CZ20032787A3

CZ20032787A3 - Renal cell carcinoma tumor markers

Info

Publication number: CZ20032787A3
Application number: CZ20032787A
Authority: CZ
Inventors: Roland Kellner; Siegfried Matzku; Barbara Seliger; Rudolf Lichtenfels
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2001-04-03
Filing date: 2002-03-28
Publication date: 2004-03-17
Also published as: JP2004531713A; EP1373900A2; CA2442957A1; WO2002082076A2; US20040096916A1; WO2002082076A3; ZA200308487B; RU2003130645A; BR0208603A; PL363009A1; CN1630819A; SK12872003A3; HUP0303749A2; KR20030086345A; MXPA03009018A; HUP0303749A3

Description

Vynález se týká nádorových signálních znaku, pro stručnost nadále označovaných jako markéry, kterých lze použít ke skriningu, diagnóze a prognóze rakoviny ledvinové buňky (RCC) a k identifikaci subtypu RCC. Dále se vynález týká nádorových markérů jako imunogenů pro stimulaci imunitní odezvy a pro výrobu protilátek a proti 1átkových fúzovaných proteinů zaměřených na nádorové markéry.

Dosavadní stav techniky

Se MHC třídou I asociované peptidy jsou v široké míře odvozeny z proteolytické degradace cytosolických proteinů. Po počátečním všeobecném výskytu jsou tyto proteiny štěpeny velkým multikatalytickým proteasomovým komplexem. Některé konstitutivní j3-sub jednotky, jmenovitě Y, Z a X, stejně jako interferonen ( IFN)-gama indukovatelné subjednotky, nízkomolekulámí proteinové (LUP) subjednotky LMP2, MECL1 (LMP10) a LMP7 vytvářejí proteolyticky aktivní místa proteasomového komplexu. Výsledné peptidy jsou dopravovány z cytosolu do endoplasmatického retíkula ( ER) transportérem asociovaným s antigen zpracovávajícími (TAP), heterodimerní membránový protein obsahujícími subjednotkami TAP1 a TAP2. Peptidy jsou pak naloženy na molekuly MHC třídy I uvnitř ER, což vyvolává vícestupňový shromažďovací proces. Nově syntetizované MHC třídy I těžké řetězce (HC) asociované s ER residentnlm doprovázejícím calnexinem pak vážou p2*mikroglobulin (P2-m) a jsou pak začleněny do velkého MHC třídy I peptidového komplexu, sestávajícího z doprovodného calret i culjnu, thioloxidoreduktázy ERp57, TAP heterodímeru a transmembránového proteinového tapasi nu. Kromě toho teplem • ♦ v · * · · ··· · šokované proteiny, lokalizované v cytosolu stejně jako v ER, nohou také vázat peptidy a nit význam v jejich stabilizaci a transportu. Stabilní asociované komplexy MHC třída 1/peptid se pak přemisťují cestou přístroje trans-Golgi na povrch buněk pro presentaci na buňkách CD8⁺T.

U některých nemocí, jako jsou rakovina, autoimunitní nemoci nebo kardiovaskulární poruchy, jsou peptidy normálních a abnormálních proteinů umístěny na povrchu buněk, které nel2e nalézt na povrchu buněk zdravých jedinců.

Proto je možno těchto peptidů a proteinů použít jako markérů pro identifikaci takových abnormálních buněk. Kromě toho může být detekce protilátek v séru nebo v jiných tělních tekutinách, zaměřené na tyto peptidy nebo proteiny, také použito jako indikátoru rizika nebo jako prognostického indikátoru.

Rakovina ledvinové buňky (RCC) představuje přibližně 5 % úmrti na rakovinu. Až dosud vlče než 50 % pacientů již vyvinulo lokálně se šířcí metastázové onemocnění s pětiletým přežitím menším než 20 %. Ačkoli jsou poměrně resistentní na konvenční režimy, RCC jsou Částečně citlivé na imunoterapii na bázi T-buněk,

Proteomová analýza je významným nástrojem ke studiu změn v expresi proteinů a módifikačniho obrazce v buňkách kultivovaných za definovaných podmínek během diferenciačních stupňů nebo během fyziologicko/pathologických procesů (Pandey a kol., Nátuře 405, str. 837, 2000; Appella a kol.,

2000; Gevaert a kol., Electrophoresis 21, str.

Exs. 88, str. 1, 1145, 2000).

V poslední době bylo proteomik použito k hledání diagnostických, prediktivních a prognostických parametru u nádorů různého původu (Alaiya a kol., Electrophoresis 21, str. 1210, 2000: Unvin a kol., Electrophoresis 20, str. 3629, 1999; Jung• φ φ φ · φ · · φ · · · φφφφφ φφφφφ φφ φφ blut a kol., Electrophoresis 20, str. 2100, 1999), Takových nádorových markérů (například molekul souvisejících s nádore») by mohlo být rutinně používáno ke sledování nemoci pacientů a mohlo by být dále nápomocné ve výběru nádorových pacientů pro specificky konstruované imunoterapeutické strategie léčení.

Existují četné strategie k definováni potenciálních cílových struktur pro tento terapeutický způsob, včetně 2-D PftGE separace (Sarto a kol,, Electrophoresis 18, str. 599, 1997; Sarto a kol. Electrophoresis 20, str, 3458, 1999), analýzy SEREX (Scanlan a kol., Int. J. Cancer 83, str.456, 1999), cDNA expresního klonování (Boon a kol., Immunol. Today 18, str. 267, 1997) a subtraktivni ho hybridizačn1 ho způsobu (Pitzer a kol., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 125, str. 487, 1999).

Světový patentový spis číslo WO 99/00671 popisuje identifikaci dvourozměrnou gelovou elektroforézou následovanou analýzou Western Blot několika specifických |3-tubu 1 lnových isoforem jako nádorových markérů neuroblastomu v pacientově séru.

Ve světovém patentovém spise číslo W0 00/20586 byly identifikovány nové ledvinové a s rakovinou související antigeny autologovým proti 1átkovým skrlningem knihoven nukleových kyselin expresovaných v ledvinových rakovinových buňkách pomocí anti séra od rakovinových pacientů, kterých je možno použít jako nádorových markérů.

Existuje však potřeba dalších nádorových markérů pro vývoj léčiv a pro diagnózy použitelných u rakovinových pacientů majících RCC nebo jiné rakoviny a pro způsoby identifikace RCC a diferenciace subtypů RCC.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použití alespoň jednoho proteinu • 4 * 4 4 4 9 ·

4 4 4 4 4

444 44 444 «4 vybraného ze souboru zahrnujícího β-aktin, gama-aktin, cr-tubulin, cytokeratin, cytokeratin 8 (CK 8), cytoskeletový tropomyosin, F-aktin čepičkujicí protein, hsp 27, hsp 60, hsp 70, hsp 90, grp 78 (BIP), gp 96, glutation-S-transferázu, glutationsynthetázu, superoxiddismutázu, thioredoxinperoxidázu, PA28cf, ubigui t inthiolesterázu, tr iosef osf át i soierázu, aldózreduktázu, enoyl- CoA-hydratážu, a-enolázu, annexin II, IV a V, stathmin, ni kot inamid-N-methyltransferázu, B23/nukleofosmin a vimentin jako nádorového signálního znaku.

Zvláště se vynález týká použití alespoň jednoho proteinu voleného ze souboru zahrnujícího β-aktin, gama-akt in, a-tubulin, β-tubulin, cytokeratin, cytokeratin 8 (CK 8), cytoskeletový tropomyosín, F-aktin čepičkujicí protein, hsp 27, hsp 60, hsp 70, hsp 90, grp 78 (BIP), gp 96, glutation-S-transferázu, glutationsynthetázu, superoxiddismutázu, thioredoxinperoxidázu, PA28cr, ubigui t inthiolesterázu, tr iosef osfát i somerázu, aldózreduktázu, enoyl-CoA-hydrátázu, a-enolázu, annexin II, IV a V, stathmin, nikotínaraid-N-methyltransferázu, B23/nukleofosmin a vimentin jako nádorového markéru pro rakovinu ledvinové buňky.

Vynález se dále týká použití takových nádorových markéru v imunitních testech, určených k detekci přítomnosti protilátek, které se specificky vážou na identifikované nádorové markéry v séru jednotlivce.

Vynález se také týká imunitních zkoušek k detekci přítomnosti protilátek specifických pro nádorové markéry v séru jednotlivce. Takových imunitních zkoušek je možno použít ke skrínování, diagnostice a prognóze nemoci. Podle vynálezu je možno použít měření hladiny protilátek ve vzorku jednotlivce ke včasné diagnóze RCC nebo jiných nádorů. Kromě toho může být použito sledování hladin protilátek v séru prognosticky ke zjištění stavu progrese nemoci.

• » ··« ·· • * ·«· «·

Dále se vynález týká použití nádorových Barkeřů jako imunogenů ke stimulaci imunitní odezvy u jedince proti nádorovým buňkám k inhibici růstu nádorových buněk nebo k jejich zabíjení .

Vynález se také týká léčiva obsahujícího tyto nádorové markéry ke stimulaci imunitní odezvy proti nádorovým buňkám k inhibici růstu nádorových buněk a/nebo k jejich zabíjení.

Vynález se týká také použití nádorových markérů pro výrobu protilátek nebo proti 1átkových fúzovaných proteinů. Takových protilátek nebo proti 1átkových fúzovaných proteinů může být použito jako léčiva k zabíjení nádorových buněk nebo pro inhibici růstu nádoru.

Vynález se také také způsobu a kítů pro identifikaci RCC a diferenciaci subtypů RCC imunohistochemickými způsoby.

Vynález podrobně objasňuje následující popis s připojenými obrázky.

Seznam obrázků na výkresech

Na obr.l jsou cíle zjištěné ve skrínovacím okénku pro složky s vysokou molekulovou hmotností (7 % T/2,5 % C gelů).

Je znázorněn řez koloi dní ho coomasiově vybarveného 2D gelu (7 % T/2,5 % C) představující obrazec skvrn totálního lyzátu z přibližně 5x10⁶ neošetřených buněk MZ1257RC. Proteiny jsou zaměřeny v prvém rozměru na nelineární imobilni pásek DryStrip (hodnota pH 3 až 10, NL; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Německo). Relevantní cílové skvrny, detekované pozitivním imunovybarvenlm skvrn pacientova séra, jsou vyznačeny šipkami. Xdenti ta těchto cílových skvrn je analyzována na odpovídajících gelech mapováním peptidové hmoty a/nebo parciálním sekvencová• ·

ni β .

Na obr. 2 jsou cíle zjištěné ve skrinovaci· okénku pro složky s nízkou aolekulovou hmotností (16 % T/2,5 % C gely).

Je znázorněn koloidní coomasiově vybarvený 2D gel (16 % T/2,5 % C) představující obrazec skvrn totálního lyzátu z přibližně 2,5x10^* neošetřených buněk MZ12S7RC. Proteiny jsou zaměřeny v první· rozměru na nelineární imobilní pásek DryStrip (hodnota pH 3 až 10, NL: Amersham PharBacia Biotech, Freiburg, Německo) . Relevantní cílové skvrny, detekované pozitivním iaunovybarvením skvrn pacientova séra, jsou vyznačeny šipkami. Identita těchto cílových skvrn je analyzována na odpovídajících gelech mapováním peptidové hmoty a/nebo parciálním sekvencovánlm.

Na obr. 3 jsou cíle zjištěné ve skrinovacím okénku pro složky s nízkou molekulovou hmotností (16 % T/2,5 % C gely), následované stimulací IFN-gama buněčné linie MZ1257RC.

Je znázorněn koloidní coomasiově vybarvený 2D gel (7 % T/2,5 %

C) představující obrazec skvrn totálního lyzátu od přibližně 2,5xlO^fc IFN-gama stimulovaných buněk (48 hodin) MZ1257RC. Proteiny jsou zaměřeny v prvním rozměru na nelineární imobilní pásek DryStrip (hodnota pH 3 až 10, NL: Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Německo). Relevantní cílové skvrny, detekované pozitivním imunovybarvením skvrn pacientova séra, jsou vyznačeny šipkami. Identita těchto cílových skvrn je analyzována na odpovídajících gelech mapováním peptidové hmoty a/nebo parciálním sekvencováním.

Na obr. 4 je znázorněna imunohistochemická analýza normální ledvinové tkáně a RCC pro CK 8, stathmin a vimentin. Imunohistochemické vybarveni (400x, zleva doprava) normální ledvinové tkáně, RCC subtypu čirých buněk (G2) a RCC chromofobního subtypu (G2) se provádí anti-CK 8, anti-stathmin a antivimentin specifickými mAb, jak je popsáno v příkladu 5. Je znázorněno φ φ φ φ φφφ φφ φφ φφ φφφ φ φ silné pozitivní vybarvení pro CR 8 v epitelu distální tubule a sběrného kanálkového systému stejně jako v buňkách RCC pročištěné buňky a chromofobního subtypu. Jsou znázorněny střední až silně pozitivní cytoplasmové vybarvení epitelu pro stathmin v distální· tubulárním systému; pozitivní cytoplasmové vybarvení buněk RCC subtypu pročištěné buňky stejně jako rozptýlená infiltrace zánětlivých buněk a negativní reakce buněk RCC chromofobního subtypu. Silné positivní cytoplasmové vybarvení intersticiálních buněk v normální ledvinové tkáni a RCC buněk typu pročištěné buňky, 2atlmco normální tubulární epitel je negativní pro vybarvení v i ment inem. Zjišťuje se slabá exprese v i ment i nu v buňkách RCC chromofobního subtypu.

Cíle vynálezu je dosaženo na základě neočekávaného poznatku, že proteiny vybrané ze souboru zahrnujícího p-aktin, gama-aktin, ď-tubulin, p-tubulin, cytokeratin, CK 8, cytoske1etový tropomyosin, F-aktin čepičkující protein, hsp 27, hsp 60, hsp 70, hsp 90, grp 78 (BIP), gp 96, glutation-S-transferázu, glutationsynthetázu, superoxiddismutázu, thíoredoxinperoxidázu, PA28CÍ, ubiquitínthiolesterázu, triosefosfát isomerázu, aldózreduktézu, enoy 1 -CoA-hydratázu, cť-enolázu, annexin II, IV a V, stathmin, nikotinamid-N-methyltransferázu, B23/nukleofosmin a vimentin, s výhodou annexin II, IV a V, stathmin, vimentin a B23/nukleofosmin, jsou substráty pro proteolytickou degradaci velkým multikatalytjckým proteásomovým komplexem v pacientech s RCC, a proto peptidy těchto proteinů jsou antigeny souvisejícími s rakovinou ledvin takových jedinců. Proto je možno těchto proteinů a jejich fragmentů používat jako nádorových markérů.

Proteiny podle vynálezu byly identifikovány dvourozměrovou gelovou elektroforézou (obr. 1 až 3) a následnou detekci imunoblottingem pacientova séra. Imunovybarvené proteinové skvrny byly vyříznuty z duplikátního gelu, podrobeny gelové digesci a anylyzovány hmotovou spektrometrií. Diferenční analýzou pa• * ·«· ·· cientova séra oproti séru zdravých dobrovolníků byly identifikovány shora uvedené proteiny jako nádorové markéry RCC pacientů .

Zde používaným označením pro nádorový signální znak nádorový markér podle vynálezu se míní proteiny vybrané ze souboru zahrnujícího £J-aktin, gama-aktin, a-tubulin, p-tubulin, cytokeratin, CK 8, cytoske1etový tropomyosin, F-aktin čepičkujicí protein, hsp 27, hsp 60, hsp 70, hsp 90, grp 78 (BIP), gp 96, glutation-S-transferázu, glutationsynthetázu, superoxiddismutázu, thioredoxinperoxidázu, PA28a, ubiquitinthiolesterázu, triosefosfátisomerázu, a 1dó2reduktázu, enoy1-CoA-hydratážu, d-enolázu, annexin II, IV a V, stathmin, nikotinamid-N-methyltransferázu, B23/nukleofosmin a vimentin a jejich imunogenické fragmenty.

Poznatek, že jsou tyto proteiny imunogenní u RCC pacientů, je základem pro vývoj diagnostických metod pro RCC a ostatní rakoviny, u kterých jsou tyto proteiny přítomny na povrchu nádorové buňky, stejně jako pro vývoj prostředků pro prognózu různých terapeutických postupů pro tuto chorobu. Kromě toho je na tomto poznatku založen způsob použití těchto proteinů jako imunogenů pro stimulaci imunitní odezvy vůči nádorovým buňkám.

Proto se vynález týká použití proteinů ze souboru zahrnujícího p-aktin, gama-aktin, u-tubulin, cytokeratin, cytokeratin 8, cytoskeletový tropomyosin, F-aktin čepičkující protein, hsp 27, hsp 60, hsp 70, hsp 90, grp 78 (BIP), gp 96, glutation-S-transferázu, glutationsynthetázu, superoxiddismutázu, thioredoxinperoxidázu, PA28a, ubiquitinthiolesterázu, triosefosfátisomerázu, aldózreduktázu, enoyl-CoA-hydrátázu, g-enolázu, annexin II, IV a V, stathmin, nikotinamid-N-methyltransferázu, B23/nukleofosmin a vimentin jako nádorových markérů.

• · • »· ·· » k kkk ··

Zejména se vynález týká použití proteinů ze souboru zahrnujícího p-aktin, gama-aktin, d-tubulin, p-tubulín, cytokeratin, CK 8, cytoskeletový tropomyosin, F-aktin čepíčkující protein, hsp 27, hsp 60, hsp 70, hsp 90, grp 78 (BIP), gp 96, glutati on-S-transferázu, glutationsynthetázu, superoxiddismutázu, thioredoxinperoxidázu, PA28cr, ubiqui t inthio 1 esterázu, triosefosf át i somerá2u, aldózreduktázu, enoyl-CoA-hydratážu, of-enolázu, annexin II, IV a V, stathmin, nikotinamid-N-methyltransferázu, B23/nuk 1eofosmin a vi ment in jako nádorových markérů rakoviny ledvinové buňky.

Tyto proteiny se mohou izolovat a čistit standardními způsoby včetně chromatografie (například iontotaěftičové, af i ni tni a sloupcové chromatografie s vyloučením velikosti) odstřeďování, rozdílné rozpustnosti, elektroforézy nebo jakéhokoliv standardního způsobu čištění proteinů. Vyčištěných proteinů se může požívat při testech imunity určených k detekci přítomnosti protilátek ve vzorku jedince, nebo alternativně může být takových proteinových preparátů použito k imunizaci, jak shora i níže popsáno.

Vynález se také týká způsobu detekce a/nebo kvanitativního měření protilátek zaměřených na nádorové markéry podle vynálezu v biologickém vzorku, jako jsou sérum nebo tělní tekutiny pacienta trpícího RCC nebo jinými nemocemi charakterizovanými specifickou přítomností fragmentů nádorových markérů na povrchu buňky.

Tyto způsoby se dají provádět kterýmkoliv z četných způsobů. Jakožto takové způsoby se uvádějí imunotesty, které zahrnují příkladně, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení, konkureční a nekonkureční testovací systémy, s použitím technik, jako jsou Vestern-blot, radioimunitní testy, ELISA (enzyme 1 inked immunosorbent assay), sendvičové imunotesty, imunoprecipitační testy, přecipiti nové reakce, gelové difúznl pre• I · · · 1 ·»··«· « ·*· 00* · · · · ·«· «« ·> ♦· ·· ·· cipitinové reakce, imunodifúzni testy, agglutinační testy, doplňkové fixační testy, imunoradioBetrické testy, fluorescenční imunotesty, proteinové A imunotesty.

Při provádění těcho testů nohou být nádorové markéry zmobilizovány na nenbráně nebo na substrátu nebo jich muže být použito v kapalné fázi. Vhodnou membránou nebo substráty jsou například povrchy schopné vázat proteiny, jako jsou důlky mikrotitračních destiček nebo nitrocelulózová membrána. Další vhodné testy in vitro jsou pracovníkům v oboru známy.

Například jedním způsobem in vitro pro diagnózu a prognózu rakoviny jedince, spočívající v detekci pomocí imunitního testu přítomnosti protilátky získané ze vzorku séra takového jedince a v zaměření na protein nádorového markéru, je způsob, při kterém:

a) se imobilizuje alespoň jeden nádorový markér na membráně nebo na substrátu,

b) uvádi se do styku membrána nebo substrát se vzorkem séra jedince,

c) zjišťuje se přítomnost protilátek specifických pro nádorový markér ve vzorku jedincova séra.

K detekci protilátek specifických pro nádorový markér ve vzorku séra se obvykle používá druhých protilátek se zjistitelným značením. Zjistitelným značením může být radioisotop, jehož detekce se provádí autoradiograficky. Obzvlášť výhodnými izotopy k tomuto účelu jsou ³H,^1Z5J, ¹³¹J, ³⁵S a ¹⁴C.

Druhé protilátky mohou být také značeny fluorescenční sloučeninou. Přítomnost fluorescenčně značené protilátky je podmíněna vystavením imunokonjugátu působení světla správné vlnové délky a detekcí výsledné fluorescenece. Jako příklady fluorescenčně značkujících sloučenin se uvádějí fluorescein, isokya« · • · · · ·· «· nát, rhodamin, fycoerytherin, fycokyanin, allofycokyanin, ofta1dehyd a fluorescanin.

• » «·· ·· « * I ·«· ··

Alternativně Bůže být druhá protilátka zjistitelně značena vázániB na chemi 1 um iniscenční sloučeninu. Přítomnost cheai luminiscenčně značeného imunokonjugátu je podmíněna detekcí přítomnosti luminiscence, která se objeví v průběhu chemické reakce. Příkladem chemi luminiscenčně značených sloučenin jsou luminol, isoluminol, aromatický aer idiuaester, imidazol, aeridiniová sůl a oxalátový ester.

Podobně lze použít biolum iniscenční sloučeniny ke značení druhé protilátky. Bioluminiscence je typ chemiluminiscence biologických systémů, ve kterých katalytický protein zvyšuje účinnost chemi 1uminiscenčni reakce. Přítomnost bíoluminiscenčního proteinu se zjišťuje detekcí přítomnosti luminiscence. Vhodnými biolum iniscenčn1 mi sloučeninami, kterých se používá ke značení, jsou luciferin, luciferáza a acquorin.

Alternativně může být druhá protilátka značena vazbou druhé protilátky na enzym. Je-li konjugát proti látka-enzym inkubován v přítomnosti vhodného substrátu, reaguje enzymový podíl se substrátem za vzniku chemického podílu, který může být detekčně zjištěn, například spektrofotometricky, fluorometricky nebo vizuálně. Příklady enzymů, kterých může být použito k detekčně značeným polyspecifickým imunokonjugátum jsou^;p-galaktosidáza, glukosoxidáza, peroxidáza a alkalická fosfatáza. Pracovníkům v oboru je známo mnoho dalších způsobů značení, kterých se může používat podle vynálezu. Vazba podílů markéru na protilátky se může provádět standarnimi způsoby, známými v oboru. Obvyklý způsob k tomuto účelu popsal Kennedy a kol. (Clin. Chim. Acta 70, (Clin. Chim. Acta 81, str.

str. 1, 1976); Schurs a kol.

1, 1977): Shih a kol. (Intl. J,

Cancer -46, str. 1101, 1990); Stein a kol. (Cancer Res. 50, str. 1330, 1990)

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

999 99 99 ·9 ·

9

999 4

Detekce a kvantitativního Měření protilátek, zaměřených na nádorové markéry podle vynálezu v séru nebo v jiné tělní tekutině, může být použito k průzkumu jedinců ohrožených RCC nebo jiných poruch charakterizovaných imunogenickými vlastnostmi nádorových markérů podle vynálezu. Kromě toho může být měření protilátek použito prognosticky ke zjištění stavu progrese choroby.

Vynález se také také soupravy (kit) k provádění těchto detekčních způsobů. Taková souprava může obsahovat všechny potřebné prvky k provádění shora popsané diagnostické zkoušky. Souprava může obsahovat také druhý kontejner obsahující protilátku nebo její fragment mající příslušné poznávací místo (například antihumánni protilátku IgG) pro protilátky pacientova séra a detekovatelné značení, jak shora popsáno.

Identifikace nádorových markérů spojených s RCC poskytuje 2áklad pro imunoíerapii nemoci. Pacint může být imunizován nádorovými markéry k vybuzení imunitní odezvy, která usnadni zabíjení nádorových buněk a/nebo inhibici růstu nádorových buněk. Nádorové markéry se mohou připravovat shora popsanými způsoby pro čištění proteinů.

Alternativně může být pacient léčen protilátkami, s výhodou humanizovanými protilátkami nebo jejich fragmenty, zaměřenými na nádorové markéry k vybuzení reakce, která usnadní zabíjení nádorových buněk a/nebo inhibici růstu nádorových buněk

Výraz “proti 1átkový fragment ve smyslu vynálezu znamená část protilátky, jako je například F( ab )2, F(ab)2, Fab a Fab. Nezávisle na struktuře se proti látkový fragemnt váže se stejným antigenem, který je poznán íntaktní protilátkou. Výraz zahrnuje také syntetický nebo geneticky konstruovaný polypeptid, který se váže na specifický antigen, jako jsou polypeptidy sestávající z variabilního úseku lehkého řetězce, Fv • φ φ φ φ φ φ φ • · » φ φ φ · φ φ φ φφ* φφφ φ φ · · φφφ φφ Φφφ φφ φφ φφ fragmenty sestávajíc! z variabilních úseků těžkého a lehkého řetězce, rekombinantní jeden řetězec polypeptidových molekul, ve kterých lehké a těžké variabilní úseky se spojují peptidovým spojovníkem (scFv proteiny) a minimální rozeznávací jednotky sestávající ze zbytku aminokyselin, které napodobují hypervariabilni úsek.

Výrazem humanizované protilátky se míní protilátky obsahující FR variabilní úseky a konstantní úseky aminokyselin na lehkém a těžkém řetězci, které pocházej i z 1idských zdrojů, zatímco hypervariabi1 η 1 úseky pocházejí z nelidských zdrojů.

Výrazem FR“ se míní úseky základní struktury protilátky a nacházejí se uvnitř variabilních úseků. V těchto úsecích dochází k určité přeměně aminokyselin.

Polyklonální protilátky vůči nádorovým markérům podle vynálezu se mohou připravovat způsoby dobře známými pracovníkům v oboru (Green a kol., Production of Polyclonal Antisera , Immunochemi ca 1 Protocols (vydavatel Manson), str, 1 až 5 (Humana Press 1992): Williams a kol., Expression of foreion proteins in E.coli using plasmid vectors and purification of spéci fic polyclonal antibodies, DNA Cloning 2= Expression Systems, 2. vydání, Glover a kol. (vydavatelé), str. 15 (Oxford University Press 1995)).

Imunogenicita nádorových markérů může být zvýšena použitím adjuvantu, jako je hydroxid hlinitý nebo Freundův úplný nebo neúplný adjuvant. Polypeptidy vhodné pro imunizaci obsahují také fúzované polypeptidy, jako jsou fúze nádorového markéru nebo jeho části s imunoglobul lnovým polypeptidem nebo s maltózou vázající protein. Polypetidovým imunogenem může být molekula plné délky nebo její část. Je-li polypeptidová část podobná haptenu (hapten like“), může být taková část s výhodou připojena nebo vázána na makromolekulární nosič (například • * • · ♦ · · · * · · · · · · • ♦ · *«· · · » • ·· ·« ··· ♦· ·· ·· “keyhole 1 impet hemocyanin (KLH), albumin hovězího séra (BSA) nebo tetanový toxoid) pro iDuni žací.

Monoklonální protilátky na nádorové markéry lze získat způsoby známými pracovníkům v oboru (například Kohler a kol., Nátuře 256, str.495, 1975; Coligan a kol. (vydavatel), Current Protocols in Immunology, sv. 1 str. 2.5.1 až 2.6.7 (John Wiley & Sons 1991: Picksley a kol., “Production of lonoclonal antíbodies against proteins expressed in E.coli, DNA Cl oning 2. Expressi on Systems 2. vydání, Glover a kol, (vydavatel) str. 93 (Oxford Univerity Press 1995)). Monoklonální protilátky lze získat injektovánim myší prostředkem obsahujícím jeden nebo několik nádorových markérů, ověřením přítomnosti produkce protilátek odebráním vzorku séra, odebráním sleziny k získání B-lymfocytů, fúzováním B-lymfocytu s buňkami myelomu k vytvoření hybridomu, klonování hybridomu, selekcí positivních klonů, které vytvářejí protilátky na antigen, kultivováním klonů, které produkují protilátky na antigen a izolováním protilátek z hybridomových kultur.

Kromě toho se může protilátka proti nádorového markéru podle vynálezu odvodit z lidské monoklonální protilátky. Lidské monoklonální protilátky se získají z transgenních myší, které byly upraveny k vytváření specifických lidských protilátek v odezvě na antigen ickou výzvu. Při tomto způsobu se zavádějí elementy místa lidského těžkého a lehkého řetězce do kmenů myší odvozených z embryového kmene buněčných linií, které obsahují cílová přerušení endogenních míst těžkého a lehkého řetězce. Transgennf myši mohou syntetizovat lidské protilátky specifické pro lidské antigeny a myší může být použito k vytváření hybridomu se sekrecí lidských protilátek.

Způsoby získávání lidských protilátek od transgenních myši jsou popsány v literatuře (například Green a kol,. Nátuře Genet. 7, str. 13, 1994; Lonberg a kol,, Nátuře 368, str. 856, • · ·

0 0 • 0 • 0 * 0 0 4

00

000 0·

0 0 090 00

1994; a Taylor a kol., Int. lieun. 6, str. 579, 1994.

Monoklonální protilátky se mohou izolovat a čistit z hybri domových kultur různými dobře zavedenými způsoby. Jako takové izolační způsoby se uvádějí afinitní chromatografie s Protein- A-Sefarózou, chromatografie s vyloučením velikosti a iontoměničová chromatografie (například Coligan, str, 2,7.1-2.7. 12 a str. 2.9.1-2.9.3: Baines a kol., “Purification of Immunoglobulin G (IgG)”, Methods in Molecular Biology, sv.10, str. 79 až 104, The Humana Press lne. , 1992).

Pro zvláštní použití může být žádoucí při prav iL fragmenty protilátek anti nádorových markérů. Takové fragmenty protilátek lze získat například proteolytickou hydrolýzou protilátky. Fragmenty protilátek je možno získat pepsinovou nebo papainovou di gescí úplných protilátek obvyklými způsoby, pro objasnění se uvádí, že fragmenty protilátek lze připravit enzymatickým štěpením protilátek pepsinem k získání fragmentu 5S označovaného F (ab*>z. Tento fragment může být dále štěpen pomocí thiol redukujícího činidla k vytvoření monovalentních fragmentů 3.5S Fab . Optimálně se může štěpná reakce provádět blokující skupinou pro sulfhydry1ové skupiny, které pocházejí ze štěpení disulfidových vazeb. Jako alternativa poskytuje enzymatické štěpeni s použitím pepsinu dva monovalentní Fab fragmenty a Fc fragment přímo. Tyto způsoby popsal například Goldenberg (americký patentový spis číslo US 4 331 647); Nisonoff a kol. (Arch. Biochem. Biophys. 89, str. 230, 1960); Porter (Biochem J. 73, str. 119, 1959); Edelman a kol, (Methods in Enzymology sv.1, str. 422 (Academie Press 1967); a Coligan str 2.8.1-2.8.10 a 2.10-2.10.4.

Použít je možno ještě jiných způsobů štěpení protilátek, jako jsou separace těžkých řetězců k vytvoření monovalentních fragmentů s lehkým-těžkým řetězcem, dále štěpení fragmentů nebo jiné enzymatické, chemické nebo genetické způsoby, pokud se m

* ···

fragmenty vážou na antigen. který je poznán intaktní protilátkou. Například Fv fragmenty obsahuji sdružení řetězců Vh a Vl . Toto sdružení může být nekovalentní (Inbar a kol.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69, str. 2659, 1972). Alternativně mohou být variabilní řetězce spojeny intermolekulární disulfidovou vazbou nebo zesltěny chemikáliemi, jako je glutaraldehyd (například Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12, str. 437, 1992).

Fragmenty Fv mohou obsahovat Vh a Vl řetězce, které jsou spojeny peptidovým spojovníkem. Tyto proteiny s jedním řetězcem, vázající antigen (scFv), se připravuji konstrukcí strukturálního genu obsahujícího sekvence DNA kódující domény Vh a Vl, které jsou spojeny oligonukleotidem. Strukturální gen se začlení do expresního vektoru, který je pak zaveden do hostitelské buňky, jako je E.coli. Rekombinantní hostitelské buňky syntetizují jediný polypeptidový řetězec se spojovníkovým peptidem přeraostuj1cím dvě V domény. Způsoby produkce scFv jsou popsány v literatuře (například Whitlov a kol., Methods^: A Companion to Methods in Enzymology 2, str. 97, 1991; Bird a kol., Science 242, 423, 1988; Ladner a kol., americký patentový spis číslo US 4 946 778).

Pro objasnění se uvádí, že scFV lze získat exponováním lymfocytů nádorovým markérům in vitro a vyčleněním proti látkových knihoven ve fagu nebo v podobných vektorech (například použitím imobi1izovaných nebo značených nádorových markérů). Jinou formou proti 1átkového fragmentu je peptid kódující jediný úsek podmiňující komplementaritu (CDR). Peptidy CDR (jednotky s minimálním poznáním“) lze získat konstrukcí genů kódujících CDR hledané protilátky. Takové geny se připraví například použitím reakce polymerázového řetězce k syntetizaci variabilního úseku z RNA buněk produkujících protilátku (například Larrick a kol., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2, str. 106, 1991: Cortenay-Luck Genetic Man i pulation of Monoclonal Ant i bod i es, Monoclonal Ant i bod i es·' Production, En9 · 9 • 9999* 9

9 9 · « · 9

99· ·9 9· ·· gineering and Clinical Application. Ritter a kol. str. 166, Cambridge University Press 1995 netic Hanipulation and Expression of Antibodies, Antibodies: Principles and Applications, Birch a kol tel), str. 137 (Wiley-Liss lne.) 1995).

( vydavatel) a Ward a kol. GeHonoclonal ( vydává Alternativně může být protilátka nádorového markéru odvozena z humanizované monoklonální protilátky. Humanizované monoklonální protilátky se připravují převedením myších komplementárně určujících úseků z těžkých a lehkých variabilních řetězců myšího imunoglobulinu do lidské variabilní domény. Typické zbytky lidských protilátek se pak substituuji do rámcových úseků myších protějšků. Použití proti 1átkových složek, odvozených z humanizovaných monoklonálních protilátek, odstraňuje potenciální problémy spojené s imunogenici tou myších konstantních úseků. Obecné techniky pro klonování variabilních domén myšího imunoglobulinu popsal například Orlandi a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, str. 3833, 1989. Způsob výroby humanizovaných monoklonálních protilátek jsou popsány v literatuře (například Jones a kol., Nátuře 321, str. 522 1986: Carter a kol., Prcc. Nati. Acad. Sci USA 89, str. 4285,

Sandhu, Crit. Rev. Biotech.12, J.Immun. 150, str. 2844, 1993:

1992' str. 437, 1992: Singer a kol., Sudhir (vydavatel), Antibody

Engineering Protocols (Humana Press lne. 1995): Kelley Engi

Protein Engineering Princip(vydavatel) str. 399 až 434 neering Therapeutic Antibodies, les and Practice, Clealand a kol (John Wiley & Sons,Inc.) 1996: a Queen a kol., americký paten tový spis číslo US 5 693762, 1997).

Alternativně může být pacient léčen proti 1átkovými fúzovanými proteiny zaměřenými na proteiny nádorových markérů k vyvolání reakce, která usnadní zabíjení nádorových buněk a/ nebo inhibici jejich růstu.

Výrazem *'prot i 1 átkový fúzovaný protein se vždy míní • · « • « • · · · · · · · ··· φφ ·· ·· fúzovaná molekula, která sestává v podstatě z protilátky nebo 2 jejího fragmentu, zaměřené na nádorový markér podle vynálezu a z terapeutického činidla, kterého se použije přímo nebo cestou spojovníku nebo mezerníku do imunoglobulinu nebo jeho fragmentu. Příklady vhodných terapeutických činidel pro takové fúzované proteiny jsou imunomodulátory a toxiny například, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení, cytokiny, jako jsou IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IFN, TNFct nebo CSF.

Fúzované proteiny se mohou připravovat o sobě známými způsoby pracovníkům v oboru připravením každé složky fúzovaného proteinu a jejich chemickou konjugací. Alternativně se může vytvořit polynukleotid kódující obě složky fúzovaného proteinu ve správném Čtecím rámci za použití známých způsobů a expresuje se způsoby popsanými například v evropském patentovém spise číslo EP O 659439.

V jednom provedení vynálezu je použito imunogenu obsahujícího jeden nebo směs vyčištěných nádorových markérů vůči nimž pacientova rakovina vyvinula protilátky k vyvolání imunitní odezvy,

V jiném provedení vynálezu může být použito protilátek nebo proti 1átkových fragmentů pěstovaných proti nádorovým markérům podle vynálezu k reakci, která usnadní zabíjení nádorových buněk a/nebo inhibici jejich růstu.

Nádorové markéry, jejich směsi nebo protilátky a fragmenty protilátek nebo protilátkové fúzované proteiny podle vynálezu lze aplikovat přímo nebo ve farmaceutických prostředcích obsahujících sloučeniny a farmaceuticky přijatelné ředidlo, nosič nebo jejich excipient pacientovi trpícímu RCC nebo jinou nemocí charakterizovanou specifickou přítomností fragmentů nádorových markérů na provrchu buňky.

• ·· • ·*···· ·« ····«· · • * 9 · · ♦ · · • «·· ·· ·· ··

Výrazem farmaceuticky přijatelný nosič” se míní inertní, netoxické pevné nebo kaplné plnidlo, ředidlo nebo v kapsli uzavřený materiál nereagující nepříznivě s účinnou sloučeninou nebo s pacientem. Vhodné, s výhodou kapalné, nosiče jsou v oboru dobře známy a příkladně se uvádějí sterilní voda, solanka, vodná dextróza, cukerné roztoky, ethanol, glykoly a oleje, včetně minerálního, živočišného, rostlinného nebo syntetického původu, například podzemnicový, sojový a minerální olej,

Prostředky podle vynálezu se mohou podávat jako jednotkové dávky obsahující o sobě známé netoxické farmaceuticky přijatelné nosiče, ředidla, adjuvanty a vehikula, které jsou typické pro parenterální podání.

Může se používat četných způsobů pro podávání prostředků podle vynálezu^ příkladně, tedy nikoliv jako jakékoliv omezení, se uvádí podáni orální, intradermálηí, intramuskulární, intraperitoneálníé, intravenózní a subkutánní.

Výrazem intravenčzni , parenterální se i ntraart i kálárn í vždy míní podání subkutánní, a intratracheálni injekcí a infuzí. Vhodné jsou také jiné způsoby podání, například podání orální nebo topické, Parenterální prostředky a kombinace se nejvýhodněji podávají intravenózně buď ve formě bolusu nebo konstantní fúzí o sobě známými způsoby.

Pokud jsou sloučeniny podle vynálezu formulovány jako tablety, kapsule nebo prášek, používá se obvyklých nosičů a excipientů ze souboru zahrnujícího uhličitan hořečnatý, uhličitan vápenatý, hydrogenuhličitan sodný, stearát hořečnatý, stearát vápenatý, mastek, laktózu, mikrokrysta1 ickou celulózu, methyl celulózu, natriumkarboxymethylcelulózu, Škrob a bezvodý oxid křemičitý, Mazadel ze souboru zahrnujícího hydratovaný ricínový olej, stearát hořečnatý a natriumlaurylsulfát a cukru, pektinu, dextrinu, tragakantu. nizkotajícího vosku, kakaového

4» · · · ··«·*« ·

4 · 4 4 4 ·

444 44 44 44 • 4 • 4 4 ··· 44 másla, alginátú, želatiny, polyvinylpyrroli donu, polyethylenglykolů, kvartemích amoniových sloučenin a podobných přísad jakož také pojidel ze souboru zahrnujícího příkladně škrob, glukózu, arabskou klovatínu a manit. Tablety a kapsule mohiou být povlečeny způsobem v oboru obecně známým.

Orální kapalné prostředky mohou mít formu vodných nebo olejových suspenzí, roztoků, emulzí, sirupů a vodiček nebo mohou být v podobě suchých produktů pro rekonstituci ve vodě nebo v jiném vhodném nosiči před použitím. Takové kapalné prostředky mohou obsahovat o sobě známé přísady, jako jsou suspenzační činidla, emulgátory, nevodné nosiče a konzervační přísady.

Topické prostředky mohou být v podobě vodných nebo olejových suspenzi, roztoků, emulzi, gelů nebo s výhodou emulzn í ch mast í.

V případě prostředků obsahujících nádorové markéry jsou výhodnými prostředky, ve kterých jsou nádorové markéry formulovány se vhodnými adjuvanty k zesílení imunitní odezvy na proteinový antigen. Vhodnými adjuvanty jsou příkladně, tedy nikoliv jako jakékoliv omezení, minerální gely, například hydroxid hlinitý, povrchově aktivní činidla, jako jsou lysolecitin, pluronni polyoly, polyanionty, peptidy, olejové emulze a potenciálně použitelné humánní adjuvanty, jako BCG (bacili i Calmett-Guerin> a Corynebacterium parvum.

Jednotkové dávkovači formy podle vynálezu mohou obsahovat denní potřebná množství sloučeniny podle vynálezu nebo jejich podíly k dosažení žádoucí dávky. Optimální terapeuticky přijatelné dávkování a velikost dávky pro určitého pacienta (savce včetně lidí) závisí na různých faktorech, jako je aktivita určité použité účinné látky, věk, tělesná hmotnost, zdravotní stav, pohlaví, strava, doba a způsob podání, rychlost vylučo• 9 ·

9 9 9

9*9

999 99 • 9 • 9 9 • 9 9

999 99

9 • 9

9 vání, cíl ošetřování, to znamená terapie nebo profylaxe, a povaha ošetřované nemoci, jak je pracovníkům v oboru známo.

Proto je účinnou denní dávkou pro ošetřovaného pacienta (in vivo) množství účinné sloučeniny podle vynálezu v podobě prostředku nebo kombinace přibližně 0,01 až ÍOO mg/kg tělesné hmotnosti, s výhodou přibližně 0,1 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti. Podle způsobu podání obsahuje jednotlivá dávka 0,01 až 10 mg účinné sloučeniny.

Nádorové markéry, protilátky a fúzované proti látkové proteiny podle vynálezu jsou také užitečné spolu s jinými chemoterapeutickými činidly. Chemoterapeutická činidla, která se mohou používat spolu se sloučeninami podle vynálezu, zahrnují činidla, která mají antineoplastické působení, to znamená, že předcházejí vývoji, zrání nebo rozšiřování neoplastických buněk přímo na nádorovou buňku, která mají například cytostatické nebo cytotoxické působení a nikoliv nepřímo prostřednictvím mechanizmů, jako je modifikace biologické odezvy. Cheaoterapeutická činidla podle vynálezu jsou s výhodou přírodní nebo syntetické chemické sloučeniny, nejsou však vyloučeny ani biologické molekuly, jako jsou například proteiny, protilátky, chemokiny, cytokiny a polypeptidy. Je velký počet chemoterapeutických činidel obchodně dostupných pro klinické zhodnocení a pro předklinický vývoj, které vynález může zahrnovat.

Jakožto chemoterapeutická činidla nebo prostředky se uvádějí alkylační činidla například mechlorethaminy (nitrogen mustard), ethylenirainové sloučeniny, alkyl sulfonáty a jiné sloučeniny s alkylačním působením, jako jsou nitrosomočovina, cisplatin a dacarbazin: antimetaboli ty například kyselina listová, purinové nebo pyrittidinové antagonisty: mitotické inhibitory například alkaloidy vinca a deriváty podofy11otoxinu; cytotoxické antibiotika a deriváty camptophecinu. Výhodná chemoterapeutická činidla nebo chemoterapeutika zahrnují amifostin (ethyol), cisplatin, dacarbazin (DTIC), daktinomycin, mechlorethamin (nitrogen mustard) , streptozocin, cyklofosfamid.

• φ φ V Φ · ·· φφ φφφ φφ φ φ φφ carmustin (BCNU), lomustin doxorubicin lípo (doxi 1), daunorubicin lípo (daunoxom) (CCNU), doxorubicin (adriamycin), gemcitabin (gemzar), daunorubicin, , procarbazin, mitomycin, cytarabin, etoposid, methotrexát, 5-f1uorouraci1 (5-FU), vinblastin, vincristin, bleomycin, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere), aldesleukin, asparagináza, busulfan, carboplatin, cladribin, camptothecin, CPT-1 i, 10-hydroxy-7-ethylcamptothecin (SN38), dacarbazin, floxuridin, fludarabin, hydroxymočovina, ifosfamid, idarubicin, mesna, interferon alfa, interferon beta, irinotecan, mitoxantron, topotecan, leuprolid, megestrol, melphalan, mercaptopurin, plicamycin, mitotanpegaspargase, pentostatin, pipobroman, plicamycin, streptozocin, tamoxifen, teniposid, testolakton, thioguanin, thiotepa, uráčil mustard, vinořelbi ne, chlorambucil a jejich kombinace.

Vynález se dále týká způsobu identifikace RCC a diferenciace subtypů RCC imunohistochemickými způsoby na bázi níže uvedených poznatků a kitú pro provádění tohoto způsobu.

Podle hi stologických charakteristik se RCC klasifikují na odlišné subtypy, nejčastější pročištěná buňka, chromofobní, chromofilní a onkocytomický subtyp. Způsoby stanoveni různých subtypů RCC popsal Thoenes a kol. (Path. Res. Pract. 181, str. 125, 1986) a Storkel a van der Berg (World J. Urol. 13, str. 153, 1995).

Zjistilo se, že expresn gennich proteinů se liší v subtypech RCC. Expresní schéma imunohistochemicky analyzovalo RCC lézí odlišných subtypů a epithelu. 3ak je zřejmé z obr.

í schéma tří selektivních imunonormální ledvině a v rozdílných CK 8, stathminu a v i ment i nu se v řadě chirurgicky odstraněných autologů normálního ledvinového 4, epithel proximálního a distálního tubulového systému jakož také epithel kolektivního ve• ·

• 0 • · · · 0 0 • 0 · 0 0 0 0 • · · 0 0 0 0

0·· 00 00 00 douciho systému vykazuje silně pozitivní zabarvení buněčných membrán pro CK 8, zatímco všechny epithelově buňky normální ledvinové tkáně vykazují negativní zabarvení pro vimentin. Na rozdíl od toho různé RCC subtypy vykazují přechod k silně pozitivnímu zabarvení pro CK 8 a vimentin v 36 % a v 72 % chirurgicky odebraných lézí (obr. 4. tabulka I [ve sloupci ”RCC subtyp znamená PT pročištěný typ a Ch chromofovní typl)

Tabulka I

Exprese CK 8 a v i ment i nu v různých subtypech RCC

CK8 Vimentin

+++ i	++	+	i -	RCC subtyp !	G :	N	+++ I _L	++	1 + ;
3 i	5 i	7	! 2	PT ..	1 i 17	11	2	2	2
3 1	1	7	'6	PT	2	17	14	1	0	2
2	3	5	\|3	TT	3	17	15	2	0	0 i
-i	!					1
8	9	23	! 11	Σ.		51	40	5	2	4
16%	18%	45%	i 22%	-%	!	78%	10%	4%	8%
2	1	1	I 1	Ch	1	5	0	1	3	1 I
2	1	4	í 1	Ch	2	8	0	0	0	8
				I			1
4	2	5	Í2	Σ		13	0	1	3	9
31%	15%	38%	I 15%	% I		0%	8%	23%	69%

Imunohistochemické analýze se podrobí celkem 64 lezl RCC různých subtypů RCC (pročištěná buňka typ 51, chromofobní buňka: 13) histopatologicky klasifikovaných podle Stórkela a van der Berga (World J. Urol. 13, str. 153, 1995) s použitím anti-CK 8 a anti - v i ment in mAb. Výsledky jsou sumarizovány za použití klasifikačního systému popsaného v příkladech (+♦* = silně, ♦+ = středně, + = slabě a - velmi slabě vybarvený nebo vůbec positivně nevybarvený)

Silné nebo střední pozitvní vybarvení CK 8 buněčných membrán je zjištěno u i 6 % a u 18 % lézí RCC a slabá exprese CK 8 se vyskytuje u 45 % analyzovaných nádorů (obr. 4). Odlišná • 0

0« 0 0 • · • 0* ·* frekvence CK 8 a exprese v i ment i nu se nachází ve pročištěných buňkách a chromofobní RCC (tabulka I). 78 % a 10 % pročištěných buněk vykazuje silné nebo středně positivní cytoplasmové vimentínové vybarvení. Slabá exprese vimentinu se zjišťuje u 4 % RCC tohoto subtypu. Na rozdíl od toho, vykazuje RCC chromofobního subtypu silné nebo střední positivní vybarvení pro CK 8 u 31 % a u 15 % analýzovaných lesí, přičemž slabá exprese CK 8 je zjistelná u 38 % tohoto subtypu RCC. Pouze 8 % a 23 % chromofobních RCC vykazuje středně nebo slabě positivní cytoplasmové vybarvení pro vimentin (obr. 4, tabulka I). Zdá se, že pozorovaná koexpree CK 8 a vimentinu se vyskytuje často v RCC, zvláště u subtypu pročištěná buněk. Proto může kombinovaná exprese obou proteinů sloužit jako diagnostický markér k detekci RCC pročištěných buněk.

Vybarvení lézl RCC a normálních ledvinových tkání vykazuje proměnlivý stathminový expresní obrazec (tabulka II). Zatímco antistathmi nová protilátka se vybarvuje méně než 10 % epitelu proximálního a distálnlho tubulového systému, endotelové buňky, zánětlivé buňky a epitelové buňky komprimovaných peritumorálních tubu1 i vykazují silné pozitivní cytoplasmové vybarvení. Na rozdíl od toho vykazují nádorové buňky RCC pročištěných buněk pouze střední nebo slabé pozitivní vybarvení u 10 % až u 33 %, zatímco 57 % tohoto subtypu RCC postrádá úplně stathminovou expresi (obr. 4, tabulka II). RCC chromofobního subtypu vykazuje slabé pozitivní vybarvení pro stathmin u 60 % analyzovaných lézl, zatímco 40 % je negativní pro stathmi nové vybarvení (obr. 4, tabulka II [ve sloupci RCC subtyp znamená HT pročištěný typ a Ch chromofovní typ]).

Tabulka II

Exprese stathmi nu v subtypech RCC • · • · fc fcfcfc fcfcfc fcfcfcfc fcfcfc fcfc fcfcfc fcfc fcfc fcfc

	Stathmin
+++ i 1	++		-	RCC subtyp	G	n
0 !	1	3	3	PT	1	7
⁰ 1	1 -	1	5	PT	2	7
θ 1	0	3	4	PT	3	7
1
⁰	2	7	12	Σ		21
0%	10%	33%	57%	%
0	0	3	2	Ch		5
0	0	3 j 2	Ch	2	5

0	0	6	4	V		10
j 0%	0%'	60%	40%	%	I

Imunohislocheaické analýze se podrobí celkem 31 lézí RCC různých subtypů RCC a zatřídění se analyzuje imunohistochemicky za použití anti-stathmi nu mAb. Kvantitativní analýza se provádí podle hodnotícího systému popsaného v příkladech (+++ = silně, ++ = středně, + = slabě a - velmi slabě vybarvený nebo vůbec positivně nevybarvený).

Tyto výsledky dokládají, že koexprese CK 8, vimenthinu a/nebo stathminu se může používat jako diagnostických markérů pro subtypy RCC.

Vynález se proto také týká způsobu identifikace RCC a diferenciace subtypů RCC imunohistochemickým vybarvením tkáňových vzorků ledvinového epitelu za použití anti-CK 8, protilátek anti - v iment in a/nebo anti-stathmin.

V podstatě spočívá způsob podle vynálezu z následujících stupňů:

a) inkubuje se vzorek tkáně z ledvinového epitelu zlskatelného od jedince s podezřením na RCC s alespoň jednou protilátkou volenou ze souboru zahrnujícího anticytokeratin 8, antivimentin a antistathmin (první protilátku) za podmínek zaručujících vazbu protilátky na vzorek tkáně, * · •·· 9 9 a

b) uvádí se do styku první protilátka s druhou pot i látkou obsahující roseanávaci místo s vazební afinitou k první protilátce a se zjistelným značením za podmínek, které zaručují vazbu na první protilátku za shora popsaných podmínek,

c) provádí se detekční stupeň k detekci druhé protilátky vázané na první protilátku,

d) porovávají se vzorky tkáně zjištěné detekcí ve stupni c) s referenčními vzorky zpracovanými podle stupně a) až c) získanými od jedinců vykazujících pročištěnou buňku, chromofobní, chromofílní nebo onkocytomický subtyp RCC. Určení subtypu RCC pro referenční vzorky se může provádět například způsobem, který popsal Thoenes a kol. (Path. Res, Pract 181, str, 125, 1986) a Stórkel a van der Berg (World J. Urol.13, str. 153, 1995).

Vynález se také týká soupravy (kit) obsahující složky k identifikací RCC a k diferenciaci subtypu RCC immunohistochemickými způspobymetodami. Těmito složkami mohou být alespoň

a) protilátky anti-CK 8, a anti-vimentin a/nebo anti-stathmin,

b) druhá protilátka obsahující zjistitelné značení zaměřené proti první protilátce.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Buněčná kultura a zpracování IFN-gama

HZ1257RC a MZ1940RC představují dobře definované lidské buněčné linie charakterizované jako ledvinové rakovinové buňky (RCC) typu pročištěných buněk (Seliger B. a kol., Cancer Res. 56, str. 1756 až 1760, 1996), přičemž MZ2733RC a MZ2733NN je• 0 •·0 «0 • 0 · 0 0 0 0 000 00 0» 0* jich odpovídající normální ledvinová tkáň byla nedávno prokázána u pacienta s primární RCC typu pročištěných buněk. Všechny linie RCC se udržují v prostředí DUEM doplněném 10 % zárodečného telecího séra, 2 mM glutaminu a 100 U/ml pěnici 11 inu/ 100 yg/ml streptomyci nu) . Zpracování buněk MZ1257RC IFN-gama se provádí 48 hodin v přítomnosti 300 U/ml rekombinantního IFN-gama (Imukin Boehringer, Ingelheim, Ingelheim, Německo).

Vzorky séra

Vzorky séra se izolují ze vzorků lidské cévní krve odebraných náhodným pacientům s diagnózou rakoviny ledvin nebo normálním dobrovolným dárcům krve po informovaném souhlasu každého jedince.

Příklad 2

Dvourozměrná gelová e1ektroforéza

Příprava vzorku

Buněčné linie se rozšíří na počet buněk 5xl0⁷ až lxlO⁸ na skupinu a sklidí se trypsinací. Pelety buněk se promyjí 3 až 4x ve fosfátem pufrované solance (PBS) načež se uloží do sterilních kryozkumavek jako suché buněčné pelety obsahující 5x10^* nebo lxlO⁷ buněk na zkumavku v kapalném dusíku až do dalšího použití. Buněčné pelety se resuspendují do lýzového pufru (7M močoviny, 2M thiomočoviny, 0,2M dimethylbenzylamoniumpropansulfonátu <NDSB), 1 % dithiotreitolu (DTT), 4 % 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamino]-1-propansulfonátu (CHAPS), 0,5 % pharmalytů a stopa barviva bromfenolová modř). Lyzát se prozvučí (3x4 minuty v ultrazvukové lázeniň) načež se pročišťuje odstředěním v mikroodstředivce (90 minut, 15 *C, otáčky 13 000/ min) .

• · · · » · · ·»· ·· ·# ·

Kvant i táce proteinu

Kvantitace proteinu se provede způsobem, který popsali Ramagli a Rodriguez, který umožňuje použiti původního Bradfordovova způsobu i v přítomnosti vysokých množství močoviny, ReplikáLy 2,5 yl až 10 yl podílů pročištěného 1yzátu se nastaví na konečný objem 10 jal a každý vzorek se smísí s 10 yl 0, ÍM kyseliny chlorovodíkové- Pak se přidá 80 yl ddlfeO do každého vzorku a vzorky se znovu míchají. Do každého replikovaného vzorku (100 yl) se přidá 3,5 ml 1^;3 zředěné barvivové reakční směsi (Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate) a směs se míchá mírným vířením. Po 5 minutách se měří absorbance při 595 nm v plastových kyvetách za použiti reakčního slopého vzorku (10 yl lýzový pufr, zpracovaný jak shora uvedeno) jako reference.

Nakládánít isoelektrické zaměření vzorků a vyvážení pruhů

Lysáty se nastaví čerstvým lýzovým pufrem na konečný objem vždy 350 yl, z nichž 340 yl se přenese do držáků pruhů IPGphor (Amersham Pharmacia Biotech). Immobiline DryStrip (hodnota pH 3 až 10, NL, 180 mm, Amarsham Pharmacia Biotech) rehydratizace a nakládání vzorků se provede v jednom kroku. 90 minut po přidání DryStrips do lyzátů se vzorkem nasáklé pruhy pokryjí 400 yl kapaliny Immobiline DryStrip Cover Fluid. Isoelektrické zaměření se provede jednotkou IPGphor (Amersham Pharmacia Bio« těch) při teplotě 20 C za použití následujících parametrů: rehydratizace dvě hodiny při 0 V; 10 hodin při 30 V; 1 hodina při 500 V; 1 hodina při 1000 V; 1 hodina při 5000 Ví 4 až 5 hodin při 8000 V, s přidáním až 36 000 až 38 000 Vh, jestliže cílené proteiny (složky s malou molekulovou hmotností) se oddělí ve druhém rozměru na gelech 16 % T/2,5 í£ C SDS-PAGE (poslední krok 4 hodiny při 8000 V) nebo 44 000 až 46 000 Vh, jestliže vzorek 1yzátu se oddělí na gelech 7 % T/2,5 % C SDS-PAGE zaměřujících složky s vysokou molekulovou hmotností (po• · • φ ♦ · ♦ • φ · · · « · • φ * · · · φ φφφ φφ ·· <* slední krok 5 hodin při 8000 V). Všechny kroky probíhají způsobem krok a podržení. Zaměřené pruhy se buď uloží při teplotě -80 C nebo se přímo podrobí vyvažování pruhů, což se provádí inkubací pruhů 15 minut v 10 ml vyvažovacího pufru (50 mM Tris-HCl hodnota pH 8,8, 6M močoviny, 30 % glycerolu, 2 % SDS) doplněného 1,5 % DTT následované 15 minutovou inkubací v 10 ml vyvažovacího pufru doplněného 4,8% jodacetamidem.

SDS-PAGE druhého rozměru

Separace SDS-PAGE se provádí pomocí systému ISO-DALT (Amersham Pharmacia Biotech) a probíhá v OAGE gelech polyakrylamid/piperazindi akrylam id (PDA). Gelová směs obsahuje 375 mM Tris/HCI, hodnota pH 8,8, 5 mM dithi on i či tanu sodného a 4 % glycerolu avšak žádný dodecylsulfát sodný (SDS). Čerstvě vyvážené pruhy Immobiline DryStrips se přenesou na povrch důkladně opláchnutých gelů PAGE. Imobilizace pruhů se dosáhne zapuštěním pruhů do 1% měkké taviči agarózy obsahující stopy markerového barviva (brontof enol ová modř pro gely 7 % T/2,5 % C: bromfenolová modř plus xylencyanol FF pro gely 16 % T/2,5 % C),

Gely se zpracovávají ve zkušebním pufru SDS-PAGE (25 mM Tris 192 mM glycinu, 0,1 % SDS1 za přísné kontroly teploty (<20 C) dokud barevné čelo nedosáhne konce gelu (gely 16 % T/2,5 % C probíhají dokud čelo barviva xylencyanol FF se 2 gelu neeluuje). Počáteční přenos vzorku z isoelektricky zaměřeného pruhu (IEF) do gelu se provádí při nízkém napětí (1 hodina při konstantním napětí 50 V), zatímco separace probíhá při konstantním vysokém napětí (100 až 140 V).

Vybarvování gelu

Gely se vybarvují kolodiální Coomassiovou modří. Všechny gely se snímají na obvyklém snímači (Hevlet Packard ScanJet 61000 při rozlišení 600 dpi a ukládají se jako obrazy TIFF. Gely, určené pro analýzy Western-Blot nebo gely obsahující • · φφφ «· • φ φφφ φφ proteinové skvrny, které byly podrobeny analýze hmotovou spektrometrií se pouze vybarví barvicím roztokem kolodiálni Coomassiové modři (10 % síranu amonného, 2 % kyseliny fosforečné,

0,1 % Coomassiové brilantní modři G-250, 20 % methanolu) tak se skipuje počáteční fixační krok a pak se odbarví extensivním propráním ve vodě (dd).

Příklad 3

Imraunoblotting

Pro analýzy immunoblotingem se kolodní gely 2-D PAGE přebarvené kolodiálni Coomassiové modří nanesou na ImmobiIon P memrány za použití systému ISO-DALT tank blotting (Amersham Pharmacia Biotech) pomocí zkušebního pufru SDS-PAGE doplněného 20 % methanolu jako transferového pufru a aplikací 500 Vhodin na transfer. Skvrny (blots) se pak inkubují jednu hodinu v blokujícím roztoku (140 mM chloridu sodného, 10 mM Tris/HCl, hodnota pH 7,4, 0,4 % Tveen 20, 5 % nízkotučného sušeného mléka a 10 % koňského séra) promyjí se dvakrát Tris-pufrovanou sclaňkou (TBS, 140 mM chloridu sodného, 10 mM Tris/HCl, hodnoD ta pH 7,4) a inkubují se přes noc při teplotě 4 C s kontrolním nebo s pacientovým sérem (20 ml na memránu) zředěným L20 v proti Iátkovém inkubačnim pufru (TBS, 0,1 % Tveen 20, 2 % nízkotučného sušeného mléka). Pak se membrány promývají 3x (vády 10 minut) v TBS, 0,4 % Tveen 20 a inkubují se půl hodiny až jednu hodinu při teplotě místnosti s křenovou peroxidázou (HRP)-konjugovanou sekundárně roztokem mAb (20 ml na membránu, králičí anti-lidský lgG, zředění 1 = 1000 v proti 1átkovém inkubačním pufru). Po 3 stupních promytí TBS se provede zviditelnění skvrn 0,4% Tveenem 20 s detekční chemi luminiscenční soupravou (Lumi-Líght Western Blotting Substráte, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim) podle výrobcových instrukcí a zaznamenají se na filmu scientific imaging (Kodak X-Omat Blue XB-1). Signál pro sesouhlasení skvrn se provede překrytím zobrazují-

• 9 9 · · cich filmů a odpovídajících gelových otisků.

Příklad 4

Hmotová spektrometrie

Pro hmotovou spektrometrii se imaunovybarvené proteinové skvrny vyříznou z duplikátového gelu vybarveného kolodiální Cooaassiovou modří. Každý vzorek se vnese do sterilní mikroreakční zkumavky, gelové proužky se inkubují 30 minut v 50 mM systému hydrogenuhličitan amonný/aceton i tr i 1 (60 íí/40 %) při teplotě 30 Ca výsledné supernatanty se odstraní a vyhodí. Gelové proužky se vysuší ve vakuu a uloží se při teplotě -80 e

C až do dalšího použití. Pro in-gel di gesci se každý vzorek napouští po dobu jedné hodiny ve 25 až 40 pl 50 mM hydrogenuhlíčitanu amonného obsahujícího 0,1 yg/ml trypsinu (Promega, Madison, WI, USA). Supernatanty se shromáždí, přidají se 25 μΐ podíly hydrogenuhličitanu amonného a vzorky se inkubují přes β

noc při teplotě 37 C. Peptidová extrakce se provede dvojnásobnou 20-minutovou inkubací vzorů v extrakčním pufru (voda/ kyselina trifluoroctová (TFA), objemově 50 %/50 %) a pak 2x po 20 minutách v pufru obsahujícím systém aceton i tri 1/TFA, objemově 50 %/50 . Supernatanty z každého vzorku se zkoncentrují na konečný objem přibližně 25 až 50 μΙ/vzorek a odsolí se činidlem ZipTips (Millipore) podle výrobcova protokolu. Jednomi 1 i 1 itrové podíly výsledných eluátů se nanesou na matrici MALDI a podrobí se přímo hmotové analýze peptidové mapy za použití přístroje Perseptive Biosystems Voyager RP-DE (Perseptive Biosystems, Framington, MA).

Příklad 5

Pacientovy a tkáňové vzorky použité k imunohistochemii

Pro imunohistochemické analýzy se nahodile získají chi 9 • ♦ ♦ « · * ♦ · · » · • tt ♦ · · · ··♦ ·· 9l1 91

1 1 1

9 rurgicky odejmuté vzorky tkání RCC a odpovídající normální ledvinové epitely od pacientů kteří prodělali radikální nefrektomii. Hiskvrnathologická klasifikace každého nádoru se provádí podle kriterií popsaných v literatuře (Thones a kol., Path. Res. Pract. 181, str. 125, 1986: StÓrkel a van der Berg, World J. Urol, 13, str. 153, 1995). Tato data obsahují rod, stav nemoci, invasi nádoru a zasažení mízních uzlin podle systému TNM (Tumor Node Metastasis). Celkem bylo shromážděno při resekcích 64 primárních ledvinových nádorů, včetně rakoviny pročištěných buněk a 13 chromofobních karcinomů a 64 autologových ledvinových vzorků. Tyto vzorky tkání byly fixovány formalinem a zapuštěny v parafinu.

Irounohi stochemi e

Imunohistochemické vybarvení se provádí mAbs antihumáním cytokeratinem 8 (klon pHll, DAKO, Hamburg, Německo, 2ředění 1:25), anti v i ment inem mAb (klon V9, DAKO, zředění 1:40) a antistathminem (B3745, Calbiochem, USA, zředění 1:500), Pro získání antigenu se konsekutivní sekce inkubují osm hodin a šest minut v citrátovém pufru v mikrovlnové troubě, s následujícím promytím Tris-pufrovanou solankou a přídavně se inkubují 10 minut v normálním vepřovém séru (zředění 1:10). Proužky se inkubují s primárními protilátkami jednu hodinu při teplotě místnosti. Detekce se provádí za použití LASB (Labeled Streptavidin Biotin)-peroxidázové soupravy a AEC (amino-9-ethylcarbazol) podle popisu (DAKO Diagnostica RmbH, Hamburg, Německo). Negativní kontroly se provádějí s vynecháním primární proti1átky.

Kvantitativní analýzy každého nádoru se provádějí podle následujícího bodového skóre:

• 0

000 00 • ·0 vzorek s % positivních Hodnocení Klasifikace nádorových buněk <5 >5 a <25 >26 a <50 >50

Průmyslová využitelnost negativní + slabě positivní + + středně positivní +++ silně positivní

Rakovinové signální znaky pro výrobu protilátek a protilátkových fúzovaných proteinů použitelných pro skrlning, diagnózu, prognózu a identifikaci subtypů karcinomu ledvinové buňky.

Claims

NÁROKY • * ··· • » · · · » • * · · · · · • · · ♦ · · ♦ »·· ·· ·· · a

/Ψ £M-pPoužití alespoň jednoho proteinu vybraného ze souboru zahrnujícího β-aktin, gama-akt in, α-tubulin, cytokeratin, cytokeratin 8, cytoske1etový tropomyosin, F-aktin čepičkující protein, hsp 27, hsp 60, hsp 70, hsp 90, grp 78 (BIP), gp 96, glutation-S-transferázu, glutationsynthetázu, superoxiddismutázu, thioredoxínperoxidázu, PA28ot, ubiquitínthiolesterázu, triosefosfátisomerázu, aldózreduktázu, enoyl-CoA-hydratážu, a-enolázu, annexin II, IV a V, stathmin, nikotinamid-N-methyltransferázu, B23/nukleofosmin a vimentin jako nádorového signálního znaku.
2. Použití proteinu podle nároku 1 a/nebo β-tubulinu jako nádorového signálního znaku pro rakovinu ledvinových buněk.
3. Způsob in vitro diagnózy a prognózy rakoviny u jedince, vyznačující se tím, že se za použiti imunotestu provádí detekce přítomnosti protilátky získané ze vzorku séra jedince a zaměřená na nádorový protein jako signální znak podle nároku 1 a 2, který je obsažen v séru.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že při imunotestu

a) se imobilizuje alespoň jeden nádorový markér na membráně nebo na substrátu,

b) uvádí se do styku membrána nebo substrát se vzorkem séra jedince,

c) zjišťuje se přítomnost protilátek specifických pro nádorový markér ve v2orku jedincova séra.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se t 1 m , že detekce specifické protilátky nádorového signálního znaku ve vzorku séra se provádí pomocí exogenně aplikované • · «»**·» • » » ···«·« · • · · ··· ··* ··· · ··· ·· ·* značené protilátky zaměřené na uvedenou sérovou protilátku.
6. Způsob podle nároku 3 až 5, vyznačující se t 1 m, že jedinec má rakovinu ledvinové buňky.
7. Diagnostický kit k provádění způsobu podle nároku 3 až 6,vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden nebo několik nádorových signálních znaků podle nároku 1 nebo 2.
8. Použití alespoň jednoho nádorového signálního znaku podle nároku 1 a 2 pro výrobu léčiva stimulujícího imunitní odezvu jedince.
9. Použití alespoň jedné protilátky nabo jejího fragmentu, který se imunospecificky váže na alespoň jeden nádorový signální znak podle nároku 1 nebo 2 pro výrobu léčiva k vyvolání reakce, která usnadňuje zabíjení nádorové buňky a/nebo brání jejímu růstu.
10. Použití podle nároku 9, přičemž protilátkou nebo jajím fragmentem je proti 1átkový fúzovaný protein.
11. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t i m , že obsahuje alespoň jeden nádorový signální znak podle nároku 1 nebo 2 a popřípadě farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo nebo excipient.
12. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m, že obsahuje alespoň jednu protilátku nebo její Fragmenty, které se imunospecificky váže na alespoň jeden nádorový signální znak podle nároku 1 nebo 2, a případně farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo nebo excipient.
13.

Farmaceutický prostředek podle nároku 12, vyzná • · *·**·· • · · ····*· · • * · · · · ···· ··· ·· ··· »· ·« ·· č u j í c í se t í m, že protilátkou nebo její· fragmentem je proti látkový fúzovaný protein.
14. Farmaceutický prostředek podle nároku 11 až 13, v yznačujicí se tím, že obsahuje přídavně chemoterapeutické činidlo.
15. Farmaceutická souprava, vyznačující se t i m , že obsahuje v prvním kontejneru farmaceutický prostředek podle nároku lí až 13, a v druhém kontejneru farmaceutický prostředek obsahující chenoterapeutické činidlo pro současné nebo časově posunuté podávání,
16. Použití alespoň jedné protilátky volené ze souboru zahrnujícího anti-cytokeratin 8, anti-vimentin a anti-stathin k identifikaci RCC a k diferenciaci subtypu RCC imunohistochemickými způsoby.
17. Způsob identifikace RCC a diferenciace subtypu RCC, vyznačující se tím, že se

a) inkubuje se vzorek tkáně z ledvinového epitelu získatelného od jedince s podezřením na RCC s alespoň jednou protilátkou volenou ze souboru zahrnujícího anticytokeratin 8, antivimentin a antistathmin (první protilátku) za podmínek zaručujících vazbu protilátky na vzorek tkáně,

b) uvádí se do styku první protilátka s druhou pot i látkou obsahující rozeznávací místo s vazební afinitou k první protilátce a se zjistelným značením za podmínek, které zaručují vazbu na první protilátku,

c) provádí se detekční stupeň k detekci druhé protilátky vázané na první protilátku,

d) porovávají se vzorky tkáně zjištěné detekcí ve stupni c) s referenčními vzorky získanými od jedinců vykazujících pročištěnou buňku, chromofobní, chromofi lni nebo onkocytoI • · 0 0 0 0 4 0 • 0 0 0 0 0 0 0 0 · 0 0 0 ··· « · · 0

000 00 000 00 00 00 mický subtyp RCC.
18. Kit pro identifikaci RCC a pro diferenciaci subtypů,

RCC, vyznačující se tím, že obsahuje

a) alespoň jednu protilátku podle nároku 16 (první protilátku)

b) alespoň jednu druhou protilátku obsahující zjistitelné značeni zaměřené proti první protilátce.