KR20230074553A - 인자 viii 대체 치료요법의 효능 증가를 위한 화합물 - Google Patents

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KR20230074553A
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오스카 슴즈카
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아블레비아 바이오테크 게엠베하
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Abstract

본 발명은 특히 인자 VIII 대체 치료요법에 의해 치료될 때 혈우병 A와 관련된 목적하지 않은 항체의 제거를 위한 화합물을 제공한다. 상기 화합물은 생물중합체 스캐폴드 및 6-13개 아미노산의 서열 길이를 갖는 인자 VIII로부터 유래된 적어도 2개의 펩타이드를 포함하며, 여기서 각각의 펩타이드는 독립적으로 인자 VIII의 아미노산 서열 중 6-아미노산 단편을 포함하고, 임의로 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 임의의 다른 아미노산에 의해 독립적으로 치환된다. 또한, 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물, 및 혈우병 A를 치료하는 방법이 제공된다.

Description

인자 VIII 대체 치료요법의 효능 증가를 위한 화합물
본 발명의 분야는 혈우병 A의 치료요법에 관한 것이다.
혈우병 A는 일반적으로 응고 인자 VIII의 결핍 또는 억제로 인해 혈액 응고가 손상된 질병으로 설명된다(Peters & Harris, 2018). 손상된 혈액 응고의 결과로, 상처에서 나온 혈액이 응고되지 않거나 천천히 응고되기 때문에 과도한 출혈이 자발적으로 또는 외상에 의해 이차적으로 발생할 수 있다. 자발적인 출혈은 에피소드에서 발생할 수 있으며 혈우병 A의 가장 흔한 징후 중 하나는 피하 및 근육 출혈일 수 있지만 위장관-, 비뇨생식기- 및 후복막 출혈일 수도 있다. 혈우병 환자들은 또한 혈우병을 유발할 수 있는 관절로의 출혈로 고통받을 수 있다. 두개내 출혈은 드물지만 생명을 위협할 수 있다(Ljung, 2007).
인자 VIII 결핍의 일반적인 원인은 인자 VIII의 부재 또는 감소로 이어지는 X-연관 유전자 결함이다(Konkle 등, 2000 [2017년 업데이트]). 혈우병 A는 지혈의 가장 흔한 유전성 장애로 간주되며 남성의 1/5000에서 발생한다. 여성은 이러한 돌연변이의 보인자이며 일반적으로 혈우병을 나타내지 않지만 때때로 인자 VIII가 감소한다.
고전적인 유전적 인자 VIII 결핍(종종 단순히 "혈우병 A"라고 함)과 달리 후천성 혈우병은 응고 인자(가장 일반적으로 인자 VIII, 이 경우 질병을 후천성 혈우병 A라고 함)에 대한 억제성 자가항체가 신체에서 생성되는 자가면역 질환이다(Franchini 등. 2017). 후천성 혈우병은 일반적으로 유전성 혈우병이나 출혈의 가족력과 관련이 없다.
치료요법의 선택으로서, 인자 VIII(factor VIII, FVIII) 대체 치료요법은 여전히 혈우병 A(선천성 및 후천성 모두) 환자의 표준 치료법이다. 일반적으로 인자 VIII(FVIII) 대체는 환자가 외인성으로 적용된 인자 VIII에 대한 인자 VIII -억제 또는 -중화 항체(억제제)를 생성하지 않는 한 효과적이다(O'Mahony, 2020; Pratt 등, 2020). 환자에 의한 중화 항체의 발달은 혈우병 A에서 가장 중요한 치료 합병증으로 간주되며 많은 혈우병 환자에서 발생한다. 중화 항체는 상당한 이환율과 삶의 질 저하를 유발하는 주요 부담이 될 수 있다. 이 합병증은 종종 복용량 증가, 탈감작(desensitization) 또는 심지어 면역억제를 필요로 한다(Giangrande 등, 2018).
'Lavigne-Lissalde 등.'은 항-FVIII 항체와 관련이 있으며 혈우병 환자의 항-FVIII 항체 문제를 해결하기 위한 다양한 접근법에 대해 논의한다.
'Ananyeva 등.'은 혈우병 A의 억제제와 관련하여 억제, 관리 및 예측의 메커니즘을 검토한다. 구체적으로, FVIII 억제제를 차단, 인간/돼지 FVIII 하이브리드로 우회, FVIII 반응성 CD4+ T 세포를 항클론형 항체로 중화, 범용 CD4+ 에피토프를 사용하여 FVIII에 대한 면역 관용을 유도하기 위한 펩타이드 디코이가 논의된다.
'Lacroix-Desmazes 등.'은 주로 전임상 단계에서 혈우병 환자의 FVIII 억제제 개발을 예방하거나 역전시키기 위한 개입을 설명한다. 공개된 관용원성 치료요법은 FVIII-Fc 융합 단백질의 개발, 나노입자-기반 치료요법, 경구 관용, 및 FVIII-특이적이 되도록 조절 또는 세포독성 T 세포의 조작을 포함한다.
'Villard 등.'은 인간 항-FVIII 억제제의 시험관내 및 생체내 활성을 차단하기 위해 파지 디스플레이에 의해 선택된 펩타이드 디코이(decoy)에 관한 것이다. 이러한 펩타이드(인간 항-FVIII 모노클로날 항체 BO2C11을 프로토타입 FVIII 억제제로 사용한 파지 디스플레이 라이브러리 스크린에서 발견됨)는 시험관내 및 생체내에서 BO2C11의 억제 활성을 중화시키는 것으로 개시되어 있다(BO2C11이 혈우병의 뮤린 모델에 BO2C11을 투여하기 전에 이러한 펩타이드와 사전-인큐베이션되는 경우).
WO 2014/072958 A1은 추가 항원 프로세싱 없이 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있고 FVIII 특이적 T 세포에 의해 인식되는 FVIII로부터 유도 가능한 펩타이드를 개시한다. 이러한 펩타이드는 추가의 말단 K 또는 G 잔기를 함유하는 FVIII-유래 서열을 포함할 수 있으며, 이는 21개 아미노산의 서열 길이를 초래한다. 이들 펩타이드는 혈우병 환자에서 FVIII에 대한 내성을 유도하거나 회복시키는 것으로 개시되어 있다.
중화 항체는 또한 자체적으로 단점이 있는 인자 VIII 대체 치료요법에 대한 새로운 대안에 많은 노력을 기울인 주된 이유이기도 하다. 예를 들어, WO 2011/060371 A2는 면역원성이 감소된 FVIII T 세포 에피토프 변이체에 관한 것이다. C2 도메인 및/또는 A2 도메인에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 갖는 변형된 FVIII 폴리펩타이드가 개시된다. 유전자 치료요법의 최근 발전은 인자 VIII 억제제의 문제를 해결할 것으로 예상되지 않는다(Patel, 2020).
본 발명의 목적은 인자 VIII 대체 치료요법의 효능 및/또는 안전성을 개선하기 위한(또는 혈우병 A에 대한 새로운 치료 옵션을 제공하기 위한) 화합물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 생물중합체 스캐폴드 및 6-13개 아미노산 서열 길이를 갖고, 바람직하게는 (인간) 인자 VIII로부터 유래된 적어도 2개의 펩타이드를 포함하는 (전형적으로 항체, 특히 인간 개체에 존재하는 인자 VIII에 특이적인 항체의 제거 또는 고갈을 위한) 화합물을 제공하고, 여기서 각각의 펩타이드는 독립적으로 (바람직하게는 인간) 인자 VIII의 아미노산 서열 중 6-아미노산 단편, 바람직하게는 7-, 더 바람직하게는 8-, 더욱 더 바람직하게는 9-, 더욱 더 바람직하게는 10-, 더욱 더 바람직하게는 11-, 훨씬 더 바람직하게는 12-, 가장 바람직하게는 13-아미노산 단편을 포함하고, 바람직하게는 UniProt 접근 코드 P00451에 의해 식별되며, 임의로 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 임의의 다른 아미노산에 의해 독립적으로 치환된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 이 약제학적 조성물은 개체, 바람직하게는 인간 개체에서 혈우병 A, 바람직하게는 선천성 혈우병 A 및/또는 후천성 혈우병 A의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
또 다른 측면에서, 약제학적 조성물은 개체, 바람직하게는 인간 개체에서 인자 VIII 대체 제품, 바람직하게는 인자 VIII, 보다 바람직하게는 인간 인자 VIII의 중화 및/또는 억제를 억제하기 위해 사용하기 위한 것이며, 바람직하게는 여기서 약제학적 조성물은 96시간 범위 내에 적어도 2회 투여되고, 상기 범위 이후 24시간 이내에 인자 VIII 대체 제품의 투여가 뒤따른다.
본 발명의 과정에서, 생체내에서 인자 VIII에 대한 항체를 고갈(또는 제거)시킬 수 있고 따라서 혈우병 A의 예방 또는 치료에 사용하기에 적합한 화합물이 개발되었다(단독, 특히 후천성 혈우병 A의 경우, 인자 VIII 대체 제품과 함께 사용).
또한, 놀랍게도 본 발명에서도 사용되는 접근법이 개체에서 바람직하지 않은 항체의 역가를 감소시키는데 특히 효과적이라는 것이 밝혀졌다. 특히, 이 화합물은 생체 내 모델에서 선택성, 역가 감소 기간 및/또는 역가 감소 수준과 관련하여 특히 우수한 결과를 달성하였다(실험예 참조).
하기 상세한 설명은 명시적으로 제외되지 않는 한 본 발명의 상기 측면 모두에 관한 것이다.
일반적으로, 항체는 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충을 포함하는 외부 유기체에 의한 감염으로부터의 보호를 제공하는, 체액성 면역계의 필수 구성 성분이다. 그러나, 자가면역 질환, 기관 이식(organ transplantation), 수혈(blood transfusion) 또는, 생물분자 약물 또는 유전자 전달 벡터(gene delivery vector)의 투여시를 포함하는 - 특정의 상황하에서, 항체는 환자 자신의 신체(또는 바로 투여된 외부 조직 또는 세포 또는 생물분자 약물 또는 벡터)를 표적화함으로써, 유해하거나 질환을 유발하는 실체가 될 수 있다. 특정의 항체는 또한 진단 영상용 프로브(probe)를 방해할 수 있다. 이하에서, 이러한 항체는 일반적으로 "목적하지 않은 항체(undesired antibody)" 또는 "바람직하지 않은 항체(undesirable antibody)"로 지칭된다.
거의 예외없이, 목적하지 않은 항체의 선택적인 제거는 임상 실시에 도달하지 않았다. 이는 현재 매우 적은 증상(indications)에 한정된다: 선택적인 항체 제거에 대한 공지된 기술 중 하나(광범위하게 확립되어 있지 않다고 해도)는 면역채집술(immunoapheresis)이다. 면역채집술(이는 면역글로불린을 제거한다)과는 대조적으로, 선택적인 면역채집술은 이의 항원 결합 부위에 대한 선택적인 결합을 기반으로 목적하지 않은 항체를 고갈시킬 체외의, 선택적인 항체-흡수제 카트릿지(antibody-absorber cartridge)를 통한 혈장의 여과를 포함한다. 선택적인 면역채집술은 예를 들면, ABO-양립할 수 없는 이식(ABO-incompatible transplantation) 전에 또는 수혈의학의 처방과 관련하여 혈액으로부터 항-A 또는 항-B 항체를 제거하는데 사용되어 왔다(Teschner 등). 선택적인 채집술은 또한 다른 처방, 예를 들면, 신경면역학적 처방(Tetala 등) 또는 중증 근무력증(myasthenia gravis)(Lazaridis 등)에서 실험적으로 적용되었으나, 임상 실무에서 아직 확인되지 않고 있다. 선택적인 면역채집술이 단지 주저하며 적용되는 한가지 이유는 이것이 비용 집약적이고 전문화된 의학적 보호를 필요로하는 복잡한 중재 과정이라는 사실이다. 더욱이, 목적하지 않은 항체를 신속하게 및 효율적으로 고갈시키는 방법이 선행 기술에 알려져 있지 않다.
채집술(apheresis)과는 별도로, 모리모토(Morimoto) 등은 펩타이드 및 펩티도미메틱 리간드(peptidomimetic ligand), 예를 들면, FLAG 펩타이드의 면역글로불린-결합 친화성을 증진시키기 위한 일반적으로 적용가능한 다가 스캐폴드(miltivalent scaffold)로서의 덱스트란을 개시하고 있다. 제WO 2011/130324 A1호는 세포 손상의 예방용 화합물에 관한 것이다. 제EP 3 059 244 A1호는 C-met 단백질 효능제에 관한 것이다.
언급한 바와 같이, 채집술은 체외적으로 적용된다. 대조적으로, 또한 바람직하지 않은 항체를 고갈시키기 위한 수개의 접근법이, 대부분이 자가항체 또는 항-약물 항체를 포함하는 특정의 자가면역 질환과 관련하여, 선행 기술에서 제안되었다:
'로렌츠(Lorentz) 등'은 적혈구를 항원-특이적인 T 세포의 고갈을 유발하는 면역허용원성 페이로드를 사용하여 반응계내(in situ)에서 충전시키는 기술을 개시하고 있다. 이는 모델 항원에 대해 목적하지 않은 체액성 반응의 감소를 궁극적으로 초래하는 것으로 추정된다. 유사한 시도는 피쉐샤(Pishesha) 등에 제안되어 있다. 이러한 시도에서, 적혈구는 표면에 공유결합으로 결합된 펩타이드-항원 작제물로 생체외(ex vivo)에서 로딩되고 일반적인 면역내성 유도를 위해 동물 모델로 재주사된다.
제WO 92/13558 A1호는 면역원의 특이적인 B 세포 결합능을 지니고, 개체에게 도입된 경우, 면역원에 대해 체액성 아네르기(humoral anergy)를 유도하는 안정한 비면역원성 중합체 및 면역원의 유사체의 접합체(conjugate)에 관한 것이다. 따라서, 이러한 접합체는 외부- 또는 자가-면역원에 의해 유발된 항체-매개된 병리학을 치료하는데 유용한 것으로 개시되어 있다. 이와 관련하여, 또한 제EP 0 498 658 A2호를 참고한다.
탓데오(Taddeo) 등은 오브알부민(ovalbumin) 모델 항원에 융합된 항-CD138 항체 유도체를 사용하여 항체를 생산하는 혈장 세포를 선택적으로 고갈시킴으로써 모델 항원에 대해 항체를 발현하는 이러한 세포내에서 선택적으로 시험관내(in vitro)에서 수용체 가교결합 및 세포 자살을 유도하는 것을 개시하고 있다.
Apitope International NV(벨기에)는 현재 내성을 유발함으로써, 항체 반응을 억제하는 항원 제시 세포(antigen presenting cell)로부터 공-자극성 분자의 낮은 수준의 발현을 초래할 수 있는 가용성의 면역허용원성 T-세포 에피토프 펩타이드를 개발 중에 있다(참고: 예컨대, Jansson 등). 이러한 생성물(product)은 현재 예컨대, 다발경화증(multiple sclerosis), 그레이브스 질환(Grave's disease), 중간 포도막염(intermediate uveitis), 및 다른 자가면역 병태(autoimmune condition) 뿐만 아니라 인자 VIII 내성에 있어서, 전임상 및 조기 임상 평가 하에 있다.
유사하게, 문헌 [Selecta Biosciences, Inc. (USA)]은 현재 소위 합성 백신 입자(Synthetic Vaccine Particles)(SVPs)에 의한 내성 유도 전략을 추구하고 있다. SVP-라파마이신은 조절성 T 세포를 선택적으로 유도함을 통해 목적하지 않은 항체 생산을 방지함으로써 내성을 유도하는 것으로 제안되어 있다(참고: Mazor 등)
민고찌(Mingozzi) 등은 항체를 흡수하지만 표적 세포로 도입할 수 없는 데코이(decoy) 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus)(AAV) 캡시드를 개시하고 있다.
제WO 2015/136027 Al호는 항-MAG(myelin-associated glycoprotein) IgM 항체에 결합하는 최소의 사람 천연 킬러-1(Human Natural Killer-1)(HNK-1) 에피토프를 제시하는 탄수화물 리간드, 및 진단시 뿐만 아니라 항-MAG 신경병증(neuropathy)의 치료를 위한 이의 용도를 개시하고 있다. 제WO 2017/046172 Al호는 신경학적 질환과 관련된 항-글리칸 항체에 의해 결합된 신경계의 글리코스핑고리피드(glycosphingolipid)가 포함하는 당에피토프를 모사(mimicking)하는 추가의 탄수화물 리간드 및 모이어티(moiety)를 개시하고 있다. 이러한 문헌은 또한 진단뿐만 아니라 항-글리칸 항체와 관련된 신경학적 질환의 치료를 위한 이러한 탄수화물 리간드/모이어티(moiety)의 용도에 관한 것이다.
제US 2004/0258683 Al호는 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus)(SLE), 예를 들면, 신장 SLE를 치료하는 방법 및 SLE를 지닌 개체에서 신장 플래어(renal flare)의 위험을 감소시키는 방법을 개시하고 있다. 신장 SLE를 포함하는 SLE를 치료하고 SLE를 지닌 개체에서 신장 플래어의 위험을 감소시키는 하나의 개시된 방법은 항-이중 가닥 DNA(dsDNA) 항체, 예를 들면, 에피토프-제시 담체(epitope-presenting carrier) 또는 에피토프-제시 원자가 플랫폼 분자 (epitope-presenting valency platform molecule) 형태에서와 같은 dsDNA 에피토프를 개인에게 투여함을 포함한다.
미국 특허 제5,637,454호는 자가면역 질환의 검정 및 치료에 관한 것이다. 치료에 사용된 제제는 확인된 항원성의, 분자 미미크리 서열(molecular mimicry sequence)에 대해 상동성인 펩타이드를 포함할 수 있다. 이러한 펩타이드는 환자에게 전달되어 특수한 특이성을 지닌 순환하는 항체의 양을 감소시킬 수 있음이 개시되어 있다.
제US 2007/0026396 A1호는 감기-내성을 유발하는, 항체에 대해 지시된 펩타이드, 및 이의 용도에 관한 것이다. 개시된 펩타이드를 사용함으로써, 목적하지 않은 자가항체의 생체내 또는 생체외 중화가 가능함이 교시되어 있다. 비교가능한 접근법은 제WO 1992/014150 A1호 또는 제WO 1998/030586 A2호에 개시되어 있다.
제WO 2018/102668 A1호는 질환-유발 또는 달리 목적하지 않은 항체의 선택적인 분해를 위한 융합 단백질을 개시하고 있다. 융합 단백질("Seldeg"로 명명됨)은 거의 중성 pH에서 세포 표면 수용체 또는 다른 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 표적화 구성성분, 및 표적화 구성성분에 직접 또는 간접적으로 융합된 항원 구성성분을 포함한다. 또한 표적 항원-특이적인 항체에 특이적으로 결합하도록 구성된 항원 구성성분을 갖는 Seldeg를 환자에게 투여함으로써 환자로부터 표적 항원-특이적인 항체를 고갈시키는 방법이 개시되어 있다.
제WO 2015/181393 A1호는 해바라기 트립신 억제제(sunflower_trypsin-inhibitor-)(SFTI-) 및 사이클로타이드-기반 스캐폴드(cyclotide-based 스캐폴드) 내로 이식된 펩타이드에 관한 것이다. 이러한 펩타이드, 예를 들면, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)에서 자가항체를 차단하고 염증(inflammation) 및 통증(pain)을 억제하는 것으로 밝혀진 SFTI 스캐폴드 내로 이식된 시트룰린화된 (citrullinated) 피브리노겐 서열은 자가면역 질환에 효과적인 것으로 개시되어 있다. 이러한 스캐폴드는 비-면역원성인 것으로 개시되어 있다.
에를랜드슨(Erlandsson) 등은 항-이디오타입 항체(anti-idiotypic antibody) 및 이의 유도체를 생체내(in vivo)에서 청소하는 것(clearing)을 개시하고 있다.
Berlin Cures Holding AG(독일)는 고 투여량에서 자가항체의 항원 결합 영역에 대한 경쟁적 결합에 의해 자가항체를 차단하는 것으로 제안된 확장성 심근병증(dilated cardiomyopathy) 및 다른 GPCR-자가항체 관련 질환(GPCR-autoantibody related disease)의 치료를 위한 정맥내 광범위한 스펙트럼의 중화제 DNA 압타머(neutralizer DNA aptamer)(참고: 예컨대, 제WO 2016/020377 A1호 및 제 WO 2012/000889 A1호)를 제시하였다. 일반적으로, 압타머는 아직 돌파구를 달성하지 않았으며 여전히 임상 개발의 예비 단계에 있다. 주요 관심은 여전히 생물안정성 및 생이용가능성, 구속, 예를 들면, 뉴클레아제 민감성, 독성, 작은 크기 및 신장 청소(renal clearance)이다. 선택적인 항체 길항제로서 이의 용도와 관련된 특수한 문제는 선천성 면역 반응을 자극하는 이의 경향성이다.
제WO 00/33887 A2호는 항체, 특히 질환-관련된 항체의 순환 수준을 감소시키는 방법을 개시하고 있다. 방법은 유효량의 에피토프-제시 담체를 개체에게 투여함을 개시하고 있다. 또한, 에피토프-제시 담체를 사용하는 항체의 순환하는 수준을 감소시키기 위한 생체외 방법이 개시되어 있다.
제US 6,022,544 A호는 포유동물에게 고 분자량 면역자극성 분자가 없는 비-면역원성 작제물을 투여함으로써 포유동물에서 목적하지 않은 항체 반응을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 작제물(contruct)은 약제학적으로 허용되는 비-면역원성 담체에 결합된 B 세포 막 면역글로불린 수용체 에피토프의 적어도 2개의 카피를 함유하는 것으로 개시되어 있다.
그러나, 선행 기술에 개시된 체내적으로 바람직하지 않은 항체를 고갈시키려는 접근법은 많은 단점을 갖는다. 특히, 이들 중 어느 것도 정식 임상용으로 승인되지 않았다.
본 발명의 화합물과 관련하여, 각각의 펩타이드는 독립적으로 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 중 6-, 바람직하게는 7-, 보다 바람직하게는 8-, 훨씬 더 바람직하게는 9-, 훨씬 더 바람직하게는 10-, 더욱 더 바람직하게는 11-, 더욱 더 바람직하게는 12-, 가장 바람직하게는 13-아미노산 단편을 포함하는 것이 바람직하다: STLRMELMGCDLNSCSMP (서열번호 1), IALRMEVLGCEAQDLY (서열번호 2), QYLNNGPQRIGRKYKKVRFM (서열번호 3), LYGEVGDTLLIIFK (서열번호 4), NGPQRIGRKYKKVRFM (서열번호 5), KSQYLNNGPQRIGRK (서열번호 6), PHGITDVRPLYSRRLP (서열번호 7), THYSIRSTLR (서열번호 8), KARLHLQGRSNAWRP (서열번호 9), QDGHQWTLFF (서열번호 10), NSLDPPLLTRYLRIH (서열번호 11), IHPQSWVHQIALR (서열번호 12), SSSQDGHQWTLFF (서열번호 13), MGCDLNSCS (서열번호 14), VHQIALRMEVLGCEAQDLY (서열번호 15), 및 KSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFM (서열번호 16). 이러한 맥락에서 특히 바람직한 에피토프는 SSSQDGHQWTLFF (서열번호 13), VHQIALRMEVLGCEAQDLY (서열번호 15), 및 KSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFM (서열번호 16)이다.
바람직하게는, 적어도 2개의 펩타이드는 펩타이드 P1 및 펩타이드 P2를 포함하고, 여기서 P1 및 P2는 독립적으로 서열번호 1 내지 16으로부터 선택된 아미노산 서열 중 6-, 바람직하게는 7-, 더 바람직하게는 8-, 더욱 더 바람직하게는 9-, 더욱 더 바람직하게는 10-, 훨씬 더 바람직하게는 11-, 특히 12-, 가장 바람직하게는 13-아미노산 단편을 포함하고, 여기서 P1 및 P2는 펩타이드 이량체 P1 - S - P2의 형태로 존재하고, 여기서 S는 비-펩타이드 스페이서이고, 여기서 펩타이드 이량체는 바람직하게는 링커를 통해 생물중합체 스캐폴드에 공유 결합된다.
본 발명의 화합물의 바람직한 구현예는 다음을 포함하는 화합물에 관한 것으로,
- 생물중합체 스캐폴드(biopolymer scaffold) 및 적어도
- 하기 화학식의 제1의 펩타이드 n-머(peptide n-mer):
P ( ― S ― P ) (n-1) 및
- 하기 화학식의 제2의 펩타이드 n-머:
P ( ― S ― P ) (n-1) ;
여기서, 각 경우에 독립적으로 P는 펩타이드고 S는 비-펩타이드 스페이서이고,
여기서, 각각의 펩타이드 n-머에 대해 독립적으로, n은 적어도 1, 바람직하게는 적어도 2, 더 바람직하게는 적어도 3, 특히 적어도 4의 정수이고,
여기서 각각의 펩타이드 n-머는 바람직하게는 각각 링커를 통해 생물중합체 스캐폴드에 결합된다. 이 문맥에서 "P"는 각각의 경우 독립적으로 본 발명의 화합물의 적어도 2개의 펩타이드 및/또는 상기 정의된 P1 및 P2에 대해 개시된 것과 동일한 방식으로 정의된다.
본 발명의 화합물의 바람직한 구현예에 따르면, 각각의 펩타이드(예를 들어, 상기 적어도 2개의 펩타이드, P1, P2 및/또는 P)는 독립적으로 서열번호 17 내지 126으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 임의의 다른 아미노산에 의해 독립적으로 치환된다. 대안적으로(또는 추가적으로), 각각의 펩타이드는 독립적으로 서열번호 17 내지 126으로부터 선택된 아미노산 서열 중 6-, 바람직하게는 7-, 더 바람직하게는 8-, 더 바람직하게는 9-, 더욱 더 바람직하게는 10-, 훨씬 더 바람직하게는 11-, 가장 바람직하게는 12-아미노산 단편을 포함하고, 임의로 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 임의의 다른 아미노산에 의해 독립적으로 치환된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 각각의 펩타이드(예를 들어, 상기 적어도 2개의 펩타이드, P1, P2 및/또는 P)는 독립적으로 서열번호 17 내지 126으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되며, 임의로 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 아미노산은 임의로 N-말단 및/또는 C-말단 시스테인 잔기를 갖는 임의의 다른 아미노산에 의해 독립적으로 치환된다.
다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물의 적어도 2개의 펩타이드의 각각의 아미노산 서열은 동일하다. 즉, 적어도 두 개의 펩타이드가 동일하다.
본 발명에 사용된 생물중합체 스캐폴드는 포유동물 생물중합체, 예를 들면, 사람 생물중합체, 비-사람 영장류 생물중합체, 양(sheep) 생물중합체, 돼지 생물중합체, 개 생물중합체 또는 설치류 생물중합체일 수 있다. 특히, 생물중합체 스캐폴드는 단백질, 특히 (비-변형된 또는 이의 아미노산 서열과 관련하여 비-변형된) 혈장 단백질이다. 바람직하게는, 생물중합체 스캐폴드는 포유동물 단백질, 예를 들면, 사람 단백질, 비-사람 영장류 단백질, 양 단백질, 돼지 단백질, 개 단백질 또는 설치류 단백질이다. 전형적으로, 생물중합체 스캐폴드는 바람직하게는 건강한(사람) 개인의 혈장내에서 순환하고 예컨대, 효율적으로 스캐빈징(scavenging)되거나 스캐빈징 수용체(scavenging receptor)에 의해 재순환될 수 있는, 예컨대, 골수 세포 또는 간 동모양 혈관 내피 세포에 존재하는 비-면역원성 및/또는 비-독성 단백질이다(참고: Sorensen 등, 2015).
특수한 선호도에 따라서, 생물중합체 스캐폴드는 바람직하게는 면역글로불린, 알파-글로불린, 알파2-글로불린 및 베타-글로불린, 특히 면역글로불린 G, 헤파토글로빈 및 트랜스페린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, (바람직하게는 사람) 글로불린이다. 특히 헤파토글로빈은, 실시예 5 내지 9에 나타낸 바와 같은, 수 개의 유리한 특성, 특히 유리한 안전성 프로파일을 갖는다.
생물중합체 스캐폴드는 또한 (바람직하게는 사람) 알부민, 헤모펙신, 알파-1-항트립신, C1 에스테라제 억제제, 락토페린 또는 전술한 단백질, 예를 들면, 글로불린 모두의 비-면역원성(즉, 치료될 개체에서 비-면역원성) 단편일 수 있다.
또 다른 선호도에서, 생물중합체 스캐폴드는 항-CD163 항체(즉, CD163 단백질에 특이적인 항체) 또는 이의 CD163-결합 단편이다.
사람 CD163(Cluster of Differentiation 163)은 리간드 결합을 담당하는 9개의 스캐빈저 수용체 시스테인 풍부(scavenger receptor cysteine-rich, SRCR) 도메인으로 구성된 세포외 부분을 가지는 130kDa 막 당단백질(이전에는 M130이라고 함) 및 프로토타입 클래스 I 스캐빈저 수용체이다. CD163은 대식세포 및 단핵구에 존재하는 세포내 이입 수용체(endocytic receptor)이며, 혈액에서 헤모글로빈/합토글로빈 복합체를 제거하지만 항염증 과정과 상처 치유에도 역할을 한다. CD163의 가장 높은 발현 수준은 조직 대식세포(예: 간의 쿠퍼 세포)와 비장 및 골수의 특정 대식세포에서 발견된다. 조직 및 세포 특이적인 발현과 바람직하지 않은 항체의 고갈과는 전혀 관련이 없기 때문에, CD163은 예컨대, 면역독소, 리포좀 또는 기타 치료 화합물 부류의 약물 전달을 위한 대식세포 표적으로 간주된다(Skytthe 등, 2020).
모노클로날 항-CD163 항체 및 이들이 결합하는 SRCR 도메인은 예를 들어 Madsen 등, 2004, 특히 도 7에 개시되어 있다. 추가의 항-CD163 항체 및 이의 단편은 예를 들어 제WO 2002/032941 A2호 또는 제WO 2011/039510 A2호에 개시되어 있다. 도메인 특이적 항체, 예를 들어 모노클로날 항체(mAb) EDhu1를 사용하여 적어도 2개의 구조적으로 다른 리간드 결합 부위가 매핑되었다 (Madsen 등, 2004 참조). 이 항체는 CD163의 세 번째 SRCR에 결합하고 CD163에 결합하는 헤모글로빈/합토글로빈과 경쟁한다. SRCR 도메인 1, 3, 7 및 9를 각각 표적으로 하는 Mac2-158, KiM8, GHI/61 및 RM3/1을 포함하여 CD163의 다른 도메인에 대한 수많은 다른 항체가 이전에 문헌에 기술되었다. 또한, 보존된 박테리아 결합 부위가 매핑되었고 특정 항체가 박테리아 결합을 억제할 수 있지만 헤모글로빈/합토글로빈 복합체 결합은 억제할 수 없으며 그 반대도 가능하다는 것이 입증되었다. 이는 CD163의 다양한 결합 방식과 리간드 상호작용을 지시한다 (Fabriek 등, 2009; 또한, 그 인용 참조).
바람직하지 않은 항체의 고갈과는 전혀 관련이 없이, 그의 생리학적 특성 때문에 CD163은 세포 특이적 약물 전달의 표적으로 제안되었다. 종양 관련 대식세포는 현재 CD163 표적화의 잠재적 이점이 탐구되는 주요 표적 중 하나이다. 놀랍게도, 수많은 종양 및 악성종양이 CD163 발현 수준과 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, 이는 종양 치료를 위한 이 표적의 사용을 뒷받침한다. 다른 제안된 응용에는 만성 염증 및 신경염증에서 항약물 결합체(ADC)에 의한 CD163 표적화가 포함된다 (Skytthe 등, 2020에서 검토됨). 따라서, 특히 덱사메타손 또는 스텔스 리포솜 접합체를 사용한 ADC에 의한 CD163 표적화는 현재 연구되고 있는 치료 원리를 나타낸다(Graversen 등, 2012; Etzerodt 등, 2012).
이러한 맥락에서, 항-CD163 항체가 생체 내에서 적용될 때 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 신속하게 내재화될 수 있음을 나타내는 참고 문헌이 있다. 이는 예를 들어 mAB Ed-2(Dijkstra 등, 1985; Graversen 등, 2012) 또는 mAB Mac2-158/KN2/NRY(Granfeldt 등, 2013)에 대해 나타났다. 본 발명(특정 실시예 섹션 참조)의 과정에서 이루어진 관찰과 조합된 이러한 관찰에 기초하여, 항-CD163 항체 및 CD163-결합은 바람직하지 않은 항체의 고갈/제거를 위한 매우 적합한 생물중합체 스캐폴드인 것으로 밝혀졌다.
수많은 항-CD163 항체 및 이의 CD163-결합 단편이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어 상기 참조). 이들은 본 발명의 생물중합체 스캐폴드로 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 본원 또는 제WO 2011/039510 A2호(본원에 참조로 포함됨)에 언급된 임의의 항-CD163 항체 또는 이의 단편은 본 발명에서 생체중합체 스캐폴드로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명 화합물의 생물중합체 스캐폴드는 제WO 2011/039510 A2호에 개시된 항체 Mac2-48, Mac2-158, 5C6-FAT, BerMac3, 또는 E10B10이고, 특히 제WO 2011/039510 A2호에 개시된 사람화 Mac2-48 또는 Mac2-158이다.
바람직한 구현예에서, 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은 제WO 2011/039510 A2호의 서열번호 11-13으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 서열을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역을 포함한다.
추가로 또는 이에 대안적으로, 바람직한 구현예에서, 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은 제WO 2011/039510 A2호의 서열번호 14-16으로 이루어진 그룹 또는 제WO 2011/039510 A2호의 서열번호 17-19로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은 제WO 2011/039510 A2호의 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변(VH) 영역을 포함한다.
추가로 또는 이에 대안적으로, 바람직한 구현예에서, 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은 제WO 2011/039510 A2호의 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은 제WO 2011/039510 A2호의 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변(VH) 영역을 포함한다.
추가로 또는 이에 대안적으로, 바람직한 구현예에서, 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은 제WO 2011/039510 A2호의 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은 제WO 2011/039510 A2호의 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변(VH) 영역을 포함한다.
추가로 또는 이에 대안적으로, 바람직한 구현예에서, 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은 제WO 2011/039510 A2호의 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 항-CD163 항체는 사람화 항체 또는 사람 항체, 비사람 영장류 항체, 양 항체, 돼지 항체, 개 항체 또는 설치류 항체와 같은 포유동물 항체일 수 있다. 구현예에서, 항-CD163 항체는 모노클로날일 수 있다.
선호도에 따라서, 항-CD163 항체는 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM에서 선택된다.
추가의 선호도에 따라서, CD163-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab)2, Fv, 단일 사슬 항체, 나노바디 및 항원 결합 도메인으로부터 선택된다.
CD163 아미노산 서열은 예를 들어 제WO 2011/039510 A2호(여기에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다. 본 발명의 맥락에서, 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은 바람직하게는 사람 CD163에 대해 특이적이고, 특히 제WO 2011/039510 A2호의 서열번호 28-31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다.
추가의 바람직한 구현예에서, 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은 CD163의 세포외 영역 (예를 들어, 사람 CD163의 경우: UniProt Q86VB7의 아미노산 42-1050, 서열 버전 2)에 대해, 바람직하게는 CD163의 SRCR 도메인에 대해, 보다 바람직하게는 CD163의 SRCR 도메인 1-9 (예를 들어 사람 CD163의 경우: 각각 UniProt Q86VB7의 아미노산 51-152, 159-259, 266-366, 373-473, 478-578, 583-683, 719-819, 824-926 및 929-1029, 서열 버전 2) 중 어느 하나에 대해, 심지어 보다 바람직하게는 CD163의 SRCR 도메인 1-3 (예를 들어, 사람 CD163에 경우, 각각 UniProt Q86VB7의 아미노산 51-152, 159-259, 266-366 및 373-473, 서열 버전 2) 중 어느 하나에 대해, 특히 CD163의 SRCR 도메인 1 (특히, 제WO 2011/039510 A2호의 서열번호 1-8 중 어느 하나의 아미노산 서열, 특히 제WO 2011/039510 A2호의 서열번호 1)에 대해 특이적이다.
특정 선호도에서, 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은 (바람직하게는 사람) CD163에 대한 결합에 대해 (바람직하게는 사람) 헤모글로빈-합토글로빈 복합체 (예컨대, ELISA에서)와 경쟁할 수 있다.
또 다른 특정 선호도에서, 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은 사람 CD163에 대한 결합에 대해 본원에 개시된 임의의 항-사람 CD163 mAb, 특히 제WO 2011/039510 A2호에 개시된 바와 같은 Mac2-48 또는 Mac2-158과 경쟁할 수 있다.
심지어 또 다른 특정 선호도에서, 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은 사람 CD163에 결합하기 위해
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYIT
YSGITNYNPSLKSQISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCVSGTYYFDYW
GQGTTLTVSS (서열번호 137) 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변(VH) 영역 및
SVVMTQTPKSLLISIGDRVTITCKASQSVSSDVAWFQQKPGQSPKPLIYYASNRY
TGVPDRFTGSGYGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCGQDYTSPRTFGGGTKLEIKRA (서열번호 138)의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변(VL) 영역을 가지는 항체와 (예컨대, ELISA에서) 경쟁할 수 있다.
경쟁적 결합 실험(예를 들어 ELISA를 기반으로 함)에 대한 상세한 사항은 당업자에게 공지되어 있고 예를 들어 제WO 2011/039510 A2호(본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다.
본 발명의 과정에서, 제WO 2011/039510 호에 개시된 바와 같은 항체 E10B10 및 Mac2-158의 에피토프는 환형 펩타이드 어레이를 사용하는 미세 맵핑에 의해 맵핑되었고, 여기서 펩타이드는 CD163으로부터 유래되었다. 이들 에피토프는 본 발명의 화합물의 항-CD163 항체(또는 이의 CD163-결합 단편)의 결합에 특히 적합하다.
따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은 7 내지 25개, 바람직하게는 8 내지 20개, 심지어 보다 바람직하게는 9 내지 15개, 특히 10 내지 13개의 아미노산으로 구성된 펩타이드에 특이적이며, 여기서 펩타이드는 아미노산 서열 CSGRVEVKVQEEWGTVCNNGWSMEA(서열번호 139) 또는 이의 7 내지 24개 아미노산 단편을 포함한다. 바람직하게는, 이 펩타이드는 아미노산 서열 GRVEVKVQEEW (서열번호 140), WGTVCNNGWS (서열번호 141) 또는 WGTVCNNGW (서열번호 142)를 포함한다. 보다 바람직하게는, 이 펩타이드는 EWGTVCNNGWSME (서열번호 143), QEEWGTVCNNGWS (서열번호 144), WGTVCNNGWSMEA (서열번호 145), EEWGTVCNNGWSM (서열번호 146), VQEEWGTVCNNGW (서열번호 147), EWGTVCNNGW (서열번호 148) 및 WGTVCNNGWS (서열번호 141)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 심지어 보다 바람직하게는, 이 펩타이드는 EWGTVCNNGWSME (서열번호 143), QEEWGTVCNNGWS (서열번호 144), WGTVCNNGWSMEA (서열번호 145), EEWGTVCNNGWSM (서열번호 146), VQEEWGTVCNNGW (서열번호 147), EWGTVCNNGW (서열번호 148) 및 WGTVCNNGWS (서열번호 141)로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되고, 임의로 N-말단 및/또는 C-말단 시스테인 잔기를 갖는다.
따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 항-CD163 항체 또는 이의 CD 163-결합 단편은 7 내지 25개, 바람직하게는 8 내지 20개, 심지어 보다 바람직하게는 9 내지 15개, 특히 10 내지 13개의 아미노산으로 구성된 펩타이드에 특이적이며, 여기서 펩타이드는 아미노산 서열 DHVSCRGNESALWDCKHDGWG (서열번호 149) 또는 이의 7 내지 20개 아미노산 단편을 포함한다. 바람직하게는, 이 펩타이드는 아미노산 서열 ESALW (서열번호 150) 또는 ALW을 포함한다. 보다 바람직하게는, 이 펩타이드는 ESALWDC (서열번호 151), RGNESALWDC (서열번호 152), SCRGNESALW (서열번호 153), VSCRGNESALWDC (서열번호 154), ALWDCKHDGW (서열번호 155), DHVSCRGNESALW (서열번호 156), CRGNESALWD (서열번호 157), NESALWDCKHDGW (서열번호 158) 및 ESALWDCKHDGWG (서열번호 159)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 심지어 보다 바람직하게는, 이 펩타이드는 ESALWDC (서열번호 151), RGNESALWDC (서열번호 152), SCRGNESALW (서열번호 153), VSCRGNESALWDC (서열번호 154), ALWDCKHDGW (서열번호 155), DHVSCRGNESALW (서열번호 156), CRGNESALWD (서열번호 157), NESALWDCKHDGW (서열번호 158) 및 ESALWDCKHDGWG (서열번호 159)로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되고, 임의로 N-말단 및/또는 C-말단 시스테인 잔기를 갖는다.
따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 항-CD163 항체 또는 이의 CD 163-결합 단편은 7 내지 25개, 바람직하게는 8 내지 20개, 심지어 보다 바람직하게는 9 내지 15개, 특히 10 내지 13개의 아미노산으로 구성된 펩타이드에 특이적이며, 여기서 펩타이드는 아미노산 서열 SSLGGTDKELRLVDGENKCS (서열번호 160) 또는 이의 7 내지 19개 아미노산 단편을 포함한다. 바람직하게는, 이 펩타이드는 아미노산 서열 SSLGGTDKELR (서열번호 161) 또는 SSLGG (서열번호 162)을 포함한다. 보다 바람직하게는, 이 펩타이드는 SSLGGTDKELR (서열번호 161), SSLGGTDKEL (서열번호 163), SSLGGTDKE (서열번호 164), SSLGGTDK (서열번호 165), SSLGGTD (서열번호 166), SSLGGT (서열번호 167) 및 SSLGG (서열번호 162)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 심지어 보다 바람직하게는, 이 펩타이드는 SSLGGTDKELR (서열번호 161), SSLGGTDKEL (서열번호 163), SSLGGTDKE (서열번호 164), SSLGGTDK (서열번호 165), SSLGGTD (서열번호 166), SSLGGT (서열번호 167) 및 SSLGG (서열번호 162)로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되고, 임의로 N-말단 및/또는 C-말단 시스테인 잔기를 갖는다.
펩타이드(또는 펩타이드 n-머)는 바람직하게는 예를 들면, 아민-대-설프하이드릴 링커 및 이작용성 NHS-PEG-말레이미드 링커 또는 당해 분야에 공지된 다른 링커와 같이 당해 분야에 공지된 (비-면역원성) 링커를 통해 생물중합체 스캐폴드에 공유결합으로 접합(또는 공유결합으로 결합)된다. 대안적으로, 펩타이드(또는 펩타이드 n-머)는 예컨대, 단백질과 펩타이드(이는 또한 본원에서 "링커"로 지칭된다) 사이의 이황화물 결합의 형성에 의해, 또는 비-공유결합성 조립 기술, 자발적 이소펩타이드 결합 형성, 또는 유전 코드 확장 기술을 통한 생체-직교 화학용 비천연 아미노산을 사용하여 에피토프 담체 스캐폴드(epitope carrier scaffold)에 결합시킬 수 있다(참고: Howarth 등 2018 및 Lim 등 2016).
본 발명의 화합물은 예컨대, 하나 또는 수개의 상이한 펩타이드(이는 본원에 개시된 바와 같이 펩타이드 n-머의 상이한 형태로 존재할 수 있다)의 적어도 2개, 바람직하게는 3 내지 40개 카피를 포함할 수 있다. 화합물은 1개 유형의 에피토프성 펩타이드(epitopic peptide)(다시 말해서: 항체-결합 펩타이드 또는 파라토프-결합 펩타이드) 중 하나의 유형을 포함할 수 있지만, 하나의 생물중합체 스캐폴드 분자에 결합된 에피토프성 펩타이드의 다양성은 예컨대, 8개 이하의 상이한 에피토프성 펩타이드의 혼합물일 수 있다.
전형적으로, 본 발명에 존재하는 펩타이드는 선택된 목적하지 않은 항체에 특이적으로 결합하므로, 이의 서열을 일반적으로 선택하여 최적화함으로써 이는 특이적인 결합을 제공하여 혈액으로부터 목적하지 않은 항체 고갈의 선택성을 보장한다. 이러한 목적을 위해, 상기 펩타이드의 펩타이드 서열은 전형적으로 전체 에피토프 서열 또는 목적하지 않는 항체 에피토프의 부위에 상응한다. 본 발명에 사용된 펩타이드는 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 위치를 교환하고, 예컨대, 고갈시킬 필요가 있는 목적하지 않은 항체에 대한 결합 친화성을 조절하도록 함으로써 추가로 최적화시킬 수 있다. 증가된 결합 친화성을 지닌 "미모토프(mimotopes)를 제공할 수 있고 당해 분야에 공지된 이러한 단일 또는 다수의 아미노산 치환 전략이 파아지 디스플레이 전략 (phage display strategies) 또는 펩타이드 미세배열(peptide microarray)을 사용하여 앞서 개발되었다. 다시 말해서, 본 발명에 사용된 펩타이드는 목적하지 않은 항체의 천연 에피토프 서열과 완전히 동일하지 않아야만 한다.
전형적으로, 본 발명의 화합물에 사용된 펩타이드(예컨대, 펩타이드 P 또는 Pa 또는 Pb 또는 P1 또는 P2)는 포유동물 단백질 속에 일반적으로 존재하는 20개 아미노산 중 하나 이상으로 구성된다. 또한, 펩타이드에 사용된 아미노산 레퍼토리는 해독후 변형된 아미노산으로 확장되어, 예컨대, 단백질의 항원성, 예를 들면, 해독후 변형 (post translational modifications), 특히 산화성 해독후 변형(참고: 예컨대, Ryan 2014) 또는 펩타이드 골격에 대한 변형(참고: 예컨대, Muller 2018), 또는 비-천연 아미노산에 대한 변형(참고: 예컨대, Meister 등, 2018)에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 변형은 또한 펩타이드에서 사용되어, 예컨대, 펩타이드와 목적하지 않은 항체의 가변 영역 사이의 결합 상호작용 및 특이성을 조정할 수 있다. 특히, 에피토프(및 따라서 본 발명의 화합물에 사용된 펩타이드)는 또한 예를 들면, 자가면역 질환에서와 같이 시트룰린(citrulline)을 함유할 수 있다. 또한, 펩타이드 서열내로 변형을 도입시킴으로써 HLA 분자에 대한 결합 성향을 감소시킬 수 있거나, 안정성 및 물리화학적 특성이 개선될 수 있거나 목적하지 않은 항체에 대한 친화성이 증가될 수 있다.
많은 경우에, 고갈시켜야 하는 목적하지 않은 항체는 올리고- 또는 폴리클로날(예컨대, 자가항체, ADA 또는 동종항체는 전형적으로 폴리- 또는 올리고 클로날이다)이고, 목적하지 않은(폴리클로날) 항체 에피토프는 표적 분자의 보다 큰 에피토프성 영역을 포함한다. 이러한 상황을 조정하기 위하여, 본 발명의 화합물은 2개 또는 수개의 에피토프성 펩타이드(다시 말해서: 항체-결합 펩타이드 또는 파라토프-결합 펩타이드)의 혼합물을 포함함으로써, 목적하지 않은 항체의 폴리클로날성(polyclonality) 또는 올리고클로날성(oligoclonality)을 조정하도록 한다.
본 발명의 이러한 폴리-에피토프성 화합물은 목적하지 않은 항체를 효과적으로 고갈시킬 수 있고 목적하지 않은 항체의 에피토프가 보다 큰 아미노산 서열 범위로 연장되는 경우에 모노-에피포트성 화합물보다 흔히 더 효과적이다.
이는 본 발명의 화합물에 사용된 펩타이드를 설계하여 이것이 고갈될 목적하지 않은 항체의 가변 영역에 의해 특이적으로 인식되도록 설계하는 경우에 유리하다. 본 발명에 사용된 펩타이드의 서열은 예컨대, 목적하지 않은 항체에서 미세한 에피토프 맵핑 기술(즉, 에피토프 웍스(epitope walks), 펩타이드 고갈 맵핑, 예를 들면, Carter 등, 2004, 및 Hansen 등, 2013에 기술된 바와 같은 펩타이드 배열을 사용한 아미노산 치환 스캐닝)을 적용함으로써 선택할 수 있다.
또한 본 발명에 사용된 펩타이드가 임의의 HLA 제I 부류 또는 HLA 제II 부류 분자(즉, 치료될 개체, 예컨대 사람의)에 결합하지 않아, 생체내에서 T-세포 수용체를 통한 제시(presentation) 및 자극을 방지함으로서 면역 반응을 유도하는 것이 매우 바람직하다. 항원-특이적인 면역학적 내성화 접근법과는 대조적으로 임의의 억제성(또는 자극성) T-세포 반응을 포함시키는 것은 일반적으로 바람직하지 않다. 따라서, T-세포 에피토프 활성을 가능한 한 최대로 피하기 위하여, 본 발명의 화합물의 펩타이드(예컨대, 펩타이드 P 또는 Pa 또는 Pb 또는 P1 또는 P2)는 바람직하게는 다음의 특성 중 하나 이상을 충족한다:
- 본 발명의 화합물에 사용된 펩타이드가 HLA 제II 부류 또는 제I 부류 분자에 결합할 가능성을 감소시키기 위하여, 펩타이드(예컨대, 펩타이드 P 또는 Pa 또는 Pb 또는 P1 또는 P2)는, 6 내지 13개 아미노산 길이가 바람직하다.
- 이러한 펩타이드가 HLA 제II 부류 또는 제I 부류 분자에 결합하는 가능성을 추가로 감소시키기 위하여, HLA 결합 예측 알고리즘, 예를 들면, NetMHCII-2.3(참고: Jensen 등 2018)에 의해 후보물 펩타이드 서열을 시험하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물에 사용된 펩타이드(예컨대, 펩타이드 P 또는 Pa 또는 Pb 또는 P1 또는 P2)는 적어도 500 nM의 (예측된) HLA 결합(IC50)을 갖는다. 보다 바람직하게는, HLA 결합(IC50)은 1000 nM 이상, 특히 2000 nM 이상이다(참고: 예컨대, Peters 등 2006). HLA 제I 부류 결합의 경향성을 감소시키기 위하여, NetMHCpan 4.0을 또한 예측에 적용시킬 수 있다(Jurtz 등 2017).
- 이러한 펩타이드가 HLA 제I 부류 분자에 결합할 가능성을 추가로 감소시키기 위하여, 문헌:
Figure pct00001
에 따라 10%의 배경 수준으로 설정할 수 있다. 바람직하게는, 따라서, 본 발명의 화합물에 사용된 펩타이드(예컨대, 펩타이드 P 또는 Pa 또는 Pb 또는 P1 또는 P2)는 NetMHCpan 알고리즘에 따라 3 이상, 바람직하게는 5 이상, 보다 바람직하게는 10 이상의 순위 값%(%Rank value)를 갖는다.
- 이러한 펩타이드가 HLA 제II 부류 분자에 결합할 가능성을 추가로 감소시키기 위하여, 당해 분야에서 일반적으로 사용된 시험관내 HLA-결합 검정, 예를 들면, 리폴딩 검정(refolding assay), iTopia, 펩타이드 구제 검정(peptide rescuing assay) 또는 배열-기반 펩타이드 결합 검정(array-based peptide binding assay)을 수행하는 것이 유리하다. 대안적으로, 또는 이외에, 예컨대, Gfeller 등 2016에 고찰된 바와 같이, LC-MS 기반 분석을 사용할 수 있다.
목적하지 않은 항체의 역가의 보다 강력한 감소를 위해, 본 발명에 사용된 펩타이드를 환형화(circularization)시키는 것이 바람직하다(참고: 또한 실시예 4). 따라서, 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 경우의 P는 환형화된 펩타이드이다. 바람직하게는 모든 경우의 P의 적어도 10%는 환형화된 펩타이드이거나, 보다 바람직하게는 모든 경우의 P의 적어도 25%는 환형화된 펩타이드이거나, 여전히 보다 바람직하게는 P의 모든 환형화된 경우의 적어도 50%는 환형화된 펩타이드이거나, 심지어 보다 바람직하게는 모든 경우의 P의 적어도 75%는 환형화된 펩타이드이거나, 여전히 심지어 보다 바람직하게는 모든 경우의 P의 적어도 90%는 환형화된 펩타이드이거나 심지어 모든 경우의 P의 적어도 95%는 환형화된 펩타이드이고, 특히 P의 모든 경우은 환형화된 펩타이드이다. 수개의 일반적인 기술이 펩타이드의 환형화에 이용가능하다(참고: 예컨대, Ong 등 2017). 본원에 사용된 바와 같은 "환형화된 펩타이드"는 예컨대 문헌(참고: Ong 등)에 개시된 바와 같이, 펩타이드 자체가 환형화된 것으로 이해될 수 있음은 말할 필요가 없다(그리고, 예컨대, 서열 길이가 13개 아미노산 보다 긴 환형 스캐폴드에서 이식되지 않음). 이러한 펩타이드는 또한 본원에서 사이클로펩타이드로 지칭될 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 사용된 스캐폴드의 양에 대해 목적하지 않은 항체의 역가의 보다 강력한 감소를 위해, 독립적으로, 펩타이드 n-머 각각에 대해, n은 적어도 2, 보다 바람직하게는 적어도 3, 특히 적어도 4이다. 일반적으로, 제조 공정에서 복잡성을 피하기 위하여, 독립적으로 각각의 펩타이드 n-머에 대해, n은 10 미만, 바람직하게는 9 미만, 보다 바람직하게는 8 미만, 심지어 보다 바람직하게는 7 미만, 여전히 심지어 보다 바람직하게는 6 미만, 특히 5 미만이다. 목적하지 않은 항체의 2가 결합을 통한 보다 높은 항원항체결합력(avidity)으로부터 유리하기 위해, 펩타이드 n-머 각각에 대해, n이 2인 것이 매우 바람직하다.
목적하지 않은 항체의 다가 결합을 위해, 펩타이드 이량체 또는 n_머가 소수성의, 구조적으로 유연하고, 면역학적으로 불활성이며, 무독성이고 임상적으로 승인된 스페이서, 예를 들면, (헤테로-)이작용성 및 -삼작용성 폴리에틸렌글리콜(PEG) 스페이서 (예컨대, NHS-PEG-말레이미드)에 의해 이격되어 있는 것이 유리하다 - 광범위한 PEG 쇄가 이용가능하며 PEG는 FDA에 의해 승인되어 있다. PEG 링커의 대안, 예를 들면, 면역학적으로 불활성이고 무독성인 합성 중합체 또는 글리칸이 또한 적합하다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 스페이서(예컨대, 스페이서 S)는 바람직하게는 PEG 분자 또는 글리칸으로부터 선택된다. 예를 들면, 스페이서, 예를 들어, PEG가 펩타이드 합성 동안 도입될 수 있다. 이러한 스페이서(예컨대, PEG 스페이서)는 예컨대, 10000 달톤의 분자량을 가질 수 있다. 명백하게, 본 발명의 맥락 내에서, 링커 각각을 통한 생물중합체 스캐폴드에 대한 펩타이드 n-머의 공유결합성 결합은 예를 들면, 링커를 펩타이드 n-머의 스페이서(예컨대, 펩타이드 n-머의 펩타이드 대신에)에 직접 결합시킴으로써 달성할 수 있다.
바람직하게는, 펩타이드 n-머 각각은 바람직하게는 링커 각각을 통해 생물중합체 스캐폴드에 공유결합으로 결합된다.
본원에 사용된 바와 같이, 링커는 예컨대, 디설파이드 브릿지(difulphide bridge) 및 PEG 분자로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 화합물의 추가의 바람직한 구현예에 따르면, P의 적어도 하나의 경우는 Pa이고/이거나 P의 적어도 하나의 경우는 Pb이다(여기서 Pa 및 Pb는 각각 독립적으로 P 및/또는 P1 및 P2에 대해 상기 정의된 바와 같은 펩타이드다). 바람직하게는, 각 경우에 독립적으로 P는 Pa 또는 Pb이다.
또한, 제1의 펩타이드 n-머에서, P의 각각의 경우이 Pa이고, 제2의 펩타이드 n-머에서, P의 각각의 경우가 Pb인 것이 바람직하다. 대안적으로, 또는 이외에, Pa 및/또는 Pb는 환형화되어 있다.
항체 역가를 감소시키기 위해서는 2가 결합이 특히 적합하다. 따라서, 바람직한 구현예에서,
제1의 펩타이드 n-머는 P a - S - P a 이고 제2의 펩타이드 n-머는 P a - S - P a 이거나;
제1의 펩타이드 n-머는 P a - S - P a 이고 제2의 펩타이드 n-머는 P b - S - P b 이거나;
제1의 펩타이드 n-머는 P b - S - P b 이고 제2의 펩타이드 n-머는 P b - S - P b 이거나;
제1의 펩타이드 n-머는 P a - S - P b 이고 제2의 펩타이드 n-머는 P a - S - P b 이거나;
제1의 펩타이드 n-머는 P a - S - P b 이고 제2의 펩타이드 n-머는 P a - S - P a 이거나;
제1의 펩타이드 n-머는 P a - S - P b 이고 제2의 펩타이드 n-머는 P b - S - P b 이다.
특히 효능을 증가시키기 위하여, 특히 자가면역 질환(일반적으로 폴리클로날 항체에 기초함, 상기 참조)에서, 바람직한 구현예에서 제1의 펩타이드 n-머는 제2의 펩타이드 n-머와는 상이하다. 유사한 이유로, 바람직하게는, 펩타이드 Pa는 펩타이드 Pb와는 상이하고, 바람직하게는 여기서 펩타이드 Pa 및 펩타이드 Pb는 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프 또는 동일한 에피토프의 2개의 상이한 에피토프 부분이다.
특히 폴리클로날 항체의 보다 우수한 표적화를 위해, 펩타이드 Pa 및 펩타이드 Pb가 동일한 아미노산 서열 단편을 동일한 아미노산 단편을 포함하는 경우가 유리하며, 여기서, 아미노산 서열 단편은 적어도 2개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 3개의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 4개의 아미노산, 여전히 보다 바람직하게는 적어도 5개의 아미노산, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 6개의 아미노산, 여전히 심지어 보다 바람직하게는 적어도 7개의 아미노산, 특히 적어도 8개의 아미노산 또는 심지어 적어도 9개의 아미노산의 길이를 갖는다.
또한, 사용된 스캐폴드의 양에 대해 목적하지 않은 항체의 역가의 보다 강력한 감소를 위해, 화합물은 다수의 상기 제1의 펩타이드 n-머(예컨대, 10개 또는 20개 또는 30개 이하) 및/또는 다수의 상기 제2의 펩타이드 n-머(예컨대, 10개 또는 20개 또는 30개 이하)를 포함한다.
사용된 스캐폴드의 양에 대해 목적하지 않은 항체 역가의 더 강력한 감소를 위해, 화합물은 또한 적어도
하기 화학식의 제3의 펩타이드 n-머(n-mer):
P ( ― S ― P ) (n-1) ,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 본원에서 상기(예를 들어, P, P1, P2 및/또는 Pa에 대해)에 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드고, S는 비-펩타이드 스페이서이고,
바람직하게는 여기에서 P의 각각의 경우는 Pc이고, 여기서 Pc는 본원에서 상기(예를 들어, P, P1, P2 및/또는 Pa에 대해) 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드고,
보다 바람직하게는 여기서 Pc는 환형이고;
바람직하게는 하기 화학식의 제4의 펩타이드 n-머:
P ( ― S ― P ) (n-1) ,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 본원에서 상기(예를 들어, P, P1, P2 및/또는 Pa에 대해)에 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드고, S는 비-펩타이드 스페이서이고,
바람직하게는 여기에서 P의 각각의 경우는 Pd이고, 여기서 Pd는 본원에서 상기(예를 들어, P, P1, P2 및/또는 Pa에 대해) 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드고,
보다 바람직하게는 여기서 Pd는 환형이고;
바람직하게는 하기 화학식의 제5의 펩타이드 n-머:
P ( ― S ― P ) (n-1) ,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 본원에서 상기(예를 들어, P, P1, P2 및/또는 Pa에 대해)에 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드고, S는 비-펩타이드 스페이서이고,
바람직하게는 여기에서 P의 각각의 경우는 Pe이고, 여기서 Pe는 본원에서 상기(예를 들어, P, P1, P2 및/또는 Pa에 대해) 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드고,
보다 바람직하게는 여기서 Pe는 환형이고;
바람직하게는 하기 화학식의 제6의 펩타이드 n-머:
P ( ― S ― P ) (n-1) ,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 본원에서 상기(예를 들어, P, P1, P2 및/또는 Pa에 대해)에 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드고, S는 비-펩타이드 스페이서이고,
바람직하게는 여기에서 P의 각각의 경우는 Pf이고, 여기서 Pf는 본원에서 상기(예를 들어, P, P1, P2 및/또는 Pa에 대해) 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드고,
보다 바람직하게는 여기서 Pf는 환형이고;
바람직하게는 하기 화학식의 제7의 펩타이드 n-머:
P ( ― S ― P ) (n-1) ,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 본원에서 상기(예를 들어, P, P1, P2 및/또는 Pa에 대해)에 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드고, S는 비-펩타이드 스페이서이고,
바람직하게는 여기에서 P의 각각의 경우는 Pg이고, 여기서 Pg는 본원에서 상기(예를 들어, P, P1, P2 및/또는 Pa에 대해) 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드고,
보다 바람직하게는 여기서 Pg는 환형이고;
바람직하게는 하기 화학식의 제8의 펩타이드 n-머:
P ( ― S ― P ) (n-1) ,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 본원에서 상기(예를 들어, P, P1, P2 및/또는 Pa에 대해)에 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드고, S는 비-펩타이드 스페이서이고,
바람직하게는 여기에서 P의 각각의 경우는 Ph이고, 여기서 Ph는 본원에서 상기(예를 들어, P, P1, P2 및/또는 Pa에 대해) 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드고,
보다 바람직하게는 여기서 Ph는 환형이고;
바람직하게는 하기 화학식의 제9의 펩타이드 n-머:
P ( ― S ― P ) (n-1) ,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 본원에서 상기(예를 들어, P, P1, P2 및/또는 Pa에 대해)에 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드고, S는 비-펩타이드 스페이서이고,
바람직하게는 여기에서 P의 각각의 경우는 Pi이고, 여기서 Pi는 본원에서 상기(예를 들어, P, P1, P2 및/또는 Pa에 대해) 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드고,
보다 바람직하게는 여기서 Pi는 환형이고;
바람직하게는 하기 화학식의 제10의 펩타이드 n-머:
P ( ― S ― P ) (n-1) ,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 본원에서 상기(예를 들어, P, P1, P2 및/또는 Pa에 대해)에 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드고, S는 비-펩타이드 스페이서이고,
바람직하게는 여기에서 P의 각각의 경우는 Pj이고, 여기서 Pj는 본원에서 상기(예를 들어, P, P1, P2 및/또는 Pa에 대해) 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드고,
보다 바람직하게는 여기서 Pj는 환형인 것;
을 포함할 수 있다.
펩타이드 Pc-Pj는 펩타이드 Pa 및 Pb(및/또는 펩타이드 P, P1, P2)에 대해 본원에 개시된 것과 동일한 특징(예를 들어, 서열) 중 하나 이상을 가질 수 있다. P, P1 및 P2에 대해 본원에 개시된 모든 바람직한 특징은 또한 펩타이드 Pa-Pj의 바람직한 특징이다. 또한 상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물이 포유동물, 바람직하게는 사람, 비-사람 영장류, 양, 돼지, 개 또는 설치류 내에서 비-면역원성인 경우가 매우 바람직하다.
본 발명의 맥락에서, 비-면역원성 화합물은 바람직하게는 생물중합체 스캐폴드(이것이 단백질인 경우) 및/또는 펩타이드(펩타이드 n-머의)가 NetMHCII-2.3 알고리즘에 의해 예측된 것으로서 HLA-DRB1_0101에 대해 100 nM 초과, 바람직하게는 500 nM 초과, 심지어 보다 바람직하게는 1000 nM 초과, 특히 2000 nM 초과의 IC50을 갖는 화합물이다. NetMHCII-2.3 알고리즘은 본원에 참고로 포함된 문헌: Jensen 등에 기술되어 있다. 알고리즘은 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII-2.3/ 하에 공공 이용가능하다. 심지어 보다 바람직하게는, 비-면역원성 화합물(또는 약제학적 조성물)은 생체내에서 어떠한 HLA 및/또는 MHC 분자에도 결합하지 않는다(예컨대, 포유동물 내에서, 바람직하게는 사람에서, 비-사람 영장류에서, 양에서, 돼지에서, 개에서 또는 설치류에서; 또는 치료할 개체에서).
추가의 선호도에 따라서, 화합물은 개체내, 바람직하게는 개체의 혈류내에서 적어도 하나의 항체의 체내 제거(또는 체내 고갈)용 및/또는 개체내, 바람직하게는 개체의 혈류내에서 적어도 하나의 항체의 역가의 감소용이다. 바람직하게는 항체는 항-인자 VIII 항체, 바람직하게는 항-인간 인자 VIII 항체이다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
구현예에서, 조성물은 복강내, 피하, 근육내 및/또는 정맥내 투여를 위해 제조한다. 특히, 조성물은 반복된 투여용이다(이는 전형적으로 비-면역원성 (non-immunogenic)이기 때문이다).
바람직하게는, 조성물 속의 펩타이드 (예를들어 P 또는 Pa 또는 Pb) 대 생물중합체 스캐폴드의 몰 비는 2:1 내지 100:1, 바람직하게는 3:1 내지 90:1, 보다 바람직하게는 4:1 내지 80:1, 심지어 보다 바람직하게는 5:1 내지 70:1, 여전히 심지어 보다 바람직하게는 6:1 내지 60:1, 특히 7:1 내지 50:1 또는 심지어 8:10 내지 40:1이다.
추가의 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 인자 VIII 대체 제품을 더 포함한다. 바람직하게는 상기 인자 VIII 대체 제품은 인자 VIII(또는 항혈우병 인자), 가장 바람직하게는 인간 인자 VIII이다. 이러한 인자 VIII 대체 제품은 예를 들어 상표명 Hemofil-M, Koate-DVI 및 Monoclate-P로 알려져 있다.
다른 양태에서, 본 발명의 화합물 및/또는 약제학적 조성물은 치료요법에 사용하기 위한 것이다.
바람직하게는, 화합물 및/또는 약제학적 조성물은 개체에서 혈우병 A의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는 혈우병 A는 선천성 혈우병 A 및/또는 후천성 혈우병 A이다.
바람직한 구현예에서, 개체는 인자 VIII 대체 치료요법을 추가로 받는다.
본 발명의 과정에서, 본 발명의 화합물에 의해 저하되는 바람직하지 않은 항체의 생체내 동역학은 전형적으로 매우 빠르며, 때때로 바람직하지 않은 항체의 완만한 반동이 뒤따른다는 것이 밝혀졌다. 따라서 화합물(또는 화합물을 포함하는 약제학적 조성물)은 96시간 범위 내, 바람직하게는 72시간 범위 내, 보다 바람직하게는 48시간 범위 내, 심지어 보다 바람직하게는 36시간 범위 내, 심지어 보다 바람직하게는 24시간 범위 내, 특히 18시간 범위 내 또는 심지어 12시간 범위 내에서 2회 이상 투여되는 경우가 특히 바람직하고, 특허 여기서 이 범위는 24시간 이내, 바람직하게는 12시간 이내 (그러나 전형적으로 적어도 6시간 후)에 본원에 기재된 바와 같은 인자 VIII 대체 제품의 투여로 이어진다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 0 시간에 인자 VIII 대체 제품을 투여하기 전 -24시간 및 -12시간에 투여될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 화합물은 개체에게 투여되고, 인자 VIII 대체 제품(바람직하게는 인자 VIII, 가장 바람직하게는 인간 인자 VIII)은 상기 화합물과 조합하여, 상기 화합물이 투여되기 전, 또는 상기 화합물이 투여된 후에 개체에게 투여되고, 바람직하게는 여기서 상기 조성물은 96-시간 범위 내, 바람직하게는 72-시간 범위 내, 더 바람직하게는 48-시간 범위 내, 더욱 더 바람직하게는 36-시간 범위 내, 훨씬 더 바람직하게는 24-시간 범위 내, 특히 18-시간 범위 내 또는 심지어 12-시간 범위 내 적어도 2회 투여되고; 특히 여기서 이 범위는 24시간 이내, 바람직하게는 12시간 이내 인자 VIII 대체 제품의 투여로 이어진다. 인자 VIII 대체 제품은 또한 본 발명의 화합물과 동일한 조성물(즉, 본 발명의 약제학적 조성물)에 존재할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물(본 발명의 화합물을 포함하고 임의로 또한 인자 VIII 대체 제품을 포함함)이 개체에게 투여되는 것이 바람직하고, 인자 VIII 대체 제품(바람직하게는 인자 VIII, 가장 바람직하게는 인간 인자 VIII)은 상기 조성물과 함께, 상기 조성물이 투여되기 전 또는 상기 조성물이 투여된 후에 개체에게 투여된다.
특히, 본 발명의 화합물(또는 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물)은 개체에서 인자 VIII 대체 제품, 바람직하게는 인자 VIII, 보다 바람직하게는 인간 인자 VIII의 중화 및/또는 억제의 억제에 사용하기 위한 것이며, 바람직하게는 여기서 상기 화합물(또는 약제학적 조성물)은 96-시간 범위 내, 바람직하게는 72-시간 범위 내, 보다 바람직하게는 48-시간 범위 내, 더욱 바람직하게는 36-시간 범위 내, 더욱 더 바람직하게는 24-시간 범위 내, 특히 18-시간 범위 내 또는 심지어 12시간 범위 내에 적어도 2회 투여되고; 특히 여기서 이 범위는 24-시간 이내, 바람직하게는 12-시간 이내 인자 VIII 대체 제품의 투여로 이어진다.
구현예에서, 본 발명의 화합물의 펩타이드(예를 들어, 펩타이드 P, P1, P2, 또는 펩타이드 Pa 및/또는 펩타이드 Pb)의 적어도 하나의 발생에 특이적인 하나 이상의 항체가 개체에 존재하며, 바람직하게는 여기서 상기 항체는 인자 VIII에 대해 특이적이다.
조성물이 개체에서 비-면역원성인 것이 매우 바람직하다(예컨대, 이는 보조제 또는 선천성 또는 적응성 면역계(adaptive immune system)를 자극시키는 면역자극성 물질, 예컨대, 보조제 또는 T-세포 에피토프를 포함하지 않는다).
본 발명의 조성물은 개체의 체중 kg당 화합물을 1 내지 1000 mg, 바람직하게는 2 내지 500 mg, 보다 바람직하게는 3 내지 250 mg, 심지어 보다 바람직하게는 4 내지 100 mg, 특히 5 내지 50 mg의 용량으로 투여될 수 있고, 바람직하게는 여기서 조성물은 반복적으로 투여된다. 이러한 투여는 복강내, 피하, 근육내 또는 정맥내일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서 혈우병 A를 개선 또는 치료하는 방법에 관한 것으로,
본 발명의 약제학적 조성물을 얻는 단계; 및
약제학적 조성물의 유효량을 개인에게 투여하는 단계를 포함한다. 개체에서 혈우병 A의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 화합물 및/또는 약제학적 조성물에 대해 개시된 모든 바람직한 특징은 또한 이 방법에 적용된다.
추가 측면에서, 본 발명은 개체에 존재하는 하나 이상의 항체를 제거(또는 고갈)하는 방법에 관한 것으로,
본원에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물을 수득하는 단계(여기서, 조성물은 개체에서 비-면역원성이고 여기서 개체내에 존재하는 하나 이상의 항체는 적어도 하나의 경우의 P에 대해, 또는 펩타이드 Pa 및/또는 펩타이드 Pb에 대해 특이적이다); 및
개체에게 약제학적 조성물을 투여하는 단계(특히 반복적으로 투여, 예컨대, 적어도 2회, 바람직하게는 적어도 3회, 보다 바람직하게는 적어도 5회 투여)를 포함한다.
바람직하게는, 하나 이상의 항체는 인자 VIII, 바람직하게는 인간 인자 VIII에 대해 특이적이다.
바람직하게는, 생물중합체 스캐폴드는 개체와 관련하여 자기유래 (autologous)이고, 바람직하게는 여기서 생물중합체 스캐폴드는 자기유래 단백질이다(즉, 개체가 마우스인 경우 쥐 알부민이 사용된다).
한 구현예에서, 개체에게 인자 VIII 대체 제품이 투여되고, 개체에 존재하는 하나 이상의 항체가 상기 인자 VIII 대체 제품에 특이적이며, 바람직하게는 상기 인자 VIII 대체 제품의 투여는 약제학적 조성물의 상기 투여 이전, 동시 및/또는 이후이다. 바람직하게는 인자 VIII 대체 제품은 인자 VIII, 바람직하게는 인간 인자 VIII이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 펩타이드에 관한 것으로, 여기서 펩타이드는 본 발명의 화합물 P, P1, P2, Pa, 또는 Pb의 적어도 2개의 펩타이드 중 임의의 하나에 대해 본원에 개시된 바와 같이 정의된다.
특정 구현예에서, 이러한 펩타이드는 대체 치료요법, 유전자 치료요법 또는 후천성 혈우병 A와 같은 인자 VIII에 대한 다른 순환 (자가)항체에 의해 유도된 항약물 항체와 같은, 인자 VIII에 대한 중화 항체의 진단 유형화 및 분석을 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 펩타이드는 예를 들어 진단 항-인자 VIII 타이핑 또는 스크리닝 장치 또는 키트 또는 절차의 일부로, 동반 진단으로, 환자 계층화 또는 치료 과정에서 중화 항체 수준을 모니터링하기 위해 사용된다.
추가의 양태에서, 본 발명은
- 샘플을 본원에 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드(예컨대, P, P1, P2, Pa, 또는 Pb에 대해)와 접촉시키는 단계, 및
- 샘플 내 항-인자 VIII 항체의 존재 및/또는 농도를 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서 항-인자 VIII 항체를 검출 및/또는 정량화하는 방법에 관한 것이다.
당업자는 생물학적 샘플에서 항체를 검출 및/또는 정량화하는 방법에 익숙하다. 이 방법은 예를 들어 샌드위치 분석, 바람직하게는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 또는 SPR(surface plasmon resonance) 분석일 수 있다.
바람직하게는, 펩타이드는 고체 지지체, 바람직하게는 ELISA 플레이트 또는 SPR 칩 또는 전기화학, 형광, 자기, 전자, 중력 또는 광학 생체변환기를 갖춘 바이오센서 기반 진단 장치 상에 고정된다. 대안적으로 또는 이에 더하여, 펩타이드는 리포터 또는 단백질 단편 보완 분석(PCA)에 적합한 리포터 단편과 같은 리포터 단편에 커플링될 수 있다; 예컨대, Li 등, 2019, 또는 Kanulainen 등, 2021 참조.
바람직하게는, 샘플은 포유동물, 바람직하게는 사람으로부터 수득된다. 바람직하게는 샘플은 혈액 샘플, 바람직하게는 전혈, 혈청 또는 혈장 샘플이다.
본 발명은 또한 진단 분석, 바람직하게는 상기 본원에 개시된 바와 같은, 바람직하게는 ELISA에서, 본원에 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드(예컨대, P, P1, P2, Pa, 또는 Pb에 대한)의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 바람직하게는 고체 지지체 상에 고정된, 본원에 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드(예컨대, P, P1, P2, Pa, 또는 Pb에 대한)를 포함하는 진단 장치에 관한 것이다. 바람직하게는, 고체 지지체는 ELISA 플레이트 또는 표면 플라즈몬 공명 칩이다. 다른 바람직한 예에서, 진단 장치는 전기화학적, 형광, 자기, 전자, 중량 측정 또는 광학 생체변환기를 갖는 바이오센서 기반 진단 장치이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 진단 장치는 측면 유동 분석이다(lateral flow assay).
본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같이 정의된 (예컨대, P, P1, P2, Pa 또는 Pb) 펩타이드를 포함하는 진단 키트, 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 진단 장치에 관한 것이다. 바람직하게는 진단 키트는 버퍼, 시약, 설명서의 그룹에서 선택된 하나 이상을 더 포함한다. 바람직하게는 진단 키트는 ELISA 키트이다.
추가의 양태는 본원에 개시된 바와 같이 정의된 펩타이드(예를 들어, P, P1, P2, Pa 또는 Pb에 대해)를 포함하는 채집 장치에 관한 것이다. 바람직하게는 펩타이드는 고체 담체 상에 고정된다. 채집 장치가 본원에 개시된 바와 같이 정의된(예를 들어, P, P1, P2, Pa 또는 Pb에 대해) 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 보다 바람직하게는 적어도 4개의 상이한 펩타이드를 포함하는 경우 특히 바람직하다. 바람직한 구현예에서 고체 담체는 본 발명의 화합물을 포함한다.
바람직하게는, 고체 담체는 혈액 또는 혈장 흐름과 접촉할 수 있다. 바람직하게는, 고체 담체는 멸균되고 발열원이 없는(pyrogen-free) 컬럼이다.
본 발명의 맥락에서, 개선된 생물이용능(bioavailability)을 위해, 본 발명의 화합물은 25℃에서 적어도 0.1 μg/ml, 바람직하게는 적어도 1 μg/ml, 보다 바람직하게는 적어도 10 μg/ml, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 100 μg/ml, 특히 적어도 1000 μg/ml의 수중 용해도를 갖는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "예방하는" 또는 "예방"은 환자 또는 대상체 또는 개체가 이러한 질환 상태(disease state) 또는 병태(condition)에 걸릴 위험에 취약하게 되는 경우, 환자 또는 대상체에서의 발생으로부터 질환 상태 또는 병태를 완벽하게 또는 거의 완벽하게 또는 적어도 (바람직하게는 유의적인) 정도로 정지시키는 것을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 (전형적으로 수성) 액제, (전형적으로 수성) 현탁제(suspension) 또는 (전형적으로 수성) 유제(emulsion)로서 제공된다. 본 발명의 약제학적 조성물에 적합한 부형제는 당해 분야의 기술자에게 공지되어 있고, 본 명세서의 판독시, 예를 들면, 물(특히 주사용수), 염수, 링커액(Ringer's solution), 덱스트로즈 용액, 완충제, 행크 용액(Hank solution), 비히클 형성 화합물(예컨대, 지질), 고정 오일(fixed oil), 에틸 올레이트, 염수 중 5% 덱스트로즈, 등장성 및 화학 안정성을 향상시키는 물질, 완충제 및 방부제이다. 다른 적합한 부형제는 환자(또는 개체)에 대해 유해한 환자(또는 개체)에서 항체의 생산을 자체적으로 유도하지 않는 임의의 화합물이다. 예에는 잘 견딜 수 있는 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산 및 아미노산 공중합체가 있다. 이러한 약제학적 조성물은 (약물로서) 당해 분야의 기술자에게 공지된 적절한 과정을 통해(본 명세서의 판독시) 이를 필요로 하는 환자 또는 개체(즉, 본원에서 언급한 질환 또는 병태를 갖거나 이로 발전할 위험을 가진 환자 또는 개체)에게 투여될 수 있다. 상기 약제학적 조성물의 바람직한 투여 경로는 특히 복강내, 피하, 근육내 및/또는 정맥내 투여를 통한 비경구 투여이다. 비경구 투여를 위해, 본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 상기 정의한 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화된, 주사가능한 투여량 단위형, 예컨대, 액제(전형적으로 수성 액제), 현탁제 또는 유제로서 제공된다. 그러나, 투여량 및 투여방법은 치료될 개체 환자 또는 개체에 의존한다. 상기 약제학적 조성물은 다른 생물학적 투여량 요법(regimen)으로부터 공지된 임의의 적합한 투여량으로 투여될 수 있거나 주어진 개체에 대해 구체적으로 평가 및 최적화될 수 있다. 예를 들면, 활성제는 약제학적 조성물 속에 1 mg 내지 10 g, 바람직하게는 50 mg 내지 2 g, 특히 100 mg 내지 1 g의 양으로 존재할 수 있다. 일반적인 투여량은 또한 환자의 체중 kg을 기반으로 측정할 수 있고, 예를 들면, 바람직한 투여량은 0.1 mg 내지 100 mg/kg 체중, 특히 1 내지 10 mg/kg 체중(투여 기간 당)의 범위이다. 투여는 예컨대, 1일 1회, 격일에 1회, 주당 1회 또는 2주당 1회일 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여 방식은 비경구 투여이므로, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 바람직하게는 액체이거나 멸균, 탈이온화 또는 증류수 또는 멸균 등장성 인산염 완충된 염수(PBS)와 같은 액체 속에 용해될 준비가 되어 있다. 바람직하게는, 이러한 조성물 1000 μg(무수 중량)은 0.1 내지 990 μg, 바람직하게는 1 내지 900μg, 보다 바람직하게는 10 내지 200μg의 화합물, 및 임의로 1 내지 500 μg, 바람직하게는 1 내지 100 μg, 보다 바람직하게는 5 내지 15 μg(완충제) 염(바람직하게는 최종 용적으로 등장성 완충제를 수득하기 위하여), 및 임의로 0.1 내지 999.9 μg, 바람직하게는 100 내지 999.9 μg, 보다 바람직하게는 200 내지 999 μg의 다른 부형제를 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직하게는, 이러한 무수 조성물 100 mg은 멸균된, 탈이온수/증류수 또는 멸균 등장성 인산염 완충된 염수(PBS) 속에 용해되어 0.1 내지 100 ml, 바람직하게는 0.5 내지 20 ml, 보다 바람직하게는 1 내지 10 ml의 최종 용적을 생성한다.
본원에 기술된 활성제 및 약물이 염 형태(즉, 활성제의 약제학적으로 허용되능 염)로 또한 투여될 수 있음은 기술자에게 명백하다. 따라서, 본원의 활성제의 임의의 언급은 또한 이의 임의의 약제학적으로 허용되는 염 형태를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물에 대해 사용된 펩타이드의 화학적 합성 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 물론, 재조합 방법을 사용하여 펩타이드를 생산하는 것이 또한 가능하다. 펩타이드는 미생물, 예를 들면,세균, 효모 또는 진균, 진핵 세포, 예를 들면, 포유동물 또는 곤충 세포, 또는 재조합 바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 심리키 포레스트 바이러스(Simliki forest virus), 바쿨로바이러스, 신드비스 바이러스(sindbis virus) 또는 센다이 바이러스(sendai virus)에서 생산될 수 있다. 펩타이드를 생산하기에 적합한 세균은 이. 콜라이(E. coli), 비. 서브틸리스(B. subtilis) 또는 이러한 펩타이드를 발현할 수 있는 임의의 다른 세균을 포함한다. 본 발명의 펩타이드를 발현하기에 적합한 효모 세균은 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 시크조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 칸디다(Candida), 피키아파스토리스(Pichiapastoris) 또는 펩타이드를 발현할 수 있는 임의의 다른 효모를 포함한다. 상응하는 수단 및 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 또한, 재조합적으로 생산된 펩타이드를 단리 및 정제하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있고 예컨대, 겔 여과, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등을 포함한다.
유리하게는, 시스테인 잔기를 N- 및/또는 C-말단에서 펩타이드에 가하여 특히 생물중합체 스캐폴드에 대한 커플링을 촉진시킨다.
상기 펩타이드의 단리를 용이하게 하기 위하여, 융합 폴리펩타이드를 제조할 수 있고 여기서 펩타이드는 친화성 크로마토그래피에 의한 단리를 가능하도록 하는 이종 폴리펩타이드에 해독적으로 융합(공유결합으로 연결)된다. 대표적인 이종 폴리펩타이드는 His-Tag(예컨대, His6; 6 히스티딘 잔기), GST-Tag(글루타티온-S-트랜스퍼라제) 등이다. 융합 폴리펩타이드는 펩타이드의 정제를 촉진할 뿐만 아니라 정제 단계 동안 펩타이드의 분해를 방지할 수 있다. 정제 후 이종 폴리펩타이드를 제거하는 것이 요구되는 경우, 융합 폴리펩타이드는 펩타이드와 이종 폴리펩타이드 사이의 접합(junction)에서 절단 부위를 포함할 수 있다. 절단 부위는 이러한 부위에서 아미노산 서열에 대해 특이적인 효소(예컨대, 프로테아제)로 절단되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
생물중합체 스캐폴드에 펩타이드/펩타이드 n-머를 연결(예컨대, 헤테로이작용성 화합물, 예를 들면, GMBS 및 물론 또한 문헌: "Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson에 기술된 바와 같은 다른 것)시키는데 사용되거나 본 발명의 맥락에서 펩타이드에 스페이스를 접합시키는데 사용된 커플링/접합 화학은 또한 당해 분야의 기술자에게 공지된 반응으로부터 선택될 수 있다. 생물중합체 스캐폴드 자체는 재조합작으로 생산될 수 있거나 천연 공급원으로부터 수득될 수 있다.
본 발명의 모든 양태의 맥락에서, 인자 VIII은 바람직하게는 인간 인자 VIII, 가장 바람직하게는 UniProt 접근 코드 P00451로 식별되는 인자 VIII이다.
본 발명의 모든 양태에서 혈우병 A는 바람직하게는 인자 VIII 결핍을 의미한다. 바람직하게는 혈우병 A는 선천성 혈우병 A 및/또는 후천성 혈우병 A이다.
본 출원의 맥락에서 언급되는 "인자 VIII 대체 제품"은 바람직하게는 인자 VIII, 특히 인간 인자 VIII이다. 바람직하게는, 인자 VIII 대체 제품은 재조합 (인간) 인자 VIII이다. 인자 VIII는 항혈우병 인자라고도 한다. 인자 VIII 대체 제품은 예를 들어 Hemofil-M, Koate-DVI 및 Monoclate-P라는 상표명으로 알려져 있다.
여기서, "분자 B에 대해 특이적인 분자 A"에서와 같이 용어 "~에 대해 특이적인"은 분자 A가 개체의 체(body)내 다른 분자와 비교하여 분자 B에 대한 결합 선호도를 갖는다. 전형적으로, 이는 분자 A(예를 들면, 항체)는 (즉, 보다 더 강한") 1000 nM 미만, 바람직하게는 100 nM 미만, 보다 바람직하게는 50 nM 미만, 심지어 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 특히 5 nM 미만인 분자 B(예를 들면, 항원, 특이적으로 이의 결합 에피토프)와 관련하여 해리 상수(또한 "친화성"으로 불림)를 갖는다.
여기서, "UniProt"은 Universal Protein Resource를 지칭한다. UniProt은 단백질 서열에 대한 포괄적인 자원 및 주석 데이타이다. UniProt는 유럽 생물정보 협회(European Bioinformatics Institute)(EMBL-EBI), SIB 스위스 생물정보 협회(SIB Swiss Institute)와 단백질 정보 자원(Protein Information Resource)(PIR) 사이의 공동 작업체이다. 3개의 협회에 걸쳐 100명 이상의 사람들이 상이한 업무, 예를 들면, 데이타베이스 큐레이션(database curation), 소프트웨어 개발 및 지원(software development and support)을 통해 포함된다. Website: https://www.uniprot.org/
UniProt 데이타베이스내 기입은 이의 수탁 코드(본원에서 예컨대, "UniProt 수탁 코드" 또는 요약하면 "UniProt"에 이은 수탁 코드로 지칭됨), 일반적으로 6개의 영숫자 문자(alphanumeric letter)의 코드(예컨대, "Q1HVF7")에 의해 확인된다. 달리 구체화되지 않는 경우, 본원에 사용된 수탁 코드는 UniProt의 단백질 지식베이스(UniProtKB)내 기입을 지칭한다. 달리 기술하지 않는 한, 본원에 지칭된 모든 기입에 대한 UniProt 데이타베이스 상태는 2020년 9월 22일부터이다(UniProt/UniProtKB Release 2020_04).
본원의 맥락에서, 서열 변이체(UniProt에서 "천연 변이체"로서 지정됨)는 UniProt 데이타베이스 기입을 지칭하는 경우 명확하게 포함된다.
참고 폴리펩타이드 또는 단백질 서열와 관련하여 "아미노산 서열 동일성(sequence identity) 퍼센트(%)" 또는 "X% 동일한"(예를 들면, "70% 동일한")은 필요한 경우 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위하여, 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 및 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 참고 폴리펩타이드 서열내 아미노산 잔기와 동일한 후보물 서열내 아미노산 잔기의 퍼센트로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 측정할 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술내 다양한 방식으로, 예를 들면, 공공 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, Megalign(DNASTAR) 또는 EMBOSS 소프트웨어 패키지의 "니들(needle)" 쌍식 서열 정렬 적용을 사용하여 달성할 수 있다. 당해 분야의 기술자는 서열을 정렬하기에 적절한 매개변수, 예를 들면, 비교하는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 요구되는 임의의 알고리즘을 측정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 값%는 EMBOSS 소트트웨어 패키지(European Molecular Biology Laboratory로부터 공공 이용가능함; Rice 등, EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite, Trends Genet. 2000년 6월;16(6):276-7)의 컴퓨터 프로그램 "니들"의 서열 정렬을 사용하여 계산한다.
니들 프로그램(needle program)은 웹 사이트 http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/하에 수탁되거나 http://emboss.sourceforge.net/로부터 EMBOSS 패키지의 부분으로서 국소 설치를 위해 다운로드된다. 이는 많은 널리 사용된 Linux 같은 UNIX 운용 시스템에서 작동한다.
2개의 단백질 서열을 정렬하기 위하여, 니들 프로그램은 바람직하게는 다음의 매개변수로 작동한다:
명령행(Commandline): needle -auto -stdout -asequence SEQUENCE_FILE_A -bsequence SEQUENCE_FILE_B -datafile EBLOSUM62 -gapopen 10.0 -gapextend 0.5 -endopen 10.0 -endextend 0.5 -aformat3 pair -sprotein1 -sprotein2 (Align_format: pair Report_file: stdout)
주어진 아미노산 서열 B(이는 대안적으로 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 이와, 또는 이에 대해 특정의 아미노산 서열 동일성%를 갖거나 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 대안적으로 표현될 수 있다)에 대해, 이와 함께, 또는 이에 대해 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성%는 다음과 같이 계산된다:
분획 X/Y 100배
여기서 X는 A 및 B의 이러한 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 니들에 의한 동일한 매치로 기록된 아미노산 잔기의 수이고, 여기서 Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않을 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성%는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성%와 동일하지 않을 것임이 인식될 것이다. "A의 서열이 B의 전체 서열에 대해 N% 이상 동일한 경우, Y는 B의 전체 서열 길이이다(즉, B에서 아미노산 잔기의 전체 수). 구체적으로 달리 기술하지 않는 한, 본원에 사용된 아미노산 서열 동일성 값의 모든 %는 니들 컴퓨터 프로그램을 사용한 바로 위 단락에 기술된 바와 같이 수득된다.
본 발명은 또한 다음의 구현예에 관한 것이다:
구현예 1. 생물중합체 스캐폴드 및 6-13개 아미노산의 서열 길이를 갖고, 바람직하게는 (인간) 인자 VIII로부터 유래된 적어도 2개의 펩타이드를 포함하는 화합물로서,
여기서, 각각의 펩타이드는 독립적으로 (바람직하게는 인간) 인자 VIII의 아미노산 서열 중 6-아미노산 단편, 바람직하게는 7-, 더 바람직하게는 8-, 더욱 더 바람직하게는 9-, 더욱 더 바람직하게는 10-, 더욱 더 바람직하게는 11-, 훨씬 더 바람직하게는 12-, 가장 바람직하게는 13-아미노산 단편을 포함하고, 바람직하게는 UniProt 접근 코드 P00451에 의해 식별되고,
임의로 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 임의의 다른 아미노산에 의해 독립적으로 치환된 화합물.
구현예 2. 생물중합체 스캐폴드 및 6-13개 아미노산의 서열 길이를 갖고, 바람직하게는 (인간) 인자 VIII로부터 유래된 적어도 2개의 펩타이드를 포함하는 화합물, 바람직하게는 구현예 1의 화합물로서,
여기서, 각각의 펩타이드는 독립적으로 STLRMELMGCDLNSCSMP (서열번호 1), IALRMEVLGCEAQDLY (서열번호 2), QYLNNGPQRIGRKYKKVRFM (서열번호 3), LYGEVGDTLLIIFK (서열번호 4), NGPQRIGRKYKKVRFM (서열번호 5), KSQYLNNGPQRIGRK (서열번호 6), PHGITDVRPLYSRRLP (서열번호 7), THYSIRSTLR (서열번호 8), KARLHLQGRSNAWRP (서열번호 9), QDGHQWTLFF (서열번호 10), NSLDPPLLTRYLRIH (서열번호 11), IHPQSWVHQIALR (서열번호 12), SSSQDGHQWTLFF (서열번호 13), MGCDLNSCS (서열번호 14), VHQIALRMEVLGCEAQDLY (서열번호 15), 및 KSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFM (서열번호 16) 으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열 중 6-아미노산 단편, 바람직하게는 7-, 더 바람직하게는 8-, 더욱 더 바람직하게는 9-, 더욱 더 바람직하게는 10-, 더욱 더 바람직하게는 11-, 훨씬 더 바람직하게는 12-, 가장 바람직하게는 13-아미노산 단편을 포함하고,
임의로 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 임의의 다른 아미노산에 의해 독립적으로 치환된 화합물.
구현예 3. 구현예 2의 화합물로서, 여기서 상기 아미노산 서열은 SSSQDGHQWTLFF (서열번호 13), VHQIALRMEVLGCEAQDLY (서열번호 15), 및 KSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFM (서열번호 16)으로부터 선택된 화합물.
구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물중합체 스캐폴드는 인간 단백질인 화합물.
구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 적어도 2개의 펩타이드는 펩타이드 P1 및 펩타이드 P2를 포함하고, 여기서 P1 및 P2는 독립적으로 구현예 1 또는 2에 정의된 바와 같은 6-아미노산 단편을 포함하고,
실시예 3에서 정의된 바와 같은 바람직하게는 7-, 더 바람직하게는 8-, 더 바람직하게는 9-, 더욱 더 바람직하게는 10-, 훨씬 더 바람직하게는 11-, 특히 12-, 가장 바람직하게는 13-아미노산 단편,
여기서 P1 및 P2는 펩타이드 이량체 P1 - S - P2의 형태로 존재하고, 여기서 S는 비-펩타이드 스페이서이고, 여기서 펩타이드 이량체는 바람직하게는 링커를 통해 생물중합체 스캐폴드에 공유 결합된 화합물.
구현예 6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물중합체 스캐폴드는 인간 글로불린 및 인간 알부민으로부터 선택되는 화합물.
구현예 7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나의 화합물로서, 적어도 2개의 펩타이드 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개의 펩타이드 각각이 환형화된, 화합물.
구현예 8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 화합물은 인간에서 비-면역원성인 화합물.
구현예 9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 각각의 펩타이드는 독립적으로 서열번호 17 내지 126으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 아미노산은 임의의 다른 아미노산 또는 그의 6- 바람직하게는 7-, 더 바람직하게는 8-, 더 바람직하게는 9-, 더욱 더 바람직하게는 10-, 훨씬 더 바람직하게는 11-, 가장 바람직하게는 12-아미노산 단편에 의해 독립적으로 치환되는 화합물.
구현예 10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나의 화합물로서, 상기 각각의 펩타이드는 독립적으로 서열번호 17 내지 126으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되고, 임의로 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 임의로 N-말단 및/또는 C-말단 시스테인 잔기를 갖는 임의의 다른 아미노산에 의해 독립적으로 치환된 화합물.
구현예 11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 생물중합체 스캐폴드는 인간 트랜스페린 및 인간 알부민으로부터 선택되는 화합물.
구현예 12. - 생물중합체 스캐폴드(biopolymer scaffold) 및 적어도
- 하기 화학식의 제1의 펩타이드 n-머(peptide n-mer):
P ( ― S ― P ) (n-1) 및
- 하기 화학식의 제2의 펩타이드 n-머:
P ( ― S ― P ) (n-1)
를 포함하는 화합물, 바람직하게는 구현예 1 내지 11 중 어느 하나의 화합물 로서,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고, S는 비-펩타이드 스페이서(non-peptide spacer)이고,
여기서 각각의 펩타이드 n-머에 대해 독립적으로, n은 적어도 1, 바람직하게는 적어도 2, 보다 바람직하게는 적어도 3, 특히 적어도 4의 정수이고,
여기서 펩타이드 n-머 각각은, 바람직하게는 링커(linker) 각각을 통해, 생물중합체 스캐폴드에 결합된 화합물.
구현예 13. 구현예 12의 화합물로서, 여기서 P의 적어도 하나의 경우는 환형화된 펩타이드이거나, 바람직하게는 여기서 모든 경우의 P의 적어도 10%는 환형화된 펩타이드이거나, 보다 바람직하게는 여기서 모든 경우의 P의 적어도 25%는 환형화된 펩타이드이거나, 여전히 보다 바람직하게는 여기서 모든 경우의 P의 적어도 50%는 환형화된 펩타이드이거나, 심지어 보다 바람직하게는 여기서 모든 경우의 P의 적어도 75%는 환형화된 펩타이드이거나, 여전히 심지어 보다 바람직하게는 여기서 P의 모든 경우의 적어도 90%는 환형화된 펩타이드이거나 심지어 여기서 모든 경우의 P의 적어도 95%는 환형화된 펩타이드이고, 특히 여기서 P의 모든 경우는 환형화된 펩타이드인 화합물.
구현예 14. 구현예 12 또는 13의 화합물로서, 여기서, 각각의 펩타이드 n-머에 대해 독립적으로, n은 적어도 2, 보다 바람직하게는 적어도 3, 특히 적어도 4인 화합물.
구현예 15. 구현예 12 내지 14 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서, 펩타이드 n-머 각각에 대해 독립적으로, n은 10 미만, 바람직하게는 9 미만, 보다 바람직하게는 8 미만, 심지어 보다 바람직하게는 7 미만, 여전히 심지어 보다 바람직하게는 6 미만, 특히 5 미만인 화합물.
구현예 16. 구현예 12 내지 15 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서, 각각의 펩타이드 n-머에 대해 n은 2인 화합물.
구현예 17. 구현예 12 내지 16 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서, P의 적어도 하나의 경우는 Pa이고/이거나 P의 적어도 하나의 경우는 Pb이고,
여기서 Pa 및 Pb는 각각 독립적으로 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 펩타이드인 화합물.
구현예 18. 구현예 12 내지 17 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서, 각각의 경우에 독립적으로, P는 Pa 또는 Pb인 화합물.
구현예 19. 구현예 12 내지 18 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서, 제1의 펩타이드 n-머에서, P의 각각의 경우는 Pa이고, 제2의 펩타이드 n-머에서, P의 각각의 경우는 Pb인 화합물.
구현예 20. 구현예 12 내지 19 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서
제1의 펩타이드 n-머는 P a - S - P a 이고 제2의 펩타이드 n-머는 P a - S - P a 이거나;
제1의 펩타이드 n-머는 P a - S - P a 이고 제2의 펩타이드 n-머는 P b - S - P b 이거나;
제1의 펩타이드 n-머는 P a - S - P a 이고 제2의 펩타이드 n-머는 P b - S - P b 이거나;
제1의 펩타이드 n-머는 P a - S - P b 이고 제2의 펩타이드 n-머는 P a - S - P b 이거나;
제1의 펩타이드 n-머는 P a - S - P b 이고 제2의 펩타이드 n-머는 P a - S - P a 이거나;
제1의 펩타이드 n-머는 P a - S - P b 이고 제2의 펩타이드 n-머는 P b - S - P b 인 화합물.
구현예 21. - 생물중합체 스캐폴드 및 적어도
- 화학식 P a - S - P a 또는 P a - S - P b 의 펩타이드 이량체인 제1의 펩타이드 n-머를 포함하는 화합물로서,
여기서 Pa 및 Pb는 각각 독립적으로 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 펩타이드이고, S는 비- 펩타이드 스페이서이고,
여기서 제1의 펩타이드 n-머는, 바람직하게는 링커를 통해, 생물중합체 스캐폴드에 결합된 화합물.
구현예 22. 구현예 21의 화합물로서, 화학식 P b - S - P b 또는 P a - S - P b 의 펩타이드 이량체인 제2의 펩타이드 n-머를 더 포함하고,
여기서 제2의 펩타이드 n-머는 바람직하게는 링커를 통해 생물중합체 스캐폴드에 결합된 화합물.
구현예 23. 구현예 12 내지 20 및 22 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 제1의 펩타이드 n-머는 제2의 펩타이드 n-머와는 상이한 화합물.
구현예 24. 구현예 17 내지 23 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 펩타이드 Pa는 펩타이드 Pb와 상이하고, 바람직하게는 여기서 펩타이드 Pa 및 펩타이드 Pb는 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프 또는 동일한 에피토프의 2개의 상이한 에피토프 부분인 화합물.
구현예 25. 구현예 17 내지 24 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 펩타이드 Pa 및 펩타이드 Pb는 동일한 아미노산 서열 단편을 포함하고, 여기서 아미노산 서열 단편은 적어도 2개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 3개의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 4개의 아미노산, 여전히 보다 바람직하게는 적어도 5개의 아미노산, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 6개의 아미노산, 여전히 심지어 보다 바람직하게는 적어도 7개의 아미노산, 특히 적어도 8개의 아미노산 또는 심지어 적어도 9개의 아미노산의 길이를 갖는 화합물.
구현예 26. 구현예 17 내지 25 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 Pa 및/또는 Pb가 환형화된 화합물.
구현예 27. 구현예 12 내지 26 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 화합물이 다수의 상기 제1의 펩타이드 n-머 및/또는 다수의 상기 제2의 펩타이드 n-머를 포함하는 화합물.
구현예 28. 구현예 1 내지 27 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 생물중합체 스캐폴드가 단백질, 바람직하게는 포유동물 단백질, 예를 들면, 사람 단백질, 비-사람 영장류 단백질, 양(sheep) 단백질, 돼지 단백질, 개 단백질 또는 설치류 단백질인 화합물.
구현예 29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 생물중합체 스캐폴드가 글로불린인 화합물.
구현예 30. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 생물중합체 스캐폴드가 면역글로불린, 알파1-글로불린, 알파2-글로불린 및 베타-글로불린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물.
구현예 31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 생물중합체 스캐폴드가 면역글로불린 G, 합토글로빈(haptoglobin) 및 트랜스페린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물.
구현예 32. 구현예 1 내지 31 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 생물중합체 스캐폴드가 합토글로빈인 화합물.
구현예 33. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 생물중합체 스캐폴드가 알부민인 화합물.
구현예 34. 구현예 1 내지 31 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 생물중합체 스캐폴드는 항-CD163 항체(즉, CD163 단백질에 특이적인 항체) 또는 이의 CD163-결합 단편인 화합물.
구현예 35. 구현예 34의 화합물로서, 여기서 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은 사람 CD163에 특이적 및/또는 CD163의 세포외 영역, 바람직하게는 CD163의 SRCR 도메인, 보다 바람직하게는 CD163의 SRCR 도메인 1-9 중 어느 하나, 심지어 보다 바람직하게는 CD163의 SRCR 도메인 1-3 중 어느 하나, 특히 CD163의 SRCR 도메인 1에 특이적인 화합물.
구현예 36. 구현예 34의 화합물로서, 여기서 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은:
7 내지 25개, 바람직하게는 8 내지 20개, 심지어 보다 바람직하게는 9 내지 15개, 특히 10 내지 13개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로, 여기서 상기 펩타이드는 아미노산 서열 CSGRVEVKVQEEWGTVCNNGWSMEA (서열번호 139) 또는 이의 7 내지 24개 아미노산 단편을 포함하거나;
7 내지 25개, 바람직하게는 8 내지 20개, 심지어 보다 바람직하게는 9 내지 15개, 특히 10 내지 13개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로, 여기서 상기 펩타이드는 아미노산 서열 DHVSCRGNESALWDCKHDGWG(서열번호 149) 또는 이의 7 내지 20개 아미노산 단편을 포함하거나; 또는
7 내지 25개, 바람직하게는 8 내지 20개, 심지어 보다 바람직하게는 9 내지 15개, 특히 10 내지 13개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로, 여기서 상기 펩타이드는 아미노산 서열 SSLGGTDKELRLVDGENKCS(서열번호 160) 또는 이의 7 내지 19개의 아미노산 단편을 포함하는 펩타이드 중 하나에 특이적인 화합물.
구현예 37. 구현예 36의 화합물로서, 여기서 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편이 아미노산 서열 ESALW(서열번호 150) 또는 ALW를 포함하는 펩타이드에 대해 특이적인 화합물.
구현예 38. 구현예 36의 화합물로서, 여기서 항-CD163 항체 또는 이의 CD163-결합 단편은 아미노산 서열 GRVEVKVQEEW (서열번호 140), WGTVCNNGWS (서열번호 141) 또는 WGTVCNNGW (서열번호 142)을 포함하는 펩타이드에 특이적인 화합물.
구현예 39. 구현예 36의 화합물로서, 여기서 항-CD163 항체 또는 그의 CD163-결합 단편은 아미노산 서열 SSLGGTDKELR(서열번호 161) 또는 SSLGG(서열번호 162)를 포함하는 펩타이드에 특이적인 화합물.
구현예 40. 구현예 1 내지 39 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 화합물은 포유동물, 바람직하게는 인간, 비인간 영장류, 양, 돼지, 개 또는 설치류에서 비-면역원성인 화합물.
구현예 41. 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 화합물은 개체, 바람직하게는 개체의 혈류에서 적어도 하나의 항체의 체내 제거(또는 체내 고갈) 및/또는 개체, 바람직하게는 개체의 혈류에서 적어도 하나의 항체의 역가 감소를 위한 것인 화합물.
구현예 42. 구현예 1 내지 41 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 상기 화합물은 적어도
하기 화학식의 제3의 펩타이드 n-머(peptide n-mer):
P ( ― S ― P ) (n-1)
를 더 포함하고,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고, S는 비-펩타이드 스페이서이고,
바람직하게는 여기에서 P의 각각의 경우는 Pc이고, 여기서 Pc는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고,
바람직하게 여기서 Pc는 환형화된 화합물.
구현예 43. 구현예 42의 화합물로서, 여기서 상기 화합물은 적어도
하기 화학식의 제4의 펩타이드 n-머(peptide n-mer):
P ( ― S ― P ) (n-1)
를 더 포함하고,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고, S는 비-펩타이드 스페이서이고,
바람직하게는 여기에서 P의 각각의 경우는 Pd이고, 여기서 Pd는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고,
바람직하게 여기서 Pd는 환형화된 화합물.
구현예 44. 구현예 43의 화합물로서, 여기서 상기 화합물은 적어도
하기 화학식의 제5의 펩타이드 n-머(peptide n-mer):
P ( ― S ― P ) (n-1)
를 더 포함하고,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고, S는 비-펩타이드 스페이서이고,
바람직하게는 여기에서 P의 각각의 경우는 Pe이고, 여기서 Pe는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고,
바람직하게 여기서 Pe는 환형화된 화합물.
구현예 45. 구현예 44의 화합물로서, 여기서 상기 화합물은 적어도
하기 화학식의 제6의 펩타이드 n-머(peptide n-mer):
P ( ― S ― P ) (n-1)
를 더 포함하고,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고, S는 비-펩타이드 스페이서이고,
바람직하게는 여기에서 P의 각각의 경우는 Pf이고, 여기서 Pf는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고,
바람직하게 여기서 Pf는 환형화된 화합물.
구현예 46. 구현예 45의 화합물로서, 여기서 상기 화합물은 적어도
하기 화학식의 제7의 펩타이드 n-머(peptide n-mer):
P ( ― S ― P ) (n-1)
를 더 포함하고,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고, S는 비-펩타이드 스페이서이고,
바람직하게는 여기에서 P의 각각의 경우는 Pg이고, 여기서 Pg는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고,
바람직하게 여기서 Pg는 환형화된 화합물.
구현예 47. 구현예 46의 화합물로서, 여기서 상기 화합물은 적어도
하기 화학식의 제8의 펩타이드 n-머(peptide n-mer):
P ( ― S ― P ) (n-1)
를 더 포함하고,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고, S는 비-펩타이드 스페이서이고,
바람직하게는 여기에서 P의 각각의 경우는 Ph이고, 여기서 Ph는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고,
바람직하게 여기서 Ph는 환형화된 화합물.
구현예 48. 구현예 47의 화합물로서, 여기서 상기 화합물은 적어도
하기 화학식의 제9의 펩타이드 n-머(peptide n-mer):
P ( ― S ― P ) (n-1)
를 더 포함하고,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고, S는 비-펩타이드 스페이서이고,
바람직하게는 여기에서 P의 각각의 경우는 Pi이고, 여기서 Pi는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고,
바람직하게 여기서 Pi는 환형화된 화합물.
구현예 49. 구현예 48의 화합물로서, 여기서 상기 화합물은 적어도
하기 화학식의 제10의 펩타이드 n-머(peptide n-mer):
P ( ― S ― P ) (n-1)
를 더 포함하고,
여기서, 각 경우에 독립적으로, P는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고, S는 비-펩타이드 스페이서이고,
바람직하게는 여기에서 P의 각각의 경우는 Pj이고, 여기서 Pj는 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩타이드이고,
바람직하게 여기서 Pj는 환형화된 화합물.
구현예 50. 구현예 12 내지 49 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 펩타이드 n-머 각각은 바람직하게는 각각 링커를 통해 생물중합체 스캐폴드에 공유 결합된 화합물.
구현예 51. 구현예 5 내지 50 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 링커 중 적어도 하나는 이황화 가교(disulphide bridges) 및 PEG 분자로부터 선택되는 화합물.
구현예 52. 구현예 5 내지 51 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 스페이서 S 중 적어도 하나는 PEG 분자 또는 글리칸으로부터 선택되는 화합물.
구현예 53. 구현예 17 내지 52 중 어느 하나의 화합물로서, 제1 펩타이드 n-머는 P a - S - P b 이고 제2 펩타이드 n-머는 P a - S - P b 인 화합물.
구현예 54. 구현예 17 내지 53 중 어느 하나의 화합물로서, 펩타이드 Pa 및 펩타이드 Pb는 동일한 아미노산 서열 단편을 포함하고, 여기서 아미노산 서열 단편은 적어도 5개 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 적어도 6개의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 7개의 아미노산, 특히 적어도 8개의 아미노산 또는 심지어 적어도 9개의 아미노산의 길이를 갖는, 화합물.
구현예 55. 구현예 1 내지 54 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 화합물은 항-(인간) 인자 VIII 항체의 제거(또는 고갈)을 위한 것인 화합물.
구현예 56. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나의 화합물 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
구현예 57. 구현예 56의 약제학적 조성물로서, 여기서 상기 조성물 중 펩타이드 대 스캐폴드의 몰비가 2:1 내지 100:1, 바람직하게는 3:1 내지 90:1, 보다 바람직하게는 4:1 내지 80:1, 보다 더 바람직하게는 5:1 내지 70:1, 훨씬 더 바람직하게는 6:1 내지 60:1, 특히 7:1 내지 50:1 또는 심지어 8:10 내지 40:1인 약제학적 조성물.
구현예 58. 구현예 56 또는 57의 약제학적 조성물로서, 여기서 조성물이 복강내, 피하, 근육내 및/또는 정맥내 투여를 위해 제조되고/되거나, 여기서 조성물이 반복된 투여용인 약제학적 조성물.
구현예 59. 구현예 56 내지 58 중 어느 하나의 약제학적 조성물, 또는 구현예 5 내지 55 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 조성물 중 펩타이드 P 대 생물중합체 스캐폴드의 몰비는 2:1 내지 100:1, 바람직하게는 3:1 내지 90:1, 보다 바람직하게는 4:1 내지 80:1, 보다 더 바람직하게는 5:1 내지 70:1, 훨씬 더 바람직하게는 6:1 내지 60:1, 특히 7:1 내지 50:1 또는 심지어 8:10 내지 40:1인 약제학적 조성물 또는 화합물.
구현예 60. 구현예 56 내지 59 중 어느 하나의 약제학적 조성물 또는 구현예 17 내지 55 중 어느 하나의 화합물로서, 조성물 내 펩타이드 Pa 대 생물중합체 스캐폴드의 몰비는 2:1 내지 100:1, 바람직하게는 3:1 내지 90:1, 보다 바람직하게는 4:1 내지 80:1, 심지어 보다 바람직하게는 5:1 내지 70:1, 여전히 심지어 보다 바람직하게는 6:1 내지 60:1, 특히 7:1 내지 50:1 또는 심지어 8:10 내지 40:1인 약제학적 조성물 또는 화합물.
구현예 61. 구현예 56 내지 60 중 어느 하나의 약제학적 조성물, 또는 구현예 17 내지 55 중 어느 하나의 화합물로서, 여기서 조성물 속의 펩타이드 Pb 대 생물중합체 스캐폴드의 몰 비가 2:1 내지 100:1, 바람직하게는 3:1 내지 90:1, 보다 바람직하게는 4:1 내지 80:1, 심지어 보다 바람직하게는 5:1 내지 70:1, 여전히 심지어 보다 바람직하게는 6:1 내지 60:1, 특히 7:1 내지 50:1 또는 심지어 8:10 내지 40:1인 약제학적 조성물 또는 화합물.
구현예 62. 구현예 56 내지 61 중 어느 하나의 약제학적 조성물로서, 인자 VIII 대체 제품, 바람직하게는 인자 VIII, 가장 바람직하게는 인간 인자 VIII를 더 포함하는 약제학적 조성물.
구현예 63. 치료요법에서 사용하기 위한, 구현예 56 내지 62 중 어느 하나의 약제학적 조성물.
구현예 64. 구현예 56 내지 62 중 어느 하나의 약제학적 조성물로서, 개체에서 혈우병 A의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
구현예 65. 구현예 64의 사용을 위한 약제학적 조성물로서, 혈우병 A는 선천성 혈우병 A 및/또는 후천성 혈우병 A인 약제학적 조성물.
구현예 66. 구현예 63 내지 65 중 어느 하나의 사용을 위한 약제학적 조성물로서, 여기서 약제학적 조성물은 개체에게 투여되고, 인자 VIII 대체 제품, 바람직하게는 인자 VIII, 가장 바람직하게는 인간 인자 VIII는 상기 조성물이 투여되기 전 또는 상기 조성물이 투여된 후에 상기 조성물과 함께 개체에게 투여되고,
바람직하게는 여기서 약제학적 조성물은 96시간 범위 내, 바람직하게는 72시간 범위 내, 보다 바람직하게는 48시간 범위 내, 심지어 보다 바람직하게는 36시간 범위 내, 심지어 보다 바람직하게는 24시간 범위 내, 특히 18시간 범위 또는 심지어 12시간 범위 내에서 적어도 2회 투여되고, 특히 이 범위는 24시간 내, 바람직하게는 12시간 내 인자 VIII 대체 제품, 바람직하게는 인자 VIII, 가장 바람직하게는 인간 인자 VIII의 투여가 뒤따르는 약제학적 조성물.
구현예 67. 구현예 56 내지 61 중 어느 하나의 약제학적 조성물로서, 개체에서 인자 VIII 대체 제품, 바람직하게는 인자 VIII, 보다 바람직하게는 인간 인자 VIII의 중화 억제 및/또는 억제의 억제에 사용하기 위한 것으로,
바람직하게는 여기서 약제학적 조성물은 96시간 범위 내, 바람직하게는 72시간 범위 내, 보다 바람직하게는 48시간 범위 내, 심지어 보다 바람직하게는 36시간 범위 내, 심지어 보다 바람직하게는 24시간 범위 내, 특히 18시간 범위 또는 심지어 12시간 범위 내에서 적어도 2회 투여되고, 특히 이 범위는 24시간 내, 바람직하게는 12시간 내 인자 VIII 대체 제품의 투여가 뒤따르는 약제학적 조성물.
구현예 68. 구현예 63 내지 67 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 개체의 체중 kg당 화합물 1-1000 mg, 바람직하게는 2-500 mg, 보다 바람직하게는 3-250 mg, 훨씬 더 바람직하게는 4-100 mg, 특히 5-50 mg의 용량으로 투여되는 약제학적 조성물.
구현예 69. 구현예 63 내지 68 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 복강내, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여되는 약제학적 조성물.
구현예 70. 구현예 63 내지 69 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 여기에서 하나 이상의 항체는 펩타이드 P의 적어도 하나의 경우에 대해, 또는 펩타이드 Pa 및/또는 펩타이드 Pb에 대해 특이적인 개체에 존재하며, 바람직하게는 여기서 상기 항체는 인자 VIII, 바람직하게는 인간 인자 VIII에 대해 특이적인 약제학적 조성물.
구현예 71. 구현예 63 내지 70 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 하나 이상의 인자 VIII 중화 또는 억제 항체가 개체에 존재하는 약제학적 조성물.
구현예 72. 구현예 63 내지 71 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 개체에서 비-면역원성인 약제학적 조성물.
구현예 73. 구현예 63 내지 72 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 개체의 체중 kg당 화합물 1-1000 mg, 바람직하게는 2-500 mg, 보다 바람직하게는 3-250 mg, 훨씬 더 바람직하게는 4-100 mg, 특히 5-50 mg의 용량으로 투여되는 약제학적 조성물.
구현예 74. 구현예 63 내지 73 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 여기서 개체는 인자 VIII 대체 치료요법을 추가로 받고, 바람직하게는 여기서 개체는 인자 VIII 대체 제품, 바람직하게는 인자 VIII, 가장 바람직하게는 인간 인자 VIII를 투여받고, 바람직하게는 여기서 인자 VIII 대체 제품의 상기 투여는 약제학적 조성물의 투여 이전, 동시 및/또는 이후인, 약제학적 조성물.
구현예 75. 이를 필요로 하는 개체에서 혈우병 A를 개선 또는 치료하는 방법으로서,
구현예 56 내지 62 중 어느 하나에 정의된 약제학적 조성물을 수득하는 단계; 및
상기 약제학적 조성물의 유효량을 개체게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 76. 구현예 75에 따른 방법으로서, 여기서 상기 방법은 구현예 63 내지 74 중 어느 하나에서와 같이 정의되는 방법.
구현예 77. 구현예 56 내지 62 중 어느 하나에서 정의한 바와 같은 약제학적 조성물을 수득하는 단계; 및
약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에 존재하는 하나 이상의 항체의 제거(또는 고갈) 방법으로서, 여기서 조성물은 개체에서 비-면역원성이고, 여기서 개체에 존재하는 하나 이상의 항체가 적어도 하나의 경우의 P에 대해, 또는 펩타이드 Pa 및/또는 펩타이드 Pb에 대해 특이적인, 방법.
구현예 78. 구현예 77의 방법으로서, 하나 이상의 항체는 인자 VIII, 바람직하게는 인간 인자 VIII에 특이적인 방법.
구현예 79. 구현예 77 또는 78의 방법으로서, 여기서 개체가 비-사람 동물, 바람직하게는 비-사람 영장류, 양, 돼지, 개 또는 설치류, 특히 마우스인 방법.
구현예 80. 구현예 77 내지 79의 방법으로서, 여기서 생물중합체 스캐폴드가 개체와 관련하여 자가이고, 바람직하게는 여기서 생물중합체 스캐폴드가 자가 단백질인 방법.
구현예 81. 구현예 77 내지 80 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 개체는 인자 VIII 대체 제품을 투여받고, 개체에 존재하는 하나 이상의 항체는 상기 인자 VIII 대체 제품에 대해 특이적이며, 바람직하게는 여기서 인자 VIII 대체 제품의 상기 투여는 약제학적 조성물의 상기 투여 이전, 동시 및/또는 이후이고,
바람직하게는 여기서 약제학적 조성물은 96시간 범위 내, 바람직하게는 72시간 범위 내, 보다 바람직하게는 48시간 범위 내, 심지어 보다 바람직하게는 36시간 범위 내, 심지어 보다 바람직하게는 24시간 범위 내, 특히 18시간 범위 또는 심지어 12시간 범위 내에서 적어도 2회 투여되고, 특히 이 범위는 24시간 내, 바람직하게는 12시간 내 인자 VIII 대체 제품의 투여가 뒤따르는 방법.
구현예 82. 구현예 81의 방법에 있어서, 여기서 인자 VIII 대체 제품은 인자 VIII, 바람직하게는 인간 인자 VIII인 방법.
구현예 83. 구현예 77 내지 82 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 조성물이 복강내, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여되는 방법.
구현예 84. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 펩타이드.
구현예 85. - 샘플을 구현예 84의 펩타이드와 접촉시키는 단계, 및
- 샘플 내 항-인자 VIII 항체의 존재 및/또는 농도를 검출하는 단계;를 포함하는
생물학적 샘플에서 항-인자 VIII 항체를 검출 및/또는 정량하는 방법.
구현예 86. 구현예 85의 방법에 있어서, 펩타이드는 고체 지지체, 특히 전기화학, 형광, 자기, 전자, 중력 또는 광학 생체변환기를 갖는 바이오센서 기반 진단 장치 상에 고정 및/또는 펩타이드는 리포터 또는 리포터 단편, 예컨대 PCA에 적합한 리포터 단편에 커플링된, 방법.
구현예 87. 구현예 85 또는 86에 있어서, 상기 방법이 샌드위치 검정, 바람직하게는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)인 방법.
구현예 88. 구현예 85 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플은 포유동물, 바람직하게는 사람으로부터 얻어지는 방법.
구현예 89. 구현예 85 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 샘플이 혈액 샘플, 바람직하게는 전혈, 혈청 또는 혈장인 방법.
구현예 90. 구현예 84에 따른 펩타이드의 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에서의 용도로, 바람직하게는 구현예 85 내지 89 중 어느 하나에 정의된 방법을 위한 용도.
구현예 91. 구현예 84에 따른 펩타이드를 포함하는 진단 장치로, 펩타이드는 고체 지지체 상에 고정 및/또는 펩타이드는 리포터 또는 리포터 단편, 예컨대 PCA에 적합한 리포터 단편에 커플링된, 진단 장치.
구현예 92. 구현예 91에 있어서, 고체 지지체가 ELISA 플레이트 또는 표면 플라즈몬 공명 칩인 진단 장치.
구현예 93. 구현예 91에 따른 진단 장치로서, 상기 진단 장치는 전기화학적, 형광, 자기, 전자, 중력 또는 광학 생체변환기를 갖는 측면 흐름 분석 장치 또는 바이오센서 기반 진단 장치인, 진단 장치.
구현예 94. 구현예 84에 따른 펩타이드, 바람직하게는 구현예 91 내지 93 중 어느 하나에 따른 진단 장치, 및 바람직하게는 완충제, 시약, 설명서의 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 진단 키트.
구현예 95. 구현예 84에 따른 펩타이드를 포함하는 채집 장치(apheresis device)로, 바람직하게는 고체 담체 상에 고정된 채집 장치.
구현예 96. 구현예 95에 있어서, 고체 담체가 혈액 또는 혈장 흐름과 접촉할 수 있는 채집 장치.
구현예 97. 고체 담체가 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 따른 화합물을 포함하는, 구현예 95 또는 96에 따른 채집 장치.
구현예 98. 구현예 95 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 고체 담체가 멸균되고 발열원이 없는 컬럼인 채집 장치.
구현예 99. 구현예 95 내지 98 중 어느 하나에 따른 채집 장치로서, 상기 채집 장치는 구현예 84에 따른 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 보다 바람직하게는 적어도 4개의 상이한 펩타이드를 포함하는, 채집 장치.
본 발명을 이에 한정되지 않는, 다음의 도면 및 실시예로 추가로 나타낸다. 다음의 도면 및 실시예의 맥락에서, 본 발명의 접근법이 기반으로 하는 화합물은 또한 "선택적인 항체 고갈 화합물"(SADC)로 지칭된다.
도 1: SADC는 목적하지 않은 항체의 역가를 성공적으로 감소시킨다. 각각의 화합물은 정의된 항원에 대해 펩타이드 면역화에 의해 예비-면역화된 Balb/c 마우스내로 복강내 투여함으로써 0 시점에 적용시켰다. 각각의 상부 패널(top panel)은 상응하는 항체를 검출하는 표준 ELISA에 따라 OD 값(y_축)에 대한 항-펩타이드 역가(0.5x 희석 단계; X-축은 log(X) 희석을 나타낸다)를 나타낸다. 각각의 하부 패널은 각각의 본 발명의 화합물 주사 전 역가(즉, -48h 및 -24h에서의 역가) 및 각각의 본 발명의 화합물 적용 후(즉, 주사 후 +24h, +48h 및 +72h째 역가; x-축에 나타냄) LogIC50(y-축)를 나타낸다. (A) EBNA1(전자간증과 관련됨)에 대해 지시된 항체에 결합하는 생물중합체 스캐폴드로서 알부민을 지닌 화합물. 마우스를 EBNA-1 모델 에피토프를 수반하는 펩타이드 백신으로 예비-면역화시켰다. (B) 사람 AChR 단백질 MIR(중중 근무력증과 관련됨)로부터 유래된 펩타이드에 대해 지시된 항체에 결합하는 생물중합체 스캐폴드로서 알부민을 지닌 화합물. 마우스를 AChR MIR 모델 에피토르를 수반하는 펩타이드 백신으로 예비-면역화시켰다. (C) EBNA1(전자간증과 관련됨)에 대해 지시된 항체에 결합하는 생물중 합체 스캐폴드로서 면역글로불린을 지닌 화합물. 마우스를 EBNA-1 모델 에피토프를 수반하는 펩타이드 백신으로 예비-면역화시켰다. (D) EBNA1(전자간증과 관련됨)에 대해 지시된 항체에 결합하는 생물중합체 스캐폴드로서 합토글로빈을 지닌 화합물. 마우스를 EBNA-1 모델 에피토프를 수반하는 펩타이드 백신으로 예비-면역화시켰다. (E) 패널 C에 나타낸 실험에서 사용된 EBNA1에 대해 지시된 항체에 결합하는 동일한 면역글로불린-기반 본 발명의 화합물을 사용한 선택성의 증명. 마우스를 관련되지 않은 아미노산 서열로 예비-면역화시켰다. 역가 감소는 발생하지 않았고, 이는 화합물의 선택성을 입증하였다.
도 2: SADC는 비-면역원성이고 마우스 내로 반복된 주사 후 항체 형성을 유도하지 않는다. 동물 C1-C4 뿐만 아니라 동물 C5-C8을 2개의 상이한 본 발명의 화합물로 복강내 처리하였다. 대조군 동물 C를 사람 AChR 단백질 MIR로부터 유래된 KLH-펩타이드로 예방접종하였다. 1:100의 희석에서 표준 ELISA에 의한 항체 역가 검출을 위해, BSA-접합된 펩타이드 프로브 T3-1, T9-1 및 E005(회색 바아, 그래프에서 나타낸 바와 같음)를 각각 사용하여, 백신-처리된 대조군 동물 C(y-축, OD450 nm)와 비교하는 경우, 항체 유도가 본 발명의 화합물로 처리한 동물에서 부재하였음이 입증될 수 있다.
도 3: 1가 또는 2가 펩타이드의 다중 카피를 수반하는 SADC를 사용한 항체의 성공적인 시험관내 고갈. 1가 또는 2가 펩타이드를 지닌 SADC는 항체를 흡수함으로써 이를 고갈시키는데 매우 적합하였다. "1가"는 펩타이드 단량체가 생물중합체 스캐폴드(즉, n=1)에 결합함을 의미하는 반면, "2가"는 펩타이드 이량체가 생물중합체 스캐폴드(즉, n=2)에 결합함을 의미한다. 본 경우에, 2가 펩타이드는 "단독2가 (homodivalent)"인데, 즉, SADC의 펩타이드 n-머는 E006 - 스페이서 - E006)이다.
도 4: 다양한 SADC 생물중합체 스캐폴드를 사용한 마우스에서 신속하고 선택적인 항체 고갈. 모의 처리된(mock treated) 대조군 그룹 SADC-CTL(관련되지 않은 펩타이드 함유)과 비교하는 경우 처리된 그룹은 이미 24 시간째에 신속하고 확실한 항체 감소를 나타내었다(특히 SADC-TF). 알부민 스캐폴 - SADC - SADC-ALB를 지닌 SADC, 면역글로불린 스캐폴드 - SADC-IG를 지닌 SADC, 합토글로빈 스캐폴드 - SADC-HP를 지닌 SADC, 및 트랜스페린 스캐폴드 - SADC-TF를 지닌 SADC.
도 5: SADC 주사 후 24시간째에 이의 펩타이드 모이어티를 통한 혈장 속의 SADC의 검출. 합토글로빈-스캐폴드-기반 SADC(SADC-HP 및 SADC-CTL)는 SADC-ALB, SADC-IG oder SADC-TF와 같은 다른 생물중합체 스캐폴드를 지닌 SADC보다 장점을 나타내는 비교적 보다 짧은 혈장 반감기를 나타내었다. 알부민 스캐폴드 - SADC-ALB를 지닌 SADC, 면역글로불린 스캐폴드 - SADC-IG를 지닌 SADC, 합토글로빈 스캐폴드 - SADC-HP를 지닌 SADC, 및 트랜스페린 스캐폴드 - SADC-TF를 지닌 SADC.
도 6: SADC 주사 후 24시간째에 혈장 속에서 SADC-IgG 복합체의 검출. 합토글로빈 기반 SADC는 다른 생물중합체 스캐폴드를 지닌 SADC와 비교하는 경우 가속화된 청소(clearance)에 처리하였다. 알부민 스캐폴드 - SADC-ALB를 지닌 SADC, 면역글로불린 스캐폴드 - SADC-IG를 지닌 SADC, 합토글로빈 스캐폴드 - SADC-HP를 지닌 SADC, 및 트랜스페린 스캐폴드 - SADC-TF를 지닌 SADC.
도 7: SADC-IgG 복합체 형성의 시험관내 분석. 동물 SADC-TF 및 -ALB는 강력한 신호 및 항원-항체 평형으로부터 항원 과다로의 이전으로 인해 1000ng/ml SADC-TF의 경우에 급격한 신호 저하에 의해 반영되는 것으로서 명백한 면역복합체 형성 및 C1q에 대한 결합을 나타내었다. 대조적으로, SADC-HP 또는 SADC-IG를 사용한 시험관내 면역복합체 형성은 존재하는 검정에서 측정시 훨씬 덜 효율적이었다. 이러한 발견은 합토글로빈 스캐폴드가 보체 시스템을 활성화시키기 위한 감소된 경향성(propensity)으로 인하여 다른 SADC 생물중합체 스캐폴드보다 유리하다는 발견을 확증한다. 알부민 스캐폴드 - SADC-ALB를 지닌 SADC, 면역글로불린 스캐폴드 - SADC-IG를 지닌 SADC, 합토글로빈 스캐폴드 - SADC-HP를 지닌 SADC, 및 트랜스페린 스캐폴드 - SADC-TF를 지닌 SADC.
도 8: 시험관내에서 SADC에 의한 IgG 포획의 측정. SADC-HP는 SADC-TF 또는 SADC-ALB과 비교하는 경우 시험관내에서 현저히 적은 항체 결합능을 나타내었다. 알부민 스캐폴드 - SADC-ALB를 지닌 SADC, 면역글로불린 스캐폴드 - SADC-IG를 지닌 SADC, 합토글로빈 스캐폴드 - SADC-HP를 지닌 SADC, 및 트랜스페린 스캐폴드 - SADC-TF를 지닌 SADC.
도 9: 항-CD163-항체 기반 생물중합체 스캐폴드의 혈액 청소. 마우스 모델에서, mAb E10B10(뮤린 CD163에 특이적)은 mAb Mac2-158(사람 CD163에 특이적이지만 뮤린 CD163에 특이적이지 않으므로 이 실험에서 음성 대조군으로 사용됨)보다 순환에서 심지어 더 빠르게 청소된다.
실시예 1-10은 항체의 선택적 제거를 입증하는 SADC의 일반적인 작동 원리에 관한 것이다. 실시예 11-12는 인자 VIII 및 혈우병 A에 대한 이 치료 개념의 특정 적용에 관한 것이다.
실시예 1: SADC는 목적하지 않은 항체의 역가를 효과적으로 감소시킨다.
동물 모델: 사람 처방에서 환형의 목적하지 않은 항체의 측정가능한 역가를 지닌 생체내 모델을 제공하기 위하여, BALB/c 마우스를 확립된 하람 자가항원 또는 항-약물 항체로부터 유래된 KLH-접합된 펩타이드 백신을 사용한 표준 실험 예방접종을 사용하여 면역화시켰다. 표준 펩타이드 ELISA에 의한 역가 평가 후, 면역화된 동물을 상응하는 시험 SADC로 처리하여 SADC 처리에 의한 선택적인 항체 저하를 입증하였다. 모든 실험을 상응하는 동물 윤리에 의한 안내에 따라 수행하였다.
모델 항원을 사용한 마우스의 면역화: 암컷 BALB/c 마우스(8 내지 10주령)는 Janvier(프랑스)가 제공하였으며, 12시간 광/12시간 암 주기 하에 유지시키고 사료 및 물을 자유로이 접근하도록 하였다. 면역화는 2주 간격으로 3회 주사한 KLH 담체-접합된 펩타이드 백신의 피하 적용에 의해 수행하였다. KLH 접합체를, 바이러스 항원(EBNA-1)과 내인성 사람 수용체 항원, 즉, 자간전증과 관련된 것으로 밝혀진(Elliott 등), 태반 GPR50 단백질 사이의 분자 모조품(mimicry)에 대한 예를 나타낸, 펩타이드 T3-2(서열번호 127: CGRPQKRPSCIGCKG)를 사용하여 생성시켰다. 이러한 접근법의 일반화를 확립하기 위하여, 자가면역 병태 중증 근무력증으로부터 유래된 보다 큰 항원성 펩타이드를 사람 자가에피토프를 사용한 마우스의 면역화에 사용하였다. 펩타이드 T3-2와 유사하게, 동물을 질환의 병리학에 근본 역활을 하는 사람 AChR 단백질의 MIR(주요 면역원성 영역)으로부터 유래된 펩타이드 T1-1(서열번호 128: LKWNPDDYGGVKKIHIPSEKGC)으로 면역화시켰다(Luo 등). T1-1 펩타이드는 마우스를 사람 AChR 자가항원의 대용 부분 모델 에피토프를 사용하여 면역화시키기 위해 사용하였다. 펩타이드 T8-1(서열번호 129: DHTLYTPYHTHPG)을 사용하여 대조군 마우스를 면역화시킴으로써 시스템의 선택성의 입증을 위한 대조군 역가를 제공하였다. 백신 접합체 제조를 위해, KLH 담체(Sigma)를 설포-GMBS(제품 번호 22324 Thermo)로 제조업자의 지시에 따라 활성화시킨 후, N- 또는 C-말단적으로 시스테이닐화된(cysteinylated) 펩타이드 T3-2 및 T1-1 중의 하나를 첨가하고 Alhydrogel®을 최종 첨가한 후 동물의 옆구리에 주사하였다. 백신 T3-2 및 T1-1에 대한 용량은 용량당 1%의 최종 농도에서 Alhydrogel®(InvivoGen VAC-Alu-250)을 함유하는 주사 당 100μg의 용적 속에 15ul의 접합체이었다.
환형 SADC의 생성: T3-2 및 T1-1 면역화된 마우스의 DSDC에 의한 선택적인 항체 저하 활성을 시험하기 위하여, SADC를 생물중합체 스캐폴드로서 마우스 혈청 알부민(MSA) 또는 마우스 면역글로불린(마우스-Ig)을 사용하여 제조함으로써 마우스에서 어떠한 면역 반응도 유도하지 않을, 자가 생물중합체 스캐폴드를 생성시키거나, 생물중합체 스캐폴드(이는 72시간내 1회 주사 후 동종면역 반응을 유도하지 않았다)로서 비-자가 사람 합토글로빈을 생성시켰다. N-말단으로 시스테이닐화된 SADC 펩타이드 E049(서열번호 130: GRPQKRPSCIG) 및/또는 C-말단으로 시스테이닐화된 SADC 펩타이드 E006(서열번호 131: VKKIHIPSEKG)를 스캐폴드에 설포-GMBS(제품 번호 22324 Thermo)-활성화된 MSA(Sigma; 제품 번호 A3559) 또는 -마우스-Ig(Sigma, I5381) 또는 -사람 합토글로빈(Sigma H0138)을 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 연결시킴으로써, 상응하는 생물중합체 스캐폴드의 라이신에 공유결합으로 부착된, MSA-, Ig- 및 합토글로빈-기반 SADC를 제공하였다. 이작용성 아민-대-설프하이드릴 가교 결합제를 통해 라이신에 대한 시스테이닐화된 펩타이드의 접합 외에도, 첨가된 시스테이닐화된 SADC 펩타이드의 부위를 알부민 스캐폴드 단백질의 시스테인의 설프하이드릴 그룹과 반응시켰으며, 이는 접합체를 DTT로 처리한 다음 유리 펩타이드를 진량 분광법 또는 유리 펩타이드를 검출하는 임의의 다른 분석 방법을 사용한 후속적인 검출로 검출할 수 있다. 최종적으로, 이러한 SADC 접합체는 물에 대해 Pur-A-Lyzer™(Sigma)을 사용하여 투석하고 후속적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 물질은 동물에게 주사하기 전에 PBS 속에 재현탁시켰다.
SADC의 생체내 기능 시험: 환형 SADC, SADC-E049 및 SADC-E006을 펩타이드 백신 T3-2(EBNA-1 모델 에피토프 수반) 및 펩타이드 백신 T1-1(AChR MIR 모델 에피토프 수반)로 미리 면역화시킨 마우스 내로 복강내 주사하였다(i.p.; 사람 및 보다 큰 동물에서 의도된 정맥내 적용을 위한 대용품으로서). 적용된 용량은 50μl의 PBS 용적 속에 30μg의 SADC 접합체이었다. 채혈은 복강내 SADC 주사 전(-48h, -24h) 및 후(+24h, +48h, +72h 등) 각각에 모세관 미세-헤마토크릿 튜브(capillary micro-hematocrit tube)를 사용하여, 턱밑 정맥 천자(submandibular vein puncture)로 수행하였다. ELISA 분석(하기 참고)을 사용하여, 환형 SADC 둘 다는 나타낸 동물 모델에서 적어도 72시간에 걸쳐 역가를 명확하게 감소시킬 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, SADC를 사용하여 생체내에서 역가를 효과적으로 감소시킬 수 있다고 결론지을 수 있다.
역가 분석: 펩타이드 ELISA를 BSA-커플링된 펩타이드(30nM, PBS 속에 용해시킴)로 실온에서 1시간 동안 코팅시킨 96-웰 플레이트(Nunc Medisorp 플레이트; Thermofisher, 제품 번호 467320)를 사용하여 표준 과정에 따라 수행하고 적절한 완충액과 함께 진탕(차단 완충액, 1% BSA, 1x PBS; 세척 완충액, 1xPBS/0.1% 트윈; 희석 완충액, 1xPBS / 0.1% BSA /0.1% 트윈)시키면서 수행하였다. 혈청 항온 처리(PBS 속에서 1:50로 출발하는 희석; 전형적으로 1:3 또는 1:2 적정 단계로)한 후, 결합된 항체를 Jackson immunoresearch (115-035-008)로부터 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스 IgG(Fc)를 사용하여 검출하였다. 반응을 정지시킨 후, 플레이트를 450nm에서 20분 동안 TMB를 사용하여 측정하였다. EC50은 4-매개변수 로지스틱 회귀 모델(4-parameter logistic regression model)(GraphPad Prism)을 지닌 곡선 핏팅(curve fitting)을 사용하여 제조업자가 추천한 과정에 따라 판독물 값으로부터 계산하였다. 상한치 및 하한치에 대한 제한 매개변수(constraining parameter)를 상응하게 설정하여 R2 >0.98의 커브 핏팅 품질 수준(curve fitting quality level)을 설정하였다.
도 1a는 자간전증에서 자가항체 및 모조품에 대한 모델로서(Elliott 등), EBNA1에 대해 지시된 항원에 결합하는 환형 알부민-기반 SADC 후보물의 생체내 선택적인 혈장-저하 활성에 대해 마우스 모델에서 생체내 개념 증명을 나타낸다. 이러한 마우스 실험을 위해, 마우스 알부민을 사용하여, 외부 종(foreign species)으로부터의 단백질에 대한 어떠한 반응도 피하였다. 항체 역가를 표준 펩타이드 예방접종에 의해 6개월령 Balb/c 마우스에서 유도하였다. 하부 패널은 SADC 주사 전(즉, -48h 및 -24h에서의 역가) 역가 LogIC50(y-축)이 SADC 적용 후(즉, 주사 후 +24h, +48h 및 +72h에서의 역가; x-축에 나타냄) 역가 LogIC50보다 더 높았음을 입증한다.
유사한 실시예를 상이한 질환 처방을 위한 펩타이드 항체 결합 모이어티의 대안적인 예를 사용하여, 도 1b에 나타낸다. 중증 근무력증에서의 상황을 모사하기 위하여 사람 AChR 단백질 MIR 영역(Luo 등)으로부터 유래된 상이한 펩타이드로 예비-면역화시킨 마우스 모델에서 알부민-기반 SADC의 항체 저하 활성. AChR-MIR 영역에 대해 유도된 항체 역가를 중증 근무력증에서 유발 역활을 하는 것으로 공지된 항-AChR-MIR 자가항체에 대한 대리물로서 사용하였다(참고: Vincent 등). 명확한 역가 감소가 SADC 적용 후 관찰되었다.
도 1c 및 1d는 대안적인 생물중합체 스캐폴드를 포함하는 SADC 변이 체의 기능성을 입증한다. 구체적으로, 도 1c는 면역글로불린 스캐폴드가 성공적으로 사용될 수 있는 반면, 도 1d는 SADC를 작제하기 위한 합토글로빈-스캐폴드의 사용을 입증한다. 예 둘 다는 공유결합으로 결합된 실시예 펩타이드 E049를 수반하는, SADC에 의한 선택적인 항체 저하에 대한 생체내 개념 증명을 나타낸다.
자가 스캐폴드 단백질이 바람직할 수 있지만 합토글로빈-기반 SADC를 대리물로서 사람 합토글로빈을 사용하여 생성시켰다. 항-사람-합토글로빈 항체의 형성을 피하기 위하여, 비-자가 스캐폴드 합토글로빈의 마우스 당 단지 1회 단일 SADC 주사를 본 실험 조건을 위해 사용하였다. 예측한 바와 같이, 본 실험 조건(즉, 1회 적용) 하에서, 본 대리물 합토글로빈 동족체에 대해 항체 반응성은 관찰되지 않았다.
도 1e는 SADC 시스템의 선택성을 입증한다. 펩타이드 E049를 수반하는 면역글로불린-기반 SADC(즉, 도 1c와 동일함)는 관련되지 않은, 비관련성 아미노산 서열, 지정된 펩타이드 T8-1(서열번호 129: DHTLYTPYHTHPG)을 사용한 펩타이드에 의해 유도된 Ig-역가를 감소시킬 수 없다. 실시예는 시스템의 선택성에 대한 생체내 개념 증명을 나타낸다. 상단 패널은 표준 ELISA에 따라 OD 값(y-축)에 대한 항-펩타이드 T8-1 역가(1:50로부터 1:102400까지의 0,5x 희석 단계; X-축은 log(X) 희석을 나타낸다)를 나타낸다. T8-1-역가는 적용 후 SADC-Ig-E049의 투여에 의해 영향받지 않는다. 하단 패널은 SADC 주사 전(즉, -48h 및 -24h에서 역가) 초기 역가 LogIC50(y-축)가 SADC 적용 후(즉, 역가 +24h, +48h 및 +72h; x-축에서 나타낸 바와 같음) 역가 LogIC50과 비교하는 경우 SADC-Ig-E049의 투여(화살표)에 의해 영향받지 않음으로써, 시스템의 선택성을 증명함음을 입증한다.
실시예 2: SADC의 면역원성.
SADC의 면역원성을 배제시키기 위하여, 환형 후보물 SADC를 반복된 주사시 항체를 유도하는 이의 경향성에 대해 시험하였다. 펩타이드 T3-1 및 T9-1을 당해 시험을 위해 사용하였다. T3-1은 이에 대해 작용성 자가항체가 전-자간증 동물 모델에서 형성된 안지오텐신 수용체의 참고 에피토프로부터 유래된 10개 아미노산 펩타이드이고(Zhou 등); T9-1은 사람 IFN 감마의 참고 항-약물 항체 에피토프로부터 유래된 12개 아미노산 펩타이드이다(Lin 등). 이러한 대조군 SADC 접합체를 8 내지 10주령에서 출발하여 나이브(naive), 비-면역화된 암컷 BALB/c 마우스내로 복강내에 2주마다 8회 주사하였다.
동물 C1 내지 C4를 SADC T3-1으로 복강내 처리하였다(실시예 1에 기술된 바와 같음). 동물 C5 내지 C8을 펩타이드 T9-1을 수반하는 SADC를 사용하여 복강내 처리하였다. ELISA 분석을 위한 참고 신호로서, KLH-펩타이드 T1-1(AChR_MIR로부터 유래됨, 실시예 1에서 설명됨)로 3회 예방접종시킨 대조군 동물로부터의 혈장을 사용하였다. 1:100의 희석에서 표준 ELISA에 의한 항체 역가 검출에 대해, BSA-접합된 펩타이드 프로브 T3-1, T9-1 및 E005(서열번호 132: GGVKKIHIPSEK)을 각각 사용하여, 백신-처리된 대조군 동물 C와 비교하는 경우, 항체 유도가 SADC-처리된 동물에서 부재하였음을 입증할 수 있다(참고: 도 2). 3번째 백신 주사 후 1주째(대조군 동물 C) 및 2주 간격으로 마지막 8회의 연속적인 SADC 주사 후(동물 C1 내지 C8) 각각 후 혈장을 턱밑 혈액 수집으로 수득하였다. 따라서, SADC는 비-면역원성이고 마우스내로 반복된 주사 후 항체 형성을 유도하지 않음이 입증되었다.
실시예 3: 1가 또는 2가 펩타이드의 다수 카피를 수반하는 SADC를 사용한 항체의 성공적인 시험관내 고갈.
E006-KLH(KLH에 접합된, C-말단 시스테인을 지닌 VKKIHIPSEKG(서열번호: 131) 예방접종된 마우스의 혈장을 희석 완충액(PBS + 0.1% w/v BSA + 0.1% 트윈(Tween) 20) 속에 1:3200으로 희석시키고 음성 대조군으로서 2.5 μg/ml(250 ng/웰)의 SADC 또는 5 μg/ml(500 ng/웰)의 알부민으로 코팅시킨 미세역가 플레이트의 단일 웰에서 4회 연속적으로(10분/웰) 항온처리(100 μl, 실온)하였다.
SADC 코팅된 웰에서 항온처리 전 및 후에 존재하는 유리되고, 결합되지 않은 항체의 양을 측정하기 위하여, 50 μl의 희석된 혈청을 고갈 전 및 후에 취하고 표준 ELISA에 의해 E006-BSA 코팅된 플레이트(10 nM 펩타이드)를 사용하여 정량화하고 염소 항 마우스 IgG 바이오(Southern Biotech, 1:2000로 희석시킴)로 희석시켰다. 후속적으로, 바이오티닐화된 항체를 스트렙타비딘-HRP(Thermo Scientific, 1:5000으로 희석시킴)으로 기질로서 TMB를 사용하여 검출하였다. 신호의 발달은 0.5 M 황산으로 정지시켰다.
ELISA를 OD450nm(y-축)에서 측정하였다. 결과적으로, 항체는 C-말단 시스테인을 지닌 펩타이드 E006(서열 VKKIHIPSEKGC, 서열번호 133)을 함유하는 코팅된 1가- 또는 2가 SADC에 의해 효율적으로 흡착되었다(전 = 고갈된 출발 물질 없음; 1가는 SADC 표면에 나타난 펩타이드에 상응한다; 음성 대조군은 알부민이었다; x-축에 나타냄). 도 3 참고. ("1가"는 펩타이드 단량체가 생물중합체 스캐폴드에 결합함을 의미(즉, n=1)하는 반면 "2가"는 펩타이드 이량체가 생물중합체 스캐폴드에 결합함을 의미(즉, n=2)한다. 본 경우에, 2가 펩타이드는 "단독2가"이었는데, 즉 SADC의 펩타이드 n-머는 E006 - S - E006이다.)
이는 1가 또는 2가 펩타이드를 지닌 SADC가 항체를 흡착시킴으로써 이를 고갈시키는데 매우 적합함을 입증한다.
실시예 4: 미모토프 -기반 SADC의 생성
야생형 또는 변형된 펩타이드 아미노산 서열로부터 유래된 선형 및 환형 펩타이드를 특정 에피토프에 대해 해로운, 질병-유발 또는 달리 원치 않는 항체의 선택적인 제거를 위한 특이적인 SADC의 작제를 위해 사용할 수 있다. 특수한 에피토프의 경우에, 선형 펩타이드 또는 구속된 펩타이드, 예를 들면, 에피토프의 일부 또는 이의 변이체를 함유하는 사이클로펩타이드(여기서, 예를 들면, 하나 또는 수개의 아미노산은 치환되거나 화학적으로 변형되어 항체(미모토프)에 대한 친화성을 증진시켰다)는 SADC를 작제하는데 사용될 수 있다. 펩타이드 스크린은 질병-유발 자가항체에 대해 최적화된 친화성을 지닌 펩타이드를 확인하는 목표로 수행될 수 있다. 구조적 또는 화학적 펩타이드 변형의 유연성(flexibility)은 HLA에 대한 펩타이드 결합의 면역원성의 위험 및 따라서 원치않은 면역 자극 위험을 최소화시키기 위한 해결책을 제공하였다.
따라서, 야생형 뿐만 아니라 변형된 선형 및 환형 펩타이드 서열은 자가면역 질환과 관련된 공지된 에피토프로부터 유도되었다. 다양한 길이 및 위치의 펩타이드는 아미노산 치환에 의해 시스템적으로 추정되었고 펩타이드 배열에서 합성되었다. 이는 이러한 서열로부터 유래된 60000개의 환형 및 선형의 야생형 및 미모토프 펩타이드의 스크리닝을 허용하였다. 펩타이드 배열은 자가면역 질환에 관여하는 것으로 알려진 자가항체와 함께 배양되었다. 따라서, 이러한 자가항체를 사용하여 60000개의 펩타이드를 스크리닝하였고 100개의 환형 및 100개의 선형 펩타이드 히트(hit)를 자가항체에 대한 이들의 상대적인 결합 강도를 기반으로 선택하였다. 이러한 200개 펩타이드 중에서, 51개의 서열은 선형 펩타이드 그룹과 환형 펩타이드 그룹 사이에서 동일하였다. 확인된 가장 우수한 펩타이드 모두는 원래의 서열 각각에 대해 정렬하는 경우 적어도 하나의 아미노산 치환을 가졌고 따라서 미모토프로 고려된다. 보다 높은 결합 강도가 환형화된 펩타이드로 달성될 수 있음이 밝혀졌다.
이러한 새로이 확인된 펩타이드, 우선적으로 높은 상대적 결합 값을 가진 펩타이드는 이 특정 에피토프에 대한 자가항체를 제거할 수 있는 SADC를 생성하거나 그들의 서열에 기초하여 추가의 미모토프 및 유도체를 개발하는 데 사용된다.
실시예 5: 다양한 SADC 생물중합체 스캐폴드를 사용한 마우스에서의 신속하고, 선택적인 항체 고갈.
10 μg의 모델 목적하지 않은 항체 mAB 항 V5(Thermo Scientific)를 암컷 Balb/c 마우스(처리 그룹 당 5마리; 9 내지 11주령)에게 복강내 주사한 다음 초기 항체 투여 후 48시간째에 50 μg의 SADC(결합된 표적화된 V5 펩타이드를 지닌 상이한 생물중합체 스캐폴드, 하기 참고)를 정맥내 주사하였다. 턱밑 정맥으로부터 24시간 간격에서 혈액을 수집하였다. 0 hr 시점에 대한 혈액 샘플을 SADC 투여 직전에 취하였다.
혈액을 SADC 투여 후 120시간 시점까지 24시간마다 수집하였다(x-축). SADC 투여 후 혈장 항-V5 IgG 수준의 쇠퇴 및 감소를 코팅된 V5-펩타이드-BSA(펩타이드 서열 IPNPLLGLDC - 서열번호: 134)와 함께 표준 ELISA 과정을 사용하여 항 V5 역가 판독 및 도 4에 나타낸 바와 같은 염소 항 마우스 IgG 바이오(Southern Biotech, diluted 1:2000)에 의한 검출로 측정하였다. 또한, SADC 수준(참고: 실시예 6) 및 면역복합체 형성(참고: 실시예 7)을 분석하였다.
EC50[OD450] 값을 4 매개변수 로지스틱 곡선 핏팅을 사용하여 측정하고 초기 수준(0 시점에서 1로 설정)과 이후 시점(x-축) 사이의 상대적인 신호 쇠퇴를 EC50 값의 비(y-축, 배 신호 감소 EC50)로서 계산하였다. 모든 SADC 펩타이드는 SADC의 직접적인 검출을 위한 태그 및 혈장 샘플로부터의 면역복합체를 함유하였고; SADC에 사용된 펩타이드 서열은: IPNPLLGLDGGSGDYKDDDDKGK(서열번호 135)-(BiotinAca)GC(알부민 스캐폴드 - SADC-ALB를 지닌 SADC, 면역글로불린 스캐폴드 - SADC-IG를 지닌 SADC, 합토글로빈 스캐폴드 - SADC-HP를 지닌 SADC, 및 트랜스페린 스캐폴드 - SADC-TF를 지닌 SADC) 및 음성 대조군 SADC로서 관련되지 않은 펩타이드 VKKIHIPSEKGGSGDYKDDDDKGK(서열번호 136)-(BiotinAca)GC(SADC-CTR)이었다.
5마리 동물의 상이한 처리 그룹에 대한 SADC 스캐폴드는 검정색/회색 음영으로 나타낸다(참고: 도 4의 삽도(inset)).
처리된 그룹은 모조물 처리된 대조군 그룹 SADC-CTL과 비교하는 경우 24 시간째에 이미 신속하고 명백한 항체 감소를 나타내었다(특히 SADC-TF). SADC-CTR은, 이의 펩타이드 서열이 투여된 항 V5 항체에 의해 인식되지 않으므로 항체 저하 활성을 가지지 않기 때문에 정상 항체에 대한 참고로 사용하였다. 따라서, SADC-CTR의 쇠퇴를 추세선(trend line)으로 표시하여 처리된 동물과 모조물 처리된 동물 사이의 항체 수준 차이를 강조하였다.
이러한 실험 조건 하에서 선택적인 항체 저하의 효능을 측정하기 위하여, 2원 ANOVA 시험을 SADC 투여 48시간 후 던네트 다중 비교 시험(Dunnett's multiple comparison test)을 사용하여 수행하였고, 항체 EC50은 SADC-CTR 참고 그룹(추세선)과 비교하여 모든 SADC 그룹에서 크게 유의적으로 감소하였다(p<0.0001). SADC 투여 120 시간째에, 항체 감소는 SADC-ALB 및 SADC-TF 그룹에서 매우 유의적이었고(둘 다 p<0.0001) SADC-HP 그룹에서 유의적(p=0.0292)이었으나, SADC-IG 그룹은 SADC 투여 120 시간 후 EC50 감소를 항한 경향성(p = 0.0722)을 나타내었다. 물론, 선택적인 항체 감소가 SADC 투여 후 모든 시험한 시점에서 SADC-ALB 및 SADC-TF 그룹에서 매우 유의적(p<0.0001)이었다.
모든 SADC 생물중합체 스캐폴드는 항체 수준을 선택적으로 감소시킬 수 있었다고 결론지어진다. 역가 감소는 SADC-ALB 및 SADC-TF로 가장 명확하며 항체 수준의 재결합 또는 재순환은 마지막 시점을 향해 검출되지 않았고, 이는 목적하지 않은 항체가 의도된 바와 같이 분해됨을 시사한다.
실시예 6: SADC 주사 후 24시간째에 혈장 속에서 SADC의 검출
Balb/c 마우스내로 정맥내 주사 후 24시간째에 상이한 SADC 변이체의 혈장 수준. SADC-ALB, -IG, -HP, -TF의 혈장 수준(y-축) 및 음성 대조군 SADC-CTR의 혈장 수준(x-축)의 측정을 실시예 5에 이미 기술된 동물로부터의 혈장에서 검출하였다. 주사된 혈장 SADC 수준은 표준 ELISA로 검출하였으며 이에 의해 SADC가 스트렙타비딘 코팅된 플레이트(Thermo Scientific)와 함께 이의 펩타이드의 이들의 바이오틴 모이어티를 통해 포획되었다. 포획된 SADC는 Flag-태그된 펩타이드를 검출하는 마우스 항 Flag-HRP 항체(Thermo Scientific, 1:2,000 희석됨)로 검출하였다(참고: 또한 실시예 7):
50 μg의 SADC를 정맥내 주사한 후 혈액 속에서 대략 25 μg/ml의 이론적 양을 추정할 때, SADC의 검출가능한 양은 SADC 주사 후 24시간 째에, SADC-ALB 또는 SADC-IG의 경우 799 내지 623 ng/ml 및 SADC-TF의 경우 대략 5000 ng/ml 이하의 범위이었다. 그러나, 놀랍게도 및 대조적으로, SADC-HP 및 대조군 SADC-CTR(이는 또한 SADC-HP 변이체이나, 당해 경우에 관련되지 않은 음성 대조군 펩타이드 E006를 수반한다, 참고: 앞서의 실시예)은 주사 후 24시간째에 순환으로부터 완전히 사라졌고, 더 이상 검출될 수 없었다. 도 5를 참고한다.
이는 본 실시예에서 시험한 합토글로빈 스캐폴드-기반 SADC 둘 다(즉, SADC-HP 및 SADC-CTR)가 면역복합체 형성의 생체내 위험으로 인한 보체 의존성 혈관 및 신장 손상에 있어서 이의 잠재적인 역활과 관련하여 SADC, 예를 들면, SADC-ALB, SADC-IG 또는 SADC-TF보다 장점을 나타내는 비교적 보다 짧은 혈장 반감기를 나타냄을 입증한다. SADC-HP의 다른 장점은 신속한 치료학적 효과가 요구되는 경우에 혈액으로부터 이의 원치않는 표적 항체의 가속화된 청소율이다. 이러한 결과는 합토글로빈-기반 SADC 스캐폴드(SADC-HP 및 SADC-CTR로 나타낸 바와 같음)가 SADC-결합 항체가 혈액 속에 존재하는 여부와 상관없이, 혈액으로부터의 신속한 청소에 적용됨으로써 바람직하지 않은 면역복합체 형성을 최소화하고 신속하고 효율적인 청소를 나타냄을 입증한다. 따라서 본 실시예에서 합토글로빈-기반 SADC, 예를 들면, SADC-HP는 둘 다 주사후 24시간째에 완전히 청소된 SADC-HP 또는 SADC-CTR과는 대조적으로, 기술된 조건 하에서 주사 후 둘 다 24시간째까지 여전히 검출가능한, SADC-TF 또는 SADC-ALB에 의해 입증되는 바와 같이, 다른 SADC 생물중합체 스캐폴드보다 치료학적으로 관련된 장점을 제공한다.
실시예 7: SADC 주사 후 24시간째에 혈장 속에서 SADC - IgG 복합체의 검출
생체내에서 SADC에 결합된 IgG의 양을 측정하기 위하여, 10 μg의 항 V5 IgG(Thermo Scientific)의 정맥내 주사에 이어 항체 주사 후 24시간째에 정맥내 투여된 SADC-ALB, -HP, -TF 및 -CTR(50 μg)의 주사 후, 혈장을, SADC 주사 후 24시간째에, 턱밑 정맥으로부터 수집하고, 이의 바이오티닐화된 SADC-V5-펩타이드 [IPNPLLGLDGGSGDYKDDDDKGK(서열번호 135)(BiotinAca)GC를 통해 또는 SADC-CTR의 경우 음성 대조군 펩타이드 VKKIHIPSEKGGSGDYKDDDDKGK(서열번호 136)(BiotinAca)GC]를 통해 혈장으로부터 SADC를 포획하기 위해 스트렙타비딘 플레이트 상에서 항온처리하였다. 스트렙타비딘-포획된 SADC에 결합된 IgG는 SADC 주사 후 24시간째에 혈장 속에 존재하는 SADC-항체 복합체의 검출을 위한 염소 항 마우스 IgG HRP 항체 (Jackson Immuno Research, 1:2,000으로 희석됨)를 사용한 ELISA로 검출하였다. 처리되지 않은 동물로부터의 음성 대조군 혈청에 대해 수득된 OD450nm 값(y-축)을 배경 보정(background correction)을 위해 시험 그룹의 OD450nm 값(x-축)으로부터 감하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 명백한 항-V5 항체 신호가 SADC-ALB 및 SADC-TF 주사된 마우스의 경우에 관찰되었지만(검정색 바아는, 5마리의 평균 값인, 1:25의 희석에서 배경 보정된 OD 값을 나타낸다; 표준 편차 오차 바아(standard deviation error bar)), 항체 신호는 SADC-HP 또는 대조군 SADC-CTR 주사된 동물에서 검출할 수 없었다(SADC-CTR은 임의의 항 V5 항체에 의해 인식되지 않는 관련없는 펩타이드 바이오-FLG-E006[VKKIHIPSEKGGSGDYKDDDDKGK(서열번호 136)(BiotinAca)GC]를 수반하는 음성 대조군이다). 이는 SADC의 정맥내 적용 후 24 시간째에 혈장 속에서 검출가능한 양의 SADC-HP/IgG 복합체의 부재를 입증한다.
따라서, SADC-HP는 SADC-ALB 또는 SADC-TF와 비교하는 경우 항 V5 예비-주사된 마우스에서 가속화된 청소(clearance)에 적용된다.
실시예 8: SADC -면역글로불린 복합체 형성의 시험관내 분석
SADC-항체 복합체 형성을 PBS +0.1% w/v BSA + 0.1% v/v 트윈20 속에서 증가하는 농도의 SADC-ALB, -IG, -HP, -TF 및 -CTR과 함께 1 μg/ml의 사람 항 V5 항체(항 V5 에피토프 태그 [SV5-P-K], 사람 IgG3, 절대 항체)를 실온에서 2 시간 동안 예비-항온처리하여 시험관내에서 면역복합체가 형성되도록 함으로써 분석하였다. 복합체 형성 후, 샘플을 10 μg/ml의 사람 C1q(CompTech)로 미리 코팅된 ELISA 플레이트에서 실온에서 1시간 동안 항온처리함으로써, 시험관내 형성된 면역 복합체의 포획이 가능하도록 하였다. 복합체를 ELISA에 의해 항 사람 IgG(Fab 특이적인)-퍼옥시다제(Sigma, 1:1,000로 희석됨)를 사용하여 후속적으로 검출하였다. OD450 nm에서 측정된 신호(y-축)는 시험관내에서 항체-SADC 복합체 형성을 반영한다.
도 7에 나타낸 바와 같이, SADC-TF 및 -ALB는 항원-항체 평형으로부터 항원 과다로의 이전으로 인하여 1000ng/ml SADC-TF의 경우에 강력한 신호 및 급격한 신호 저하로 반영되는 바와 같이 명백한 면역복합체 형성 및 C1q에 대한 결합을 나타내었다. 대조적으로, SADC-HP 또는 SADC-IG를 사용한 시험관내 면역 복합체 형성은 본 검정에서 측정한 경우 훨씬 덜 효율적이었다.
생체내 데이타(앞서의 실시예)와 함께, 이러한 발견은 합토글로빈 스캐폴드가 보체 시스템을 활성화시키기 위한 감소된 경향성으로 인하여 다른 SADC 생물중합체 스캐폴드보다 유리하다는 발견을 제공한다. 대조적으로, SADC-TF 또는 SADC-ALB는 보다 높은 복잡성을 나타내므로, 전통적인 보체 경로의 개시와 함께 C1 복합체를 활성화시키는 특정 위험을 수반한다(이러한 위험은 그러나, 일부 설정에 서 견디어질 수 있다).
실시예 9: 시험관내에서 SADC에 의한 IgG 포획의 측정
앞서의 실시예와 유사하게, 증가하는 양의 SADC(x-축에 나타냄)와 함께 1 μg/ml의 마우스 항 V5 항체(Thermo Scientific)를 사용하여 면역복합체를 시험관내에서 형성하도록 하였다. SADC-항체 복합체를 스트렙타비딘 코팅된 ELISA 플레이트에서 바이오티닐화된 SADC-펩타이드를 통해 포획한 다음(참고: 앞서의 실시예), 항 마우스 IgG-HRP(Jackson Immuno Research, 1:2,000으로 희석됨)를 사용하여 결합된 항-V5를 검출하였다.
이러한 검정 조건 하에서, SADC-HP는 SADC-TF 또는 SADC-ALB와 비교하는 경우 시험관내에서 현저히 적은 항체 결합능을 나타내었다(참고: 도 8, A). SADC에서 IgG 검출에 대해 계산된 EC50 값은 SADC-TF, -ALB 및 -HP의 경우 각각 7.0 ng/ml, 27.9 ng/ml 및 55.5 ng/ml이었다(참고: 도 8, B).
이러한 시험관내 발견은 SADC-HP가 원치않는 항체의 고갈을 위한 이의 치료학적 사용과 관련하여 안전성 장점으로서 고려되는 SADC-TF 또는 SADC-ALB와 비교하는 경우 보다 적은 면역복합체 형성능을 가진다는 관찰(참고: 앞서의 실시예)과 일치한다.
실시예 10: 항 CD163 항체 기반 SADC 생물중합체 스캐폴드의 생체 내 기능
항-마우스-CD163 mAB E10B10의 신속한 생체 내 혈액 제거(제WO 2011/039510 A2호에 개시됨). mAB E10B10은 마우스 IgG2a 백본으로 재합성되었다. 50 μg mAb E10B10 및 Mac2-158 (제WO 2011/039510 A2호에 개시된 바와 같이 사람-특이적 항-CD163 mAb, 마우스 CD163에 결합하지 않기 때문에 이 실시예에서 음성 대조군으로 사용됨)을 마우스에 정맥 내 주입하고 ELISA에서 12, 24, 36, 48, 72, 96 시간 후에 측정하여 혈액 제거율을 결정하였다.
직접적인 비교를 위해 둘 다 마우스 IgG2a 아이소타입으로 표현되었지만, E10B10은 마우스 CD163에 결합하는 반면 Mac2-158은 사람 특이적이므로, mAb E10B10은 도 9에 나타낸 바와 같이 대조군 mAb Mac2-158 보다 심지어 더 빠르게 순환계에서 제거되었다.
결론적으로 항-CD163 항체는 제거 프로파일 때문에 SADC 스캐폴드로 매우 적합하다. 이러한 스캐폴드가 있는 SADC는 바람직하지 않은 항체를 순환에서 빠르게 제거한다.
상세한 방법: 50ug의 바이오티닐화 모노클로날 항체 E10B10 및 바이오티닐화 Mac2-158을 마우스로 정맥 내 주사하고 12, 24, 36, 48, 72, 96시간 후에 ELISA로 측정하여 제거율을 결정하였다: 스트렙타비딘 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBS + 0.1% BSA + 0.1% Tween20에 희석된 혈장 샘플과 함께 인큐베이션하였다 (50 ㎕/웰). 세척 후(PBS + 0.1% Tween20으로 3회), 결합된 비오티닐화 항체는 1:1000 희석된 항-마우스 IgG+IgM-HRP 항체로 검출되었다. 세척 후, TMB 기질을 첨가하고 TMB 정지 용액으로 기질의 현상을 정지시켰다. OD450nm의 신호를 측정하였다. EC50 는 제한된 곡선 및 최소 제곱 회귀를 사용한 4 매개변수 곡선 피팅을 사용하여 비선형 회귀로 계산되었다. 시점 T12에서의 EC50 값(항체 주입 후 처음 측정된 시점임)을 100%로 설정하고, 다른 모든 EC50 값을 T12에서의 수준과 비교하였다.
실시예 11: 인자 VIII-중화 항체에 결합하는 펩타이드의 확인
인간 인자 VIII에 대한 중화 항체를 고갈, 제거 또는 불활성화하기 위해 인자 VIII 투여 전에 항 인자 VIII 항체의 파라토프에 결합할 수 있는 짧은 비면역원성 펩타이드를 검색했다.
목표는 항 인자 VIII 중화 항체에 의해 인식되는 펩타이드를 확인하는 것이었다. 그런 다음 이러한 펩타이드는 SADC의 스캐폴드에 부착될 수 있다.
mAb BO2C11은 중화 항체가 발생한 혈우병 환자로부터 분리된 프로토타입 중화 항체를 나타낸다(Jacquemin 1998). 항체는 마우스 IgG2a 불변 사슬을 가진 인간/마우스 키메라 항체로 재복제되었고 펩타이드 어레이에 의한 미세 에피토프 매핑(fine epitope mapping)에 사용되었다.
단클론 항체 BO2C11의 미세 에피토프 매핑: BO2C11은 억제제가 있는 혈우병 A 환자로부터 PBMC를 분리할 때 생성된 프로토타입 중화 항체를 나타낸다. 세포주는 Epstein-Barr 바이러스(EBV)로 불멸화하여 생성되었다. 생성된 세포주를 FVIII의 C2 도메인에 대한 항체의 결합에 대해 테스트하였다. 이 스크리닝 과정에서 BO2C11 세포주는 FVIII의 C2 도메인에 결합하고 또한 FVIII 활성을 억제하는 항체를 분비하기 때문에 선택되었다. (Jacquemin, 1998). 환형 펩타이드 어레이를 사용하여 인자 VIII C2 도메인(Genbank AAA52484.1)으로부터 유래된 환형 펩타이드를 사용하여 항체를 미세 에피토프 맵핑에 적용하였다.
인자 VIII 서열, 서브유닛 C2의 아미노산 위치 2173 내지 2351에 있는 서열을 7mer, 10mer 및 13mer 펩타이드 설계를 위한 출발 서열로 사용하였다. 이들 펩타이드는 펩타이드 마이크로어레이 상에서 합성 및 환형화되었고 이후 다양한 농도의 프로토타입 중화 항체 BO2C11과 함께 인큐베이션되었다. 펩타이드에 대한 mAB BO2C11의 결합 신호는 에피토프 1(18mer) 및 에피토프 2(16mer)로 설계된 여러 인자 VIII 에피토프를 산출했다.
표 1은 mAB BO2C11에 의해 결합된 해당 환형 펩타이드의 정렬을 보여준다. 펩타이드 지정의 수는 Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)를 사용하여 인자 VIII 서열에 대한 정렬을 위해 선택된 최대 50개의 상위 결합제 중에서 펩타이드 마이크로어레이에 대한 항체의 등급이 매겨진 결합 신호(즉, 펩타이드 01이 가장 강하게 결합하고, 02가 두 번째로 강력하게 결합하는 등)에 해당한다.
단클론 항체 GMA-8015의 미세 에피토프 매핑: GMA-8015는 혈우병 A 마우스를 인자 VIII로 면역화함으로써 기존의 마우스 하이브리도마 기술로 생성된 프로토타입 중화 항체를 나타낸다(Healey 등, 2007). Bethesda 분석에 의해 평가된 바와 같이 인자 VIII를 중화시키는 것으로 나타났다. 또한 항체 GMA-8015(항체 4A4라고도 함)는 마우스에서 후천성 혈우병을 유도하는 데 사용됩니다(Keshava 등, 2017).
GMA-8015는 mAB BO2C11과 같이 환형 펩타이드 어레이을 사용하여 인자 VIII A2 도메인(Genbank AAA52484.1)에서 유도된 환형 펩타이드를 사용하여 미세 에피토프 매핑이 수행되었다. A2 도메인에 대한 면역 반응의 다양성은 이전에 예를들어, Markovitz 외, 2013에 설명되었다. 인자 VIII 서열, 서브유닛 A2의 아미노산 위치 337 내지 710에 있는 서열은 7mer, 10mer 및 13mer 펩타이드를 설계하기 위한 출발 서열로 사용되었고, 펩타이드 마이크로어레이에서 합성되고 환형화되었으며, 이어서 다양한 농도의 프로토타입 중화 항체 GMA-8015와 함께 배양되었다. 펩타이드에 대한 GMA-8015의 결합 신호는 에피토프 3(20mer) 및 에피토프 4(14mer)로 설계된 여러 인자 VIII 에피토프를 산출했다. 표 1은 mAB GMA-8015에 의해 결합된 해당 환형 펩타이드의 정렬을 보여준다. 펩타이드 지정의 수는 인자 VIII 서열에 대한 정렬을 위해 선택된 최대 50개의 상위 결합제 중에서 펩타이드 마이크로어레이에 대한 항체의 등급이 매겨진 결합 신호(즉, 펩타이드 01이 가장 강하게 결합하고, 02가 두 번째로 강력하게 결합하는 등)에 해당한다.
단클론 항체 GMA-8021의 미세 에피토프 매핑: GMA-8021은 혈우병 A 마우스를 인자 VIII로 면역화함으로써 기존의 마우스 하이브리도마 기술로 생성된 프로토타입 중화 항체를 나타낸다(Healey 등, 2007). 이는 Bethesda 분석에 의해 평가된 바와 같이 인자 VIII를 중화시키는 것으로 나타났다. 항체는 mAB BO2C11의 경우와 같이 환형 펩타이드 어레이를 사용하여 인자 VIII A2 도메인(Genbank AAA52484.1)에서 유래된 환형 펩타이드를 사용하여 미세 에피토프 매핑에 적용되었다.
인자 VIII 서열, 서브유닛 A2의 아미노산 위치 337 내지 710에 있는 서열은 7mer, 10mer 및 13mer 펩타이드를 설계하기 위한 출발 서열로 사용되었고, 펩타이드 마이크로어레이에서 합성되고 환형화되었으며, 이어서 다양한 농도의 프로토타입 중화 항체 GMA-8021와 함께 배양되었다. 펩타이드에 대한 GMA-8021의 결합 신호는 에피토프 5(16mer), 에피토프 6(15mer) 및 에피토프 7(16mer)로 설계된 여러 인자 VIII 에피토프를 산출했다. 표 1은 mAB GMA-8021에 의해 결합된 해당 환형 펩타이드의 정렬을 보여준다. 펩타이드 지정의 수는 인자 VIII 서열에 대한 정렬을 위해 선택된 최대 50개의 상위 결합제 중에서 펩타이드 마이크로어레이에 대한 항체의 등급이 매겨진 결합 신호(즉, 펩타이드 01이 가장 강하게 결합하고, 02가 두 번째로 강력하게 결합하는 등)에 해당한다.
단클론 항체 GMA-8014의 미세 에피토프 매핑:
GMA-8014는 혈우병 A 마우스를 인자 VIII(Healey 등, 2007)로 면역화하여 기존의 마우스 하이브리도마 기술로 생성된 프로토타입 중화 항체를 나타낸다. 이는 Bethesda 분석에 의해 평가된 바와 같이 인자 VIII를 중화시키는 것으로 나타났다. 항체는 mAB BO2C11에서와 같이 환형 펩타이드 어레이를 사용하여 인자 VIII C2 도메인(Genbank AAA52484.1)에서 유래된 환형 펩타이드를 사용하여 미세 에피토프 매핑에 적용되었다.
인자 VIII 서열, 서브유닛 C2의 아미노산 위치 2173 내지 2351에 있는 서열은 7mer, 10mer 및 13mer 펩타이드를 설계하기 위한 출발 서열로 사용되었고, 펩타이드 마이크로어레이에서 합성 및 환형화되었고, 이어서 다양한 농도의 프로토타입 중화 항체 GMA-8014와 함께 인큐베이션되었다. 펩타이드에 대한 GMA-8014의 결합 신호는 에피토프 8(10mer), 에피토프 9(15mer), 에피토프 10(10mer), 에피토프 11(15mer) 및 에피토프 12(13mer)로 설계된 여러 인자 VIII 에피토프를 산출했다. 표 1은 mAB GMA-8014에 의해 결합된 해당 환형 펩타이드의 정렬을 보여준다. 펩타이드 지정의 수는 인자 VIII 서열에 대한 정렬을 위해 선택된 최대 50개의 상위 결합제 중에서 펩타이드 마이크로어레이에 대한 항체의 등급이 매겨진 결합 신호(즉, 펩타이드 01이 가장 강하게 결합하고, 02가 두 번째로 강력하게 결합하는 등)에 해당한다.
단클론 항체 GMA-8008의 미세 에피토프 매핑: GMA-8008은 혈우병 A 마우스를 인자 VIII로 면역화함으로써 기존의 마우스 하이브리도마 기술로 생성된 프로토타입 중화 항체를 나타낸다(Healey 등, 2007). 이는 Bethesda 분석에 의해 평가된 바와 같이 VIII 인자를 중화시키는 것으로 나타났다. 항체는 mAB BO2C11에서와 같이 환형 펩타이드 어레이를 사용하여 인자 VIII C2 도메인(Genbank AAA52484.1)에서 유래된 환형 펩타이드를 사용하여 미세 에피토프 매핑에 적용되었다.
인자 VIII 서열, 서브유닛 C2의 아미노산 위치 2173 내지 2351에 있는 서열은 7mer, 10mer 및 13mer 펩타이드를 설계하기 위한 출발 서열로 사용되었고, 펩타이드 마이크로어레이에서 합성 및 환형화되었고, 이어서 다양한 농도의 프로토타입 중화 항체 GMA-8008와 함께 인큐베이션되었다. 펩타이드에 대한 GMA-8008의 결합 신호는 에피토프 13(13mer), 에피토프 14(9mer) 및 에피토프 15(19mer)로 설계된 여러 인자 VIII 에피토프를 산출했다. 표 1은 mAB GMA-8008에 의해 결합된 해당 환형 펩타이드의 정렬을 보여준다. 펩타이드 지정의 수는 인자 VIII 서열에 대한 정렬을 위해 선택된 최대 50개의 상위 결합제 중에서 펩타이드 마이크로어레이에 대한 항체의 등급이 매겨진 결합 신호(즉, 펩타이드 01이 가장 강하게 결합하고, 02가 두 번째로 강력하게 결합하는 등)에 해당한다.
종합하면, 중화 프로토타입 항체에 존재하는 확인된 에피토프(epitope) 서열은 다음과 같다:
BO2C11:
에피토프1: STLRMELMGCDLNSCSMP (서열번호 1)(Genbank AAA52484.1을 기반으로 aa 2179-2196)
에피토프2: IALRMEVLGCEAQDLY (서열번호 2)(Genbank AAA52484.1을 기반으로 aa 2336-2351)
GMA-8015
에피토프3: QYLNNGPQRIGRKYKKVRFM (서열번호 3)(Genbank AAA52484.1을 기반으로 aa 429-448)
에피토프4: LYGEVGDTLLIIFK (서열번호 4)(Genbank AAA52484.1을 기반으로 aa 472-485)
GMA-8021
에피토프05: NGPQRIGRKYKKVRFM (서열번호 5) (Genbank AAA52484.1을 기반으로 aa 433-448)
에피토프06: KSQYLNNGPQRIGRK (서열번호 6) (Genbank AAA52484.1을 기반으로 aa 427-441)
에피토프07: PHGITDVRPLYSRRLP (서열번호 7) (Genbank AAA52484.1을 기반으로 aa 496-511)
GMA-8014
에피토프08: THYSIRSTLR (서열번호 8) (Genbank AAA52484.1을 기반으로 aa 2173-2182)
에피토프09: KARLHLQGRSNAWRP (서열번호 9) (Genbank AAA52484.1을 기반으로 aa 2226-2240)
에피토프10: QDGHQWTLFF (서열번호 10) (Genbank AAA52484.1을 기반으로 aa 2285-2294)
에피토프11: NSLDPPLLTRYLRIH (서열번호 11) (Genbank AAA52484.1을 기반으로 aa 2314-2328)
에피토프12: IHPQSWVHQIALR (서열번호 12) (Genbank AAA52484.1을 기반으로 aa 2327-2339)
GMA-8008
에피토프13: SSSQDGHQWTLFF (서열번호 13) (Genbank AAA52484.1을 기반으로 aa 2282-2294)
에피토프14: MGCDLNSCS (서열번호 14) (Genbank AAA52484.1을 기반으로 aa 2186-2194)
에피토프15: VHQIALRMEVLGCEAQDLY (서열번호 15) (Genbank AAA52484.1을 기반으로 aa 2333-2351)
놀랍게도, 다음 에피토프가 항체 쌍 사이에 공유되고 항 인자 VIII 항체에 의한 인자 VIII 에피토프의 일반적인 구조적 접근성을 가리키는 세 가지 경우 중 두 가지 경우에서 중첩된다는 것이 밝혀졌다:
에피토프10 ---QDGHQWTLFF (서열번호 10)
에피토프13 SSSQDGHQWTLFF (서열번호 13)
에피토프02 ---IALRMEVLGCEAQDLY (서열번호 2)
에피토프15 VHQIALRMEVLGCEAQDLY (서열번호 15)
에피토프06 KSQYLNNGPQRIGRK------- (서열번호 6)
에피토프03 --QYLNNGPQRIGRKYKKVRFM (서열번호 3)
에피토프06과 에피토프03을 기반으로 더 긴 에피토프16을 정의할 수 있다: KSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFM (서열번호 16).
이러한 에피토프로부터 항 FVIII 항체를 중화함으로써 인식되는 펩타이드를 설계할 수 있다. 이러한 펩타이드는 SADC 구성, 새로운 미모토프(mimotope) 개발, 혈우병 환자의 중화 항체 진단 및 분류(-typing)를 위한 펩타이드 개발에 사용할 수 있다.
서열번호 펩타이드 서열
1 에피토프01 STLRMELMGCDLNSCSMP
17 02 -----ELMGCDLNSC---
18 03 --------GCDLNSC---
19 06 -----ELMGCDL------
20 07 ---------CDLNSCS--
21 08 ----MELMGCD-------
22 10 STLRMELMGC--------
23 11 --------GCDLNSCSMP
24 15 -----------LNSCSMP
25 17 ---RMELMGCDLN-----
26 18 ---RMELMGC--------
27 20 --LRMELMGCDLNSC---
28 24 ------LMGCDLN-----
29 30 -----ELMGCDLNSCSMP
2 에피토프02 IALRMEVLGCEAQDLY --
30 01 ---------CEAQDLY--
31 04 ------VLGCEAQDLY--
32 05 ---RMEVLGCEAQDLY--
33 09 ----MEVLGCE-------
34 12 ----MEVLGCEAQDLYG-
35 13 -----EVLGCEAQDLYGS
36 14 ---RMEVLGC--------
37 16 -----EVLGCEA------
38 19 IALRMEVLGC--------
3 에피토프3 QYLNNGPQRIGRKYKKVRFM
39 01 -----GPQRIGRKYKKVR--
40 02 ------PQRIGRKYKKVRF-
41 03 --------RIGRKYKKVR--
42 04 ---NNGPQRIGRKYKK----
43 05 -------QRIGRKYKKV---
44 06 ----NGPQRIGRKYKKV---
45 07 -------QRIGRKYKKVRFM
46 08 ------PQRIGRKYKK----
47 10 --LNNGPQRIGRKYK-----
48 11 ---------IGRKYKKVRF-
49 18 -----GPQRIGRKYK-----
50 20 -----------RKYKKVR--
51 21 QYLNNGPQRIGRK-------
4 에피토프4 LYGEVGDTLLIIFK
52 09 ---EVGDTLLIIF-
53 12 LYGEVGDTLLIIF-
54 13 ------DTLLIIF-
55 15 ----VGDTLLIIFK
56 17 --GEVGDTLLII--
57 19 -------TLLIIFK
5 에피토프05 NGPQRIGRKYKKVRFM
58 02 -GPQRIGRKYKKVR--
59 04 NGPQRIGRKYKKV---
60 06 --PQRIGRKYKKVRF-
61 07 ----RIGRKYKKVR--
62 09 ---QRIGRKYKKV---
63 16 ---QRIGRKYKKVRFM
64 18 -------RKYKKVR--
65 20 --PQRIGRKYKK----
66 21 -GPQRIGR--------
67 25 -GPQRIGRKYK-----
68 26 --PQRIGRK-------
6 에피토프06 KSQYLNNGPQRIGRK
69 13 KSQYLNNGPQRIG--
70 14 -SQYLNNGPQRIGR-
71 22 --QYLNNGPQRIGRK
72 23 ----LNNGPQRIGR-
73 28 ---YLNNGPQRIG--
74 29 -----NNGPQRIGRK
75 30 ------DGPTKSD--
7 에피토프07 PHGITDVRPLYSRRLP
76 01 -HGITDVRPLYSRR--
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16 에피토프16 KSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFM
실시예 12: 혈우병 A 환자에 SADC의 투여.
본질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 SADC를 제조하고, 생물중합체 스캐폴드로서 인간 트랜스페린을 사용한다.
N-말단 시스테닐화 펩타이드 서열번호 39 및/또는 C-말단 시스테닐화 펩타이드 서열번호 107은 설포-GMBS-활성화 인간 트랜스페린(sulfo-GMBS-activated human transferrin)을 사용하여 스캐폴드에 연결되어, 해당 생물중합체 스캐폴드의 라이신에 공유적으로(covalently) 부착되는 해당 시스테닐화된 펩타이드와 함께 트랜스페린 기반 SADC를 제공한다. 이러한 SADC 접합체는 PBS에서 정제 및 재현탁된다.
환자의 혈장에서 중화 항체를 감소시켜 인간 인자 VIII 치료의 효능을 증가시키기 위해, 인간 인자 VIII로 치료를 받고 인간 인자 VIII에 대한 중화 항체가 발생한 3명의 혈우병 A 환자에게 각각 재현탁된 SADC 접합체 150 mg, 250 mg 및 500 mg을 정맥내 투여한다.
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<223> peptide <400> 141 Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp Ser 1 5 10 <210> 142 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 142 Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp 1 5 <210> 143 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 143 Glu Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp Ser Met Glu 1 5 10 <210> 144 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 144 Gln Glu Glu Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp Ser 1 5 10 <210> 145 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 145 Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp Ser Met Glu Ala 1 5 10 <210> 146 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 146 Glu Glu Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp Ser Met 1 5 10 <210> 147 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 147 Val Gln Glu Glu Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp 1 5 10 <210> 148 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 148 Glu Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp 1 5 10 <210> 149 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 149 Asp His Val Ser Cys Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp Cys Lys 1 5 10 15 His Asp Gly Trp Gly 20 <210> 150 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 150 Glu Ser Ala Leu Trp 1 5 <210> 151 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 151 Glu Ser Ala Leu Trp Asp Cys 1 5 <210> 152 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 152 Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp Cys 1 5 10 <210> 153 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 153 Ser Cys Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp 1 5 10 <210> 154 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 154 Val Ser Cys Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp Cys 1 5 10 <210> 155 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 155 Ala Leu Trp Asp Cys Lys His Asp Gly Trp 1 5 10 <210> 156 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 156 Asp His Val Ser Cys Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp 1 5 10 <210> 157 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 157 Cys Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp 1 5 10 <210> 158 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 158 Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp Cys Lys His Asp Gly Trp 1 5 10 <210> 159 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 159 Glu Ser Ala Leu Trp Asp Cys Lys His Asp Gly Trp Gly 1 5 10 <210> 160 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 160 Ser Ser Leu Gly Gly Thr Asp Lys Glu Leu Arg Leu Val Asp Gly Glu 1 5 10 15 Asn Lys Cys Ser 20 <210> 161 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 161 Ser Ser Leu Gly Gly Thr Asp Lys Glu Leu Arg 1 5 10 <210> 162 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 162 Ser Ser Leu Gly Gly 1 5 <210> 163 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 163 Ser Ser Leu Gly Gly Thr Asp Lys Glu Leu 1 5 10 <210> 164 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 164 Ser Ser Leu Gly Gly Thr Asp Lys Glu 1 5 <210> 165 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 165 Ser Ser Leu Gly Gly Thr Asp Lys 1 5 <210> 166 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 166 Ser Ser Leu Gly Gly Thr Asp 1 5 <210> 167 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 167 Ser Ser Leu Gly Gly Thr 1 5

Claims (15)

  1. 화합물로서,
    생물중합체(biopolymer) 스캐폴드 및 6-13개 아미노산의 서열 길이를 갖는 인자 VIII로부터 유래된 적어도 2개의 펩타이드를 포함하되,
    여기서 각각의 펩타이드는 독립적으로 인자 VIII의 아미노산 서열 중 6-아미노산 단편, 바람직하게는 7-, 더 바람직하게는 8-, 더욱 더 바람직하게는 9-, 더욱 더 바람직하게는 10-, 더욱 더 바람직하게는 11-, 훨씬 더 바람직하게는 12-, 가장 바람직하게는 13-아미노산 단편을 포함하고,
    임의로 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 임의의 다른 아미노산에 의해 독립적으로 치환된, 화합물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 각각의 펩타이드는 독립적으로:
    STLRMELMGCDLNSCSMP (서열번호 1), IALRMEVLGCEAQDLY (서열번호 2), QYLNNGPQRIGRKYKKVRFM (서열번호 3), LYGEVGDTLLIIFK (서열번호 4), NGPQRIGRKYKKVRFM (서열번호 5), KSQYLNNGPQRIGRK (서열번호 6), PHGITDVRPLYSRRLP (서열번호 7), THYSIRSTLR (서열번호 8), KARLHLQGRSNAWRP (서열번호 9), QDGHQWTLFF (서열번호 10), NSLDPPLLTRYLRIH (서열번호 11), IHPQSWVHQIALR (서열번호 12), SSSQDGHQWTLFF (서열번호 13), MGCDLNSCS (서열번호 14), VHQIALRMEVLGCEAQDLY (서열번호 15), 및 KSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFM (서열번호 16)으로 이루어진 그룹에서 선택된, 바람직하게는 SSSQDGHQWTLFF (서열번호 13), VHQIALRMEVLGCEAQDLY (서열번호 15), 및 KSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFM (서열번호 16)으로부터 선택된 아미노산 서열 중 6-아미노산 단편, 바람직하게는 7-, 더 바람직하게는 8-, 더욱 더 바람직하게는 9-, 더욱 더 바람직하게는 10-, 더욱 더 바람직하게는 11-, 훨씬 더 바람직하게는 12-, 가장 바람직하게는 13-아미노산 단편을 포함하고,
    임의로 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 임의의 다른 아미노산에 의해 독립적으로 치환된, 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    여기서 상기 적어도 2개의 펩타이드는 펩타이드 P1 및 펩타이드 P2를 포함하고, 여기서 P1 및 P2는 독립적으로 제1항 또는 제2항에 정의된 바와 같은 6-아미노산 단편, 바람직하게는 7-, 더 바람직하게는 8-, 더 바람직하게는 9-, 더욱 더 바람직하게는 10-, 훨씬 더 바람직하게는 11-, 특히 12-, 가장 바람직하게는 13-아미노산 단편을 포함하고, 여기서 P1 및 P2는 펩타이드 이량체 P 1 - S - P 2 의 형태로 존재하며, 여기서 S는 비-펩타이드 스페이서이고, 여기서 상기 펩타이드 이량체는 바람직하게는 링커를 통해 상기 생물중합체 스캐폴드에 공유 결합된, 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생물중합체 스캐폴드는 인간 글로불린 및 인간 알부민으로부터 선택되는 것인, 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 적어도 2개의 펩타이드 중 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개의 펩타이드 각각이 환형화(circularize)된 것인, 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물은 인간에서 비면역원성인, 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 상기 각각의 펩타이드는 독립적으로 서열번호 17 내지 126으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 더 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 또는 이의 6-, 바람직하게는 7-, 더 바람직하게는 8-, 더 바람직하게는 9-, 더욱 더 바람직하게는 10-, 훨씬 더 바람직하게는 11-, 가장 바람직하게는 12-아미노산 단편에 의해 독립적으로 치환된, 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 상기 각각의 펩타이드는 독립적으로 서열번호 17 내지 126으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되고, 임의로 여기서 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개의 아미노산이 임의로 N-말단 및/또는 C-말단 시스테인 잔기를 갖는 임의의 다른 아미노산에 의해 독립적으로 치환된, 화합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생물중합체(biopolymer) 스캐폴드는 인간 트랜스페린인 것을 특징으로 하는, 화합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 화합물 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    여기서 조성물 중 펩타이드 대 스캐폴드의 몰비는 2:1 내지 100:1, 바람직하게는 3:1 내지 90:1, 보다 바람직하게는 4:1 내지 80:1, 보다 더 바람직하게는 5:1 내지 70:1, 훨씬 더 바람직하게는 6:1 내지 60:1, 특히 7:1 내지 50:1 또는 심지어 8:10 내지 40:1인, 약제학적 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    인자 VIII 대체 제품, 바람직하게는 인자 VIII, 가장 바람직하게는 인간 인자 VIII를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  13. 제10항 또는 제12항에 있어서,
    개체에서 혈우병 A, 바람직하게는 선천성 혈우병 A 및/또는 후천성 혈우병 A의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    여기서 상기 약제학적 조성물은 개체에게 투여되고,
    여기서 인자 VIII 대체 제품, 바람직하게는 인자 VIII, 가장 바람직하게는 인간 인자 VIII은 상기 조성물이 투여되기 전 또는 상기 조성물이 투여된 후에 상기 조성물과 조합하여 개체에게 투여되고,
    바람직하게는 여기서 상기 조성물은 96시간 범위(window) 내에 적어도 2회 투여되고, 상기 범위 이후 24시간 이내에 인자 VIII 대체 제품의 투여가 뒤따르는, 약제학적 조성물.
  15. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    개체에서 인자 VIII 대체 제품, 바람직하게는 인자 VIII, 보다 바람직하게는 인간 인자 VIII의 중화 및/또는 억제의 억제에 사용하기 위한 것으로서, 바람직하게는 여기서 약제학적 조성물은 96시간 범위 내에 적어도 2회 투여되고, 여기서 상기 범위 이후 24시간 이내에 인자 VIII 대체 제품의 투여가 뒤따르는, 약제학적 조성물.
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