CN105120894B - 新颖的免疫治疗分子和其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明大体上涉及与对花生过敏或对其它树生坚果过敏的受试者中的T淋巴细胞发生免疫相互作用的分子，诸如肽、多肽和蛋白质，以及编码所述分子的基因序列。这些分子优选地与对Ara h 1过敏原过敏的受试者中的T细胞发生免疫相互作用。本发明的分子适用于开发诊断剂、治疗剂以及预防剂用于特征为对Ara h 1或其衍生物或同源物的异常、不当或其它方面不需要的免疫响应的病状。
Description
技术领域
本发明大体上涉及与对花生过敏或对其它树生坚果过敏的受试者中的T淋巴细胞发生免疫相互作用的分子，诸如肽、多肽和蛋白质，以及编码所述分子的基因序列。这些分子优选地与对Ara h 1过敏原过敏的受试者中的T细胞发生免疫相互作用。本发明的分子适用于开发诊断剂、治疗剂以及预防剂用于特征为对Ara h 1或其衍生物或同源物的异常、不当或其它方面不需要的免疫响应的病状。
发明背景
在本说明书中作者所提及的出版物的书目详情在描述结尾处按字母顺序集中起来。
在本说明书中对任何现有技术的参考不是并且不应被视为现有技术在澳大利亚构成公知常识的一部分的认可或任何形式的暗示。
花生过敏是威胁生命并且不可治愈的病症，其影响约1％的一般群体(Husain等，JAm Acad Dermatol.66(1)：136-43，2012；Burks，Lancet.371(9623)：1538-46，2008)。花生过敏的特征为过敏反应的突然发作，其可能在暴露于极少量的花生蛋白下发生(Hourihane等，J Allergy Clin Immunol 100：596-600，1997；Pumphrey，Current Opinion inAllergy&Clinical Immunology.4(4)：285-90，2004)。坚果诱导的过敏反应最常与死亡率或与威胁生命的特征相关联(Bock等，J Allergy Clin Immunol.119(4)：1016-8，2007；Burks 2008，同上)。花生蛋白常常隐藏在表面上安全的食物来源内，这使得在5年期间多达50％的受害者发生偶然接触(Sicherer等，Paediatrics 102：e6，1998)。并不意外的是，坚果过敏与受害者和护理者同样的显著心理发病率相关联，这与患有诸如类风湿性关节炎的慢性衰弱疾病的那些人所遭受的类似(Primeau等，Clin Exp Allergy 30：1135-43，2000；Kemp等，Med.J.Aust.188(9)：503-4，2008)。尽管治愈对于去除造成死亡率的一个原因的坚果过敏是迫切的，但也有必要去除花生过敏受试者所承受的长期心理负担。
迄今为止，在免疫疗法上对花生过敏所作的努力已经取得了极其有限的成功。Nelson等已经显示，可以使用快速免疫疗法方案诱导对花生的耐受，但那种耐受在维持给药期间在约一半的受试者中损失，另外，注射与在建立期与维持期中大多数受试者的过敏反应的频繁发作相关联(Nelson等，J Allergy Clin Immunol 99：744-51，1997)。Oppenheimer等在其研究中展示类似的发现，这再次显示主动疗法与高比率的全身过敏反应相关联。在将花生提取物施用于安慰剂随机的受试者导致其死亡之后终止那项研究中的数据收集，这突出了这种病状的危险性质(Oppenheimer等，J Allergy Clin Immunol 90：256-62，1992)。使用整个花生粉的口服免疫疗法的最新研究鼓励脱敏是可行的，但所观测到的不良反应突出了主要的安全问题(Hofmann等，J.Allergy Clin.Immunol.124，286，2009；Jones等，J.Allergy Clin.Immunol.24，292，2009；Clark等，Allergy 64，1218，2009；Varshney等，J Allergy Clin Immunol.127(3)：654-60，2011；Varshney等，J AllergyClin Immunol.124(6)：1351-2，2009；Anagnostou等，Clin Exp Allergy.41(9)：1273-81，2011；Allen和O′Hehir.Clin Exp Allergy.41(9)：1172-4，2011；Yu等，Int Arch AllergyImmunol.159(2)：179-182，2012；Thyagarajan等，J Allergy Clin Immunol.126(1)：31-2，2010；Blumchen等，J Allergy Clin Immunol.126(1)：83-91，2010)。即使排除有重度症状或哮喘倾向的儿童，但两项研究报道了过敏发作，在一个病例中在初始食物激发期间(Clark等，Allergy 64，1218，2009)并且在另一个病例中在治疗先前没有经历过敏反应的儿童期间(Hofmann等，J.Allergy Clin.Immunol.124，286，2009)。
克服与过敏原免疫疗法相关的发病率的新颖策略的开发取决于对成功的免疫疗法的免疫学基础以及免疫疗法的副作用的准确理解。长久以来已经确立了因过敏原免疫疗法所致的发病率是由于IgE的交联，并且这种作用不是所述疗法有效所需要的(Litwin等，Int Arch Allergy Appl Immunol 87：361-61，998)。还已知，产生耐受的免疫疗法的关键作用之一是其能够将主要的特异性T细胞表型从TH2变为调控性表型。这些调控性T细胞经由产生抗炎性细胞因子IL-10和/或TGFβ而起作用(Akdis和Akdis，J Allergy ClinImmunol.123：735-46，2009；Akdis和Akdis，Nature Reviews：Drug Discovery.8：645-60.2009；Akdis和Akdis，J Allergy Clin Immunol.127：18-27，2011)。
抗体响应与淋巴细胞响应的关键差异在于抗原识别，抗体依靠分子三级结构识别构象表位，而CD4+T细胞识别短的线性肽。抗原识别的这种差异是免疫疗法的许多新颖策略的基础，包括基于T细胞表位、B细胞表位突变体以及改变的肽配体来使用肽(Rolland等，Pharmacology&Therapeutics 121：273-284，2009)。所述方法全部取决于分子三级结构的改变或不存在，这样IgE交联和效应细胞活化损失。肽免疫疗法是存在功效证据的方法，对于猫毛屑过敏与蜂毒过敏都有记录。三项不同研究显示，在不存在任何全身副作用的情况下，可以使用含T细胞表位的序列对主要蜂毒过敏原磷脂酶A2(PLA2)实现耐受(Muller等，JAllergy Clin Immunol.101：747-54，1998；Tarzi等，Clin Exp Allergy.36：465-74，2006；Fellrath等，J Allergy Clin Immunol.111：854-61，2003)，而若干研究已经展示，基于主要猫过敏原Fel d 1的结构的肽可以用于诱导减小的临床响应(Norman等，Am J RespirCrit Care Med 154：1623-8，1996；Marcotte等，J Allergy Clin Immunol 101：506-13，1998；Pene等，J Allergy Clin Immunol 102：571-8，1998；Oldfield等，Lancet 360：47-53，2002；Alexander等，Clin Exp Allergy 35：52-8，2004；Alexander等，Allergy 60：1269-74，2005)。最近，IIa期试验确认了来自Fel d 1(ToleromuneCicassia Ltd.，Oxford，UK)的七肽混合物的安全性、耐受性以及潜在功效(Worm等，J Allergy ClinImmunol.127：89-97，2011)，并且IIb期试验现在正在进行中(Moldaver和Larche.Allergy.66：784-91，2011)。开发所述策略至关重要的是保留T细胞表位，以使得可以诱导T细胞表型变化。
直接结合至MHC II类分子上的能力允许肽被非专职或不成熟的APC呈递，而无需促进诱导响应性T细胞的耐受、无反应性和/或抑制活性的促发炎和共刺激信号(Moldaver和Larche，Allergy 66：784-91，2011)。这还允许肽以比从整个分子加工的肽更高的频率呈递(Santambrogio等，Proc NatlAcadSci U S A，1999，96：15056-61)，并且因为其也比整个过敏原更安全，所以可以给予更高浓度的肽，由此更有效地再极化T细胞响应。
重要地，靶向对主要过敏原的显性表位具特异性的T细胞可以改变对整个过敏原提取物的响应(连锁抑制)。报道在鼠类过敏模型中成功的肽免疫疗法的许多研究展示，施用主要过敏原的显性T细胞表位肽不仅诱导对那些肽的耐受，而且诱导对纯化的过敏原和整个过敏原提取物的耐受(Yang等，Clin Exp Allergy 40(4)：668-78，2010；Yoshitomi等，J Pept Sci.13(8)：499-503，2007；Marazuela等，Mol Immunol.45(2)：438-45，2008；Rupa等，Allergy.67(1)：74-82，2012；Hoyne等，J Exp Med.178(5)：1783-8，1993；Hall等，Vaccine.21(5-6)：549-61，2003)。
因此，需要鉴别主要花生过敏原并且进一步鉴别这些过敏原的T细胞表位。这些表位的鉴别表征和分析对于开发特异性诊断和免疫治疗方法是关键的。为此，尽管Ara h 1花生过敏原分子先前已经成为分析的主题，但尚未实现对开发有效疫苗必不可少的T细胞核心表位区的鉴别。另外，先前研究已经受以下事实所限制：这些研究是基于HLA-DR四聚体的使用，从而阻止检测由其它HLA类型呈递的表位。因为跨越一般群体的疫苗的有效性需要讨论中的表位可以跨越一系列不同HLA类型而呈递，所以不仅需要鉴别Ara h 1分子内的T细胞表位，而且需要进一步鉴别显性的并且可以由代表群体的各种HLA类型有效呈递的表位。
在引出本发明的工作中，已经鉴别了显性HLA简并Ara h 1核心表位区。这个群组的核心表位区的独特之处在于其特别高的功效水平。不同于先前研究的仅基于展现一定水平的T细胞反应性的能力而鉴别的20mer Ara h 1肽，本发明的序列是一组选定的核心T细胞表位区，其相对于其它Ara h 1肽片段是免疫显性的，并且由于其结合至两种或更多种HLA类型也是HLA简并的。另外，这些表位核心区是由HLA-DQ分子呈递。HLA-DQ分子在混合群体中比HLA-DR分子更保守。因此，在HLA-DQ上呈递的肽能够实现更广泛的群体覆盖。这个特定群组的核心表位区的鉴别已经首次推动开发治疗特征为对Ara h 1或其衍生物或同源物的异常、不当或其它方面不需要的免疫响应、其它树生坚果过敏或对含有Ara h 1过敏原的组合物(诸如食物)过敏的病状的有效方法。这些表位的鉴别还已经推动开发对应的诊断技术。
发明概述
在本说明书和以上权利要求书通篇，除非上下文另有要求，否则词语“包含”以及诸如“包含了”和“包含着”的变化形式应理解为意味着包括规定的整数或步骤或者整数或步骤的群组，但不排除任何其它整数或步骤或者整数或步骤的群组。
如本文所用的术语“来源于”应被视为指示特定的整数或整数的群组已经源自于指定的物质，但不一定直接从指定的来源获得。此外，除非上下文另有明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个(a/an)”和“这个”包括复数个指示物。
除非另有规定，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。
本说明书含有使用本文中在参考书目之后呈现的程序PatentIn版本3.5制作的氨基酸序列信息。每个氨基酸序列在序列表中由数字指示符<210>继之以序列标识符(例如<210>1、<210>2等)鉴别。每个序列的长度、序列类型(蛋白质等)以及生物体来源分别由数字指示符字段<211>、<212>以及<213>所提供的信息指示。说明书中所提及的氨基酸序列由指示符SEQ ID NO：继之以序列标识符(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2等)鉴别。说明书中所提及的序列标识符与序列表中数字指示符字段<400>继之以序列标识符(例如，<400>1、<400>2等)所提供的信息相关联。就是说，如说明书中详述的SEQ ID NO：1与如序列表中<400>1所指示的序列相关联。
本发明的一个方面涉及一种组合物，其包含一个或多个选自由以下组成的清单的Ara h 1 T细胞核心表位区：
(i)FQNLQNHR(SEQ ID NO：1)
(ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
(iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
(iv)FGKLFEVK(SEQ ID NO：4)
(v)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：5)
(vi)EGALML(SEQ ID NO：6)
(vii)PHFNSKAMVIV(SEQ ID NO：7)
(viii)IVVVN(SEQ ID NO：8)
(ix)VVNKGTGNLEL(SEQ ID NO：9)
(x)IMPAAHP(SEQ ID NO：10)
或其功能衍生物或同源物。
在一个相关方面，本发明涉及一种组合物，其包含一种或多种肽，这些肽中的每一者长度为至多60个连续氨基酸并且这些肽包括一个或多个选自由以下组成的清单的Ara h1 T细胞核心表位区：
(ii)FQNLQNHR(SEQ ID NO：1)
(ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
(iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
(iv)FGKLFEVK(SEQ ID NO：4)
(v)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：5)
(vi)EGALML(SEQ ID NO：6)
(vii)PHFNSKAMVIV(SEQ ID NO：7)
(viii)IVVVN(SEQ ID NO：8)
(ix)VVNKGTGNLEL(SEQ ID NO：9)
(x)IMPAAHP(SEQ ID NO：10)
或其功能衍生物或同源物。
在本发明的前述方面的一个实施方案中，所述肽或表位当呈递至从患有特征为对Ara h 1的异常、不需要或其它方面不当的免疫响应的病状的受试者中分离的T细胞时能够修饰T细胞功能，但这些肽不能结合至Ara h 1特异性IgE。
在另一个相关方面，提供了一种组合物，其包含一种或多种肽，这些肽中的每一者长度为至多60个连续氨基酸并且这些肽包括一个或多个选自由以下组成的清单的Ara h 1T细胞核心表位区：
(i)FQNLQNHR(SEQ ID NO：1)
(ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
(iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
(iv)FGKLFEVK(SEQ ID NO：4)
(v)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：5)
(vi)EGALML(SEQ ID NO：6)
(vii)PHFNSKAMVIV(SEQ ID NO：7)
(viii)IVVVN(SEQ ID NO：8)
(ix)VVNKGTGNLEL(SEQ ID NO：9)
(x)IMPAAHP(SEQ ID NO：10)
或其功能衍生物或同源物，这些肽当施用于患有特征为Ara h 1超敏或对包含Arah 1的组合物超敏的病状的受试者时能够减轻所述超敏。
在另一个方面，提供了一种组合物，其包含一种或多种肽，这些肽中的每一者长度为至多60个连续氨基酸并且这些肽包括表位NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)以及一个或多个选自由以下组成的清单的Ara h 1 T细胞核心表位区：
(i)FQNLQNHR(SEQ ID NO：1)
(ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
(iii)FGKLFEVK(SEQ ID NO：4)
(iv)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：5)
(v)EGALML(SEQ ID NO：6)
(vi)PHFNSKAMVIV(SEQ ID NO：7)
(vii)IVVVN(SEQ ID NO：8)
(viii)VVNKGTGNLEL(SEQ ID NO：9)
(ix)IMPAAHP(SEQ ID NO：10)
或其功能衍生物或同源物。
在另一个方面，提供了一种组合物，其包含一种或多种肽，这些肽中的每一者长度为至多60个连续氨基酸并且这种肽包括表位EGALML(SEQ ID NO：6)以及一个或多个选自由以下组成的清单的Ara h 1 T细胞核心表位区：
(i)FQNLQNHR(SEQ ID NO：1)
(ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
(iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
(iv)FGKLFEVK(SEQ ID NO：4)
(v)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：5)
(vi)PHFNSKAMVIV(SEQ ID NO：7)
(vii)IVVVN(SEQ ID NO：8)
(viii)VVNKGTGNLEL(SEQ ID NO：9)
(ix)IMPAAHP(SEQ ID NO：10)
或其功能衍生物或同源物。
就设计组合物以使得本发明的核心表位区被包括在内作为更大肽的一部分来说，应了解，可以设计任何给定的肽以包括一个或多个核心表位区。为此，在本发明的一个实施方案中，主题组合物的一种或多种肽选自以下清单：
(i)FQNLQNHRIV(SEQ ID NO：12)
(ii)RIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：13)
(iii)FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：14)
(iv)WSTRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：15)
(v)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：16)
(vi)ENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：17)
(vii)NNFGKLFEVKPDKKNPQ(SEQ ID NO：18)
(viii)SNNFGKLFEVKPDKKNPQ(SEQ ID NO：19)
(ix)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：20)
(x)NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：21)
(xi)SNNFGKLFEVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：22)
(xii)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：23)
(xiii)ALMLPHFNSKAMVIVVV(SEQ ID NO：24)
(xiv)KAMVIVVVNKG(SEQ ID NO：25)
(xv)AMVIVVVNKGTGNLELVAV(SEQ ID NO：26)
(xvi)VVNKGTGNLELVAVRK(SEQ ID NO：27)
(xvii)AMVIVVVNKGTGNLELV(SEQ ID NO：28)
(xviii)KAMVIVVVNKGTGNLELVAV(SEQ ID NO：29)
(xix)GDVFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：30)
(xx)VFIMPAAHPVAINASSE(SEQ ID NO：31)
(xxi)GDVFIMPAAHPVAINASSE(SEQ ID NO：32)
(xxii)VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：33)
在这个实施方案的另一个方面，所述组合物包含由SEQ ID NO：15、16或17定义的肽以及由SEQ ID NO：12-14或18-33定义的肽中的一者或多者。
在这个实施方案的另一个方面，所述组合物包含由SEQ ID NO：23定义的肽以及由SEQ ID NO：12-22或24-33定义的肽中的一者或多者。
附图简述
图1：Ara h 1 20-mer肽的供体响应频率分布图
Ara h 1 20-mer肽的TCL识别的供体响应频率(n＝18个花生过敏受试者)。
图2：在Ara h 1 20-mer肽50和51内定位核心T细胞表位
针对截短的肽组的20-mer特异性TCL增殖。对于肽50(A)和51(B)示出的代表性TCL(平均cpm重复孔+SD)。上图指示在20-mer之间重叠的表位(n＝2；3TCL)。下图指示每种20-mer所特有的表位；A)n＝3；6TCL。B)n＝4；7TCL。由代表的TCL识别的表位序列被加粗并且由所有特异性TCL识别的‘统一表位(consolidated epitope)’加下划线。
图3：响应于候选Ara h 1肽的嗜碱性粒细胞活化
示出七个花生过敏受试者响应于Ara h 1或候选肽而活化的(CD63h1)嗜碱性粒细胞(IgEh1)的百分比的盒须图。阴性对照是无抗原(未受刺激)并且阳性对照是抗IgE、fMLP以及CPE。须示出了最小值至最大值。
图4：用于检测PBMC中的CD4+T细胞增殖的代表性的基于CFSE的检验
在用所选的Ara h 1 20-mer肽刺激7天之后来自花生过敏受试者26的经过CF SE标记的PBMC的增殖。单独的培养基(无抗原)或粗花生提取物(CPE)分别提供阴性和阳性对照。每个样品分析至少10,000个活的CD4+T细胞。闸指示总CD4+T细胞的CD4+CFSElo(增殖)T细胞的百分比和圆括号中的刺激指数(SI)。
图5：T细胞表位识别的代表性HLA II类限制特异性
在HLA-DR(圆形)、HLA-DQ(正方形)或HLA-DP(三角形)mAb(Ai和Bi)或同型对照抗体(10μg/ml)(Aii和Bii)存在下针对所选表位的特异性TCL的增殖(平均cpm重复孔+SD)。图形示出了HLA-DR限制的表位(442-458)(A)和HLA-DQ限制的表位(507-524)(B)的样品数据。
发明详述
本发明是部分基于HLA简并Ara h 1显性T细胞核心表位区的鉴别。这些免疫显性核心表位区的鉴别能够改进诊断方法并且开发相比迄今可用的显著更有效的治疗和预防组合物以及治疗方法，用于诸如(但不限于)花生过敏的病状。
因此，本发明的一个方面涉及一种组合物，其包含一个或多个选自由以下组成的清单的Ara h 1 T细胞核心表位区：
(i)FQNLQNHR(SEQ ID NO：1)
(ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
(iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
(iv)FGKLFEVK(SEQ ID NO：4)
(v)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：5)
(vi)EGALML(SEQ ID NO：6)
(vii)PHFNSKAMVIV(SEQ ID NO：7)
(viii)IVVVN(SEQ ID NO：8)
(ix)VVNKGTGNLEL(SEQ ID NO：9)
(x)IMPAAHP(SEQ ID NO：10)
或其功能衍生物或同源物。
在一个相关方面，本发明涉及一种组合物，其包含一种或多种肽，这些肽中的每一者长度为至多60个连续氨基酸并且这些肽包括一个或多个选自由以下组成的清单的Ara h1 T细胞核心表位区：
(i)FQNLQNHR(SEQ ID NO：1)
(ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
(iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
(iv)FGKLFEVK(SEQ ID NO：4)
(v)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：5)
(vi)EGALML(SEQ ID NO：6)
(vii)PHFNSKAMVIV(SEQ ID NO：7)
(viii)IVVVN(SEQ ID NO：8)
(ix)VVNKGTGNLEL(SEQ ID NO：9)
(x)IMPAAHP(SEQ ID NO：10)
或其功能衍生物或同源物。
在本发明的前述方面的一个实施方案中，所述肽或核心表位区当呈递至从患有特征为对Ara h 1或对存在于包含Ara h 1的组合物(诸如食物)中的过敏原的异常、不需要或其它方面不当的免疫响应的病状的受试者中分离的T细胞时能够修饰T细胞功能，但这些肽不能结合至Ara h 1特异性IgE。
在不以任何方式限制本发明的情况下，花生含有许多蛋白质，其中在SDS-PAGE上可见的独特带的数目取决于所使用的方法。在高压液相色谱法之后至多53个带是可见的(de Jong等，Clin Exp Allergy28：743-51，1998)。这些蛋白质中仅两种证实使用标准准则归类为主要过敏原，借此，IgE反应性在超过50％的花生过敏群体内发生；这些蛋白质被称为Ara h 1和Ara h 2(Burks等，Allergy 53：725-30，1998)。尽管许多研究已经指示Ara h2在这两种过敏原中更强力(Blanc等，Clin Exp Allergy.2009；39(8)：1277-85；Koppelman等，Clin Exp Allergy.2004；34(4)：583-90；Palmer等，Clin Immunol.2005；115(3)：302-12)，但Ara h 1在花生过敏的发病机理中也起主要作用，其中众多研究报道了症状严重程度与对Ara h 1和Ara h 2的IgE反应性之间的强关联(Glaumann等，Allergy.2012；67(2)：242-7；Chiang等，Pediatr Allergy Immunol.2009；21(2Pt 2)：e429-38；Asarnoj等，Allergy.2010，65(9)：1189-95；Moverare等，Int Arch Allergy Immunol 2011；156(3)：282-90；Lin等，J Microbiol Immunol Infect.2012；Peeters等，Clin Exp Allergy.2007；37(1)：108-15)。Ara h 1是花生中最丰富的主要过敏原，占总花生蛋白的12-16％(Koppelman等，Allergy.2001；56(2)：132-7)。
仍在不以任何方式限制本发明的情况下，Ara h 1过敏原是7S种子贮藏糖蛋白或豌豆球蛋白。花生中Ara h 1的浓度随核仁(4-16mg提取的Ara h 1/g花生)的尺寸而增加，因此蛋白质的表达与花生成熟度相关联(Pomés等，2006，Clin.Exp.Allergy 36(6)：824-30)。Ara h 1是通过单体远端的疏水区保持在一起的同源三聚体，其中定位有大多数IgE结合表位。每个64.5kD单体具有由两个核心β桶组成的卡因(cupin)基序，每个β桶与α螺旋的环状结构域缔合。
提及“Ara h 1”应理解为提及这种分子的所有形式，包括提及可以通过Ara h 1mRNA的选择性剪接而产生的任何同种型或者Ara h 1的功能突变体或多态形式。这应进一步理解为延伸至由Ara h 1基因编码的任何蛋白质，任何亚单元多肽，诸如可以产生的前体形式，无论以单体、多聚体还是融合蛋白形式存在。其还包括提及Ara h 1的类似物或等效物，诸如在出于产生诸如食物添加剂的产物的目的而以合成方式产生天然地包含Ara h 1的产物的情况下可能出现的。本发明从而提供了表位以及使用其诊断和治疗特征为对Arah 1或Ara h 1样分子超敏(诸如花生过敏或树生坚果过敏)或对存在于组合物(诸如食物)中的抗原过敏的任何病状的方法，这种组合物也包含Ara h 1。优选地，所述Ara h 1包含SEQ ID NO：11所列的序列。
提及“T细胞”应理解为提及包含T细胞受体的任何细胞。在这方面，T细胞受体可以包含α、β、γ或δ链中的任何一者或多者。本发明并不意图受限于T细胞的任何特定的功能子类，不过在一个优选的实施方案中，主题T细胞是T辅助细胞，并且更优选地是Th2型细胞和/或Treg细胞。在这方面，提及“修饰T细胞功能”应理解为提及修饰T细胞能够执行的任何一种或多种功能。举例来说，主题功能可以是增殖、分化或其它形式的细胞功能活性，诸如细胞因子产生。在一个实施方案中，主题功能活性是增殖。
就从患有特征为对Ara h 1或对包含Ara h 1的组合物的异常、不需要或不当的免疫响应的病状的受试者中分离的T细胞的“功能修饰”来说，应了解，这不一定是提及修饰给定的生物样品中的所有T细胞的功能，而实际上可能是反映样品中仅一些T细胞的功能修饰。举例来说，给定的T细胞样品中仅一部分T辅助细胞可以在功能上响应于与主题肽接触。这种部分响应应理解为落入本发明的范围内。还应了解，来源于受试者的T细胞可以是新鲜收集的T细胞，或其可以在测试之前已经经历某种形式的体外或体内操作。举例来说，T细胞系可以从细胞样品中产生，并且这些T细胞系然后形成根据本发明测试的来源于受试者的T细胞群体。就主题功能活性是T细胞增殖来说，T细胞增殖检验优选地如本文所论述来进行。更优选地，T细胞功能的主题修饰是诱导增殖。在这方面，提及“Ara h 1反应性”T细胞应理解为提及在功能上响应于Ara h 1 T细胞表位的HLA呈递的T细胞。类似地，提及“Ara h 1特异性”IgE应理解为提及针对Ara h 1B细胞表位的IgE。
提及“异常、不需要或其它方面不当的”免疫响应应理解为提及任何形式的生理活性，其涉及一种或多种免疫细胞的活化和/或功能化，所述免疫细胞的活性的不当之处在于其为不当的类型或进展至不当的程度。异常之处可能在于，根据已知的免疫学原理，其在应该发生时不发生，或者其在不应发生时发生。在另一个实例中，免疫响应的不当之处可能在于其为生理上正常响应，但是不必要和/或不需要的，诸如关于对无害的过敏原的I型超敏响应所发生的。在本发明的上下文中，这种免疫响应可以针对Ara h 1，或其可以针对与Arah 1一起存在于组合物中的不同过敏原。在不将本发明限于任一种理论或作用模式的情况下，已经确定，甚至在超敏响应针对除Ara h 1之外的过敏原时，这种过敏原存在于仍然包含Ara h 1的组合物中，经由针对Ara h 1的本发明方法的治疗仍然诱导Th2和Treg功能性的有益调节，以使得所存在的对无关过敏原的超敏仍然被减轻。优选地，所述免疫响应是花生超敏。
“花生超敏”意指诱导IgE介导的花生超敏的临床症状。然而，应了解，尽管临床症状可能是明显的，但并非所有这样的个体将必然展现使用Kallestad Allercoat EAST系统(Sanofi-Pasteur Diagnostics，USA)所测量的可检测水平的花生特异性血清IgE，不过这样的个体仍然应理解为落入展现“花生超敏”的那些人的定义的范围内。或者，可以利用Pharmacia或UniCap系统进行测试。提及“Ara h 1超敏”应理解为具有在对Ara h 1蛋白质的反应性的情形中对应的含义。
在另一个相关方面，提供了一种组合物，其包含一种或多种肽，每种肽的长度为至多60个连续氨基酸并且这些肽包括一个或多个选自由以下组成的清单的Ara h 1 T细胞核心表位区：
(i)FQNLQNHR(SEQ ID NO：1)
(ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
(iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
(iv)FGKLFEVK(SEQ ID NO：4)
(v)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：5)
(vi)EGALML(SEQ ID NO：6)
(vii)PHFNSKAMVIV(SEQ ID NO：7)
(viii)IVVVN(SEQ ID NO：8)
(ix)VVNKGTGNLEL(SEQ ID NO：9)
(x)IMPAAHP(SEQ ID NO：10)
或其功能衍生物或同源物，这些肽当施用于患有特征为Ara h 1超敏或对包含Arah l的组合物超敏的病状的受试者时能够减轻所述超敏。
减轻Ara h l超敏(并且更一般地说，过敏原超敏)更详细地论述于下文中。简单地说，然而，这可以采取使个体特异性地对Ara h 1或更一般地说对花生或其它蛋白质部分或完全脱敏或耐受的形式。
提及“肽”包括提及肽、多肽或蛋白质或其部分。肽可以被糖基化或未糖基化和/或可以含有一系列与蛋白质融合、连接、结合或以其它方式缔合的其它分子，这种蛋白质如氨基酸、脂质、碳水化合物或其它肽、多肽或蛋白质。下文中提及“肽”包括包含氨基酸序列的肽以及与其它分子缔合的肽，这些分子如氨基酸、脂质、碳水化合物或其它肽、多肽或蛋白质。
“衍生物”包括来自天然、合成或重组来源的片段、部分(part/portion)以及变体，包括融合蛋白。部分或片段包括例如主题肽的活性区。衍生物可以来源于氨基酸的插入、缺失或取代。氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羧基端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。插入型氨基酸序列变体是将一个或多个氨基酸残基引入蛋白质中的预定位点的变体，不过在所得产物的适合筛选下随机插入也是可能的。缺失型变体的特征为从序列中去除一个或多个氨基酸。
取代型氨基酸变体是已经去除了序列中的至少一个残基并且在其位置处插入不同残基的变体。取代型氨基酸变体的一个实例是保守氨基酸取代。保守氨基酸取代通常包括在以下群组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸以及亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。对氨基酸序列的添加包括与其它肽、多肽或蛋白质融合。
主题肽的化学和功能等效物应理解为展现这些分子的功能活性中的任何一者或多者的分子并且可以来源于任何来源，诸如以化学方式合成或经由诸如天然产物筛选的筛选过程鉴别。
同源物包括来源于除花生之外的品种的肽，诸如来源于其它树生坚果的肽。
本文所涵盖的类似物包括(但不限于)对侧链的修饰，在肽、多肽或蛋白质合成期间并入非天然氨基酸和/或其衍生物，以及使用对蛋白质性分子或其类似物施加构象限制的交联剂和其它方法。突变体包括展现经过修饰的功能活性的分子(例如，表达一个或多个T细胞表位，但缺乏B细胞反应性的Ara h 1肽)。
本发明所涵盖的侧链修饰的实例包括诸如通过以下方式修饰氨基：通过与醛反应，接下来用NaBH4还原进行还原烷基化；用乙酰亚氨酸甲酯进行脒化；用乙酸酐进行酰化；用氰酸酯对氨基进行甲氨酰化；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基进行三硝基苯甲基化；用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐对氨基进行酰化；以及用吡哆醛-5-磷酸酯对赖氨酸进行吡哆醛化，接下来用NaBH4还原。
精氨酸残基的胍基可以通过与诸如2，3-丁二酮、苯甲酰甲醛以及乙二醛的试剂形成杂环缩合产物来修饰。
羧基可以通过经由形成O-酰基异脲，随后衍生成例如对应的酰胺进行碳化二亚胺活化来修饰。
巯基可以通过以下方法修饰：诸如用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧甲基化；过甲酸氧化成磺基丙氨酸；与其它硫醇化合物形成混合二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其它经取代的马来酰亚胺反应；使用4-氯汞苯甲酸酯、4-氯汞苯磺酸、氯化苯汞、2-氯汞-4-硝基苯酚以及其它汞剂形成汞剂衍生物；在碱性pH下用氰酸酯进行甲氨酰化。
色氨酸残基可以通过例如用N-溴代琥珀酰亚胺进行氧化或用2-羟基-5-硝基苯甲基溴或硫苯基卤(sulphenyl halide)对吲哚环进行烷基化来修饰。另一方面，酪氨酸残基可以通过用四硝基甲烷进行硝化以形成3-硝基酪氨酸衍生物来改变。
组氨酸残基的咪唑环的修饰可以通过用碘乙酸衍生物进行烷基化或用焦碳酸二乙酯进行N-羰乙氧基化来实现。
在蛋白质合成期间并入非天然氨基酸和衍生物的实例包括(但不限于)使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。本文所涵盖的非天然氨基酸的清单示于表1中。
表1
可以使用例如交联剂来稳定3D构象，使用诸如具有(CH2)n间隔基团(其中n＝1至n＝6)的双功能亚氨酸酯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯的同双功能交联剂，以及通常含有氨基反应部分(诸如N-羟基琥珀酰亚胺)和另一个基团特异性反应部分的异双功能试剂。
有可能修饰根据本发明的肽的结构用于达成各种目的，诸如用于增加溶解度，增强治疗或预防功效，增强稳定性，或增加对蛋白质降解的抗性。可以产生经过修饰的肽，其中氨基酸序列已经诸如通过氨基酸取代、缺失或添加而改变，以修饰免疫原性和/或降低过敏原性。类似地，可以将组分添加至本发明的肽中以产生相同的结果。
举例来说，可以对肽进行修饰以使其展现诱导T细胞无反应性的能力。在这种情况下，可以使用已知技术(例如取代每个残基并且确定T细胞反应性的存在或不存在)来确定T细胞受体的关键结合残基。在一个实例中，显示对于与T细胞受体相互作用所必需的那些残基可以通过用另一个氨基酸残基、优选类似的氨基酸残基置换必需氨基酸(保守取代)来修饰，这个氨基酸残基的存在显示改变T细胞反应性或T细胞功能。另外，对于T细胞受体相互作用并非必需的那些氨基酸残基可以通过用另一个氨基酸置换来修饰，这另一个氨基酸的并入然后可以改变T细胞反应性或T细胞功能，但不会例如消除与相关MHC蛋白质的结合。在另一个实例中，可以产生展现正常的T细胞结合，但消除IgE结合的突变体肽。
示例性保守取代详述于下表2中，并且包括：
| 原始残基 | 示例性取代 |
| Ala | Ser |
| Arg | Lys |
| Asn | Gln、His |
| Asp | Glu |
| Cys | Ser、Ala |
| Gln | Asn |
| Glu | Asp |
| Gly | Pro |
| His | Asn、Gln |
| Ile | Leu、Val |
| Leu | Ile、Val |
| Lys | Arg、Gln、Glu |
| Met | Leu、Ile |
| Phe | Met、Leu、Tyr |
| Ser | Thr |
| Thr | Ser |
| Trp | Tyr |
| Tyr | Trp、Phe |
| Val | Ile、Leu |
所述修饰将促使产生落入如本文所定义的主题肽的“突变体”的范围内的分子。“突变体”应理解为提及展现一种或多种不同于非突变的肽对应物所展现的结构特征或功能活性的肽。
还可以对本发明的肽进行修饰以并入一种或多种由天然等位基因变异产生的多态现象，并且D-氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸类似物可以被取代至肽中以产生落入本发明的范围内的经过修饰的肽。还可以通过已知技术与聚乙二醇(PEG)缀合来对肽进行修饰。还可以添加报告基团以有助于纯化并且潜在地增加根据本发明的肽的溶解度。还可以使用其它熟知类型的修饰，包括插入特异性内切蛋白酶裂解位点、添加官能团或用疏水性更小的残基置换疏水性残基以及编码本发明的肽的DNA的定点诱变，以引入可以适用于大范围的目的的修饰。对上文已经提及的根据本发明的肽的各种修饰仅仅作为实例而提及并且仅意图指示可以实现的大范围的修饰。
如上文所详述，本发明提供了保留与T细胞相互作用的全部或一些能力，但展现部分或完全抑制、消除或以其它方式下调的抗体反应性的肽。实现抗体反应性的下调可以通过任何适合的方法来实现，这些方法将为本领域的技术人员所熟知。举例来说，在B细胞表位由其线性氨基酸序列定义的情况下，可以添加、缺失或取代一个或多个氨基酸残基以促使突变的线性序列不同于天然存在的序列。在表位可以另外或替代地由构象表位定义的情况下，可以设法通过破坏肽的2°结构或在同源二聚体或异源二聚体存在的情况下破坏肽的3°结构来破坏那种构象。这可以例如通过破坏据知稳定2°和/或3°结构的键(诸如二硫键)形成来实现。就上文所定义的T细胞表位来说，这些表位区不包含B细胞表位。
由SEQ ID NO：1-10定义的表位是Ara h 1的T细胞核心表位区，已经确定这些核心表位区在由HLA-DQ特定呈递中还展现HLA简并性，这对于开发有效的治疗方案是至关重要的。应了解，本发明的组合物可以包含所列的核心表位区之一，或其可以包含这些核心表位区中的两者或更多者。
在一个实施方案中，所述组合物包含任何两个表位区、三个表位区、四个表位区、五个表位区、六个表位区、七个表位区、八个表位区、九个表位区或十个表位区。
在另一个实施方案中，提供了一种组合物，其包含一种或多种肽，这些肽中的每一者长度为至多60个连续氨基酸并且这些肽包括表位NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)以及一个或多个选自由以下组成的清单的Ara h 1 T细胞核心表位区：
(i)FQNLQNHR(SEQ ID NO：1)
(ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
(iii)FGKLFEVK(SEQ ID NO：4)
(iv)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：5)
(v)EGALML(SEQ ID NO：6)
(vi)PHFNSKAMVIV(SEQ ID NO：7)
(vii)IVVVN(SEQ ID NO：8)
(viii)VVNKGTGNLEL(SEQ ID NO：9)
(ix)IMPAAHP(SEQ ID NO：10)
或其功能衍生物或同源物。
在另一个实施方案中，提供了一种组合物，其包含一种或多种肽，这些肽中的每一者长度为至多60个连续氨基酸并且这种肽包括表位EGALML(SEQ ID NO：6)以及一个或多个选自由以下组成的清单的Ara h 1 T细胞核心表位区：
(i)FQNLQNHR(SEQ ID NO：1)
(ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
(iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
(iv)FGKLFEVK(SEQ ID NO：4)
(v)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：5)
(vi)PHFNSKAMVIV(SEQ ID NO：7)
(vii)IVVVN(SEQ ID NO：8)
(viii)VVNKGTGNLEL(SEQ ID NO 9)
(ix)IMPAAHP(SEQ ID NO：10)
或其功能衍生物或同源物。
根据这些方面，在其它实施方案中，所述组合物包括至少三种肽、至少四种肽、至少五种肽、至少六种肽、至少七种肽、至少八种肽、至少九种肽或十种肽。
如上文所详述，本发明的组合物包含HLA简并Ara h 1 T细胞核心表位区。这些核心表位区可以作为独立的肽施用，或其可以形成更大结构(诸如更长的肽或非肽结构)的一部分。如本领域的技术人员应了解，表位区有时本身可能太小而无法诱导免疫响应。半抗原是这种类型的表位的一个实例。因此，本发明的核心表位区可以与任何蛋白质性或非蛋白质性载体分子一起配制，以实现必需水平的免疫原性。
在一个实施方案中，主题核心表位区形成长度为至多30个连续氨基酸的更大肽的一部分。主题肽的长度可以是10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个氨基酸。优选地，主题肽的长度是12-25个氨基酸，长度是15-25个氨基酸，长度是15-20个氨基酸，或长度是10-20个氨基酸。
就设计组合物以使得本发明的核心表位区被包括在内作为更大肽的一部分来说，应了解，可以设计任何给定的肽以包括一个或多个核心表位区。为此，在本发明的一个实施方案中，主题组合物的一种或多种肽选自以下清单：
(i)FQNLQNHRIV(SEQ ID NO：12）
(ii)RIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：13)
(iii）FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：14)
(iv)WSTRSSENNEGVIVKVSKE（SEQ ID NO：15)
（v)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：16)
(vi)ENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：17)
(vii)NNFGKLFEVKPDKKNPQ(SEQ ID NO：18)
(viii)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：5)
(ix)SNNFGKLFEVKPDKKNPQ(SEQ ID NO：19)
(x)NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：21)
(xi)SNNFGKLFEVKPDKKNPQLQ(SEO ID NO：22)
(xii)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：23)
(xiii)ALMLPHFNSKAMVIVVV(SEQ ID NO：24).
(xiv)KAMVIVVVNKG(SEQ ID NO：25)
(xv)AMVIVVVNKGTGNLELVAV(SEQ ID NO：26)
(xvi)VVNKGTGNLELVAVRK(SEQ ID NO：27)
(xvii)AMVIVVVNKGTGNLELV(SEQ ID NO：28)
(xviii)KAMVIVVVNKGTGNLELVAV(SEQ ID NO：29)
(xix)GDVFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：30)
(xx)VFIMPAAHPVAINSSSE(SEQ ID NO：31)
(xxi)GDVFIMPAAHPVAINASSE(SEQ ID NO：32)
(xxii)VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：33)
在这个实施方案的另一个方面，所述组合物包含由SEQ ID NO：15、16或17定义的肽以及由SEQ ID NO：12-14或18-33定义的肽中的一者或多者。
在这个实施方案的另一个方面，所述组合物包含由SEQ ID NO：23定义的肽以及由SEQ ID NO：12-22或24-33定义的肽中的一者或多者。
在另一个方面，主题组合物的一种或多种肽选自以下清单：
(i)FQNLQNHRIV(SEQ ID NO：12)
(ii)RIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：13)
(iii)FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：14)
(iv)WSTRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：15)
(v)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：16)
(vi)NNFGKLFEVKPDKKNPQ(SEQ ID NO：18)
(viii)SNNFGKLFEVKPDKKNPQ(SEQ ID NO：19)
(viii)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：5)
(ix)NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：21)
(x)SNNFGKLFEVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：22)
(xi)VEILEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：23)
(xii)ALMLPHFNSKAMVIVVV(SEQ ID NO：24)
(xiii)KAMVIVVVNKG(SEQ ID NO：25)
(xiv)AMVIVVVNKGTGNLELVAV(SEQ ID NO：26)
(xv)AMVIVVVNKGTGNLELV(SEQ ID NO：28)
(xvi)KAMVIVVVNKGTGNLELVAV(SEQ ID NO：29)
(xvii)GDVFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：30)
(xviii)GDVF IMPAAHPVAINASSE(SEQ ID NO：32)
(xix)VFIMPAAHPVAINASSE(SEQ ID NO：31)
在这个实施方案的另一个方面，所述组合物包含由SEQ ID NO：15或16定义的肽以及由SEQ ID NO：12-14、18-26或28-32定义的肽中的一者或多者。
在这个实施方案的另一个方面，所述组合物包含由SEQ ID NO：23定义的肽以及由SEQ ID NO：12-16、18-22、24-26或28-32定义的肽中的一者或多者。
在另一个实施方案中，主题组合物的所述一种或多种肽选自以下清单：
(i)FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：14)
(ii)WSTRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：15)
(iii)NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：21)
(iv)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：23)
(v)ALMLPHFNSKAMVIVVV(SEQ ID NO：24)
(vi)KAMVIVVVNKGTGNLELVAV(SEQ ID NO：29)
(vii)GDVFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：30)。
在这个实施方案的另一个方面，所述组合物包含由SEQ ID NO：15定义的肽以及由SEQ ID NO：14、21、23、24、29或30定义的肽中的一者或多者。
在这个实施方案的另一个方面，所述组合物包含由SEQ ID NO：23定义的肽以及由SEQ ID NO：14、15、21、24、29或30定义的肽中的一者或多者。
在另一个实施方案中，所述组合物包含由SEQ ID NO：14、15、21、23、24、29和30定义的肽。
在另一个实施方案中，所述组合物包含由SEQ ID NO：14、16、21、23、24、29和30定义的肽。
在另一个实施方案中，所述组合物包含由SEQ ID NO：14、15、22、23、24、29和30定义的肽。
在另一个实施方案中，所述组合物包含由SEQ ID NO：14、15、21、23、24、29和32定义的肽。
在本发明的上下文中，应了解，在提及由SEQ ID NO：14定义的肽的用途的情况下，这种肽可以被以下取代：
(i)由SEQ ID NO：12和13定义的肽；
(ii)由SEQ ID NO：12定义的肽；或
(iii)由SEQ ID NO：13定义的肽。
就提及由SEQ ID NO：15定义的肽的用途来说，这种肽可以被由SEQ ID NO：16或17定义的肽取代。
就提及由SEQ ID NO：21定义的肽的用途来说，这种肽可以被由以下定义的肽取代：
(i)由SEQ ID NO：22定义的肽；
(ii)由SEQ ID NO：18和20定义的肽；
(iii)由SEQ ID NO：20和19定义的肽；
(iv)由SEQ ID NO：18定义的肽；
(v)由SEQ ID NO：19定义的肽；或
(vi)由SEQ ID NO：20定义的肽。
就提及由SEQ ID NO：29定义的肽的用途来说，这种肽可以被由以下定义的肽取代：
(i)由SEQ ID NO：25、28和27定义的肽；
(ii)由SEQ ID NO：25和26定义的肽；
(iii)由SEQ ID NO：25和28定义的肽；
(iv)由SEQ ID NO：25和27定义的肽；
(v)由SEQ ID NO：25定义的肽；
(vi)由SEQ ID NO：28定义的肽；
(vii)由SEQ ID NO：27定义的肽；或
(viii)由SEQ ID NO：26定义的肽。
就提及由SEQ ID NO：30定义的肽的用途来说，这种肽可以被由以下定义的肽取代：
(i)由SEQ ID NO：32定义的肽；
(ii)由SEQ ID NO：33定义的肽；或
(iii)由SEQ ID NO：31定义的肽。
在这些实施方案的另一个方面，所述组合物包含3种或4种或5种或6种所列的肽。
在另一个实施方案中，所述组合物包含所有7种肽。
本发明的肽可以通过重组或化学合成方式来制备。根据本发明的优选方面，提供了一种优先与来自花生超敏个体的T细胞发生免疫反应的重组肽或其突变体，其通过被编码本发明的肽序列的载体转化的宿主细胞的表达而表达。这种肽可以与另一种肽、多肽或蛋白质融合。或者，这种肽可以通过化学合成技术，诸如通过梅里菲尔德固相合成程序(Merrifield solid phase synthesis procedure)来制备。此外，尽管上文所给出的序列的合成肽代表优选的实施方案，但本发明还延伸至天然存在的肽或其片段的生物上纯的制剂。“生物上纯的”意指如通过重量、活性或其它适合的方式所测定，制剂包含至少约60％、优选地至少约70％、或优选地至少约80％并且更优选地至少约90％或更高。
因此，本发明应理解为涵盖包含如上文所定义的Ara h 1的至少一个T细胞核心表位区，连同其它氨基酸(其可能是或可能不是天然存在的)或其它化学物质的肽。在本发明的优选方面，所述肽可以包含Ara h 1的一个或多个表位，这些表位是T细胞核心表位区。具有Ara h 1的一个或多个表位的肽是增加治疗有效性所需要的。
在另一个方面，本发明提供了一种核酸分子，其包含编码如上文所定义的表位和肽或其衍生物、同源物或类似物的核苷酸序列，或与编码如上文所定义的表位和肽或其衍生物、同源物或类似物的序列互补的核苷酸序列。
应了解，提及“肽”包括提及包含一个或多个T细胞表位的肽。编码主题肽的核酸分子优选地是脱氧核糖核酸(诸如cDNA)的序列或基因组序列。基因组序列可以包含外显子和内含子。基因组序列还可以包括启动子区或其它调控区。
核酸分子可以接合至能够在原核细胞(例如，大肠杆菌)或真核细胞(例如，酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞)中表达的表达载体。核酸分子可以与编码另一个实体(诸如信号肽)的核酸分子接合或融合或以其它方式缔合。核酸分子还可以包含在3′或5′末端部分或在3′与5′末端部分与其融合、连接或以其它方式缔合的额外核苷酸序列信息。核酸分子还可以是诸如表达载体的载体的一部分。后一个实施方案有助于产生重组型式的主题肽，这些形式被本发明所涵盖。
所述核酸可以适用于通过插入适当载体中并且转染至适合的细胞系中来重组产生Ara h 1的T细胞表位或包含其的蛋白质。所述表达载体和宿主细胞系也构成本发明的一个方面。
在通过重组技术产生肽时，在适合于所关注的特定细胞的培养基中培养被具有编码根据本发明的肽的序列的核酸或核酸序列的功能等效物转化的宿主细胞。然后，可以使用本领域中熟知的技术从细胞培养基、宿主细胞或两者中纯化肽，这些技术如离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、超滤、电泳或使用对肽具特异性的抗体的免疫纯化。
可以在细菌细胞(诸如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO))中表达编码Ara h 1的核酸或包含Ara h 1的T细胞核心表位区的肽。适合的表达载体、启动子、增强子以及其它表达控制元件在Sambruck等(1989)中有提及。其它适合的表达载体、启动子、增强子以及其它表达元件为本领域的技术人员所熟知。酵母中适合的表达载体的实例包括Yep Sec 1(Balderi等，1987，Embo J.，6：229-234)；pMFa(Kurjan和Herskowitz.，1982，Cell.，30：933-943)；JRY88(Schultz等，1987，Gene.，54：113-123)；以及pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。这些载体可随意地用作杆状病毒和哺乳动物表达系统。举例来说，杆状病毒系统是可商购的(ParMingen，San Diego，CA)用于在昆虫细胞中表达，而pMsg载体是可商购的(Pharmacia，Piscataway，NJ)用于在哺乳动物细胞中表达。
对于在大肠杆菌中表达，适合的表达载体尤其包括pTrc(Amann等，1998，Gene.，69：301-315)；pGex(Amrad Corporation，Melbourne，Australia)；pMal(N.E Biolabs，Beverley，MA)；pRit5(Pharmacia，Piscataway，NJ)；pEt-11d(Novagen，Maddison，WI)(Jameel等，1990，J.Virol.，64：3963-3966)；以及pSem(Knapp等，1990，Bio Techniques.，8：280-281)。pTRC和pEt-11d的使用例如将使得未融合的蛋白质表达。pMal、pRit5、pSem以及pGex的使用将使得融合至麦芽糖E结合蛋白(pMal)、蛋白质A(pRit5)、截短的半乳糖苷酶(PSEM)或谷胱甘肽S转移酶(pGex)的过敏原表达。当Ara h 1的T细胞表位或包含其的肽以融合蛋白形式表达时，在载体蛋白与所关注的肽之间的融合连接点处引入酶裂解位点是特别有利的。然后，可以通过在酶位点处的酶裂解并且使用纯化蛋白质和肽的常规技术进行生物化学纯化，从融合蛋白中回收本发明的肽。不同载体也具有不同启动子区，从而允许组成型或诱导型表达或温度诱导。另外，在不同大肠杆菌宿主中表达重组肽可能是适当的，这些宿主具有使重组表达的蛋白质降解的改变的能力。或者，改变核酸序列以使用由大肠杆菌优先利用的密码子可能是有利的，其中所述核酸变化不会影响所表达的蛋白质的氨基酸序列。
可以使用常规技术转化宿主细胞以表达本发明的核酸，这些技术如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、或电穿孔。转化宿主细胞的合适方法可以见于Sambruck等(1989)和其它实验室文本中。本发明的核酸序列还可以使用标准技术以化学方式合成。
除了重组产生根据本发明的肽之外，核酸还可以用作探针用于实验或纯化目的。
如本文所公开的Ara h 1 T细胞表位的鉴别和合成现在有助于开发一系列诊断方案和预防性/治疗性治疗方案用于花生相关的免疫病状。还有助于开发其中所用的试剂。因此，本发明应理解为延伸至肽或其功能衍生物、同源物或类似物在治疗性和/或预防性治疗患者中的用途。所述治疗方法包括(但不限于)：
(i)将主题肽或其突变体施用于患者作为对Ara h 1或Ara h 1样分子脱敏或诱导对Ara h 1或Ara h 1样分子的免疫耐受的方式。这可以例如通过诱导Ara h 1定向的Th2无反应性或凋亡来实现。这种结果可以通过许多技术中的任一者来实现，包括使用维持T细胞表位反应性，但天然地或由于突变而不能经历IgE结合的肽。或者，可以利用脱敏/治疗方案，其基于根据特定方案施用特定浓度的给定肽以诱导耐受。所述方法可以消除Ara h 1超敏，或其可以降低Ara h 1超敏或对存在于包含Ara h 1的组合物中的过敏原敏感(诸如花生过敏)的严重程度。本文中提及Ara h 1敏感的治疗应理解为在其范围内涵盖特征为对包含Ara h 1的组合物(诸如，一般为花生)敏感的病状的治疗，即使这种敏感是针对除Ara h1之外的过敏原。
优选地，所述治疗方案能够修饰所关注的个体的T细胞响应或者B细胞与T细胞响应。如本文所用，对罹患花生超敏的个体的过敏响应的修饰可以被定义为诱导对Ara h 1分子的无响应性或症状减少，如通过标准临床程序所测定(Varney等，1991British MedicalJournal302：265-269)。症状减少包括在治疗方案已经完成之后个体对Ara h 1的过敏响应的任何减轻。这种减少可以是主观的，或例如通过本领域中已知的标准皮肤测试在临床上测定。
个体暴露于本发明的肽，这些肽包含至少一个T细胞表位，可以耐受适当的T细胞亚群或使适当的T细胞亚群无反应性，以使得其在所述暴露后变得对Ara h 1无响应并且不参与刺激免疫响应。优选地，根据本发明的肽将保留免疫显性T细胞表位，但具有消除的IgE结合。另外，即使讨论中过敏原不是Ara h 1，而是针对与Ara h 1存在于相同组合物中的不同过敏原(诸如不同的花生过敏原)，用Ara h 1免疫仍然可以诱导旁观抑制效应，其用以降低对那种过敏原超敏的程度。
施用本发明的肽与暴露于天然存在的Ara h 1过敏原相比可以修饰细胞因子分泌型态。这种暴露还可以影响通常参与过敏响应的T细胞亚群以远离正常暴露于过敏原的部位并且朝向治疗性施用的部位迁移。T细胞亚群的这种再分布可以改善或降低个体的免疫系统在正常暴露于过敏原的部位处刺激普通免疫响应的能力，从而减少过敏症状。
如上文所详述，B细胞响应的修饰可以例如经由调节由T细胞产生的细胞因子型态来实现。具体地说，减少来源于T细胞的IL-4和IL-13产生，从而减少IgE合成。
(ii)本发明的肽可以用于吸附剂从生物样品或从患者中去除Ara h 1定向的T细胞的能力中。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种治疗和/或预防受试者的病状的方法，这种病状的特征为对Ara h 1或包含Ara h 1的组合物中的过敏原的异常、不需要或其它方面不当的免疫响应，所述方法包括在足以去除或减少所述受试者中针对所述Ara h 1或其它过敏原的T细胞的存在或功能的时间和条件下向所述受试者施用有效量的如上文所定义的组合物。
优选地，所述病状是对含有Ara h 1或Ara h 1样分子的花生或诸如榛子、杏仁或巴西坚果的树生坚果超敏。
在一个实施方案中，所述方法使得对所述组合物的Ara h 1或其它过敏原脱敏或诱导对所述组合物的Ara h 1或其它过敏原的免疫耐受。
在另一个实施方案中，所述脱敏或耐受是通过诱导Th2无反应性或凋亡来实现。
在另一个实施方案中，所述脱敏或耐受是通过诱导Ara h 1特异性Treg细胞来实现。
“有效量”意指至少部分获得所需的免疫响应，或延迟所治疗的特定病状的发作或抑制其进展或完全停止其发作或进展所必需的量。这种量取决于待治疗的个体的健康和身体状况、待治疗的个体的分类群组、所需的保护程度、组合物的配方、医疗情况的评估以及其它相关因素而变化。预期这种量将落入可以通过常规试验确定的相对宽的范围内。
还应了解，本发明的组合物可以仅包含Ara h 1表位，或其还可以包含适用于实现治疗功效的其它表位或分子，诸如一系列Ara h 2表位。
治疗或预防的受试者一般是哺乳动物，诸如(但不限于)人类、灵长类动物、牲畜(例如，绵羊、母牛、马、驴、猪)、伴侣动物(例如，狗、猫)、实验室测试动物(例如，小鼠、兔、大鼠、天竺鼠、仓鼠)、圈养的野生动物(例如，狐狸、鹿)。优选地，哺乳动物是人类或灵长类动物。最优选地，哺乳动物是人类。
本文中提及“治疗”和“预防”应被认为处于其最宽泛的情形中。术语“治疗”不一定暗示着治疗受试者直至完全恢复。类似地，“预防”不一定意指受试者将最终不会染上疾病病状。因此，治疗和预防包括改善特定病状的症状，或预防或以其它方式降低发展特定病状的风险。术语“预防”可以被视为降低特定病状的严重程度或发作。“治疗”也可以降低现有病状的严重程度。
以药物组合物的形式施用本发明的肽(本文中称作“药剂”)可以通过任何便利的方式来进行。预期药物组合物的药剂当以视特定情况而定的量施用时展现治疗活性。变化取决于例如所选的人类或动物和药剂。宽范围的剂量可能是适用的。考虑到患者，每天每公斤体重可以施用例如约0.1mg至约1mg的药剂。可以调整给药方案以提供最佳治疗响应。举例来说，可以每天、每周、每月或以其它适合的时间间隔施用若干分次剂量，或如情况的紧急性所指示可以按比例减少剂量。
药剂可以按便利的方式施用，诸如通过经口、静脉内(在可溶于水时)、腹膜内、肌肉内、皮下、皮内、鼻内、舌下或栓剂途径或植入(例如，使用缓释分子)。药剂可以按以下形式施用：药学上可接受的无毒盐，诸如酸加成盐；或例如与锌、铁等形成的金属络合物(出于本申请的目的，其被视为盐)。所述酸加成盐的示例为盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐，等等。如果活性成分以片剂形式施用，那么片剂可以含有粘合剂，诸如黄蓍胶、玉米淀粉或明胶；崩解剂，诸如海藻酸；以及润滑剂，诸如硬脂酸镁。
根据这些方法，根据本发明定义的药剂可以与一种或多种其它化合物或分子共同施用。“共同施用”意指在相同配方中或在两种不同配方中经由相同或不同途径同时施用，或通过相同或不同途径依序施用。“依序”施用意指在施用两种类型的分子之间存在几秒、几分钟、几小时或几天的时间差。这些分子可以按任何顺序施用。
本发明的另一个方面涵盖如上文所定义的组合物的用途，其用于制造用以治疗哺乳动物的病状的药物，所述病状的特征为对Ara h 1的异常、不需要或其它方面不当的免疫响应。
优选地，所述病状是对含有Ara h 1或Ara h 1样分子的花生或树生坚果(诸如榛子)超敏。
在另一个方面，本发明涵盖一种药物组合物，其包含如上文所定义的组合物以及一种或多种药学上可接受的载剂和/或稀释剂。所述组合物被称作活性成分。
适合于可注射使用的药物形式包括无菌水性溶液(在可溶于水时)或分散体以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末，或可以呈乳膏形式或适合于局部应用的其它形式。其必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防腐以对抗诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇，等等)、其适合的混合物，以及植物油。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散体的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以用各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等等来防止微生物作用。在许多情况下，将优选地包括等张剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延长吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶来达成。
通过将所需量的活性化合物与上文所列的各种其它成分一起并入适当溶剂中，需要时接下来进行过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般来说，通过将各种灭菌的活性成分并入含有基础分散介质和来自上文所列的那些的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液得到活性成分加上任何额外的所需成分的粉末。
当适当地保护活性成分时，其可以例如与惰性稀释剂或与可吸收的可食用载剂一起经口施用，或其可以被封闭于硬壳或软壳明胶胶囊中，或其可以被压缩成片剂，或其可以直接与膳食的食物合并。对于经口治疗性施用，活性化合物可以与赋形剂合并，并且以可摄取片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。所述组合物和制剂应含有至少1重量％的活性化合物。组合物和制剂的百分比当然可以变化，并且宜介于单位的约5重量％至约80重量％之间。所述治疗上适用的组合物中活性化合物的量使得将获得适合的剂量。制备根据本发明的优选组合物或制剂以使得口服剂量单位形式含有约0.1μg与2000mg之间的活性化合物。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以含有如下所列的组分：粘合剂，诸如树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；以及甜味剂，诸如可以添加蔗糖、乳糖或糖精；或调味剂，诸如薄荷、冬青油或樱桃香料。当剂量单位形式是胶囊时，其除了上述类型的物质之外还可以含有液体载剂。各种其它物质可以呈现为包衣或以其它方式修饰剂量单位的实体形式。举例来说，片剂、丸剂或胶囊可以包覆有虫胶、糖或两者。糖浆或酏剂可以含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料，以及香料，诸如樱桃或桔子香料。当然，制备任何剂量单位形式所用的任何物质应为药学上纯的并且在所采用的量下基本上无毒。另外，可以将活性化合物并入持续释放制剂和配方中。
药物组合物还可以包含基因分子，诸如能够转染靶细胞的载体，其中这种载体携带编码调节剂的核酸分子。载体可以是例如病毒载体。
施用途径包括(但不限于)经呼吸道(例如，经由气雾剂鼻内或经口)、气管内、经鼻咽、静脉内、腹膜内、皮下、颅内、皮内、肌肉内、眼内、鞘内、脑内、鼻内、输注、经口、经直肠、经由IV滴注贴片、植入以及舌下。优选地，所述施用途径是皮下、皮内或鼻内。
本发明的另一个方面涉及用于本发明的方法中的如上文所定义的组合物。
在另一个方面，本发明应理解为延伸至本发明的表位和肽在诊断应用中的用途。所述诊断应用包括(但不限于)：
(i)用以测量受试者的细胞对Ara h 1的反应性。这是例如关于诊断和/或监控特征为对Ara h 1的异常、不需要或其它方面不当的免疫响应的病状的用途。可以将肽与来源于外周血或来源于未分级的、分级的或作为传代细胞系而得的组织活检体的细胞一起添加至溶液中或结合至固体支撑物。然后，可以通过标准增殖检验来测量对主题肽的反应性，这些检验如掺入H3-胸苷、测量表达或分泌的分子(诸如表面标志物、细胞因子)，或本领域中熟知的细胞活性的其它标准检验。
(ii)使用包含T细胞表位的肽以及利用来源于受试者的T细胞样品的T细胞增殖检验将有助于例如鉴别T细胞响应群体。
可以利用例如检测Ara h 1的方法，以定性地或定量地检测Ara h1水平。然而，还可以利用这些方法来筛选Ara h 1中的突变或多态现象，其中突变可以使得例如对Ara h 1的T细胞反应性损失。可以利用这些方法来达成筛选适合用于治疗性地或预防性地治疗罹患Ara h 1相关超敏的个体的肽分子的目的。
因此，本发明的另一个方面涉及一种诊断或监控哺乳动物的病状的方法，这种病状的特征为对Ara h 1的异常、不需要或不当的响应，所述方法包括利用上文所定义的肽或表位筛选Ara h 1反应性T细胞。
优选地，所述病状是对含有Ara h 1或Ara h 1样分子的花生或诸如榛子、杏仁或巴西坚果的树生坚果超敏。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于上文所定义的诊断方法中的诊断试剂盒。
现在将参考以下非限制性实施例来进一步描述本发明。
实施例
方法
受试者
花生过敏的成年受试者从阿尔弗雷德过敏诊所(The Alfred Allergy Clinic；Melbourne，Australia)募集(表4)。所有受试者都具有IgE介导的花生过敏的临床症状并且花生特异性IgE CAP评分＞1(＞0.49kUA/1；Pharmacia CAP SystemTM，PharmaciaDiagnostics，Uppsala，Sweden)。由维多利亚移植和免疫遗传学服务(VictorianTransplantation and Immunogenetics Service)对用于T细胞系(TCL)产生的受试者进行基因分型(HLA-DRB 1、HLA-DQB 1以及HLA-DPB 1，外显子2)(表5)。这项研究经阿尔弗雷德和莫纳什大学伦理委员会(The Alfred and Monash University Ethics Committees)批准并且通报从每个受试者获得的书面同意。
抗原
如所描述(Prickett等，2011，同上；de Leon等，Clin Exp Allergy.2003；33(9)：1273-80)，从商业的未加盐的干烤花生制备粗的花生提取物(CPE)。如所描述(Prickett等，2011，同上)，通过液相色谱法从CPE富集Ara h 1和Ara h 1。内毒素含量对于CPE、Ara h 1以及Ara h 1分别是1.7、4.0以及78.0EU/mg(Endpoint Chromogenic LAL检验；Lonza，Walkersville，USA)。在10％二甲亚砜/PBS中(20-mer和截短的肽组)或单独的PBS中(定制合成的核心表位肽)以2mg/ml重构Ara h1肽(Mimotopes，Victoria，Australia andGenScript USA Inc，New Jersey，USA；表6)。如所描述(Eusebius等，Int Arch AllergyImmunol.2002；127(3)：234-44)，确认所有抗原既不会致有丝分裂，也没有毒性。
产生Ara h 1特异性CD4+T细胞系(TCL)
使用基于5，6-羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯(CFSE)的方法(Mannering等，JImmunol Methods.2005；298(1-2)：83-92)，如所描述(Prickett等，2011，同上)，以CPE(100pg/mL)、Ara h 1(10gg/mL)或跨越Ara h 1序列的20-mer肽(11氨基酸(aa)重叠(对于最后一个肽是17aa重叠)；表6；10pg/mL/肽)作为驱动抗原，从花生过敏受试者的外周血单核细胞(PBMC)产生Ara h 1特异性寡克隆TCL。测试所有TCL对个别的Ara h 1 20-mer(10pg/mL)以及CPE(100pg/mL)和/或Ara h 1(10pg/mL)的特异性(增殖)。如所描述(Prickett等，2011，同上)，使用从20-mer的N端或C端截短的肽组在所选的20-mer内定位核心表位序列。
T细胞检验
在含有2mM L-谷氨酰胺、100IU/mL青霉素-链霉素以及5％热灭活人类AB血清的RPMI-1640(Sigma-Aldrich，St Louis，USA)(cRPMI)中进行所有培养。如所描述(Prickett等，2011，同上)，通过3H-胸苷(3H-TdR)摄入检验来评估抗原诱导的TCL增殖。刺激指数(SI；cpm抗原刺激的T细胞/cpm未受刺激的T细胞)＞2.5被视为阳性的，并且在＞2个检验中确认所有阳性响应。如所描述(Prickett等，2011，同上)，使用针对HLA-DR(L243)、HLA-DQ(SVP-L3)或HLA-DP(B7/21)的单克隆抗体(mAb)阻断表位呈递来评估由TCL进行表位识别的HLA限制。为了允许检测在整个PBMC内肽诱导的CD4+T细胞增殖，如对于TCL产生所描述(Prickett等，2011，同上)，设定CFSE标记的PBMC的7天培养。每个样品分析至少10,000个CD4+T细胞，并且SI以含抗原的CD4+CFSElo(增殖的)细胞的百分比/不含抗原的CD4+CFSElo细胞(背景)的百分比计算。通过在三个受试者的SI值的一定范围上从增殖的CD4+细胞扩增肽特异性TCL来评估这个检验中特异性响应的检测阈值。可以从在所有三个受试者中SI低至1.1的分裂的T细胞产生特异性TCL(数据未示出)，从而允许将SI＞1.1指定为阳性。
嗜碱性粒细胞活化测试
如所描述(Drew等，J Immunol.2004；173(9)：5872-9)，通过流式细胞测量术，由CD63上调来评估嗜碱性粒细胞活化。阳性对照是兔抗人IgE抗体(7.5μg/mL；DAKOCorporation，CA，USA)、N-甲酰基-甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(fMLP)(0.4μg/mL；Sigma)以及CPE。在3对数浓度范围(5、0.5以及0.05μg/mL)上测试CPE、Ara h 1以及肽
结果
选择含有由花生过敏受试者识别的显性CD4+T细胞表位的Ara h 1 20-mer肽
通过从受CPE、Ara h 1或共同跨越Ara h 1序列的Ara h 1 20-mer肽库(表6)刺激的7天CFSE标记的PBMC培养物中分离并扩增抗原特异性(增殖的)CD4+CFSEloT细胞，从18个HLA不同的花生过敏受试者(表4和5)的PBMC产生总共145个Ara h 1特异性T细胞系(TCL)。由每个受试者识别的20-mer肽(SI≥2.5)示于表7中，并且数据概括于图1中。对于一些受试者，CPE或Ara h 1刺激产生大多数TCL，而对于其它受试者，其为肽库。在使用不同的抗原制剂(CPE、Ara h或肽库)从给定的受试者产生TCL时，TCL 20-mer特异性是相当的。总之，取决于抗原制剂而产生的TCL 20-mer特异性不存在偏差。
145个TCL共同识别遍及整个Ara h 1序列的表位，其中六十九种20-mer中仅有四种未能刺激任何TCL。十四种20-mer(23、24、26、38、40、44-51以及57)各自由四个(22％)或更多个受试者识别，其中肽50和51具有大多数响应者(六个受试者；33％)(图1)。为了选择含有显性T细胞表位的20-mer，除了响应频率之外还考虑许多因素，包括TCL响应的量级、每个受试者的特异性TCL的数目、特异性TCL响应的再现性以及靶向PBMC中的特异性T细胞的能力。基于这些参数，选择十四种20-mer中的九种(肽23、24、40、46、47、49、50、51以及57)用于后续分析。这九种20-mer由这个组群中18个受试者中的16个受试者(89％)共同识别，并且通常诱导特异性TCL中强烈而一致的增殖响应，其中大多数SI超过5并且许多远高于5(表7)。此外，这些20-mer中的每一者由来自许多响应者的多个TCL识别，从而反映在受试者的T细胞谱系当中对这些肽具特异性的T细胞的流行性。为了评估在更广泛的组群中的识别，通过在用每种肽刺激七天之后对整个PBMC中的CD4+T细胞增殖进行CFSE检验(表1上部分和图4)来筛选来自额外的21个花生过敏受试者的PBMC。这个检验提供了用于检测整个PBMC内的肽特异性CD4+T细胞响应的灵敏而准确的筛选。所有21个受试者都显示针对CPE的PBMC T细胞增殖或富集的Ara h 1与Ara h 1的组合。20-mer由19个受试者(90个这些受试者共同识别，其中每种20-mer有8-12个(38-60％)响应者。来自用于TCL产生的原始组群的四个受试者的分析确认，这些受试者除了由其TCL识别的那些之外还具有对其它20-mer具特异性的T细胞(表1，下部分)。总之，在所分析的39个受试者中的35个受试者(90％)中确认九种20-mer的所选组的T细胞识别。
在所选的Ara h 1 20-mer肽内定位核心T细胞表位
最小长度的肽降低了在临床施用期间细胞结合的IgE交联于炎性细胞上的风险并且有助于治疗剂生产。通过测试来自不同受试者的反应性TCL针对截短的肽组的增殖(例如，图2和表2)来确定在每种所选的20-mer内的最小T细胞刺激序列(核心表位)。诱导最大T细胞增殖所需的残基的数目在不同TCL和/或受试者之间从6至19aa变化(表2)，这与CD4+T细胞表位的先前报道一致(Hemmer等，Int Immunol.2000；12(3)：375-83(Hemmer等，IntImmunol.2000；12(3)：375-83；Suri等，Curr Opin Immunol.2006；18(1)：70-7)。归因于最佳表位识别所需的侧接残基的数目的变化(Suri等，2006，同上)，如果含有共同核心序列的肽诱导识别，那么就认为TCL识别相同的表位。基于这个准则，鉴别十个不同的CD4+T细胞表位(‘统一表位’，表2)；其中共同核心从5至12aa变化(加下划线的序列，表2)。选择‘统一表位’序列以包涵所测试的所有特异性TCL的最大刺激所需的残基来确保最广泛可能的识别。
在九种20-mer中的每一者内发现至少一个表位，其中20-mer 50和51各自含有两个不同但重叠的T细胞表位；一个是每种20-mer所特有的((442-458)和(452-470))，并且另一个在重叠序列内((451-461)，表2和图2)。没有单个TCL响应于任一20-mer内的两个表位，这进一步确认这些表位的相异性(数据未示出)。HLA表位预测算法(Singh等，Bioinformatics.2001；17(12)：1236-7；Vita等，Nucleic Acids Res.2010；38(数据库问题)：D854-62)还突出了在最小刺激序列中的每一者内的一个或多个强HLA II类(HLA-II)结合基序。表8中示出了Propred(Singh等，2001，同上)HLA-DR结合算法的数据。这种算法并不预测肽40内的HLA-DR表位，但免疫表位数据库(IEDB)和分析资源(Vita等，2010，同上)的算法预测这种肽内的表位以最强烈地结合至HLA-DP和/或HLA-DQ分子。
最后，为了避免不必要的序列重复并且使治疗剂的肽数目最小化，将六个统一表位(包含三个重叠表位对)组合成20aa或更小的三个单肽((206-225)、(409-427)以及(451-470)；灰色阴影，表2)。组合的表位肽有效地刺激对任一表位(数据未示出)以及其余四个统一表位((353-371)、(436-452)、(442-458)以及(507-524))具特异性的TCL，提供一组七个候选肽用于进一步表征(见星号，表II)。来自我们的组群的九个受试者的基于CFSE的筛选确认，这些肽可以各自直接靶向花生过敏受试者的整个PBMC当中可检测数目的Ara h 1特异性T细胞(表9)。
确定Ara h 1 T细胞表位的HLA II类限制特异性
没有鉴别到HLA-II与花生过敏的关联(Shreffler等，Ann Allergy AsthmaImmunol 2006；96(6)：865-9)，因此，选择用于疗法的肽必须结合多种HLA-II分子用于广泛应用。为了确定呈递每个表位的HLA-II类型，使用抗HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ mAb阻断个别表位呈递至T细胞。对于所测试的每个TCL，一个或多个HLA-mAb以剂量依赖性方式阻止表位识别(例如，图5)并且相同的mAb阻断CPE的识别(数据未示出)，从而证实天然加工和合成的表位形式的呈递的一致性。每个表位测试至少两个受试者和/或TCL(表3)。与上文所描述的HLA-II算法(Singh等，2001，同上；Vita等，2010，同上)的预测一致，抗HLA-DR阻断除了一个表位(353-371)以外的所有表位的识别，这个表位(353-371)的识别在所测试的两个受试者中被抗HLA-DQ阻断。对于表位(436-452)和(507-524)来说，对于一些TCL，抗HLA-DR阻断识别，但对于其它TCL，抗HLA-DQ阻断识别，从而确认这些表位的HLA结合简并性。
为了评估被单个HLA-mAb阻断识别的表位的HLA结合简并性，比较具有对那个表位具特异性的TCL的至少两个受试者的相应的HLA等位基因(表5和表3)。在受试者之间识别HLA-DR或HLA-DQ限制的表位的共用HLA-DRBl或HLA-DQBl等位基因的不存在分别确认，每个表位呈递于至少两个不同的HLA分子上。HLA结合算法进一步支持这些数据，其中含有基序的每个表位预测结合多个HLA分子((Singh等，2001，同上；Vita等，2010，同上)(例如，表8)。
测试用于嗜碱性粒细胞活化的候选肽
为了提供整个过敏原的安全替代物，肽必须不结合并交联细胞结合的IgE。在来自这项研究募集的七个花生过敏受试者(表4)的新鲜血液中评估对肽的嗜碱性粒细胞反应性(图3)。所有七个受试者都显示在一定浓度范围上对CPE的高水平的嗜碱性粒细胞活化。虽然对Ara h 1的响应在最低剂量下在受试者之间有变化，但最高浓度在所有受试者中诱导高度活化。然而，候选肽中无一者在所测试的任何浓度下诱导活化。一个受试者显示对肽(409-427)的极低响应(8％)，但这低于阳性活化的阈值(Boumiza等，Clin MolAllergy.2005；3：9)，并且与这个受试者中由Ara h 1(80-90％)或CPE(74-76％)诱导的活化相比是可忽略的。
本领域的技术人员应了解，本文所描述的发明内容除了特定描述的那些之外易发生变化和修改。应了解，本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括在本说明书中个别地或共同地提及或指示的所有步骤、特征、组合物以及化合物，以及所述步骤或特征中的任何两者或更多者的任何和所有组合。
表1.响应于所选的Ara h 1 20-mer的花生过敏供体CD4+T细胞增殖的基于CFSE的检测
上部分示出了新的花生过敏供体组群；下部分示出了来自用于TCL产生的花生过敏供体组群的四个受试者。CPE，粗的花生提取物；+ve，阳性；nt，未测试(肽储备物在测试时不可用)；灰色，刺激指数＞1.1＜2.5；黑色，刺激指数＞2.5
*无抗原的背景增殖，总CD4+T细胞的％CD4+CFSEloT细胞；^使用富集的Ara h 1与Ara h 1(各自10 1.tg/mL)的组合替代CPE用于这些受试者。
表2.在所选的Ara h 1 20-mer内定位的核心T细胞表位序列
灰色阴影指示组合成单肽用于进一步分析的重叠统一表位对
*七种候选肽被建议用于治疗剂
表3.核心表位肽的HLAII类限制
nt＝未测试(TCL不可用)；灰色阴影指示组合成单肽用于进一步分析的重叠表位对。
表4.受试者人口统计
TCL，T细胞系；20-mer CFSE，对所选的Ara h 1 20-mer的T细胞反应性的筛选；核心CF SE，对候选Ara h 1肽的T细胞反应性的筛选；BAT，嗜碱性粒细胞活化测试；na，数据不可用；SPT，皮肤点刺测试(RAST对于这个受试者不可用)。
表5.用于T细胞系产生的受试者的HLA基因分型
所有HLA缩写都遵照等位基因命名的最新变化(http：//hla.alleles.org/ announcement.html和http：//www.ebi.ac.uldimgt/hla/)。
后接有Iv的等位基因表示共有外显子2中的共同序列的等位基因的组(http：// hla.alleles.org/alleles/p_groups.html)。
表6.Ara h 1 20-mer肽
表7.T细胞系对Ara h 1 20-mer肽的增殖响应(胸苷摄入)
TCL，T细胞系。仅示出了阳性刺激指数(SI＞2.5)。对于具有对给定的20-mer具特异性的多个TCL的受试者，示出了最高SI。高于10的SI已经被四舍五入至最接近的整数。深灰色，SI＞2.5＜5.0；黑色，SI＞5.0。
使用ProPred算法(http：www.immuneepitope.org；2012年1月30日存取)预测HLA-DR结合基序(灰色阴影)。预测的主要锚定残基被加粗并且加下划线。未示出肽40(352-371，因为通过这种算法对于这种肽没有预测到HLA-DR结合基序。
表9.响应于所选的Ara h 1候选肽的花生过敏供体CD4+T细胞增殖的基于CFSE的检测
CPE，粗的花生提取物；+ve，阳性；灰色，刺激指数＞1.1＜2.5；黑色，刺激指数＞2.5
*无抗原的背景增殖，总CD4+T细胞的％CD4+CFSEloT细胞；^使用富集的Ara h 1与Ara h 1(各自10 1.tg/mL)的组合替代CPE用于这些受试者。
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Claims (22)
1.一种组合物，其包含肽，所述肽包含EGALML(SEQ ID NO：6)，并且所述组合物进一步包含一种或多种肽，所述肽包含选自以下的序列：
(i)FQNLQNHR(SEQ ID NO：1)
(ii)IVQIEA(SEQ ID NO：2)
(iii)NEGVIVKVSK(SEQ ID NO：3)
(iv)FGKLFEVK(SEQ ID NO：4)
(v)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：5)
(vi)PHFNSKAMVIV(SEQ ID NO：7)
(vii)IVVVN(SEQ ID NO：8)
(viii)VVNKGTGNLEL(SEQ ID NO：9)
(ix)IMPAAHP(SEQ ID NO：10)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含至少三种肽。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含至少四种肽。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含至少五种肽。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含至少六种肽。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含至少七种肽。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肽长度为10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个氨基酸。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述肽长度为10至25个氨基酸。
9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述肽长度为15至25个氨基酸。
10.根据权利要求7所述的组合物，其中所述肽长度为15至20个氨基酸。
11.根据权利要求7所述的组合物，其中所述肽长度为10至20个氨基酸。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肽选自以下清单：
(i)FQNLQNHRIV(SEQ ID NO：12)
(ii)RIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：13)
(iii)FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：14)
(iv)WSTRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：15)
(v)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：16)
(vi)ENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：17)
(vii)NNFGKLFEVKPDKKNPQ(SEQ ID NO：18)
(viii)SNNFGKLFEVKPDKKNPQ(SEQ ID NO：19)
(ix)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：20)
(x)NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：21)
(xi)SNNFGKLFEVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：22)
(xii)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：23)
(xiii)ALMLPHFNSKAMVIVVV(SEQ ID NO：24)
(xiv)KAMVIVVVNKG(SEQ ID NO：25)
(xv)AMVIVVVNKGTGNLELVAV(SEQ ID NO：26)
(xvi)VVNKGTGNLELVAVRK(SEQ ID NO：27)
(xvii)AMVIVVVNKGTGNLELV(SEQ ID NO：28)
(xviii)KAMVIVVVNKGTGNLELVAV(SEQ ID NO：29)
(xix)GDVFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：30)
(xx)VFIMPAAHPVAINASSE(SEQ ID NO：31)
(xxi)GDVFIMPAAHPVAINASSE(SEQ ID NO：32)
(xxii)VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：33)。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物包含由SEQ ID NO：23定义的肽以及由SEQ ID NO：12-22或24-33定义的肽中的一者或多者。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述肽选自以下清单：
(i)FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV(SEQ ID NO：14)
(ii)WSTRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：15)
(iii)NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：21)
(iv)VEIKEGALMLPHFNSKA(SEQ ID NO：23)
(v)ALMLPHFNSKAMVIVVV(SEQ ID NO：24)
(vi)KAMVIVVVNKGTGNLELVAV(SEQ ID NO：29)
(vii)GDVFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：30)
(viii)EVKPDKKNPQLQ(SEQ ID NO：20)
(ix)STRSSENNEGVIVKVSKE(SEQ ID NO：16)
(x)VFIMPAAHPVAINASS(SEQ ID NO：33)。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物包含由SEQ ID NO：23定义的肽以及由SEQ ID NO：14、16、20或33定义的肽中的一者或多者。
16.一种核酸分子，其包含编码根据权利要求1所述的肽的核苷酸序列，或与编码根据权利要求1所述的肽的序列互补的核苷酸序列。
17.一种组合物的用途，其用于制造用以治疗或预防哺乳动物的病状的药物，所述病状的特征为对Ara h 1或对存在于包含Ara h 1的组合物中的过敏原的异常、不需要或其它方面不当的免疫响应，其中所述组合物包含长度不大于60个氨基酸的肽，并且所述肽包含EGALML(SEQ ID NO：6)。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述组合物是权利要求1至15中任一项所述的组合物。
19.根据权利要求17或18所述的用途，其中所述病状是对含有Ara h 1或Ara h 1样分子的花生或树生坚果超敏。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述树生坚果是榛子、杏仁或巴西坚果。
21.根据权利要求17所述的用途，其中所述治疗或预防使得对Ara h 1脱敏或诱导对Ara h 1的免疫耐受。
22.根据权利要求1所述的组合物在制备用于诊断或监控哺乳动物的病状的药物中的用途，所述病状的特征为对Ara h 1的异常、不需要或不当的响应，所述诊断或监控包括利用长度不大于60个氨基酸的肽筛选Ara h 1反应性T细胞，并且所述肽包含EGALML(SEQ IDNO：6)。
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