RU2662927C2 - Иммунная модуляция - Google Patents
Иммунная модуляция Download PDFInfo
- Publication number
- RU2662927C2 RU2662927C2 RU2015144308A RU2015144308A RU2662927C2 RU 2662927 C2 RU2662927 C2 RU 2662927C2 RU 2015144308 A RU2015144308 A RU 2015144308A RU 2015144308 A RU2015144308 A RU 2015144308A RU 2662927 C2 RU2662927 C2 RU 2662927C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ara
- peanut
- fusion protein
- subject
- poxvirus vector
- Prior art date
Links
- 230000008102 immune modulation Effects 0.000 title 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 claims abstract description 215
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims abstract description 213
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 claims abstract description 196
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 claims abstract description 196
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 claims abstract description 196
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 134
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 134
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 114
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 89
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 63
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 55
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 55
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 241001553178 Arachis glabrata Species 0.000 claims abstract 20
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 138
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 49
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 39
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 25
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 23
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 11
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 8
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 108010056354 Ubiquitin C Proteins 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 3
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims 1
- 201000010853 peanut allergy Diseases 0.000 abstract description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 208000025864 peanut allergic reaction Diseases 0.000 abstract description 2
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 196
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 37
- 208000008267 Peanut Hypersensitivity Diseases 0.000 description 32
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 30
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 description 28
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 28
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 28
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 27
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 23
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 23
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 20
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 20
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 17
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 17
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 17
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 230000004063 proteosomal degradation Effects 0.000 description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 15
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 14
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 14
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 12
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 12
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 12
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 11
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 11
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 11
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 10
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 8
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 8
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 8
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 8
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 8
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 7
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 7
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000000774 hypoallergenic effect Effects 0.000 description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 7
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 6
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 6
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 6
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 6
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- -1 amino acid amino acid Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 201000009805 cryptogenic organizing pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- YQNRVGJCPCNMKT-LFVJCYFKSA-N 2-[(e)-[[2-(4-benzylpiperazin-1-ium-1-yl)acetyl]hydrazinylidene]methyl]-6-prop-2-enylphenolate Chemical compound [O-]C1=C(CC=C)C=CC=C1\C=N\NC(=O)C[NH+]1CCN(CC=2C=CC=CC=2)CC1 YQNRVGJCPCNMKT-LFVJCYFKSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 208000032484 Accidental exposure to product Diseases 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 101100462537 Caenorhabditis elegans pac-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 2
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 101100117764 Mus musculus Dusp2 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 108010068086 Polyubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 231100000818 accidental exposure Toxicity 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 2
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 2
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 2
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002227 vasoactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150111329 ACE-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 244000036975 Ambrosia artemisiifolia Species 0.000 description 1
- 235000003129 Ambrosia artemisiifolia var elatior Nutrition 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 241000269350 Anura Species 0.000 description 1
- 101000878581 Aplysia californica Feeding circuit activating peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102000019260 B-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010012919 B-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029649 Beta-arrestin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100029648 Beta-arrestin-2 Human genes 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000251556 Chordata Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 102100021306 Cyclic AMP-responsive element-binding protein 3-like protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102100031702 Endoplasmic reticulum membrane sensor NFE2L1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 108050002220 Green fluorescent protein, GFP Proteins 0.000 description 1
- 101150009243 HAP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034047 Heat shock factor protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 1
- 101000728629 Homo sapiens Beta-arrestin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000728661 Homo sapiens Beta-arrestin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000895303 Homo sapiens Cyclic AMP-responsive element-binding protein 3-like protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001016879 Homo sapiens Heat shock factor protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001005664 Homo sapiens Mastermind-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001106801 Homo sapiens Rab11 family-interacting protein 5 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 102000004560 Interleukin-12 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017515 Interleukin-12 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102100025129 Mastermind-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- 108010071380 NF-E2-Related Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100247316 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ras-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010016592 Nuclear Respiratory Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 241000232219 Platanista Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100021330 Rab11 family-interacting protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101000886149 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) Transcription factor gaf1 Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000287231 Serinus Species 0.000 description 1
- 241000287219 Serinus canaria Species 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000029662 T-helper 1 type immune response Effects 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 235000003484 annual ragweed Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000003659 bee venom Substances 0.000 description 1
- GNNALEGJVYVIIH-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydrochloride Chemical compound Cl.NC1=CC=CC=C1N GNNALEGJVYVIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 235000006263 bur ragweed Nutrition 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 235000003488 common ragweed Nutrition 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003256 environmental substance Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000003386 epithelial cell of thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000013568 food allergen Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000002327 glycerophospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003870 intestinal permeability Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000007319 proteasomal degradation pathway Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 235000009736 ragweed Nutrition 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000024664 tolerance induction Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000029069 type 2 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24142—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector virus or viral particle as vehicle, e.g. encapsulating small organic molecule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24171—Demonstrated in vivo effect
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются поксвирусного вектора, композиции, включающей такой вектор, способу десенсибилизации, индукции переносимости или подавления аллергической реакции, способу вакцинации субъекта и набору. Представленный вектор включает нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере два аллергена арахиса, выбранных из группы, состоящей из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h10 и ara h 11, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка, где вектор включает последовательность контроля транскрипции и старт-кодон для облечения экспрессии слитого белка и где метка деградации протеосомой включает мономер убиквитина. Изобретения могут быть использованы для предупреждения аллергии на арихис и облегчения ее переносимости. 8 н. и 17 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл., 2 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится, главным образом, к области профилактических или терапевтических вакцин. В частности описание относится к вакцине для лечения аллергий на арахис путем подавления аллергической реакции на него.
Уровень техники
В принципе аллергические заболевания представляют собой расстройства иммунной системы, связанные с дисрегуляцией субпопуляций лимфоцитов TH1 и TH2 [de Vries et al., 1999, Parronchi et al., 1999, Singh et al., 1999]. Постулировано, что со снижением частоты инфекционных заболеваний вследствие вакцинации, применения антибиотиков и других методов здравоохранения утерян основной источник иммунной провокации TH1 с последующим возрастанием смещения иммунных реакций TH2 на окружающие аллергены [Holgate 1999, Shaheen et al., 1996].
Из различных аллергических заболеваний, которые поражают значительную часть населения, вызываемая арахисом анафилаксия является особенно тяжелой и представляет наиболее распространенного участника госпитализаций в отделения неотложной помощи для лечения анафилактических реакций.
Аллергии на арахис являются результатом аберрантной иммунной реакции, направленной против другого безвредного антигена окружающей среды. Аллергия на и анафилаксия к арахису концентрируются вокруг иммунной реакции типа 2, характеризующейся генерацией клеток TH2 и В-клеток, секретирующих антитела IgE. Напротив, иммунная реакция типа 1 может характеризоваться антителами преимущественно IgG (изотип IgG2 у мышей), активацией клеток NK и фагоцитов и развитием цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Реакции как типа 1, так и 2 координируются хелперными Т-клетками, которые дифференцируют до нескольких функционально различных субпопуляций, включая лимфоциты TH1 и TH2. Такие субпопуляции характеризуются по их профилю секреции цитокинов [Mosmann et al., 1989], где клетки TH1 продуцируют IFN-гамма, и клетки TH2 типично секретируют IL-4, IL-5 и IL-13.
Поглощаемые перорально аллергены арахиса сначала сталкиваются с иммунной системой слизистой оболочки кишечника. Складчатые (М) клетки являются специализированными фолликул-ассоциированными клетками, которые выстилают эпителий желудочно-кишечного тракта и находятся в непосредственной близости к пейеровым бляшкам. Они ответственны за индукцию толеризации и/или защитные ассоциированные с кишечником иммунные реакции. Чувствительность к пищевым аллергенам имеет место, когда экзогенные пищевые антигены поглощаются М-клетками и затем представляются макрофагам и дендритным клеткам (DC) [DeLong et al., 2011]. После интернализации макрофагами и DC антигены претерпевают эндоцитоз, затем денатурируются и разрушаются до пептидов длиной примерно в 12-20 аминокислот. Затем небольшая фракция таких небольших пептидных фрагментов переносится внутриклеточно и представляется молекулам класса II ГКС на поверхности клеток для специфического взаимодействия с CD4+ Т-клетками. Затем такие активированные CD4+ Т-клетки увеличиваются в числе и высвобождают цитокины TH2. Клетки TH2, IL-4 и IL-5 промотируют дифференцировку В-клеток, которые включают аллергены, связанные с поверхностными иммуноглобулиновыми (Ig) рецепторами, до клеток, которые секретируют аллергенспецифические антитела IgE [Turcanu et al., 2010]. Такие продуцирующие IgE В-клетки увеличиваются в числе и становятся клетками плазмы, которые непрерывно секретируют аллергенспецифические антитела IgE. Воздействие окружающей среды на арахис приводит к связыванию аллергенов арахиса со специфическим слоем IgE на тучных клетках и базофилах. Затем перекрестное сшивание с Fc-рецептором дает сильный активирующий стимул, что приводит к дегрануляции базофилов и тучных клеток, которые быстро высвобождают различные предварительно образовавшиеся провоспалительные и вазоактивные соединения, такие как простагландины, лейкотриены, серинпротеазы, гистамин и цитокины, во внеклеточную жидкость с продуцированием воспалительной реакции [Sicherer et al., 2010], которые все достигают кульминации в клиническом проявлении острой аллергической реакции [Long 2002].
Локальные симптомы аллергии на арахис включают боль в животе, рвоту, судороги и диарею и являются обычными даже в случаях умеренной аллергии на арахис. Такая острая неопасная для жизни реакция вызывает временное возрастание интестинальной проницаемости, которая затем допускает системное распространение макромолекул, таких как цельные аллергены арахиса, обострение аллергической реакции на аллергены арахиса, что может вызвать опасные для жизни анафилактические реакции [Sanderson et al., 1993].
В отличие от традиционной иммунотерапии против аллергических реакций на пыльцу растений, пылевого клеща и пчелиный яд, подкожные десенсибилизирующие инъекции арахисовых экстрактов имеют неприемлемые опасные благоприятные действия [Oppenheimer et al., 1992]. Поэтому в настоящее время единственным доступным способом предотвращения дополнительных реакций является избегать арахис. Однако строгое избегание часто является нереальной стратегией для многих индивидуумов, в частности, в свете случайного воздействия арахиса, которое часто происходит через поглощение обработанных пищевых продуктов или продуктов, приготовленных в некоторой близости от продуктов, содержащих арахис, например, в ресторанах, школах, предприятиях питания и рабочих столовых. Поэтому сохраняется потребность в эффективной терапевтической стратегии для лечения и предупреждения аллергии на арахис.
Сущность изобретения
В одном аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере, два аллергена арахиса, выбранных из перечня, состоящего из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7, и их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере, два аллергена арахиса, выбранных из перечня, состоящего из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11, и их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.
В другом аспекте изобретение относится к поксвирусному вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере, три аллергена арахиса, выбранных из перечня, состоящего из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7, и их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере, три аллергена арахиса, выбранных из перечня, состоящего из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11, и их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению поксвирусного вектора, раскрытого в данном описании, для лечения или для изготовления лекарственного средства для лечения аллергии на арахис.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу индукции переносимости или подавления аллергической реакции у субъекта или пациента, причем способ включает введение субъекту или пациенту эффективного количества поксвирусного вектора, раскрытого в данном описании, в течение времени и в условиях, достаточных для того, чтобы добиться подавления/переносимости.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу вакцинации субъекта для индукции переносимости аллергена арахиса, включающему введение поксвирусного вектора, раскрытого в данном описании.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору, включающему поксвирусный вектор, раскрытый в данном описании.
Изложенную выше сущность изобретения не следует рассматривать как исчерпывающую все воплощения настоящего изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 показывает расположение антигена PHAV согласно воплощению настоящего изобретения, включающего метку деградации протеасомой и несколько аллергенов арахиса (фиг. 1А и 1В), и антигена PHAV согласно воплощению настоящего изобретения без метки деградации протеасомой (фиг. 1С).
Фиг. 2 показывает нуклеотидную последовательность экспрессирующей кассеты UBc.PHAV.
Фиг. 3 показывает нуклеотидную последовательность экспрессирующей кассеты конструкции PHAVag без последовательности убиквитина.
Фиг. 4 является схематическим представлением встраивания экспрессирующих кассет PHAV в ORF A39R вируса коровьей оспы, штамм Копенгаген, методом гомологичной рекомбинации.
Фиг. 5 перечисляет особенности кассеты гомологичной рекомбинации, схематически представленной на фиг. 4.
Фиг. 6 показывает нуклеотидную последовательность кассеты гомологичной рекомбинации UBc.PHAV.
Фиг. 7 показывает нуклеотидную последовательность кассеты гомологичной рекомбинации PHAV.
Фиг. 8 является схематическим представлением рТС11 (UBc.PHAV) и рТС12 (PHAV). На фиг. 8 показаны плазмиды.
Фиг. 9 является схематическим представлением пути протеасомальной деградации в клетке.
Фиг. 10 показывает уровни сывороточных антител IgE (фиг. 10А) и IgG2a (фиг. 10В), специфических к белкам арахиса, до и после вакцинации (17 дней после вакцинации) с пустым вектором (SCV000) или вектором UBc.PHAV (SCV201C); *=р<0,05.
Фиг. 11 показывает уровни IFN-гамма (IFN-g; цитокин TH1; фиг. 11А), IL4 (цитокины TH2; фиг. 11В) и IL5 (цитокины TH2; фиг. 11С), секретированных культивированными лимфоцитами, полученными из селезенок мышей, вакцинированных SCV000 и SCV201C.
Подробное описание
Ссылка на любой уровень техники в данном описании не является и не должна приниматься как признание или какая-либо форма утверждения, что данный уровень техники образует часть общедоступных сведений в любой стране.
В данном описании, если контекст не требует иного, слова «включать», «включает» и «включающий» следует понимать как означающие включение определенной стадии или элемента или группы стадий или элементов, но без исключения любой другой стадии или элемента или группы стадий или элементов. Таким образом, применение термина «включающий» и подобных показывает, что перечисленные элементы являются требуемыми или обязательными, но что другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или не могут. «Состоящий из» подразумевает включение и ограничивается тем, что следует за выражением «состоящий из». Таким образом, выражение «состоящий из» показывает, что перечисленные элементы требуются или являются обязательными, и что никакие другие элементы не могут присутствовать. «Состоящий по существу из» подразумевает включение любых элементов, перечисленных после указанного выражения и ставит предел другим элементам, которые не влияют на или не вносят вклад в активность или действие, конкретизированные в раскрытии для перечисленных элементов. Таким образом, выражение «состоящий по существу из» показывает, что перечисленные элементы требуются или являются необходимыми, но что другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или не могут, в зависимости от того, влияют ли они или нет на активность или действие перечисленных элементов.
Используемые в данном описании формы единственного числа включают множественные аспекты, если контекст не требует четко иного. Таким образом, например, ссылка на «композицию» включает одну композицию, а также две или больше композиций; ссылка на «агента» включает одного агента, а также два или больше агентов; ссылка на «изобретение» включает один и несколько аспектов изобретения; и так далее.
Если не указано иное, все технические термины, используемые в данном описании, имеют значения, которые им обычно придаются специалистами в области техники, к которой относится данное изобретение. Любые материалы и способы, схожие с или эквивалентные способам, описанным в данном описании, могут быть использованы для осуществления на практике или проверки настоящего изобретения.
Настоящее изобретение делает возможным «вакцинный» подход к разработке терапевтического средства для лечения или предупреждения аллергии на арахис. В частности, описывается средство, способное предоставить терапию в контексте основных аллергенов арахиса, например, по меньшей мере, одного, по меньшей мере, двух, по меньшей мере, трех и т.д. наиболее распространенных или опасных аллергенов арахиса.
Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии авторов изобретения, что ДНК-вакцина, включающая нуклеотидную конструкцию, оперативно кодирующую слитый белок, причем слитый белок включает аллерген арахиса (такой, как ara h 1), соединенный с меткой деградации протеасомой (такой, как убиквитин), способна индуцировать иммунную реакцию у субъекта, которая смещена к фенотипу TH1, что ведет таким образом к секреции специфических IgG-антител к аллергенам арахиса как противодействующих специфическим IgE-антителам к аллергенам арахиса, которые в противном случае облегчают аллергическую реакцию при воздействии аллергена арахиса.
Соответственно в одном аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере, два аллергена арахиса, выбранных из перечня, состоящего из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7, и их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере, два аллергена арахиса, выбранных из перечня, состоящего из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11, и их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере, три аллергена арахиса, выбранных из перечня, состоящего из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7, и их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере, три аллергена арахиса, выбранных из перечня, состоящего из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11, и их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, который экспрессирует в клетке субъекта слитый белок, включающий (i) аллерген аллергена арахиса, выбранный из перечня, состоящего из, (а) по меньшей мере, двух аллергенов арахиса из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7 или их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, или (b), по меньшей мере, трех аллергенов арахиса из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7 или их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к поксвирусному вектору, который экспрессирует в клетке субъекта слитый белок, включающий (i) аллерген аллергена арахиса, выбранный из перечня, состоящего из, (а) по меньшей мере, двух аллергенов арахиса из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11 или их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, или (b), по меньшей мере, трех аллергенов арахиса из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11 или их производных или частей, имеющих, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей с ними, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.
Аллергены арахиса
Аллергены арахиса хорошо известны специалистам в данной области техники и включают любой пептид вида Arachis hypogaea, который может воздействовать на субъекта, например, при контакте, вдыхании, заглатывании, инъекции или подобным образом. В одном воплощении, по меньшей мере, два аллергена арахиса выбирают из группы, состоящей из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7. В другом воплощении, по меньшей мере, два аллергена арахиса выбирают из группы, состоящей из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11.
Слитый белок может включать любые два или больше аллергенов арахиса ara h 1 - ara h 11. Например, слитый белок может включать следующие аллергены арахиса:
(i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11;
(ii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 и ara h 10;
(iii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 и ara h 9;
(iv) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 и ara h 8;
(iv)) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7;
(vi) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5 и ara h 6;
(vii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4 и ara h 5;
(viii) ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 4;
(ix) ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 6;
(x) ara h 1, ara h 2 и ara h 3;
(xi) ara h 1 и ara h 2;
(xii) ara h 1 и ara h3;
(xiii) ara h 1 и ara h 4;
(xiv) ara h 1 и ara h 5;
(xv) ara h 1 и ara h 6;
(xvi) ara h 1 и ara h 7;
(xvii) ara h 1 и ara h 8;
(xviii) ara h 1 и ara h 9;
(xix) ara h 1 и ara h 10;
(xx) ara h 1 и ara h 11;
(xxi) ara h 2 и ara h 3;
(xxii) ara h 2 и ara h 4; и т.д.
За счет использования метки деградации протеасомой (например, убиквитина) как компонента слитого белка синтезированный слитый белок является мишенью для протеасомальной деградации, приводящей к генерации небольших пептидных фрагментов, которые вступают в эндоплазматический ретикулум (ER), где они образуют комплекс с белками класса I ГКС и затем переносятся к поверхности клетки для представления Т-лимфоцитам. Как следствие, имеет место усиленное представление фрагментов белков классу I ГКС. Таким образом, специалистам в данной области техники следует иметь в виду, что когда нуклеотидная последовательность кодирует слитый белок, включающий два или больше аллергенов арахиса, два или больше аллергенов арахиса могут оказаться в слитом белке в любом определенном порядке, когда экспрессированный слитый белок будет подвергаться протеасомальной деградации.
Специалистам в данной области техники следует иметь в виду, что выбор аллергена или аллергенов арахиса вероятно зависит от определенного терапевтического и/или профилактического применения. Например, когда вакцина должна использоваться для индукции переносимости у субъекта, который имеет аллергию на аллерген арахиса Ara h 1, тогда желательно, чтобы слитый белок включал ara h 1; когда вакцина должна использоваться для индукции переносимости у субъекта, который имеет аллергию на аллерген арахиса ara h2, тогда желательно, чтобы слитый белок включал ara h2; когда вакцина должна использоваться для индукции переносимости у субъекта, который имеет аллергию на аллергены арахиса ara h 1 и ara h 2, тогда желательно, чтобы слитый белок включал ara h 1 и ara h2; и т.д.
В одном воплощении аллерген арахиса выбирают из группы, включающей клон Р41В ara h 1 (GenBank, инвентарный номер L34402, или Swiss-Prot: Р43238.1); клон Р17 ara h 1 (GenBank, инвентарный номер L38853); кДНК ara h 2 (GenBank, инвентарный номер L7797, или UniProtKB/TrEMBL: Q8GV20); кДНК ara h 3 (GenBank, инвентарный номер AF093541 или АСН91862); кДНК ara h 4 (GenBank, инвентарный номер AF086821); кДНК ara h 5 (GenBank, инвентарный номер AF059616); кДНК ara h 6 (GenBank, инвентарный номер AF092846, или UniProtKB/TrEMBL: Q647G9), кДНК ara h 7 (GenBank, инвентарный номер AF091737), ara h 8 (GenBank, инвентарный номер AY328088, EF436550), ara h 9 (GenBank, инвентарный номер EU159429, EU161278), ara h 10 (AY722694, AY722695) и ara h 11 (DQ097716).
В одном воплощении слитый белок включает, по меньшей мере, четыре аллергена арахиса, предпочтительно, по меньшей мере, четыре из наиболее распространенных аллергенов, влияющих на субъектов с аллергией на арахис. В одном воплощении слитый белок включает аллергены арахиса ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 6.
Используемый в данном описании термин «аллерген арахиса», включающий конкретные примеры, такие как ara h 1, ara h 2 и т.д., следует понимать как включающий также его гомолог или вариант. Термин «гомолог», используемый в данном описании с обращением к гомологам нуклеотидных последовательностей или полипептидов, описанных в данном описании (включая, например, любую из SEQ ID NO: 1-12), следует понимать как включающий, например, ортологи, паралоги, мутанты и варианты нуклеиновых кислот или полипептидов, описанных в данном описании. В некоторых воплощениях гомолог включает нуклеотидную или аминокислотную последовательность, которая включает, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей, по меньшей мере, 75% идентичность последовательностей, по меньшей мере, 80% идентичность последовательностей, по меньшей мере, 85% идентичность последовательностей, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей, по меньшей мере, 96% идентичность последовательностей, по меньшей мере, 97% идентичность последовательностей, по меньшей мере, 98% идентичность последовательностей или, по меньшей мере, 99% идентичность последовательностей с нуклеотидной или аминокислотной последовательностью, описанной в данном описании.
Так, в одном воплощении ara h 1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность с нею, ara h 2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность с нею, ara h 3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность с нею, и ara h 6 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность с нею,
В другом воплощении ara h 1 кодирован нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3 или нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность с нею, ara h 2 кодирован нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5 или нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность с нею, ara h 3 кодирован нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 7 или нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность с нею, и ara h 6 кодирован нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность с нею.
Термин «идентичность последовательностей», используемый в данном описании, относится к степени, в которой последовательности идентичны на основе нуклеотид-нуклеотид или аминокислота-аминокислота в окне сравнения. Так, «процент идентичности последовательностей» вычисляют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, определяя число позиций, в которых идентичное нуклеотидное основание (например, А, Т, С, G, I) или идентичный аминокислотный остаток (например, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys и Met) имеет место в обеих последовательностях, что дает число соответственных позиций, путем деления числа соответственных позиций на общее число позиций в окне сравнения (т.е. размер окна), и умножая результат на 100, что дает процент идентичности последовательностей. Для целей настоящего изобретения «идентичность последовательностей» следует понимать как обозначение «процента соответствий», вычисленного соответствующим способом. Например, анализ идентичности последовательностей можно выполнить с использованием компьютерной программы DNASIS (версия 2.5 для окон; доступна от Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, США) с использованием стандартных значений по умолчанию, как описано в справочном руководстве, прилагаемом к программному обеспечению. Идентичность последовательностей заключенной в аллергене арахиса аминокислотной или нуклеотидной последовательности в некоторых воплощениях возрастает до, по меньшей мере, 75% или по меньшей мере, 80% или по меньшей мере, 85% или, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% или, по меньшей мере, 98% идентичности последовательностей.
В некоторых воплощениях термин «аллерген» может также включать фрагмент любого одного из вышеуказанных пептидов. Как таковая, нуклеиновая кислота может включать нуклеотид, который кодирует фрагмент одного из вышеуказанных аллергенов арахиса.
В некоторых воплощениях аллерген арахиса включает модифицированный аллерген арахиса, посредством чего повтор последовательностей из 8 или больше оснований удаляется из последовательности нативного аллергена арахиса. В некоторых воплощениях слитый белок включает 2 или больше аллергенов арахиса. В некоторых воплощениях слитый белок включает два или больше аллергенов арахиса, по меньшей мере, один из которых выбран из группы, состоящей из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11. В некоторых воплощениях слитый белок включает ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 6 или их гомологи.
В некоторых воплощениях для облегчения экспрессии слитого белка нуклеиновую кислоту лишают стоп-кодонов между двумя последовательностями, кодирующими аллергены арахиса.
Метка деградации протеасомой
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что использование метки деградации протеасомой (такой как убиквитин) как компонента слитого белка дает возможность преодолеть явное токсичное и/или ингибирующее действие, которое пептидная конструкция аллергена арахиса без убиквитина оказывает на рекомбинантную экспрессию. Использование метки деградации протеасомой делает экспрессированный слитый белок мишенью для протеасомальной деградации. В результате нацеленной убиквитином протеасомальной деградации небольшие пептидные фрагменты слитого белка (например, пептиды длиной примерно в 8-12 аминокислот) входят в эндоплазматический ретикулум (ER), где они образуют комплекс с белками класса I ГКС и затем переносятся к поверхности клетки для представления Т-лимфоцитам. В результате имеет место усиленное представление фрагментов слитого белка с классом I ГКС, приводящее к более сильной иммунной реакции TH1 на аллергены арахиса. Таким образом, метка деградации протеасомой неожиданно предохраняет интактную пептидную конструкцию аллергена арахиса от ингибирования рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине и сдвигает иммунную реакцию к фенотипу TH1.
Метка деградации протеасомой может представлять собой любую метку, которая делает слитый белок мишенью для протеасомальной деградации. В некоторых воплощениях метка деградации протеасомой может включать молекулу убиквитина или связывающий домен убиквитина. В одном воплощении метка деградации протеасомой представляет собой мономер убиквитина, пояснительным примером которого является убиквитин С. В некоторых воплощениях мономер убиквитина включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность нуклеотидной последовательности к ней.
В некоторых воплощениях C-конец мономера убиквитина представляет собой аланиновый остаток.
В другом воплощении мономер убиквитина кодирован нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность нуклеотидной последовательности с нею.
Последовательность, кодирующая метку деградации протеасомой, может размещаться до или после последовательности, кодирующей, по меньшей мере, один аллерген арахиса (т.е. метка деградации белка может являться C-концом или N-концом слитого белка).
Молекулы убиквитина могут быть получены из любого подходящего вида. Для вакцины, предназначенной для лечения людей, молекула убиквитина может быть молекулой убиквитина человека или молекулой убиквитина животного другого вида, который может иметь кодон, оптимизированный для экспрессии в клетках человека. В некоторых воплощениях молекула убиквитина может представлять собой мономер убиквитина С. Сразу после экспрессии молекула убиквитина может притягиваться и связываться с другими молекулами убиквитина с образованием полиубиквитиновой цепи на слитом белке. Молекула убиквитина и/или полиубиквитиновая цепь могут направлять слитый белок для протеасомальной деградации.
В некоторых воплощениях нуклеотидная конструкция операбельно кодирует несколько молекул убиквитина или одну или несколько последовательностей, кодирующих укороченную или модифицированную молекулу убиквитина. Если кодированы несколько молекул убиквитина, один или несколько стартовых и стоп-кодонов могут быть удалены для создания возможности трансляции полного слитого белка.
В некоторых воплощениях укороченная молекула убиквитина может включать исключение лизина, ближайшего к C-концу нативной молекулы убиквитина. В некоторых воплощениях модифицированная молекула убиквитина может иметь один или несколько удаленных из последовательности или замененных (например, аргинином) лизиновых остатков нативной последовательности. В некоторых воплощениях молекула убиквитина может иметь только один лизин.
В некоторых воплощениях C-концевая молекула убиквитина может быть модифицирована. Например, C-концевой глицин нативной молекулы может быть заменен аланином. Замена глицина на аланин или другую аминокислоту может предотвратить отщепление метки деградации протеасомой от аллергена. Замена глицина на аланин также может создать возможность для образования ковалентной связи между меткой деградации протеасомой и аллергеном. Ковалентная связь может быть устойчива к расщеплению протеазой.
В некоторых воплощениях метка деградации протеасомой может включать связывающий домен убиквитина. Метка деградации протеасомой может являться членом семейства UbL (убиквитинподобных)-UBA (убиквитинассоциированных) доменсодержащих белков. В этом отношении экспрессированный слитый белок может способствовать связыванию молекул убиквитина со связывающим доменом, что ведет к протеасомальной деградации слитого белка.
Слитый белок
В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность кодирует слитый белок, который оптимизирован для экспрессии у субъекта. Например, последовательность слитого белка аллергена арахиса может быть оптимизирована для экспрессии в клетке человека. Подобным образом, в некоторых воплощениях метка деградации протеасомой оптимизирована для экспрессии у субъекта и/или может представлять собой метку деградации протеасомой, клонированную из того же вида, что и нужный субъект. В некоторых воплощениях оптимизация кодона включает замену кодона другим кодоном, который кодирует ту же аминокислоту, но более эффективно или точно транслируется в видах-мишенях (например, у людей).
В некоторых воплощениях оптимизация последовательности для экспрессии у субъекта также включает удаление повторных последовательностей. Например, в некоторых воплощениях из последовательности аллергена арахиса удаляют повторные последовательности из 8 или более оснований. Это может быть важно, в частности, если последовательность сконструирована синтетически обратной трансляцией. Синтетические последовательности обычно утрачивают преимущество оптимизации кодона через эволюцию. Поэтому разрыв случайно встречающихся дестабилизирующих повторных последовательностей в последовательности путем замены нуклеотидных оснований без изменения аминокислотной последовательности может улучшить экспрессию последовательности.
В некоторых воплощениях метка деградации протеасомой кодирована нуклеотидной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO: 1 или ее гомологу. В некоторых воплощениях аллергены арахиса слитого белка кодированы нуклеотидной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 9, или гомологу одной из вышеуказанных последовательностей.
В некоторых воплощениях метка деградации протеасомой включает аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях аллергены арахиса слитого белка включает аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и/или SEQ ID NO: 10.
Так как конформационные эпитопы не требуются для представления КГС-1 и в некоторых отношениях нежелательны для того, чтобы предотвратить связывание аллергенспецифических IgE-антител, не требуется, чтобы аллергены, экспрессированные как часть слитого белка, находились в своей нативной структурной форме. Это может создать возможность для использования слитых белков, включающих несколько аллергенов арахиса, и дает маневренность при создании слитого белка.
Соответственно в некоторых воплощениях нуклеотидная конструкция операбельно кодирует 2 или больше аллергенов арахиса. Например, слитый белок может кодировать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше аллергенов арахиса. Для некоторых нуклеиновых кислот, по меньшей мере, один из аллергенов можно выбрать из следующих аллергенов арахиса или их гомологов: ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 или ara h 11. В примере для пояснения нуклеотидная конструкция операбельно кодирует ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 6 или их гомологи. Например, нуклеотидная конструкция может включать нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 11, или может кодировать белок с аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO: 12.
Каждый аллерген может быть слит со своей собственной меткой деградации протеасомой и может быть операбельно соединен со своим собственным промотором (например, могут экспрессироваться несколько слитых белков). С другой стороны, последовательности для метки деградации протеасомой и аллергенов могут располагаться, допуская экспрессию слитого белка, включающего метку деградации протеасомой и несколько аллергенов. Такой последний подход может предотвратить дифференциальную экспрессию различных аллергенов и/или предотвратить внутримолекулярную рекомбинацию, если используют несколько экспрессирующих кассет с идентичными промоторами.
Для того чтобы создать возможность трансляции слитого белка с 2 или больше аллергенами, нуклеиновую кислоту можно лишить стоп-кодонов между двумя последовательностями, кодирующими аллергены арахиса. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность может быть лишена стоп-кодонов между любыми последовательностями, кодирующими аллергены арахиса, и/или может быть лишена стоп-кодонов между последовательностью, кодирующей метку деградации протеасомой, и последовательностью, кодирующей аллерген.
Для того чтобы провести трансляцию, последовательность, кодирующая первую часть слитого белка, может включать стартовый кодон на 5'-конце последовательности. Стартовые кодоны могут отсутствовать в последовательности, кодирующей остальную часть слитого белка. В этом отношении аллергены, которые не слиты с меткой деградации протеасомой, могут быть сведены к минимуму или предотвращены. Это может минимизировать или предотвратить секрецию интактных аллергенов арахиса из клетки или представление на поверхность клетки, что в ином случае может стимулировать иммунную реакцию TH2 против аллергена.
В одном воплощении слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность с нею.
В другом воплощении слитый белок кодирован нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 11 или нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность с нею.
В некоторых воплощениях, и для того, чтобы облегчить экспрессию слитого белка в виде интактного белка и уменьшить дифференциальную экспрессию каждого аллергена, вектор включает регулярную последовательность транскрипции (такую, как промотор) и единичный стартовый кодон для облегчения экспрессии интактного слитого белка.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к нуклеотидной кассете для десенсибилизации или индукции переносимости у субъекта аллергена арахиса, причем кассета включает i) вакцину, описанную в данном описании, и ii) концевой рестриктазный линкер на каждом конце последовательности кассеты. В некоторых воплощениях, по меньшей мере, один рестриктазный линкер включает последовательность узнавания/расщепления рестриктазой Pac1. В некоторых воплощениях кассета представляет собой кассету вирусного вектора.
Нуклеотидная конструкция может выгодно включать транскрипционную регулярную последовательность, операбельно соединенную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей слитый белок.
Термин «транскрипционная регулярная последовательность» следует понимать как включающий любую нуклеотидную последовательность, которая влияет на транскрипцию операбельно соединенной нуклеиновой кислоты. Подходящие транскрипционные регулярные последовательности могут быть известны специалистам в данной области техники. Пояснительные примеры включают лидерную последовательность, последовательность полиаденилирования, промотор, энхансер или активирующую последовательность и терминатор транскрипции. Типично транскрипционная регулярная последовательность, по меньшей мере, включает промотор. Термин «промотор», используемый в данном описании, описывает любую нуклеиновую кислоту, которая предоставляет, активирует или усиливает экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты в клетке.
В некоторых воплощениях, по меньшей мере, одна транскрипционная регулярная последовательность операбельно соединена с нуклеиновой кислотой, кодирующей слитый белок. Для целей настоящего изобретения транскрипционная регулярная последовательность рассматривается как «операбельно соединенная» с данным геном или нуклеотидной последовательностью, когда транскрипционная регулярная последовательность способна промотировать, ингибировать или иначе модулировать транскрипцию гена или другой нуклеотидной последовательности.
Промотор может регулировать экспрессию операбельно соединенной нуклеотидной последовательности конститутивно или дифференциально в отношении клетки, ткани, органа или стадии развития, на которой происходит экспрессия, в ответ на внешние раздражители, такие как, среди прочих, психологический стресс, патогены или ионы металлов, или в ответ на один или несколько активаторов транскрипции. Как таковой, промотор, используемый в соответствии с вакциной и/или способами по настоящему изобретению, может включать, например, конститутивный промотор, индуцируемый промотор, тканеспецифический промотор или активирующий промотор. Настоящее изобретение предполагает использование любого промотора, который мог бы быть активным в клетке, представляющей интерес.
«Тканеспецифические промоторы» включают промоторы, которые преимущественно или специфически экспрессируются в одной или нескольких специфических клетках, тканях или органах в организме и/или на одной или нескольких стадиях развития организма. Следует иметь в виду, что тканеспецифический промотор также может быть конститутивным или индуцируемым.
Промотор также может представлять собой промотор, который может активироваться одним или несколькими транскрипционными активаторами, называемый в данном описании «активируемым промотором». Например, активируемый промотор может включать минимальный промотор, операбельно соединенный с активирующей последовательностью (UAS), который включает, среди прочего, ДНК-связывающий сайт для одного или нескольких транскрипционных активаторов.
Упоминаемый в данном описании термин «минимальный промотор» следует понимать как включающий любой промотор, который включает, по меньшей мере, сайт связывания РНК-полимеразы и, необязательно, ТАТА-бокс и сайт инициации транскрипции и/или один или несколько СААТ-боксов.
Как указано выше, активируемый промотор может включать минимальный промотор, слитый с активирующей последовательностью (UAS). UAS может представлять собой любую последовательность, которая может связывать транскрипционный активатор для активации минимального промотора. Примеры транскрипционных активаторов включают, например, транскрипционные активаторы, полученные из дрожжей, такие как Gal4, Pdr1, Gcn4 и Ace1; транскрипционный активатор, полученный из вирусов, VP16; Hap1 (Hach et al., J. Biol. Chem., 278: 248-254, 2000); Gaf1 (Hoe et al., Gene, 215(2): 319-328, 1998); E2F (Albani et al., J. Biol. Chem., 275: 19258-19267, 2000); HAND2 (Dai and Cserjesi, J. Biol. Chem., 277: 12604-12612, 2002); NRF-1 и EWG (Herzig et al., J. Cell Sci., 113: 4263-4273, 2000); P/CAF (Itoh et al., Nucl. Acids Res., 28: 4291-4298, 2000); MafA (Kataoka et al., J. Biol. Chem., 277: 49903-49910, 2002); человеческий активирующий фактор 4 (Liang and Hai, J. Biol. Chem., 272: 24088-24095, 1997); Bc110 (Liu et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 320(1): 1-6, 2004); CREB-H (Omori et al., Nucl. Acids Res., 29: 2154-2162, 2001); ARR1 и ARR2 (Sakai et al., Plant J., 24(6): 703-711, 2000); Fos (Szuts and Bienz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 5351-5356, 2000); HSF4 (Tanabe et al., J. Biol. Chem., 274: 27845-27856, 1999); MAML1 (Wu et al., Nat. Genet, 26: 484-489, 2000).
Транскрипционная регулярная последовательность также может включать терминатор. Термин «терминатор» относится к последовательности ДНК на конце транскрипционной единицы, которая передает сигналы терминации транскрипции. Терминаторы представляют собой 3'-нетранслируемые последовательности ДНК, обычно содержащие сигнал полиаденелирования, который облегчает присоединение последовательности полиаденилата к 3'-концу первичного транскрипта. Как и в случае промоторных последовательностей, терминатор может представлять собой любую последовательность-терминатор, которая способна работать в клетках, тканях или органах, для использования в которых он предназначен. В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность может включать вирусную последовательность прекращения ранней транскрипции 3' последовательности, кодирующей слитый белок.
Векторы
В одном воплощении нуклеотидная конструкция операбельно включена в вектор.
В некоторых воплощениях вектор может представлять собой экспрессирующий вектор, адаптированный для экспрессии в эукариотной клетке. Используемый в данном описании «вектор» может представлять собой любую из нуклеиновых кислот, в которые может быть встроена нужная последовательность. Векторы включают, но не ограничиваются перечисленным, плазмиды, фагемиды и вирусные геномы. В некоторых воплощениях экспрессирующий вектор также способен к репликации в клетке-хозяине (например, бактериальной клетке) и также может дополнительно включать один или несколько сайтов рестрикции эндонуклеазами, в которых вектор может быть разрезан нужным образом, и в которые можно лигировать нужную последовательность ДНК таким образом, что рекомбинантный вектор сохраняет свою способность к репликации в клетке-хозяине. В случае плазмид репликация нужной последовательности может происходить несколько раз, когда увеличивается число копий плазмиды в хозяине-бактерии, или только один раз на хозяина, прежде чем хозяин репродуцируется путем митоза. В случае фага репликация может происходить активно во время литической фазы или пассивно во время лизогенной фазы.
Экспрессирующие векторы могут содержать транскрипционные регулярные последовательности для проведения экспрессии встроенных нуклеиновых кислот в клетках-мишенях (например, в клетке человека). Транскрипционные регулярные последовательности включают последовательности, описанные выше, и включают, например, промоторы.
Векторы также могут содержать одну или несколько селектируемых маркерных последовательностей, подходящих для применения при идентификации клеток, которые трансформированы или нет или трансфицированы или нет вектором. Маркеры включают, например, гены, кодирующие белки, которые повышают или снижают любую резистентность или чувствительность к антибиотикам или другим соединениям, гены, которые кодируют ферменты, активность которых детектируется стандартными анализами, известными в технике (например, β-галактозидазы, люциферазы), и гены, которые явно влияют на фенотип трансформированных или трансфицированных клеток, хозяев, колоний или бляшек (например, различные флуоресцентные белки, такие как зеленый флуоресцентный белок, GFP). Некоторые векторы могут быть способны к автономной репликации, и их также обычно относят к эписомным векторам. С другой стороны, векторы можно адаптировать для встраивания в хромосому - так называемые интегрирующие векторы. Вектор может быть предоставлен с регулярными последовательностями транскрипции (промоторными последовательностями), которые опосредуют клеточно/тканеспецифическую экспрессию. Такие промоторные последовательности могут быть клеточно/тканеспецифическими, индуцируемыми или конститутивными.
В некоторых воплощениях вектор может представлять собой вирусный вектор. Подходящие вирусные векторы должны быть известны специалистам в данной области техники. Пояснительные примеры вирусных векторов включают ретровирусный вектор, лентивирусный вектор, аденовирусный вектор, аденоассоциированный вирусный вектор или поксвирусный вектор. Поксвирусные векторы могут включать, например, вектор на основе птичьей оспы (например, оспы домашней птицы или оспы канареек). В некоторых воплощениях поксвирусный вектор может представлять собой вирусный вектор с ограниченной репликацией, например, модифицированный вирус коровьей оспы Ankara (MVA), вирус птичьей оспы или ослабленный вирус коровьей оспы. Использование вирусных векторов может быть благоприятным при дополнительном смещении реакции TH1 против клеток, экспрессирующих пептидные фрагменты разрушенных аллергенов арахиса на молекулах класса I ГКС, так как сам вирусный вектор может промотировать экспрессию рецепторов IL-12 на клетках. Кроме того, активация иммунных клеток вирусными векторами может инициировать комплексную сеть взаимодействий клетка-клетка и каскады продуцирования цитокинов, что приводит к сверхусилению иммунных функций TH1 по антигензависимому типу.
В одном воплощении вирусный вектор представляет собой поксвирусный вектор.
В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность включает последовательность прекращения ранней транскрипции 3' последовательности, кодирующей слитый белок.
Для облегчения клонирования нуклеотидная конструкция может быть включена в нуклеотидную кассету (т.е. экспрессирующую кассету). Соответственно в некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к нуклеотидной кассете для десенсибилизации субъекта к аллергену арахиса, причем кассета включает нуклеотидную конструкцию, операбельно кодирующую слитый белок, нужный в данном случае, и концевой рестриктазный линкер на каждом конце последовательности кассеты.
Термин «нуклеотидная кассета», используемый в данном описании, предназначен для обозначения нуклеотидной последовательности, созданной для введения молекулы нуклеиновой кислоты (например, нуклеотидной конструкции, описанной в данном описании), в вектор или геном.
Кассета типично будет включать концевой рестриктазный линкер на каждом конце последовательности кассеты. Концевые рестриктазные линкеры на каждом конце могут быть одинаковыми или различными концевыми рестриктазными линкерами. В некоторых воплощениях с одинаковыми концевыми рестриктазными линкерами на каждом конце может быть выгодно, если желательна репликация кассеты в бактериальных клетках (и кассета включает начало репликации), так как кассета может быть замкнута в кольцо путем гидролиза кассеты соответствующей рестриктазой и лигирования концов вместе. Подобным образом, циклическая кассета может быть линеаризована путем гидролиза кассеты отдельной рестриктазой.
В некоторых воплощениях концевые рестриктазные линкеры могут включать последовательности узнавания/расщепления редкими рестриктазами, так что непредусмотренный гидролиз нуклеиновой кислоты или вектора или генома, в которые следует ввести кассету, не происходит. В некоторых воплощениях концевые рестриктазные линкеры включают последовательность узнавания/расщепления рестриктазой Pac1.
Кассету можно клонировать в экспрессирующий вектор млекопитающего, бактериальный экспрессирующий или клонирующий вектор, экспрессирующий вектор насекомого, растительный экспрессирующий вектор или вирусный вектор. Соответственно кассета может представлять собой кассету вектора млекопитающего, кассету бактериального вектора, кассету вектора насекомого, кассету растительного вектора или кассету вирусного вектора.
Лечение и предупреждение аллергии на арахис
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что вакцина по настоящему изобретению вызывает смещенную иммунную реакцию TH1 против белка арахиса, которая будет доминировать над имеющейся аллергенспецифической иммунной реакцией TH2 и в силу этого будет десенсибилизировать индивидуума к последующему воздействию аллергена арахиса. Более того, экспрессия цитокинов TH1 (например, IFNγ, IL-12, TGF-β, IL2 и т.д.) может уменьшить экспрессию цитокинов TH2 (например, IL-3, IL-4, IL-5, IL6, IL10 и т.д.), смещая иммунную реакцию против аллергена в сторону иммунной реакции TH1, результатом чего является ингибирование или уменьшение интенсивности активации и/или рекруитмента продуцирующих IgE-антитела В-клеток, тучных клеток и эозинофилов, причем посредством этого ослабляется или предупреждается аллергическая реакция на последующее воздействие аллергена (например, анафилактическая реакция). Соответственно вакцина по настоящему изобретению подходит для использования при лечении у субъекта аллергии на арахис.
Авторы настоящего изобретения также неожиданно обнаружили, что вакцина по настоящему изобретению продуцирует смещенную иммунную реакцию TH1 на аллерген арахиса, которая не зависит от прежде имеющейся аллергии на арахис. Соответственно вакцина по настоящему изобретению подходит для использования при предупреждении аллергии на арахис у субъекта, который может иметь опасность такой аллергии.
Таким образом, другой аспект относится к применению поксвирусного вектора, раскрытого в данном описании, или при изготовлении лекарственного средства для вызывания переносимости у субъекта аллергии на арахис.
В одном воплощении поксвирусный вектор, раскрытый в данном описании, используют как профилактическое средство для предупреждения или уменьшения интенсивности аллергии на арахис у субъекта в опасности развития аллергии на арахис (т.е. у субъекта в опасности развития аллергии на арахис может быть вызвана переносимость). Субъекты в опасности развития аллергии на арахис могут включать людей, уже страдающих от аллергии, такой как сенная лихорадка, астма, или других пищевых аллергий, или людей, которые имеют семейный анамнез аллергий.
Другой аспект относится к способу индукции переносимости у субъекта аллергии на арахис, причем способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества поксвирусного вектора, раскрытого в данном описании, в течение времени и в условиях, достаточных для появления супрессии и/или переносимости, например, путем индукции аллергенспецифической реакции TH1 у субъекта.
Термины «аллергическая реакция», «аллергия», «аллергическое расстройство» и т.п., используемые в данном описании, следует понимать как обозначающие иммунное расстройство, при котором иммунная система является гиперчувствительной к другим безвредным веществам окружающей среды. Такие вещества окружающей среды, которые вызывают аллергии, называют «аллергенами». Обычные аллергии включают сезонный риноконъюнктивит (например, аллергии на травы и пыльцу, такие как амброзия, темофеевка луговая), аллергии на опасность от домашних животных, такую как опасность от кошек или опасность от собак, пищевые аллергии, такие как аллергия на арахис, молочные продукты и пшеницу, анафилаксию к ядам насекомых и астму. Аллергическое расстройство типично характеризуется выработкой IgE.
Аллергические заболевания являются результатом иммунных реакций против иных безвредных антигенов окружающей среды, характеризующихся генерацией клеток TH2, которые продуцируют IL-4 и IL-5 и промотируют дифференцировку В-клеток в клетки, секретерующие антитела IgE. Антитела IgE связываются с высокоаффинными рецепторами на базофилах и тучных клетках. Воздействие аллергена ведет к связыванию молекул аллергена поверхностью IgE и сшивает рецепторы, вызывая таким образом активацию и дегрануляцию базофилов и тучных клеток. Последние высвобождают ряд предварительно образовавшихся провоспалительных и вазоактивных соединений, таких как гистамин, простагландины, лейкотриены и цитокины, что ведет к воспалительной реакции. Связывание аллергена арахиса с антителами IgE, которые связаны с поверхностью тучных клеток и базофилов, является инициирующим событием, которое в итоге достигает кульминации в аллергической реакции. Предотвращение связывания аллергена с IgE, связанным с тучными клетками и/или базофилами, будет предотвращать начало аллергической реакции. Предотвращение продуцирования аллергенспецифического IgE после воздействия аллергена арахиса будет вызывать переносимость арахиса.
Термин «переносимость», используемый в данном описании, принят для обозначения ингибирования (частичного или полного) аллергической реакции на воздействие аллергена арахиса. Ингибирование может представлять собой предотвращение, замедление, ослабление, отмену или иное препятствование аллергической реакции. Такое ингибирование по характеру может быть значительным и/или быть временным. В определенном контексте термины «ингибировать» и «предотвращать» и их варианты могут быть использованы взаимозаменяемо. Переносимость можно оценить любыми средствами, известными специалистам в данной области техники. Как пояснительный пример, тест с прокалыванием кожи может быть использован для измерения реакции субъекта на аллерген или несколько аллергенов до и/или после лечения поксвирусным вектором, раскрытым в данном описании. Например, у субъекта, который имеет аллергию на арахис, тест с прокалыванием кожи с использованием одного или нескольких аллергенов арахиса типично будет продуцировать наблюдаемую локализованную аллергическую реакцию, характеризующуюся местным высыпанием, язвой и/или отеком. Переносимость у того же индивидуума после лечения поксвирусным вектором, раскрытым в данном описании, типично будет проявляться сама как ослабленная локализованная аллергическая реакция при тесте с прокалыванием. Такое ослабление можно измерить, например, по различию в размере (например, диаметре) локализованной аллергической реакции до и после лечения.
В другом пояснительном примере переносимость оценивают по предотвращению, замедлению, ингибированию, ослаблению, отмене или препятствованию тяжести аллергической реакции после случайного воздействия аллергена арахиса. Например, когда субъект имеет историю болезни с анафилактическими реакциями на воздействие аллергена арахиса, переносимость как результат лечения поксвирусным вектором по настоящему изобретению можно определить по отсутствию анафилактической реакции после последующего воздействия аллергена арахиса, даже если субъект может показывать другие признаки аллергической реакции, такие как сыпь.
В другом пояснительном примере переносимость оценивают, определяя в кровотоке у субъекта уровень специфических к аллергену арахиса антител IgE. Например, субъект, который имеет в истории болезни аллергические реакции (включая анафилактические реакции) на воздействие аллергена арахиса, типично будет иметь более высокий уровень специфических к аллергену арахиса антител IgE по сравнению, например, с субъектом, у которого нет аллергии на арахис. У таких индивидуумов переносимость можно определить по снижению уровня специфических к аллергену арахиса антител IgE в кровотоке после лечения вакциной по настоящему изобретению. С другой стороны, переносимость можно определить по более высокому уровню в кровотоке специфических к аллергену арахиса антител IgG после лечения поксвирусным вектором по настоящему изобретению, которое характеризуется иммунной реакцией TH1 и типично показательным толерантным состоянием.
С другой стороны или кроме того, переносимость можно определить, оценивая профиль цитокинов в образце, взятом у субъекта (например, образце крови, включая образец плазмы или сыворотки). Например, более высокий уровень IFN-гамма является показателем смещения в сторону аллергенспецифической реакции TH1, в то время как более высокий уровень IL-4 и/или IL-5 является показателем смещения в сторону аллергенспецифической реакции TH2.
С другой стороны или кроме того, переносимость можно определить, получая образец Т-лимфоцитов субъекта, которого лечат поксвирусным вектором по настоящему изобретению, раскрытым в данном описании, и измеряя профиль цитокинов лимфоцитов ex vivo. Например, более высокий уровень продуцирования Т-лимфоцитами IFN-гамма является показателем смещения в сторону аллергенспецифической реакции TH1, в то время как более высокий уровень продуцирования Т-лимфоцитами IL-4 и/или IL-5 является показателем смещения в сторону аллергенспецифической реакции TH2. Способы измерения уровня специфических к аллергену арахиса антител IgE и/или IgG и цитокинов, которые способны к дифференцировке между реакцией TH1 и TH2, должны быть известны специалистам в данной области техники. Пояснительные примеры включают радиоиммуноанализ (РИА) и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).
Специалистам в данной области техники следует иметь в виду, что поксвирусный вектор, раскрытый в данном описании, следует вводить или в одной дозе или как часть ряда доз, которые обеспечивают нужное терапевтическое или профилактическое действие у субъекта, нуждающегося в этом, а именно, индукцию переносимости аллергена арахиса. Нежелательное действие, например, побочное действие, иногда может проявляться вместе с желательным терапевтическим или профилактическим действием; поэтому на практике при определении соответствующего эффективного количества обычно приходится балансировать между возможным благоприятным действием и возможными рисками. Точное требуемое количество вакцины будет изменяться от субъекта к субъекту в зависимости от вида и общего состояния субъекта, способа введения и т.п. Таким образом, невозможно конкретизировать точное количество. Однако соответствующее эффективное количество в любом отдельном случае специалист в данной области техники может определить с использованием обычных приемов или экспериментов. Специалист в данной области техники сможет определить требуемые количества на основании таких факторов, как объем и масса субъекта, тяжесть симптомов у субъекта и предполагаемый способ введения.
Термин «лечение» относится к любому поддающемуся измерению или статистически значимому ингибированию или уменьшению интенсивности у, по меньшей мере, некоторых субъектов одного или нескольких симптомов аллергии на арахис.
В некоторых воплощениях поксвирусный вектор, раскрытый в данном описании, используют для десенсибилизации субъекта с аллергией на арахис (т.е. субъекта, который гиперчувствителен к одному или нескольким аллергенам арахиса) к одному или нескольким аллергенам арахиса. Предполагается, что термин «десенсибилизация субъекта», используемый в данном описании в отношении аллергена арахиса, означает, что чувствительность субъекта к аллергену арахиса снижается, уменьшается ее интенсивность или она устраняется. В этом отношении симптомы аллергии на арахис у субъекта после повторного воздействия одного или нескольких аллергенов арахиса ослабевают частично или полностью.
С другой стороны или кроме того, в некоторых воплощениях для вызывания переносимости у субъекта к одному или нескольким аллергенам арахиса используют нуклеотидную последовательность. Индукцию переносимости к одному или нескольким аллергенам арахиса осуществляют у субъекта с аллергией на арахис или у субъекта, который может находиться в опасности развития аллергии на арахис (т.е. нуклеотидная последовательность может быть использована как часть профилактического лечения аллергии на арахис).
Хотя поксвирусный вектор, раскрытый в данном описании, используют для сенсибилизации или индукции переносимости у субъекта с аллергией на арахис различными путями (как раскрыто в данном описании), общий принцип, согласно которому действует поксвирусный вектор, является одним и тем же. Когда слитый пептид экспрессируется в клетке, он является мишенью для протеасомальной деградации в силу метки деградации протеасомой, что предотвращает секрецию интактного слитого белка из клетки.
В одном воплощении предлагается способ вакцинации субъекта для индукции переносимости аллергена арахиса, включающий введение поксвирусного вектора, раскрытого в данном описании. В отдельном воплощении способ является способом индукции переносимости, по меньшей мере, двух или, по меньшей мере, трех аллергенов арахиса.
Настоящее изобретение распространяется на наборы, включающие поксвирусный вектор, раскрытый в данном описании.
Поксвирусный вектор по настоящему изобретению может быть доставлен к клетке in vivo или ex vivo (например, в виде голой ДНК или в векторе) способом, известным в технике. Пояснительные примеры включают вирусную доставку, микроинъекцию, генную пушку, прокалывание, гидростатическое давление, электропорацию, ультразвук и/или липофекцию. Поксвирусный вектор также может быть доставлен в клетку в виде фармацевтической композиции.
Липосомы могут служить в качестве носителя для поксвирусного вектора. Липосомы представляют собой везикулы на основе липидов, которые инкапсулируют выбранное терапевтическое средство (например, вектор), которое затем вводят пациенту. Липосому можно получить или из чистого фосфолипида или из смеси фосфолипида и фосфоглицерида. Типично можно получить липосомы диаметром менее 200 нм, что делает возможным инъецировать их внутривенно и позволяет им проходить через слой легочных капилляров. Кроме того, биохимический характер липосом предоставляет проникание через мембраны кровеносных сосудов для приобретения доступа к выбранным тканям.
Поксвирусный вектор может быть голым, иными словами, неассоциированным с какими-либо белками или другими агентами, которые могут влиять на иммунную систему реципиента. В таком случае желательно, чтобы поксвирусный вектор находился в физиологически приемлемом растворе, таком как, но без ограничения, стерильный физиологический раствор или стерильный забуференный физиологический раствор. С другой стороны, вакцина может ассоциироваться с липосомами, такими как лецитиновые липосомы, известные в технике. Также можно использовать средства, которые способствуют клеточному поглощению молекул нуклеиновой кислоты, такие как, но без ограничения, ионы кальция.
В случае невирусных векторов количество нуклеиновой кислоты, вводимой реципиенту, будет иметь очень широкий интервал и может зависеть, например, от силы используемых транскрипционных и трансляционных промоторов. Кроме того, величина иммунной реакции может зависеть от уровня экспрессии белка и от иммуногенности экспрессированного продукта слитого белка. Эффективный дозовый интервал может включать примерно 1 нг - 5 мг, примерно 100 нг - 2,5 мг, примерно 1 мкг - 750 мкг или примерно 10 мкг - 300 мкг нуклеиновой кислоты (например, как части поксовирусного вектора).
Поксвирусный вектор можно вводить или инокулировать подкожно, внутримышечно, интрадермально или другими путями, такими как интраперитонеальный, внутривенный или ингаляция, в присутствии адъювантов или других веществ, которые имеют способность промотировать поглощение ДНК или рекрутинг клеток иммунной системы к сайту инокуляции. Выбранный путь введения будет зависеть от композиции и статуса заболевания пациентов. Релевантные рассмотрения включают типы иммунных клеток, которые активируются, время, за которое антиген воздействует на иммунную систему, и график иммунизации. Также учитывается, что может быть предоставлено бустерное лечение.
Как описано в данном описании, поксвирусный вектор способен к десенсибилизации (т.е. вызывать переносимость у) субъекта путем экспрессии в клетке слитого белка. Слитый белок разрушается в клетке, и фрагменты разрушенного аллергена арахиса экспрессируются на клеточной поверхности в ассоциации с молекулами класса I ГКС. В некоторых воплощениях во время выполнения способов по настоящему изобретению на иммунную систему субъекта воздействует неинтактный экспрессированный аллерген арахиса. Это имеет место из-за метки деградации протеасомой, которая управляет протеасомальной деградацией экспрессированного слитого белка.
Способ десенсибилизации или индукции переносимости у субъекта аллергена арахиса может включать введение субъекту поксвирусного вектора или фармацевтической композиции, включающей поксвирусный вектор. Соответственно настоящее изобретение относится к способу десенсибилизации субъекта в отношении аллергена арахиса, при этом способ включает экспрессию слитого белка в клетке субъекта, при этом метка деградации протеасомой экспрессированного слитого белка делает слитый белок мишенью для внутриклеточной протеасомальной деградации и ассоциации разрушенных пептидов аллергена арахиса с молекулами класса I ГКС для промотирования генерации реакции TH1 на аллерген арахиса, таким образом сенсибилизируя субъекта к или индуцируя переносимость у субъекта аллергена арахиса.
Настоящее изобретение также относится к способу профилактического лечения для индукции переносимости аллергена арахиса у субъекта, при этом способ включает экспрессию слитого белка в клетке субъекта, при этом метка деградации протеасомой экспрессированного слитого белка делает слитый белок мишенью для внутриклеточной протеасомальной деградации и ассоциации разрушенных пептидов аллергена арахиса с молекулами класса I ГКС для промотирования генерации реакции TH1 на аллерген арахиса, таким образом предотвращая чувствительность субъекта к аллергену арахиса.
Хотя указанные способы могут включать экспрессию слитого белка в клетке in vivo, другие способы могут включать экспрессию слитого белка в клетке ex vivo. Как таковое, настоящее изобретение также относится к клетке, экспрессирующей слитый белок. В этом отношении клетка может использоваться в эксперименте in vitro, лечении in vivo и/или лечении ex vivo.
Субъект
Термины «субъект», «индивидуум» и «пациент» используются в данном описании как взаимозаменяемые и относятся к любому субъекту, для которого настоящее раскрытие может быть приемлемо, в частности, позвоночному субъекту, и даже конкретнее, субъекту-млекопитающему. Подходящие позвоночные животные, которые попадают в объем изобретения, включают, но не ограничиваются перечисленным, любой ряд подтипа хордовых, включая приматов, грызунов (например, мышей, крыс, морских свинок), свиней (например, домашних свиней), лошадиных (например, лошадей), собачьих (например, собак), кошачьих (например, кошек), птиц (например, кур, индюков, уток, птиц-компаньонов, таких как канарейки, волнистые попугайчики и т.д.), морских млекопитающих (например, дельфинов, китов), рептилий (змей, лягушек, ящериц и т.д.) и рыб. В некоторых воплощениях субъектом является примат (например, человек, обезьяна, мартышка, шимпанзе).
В предпочтительном воплощении субъектом является человек. Соответственно в некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, представляет собой кодон, оптимизированный для экспрессии в человеческих клетках.
Фармацевтические композиции
Поксвирусный вектор по настоящему изобретению может быть предоставлен в форме, включающей фармацевтически или физиологически приемлемый носитель и/или разбавитель.
Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции для десенсибилизации или индукции переносимости у субъекта с аллергией на арахис, причем композиция включает поксвирусный вектор, раскрытый в данном описании, и фармацевтически приемлемый носитель.
Фармацевтические композиции обычно получают согласно общепринятым методам составления фармацевтических композиций (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing, Company, Easton, PA, U.S.A., 1990). Такие композиции могут включать, кроме одного или нескольких активных веществ, фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, буфер, стабилизатор или другие материалы, хорошо известные в технике. Такие материалы не должны быть токсичными и не должны влиять на эффективность активного ингредиента. Носитель может принимать самые разные формы, в зависимости от формы препарата, нужного для введения, например, внутривенного или парентерального.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к способу десенсибилизации или индукции переносимости у субъекта с аллергией на арахис, причем способ включает экспрессию слитого белка, описанного в данном описании, в клетке субъекта, при этом метка деградации протеасомой экспрессированного слитого белка делает слитый белок мишенью для внутриклеточной протеасомальной деградации и ассоциации разрушенных пептидов аллергена арахиса с молекулами класса I ГКС для промотирования генерации реакции TH1 на аллерген арахиса, таким образом десенсибилизируя или вызывая у субъекта переносимость аллергена арахиса.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к способу профилактического лечения для индукции переносимости аллергена арахиса у субъекта, причем способ включает экспрессию слитого пептида, описанного в данном описании, в клетке субъекта, при этом метка деградации протеасомой экспрессированного слитого белка делает слитый белок мишенью для внутриклеточной протеасомальной деградации и ассоциации разрушенных пептидов аллергена арахиса с молекулами класса I ГКС для промотирования генерации реакции TH1 на аллерген арахиса, таким образом предотвращая чувствительность субъекта к аллергену арахиса.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что поксвирусный вектор, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий аллергены арахиса и метку деградации протеасомой, может, после вакцинации, производить иммунную реакцию специфических к арахису TH1 при измерении по продуцированию антител IgG2, специфических к аллергену арахиса, и вызванной аллергеном арахиса секреции цитокинов TH1 из лимфоцитов. Так как такой поксвирусный вектор стимулирует иммунную реакцию специфических к арахису TH1, из этого следует, что поксвирусный вектор, раскрытый в данном описании, можно использовать для десенсибилизации (т.е. индукции переносимости у) субъектов, у которых имеется аллергия на аллергены арахиса.
Настоящее изобретение также относится к нуклеотидной последовательности для десенсибилизации или индукции переносимости у субъекта аллергена арахиса, причем нуклеотидная последовательность включает последовательность, кодирующую слитый белок, включающий метку деградации протеасомой аллергена арахиса. Нуклеиновую кислоту можно использовать в качестве генетической вакцины.
Как описано в данном описании, в некоторых воплощениях нуклеиновая кислота включена в экспрессирующий вектор (например, вирусный вектор) или фармацевтическую композицию, которые можно вводить субъекту для возможности экспрессии включающего убиквитин слитого белка в клетке in vivo. С другой стороны, нуклеиновая кислота экспрессируется в клетке ex vivo (например, антигенпредставляющей клетке), которую затем можно ввести субъекту. С другой стороны или кроме того, можно использовать трансфицированную клетку для стимуляции и распространению популяции лимфоцитов TH1 ex vivo, которую затем вводят субъекту.
В некоторых воплощениях установление памяти TH1 на представленные пептиды аллергена арахиса может предотвратить или ослабить иммунные реакции TH2 против аллергена арахиса после последующего воздействия аллергена арахиса. В некоторых воплощениях память TH1 на аллерген арахиса устанавливают путем активации и поддержания CD8+Т-клеток, специфических к аллергену арахиса.
Клетки
В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке, экспрессирующей слитый белок, описанный в данном описании, такой как клетка-хозяин или антигенпредставляющая клетка (например, дендритная клетка). Затем трансфицированную клетку, экспрессирующую слитый белок, можно использовать для генерации и/или расширения популяции реактивных к аллергену арахиса лимфоцитов TH1 in vivo или ex vivo. Так, в одном воплощении настоящее раскрытие делает возможным способ генерации и/или расширения популяции реактивных к аллергену арахиса лимфоцитов TH1 ex vivo, причем способ включает культивирование клеток (т.е. трансфицированных клеток, экспрессирующих слитый белок), как описано в данном описании, с одним или несколькими Т-лимфоцитами. В другом воплощении настоящее раскрытие делает возможным способ генерации и/или расширения популяции реактивных к аллергену арахиса лимфоцитов TH1 in vivo, причем способ включает введение трансфицированной клетки, описанной в данном описании, субъекту, нуждающемуся в этом, при этом введенная трансфицированная клетка активирует наивные Т-клетки у субъекта, которые становятся клетками TH1, специфическими к аллергену арахиса.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к способу десенсибилизации или индукции переносимости у субъекта аллергена арахиса, причем способ включает i) сбор лимфоцитов субъекта; ii) совместное культивирование лимфоцитов с клетками, описанными в данном описании (т.е. трансфицированными клетками, экспрессирующими слитый белок, раскрытый в данном описании), для генерации и/или расширения популяции лимфоцитов TH1, которые узнают деградированный протеасомой слитый белок аллергена арахиса, ассоциированный с молекулами класса I ГКС на клетках; и iii) введение лимфоцитов TH1 из (ii) субъекту.
В некоторых воплощениях клетка может включать прокариотную клетку (например, бактериальную клетку). Прокариотную клетку можно использовать для репликации нуклеотидной конструкции (например, в форме вектора) и/или на различных стадиях клонирования. В некоторых воплощениях клетка может включать эукариотную клетку (например, клетку млекопитающего). В этом отношении настоящее изобретение также включает клетку, экспрессирующую нуклеотидную конструкцию, опереабельно кодирующую слитый белок.
Поксвирусный вектор, раскрытый в данном описании, также можно использовать для активации наивных антигенпредставляющих клеток, которые затем можно повторно ввести субъекту для активации наивных Т-клеток, которые становятся клетками TH1, специфическими к аллергену арахиса. Таким образом, в некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к способу десенсибилизации или индукции переносимости у субъекта аллергена арахиса, причем способ включает: i) сбор антигенпредставляющих клеток субъекта; ii) совместное культивирование антигенпредставляющих клеток с клетками, описанными в данном описании (т.е. трансфицированными клетками, экспрессирующими слитый белок, раскрытый в данном описании), для генерации и/или расширения популяции активированных антигенпредставляющих клеток TH1; и iii) введение активированных антигенпредставляющих клеток TH1 из (ii) субъекту для активации Т-лимфоцитов в отношении аллергенспецифического фенотипа TH1. Подходящие наивные антигенпредставляющие клетки должны быть известны специалистам в данной области техники. Пояснительные примеры включают дендритные клетки и фибробласты.
Тип клеток, экспрессирующих слитый белок, ограничивается только тем, что клетка должны быть содержащей ядро клеткой, которая экспрессирует молекулу класса I ГКС. В этом отношении клетка может представлять собой клетку из клеточной линии (например, клеточной линии СНО, клеточной линии НЕК, клеточной линии фибробластов и т.д.) или первичную клетку (например, фибробласт, дендритную клетку). В воплощениях, где в соответствии с этим клетка предназначена как аутогенное лечение ех vivo, клетка может представлять собой клетку, которую можно легко взять у субъекта (например, клетку крови, лимфы, костного мозга) и/или легко культивировать из образца ткани (например, фибробласты). В некоторых воплощениях клетка может представлять собой специлизированную антигенпредставляющую клетку (например, дендритную клетку, макрофаг, В-клетку, эпителиальную клетку и т.д.) или может представлять собой неспецилизированную антигенпредставляющую клетку (например, фибробласт, тимусную эпителиальную клетку, эпителиальную клетку щитовидной железы, глиальную клетку, панкреатическую бета-клетку, клетку сосудистого эндотелия и т.д.).
Экспрессия слитого белка в клетке ex vivo (например, трансфекция клетки поксвирусным вектором, раскрытым в данном описании) может быть выгодна в том отношении, что можно регулировать число клеток, экспрессирующих нуклеиновую кислоту. Кроме того, для клеток ex vivo доступен широкий ряд систем доставки нуклеиновой кислоты. Затем клетки, экспрессирующие слитый белок (т.е. трансфицированные клетки) можно ввести субъекту для активации наивных Т-клеток у субъекта к специфическому к аллергену арахиса фенотипу TH1, которые затем могут десенсибилизировать или вызвать переносимость у субъекта одного или нескольких аллергенов арахиса. С другой стороны, клетки, экспрессирующие слитый белок, можно культивировать с лимфоцитами ex vivo для генерации реактивных к аллергену арахиса лимфоцитов TH1, которые затем можно ввести субъекту.
Соответственно настоящее изобретение также относится к способу ex vivo генерации и/или расширения реактивных к аллергену арахиса лимфоцитов TH1, при этом способ включает культивирование клеток, экспрессирующих слитый белок, с одним или несколькими Т-лимфоцитами. Т-Лимфоциты могут быть включены в смешанную популяцию лимфоцитов или могут представлять собой изолированные Т-лимфоциты. Смешанные популяции лимфоцитов могут быть легко получены из периферической крови, лимфы или костного мозга способами, известными в технике. Т-Клетки могут быть выделены из таких смешанных популяций лимфоцитов способами, известными в технике, включая, например, выделение клеток с помощью нейлонового волокна, сортинг FACS, разделение на магнитных гранулах и т.д. В некоторых воплощениях отдельные субпопуляции Т-лимфоцитов могут быть выделены для культивирования с клетками, экспрессирующими нуклеиновую кислоту.
Специалистам в данной области техники следует иметь в виду, что когда клетки трансфицируют ex vivo для экспрессии слитого белка, и/или когда получают и/или расширяют популяцию лимфоцитов TH1 ex vivo, как раскрыто в данном описании, часто желательно использовать аутологичные клетки (т.е. клетки, полученные от субъекта, которого лечат), причем посредством этого избегают или минимизируют иммунную реакцию, которая может происходить, когда используют и вводят субъекту аутогенные клетки (т.е. клетки, полученные от другого субъекта).
Расширение реактивных к аллергену арахиса лимфоцитов TH1 ex vivo можно использовать для генерации большого числа реактивных к аллергену арахиса лимфоцитов TH1, которые затем можно вводить субъекту как профилактическое или терапевтическое лечение аллергии на арахис. В некоторых случаях расширение ex vivo может ускорить активацию и увеличение числа реактивных к аллергену арахиса лимфоцитов TH1 по сравнению с активацией и расширением in vivo. Кроме того, расширение ex vivo позволяет регулировать число и реактивность реактивных к аллергену арахиса лимфоцитов TH1, которые расширяются. В некоторых воплощениях реактивные к аллергену арахиса лимфоциты TH1 могут быть аутологичными для субъекта.
Соответственно настоящее изобретение также относится к способу десенсибилизации субъекта к аллергену арахиса, причем способ включает: (i) сбор лимфоцитов у субъекта; (ii) совместное культивирование лимфоцитов с клетками, экспрессирующими слитый белок, для генерации и/или увеличения числа лимфоцитов TH1, которые узнают пептидные фрагменты деградированного протеасомой слитого белка, ассоциированные с молекулами класса I ГКС на клетках; и (iii) введение субъекту лимфоцитов TH1 с (ii). В некоторых воплощениях лимфоциты собирают у субъекта для введения поксвирусного вектора, раскрытого в данном описании.
В некоторых воплощениях способ может включать выделение лимфоцитов со стадии (ii) перед введением субъекту. Выделение лимфоцитов со стадии (ii) может включать выделение всех лимфоцитов из клеток, экспрессирующих нуклеиновую кислоту, и/или может включать выделение одного или нескольких типов лимфоцитов (например, всех Т-лимфоцитов, всех лимфоцитов TH1 и т.д.). С другой стороны, лимфоциты TH1 со стадии (ii) можно ввести субъекту, не выделяя лимфоциты из клеток, экспрессирующих слитый белок, и в таком случае введенные клетки, экспрессирующие слитый белок, могут продолжать активировать другие лимфоциты TH1 in vivo. Способы выделения лимфоцитов у субъекта, способы выделения Т-клеток и субпопуляций Т-клеток включают способы, описанные выше.
По данному описанию также возможны способы, которыми получают выделенные или нет Т-лимфоциты у субъекта, которого лечат согласно настоящему изобретению, и определение, смещаются ли лимфоциты в сторону фенотипа TH1, как раскрыто в данном описании (например, определение профиля экспрессии цитокинов ex vivo). Такой подход добавляет преимущество определения, индуцирует ли введение поксвирусного вектора смещенную к TH1 аллергенспецифическую иммунную реакцию у субъекта. Таким образом, в некоторых воплощениях способ включает определение, смещаются ли лимфоциты, выделенные со стадии (ii), к фенотипу TH1, до их введения субъекту.
В некоторых воплощениях десенсибилизация или индукции переносимости у субъекта аллергена арахиса может предотвратить или снизить реакции гиперчувствительности при последующем воздействии арахиса на субъекта. Как таковые, способы, описанные выше, могут уменьшить опасность анафилактических реакций на арахис у субъектов, имеющих ранее аллергию на арахис, при последующем воздействии на субъекта арахиса и/или уменьшить опасность анафилактических реакций на арахис у субъектов в опасности развития аллергии на арахис.
Настоящее изобретение дополнительно описывается приведенными далее примерами. Следует иметь в виду, что последующее описание приводится только с целью описания отдельных воплощений и не предназначено для ограничения приведенного выше описания.
Примеры
Материалы и методы
Получение антигена PHAV. Нуклеотидную последовательность слитого белка (антигена PHAV), включающую мономер человеческого убиквитина С (Ubc) и четыре аллергена арахиса, создают так, как указано ниже и поясняется на фиг. 1А.
Аминокислотную последовательность для Ubc (NM_021009), ara h 1 (Swiss-Prot ввод P43238), ara h 2 (TrEMBL ввод Q8GV20), ara h 3 (Genbank Protein ACH91862) и ara h 6 (UniProtKB/TrEMBL ввод Q647G9) получают из базы данных последовательностей белков онлайн. Аминокислоту Met (М) стартового кодона удаляют из последовательностей белков ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 6 перед соединением последовательностей с образованием непрерывной последовательности белка в порядке Ubc + ara h1 + ara h2 + ara h3 + ara h6. Последовательность ДНК, кодирующую такой белок PHAVag, получают обратной трансляцией с использованием предпочтительной таблицы кодонов Homo Sapeins.
Аминокислотную последовательность PHAVag в обратном порядке транслируют в нуклеотидную последовательность с использованием Gene Designer (DNA2.0 Inc) и используют набор для оптимизации кодонов Homo Sapeins при 10% пороге. Также отделяют повторные последовательности из 8 оснований или более. Полученную последовательность дополнительно скринируют на возможность образования вторичной структуры и дестабилизирующие элементы с помощью DNA2.0 Inc. Конечную нуклеотидную последовательность последовательности белка PHAVag скринируют на мотив ранней трансляции поксвируса «TTTTTNT». Однако ничего не находят.
К концу нуклеотидной последовательности, кодирующей антиген PHAV, добавляют стоп-кодон «ТАА». Сразу же после кодона также добавляют последовательность прекращения ранней трансляции поксвируса ТТТТТАТ. Экспрессирующую кассету фланкируют линкерами Рас I. Так как сайты узнавания Рас I в кассете отсутствуют, такую кассету можно клонировать в плазмиды и целиком вырезать из плазмиды путем гидролиза рестриктазой Рас I.
Как видно из таблицы 1, Ubc, ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 6 в антигене PHAV имеют примерно 75% идентичность нуклеотидных последовательностей с нативными последовательностями.
Совокупность нуклеотидных и аминокислотных последовательностей конструкции антигена PHAV приводится в таблице 2.
Получение альтернативного антигена PHAV. Получают включающий убиквитин антиген арахисгипоаллергенной вакцины (UBc.PHAVag), включающий белковую последовательность антигена PHAV, полученную слиянием следующих кодирующих белок последовательностей - мономера убиквитина С, аллергена арахиса ara h 1, аллергена арахиса ara h 2, аллергена арахиса ara h 3 и аллергена арахиса ara h 6, последовательности прекращения ранней транскрипции поксвируса и наконец еще одного линкера Рас 1.
Мономер убиквитина С модифицируют по C-концу для замены концевого остатка Gly (G) на Ala (А). Модифицированный убиквитин С делает антиген PHAV после синтеза мишенью для каскада протеасомальной деградации в клетке-хозяине (см. фиг. 9). Это гарантирует, что интактный белок не представлен к продуцированию антител, и что полученные пептидные фрагменты процессированы каскадом класса I ГКС, запускающим иммунную реакцию TH1 на антиген PHAV.
Конфигурация и особенности экспрессирующих PHAV кассет показаны схематично на фиг. 1В и включают рестриктазные ликеры Рас I на 5'- и 3'-концах, а также вакцинный ранний/поздний промотор на 5'-конце.
Аминокислотную последовательность для UBc, ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 6 получают из баз данных или Swit-Prot или EMBL. Стартовый кодон, кодирующий остаток Met (М), удаляют из нуклеотидных последовательностей ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 6 перед их соединением с образованием непрерывной нуклеотидной последовательности, кодирующей белковую последовательность UBc + h1 + h2 + h3 + h6 в указанном порядке.
Последовательность ДНК для кодирования такого UBc.PHAVag, получают обратной трансляцией с использованием предпочтительной таблицы кодонов Homo Sapeins. Аминокислотную последовательность UBc.PHAVag обратно транслируют в нуклеотидную последовательность с использованием Gene Designer (DNA2.0 Inc), с использованием набора для оптимизации кодонов Homo Sapeins при 10% пороге, и очищая повторные последовательности из 8 оснований или более. Полученную последовательность дополнительно скринируют на возможность образования вторичной структуры и дестабилизирующие элементы с помощью DNA2.0 Inc. Конечную нуклеотидную последовательность, кодирующую UBc.PHAVag, скринируют на мотив ранней трансляции поксвируса «TTTTTNT», но ничего не находят. К концу нуклеотидной последовательности, кодирующей UBc.PHAVag, добавляют стоп-кодон «ТАА». Также сразу после кодона добавляют последовательность прекращения ранней трансляции поксвируса ТТТТТАТ. Экспрессирующую кассету фланкируют линкерами Рас I, и так как сайты узнавания Рас I в кассете отсутствуют, такую кассету можно клонировать в плазмиды и целиком вырезать из плазмиды путем гидролиза рестриктазой Рас I. Последовательность ДНК экспрессирующей UBc.PHAVag кассеты можно найти на фиг. 2.
Также конструируют антиген гипоаллергенной вакцины против арахиса, в который не включают мономер убиквитина на 5'-конце. Такая конструкция идентична конструкции UBc.PHAVag, описанной выше, но без последовательности убиквитина. Такую конструкцию относят к PHAVag, и схематичное представление конфигурации и особенностей PHAVag можно найти на фиг. 1С, а последовательность ДНК на фиг. 3.
Экспрессирующие кассеты как UBc.PHAVag, так и PHAVag клонируют в бактериальные плазмиды таким образом, что указанные экспрессирующие кассеты можно получить обратно после клонирования гидролизом PacI/Sbf I и очисткой в геле.
Можно получить другие антигены гипоаллергенной вакцины против арахиса, содержащие убиквитин, которые включают следующие аллергены арахиса:
(i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11;
(ii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 и ara h 10;
(iii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 и ara h 9;
(iv) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 и ara h 8;
(v) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7;
(vi) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5 и ara h 6;
(vii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4 и ara h 5;
(viii) ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 4;
(ix) ara h 1, ara h 2 и ara h 3;
(x) ara h 1 и ara h 2;
(xi) ara h 1;
(xii) ara h 2;
(xiii) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10, и ara h 11;
(xiv) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 и ara h 10;
(xv) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 и ara h 9;
(xvi) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 и ara h 8;
(xvii) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7;
(xviii) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5 и ara h 6;
(xix) ara h 2, ara h 3, ara h 4 и ara h 5;
(xx) ara h 2, ara h 3 и ara h 4;
(xxi) ara h 2 и ara h 3;
(xxii) ara h 3;
(xxiii) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11;
(xxiv) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 и ara h 10;
(xxv) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 и ara h 9;
(xxvi) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 и ara h 8;
(xxvii) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7;
(xxviii) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5 и ara h 6;
(xxix) ara h 1, ara h 3, ara h 4 и ara h 5;
(xxx) ara h 1, ara h 3 и ara h 4;
(xxxi) ara h 1 и ara h 3;
(xxxii) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11;
(xxxiii) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 и ara h 10;
(xxxiv) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 и ara h 9;
(xxxv) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 и ara h 8;
(xxxvi) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7;
(xxxvii) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5 и ara h 6;
(xxxviii) ara h 1, ara h 3, ara h 4 и ara h 5;
(xxxix) ara h 1, ara h 2 и ara h 4;
(x1) ara h 1, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 и ara h 11;
(x1i) ara h 1, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 и ara h 10;
(x1ii) ara h 1, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 и ara h 9;
(x1iii) ara h 1, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 и ara h 8;
(x1iv) ara h 1, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7;
(x1v) ara h 1, ara h 4, ara h 5 и ara h 6;
(x1vi) ara h 1, ara h 4 и ara h 5;
(x1vii) ara h 1 и ara h 4;
(x1viii) ara h 4; и т.д.
Аминокислотные последовательности для ara h 1, h 2, h 3, h 4, h 5, h 6, h 7, h 8, h 9, h 10 и h 11 легко получают из баз данных белков или Swit-Prot или EMBL. Стартовый кодон, кодирующий остаток Met (М), а также стоп-кодон могут быть удалены из нуклеотидных последовательностей ara h до их соединения с образованием непрерывной нуклеотидной последовательности, кодирующей слитый белок из любых двух или большего числа белков ara h и в любом определенном порядке. Однако стартовый кодон может потребоваться как начало последовательности, кодирующей слитый белок, а стоп-кодон для терминации экспрессии кодированного слитого белка.
Конструирование гомологичной рекомбинантной плазмиды на основе вируса коровьей оспы. Кассета гомологичной рекомбинации состоит из следующих элементов, которые все получены синтетически Gene Art GmbH of Life Technologies: (i) левого гомологичного рекомбинантного плеча в 500 п.о., которое фланкирует ORF штамма Копенгаген выше VACV-A39R, (ii) экспрессирующей кассеты EGFP под контролем вакцинного раннего/позднего промотора и терминирующей в последовательности прекращения ранней транскрипции поксвируса (TTTTTNT), (iii) экспрессирующей кассеты Ecogpt под контролем вакцинного раннего/позднего промотора и терминирующей в последовательности прекращения ранней транскрипции поксвируса (TTTTTNT); (iv) экспрессирующей кассеты антигена гипоаллергенной вакцины против арахиса (UBc.PHAVag), описанной выше, (v) правого гомологичного рекомбинантного плеча в 500 п. о., которое фланкирует ORF штамма Копенгаген ниже VACV-A39R. Схематическое представление таких кассет можно найти на фигуре 4, и их последовательности ДНК можно найти на фиг. 6 и 7.
Кассеты гомологичной рекомбинации как UBc.PHAVag, так и PHAV фланкированы сайтами рестриктаз Not I и клонированы в плазмиды с образованием клонов рТС11 (UBc.PHAVag) и рТС12 (PHAV). Плазмиды показаны на фиг. 8. Так как такие плазмиды получены синтетически, любые последовательности TTTTTNT, встречающиеся с белковыми кодирующими последовательностями EGFP и Ecogpt, разрушаются молчащими мутациями без воздействия на кодированные аминокислотные последовательности.
Конструирование вируса коровьей оспы, экспрессирующего гипоаллергенные вакцинные антигены против арахиса. Экспрессирующие кассеты PHAV встраивают в ORF A39R вируса коровьей оспы штамма Копенгаген путем гомологичной рекомбинации. Фиг. 4 показывает карту, иллюстрирующую сайт вставки в ORF A39R. Коротко, это осуществляют, инфицируя клетки ВНК21 при низкой множественности заражения (moi) 0,01 бое на клетку в течение 45 минут и затем трансфицируя клетки линеаризированными Not I рТС11 или рТС12 плазмидными векторами. Затем инфицированные/трансфицированные клетки собирают, как только заражение достигает почти слияния. Затем собранные клетки обрабатывают ультразвуком для получения вирусных экстрактов, и эти вирусные экстракты подвергают одному циклу очистки бляшек при положительном отборе с микофеноловой кислотой (MPA) в присутствии ксантина, гипоксантина, аминоптерина и тимидина. Затем клоны очищенных бляшек последовательно амплифицируют при МРА-положительном отборе, и получают посевной штамм вируса. Рекомбинантный вирус коровьей оспы, содержащий экспрессирующую кассету UBc.PHAVag, обозначают SCV201C, и рекомбинантный вирус коровьей оспы, содержащий экспрессирующую кассету PHAVag, обозначают SCV202C.
Подробные протоколы получения рекомбинантного вируса коровьей оспы с использованием метода отбора Ecogpt можно найти в работе Smith, 1993. Способ, используемый для получения SCV201C и SCV202C, описан ниже.
Гомологичная рекомбинация. Для конструирования каждого вируса в три колбы Т25, содержащие среду для выращивания (RPMI-1640/10% FCS/2 мМ глютамакса/пен-стрепт), высевают клетки ВНК21 и выращивают до субслияния при 37°C/5% СО2. В день заражения две колбы инифицируют VACV-COP при moi 0,01 бое/клетка, и другие колбы не инфицируют (неинфицированный контроль). После заражения колб 1 и 2 в течение 45 мин при комнатной температуре вирусные инокуляты удаляют, и монослой клеток дважды промывают PBS. После промывки в каждую колбу добавляют 4 мл поддерживающей среды (MM: RPMI-1640/2% FCS/2 мМ глютамакса/пен-стрепт), включая колбу 3, в которой также осуществляют такую же стадию промывки.
Трансфекцию выполняют с использованием реагента Effectene Transfection (Qiagen, Cat No 301425), следуя инструкциям изготовителя. Коротко, 16 мкл энхансера добавляют к 2 мкг линеаризированного рТС11 или рТС12 в 150 мкл буфера ЕС и после тщательного перемешивания оставляют стоять в течение 5 минут при комнатной температуре. К полученной смеси добавляют 25 мкл реагента Effectene Transfection, тщательно перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре в течение 10 минут. Наконец, добавляют 1 мл MM (RPMI-1640/2% FCS/2 мМ глютамакса/пен-стрепт) и тщательно и осторожно все перемешивают. Затем такую смесь для трансфекции добавляют в колбу 1, которая предварительно инфицирована VACV-COP.
Колбу 1 (гомологичная рекомбинация), колбу 2 (только контроль заражения) и колбу 3 (неинфицированный контроль) инкубируют в течение ночи при 37°C/5% СО2, на следующий день в каждой колбе заменяют среду на свежую ММ, содержащую 25 мкг/мл микофеноловой кислоты (MPA), 250 мкг/мл ксантина и 1×HAT (Sigma, кат. № Н0262-10VL) - 5 мл на колбу, и дополнительно инкубируют 37°C/5% CO2 до тех пор, пока сильный СРЕ можно видеть только в колбе 1. В колбе 2 имеются слабые признаки сильного СРЕ или его отсутствие, так как обработка МРА ингибирует распространение инфекции VACV-COP, и в колбе 3 монослой выглядит здоровым.
Клетки в колбе 1 собирают, соскребая клетки в культуральную среду, затем осаждают центрифугированием при малой скорости (500 g в течение 5 минут при комнатной температуре) и затем ресуспендируют клеточный осадок в 1 мл 10 мМ трис-HCl, pH 8. Вирусный экстракт получают несколькими циклами замораживания и оттаивания и затем хранят при -80°C готовым для фазы очистки бляшек. Вирусные конструкции называют SCV201C (вставка UBc.PHAVag) и SCV202C (вставка PHAV).
Процесс очистки бляшек. Экстракт от гомологичной рекомбинации серийно разводят, и каждое разведение используют для инфицирования ряда клеток ВНК21, культивированных в 48-луночном планшете в присутствии МРА. Целью является разведение вируса до заражения 1 бое на лунку и, перед харвестированием, поиск лунок, которые содержат только 1 флуоресцентную бляшку приблизит, через 30 час после заражения.
Клетки ВНК21 высевают в каждую лунку 48-луночного планшета и культивируют до 100% в среде для выращивания (RPMI-1640/10% FCS/2 мМ глютамакса/пен-стрепт) при 37°C/5% CO2. Затем среду заменяют ММ, содержащей 25 мкг/мл микофеноловой кислоты (МРА), 250 мкг/мл ксантина и 1×HAT (Sigma, кат. № H0262-10VL), и инкубируют дополнительно в течение ночи.
Для заражения экстракты от гомологичной рекомбинации (SCV201C и SCV202C) оттаивают и кратковременно обрабатывают ультразвуком для разрушения комков и агрегатов. Выполняют десятикратное серийное разведение каждого вирусного экстракта до 10-5 с использованием MM (RPMI/2% FCS/глютамакс/пен-стрепт) в объемах 1 мл. Для каждого разведения засевают один ряд 48-луночного планшета 100 мкл разведенного вируса после удаления среды для выращивания из каждой лунки и промывки один раз PBS. Оставляют 48-луночный планшет при комнатной температуре на 45 минут для того, чтобы произошла адсорбция вируса. После адсорбции вируса вирусный инокулят осторожно удаляют из каждой лунки, и остаточный инокулят удаляют на стадии промывки, включающей использование 500 мкл PBS на лунку. После промывки в каждую лунку добавляют 500 мкл MM (RPMI/2% FCS/глютамакс/пен-стрепт), содержащей 25 мкг/мл МРА, 250 мкг/мл ксантина и 1×HAT (Sigma, кат. № H0262-10VL), и затем инкубируют при 37°C/5% CO2 до тех пор, пока во флуоресцентном микроскопе можно будет ясно увидеть зеленые флуоресцентные очаги заражения.
Для харвестирования отбирают только лунки, содержащие один очаг флуоресценции при наивысшей возможной степени разведения. Среду из выбранных лунок осторожно удаляют, и добавляют 100 мкл 10 мМ трис-HCl, pH 8. Планшет замораживают-оттаивают три раза, и извлекают содержимое из выбранных лунок.
Затем один выбранный клон далее амплифицируют, инфицируя 1 лунку 6-луночного планшета, содержащего клетки ВНК21 при 100% слиянии, которые предварительно в течение ночи обрабатывали 25 мкг/мл МРА, 250 мкг/мл ксантина и 1×HAT (Sigma, кат. № H0262-10VL), удаляя культуральную среду из лунки и добавляя 10 мкл вирусного экстракта, разведенного до 500 мкл в PBS. Через 45 мин при комнатной температуре в лунку добавляют 2 мл ММ, содержащей 25 мкг/мл МРА, 250 мкг/мл ксантина и 1×HAT (Sigma, кат. № H0262-10VL), и затем инкубируют при 37°C/5% CO2 в течение 3 суток до преобладания зеленых флуоресцентных клеток во флуоресцентном микроскопе. Клетки в инфицированной лунке соскребают в культуральную среду и затем осаждают при 500 g в течение 5 минут. Осажденные клетки ресуспендируют в 500 мкл 10 мМ трис-HCl, pH 8 и быстро обрабатывают ультразвуком для получения вирусного экстракта.
Часть такого экстракта используют для дальнейшей амплификации путем инфицирования ВНК21 в пяти колбах Т175 при отборе с МРА. Инфицированные клетки извлекают и затем осаждают при 500 g в течение 5 мин. Осажденные клетки из всех пяти колб ресуспендируют в 5 мл 10 мМ трис-HCl, pH 8, и быстро обрабатывают ультразвуком для получения вирусного экстракта. Затем удаляют нерастворимый материал путем осаждения при 500 g в течение 5 мин. Затем супернатант (вирусный экстракт) титруют на клетки ВНК21 с использованием процедуры, описанной ниже, и присутствие встроенного UBc.PHAV в ORF A39R подтверждают анализом ПЦР.
Титрование. Титрование выполняют с использованием формата 24-луночного планшета. Бляшки можно отчетливо различить в виде контрастно окрашенных фиолетовым кристаллическим ямок в монослое (бляшках), видных невооруженным глазом.
Для каждого рекомбинантного вируса, который титруют, один 24-луночный планшет засевают клетками ВНК21 и культивируют до слияния в среде для выращивания (RPMI/10% FCS/глютамакс/пен-стрепт). В день титрования каждый вирусный штамм оттаивают и обрабатывают ультразвуком для разрушения комков и скоплений. Каждый вирус серийно разводят в PBS до 10-8. Удаляют среду из каждой лунки, и, начиная с разведения 10-8, 500 мкл каждого разведения добавляют в каждую лунку вертикального ряда в 24-луночном планшете (4 лунки на разведение) и оставляют для инкубации при комнатной температуре на 45 мин для адсорбции вируса на клетках. После этого вирусный инокулят удаляют из каждой лунки, и затем каждую лунку промывают один раз PBS. После промывки в каждую лунку добавляют 1 мл MM (RPMI/2% FCS/глютамакс/пен-стрепт), и планшеты инкубируют при 37°C/5% CO2 до тех пор, пока в монослоях можно увидеть бляшки. Для контрастного окрашивания бляшек среду из каждой лунки удаляют, и в каждую лунку добавляют раствор кристаллического фиолетового (0,4%, масс./об. в 20% этаноле). Окрашивание осуществляют при комнатной температуре в течение 15-30 мин, после чего краситель кристаллический фиолетовый удаляют из каждой лунки, и каждую лунку оставляют сушиться на воздухе перед подсчетом бляшек. Для разбавления, которое дает возрастание до 10-30 точек на лунку, вычисляют среднее. Затем полученную величину умножают на обратное серийное разведение и затем еще умножают на 2 (т.е. 2×500 мкл = 1 мл), и получают титр в бое/мл.
Проверка иммуногенности SCV201C на мышах С3Н/HeJ. Для того, чтобы проверить иммуногенность SCV201C и определить, может ли антиген PHAV вызывать специфическую иммунную реакцию ТН1 на белок арахиса, 3 группы мышей С3Н/HeJ вакцинируют следующим: (i) 106 бое SCV201C, введенными интраперитонеально (IP), (ii) 106 бое SCV000C, введенными интраперитонеально (IP), и (iii) PBS, введенным интраперитонеально (IP). Образцы крови берут непосредственно перед вакцинацией (prebleed) и через 17 дней после вакцинации. Селезенки для определения профиля цитокинов собирают через 9 недель после вакцинации.
Получение растворимого экстракта белка арахиса. Способ, используемый для экстрагирования растворимого белка арахиса из жареного несоленого арахиса, получают из процедур, описанных Sachs et al. (1981) и Burks et al. (1992). Жареный несоленый арахис закупают в местном бакалейном магазине. Затем орехи измельчают в блендере в муку и затем обезжиривают реагентом гексаном. Для этого н-гексан добавляют к арахисовой массе и энергично встряхивают для перемешивания. Смесь переносят в стеклянный стакан и оставляют расслаиваться на фазы растворителя и твердого вещества. Фазу растворителя (которая содержит экстрагированные липиды/жиры) отделяют от твердой фазы. Твердую фазу сушат на воздухе до кека. Полученный кек растворяют в 0,1 М NH4HCO3 (2 мл на грамм) при 4°C в течение 36 часов при перемешивании для экстрагирования твердых белков. Взвесь центрифугируют в течение 15 мин при 10000 g для удаления твердых веществ. Супернатант диализуют против 5 мМ фосфатного буфера (pH 7 - pH 8) или PBS с использованием мембраны/трубки 3500 MWCO. Диализованный раствор центрифугируют при 10000 g в течение 15 мин при 4°C для осветления экстракта. Общую концентрацию белка в растворимом экстракте измеряют с использованием стандартных методов. Полученный растворимый экстракт белка (10 мг/мл) хранят при -20°C и оттаивают перед использованием.
Количественное определение арахисспецифических сывороточных IgE и IgG2a. Сенсибилизируют 96-луночные планшеты с плоскодонными лунками для EIA/RIA ELISA (Costar) 2 мкг/лунка очищенного экстракта арахиса в PBS и инкубируют при 37°C в течение 1 часа и затем в течение ночи при 4°C. Планшеты три раза промывают PBS, 200 мкл/лунка, перед блокировкой 5% снятым молоком с PBS и 0,05% твина (SM+PBS+TW). Неспецифическое связывание блокируют при 37°C в течение, по меньшей мере, одного часа и затем осуществляют три промывки 200 мкл/лунка PBS с 0,05% твина (PBS+TW). После промывки образцы сыворотки сначала разбавляют 1:100 для анализов на IgE или 1:500 для анализов на IgG2a в SM+PBS+TW. Образцы сыворотки серийно разводят в трех вертикальных рядах. Некоторые лунки оставляют без сыворотки как фоновый контроль. Планшеты инкубируют при 37°C в течение одного часа.
Планшеты промывают пять раз 200 мкл PBS, и добавляют вторичные антитела (1:500, конъюгат козьего антимышиного IgE и HRP, Alpha Diagnostic; 1:1000 HRP крысиный антимышиный IgG2a, BD Biosciences-BD Pharmingen), разведенные в SM+PBS+TW (100 мкл/лунка). Планшеты инкубируют в течение одного часа и затем промывают пять раз, как описано выше, и добавляют 100 мкл/лунка раствора субстрата гидрохлорида о-фенилендиамина (OPD), полученного согласно указаниям изготовителя (SigmaFAST™ OPD, Sigma-Aldrich). Реакции останавливают 20 мкл/лунка 1 М HCl, когда начинает появляться окраска в лунках-пустышках (время колеблется от пяти минут для анализов на IgG1 и IgG2a до 45 минут для анализа на IgE). Оптическую плотность измеряют при 450 нм планшет-ридером (EL808 Ultra Microplate Reader, Bio-tek Instruments Inc).
Строят графики оптической плотности для серийных разведений в каждый соответствующий момент времени в зависимости от фактора разведения в логарифмической шкале с использованием GraphPadPrisim V5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Конечный титр для каждого момента времени определяют как показатель разведения, при котором кривая отсекает вычисленный порог оптической плотности (минимум трехкратной величины среднеквадратической ошибки (SEM) образцов до вакцинации, но больше самой высокой величины оптической плотности, измеренной для всех образцов до вакцинации).
Статистический анализ. Статистические сравнения выполняют с использованием GraphPad Prism V5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с постпроверкой по Бенферрони используют для заключения о значимых различиях в результатах ELISA.
Пример 1. Убиквитинизация антигена PHAV, облегченная успешной экспрессией SCV201C, но не SCV202C
Экспрессия SCV201C после встраивания экспрессирующей кассеты UBc.PHAVag в A39R вируса коровьей оспы является успешной. После гомологичной рекомбинации и во время стадии очистки бляшек МРА-резистентные бляшки можно четко идентифицировать и амплифицировать в присутствии МРА для получения посевного штамма, который дает достаточные титры для протекания следующей стадии проверки иммуногенности на мышах.
Напротив, экспрессия SCV202C затруднена для развития из-за стадии очистки бляшек, так как при высокой степени разведения нельзя четко обнаружить различимые бляшки. Флуоресцирующие инфицированные клетки можно обнаружить в небольшом интервале разведений, и при таких разведениях 100% СРЕ видно только в инфицированных лунках в противоположность различимым бляшкам. Когда собирают содержимое таких лунок и подвергают дальнейшей амплификации в присутствии МРА, получают очень низкий вирусный титр, большая часть которого состоит из исходного вируса, что определяют анализом ПЦР и анализом бляшек, показывающим отсутствие флуоресцирующей бляшки в отсутствие МРА.
Экспрессия PHAVag после заражения оказывает ингибирующее или токсичное действие на размножение вируса, которое преодолевается конструкцией SCV201C. Без связи с какой-либо теорией или определенным типом применения, постулируют, что ингибирующее или токсичное действие синтезированного PHAVag преодолевается путем применения метки деградации протеасомой, такой как убиквитин, для того, чтобы экспрессированный PHAVag стал мишенью протеасомальной деградации.
Ингибирующее действие на размножение вируса путем экспрессии интактного PHAVag также подтверждается, поскольку конструкция рекомбинантной вакцины, содержащая только экспрессирующие кассеты Ecogtp и EFGR, встроенные в ORF A39R, является легко достижимой (обозначена как SCV000).
Пример 2. Антигенспецифические антитела реагируют на вакцинацию
На фиг. 10 представлены результаты по уровню в сыворотке специфических к белку арахиса антител как IgE (фиг. 10А), так и IgG2a (фиг. 10В) до и после вакцинации (17 день после вакцинации). Можно ясно видеть, что вакцинация SCV201C вызывает значительные уровни специфических к белку арахиса антител IgG2a через 17 дней после вакцинации. Такие уровни значимо выше, чем для контроля с вектором (SCV000) и контроля PBS, что показывает, что SCV201C вызывает реакцию антител, специфических к белку арахиса. Отмечается, что SCV201C вызывает более слабую реакцию IgE по сравнению с реакцией IgG2a; иными словами, при сравнении конечное разведение для IgE 1:2500, а конечное разведение для IgG2a приближается к 1:1000000. Более того, реакция IgE не намного выше реакций, вызываемых контролями пустым вектором (SCV000) и PBS.
Такие результаты показывают, что SCV201C вызывает реакцию IgG2a на белки арахиса, но очень слабую реакцию IgE, что показывает, что SCV201C в ответ на PHAVag инициирует специфическую иммунную реакцию на арахис, смещенную к TH1.
Пример 3. Профиль цитокинов лимфоцитов у мышей после вакцинации SCV201C Селезенки мышей собирают и хранят в полной RPMI, а затем переносят в 60-мм чашку для культивирования. Затем селезенки рассекают на три секции и разрушают до одноклеточной суспензии. Затем клетки фильтруют и промывают 5% RPMI (300 g × 5 минут). Затем эритроциты лизируют в 5 мл щелочного буфера для лизиса в течение 5 минут, затем разбавляют до 20 мл 5% RPMI и центрифугируют при 200 g в течение 5 минут. Затем клетки ресуспендируют и считают. Тем временем, подготавливают лунки 96-луночных планшетов с контролем RPMI, растворимым антигеном к арахису (100 мкг/мл) и ConA (5 нг/мл). Затем добавляют лимфоциты по 400000 клеток на лунку и инкубируют при 37°C в течение 96 часов.
После инкубации в течение 96 часов собирают супернатант каждого типа и замораживают при -80°C. Затем количественно определяют цитокины Th1/Th2 проточной цитометрией согласно инструкциям изготовителя (BD Biosciences # 551287). Затем образцы пропускают через проточный цитометр BD FACSCanto II. Концентрацию цитокинов определяют с использованием программы Soft Flow FCAP Array. Весь дополнительный анализ проводят в Graph Pad 6.0.
Результаты, представленные на фиг. 11, ясно показывают, что вакцинация SCV201C вызывает смещенную к TH1 иммунную реакцию на воздействие белка арахиса. Это иллюстрируется значимо более высоким уровнем IFN-гамма (IFN-g; цитокин TH1; фиг. 11А) по сравнению с уровнями IL4 и IL5 (цитокины TH2; фиг. 11В и 11С), секретированными культивированными лимфоцитами, полученными из селезенок мышей, вакцинированных SCV201C.
Выводы
Вакцинация мышей SCV201C вызывает смещенную к TH1 иммунную реакцию против белка арахиса. Аллергенспецифическая иммунная реакция TH1 будет доминировать над имеющейся аллергенспецифической иммунной реакцией TH2, и в силу этого будет десенсибилировать индивидуума к последующему воздействию аллергена. Исследования, раскрытые в данном описании, показывают, что убиквитинизированный антиген гипоаллергенной вакцины против арахиса (UBc.PHAVag) стимулирует иммунную реакцию TH1, специфическую против белка арахиса. Таким образом, вакцины, содержащие убиквитинизированный антиген гипоаллергенной вакцины, описанный в данном описании, можно использовать для десенсибилизации индивидуумов к аллергенам арахиса и, следовательно, можно использовать для лечения и/или предупреждения аллергических реакций у индивидуумов, которые запускаются воздействием аллергенов арахиса.
Как отмечалось выше, экспрессия конструкции SCV201C является успешной после заражения, в то время как экспрессия конструкции без убиквитина SCV202C затруднена для развития после стадии очистки бляшек. Поэтому оказывается, что экспрессия PHAVag после заражения оказывает ингибирующее или токсичное действие на размножение вируса, которое преодолевается конструкцией SCV201C. Без связи с какой-либо теорией или определенным типом применения, постулируют, что ингибирующее или токсичное действие синтезированного PHAVag преодолевается путем применения убиквитина, который делает экспрессированный PHAVag мишенью для протеасомальной деградации. В результате нацеленной убиквитином протеасомальной деградации PHAVag небольшие пептидные фрагменты PHAVag поступают в эндоплазматический ретикулум (ER), где они образуют комплекс с белками класса I ГКС и затем переносятся к поверхности клетки для представления Т-лимфоцитам (см., например, фиг. 9). Следствием этого является то, что имеет место усиленное представление фрагментов PHAVag с классом I ГКС, приводящее к более сильной иммунной реакции TH1 на аллергены арахиса. Таким образом, метка деградации протеасомой (например, убиквитин) неожиданно предохраняет искусственный интактный слитый белок PHAVag от ингибирования репликации вируса.
Ara h 1, ara h 2, ara h 3 являются тремя основными аллергенами, которые, как показано, вызывают специфические аллергические реакции на арахис у чувствительных индивидуумов. Ara h 6 вовлекается в восприимчивость детей к аллергии на арахис (Flinterman et al., 2007). Ara h 7 узнается у 43% индивидуумов с аллергией на арахис, ara h 8 узнается у 85% индивидуумов с аллергией на арахис, ara h 4 узнается у 54% индивидуумов с аллергией на арахис, и ara h 5 узнается у 13% индивидуумов с аллергией на арахис
Каждые патент, заявка на патент и публикация, цитированные в данном описании, включены в него в качестве ссылок.
Для специалистов в данной области техники очевидны многие модификации без отступления от объема настоящего изобретения.
Библиография
Burks W.A., Williams L.W., Connaughton C., Cockrell G., O'Brien T.J., Helm R.M., 1992. Identification and characterization of a second major peanut allergen, Ara h II, with use of the sera of patients with atopic dermatitis and positive peanut challenge. J. Allergy Clin. Immunol., 90: 962-969.
DeLong J.H., Simpson K.H., Wambre E., James E.A., Robinson D., Kwok W.W., 2011. Ara h 1-reactive T cells in individuals with peanut allergy. J. Allergy Clin. Immunol, 127 (5): 1211-1218.e3.
Dudek Т., Knipe D.M., 2006. Replication-defective viruses as vaccines and vaccine vectors. Virology, 344 (1): 230-239.
Flinterman A.E., van Hoffen E., den Hartog Jager C.F., Koppelman S., Pasmans S.G., Hoekstra M.O., Bruijnzeel-Koomen C.A., Knulst A.C., Knol E.F., 2007. Children with peanut allergy recognize predominantly Ara h2 and Ara h6, which remains stable over time. Clin. Exp. Allergy, 37(8): 1221-8.
Heath W.R., Carbone F.R., 1999. Cytotoxic T lymphocyte activation by cross-priming. Curr. Opin. Immunol, 11 (3): 314-318.
Hartl A., Kiesslich J., Weiss R., Bernhaupt A., S., Scheiblhofer S., Ebner C., Ferreira F., Thalhamer J., 1999. Immune responses after immunization with plasmid DNA encoding Bet v 1, the major allergen of birch pollen. J. Allergy Clin. Immunol 103: 107-13.
Hartl A., Hochreiter R., Stepanoska Т., Ferreira F., Thalhamer J., 2004. Characterization of the protective and therapeutic efficiency of a DNA vaccine encoding the major birch pollen allergen Bet v 1a. Allergy, 59: 65-73.
Holgate S.T., 1999. The epidemic of allergy and asthma. Nature, 402 (6760 Suppl), B2-B4
Hsu C.H., Chua K.Y., Tao M.H., Lai Y.L., Wu H.D., Huang S.K., Hsieh K.H., 1996. Immunoprophylaxis of allergen-induced immunoglobulin E synthesis and airway hyperresponsiveness in vivo by genetic immunization. Nat. Med., 2 (5): 540-544.
Jilek S., Barbey C, Spertini F., Corthesy В., 2001. Antigen-independent suppression of the allergic immune response to bee venom phospholipase A(2) by DNA vaccination in CBA/J mice. J. Immunol, 166: 3612-21.
Kumaraguru U., Rouse R.J., Nair S.K., Bruce B.D., Rouse В.Т., 2000. Involvement of an ATP-dependent peptide chaperone in cross-presentation after DNA immunization. J. Immunol., 165 (2): 750-759.
Leitner W.W., Hammerl P., Thalhamer J., 2001. Nucleic acid for treatment of cancer: genetic vaccines and DNA adjuvants. Curr. Pharm. Des., 7(16): 1641-1667.
Long A., 2002. The nuts and bolts of peanut allergy. N. Engl. J. Med., 346 (17): 1320-1322.
Lu Z, Yuan L, Zhou X, SotE, Levitsky HI, Pardoll DM. 2000. CD4040-independent pathways of T cell help for priming of CD8(+) cytotoxic T lymphocytes. J. Exp. Med. 191 (3): 541-550.
Mosmann T.R., Coffman R.L., 1989. TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu. Rev. Immunol, 7: 145-173.
Oppenheimer J.J., Nelson H.S., Bock S.A., Christenson F., Leung D.Y., 1992. Treatment of peanut allergy with rush immunotherapy. J. Allergy Clin. Immunol, 90 (2): 256-262.
Parronchi P., Maggi E., Romagnani S., 1999. Redirecting Th2 responses in allergy. Curr. Top. Microbiol. Immunol, 238: 27-56.
Polo J.M., Dubensky T.W. Jr., 2002. Virus-based vectors for human vaccine applications. Drug Discov. Today, 7 (13): 719-727.
Raz E., Tighe H., Sato Y., Corr M., Dudler J.A., Roman M., Swain S.L., Spiegelberg H.L., Carson D.A., 1996. Preferential induction of a Th1 immune response and inhibition of specific IgE antibody formation by plasmid DNA immunization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (10): 5141-5145.
Ridge J.P., Di Rosa F., Matzinger P., 1998. A conditioned dendritic cell can be a temporal bridge between a CD4+ T-helper and a T-killer cell. Nature, 393 (6684): 474-478.
Rocha C.D., Caetano B.C., Machado A.V., Bruna-Romero O., 2004. Recombinant viruses as tools to induce protective cellular immunity against infectious diseases. Int. Microbiol,. 7 (2): 83-94.
Roy K., Mao H.Q., Huang S.K., Leong K.W., 1999. Oral gene delivery with chitosan-DNA nanoparticles generates immunologic protection in a murine model of peanut allergy. Nat. Med., 1999; 5: 387-91.
Sachs M.I., Jones R.T., Yunginger J.W., 1981. Isolation and partial characterization of a major peanut allergen. J. Allergy Clin. Immunol., 67: 27-34.
Sanderson I.R., Walker W.A., 1993. Uptake and transport of macromolecules by the intestine: possible role in clinical disorders (an update). Gastroenterology, 104 (2): 622-639.
Shaheen S.O., Aaby P., Hall A.J., Barker D.J., Heyes C.B., Shiell A.W., Goudiaby A., 1996. Measles and atopy in Guinea-Bissau. Lancet, 347 (9018): 1792-1796.
Sicherer S.H. and Leung D.Y., 2010. Advances in allergic skin disease, anaphylaxis, and hypersensitivity reactions to foods, drugs, and insects in 2009. J. Allergy Clin. Immunol, 125 (1), 85-97.
Singh V.K., Mehrotra S., Agarwal S.S., 1999. The paradigm of Th1 and Th2 cytokines: its relevance to autoimmunity and allergy. Immunol. Res., 20 (2): 147-161.
Slater J.E., Colberg-Poley A., 1997. A DNA vaccine for allergen immunotherapy using the latexallergen Hev b 5.Arb. Paul Ehrlich Int. Bundesamt Sera ImpfstoffeFrankf A.M., 91: 230-235.
Smith G.L., 1993. Expression of genes by vaccinia virus vectors. In Molecular Virology: A practical approach. Edited by A.J. Dawson and R.M. Elliott. IRL Press at Oxford University Press, Oxford UK.
Spiegelberg H.L., Orozco E.M., Roman M., Raz E., 1997. DNA immunization: a novel approach to allergen-specific immunotherapy. Allergy, 52 (10): 964-970.
Srivastava K.D., Qu C., Zhang Т., Goldfarb J., Sampson H.A., Li X.M., 2009. Food allergy herbal formula-2 silences peanut-induced anaphylaxis for a prolonged posttreatment period via IFN-gamma-producing CD8+ T cells. J. Allergy Clin. Immunol, 123 (2), 443-451.
Toda M., Sato H., Takebe Y., Taniguchi Y., Saito S., Inouye S., Takemori Т., Sakaguchi M., 2000. Inhibition of immunoglobulin E response to Japanese cedar pollen allergen (Cry j 1) in mice by DNA immunization: Different outcomes dependent on the plasmid DNA inoculation method. Immunology, 99: 179-86.
Turcanu V., Stephens A.C., Chan S.M., Ranee F., Lack G., 2010. IgE-mediated facilitated antigen presentation underlies higher immune responses in peanut allergy. Allergy, 65 (10), 1274-1281.
deVries J.E., Carballido J.M., Aversa G., 1999. Receptors and cytokines involved in allergic TH2 cell responses. J. Allergy Clin. Immunol, 103 (5 Pt 2), S492-S496.
Claims (25)
1. Поксвирусный вектор для десенсибилизации, индукции переносимости или супрессии аллергического ответа у субъекта на аллерген арахиса, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, включающий (i) по меньшей мере два аллергена арахиса, выбранных из группы, состоящей из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h10 и ara h 11, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка, где вектор включает последовательность контроля транскрипции и старт-кодон для облечения экспрессии слитого белка и где метка деградации протеосомой включает мономер убиквитина.
2. Поксвирусный вектор по п.1, в котором нуклеотидная последовательность кодирует слитый белок, включающий (i) по меньшей мере два аллергена арахиса, выбранных из группы, состоящей из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.
3. Поксвирусный вектор по п.1, в котором нуклеотидная последовательность кодирует слитый белок, включающий (i) по меньшей мере три аллергена арахиса, выбранных из группы, состоящей из h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h10 и ara h 11, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.
4. Поксвирусный вектор по п.3, в котором нуклеотидная последовательность кодирует слитый белок, включающий (i) по меньшей мере три аллергена арахиса, выбранных из группы, состоящей из ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 и ara h 7, и (ii) метку деградации протеасомой для усиления внутриклеточной деградации слитого белка.
5. Поксвирусный вектор по пп.1-4, который включает промотор и один стартовый кодон для облегчения экспрессии интактного слитого белка.
6. Поксвирусный вектор по любому из пп. 1-4, в котором нуклеотидная последовательность кодирует слитый белок, включающий четыре аллергена арахиса, которые представляют собой ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 6.
7. Поксвирусный вектор по любому из пп. 1-4, в котором слитый белок включает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12.
8. Поксвирусный вектор по любому из пп. 1-4, который включает нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 11.
9. Поксвирусный вектор по любому из пп. 1-4, в котором метка деградации протеосомой включает нуклеотидную последовательность, SEQ ID NO: 1.
10. Поксвирусный вектор по любому из пп. 1-4, в котором метка деградации протеасомой включает убиквитин С.
11. Поксвирусный вектор по любому из пп. 1-4, в котором нуклеотидная последовательность кодирует слитый белок, включающий аллергены арахиса ara h 1, ara h 2, ara h 3 и ara h 6.
12. Поксвирусный вектор по любому из пп. 1-4, который представляет собой вектор на основе вируса коровьей оспы.
13. Поксвирусный вектор по п. 12, который представляет собой модифицированный вектор на основе вируса коровьей оспы или вектор на основе вируса оспы птиц.
14. Композиция для десенсибилизации, индукции переносимости или супрессии аллергического ответа у субъекта на аллерген арахиса, включающая поксвирусный вектор по любому из пп. 1-4, и фармацевтически или физиологически приемлемый носитель и/или разбавитель.
15. Применение поксвирусного вектора по любому из пп. 1-4 при изготовлении лекарственного средства для десенсибилизации, индукции переносимости или супрессии аллергического ответа у субъекта на аллерген арахиса.
16. Способ десенсибилизации, индукции переносимости или подавления аллергической реакции на аллерген арахиса у субъекта или пациента, включающий введение субъекту или пациенту эффективного количества поксвирусного вектора по любому из пп. 1-4 в течение времени и в условиях, достаточных для того, чтобы добиться подавления/переносимости.
17. Способ вакцинации субъекта для десенсибилизации или индукции переносимости аллергена арахиса, включающий введение поксвирусного вектора по любому из пп. 1-4.
18. Применение по п. 15 для индукции переносимости против по меньшей мере двух или по меньшей мере трех основных аллергенов арахиса.
19. Способ по п. 16 для индукции переносимости против по меньшей мере двух или против по меньшей мере трех основных аллергенов арахиса.
20. Способ по п. 17 для индукции переносимости против по меньшей мере двух или против по меньшей мере трех основных аллергенов арахиса.
21. Набор для десенсибилизации, индукции переносимости или супрессии аллергического ответа у субъекта на аллерген арахиса, включающий (i) поксвирусный вектор по любому из пп. 1-4 и (ii) фармацевтически или физиологически приемлемый носитель и/или растворитель.
22. Поксвирусный вектор по любому из пп. 1-4 для применения человеком.
23. Поксвирусный вектор по п. 22, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, оптимизирована по кодонам для экспрессии в человеческих клетках.
24. Способ десенсибилизации или индукции переносимости аллергена арахиса у субъекта, включающий: i) сбор лимфоцитов субъекта; ii) совместное культивирование лимфоцитов с клетками, трансфицированными поксвирусным вектором по любому из пп. 1-4 ex vivo, для генерации и/или расширения популяции лимфоцитов ТН1, которая узнает деградированный протеасомой слитый белок аллергена арахиса, ассоциированный с молекулами класса I ГКС на клетке; и iii) введение популяции лимфоцитов ТН1 из (ii) субъекту.
25. Способ десенсибилизации или индукции переносимости аллергена арахиса у субъекта, включающий: i) сбор наивных антигенпредставляющих клеток субъекта; ii) совместное культивирование антигенпредставляющих клеток с клетками, трансфицированными поксвирусным вектором по любому из пп. 1-4 ex vivo, для генерации популяции активированных антигенпредставляющих клеток ТН1, которые узнают деградированный протеасомой слитый белок аллергена арахиса, ассоциированный с молекулами класса I ГКС на клетке; и iii) введение популяции активированных антигенпредставляющих клеток из (ii) субъекту.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361852239P | 2013-03-15 | 2013-03-15 | |
US61/852,239 | 2013-03-15 | ||
PCT/AU2014/000286 WO2014138824A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-03-17 | Immune modulation |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018121086A Division RU2709771C2 (ru) | 2013-03-15 | 2014-03-17 | Иммунная модуляция |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2015144308A RU2015144308A (ru) | 2017-04-20 |
RU2662927C2 true RU2662927C2 (ru) | 2018-07-31 |
Family
ID=51535630
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015144308A RU2662927C2 (ru) | 2013-03-15 | 2014-03-17 | Иммунная модуляция |
RU2018121086A RU2709771C2 (ru) | 2013-03-15 | 2014-03-17 | Иммунная модуляция |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018121086A RU2709771C2 (ru) | 2013-03-15 | 2014-03-17 | Иммунная модуляция |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11173206B2 (ru) |
EP (2) | EP3685853A1 (ru) |
JP (2) | JP6549042B2 (ru) |
KR (2) | KR102212253B1 (ru) |
CN (2) | CN109517842A (ru) |
AU (1) | AU2014231734B2 (ru) |
CA (1) | CA2906735C (ru) |
DK (1) | DK2968528T3 (ru) |
ES (1) | ES2909750T3 (ru) |
HK (1) | HK1219436A1 (ru) |
IL (1) | IL241596B (ru) |
MY (1) | MY193724A (ru) |
NZ (1) | NZ630642A (ru) |
RU (2) | RU2662927C2 (ru) |
SG (1) | SG11201507657QA (ru) |
WO (1) | WO2014138824A1 (ru) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110075285A (zh) | 2012-10-30 | 2019-08-02 | 阿拉沃克斯有限公司 | 新颖的免疫治疗分子和其用途 |
US11173206B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-11-16 | Sementis Limited | Immune modulation |
CA2925480A1 (en) | 2013-09-25 | 2015-04-02 | Aravax Pty Ltd | Novel immunotherapeutic composition and uses thereof |
CA3034282A1 (en) * | 2016-08-19 | 2018-02-22 | Sementis Limited | Viral vaccines |
CA3207206A1 (en) * | 2021-02-01 | 2022-08-04 | Lingfeng LIU | Targeted protein degradation system and use thereof |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5773705A (en) * | 1992-12-31 | 1998-06-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Ubiquitin fusion protein system for protein production in plants |
WO2001040264A2 (en) * | 1999-12-06 | 2001-06-07 | Panacea Pharmaceuticals, Llc. | Peptide antigens |
WO2007104581A1 (en) * | 2006-03-14 | 2007-09-20 | Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt Für Sera Und Impfstoffe | Use of recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) for the treatment of type 1 hypersensitivity in a living animal including humans |
EA012160B1 (ru) * | 2002-05-16 | 2009-08-28 | Бавариан Нордик А/С | Рекомбинантный поксвирус, экспрессирующий гомологичные гены, встроенные в поксвирусный геном, и его применение |
WO2010018378A2 (en) * | 2008-08-15 | 2010-02-18 | Circassia Limited | Ragweed peptides for vaccine |
WO2012123759A1 (en) * | 2011-03-17 | 2012-09-20 | Cambridge Enterprise Limited | Treatment for peanut allergy |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6037135A (en) | 1992-08-07 | 2000-03-14 | Epimmune Inc. | Methods for making HLA binding peptides and their uses |
US8623379B2 (en) * | 2000-03-02 | 2014-01-07 | Emory University | Compositions and methods for generating an immune response |
US7265208B2 (en) * | 2001-05-01 | 2007-09-04 | The Regents Of The University Of California | Fusion molecules and treatment of IgE-mediated allergic diseases |
JP2009513532A (ja) * | 2003-07-10 | 2009-04-02 | サイトス バイオテクノロジー アーゲー | パッケージ化ウイルス様粒子 |
CN101001872A (zh) * | 2004-04-16 | 2007-07-18 | 宏观基因有限公司 | FcγRIIB-特异性抗体及其使用方法 |
CN100374152C (zh) * | 2005-12-23 | 2008-03-12 | 中国农业大学 | 一种过敏性反应抑制剂 |
US11173206B2 (en) * | 2013-03-15 | 2021-11-16 | Sementis Limited | Immune modulation |
-
2014
- 2014-03-17 US US14/777,457 patent/US11173206B2/en active Active
- 2014-03-17 CN CN201811364128.0A patent/CN109517842A/zh active Pending
- 2014-03-17 CN CN201480024524.2A patent/CN105163756A/zh active Pending
- 2014-03-17 EP EP20156953.0A patent/EP3685853A1/en not_active Withdrawn
- 2014-03-17 DK DK14763738.3T patent/DK2968528T3/da active
- 2014-03-17 CA CA2906735A patent/CA2906735C/en active Active
- 2014-03-17 SG SG11201507657QA patent/SG11201507657QA/en unknown
- 2014-03-17 NZ NZ630642A patent/NZ630642A/en unknown
- 2014-03-17 RU RU2015144308A patent/RU2662927C2/ru active
- 2014-03-17 MY MYPI2015703226A patent/MY193724A/en unknown
- 2014-03-17 WO PCT/AU2014/000286 patent/WO2014138824A1/en active Application Filing
- 2014-03-17 ES ES14763738T patent/ES2909750T3/es active Active
- 2014-03-17 KR KR1020197033558A patent/KR102212253B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-17 AU AU2014231734A patent/AU2014231734B2/en active Active
- 2014-03-17 EP EP14763738.3A patent/EP2968528B1/en active Active
- 2014-03-17 JP JP2015561833A patent/JP6549042B2/ja active Active
- 2014-03-17 RU RU2018121086A patent/RU2709771C2/ru active
- 2014-03-17 KR KR1020157029396A patent/KR102125594B1/ko active IP Right Grant
-
2015
- 2015-09-16 IL IL241596A patent/IL241596B/en active IP Right Grant
-
2016
- 2016-06-30 HK HK16107611.6A patent/HK1219436A1/zh unknown
-
2019
- 2019-03-26 JP JP2019059511A patent/JP2019134707A/ja active Pending
-
2021
- 2021-10-14 US US17/501,305 patent/US20220088189A1/en active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5773705A (en) * | 1992-12-31 | 1998-06-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Ubiquitin fusion protein system for protein production in plants |
WO2001040264A2 (en) * | 1999-12-06 | 2001-06-07 | Panacea Pharmaceuticals, Llc. | Peptide antigens |
EA012160B1 (ru) * | 2002-05-16 | 2009-08-28 | Бавариан Нордик А/С | Рекомбинантный поксвирус, экспрессирующий гомологичные гены, встроенные в поксвирусный геном, и его применение |
WO2007104581A1 (en) * | 2006-03-14 | 2007-09-20 | Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt Für Sera Und Impfstoffe | Use of recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) for the treatment of type 1 hypersensitivity in a living animal including humans |
WO2010018378A2 (en) * | 2008-08-15 | 2010-02-18 | Circassia Limited | Ragweed peptides for vaccine |
WO2012123759A1 (en) * | 2011-03-17 | 2012-09-20 | Cambridge Enterprise Limited | Treatment for peanut allergy |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2906735C (en) | 2020-03-24 |
US20220088189A1 (en) | 2022-03-24 |
US20160030552A1 (en) | 2016-02-04 |
SG11201507657QA (en) | 2015-10-29 |
KR102125594B1 (ko) | 2020-06-24 |
CN109517842A (zh) | 2019-03-26 |
RU2015144308A (ru) | 2017-04-20 |
EP2968528A1 (en) | 2016-01-20 |
JP6549042B2 (ja) | 2019-07-24 |
KR102212253B1 (ko) | 2021-02-04 |
RU2018121086A (ru) | 2019-03-05 |
EP2968528B1 (en) | 2022-02-23 |
AU2014231734A1 (en) | 2015-10-08 |
CA2906735A1 (en) | 2014-09-18 |
US11173206B2 (en) | 2021-11-16 |
MY193724A (en) | 2022-10-27 |
KR20160002771A (ko) | 2016-01-08 |
IL241596B (en) | 2018-05-31 |
EP3685853A1 (en) | 2020-07-29 |
AU2014231734B2 (en) | 2018-03-15 |
CN105163756A (zh) | 2015-12-16 |
WO2014138824A1 (en) | 2014-09-18 |
RU2709771C2 (ru) | 2019-12-19 |
ES2909750T3 (es) | 2022-05-10 |
JP2019134707A (ja) | 2019-08-15 |
EP2968528A4 (en) | 2016-10-12 |
NZ630642A (en) | 2016-01-29 |
DK2968528T3 (da) | 2022-03-28 |
KR20190130665A (ko) | 2019-11-22 |
JP2016513963A (ja) | 2016-05-19 |
RU2018121086A3 (ru) | 2019-03-05 |
HK1219436A1 (zh) | 2017-04-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220088189A1 (en) | Immune modulation | |
CA2204253C (en) | Methods and devices for immunizing a host through administration of naked polynucleotides which encode antigenic peptides | |
JP4359654B2 (ja) | 抗原特異的免疫応答を生起させる遺伝子発現ベクターおよびその使用方法 | |
JP2001503741A (ja) | アレルギー性肺疾患を治療するための方法 | |
BRPI0620459A2 (pt) | composição, e kit para prevenir e inibir uma resposta alérgica contra uma proteìna alergenica, e, método para prevenir e inibir uma reação alérgica a uma proteìna alergenica em um indivìduo | |
CN113666990A (zh) | 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用 | |
EP4205762A1 (en) | Improved dna vaccine for sars-cov-2 | |
EP3775174A1 (en) | Respiratory syncytial virus (rsv) vaccines | |
JP2021523185A (ja) | アレルゲンを含む改善されたlamp構築物 | |
WO2023013785A1 (ja) | Snareを活用した核酸構築物 | |
US20150147355A1 (en) | Compositions and Methods of Vaccination | |
CN115569189A (zh) | 治疗hpv感染的疫苗组合 | |
AU759590B2 (en) | Gene expression vectors which generate an antigen specific immune response and methods of using the same | |
AU1841897A (en) | Gene expression vectors which generate an antigen specific immune response and methods of using the same |