KR20160002771A - 면역 조절 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6. ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 및 ara h 11, 또는 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부로부터의 2종 이상의 땅콩 알레르겐으로 이루어진 목록으로부터 선택되는 땅콩 알레르겐, 및 (ii) 융합 단백질의 세포내 분해를 증진시키기 위한 프로테아좀 분해 태그를 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폭스바이러스 벡터에 관한 것이다. 땅콩 알레르겐에 대해 탈감작화시키거나, 또는 그에 대한 내성을 유도하는 방법, 및/또는 땅콩 알레르겐에 대한 알레르기 반응을 억제하는 방법 또한 개시한다.

Description

면역 조절{IMMUNE MODULATION}
본 명세서는 일반적으로 예방적 또는 치료적 백신 분야에 관한 것이다. 특히, 본 명세서는 땅콩에 대한 알레르기 반응을 억제함으로써 땅콩 알레르기 치료용 백신에 관한 것이다.
이론상, 알레르기성 질환은 TH1 및 TH2 림프구 서브세트의 조절 이상과 관련된 면역계 장애이다[de Vries et al. 1999, Parronchi et al. 1999, Singh et al. 1999]. 백신접종에 기인하여 감염성 질환의 발생이 감소함에 따라, TH1 면역 유발의 주된 원인이 되는 항생제 및 다른 공중 위생 관행의 사용은 점점 줄어들고 있고, 그 결과로 환경 알레르겐에 대한 면역 반응의 TH2 편향은 증가하고 있다[Holgate 1999, Shaheen et al. 1996].
일반 집단에 영향을 미치는 다양한 알레르기 질환 중에서도 땅콩 유도성 아나필락시스는 특히 중증이며, 아나필락시스성 반응 치료를 위한 응급실 입원의 가장 일반적인 원인자임을 나타낸다.
땅콩에 대한 알레르기는 달리 유해하지도 않은 환경 항원에 대해 일어난 비정상적인 면역 반응으로부터 발생된 것이다. 땅콩 알레르기 및 아나필락시스는 TH2 T 세포 및 IgE 항체 분비 B 세포의 생성을 특징으로 하는 2형 면역 반응이 중심이 된다. 대조적으로, 1형 면역 반응은 대개 IgG(마우스에서 IgG2a 이소형)인 항체, NK 세포 및 포식 세포의 활성화, 및 세포독성 T 림프구(CTL: cytotoxic T lymphocyte)의 발생을 특징으로 할 수 있다. 1형 및 2형 반응, 두 반응 모두 TH1 및 TH2 림프구를 비롯한, 기능적으로 상이한 수개의 서브세트로 분화되는 헬퍼 T 세포에 의해 조정된다. 상기 서브세트는 그의 사이토카인 분비 프로파일을 특징으로 하는데[Mosmann et al. 1989], TH1 세포는 IFN-감마를 생산하고, TH2 세포는 전형적으로 IL-4, IL-5 및 IL-13을 분비한다.
경구적으로 섭취된 땅콩 알레르겐은 먼저 소화관 점막 면역계와 대면하게 된다. 미세주름(M) 세포는 위장관 상피 내층을 형성하고, 파이어판에 매우 인접하게 있는, 분화된 소포 결합 세포이다. 내성 및/또는 보호 소화관 관련 면역 반응 유도를 담당한다. 외인성 식품 항원이 M 세포에 의해 흡수된 후, 대식세포 및 수지상 세포(DC: dendritic cell)에 제시되었을 때, 식품 알레르겐에의 감작화가 일어나게 된다[DeLong et al. 2011]. 일단 대식세포 및 DC에 의해 내재화되고 나면, 항원은 엔도사이토시스된 후, 변성되고, 길이가 약 12-20개의 아미노산인 펩티드로 분해된다. 이어서, 상기 작은 펩티드 단편 중 소량의 분획은 세포내에서 수송되고, CD4+ T 세포와의 특이적인 상호작용을 위해 세포 표면 II형 MHC 분자 상에 제시된다. 이어서, 상기 활성화된 CD4+ T 세포는 수적으로 증폭되고, TH2 사이토카인을 방출한다. TH2, IL-4 및 IL-5는, 표면 면역글로불린(Ig) 수용체에 결합되어 있는 알레르겐을 보유하는 B 세포의, 알레르겐 특이 IgE 항체를 분비하는 세포로의 분화를 촉진시킨다[Turcanu et al. 2010]. 이어서, 상기 IgE 생산 B 세포는 수적으로 증폭되고, 계속해서 알레르겐 특이 IgE 항체를 분비하는 형질 세포가 된다. 땅콩에의 환경적 노출로 땅콩 알레르겐은 비만 세포 및 호염기구 상의 특이적인 IgE 코팅에 결합하게 된다. 이어서, Fc 수용체 가교 결합은 호염기구 및 비만 세포를 탈과립화시키는 강력한 활성화 자극을 제공하고, 이로써, 다양한 미리 형성된 염증유발성 및 혈관작용성 화합물, 예컨대, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 세린 프로테아제, 히스타민 및 사이토카인은 세포외 유체로 빠르게 방출되어 염증성 반응이 일어나게 되고[Sicherer et al. 2010], 이 모두는 결국 급성 알레르기성 반응이 임상적으로 일어나는 것으로 끝이 나게 된다[Long 2002].
땅콩 알레르기의 국소 증상으로는 복통, 구토, 경련 및 설사를 포함하고, 심지어 경미한 땅콩 알레르기이 경우에도 공통된다. 이러한 생명을 위협하지 않는 급성 반응은 장 투과성을 일시적으로 증가시키고, 이로써, 이어서 거대 분자, 예컨대, 땅콩 알레르겐이 전신에 분포될 수 있으며, 이는 후속된 땅콩 알레르겐에의 노출에 대한 알레르기 반응을 악화시킴으로써 생명을 위협하는 아나필락시스성 반응을 유발할 수 있다[Sanderson et al. 1993].
잔디, 화분, 집먼지 진드기 및 벌침 독에의 알레르기성 반응에 대한 전통적인 면역요법과 달리, 땅콩 추출물의 피하 탈감작화 주사는 허용되지 않는 위험-이익을 가진다[Oppenheimer et al. 1992]. 그러므로, 현 시점에서는 땅콩을 피하는 것이 추가 반응을 예방하는 데 이용가능한 유일의 방법이다. 그러나, 특히 땅콩에의 우발적 노출은 예컨대, 식당, 학교, 푸드 코트 및 회사 구내 식당과 같은, 땅콩을 함유하는 것과의 동일 인근 주변에서 제조된 가공 식품 또는 식품의 섭취를 통해 흔히 발생한다는 점에 비추어 볼 때, 완전히 회피한다는 것은 대개 비현실적인 전략법이다. 그러므로, 땅콩 알레르기의 치료 및 예방을 위한 효과적인 치료 전략법이 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 한 측면에서, (i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 및 ara h 7, 및 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부로 이루어진 목록으로부터 선택되는 2종 이상의 땅콩 알레르겐, 및 (ii) 융합 단백질의 세포내 분해를 증진시키기 위한 프로테아좀 분해 태그를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폭스바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명의 한 측면에서, (i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h10 및 ara h 11, 및 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부로 이루어진 목록으로부터 선택되는 2종 이상의 땅콩 알레르겐, 및 (ii) 융합 단백질의 세포내 분해를 증진시키기 위한 프로테아좀 분해 태그를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폭스바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, (i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 및 ara h 7, 및 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부로 이루어진 목록으로부터 선택되는 3종 이상의 땅콩 알레르겐, 및 (ii) 융합 단백질의 세포내 분해를 증진시키기 위한 프로테아좀 분해 태그를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폭스바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, (i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h10 및 ara h 11, 및 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부로 이루어진 목록으로부터 선택되는 3종 이상의 땅콩 알레르겐, 및 (ii) 융합 단백질의 세포내 분해를 증진시키기 위한 프로테아좀 분해 태그를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폭스바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 땅콩 알레르기의 치료, 또는 땅콩 알레르기 치료용 의약의 제조에 있어서의 본원에 개시된 폭스바이러스 벡터의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 억제/내성을 유도하는 데 충분한 시간 동안 및 그러한 조건 하에서 피험체 또는 환자에게 유효량의 본원에 개시된 폭스바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 피험체 또는 환자에서 알레르기 반응에 대한 내성을 유도하거나, 알레르기 반응을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 폭스바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 땅콩 알레르겐에 대한 내성을 유도하기 위해 피험체에게 백신접종하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 폭스바이러스 벡터를 포함하는 키트를 제공한다.
상기 요약은 어느 방식으로든 본 발명의 모든 실시양태를 완전히 나타낸 것으로 간주되지 않고, 그러한 것으로 간주되지 않아야 한다.
도 1은 프로테아좀 분해 태그 및 다중 땅콩 알레르겐을 포함하는, 본 발명의 실시양태에 따른 PHAV 항원(도 1a 및 b), 및 프로테아좀 분해 태그를 포함하지 않는, 본 발명의 실시양태에 따른 PHAV 항원(도 1c)의 배열을 보여주는 것이다.
도 2는 UBc.PHAV 발현 카세트의 핵산 서열을 보여주는 것이다.
도 3은 유비퀴틴 서열을 포함하지 않는, PHAVag 구성물 발현 카세트의 핵산 서열을 보여주는 것이다.
도 4는 상동성 재조합에 의한 PHAV 발현 카세트의, 백시니아 바이러스 코펜하겐(Copenhagen) 균주의 A39R ORF 내로의 삽입을 나타내는 다이어그램이다.
도 5는 도 4에 다이어그램으로 나타낸 상동성 재조합 카세트의 특징을 열거한 것이다.
도 6은 UBc.PHAV 상동성 재조합 카세트의 핵산 서열을 보여주는 것이다.
도 7은 PHAV 상동성 재조합 카세트의 핵산 서열을 보여주는 것이다.
도 8은 pTC11(UBc.PHAV) 및 pTC12(PHAV)를 나타내는 다이어그램이다. 플라스미드는 도 8에 제시되어 있다.
도 9는 세포에서의 프로테아좀 분해 경로를 나타내는 다이어그램이다.
도 10은 공 벡터(SCV000) 또는 UBc.PHAV 벡터(SCV201C)를 이용한 백신접종 이전 및 이후(백신접종 후 17일째)의 땅콩 단백질 특이 혈청 IgE(도 10a) 및 IgG2a(도 10b) 항체의 수준을 보여주는 것이다; *=p<0.05.
도 11은 SCV000 및 SCV201C로 백신접종된 마우스의 비장으로부터 수득된 배양된 림프구에 의해 분비된 IFN-감마(IFN-g; TH1 사이토카인; 도 11a), IL4(TH1 사이토카인; 도 11b) 및 IL5(TH2 사이토카인; 도 11c)의 수준을 보여주는 것이다.
본 명세서에서 임의의 선행 기술에 대한 참조는 상기 선행 기술이 모든 국가에서 기술 상식의 일부를 형성한다는 것에 관한 승인 또는 그러한 제안의 임의 형태가 아니며, 그러한 것으로도 간주되지 않아야 한다.
본 명세서 전역에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다(comprise)," "포함하다(comprises)" 및 "포함하는"이라는 단어는 임의의 다른 단계 또는 요소, 또는 단계들 또는 요소들의 군을 배제시킨다는 것이 아니라, 언급된 단계 또는 요소, 또는 단계들 또는 요소들의 군을 포함한다는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, "포함하는"이라는 용어 등을 사용하는 것은 열거된 요소는 요구되거나, 또는 필수적인 것이지만, 다른 요소는 임의적인 것이고, 존재할 수 있거나, 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타내는 것이다. "~으로 이루어진"이라는 것은 "~으로 이루어진"이라는 어구 다음에 오는 대상은 무엇이든 그를 포함하고, 그러한 것으로 한정된다는 것을 의미한다. 따라서, "~으로 이루어진"이라는 어구는 열거된 요소는 요구되거나, 또는 필수적인 것이고, 어떤 다른 요소도 존재할 수 없다는 것을 나타내는 것이다. "본질적으로 ~으로 이루어진"이라는 것은 상기 어구 다음에 열거된 임의의 요소를 포함하고, 열거된 요소에 대한 본 개시내용에서 언급된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나, 또는 그에 기여하지 않는 다른 요소로 한정된다는 것을 의미한다. 따라서, "본질적으로 ~으로 이루어진"이라는 어구는 열거된 요소는 요구되거나, 또는 필수적인 것이지만, 다른 요소는 임의적인 것이고, 이는 그가 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수 있거나, 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
본원에서 사용되는 바, 문맥상 달리 명백하게 나타내지 않는 한, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 복수 측면을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 조성물"이라고 언급하는 것은 단일의 조성물뿐만 아니라, 2종 이상의 조성물을 포함하고; "하나의 작용제"라고 언급하는 것은 하나의 작용제 뿐만 아니라, 2종 이상의 작용제를 포함하고; "본 발명"이라고 언급하는 것은 본 발명의 단일 및 다중 측면을 포함하는 것 등이 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가가 통상 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 것과 유사하거나, 또는 등가인 임의의 물질 및 방법이 본 발명을 실시하거나, 또는 테스트하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서를 통해 백신 접근법은 땅콩 알레르기 치료 또는 예방용 치료제를 개발할 수 있다. 특히, 본 명세서를 통해 작용제는 주된 땅콩 알레르겐, 예컨대, 가장 일반적이거나, 문제가 되는 땅콩 알레르겐들 중 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상 등의 것과 관련하여 요법을 제공할 수 있다.
본 발명은 다르게는 땅콩 알레르겐에의 노출시 알레르기성 반응을 촉진시키는 땅콩 알레르겐 특이 IgE 항체와 달리, 프로테아좀 분해 태그(예컨대, 유비퀴틴)에 연결된 땅콩 알레르겐(예컨대, ara h 1)을 포함하는 융합 단백질을 작동적으로 코딩하는 핵산 구성물을 포함하는 DNA 백신이 TH1 표현형으로 편향되어 있는 피험체에서 면역 반응을 유도할 수 있고, 이로써, 땅콩 알레르겐 특이 IgG 항체가 분비된다는 본 발명자들의 놀라운 발견에 입각한다.
따라서, 본 발명의 한 측면에서, (i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 및 ara h 7, 및 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부로 이루어진 목록으로부터 선택되는 2종 이상의 땅콩 알레르겐, 및 (ii) 융합 단백질의 세포내 분해를 증진시키기 위한 프로테아좀 분해 태그를 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폭스바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, (i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h10 및 ara h 11, 및 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부로 이루어진 목록으로부터 선택되는 2종 이상의 땅콩 알레르겐, 및 (ii) 융합 단백질의 세포내 분해를 증진시키기 위한 프로테아좀 분해 태그를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폭스바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, (i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 및 ara h 7, 및 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부로 이루어진 목록으로부터 선택되는 3종 이상의 땅콩 알레르겐, 및 (ii) 융합 단백질의 세포내 분해를 증진시키기 위한 프로테아좀 분해 태그를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폭스바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, (i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h10 및 ara h 11, 및 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부로 이루어진 목록으로부터 선택되는 3종 이상의 땅콩 알레르겐, 및 (ii) 융합 단백질의 세포내 분해를 증진시키기 위한 프로테아좀 분해 태그를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폭스바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, (i) (a) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 및 ara h 7 또는 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부로부터의 2종 이상의 땅콩 알레르겐, 또는 (b) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 및 ara h 7, 또는 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부로부터의 3종 이상의 땅콩 알레르겐으로 이루어진 목록으로부터 선택되는 땅콩 알레르겐, 및 (ii) 융합 단백질의 세포내 분해를 증진시키기 위한 프로테아좀 분해 태그를 포함하는 융합 단백질을 피험체의 세포에서 발현하는 폭스바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, (i) (a) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 및 ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h10 및 ara h 11, 또는 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부로부터의 2종 이상의 땅콩 알레르겐, 또는 (b) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h10 및 ara h 11 또는 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부부터의 3종 이상의 땅콩 알레르겐으로 이루어진 목록으로부터 선택되는 땅콩 알레르겐, 및 (ii) 융합 단백질의 세포내 분해를 증진시키기 위한 프로테아좀 분해 태그를 포함하는 융합 단백질을 피험체의 세포에서 발현하는 폭스바이러스 벡터를 제공한다.
땅콩 알레르겐
땅콩 알레르겐은 당업자에게 알려져 있으며, 이는 예를 들어, 접촉, 흡입, 섭취, 주사 등을 통해 피험체에 노출될 수 있는 아라키스 하이포가에아(Arachis hypogaea) 종의 임의의 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 2종 이상의 땅콩 알레르겐은 ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 및 ara h 7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 2종 이상의 땅콩 알레르겐은 ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 및 ara h 11로 이루어진 군으로부터 선택된다.
융합 단백질은 임의의 2종 이상의 땅콩 알레르겐 ara h 1내지 ara h 11을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 하기 땅콩 알레르겐
(i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 및 ara h 11;
(ii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 및 ara h 10;
(iii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 및 ara h 9;
(iv) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 및 ara h 8;
(v) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 및 ara h 7;
(vi) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5 및 ara h 6;
(vii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4 및 ara h 5;
(viii) ara h 1, ara h 2, ara h 3 및 ara h 4;
(ix) ara h 1, ara h 2, ara h 3 및 ara h 6;
(x) ara h l, ara h 2및 ara h 3;
(xi) ara h 1 및 ara h 2;
(xii) ara h 1 및 ara h 3;
(xiii) ara h 1 및 ara h 4;
(xiv) ara h 1 및 ara h 5;
(xv) ara h 1 및 ara h 6;
(xvi) ara h 1 및 ara h 7;
(xvii) ara h 1 및 ara h 8;
(xviii) ara h 1 및 ara h 9;
(xix) ara h 1 및 ara h 10;
(xx) ara h 1 및 ara h 11;
(xxi) ara h 2및 ara h 3;
(xxii) ara h 2및 ara h 4 등을 포함할 수 있다.
융합 단백질의 한 성분으로서 프로테아좀 분해 태그(예컨대, 유비퀴틴)를 사용함으로써, 합성된 융합 단백질은 프로테아좀 분해에 대해 표적화되어 소형 펩티드 단편이 생성되고, 상기 단편은 소포체(ER: endoplasmic reticulum)로 진입하여, 여기서, MHC I형 단백질과 복합체를 형성한 후, 세포 표면으로 수송되어 T 림프구에 제시된다. 그 결과, MHC I형을 가지는 단백질 단편의 제시는 증진된다. 따라서, 핵산 서열이 2종 이상의 땅콩 알레르겐을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 경우, 발현된 융합 단백질은 프로테아좀 분해되는 바, 2종 이상의 땅콩 알레르겐은 융합 단백질 중에 임의의 특정 순서로 출현할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
땅콩 알레르겐 또는 알레르겐들을 선택하는 것은 특정의 치료적 및/또는 예방적 적용에 따라 달라질 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, 땅콩 알레르겐 Ara h1에 대하여 알레르기성인 피험체에서 내성을 유도하는 데 백신을 사용되는 경우, 이때 융합 단백질은 바람직하게 ara h 1을 포함할 것이고; 땅콩 알레르겐 Ara h2에 대하여 알레르기성인 피험체에서 내성을 유도하는 데 백신을 사용되는 경우, 이때 융합 단백질은 바람직하게 ara h 2를 포함할 것이고; 땅콩 알레르겐 ara h 1 및 ara h 2에 대하여 알레르기성인 피험체에서 내성을 유도하는 데 백신을 사용되는 경우, 이때 융합 단백질은 바람직하게 ara h 1 및 ara h 2를 포함할 것이고; 그 이외의 것 등도 그러하다.
한 실시양태에서, 땅콩 알레르겐은 arah 1, 클론 P41B(진뱅크 수탁 번호 L34402 또는 스위스 프로트(Swiss-Prot): P43238.1); ara h 1클론 P17(진뱅크 수탁 번호 L38853); ara h 2cDNA(진뱅크 수탁 번호 L7797 또는 UniProtKB/TrEMBL: Q8GV20); ara h 3cDNA(진뱅크 수탁 번호 AF093541 or ACH91862); ara h 4 cDNA(진뱅크 수탁 번호 AF086821); ara h 5 cDNA(진뱅크 수탁 번호 AF059616); ara h 6cDNA(진뱅크 수탁 번호 AF092846 또는 UniProtKB/TrEMBL: Q647G9), ara h 7 cDNA(진뱅크 수탁 번호 AF091737), ara h 8(진뱅크 수탁 번호 AY328088, EF436550), ara h 9(진뱅크 수탁 번호 EU159429, EU161278), ara h 10(AY722694, AY722695) 및 ara h 11(DQ097716)을 포함하는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 융합 단백질은 4개 이상의 땅콩 알레르겐, 더욱 바람직하게, 땅콩에 알레르기성인 개체에게 영향을 미치는 가장 일반적인 땅콩 알레르겐 중 4개 이상의 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 융합 단백질은 땅콩 알레르겐 ara h 1, ara h 2, ara h 3 및 ara h 6을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 구체적인 예로, 에컨대, ara h 1, ara h 2 등을 비롯한, "땅콩 알레르겐"이라는 용어는 또한 그의 상동체 또는 변이체를 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 본원에 기술된 핵산 서열 또는 폴리펩티드(예를 들어, 서열 번호 1-12 중 어느 하나 포함)의 상동체를 참조로 하여 사용되는 바, "상동체"라는 용어는 예를 들어, 본원에 기술된 핵산 또는 폴리펩티드의 오르토로그, 파라로그, 돌연변이체 및 변이체를 포함하는 것으로 이해하여 하여야 한다. 일부 실시양태에서, 상동체는 본원에 기술된 핵산 또는 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성, 75% 이상의 서열 동일성, 80% 이상의 서열 동일성, 85% 이상의 서열 동일성, 90% 이상의 서열 동일성, 95% 이상의 서열 동일성, 96% 이상의 서열 동일성, 97% 이상의 서열 동일성, 98% 이상의 서열 동일성, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 포함하는 핵산 또는 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 한 실시양태에서, ara h 1은 서열 번호 4의 아미노산 서열, 또는 그와 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지고, ara h 2는 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 그와 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, ara h 3은 서열 번호 8의 아미노산 서열, 또는 그와 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, ara h 6은 서열 번호 10의 아미노산 서열, 또는 그와 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, ara h 1은 서열 번호 3의 핵산 서열, 또는 그와 70% 이상의 동일성을 가지는 핵산 서열에 의해 코딩되고, ara h 2는 서열 번호 5의 핵산 서열, 또는 그와 70% 이상의 동일성을 가지는 핵산 서열에 의해 코딩되고, ara h 3은 서열 번호 7의 핵산 서열, 또는 그와 70% 이상의 동일성을 가지는 핵산 서열에 의해 코딩되고, ara h 6은 서열 번호 9의 핵산 서열, 또는 그와 70% 이상의 동일성을 가지는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본원에서 사용되는 바, "서열 동일성"이라는 용어는 비교창에 걸쳐 개개의 뉴클레오티드 별로, 또는 개개의 아미노산 별로 서열이 동일한 정도를 의미한다. 따라서, "서열 동일성(%)"은 비교창에 걸쳐 최적으로 정렬된 두 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예컨대, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예컨대, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, He, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gin, Cys 및 Met)가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 개수를 측정하여 매칭되는 위치의 개수를 수득하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교창(즉, 창 크기) 중의 위치의 총 개수로 나누고, 그 값에 100을 곱하여 서열 동일성(%)을 얻는다. 본 발명의 목적을 위해, "서열 동일성"은 적절한 방법에 의해 계산된 "매칭률(%)"을 의미하는 것으로 이해할 것이다. 예를 들어, 서열 동일성 분석은 참조 매뉴얼이 첨부된 소프트웨에서 사용되는 바와 같이 표준 디폴트를 사용하는 DNASIS 컴퓨터 프로그램(윈도우스 버전 2.5; 히트치 소프트웨어 엔지니어링 컴퍼니 리미티드(Hitachi Software engineering Co., Ltd.: 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코))을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 코딩된 땅콩 알레르겐 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 서열 동일성은 75% 이상, 또는 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상의 서열 동일성으로 증가된다.
일부 실시양태에서, "알레르겐"이라는 용어는 또한 상기 펩티드 중 어느 하나의 단편을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 핵산은 상기 언급된 땅콩 알레르겐 중 하나의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 땅콩 알레르겐은 8개 이상의 염기로 이루어진 반복 서열이 천연 땅콩 알레르겐 서열로부터 제거된, 변형된 땅콩 알레르겐을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 2종 이상의 땅콩 알레르겐을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 2종 이상의 땅콩 알레르겐을 포함하고, 그 중 1종 이상은 ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 및 ara h 11으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 ara h 1, ara h 2, ara h 3 및 ara h 6, 또는 그의 상동체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 융합 단백질의 발현을 촉진하기 위하여, 핵산 중 땅콩 알레르겐을 코딩하는 두 서열 사이에는 종결 코돈은 없다.
프로테아좀 분해 태그
본 발명자들은 놀랍게도 융합 단백질의 한 구성 성분으로서 프로테아좀 분해 태그(예컨대, 유비퀴틴)를 사용하면 비유비퀴틴화된 땅콩 알레르겐 펩티드 구성물이 재조합 발현에 미치는 겉보기 독성 및/또는 억제성 효과를 극복할 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 프로테아좀 분해 태그를 사용함으로써 발현된 융합 펩티드를 프로테아좀 분해에 대하여 표적화시킨다. 유비퀴틴 표적화된 프로테아좀 분해의 결과로서, 융합 펩티드의 소형 펩티드 단편(예컨대, 길이 약 8-12개의 아미노산 길이인 펩티드)은 소포체(ER)로 진입하여, 여기서, MHC I형 단백질과 복합체를 형성한 후, 세포 표면으로 수송되어 T 림프구에 제시된다. 그 결과, MHC I형을 가지는 단백질 단편의 제시는 증진된다. 따라서, 핵산 서열이 2종 이상의 땅콩 알레르겐을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 경우, 발현된 융합 단백질은 프로테아좀 분해되는 바, 2종 이상의 땅콩 알레르겐은 융합 단백질 중에 임의의 특정 순서로 출현할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 결과로서, MHC I형을 가지는 융합 펩티드 단편의 융합 펩티드 단편의 제시는 증진됨에 따라, 땅콩 알레르겐에 대한 TH1 면역 반응은 증가하게 된다. 따라서, 프로테아좀 분해 태그는 예상 밖으로 온전한 땅콩 알레르겐 펩티드 구성물이 숙주 세포에서 재조합 발현을 억제하지 못하도록 방해하고, 면역 반응을 TH1 표현형 쪽으로 편향시킨다.
프로테아좀 분해 태그는 프로테아좀 분해를 위해 융합 단백질을 표적화시키는 임의의 태그일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로테아좀 분해 태그는 유비퀴틴 분자 또는 유비퀴틴 결합 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 프로테아좀 분해 태그는 유비퀴틴 단량체이고, 그의 예시적인 일례로는 유비퀴틴 C가 있다. 일부 실시양태에서, 유비퀴틴 단량체는 서열 번호 2의 아미노산 서열, 또는 그와 70% 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유비퀴틴 단량체의 C 말단은 알라닌 잔기이다.
또 다른 실시양태에서, 유비퀴틴 단량체는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 70% 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열 의해 코딩된다.
프로테아좀 분해 태그를 코딩하는 서열은 1종 이상의 땅콩 알레르겐을 코딩하는 서열 앞에 또는 그 뒤에 배치될 수 있다(즉, 단백질 분해 태그는 C 말단 또는 N 말단 융합 단백질일 수 있다).
유비퀴틴 분자는 임의의 적합한 종으로부터 유래된 것일 수 있다. 인간 치료용 백신의 경우, 유비퀴틴 분자는 인간 유비퀴틴 분자 또는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있는, 또 다른 동물 종으로부터의 유비퀴틴 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유비퀴틴 분자는 유비퀴틴 C 단량체일 수 있다. 일단 발현되고 나면, 유비퀴틴 분자는 다른 유비퀴틴 분자를 유인하고, 그에 결합하여 융합 단백질 상에 폴리유비퀴틴 쇄를 형성할 수 있다. 유비퀴틴 분자 및/또는 폴리유비퀴틴 쇄는 융합 단백질에 대해 프로테아좀 분해를 위해 유도할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 구성물을 작동가능하게 다중 유비퀴틴 분자 또는 하나 이상의, 절두된 또는 변형된 유비퀴틴 분자를 코딩하는 서열을 코딩한다. 다중 유비퀴틴 분자가 코딩될 경우, 하나 이상의 출발 및 종결 코돈이 제거됨으로써 전체 융합 단백질의 번역이 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 절두된 유비퀴틴 분자는 천연 유비퀴틴 분자의 C 말단에 가장 가까운 리신의 배제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 유비퀴틴 분자는 천연 서열의 하나 이상의 리신이 상기 서열로부터 제거되거나, 또는 (예컨대, 아르기닌으로) 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유비퀴틴 분자는 오직 단일 리신만을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 유비퀴틴 분자의 C 말단은 변형된 것일 수 있다. 예를 들어, 천연 분자의 C 말단 글리신은 알라닌으로 치환될 수 있다. 글리신의 알라닌 또는 또 다른 아미노산으로의 치환은 프로테아좀 분해 태그의 알레르겐으로부터의 프로테아제 절단을 막을 수 있다. 글리신의 알라닌으로의 치환은 또한 프로테아좀 분해 태그와 알레르겐 사이의 공유 결합 형성시킬 수 있다. 이러한 공유 결합은 프로테아제 절단에 대하여 저항성을 띨 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로테아좀 분해 태그는 유비퀴틴 결합 도메인을 포함할 수 있다. 단백질 분해 태그는 UbL(유비퀴틴-유사: ubiquitin-like)-UBA(유비퀴틴-결합: ubiquitin-associated) 도메인 함유 단백질 패밀리의 구성원일 수 있다. 이와 관련하여, 발현된 융합 단백질은 유비퀴틴 분자의 결합 도메인에의 결합을 유인할 수 있고, 이로써, 융합 단백질의 프로테아좀 분해가 일어날 수 있다.
융합 단백질
일부 실시양태에서, 핵산 서열은 피험체에서 발현을 위해 최적화된 융합 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 땅콩 알레르겐 융합 단백질에 대한 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있거나, 또는 최적화된다. 유사하게, 일부 실시양태에서, 프로테아좀 분해 태그는 피험체에서의 발현을 위해 최적화되고/되거나, 원하는 피험체와 동일한 종으로부터 프로테아좀 분해 태그 클로닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, 코돈 최적화는 한 코돈을, 같은 아미노산을 코딩하지만, 표적 종에서(예컨대, 인간)에서 더욱 효율적으로 또는 정확하게 번역되는 다른 코돈으로 치환하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 피험체에서의 발현을 위해 서열을 최적화하는 것 또한 반복 서열의 제거를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 8개 이상의 염기로 이루어진 반복 서열은 땅콩 알레르겐 서열로부터 제거된다. 이는 특히 서열이 역 번역에 의해 합성적으로 이루어진 경우에 중요할 수 있다. 합성 서열에는 일반적으로 진화를 통한 코돈 최적화의 이점이 결여되어 있다. 그러므로, 아미노산 서열을 바꾸지 않으면서, 뉴클레오티드 서열을 바꿈으로써 서열내의 무작위로 발생된 탈안정화 반복 서열을 파괴시키는 것이 서열의 발현을 개선시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로테아좀 분해 태그는 서열 번호 1에 따른 핵산 서열, 또는 그의 상동체에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 땅콩 알레르겐은 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 및/또는 서열 번호 9에 따른 핵산 서열, 또는 상기 중 어느 하나의 상동체에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 프로테아좀 분해 태그는 서열 번호 2에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 땅콩 알레르겐은 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 및/또는 서열 번호 10에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
입체구조적 에피토프가 MHC-1 제시를 위해서는 요구되지 않고, 어느 점에서는 알레르겐 특이 IgE 항체 결합을 막기 위해서는 원치않기 때문에, 융합 단백질의 일부로서 발현되는 알레르겐이 그의 천연 구조 형태에 존재할 필요는 없다. 이로써, 다중 땅콩 알레르겐을 포함하는 융합 단백질이 사용될 수 있으며, 이는 융합 단백질의 디자인에 있어 유연성을 제공한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 핵산 구성물은 작동가능하게 2종 이상의 땅콩 알레르겐을 코딩한다. 예를 들어, 융합 단백질은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 땅콩 알레르겐을 코딩할 수 있다. 일부 핵산의 경우, 알레르겐 중 1종 이상은 하기 땅콩 알레르겐 또는 그의 상동체로부터 선택될 수 있다: ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 또는 ara h 11. 예시적인 일례에서, 핵산 구성물은 ara h 1, ara h 2, ara h 3 및 ara h 6, 또는 그의 상동체를 작동가능하게 코딩한다. 예를 들어, 핵산 구성물은 서열 번호 11에 따른 핵선 서열을 포함할 수 있고, 서열 번호 12에 따른 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
각 알레르겐은 그 자신의 프로테아좀 분해 태그에 융합될 수 있고, 그 자신의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다(예컨대, 다중 융합 단백질이 발현될 수 있다). 별법으로, 프로테아좀 분해 태그 및 알레르겐에 대한 서열은 프로테아좀 분해 태그 및 다중 알레르겐을 포함하는 융합 단백질이 발현될 수 있도록 배열될 수 있다. 상기 후자의 접근법은 상이한 알레르겐의 차별적인 발현을 막을 수 있고/있거나, 같은 프로모터로 다중 발현 카세트가 사용되는 경우에는 분자내 재조합을 막을 수 있다.
2종 이상의 알레르겐을 포함하는 융합 단백질이 번역될 수 있도록 하기 위해, 핵산은 땅콩 알레르겐을 코딩하는 두 서열 사이에 종결 코돈을 함유하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 땅콩 알레르겐을 코딩하는 임의 서열 사이에 종결 코돈을 함유하지 않을 수 있고/있거나, 프로테아좀 분해 태그를 코딩하는 서열과 알레르겐을 코딩하는 서열 사이에 종결 코돈을 함유하지 않을 수 있다.
번역을 유도하기 위해, 융합 단백질 중 제1부를 코딩하는 서열은 서열 5' 말단에 출발 코돈을 포함할 수 있다. 출발 코돈은 융합 단백질의 나머지 부분을 코딩하는 서열에는 존재하지 않을 수 있다. 이와 관련하여, 프로테아좀 분해 태그에 융합되지 않은 알레르겐의 발현은 최소화되거나, 발현이 방해될 수 있다. 이는 온전한 땅콩 알레르겐이 세포로부터 분비되거나, 또는 세포 표면 상에 제시되는 것을 최소화하거나, 또는 그를 방해할 수 있는데, 그렇지 않을 경우, 이는 알레르겐에 대한 TH2 면역 반응을 자극시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 번호 12의 아미노산 서열, 또는 그와 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 번호 11의 핵산 서열, 또는 그와 70% 이상의 동일성을 가지는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 및 융합 단백질을 온전한 단백질로서 발현시키는 것을 촉진하기 위해, 및 각 알레르겐의 차별적인 발현을 감소시키기 위해, 벡터는 온전한(intact) 융합 단백질의 발현을 촉진하기 위해 단일 출발 코돈 및 전사 제어 서열(예컨대, 프로모터)을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 i) 본원에 기술된 백신, 및 ii) 카세트 서열의 각각의 말단에 말단 제한 효소 링커를 포함하는, 땅콩 알레르겐에 대한 피험체에서의 내성을 탈감작화시키기 위한, 또는 그를 유도하기 위한 핵산 카세트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 말단 제한 효소 링커는 Pac1 제한 효소 인식/절단 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 카세트는 바이러스 벡터 카세트이다.
핵산 구성물은 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 전사 제어 서열을 포함한다.
"전사 제어 서열"이라는 용어는 작동가능하게 연결된 핵산의 전사에 영향을 미치는 임의의 핵산 서열을 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 적합한 전사 제어 서열은 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예시적인 일례로는 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로모터, 인핸서 또는 상류 활성화 서열, 및 전사 종결 인자를 포함한다. 전형적으로, 전사 제어 서열은 적어도 프로모터는 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "프로모터"라는 용어는 세포에서 핵산 분자의 발현을 부여하거나, 활성화시키거나, 또는 증진시키는 임의의 핵산을 기술한다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 전사 제어 서열은 융합 단백질을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 목적을 위해, 전사 제어 서열은 상기 전사 제어 서열이 유전자 또는 다른 뉴클레오티드 서열의 전사를 촉진시키거나, 또는 억제하거나, 또는 다르게는 조정할 수 있을 때, 주어진 유전자 또는 뉴클레오티드에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주된다.
프로모터는 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 발현을 발현이 일어나는 세포, 조직, 기관 또는 발생 단계와 관련하여 외부 자극, 예컨대, 그 중에서도 특히, 생리학적 스트레스, 병원체, 또는 금속 이온에 대한 반응으로, 또는 하나 이상의 전사 활성 인자에 대한 반응으로 구성적으로, 또는 차별적으로 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명의 백신 및/또는 방법에 따라 사용되는 프로모터로는 예를 들어, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이 프로모터 또는 활성 가능 프로모터를 포함한다. 본 발명은 관시의 대상이 되는 세포에서 활성을 띠는 임의의 프로모터의 사용을 고려한다.
"조직 특이 프로모터"로는 유기체 중 하나 이상의 특이 세포, 조직 또는 기관 및/또는 유기체의 하나 이상의 발생 단계에서 우선적으로 또는 특이적으로 발현되는 프로모터를 포함한다. 조직 특이 프로모터는 또한 구성적 또는 유도성 프로모터일 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
프로모터는 본원에서 "활성 가능 프로모터"로서 지칭되는, 하나 이상의 전사 활성 인자에 의해 활성 가능한 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 활성 가능 프로모터는 그 중에서도 하나 이상의 전사 활성 인자에 대한 DNA 결합 부위를 포함하는 상류 활성화 서열(UAS: Upstream Activating Sequence)에 작동가능하게 연결된 최소 프로모터를 포함할 수 있다.
본원에서 언급되는 바, "최소 프로모터(minimal promoter)"라는 용어는 적어도 RNA 폴리머라제 결합 부위, 및 임의적으로 TATA 박스 및 전사 개시 부위 및/또는 하나 이상의 CAAT 박스를 도입하는 임의의 프로모터를 포함하는 것으로 이해하여야 한다.
상기 기술된 바와 같이, 활성 가능 프로모터는 상류 활성화 서열(UAS)에 융합된 최소 프로모터를 포함할 수 있다. UAS는 전사 활성 인자에 결합하여 최소 프로모터를 활성화시킬 수 있는 임의의 서열일 수 있다. 예시적인 전사 활성 인자로는 예를 들어, 효모 유래 전사 활성 인자, 예컨대, Gal4, Pdr1, Gcn4 및 Ace1; 바이러스 유래 전사 활성 인자, VP16; Hap1(문헌 [Hach et al., J Biol Chem 278: 248-254, 2000]); Gaf1(문헌 [Hoe et al., Gene 215(2): 319-328, 1998]); E2F(문헌 [Albani et al., J Biol Chem 275: 19258-19267, 2000]); HAND2(문헌 [Dai and Cserjesi, J Biol Chem 277:12604-12612, 2002]); NRF-1 및 EWG(문헌 [Herzig et al., J Cell Sci 113: 4263-4273, 2000]); P/CAF(문헌 [Itoh et al., Nucl Acids Res 28: 4291-4298, 2000]); MafA(문헌 [Kataoka et al., J Biol Chem 277: 49903-49910, 2002]); 인간 활성화 전사 인자 4(문헌 [Liang and Hai, J Biol Chem 272: 24088-24095, 1997]); Bcl10(문헌 [Liu et al., Biochem Biophys Res Comm 320(1): 1-6, 2004]); CREB-H(문헌 [Omori et al., Nucl Acids Res 29: 2154-2162, 2001]); ARR1 및 ARR2(문헌 [Sakai et al., Plant J 24(6): 703-711, 2000]); Fos(문헌 [Szuts and Bienz, Proc Natl Acad Sci USA 97: 5351-5356, 2000]); HSF4(문헌 [Tanabe et al., J Biol Chem 274: 27845-27856, 1999); MAML1(문헌 [Wu et al., Nat Genet 26: 484-489, 2000])을 포함한다.
전사 제어 서열은 또한 종결 인자를 포함할 수 있다. "종결 인자"라는 용어는 전사 종결 신호를 보내는, 전사 단위 말단에 위치하는 DNA 서열을 의미한다. 종결 인자는 1차 전사체의 3' 말단에의 폴리아데닐레이트 서열의 첨가를 촉진시키는 것인 폴리아데닐화 신호를 일반적으로 함유하는 3' 비번역 DNA 서열이다. 프로모터 서열과 같이, 종결 인자는 그를 사용하고자 하는 세포, 조직, 또는 기관에서 작동가능한 임의의 종결 인자 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 융합 단백질을 코딩하는 서열의 3'에 바이러스 조기 전사 정지 서열을 포함할 수 있다.
벡터
한 실시양태에서, 핵산 구성물은 벡터에 작동가능하게 도입된다.
일부 실시양태에서, 벡터는 진핵 세포에서의 발현을 위해 적합화된 발현 벡터일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "벡터"는 원하는 서열이 삽입될 수 있는 다수의 핵산으로 이루어진 임의의 것일 수 있다. 벡터는 플라스미드, 파지미드 및 바이러스 게놈을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 또한 숙주 세포(예컨대, 박테리아 세포)에서 복제될 수 있고, 이는 또한 여기서 벡터가 결정가능한 방식으로 절단될 수 있고, 그 안에 원하는 DNA 서열을 결찰시켜 재조합 벡터가 숙주 세포에서 복제될 수 있는 그의 능력을 유지할 수 있도록 하는 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 추가로 포함할 수 있다. 플라스미드의 경우, 플라스미드는 숙주 박테리아 내에서 카피수를 증가시키는 바, 원하는 서열의 복제는 다회에 걸쳐 일어날 수 있거나, 또는 숙주가 유사분열에 의해 복제하기 전 숙주당 단 1회에 걸쳐 일어날 수 있다. 파지인 경우, 복제는 용균 단계 동안 능동적으로, 또는 용원 단계 동안 수동적으로 일어날 수 있다.
발현 벡터는 표적 세포에서(예컨대, 인간 세포에서) 삽입된 핵산의 발현을 유도하는 전사 제어 서열을 함유할 수 있다. 전사 제어 서열은 상기 기술된 것을 포함하고, 예를 들어, 프로모터를 포함한다.
벡터는 벡터로 형질전환되거나, 또는 형질감염된 세포, 또는 그렇지 않는 세포의 식별을 위해 사용하는 데 적합한 하나 이상의 선별가능한 마커 서열을 추가로 함유할 수 있다. 마커로는 예를 들어, 항생제 또는 다른 화합물에 대한 저항성 또는 감수성을 증가 또는 감소시키는 단백질을 코딩하는 유전자, 그의 활성이 당업계에 공지된 표준 검정법에 의해 검출가능한 효소(예컨대, β-갈락토시다제, 루시퍼라제)를 코딩하는 유전자, 및 가능하게는 형질전환된 또는 형질감염된 세포, 숙주, 콜로니, 또는 플라크의 표현형(예컨대, 다양한 형광성 단백질, 예컨대, 녹색 형광 단백질(GFP: green fluorescent protein))에 영향을 주는 유전자를 포함한다. 일부 벡터는 자가 복제 가능하며, 이는 또한 에피솜 벡터로도 지칭된다. 별법으로, 벡터는 적합화되어 염색체 내로의 삽입될 수 있으며, 이로써, 통합 벡터로 명명된다. 벡터는 세포/조직 특이 발현을 매개하는 전사 제어 서열(프로모터 서열)을 장착할 수 있다. 이러한 프로모터 서열은 세포/조직 특이성의 유도성 또는 구성적인 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 적합한 바이러스 벡터는 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 바이러스 벡터의 예시적인 예로는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 또는 폭스바이러스 바이러스 벡터를 포함한다. 폭스바이러스 벡터는 예를 들어, 조류폭스 바이러스 벡터(예컨대, 계두 또는 카나리아 폭스)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폭스바이러스 바이러스 벡터는 예를 들어, 변형된 백시니아 앙카라(MVA: Modified Vaccinia Ankara) 바이러스, 조류폭스 바이러스 또는 무능력한(crippled) 백시니아 바이러스를 비롯한, 복제 제한 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터 그 자체가 세포 상에서 IL-12 수용체 발현을 촉진시킬 수 있는 바, 바이러스 벡터를 사용하는 것이 MHC I형 분자 상에서 분해된 땅콩 알레르겐 펩티드 단편을 발현하는 세포에 대한 TH1 반응으로 추가로 편향시키는 데 있어서 유익할 수 있다. 추가로, 바이러스 벡터에 의해 면역 세포의 활성화는 복잡한 세포-세포 상호작용 망 및 사이토카인 생산 케스케이드를 개시할 수 있고, 이로써, 항원에 의존하는 방식으로 TH1 면역 기능은 전반적으로 증강된다.
한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 폭스바이러스 바이러스 벡터이다.
일부 실시양태에서, 핵산 서열은 융합 단백질을 코딩하는 서열의 3'에 바이러스 조기 전사 정지 서열을 포함한다.
클로닝을 촉진하기 위해, 핵산 구성물은 핵산 카세트(즉, 발현 카세트)에 포함될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질을 작동가능한 코딩하는 핵산 구성물 및 카세트의 서열의 각 단부에 말단 제한 효소 링커를 포함하는, 땅콩 알레르겐에 대해 피험체를 탈감작화시키기 위한 핵산 카세트를 제공한다.
본원에서 사용되는 바, "핵산 카세트"라는 용어는 벡터 또는 게놈 내로 핵산 분자(예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 구성물)을 도입하기 위해 디자인된 핵산 서열을 의미하는 것으로 한다.
카세트는 전형적으로 카세트의 서열의 각 단부에 말단 제한 효소 링커를 포함할 것이다. 각 단부의 말단 제한 효소 링커는 동일하거나, 또는 상이한 말단 제한 효소 링커일 수 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아 세포에서 카세트의 복제가 요구되는 경우(및 카세트가 복제 기점을 포함하는 경우)에는 카세트가 카세트를 적절한 제한 효소로 분해하고, 단부를 함께 결찰시킴으로써 폐환화될 수 있는 바, 각 단부에 동일한 말단 제한 효소 링커를 가지는 것이 이로울 수 있다. 유사하게, 환형 카세트는 카세트를 단일 제한 효소로 분해함으로써 선형화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 말단 제한 효소 링커는 희귀 제한 효소 인식/절단 서열을 포함할 수 있고, 이로써, 카세트가 도입하고자 하는 핵산 또는 벡터 또는 게놈의 의도치 않은 분해가 일어나지 않도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 말단 제한 효소 링커는 Pac1 제한 효소 인식/절단 서열을 포함한다.
카세트는 포유동물 발현 벡터, 박테리아 발현 또는 클로닝 벡터, 곤충 발현 벡터, 식물 발현 벡터 또는 바이러스 벡터로 클로닝될 수 있다. 따라서, 카세트는 포유동물 벡터 카세트, 박테리아 벡터 카세트, 곤충 벡터 카세트, 식물 벡터 카세트 or a 바이러스 벡터 카세트일 수 있다.
땅콩 알레르기 치료 및 예방
본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 백신이 편향된 항땅콩 단백질 TH1 면역 반응을 일으키고, 현 알레르겐 특이 TH2 면역 반응에 비해 우세할 것이며, 그렇게 함으로써, 개체를 후속되는 알레르겐에의 노출에 대해 탈감작화시킬 것이라는 것을 발견하게 되었다. 추가로, TH1 사이토카인(예컨대 IFNγ, IL-12, TGF-β, IL2 등)의 발현은 TH2 사이토카인(예컨대 IL-3, IL-4, IL-5, IL6, IL10 등)의 발현을 감소시킬 수 있고, TH1 면역 반응 쪽으로 알레르겐에 대한 면역 반응을 편향시키고, 그 결과는 IgE 항체 생산 B 세포, 비만 세포 및 호산중구의 활성화 및/또는 동원 억제 또는 호전이며, 이로써, 후속되는 알레르겐 노출에 대한 알레르기성 반응(예컨대, 아나필락시스성 반응)을 감소 또는 예방할 수 있다. 따라서, 본 발명의 백신은 피험체에서 땅콩 알레르기의 치료에서 사용하는 데 적합한다.
본 발명자들은 놀랍게도, 본 발명의 백신이 기존 땅콩 알레르기와는 상관없이 땅콩 알레르겐에 대하여 편향된 TH1 면역 반응을 일으킨다는 것 또한 발견하게 되었다. 따라서, 본 발명의 백신은 땅콩 알레르기의 위험이 있을 수 있는 피험체에서 땅콩 알레르기의 예방에서 사용하는 데 적합한다.
따라서, 또 다른 측면에서, 피험체에서 땅콩 알레르겐에 대한 내성을 유도하는 데, 또는 그를 위한 의약을 제조하는 데 있어서 본원에 개시된 폭스바이러스 벡터의 용도를 제공한다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 폭스바이러스 벡터는 땅콩 알레르기의 발생 위험이 있는 피험체에서 땅콩 알레르기를 예방 또는 호전시키는 예방제로서 사용된다(즉, 알레르기의 발생 위험이 있는 피험체에서 내성이 유도될 수 있다). 땅콩 알레르기의 발생 위험이 있는 피험체로는 이미 알레르기, 예컨대, 건초열, 천식 또는 다른 식품 알레르기를 앓은 적이 있는 사람, 또는 알레르기의 가족력을 가진 사람을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 예를 들어, 피험체에서 땅콩 알레르겐 특이 TH1 반응을 유도함으로써 억제 및/또는 내성을 유도하는 데 충분한 시간 동안 및 그러한 조건 하에서 땅콩 알레르겐에 대한 내성 유도를 필요로 하는 피험체에게 유효량의 본원에 개시된 폭스바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 땅콩 알레르겐에 대한 내성을 유도하는 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 바, "알레르기성 반응," "알레르기," "알레르기성 장애"라는 용어 등은 면역계가 다른 무해한 환경 물질에 대하여 과민성인 면역 장애를 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 알레르기를 유발하는 상기 환경 물질은 "알레르겐"으로 명명된다. 일반 알레르기로는 계절성 비강안검염(예컨대, 잔디 및 화분, 예컨대, 돼지풀, 티모시 풀에 대한 알레르기), 애완동물 비듬, 예컨대, 고양이 비듬, 또는 개 비듬에 대한 알레르기, 식품 알레르기, 예컨대, 땅콩, 유제품 및 밀 알레르기, 독 아나필락시스, 및 천식을 포함한다. 알레르기성 장애는 전형적으로 IgE 생산을 특징으로 한다.
알레르기성 질환은 IL-4 및 IL-5를 생산하고, B 세포의 IgE 항체 분비 세포로의 분화를 촉진시키는 TH2 T 세포의 생성을 특징으로 하는, 다른 무해한 환경 항원에 대한 면역 반응으로부터 일어난다. IgE 항체는 호염기구 및 비만 세포 상의 고친화성 수용체에 결합한다. 알레르겐 노출로 표면 IgE에 의해 알레르겐 분자에 결합하게 되고, 수용체와 가교 결합함으로써 호염기구 및 비만 세포의 활성화 및 탈과립화를 유발한다. 후자의 경우, 다양한 미리 형성된 염증유발성 및 혈관작용성 화합물, 예컨대, 히스타민, 프로스타글란딘, 류코트리엔 및 사이토카인을 방출하여 염증성 반응을 일으킨다. 비만 세포 및 호염기구의 표면에 결합하는 IgE 항체에의 땅콩 알레르겐 결합이 초기 이벤트이며, 이는 결국 알레르기성 반응으로 끝나게 된다. 비만 세포 및/또는 호염기구 결합된 IgE에의 알레르겐 결합을 막는 것이 알레르기성 반응의 발생을 예방할 것이다. 땅콩 알레르겐에의 노출시 알레르겐 특이 IgE 생산을 예방하는 것이 땅콩에 대한 내성을 유도할 것이다.
본원에서 사용되는 바, "내성"이라는 용어는 땅콩 알레르겐 노출에 대한 알레르기성 반응의 (부분적 또는 완전한) 억제를 의미하는 것으로 간주된다. 억제는 알레르기성 반응의 방해, 지연, 감소, 저지 또는 다르게는 저해일 수 있다. 그러한 억제는 실제로 크기에 있어서의 억제일 수 있고/있거나, 일시적인 것일 수 있다. 특정 문맥에서, "억제하다" 및 "방해하다"라는 용어, 및 그의 파생어는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 내성은 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 평가될 수 있다. 예시적인 일례로서, 본원에 개시된 폭스바이러스 벡터를 이용한 치료 이전 및/또는 이후에 알레르겐 또는 다중 알레르겐에 대한 피험체의 반응을 측정하는 데 피부 단자 검사가 사용될 수 있다. 예를 들어, 땅콩에 대해 알레르기성인 피험체에서, 하나 이상의 땅콩 알레르겐을 이용한 피부 단자 검사는 전형적으로 국소 발진, 두드러기 및/또는 팽윤을 특징으로 하는 관찰가능한 국소 알레르기 반응을 일으킬 것이다. 본원에 개시된 폭스바이러스 벡터를 이용한 치료 이후 같은 개체에서의 내성은 전형적으로 그 자체는 피부 단자 검사에 대해 감소된 국소 알레르기성 반응을 보일 것이다. 이러한 감소는 예를 들어, 치료 전후의 국소 알레르기성 반응의 크기(예컨대, 직경)의 차이에 의해 측정될 수 있다.
또 다른 예시적인 일례에서, 내성은 땅콩 알레르겐에의 우발적 노출 이후의 알레르기 반응의 중증도의 방해, 지연, 억제, 감소, 저지 또는 저해에 의해 평가된다. 예를 들어, 피험체가 땅콩 알레르겐 노출에 대하여 아나필락시스성 반응의 병력이 있는 경우, 본 발명에 따른 폭스바이러스 벡터를 이용한 치료의 결과로서 내성은 비록 피험체가 다른 알레르기성 반응의 징후, 예컨대, 발진을 보일 수는 있지만, 후속되는 땅콩 알레르겐 노출 이후의 아나필락시스성 반응의 부재에 의해 측정될 수 있다.
또 다른 예시적인 일례에서, 내성은 피험체에서 순환 땅콩 알레르겐 특이 IgE 항체의 수준을 측정함으로써 평가된다. 예를 들어, 땅콩 알레르겐 노출에 대해 (아나필락시스성 반응을 비롯한) 알레르기성 반응의 병력이 있는 피험체는 전형적으로 예를 들어, 땅콩 알레르기가 없는 피험체와 비교하여 땅콩 알레르겐 특이 IgE 항체를 더 높은 수준으로 가질 것이다. 상기 개체에서, 내성은 본 발명의 백신을 이용한 치료 이후 순환 땅콩 알레르겐 특이 IgE 항체의 수준 감소에 의해 측정될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 내성은 TH1 면역 반응을 특징으로 하고, 전형적으로 내성 상태를 나타내는, 본 발명의 폭스바이러스 벡터를 이용하는 치료 이후 더 높은 수준의 순환 땅콩 알레르겐 특이 IgG 항체에 의해 측정될 수 있다.
별법으로, 또는 추가로, 내성은 피험체로부터 수득된 샘플(예컨대, 혈액 샘플, 예컨대, 혈장 또는 혈청 샘플 포함) 중 사이토카인 프로파일을 평가함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 더 높은 수준의 IFN-감마는 알레르겐 특이 TH1 반응 쪽으로 편향되어 있음을 나타내는 반면, 더 높은 수준의 IL-4 및/또는 IL-5는 알레르겐 특이 TH2 반응 쪽으로 편향되어 있음을 나타낸다.
별법으로, 또는 추가로, 내성은 본원에 개시된 바와 같이, 본 발명에 따른 폭스바이러스 벡터로 치료받은 피험체로부터 T 림프구의 샘플을 수득하고, 생체외에서 림프구의 사이토카인 프로파일을 측정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, T 림프구에 의한 더 높은 수준의 IFN-감마 생산은 알레르겐 특이 TH1 반응 쪽으로 편향되어 있음을 나타내는 반면, T 림프구에 의한 더 높은 수준의 IL-4 및/또는 IL-5생산은 알레르겐 특이 TH2 반응 쪽으로 편향되어 있음을 나타낸다. TH1과 TH2 반응 사이를 구별할 수 있는 땅콩 알레르겐 특이 IgE 및/또는 IgG 항체 및 사이토카인의 수준을 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예시적인 예로는 방사선 면역 검정법(RIA) 및 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA: enzyme linked immunosorbant assay)을 포함한다.
본원에 개시된 폭스바이러스 벡터는 그를 필요로 하는 피험체에서 원하는 치료적 또는 예방적 효과, 즉, 땅콩 알레르겐에 대한 내성 유도를 제공하는 단일 용량으로 또는 일련의 용량의 일부분으로서 투여되어야 한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 원치않는 효과, 예컨대, 부작용이 종종 원하는 치료적 및/또는 예방적 효과와 함께 나타날 수 있으며; 따라서, 의사는 적절한 유효량을 결정할 때 잠재적인 위험에 대하여 잠재적인 유익의 균형을 맞출 것이다. 백신의 정확한 필요량은 피험체의 종, 연령, 및 일반적인 상태, 투여 모드 등에 따라 피험체마다 달라질 것이다. 따라서, 정확한 유효량을 명시하는 것이 가능하지 않을 수도 있다. 그러나, 임의의 개체 사례에서의 적절한 유효량은 통상의 기술 또는 실험을 사용하여 당업계의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 당업계의 숙련가는 피험체의 크기 및 체중, 피험체의 증상의 중증도, 및 제안된 투여 경로와 같은 인자에 기초하여 필요량을 결정할 수 있을 것이다.
"치료"라는 용어는 적어도 일부 피험체에서 땅콩 알레르기의 하나 이상의 증상을 임의의 측정가능하게 또는 통계학상 유의적으로 억제 또는 호전시키는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 폭스바이러스 벡터는 하나 이상의 땅콩 알레르겐에 대하여 땅콩 알레르기를 가지는 피험체(즉, 하나 이상의 땅콩 알레르겐에 대하여 과민성인 피험체)를 탈감작화시키는 데 사용된다. 땅콩 알레르겐을 참조로 하여 본원에서 사용되는 바, "피험체를 탈감작화시키는"이라는 용어는 땅콩 알레르겐에 대한 피험체의 감수성이 감소되거나, 호전되거나, 또는 제거된 것을 의미하는 것으로 한다. 이와 관련하여, 피험체에서 땅콩 알레르기의 증상은 하나 이상의 땅콩 알레르겐에의 재노출시 부분적으로 또는 완전하게 감소된다.
일부 실시양태에서, 별법으로, 또는 추가로, 핵산 서열은 피험체에서 하나 이상의 땅콩 알레르겐에 대해 내성을 유도하는 데 사용된다. 하나 이상의 땅콩 알레르겐에 대한 내성 유도는 땅콩 알레르기를 가진 피험체, 또는 땅콩 알레르기가 발생될 위험이 있을 수 있는 피험체에서 수행된다(즉, 핵산은 땅콩 알레르기의 예방적 처치의 일부로서 사용될 수 있다).
본원에 개시된 폭스바이러스 벡터는 (본원에 기술된 바와 같이) 피험체에서 땅콩 알레르겐에 대해 탈감작화시키는 데, 또는 그에 대한 내성을 유도하는 데 상이한 방식으로 사용되지만, 폭스바이러스 벡터가 작동하는 일반 원리는 동일하다. 융합 펩티드가 세포에서 발현되었을 때, 이는 프로테아좀 분해 태그에 의해 프로테아좀 분해에 표적화되고, 이는 온전한 융합 단백질이 세포로부터 분비되지 못하도록 막는다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 폭스바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 피험체를 백신접종하여 땅콩 알레르겐에 대한 내성을 유도하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 2종 이상 또는 3종 이상의 주요 땅콩 알레르겐에 대해 내성을 유도하기 위한 방법이다.
본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 폭스바이러스 벡터를 포함하는 키트로 확대된다.
본 발명의 폭스바이러스 벡터는 당업계에 공지된 방법에 의해 생체내 또는 생체외에서(예컨대, 네이키드 DNA로서 또는 벡터로) 세포에 전달될 수 있다. 예시적인 일례로는 바이러스 전달, 미세주입, 유전자 총, 임페일펙션(impalefection), 정수압, 전자천공, 초음파 처리, 및/또는 리포펙션을 포함한다. 폭스바이러스 벡터는 또한 약학 조성물로서 세포에 전달될 수 있다.
리포솜은 폭스바이러스 벡터를 위한 운반체로서의 역할을 할 수 있다. 리포솜은 선택된 치료제(예컨대, 벡터)를 캡슐화한 후, 환자 내로 도입되는 지질 기반 소포이다. 리포솜은 순수한 인지질로부터 또는 인지질 및 포스포글리세리드의 혼합물로부터 제조된다. 전형적으로, 리포솜은 직경 200 nm 미만으로 제조될 수 있는데, 이를 통해 리포솜은 정맥내로 주사될 수 있고, 폐 모세관 층을 통과할 수 있다. 추가로, 리포솜의 생화학적 성질은 혈관막을 통과하는 투과성을 부여함으로써 선택된 조직에 접근할 수 있다.
폭스바이러스 벡터는 수혜자의 면역계에 영향을 줄 수 있는 임의의 단백질 또는 다른 작용제와 회합되지 않은, 네이키드 형태일 수 있다. 이러한 경우, 폭스바이러스 벡터는 생리학적으로 허용되는 용액, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 멸균 염수 또는 멸균 완충처리된 염수 중에 존재하는 것이 바람직할 수 있다. 별법으로, 백신은 예컨대, 렉시틴 리포솜 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 리포솜과 같은, 리포솜과 회합된 것일 수 있다. 핵산 분자의 세포 흡수를 지원하는 작용제, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 칼슘 이온 또한 사용될 수 있다.
비바이러스 벡터인 경우, 수혜자 내로 도입되는 핵산의 양은 투여량 범위가 매우 광범위할 것이며, 이는 예를 들어, 사용되는 전사 및 번역 프로모터의 강도에 의존할 수 있다. 추가로, 면역 반응의 크기는 단백질 발현 수준, 및 발현된 융합 단백질 생성물의 면역원성에 의존할 수 있다. 유효 용량 범위는 약 1 ng 내지 5 mg, 약 100 ng 내지 2.5 mg, 약 1 ㎍ 내지 750 ㎍, 또는 약 10 ㎍ 내지 300 ㎍의 핵산(예컨대, 폭스바이러스 벡터의 일부로서)을 포함할 수 있다.
폭스바이러스 벡터는 애주번트, 또는 DNA 흡수를 촉진시키거나, 또는 접종 부위로 면역계 세포를 동원시킬 수 있는 능력을 가지는 다른 물질의 존재하에서 피하로, 근육내로, 진피내로 또는 다른 모드에 의해 예컨대, 복강내, 정맥내 또는 흡입에 의해 투여되거나, 또는 접종될 수 있다. 선택되는 투여 경로는 환자의 질환 상태 및 조성물에 따라 달라질 것이다. 관련된 고려 사항으로는 활성화되는 면역 세포 유형, 항원이 면역계에 노출되는 시점, 및 면역화 스케줄을 포함한다. 부스터치료가 제공될 수 있다는 점도 또한 고려된다.
본원에 기술된 바와 같이, 폭스바이러스 벡터는 세포에서 융합 단백질의 발현에 의해 피험체를 탈감작화시킬 수 있다(즉, 피험체에서 내성을 유도할 수 있다). 융합 단백질은 세포 내에서 분해되고, 분해된 땅콩 알레르겐 단편은 MHC I형 분자가 회합되어 세포 표면 상에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 동안 어떠한 무손상의 발현된 땅콩 알레르겐도 피험체의 면역계에 노출되지 않는다. 이는 프로테아좀 분해 태그의 결과이며, 이는 발현된 융합 단백질의 세포내 프로테아좀 분해를 유도한다.
피험체에서 땅콩 알레르겐에 대해 탈감작화시키거나, 또는 피험체에서 내성을 유도하는 방법은 피험체에게 폭스바이러스 벡터, 또는 폭스바이러스 벡터를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 피험체의 세포에서 융합 단백질을 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서, 발현된 융합 단백질의 프로테아좀 분해 태그는 세포내 프로테아좀 분해 및 땅콩 알레르겐의 분해된 펩티드와 MHC I형 분자의 회합을 위해 융합 단백질을 표적화함으로써 땅콩 알레르겐에 대한 TH1 반응의 생성을 촉진시키고, 이로써, 피험체에서 땅콩 알레르겐에 대해 탈감작화시키거나, 또는 그에 대한 내성을 유도하는 것인, 땅콩 알레르겐에 대하여 피험체를 탈감작화시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 피험체의 세포에서 융합 단백질을 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서, 발현된 융합 단백질의 프로테아좀 분해 태그는 세포내 프로테아좀 분해 및 땅콩 알레르겐의 분해된 펩티드와 MHC I형 분자의 회합을 위해 융합 단백질을 표적화함으로써 땅콩 알레르겐에 대한 TH1 반응의 생성을 촉진시키고, 이로써, 땅콩 알레르겐에 대한 피험체의 감수성을 방해하는, 피험체에서 땅콩 알레르겐에 대한 내성을 유도하기 위한 예방적 처치 방법을 제공한다.
상기 방법은 생체내 세포에서 융합 단백질을 발현시키는 것을 포함할 수 있지만, 다른 방법은 생체외 세포에서 융합 단백질을 발현시키는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 융합 단백질을 발현하는 세포를 제공한다. 이와 관련하여, 세포는 시험관내 실험, 생체내 치료, 및/또는 생체외 치료를 위해 사용될 수 있다.
피험체
"피험체," "개체" 및 "환자"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 본 개시내용이 적용가능한 임의의 피험체, 특히, 척추동물 피험체, 및 심지어는 더욱 특히, 포유동물 피험체를 의미한다. 본 발명의 범주 내에 포함되는 적합한 척추동물로는 영장류를 비롯한, 척색동물(Chordata) 아문, 설치류(예컨대, 마우스, 래트, 기니아 피그), 토끼목(예컨대, 토끼, 산토끼), 소과(예컨대, 소), 양과(예컨대, 양), 염소과(예컨대, 염소), 돼지과(예컨대, 돼지), 말과(예컨대, 말), 개과(예컨대, 개), 고양이과(예컨대, 고양이), 조류(예컨대, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 애완조, 예컨대, 카나리아, 작은 앵무새 등), 해양 동물(예컨대, 돌고래, 고래), 파충류(뱀, 개구리, 도마뱀 등), 및 어류의 임의의 구성원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 피험체는 영장류(예컨대, 인간, 유인원, 원숭이, 침팬지)이다.
바람직한 실시양태에서, 피험체는 인간이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 인간 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된다.
약학 조성물
본 발명에 따른 폭스바이러스 벡터는 약학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 형태로 제공될 수 있다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 폭스바이러스 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 피험체에서 땅콩 알레르겐에 대해 탈감작화시키기 위한, 또는 그에 대한 내성을 유도하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
약학 조성물은 편리하게는 종래 제약 조제 기법에 따라 제조된다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing, Company, Easton, PA, U.S.A., 1990]을 참조할 수 있다. 상기 조성물은 활성 물질 중 하나 이외에도, 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정제 또는 당업계에 주지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 그러한 물질을 비독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체는 예컨대, 정맥내, 경구, 또는 비경구 투여와 같은 투여에 바람직한 제제 형태에 의존하여 매우 다양한 형태를 취할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 피험체의 세포에서 본원에 기술된 융합 펩티드를 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서, 발현된 융합 단백질의 프로테아좀 분해 태그는 세포내 프로테아좀 분해 및 땅콩 알레르겐의 분해된 펩티드와 MHC I형 분자의 회합을 위해 융합 단백질을 표적화함으로써 땅콩 알레르겐에 대한 TH1 반응의 생성을 촉진시키고, 이로써, 피험체에서 땅콩 알레르겐에 대해 탈감작화시키거나, 또는 그에 대한 내성을 유도하는 것인, 피험체에서 땅콩 알레르겐에 대하여 탈감작화시키거나, 또는 그에 대한 내성을 유도하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 피험체의 세포에서 본원에 기술된 융합 펩티드를 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서, 발현된 융합 단백질의 프로테아좀 분해 태그는 세포내 프로테아좀 분해 및 땅콩 알레르겐의 분해된 펩티드와 MHC I형 분자의 회합을 위해 융합 단백질을 표적화함으로써 땅콩 알레르겐에 대한 TH1 반응의 생성을 촉진시키고, 이로써, 땅콩 알레르겐에 대한 피험체의 감수성을 방해하는, 피험체에서 땅콩 알레르겐에 대한 내성을 유도하기 위한 예방적 처치 방법을 제공한다.
본 발명자들은 놀랍게도 땅콩 알레르겐 특이 IgG2a 항체 생산, 및 땅콩 알레르겐 유도성의, 림프구로부터의 TH1 사이토카인의 분비에 의해 측정된 바, 땅콩 알레르겐 및 프로테아좀 분해 태그를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폭스바이러스 벡터가 백신접종 시에 땅콩 특이 TH1 면역 반응을 일으킬 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 상기 폭스바이러스 벡터가 땅콩 알레르겐 특이 TH1 면역 반응을 자극시켰는 바, 결과적으로, 본원에 개시된 폭스바이러스 벡터는 땅콩 알레르겐에 대해 알레르기성인 피험체를 탈감작화시키는 데(즉, 피험체에서 내성을 유도하는 데) 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 프로테아좀 분해 태그 및 땅콩 알레르겐을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산인, 피험체에서 땅콩 알레르겐에 대해 탈감작화시키거나, 또는 그에 대한 내성을 유도하기 위한 핵산 서열을 제공한다. 핵산은 유전자 백신으로서 사용될 수 있다.
본원에 기술되어 있는 바와 같이, 일부 실시양태에서, 핵산은 생체내에서 세포에서 유비퀴틴화된 융합 단백질이 발현될 수 있도록 피험체에게 투여될 수 있는 발현 벡터(예컨대, 바이러스 벡터) 또는 약학 조성물에 포함된다. 별법으로, 핵산은 생체외 세포(예컨대, 항원 제시 세포)에서 발현되고, 이어서, 피험체에게로 투여될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 형질감염된 세포를 사용하여 생체외에서 TH1 림프구 집단을 자극시키고, 증식시킬 수 있고, 이를 피험체에게 투여한다.
일부 실시양태에서, TH1 기억을 땅콩 알레르겐의 제시된 펩티드에 확립시키는 것은 후속된 땅콩 알레르겐에의 노출시 땅콩 알레르겐에 대한 TH2 면역 반응을 방해하거나, 또는 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 땅콩 알레르겐에 대한 TH1 기억은 땅콩 알레르겐 특이 CD8+ T 세포의 활성화 및 유지에 의해 확립된다.
세포
본 발명의 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 융합 단백질을 발현하는 세포, 예컨대, 숙주 세포 또는 항원 제시 세포(예컨대, 수지상 세포)를 제공한다. 이어서, 생체내에서 또는 생체외에서 땅콩 알레르겐 반응성 TH1 림프구 집단을 생성하고/하거나 증식시키는 데 융합 단백질을 발현하는 형질감염된 세포가 사용될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 바와 같은 세포(즉, 융합 단백질을 발현하는 형질감염된 세포)를 하나 이상의 T 림프구와 함께 배양하는 단계를 포함하는, 생체외에서 땅콩 알레르겐 반응성 TH1 림프구 집단을 생성하고/하거나 증식시키는 방법을 가능하게 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 바와 같은 형질감염된 세포를 땅콩 알레르겐 반응성 TH1 림프구 집단의 생성 및/또는 증식을 필요로 하는 피험체에 투여하고, 여기서, 투여된 형질감염된 세포는 피험체에서 순수한 T 세포를 활성화시켜 땅콩 알레르겐 특이 TH1 세포가 되게 하는 단계를 포함하는, 생체내에서 땅콩 알레르겐 반응성 TH1 림프구 집단을 생성하고/하거나 증식시키는 방법을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 i) 피험체로부터 림프구를 수집하는 단계; ii) 본원에 기술된 바와 같은 세포(즉, 본원에 개시된 융합 단백질을 발현하는 형질감염된 세포)와 함께 림프구를 공동 배양하여, 세포 상의, MHC I형 분자와 회합된, 프로테아좀에 의해 분해된 땅콩 알레르겐 융합 단백질을 인식하는 TH1 림프구 집단을 생성하고/하거나 증식시키는 단계; 및 iii) (ii)로부터의 TH1 림프구를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 땅콩 알레르겐에 대해 탈감작화시키거나, 또는 그에 대한 내성을 유도하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 세포는 원핵 세포(예컨대, 박테리아 세포)를 포함할 수 있다. 원핵 세포는 핵산 구성물(예컨대, 벡터 형태로)을 복제시키는 데, 및/또는 다양한 클로닝 단계에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 진핵 세포(예컨대, 포유동물 세포)를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 또한 융합 단백질을 작동가능하게 코딩하는 핵산 구성물을 발현하는 세포를 포함한다.
본원에 개시된 폭스바이러스 벡터 또한 미감작(naive) 항원 제시 세포를 활성화시키는 데 사용될 수 있고, 이어서, 이 세포는 피험체 내로 다시 재도입되어 순수한 T 세포를 활성화시켜 땅콩 알레르겐 특이 TH1 세포가 되게 할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 i) 피험체로부터 항원 제시 세포를 수집하는 단계; ii) 본원에 기술된 바와 같은 세포(즉, 본원에 개시된 융합 단백질을 발현하는 형질감염된 세포)와 함께 항원 제시 세포를 공동 배양하여, 활성화된 TH1 항원 제시 세포 집단으로 된 집단을 생성하고/하거나 증식시키는 단계; 및 iii) (ii)로부터의 활성화된 TH1 항원 제시 세포를 피험체에게 투여하여 T 림프구를 알레르겐 특이 TH1 표현형 쪽으로 활성화시키는 단계를 포함하는, 피험체에서 땅콩 알레르겐에 대해 탈감작화시키거나, 또는 그에 대한 내성을 유도하는 방법을 제공한다. 적합한 미감작 항원 제시 세포는 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예시적인 예로는 수지상 세포 및 섬유아세포를 포함한다.
융합 단백질을 발현하는 세포 유형은 세포가 MHC I형 분자를 발현하는 유핵 세포여야 한다는 점에서 유일하게 제한된다. 이와 관련하여, 세포는 세포주(예컨대, CHO 세포주, HEK 세포주, 섬유아세포 세포주 등) 또는 1차 세포(예컨대, 섬유아세포, 수지상 세포)로부터의 세포일 수 있다. 세포가 생체외 자가 치료법으로서 의도되는 실시양태에서, 세포는 피험체로부터 쉽게 제거될 수 있는 세포(예컨대, 혈액, 림프, 골수 중 세포), 및/또는 조직 샘플로부터 쉽게 배양될 수 있는 세포(예컨대, 섬유아세포 세포)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 전문적 항원 제시 세포(예컨대, 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 상피 세포 등)일 수 있거나, 또는 비전문적 항원 제시 세포(예컨대, 섬유아세포, 흉선 상피 세포, 갑상샘 상피 세포, 신경아교세포, 췌장 베타 세포, 혈관 내피 세포 등)일 수 있다.
생체외에서 세포에서 융합 단백질을 발현시키는 것(예컨대, 본원에 개시된 폭스바이러스 벡터로 세포를 형질감염시키는 것)은 핵산을 발현하는 세포의 개수를 제어할 수 있다는 점에서 이로울 수 있다. 추가로, 생체외에서 세포를 위해 더욱 다양한 핵산 전달 시스템이 이용가능하다. 이어서, 융합 단백질을 발현하는 세포(즉, 형질감염된 세포)를 피험체에게 투여하여 피험체에서 순수한 T 세포를 땅콩 알레르겐 특이 TH1 표현형 쪽으로 활성화시킬 수 있고, 이어서, 피험체에서 하나 이상의 땅콩 알레르겐에 대하여 탈감작시킬 수 있거나, 그에 대한 내성을 유도할 수 있다. 별법으로, 융합 단백질을 발현하는 세포를 생체외에서 림프구와 함께 배양하여, 땅콩 알레르겐 반응성 TH1 림프구를 생성할 수 있고, 이어서, 피험체에게 투여할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 융합 단백질을 발현하는 세포를 하나 이상의 T 림프구와 함께 배양하는 단계를 포함하는, 생체외에서 땅콩 알레르겐 반응성 TH1 림프구를 생성하고/하거나 증식시키는 방법을 제공한다. T 림프구는 혼합된 림프구 집단 중에 포함되어 있을 수 있거나, 또는 단리된 T 림프구일 수 있다. 혼합된 림프구 집단은 말초혈, 림프 또는 골수로부터 당업계에 공지된 방법에 의하여 쉽게 수득될 수 있다. T 세포는 예를 들어, 나일론 울 단리, FACS 분류, 자기 비드 분리 등을 비롯한, 당업계에 공지된 방법에 의해 상기 혼합된 림프구 집단으로부터 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 T 림프구 서브세트는 핵산을 발현하는 세포와의 발현을 위해 단리될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이, 세포가 생체외에서 형질감염되어 융합 단백질을 발현하는 경우, 및/또는 TH1 림프구 집단이 생체외에서 생성되고/되거나 증식되는 경우, 대개는 자가 세포(즉, 치료하고자 하는 피험체로부터 유래된 세포)를 사용함으로써, 동종이계 세포(즉, 상이한 피험체로부터 유래된 세포)가 사용되고, 피험체에게 투여되었을 때 발생하는 면역 반응을 회피하거나, 최소화시키는 것이 대개는 바람직하다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
땅콩 알레르겐 반응성 TH1 림프구의 생체외 증식을 사용하여 다수의 땅콩 알레르겐 반응성 TH1 림프구를 생성할 수 있고, 이어서, 땅콩 알레르기의 예방적 또는 치료적 처리로서 피험체에게 투여될 수 있다. 일부 경우에, 생체외 증식은 생체내 활성화 및 증식과 비교하여 땅콩 알레르겐 반응성 TH1 림프구의 활성화 및 증식을 가속화시킬 수 있다. 추가로, 생체외 증식을 통해 증폭되는 땅콩 알레르겐 반응성 TH1 림프구의 개수 및 반응성을 제어할 수 있다. 일부 실시양태에서, 땅콩 알레르겐 반응성 TH1 림프구는 피험체에 대해 자가 유래의 것일 수 있다.
따라서, 본 발명은 (i) 피험체로부터 림프구를 수집하는 단계; (ii) 림프구를 융합 단백질을 발현하는 세포와 함께 공동 배양하여, 세포 상의, MHC I형 분자와 회합된, 프로테아좀에 의해 분해된 융합 단백질 펩티드을 인식하는 TH1 림프구 집단을 생성하고/하거나 증식시키는 단계; 및 (iii) (ii)로부터의 TH1 림프구를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험체를 땅콩 알레르겐에 대하여 탈감작화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같이, 림프구를 피험체로부터 수집한 후, 폭스바이러스 벡터를 투여한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 피험체에게 투여하기 이전에 단계 (ii)로부터의 림프구를 단리시키는 것을 포함할 수 있다. 단계 (ii)로부터의 림프구를 단리시키는 것은 핵산을 발현하는 세포로부터 모든 림프구를 단리시키는 것을 포함할 수 있고/있거나, 하나 이상의 림프구 유형(예컨대, 모든 T 세포 림프구, 모든 TH1 림프구 등)을 단리시키는 것을 포함할 수 있다. 별법으로, 융합 단백질을 발현하는 세포로부터 림프구를 단리시키지 않고, (ii)로부터의 TH1 림프구를 피험체에게 투여할 수 있으며, 이 경우, 투여되는, 융합 단백질을 발현하는 세포는 생체내에서 추가의 TH1 림프구를 계속해서 활성화시킬 수 있다. 피험체로부터 림프구를 단리시키는 방법, T 세포 및 T 세포 서브세트를 단리시키는 방법은 상기 기술된 방법을 포함한다.
또한, 본원에서는 T 림프구의 단리 여부에는 상관없이, 본 발명에 따라 처리되는 피험체로부터 T 림프구를 수득하고, 본원에 개시된 바와 같이, 림프구가 TH1 표현형 쪽으로 편향되어 있는지 여부를 측정하는 방법(예컨대, 생체외에서 사이토카인 발현 프로파일 측정)도 가능하다. 상기 접근법은 폭스바이러스 벡터 투여가 피험체에서 TH1 편향된 알레르겐 특이 면역 반응을 유도하였는지 여부를 측정한다는 추가의 이점을 가진다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 방법은 단계 (ii)로부터 단리된 림프구가 피험체에게로의 그의 투여 이전에 TH1 표현형 쪽으로 편향되어 있는지 여부를 측정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 피험체의 땅콩 알레르겐에 대한 탈감작화 또는 내성 유도는 땅콩에 대한 피험체의 후속되는 노출에 대하여 과민성 반응을 막거나, 감소시킬 수 있다. 따라서, 상기 기술된 본 방법은 땅콩에 대한 피험체의 후속된 노출시 앞서 땅콩에 대해 알레르기성인 피험체에서 땅콩에 대한 아나필락시스성 반응의 위험을 감소시킬 수 있고/있거나, 땅콩 알레르기 발생 위험이 있는 피험체에서 땅콩에 대한 아나필락시스성 반응의 위험을 감소시킬 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 기술된다. 하기 기술 내용은 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 것이며, 상기 기술 내용과 관련하여 제한하고자 하는 것이 아님을 이해하여야 한다.
실시예
재료 및 방법
PHAV 항원 제조 : 인간 유비퀴틴 C 단량체(Ubc) 및 4종의 땅콩 알레르겐을 포함하는 융합 단백질(PHAV 항원)에 대한 핵산 서열을 하기 기술되는 바와 같이, 및 도 1a에 도시된 바와 같이 디자인하였다.
온라인 단백질 서열 데이터베이스로부터 Ubc(NM 021009), ara h 1(스위스 프로트 엔트리 P43238), ara h 2(TrEMBL 엔트리 Q8GV20), ara h 3(진뱅크 단백질 ACH91862) 및 ara h 6(UniProtKB/TrEMBL 엔트리 Q647G9)에 대한 아미노산 서열을 입수하였다. 출발 코돈 아미노산 Met(M)를 ara h 1, ara h 2, ara h 3 및 ara h 6 단백질 서열로부터 제거한 후, 상기 서열을 연결시켜 Ubc + ara h1 + ara h2 + ara h3 + ara h6의 순서로 하나의 연속된 단백질 서열을 형성하였다. 호모 사피엔스(Homo Sapiens) 코돈 선호표를 사용하여 역 번역에 의해 상기 PHAVag 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 수득하였다.
진 디자이너(Gene Designer)(DNA2.0 인크(DNA2.0 Inc))를 사용하고, 10% 역치로 설정된 호모 사피엔스 코돈 최적화를 이용하여 PHAVag 아미노산 서열을 뉴클레오티드 서열로 역 번역시켰다. 8개 이상의 염기로 된 반복 서열 또한 필터링하였다. 생성된 서열을 DNA2.0 인크에 의해 2차 구조 형성 잠재능 및 탈안정화 요소에 대하여 추가로 스크리닝하였다. PHAVag 단백질 서열의 최종 뉴클레오티드 서열을 폭스바이러스 조기 전사 모티프 "TTTTTNT"에 대해 스크리닝하였다. 그러나, 어느 것도 관찰되지 않았다.
PHAV 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 말단에 "TAA" 종결 코돈을 부가하였다. 폭스바이러스 조기 전사 정지 서열 TTTTTAT 또한 종결 코돈 바로 다음에 부가하였다. 발현 카세트를 PacI 링커 측면에 배치시켰다. Pac I 인식 부위가 카세트 내에 존재하지 않기 때문에, 상기 카세트를 플라스미드로 클로닝할 수 있고, Pac I 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 플라스미드로부터 전체를 잘라낼 수 있다.
하기 표 1에 제시된 바와 같이, PHAV 항원 중 Ubc, ara h 1, ara h 2, ara h 3 및 ara h 6은 천연 서열과 약 75% 핵산 서열 동일성을 가졌다.
Figure pct00001
PHAV 항원 구성물 및 그의 성분의 핵산 및 아미노산 서열에 관한 요약은 하기 표 2에 기재되어 있다.
Figure pct00002
대체 PHAV 항원 제조 : 하기 단백질 코딩 서열 - 유비퀴틴 C 단량체, 땅콩 알레르겐 ara h 1, 땅콩 알레르겐 ara h 2, 땅콩 알레르겐 ara h 3 및 땅콩 알레르겐 ara h 6으로 이루어진 융합물, 폭스바이러스 조기 전사 정지 서열 및 최종적으로 또 다른 Pac 1 링커로 이루어진 PHAV 항원 단백질 서열을 포함하는 유비퀴틴화된 땅콩 저알레르기 백신 항원(UBc.PHAVag)을 제조하였다.
C 말단에서 말단 Gly(G) 잔기를 Ala(A)로 치환시켜 유비퀴틴 C 단량체를 변형시켰다. 변형된 유비퀴틴 C는 숙주 세포에서 PHAV 항원을 합성시에 프로테아좀 분해 경로로 표적하시킨다(도 9 참조). 이를 통해 확실하게 온전한 단백질은 항체 제조를 위해 제시되지 않고, 생성된 펩티드 단편은 MHC I형 경로에 의해 프로세싱되어 PHAV 항원에 대한 TH1 면역 반응을 일으킨다.
PHAV 발현 카세트의 입체 형태 및 특징은 도 1b에 다이어그램으로 제시되어 있고, 이는 5' 및 3' 말단에 Pac I 제한 엔도뉴클레아제 링커 뿐만 아니라, 5' 말단에 백시니아 조기/후기 프로모터를 포함한다.
UBc, ara h 1, ara h 2, ara h 3 및 ara h 6에 대한 아미노산 서열은 스위트-프로트 또는 EMBL 단백질 데이터베이스로부터 입수하였다. Met(M) 잔기를 코딩하는 출발 코돈을 ara h 1, ara h 2, ara h 3 및 ara h 6 핵산 서열로부터 제거한 후, 상기 서열을 연결시켜 본 순서대로 단백질 서열 UBc+h1+h2+h3+h6을 코딩하는 연속 핵산 서열을 형성하였다.
호모 사피엔스 코돈 선호표를 사용하여 역 번역에 의해 상기 UBc.PHAVag를 코딩하는 DNA 서열을 수득하였다. 진 디자이너(DNA2.0 인크)를 사용하고, 10% 역치로 설정된 호모 사피엔스 코돈 최적화를 이용하여 UBc.PHAVag 아미노산 서열을 뉴클레오티드 서열로 역 번역시키고, 8개 이상의 염기로 된 반복 서열을 필터링하였다. 생성된 서열을 DNA2.0 인크에 의해 2차 구조 형성 잠재능 및 탈안정화 요소에 대하여 추가로 스크리닝하였다. UBc.PHAVag를 코딩하는 최종 뉴클레오티드 서열을 폭스바이러스 조기 전사 모티프 "TTTTTNT"에 대해 스크리닝하였는데 - 어느 것도 관찰되지 않았다. UBc.PHAV를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 말단에 "TAA" 종결 코돈을 부가하였다. 폭스바이러스 조기 전사 정지 서열 TTTTTAT 또한 종결 코돈 바로 다음에 부가하였다. 발현 카세트를 PacI 링커 측면에 배치시키고, Pac I 인식 부위가 카세트 내에 존재하지 않기 때문에, 상기 카세트를 플라스미드로 클로닝할 수 있고, Pac I 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 플라스미드로부터 전체를 잘라낼 수 있다. UBc.PHAV 발현 카세트의 DNA 서열을 도 2에서 살펴볼 수 있다.
5' 말단에 유비퀴틴 단량체가 생략된 땅콩 저알레르겐 백신 항원 또한 구성하였다. 상기 구성물은 유비퀴틴 서열을 포함하지 않는 것만을 제외하면, 상기 기술된 바와 같은 UBc.PHAVag 구성물과 동일하였다. 상기 구성물을 PHAVag로 지칭하였고, PHAVag의 입체 형태 및 특징을 나타낸 다이어그램은 도 1c에서 살펴볼 수 있고, DNA 서열은 도 3에서 살펴볼 수 있다.
UBc.PHAVag 및 PHAVag 발현 카세트, 둘 모두 박테리아 플라스미드로 클로닝함으로써 PacI/SbfI 분해 및 겔 여과에 의한 클로닝 후 상기 발현 카세트를 검색할 수 있었다.
하기 땅콩 알레르겐을 포함하는 추가의 유비퀴틴화된 땅콩 저알레르기 백신 항원을 제조할 수 있었다:
(i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h, 10 및 ara h 11;
(ii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 및 ara h 10;
(iii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 및 ara h 9;
(iv) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 및 ara h 8;
(v) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 및 ara h 7;
(vi) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5 및 ara h 6;
(vii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4 및 ara h 5;
(viii) ara h 1, ara h 2, ara h 3 및 ara h 4;
(ix) ara h 1, ara h 2및 ara h 3;
(x) ara h 1 및 ara h 2;
(xi) ara h 1;
(xii) ara h 2;
(xiii) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10, 및 ara h 11;
(xiv) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 및 ara h 10;
(xv) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 및 ara h 9;
(xvi) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 및 ara h 8;
(xvii) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 및 ara h 7;
(xviii) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5 및 ara h 6;
(xix) ara h 2, ara h 3, ara h 4 및 ara h 5;
(xx) ara h 2, ara h 3 및 ara h 4;
(xxi) ara h 2및 ara h 3;
(xxii) ara h 3;
(xxiii) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 및 ara h 11;
(xxiv) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 및 ara h 10;
(xxv) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 및 ara h 9;
(xxvi) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 및 ara h 8;
(xxvii) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 및 ara h 7;
(xxviii) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5 및 ara h 6;
(xxix) ara h 1, ara h 3, ara h 4 및 ara h 5;
(xxx) ara h 1, ara h 3 및 ara h 4;
(xxxi) ara h 1 및 ara h 3;
(xxxii) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 및 ara h 11;
(xxxiii) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 및 ara h 10;
(xxxiv) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 및 ara h 9;
(xxxv) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 및 ara h 8;
(xxxvi) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5, ara h 6 및 ara h 7;
(xxxvii) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5 및 ara h 6;
(xxxviii) ara h 1, ara h 3, ara h 4 및 ara h 5;
(xxxix) ara h 1, ara h 2 및 ara h 4;
(xl) ara h 1, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 및 ara h 11;
(xli) ara h 1, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 및 ara h 10;
(xlii) ara h 1ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 및 ara h 9;
(xliii) ara h 1ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 및 ara h 8;
(xliv) ara h 1ara h 4, ara h 5, ara h 6 및 ara h 7;
(xlv) ara h 1ara h 4, ara h 5 및 ara h 6;
(xlvi) ara h 1ara h 4 및 ara h 5;
(xlvii) ara h 1 및 ara h 4;
(xlviii) ara h 4 등.
Ara h1, h2, h3, h4, h5, h6, h7, h8, h9, h10 및 h에 대한 아미노산 서열은 스위트-프로트 또는 EMBL 단백질 데이터베이스로부터 쉽게 입수한다. Met(M) 잔기를 코딩하는 출발 코돈 및 또한 종결 코돈을 ara h 핵산 서열로부터 제거한 후, 상기 서열을 연결시켜 ara h 단백질 중 임의의 2종 이상의 것으로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 연속 핵산 서열을 임의의 특정 순서로 형성할 것이다. 그러나, 출발 코돈은 융합 단백질 코딩 서열의 출발시에, 및 종결 코돈은 코딩된 융합 단백질의 발현 종결을 위해 요구될 것이다.
백시니아 바이러스 상동성 재조합 플라스미드 구성 : 상동성 재조합 카세트는 하기 요소들로 이루어지며, 이들 요소는 모두 라이프 테크놀러지즈의 진 아트 게엠베하(Gene Art GmbH of Life Technologies)에 의해 합성적으로 제조되었다: (i) 코펜하겐 균주의 VACV-A39R ORF의 상류 측면에 위치하는 500 bp의 좌측 상동성 재조합 아암, (ii) 백시니아 조기/후기 프로모터의 제어하에 있고, 폭스바이러스 조기 전사 정지 서열(TTTTTNT)에서 종료되는 EGFP 발현 카세트, (iii) 백시니아 조기/후기 프로모터의 제어하에 있고, 폭스바이러스 조기 전사 정지 서열(TTTTTNT)에서 종료되는 Ecogpt 발현 카세트; (iv) 상기 기술된 바와 같은 땅콩 저알레르겐 백신 항원 발현 카세트(UBc.PHAVag 또는 PHAVag), (v) 코펜하겐 균주의 VACV-A39R ORF의 하류 측면에 위치하는 500 bp 우측 상동성 재조합 아암. 상기 카세트를 나타낸 다이어그램은 도 4에서 살펴볼 수 있고, 그의 DNA 서열은 도 6 및 7에서 살펴볼 수 있다.
Both UBc.PHAV 및 PHAV 상동성 재조합 카세트를 Not I 제한 효소 부위 측면에 배치시키고, 플라스미드로 클로닝하여 클론 pTC11(UBc.PHAV) 및 pTC12(PHAV)를 형성하였다. 플라스미드는 도 8에 제시되어 있다. 상기 카세트는 합성적으로 제조된 것이기 때문에, 코딩된 아미노산 서열에는 어떤 영향도 미치지 않는 침묵 돌연변이로 파괴된 EGFP 및 Ecogpt의 단백질 코딩 서열과 함께 임의의 TTTTTNT 서열이 존재한다.
땅콩 저알레르겐 백신 항원을 발현하는 백시니아 바이러스 구성 : PHAV 발현 카세트를 상동성 재조합에 의해 백시니아 바이러스 코펜하겐 균주의 A39R ORF 내로 삽입하였다. 도 4는 A39R ORF 내의 삽입 부위를 도시한 지도를 보여주는 것이다. 간략하면, 45분 동안 BHK21 세포를 세포 1개당 0.01 pfu인 낮은 감염 다중도(moi: multiplicity of infection)로 감염시킨 후, Not I 선형화된 pTC11 또는 pTC12 플라스미드 벡터 중 하나로 세포를 형질감염시킴으로써 수행하였다. 이어서, 일단 감염이 거의 완료되고 나면, 감염/형질감염된 세포를 수거하였다. 이어서, 수거된 세포를 초음파 처리하여 바이러스 추출물을 제조하고, 크산틴, 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘의 존재하에 미코페놀산(MPA)을 이용하는 양성 선별하에서 1회차에 걸친 플라크 정제를 상기 바이러스 추출물에 대하여 실시하였다. 이어서, 순차적으로 플라크 정제된 클론을 MPA 양성 선별하에 증폭시켜 바이러스의 시드 스톡을 제조하였다. UBc.PHAVag 발현 카세트를 보유하는 재조합 백시니아 바이러스는 SCV201C로 지정하였고, PHAVag 발현 카세트를 보유하는 재조합 바이러스는 SCV202C로 지정하였다.
Ecogpt 선별 방법을 사용하여 재조합 백시니아 바이러스를 제조하는 것에 대한 상세한 프로토콜은 문헌 [Smith 1993]에서 살펴볼 수 있다. SCV201C 및 SCV202C를 제조하는 데 사용된 방법은 하기에 개요되어 있다.
상동성 재조합 : 각 바이러스 구성을 위해, 성장 배지(RPMI-1640/10% FCS/2 mM 글루타맥스/Pen-Strep)를 함유하는 3개의 T25 플라스크에 BHK21 세포를 시딩하고, 서브컨플루언트될 때까지 37℃/5% CO2에서 배양하였다. 감염 당일, 2개의 플라스크를 VACV-COP를 이용하여 0.01 pfu/세포로 감염시켰고, 나머지 다른 한 플라스크는 감염시키지 않았다(비감염 대조군). 플라스크 1 및 2를 실온에서 45 min 동안 감염시킨 후, 바이러스 접종물을 제거하고, 세포 단일층을 PBS로 2회에 걸쳐 세척하였다. 세척 후, 4 ml의 유지 배지(MM: Maintenance Medium, RPMI-1640/2% FCS/2 mM 글루타맥스/Pen-Strep)를, 이 또한 같은 세척 단계를 거친 플라스크 3을 비롯한, 각 플라스크에 첨가하였다.
이펙텐(Effectene) 형질감염 시약(퀴아젠(Qiagen), 카탈로그 번호 301425)을 사용하고, 제조사의 설명서에 따라 형질감염을 수행하였다. 간략하면, 16 ㎕의 인핸서를 150 ㎕의 EC 완충제 중 2 ㎍의 선형화된 pTC11 또는 pTC12에 첨가하고, 철저히 혼합한 후, 실온에서 5분 동안 방치하였다. 상기에 25 ㎕의 이펙텐 형질감염 시약을 첨가하고, 철저히 혼합하고, 실온에서 10분 동안 방치하였다. 최종적으로, 1 ml의 MM(RPMI-1640/2% FCS/2 mM 글루타맥스/Pen-Strep)을 첨가하고, 함께 온화하게 혼합하면서 철저히 혼합하였다. 이어서, 앞서 VACV-COP로 감염된 플라스크 1에 상기 형질감염 믹스를 첨가하였다.
플라스크 1(상동성 재조합), 플라스크 2(오직 대조군만 감염), 및 플라스크 3(비감염 대조군)을 37℃/5% CO2에서 밤새도록 인큐베이션시켰고, 그 다음날 각 플라스크의 배지를, 플라스크당 5 mL로, 25 ㎍/mL 미코페놀산(MPA), 250 ㎍/mL 크산틴 및 1X HAT(시그마(Sigma) 카탈로그 번호 H0262-10VL)를 함유하는 새 MM으로 교체하였고, 육안적 CPE를 오직 플라스크 1에서만 관찰할 수 있을 때까지 37℃/5% CO2에 추가로 인큐베이션시켰다. MPA 처리가 VACV-COP 감염 확산을 억제하였기 때문에 플라스크 2에서는 육안적 CPE 징후가 거의 없거나, 또는 전혀 없었고, 플라스크 3에서 단일층은 건강한 것으로 보였다.
플라스크 1 중 세포는 세포를 배양 배지로 스크랩핑하여 수거한 후, 저속 원심분리(실온에서 5분 동안 500 g)에 의해 펠릿화한 후, 1 mL의 10 mM 트리스-HCl(pH 8) 중에 세포 펠릿을 재현탁시켰다. 다회의 냉동 및 해동 사이클을 거쳐 바이러스 추출물을 제조한 후, 플라크 정제 단계를 위해 -80℃에서 보관하였다. 바이러스 구성물을 SCV201C(UBc.PHAV 삽입) 및 SCV202C(PHAV 삽입)로 지정하였다.
플라크 정제 프로세스 : 상동성 재조합 추출물을 일련으로 희석시키고, 각 희석액을 사용하여 MPA의 존재하에서 48 웰 플레이트 중에서 배양된 한 행의 BHK21 세포를 감염시켰다. 상기 목적은 바이러스를 1 pfu 감염/웰로 희석시키고, 감염 후 ? 30 hr 경과 후, 수거 이전에 단지 1 형광성 플라크만을 함유하는 웰을 찾고자 하는 것이었다.
BHK21 세포를 48 웰 플레이트의 각 웰에 시딩하고, 37℃/5% CO2에서 성장 배지(RPMI-1640/10% FBS/2 mM 글루타맥스/pen-strep) 중에서 100%까지 배양하였다. 이후, 배지를 25 ㎍/mL MPA, 250 ㎍/mL 크산틴 및 1x HAT(시그마 카탈로그 번호 H0262-10VL)를 함유하는 MM으로 교체하고, 밤새도록 추가로 인큐베이션시켰다.
감염을 위해, 상동성 재조합 추출물(SCV201C 및 SCV202C)를 해동시키고, 단기간 동안 초음파처리하여 럼프(lump) 및 응집체를 파괴시켰다. 1 mL 부피로 MM(RPMI/2% FBS/글루타맥스/PenStrep)을 사용하여 각 바이러스 추출물을 10-5로 10배 일련의 희석을 수생하였다. 각각의 희석을 위해, 성장 배지를 각 웰로부터 제거한 후, 48 웰 플레이트의 한 행에 100 ㎕의 희석된 바이러스를 시딩하고, PBS로 1회 세척하였다. 바이러스 흡착이 일어나도록 48 웰 플레이트를 실온에서 45분 동안 방치하였다. 바이러스 흡착 후, 각 웰로부터 바이러스 접종물을 주의하여 제거하고, 남은 접종물은 웰당 500 ㎕의 PBS로 이루어진 세척 단계에 의해 제거하였다. 세척 후, 25 ㎍/mL MPA, 250 ㎍/mL 크산틴 및 1x HAT(시그마 카탈로그 번호 H0262-10VL)를 함유하는 500 ㎕의 MM(RPMI/2% FBS/글루타맥스/PenStrep)을 각 웰에 첨가한 후, 형광 현미경하에 녹색 형광성 감염 병소를 뚜렷하게 관찰할 수 있을 때까지 37℃/CO2에서 인큐베이션시켰다.
수거를 위해, 가능한 최고 희석률의 단일 형광성 병소를 함유하는 웰만을 선택하였다. 선택된 웰로부터의 배지를 주의하여 제거하고, 100 ㎕의 10 mM 트리스HCl(pH 8)을 첨가하였다. 플레이트를 3회에 걸쳐 냉동 해동시키고, 선택된 웰의 내용물을 회수하였다.
이어서, 100% 컨플루언시의 밤새도록 25 ㎍/mL MPA, 250 ㎍/mL 크산틴 및 1x HAT(시그마 카탈로그 번호 H0262-10VL)로 전처리된 BHK21 세포를 함유하는 6 웰 플레이트 중 1 웰을 감염시킴으로써, 웰로부터 배양 배지를 제거하고, PBS 중 500 ㎕로 희석된 10 ㎕의 바이러스 추출물을 첨가함으로써 선택된 한 클론을 추가로 증폭시켰다. 실온에서 45 min 경과 후, 25 ㎍/mL MPA, 250 ㎍/mL 크산틴 및 1x HAT(시그마 카탈로그 번호 H0262-10VL)를 함유하는, 2 mL의 MM을 웰에 첨가하고, 37℃/5% CO2에서 3일 동안 세포 대다수가 형광 현미경하에서 녹색 형광을 나타낼 때까지 추가로 인큐베이션시켰다. 감염된 웰 내의 세포를 배양 배지로 스크래핑한 후, 5분 동안 500 g로 펠릿화하였다. 펠릿화된 세포를 500 ㎕의 10 mM 트리스HCl(pH 8)에 재현탁시키고, 단기간 동안 초음파처리하여 바이러스 추출물을 제조하였다.
MPA 선별하에 BHK21을 포함하는 5개의 T175 플라스크를 감염시킴으로써 추가로 증폭시키는 데 상기 추출물 중 일부를 사용하였다. 감염된 세포를 회수한 후, 이어서, 5 min 동안 500 g로 펠릿화하였다. 5개의 플라스크 모두에 대한 펠릿화된 세포를 5 mL의 10 mM 트리스HCl(pH 8)에 재현탁시키고, 단기간 동안 초음파처리하여 바이러스 추출물을 제조하였다. 이어서, 5 min 동안 500 g로 펠릿화하여 불용성 물질을 제거하였다. 이어서, 하기에 개요되는 하기 방법을 사용하여 BHK21 세포에서 상등액(바이러스 추출물)을 적정하고, PCR 분석에 의해 A39R ORF 내에 삽입된 UBc.PHAV의 존재를 확인하였다.
적정 : 24 웰 플레이트 포맷을 사용하여 적정을 수행하였다. 육안으로 관찰할 수 있는 바와 같이, 플라크는 단일층에서 크리스탈 바이오렛 대비 염색된 홀(플라크)로서 뚜렷하게 식별가능하였다.
적정하고자 하는 각 재조합 바이러스에 대하여, 하나의 24 웰 플레이트에 BHK21 세포를 시딩하고, 성장 배지(RPMI/10% FBS/글루타맥스/Pen Strep) 중에서 컨플루언시가 될 때까지 배양하였다. 적정 당일, 각 바이러스 스톡을 해동시키고, 초음파처리하여 럼프 및 클럼프를 파괴시켰다. 각 바이러스를 10-8로 PBS 중에서 일련으로 희석시켰다. 배지를 각 웰로부터 제거하고, 10-8 희석액으로부터 출발하여, 500 ㎕의 각 희석액을 24 웰 플레이트 중 일렬의 각 웰(희석액당 4개의 웰)에 첨가하고, 바이러스가 세포에 흡착되도록 실온에서 45 min 동안 방치하여 인큐베이션시켰다. 이후, 각 웰로부터 바이러스 접종물을 제거하고, 이어서, 각 웰을 PBS로 1회 세척하였다. 세척 후, MM(RPMI/2% FBS/글루타맥스/PenStrep)을 각 웰에 첨가하고, 단일층에서 플라크를 관찰할 수 있을 때까지 37℃/CO2에서 플라크를 인큐베이션시켰다. 플라크 계수기 염색을 위해, 각 웰로부터 배지를 제거하고, 500 ㎕의 크리스탈 바이올렛 용액(20% 에탄올 중 0.4% w/v)을 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 15-30 min 동안 염색을 수행한 후, 크리스탈 바이올렛 염료를 각 웰로부터 제거하고, 각 웰을 방치하여 대기 건조시킨 후, 플라크를 계수하였다. 웰당 10-30개의 계수를 생성한 희석액으로부터, 평균을 계산하였다. 이어서, 상기 값에 일련의 희석률의 역수를 곱한 후, 추가로 2를 곱하여(즉, 2 x 500 ㎕ = 1 mL) 역가(pfu/mL)를 얻었다.
C3H / HeJ 마우스에서의 SCV201C의 면역원성 검사 : SCV201C의 면역원성을 테스트하고, 유비퀴틴화된 PHAV 항원이 땅콩 단백질 특이 TH1 면역 반응을 유도할 수 있는지 여부를 측정하기 위해, 3개의 C3H/HeJ 마우스 군(각 군당 5마리의 마우스)을 하기와 같이 백신접종하였다: (i) 106 pfu의 SCV201C를 복강내로(IP) 투여, (ii) 106 pfu의 SCV000을 복강내로(IP) 투여, 및 (iii) PBS를 복강내로(IP) 투여. 백신접종 직전(채혈 전), 및 백신접종 후 17일째에 혈액 샘플을 채취하였다. 사이토카인 프로파일링을 위한 비장은 백신접종 후 9주째에 수거하였다.
가용성 땅콩 단백질 추출물 제조 : 로스팅된 무염 땅콩으로부터 가용성 땅콩 단백질을 추출하는 데 사용된 방법은 문헌 [Sachs et al. (1981)] 및 [Burks et al. (1992)]에 기술된 방법으로부터 유도된 것이었다. 로스팅된 무염 땅콩은 지방 식품점에서 구입하였다. 이어서, 너트를 블렌더에서 분쇄하여 밀(meal), 및 이어서, 버터 페이스트로 만들었다. 탈지 시약인 헥산을 첨가하여 지질/지방을 땅콩 버터로부터 제거하였다. 이를 수행하기 위해, n-헥산을 땅콩 버터에 첨가하고, 왕성하게 진탕시켜 혼합하였다. 혼합물을 유리 비이커로 옮기고, 방치하여 정치시킴으로써 용매 및 고체상을 얻었다. 용매상(추출된 지질/지방 함유)을 고체상으로부터 제거하였다. 고체상을 대기 건조시켜 케이크를 얻었다. 상기 케이크를 교반하면서 4℃에서 36시간 동안 0.1 M NH4HCO3(2 mL/그램) 중에 용해시켜 가용성 단백질을 추출하였다. 슬러리를 15 min 동안 10,000 g로 원심분리하여 고체를 제거하였다. 3500 MWCO 막/배관을 사용하여 5 mM 포스페이트 완충제(pH 7 내지 pH 8) 또는 PBS에 대하여 상등액을 투석시켰다. 투석된 용액을 4℃에서 15 min 동안 10,000 g로 원심분리하여 추출물을 정화시켰다. 표준 기법을 사용하여 가용성 추출물 중 전체 단백질 농도를 측저?였다. 생성된 가용성 단백질 추출물(10 mg/ml)을 보관을 위해 -20℃에서 유지시키고, 사용 전에 해동시켰다.
땅콩 특이 혈청 IgE 및 IgG2a 정량화: 바닥이 평평한 96 웰 EIA/RIA ELISA 플레이트(코스타(Costar))를 PBS 중 2 ㎍/웰 정제된 땅콩 추출물로 코팅하고, 37℃에서 1 hr 동안, 이어서, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 플레이트를 200 ㎕/웰 PBS로 3회에 걸쳐 세척한 후, PBS 및 0.05% 트윈과 함께 5% 탈지유로 차단시켰다. 비특이 결합을 37℃에서 1시간 이상 동안 차단시킨 후, 0.05% 트윈과 함께 PBS(PBS+TW)를 이용하여 200 ㎕/웰로 3회에 걸쳐 세척하였다. 세척 후, 혈청 샘플을 SM+PBS+TW 중에서 먼저 IgE 검정을 위해 1:100으로, 또는 IgG1 및 IgG2a 검정을 위해 1:500으로 희석시켰다. 혈청 샘플을 3개의 열에 걸쳐 일련으로 희석시켰다. 배경 대조군으로서 혈청을 함유하지 않는 다양한 웰을 방치하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.
플레이트를 200 ㎕의 PBS로 5회에 걸쳐 세척하고, SM+PBS+TW 중에 희석된 2차 항체(1:500 염소 항마우스 IgE HRP 컨쥬게이트, 알파 다이아그노스틱(Alpha Diagnostic); 1:1,000 HRP ? 항마우스 IgG2a, BD 바이오사이언시즈-BD 파민겐(BD Biosciences-BD Pharmingen))를 첨가하였다(100 ㎕/웰). 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 상기와 같이 5회에 걸쳐 세척하고, 제조사의 설명서(시그마패스트(SigmaFAST)™ OPD, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))에 따라 제조된 100 ㎕/웰의 o-페닐렌디아민디하이드로클로라이드(OPD) 기질 용액을 첨가하였다. '블랭크' 웰에서 색상이 발색되기 시작할 때(IgG1 및 IgG2a 검정법의 경우, 5분 내지 IgE 검정법의 경우, 45분 범위), 20 ㎕/웰 1MHC1로 반응을 종결시켰다. 플레이트 판독기(EL808 울트라 마이크로플레이트 리더(Ultra Microplate Reader), 바이오-테크 인스트루먼츠 인크.(Bio-tek Instruments Inc)) 상에서 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였다.
각 시점으로부터의 일련의 희석액에 대한 광학 밀도를 그래프패드프리즘(GraphPadPrisim) V5.01(그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software: 미국 캘리포니아주 샌디에고))을 사용하여 로그 스케일로 희석 인자에 대하여 플롯팅하였다. 곡선이 계산된 컷 오프 광학 밀도를 둘로 구분하는 희석률 값으로서 각 시점의 종점 역가를 측정하였다(최소 3회 실시된 채혈 전의 샘플의 표준 오차 평균(SEM: standard error mean), 그러나, 채혈 전의 모든 샘플에 대하여 측정된 최고 광학 밀도 값보다는 컸다).
통계학적 분석: 그래프패드프리즘 V5.01(그래프패드 소프트웨어: 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 통계학적 비교를 수행하였다. 본페로니(Bonferroni) 사후 검정과 함께 2원 분산 분석(ANOVA: analysis of variance)을 사용하여 ELISA 결과 간의 유의적인 차이를 도출해 내었다.
실시예 1: PHAV 항원의 유비퀴틴화는 SCV202C가 아닌, SCV201C를 성공적으로 발현시킬 수 있었다.
UBc.PHAVag 발현 카세트의 백시니아 바이러스의 A39R 내로의 삽입 후, SCV201C의 발현은 성공적으로 이루어졌다. 상동성 재조합 후, 플라크 정제 단계 동안, MPA 저항성 플라크는 뚜렷하게 확인할 수 있었고, MPA의 존재하에서 증폭시켜 마우스에서의 면역원성 검사를 수행하는 다음 단계로 진행하는 데 충분한 역가를 제공한 시드 스톡을 제조하였다.
대조적으로, 높은 희석률 범위에서는 어떤 식별가능한 플라크도 관찰할 수 없었던 것과 같이, SCV202C의 발현은 플라크 정제 단계 이후에는 진전이 어려웠다. 낮은 희석률 범위에서 형광성을 띠는 감염된 세포를 검출할 수 있었고, 상기 희석률에서 식별가능한 플라크와 달리 감염된 웰에서 오직 100%의 CPE만이 관찰되었다. 상기 웰을 수거하고, MPA의 존재하에서 추가로 증폭시켰을 때, 극소량의 바이러스 역가가 관찰되었는데, PCR 분석에 의해 측정된 바, 그중 대부분은 모체 바이러스로 이루어진 것이었고, 플라크 검정법에서는 MPA의 부재하에서는 형광성 플라크가 없는 것으로 나타났다.
감염 후 PHAVag의 발현은 바이러스 증식에 대하여 억제성 또는 독성 효과를 가졌고, 이러한 바이러스 증식은 SCV201C 구성물로 약화된 것이었다. 이론으로, 또는 특정 적용 모드로 제한하고자 하지 않으면서, 합성된 PHAVag의 억제성 또는 독성 효과는 발현된 PHAVag를 프로테아좀 분해에 표적화시키기 위해 프로테아좀 분해 태그, 예컨대, 유비퀴틴을 사용함으로써 약화되었다고 가정된다.
A39R ORF 내로 삽입된 Ecogpt 및 EFGP 발현 카세트만을 함유하는 재조합 백시니아 구성물(SCV000으로 지정)은 쉽게 수득할 수 있기 때문에, 온전한 PHAVag를 발현함으로써 바이러스 증식의 억제 효과를 추가로 확인하였다.
실시예 2: 백신접종 후 항원 특이 항체 반응
백신접종 이전 및 이후(백신접종 후 17일째)의 땅콩 단백질 특이 혈청 IgE(도 10a) 및 IgG2a(도 10b) 항체 수준, 둘 모두에 대한 결과는 도 10에 제시되어 있다. SCV201C를 이용한 백신접종은 백신접종 후 17일째 땅콩 단백질 특이 IgG2a를 유의적인 수준으로 생산한 것을 뚜렷이 관찰할 수 있다. 상기 수준은 오직 벡터만을 함유하는 대조군(SCV000) 및 PBS 대조군보다 유의적으로 더 높으며, 이는 SCV201C가 특이적인 땅콩 단백질 항체 반응을 일으킨다는 것을 입증한다. SCV201C는 IgG2a 반응과 비교하여 IgE 반응을 훨씬 더 적게 일으킨다는 것에 주목하여야 하며; 즉, IgG2a의 경우, 종점 희석률이 1:1,000,000에 달하는 것에 반해, 그와 비교하면, IgE의 경우, 종점 희석률은 1:2,500이다. 또한, IgE 반응은 공 벡터(SCV000) 또는 PBS 대조군에 의해 유도되는 반응보다 훨씬 더 크지는 않았다.
본 결과는 SCV201C가 땅콩 단백질에 대하여 IgG2a 반응은 일으키지만, IgE 반응은 거의 일으키지 않는다는 것을 나타내며, 이는 SCV201C가 PHAVag에 대한 반응으로 땅콩 특이 TH1 편향된 면역 반응을 개시하였다는 것을 시사한다.
실시예 3: 마우스에서 SCV201C 백신접종 이후의 림프구 사이토카인 프로파일
마우스로부터 비장을 수거하고, 완전 RPMI에 저장한 후, 60 mm 조직 배양 디쉬로 옮겨 놓았다. 이어서, 비장을 3개의 절편으로 절단하고, 단일 세포 현탁액으로 분해하였다. 이어서, 세포를 여과하고, 5% RPMI(300 g x 5분)로 세척하였다. 이어서, 적혈구를 5분 동안 5 ml의 알칼리성 용해 완충제 중에서 용해시킨 후, 5% RPMI를 이용하여 20 ml로 희석시키고, 5분 동안 200 g로 원심분리하였다. 이어서, 세포를 재현탁시키고, 계수하였다. 그 동안, 대조군 RPMI, 가용성 땅콩 항원(100 ㎍/ml), 및 ConA(5 ug/ml) 웰을 포함하는 96 웰 플레이트를 제조하였다. 이어서, 림프구를 400,000개의 세포/웰로 첨가하고, 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션시켰다.
96시간 동안 인큐베이션 기간이 경과한 후, 각각의 것으로부터 100 ㎕의 상등액을 수집하고, -80℃에서 냉동시켰다. 이어서, Th1/Th2 사이토카인을 유세포 측정법에 의해 제조사의 설명서에 따라(BD 바이오사이언시즈 # 551287) 정량화하였다. 이어서, 샘플을 BD FACS캔토(BD FACSCanto) II 유세포 측정기 상에 전개시켰다. 소프트 플로우 FCAP 어레이(Soft Flow FCAP Array) 소프트웨어를 사용하여 사이토카인 농도를 측정하였다. 그래프패드 6.0에서 모든 추가 분석을 수행하였다.
도 11에 제시된 결과는 SCV201C를 이용한 백신접종이 땅콩 단백질 노출에 대하여 편향된 TH1 면역 반응을 일으킨다는 것을 명확하게 나타낸다. 이는 SCV201C로 백신접종된 마우스이 비장으로부터 수득된 배양된 림프구에 의해 분비된 IL4 및 IL5 수준(TH2 사이토카인; 도 11b 및 11c)과 비교하여 IFN 감마 수준이 유의적으로 더 높다는 것으로 예시된다(IFN-g; TH1 사이토카인; 도 11a).
결론
SCV201C를 이용하여 마우스를 백신접종한 결과, 편향된 항땅콩 단백질 TH1 면역 반응이 일어났다. 알레르겐 특이 TH1 면역 반응은 현 알레르겐 특이 TH2 면역 반응에 비해 우세할 것이며, 그렇게 함으로써, 개체를 후속되는 알레르겐에의 노출에 대해 탈감작화시킬 것이다. 본원에 개시된 연구는 유비퀴틴화된 땅콩 저알레르겐 백신 항원(UBc.PHAVag)이 항땅콩 단백질 특이 TH1 면역 반응을 자극시킨다는 것을 보여준다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같이, 유비퀴틴화된 저알레르겐 백신 항원을 함유하는 백신은 개체를 땅콩 알레르겐에 대해 탈감작화시키는 데 사용될 수 있고, 따라서, 땅콩 알레르겐에의 노출에 의해 유발되는 개체에서의 알레르기성 반응을 치료 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, SCV201C 구성물의 발현은 감염 후 성공적이었던 반면, 비유비퀴틴화된 SCV202C 구성물의 발현은 플라크 정제 단계 이후에는 진전이 어려웠다. 그러므로, 감염 후 PHAVag의 발현은 바이러스 증식에 대하여 억제성 또는 독성 효과를 가지는 것으로 보이고, 이러한 바이러스 증식은 유비퀴틴화된 SCV201C로 약화된 것이었다. 이론으로, 또는 특정 적용 모드로 제한하고자 하지 않으면서, 합성된 PHAVag의 억제성 또는 독성 효과는 발현된 PHAVag를 프로테아좀 분해에 표적화시키는 유비퀴틴을 사용함으로써 약화되었다고 가정된다. PHAVag의 유비퀴틴 표적화된 프로테아좀 분해의 결과로서, PHAVag의 소형 펩티드 단편은 소포체 (ER)로 진입하여, 여기서, MHC I형 단백질과 복합체를 형성한 후, 세포 표면으로 수송되어 T 림프구에 제시된다(예를 들어, 도 9 참조). 그 결과, MHC I형을 가지는 PHAVag 단편의 제시는 증진되고, 이로써, 땅콩 알레르겐에 대한 TH1 면역 반응은 증가하게 된다. 따라서, 프로테아좀 분해 태그(예컨대, 유비퀴틴)는 예상 밖으로 인공, 온전한 PHAVag 융합 단백질이 바이러스 복제를 억제하지 못하게 막는다.
Ara h 1, ara h 2, ara h 3은 감응성 개체에서 땅콩 특이 알레르기성 반응을 유발하는 것으로 밝혀진 3종의 주요 땅콩 알레르겐이다. Ara h 6은 유아의 땅콩 알레르기에 대한 감응성과 연루되어 왔다(문헌 [Flinterman et al. 2007]). Ara h 7은 43%의 땅콩 알레르기성 개체에서 인식되고, ara h 8은 85%의 땅콩 알레르기성 개체에서 인식되고, ara h 4는 54%의 땅콩 알레르기성 개체에서 인식되고, ara h 5는 13%의 땅콩 알레르기성 개체에서 인식된다.
본원에서 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 공개 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
다수의 변형이 본 발명의 범주로부터 벗어남 없이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
참고 문헌
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
SEQUENCE LISTING <110> Sementis Pty Ltd <120> IMMUNE MODULATION <130> 902409 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Ubiquitin C monomer <400> 1 atgcagatct ttgtgaaaac actcacggga aaaactataa ctcttgaggt ggagccctct 60 gacacaatcg aaaatgtgaa agccaagatc caagataagg aaggcatccc tccagaccag 120 caacggctca tctttgcggg caaacaactg gaggatgggc gcactctcag tgattacaat 180 attcaaaagg aatctacact gcacctggtt cttaggctgc ggggagcc 228 <210> 2 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified ubiquitin C monomer <400> 2 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 50 55 60 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Ala 65 70 75 <210> 3 <211> 1875 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Ara h1 <400> 3 cgaggcagag tcagccctct gatgctgctg ttggggatct tggttcttgc atccgtttca 60 gccacacatg ccaagtccag cccataccag aaaaagaccg agaacccatg tgctcagcgg 120 tgcctccagt catgtcagca ggaacccgat gacctcaagc aaaaggcgtg tgaaagcaga 180 tgtacgaaac tggaatacga ccccagatgc gtgtacgatc cacgaggcca tactggcacc 240 accaatcaaa gatcaccacc tggcgagcga accaggggac gacagccagg ggattacgat 300 gacgatagac gacagcctcg ccgggaagag ggtgggcgct ggggtccagc cggtcccaga 360 gagcgagaac gggaagagga ctggcgccaa ccccgggagg actggcgcag accttcacac 420 cagcagcccc ggaaaatacg cccggagggc agagagggtg aacaggaatg gggaacccct 480 ggcagtcacg tcagggaaga aaccagccgg aacaacccct tctatttccc ctcccggagg 540 tttagcactc ggtacgggaa ccaaaacgga cgcattcgcg tacttcagag atttgatcaa 600 cgctcacggc agttccagaa ccttcaaaac catcggattg ttcagatcga ggccaaacca 660 aacactttgg ttctgccaaa acatgctgat gcagacaaca tactggtgat acagcagggt 720 caagccacag tgacagtagc caatgggaac aatcgcaaat cattcaatct cgatgaggga 780 cacgcactga ggatcccttc tggctttatc tcctatatac tgaatcggca cgacaatcaa 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gccttccctg gatcaggtga acaggtcgag aagctcatca aaaaccagaa ggaatcccac 1740 tttgtatctg ccagaccaca gtcacagtcc cagagcccct ctagtcccga gaaggagagc 1800 cccgaaaagg aagatcaaga ggaggagaac cagggtggaa agggcccact gctttccatt 1860 ctcaaagcct tcaat 1875 <210> 4 <211> 625 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Ara h1 <400> 4 Arg Gly Arg Val Ser Pro Leu Met Leu Leu Leu Gly Ile Leu Val Leu 1 5 10 15 Ala Ser Val Ser Ala Thr His Ala Lys Ser Ser Pro Tyr Gln Lys Lys 20 25 30 Thr Glu Asn Pro Cys Ala Gln Arg Cys Leu Gln Ser Cys Gln Gln Glu 35 40 45 Pro Asp Asp Leu Lys Gln Lys Ala Cys Glu Ser Arg Cys Thr Lys Leu 50 55 60 Glu Tyr Asp Pro Arg Cys Val Tyr Asp Pro Arg Gly His Thr Gly Thr 65 70 75 80 Thr Asn Gln Arg Ser Pro Pro Gly Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gln Pro 85 90 95 Gly Asp Tyr Asp Asp Asp Arg Arg Gln Pro Arg Arg Glu Glu Gly Gly 100 105 110 Arg Trp Gly Pro Ala Gly Pro Arg Glu Arg Glu Arg Glu Glu Asp Trp 115 120 125 Arg Gln Pro Arg Glu Asp Trp Arg Arg Pro Ser His Gln Gln Pro Arg 130 135 140 Lys 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tcagaagagg aaggggcaat cgtgacggtg 900 cgcggaggct tgcgcatcct gtcccctgac cgcaaacgca gggccgacga ggaagaagag 960 tatgacgagg atgaatatga atatgatgag gaggatcgaa ggcgcggaag gggcagtagg 1020 ggacgaggga acggcataga agaaactatt tgtaccgcgt ccgccaagaa gaatattggg 1080 cgaaaccgca gtcccgacat atacaatcct caagccggca gccttaaaac cgccaacgat 1140 ctgaacctgc tgatcctccg ctggctgggg ccaagcgccg aatatgggaa tctgtaccga 1200 aatgctctgt ttgtggccca ctacaataca aatgcccact ctattatcta ccgcctcaga 1260 gggagggctc atgtgcaagt ggtcgacagc aatgggaatc gcgtgtacga tgaggagctc 1320 caagaagggc atgtccttgt tgtgcctcag aatttcgcag ttgcgggcaa atcacagagt 1380 gagaacttcg agtacgttgc ctttaagacc gattccagac cctccattgc aaacctggcc 1440 ggagagaaca gtgttattga caatctgccg gaggaagtgg ttgctaacag ttatgggctt 1500 cagcgcgaac aggctcggca gctgaagaac aacaatccgt tcaagttttt cgtccctcca 1560 tcccagcagt cacccagagc tgtggcc 1587 <210> 8 <211> 529 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Ara h3 <400> 8 Ala Lys Leu Leu Glu Leu Ser Phe Cys Phe Cys Phe Leu Val 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atgctgatgc agacaacata ctggtgatac agcagggtca agccacagtg 960 acagtagcca atgggaacaa tcgcaaatca ttcaatctcg atgagggaca cgcactgagg 1020 atcccttctg gctttatctc ctatatactg aatcggcacg acaatcaaaa tctcagggtt 1080 gctaagatct ctatgccagt caacactccg ggtcagttcg aggatttctt tcccgcgtcc 1140 tcacgggacc agtctagtta tcttcaagga ttcagcagaa acaccttgga agcggccttt 1200 aacgccgagt ttaacgagat caggcgggtg cttctcgagg agaacgctgg cggggaacag 1260 gaggagagag gccaacggcg gtggtctacc aggtccagtg agaacaatga gggcgtgatc 1320 gtcaaggtat ctaaggagca tgtcgaggaa ctgaccaaac atgcaaagtc cgtttccaag 1380 aaaggctccg aggaggaagg ggacattacg aatccgatca accttcggga gggcgagccg 1440 gatctgtcaa ataactttgg aaaactcttc gaagtcaagc ccgacaaaaa gaatccgcag 1500 ttgcaagatc tggacatgat gctcacgtgt gtcgagatta aggaaggagc actgatgttg 1560 cctcacttta actccaaagc catggtgata gtcgtagtaa acaaaggaac cggcaatctg 1620 gagttggtgg ctgtccgaaa ggaacaacag caaagagggc ggagggaaga agaggaagat 1680 gaggacgagg aggaggaggg atcaaaccgg gaggtacgcc gatacacagc gaggctgaaa 1740 gagggagacg tgtttatcat gccggcagca catcctgtcg ctatcaacgc ctctagcgag 1800 ctccatttgc tggggttcgg gatcaatgcg gagaacaatc atcgcatttt cctggcaggc 1860 gacaaggaca acgttattga ccaaattgag aagcaagcca aggacctggc cttccctgga 1920 tcaggtgaac aggtcgagaa gctcatcaaa aaccagaagg aatcccactt tgtatctgcc 1980 agaccacagt cacagtccca gagcccctct agtcccgaga aggagagccc cgaaaaggaa 2040 gatcaagagg aggagaacca gggtggaaag ggcccactgc tttccattct caaagccttc 2100 aatgctaagc tgacaatatt ggtggcactg gcactgttcc ttcttgctgc acacgcgtca 2160 gcccggcagc agtgggaatt gcagggcgat cgaaggtgtc agtcacagct ggagagggcg 2220 aacctccggc cttgtgaaca gcacctgatg cagaagattc agcgggacga ggattcttac 2280 gggcgagatc cttacagtcc ctcccaagat ccatatagcc cgtctcaaga cccagatcgc 2340 agggacccat atagccccag cccctatgat cgaagaggtg ccggaagcag ccagcatcag 2400 gaaaggtgct gcaatgagct gaacgagttc gagaacaacc agagatgtat gtgcgaggct 2460 ctgcagcaga ttatggaaaa tcaatctgac cggctgcagg gacggcagca ggagcagcag 2520 ttcaaaaggg agctccgcaa ccttccacag cagtgcggtt tgcgcgcacc tcagcgctgc 2580 gacttggagg 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aggcattcca agtagatgac agacagatcg tccagaacct taggggcgag 3480 actgaatcag aagaggaagg ggcaatcgtg acggtgcgcg gaggcttgcg catcctgtcc 3540 cctgaccgca aacgcagggc cgacgaggaa gaagagtatg acgaggatga atatgaatat 3600 gatgaggagg atcgaaggcg cggaaggggc agtaggggac gagggaacgg catagaagaa 3660 actatttgta ccgcgtccgc caagaagaat attgggcgaa accgcagtcc cgacatatac 3720 aatcctcaag ccggcagcct taaaaccgcc aacgatctga acctgctgat cctccgctgg 3780 ctggggccaa gcgccgaata tgggaatctg taccgaaatg ctctgtttgt ggcccactac 3840 aatacaaatg cccactctat tatctaccgc ctcagaggga gggctcatgt gcaagtggtc 3900 gacagcaatg ggaatcgcgt gtacgatgag gagctccaag aagggcatgt ccttgttgtg 3960 cctcagaatt tcgcagttgc gggcaaatca cagagtgaga acttcgagta cgttgccttt 4020 aagaccgatt ccagaccctc cattgcaaac ctggccggag agaacagtgt tattgacaat 4080 ctgccggagg aagtggttgc taacagttat gggcttcagc gcgaacaggc tcggcagctg 4140 aagaacaaca atccgttcaa gtttttcgtc cctccatccc agcagtcacc cagagctgtg 4200 gccgccaaat ccactattct tgtggccctc ttggcactcg tgctggtcgc ccatgcttct 4260 gctatgcgaa gggagagagg gcgccaaggt gactcaagca gttgcgaacg acaagtggac 4320 agagtgaacc tcaaaccttg cgaacagcac attatgcaga gaattatggg agagcaagag 4380 cagtatgata gttatgatat cagatcaaca cgctcttccg atcagcaaca gcggtgttgc 4440 gatgaactca acgaaatgga gaatacgcag cggtgcatgt gtgaggctct tcagcaaatc 4500 atggaaaacc aatgcgatcg gctccaagat cgacagatgg tgcagcagtt taagcgcgag 4560 ctgatgaatt tgccacaaca gtgcaacttt cgggctcccc agagatgcga cctcgatgtc 4620 agcggaggga gatgctaa 4638 <210> 12 <211> 1545 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PHAVag sequence <400> 12 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 50 55 60 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Ala Arg Gly Arg Val 65 70 75 80 Ser Pro Leu Met Leu Leu Leu Gly Ile Leu Val Leu Ala Ser Val Ser 85 90 95 Ala Thr His Ala Lys Ser Ser Pro Tyr Gln Lys Lys Thr Glu Asn Pro 100 105 110 Cys Ala Gln Arg Cys Leu Gln Ser Cys Gln Gln Glu Pro Asp Asp Leu 115 120 125 Lys Gln Lys Ala Cys Glu Ser Arg Cys Thr Lys Leu Glu Tyr Asp Pro 130 135 140 Arg Cys Val Tyr Asp Pro Arg Gly His Thr Gly Thr Thr Asn Gln Arg 145 150 155 160 Ser Pro Pro Gly Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gln Pro Gly Asp Tyr Asp 165 170 175 Asp Asp Arg Arg Gln Pro Arg Arg Glu Glu Gly Gly Arg Trp Gly Pro 180 185 190 Ala Gly Pro Arg Glu Arg Glu Arg Glu Glu Asp Trp Arg Gln Pro Arg 195 200 205 Glu Asp Trp Arg Arg Pro Ser His Gln Gln Pro Arg Lys Ile Arg Pro 210 215 220 Glu Gly Arg Glu Gly Glu Gln Glu Trp Gly Thr Pro Gly Ser His Val 225 230 235 240 Arg Glu Glu Thr Ser Arg Asn Asn Pro Phe Tyr Phe Pro Ser Arg Arg 245 250 255 Phe Ser Thr Arg Tyr Gly Asn Gln Asn Gly Arg Ile Arg Val Leu Gln 260 265 270 Arg Phe Asp Gln Arg Ser Arg Gln Phe Gln Asn Leu Gln Asn His Arg 275 280 285 Ile Val Gln Ile Glu Ala Lys Pro Asn Thr Leu Val Leu Pro Lys His 290 295 300 Ala Asp Ala Asp Asn Ile Leu Val Ile Gln Gln Gly Gln Ala Thr Val 305 310 315 320 Thr Val Ala Asn Gly Asn Asn Arg Lys Ser Phe Asn Leu Asp Glu Gly 325 330 335 His Ala Leu Arg Ile Pro Ser Gly Phe Ile Ser Tyr Ile Leu Asn Arg 340 345 350 His Asp Asn Gln Asn Leu Arg Val Ala Lys Ile Ser Met Pro Val Asn 355 360 365 Thr Pro Gly Gln Phe Glu Asp Phe Phe Pro Ala Ser Ser Arg Asp Gln 370 375 380 Ser Ser Tyr Leu Gln Gly Phe Ser Arg Asn Thr Leu Glu Ala Ala Phe 385 390 395 400 Asn Ala Glu Phe Asn Glu Ile Arg Arg Val Leu Leu Glu Glu Asn Ala 405 410 415 Gly Gly Glu Gln Glu Glu Arg Gly Gln Arg Arg Trp Ser Thr Arg Ser 420 425 430 Ser Glu Asn Asn Glu Gly Val Ile Val Lys Val Ser Lys Glu His Val 435 440 445 Glu Glu Leu Thr Lys His Ala Lys Ser Val Ser Lys Lys Gly Ser Glu 450 455 460 Glu Glu Gly Asp Ile Thr Asn Pro Ile Asn Leu Arg Glu Gly Glu Pro 465 470 475 480 Asp Leu Ser Asn Asn Phe Gly Lys Leu Phe Glu Val Lys Pro Asp Lys 485 490 495 Lys Asn Pro Gln Leu Gln Asp Leu Asp Met Met Leu Thr Cys Val Glu 500 505 510 Ile Lys Glu Gly Ala Leu Met Leu Pro His Phe Asn Ser Lys Ala Met 515 520 525 Val Ile Val Val Val Asn Lys Gly Thr Gly Asn Leu Glu Leu Val Ala 530 535 540 Val Arg Lys Glu Gln Gln Gln Arg Gly Arg Arg Glu Glu Glu Glu Asp 545 550 555 560 Glu Asp Glu Glu Glu Glu Gly Ser Asn Arg Glu Val Arg Arg Tyr Thr 565 570 575 Ala Arg Leu Lys Glu Gly Asp Val Phe Ile Met Pro Ala Ala His Pro 580 585 590 Val Ala Ile Asn Ala Ser Ser Glu Leu His Leu Leu Gly Phe Gly Ile 595 600 605 Asn Ala Glu Asn Asn His Arg Ile Phe Leu Ala Gly Asp Lys Asp Asn 610 615 620 Val Ile Asp Gln Ile Glu Lys Gln Ala Lys Asp Leu Ala Phe Pro Gly 625 630 635 640 Ser Gly Glu Gln Val Glu Lys Leu Ile Lys Asn Gln Lys Glu Ser His 645 650 655 Phe Val Ser Ala Arg Pro Gln Ser Gln Ser Gln Ser Pro Ser Ser Pro 660 665 670 Glu Lys Glu Ser Pro Glu Lys Glu Asp Gln Glu Glu Glu Asn Gln Gly 675 680 685 Gly Lys Gly Pro Leu Leu Ser Ile Leu Lys Ala Phe Asn Ala Lys Leu 690 695 700 Thr Ile Leu Val Ala Leu Ala Leu Phe Leu Leu Ala Ala His Ala Ser 705 710 715 720 Ala Arg Gln Gln Trp Glu Leu Gln Gly Asp Arg Arg Cys Gln Ser Gln 725 730 735 Leu Glu Arg Ala Asn Leu Arg Pro Cys Glu Gln His Leu Met Gln Lys 740 745 750 Ile Gln Arg Asp Glu Asp Ser Tyr Gly Arg Asp Pro Tyr Ser Pro Ser 755 760 765 Gln Asp Pro Tyr Ser Pro Ser Gln Asp Pro Asp Arg Arg Asp Pro Tyr 770 775 780 Ser Pro Ser Pro Tyr Asp Arg Arg Gly Ala Gly Ser Ser Gln His Gln 785 790 795 800 Glu Arg Cys Cys Asn Glu Leu Asn Glu Phe Glu Asn Asn Gln Arg Cys 805 810 815 Met Cys Glu Ala Leu Gln Gln Ile Met Glu Asn Gln Ser Asp Arg Leu 820 825 830 Gln Gly Arg Gln Gln Glu Gln Gln Phe Lys Arg Glu Leu Arg Asn Leu 835 840 845 Pro Gln Gln Cys Gly Leu Arg Ala Pro Gln Arg Cys Asp Leu Glu Val 850 855 860 Glu Ser Gly Gly Arg Asp Arg Tyr Ala Lys Leu Leu Glu Leu Ser Phe 865 870 875 880 Cys Phe Cys Phe Leu Val Leu Gly Ala Ser Ser Ile Ser Phe Arg Gln 885 890 895 Gln Pro Glu Glu Asn Ala Cys Gln Phe Gln Arg Leu Asn Ala Gln Arg 900 905 910 Pro Asp Asn Arg Ile Glu Ser Glu Gly Gly Tyr Ile Glu Thr Trp Asn 915 920 925 Pro Asn Asn Gln Glu Phe Glu Cys Ala Gly Val Ala Leu Ser Arg Leu 930 935 940 Val Leu Arg Arg Asn Ala Leu Arg Arg Pro Phe Tyr Ser Asn Ala Pro 945 950 955 960 Gln Glu Ile Phe Ile Gln Gln Gly Arg Gly Tyr Phe Gly Leu Ile Phe 965 970 975 Pro Gly Cys Pro Arg His Tyr Glu Glu Pro His Thr Gln Gly Arg Arg 980 985 990 Ser Gln Ser Gln Arg Pro Pro Arg Arg Leu Gln Gly Glu Asp Gln Ser 995 1000 1005 Gln Gln Gln Arg Asp Ser His Gln Lys Val His Arg Phe Asp Glu 1010 1015 1020 Gly Asp Leu Ile Ala Val Pro Thr Gly Val Ala Phe Trp Leu Tyr 1025 1030 1035 Asn Asp His Asp Thr Asp Val Val Ala Val Ser Leu Thr Asp Thr 1040 1045 1050 Asn Asn Asn Asp Asn Gln Leu Asp Gln Phe Pro Arg Arg Phe Asn 1055 1060 1065 Leu Ala Gly Asn Thr Glu Gln Glu Phe Leu Arg Tyr Gln Gln Gln 1070 1075 1080 Ser Arg Gln Ser Arg Arg Arg Ser Leu Pro Tyr Ser Pro Tyr Ser 1085 1090 1095 Pro Gln Ser Gln Pro Arg Gln Glu Glu Arg Glu Phe Ser Pro Arg 1100 1105 1110 Gly Gln His Ser Arg Arg Glu Arg Ala Gly Gln Glu Glu Glu Asn 1115 1120 1125 Glu Gly Gly Asn Ile Phe Ser Gly Phe Thr Pro Glu Phe Leu Glu 1130 1135 1140 Gln Ala Phe Gln Val Asp Asp Arg Gln Ile Val Gln Asn Leu Arg 1145 1150 1155 Gly Glu Thr Glu Ser Glu Glu Glu Gly Ala Ile Val Thr Val Arg 1160 1165 1170 Gly Gly Leu Arg Ile Leu Ser Pro Asp Arg Lys Arg Arg Ala Asp 1175 1180 1185 Glu Glu Glu Glu Tyr Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Tyr Asp Glu Glu 1190 1195 1200 Asp Arg Arg Arg Gly Arg Gly Ser Arg Gly Arg Gly Asn Gly Ile 1205 1210 1215 Glu Glu Thr Ile Cys Thr Ala Ser Ala Lys Lys Asn Ile Gly Arg 1220 1225 1230 Asn Arg Ser Pro Asp Ile Tyr Asn Pro Gln Ala Gly Ser Leu Lys 1235 1240 1245 Thr Ala Asn Asp Leu Asn Leu Leu Ile Leu Arg Trp Leu Gly Pro 1250 1255 1260 Ser Ala Glu Tyr Gly Asn Leu Tyr Arg Asn Ala Leu Phe Val Ala 1265 1270 1275 His Tyr Asn Thr Asn Ala His Ser Ile Ile Tyr Arg Leu Arg Gly 1280 1285 1290 Arg Ala His Val Gln Val Val Asp Ser Asn Gly Asn Arg Val Tyr 1295 1300 1305 Asp Glu Glu Leu Gln Glu Gly His Val Leu Val Val Pro Gln Asn 1310 1315 1320 Phe Ala Val Ala Gly Lys Ser Gln Ser Glu Asn Phe Glu Tyr Val 1325 1330 1335 Ala Phe Lys Thr Asp Ser Arg Pro Ser Ile Ala Asn Leu Ala Gly 1340 1345 1350 Glu Asn Ser Val Ile Asp Asn Leu Pro Glu Glu Val Val Ala Asn 1355 1360 1365 Ser Tyr Gly Leu Gln Arg Glu Gln Ala Arg Gln Leu Lys Asn Asn 1370 1375 1380 Asn Pro Phe Lys Phe Phe Val Pro Pro Ser Gln Gln Ser Pro Arg 1385 1390 1395 Ala Val Ala Ala Lys Ser Thr Ile Leu Val Ala Leu Leu Ala Leu 1400 1405 1410 Val Leu Val Ala His Ala Ser Ala Met Arg Arg Glu Arg Gly Arg 1415 1420 1425 Gln Gly Asp Ser Ser Ser Cys Glu Arg Gln Val Asp Arg Val Asn 1430 1435 1440 Leu Lys Pro Cys Glu Gln His Ile Met Gln Arg Ile Met Gly Glu 1445 1450 1455 Gln Glu Gln Tyr Asp Ser Tyr Asp Ile Arg Ser Thr Arg Ser Ser 1460 1465 1470 Asp Gln Gln Gln Arg Cys Cys Asp Glu Leu Asn Glu Met Glu Asn 1475 1480 1485 Thr Gln Arg Cys Met Cys Glu Ala Leu Gln Gln Ile Met Glu Asn 1490 1495 1500 Gln Cys Asp Arg Leu Gln Asp Arg Gln Met Val Gln Gln Phe Lys 1505 1510 1515 Arg Glu Leu Met Asn Leu Pro Gln Gln Cys Asn Phe Arg Ala Pro 1520 1525 1530 Gln Arg Cys Asp Leu Asp Val Ser Gly Gly Arg Cys 1535 1540 1545

Claims (25)

  1. (i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 및 ara h 11 및 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 땅콩 알레르겐, 및 (ii) 융합 단백질의 세포내 분해를 증진시키기 위한 프로테아좀 분해 태그를 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폭스바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 핵산 서열이 (i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 및 ara h 7, 및 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부로 이루어진 목록으로부터 선택되는 2종 이상의 땅콩 알레르겐, 및 (ii) 융합 단백질의 세포내 분해를 증진시키기 위한 프로테아좀 분해 태그를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 것인 폭스바이러스 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 핵산 서열이 (i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 및 ara h 11 및 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부로 이루어진 군으로부터 선택되는 3종 이상의 땅콩 알레르겐, 및 (ii) 융합 단백질의 세포내 분해를 증진시키기 위한 프로테아좀 분해 태그를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 것인 폭스바이러스 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 핵산 서열이 (i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 및 ara h 7, 및 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부로 이루어진 군으로부터 선택되는 3종 이상의 땅콩 알레르겐, 및 (ii) 융합 단백질의 세포내 분해를 증진시키기 위한 프로테아좀 분해 태그를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 것인 폭스바이러스 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 온전한 융합 단백질의 발현을 촉진하기 위해 프로모터 및 단일 출발 코돈을 포함하는 것인 폭스바이러스 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아좀 분해 태그가 유비퀴틴 단량체를 포함하는 것인 폭스바이러스 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 ara h 1, ara h 2, ara h 3, 및 ara h 6, 또는 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부인 4종의 땅콩 알레르겐을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 것인 폭스바이러스 벡터.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열 또는 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부를 포함하는 것인 폭스바이러스 벡터.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 폭스바이러스 벡터가 서열 번호 11에 기재된 핵산 서열 또는 그와 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 그의 유도체 또는 일부를 포함하는 것인 폭스바이러스 벡터.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 유비퀴틴 단량체가 서열 번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 그와 70% 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 그의 유도체를 포함하는 것인 폭스바이러스 벡터.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아좀 분해 태그가 유비퀴틴 C를 포함하는 것인 폭스바이러스 벡터.
  12. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 땅콩 알레르겐 ara h 1, ara h 2, ara h 3 및 ara h 6을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 것인 폭스바이러스 벡터.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 폭스바이러스 벡터가 백시니아 벡터인 폭스바이러스 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 폭스바이러스 벡터가 변형된 백시니아 벡터 또는 조류폭스 벡터인 폭스바이러스 벡터.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 폭스바이러스 벡터.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체에서 땅콩 알레르기 치료에 사용하기 위한 것인 폭스바이러스 벡터.
  17. 땅콩 알레르기 치료 또는 땅콩 알레르기 치료용 의약의 제조에 있어서의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 폭스바이러스 벡터의 용도.
  18. 피험체 또는 환자에서 알레르기 반응에 대한 내성을 유도하거나 알레르기 반응을 억제하는 방법으로서, 억제/내성을 유도하는 데 충분한 시간 동안 충분한 조건 하에서 피험체 또는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폭스바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 땅콩 알레르겐에 대한 내성을 유도하기 위해 피험체에게 백신접종하는 방법으로서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폭스바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  20. 2종 이상 또는 3종 이상의 주요 땅콩 알레르겐에 대한 내성을 유도하기 위한 제15항의 용도 또는 제18항 또는 제19항의 방법.
  21. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폭스바이러스 벡터를 포함하는 키트.
  22. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 피험체에서 사용하기 위한 폭스바이러스 벡터.
  23. 제22항에서 있어서, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 것인 폭스바이러스 벡터.
  24. 피험체에서 땅콩 알레르겐에 대해 탈감작화시키거나 땅콩 알레르겐에 대한 내성을 유도하는 방법으로서, i) 피험체로부터 림프구를 수집하는 단계; ii) 생체외에서 상기 림프구를 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폭스바이러스 벡터로 형질감염된 세포와 함께 공동 배양하여, 세포 상의 MHC I형 분자와 회합된, 프로테아좀에 의해 분해된 땅콩 알레르겐 융합 단백질을 인식하는 TH1 림프구 집단을 생성하고/하거나 증식시키는 단계; 및 iii) (ii)로부터의 TH1 림프구 집단을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 피험체에서 땅콩 알레르겐에 대해 탈감작화시키거나 땅콩 알레르겐에 대한 내성을 유도하는 방법으로서, i) 피험체로부터 미감작 항원 제시 세포를 수집하는 단계; ii) 생체외에서 상기 항원 제시 세포를 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폭스바이러스 벡터로 형질감염된 세포와 함께 공동 배양하여, 세포 상의 MHC I형 분자와 회합된, 프로테아좀에 의해 분해된 땅콩 알레르겐 융합 단백질을 인식하는 활성화된 항원 제시 세포의 집단을 생성하는 단계; 및 iii) (ii)로부터의 활성화된 항원 제시 세포 집단을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
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