ES2909750T3 - Modulación inmunitaria - Google Patents

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Abstract

Un vector poxviral que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende (i) al menos los siguientes alérgenos de cacahuete - ara h 1 según SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 4 en toda la longitud de SEQ ID NO: 4, - ara h 2 según SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 6 en toda la longitud de SEQ ID NO: 6, - ara h 3 según SEQ ID NO: 8, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 8 en toda la longitud de SEQ ID NO: 8, - ara h 6 según SEQ ID NO: 10, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 10 en toda la longitud de SEQ ID NO: 10, y (ii) un marcador de la degradación proteasómica que es ubiquitina; en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión está optimizada codónicamente para la expresión en células humanas.

Description

DESCRIPCIÓN
Modulación inmunitaria
CAMPO TÉCNICO
La presente memoria descriptiva se refiere generalmente al campo de las vacunas profilácticas o terapéuticas. En particular, la memoria descriptiva se refiere a una vacuna para el tratamiento de las alergias a los cacahuetes al suprimir la respuesta alérgica a los mismos.
ANTECEDENTES
En principio, las enfermedades alérgicas son trastornos de sistema inmunitario asociados con una desregulación de los subgrupos de linfocitos Th1 y Th2 [de Vries y cols. 1999, Parronchi y cols. 1999, Singh y cols. 1999]. Se ha postulado que con una incidencia descendente de las enfermedades infecciosas debido a la vacunación, el uso de antibióticos y otras prácticas de salud pública, se ha perdido una fuente importante de provocación inmunitaria de Th1, con un incremento consiguiente en la tendencia a Th2 de las respuestas inmunitarias hacia alérgenos ambientales [Holgate 1999, Shaheen y cols. 1996].
De las diversas enfermedades alérgicas que afectan a la población general, la anafilaxis inducida por cacahuetes es particularmente grave y representa el factor contribuyente más común de las admisiones en los servicios de urgencias para el tratamiento de reacciones anafilácticas.
Las alergias a los cacahuetes resultan de una respuesta inmunitaria aberrante orientada contra un antígeno ambiental por lo demás inocuo. El documento WO 2007/104581 A1 menciona un ácido nucleico que codifica alérgenos, fragmentos o mutantes homólogos procedentes de diferentes organismos o especies. El documento WO 2007/104581 A1 también menciona los alérgenos de los cacahuetes entre muchos alérgenos diferentes. Liu Y y cols., J. Allergy Clin Immunol., (2013), vol. 131, n° 1, páginas 213 - 221 divulga un bloqueo de la alergia a los cacahuetes con una proteína de fusión de Ara h 2-Fcgamma en ratones. Zhuang, Y. y Dreskin, S. y cols. 2012 "Redefining the major peanut allergen", p. 125 - 134, divulga criterios según los cuales Ara h2 y Ara h6 son importantes alérgenos del cacahuete. La alergia y la anafilaxis por cacahuetes están centradas alrededor de una respuesta inmunitaria tipo 2, caracterizada por la generación de células T Th2 y células B que secretan anticuerpos de IgE. En contraste, una respuesta inmunitaria de tipos 1 se puede caracterizar por anticuerpos predominantemente de IgG (isotipo IgG2a en ratones), activación de células NK y células fagocíticas y el desarrollo de linfocitos T citotóxicos (CTL). Las respuestas tanto de tipo 1 como 2 son coordinadas por células T cooperadoras, que se diferencian en varios subgrupos funcionalmente diferentes incluyendo linfocitos Th1 y Th2. Estos subgrupos se caracterizan por su perfil de secreción de citocinas [Mosmann y cols. 1989], donde las células Th1 producen IFN-gamma y las células Th2 secretan típicamente IL-4, IL-5 e IL-13.
Los alérgenos de cacahuete ingeridos oralmente se encuentran en primer lugar el sistema inmunitario mucoso intestinal. Las células microplegadas (M) son células asociadas al folículo especializadas que revisten el epitelio del tracto gastrointestinal y están en estrecha proximidad con las placas de Peyer. Son responsables de la inducción de respuestas inmunitarias asociadas al intestino tolerizantes y/o protectoras. La sensibilización a alérgenos alimentarios se produce cuando antígenos alimentarios exógenos son recogidos por células M y a continuación son presentados a macrófagos y células dendríticas (DCs) [DeLong y cols. 2011]. Una vez internalizados por macrófagos y DCs, los antígenos son endocitosados, a continuación desnaturalizados y degradados en péptidos de una longitud de alrededor de 12-20 aminoácidos. A continuación, una pequeña fracción de estos fragmentos peptídicos pequeños es transportada intracelularmente y presentada sobre moléculas del MHC clase II de la superficie celular para la interacción específica con células T CD4+. Estas células T CD4+ activadas se expanden posteriormente en número y liberan citocinas de Th2. Las células Th2, IL-4 e IL-5 promueven la diferenciación de células B, que portan alérgenos unidos a receptores inmunoglobulínicos (Ig) superficiales, en células que secretan anticuerpos de IgE específicos de alérgenos [Turcanu y cols. 2010]. Estas células B productoras de IgE se expanden a continuación en número y se convierten en células plasmáticas que secretan continuamente anticuerpos de IgE específicos de alérgenos. La exposición ambiental a cacahuetes da como resultado una unión de alérgenos de cacahuete al revestimiento de IgE específico sobre mastocitos y basófilos. Posteriormente, la reticulación de receptores de Fc proporciona un potente estímulo de activación que da como resultado la desgranulación de basófilos y mastocitos, que rápidamente liberan una variedad de compuestos proinflamatorios y vasoactivos preformados tales como prostaglandinas, leucotrienos, serina proteasas, histamina y citocinas en el líquido extracelular para producir una respuesta inflamatoria [Sicherer y cols. 2010], todos los cuales culminan en la manifestación clínica de una reacción alérgica aguda [Long 2002].
Síntomas locales de la alergia a los cacahuetes incluyen dolor abdominal, vómitos, cólicos y diarrea, y son comunes incluso en casos de alergia leve a los cacahuetes. Esta reacción aguda no potencialmente letal provoca un incremento transitorio en la permeabilidad intestinal, que permite posteriormente la distribución sistémica de macromoléculas, tales como alérgenos de cacahuete enteros, exacerbando la respuesta alérgica a una exposición posterior a alérgenos de cacahuete, lo que puede provocar reacciones anafilácticas potencialmente letales [Sanderson y cols. 1993].
A diferencia de la inmunoterapia tradicional para las reacciones alérgicas a pólenes de gramíneas, ácaros del polvo y veneno por picaduras de abeja, las inyecciones subcutáneas de desensibilización de extractos de cacahuete tienen riesgo-beneficios inaceptables [Oppenheimer y cols. 1992]. Por lo tanto, en la actualidad, evitar los cacahuetes es el único método disponible para prevenir reacciones adicionales. Sin embargo, la evitación estricta a menudo es una estrategia poco realista para muchos individuos, particularmente en vista de la exposición accidental a cacahuetes que se produce a menudo a través de la ingestión de alimentos procesados o alimentos preparados en la misma zona que los que contienen cacahuetes, p. ej., restaurantes, colegios, zonas de restauración y comedores de trabajo. Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad de una estrategia terapéutica eficaz para el tratamiento y la prevención de la alergia a los cacahuetes.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un aspecto de la presente invención, se proporciona un vector poxviral que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende (i) al menos los alérgenos de cacahuete ara h 1, ara h 2, ara h 3 y ara h 6 según se definen en la reivindicación 1, y (ii) un marcador de la degradación proteasómica que es ubiquitina, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión está optimizada codónicamente para la expresión en células humanas. El marcador de la degradación proteasómica potencia la degradación intracelular de la proteína de fusión.
En aspectos preferidos, el vector poxviral que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende (i) al menos dos alérgenos de cacahuete seleccionados de la lista que consiste en ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h10 y ara h 11 y una de sus secuencias de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la misma, y (ii) un marcador de la degradación proteasómica para potenciar la degradación intracelular de la proteína de fusión.
En otro aspecto, se proporciona un vector poxviral que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende: (i) al menos tres alérgenos de cacahuete seleccionados de la lista que consiste en ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 y ara h 7 y una secuencia de aminoácidos de cualquiera de estos alérgenos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la misma, y (ii) un marcador de la degradación proteasómica para potenciar la degradación intracelular de la proteína de fusión.
En otro aspecto preferido, se proporciona un vector poxviral que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende: (i) al menos tres alérgenos de cacahuete seleccionados de la lista que consiste en ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h10 y ara h 11 y una secuencia de aminoácidos de cualquiera de estos alérgenos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la misma, y (ii) un marcador de la degradación proteasómica para potenciar la degradación intracelular de la proteína de fusión.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un vector poxviral como el reivindicado para el uso en la prevención o el tratamiento de la alergia a los cacahuetes.
Parte de la presente divulgación es un método para inducir tolerancia a o suprimir una respuesta alérgica en un sujeto o paciente, comprendiendo el método administrar al sujeto o paciente una cantidad eficaz del vector poxviral divulgado en la presente durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para provocar supresión/tolerancia.
Parte de la presente divulgación es un método para vacunar a un sujeto para inducir tolerancia a un alérgeno de cacahuete que comprende administrar el vector poxviral divulgado en la presente.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un estuche que comprende el vector poxviral de la invención. También se proporciona una célula ex vivo y un producto farmacéutico. También se proporciona una célula ex vivo y una composición farmacéutica como las definidas en las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra una disposición del antígeno PHAV según una realización de la presente invención incluyendo un marcador de la degradación proteasómica y múltiples alérgenos de cacahuete (Figuras 1A y B) y el antígeno PHAV según una realización de la presente invención sin un marcador de la degradación proteasómica (Figura 1C).
La Figura 2 muestra la secuencia de ácido nucleico del casete de expresión UBc.PHAV.
La Figura 3 muestra la secuencia de ácido nucleico del casete de expresión de la construcción PHAVag, sin la secuencia de ubiquitina.
La Figura 4 es una representación esquemática de la inserción de los casetes de expresión de PHAV en el ORF A39R de la cepa de Copenhague de virus variolovacunal mediante recombinación homóloga.
La Figura 5 lista las características del casete de recombinación homóloga representado esquemáticamente en la Figura 4.
La Figura 6 muestra la secuencia de ácido nucleico del casete de recombinación homóloga UBc.PHAV. La Figura 7 muestra la secuencia de ácido nucleico del casete de recombinación homóloga PHAV.
La Figura 8 es una representación esquemática del pTC11 (UBc.PHAV) y pTC12 (PHAV). Los plásmidos se muestran en la Figura 8.
La Figura 9 es una representación esquemática de la ruta de degradación proteasómica en una célula. La Figura 10 muestra los niveles de anticuerpos IgE (Figura 10A) y IgG2a (Figura 10B) séricos específicos de proteína de cacahuete antes y después de la vacunación (17 días después de la vacunación) con el vector vacío (SCV000) o el vector UBc.PHAV (SCV201C); *=p<0,05.
La Figura 11 muestra los niveles de IFN-gamma (IFN-g; una citocina de Th1 ; Figura 11A), IL4 (citocinas de Th2; Figura 11B) e IL5 (citocinas de Th2; Figuras 11C) secretados por linfocitos cultivados obtenidos de los bazos de ratones vacunados SCV000 y SCV201C.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Una referencia a cualquier técnica anterior en esta memoria descriptiva no es, y no se debe tomar como, un conocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forme parte del conocimiento general común en cualquier país.
A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que las palabras "comprenden", "comprende" y "que comprende" implicarán la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos indicados pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos. Así, el uso del término "que comprende" y similares indica que los elementos listados se requieren o son obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden estar presentes o no. Por "que consiste en” se entiende incluyendo, y limitado a, lo que siga a la expresión "que consiste en”. Así, la expresión "que consiste en” indica que los elementos listados se requieren o son obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos. Por "que consiste esencialmente en” se entiende que incluye cualesquiera elementos listados después de la expresión, y limitados a otros elementos que no interfieran con o contribuyan a la actividad o la acción especificada en la divulgación para los elementos listados. Así, la expresión "que consiste esencialmente en” indica que los elementos listados se requieren o son obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden estar presentes o no dependiendo de si afectan o no a la actividad o la acción de los elementos listados.
Según se usan en la presente, las formas singulares "un", "uno/a" y "el/la" incluyen aspectos plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a "una composición" incluye una sola composición, así como dos o más composiciones; la referencia a "un agente" incluye un agente, así como dos o más agentes; la referencia a "la invención" incluye aspectos individuales y múltiples de la invención; etc.
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen los mismos significados que se entienden comúnmente por un experto normal en la técnica a la que pertenece esta invención. Cualesquiera materiales y métodos similares o equivalentes a los descritos en la presente se pueden usar para poner en práctica o probar la presente invención.
La presente memoria descriptiva permite un enfoque vacunal para el desarrollo de un agente terapéutico para tratar o prevenir la alergia a los cacahuetes. En particular, la memoria descriptiva hace posible un agente capaz de proporcionar terapia en el contexto de los principales alérgenos de cacahuete, p. ej., al menos uno, al menos dos, al menos tres, etc., de los alérgenos de cacahuete más extendidos o problemáticos.
La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de los inventores de que una vacuna de ADN que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica operativamente una proteína de fusión, comprendiendo la proteína de fusión un alérgeno de cacahuete (tal como ara h 1) ligado a un marcador de la degradación proteasómica (tal como ubiquitina), es capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto que está sesgada hacia un fenotipo Th1, dando como resultado así la secreción de anticuerpos de IgG específicos del alérgeno de cacahuete, en oposición a anticuerpos de IgE específicos del alérgeno de cacahuete que por el contrario facilitarían una reacción alérgica tras la exposición al alérgeno de cacahuete.
Según esto, en un aspecto de la presente invención, se proporciona un vector poxviral que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende (i) al menos los alérgenos de cacahuete ara h 1, ara h 2, ara h 3 y ara h 6 según se define en la reivindicación 1 y (ii) un marcador de la degradación proteasómica que es ubiquitina, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión está optimizada codónicamente para la expresión en células humanas. El marcador de la degradación proteasómica potencia la degradación intracelular de la proteína de fusión.
En un aspecto preferido, el vector poxviral que se define en las reivindicaciones comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende (i) al menos dos alérgenos de cacahuete seleccionados de la lista que consiste en ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h10 y ara h 11 y una de sus secuencias de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la misma, y (ii) un marcador de la degradación proteasómica para potenciar la degradación intracelular de la proteína de fusión.
En un aspecto preferido, el vector poxviral que se define en las reivindicaciones comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende: (i) al menos tres alérgenos de cacahuete seleccionados de la lista que consiste en ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 y ara h 7 y una de sus secuencias de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la misma, y (ii) un marcador de la degradación proteasómica para potenciar la degradación intracelular de la proteína de fusión.
En un aspecto preferido, el vector poxviral que se define en las reivindicaciones comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende: (i) al menos tres alérgenos de cacahuete seleccionados de la lista que consiste en ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h10 y ara h 11 y una de sus secuencias de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la misma, y (ii) un marcador de la degradación proteasómica para potenciar la degradación intracelular de la proteína de fusión.
En un aspecto preferido, el vector poxviral que se define en las reivindicaciones que es capaz de expresar en la célula de un sujeto una proteína de fusión que comprende: (i) un alérgeno de cacahuete seleccionado de la lista que consiste en (a) al menos dos alérgenos de cacahuete de ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 y ara h 7 o uno de sus aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la misma, o (b) al menos tres alérgenos de cacahuete de ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 y ara h 7, o uno de sus aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la misma, y (ii) un marcador de la degradación proteasómica para potenciar la degradación intracelular de la proteína de fusión.
En otro aspecto preferido, se proporciona un vector poxviral como el definido en las reivindicaciones que es capaz de expresar en la célula de un sujeto una proteína de fusión que comprende: (i) un alérgeno de cacahuete seleccionado de la lista que consiste en (a) al menos dos alérgenos de cacahuete de ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 y ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h10 y ara h 11 o uno de sus aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la misma, o (b) al menos tres alérgenos de cacahuete de ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h10 y ara h 11 o uno de sus aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la misma, y (ii) un marcador de la degradación proteasómica para potenciar la degradación intracelular de la proteína de fusión.
Alérgenos de cacahuete
Los alérgenos de cacahuete serán conocidos para los expertos en la técnica e incluyen cualquier péptido de la especie Arachis hypogaea al que se pueda exponer un sujeto a través de, por ejemplo, contacto, inhalación, ingestión, inyección, o similares. Para el uso según la divulgación, al menos dos alérgenos de cacahuete se seleccionan del grupo que consiste en ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 y ara h 7. Para el uso según la divulgación, también se pueden seleccionar al menos dos alérgenos de cacahuete del grupo que consiste en ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 y ara h 11.
La proteína de fusión que se define en las reivindicaciones comprende ara h 1 ara h 2, ara h 3 y ara h 6. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender los siguientes alérgenos de cacahuete:
(i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 y ara h 11;
(ii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 y ara h 10;
(iii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 y ara h 9;
(iv) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 y ara h 8;
(v) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 y ara h 7;
(vi) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5 y ara h 6;
(vii) ara h 1, ara h 2, ara h 3 y ara h 6.
Al emplear el marcador de la degradación proteasómica ubiquitina como un componente de la proteína de fusión, la proteína de fusión sintetizada se orienta a la degradación proteasómica, dando como resultado la generación de fragmentos peptídicos pequeños, que entran en el retículo endoplásmico (ER) donde se complejan con proteínas del MHC clase I y a continuación se transportan a la superficie celular para ser presentados a linfocitos T. Como consecuencia, existe una potenciación de la presentación de los fragmentos proteínicos con MHC clase I. Así, se entenderá por los expertos en la técnica que, cuando la secuencia de ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende dos o más alérgenos de cacahuete, los dos o más alérgenos de cacahuete pueden aparecer en la proteína de fusión en cualquier orden particular, ya que la proteína de fusión expresada se someterá a degradación proteasómica.
Se entenderá por los expertos en la técnica que es probable que la elección del alérgeno o los alérgenos de cacahuete dependa de la aplicación terapéutica y/o profiláctica particular. Por ejemplo, cuando la vacuna se vaya a usar para inducir tolerancia en un sujeto que sea alérgico al alérgeno de cacahuete Ara h1, entonces la proteína de fusión comprendería deseablemente ara h 1; cuando la vacuna se vaya a usar para inducir tolerancia en un sujeto que sea alérgico al alérgeno de cacahuete ara h 2, entonces la proteína de fusión comprendería deseablemente ara h 2; cuando la vacuna se vaya a usar para inducir tolerancia en un sujeto que sea alérgico a los alérgenos de cacahuete ara h 1 y ara h 2, entonces la proteína de fusión comprendería deseablemente ara h 1 y ara h 2; etc.
En una realización, cualquier alérgeno de cacahuete comprendido en la proteína de fusión definida en las reivindicaciones se puede seleccionar del grupo que incluye: arah 1, Clon P41B (Número de registro de GenBank L34402 o Swiss-Prot: P43238.1); Clon P17 de ara h 1 (Número de registro de GenBank L38853); ADNc de ara h 2 (Número de registro de GenBank L7797 o UniProtKB/TrEMBL: Q8GV20); ADNc de ara h 3 (Número de registro de GenBank AF093541 o ACH91862); ADNc de ara h 4 (Número de registro de GenBank AF086821); ADNc de ara h 5 (Número de registro de GenBank AF059616); ADNc de ara h 6 (Número de registro de GenBank AF092846 o UniProtKB/TrEMBL: Q647G9), ADNc de ara h 7 (Número de registro de GenBank AF091737), ara h 8 (Número de registro de GenBank AY328088, EF436550), ara h 9 (Número de registro de GenBank EU159429, EU161278), ara h 10 (AY722694, AY722695) y ara h 11 (DQ097716).
La proteína de fusión comprende al menos cuatro de los alérgenos de cacahuete más comunes que afectan a individuos que son alérgicos a los cacahuetes. La proteína de fusión comprende los alérgenos de cacahuete ara h 1, ara h 2, ara h 3 y ara h 6.
Según se usa en la presente, se ha de entender que el término "alérgeno de cacahuete", incluyendo ejemplos específicos tales como ara h 1, ara h 2, etc., también incluye uno de sus homólogos. Se ha de entender que el término "homólogo", según se usa en la presente con referencia a homólogos de secuencias de ácido nucleico o polipéptidos descritos en la presente (incluyendo, por ejemplo, una cualquiera de SEQ ID NOs: 1-12), incluye, por ejemplo, ortólogos, parálogos, mutantes y variantes de ácidos nucleicos o polipéptidos descritos en la presente, en donde el homólogo comprende un ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 70% de identidad de secuencia, al menos 75% de identidad de secuencia, al menos 80% de identidad de secuencia, al menos 85% de identidad de secuencia, al menos 90% de identidad de secuencia, al menos 95% de identidad de secuencia, al menos 96% de identidad de secuencia, al menos 97% de identidad de secuencia, al menos 98% de identidad de secuencia, o al menos 99% de identidad de secuencia con el ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos descritos en la presente.
Así, ara h 1 tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con la misma, ara h 2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con la misma, ara h 3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con la misma, y ara h 6 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con la misma, en donde en cada caso la identidad de secuencia se determina sobre toda la longitud de la secuencia de referencia respectiva.
Ara h 1 es codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:3 o una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70% de identidad con la misma, ara h 2 es codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:5 o una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70% de identidad con la misma, ara h 3 es codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 o una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70% de identidad con la misma y ara h 6 es codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:9 o una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70% de identidad con la misma.
El término "identidad de secuencia" según se usa en la presente se refiere al grado en el que las secuencias son idénticas sobre una base de nucleótido por nucleótido o una base de aminoácido por aminoácido a lo largo de un intervalo de comparación. Así, un "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula al comparar dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo del intervalo de comparación, determinar el número de posiciones en el que se presenta la base de ácido nucleico (p. ej., A, T, C, G, I) idéntica o el residuo de aminoácido (p. ej., Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) idéntico en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividir el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en el intervalo de comparación (es decir, el tamaño del intervalo) y multiplicar el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. Para los propósitos de la presente invención, se entenderá que "identidad de secuencia" significa el "porcentaje de coincidencias" calculado mediante un método apropiado. Por ejemplo, el análisis de la identidad de secuencia se puede llevar a cabo usando el programa informático DNASIS (Versión 2.5 para Windows; disponible de Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, EE. UU. de A.) usando valores por defecto estándar como los usados en el manual de referencia que acompaña al software. La identidad de secuencia de la secuencia de aminoácidos o nucleótidos de alérgeno de cacahuete abarcada, en algunas realizaciones, se incrementa hasta al menos 75%, o al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90% o al menos 95% o al menos 98% de identidad de secuencia .
En algunas realizaciones, el término "alérgeno" según se define adicionalmente en las reivindicaciones también puede incluir un fragmento de uno cualquiera de los péptidos precedentes, en donde los fragmentos tienen el mínimo requerido de identidad de secuencia según se define en las reivindicaciones. Como tal, el ácido nucleico puede comprender un nucleótido que codifica un fragmento de uno de los susodichos alérgenos de cacahuete.
En algunas realizaciones, los alérgenos de cacahuete que se definen en las reivindicaciones incluyen un alérgeno de cacahuete modificado por el que se retiran secuencias repetidas de 8 o más bases de una secuencia de alérgeno de cacahuete natural. La proteína de fusión incluye al menos cuatro alérgenos de cacahuete como los definidos en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la proteína de fusión según se define adicionalmente en las reivindicaciones incluye más alérgenos de cacahuete, al menos uno de los cuales se selecciona del grupo que consiste en ara h 4, ara h 5, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 y ara h 11.
En algunas realizaciones, para facilitar la expresión de una sola proteína de fusión, el ácido nucleico carece de codones de terminación entre dos secuencias que codifican alérgenos de cacahuete.
Marcador de la degradación proteasómica
Los presente inventores han encontrado sorprendentemente que el empleo de un marcador de la degradación proteasómica (tal como ubiquitina) como un componente de la proteína de fusión es capaz de vencer el efecto tóxico y/o inhibidor evidente que una construcción peptídica de alérgeno de cacahuete no ubiquitinada tiene sobre la expresión recombinante. El uso de un marcador de la degradación proteasómica orienta el péptido de fusión expresado a la degradación proteasómica. Como resultado de la degradación proteasómica orientada por ubiquitina, los fragmentos peptídicos pequeños del péptido de fusión (p. ej. péptidos de una longitud de aproximadamente 8-12 aminoácidos) entran en el retículo endoplásmico (ER) donde se complejan con proteínas del MHC clase I y posteriormente se transportan a la superficie celular para ser presentados a linfocitos T. Como resultado, existe una potenciación de la presentación de los fragmentos del péptido de fusión con MHC clase I, dando como resultado una mayor respuesta inmunitaria de Th1 a alérgenos de cacahuete. Así, el marcador de la degradación proteasómica impide inesperadamente que la construcción peptídica de alérgeno de cacahuete intacta inhiba la expresión recombinante en una célula anfitriona y sesgue la respuesta inmunitaria hacia un fenotipo Th1.
El marcador de la degradación proteasómica puede ser cualquier marcador que oriente la proteína de fusión para la degradación proteasómica. El marcador de la degradación proteasómica es ubiquitina. En una realización, el marcador de la degradación proteasómica es un monómero de ubiquitina, un ejemplo ilustrativo del cual es ubiquitina C. En algunas realizaciones, el monómero de ubiquitina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia nucleotídica con la misma.
En algunas realizaciones, el extremo C del monómero de ubiquitina es un residuo de alanina.
En otra realización, el monómero de ubiquitina es codificado por la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 o una secuencia nucleotídica que tiene al menos 70% de identidad de secuencia nucleotídica con la misma.
La secuencia que codifica el marcador de la degradación proteasómica puede estar situada antes o después de la secuencia que codifica el al menos un alérgeno de cacahuete (es decir el marcador de la degradación proteínica puede ser una proteína de fusión C-terminal o N-terminal).
Las moléculas de ubiquitina se pueden derivar de cualesquiera especies adecuadas. Para una vacuna destinada al tratamiento de seres humanos, la molécula de ubiquitina puede ser una molécula de ubiquitina humana o una molécula de ubiquitina procedente de otra especie animal que se puede haber optimizado codónicamente para la expresión en células humanas. En algunas realizaciones, la molécula de ubiquitina puede ser un monómero de ubiquitina C. Una vez expresada, la molécula de ubiquitina puede atraer y unirse a otras moléculas de ubiquitina para formar una cadena de poliubiquitina sobre la proteína de fusión. La molécula de ubiquitina y/o la cadena de poliubiquitina pueden dirigir la proteína de fusión para la degradación proteasómica.
En algunas realizaciones, la construcción de ácido nucleico codifica operativamente múltiples moléculas de ubiquitina o una o más secuencias que codifican una molécula de ubiquitina truncada o modificada. Si se codifican múltiples moléculas de ubiquitina, uno o más codones de iniciación y terminación se pueden retirar para permitir la traducción de toda la proteína de fusión.
En algunas realizaciones, una molécula de ubiquitina truncada puede implicar la exclusión de la lisina más cercana al extremo C de la molécula de ubiquitina natural. En algunas realizaciones, una molécula de ubiquitina modificada puede tener una o más lisinas de la secuencia natural retiradas o reemplazadas (p. ej. por arginina) de la secuencia. En algunas realizaciones, la molécula de ubiquitina puede tener solamente una única lisina.
En algunas realizaciones, el extremo C de la molécula de ubiquitina puede estar modificado. Por ejemplo, la glicina C-terminal de la molécula natural se puede reemplazar por alanina. Reemplazar la glicina por alanina u otro aminoácido puede prevenir la escisión por proteasas del marcador de la degradación proteasómica desde el alérgeno. La sustitución de la glicina por alanina también puede permitir la formación de un enlace covalente entre el marcador de la degradación proteasómica y el alérgeno. Este enlace covalente puede ser resistente a la escisión por proteasas.
En algunas realizaciones, el marcador de la degradación proteasómica puede incluir un dominio de unión a ubiquitina. El marcador de la degradación proteínica puede ser un miembro de la familia de proteínas que contienen el dominio UbL (similar a ubiquitina)-UBA (asociado a ubiquitina). A este respecto, la proteína de fusión expresada puede atraer la unión de moléculas de ubiquitina al dominio de unión, conduciendo a la degradación proteasómica de la proteína de fusión.
Proteína de fusión
La secuencia de ácido nucleico codifica una proteína de fusión que se ha optimizado con respecto a la expresión en una célula humana. De forma similar, el marcador de la degradación proteasómica está optimizado con respecto a la expresión en un sujeto y/o puede ser un marcador de la degradación proteasómica clonado a partir de la misma especie que el sujeto deseado. En algunas realizaciones, la optimización codónica implica reemplazar un codón por un codón diferente que codifica el mismo aminoácido pero se traduce más eficazmente o exactamente en una especie elegida, a saber en seres humanos.
En algunas realizaciones, la optimización de una secuencia para la expresión en un sujeto también incluye la retirada de secuencias repetidas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, secuencias repetidas de 8 o más bases se retiran de la secuencia del alérgeno de cacahuete. Esto puede ser particularmente importante si la secuencia se construye sintéticamente mediante traducción inversa. Generalmente, las secuencias sintéticas carecen del beneficio de la optimización codónica a través de la evolución. Por lo tanto, alterar secuencias repetidas desestabilizadoras que se presentan aleatoriamente dentro de la secuencia al cambiar las bases nucleotídicas sin cambiar la secuencia de aminoácidos puede mejorar la expresión de la secuencia.
En algunas realizaciones, el marcador de la degradación proteasómica es codificado por una secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1 o uno de sus homólogos. En algunas realizaciones, los alérgenos de cacahuete de la proteína de fusión son codificados por una secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 y/o SEQ ID NO: 9, o un homólogo de una cualquiera de las precedentes.
En algunas realizaciones, el marcador de la degradación proteasómica comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, los alérgenos de cacahuete de la proteína de fusión comprenden una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 y/o SEQ ID NO: 10.
Como no se requieren epítopos de conformación para la presentación en MHC-1 y en algunos aspectos no se desean a fin de prevenir la unión del anticuerpo de IgE específico del alérgeno, no se requiere que los alérgenos expresados como parte de la proteína de fusión estén en su forma estructural natural. Esto puede permitir que se usen proteínas de fusión que incluyen múltiples alérgenos de cacahuete y proporciona flexibilidad en el diseño de la proteína de fusión.
Según esto, la proteína de fusión puede codificar 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más alérgenos de cacahuete. Para algunos ácidos nucleicos, al menos uno de los alérgenos se puede seleccionar de los siguientes alérgenos de cacahuete o sus homólogos: ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 o ara h 11. En un ejemplo ilustrativo, la construcción de ácido nucleico codifica operativamente ara h 1, ara h 2, ara h 3 y ara h 6, como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, la construcción de ácido nucleico puede incluir una secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 11 o puede codificar una proteína con una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 12.
Cada alérgeno puede estar fusionado a su propio marcador de la degradación proteasómica y puede estar conectado operativamente a su propio promotor (p. ej., se pueden expresar múltiples proteínas de fusión). Alternativamente, las secuencias para el marcador de la degradación proteasómica y los alérgenos pueden estar dispuestas para permitir la expresión de una proteína de fusión que incluye un marcador de la degradación proteasómica y los múltiples alérgenos. Este último enfoque puede prevenir la expresión diferencial de los diferentes alérgenos y/o prevenir la recombinación intramolecular si se usan múltiples casetes de expresión con promotores idénticos.
Para permitir la traducción de una proteína de fusión con 2 o más alérgenos, el ácido nucleico puede carecer de codones de terminación entre dos secuencias que codifican alérgenos de cacahuete. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico puede carecer de codones de terminación entre cualquiera de las secuencias que codifican alérgenos de cacahuete y/o puede carecer de codones de terminación entre la secuencia que codifica el marcador de la degradación proteasómica y una secuencia que codifica un alérgeno.
Para conducir la traducción, la secuencia que codifica la primera parte de la proteína de fusión puede incluir un codón de iniciación en el extremo 5' de la secuencia. Los codones de iniciación pueden estar ausentes de la secuencia que codifica el resto de la proteína de fusión. A este respecto, la expresión de alérgenos que no están fusionados al marcador de la degradación proteasómica se puede minimizar o prevenir. Esto puede minimizar o prevenir que alérgenos de cacahuete intactos se secreten desde la célula o se presenten sobre la superficie de la célula, lo que podría estimular de otro modo una respuesta inmunitaria de Th2 contra el alérgeno.
En una realización, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con la misma.
En otra realización, la proteína de fusión es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11 o una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de ácido nucleico indicada en SEQ ID NO: 11 sobre toda la longitud de SEQ ID NO: 11.
En algunas realizaciones, y a fin de facilitar la expresión de la proteína de fusión como una proteína intacta y reducir la expresión diferencial de cada alérgeno, el vector comprende una secuencia de control de la transcripción (tal como un promotor) y un solo codón de iniciación para facilitar la expresión de la proteína de fusión intacta.
En algunos aspectos, se proporciona un casete de ácido nucleico para desensibilizar o inducir tolerancia en un sujeto a un alérgeno de cacahuete, incluyendo el casete:
i) la vacuna que se describe en la presente y ii) un conector de enzima de restricción terminal en cada extremo de la secuencia del casete. En algunas realizaciones, al menos un conector de enzima de restricción terminal incluye una secuencia de reconocimiento/escisión de la enzima de restricción Pac1. En algunas realizaciones, el casete es un casete de vector viral.
La construcción de ácido nucleico puede incluir ventajosamente una secuencia de control de la transcripción conectada operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión.
Se ha de entender que el término "secuencia de control de la transcripción" incluye cualquier secuencia de ácido nucleico que efectúe la transcripción de un ácido nucleico conectado operativamente. Secuencias de control de la transcripción adecuadas serían conocidas para los expertos en la técnica. Ejemplos ilustrativos incluyen un líder, una secuencia de poliadenilación, un promotor, un potenciador o una secuencia activadora aguas arriba y un terminador de la transcripción. Típicamente, una secuencia de control de la transcripción incluye al menos un promotor. El término "promotor", según se usa en la presente, describe cualquier ácido nucleico que confiera, active o potencie la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula.
En algunas realizaciones, al menos una secuencia de control de la transcripción está conectada operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína de fusión. Para los propósitos de la presente invención, una secuencia de control de la transcripción se considera "conectada operativamente" a un gen o una secuencia nucleotídica dados cuando la secuencia de control de la transcripción sea capaz de promover, inhibir o modular de otro modo la transcripción del gen u otra secuencia nucleotídica.
Un promotor puede regular la expresión de una secuencia nucleotídica conectada operativamente constitutivamente, o diferencialmente, con respecto a la célula, el tejido, el órgano o la fase de desarrollo en los que se produce la expresión, en respuesta a estímulos externos tales como estreses fisiológicos, patógenos o iones metálicos, entre otros, o en respuesta a uno o más activadores de la transcripción. Como tal, el promotor usado según la vacuna y/o los métodos de la presente invención puede incluir, por ejemplo, un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor tisularmente específico o un promotor activable. La presente invención contempla el uso de cualquier promotor que sea activo en una célula de interés.
"Promotores tisularmente específicos" incluyen promotores que se expresan preferentemente o específicamente en uno o más células, tejidos u órganos específicos en un organismo y/o una o más fases de desarrollo del organismo. Se debe entender que un promotor específico tisularmente también será constitutivo o inducible.
El promotor también puede ser un promotor que sea activable mediante uno o más activadores de la transcripción, denominado en la presente un "promotor activable". Por ejemplo, el promotor activable puede comprender un promotor mínimo conectado operativamente a una secuencia activadora aguas arriba (UAS), que comprende, entre otros, un sitio de unión a ADN para uno o más activadores de la transcripción.
Según se menciona en la presente, se debe entender que el término "promotor mínimo" incluye cualquier promotor que incorpore al menos un sitio de unión a ARN polimerasa y, opcionalmente, una secuencia TATA y un sitio de iniciación de la transcripción y/o una o más secuencias CAAT.
Como se indica anteriormente, el promotor activable puede comprender un promotor mínimo fusionado a una secuencia activadora aguas arriba (UAS). La UAS puede ser cualquier secuencia que se pueda unir a un activador de la transcripción para activar el promotor mínimo. Activadores de la transcripción ejemplares incluyen, por ejemplo: activadores de la transcripción derivados de levadora tales como Gal4, Pdr1, Gcn4 y Ace1; el activador de la transcripción derivado de virus, VP16; Hap1 (Hach y cols, J Biol Chem 278: 248-254, 2000); Gaf1 (Hoe y cols, Gene 215(2): 319-328, 1998); E2F (Albani y cols., J Biol Chem 275: 19258-19267, 2000); HAND2 (Dai y Cserjesi, J Biol Chem 277: 12604-12612, 2002); NRF-1 y EWG (Herzig y cols., J Cell Sci 113: 4263-4273, 2000); P/CAF (Itoh y cols., Nucl Acids Res 28: 4291 - 4298, 2000); MafA (Kataoka y cols., J Biol Chem 277: 49903-49910, 2002); factor de transcripción activador 4 (Liang y Hai, J Biol Chem 272: 24088 - 24095, 1997); Bcl10 (Liu y cols., Biochem Biophys Res Comm 320(1): 1-6, 2004); CREB-H (Omori y cols., Nucl Acids Res 29: 2154 - 2162, 2001); ARR1 y ARR2 (Sakai y cols., Plant J 24(6): 703-711, 2000); Fos (Szuts y Bienz, Proc Natl Acad Sci USA 97: 5351-5356, 2000); HSF4 (Tanabe y cols., J Biol Chem 274: 27845 - 27856, 1999); MAML1 (Wu y cols., Nat Genet 26: 484-489, 2000).
La secuencia de control de la transcripción también puede incluir un terminador. El término "terminador" se refiere a una secuencia de ADN al final de una unidad de transcripción que señala la terminación de la transcripción. Los terminadores son secuencias de ADN no traducidas 3' que contienen generalmente una señal de poliadenilación, lo que facilita la adición de secuencias de poliadenilato al extremo 3' de un transcrito primario. Como con las secuencias promotoras, el terminador puede ser cualquier secuencia terminadora que pueda operar en las células, los tejidos o los órganos en los que se pretende usar. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico puede incluir una secuencia de terminación de la transcripción temprana viral 3' de la secuencia que codifica la proteína de fusión.
Vectores
La construcción de ácido nucleico está incorporada operativamente en un vector.
En algunas realizaciones, el vector poxviral que se define en las reivindicaciones puede ser un vector de expresión adaptado para la expresión en una célula eucariótica. Según se usa en la presente, un "vector" puede ser cualquiera de un número de ácidos nucleicos en los que se pueda insertar una secuencia deseada. Vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagémidos y genomas virales. En algunas realizaciones de expresión, el vector también es capaz de replicarse en una célula anfitriona (p. ej. una célula bacteriana), y también puede comprender además uno o más sitios de restricción de endonucleasa en los que el vector se puede cortan de un modo determinable y en los que se puede ligar una secuencia de ADN deseada de modo que el vector recombinante retenga su capacidad para replicarse en la célula anfitriona. En el caso de los plásmidos, la replicación de la secuencia deseada se puede producir muchas veces ya que el plásmido se incrementa en número de copias dentro de la bacteria anfitriona o una sola vez por anfitrión antes de que el anfitrión se reproduzca por mitosis. En el caso de un fago, la replicación se puede producir activamente durante una fase lítica o pasivamente durante una fase lisogénica.
Los vectores de expresión pueden contener secuencias de control de la transcripción para conducir la expresión de ácidos nucleicos insertados en células anfitrionas (p. ej. en una célula humana). Secuencias de control de la transcripción incluyen las descritas anteriormente e incluyen, por ejemplo, promotores.
Los vectores pueden contener además una o más secuencias marcadoras seleccionables adecuadas para el uso en la identificación de células que se hayan transformado o transfectado o no con el vector. Marcadores incluyen, por ejemplo, genes que codifican proteínas que incrementan o disminuyen bien la resistencia o bien la sensibilidad a antibióticos u otros compuestos, genes que codifican enzimas cuyas actividades sean detectables mediante ensayos estándar conocidos en la técnica (p. ej., p-galactosidasa, luciferasa), y genes que afectan visiblemente al fenotipo de células transformadas o transfectadas, anfitriones, colonias o calvas (p. ej., diversas proteínas fluorescentes tales como proteína fluorescente verde, GFP). Algunos vectores pueden ser capaces de replicación autónoma, también denominados vectores episómicos. Alternativamente, los vectores pueden estar adaptados para insertarse en un cromosoma, de modo que se denominan vectores integradores. El vector también puede estar provisto de secuencias de control de la transcripción (secuencias promotoras) que median en la expresión específica celularmente/tisularmente. Estas secuencias promotoras pueden ser específicas celularmente/tisularmente, inducibles o constitutivas.
Vectores virales adecuados serían conocidos para los expertos en la técnica. Ejemplos ilustrativos de vectores virales incluyen un vector retroviral, un vector lentiviral, un vector adenoviral, un vector viral adenoasociado o un vector viral de poxvirus. Vectores poxvirales pueden incluir, por ejemplo, un vector poxviral aviario (p. ej. viruela aviar o viruela del canario). En algunas realizaciones, el vector viral de poxvirus puede ser un vector viral restringido a la replicación que incluye, por ejemplo, virus variolovacunal de Ankara modificado (MVA), un poxvirus aviar o un virus variolovacunal incapacitado. El uso de vectores virales puede ser beneficioso para sesgar adicionalmente una respuesta Th1 contra células que expresan los fragmentos peptídicos de alérgeno de cacahuete degradados sobre moléculas del MHC Clase I ya que el propio vector viral puede promover la expresión del receptor de IL-12 sobre las células. Por otra parte, la activación de células inmunitarias por vectores virales puede iniciar una compleja red de interacciones célulacélula y cascadas de producción de citocinas que dan como resultado la potenciación global de funciones inmunitarias de Th1 de un modo dependiente de antígenos.
Según se define en las reivindicaciones, el vector viral es un vector viral de poxvirus.
En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico incluye una secuencia de terminación de la transcripción temprana viral 3' de la secuencia que codifica la proteína de fusión.
Para facilitar la clonación, la construcción de ácido nucleico puede estar incluida en un casete de ácido nucleico (es decir, un casete de expresión). Según esto, la presente divulgación proporciona un casete de ácido nucleico para desensibilizar a un sujeto con respecto a un alérgeno de cacahuete, incluyendo el casete: la construcción de ácido nucleico que codifica operativamente la proteína de fusión que se describe en la presente y un conector de enzima de restricción terminal en cada extremo de la secuencia del casete.
Se entiende que el término "casete de ácido nucleico" según se usa en la presente significa una secuencia de ácido nucleico diseñada para introducir una molécula de ácido nucleico (p. ej., la construcción de ácido nucleico que se describe en la presente) en un vector o genoma.
El casete incluirá típicamente un conector de enzima de restricción terminal en cada extremo de la secuencia del casete. Los conectores de enzima de restricción terminales en cada extremo pueden ser conectores de enzima de restricción terminales iguales o diferentes. En algunas realizaciones, tener los mismos conectores de enzima de restricción terminales en cada extremo puede ser ventajoso si se desea la replicación del casete en células bacterianas (y el casete incluye un origen de replicación) ya que el casete se puede circularizar al digerir el casete con la enzima de restricción apropiada y ligar los extremos entre sí. De forma similar, un casete circular se puede linealizar al digerir el casete con una sola enzima de restricción.
En algunas realizaciones, los conectores de enzima de restricción terminales pueden incluir secuencias de reconocimiento/escisión de enzimas de restricción raras, de modo que no se produzca la digestión inintencionada del ácido nucleico o el vector o el genoma en el que se va a introducir el casete. En algunas realizaciones, los conectores de enzima de restricción terminales incluyen una secuencia de reconocimiento/escisión de la enzima de restricción Pac1.
El casete se puede clonar en un vector de expresión de mamífero, un vector de expresión o clonación bacteriano, un vector de expresión de insecto, un vector de expresión vegetal o un vector viral. Según esto, el casete puede ser un casete de vector de mamífero, un casete de vector bacteriano, un casete de vector de insecto, un casete de vector vegetal o un casete de vector viral.
Tratamiento y prevención de la alergia a los cacahuetes
Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que la vacuna de la presente invención produce una respuesta inmunitaria de Th1 sesgada contra proteínas de cacahuete, que dominará sobre la respuesta inmunitaria de Th2 específica para alérgeno existente y, al hacer esto, desensibilizará a un individuo a una exposición posterior al alérgeno de cacahuete. Por otra parte, la expresión de citocinas de Th1 (p. ej. IFNy, IL-12, TGF-p, IL2, etc.) puede reducir la expresión de citocinas de Th2 (p. ej. IL-3, IL-4, IL-5, IL6, IL10, etc.), sesgando la respuesta inmunitaria contra el alérgeno hacia una respuesta inmunitaria de Th1, el resultado de lo cual es la inhibición o la mejora de la activación y/o la incorporación de células B, mastocitos y eosinófilos B que producen anticuerpos de IgE, reduciendo o previniendo de ese modo una reacción alérgica a una exposición posterior al alérgeno (p. ej., reacciones anafilácticas). Según esto, la vacuna de la presente invención es adecuada para el tratamiento de una alergia a los cacahuetes en un sujeto.
Los presentes inventores también han encontrado sorprendentemente que la vacuna de la presente invención produce una respuesta inmunitaria de Th1 sesgada a alérgeno de cacahuete que es independiente de una alergia a los cacahuetes preexistente. Según esto, la vacuna de la presente invención es adecuada para el uso en la prevención de una alergia a los cacahuetes en un sujeto que pueda tener riesgo de la misma.
También se divulga el uso del vector poxviral divulgado en la presente, o en la fabricación de un medicamento para inducir tolerancia en un sujeto a un alérgeno de cacahuete.
El vector poxviral divulgado en la presente se puede usar como un profiláctico para prevenir o mejorar la alergia a los cacahuetes en un sujeto en riesgo de desarrollar una alergia a los cacahuetes (es decir, se puede inducir tolerancia en un sujeto en riesgo de desarrollar alergia a un alérgeno de cacahuete). Sujetos en riesgo de desarrollar una alergia a los cacahuetes pueden incluir personas que ya sufran una alergia tal como fiebre del heno, asma u otras alergias alimentarias o personas que tengan antecedentes familiares de alergias.
También se divulga un método para inducir tolerancia en un sujeto a un alérgeno de cacahuete, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz del vector poxviral divulgado en la presente durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para provocar supresión y/o tolerancia, por ejemplo, al inducir una respuesta de Th1 específica de alérgeno de cacahuete en el sujeto.
Se ha de entender que los términos "reacción alérgica", "alergia", "trastorno alérgico" y similares, según se usan en la presente, significan un trastorno inmunitario en el que el sistema inmunitario es hipersensible a sustancias ambientales por lo demás inocuas. Estas sustancias ambientales que provocan alergias se denominan "alérgenos". Alergias comunes incluyen rinoconjuntivitis estacional (p. ej., alergias a gramíneas y polen tales como ambrosía, fleo), alergias a caspa de mascotas tal como caspa de gato o caspa de perro, alergias alimentarias tales como alergias a los cacahuetes, los lácteos y el trigo, anafilaxis por veneno, y asma. Un trastorno alérgico se caracteriza típicamente por la producción de IgE.
Las enfermedades alérgicas resultan de respuestas inmunitarias contra antígenos ambientales por lo demás inocuos, caracterizadas por la generación de células T Th2, que producen IL-4 e IL-5 y promueven la diferenciación de células B en células que secretan anticuerpos de IgE. Los anticuerpos de IgE se unen a receptores de alta afinidad sobre basófilos y mastocitos. La exposición al alérgeno conduce a la unión de moléculas de alérgeno por IgE superficial y la reticulación de los receptores, provocando la activación y la desgranulación de basófilos y mastocitos. Los últimos liberan una variedad de compuestos proinflamatorios y vasoactivos preformados tales como histamina, prostaglandinas, leucotrienos y citocinas, conduciendo a una respuesta inflamatoria. La unión del alérgeno de cacahuete a los anticuerpos de IgE que se unen a la superficie de mastocitos y basófilos es el episodio iniciador que culmina finalmente en una reacción alérgica. La prevención de la unión del alérgeno a IgE unida a mastocitos y/o basófilos prevendrá el comienzo de una reacción alérgica. La prevención de la producción de IgE específica del alérgeno tras la exposición a alérgeno de cacahuete inducirá tolerancia al cacahuete.
El término "tolerancia", según se usa en la presente, se toma para significar una inhibición (parcial o completa) de una reacción alérgica a la exposición a alérgenos de cacahuete. La inhibición puede ser prevención, retardo, reducción, supresión o impedimento de otro modo de una reacción alérgica. Esta inhibición puede ser en magnitud y/o se de naturaleza temporal. En contextos particulares, los términos "inhibir" y "prevenir", y sus variaciones, se pueden usar intercambiablemente. La tolerancia se puede evaluar por cualesquiera medios conocidos por los expertos en la técnica. Como un ejemplo ilustrativo, se puede usar una prueba de punción cutánea para medir la respuesta del sujeto a un alérgeno o múltiples alérgenos, antes y/o después del tratamiento con el vector poxviral divulgado en la presente. Por ejemplo, en un sujeto que sea alérgico a los cacahuetes, una prueba de punción cutánea usando uno o más alérgenos de cacahuete producirá típicamente una respuesta alérgica localizada observable caracterizada por un sarpullido, urticaria y/o inflamación localizados. La tolerancia en el mismo individuo después del tratamiento con el vector poxviral divulgado en la presente típicamente se manifestará como una reducción en la reacción alérgica localizada a la prueba de punción cutánea. Esta reducción se puede medir, por ejemplo, por la diferencia en el tamaño (p. ej., diámetro) de la reacción alérgica localizada antes y después del tratamiento.
En otro ejemplo ilustrativo, la tolerancia se evalúa mediante la prevención, el retardo, la inhibición, la reducción, la supresión o el impedimento de la gravedad de la respuesta alérgica después de una exposición accidental a un alérgeno de cacahuete. Por ejemplo, cuando un sujeto tiene antecedentes de respuestas anafilácticas a la exposición a alérgenos de cacahuete, la tolerancia como resultado del tratamiento con el vector poxviral según la presente invención se puede determinar por la ausencia de una reacción anafiláctica después de la posterior exposición a alérgenos de cacahuete, aunque el sujeto pueda mostrar otros signos de una reacción alérgica, tales como un sarpullido.
En otro ejemplo ilustrativo, la tolerancia se evalúa al determinar el nivel de anticuerpos de IgE específicos de alérgeno de cacahuete circulatorios en un sujeto. A modo de ejemplo, un sujeto que tenga antecedentes de reacciones alérgicas (incluyendo respuestas anafilácticas) a la exposición a alérgeno de cacahuete tendrá típicamente un nivel superior de anticuerpos de IgE específicos de alérgeno de cacahuete en comparación, por ejemplo, con un sujeto que no tenga una alergia a los cacahuetes. En estos individuos, la tolerancia se puede determinar mediante una reducción en el nivel de anticuerpos de IgE específicos de alérgeno de cacahuete circulatorios después del tratamiento con la vacuna de la presente invención. Alternativamente, o además, la tolerancia se puede determinar mediante un nivel superior de anticuerpos de IgG específicos de alérgeno de cacahuete circulatorios después del tratamiento con el vector poxviral de la presente invención, que es característico de una respuesta inmunitaria de Th1 y típicamente indicativo de un estado tolerante.
Alternativamente, o además, la tolerancia se puede determinar al evaluar el perfil de citocinas en una muestra obtenida del sujeto (p. ej., una muestra de sangre, incluyendo una muestra de plasma o suero). Por ejemplo, un nivel superior de IFN-gamma es indicativo de un sesgo hacia una respuesta de Th1 específica de alérgeno, mientras que un nivel superior de IL-4 y/o IL-5 es indicativo de un sesgo hacia una respuesta de Th2 específica de alérgeno.
Alternativamente, o además, la tolerancia se puede determinar al obtener una muestra de linfocitos T de un sujeto que ha sido tratado con el vector poxviral según la presente invención, como se divulga en la presente, y medir el perfil de citocinas de los linfocitos ex vivo. Por ejemplo, un nivel superior de producción de IFN-gamma por los linfocitos T es indicativo de un sesgo hacia una respuesta de Th1 específica de alérgeno, mientras que un nivel superior de producción de IL-4 y/o IL-5 por los linfocitos T es indicativo de un sesgo hacia una respuesta de Th2 específica de alérgeno. Métodos para medir el nivel de anticuerpos y citocinas de IgE y/o IgG específicos de alérgeno de cacahuete que sean capaces de diferenciar entre una respuesta de Th1 y Th2 serán conocidos para los expertos en la técnica. Ejemplos ilustrativos incluyen radioinmunoensayos (RIA) y inmunoenzimoensayos de adsorción (ELISA).
Se entenderá por los expertos en la técnica que el vector poxviral divulgado en la presente se ha de administrar bien en una sola dosis o bien como parte de una serie de dosis que proporcione el efecto terapéutico o profiláctico deseado en un sujeto que lo necesite; a saber, la inducción de tolerancia a un alérgeno de cacahuete. A veces se pueden manifestar efectos no deseables, p. ej. efectos secundarios, junto con el efecto terapéutico y/o profiláctico deseado; de ahí que un médico equilibrará generalmente los beneficios potenciales frente a los riesgos potenciales al determinar una cantidad eficaz apropiada. La cantidad exacta de vacuna requerida variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, el modo de administración y similares. Así, puede que no sea posible especificar una cantidad eficaz exacta. Sin embargo, una cantidad eficaz apropiada en un caso individual puede ser determinada por un experto normal en la técnica usando habilidades o experimentación habituales. Un experto normal en la técnica será capaz de determinar las cantidades requeridas basándose en factores tales como la talla y el peso del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto y la vía de administración propuesta.
El término "tratamiento" se refiere a cualquier inhibición o mejora medible o estadísticamente significativa en al menos algunos sujetos en uno o más síntomas de la alergia a los cacahuetes.
El vector poxviral divulgado en la presente se puede explotar para desensibilizar a un sujeto con una alergia a los cacahuetes (es decir un sujeto que es hipersensible a uno o más alérgenos de cacahuete) hacia uno o más alérgenos de cacahuete. El término "desensibilizar a un sujeto", según se usa en la presente con referencia a un alérgeno de cacahuete, está destinado a significar que la sensibilidad del sujeto al alérgeno de cacahuete se reduce, mejora o elimina. A este respecto, los síntomas de una alergia a los cacahuetes en un sujeto se reducen parcialmente o completamente tras la reexposición a uno o más alérgenos de cacahuete.
Alternativamente, o además, la secuencia de ácido nucleico se puede explotar para inducir tolerancia en un sujeto a uno o más alérgenos de cacahuete. La inducción de tolerancia a uno o más alérgenos de cacahuete se realiza en un sujeto con una alergia a los cacahuetes o en un sujeto que puede estar en riesgo de desarrollar una alergia a los cacahuetes (es decir, el ácido nucleico se puede explotar como parte de un tratamiento profiláctico de la alergia a los cacahuetes).
Aunque el vector poxviral divulgado en la presente se puede explotar de diferentes modos para desensibilizar o inducir tolerancia en un sujeto a un alérgeno de cacahuete (según se describe en la presente), el principio general por el que funciona el vector poxviral es el mismo. Cuando el péptido de fusión se expresa en una célula, se orienta a la degradación proteasómica en virtud del marcador de la degradación proteasómica, que previene que la proteína de fusión intacta se secrete desde la célula.
También se divulga un método para vacunar a un sujeto para inducir tolerancia a un alérgeno de cacahuete que comprende administrar el vector poxviral que se divulga en la presente. En un aspecto particular, el método es para inducir tolerancia contra al menos dos o al menos tres alérgenos de cacahuete principales.
La presente invención se extiende a estuches que comprenden el vector poxviral, según se define mediante las reivindicaciones.
El vector poxviral de la presente invención se puede aportar a una célula in vivo o ex vivo (p. ej. como ADN desnudo o en un vector) mediante métodos conocidos en la técnica. Ejemplos ilustrativos incluyen aporte viral, microinyección, pistola génica, impalefección, presión hidrostática, electroporación, ultrasonidos y/o lipofección. El vector poxviral también se puede aportar a una célula como una composición farmacéutica.
Los liposomas pueden servir como un portador para el vector poxviral. Los liposomas son vesículas lipídicas que encapsulan un agente terapéutico seleccionado (p. ej. un vector) que a continuación se introduce en un paciente. El liposoma se puede fabricar bien a partir de un fosfolípido puro o bien a partir de una mezcla de fosfolípido y fosfoglicérido. Típicamente, los liposomas se pueden fabricar con diámetros de menos de 200 nm, lo que permite que se inyecten intravenosamente y sean capaces de atravesar el lecho capilar pulmonar. Por otra parte, la naturaleza bioquímica de los liposomas confiere permeabilidad a través de membranas de los vasos sanguíneos para acceder a tejidos seleccionados.
El vector poxviral puede estar desnudo, esto es, no asociado con proteínas u otros agentes que puedan afectar al sistema inmunitario del receptor. En este caso, es deseable que el vector poxviral esté en una solución fisiológicamente aceptable, tal como, pero no limitada a, solución salina estéril o solución salina tamponada. Alternativamente, la vacuna puede estar asociada con liposomas, tales como liposomas de lecitina u otros liposomas conocidos en la técnica. También se pueden usar agentes que ayuden a la captación celular de moléculas de ácido nucleico, tales como, pero no limitados a, iones calcio.
En el caso de vectores no virales, la cantidad de ácido nucleico que se va a introducir en un receptor tendrá un intervalo de dosificación muy amplio y puede depender, por ejemplo, de la fuerza de los promotores de la transcripción y la traducción usados. Además, la magnitud de la respuesta inmunitaria puede depender del nivel de expresión proteínica y de la inmunogenicidad del producto de proteína de fusión expresado. Un intervalo de dosis eficaces puede incluir aproximadamente de 1 ng a 5 mg, aproximadamente de 100 ng a 2,5 mg, aproximadamente de 1 gg a 750 gg o aproximadamente de 10 gg a 300 gg del ácido nucleico (p. ej. como parte de un vector poxviral).
El vector poxviral se puede administrar o inocular, subcutáneamente, intramuscularmente, intradérmicamente, o mediante otros modos tales como intraperitoneal, intravenoso o inhalación, en presencia de adyuvantes u otras sustancias que tengan la capacidad de promover la captación de ADN o incorporar células del sistema inmunitario a la zona de inoculación. La vía de administración elegida dependerá de la composición y el estado patológico de los pacientes. Consideraciones importantes incluyen los tipos de células inmunitarias que se van a activar, el tiempo que el antígeno se expone al sistema inmunitario y el esquema de inmunización. También se contempla que se puedan proporcionar tratamientos de refuerzo.
Según se describe en la presente, el vector poxviral es capaz de desensibilizar (es decir, inducir tolerancia en) un sujeto mediante la expresión de la proteína de fusión en una célula. La proteína de fusión se degrada dentro de la célula y los fragmentos del alérgeno de cacahuete degradado se expresan sobre la superficie celular en asociación con moléculas del MHC Clase I. En algunas realizaciones, no se expone alérgeno de cacahuete expresado intacto al sistema inmunitario del sujeto durante los métodos de la presente invención. Esto es como resultado del marcador de la degradación proteasómica, que conduce la degradación proteasómica intracelular de la proteína de fusión expresada.
El método de desensibilización o inducción de tolerancia en un sujeto a un alérgeno de cacahuete puede implicar administrar el vector poxviral o una composición farmacéutica que incluye el vector poxviral al sujeto. Según esto, la presente invención proporciona un método para desensibilizar a un sujeto con respecto a un alérgeno de cacahuete, en donde el método incluye expresar la proteína de fusión en una célula del sujeto, en donde el marcador de la degradación proteasómica de la proteína de fusión expresada orienta a la proteína de fusión para la degradación proteasómica intracelular y la asociación de los péptido degradados del alérgeno de cacahuete con moléculas del MHC clase I para promover la generación de una respuesta de Th1 al alérgeno de cacahuete, de este modo desensibilizando o induciendo tolerancia en el sujeto al alérgeno de cacahuete.
También se divulga un método de tratamiento profiláctico para inducir tolerancia a un alérgeno de cacahuete en un sujeto, en donde el método incluye expresar la proteína de fusión en una célula del sujeto, en donde el marcador de la degradación proteasómica de la proteína de fusión expresada orienta a la proteína de fusión para la degradación proteasómica intracelular y la asociación de los péptidos degradados del alérgeno de cacahuete con moléculas del MHC clase I para promover la generación de una respuesta de Th1 al alérgeno de cacahuete, previniendo así la sensibilidad del sujeto al alérgeno de cacahuete.
Aunque estos métodos pueden implicar expresar la proteína de fusión en una célula in vivo, otros métodos pueden incluir expresar la proteína de fusión en una célula ex vivo. Como tal, la presente invención también proporciona una célula que expresa la proteína de fusión. A este respecto, la célula se puede usar para experimentos in vitro, tratamiento in vivo y/o tratamientos ex vivo.
Sujeto
Los términos "sujeto," "individuo "y "paciente "se usan intercambiablemente en la presente para referirse a cualquier sujeto al que pueda ser aplicable la presente divulgación, particularmente un sujeto vertebrado, y aún más particularmente un sujeto mamífero. Animales vertebrados adecuados que se encuentran dentro del alcance de la invención incluyen, pero no se restringen a, cualquier miembro del subfilo Chordata incluyendo primates, roedores (p. ej., ratones, ratas, cobayas), lagomorfos (p. ej., conejos, liebres), bovinos (p. ej., vacas), ovinos (p. ej., ovejas), caprinos (p. ej., cabras), porcinos (p. ej., cerdos), equinos (p. ej., caballos), caninos (p. ej., perros), felinos (p. ej., gatos), aves (p. ej., pollos, pavos, patos, ocas, aves de compañía tales como canarios, periquitos, etc.), mamíferos marinos (p. ej., delfines, ballenas), reptiles (serpientes, ranas, lagartos, etc.) y peces. En algunas realizaciones, el sujeto es un primate (p. ej., un ser humano, un simio superior, un simio inferior, un chimpancé).
En una realización preferida, el sujeto es un ser humano. Según esto, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión está optimizada codónicamente para la expresión en células humanas.
Composiciones farmacéuticas
El vector poxviral según la presente invención se puede proporcionar en una forma que comprende un portador y/o diluyente farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable.
Así, en otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica para desensibilizar o inducir tolerancia en un sujeto a un alérgeno de cacahuete, comprendiendo la composición el vector poxviral divulgado en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas se preparan convenientemente según técnicas de combinación farmacéuticas convencionales. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Mack Publishing, Company, Easton, PA, EE. UU. de A., 1990. Estas composiciones pueden comprender, además de una de las sustancias activas, un excipiente, portador, tampón, estabilizante u otros materiales bien conocidos en la técnica, farmacéuticamente aceptables. Estos materiales deben ser atóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. El portador puede tomar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para la administración, p. ej. intravenosa, oral o parenteral.
También se divulga un método para desensibilizar o inducir tolerancia en un sujeto a un alérgeno de cacahuete, incluyendo el método expresar el péptido de fusión que se describe en la presente en una célula del sujeto, en donde el marcador de la degradación proteasómica de la proteína de fusión expresada orienta la proteína de fusión para la degradación proteasómica intracelular y la asociación de los péptidos degradados del alérgeno de cacahuete con moléculas del MHC clase I para promover la generación de una respuesta de Th1 al alérgeno de cacahuete, de este modo desensibilizando o induciendo tolerancia en el sujeto al alérgeno de cacahuete.
También se divulga un método de tratamiento profiláctico para inducir tolerancia a un alérgeno de cacahuete en un sujeto, incluyendo el método expresar el péptido de fusión que se describe en la presente en una célula del sujeto, en donde el marcador de la degradación proteasómica de la proteína de fusión expresada orienta la proteína de fusión para la degradación proteasómica intracelular y la asociación de los péptidos degradados del alérgeno de cacahuete con moléculas del MHC clase I para promover la generación de una respuesta de Th1 al alérgeno de cacahuete, previniendo así la sensibilidad del sujeto al alérgeno de cacahuete.
Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que un vector poxviral que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende alérgenos de cacahuete y un marcador de la degradación proteasómica puede, tras la vacunación, producir una respuesta inmunitaria de Th1 específica de cacahuete, según se mide por la producción de anticuerpos de IgG2a específicos de alérgeno de cacahuete y la secreción inducida por alérgeno de cacahuete de citocinas de Th1 a partir de linfocitos. Como este vector poxviral estimula una respuesta inmunitaria de Th1 específica de alérgeno de cacahuete, se deduce que el vector poxviral divulgado en la presente se puede usar para desensibilizar (es decir, inducir tolerancia en) sujetos que sean alérgicos a alérgenos de cacahuete.
Según se describe en la presente, el ácido nucleico se incluye en un vector de expresión (p. ej., un vector viral) o una composición farmacéutica que se puede administrar a un sujeto para permitir la expresión de la proteína de fusión ubiquitinada en una célula in vivo. Alternativamente, el ácido nucleico se expresa en una célula (p. ej., una célula presentadora de antígeno) ex vivo que a continuación se puede administrar a un sujeto. Alternativamente, o además, la célula transfectada se puede usar para estimular y expandir una población de linfocitos Th1 ex vivo, que a continuación se administran al sujeto.
El establecimiento de memoria de Th1 para los péptidos presentados del alérgeno de cacahuete puede prevenir o reducir respuestas inmunitarias de Th2 contra el alérgeno de cacahuete tras la exposición posterior a un alérgeno de cacahuete. En algunas realizaciones, la memoria de Th1 contra el alérgeno de cacahuete se establece mediante la activación y el mantenimiento de células T CD8+ específicas de alérgeno de cacahuete.
Células
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una célula ex vivo que comprende y que expresa la secuencia de ácido nucleico que se define en las reivindicaciones. La célula puede ser una célula anfitriona o una célula presentadora de antígeno (p. ej., una célula dendrítica). La célula transfectada que expresa la proteína de fusión se puede usar a continuación para generar y/o expandir una población de linfocitos Th1 reactivos a alérgeno de cacahuete in vivo o ex vivo. Así, la presente divulgación hace posible un método para generar y/o expandir una población de linfocitos Th1 reactivos a alérgeno de cacahuete ex vivo, comprendiendo el método cultivar la célula (es decir, una célula transfectada que expresa la proteína de fusión) según se describe en la presente con uno o más linfocitos T. La presente divulgación hace posible un método para generar y/o expandir una población de linfocitos Th1 reactivos con alérgeno de cacahuete in vivo, comprendiendo el método administrar una célula transfectada según se describe en la presente en un sujeto que lo necesite, en donde la célula transfectada administrada activa células T vírgenes en el sujeto para que se conviertan en células Th1 específicas de alérgeno de cacahuete.
Se divulga en la presente un método para desensibilizar o inducir tolerancia en un sujeto a un alérgeno de cacahuete, comprendiendo el método: i) recoger linfocitos del sujeto; ii) cocultivar los linfocitos con células como las descritas en la presente (es decir, células transfectadas que expresan la proteína de fusión divulgada en la presente) para generar y/o expandir una población de linfocitos Th1 que reconoce la proteína de fusión de alérgeno de cacahuete proteasómicamente degradada asociada con moléculas del MHC Clase I sobre las células; y iii) administrar los linfocitos Th1 procedentes de (ii) al sujeto.
La célula puede incluir una célula procariótica (p. ej. una célula bacteriana). La célula procariótica se puede usar para replicar la construcción de ácido nucleico (p. ej. en forma de vector) y/o en diversas etapas de clonación. La célula puede incluir una célula eucariótica (p. ej. una célula de mamífero). A este respecto, la presente invención también incluye una célula que expresa la construcción de ácido nucleico que codifica operativamente la proteína de fusión.
El vector poxviral que se divulga en la presente también se puede usar para activar células presentadoras de antígeno vírgenes, que a continuación se pueden reintroducir en el sujeto para activar células T vírgenes para que se conviertan en células Th1 específicas de alérgeno de cacahuete. Así, también se divulga un método para desensibilizar o inducir tolerancia en un sujeto a un alérgeno de cacahuete, comprendiendo el método: i) recoger células presentadoras de antígeno del sujeto; ii) cocultivar las células presentadoras de antígeno con las células que se describen en la presente (es decir, células transfectadas que expresan la proteína de fusión divulgada en la presente) para generar y/o expandir una población de población de células presentadoras de antígeno Th1 activadas; y iii) administrar la célula presentadora de antígeno Th1 activada procedente de (ii) al sujeto para activar linfocitos T hacia un fenotipo Th1 específico de alérgeno. Células presentadoras de antígeno vírgenes adecuadas serán conocidas para los expertos en la técnica. Ejemplos ilustrativos incluyen células dendríticas y fibroblastos.
El tipo de célula que expresa la proteína de fusión solo está limitado en que la célula debe ser una célula nucleada que exprese una molécula del MHC Clase I. A este respecto, la célula puede ser una célula procedente de una línea celular (p. ej. una línea celular CHO, una línea celular HEK, una línea celular de fibroblastos, etc.) o una célula primaria (p. ej., un fibroblasto, una célula dendrítica). En realizaciones por las que la célula está destinada a un tratamiento autólogo ex vivo, la célula puede ser una célula que se puede retirar fácilmente de un sujeto (p. ej. una célula de la sangre, la linfa, la médula ósea) y/o cultivar fácilmente a partir de una muestra tisular (p. ej. fibroblastos). En algunas realizaciones, la célula puede ser una célula presentadora de antígeno profesional (p. ej. una célula dendrítica, un macrófago, una célula B, una célula epitelial, etc.) o puede ser una célula presentadora de antígeno no profesional (p. ej. un fibroblasto, una célula epitelial tímica, una célula epitelial tiroidea, una célula glial, una célula beta pancreática, una célula endotelial vascular, etc.).
Expresar la proteína de fusión en una célula ex vivo (p. ej., transfectando la célula con el vector poxviral divulgado en la presente) puede ser ventajoso ya que se puede controlar el número de células que expresan el ácido nucleico. Por otra parte, un intervalo más amplio de sistemas de aporte de ácidos nucleicos está disponible para células ex vivo.
Las células que expresan la proteína de fusión (es decir , las células transfectadas) se pueden administrar a continuación a un sujeto para activar células T vírgenes en el sujeto hacia un fenotipo Th1 específico de alérgeno de cacahuete, que a continuación puede desensibilizar o inducir tolerancia en el sujeto a uno o más alérgenos de cacahuete. Alternativamente, las células que expresan la proteína de fusión se pueden cultivar con linfocitos ex vivo para generar linfocitos Th1 reactivos con alérgeno de cacahuete, que a continuación se pueden administrar al sujeto.
Según esto, también se divulga un método para generar y/o expandir un linfocito Th1 reactivo con alérgeno de cacahuete ex vivo, en donde el método incluye cultivar una célula que expresa la proteína de fusión con uno o más linfocitos T. Los linfocitos T pueden estar incluidos en una población mixta de linfocitos o pueden ser linfocitos T aislados. Las poblaciones mixtas de linfocitos se pueden obtener fácilmente de sangre periférica, linfa o médula ósea mediante métodos conocidos en la técnica. Las células T se pueden aislar de estas poblaciones mixtas de linfocitos mediante métodos conocidos en la técnica incluyendo, por ejemplo, aislamiento con lana de nailon, clasificación FACS, separación con cuentas magnéticas, etc. En algunas realizaciones, se pueden aislar subgrupos de linfocitos T particulares para cultivar con la célula que expresa el ácido nucleico.
Se entenderá por los expertos en la técnica que, cuando se transfectan células ex vivo para expresar la proteína de fusión y/o cuando una población de linfocitos Th1 se genera y/o expande ex vivo, según se divulga en la presente, a menudo es deseable usar células autólogas (es decir, células derivadas del sujeto que se va a tratar), evitando o minimizando de ese modo una respuesta inmunitaria que se pueda producir cuando se usan y se administran al sujeto células alogénicas (es decir, células derivadas de un sujeto diferente).
La expansión ex vivo de linfocito Th1 reactivo con alérgeno de cacahuete se puede usar para generar grandes números de linfocito Th1 reactivo con alérgeno de cacahuete, que a continuación se puede administrar a un sujeto tal como un tratamiento profiláctico o terapéutico de la alergia a los cacahuetes. En algunos casos, la expansión ex vivo puede acelerar la activación y la expansión de linfocitos Th1 reactivos con alérgeno de cacahuete en comparación con la activación y expansión in vivo. Por otra parte, la expansión ex vivo permite el control sobre el número y la reactividad de linfocitos Th1 reactivos con alérgeno de cacahuete que se expanden. En algunas realizaciones, los linfocitos Th1 reactivos con alérgeno de cacahuete pueden ser autólogos para el sujeto.
Según esto, también se divulga un método para desensibilizar a un sujeto hacia un alérgeno de cacahuete, incluyendo el método: (i) recoger linfocitos del sujeto; (ii) cocultivar los linfocitos con células que expresan la proteína de fusión para generar y/o expandir un linfocito Th1 que reconoce fragmentos peptídicos de proteínas de fusión degradadas proteasómicamente asociados con moléculas del MHC Clase I sobre las células; y (iii) administrar los linfocitos Th1 procedentes de (ii) al sujeto. Los linfocitos se pueden recoger del sujeto antes de la administración del vector poxviral que se divulga en la presente.
El método puede incluir aislar los linfocitos procedentes de la etapa (ii) antes de la administración al sujeto. El aislamiento de los linfocitos procedentes de la etapa (ii) puede incluir aislar todos los linfocitos de las células que expresan el ácido nucleico y/o puede incluir aislar uno o más tipos de linfocitos (p. ej. todos los linfocitos células T, todos los linfocitos Th1, etc.). Alternativamente, los linfocitos Th1 procedentes de (ii) se pueden administrar al sujeto sin aislar los linfocitos de las células que expresan la proteína de fusión, en cuyo caso las células administradas que expresan la proteína de fusión pueden continuar activando linfocitos Th1 adicionales in vivo. Métodos para aislar linfocitos de un sujeto, métodos para aislar células T y subgrupos de células T incluyen los métodos descritos anteriormente.
También se hacen posibles en la presente métodos en los que se obtienen linfocitos T, ya sea aislados o no, del sujeto tratado según la presente invención, y determinando si los linfocitos están sesgados hacia un fenotipo Th1, según se divulga en la presente (p. ej., determinar el perfil de expresión de citocinas ex vivo). Este enfoque tiene la ventaja añadida de determinar si la administración del vector poxviral ha inducido una respuesta inmunitaria específica de alérgeno sesgada hacia Th1 en el sujeto. Así, el método incluye determinar si los linfocitos aislados de la etapa (ii) están sesgados hacia un fenotipo Th1 antes de su administración al sujeto.
La desensibilización o la inducción de tolerancia de un sujeto a un alérgeno de cacahuete puede prevenir o reducir reacciones de hipersensibilidad contra una exposición posterior del sujeto a los cacahuetes. Como tales, los métodos descritos anteriormente pueden reducir el riesgo de reacciones anafilácticas a los cacahuetes en sujetos previamente alérgicos a los cacahuetes tras una exposición posterior del sujeto a los cacahuetes y/o reducir el riesgo de reacciones anafilácticas a los cacahuetes en sujetos con riesgo de desarrollar una alergia a los cacahuetes.
La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Se debe entender que la siguiente descripción tiene el propósito de describir realizaciones particulares.
EJEMPLOS
Materiales y Métodos
Producción de un Antígeno PHAV: Una secuencia de ácido nucleico para una proteína de fusión (antígeno PHAV) que incluye un monómero de ubiquitina C (Ubc) humana y cuatro alérgenos de cacahuete se diseñó como se indica e ilustra en la Figura 1A.
La secuencia de aminoácidos para Ubc (NM_021009), ara h 1 (entrada de Swiss-Prot P43238), ara h 2 (entrada de TrEMBL Q8GV20), ara h 3 (proteína del Genbank ACH91862) y ara h 6 (entrada de UniProtKB/TrEMBL Q647G9) se obtuvo de bases de datos de secuencias proteínicas en línea. El aminoácido del codón de iniciación Met (M) se retiró de las secuencias proteínicas de ara h 1, ara h 2, ara h 3 y ara h 6 antes de enlazar las secuencias para formar una secuencia proteínica continua en el orden de: Ubc ara h1+ ara h2+ ara h3 ara h6. La secuencia de ADN que codifica esta proteína de PHAVag se obtuvo mediante traducción inversa usando una tabla preferida de codones de Homo Sapiens.
La secuencia de aminoácidos de PHAVag se tradujo inversamente en una secuencia nucleotídica usando Gene Designer (DNA2.0 Inc) y se empleó una optimización codónica de Homo Sapiens fijada a un umbral de 10%. También se filtraron secuencias repetidas de 8 bases o más. La secuencia resultante se cribó adicionalmente con respecto a elementos potenciales y desestabilizadores de la formación de la estructura secundaria mediante DNA2.0 Inc. La secuencia nucleótidica final de la secuencia de la proteína de PHAVag se cribó con respecto al motivo de transcripción temprano de poxvirus "TTTTTNT". Sin embargo, no se encontró ninguno.
Al final de la codificación de la secuencia nucleotídica que codifica el antígeno PHAV, se añadió un codón de terminación "TAA". La secuencia de terminación de la transcripción temprana poxviral TTTTTAT también se añadió inmediatamente después del codón de terminación. El casete de expresión se flanqueó con conectores Pac I. Como los sitios de reconocimiento de Pac I no estaban presentes dentro del casete, este casete se podía clonar en plásmidos y escindir entero de un plásmido mediante digestión con la endonucleasa de restricción Pac I.
Como se muestra en la Tabla 1, Ubc, ara h 1, ara h 2, ara h 3 y ara h 6 en el antígeno PHAV tenían alrededor de 75% de identidad de secuencia del ácido nucleico con las secuencias naturales.
Tabla 1: Comparación se secuencias de componentes del antígeno PHAV y secuencias naturales
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Un compendio de las secuencias de ácido nucleico y amínicas de la construcción del antígeno PHAV y sus componentes se indica en la Tabla 2.
Tabla 2: Compendio de Secuencias
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Producción de un antígeno PHAV alternativo: Se elaboró un antígeno de vacuna hipoalergénica para cacahuete ubiquitinado (UBc.PHAVag) que comprendía una secuencia proteínica del antígeno PHAV constituida por una fusión de las siguientes secuencias codificantes de proteína - monómero de ubiquitina C, el alérgeno de cacahuete ara h 1, alérgeno de cacahuete ara h 2, alérgeno de cacahuete ara h 3 y alérgeno de cacahuete ara h 6.), secuencia de terminación de la transcripción temprana poxviral y finalmente otro conector Pac 1.
El monómero de ubiquitina C se modificó en el extremo C para reemplazar al residuo de Gly (G) terminal por Ala (A). La ubiquitina C modificada orienta el antígeno PHAV tras la síntesis a la ruta de degradación proteasómica en la célula anfitriona (véase la Figura 9). Esto asegura que no se presente proteína intacta para la producción de anticuerpo y que los fragmentos peptídicos resultantes se procesen mediante la ruta del MHC clase I, desencadenando una respuesta inmunitaria de Th1 al antígeno PHAV.
La configuración y las características de los casetes de expresión de PHAV se muestran esquemáticamente en la Figura IB e incluyen conectores de endonucleasa de restricción Pac I en los extremos 5' y 3', así como un promotor temprano/tardío de variolovacuna en el extremo 5'.
La secuencia de aminoácidos para UBc, ara h 1, ara h 2, ara h 3 y ara h 6 se obtuvo de las bases de datos de proteínas bien de Swit-Prot o bien de EMBL. El codón de iniciación que codifica un residuo de Met (M) se retiró de las secuencias de ácido nucleico de ara h 1, ara h 2, ara h 3 y ara h 6 antes de enlazarlas hasta formar la secuencia de ácido nucleico continua que codifica la secuencia proteínica UBc+h1+h2+h3+h6, en ese orden.
La secuencia de ADN para codificar este UBc.PHAVag se obtuvo mediante traducción inversa usando una tabla preferida de codones de Homo Sapiens. La secuencia de aminoácidos de UBc.PHAVag se tradujo inversamente en una secuencia nucleotídica usando Gene Designer (DNA2.0 Inc) y empleando optimización codónica de Homo Sapiens fijada a un umbral de 10% y filtrando secuencias repetidas de 8 bases o más. La secuencia resultante se cribó adicionalmente con respecto a elementos potenciales y desestabilizadores de la formación de la estructura secundaria mediante DNA2.0 Inc. La secuencia nucleótidica final que codifica UBc.PHAVag se cribó con respecto al motivo de transcripción temprano poxviral "TTTTTNT" - no se encontró ninguno. Al final de la codificación de la secuencia nucleótidica con respecto a UBc.PHAV, se añadió el codón de terminación "TAA". La secuencia de terminación de la transcripción temprana poxviral TTTTTAT también se añadió inmediatamente después del codón de terminación. El casete de expresión se flanqueó con conectores de Pac I y, debido a que no están presentes dentro del casete sitios de reconocimiento de Pac I, este casete se puede clonar en plásmidos y escindirse entero del plásmido mediante digestión con la endonucleasa de restricción Pac I. La secuencia de ADN del casete de expresión UBc.PHAV se puede encontrar en la Figura 2.
También se construyó un antígeno de vacuna hipoalergénica para cacahuete en el que se omitía el monómero de ubiquitina en el extremo 5'. Esta construcción era idéntica a la construcción UBc.PHAVag, que se describe anteriormente, pero sin la secuencia de ubiquitina. Esta construcción se denominó PHAVag y una representación esquemática de la configuración y las características de PHAVag se puede encontrar en la Figura 1C y la secuencia de ADN se puede encontrar en la Figura 3.
Ambos casetes de expresión UBc.PHAVag y PHAVag se clonaron en plásmidos bacterianos de modo que este casete de expresión se pudiera recuperar después de la clonación mediante digestión con PacI/Sbf I y purificación en gel. Se podrían elaborar antígenos de vacuna hipoalergénica para cacahuete ubiquitinados adicionales que incluyeran los siguientes alérgenos de cacahuete:
(i) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 y ara h 11;
(ii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 y ara h 10;
(iii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 y ara h 9;
(iv) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 y ara h 8;
(v) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 y ara h 7;
(vi) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5 y ara h 6;
(vii) ara h 1, ara h 2, ara h 3, ara h 4 y ara h 5;
(viii) ara h 1, ara h 2, ara h 3 y ara h 4;
(ix) ara h 1, ara h 2 y ara h 3;
(x) ara h 1 y ara h 2;
(xi) ara h 1;
(xii) ara h 2;
(xiii) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10, y ara h 11;
(xiv) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 y ara h 10;
(xv) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 y ara h 9;
(xvi) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 y ara h 8;
(xvii) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 y ara h 7;
(xviii) ara h 2, ara h 3, ara h 4, ara h 5 y ara h 6;
(xix) ara h 2, ara h 3, ara h 4 y ara h 5;
(xx) ara h 2, ara h 3 y ara h 4;
(xxi) ara h 2 y ara h 3;
(xxii) ara h 3;
(xxiii) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 y ara h 11; (xxiv) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 y ara h 10;
(xxv) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 y ara h 9;
(xxvi) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 y ara h 8;
(xxvii) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5, ara h 6 y ara h 7;
(xxviii) ara h 1, ara h 3, ara h 4, ara h 5 y ara h 6;
(xxix) ara h 1, ara h 3, ara h 4 y ara h 5;
(xxx) ara h 1, ara h 3 y ara h 4;
(xxxi) ara h 1 y ara h 3;
(xxxii) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 y ara h 11; (xxxiii) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 y ara h 10;
(xxxiv) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 y ara h 9;
(xxxv) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 y ara h 8;
(xxxvi) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5, ara h 6 y ara h 7;
(xxxvii) ara h 1, ara h 2, ara h 4, ara h 5 y ara h 6;
(xxxviii) ara h 1, ara h 3, ara h 4 y ara h 5;
(xxxix) ara h 1, ara h 2 y ara h 4;
(xl) ara h 1, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9, ara h 10 y ara h 11;
(xli) ara h 1, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8, ara h 9 y ara h 10;
(xlii) ara h 1, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7, ara h 8 y ara h 9;
(xliii) ara h 1, ara h 4, ara h 5, ara h 6, ara h 7 y ara h 8;
(xliv) ara h 1, ara h 4, ara h 5, ara h 6 y ara h 7;
(xlv) ara h 1, ara h 4, ara h 5 y ara h 6;
(xlvi) ara h 1, ara h 4 y ara h 5;
(xlvii) ara h 1 y ara h 4;
(xlviii) ara h 4; etc.
Las secuencias de aminoácidos para ara h1, h2, h3, h4, h5, h6, h7, h8, h9, h10 y h11 se obtienen fácilmente a partir de bases de datos de proteínas bien de Swit-Prot o bien de EMBL. El codón de iniciación que codifica un residuo de Met (M) y también el codón de terminación se retirarían de las secuencias de ácido nucleico de ara h antes de enlazarlas hasta formar una secuencia de ácido nucleico continua que codifica una proteína de fusión de cualesquiera dos o más de las proteínas de ara h, y en cualquier orden particular. Sin embargo, se requeriría un codón de iniciación al principio de la secuencia codificante de la proteína de fusión y un codón de terminación para terminar la expresión de la proteína de fusión codificada.
Construcción de plásmido de recombinación homologa de virus variolovacunal: El casete de recombinación homóloga consiste en el siguiente elemento, todos los cuales se elaboraban sintéticamente por GeneArt GmbH de Life Technologies: (i) brazo de recombinación homóloga izquierdo de 500 pb que flanquea aguas arriba del ORF A39R de VACV de la cepa de Copenhague, (ii) casete de expresión de EGFP bajo el control de un promotor temprano tardío de variolovacuna y que termina en la secuencia de terminación de la transcripción temprana poxviral (TTTTTNT), (iii) casete de expresión Ecogpt bajo el control de un promotor temprano tardío de variolovacuna y que termina en la secuencia de terminación de la transcripción temprana poxviral (TTTTTNT); (iv) el casete de expresión de antígeno de vacuna hipoalergénica para cacahuete (UBc.PHAVag o PHAVag) que se describe anteriormente, (v) brazo de recombinación homóloga derecho de 500 pb que flanquea agua abajo del ORF A39R de VACV de la cepa de Copenhague. Una presentación esquemática de estos casetes se puede encontrar en la Figura 4 y sus secuencias de ADN se pueden encontrar en las Figuras 6 y 7.
Ambos casetes de recombinación homóloga UBc.PHAV y PHAV se flanqueaban con sitios de enzima de restricción Not I y se clonaron en plásmidos para formar los clones pTC11 (UBc.PHAV) y pTC12 (PHAV). Los plásmidos se muestran en la Figura 8. Como estos casetes se elaboraban sintéticamente, cualesquiera secuencias TTTTTNT que se presentaran con las secuencias codificantes de proteína de EGFP y Ecogpt se alteraron con mutaciones sinónimas sin afectar a las secuencias de aminoácidos codificadas.
Construcción de Virus Variolovacunal que expresa los antígenos de vacuna hipoalergénica para cacahuete:
Los casetes de expresión de PHAV se insertaron en el ORF A39R de la cepa de Copenhague de virus variolovacunal mediante recombinación homóloga. La Figura 4 muestra un mapa que ilustra el sitio de la inserción dentro del ORF A39R. Brevemente, esto se llevó a cabo al infectar células BHK21 a una baja multiplicidad de infección (moi) de 0,01 pfu por célula durante 45 minutos y a continuación transfectar las células con cualquiera de los vectores plasmídicos pTC11 o pTC12 linealizados con Not I. A continuación, las células infectadas/transfectadas se recolectaron una vez que la infección alcanzaba la finalización. A continuación, las células recolectadas se trataron en baño ultrasónico para elaborar extractos virales y estos extractos de virus se sometieron a una ronda de purificación por calvas bajo selección positiva con ácido micofenólico (MPA) en presencia de xantina, hipoxantina, aminopterina y timidina. A continuación, los clones purificados por calvas se amplificaron secuencialmente bajo selección positiva con MPA para formar una solución madre de virus para siembra. El virus variolovacunal recombinante que alberga el casete de expresión UBc.PHAVag se denominó SCV201C y el virus recombinante que alberga el casete de expresión PHAVag se denominó SCV202C.
Protocolos detallados para elaborar virus variolovacunal recombinante usando el método de selección de Ecogpt se pueden encontrar en Smith 1993. El método esbozado para elaborar SCV201C y SCV202C se esboza posteriormente.
Recombinación homóloga: Para cada construcción viral, tres matraces T25 que contenían medio de crecimiento (RPMI-1640/10% de FCS/Glutamax 2 mM/Penicilina-estreptomicina) se sembraron con células BHK21 y se cultivaron hasta subconfluencia a 37°C/5% de CO2. El día de la infección, dos matraces se infectaron con VACV-COP a una moi 0,01 pfu/célula, donde el otro matraz no se infectaba (control sin infección). Después de infectar el matraz 1 y 2 durante 45 min a temperatura ambiente, los inóculos virales se retiraron y la monocapa de células se lavo dos veces con PBS. Después del lavado, se añadieron 4 ml de medio de mantenimiento (MM: RPMI-1640/2% de FCS/Glutamax 2 mM/penicilina-estreptomicina) a cada matraz incluyendo el Matraz 3 que también había pasado a través de la misma etapa de lavado.
La transfección se llevó a cabo usando el reactivo de transfección Effectene (Qiagen, N° Cat 301425) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron 16 ^l de potenciador a 2 |jg de pTC11 o pTC12 linealizado en 150 de tampón EC y se dejaron reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente después de mezclar a fondo. Se añadieron a esto 25 pl de reactivo de transfección Effectene, se mezclaron a fondo y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Finalmente, se añadió 1 mi de MM (RPMI-1640/2% de FCS/Glutamax 2 mM/penicilina-estreptomicina) mezclado a fondo mezclados suavemente entre sí. Esta mezcla de transfección se añadió a continuación al matraz 1 que previamente se había infectado con VACV-COP.
El matraz 1 (recombinación homóloga), el Matraz 2 (control solo con infección) y el Matraz 3 (control no infectado) se incubaron durante la noche a 37°C/5% de CO2 donde al día siguiente cada matraz tenía un cambio medio con MM reciente que contenía 25 pg/ml de ácido micofenólico (MPA), 250 pg/ml de xantina y 1x HAT (Sigma n° Cat H0262-10VL) - 5 ml por matraz y se incubaron adicionalmente a 37°C/5% de CO2 hasta que se podían observar CPE notables solamente en el Matraz 1. Había pocos o ningún signo de CPE notables en el Matraz 2 ya que el tratamiento con MPA inhibía la extensión por VACV-COP de la infección, y la monocapa parecía sana en el Matraz 3.
Las células del Matraz 1 se recolectaron al rascar las células en el medio de cultivo, a continuación se nodulizaron mediante centrifugación a baja velocidad (500 g durante 5 minutos a temperatura ambiente) seguido por resuspensión de la pella celular en 1 ml de T ris-HCl 10 mM pH8. Se preparó un extracto viral mediante múltiples ciclos de congelación y descongelación y a continuación se almacenó a -80°C listo para la fase de purificación por calvas. Las construcciones virales se denominaron SCV201C (inserción de UBc.PHAV) y SCV202C (inserción de PHAV).
Procedimiento de purificación por calvas: El extracto de recombinación homóloga se diluyó en serie y cada dilución se usó para infectar una fila de células BHK21 cultivadas en una placa de 48 pocillos en presencia de MPA. El objetivo era diluir el virus hasta 1 pfu de infección por pocillo y buscar pocillos que contuvieran solo 1 calva fluorescente después de aprox. 30 h de infección antes de la recolección.
Se sembraron células BHK21 en cada pocillo de una placa de 48 pocillos y se cultivaron hasta 100% en medio de crecimiento (RPMI-1640/10% de FBS/Glutamax 2 mM/penicilina-estreptomicina) a 37°C/5% de CO2. Posteriormente, el medio se reemplazó por MM que contenía 25 pg/ml de MPA, 250 pg/ml de xantina y 1x HAT (Sigma n° H0262-10VL) y se incubó adicionalmente durante la noche.
Para la infección, los extractos de recombinación homóloga (SCV201C y SCV202C) se descongelaron y se sometieron brevemente a un baño ultrasónico para disgregar grumos y agregados. Se realizó una dilución en serie de diez veces hasta 10-5 de cada extracto viral usando MM (RPMI/2% de FBS/Glutamax/penicilina-estreptomicina) en volúmenes de 1 ml. Para cada dilución, una fila de la placa de 48 pocillos se sembró con 100 ul de virus diluido después de retirar el medio de crecimiento de cada pocillo y se lavó una vez con PBS. La placa de 48 pocillos se dejó a temperatura ambiente durante 45 minutos para que se produjera la adsorción viral. Después de la adsorción viral, el inóculo viral se retiró cuidadosamente de cada pocillo, donde el inóculo residual se retiraba mediante una etapa de lavado que consistía en 500 pE de PBS por pocillo. Después de lavar, se añadieron a cada pocillo 500 pE de MM (RPMI/2% de FBS/Glutamax/penicilina-estreptomicina) que contenía 25 pg/ml de MPA, 250 pg/ml de xantina y 1x HAT (Sigma n° Cat H0262-10VL) y a continuación se incubaron a 37°C/CO2 hasta que se pudieran observar claramente focos verdes fluorescentes de infecciones bajo un microscopio fluorescente.
Para la recolección, solo se seleccionaron los pocillos que contenían un solo foco fluorescente a la dilución más alta posible. El medio procedente de pocillos seleccionados se retiró cuidadosamente y se añadieron 100 pl de TrisHCl 10 mM pH 8. La placa se congeló-descongeló tres veces y se recuperaron los contenidos de los pocillos seleccionados.
Un clon seleccionado se amplificó adicionalmente al infectar 1 pocillo de una placa de 6 pocillos que contenía células BHK21 al 100% de confluencia que se habían pretratado durante la noche con 25 pg/ml de MPA, 250 pg/ml de xantina y 1x HAT (n° Cat de Sigma H0262-10VL), al retirar el medio de cultivo del pocillo y añadir 10 p de extracto viral diluido hasta 500 pE en PBS. Después de 45 min a temperatura ambiente, se añadieron al pocillo 2 ml de MM que contenía 25 pg/ml de MPA, 250 pg/ml de xantina y 1x HAT (n° Cat de Sigma H0262-10VL) y se incubaron adicionalmente a 37°C/5% de CO2 durante 3 días hasta que la mayoría de las células emitieran fluorescencia verde bajo un microscopio fluorescente. Las células dentro del pocillo infectado se rascaron al medio de cultivo y a continuación se nodulizaron a 500 g durante 5 minutos. Las células nodulizadas se resuspendieron en 500 pE de TrisHCl 10 mM pH8 y se sometieron a un baño ultrasónico brevemente para elaborar un extracto viral.
Una porción de este extracto se usó para la amplificación adicional al infectar cinco matraces T175 de BHK21 bajo selección con MPA. Las células infectadas se recuperaron y a continuación se nodulizaron a 500 g durante 5 min. Las células nodulizadas para los cinco matraces se resuspendieron en 5 ml de TrisHCl 10 mM pH 8 y se sometieron brevemente a un baño ultrasónico para elaborar un extracto viral. A continuación, el material insoluble se retiró al nodulizar a 500 g durante 5 min. A continuación, el sobrenadante (extracto viral) se valoró en células BHK21 usando el siguiente procedimiento esbozado posteriormente y la presencia del UBc.PHAV insertado dentro del ORF A39R se confirmó mediante análisis por PCR.
Valoración: La valoración se llevó a cabo usando un formato de placa de 24 pocillos. Las calvas eran claramente distinguibles como orificios teñidos por contraste con violeta cristal en la monocapa (calvas), según se observa a simple vista.
Para cada virus recombinante que se vaya a valorar, una placa de 24 pocilios se sembraba con células BHK21 y se cultivaba hasta confluencia en medio de crecimiento (RPMI/10% de FBS/Glutamax/penicilina-estreptomicina). El día de la valoración, cada solución madre viral se descongeló y se trató en baño ultrasónico para disgregar grumos y conglomerados. Cada virus se diluyó en serie en PBS hasta 10-8. El medio se retiró de cada pocillo y, empezando desde la dilución de 10-8, se añadieron 500 pl de cada dilución a cada pocillo de una columna en la placa de 24 pocillos (4 pocillos por dilución) y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 45 min para que el virus se adsorbiera a las células. Después de esto, el inóculo viral se retiró de cada pocillo, donde cada pocillo se lavó a continuación una vez con PBS. Después de lavar, se añadió a cada pocillo 1 ml de MM (RPMI/2% de FBS/Glutamax/penicilinaestreptomicina) y las placas se incubaron a 37°C/5% de CO2 hasta que se pudieran observar calvas en las monocapas. Para la tinción por contraste de las calvas, el medio de cada pocillo se retiró y se añadieron a cada pocillo 500 pE de solución de violeta cristal (0,4% p/v en etanol al 20%). La tinción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 15­ 30 min, donde después el tinte violeta cristal se retiró de cada pocillo y cada pocillo se dejó secar al aire antes de contar las calvas. A partir de la dilución que daba lugar a 10-30 recuentos por pocillo, se calculó la media. A continuación, este valor se multiplicó por la recíproca de la dilución en serie y a continuación se multiplicó además por 2 (es decir, 2 x 500 pl = 1 ml) para producir la valoración en pfu/ml.
Prueba de inmunogenicidad de SCV201C en ratones C3H/HeJ: Para probar la inmunogenicidad de SCV201C y determinar si el antígeno PHAV ubiquitinado puede inducir una respuesta inmunitaria de Th1 específica de proteínas de cacahuete, 3 grupos de ratones C3H/HeJ (5 ratones por grupo) se vacunaron con lo siguiente: (i) 106 pfu de SCV201C administrados intraperitonealmente (IP), (ii) 106 pfu de SCV000 administrados intraperitonealmente (IP) y (iii) PBS administrada intraperitonealmente (IP). Se tomaron muestras de sangre justo antes de la vacunación (prevacunación) y 17 días después de la vacunación. Se recogieron los bazos para el perfilado de citocinas 9 semanas después de la vacunación.
Preparación de extracto de proteína de cacahuete soluble: El método usado para extraer proteína de cacahuete soluble de cacahuetes tostados no salados se derivaba de los procedimientos descritos por Sachs y cols. (1981) y Burks y cols. (1992). Los cacahuetes tostados no salados se adquirieron de una tienda de ultramarinos local. A continuación, los frutos secos se pulverizaron en un mezclador hasta una harina y a continuación hasta una pasta mantecosa. Los lípidos/las grasas se retiraron de la mantequilla de cacahuete mediante las adiciones del reactivo desengrasante hexano. Para hacer esto, se añadió n-hexano a la mantequilla de cacahuete y se batió vigorosamente para mezclar. La mezcla se transfirió a un vaso de precipitados de vidrio y se dejó sedimentar en fases de disolvente y sólida. La fase de disolvente (que contiene los lípidos/las grasas extraídos) se retiró de la fase sólida. La fase sólida se secó al aire hasta una torta. Esta torta se disolvió en NH4HCO30,1 M (2 ml por gramo) a 4°C durante 36 horas con agitación para extraer proteínas solubles. La suspensión se centrifugó durante 15 min a 10.000 g para retirar sólidos. El sobrenadante se dializó frente a tampón de fosfato 5 mM (pH 7 a pH 8) o PBS usando una membrana/un tubo de 3500 de MWCO. La solución dializada se centrifugó a 10.000 g durante 15 min a 4°C para clarificar el extracto. La concentración de proteína total en el extracto soluble se midió usando técnicas estándar. El extracto de proteína soluble resultante (10 mg/ml) se mantuvo a -20°C para el almacenamiento, y se descongeló antes del uso.
Cuantificación de IgE y IgG2a séricas específicas de cacahuete: Placas de ELISA de EIA/RIA de 96 pocillos de fondo redondo (Costar) se revistieron con 2 pg/pocillo de extracto de cacahuete purificado en PBS y se incubaron a 37°C durante 1 h y a continuación durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron con 200 pl/pocillo de PBS tres veces antes de bloquear con 5% de leche desnatada con PBS y 0,05% de Tween (SM+PBS+TW). La unión inespecífica se bloqueaba a 37°C durante al menos una hora antes de tres lavados de 200 pl/pocillo con PBS con 0,05% de Tween (PBS+TW). Después del lavado, las muestras de suero se diluyeron en primer lugar 1:100 para los ensayos de IgE, o 1:500 para los ensayos de IgG1 e IgG2a, en SM+PBS+TW. Las muestras de suero se diluyeron en serie a través de tres columnas. Diversos pocillos se dejaron sin suero como controles de fondo. Las placas se incubaron a 37°C durante una hora.
Las placas se lavaron cinco veces con 200 pl de PBS y se añadió (100 pl/pocillo) anticuerpo secundario (conjugado de anti-(IgE de ratón) caprina y HRP 1:500, Alpha Diagnostic; HRP y anti-(IgG2a de ratón) de rata 1:1000, BD Biosciences-BD Pharmingen) diluido en SM+PBS+TW. Las placas se incubaron durante una hora y a continuación se lavaron cinco veces como anteriormente, y se añadieron 100 pl/pocillo de solución de sustrato de hidrocloruro de ofenilendiamina (OPD) según las directrices del fabricante (SigmaFAST™ OPD, Sigma-Aldrich). Las reacciones se detuvieron con 20 pl/pocillo de HCl 1 M cuando se había empezado a desarrollar color en los pocillos 'en blanco' (variando de cinco minutos en los ensayos de IgG1 e IgG2a a 45 minutos para el ensayo de IgE). Las densidades ópticas se midieron a 450 nm sobre un lector de placas (EL808 Ultra Microplate Reader, Bio-tek Instruments Inc).
Las densidades ópticas para diluciones en serie procedentes de cada momento respectivo se representaron frente al factor de dilución en una escala logarítmica usando GraphPadPrisim V5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU. de A.). La valoración final para cada momento se determinó como el valor de dilución al que la curva intersectaba la densidad óptica de corte calculada (mínimo de tres veces la media del error estándar (SEM) de muestras de prevacunación pero mayor que el valor más alto de la densidad óptica medido para todas las muestras de prevacunación).
Análisis Estadísticos: Se realizaron comparaciones estadísticas usando GraphPad Prism V5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU. de A.). Se usó un análisis bidireccional de varianza (ANOVA) con posprueba de Bonferroni para deducir diferencias significativas entre los resultados de ELISA.
Ejemplo 1: La ubiquitinación del antígeno PHAV permitía la expresión satisfactoria de SCV201C pero no SCV202C
La expresión de SCV201C después de la inserción del casete de expresión UBc.PHAVag en el A39R de virus variolovacunal era satisfactoria. Después de la recombinación homóloga y durante la etapa de purificación por calvas, las placas resistentes a MPA se podían identificar claramente y amplificar en presencia de MPA para producir una solución madre de siembra que daba suficientes títulos para proceder a la siguiente etapa de pruebas de inmunogenicidad en ratones.
En contraste, la expresión de SCV202C era difícil de progresar más allá de la etapa de purificación por calvas, ya que no se podían encontrar placas claramente discernibles en el intervalo de dilución alta. Se podían detectar células infectadas fluorescentes en el intervalo de dilución bajo y a esta dilución solo se observaba 100% de CPE en los pocillos infectados en oposición a las calvas discernibles. Cuando estos pocillos se recolectaban y se sometían a amplificación adicional en presencia de MPA, se obtenía muy poco título viral, la mayoría del cual consistía en virus parental según se determinaba mediante análisis por PCR y ensayos de calvas que muestran la falta de calva fluorescente en ausencia de MPA.
La expresión de PHAVag después de la infección tenía un efecto inhibidor o tóxico sobre la propagación viral, que se superaba con la construcción SCV201C. Sin limitarse por una teoría o por un modo de aplicación particular, se postula que el efecto inhibidor o tóxico del PHAVag sintetizado era superado por el uso de un marcador de la degradación proteasómica tal como ubiquitina para orientar el PHAVag expresado a la degradación proteasómica.
Este efecto inhibidor de la propagación viral al expresar el PHAVag intacto se confirmó adicionalmente debido a que la construcción de un virus variolovacunal recombinante que contenía solo los casetes de expresión Ecogpt y EFGP insertados en el ORF A39R se podía conseguir fácilmente (denominado SCV000).
Ejemplo 2: Respuestas de anticuerpo específico de antígeno después de la vacunación
Los resultados se presentan en la Figura 10 para el nivel de anticuerpos tanto de IgE (Figura 10A) como de IgG2a (Figura 10B) séricas específicas de proteína de cacahuete antes y después de la vacunación (17 días después de la vacunación). Se puede observar claramente que la vacunación con SCV201C producía niveles significativos de IgG2a específica de proteína de cacahuete después de 17 días desde la vacunación. Estos niveles eran significativamente superiores que el control únicamente con vector (SCV000) y el control con PBS, demostrando que SCV201C produce una respuesta de anticuerpo contra proteína de cacahuete específica. Se debe apuntar que SCV201C producía una respuesta de IgE mucho menor en comparación con una respuesta de IgG2a; esto es, una dilución final de 1:2.500 para IgE en comparación con una dilución final que se aproxima a 1:1.000.000 para IgG2a. Por otra parte, la respuesta de IgE no era mucho mayor por encima de las respuestas inducidas por los controles de vector vacío (SCV000) o PBS.
Estos resultados muestran que SCV201C produce una respuesta de IgG2a a proteínas de cacahuete, pero muy poca respuesta de IgE, indicando que SCV201C había iniciado una respuesta inmunitaria sesgada a Th1 específica de cacahuete en respuesta a PHAVag.
Ejemplo 3: Perfil de citocinas de linfocitos después de la vacunación con SCV201C en ratones
Se recogieron bazos de ratones y se almacenaron en RPMI completo antes de transferirse a una placa de cultivo tisular de 60 mm. A continuación, los bazos se cortaron en tres secciones y se desagregaron en suspensión monocelular. A continuación, las células se filtraron y se lavaron con RPMI al 5% (300 g x 5 minutos). A continuación, los glóbulos rojos se sometieron a lisis en 5 ml de tampón de lisis alcalino durante 5 minutos, a continuación se diluyeron hasta 20 ml con RPMI al 5% y se centrifugaron a 200 g durante 5 minutos. A continuación, las células se resuspendieron y se contaron. Mientras tanto, se prepararon placas de 96 pocillos con pocillos de RPMI de control, antígeno de cacahuete soluble (100 pg/ml) y ConA (5 ug/ml). A continuación, los linfocitos se añadieron a 400.000 células/pocillo y se incubaron a 37°C durante 96 horas.
Después del período de incubación de 96 horas, se recogieron 100 pl de sobrenadante de cada uno y se congelaron a -80°C. A continuación, las citocinas de Th1/Th2 se cuantificaron mediante citometría de flujo según las instrucciones del fabricante (BD Biosciences n° 551287). A continuación, las muestras se pasaron por un citómetro de flujo BD FACSCanto II. Las concentraciones de citocinas se determinaron usando el programa Soft Flow FCAP Array. Todo el análisis adicional se realizó en Graph Pad 6.0.
Los resultados presentados en la Figura 11 muestran claramente que la vacunación con SCV201C produce una respuesta inmunitaria de Th1 sesgada a la exposición a proteína de cacahuete. Esto se ilustra por el nivel significativamente superior de IFN-gamma (IFN-g; una citocina de Th1 ; Figura 11A) en comparación con los niveles de IL4 e IL5 (citocinas de Th2; Figuras 11B y 11C) secretados por linfocitos cultivados obtenidos de bazos de los ratones vacunados con SCV201C.
Conclusión
La vacunación de ratones con SCV201C producía una respuesta inmunitaria sesgada de Th1 contra proteína de cacahuete. Una respuesta inmunitaria de Th1 específica de alérgeno dominará sobre una respuesta inmunitaria de Th2 específica de alérgeno existente y, al hacerlo, desensibilizará a un individuo a la exposición posterior al alérgeno. Los estudios divulgados en la presente muestran que el antígeno de vacuna hipoalergénica para cacahuete ubiquitinado (UBc.PHAVag) estimula una respuesta inmunitaria de Th1 específica contra proteína de cacahuete. Así, las vacunas que contienen el antígeno de vacuna hipoalergénica ubiquitinado que se describe en la presente se pueden usar para desensibilizar individuos hacia alérgenos de cacahuete y por lo tanto se pueden usar para tratar y/o prevenir reacciones alérgicas en individuos que son estimulados por la exposición a alérgenos de cacahuete.
Según se apunta anteriormente, la expresión de la construcción SCV201C era satisfactoria después de una infección, mientras que era difícil que la expresión de la construcción SCV202C no ubiquitinada progresara más allá de la etapa de purificación por calvas. Por lo tanto, la expresión de PHAVag después de una infección parece tener un efecto inhibidor o tóxico sobre la propagación viral, que se superaba con la construcción SCV201C ubiquitinada. Sin querer limitarse por una teoría o un modo de aplicación particular, se postula que el efecto inhibidor o tóxico del PHAVag sintetizado se superaba mediante el uso de ubiquitina, que orienta al PHAVag expresado hacia la degradación proteasómica. Como resultados de la degradación proteasómica orientada por ubiquitina de PHAVag, los fragmentos peptídicos pequeños de PHAVag entran en el retículo endoplásmico (ER) donde se complejan con proteínas del MHC clase I y a continuación se transportan a la superficie celular para ser presentados a linfocitos T (véase, por ejemplo, la Figura 9). La consecuencia de esto es que existe una presentación potenciada de los fragmentos de PHAVag con MHC clase I, dando como resultado una respuesta inmunitaria de Th1 mayor a alérgenos de cacahuete. Así, el marcador de la degradación proteasómica (p. ej., ubiquitina) previene inesperadamente que la proteína de fusión PHAVag intacta artificial inhiba la replicación viral.
Ara h 1, ara h 2, ara h 3 son los tres alérgenos de cacahuete principales que se ha observado que provocan reacciones alérgicas específicas de cacahuete en individuos sensibles. Ara h 6 se ha relacionado con una propensión infantil a la alergia a los cacahuetes (Flinterman y cols. 2007). Ara h 7 se identifica en 43% de los individuos alérgicos a los cacahuetes, ara h 8 se identifica en 85% de los individuos alérgicos a los cacahuetes, ara h 4 se identifica en 54% de los individuos alérgicos a los cacahuetes y ara h 5 se identifica en 13% de los individuos alérgicos a los cacahuetes.
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un vector poxviral que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende
(i) al menos los siguientes alérgenos de cacahuete
• ara h 1 según SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 4 en toda la longitud de SEQ ID NO: 4,
• ara h 2 según SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 6 en toda la longitud de SEQ ID NO: 6,
• ara h 3 según SEQ ID NO: 8, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 8 en toda la longitud de SEQ ID NO: 8,
• ara h 6 según SEQ ID NO: 10, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 10 en toda la longitud de SEQ ID NO: 10,
y
(ii) un marcador de la degradación proteasómica que es ubiquitina;
en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión está optimizada codónicamente para la expresión en células humanas.
2. El vector poxviral según la reivindicación 1, en donde el marcador de la degradación proteasómica comprende un monómero de ubiquitina.
3. El vector poxviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el marcador de la degradación proteínica es C-terminal o N-terminal en dicha proteína de fusión.
4. El vector poxviral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12 en toda la longitud de SEQ iD NO: 12.
5. El vector poxviral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el vector poxviral comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico indicada en SEQ ID NO: 11 en toda la longitud de SEQ ID NO: 11.
6. El vector poxviral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el marcador de la degradación proteasómica comprende SEQ ID NO: 2.
7. El vector poxviral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el marcador de la degradación proteasómica comprende ubiquitina C.
8. El vector poxviral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el vector poxviral es un vector variolovacunal.
9. El vector poxviral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para el uso en la prevención o el tratamiento de una alergia a los cacahuetes en un sujeto.
10. Un estuche que comprende el vector poxviral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
11. Una célula ex vivo que comprende y que expresa la secuencia de ácido nucleico que se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
12. Una composición farmacéutica que comprende el vector poxviral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un portador y/o diluyente fisiológicamente aceptable.
13. La composición farmacéutica según la reivindicación 12, para el uso en la desensibilización o la inducción de tolerancia en un sujeto a un alérgeno de cacahuete.
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