KR20150032286A - 알레르기 치료용 핵산 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 알레르기 치료용 DNA 백신을 제공한다. 본 백신은, 리소좀 관련 막 단백질(LAMP)의 루멘 도메인과 인프레임으로 융합된, 에피토프(들)가 유래되는 알레르겐 단백질의 하나 이상의 알레르겐 에피토프를 위한 코딩 서열, 바람직하게는 완전한 단백질 서열, 및 LAMP의 표적화 서열을 포함한다. 본 백신은 면역 반응을 생성하기에 적절하게 구성된 3차원 에피토프들의 제시를 가능하게 한다. 본 백신은 다가 분자일 수 있고/있거나, 2개 이상의 DNA 작제물을 함유하는 다가 백신의 일부로서 제공될 수 있다.
Description
관련 출원과의 교차 참조
본 출원은 2011년 6월 14일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/496,866호의 개시 내용에 의지하고 그의 출원일의 이득을 주장하며, 이 특허의 전체 개시 내용은 이로써 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 분자 생물학 및 의약 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 DNA 백신으로서의 사용을 위한 핵산, 및 알레르기 반응(allergic reaction)을 앓고 있거나 이에 취약한 대상체(subject)를 치료하기 위해 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
알레르기는 알레르겐(allergen), 또는 알레르기-유발성 분자에 대한 IgE 항체의 생산을 특징으로 하는 과민성 질환이다. 알레르기는 인구의 25% 넘게 영향을 준다. 알레르겐은 기도, 피부 접촉, 섭취, 곤충 교상, 또는 약물 주사를 포함한 많은 경로를 통해 인체에 들어올 수 있다.
알레르기 질환 관리는 진단 및 치료를 포함한다. 알레르기 전문의는 다양한 기술, 예컨대 피부 단자 시험(skin prick test), 방사성알레르겐흡착-기반(radioallergosorbent-based) 기술, ELISA, 또는 알레르겐 특이적 IgE를 입증하고 알레르겐 공급원을 확인하기 위한 유발 시험(provocation test)을 사용하여 알레르기를 진단한다. 알레르기의 치료는 가장 흔히 2가지 카테고리에 들어간다: 회피 및 항히스타민의 투약. 세 번째 대안인 알레르기 면역요법은, 알레르겐에 대한 면역 시스템의 반응의 재교육을 돕기 위하여, 환자가 소량의 원인(offending) 알레르겐들로 이루어진 주사를 매주 맞는 것을 필요로 한다.
알레르겐 융합 단백질의 용도 및 생성은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,566,456호는 IgE 및 IgG 결합 도메인을 가질 뿐만 아니라 알레르겐을 암호화하는 융합 단백질을 교시한다. 또한, 국제 출원 공개 WO 97/07218호는 알레르기 면역요법에 사용하기 위한 알레르겐-안티-CD32 융합 단백질을 교시한다. 그러나, 이들 문헌 중 어느 것도, 어떻게 그들 각각의 융합 단백질이 항원 제시(antigen presentation)를 통해 T 세포와 상호작용하여 Th1 반응을 유도 또는 변형시키는지를 교시하지 않는다. 더욱이, 안티-CD32 함유 백신을 수지상 세포로 안내하여 Th1 세포의 양성 유도에 영향을 주는 것 사이에 이론상의 연관성이 없다. 이들 문헌 둘 모두는, 알레르겐이 알레르겐-융합 단백질로서 혈청 내에서 발견될 수 있도록, 알레르겐을 치료학적으로 도입시키는 조성물을 교시한다.
토다(Toda) 등(2002)에 의해, 알레르겐의 T 세포 에피토프(epitope) - 이 경우에는 아미노산 247 내지 258에 위치된 Cry J2 에피토프임 - 가 융합 단백질에 부착되고 알레르기-특이적 면역요법을 수행하는 데 사용될 수 있음이 확립되었다. 토다 등(2002)에 의해 기술된 특정 조성물은, 클래스 II-관련 불변 사슬 펩티드(class II-associated invariant chain peptide, CLIP)에 부착된, 아미노산 247 내지 258에 위치된, Cry J2의 주요 CD4 T 세포 에피토프를 암호화하는 DNA 백신을 사용하는 것이다. CLIP은 리소좀/엔도좀 트래피킹 서열(lysosomal/endosomal trafficking sequence)을 함유하고, MHC II의 펩티드 결합 홈(groove)에 결합하는 도메인을 함유한다. 토다 등(2002)은 Cry J2 펩티드/CLIP DNA 백신에 의한 면역화가 Th1 반응이 우세하도록 마우스를 자극하게 된다는 것을 보여주는데, 이러한 우세한 Th1 반응은 더 높은 IFN-감마 및 IgG2a 생산을 특징으로 한다. 그러나, 토다 등은 알레르기-특이적 면역요법을 수행하는 데 유용한 알레르겐의 전체 단백질 코딩 서열의 세포내 표적화(intracellular targeting)를 교시하지 않는다.
미국 특허 제6,982,326호 및 미국 특허 제6,090,386호는 크립토메리아 자포니카(Cryptomeria japonica)의 주요 화분(pollen) 알레르겐 Cry J1, Cry J2, Jun s 1, 및 Jun v 1과 이들의 단편 또는 펩티드에 대해 코딩하는 핵산 서열을 기술한다. 상기 발명은 또한 정제된 Cry J1, Cry J2, Jun s 1, 및 Jun v 1, 및 Cry J1, Cry J2, Jun s 1, 및 Jun v 1에 대해 코딩하는 핵산 서열에 의해 형질전환된 숙주 세포 내에서 생산된 이들의 적어도 하나의 단편, 또는 이들의 적어도 하나의 단편, 및 Cry J1, Cry J2, Jun s 1, 또는 Jun v 1의 단편들, 또는 이들의 적어도 하나의 단편, 및 합성 제조된 Cry J1, Cry J2, Jun s 1, 또는 Jun v 1의 단편들을 제공한다. Cry J1, Cry J2, Jun s 1, 및 Jun v 1과 이들의 단편은 일본 삼나무 화분증(Japanese cedar pollinosis)의 진단, 치료, 및 예방에 유용한 것으로 개시되어 있다. 상기 발명은 또한 Cry J1 및 Cry J2의 단리된 펩티드를 제공한다. 상기 발명의 범주 내에 속하는 펩티드는 적어도 하나의 T 세포 에피토프, 또는 바람직하게는 Cry J1 또는 Cry J2의 적어도 2개의 T 세포 에피토프를 포함한다. 상기 발명은 또한 상응하는 천연 발생 알레르겐 또는 그의 일부분과 유사하거나 향상된 치료학적 특성을 갖지만 감소된 부작용을 갖는 변형된 펩티드(modified peptide)에 관한 것이다. 개체에서의 일본 삼나무 화분에 대한 민감성의 치료 또는 진단 방법과 치료학적 조성물, 및 상기 발명의 하나 이상의 펩티드를 포함하는 다중펩티드 제형이 또한 제공된다. 상기 발명은 면역자극 특성을 갖는 DNA 백신 내로 어떻게 에피토프 또는 알레르겐을 조합시키는지를 교시하지 않는다.
미국 특허 제7,547,440호 및 미국 특허 제7,112,329호는 편백나무(Japanese cypress)(히노키)의 화분 알레르겐 분자 상의 T-세포 에피토프 부위를 확인하고 있는데, 이는 편백나무 화분 알레르기를 앓고 있는 환자로부터 확립된 T-세포주를, 편백나무 화분 알레르겐의 1차 구조를 커버하는 중복 펩티드(overlap peptide)로 자극함으로써 행해진다. 이러한 펩티드는 편백나무 화분과의 교차 반응성을 갖는 편백나무 화분증을 가진 환자들을 포함한 봄 나무 화분증을 가진 환자들을 위한 펩티드-기반 면역요법에 유용하다. 이러한 펩티드는 또한 봄 나무 화분증의 진단에 유용하다. 상기 발명은 진단법 및 에피토프의 폴리펩티드 전달로 제한된다.
DNA 백신은 전통적인 전체 세포 또는 전체 바이러스 백신의 대안으로서 개발되어 왔다. 일반적으로 말하면, DNA 백신은 하나 이상의 에피토프를 암호화하는 서열들을 포함하는 조작된(engineered) 핵산이다. 이러한 핵산은 세포, 전형적으로는 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC)에 전달되고, 핵산이 발현되고, 발현된 단백질 상에 존재하는 에피토프가 엔도좀/리소좀 구획 내에서 처리되고, 궁극적으로 세포의 표면 상에 제시된다. 오거스트(August) 등의 미국 특허 제5,633,234호는 리소좀-관련 막 단백질(lysosomal-associated membrane protein, LAMP)의 엔도좀/리소좀 표적화 서열(endosomal/lysosomal targeting sequence)을 개시하고 특징규명한다. 이 특허는 상기 단백질의 C-말단 영역 내에서, 엔도좀/리소좀 구획으로의 상기 단백질의 표적화에 필요한 중대한 잔기들을 확인한다. 이 특허는 C-말단 LAMP 표적화 서열에 대한 항원 펩티드(antigenic peptide)의 융합이 면역 반응을 발생시키기 위한 에피토프의 향상된 처리 및 제시를 제공할 수 있다고 개시한다.
게다가, 하리스(Harris) 등의 미국 특허 출원 공개 제2004/0157307호는, "트래피킹 도메인"으로서 LAMP 루멘 도메인(lumenal domain)을 사용하여, DNA 백신으로부터 발현된 키메릭 단백질을 하나 이상의 세포성 구획/세포소기관(organelle)을 통해, 예컨대 리소좀 소포 경로(lysosomal vesicular pathway)를 통해 안내하는 것을 개시한다. 키메릭 단백질은 LAMP 폴리펩티드의 루멘 도메인, 사전에 확인되고 항원 단백질로부터 선택된 펩티드 에피토프 서열을 포함하는 항원 도메인, 막횡단 도메인, 및 엔도좀/리소좀 표적화 서열을 포함한다.
DNA 백신은 알레르기 질환(allergic disease)의 치료법으로서 제안되어 왔다(문헌[Raz et al., 1996]; 문헌[Hartl et al., 2004]; 문헌[Hsu et al., 1996]; 문헌[Crameri 2007]; 문헌[Weiss et al., 2006]). 바탕이 되는 논리적 근거는, DNA 백신에 의해 암호화된 알레르겐 단백질이, 특징적인 Th2형 반응, 예컨대 IL-4, IL-5, 및 IL-13의 분비, 및 B 림프구에 의한 IgE의 형성, 및 후기 반응에서의 호산구의 성숙 및 동원보다는 오히려, 우선적으로 APC, 자연 살해세포(natural killer, NK), 및 T 세포에 의한 인터페론의 생산에 의해 알레르겐-특이적 Th1 세포 반응을 활성화시킬 것이라는 것이다. 그러나, Th1 및 Th2 T-세포 표현형의 차별적인 유도의 바탕이 되는 기전은 다수의 인자, 예컨대 백신 제제의 세균 DNA의 특유한 특성, 예를 들어 비메틸화 및 CpG DNA 잔기, 선천성 면역에 의해 유도된 사이토카인 환경, 및 알레르겐의 세포 트래피킹 특성을 포함하는 것으로 보인다(문헌[Chen et al, 2001]; 문헌[Kaech et al, 2002]). 어떠한 발명 또는 방법도, 알레르겐을 암호화하는 핵산의 전달에 의해 수행된 바와 같은 알레르기 치료의 불확실성을 성공적으로 해결하지 못하였다. 따라서, 지금까지 그러한 알레르기 치료 방법이 가능하지 않았다. 게다가, 알레르기 질환의 치료를 위한 DNA 백신의 투여는 세포외 환경 내로의 알레르겐 펩티드의 분비를 가져왔으며, 이는 잠재적으로 IgE의 활성화를 통한 알레르기 반응의 우발적인 유발로 이어진다.
본 발명은 알레르겐 단백질(allergenic protein), 알레르겐 폴리펩티드(allergenic polypeptide), 및 알레르겐 펩티드(allergenic peptide)를 암호화하는 핵산(본 명세서에서 "작제물"이라고도 지칭됨)을 제공한다. 핵산은 면역 세포로의 전달 및 그러한 세포 내에서의 알레르겐 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드의 생산을 위해 설계된다. 암호화된 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드는 하나 이상의 에피토프의 처리(processing) 및 표시(display)를 위한 MHC-II 구획으로의 단백질의 표적화를 위한 표적화 서열을 가지며, 그 결과 에피토프(들)에 대한 면역 반응을 생성한다. 일반적으로, 핵산은 하기 도메인들을 포함하며, 이들 도메인은 암호화된 단백질의 각각의 도메인들과 상관된다: 신호 서열 도메인; 세포소기관내 안정화 도메인; 알레르겐 도메인; 막횡단 도메인; 및 세포질 리소좀/엔도좀 표적화 도메인.
암호화된 단백질과 관련하여, 신호 서열은 암호화된 단백질을 소포체 또는 리소좀으로 안내하기 위해 제공된다. 세포소기관내 안정화 도메인은 단백질 가수분해 저항성을 나타내도록 그리고 세포에 의한 에피토프 제시를 위한 처리 전에 단백질의 나머지 부분, 특히 알레르겐 도메인을 분해로부터 보호하도록 설계된 서열이다. 예시적인 실시 형태에서, 세포소기관내 안정화 도메인은 LAMP-1의 루멘 도메인이다. 알레르겐 도메인은 에피토프가 제시되는 동물에서 면역 반응을 일으키는 역할을 할 수 있는 하나 이상의 알레르겐 에피토프의 서열을 포함한다. 전형적으로, 알레르겐 도메인은 하나 이상의 알레르겐 단백질을 포함하지만, 실시 형태에서는, 알레르겐 단백질의 면역원성 폴리펩티드 또는 펩티드 단편이 사용될 수 있다. 하기에 논의되는 예시적인 실시 형태에서, 에피토프는 식물 알레르겐의 에피토프이다. 본 발명의 암호화된 단백질에서, 알레르겐 도메인은 신호 펩티드, 예컨대 알레르겐 단백질(들)의 일부로서 천연 발생하는 신호 펩티드(들)를 포함하지 않는다. 알레르겐 도메인은 단일의 알레르겐 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 포함할 수 있거나, 또는 2개 이상의 알레르겐 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 2개 이상의 알레르겐이 존재하는 경우, 각각의 알레르겐은 동일한 종/공급원으로부터 유래될 수 있거나 또는 하나 이상의 알레르겐이 하나 이상의 상이한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 2개 이상의 알레르겐이 존재하는 경우, 이들은 발현된 단백질 내의 각각의 코딩 영역의 동일한 수의 카피(copy)를 제공하도록 협조적으로 발현된다. 막횡단 도메인은 막을 통한 단백질의 삽입 및 이동을 안내하기에 적합한 임의의 서열일 수 있다. 많은 그러한 서열이 당업계에 알려져 있거나 용이하게 설계될 수 있다. 리소좀/엔도좀 표적화 도메인은 펩티드를 리소좀 또는 엔도좀으로 안내할 수 있는 임의의 서열일 수 있다. 그러한 서열은 당업계에 알려져 있으며, 본 명세서에서는 LAMP-1의 세포질 미부(cytoplasmic tail) 서열에 의해 예시된다.
상기에 언급된 바와 같이, 바람직한 실시 형태에서, 핵산은 알레르겐 단백질에 대한 전체 알레르겐 코딩 서열을 포함하지만 알레르겐의 신호 서열에 대한 코딩 서열이 결여되어 있는 알레르겐 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 핵산은 전체 알레르겐 코딩 서열을 포함하지 않으며, 대신, 발현될 때, 암호화된 폴리펩티드가 폴리펩티드 상에 존재하는 적어도 하나의 에피토프의 천연 3차원 구조를 달성하도록 접힐 수 있도록 하기에 충분한 양의 코딩 서열만을 포함한다. 전체 알레르겐 코딩 서열을 포함하는 작제물에서와 같이, 전체 코딩 서열보다 더 적은 코딩 서열이 존재하는 경우에도, 그러한 핵산 작제물은 또한 알레르겐 폴리펩티드 또는 펩티드를 위한 천연 발생 신호 펩티드에 대한 코딩 서열이 결여되어 있다.
바람직한 실시 형태에서, 핵산 작제물은 알레르겐 도메인 내에 다수의 알레르겐 단백질, 폴리펩티드, 및/또는 펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 존재하는 각각의 알레르겐은 동일한 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 각각은 상이한 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본 발명의 핵산, 및 이에 따른 암호화된 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드는 알레르기를 앓고 있거나 잠재적으로 발병될 수 있는 대상체, 특히 동물 대상체를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 치료 방법은 본 발명의 핵산을 하나 이상의 면역 세포에, 바람직하게는 면역 시스템의 하나 이상의 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC)에 전달하기에 충분한 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일단 전달되면, 핵산이 발현되고, 암호화된 단백질이 세포 내부에서 처리되고, 에피토프(들)가 세포의 표면 상에 표시된다. 이러한 치료 방법은 본 핵산 및 단백질을 사용하여 치료학적 또는 예방적 면역 반응을 제공하는 방법인 것으로 여겨질 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시 형태에 따른 핵산의 개략도인데, 여기서는 단일 에피토프를 포함하는 단일 항원이 알레르겐 도메인 내에 제공된다.
도 2는 본 발명에 따른 핵산의 벡터 맵을 도시하는데, 여기서는 알레르겐 도메인이, 인간 LAMP N-말단 서열들(SS 및 ISOD)과 인간 LAMP C-말단 서열들(TM 및 TG) 사이에 삽입된 CryJ2 알레르겐(C. 자포니카로부터 유래되는 알레르겐)을 포함하며, 그러나 이 알레르겐은 신호 서열을 갖지 않는다.
도 3은 본 발명의 대안적인 일 실시 형태에 따른 핵산의 개략도인데, 여기서는 단일 알레르겐의 다수의 에피토프 서열들이 알레르겐 도메인 내에 제공된다.
도 4는 본 발명의 대안적인 일 실시 형태에 따른 핵산의 개략도인데, 여기서는 다수의 상이한 알레르겐 서열들이 알레르겐 도메인 내에 제공된다.
도 5는 본 발명에 따른 핵산의 벡터 맵을 도시하는데, 여기서는 알레르겐 도메인이, 알레르겐 CryJ1(C. 자포니카로부터 유래되는 알레르겐) 및 CryJ2(C. 자포니카로부터 유래되는 알레르겐)에 대한 알레르겐 서열들(신호 펩티드들을 갖지 않음)을 포함한다.
도 6a는 알레르겐 도메인 내에 3개의 땅콩 알레르겐(AraH1, AraH2, 및 AraH3, 이들 모두는 신호 서열들이 결여되어 있음)을 포함하는 핵산의 벡터 맵을 도시한다.
도 6b는 도 6a의 핵산에 의해 암호화된 단백질의 개략도를 도시한다.
도 7은 본 발명에 따른 핵산의 벡터 맵을 도시하는데, 이 벡터 맵은 CryJ1 알레르겐 서열에 대한 천연 발생 신호 서열의 부재를 나타낸다. 이러한 특정 작제물은 하기에 상세히 설명되는 실험에서 알레르겐 서열들의 천연 신호 서열의 제거의 중요성을 보여주기 위해 사용된다.
도 8은 본 발명에 포함되지 않는 핵산 작제물의 벡터 맵을 도시하는데, 여기서는 CryJ2 알레르겐이 플라스미드 골격 상에 암호화되며, 그러나 이 골격에는 SS, IOS, TM, 및 TG 도메인이 부재한다. 이 작제물은 하기에 상세히 설명되는 실험에서 비교 대조군으로서 사용된다.
도 9는 293개의 세포에서의 본 발명에 따른 작제물의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯(Western blot)을 도시한다. 패널 A는, 안티-CryJ2 항체를 사용하여 검정할 때, 본 발명에 따른 작제물에서의 CryJ1-CryJ2 조합 알레르겐(도 5 참조) 및 CryJ2 알레르겐 단독(도 2 참조)의 발현을 보여준다. 패널 B는, 안티-CryJ1 항체를 사용하여 검정할 때, CryJ1-CryJ2 조합 알레르겐 및 CryJ1 알레르겐(그의 자연 신호 서열이 결여되어 있음; 도 7 참조)의 발현을 보여준다. 패널 B는 CryJ1 알레르겐에 대한 천연 신호 서열이 제거되지 않은 작제물(벡터 맵에 도시되지 않음)에서는 CryJ1 알레르겐의 발현이 검출불가능함을 추가로 보여준다.
도 10은 알레르겐 서열들을 포함하는 다른 작제물들과 비교할 때 본 발명에 따른 핵산 작제물의 유효성을 나타낸 선 그래프를 도시한다. 패널 A는, CryJ2 코딩 서열에 융합된 플라스미드 골격을 포함하는 작제물(도 8 참조)과 비교할 때, 본 발명의 CryJ2-LAMP 작제물(도 2 참조)의 투여의 결과로서 IgG1 생산 및 검출의 상당한 증가가 관찰되고 있음을 도시한다. 패널 B는, CryJ2 코딩 서열에 융합된 플라스미드 골격을 포함하는 작제물(패널 A에 따름)과 비교할 때, 본 발명의 CryJ2-LAMP 작제물(패널 A에 따름)의 투여의 결과로서 IgG2a 생산 및 검출의 상당한 증가가 관찰되고 있음을 도시한다.
도 11은 마우스에서의 CryJ2-LAMP 작제물의 투여 효과(dosing effect)를 나타낸 막대 그래프를 도시한다. 패널 A는 벡터 DNA 단독으로 주사하는 경우와 비교하여, 10 ug 내지 100 ug 범위의 다양한 양으로 DNA 백신을 주사한 후 21일째 및 28일째의 IgG2a 검출을 보여준다. 패널 B는, 벡터 DNA 단독으로 주사하는 경우와 비교하여, 10 ug 내지 100 ug 범위의 다양한 양으로 DNA 백신을 주사한 후 21일째 및 28일째의 IgG1 검출을 보여준다.
도 12는, 벡터 단독과 비교하여, 본 발명의 CryJ2-LAMP 작제물로 처리된 마우스 비장 배양액에서의 IL-4 및 IFN-감마의 유도에 대한 효과를 나타낸 막대 그래프를 도시한다. 패널 A는 IL-4의 효과를 보여준다. 패널 B는 IFN-감마의 효과를 보여준다.
도 13은 CryJ2-LAMP DNA 백신으로 사전에 감작화된 마우스의 면역화의 유효성을 나타낸 선 그래프를 도시한다. 패널 A는 시간 경과에 따른 IgG1 역가(titer)를 보여준다. 패널 B는 시간 경과에 따른 IgG2a 역가를 보여준다.
도 14는 마우스 비장 세포 배양액에서의 IFN-g(패널 A) 및 IL-4(패널 B)의 유도를 나타낸 막대 그래프를 도시한다.
도 15는 면역화된 마우스에서의 순환 CryJ2 단백질의 정량화를 나타낸 막대 그래프를 도시한다.
도 16은 CryJ2-LAMP 작제물로 면역화되고 재조합 CryJ2로 시험투여(challenge)된 기니아 피그들에 대한 IgG1 검출(패널 A) 및 IgG2 검출(패널 B)을 나타낸, 기니아 피그 데이터의 막대 그래프를 도시한다.
도 17은, 85일의 독성(toxicology) GLP 안전성 연구 동안, CryJ2-LAMP DNA 백신으로 면역화된 뉴질랜드 화이트 래빗에서의 안티-CryJ2 반응을 나타낸 막대 그래프를 도시한다.
도 18은 본 발명에 따른 작제물로부터의 땅콩 알레르겐 H1, H2, 및 H3의 공동발현을 나타낸 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 2는 본 발명에 따른 핵산의 벡터 맵을 도시하는데, 여기서는 알레르겐 도메인이, 인간 LAMP N-말단 서열들(SS 및 ISOD)과 인간 LAMP C-말단 서열들(TM 및 TG) 사이에 삽입된 CryJ2 알레르겐(C. 자포니카로부터 유래되는 알레르겐)을 포함하며, 그러나 이 알레르겐은 신호 서열을 갖지 않는다.
도 3은 본 발명의 대안적인 일 실시 형태에 따른 핵산의 개략도인데, 여기서는 단일 알레르겐의 다수의 에피토프 서열들이 알레르겐 도메인 내에 제공된다.
도 4는 본 발명의 대안적인 일 실시 형태에 따른 핵산의 개략도인데, 여기서는 다수의 상이한 알레르겐 서열들이 알레르겐 도메인 내에 제공된다.
도 5는 본 발명에 따른 핵산의 벡터 맵을 도시하는데, 여기서는 알레르겐 도메인이, 알레르겐 CryJ1(C. 자포니카로부터 유래되는 알레르겐) 및 CryJ2(C. 자포니카로부터 유래되는 알레르겐)에 대한 알레르겐 서열들(신호 펩티드들을 갖지 않음)을 포함한다.
도 6a는 알레르겐 도메인 내에 3개의 땅콩 알레르겐(AraH1, AraH2, 및 AraH3, 이들 모두는 신호 서열들이 결여되어 있음)을 포함하는 핵산의 벡터 맵을 도시한다.
도 6b는 도 6a의 핵산에 의해 암호화된 단백질의 개략도를 도시한다.
도 7은 본 발명에 따른 핵산의 벡터 맵을 도시하는데, 이 벡터 맵은 CryJ1 알레르겐 서열에 대한 천연 발생 신호 서열의 부재를 나타낸다. 이러한 특정 작제물은 하기에 상세히 설명되는 실험에서 알레르겐 서열들의 천연 신호 서열의 제거의 중요성을 보여주기 위해 사용된다.
도 8은 본 발명에 포함되지 않는 핵산 작제물의 벡터 맵을 도시하는데, 여기서는 CryJ2 알레르겐이 플라스미드 골격 상에 암호화되며, 그러나 이 골격에는 SS, IOS, TM, 및 TG 도메인이 부재한다. 이 작제물은 하기에 상세히 설명되는 실험에서 비교 대조군으로서 사용된다.
도 9는 293개의 세포에서의 본 발명에 따른 작제물의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯(Western blot)을 도시한다. 패널 A는, 안티-CryJ2 항체를 사용하여 검정할 때, 본 발명에 따른 작제물에서의 CryJ1-CryJ2 조합 알레르겐(도 5 참조) 및 CryJ2 알레르겐 단독(도 2 참조)의 발현을 보여준다. 패널 B는, 안티-CryJ1 항체를 사용하여 검정할 때, CryJ1-CryJ2 조합 알레르겐 및 CryJ1 알레르겐(그의 자연 신호 서열이 결여되어 있음; 도 7 참조)의 발현을 보여준다. 패널 B는 CryJ1 알레르겐에 대한 천연 신호 서열이 제거되지 않은 작제물(벡터 맵에 도시되지 않음)에서는 CryJ1 알레르겐의 발현이 검출불가능함을 추가로 보여준다.
도 10은 알레르겐 서열들을 포함하는 다른 작제물들과 비교할 때 본 발명에 따른 핵산 작제물의 유효성을 나타낸 선 그래프를 도시한다. 패널 A는, CryJ2 코딩 서열에 융합된 플라스미드 골격을 포함하는 작제물(도 8 참조)과 비교할 때, 본 발명의 CryJ2-LAMP 작제물(도 2 참조)의 투여의 결과로서 IgG1 생산 및 검출의 상당한 증가가 관찰되고 있음을 도시한다. 패널 B는, CryJ2 코딩 서열에 융합된 플라스미드 골격을 포함하는 작제물(패널 A에 따름)과 비교할 때, 본 발명의 CryJ2-LAMP 작제물(패널 A에 따름)의 투여의 결과로서 IgG2a 생산 및 검출의 상당한 증가가 관찰되고 있음을 도시한다.
도 11은 마우스에서의 CryJ2-LAMP 작제물의 투여 효과(dosing effect)를 나타낸 막대 그래프를 도시한다. 패널 A는 벡터 DNA 단독으로 주사하는 경우와 비교하여, 10 ug 내지 100 ug 범위의 다양한 양으로 DNA 백신을 주사한 후 21일째 및 28일째의 IgG2a 검출을 보여준다. 패널 B는, 벡터 DNA 단독으로 주사하는 경우와 비교하여, 10 ug 내지 100 ug 범위의 다양한 양으로 DNA 백신을 주사한 후 21일째 및 28일째의 IgG1 검출을 보여준다.
도 12는, 벡터 단독과 비교하여, 본 발명의 CryJ2-LAMP 작제물로 처리된 마우스 비장 배양액에서의 IL-4 및 IFN-감마의 유도에 대한 효과를 나타낸 막대 그래프를 도시한다. 패널 A는 IL-4의 효과를 보여준다. 패널 B는 IFN-감마의 효과를 보여준다.
도 13은 CryJ2-LAMP DNA 백신으로 사전에 감작화된 마우스의 면역화의 유효성을 나타낸 선 그래프를 도시한다. 패널 A는 시간 경과에 따른 IgG1 역가(titer)를 보여준다. 패널 B는 시간 경과에 따른 IgG2a 역가를 보여준다.
도 14는 마우스 비장 세포 배양액에서의 IFN-g(패널 A) 및 IL-4(패널 B)의 유도를 나타낸 막대 그래프를 도시한다.
도 15는 면역화된 마우스에서의 순환 CryJ2 단백질의 정량화를 나타낸 막대 그래프를 도시한다.
도 16은 CryJ2-LAMP 작제물로 면역화되고 재조합 CryJ2로 시험투여(challenge)된 기니아 피그들에 대한 IgG1 검출(패널 A) 및 IgG2 검출(패널 B)을 나타낸, 기니아 피그 데이터의 막대 그래프를 도시한다.
도 17은, 85일의 독성(toxicology) GLP 안전성 연구 동안, CryJ2-LAMP DNA 백신으로 면역화된 뉴질랜드 화이트 래빗에서의 안티-CryJ2 반응을 나타낸 막대 그래프를 도시한다.
도 18은 본 발명에 따른 작제물로부터의 땅콩 알레르겐 H1, H2, 및 H3의 공동발현을 나타낸 웨스턴 블롯을 도시한다.
이제, 본 발명의 다양한 예시적인 실시 형태를 상세히 언급할 것이다. 예시적인 실시 형태의 하기의 논의는, 본 명세서에서 폭넓게 개시된 바와 같이, 본 발명에 대한 제한으로서 의도되지 않음이 이해되어야 한다. 오히려, 하기의 논의는 독자에게 본 발명의 소정 태양 및 특징에 대한 더 상세한 이해를 도모하도록 제공된다. 본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 당업자의 기술 내에서 종래의 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합 DNA 기술을 사용한다. 그러한 기술은 이들 분야에서의 통상의 기술자에게 알려진 문헌에 완전히 설명되어 있으며, 이에 따라 본 명세서에서 상세히 설명할 필요가 없다. 마찬가지로, 의학적 치료에 대한 본 발명의 실시는 당업계에 알려진 표준 프로토콜을 따르며, 이러한 프로토콜도 본 명세서에서 상세히 설명할 필요가 없다.
본 발명의 실시 형태를 상세히 설명하기 전에, 본 명세서에 사용되는 용어가 단지 특정 실시 형태를 기술하기 위한 목적이며, 제한적인 것으로 의도되지 않음이 이해되어야 한다. 추가로, 값들의 범위가 제공되는 경우, 그 문맥에 달리 명확히 나타나 있지 않는 한, 하한 단위의 소수점 첫째 자리까지의, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 중간 값(intervening value)이 또한 구체적으로 개시되어 있는 것으로 이해된다. 임의의 언급된 값 또는 언급된 범위 내의 중간 값과 임의의 다른 언급된 값 또는 그 언급된 범위 내의 중간 값 사이의 각각의 더 작은 범위가 본 발명 내에 포함된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 그 범위 내에 포함되거나 배제될 수 있으며, 어느 하나(either), 어느 것도 아닌(neither), 또는 둘 모두(both)의 한계가 더 작은 범위 내에 포함되는 각각의 범위가 또한 본 발명 내에 포함되며, 이는 그 기술된 범위 내의 임의의 구체적으로 배제된 한계에 따른다. 언급된 범위가 한계들 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 그러한 포함된 한계들 중 어느 하나 또는 둘 모두를 배제하는 범위가 또한 본 발명에 포함된다. 따라서, 값들의 범위가 제시되는 경우, 그 범위 내의 각각의 값, 및 그 범위 내에 들어가는 각각의 범위는 본질적으로 마찬가지로 언급되어 있는 것으로 이해되어야 하며, 각각의 모든 값, 및 값들의 각각의 모든 가능한 범위에 대한 구체적인 언급을 피하는 것은 그러한 값들 및 범위들의 생략이 아니라 대신, 독자에 대한 편의성 및 본 발명의 간략함을 위한 것으로 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 그러한 용어가 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자가 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료를 지금 설명한다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 이들 간행물에서 관련되어 인용하고 있는 방법 및/또는 재료를 개시하고 기술하기 위하여 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 발명이 임의의 포함된 간행물과 상충되는 한에 있어서는 본 발명이 지배적이다.
본 명세서에, 그리고 첨부된 특허청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an", 및 "the")은, 그 문맥에 달리 명확히 나타나 있지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 알레르겐"에 대한 언급은 복수의 그러한 알레르겐을 포함하며, "그 샘플"에 대한 언급은 당업자에게 알려진 하나 이상의 샘플 및 그의 등가물에 대한 언급을 포함하거나 하는 등등이다. 더욱이, 등가의 용어를 사용하여 기술될 수 있는 용어의 사용은 그러한 등가의 용어의 사용을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 용어 "대상체"의 사용은 용어 "동물", "인간", 및 의학적 치료의 대상이 되는 것을 나타내기 위해 당업계에서 사용되는 다른 용어들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"은 작제물, 조성물, 및 방법이 언급된 요소 및/또는 단계를 포함하지만 다른 요소들 및/또는 단계들을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 의도된다. "본질적으로 이루어진"은, 작제물, 조성물, 및 방법을 정의하는 데 사용될 때, 언급된 작제물, 조성물, 및 방법에 대해 임의의 본질적인 유의성을 갖는 다른 요소들 및 단계들을 배제함을 의미한다. 따라서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 요소들로 본질적으로 이루어진 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터의 미량 오염물(trace contaminant) 및 약제학적으로 허용되는 담체, 예컨대 인산염 완충 식염수, 방부제 등을 배제하지 않을 것이다. "이루어진"은 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 사실상의 방법 단계들 및 다른 성분들의 미량 원소들을 초과하는 것을 배제함을 의미한다. 각각의 이들 이행 용어(transition term)에 의해 정의된 실시 형태는 본 발명의 범주 내에 있다.
"키메릭 DNA"는 더 큰 DNA 분자 내의 DNA의 식별가능한 분절(segment)로, 이 분절은 천연에서 상기 더 큰 분자와 회합된 상태로 발견되지 않는 것이다. 따라서, 키메릭 DNA가 단백질 분절을 암호화할 때, 분절 코딩 서열은 임의의 천연 발생 게놈 내에 그 코딩 서열을 플랭킹(flanking)하지 않는 DNA에 의해 플랭킹될 것이다. 플랭킹 DNA가 폴리펩티드 서열을 암호화하는 경우에, 암호화된 단백질은 "키메릭 단백질"(즉, 함께 융합된 비천연 발생 아미노산 서열들을 갖는 것)이라 지칭된다. 대립유전자 변이 또는 천연 발생 돌연변이 사건은 본 명세서에 정의된 바와 같은 키메릭 DNA 또는 키메릭 단백질을 발생시키지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산 분자"는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭하기 위하여 상호교환가능하게 사용된다. 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 및/또는 이들의 유사체를 함유할 수 있다. 뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 알려져 있거나 알려져 있지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는, 예를 들어 단일가닥, 이중가닥 및 삼중 나선형 분자, 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, 안티센스 분자, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 압타머(aptamer), 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 핵산 분자는 또한 변형된 핵산 분자(예를 들어, 변형된 염기, 당, 및/또는 뉴클레오티드간 링커(internucleotide linker)를 포함함)를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "펩티드"는 2개 이상의 소단위 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 펩티드모방체(peptidomimetic)의 화합물을 지칭한다. 이들 소단위는 펩티드 결합에 의해 또는 (예를 들어, 에스테르, 에테르 등과 같은) 다른 결합들에 의해 연결될 수 있다. 용어 "펩티드"는 펩티드(즉, 2개 내지 약 20개의 잔기의 폴리아미노산), 폴리펩티드(즉, 약 20개의 잔기 내지 약 100개의 잔기의 펩티드), 및 단백질(즉, 약 100개 이상의 잔기를 갖는 펩티드)을 지칭하기 위하여 본 명세서에서 총칭적으로 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산"은, 글리신 및 D 또는 L 광학 이성체 둘 모두를 포함한 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산과, 아미노산 유사체 및 펩티드모방체를 지칭한다. 3개 이상의 아미노산의 펩티드는, 펩티드 사슬이 짧다면, 올리고펩티드로 일반적으로 불린다. 용어 "단백질"이 용어 "폴리펩티드"를 포함하는 경우, "폴리펩티드"는 전장(full-length) 단백질보다 더 적을 수 있다.
용어 "알레르겐"은 개체에 대한 반복된 노출시에 알레르기 반응, 즉 IgE 매개 반응을 유발하는 것으로 보고된 임의의 천연 발생 단백질 또는 단백질들의 혼합물을 지칭한다. 알레르겐은 알레르기 반응을 유발할 수 있는 임의의 화합물, 물질, 또는 재료이다. 알레르겐은 면역 반응을 유발할 수 있는 화합물, 물질, 또는 재료인 항원의 하위카테고리로서 통상 이해된다. 본 발명을 수행함에 있어서, 알레르겐은, 특히 천연 또는 자연 알레르겐, 변형된 천연 알레르겐, 합성 알레르겐, 재조합 알레르겐, 알레르고이드(allergoid), 및 이들의 혼합물 또는 조합으로부터 선택될 수 있다. IgE-매개 즉시형 과민증을 야기할 수 있는 알레르겐이 특히 관심 대상이다.
천연 발생 알레르겐의 예에는 화분 알레르겐(예를 들어, 나무, 잡초, 초본 및 잔디의 화분 알레르겐), 진드기 알레르겐(예를 들어, 집먼지 진드기 및 저장 진드기로부터 유래되는 알레르겐), 곤충 알레르겐(예를 들어, 흡입(inhalant), 타액(saliva)- 및 독액(venom) 기원 알레르겐), 동물(예를 들어, 개, 고양이, 말, 래트, 마우스 등)로부터의, 예를 들어 타액, 모발 및 비듬으로부터 유래되는 동물 알레르겐, 진균 알레르겐 및 식품 알레르겐이 포함된다. 알레르겐은 알레르겐 추출물, 정제된 알레르겐, 변형된 알레르겐 또는 재조합 알레르겐 또는 재조합 돌연변이 알레르겐, 30개 초과의 아미노산의 알레르겐 단편의 형태 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
화학적 또는 생화학적 성질의 관점에서, 알레르겐은 자연 또는 재조합 단백질 또는 펩티드, 자연 또는 재조합 단백질 또는 펩티드의 단편 또는 절단형 변형물(truncated version), 융합 단백질, 합성 화합물(화학적 알레르겐), 알레르겐을 모방하는 합성 화합물, 또는 화학적으로 또는 물리적으로 변경된 알레르겐, 예컨대 열 변성에 의해 변형된 알레르겐을 나타낼 수 있다.
주요 알레르겐으로서의 알레르겐의 분류는 몇몇 시험에 따를 수 있다. 알레르겐은, 환자의 25% 이상이 강한 IgE 결합(점수 3)을 나타내고 환자의 50% 이상이 적어도 중등도 결합(점수 2)을 나타내는 경우 주요 알레르겐(major allergen)으로서 일반적으로 분류되는데, 이때 결합은 CRIE(Crossed Radio Immune Electrophoresis, 교차 방사성 면역 전기영동)(CRIE 강한 결합, 즉 1일 후 X선 필름 상에서의 가시적인 IgE-결합; CRIE 중등도 결합, 즉 3일 후 결합; CRIE 약한 결합, 즉 10일 후 결합)에 의해 결정된다. 환자의 10% 이상의 강한 IgE 결합은 알레르겐을 중간 알레르겐(Intermediate allergen)으로서 분류시키고, 환자의 10% 미만의 명백히 특이적인 결합은 그것을 소수 알레르겐(Minor allergen)으로서 분류시킨다. 예를 들어 IgE-블롯의 IgE 결합을 결정함에 있어서 다른 방법이 또한 사용될 수 있다.
"에피토프"는 면역 시스템의 성분에 의해 특이적으로 인식되거나 특이적으로 결합되는, 짧은 펩티드 서열 또는 올리고당으로 통상 구성된 구조체이다. T-세포 에피토프는 선형 올리고펩티드인 것으로 일반적으로 밝혀졌다. 2개의 에피토프가 동일한 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있다면, 이들은 서로 상응한다(correspond). 2개의 에피토프 모두가 동일한 B 세포 수용체 또는 동일한 T 세포 수용체에 결합할 수 있고, 그의 에피토프에 대한 하나의 항체의 결합이 다른 에피토프에 의한 결합을 사실상 방해한다면(예를 들어, 다른 에피토프 결합이 약 30% 미만, 바람직하게는, 약 20% 미만, 그리고 더 바람직하게는, 약 10%, 5%, 1%, 또는 약 0.1% 미만임), 이들은 서로 상응한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 2개의 핵산 코딩 서열 또는 이들의 상보적인 서열이 동일한 아미노산 서열들을 암호화한다면, 이들은 서로 "상응한다".
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 다른 서열과 소정 백분율(예를 들어, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 99% 이상)의 "서열 동일성(sequence identity)"을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역(또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)은, 수작업으로 또는 당업계에서 일상적인 소프트웨어 프로그램을 사용하여 최대로 정렬될 때, 2개의 서열의 비교시 염기(또는 아미노산)의 백분율이 동일함을 의미한다.
2개의 뉴클레오티드 서열은, 이들 뉴클레오티드의 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 약 90 또는 95% 이상이 DNA 서열들의 규정된 길이에 걸쳐 일치될 때, "사실상 동종"이거나 "사실상 유사"하다. 유사하게, 2개의 폴리펩티드 서열은, 폴리펩티드의 아미노산 잔기들의 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 66% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 약 90 또는 95% 또는 98% 이상이 폴리펩티드 서열의 규정된 길이에 걸쳐 일치될 때, "사실상 동종"이거나 "사실상 유사"하다. 사실상 동종인 서열들은 서열 데이터 뱅크에서 입수가능한 표준 소프트웨어를 사용하여 서열들을 비교함으로써 확인될 수 있다. 사실상 동종인 핵산 서열들은 또한 서던 하이브리드화(Southern hybridization) 실험으로 확인될 수 있는데, 이는, 예를 들어 그러한 특정 시스템에 대해 정의된 바와 같은 엄격한 조건 하에서 이루어진다. 적절한 하이브리드화 조건에 대한 규정은 본 기술분야의 기술 내에 있다. 예를 들어, 엄격한 조건은 다음과 같을 수 있다: 42℃에서 5xSSC 및 50% 포름아미드에서의 하이브리드화, 및 60℃에서 0.1xSSC 및 0.1% 소듐 도데실 설페이트에서의 세척.
도메인 서열의 "보존적으로 변형된 변이체"가 또한 제공될 수 있다. 특정 핵산 서열에 관하여, 용어, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 지칭하거나, 또는 여기서 이러한 핵산은 본질적으로 동일한 서열로 아미노산 서열을 암호화하지 않는다. 구체적으로, 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈들의 제3 위치가 혼합된-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기들로 치환되는 서열을 생성함으로써 축퇴성 코돈 치환이 달성될 수 있다(문헌[Batzer, et al, 1991, Nucleic Acid Res. 19: 5081]; 문헌[Ohtsuka, et al, 1985, J. Biol. Chem. 260: 2605-2608]; 문헌[Rossolini et al, 1994, Mol. Cell. Probes 8: 91-98]).
야생형 단백질의 "생물학적으로 활성인 단편", "생물학적으로 활성인 형태", "생물학적으로 활성인 등가물", 및 "기능성 유도체"라는 용어는, 활성을 검출하기에 적합한 검정을 사용하여 측정할 때, 야생형 단백질의 생물학적 활성과 적어도 사실상 동일한(예를 들어, 그와 유의하게 상이하지 않은) 생물학적 활성을 갖는 물질을 의미한다. 예를 들어, 트래피킹 도메인을 포함하는 생물학적으로 활성인 단편은 그러한 트래피킹 도메인을 포함하는 전장 폴리펩티드와 동일한 구획에 공존(co-localize)될 수 있는 것이다.
외인성 또는 이종 핵산이 세포 내부에 도입되었을 때, 그 세포는 그러한 핵산에 의해 "형질전환", "형질도입", 또는 "형질감염"된 것이다. 형질전환성 DNA는 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA와 일체화될(공유결합적으로 연결될) 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, 원핵생물, 효모, 및 포유류 세포에서, 형질전환성 DNA는 에피솜 요소, 예컨대 플라스미드 상에 유지될 수 있다. 진핵 세포에서, 안정하게 형질전환된 세포는, 형질전환성 DNA가 염색체 내로 일체화되게 되어서 그것이 염색체 복제를 통해 딸 세포들에 의해 유전되도록 한 것이다. 이러한 안정성은 형질전환성 DNA를 함유하는 딸 세포들의 집단으로 구성된 세포주 또는 세포 클론을 확립하는 진핵 세포의 능력에 의해 입증된다. "클론"은 단일 세포 또는 공통 조상으로부터 유사분열에 의해 유래된 세포들의 집단이다. "세포주"는 많은 세대(예를 들어, 약 10 세대 이상) 동안 시험관내(in vitro)에서 안정한 성장이 가능한 1차 세포의 클론이다.
"레플리콘(replicon)"은 생체내(in vivo)에서 DNA 복제의 자율 단위로서 기능하는 임의의 유전 요소(예를 들어, 플라스미드, 염색체, 바이러스)이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "바이러스성 벡터"는 생체내, 생체외(ex vivo), 또는 시험관내에서 숙주 세포 내로 전달될 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 또는 바이러스성 입자를 지칭한다. 바이러스성 벡터의 예에는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스성 벡터 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 유전자 이동이 아데노바이러스성 벡터에 의해 매개되는 태양에서, 벡터 작제물은, 아데노바이러스성 캡시드 단백질과 회합된, 아데노바이러스 게놈 또는 그의 일부 및 선택된 비-아데노바이러스성 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "핵산 전달 벡터"는 관심 대상의 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 수송할 수 있는 핵산 분자이다. 바람직하게는, 그러한 벡터는 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함한다. 그러나, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드 서열이 반드시 코딩 서열을 포함하는 것은 아니다. 예를 들어, 일 태양에서, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 분자에 결합되는 압타머이다. 다른 태양에서, 관심 대상의 서열은 조절 서열에 결합되어 조절 서열의 조절을 억제하는 조절 서열의 상보적인 서열이다. 또 다른 태양에서, 관심 대상은 서열은 그 자체가 (예를 들어, 세포 내의 조절 인자들을 타이트레이팅 아웃(titrating out)하기 위한) 조절 서열이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "핵산 전달 비히클"은 삽입된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 유전자 또는 유전자 단편, 안티센스 분자, 리보자임, 압타머 등)를 숙주 세포 내로 운반할 수 있고, 전술된 바와 같은 핵산 전달 벡터와 회합하여 발생되는 임의의 분자, 또는 분자들 또는 거대분자들의 집단으로 정의된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "핵산 전달" 또는 "핵산 이동"은, 도입을 위해 사용되는 방법과 관계없이, 외인성 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 도입유전자(transgene))의 숙주 세포 내로의 도입을 지칭한다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에 안정하게 또는 일시적으로 유지될 수 있다. 전형적으로, 안정한 유지는, 도입된 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포에 적합한 복제 원점을 함유하거나, 또는 숙주 세포의 레플리콘, 예컨대 염색체외 레플리콘(예를 들어, 플라스미드) 또는 핵 또는 미토콘드리아 염색체 내로 일체화될 것을 필요로 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되고/되거나 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈성 DNA로부터 유래된다면, 발현은 게놈성 DNA로부터 전사된 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전사 제어 하에 있는" 또는 "작동가능하게 연결된"은 코딩 서열 및 발현 제어 요소의 적절한 근위(juxtaposition)에 의해 제어되는 폴리뉴클레오티드 서열의 발현(예를 들어, 전사 또는 번역)을 지칭한다. 일 태양에서, DNA 서열은, 발현 제어 서열이 그러한 DNA 서열의 전사를 제어하고 조절할 때, 발현 제어 서열에 "작동가능하게 연결된다".
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "코딩 서열"은, 적절한 발현 제어 서열의 제어 하에 놓여질 때, 폴리펩티드로 전사 및 번역되는 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5'(아미노) 말단에 있는 시작 코돈 및 3'(카르복실) 말단에 있는 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열에는 원핵생물 서열, 진핵생물 mRNA로부터의 cDNA, 진핵생물(예를 들어, 포유류) DNA로부터의 게놈성 DNA 서열, 및 심지어는 합성 DNA 서열이 포함될 수 있지만 이로 한정되지 않는다. 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열이 코딩 서열에 대해 3'에 통상 위치될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유전자 변형"은 세포의 정상 뉴클레오티드 서열에 대한 임의의 첨가 또는 이의 결실 또는 파괴를 지칭한다. APC의 유전자 변형을 달성할 수 있는 임의의 방법은 본 발명의 사상 및 범주 내에 있다. 당업계에서 인식된 방법에는 바이러스 매개 유전자 이동, 리포좀 매개 이동, 형질전환, 형질감염 및 형질도입, 예를 들어 DNA 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 헤르페스 바이러스에 기초한 벡터뿐만 아니라 레트로바이러스 기반 벡터의 사용과 같은 바이러스-매개 유전자 이동이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "리소좀/엔도좀 구획"은 막 내에 LAMP 분자를 함유하는 막-결합된 산성 액포, 항원 처리에서 기능하는 가수분해성 효소, 및 항원 인식 및 제시를 위한 MHC 클래스 II 분자를 지칭한다. 이 구획은 세포내이입, 식작용, 및 음작용을 포함한 임의의 다양한 기전에 의해 세포 표면으로부터 내부화된 외래 물질의 분해, 및 특수한 자가분해(autolytic) 현상에 의해 이 구획으로 전달되는 세포내 물질의 분해를 위한 부위로서 기능한다(예를 들어, 문헌[de Duve, Eur. J. Biochem. 137: 391, 1983] 참조). 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "엔도좀"은 리소좀을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "리소좀-관련 세포소기관"은 리소자임을 포함하는 임의의 세포소기관을 지칭하며, 이에는 MIIC, CUV, 멜라노좀, 분비 과립, 용해성 과립, 혈소판-치밀(platelet-dense) 과립, 호염기성 과립, 버벡(Birbeck) 과립, 포식리소좀, 분비 리소좀 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 바람직하게는, 그러한 세포소기관은 만노스 6-인산 수용체가 결여되어 있고 LAMP를 포함하지만, MHC 클래스 II 분자를 포함할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 개관을 위하여, 예를 들어 문헌[Blott and Griffiths, Nature Reviews, Molecular Cell Biology, 2002; Dell'Angelica, et al, The FASEB Journal 14: 1265-1278,2000]을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "LAMP 폴리펩티드"는 LAMP-1, LAMP-2, CD63/LAMP-3, DC-LAMP, 또는 임의의 리소좀 관련 막 단백질, 또는 동종체, 병렬상동체(ortholog), 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 (예를 들어, 천연 발생 또는 조작된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는) 변형된 형태를 지칭한다. 일 태양에서, LAMP 폴리펩티드는 포유류 리소좀 관련 막 단백질, 예컨대 인간 또는 마우스 리소좀 관련 막 단백질이다. 더 일반적으로, "리소좀 막 단백질"은 엔도좀/리소좀 구획 또는 리소좀-관련 세포소기관의 막 내에서 발견되는 도메인을 포함하는 임의의 단백질을 지칭하며, 이는 루멘 도메인을 추가로 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "표적화"는 본 발명의 키메릭 단백질을 바람직한 부위, 예컨대 항원 처리 및 MHC II에 대한 결합이 일어나는 세포성 세포소기관 또는 구획으로 안내하는 폴리펩티드 서열을 나타낸다. 그렇기 때문에, "표적화 도메인"은 세포성 구획/세포소기관으로 전달하는 데 필요한 일련의 아미노산들을 지칭한다. 바람직하게는, 표적화 도메인은 어댑터 또는 AP 단백질(예컨대, AP1, AP2, 또는 AP3 단백질)에 결합되는 서열이다. 예시적인 표적화 도메인 서열이, 예를 들어 문헌[Dell'Angelica, 2000]에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 생체내 핵산 전달, 핵산 이동, 핵산 요법 등은 유기체, 예컨대 인간 또는 인간 외의 포유류의 체내로 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 도입함으로써 외인성 폴리뉴클레오티드가 생체내에서 그러한 유기체의 세포 내로 도입되는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "계내(in situ)"는 생체내 핵산 전달의 유형을 지칭하는데, 이러한 유형에서는 핵산이 표적 세포와 근접하게 된다(예를 들어, 핵산이 전신 투여되지 않는다). 예를 들어, 계내 전달 방법에는 부위에서의 (예를 들어, 종양 또는 심근육과 같은 조직 내로의) 핵산의 직접 주사, 개방 수술 필드(open surgical field)를 통해 세포(들) 또는 조직과의 핵산의 접촉, 또는 카테터와 같은 의료용 접근 장치를 사용하여 부위로의 핵산의 전달이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된" 및 "정제된"은, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 이들의 단편이 천연에서 통상 회합되어 있는, 세포성 및 그 외의 다른 성분들로부터 분리된 것을 의미하기 위하여 때때로 상호교환가능하게 사용된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드에 관하여, 단리된 폴리뉴클레오티드는, 이것이 염색체 내에서 통상 회합되어 있는 5' 및 3' 서열로부터 분리된 것이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 비천연 발생 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 이들의 단편은 그것을 그의 천연 발생 상대물로부터 구별하기 위해 "단리"를 필요로 하지 않는다. 더욱이, 용어 "단리된" 및 "정제된"은 전체 단리 및 전체 순도를 내포하지 않는다. 이들 용어는 폴리뉴클레오티드 등과 회합하여 천연적으로 발견되는 일부 또는 모든 다른 물질들로부터의 부분 순도 및 전체 순도 둘 모두를 나타내기 위해 사용된다. 따라서, 이들 용어는 하나의 천연적으로 회합된 물질로부터의 단리 또는 정제(예를 들어, RNA로부터의 DNA의 단리 또는 정제), 동일한 일반적 클래스의 분자의 다른 물질들로부터의 단리 또는 정제(예를 들어, 샘플 내의 모든 단백질과 비교하여 20% 순도를 보여주는 특정 단백질), 또는 임의의 조합을 의미할 수 있다. 단리 및 정제는 약 1% 내지 약 100%(100%를 포함함)의 임의의 수준을 의미할 수 있다. 그렇기 때문에, 세포들의 "단리된" 또는 "정제된" 집단에는, 그것이 천연에서 회합되어 있는 세포 및 물질이 사실상 없다. 사실상 유리 상태의 또는 사실상 정제된 APC는, 세포들의 집단의 50% 이상이 APC이며, 바람직하게는 이들이 천연에서 회합되어 있는 비-APC 세포들이 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 그리고 더욱 더 바람직하게는 90% 이상 없음을 의미한다. 물론, 당업자는 값들의 분수를 포함한 모든 구체적인 값들이, 각각의 특정 값이 본 명세서에 열거될 필요 없이, 이들 범위 내에 포함됨을 인식할 것이다. 각각의 값은 간략함을 위해 구체적으로 개시되지 않지만; 독자는 각각의 모든 구체적인 값이 본질적으로 개시되고 본 발명에 의해 포함됨을 이해해야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "표적 세포" 또는 "수용 세포(recipient cell)"는 외인성 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드, 및/또는 단백질의 수용체일 것이 요구되거나 이들의 수용체이었던 세포 또는 개별 세포를 지칭한다. 이 용어는 또한 단일 세포의 자손(progeny)을 포함하는 것으로 의도되며, 자손은 천연 돌연변이, 우발적인 돌연변이, 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원래의 부모 세포와 (형태에서 또는 게놈성 또는 전체 DNA 상보체에서) 반드시 완전히 동일하지 않아도 된다. 표적 세포는 (예를 들어, 조직에서와 같이) 다른 세포들과 접촉할 수 있거나, 유기체의 체내에서 순환되는 것으로 발견될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 주요 조직적합성 복합 분자와 회합된 항원 또는 그의 일부분이나, 또는 대안적으로, 하나 이상의 비고전적 MHC 분자 또는 그의 일부분을 표면 상에 제시하는 임의의 세포를 의도한다. 적합한 APC의 예는 하기에서 상세히 논의되며, 이에는 전세포(whole cell), 예컨대 대식세포, 수지상 세포, B 세포, 하이브리드 APC, 및 위탁 항원 제시 세포가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "조작된 항원-제시 세포"는 표면 상에 비천연 분자 모이어티(moiety)를 갖는 항원-제시 세포를 지칭한다. 예를 들어, 그러한 세포는 천연적으로 그의 표면 상에 공자극체(co-stimulator)를 가질 수 없거나, 또는 그의 표면 상에 천연 공자극체에 더하여 추가의 인공적인 공자극체를 가질 수 있거나, 또는 그의 표면 상에 비천연 클래스 II 분자를 발현할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역 이펙터 세포"는 항원에 결합될 수 있고 면역 반응을 매개하는 세포를 지칭한다. 이러한 세포에는 T 세포, B 세포, 단핵구, 대식세포, NK 세포, 및 세포독성 T 림프구(CTL), 예를 들어 CTL 주, CTL 클론, 및 종양, 염증, 또는 다른 침윤물로부터의 CTL이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 본 발명이 지향하는 동물을 나타내기 위하여 상호교환가능하게 사용된다. 용어 "동물"은 인간 및 인간 외의 동물을 포함하는 것으로 이해되어야 하며; 이들 둘 사이의 구별이 요구되는 경우에는, 용어 인간 및/또는 인간 외의 동물이 사용된다. 실시 형태에서, 대상체 또는 환자는 척추동물, 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 인간이다. 포유류에는 쥐, 원숭이, 인간, 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지), 운동경기용 동물(sport animal)(예를 들어, 말), 및 애완동물(예를 들어, 개 및 고양이)이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
임상 알레르기 증상은 당업자에게 알려져 있으며, 본 명세서에 완전히 망라된 목록을 열거하는 것은 필요하지 않다. 비제한적인 예에는 비염, 결막염, 천식, 두드러기, 습진이 포함되는데, 이는 눈 및 코의 발적 및 소양증, 소양증 및 콧물, 기침, 천명, 숨참(shortness of breath), 소양증, 및 조직의 부종과 같은 일반적인 증상과 함께 피부, 눈, 코, 상기도 및 하기도에서의 반응을 포함한다.
"면역학적 생체내 시험"의 예는 피부 단자 시험(SPT), 결막 유발 시험(Conjunctival Provocation Test, CPT), 알레르겐에 의한 기관지 유발 시험(Bronchial Challenge with Allergen, BCA), 및 하나 이상의 알레르기 증상이 모니터링되는 다양한 임상 시험이다. 예를 들어, 문헌[Haugaard et al, J Allergy Clin Immunol, Vol. 91, No. 3, pp 709-722, March 1993]을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 당업계에 알려진 임의의 표준 약제학적 담체, 예컨대 인산염 완충 식염수 용액, 물, 및 에멀젼, 예컨대 유/수 또는 수/유 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함한다. 조성물은 또한 안정제 및 방부제를 포함할 수 있다. 담체, 안정제 및 애쥬번트의 예에 대해서는, 문헌[Martin Remington's Pharm Sei., 15th Ed. (Mack PubL Co., Easton (1975))]을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료학적 유효량"은, 본 명세서에서, 비정상적인 생리학적 반응을 예방, 교정, 및/또는 정상화하기에 충분한 양을 의미하기 위해 사용된다. 일 태양에서, "치료학적 유효량"은, 예를 들어 종양 덩어리의 크기, 항체 생산, 사이토카인 생산, 열(fever) 또는 백혈구 수, 또는 히스타민의 수준과 같은 병리학(pathology)의 임상적으로 유의한 특징을 약 30% 이상, 더 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 감소시키기에 충분한 양이다.
"항체"는 특정 에피토프에 결합하는 항체 및 그의 단편을 포함한 임의의 면역글로불린이다. 이 용어는 다클론, 단일클론, 및 키메릭 항체(예를 들어, 이중특이성 항체)를 포함한다. "항체 결합 부위(antibody combining site)"는, 항원에 특이적으로 결합되는, 중쇄 및 경쇄의 가변 및 초가변 영역들로 구성된 항체 분자의 구조 부분이다. 예시적인 항체 분자는 온전한 면역글로불린 분자, 사실상 온전한 면역글로불린 분자, 및 Fab, Fab', F(ab')2, 및 F(v) 부분들을 포함한, 파라토프(paratope)를 함유하는 면역글로불린 분자의 부분들이며, 이때 이들 부분은 본 명세서에 기술된 치료학적 방법에 사용하기에 바람직하다.
용어 "구강점막(oromucosal) 투여"는 활성 성분의 국소 또는 전신 효과를 얻기 위하여 활성 성분이 환자의 구강 또는 인두의 점막과 접촉될 수 있도록, 투여형이 혀 아래 또는 구강 내의 어딘가 다른 곳에 놓여지는 투여 경로를 지칭한다. 구강점막 투여 경로의 일 예는 설하 투여이다. 용어 "설하 투여"는 활성 성분의 국소 또는 전신 효과를 얻기 위하여 투여형이 혀 바로 아래에 놓여지는 투여 경로를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "진피내 전달"은 피부 내의 진피로의 백신의 전달을 의미한다. 그러나, 백신은 반드시 오로지 진피 내에 위치되어야 할 필요는 없을 것이다. 진피는 인간 피부에서 표면으로부터 약 1.0 내지 약 2.0 mm 사이에 위치된 피부 내의 층이지만, 개인들 간에 그리고 인체의 상이한 부분에 있어서 소정량의 변동이 있다. 일반적으로, 피부의 표면 아래로 1.5 mm 내려감으로써 진피에 도달하는 것으로 예측될 수 있다. 진피는 표면에 있는 각질층 및 표피와 아래에 있는 피하 층 사이에 위치된다. 전달 방식에 따라, 백신은 최종적으로 오로지 또는 주로 진피 내에 위치될 수 있거나, 또는 이는 최종적으로 표피 및 진피 내에 분포될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 알레르기 면역요법, 알레르기 치료, 또는 알레르기 환자를 위해 고안된 개입을 기술하는 다른 용어와 관련하여 용어 "예방하다"는 모든 환자의 20% 이상에서의 IgE 반응의 예방을 의미한다. 용어 "예방하다"는, 모든 환자에서의 IgE 매개 질환의 발병으로부터의 전체적인 예방을 의미하지 않으며, 그러한 정의는 알레르기 증상을 감소시키는 기전을 통해 알레르기를 치료하기 위한 본 발명의 범주 밖에 있으며, 당업계에서의 이 용어의 사용과 일치하지 않는다. 알레르기 치료가 100%의 환자에서 100% 효과적이지는 않다는 것은 알레르기 면역 요법의 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 그렇기 때문에, "예방하다"의 절대적 정의는 본 발명의 문맥 내에서는 적용되지 않는다. 당업계에서 인식된 예방의 개념이 본 발명에 의해 고려된다.
본 발명은 폴리핵산, 폴리아미노산, 및 폴리핵산 및 폴리아미노산을 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 대체적으로 말하면, 폴리핵산은 폴리핵산이 투여되는 대상체의 체내에서 보호 면역 반응을 끌어내는 알레르겐 서열(폴리아미노산)의 세포내 생산을 위한 핵산(예를 들어, DNA, RNA) 백신으로서 여겨질 수 있다. 폴리핵산은, 투여될 때, 우선적으로는, MHC-II 경로를 통해 세포-매개 면역 반응을 유발하고, IgE 항체, 과립구(예를 들어, 호산구), 및 다른 물질들의 생산을 수반하는 Th2형 반응이라기보다는 APC, NK 세포, 및 T 세포에 의한 인터페론의 생산과 함께 알레르겐-특이적 T-헬퍼형 1(Th1) 세포 반응을 활성화함으로써 IgG 항체의 생산을 유발할 수 있다. 어느 정도는, MHC-II 및 MHC-I 반응 둘 모두가 생성될 수 있지만; 본 발명은 주로 또는 사실상 MHC-II 반응인 반응을 제공한다. 바람직하게는, 핵산은 항생제 저항성 유전자를 암호화하지 않는다.
본 발명은 소정의 구조적 및 이에 따른 기능적 요소들의 조합이 핵산 백신 및 암호화된 알레르겐에 유리한 특성을 제공하고, 당업계에서 충족되지 않은 필요성을 만족시키는 알레르기 치료 방법을 가능하게 한다는 인식에 적어도 부분적으로 기초한다. 독립적인 실시 형태로서 그리고 그러한 독립적인 실시 형태들의 2개 이상의 특징을 조합시킨 실시 형태로서 독립형인 것으로 이해되는 것으로 의도된 본 발명의 다양한 실시 형태에서, 그러한 조합은, 알레르겐 아미노산 서열을 MHC II 단백질을 갖는 리소좀으로 안내하기 위하여 리소좀 트래피킹 도메인을 사용하는 것을 포함한다. 그렇게 하는 것은, 알레르겐 서열에 대한 IgE 반응과 대립되는 것으로서의 IgG 반응이 우세해지도록 할 수 있다. 또한, 독립적인 실시 형태 또는 실시 형태들의 조합은 에피토프의 천연-발생 3차원 구조를 제공하는 아미노산 서열을 암호화하기에 충분한 길이의 핵산 서열을 함유하는 작제물을 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 핵산 서열은 전장 알레르겐 코딩 서열을 제공하지만/암호화하지만, 이는 알레르겐 서열과 회합된 어떠한 천연-발생 신호 펩티드 서열도 결여되어 있다. 다른 실시 형태에서, 핵산 서열은 알레르겐의 적어도 하나의 알레르겐 영역(allergenic region)을 암호화하지만, 전장 알레르겐 단백질(그리고 또한 천연적으로 존재한다면, 신호 서열이 결여되어 있음)을 암호화하지는 않는다. 에피토프의 1차 서열에 대해 면역 반응이 생성될 수 있음이 당업계에서 인식되긴 하지만, 본 발명은 암호화된 에피토프에 대한 MHC-II 면역 반응의 생성을 위한 핵산 백신이 바람직하게는, 적어도 알레르겐 서열이 처리를 위한 리소좀으로 전달되는 시점에서, 알레르겐 에피토프를 포함하는 영역 내에서 올바른 3차원 펩티드 구조를 생산하기에 충분한 서열 데이터를 암호화하는 핵산 작제물을 사용함을 인식한다. 어떠한 특정 분자 이론으로도 제한되지 않지만, 적절하게 3차원으로 접혀진 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 엔도좀으로의 전달은 면역 반응을 위한 알레르겐 에피토프의 처리 및 제시를 개선하는 것으로 여겨진다.
단독으로 또는 실시 형태들의 조합의 일부로서 구현될 수 있는 일 실시 형태의 또 다른 예로서, 단일 작제물로부터의 다수의 알레르겐의 발현이 제공된다. 지금까지는, 알레르겐에 대해 보호적인 핵산 백신이 효과적으로 생산 및 사용될 수 있는 것으로 밝혀져 있지 않다. 본 발명은 알레르겐에 대해 효과적인 핵산 백신을 제공할 뿐만 아니라, 동시에 다수의 알레르겐에 대해 효과적인 핵산 백신도 추가로 제공한다. 이들 알레르겐은 동일한 공급원(예를 들어, 단일 식물)으로부터의 알레르겐들일 수 있거나, 또는 2개 이상의 공급원(예를 들어, 나무, 꽃, 식품 등)으로부터의 알레르겐들일 수 있다. 상기에서와 같이, (알레르겐에 대한 어떠한 천연-회합된 신호 서열도 결여되어 있는) 전장 알레르겐 서열이 사용될 수 있거나, 또는 알레르겐 부분이 사용될 수 있다. 다수의 알레르겐 서열을 포함하는 작제물에서는, 전장 알레르겐 서열들 또는 절단형 알레르겐 서열들의 임의의 혼합물이 사용될 수 있다. 또한, 다른 실시 형태에서와 같이, 각각의 알레르겐 서열에 대한 천연-발생 신호 서열이 제거되는 것이 바람직하다(즉, 각각의 알레르겐 서열에 대한 천연-발생 신호 서열이 작제물에 존재하지 않는다).
알레르겐 도메인 내의 독립된 알레르겐 서열들에 대한 신호 서열들의 사용이 핵산 작제물의 기능에 불리한 것으로 밝혀졌지만, 핵산 백신 작제물 내의 신호 서열 영역 또는 도메인의 사용은 중요한 특징인 것으로 밝혀졌다. 그렇기 때문에, 실시 형태에서, 핵산 백신은, 암호화된 펩티드를 막으로 또는 막을 통해 안내하기 위하여, 신호 서열 도메인 내에 적어도 하나의 신호 서열을 포함한다. 신호 서열의 아미노산 서열이 작제물마다 변할 수 있고, 임의의 알려진 신호 서열이 선택될 수 있지만, 바람직한 실시 형태에서, 신호 서열은 알레르겐 서열(들)의 코딩 서열과 인-프레임(in-frame)으로 존재하고 제공되는 것으로 밝혀졌다. 단일 신호 서열의 사용은 전체 암호화된 키메릭 단백질을 막으로 그리고 막을 통해 안내하기에 적절하다. 그렇기 때문에, 각각의 알레르겐 서열에 대한 신호 서열은 반드시 필요한 것은 아니며, 실제로 면역 세포 표면 상에서의 알레르겐 에피토프의 적절한 위치결정(localization), 처리, 및 발현에 불리한 것으로 밝혀졌다.
그리고 또한, 구체적 실시 형태에서 및 실시 형태들의 조합에서, 폴리펩티드가 세포 표면에서의 제시를 위한 단위들로 절단(cleavage)되기 전에, 엔도좀에서의 시간을 포함한 세포질로부터 엔도좀으로의 폴리펩티드의 이동 동안, 알레르겐 서열의 봉쇄 또는 물리적 보호가 본 발명에 따른 유용한 핵산 백신을 제공하는 데 있어서 중요한 인자일 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그렇기 때문에, 일반적으로, 본 발명은 알레르겐 서열을 보호하기 위해 세포소기관내 안정화 도메인(IOSD)을 포함하는 작제물을 포함한다.
본 발명의 핵산은 적어도 하기 도메인을 포함한다: 신호 서열 도메인; 세포소기관내 안정화 도메인; 알레르겐 도메인(이는 단일 알레르겐 또는 2개 이상의 알레르겐을 포함할 수 있으며, 이때 각각의 알레르겐은 하나 이상의 알레르겐 에피토프를 포함함); 막횡단 도메인; 및 세포질 리소좀/엔도좀 표적화 도메인. 다양한 도메인들이 단일 키메릭 또는 조작된 핵산 상에 존재한다. 다양한 도메인들은 당업계에 알려지고 널리 실시되는 기술을 사용하여 임의의 선형 순서로 조합될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 도메인들은 키메릭 단백질을 암호화하는 단일 개방 판독 프레임(open reading frame)을 포함하도록 조합되고 배열되는데, 이때 개방 판독 프레임은 키메릭 단백질의 발현에 충분한 전사 요소들에 작동가능하게 연결된다. 따라서, 핵산은 발현 벡터, 예컨대 플라스미드, 파지미드(phagemid), 바이러스성 벡터 등일 수 있다. 바람직하게는, 핵산은 포유류 세포, 예컨대 인간 세포에서의 발현에 적합한 전사 요소들을 포함한다. 그러한 발현 벡터 요소들 및 발현 벡터들은, 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2004/0157307호에 예시된 바와 같이, 당업계에 알려져 있으며 널리 사용된다. 본 발명에 따른 핵산 작제물을 생성하는 데 사용하기 위한 플라스미드 골격의 비제한적인 예는 본 명세서에서 때때로 "pITI" 플라스미드로서 지칭되며, 이의 서열은 서열 번호(SEQ ID NO) 1로서 제공된다.
본 발명의 핵산의 3개의 예시적인 구성이 도 1, 도 3, 및 도 4에 각각 개략적으로 도시되어 있다. 도 1은 단일 에피토프를 포함하는 단일 알레르겐이 암호화된 키메릭 단백질 내에 포함된 도메인들의 순차적 배열을 도시한다. 도 3은 단일 알레르겐의 다수의 상이한 에피토프들이 암호화된 키메릭 단백질 내의 알레르겐 도메인 내에 포함된 도메인들의 순차적 배열을 도시한다. 2개의 에피토프는, 이들이 동일한 판독 프레임 내에 있으며, 이에 따라 둘 모두 키메릭 단백질의 일부로서 생산되도록 배열된다. 당업자는, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 3개 이상의 에피토프가 에피토프 도메인 내의 동일한 판독 프레임 내에 제공될 수 있음을 즉시 인식할 것이다. 도 4는 2개의 상이한 알레르겐들이 알레르겐 도메인 내에 존재하는 도메인들의 순차적 배열을 도시한다. 물론, 당업자는 각각의 알레르겐 서열이 하나 또는 다수의 알레르겐 에피토프를 함유할 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명의 핵산의 실시 형태들의 이들 3개의 개략도에 기초하여, 독자는 임의의 수의 공급원으로부터 유래되고 임의의 수의 에피토프를 함유하는 임의의 수의 알레르겐이 알레르겐 도메인 내에 포함될 수 있으며, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 인-프레임으로 연결될 수 있음을 즉시 인식할 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시 형태에 따른 핵산("pITI-CRY J2-LAMP"; 본 명세서에서 때때로 "CRYJ2-LAMP"로 또한 지칭됨)의 벡터 맵을 도시하는데, 이는 일반적으로 도 1에서 개략적으로 도시된 본 발명의 실시 형태에 관한 것이다. 이러한 벡터 또는 전달 비히클은 암호화된 단백질을 생산하기 위한 다양한 전사 및 발현 요소들 및 pUC 복제 원점을 갖는 플라스미드 골격을 포함한다. 더 구체적으로, 이는 pITI 골격의 서열(서열 번호 1)을 포함한다. 핵산 작제물은 본 발명의 바람직한 실시 형태에 따라 항생제 저항성 유전자를 포함하지 않음을 유의해야 한다. 핵산은 신호 서열 및 세포소기관내 안정화 도메인을 포함하는, 인간 LAMP 단백질의 N-말단 영역을 포함하는 암호화된 단백질에 대한 서열들을 추가로 포함한다. 핵산은 LAMP 단백질의 N-말단 영역에 인-프레임으로 융합된 (신호 서열이 결여되어 있는) CryJ2 알레르겐 서열을 포함하는 암호화된 단백질에 대한 서열들을 추가로 제공한다. 핵산은 막횡단 영역 및 표적화 영역을 포함하는, 인간 LAMP 단백질의 C-말단 영역의 일부분을 암호화하는 서열들을 추가로 포함한다. CRY J2-LAMP 키메릭 단백질 서열에 대한 코딩 영역은 서열 번호 2로서 제공된다. CRY J2-LAMP 키메릭 단백질에 대한 아미노산 서열은 서열 번호 3으로서 제공된다.
예시적인 실시 형태에서, 본 발명은 또한 CryJ1 알레르겐을 포함한 C. 자포니카의 다른 알레르겐들의 전달 및 발현을 위한 핵산 작제물에 관한 것이다. 동일한 플라스미드 골격을 사용하여, pITI-CRYJ1-LAMP 작제물을 생성하였다. 키메릭 단백질은 MHC II형의 면역 반응을 끌어낼 수 있다. pITI- CRYJ1-LAMP 작제물에 대한 코딩 영역은 서열 번호 4로서 제공된다. CRY J1-LAMP 키메릭 단백질에 대한 아미노산 서열은 서열 번호 5로서 제공된다.
도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, 알레르겐 도메인은 다수의 알레르겐 에피토프를 갖는 알레르겐을 포함할 수 있거나, 또는 다수의 알레르겐(각각은 하나 이상의 알레르겐 에피토프를 가짐)을 포함할 수 있다. 도 5는 알레르겐 도메인이 2개의 알레르겐 서열을 포함하는 핵산 작제물의 특정 예시적인 실시 형태의 벡터 맵을 도시한다. 이 예시적인 실시 형태에서, 알레르겐 도메인은, 인-프레임으로 융합되고 LAMP 신호 서열 도메인 및 세포소기관내 안정화 도메인을 갖는 N-말단에서 융합된 C. 자포니카의 CryJ1 및 CryJ2 알레르겐(각각은 그의 천연 신호 서열이 결여되어 있음)을 함유한다. CryJ1 - CryJ2 서열은 또한 LAMP 막횡단 도메인 및 표적화 도메인을 갖는 C-말단에서 융합된다. 키메릭 단백질에 대한 코딩 영역의 전체 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 6으로서 제공된다. 암호화된 키메릭 단백질에 대한 전체 아미노산 서열은 서열 번호 7로서 제공되며, 여기서 잔기 1 내지 27은 키메릭 단백질에 대한 신호 서열을 나타내고; 잔기 28 내지 380은 세포소기관내 안정화 도메인(인간 LAMP로부터 취해진 서열)을 나타내고; 잔기 381 및 382는 링커를 나타내고; 잔기 383 내지 735는 CryJ1(그의 신호 서열을 갖지 않음)의 코딩 영역을 나타내고; 잔기 736 내지 741은 링커 영역을 나타내고; 잔기 742 내지 1232는 CryJ2 알레르겐에 대한 코딩 영역을 나타내고; 잔기 1233 및 1234는 링커 영역을 나타내고; 잔기 1235 내지 1258은 막횡단 및 표적화 도메인을 나타내고; 잔기 1259 내지 1270은 추가 C-말단 잔기를 나타낸다.
본 발명의 핵산 작제물은 협조적으로 생산될 수 있는 알레르겐들의 수에 있어서 본질적으로 무제한이다. 그렇기 때문에, (동일한 공급원 또는 상이한 공급원들의 혼합물로부터의) 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 10개, 20개, 또는 더 많은 상이한 알레르겐들이 본 발명의 핵산 작제물 내에 포함될 수 있다. 도 6a는 본 발명의 일 실시 형태에 따른 다른 예시적인 핵산의 벡터 맵을 제공한다. 이러한 벡터 또는 전달 비히클은 암호화된 단백질을 생산하기 위한 다양한 전사 및 발현 요소들 및 pUC 복제 원점을 갖는 플라스미드 골격을 포함한다. 이 골격은 서열 1의 pITI 골격일 수 있지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 핵산은 신호 서열 도메인 및 세포소기관내 안정화 도메인을 포함하는, 인간 LAMP 단백질의 N-말단 영역을 포함하는 암호화된 단백질에 대한 서열들을 추가로 포함한다. 핵산은 땅콩 알레르겐 폴리단백질 AraH1/AraH2/AraH3을 포함하는 암호화된 키메릭 단백질에 대한 서열들을 추가로 제공한다. 핵산은 막횡단 영역 및 표적화 영역을 포함하는, 인간 LAMP 단백질의 C-말단 영역의 일부분을 암호화하는 서열들을 추가로 포함한다. 키메릭 단백질의 코딩 영역에 대한 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 8로서 제공된다. 도 6a의 벡터에 의해 암호화된 키메릭 단백질은 도 6b에 (그리고 서열 번호 9로서) 개략적으로 제시되어 있다.
본 발명의 핵산 내에 존재하는 도메인들은 암호화된 키메릭 단백질에 의해 제공되는 기능과 관련하여 하기에 더 상세히 기술된다. 본 발명의 실시가 임의의 특정 핵산 또는 단백질 서열에 좌우되거나 그에 의해 제한되지 않으며, 오히려 이는 작제물에 대해 이점 및 특성을 제공하는 요소들 및 도메인들의 조합임이 이해되어야 한다. 또한, 핵산 작제물의 다양한 도메인들에 관한 설명은, 암호화된 단백질의 물리적 및 기능적 특성과 관련하여 논의될 때, 및 그 반대일 때 이해되어야 한다. 이는 당업자에게 핵산 또는 단백질의 물리적 및 기능적 특성을 알려주기에 충분하다. 이는, 컴퓨터 및 유전 코드의 축퇴를 사용하여, 알려진 단백질 서열들을 암호화하는 모든 가능한 핵산 분자들에 도달하고 핵산에 의해 암호화된 단백질에 도달하면 되는 간단한 문제이다. 따라서, 특정 단백질 서열의 물리적 또는 기능적 특성에 대한 언급은 당업자에게 물리적 또는 기능적 특성과 관련된 모든 가능한 핵산 서열을 즉시 개시하는 것이고, 그 반대도 그렇다.
또한, 2개 이상의 핵산 분자 또는 서열을 설계 및 조합하여 본 발명에 따른 키메릭 단백질을 암호화하는 서열에 도달하는 것은 충분히 당업자의 기술 내에 있다. 마찬가지로, 전사 및 번역 제어 요소들을 선택 및 조합하여, 필요에 따라 생체내 또는 시험관내에서 코딩 서열 및 키메릭 단백질을 발현시키는 것은 충분히 당업자의 능력 내에 있다. 따라서, 이러한 통상적으로 사용되는 기술은 본 발명을 실시할 수 있게 하기 위하여 본 명세서에서 상세히 논의될 필요가 없다.
본 발명의 핵산은 신호 서열 도메인을 포함한다. 신호 서열 도메인은 외부 환경과 내부 환경 사이의 경계를 한정하는 생물학적 막 내로의 암호화된 키메릭 단백질의 삽입을 위해 제공되는 신호 서열을 함유한다. 신호 서열은 또한 외부 환경으로부터 내부 환경으로의 단백질의 이동을 안내한다. 특정 신호 서열들의 다수의 예가 있는 바와 같이, 신호 서열의 일반적 구조는 당업계에 잘 알려져 있다. 실무자는 본 발명의 범주 내에 속하는 각각의 실시 형태에 대한 다양한 선택 파라미터들에 따라 임의의 적절한 신호 서열을 자유롭게 선택한다. 예시적인 실시 형태에서, 신호 서열은 키메릭 단백질을 소포체로 안내하는 것이다. 현 단계에서, 신호 서열 도메인은 신호 서열을 함유하는 키메릭 단백질의 단지 일부분인 것을 유념하는 것이 중요하다. 그렇기 때문에, 알레르겐 도메인 내에 존재하는 알레르겐들의 천연-발생 신호 서열들은 작제물 내에 알레르겐 서열들을 포함시키기 전에 제거되었다. 이들 개별적인 신호 서열들의 제거는 생체내에서 작제물의 전체 성능을 개선하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 핵산은 세포소기관내 안정화 도메인(IOSD)을 포함한다. IOSD는, 화학적 결합을 통해 알레르겐 도메인 내의 하나 이상의 서열들에 결합되는 아미노산 서열을 암호화하고 그러한 서열들이 엔도좀/리소좀 구획 내에 키메릭 단백질이 도달하기 전에 분해(예를 들어, 단백질 가수분해)되는 것으로부터 보호하는 서열을 포함한다. 본질적으로, IOSD는 단백질 가수분해 효소, 낮은 pH, 및 기타 단백질-불안정화 물질 및 조건으로부터 알레르겐 도메인 서열들, 및 특히 알레르겐 에피토프 서열들을 보호하기 위하여 그러한 서열들을 차폐하는 보호 캡으로서 구상될 수 있다. IOSD는 다수의 알려지거나 조작된 서열들 중 임의의 것일 수 있는데, 이에는 LAMP 폴리펩티드 루멘 도메인 및 마크로시알린/CD68 단백질 - 이는 후기 엔도좀 단백질로서 대식세포 및 대식세포-유사 세포에서 발현되는 고도로 글리코실화된 막횡단 단백질임 - 이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. IOSD의 핵심 특징은, IOSD가 알레르겐 도메인에 결합되고, MHC 클래스 II 분자가 불변 펩티드(invariant peptide)로부터 방출될 때까지 단백질 가수분해로부터 그러한 알레르겐 도메인을 보호하는 능력이다. 이런 식으로, 활성 MHC 클래스 II 분자가 상호작용에 이용가능할 때까지 알레르겐 에피토프(들)의 3차원 구조가 보존된다. 바람직한 실시 형태에서, IOSD는 리소좀 단백질의 서열 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 실시 형태에서, IOSD는, LAMP 폴리펩티드 루멘 도메인 이외의, 마크로시알린/CD68과 같은 그러나 이로 한정되지 않는 단백질 또는 폴리펩티드이다.
본 발명의 핵산 작제물은 알레르겐 도메인을 포함한다. 알레르겐 도메인은, 하나 이상의 알레르겐 에피토프를 포함하는 알레르겐 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 서열을 포함한다. 알레르겐 도메인은 존재하는 알레르겐들로부터 유래되는 신호 서열들을 포함하지 않는다. 다수의 단백질성 알레르겐(proteinaceous allergen)이 당업계에 알려져 있으며, 알레르겐들 및/또는 알레르겐 에피토프들 중 어느 하나 또는 이들의 조합이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 전장 알레르겐 서열보다 더 적은 알레르겐 서열이 사용되는 경우, 바람직하게는, 전장 알레르겐 단백질의 하나 이상의 에피토프가 그 알레르겐 단백질 내의 그들의 천연 위치와 관련하여 제공된다. 더 구체적으로는, 본 발명은 개선된 핵산 백신을 제공하며, 여기서 백신은, MHC 클래스 II 분자가 키메릭 단백질 상의 에피토프에 결합될 능력을 갖출 때까지, 3차원 구조를 유지하거나 사실상 유지하는 키메릭 단백질을 암호화한다. 이런 식으로, 일반적으로 적절한 3차원 구조가 결여되어 있을 짧은 펩티드의 MHC 클래스 II 분자로의 전달과 비교할 때, 개선된 면역 반응이 유도될 수 있다. 따라서, 알레르겐 도메인은, 하나 이상의 에피토프가 알레르겐 단백질 상에 원래 존재한다면, 이들 에피토프를 포함하는 비교적 긴 아미노산 서열들을 암호화하는 것이 바람직하다.
알레르겐 도메인은 2개 이상의 알레르겐을 포함할 수 있으며, 각각의 알레르겐은 하나 이상의 알레르겐 에피토프를 함유한다. 소정의 알레르겐 단백질은 2개 이상의 에피토프를 함유하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시 형태가 알레르겐 단백질의 전체 알레르겐 코딩 영역(즉, 신호 서열이 결여되어 있는 코딩 영역), 또는 그의 사실상의 부분을 사용함에 따라, 소정 알레르겐 도메인은 그들의 천연-발생 관계에서 2개 이상의 에피토프를 포함할 것이다. 대안적으로, 2개 이상의 알려진 에피토프가 하나의 코딩 영역 내로 융합될 수 있다. 또 역시, 예시적인 실시 형태에서, 2개 이상의 알레르겐 단백질, 또는 그의 알레르겐 영역이 알레르겐 도메인 내에 존재한다. 2개 이상의 에피토프가 단일 에피토프 도메인 내에 존재하도록 조작된 경우, 이들 에피토프는 동일한 항원 단백질로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 이들은 동일한 종의 2개의 상이한 단백질로부터 유래될 수 있다. 또 역시, 이들은 2개의 상이한 종의 동일한 단백질로부터 유래될 수 있다. 더욱이, 이들은 2개 이상의 상이한 종으로부터의 2개 이상의 상이한 단백질로부터 유래될 수 있다. 본질적으로, 동일하거나 상이한 종으로부터의 동일하거나 상이한 단백질로부터 유래되는 에피토프들의 임의의 조합이 본 발명에 의해 고려된다. 마찬가지로, 다양한 알레르겐들 및 에피토프들의 순서는 상상할 수 있는 임의의 방식으로 변할 수 있다. 다수의 종들로부터 유래되는 알레르겐 단백질들 및/또는 알레르겐 펩티드들의 혼합은, 다수의 알레르겐들에 기초한 단일 공급원 유기체(예를 들어, 특히 나무의 종)에 대한 알레르기 치료뿐만 아니라 다수의 알레르겐들에 기초한 다수의 공급원 유기체들(예를 들어, 그 해의 동일한 계절 동안 포자를 방출하는 다수의 식물들)에 대한 알레르기 치료도 제공할 수 있는 강력한 핵산 백신의 생성을 가능하게 한다. 단일 핵산 백신으로부터 다수의 알레르기들에 대항하는 능력은 지금까지 입증되어 있지 않다.
본 발명의 핵산 작제물은 막횡단 도메인을 추가로 포함한다. 막횡단 도메인은 잘 알려져 있으며, 생물학적 막의 양쪽에 부분적으로 존재하는 단백질들의 잘 규정된 물리적 및 기능적 요소들이다. 본질적으로, 막횡단 도메인은, 천연에서 일반적으로 소수성 또는 친유성이고 생물학적 막에 단백질을 고착시키도록 기능하는 아미노산들의 선형 서열이다. 일반적으로, 그러한 서열은 20개 내지 25개의 잔기 길이이다. 당업자는 그러한 서열들을 잘 알고 있을 것이며, 본 발명에서 사용하기에 적합한 막횡단 서열을 용이하게 입수하거나 조작할 수 있다.
상기에 논의된 요소들에 더하여, 본 발명의 핵산은 표적화 도메인을 포함한다. 표적화 도메인은 암호화된 키메릭 단백질을 엔도좀/리소좀 구획으로 표적화하도록 기능하는 아미노산 서열을 암호화하는 서열이다. 그의 정체에서 그렇게 제한되지는 않지만, 바람직한 실시 형태에서, 표적화 도메인은 LAMP 폴리펩티드, DC-LAMP, LAMP2, LAMP-3, LIMP II, ENDOLYN, 또는 마크로시알린/CD68의 C-말단 세포질 표적화 서열을 포함한다.
실시 형태에서, 본 발명의 핵산은, 알레르겐 도메인의 일부로서, 알레르겐 도메인 내에 서열 번호 2의 서열(즉, 신호 서열이 결여되어 있는 Cry J2 뉴클레오티드 서열) 또는 서열 번호 3을 암호화하는 다른 서열(즉, 신호 서열이 결여되어 있는 Cry J2 단백질 서열)을 포함한다. 서열 번호 2는, 크립토메리아 자포니카의 화분에서 발견되는 펙테이트 리아제 단백질인, 신호 서열을 제외한 Cry J2의 전체 단백질 코딩 서열(즉, 서열 번호 2)을 암호화하는 뉴클레오티드들로 이루어진다. Cry J2는 삼나무 화분이 존재하는 지역에서 계절성 및 지속성 알레르기와 상관되는 것으로 당업계에 잘 알려져 있다. Cry J2에 특이적인 IgE는 삼나무 숲 부근의 지역에 있는 알레르기 환자에서 통상적으로 발견된다. 본 발명의 개시 내용의 일부로서 제공되는 서열 목록에서, 각각의 알레르겐에 대한 신호 서열이 존재한다면 이것이 기재되어야 함을 유념해야 한다. 본 발명의 작제물과 관련하여, 이들 신호 서열은 존재하지 않음이 이해되어야 한다.
다른 실시 형태에서, 핵산은 서열 번호 4의 서열(즉, 신호 서열이 결여되어 있는 Cry J1 뉴클레오티드 서열) 또는 서열 번호 5를 암호화하는 다른 서열(즉, 신호 서열이 결여되어 있는 Cry J2 단백질 서열)을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 핵산은 서열 번호 2 및 서열 번호 4 둘 모두의 서열, 또는 각각 서열 번호 3 및 서열 번호 5를 암호화하는 다른 서열들을 포함한다. 실시 형태에서, 핵산은, 하기의 알레르겐들 중 임의의 것을 암호화하는 서열들과 같은 본 명세서에 개시된 다른 서열들 중 하나 이상을 포함한다: Cry J3(Cry J3.8; C. 자포니카; 서열 번호 10; 신호 서열은 잔기 1 내지 26임), CJP-4(C. 자포니카; 서열 번호 11), CJP-6(C. 자포니카; 서열 번호 12), CJP-8(C. 자포니카; 서열 번호 13; 신호 서열은 잔기 1 내지 35임), CPA63(C. 자포니카; 서열 번호 14; 신호 서열은 잔기 1 내지 20임), CJP38(C. 자포니카; 서열 번호 15; 신호 서열은 잔기 1 내지 28임), Cha o 1(C. 오브투사(C. obtusa); 서열 번호 16; 신호 서열은 잔기 1 내지 21임), Jun a 1(J. 아세이(J. ashei); 서열 번호 17; 신호 서열은 잔기 1 내지 21임), Jun v 1(J. 비르기니아나(J. virginiana); 서열 번호 18; 신호 서열은 잔기 1 내지 21임), Cup a 1(H. 아리조니카(H. arizonica); 서열 번호 19; 신호 서열은 잔기 1 내지 21임), Jun o 1(J. 옥시세드루스(J. oxycedrus); 서열 번호 20; 신호 서열은 잔기 1 내지 21임), Cup s 1(C. 셈페르비렌스(C. sempervirens); 서열 번호 21; 신호 서열은 잔기 1 내지 21임), Cha o 2(C. 오브투사; 서열 번호 22; 신호 서열은 잔기 1 내지 22임), Jun a 2(J. 아세이; 서열 번호 23; 신호 서열은 잔기 1 내지 22임), Cup a 2(H. 아리조니카(H. arizonica); 서열 번호 24), Jun a 3(J. 아세이; 서열 번호 25; 신호 서열은 잔기 1 내지 16임), Jun r 3(J. 리기다(J. rigida); 서열 번호 26; 신호 서열은 잔기 1 내지 26임), Cup s 3(C. 셈페르비렌스; 서열 번호 27; 신호 서열은 잔기 1 내지 26임), Cup a 3(H. 아리조니카; 서열 번호 28), Ch4A(P. 몬티콜라(P. monticola); 서열 번호 29; 신호 서열은 잔기 1 내지 25임), Ch4-1(P. 멘지에시이(P. menziesii); 서열 번호 30; 신호 서열은 잔기 1 내지 26임), PT-1(P. 타에다(P. taeda); 서열 번호 31), 및 LTP(P. 아비에스(P. abies); 서열 번호 32; 신호 서열은 잔기 1 내지 25임). 서열 번호와 관련하여 열거되지 않은 핵산 및 아미노산 서열은 또한 공개적으로 입수가능하다. 핵산 서열에 기초하여 본 발명에 따른 단백질 서열들에 도달하는 것은 단지 컴퓨터 프로그램 구현의 문제일 뿐이다. 물론, 이들 단백질 서열에 대해 생화학적으로 동종인 서열들은 이들 실시 형태에 의해 포함된다. 예를 들어, 개시된 서열들에 대해 30% 이상, 예컨대 40% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 나타내는 서열은 이들 실시 형태에 의해 포함된다. 이러한 개념은 본 명세서에 개시된 알레르겐의 특정 서열에 대해서뿐만 아니라 본 명세서에 제공된 모든 단백질 및 핵산 서열에도 적용됨이 이해되어야 한다. 또한, 상기에 언급된 바와 같이, 개시된 범위 내의 각각의 값은 본 발명에 의해 구체적으로 포함되는 것으로 이해된다.
본 발명의 특정 경우에, 알레르겐 도메인 내에 서열 번호 2, 또는 서열 번호 3을 암호화하는 다른 서열을 포함하는 DNA 백신이 제공된다. 그러한 백신이 일본 적삼목(Japanese red cedar) 알레르기에 대해 상당한 증거가 있는 환자에게 투여될 때, 백신은 알레르겐 Cry J2(서열 번호 3 내에 제공됨)를 포함하는 융합 또는 키메릭(이들 용어는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용됨) 단백질의 신생 합성(de novo synthesis)을 가져온다. 키메릭 단백질 상에 존재하는 도메인들의 조합으로 인해, 그 단백질은 소포체로부터 엔도좀 경로 내로 안내되며, 그 결과 융합 단백질이 처리되어 MHC 소포 내에서 에피토프들로 되며, 이들 중 일부가 MHC 클래스 II 분자에 결합되게 되어, 향상된 체액성 면역 반응으로 이어진다.
본 발명의 다른 경우에, 알레르겐 도메인 내에 서열 번호 4의 서열 또는 서열 번호 5를 암호화하는 다른 서열을 포함하는 DNA 백신이 제공된다. 그러한 백신이 일본 적삼목 알레르기에 대해 상당한 증거가 있는 환자에게 투여될 때, 백신은 알레르겐 Cry J1(서열 번호 4의 서열 내에서 발견됨)을 포함하는 융합 또는 키메릭(이들 용어는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용됨) 단백질의 신생 합성을 가져온다. 키메릭 단백질 상에 존재하는 도메인들의 조합으로 인해, 그 단백질은 소포체로부터 엔도좀 경로 내로 안내되며, 그 결과 융합 단백질이 처리되어 MHC 소포 내에서 에피토프들로 되며, 이들 중 일부가 MHC 클래스 II 분자에 결합되게 되어, 향상된 체액성 면역 반응으로 이어진다.
본 발명의 다른 경우에, 알레르겐 도메인 내에 서열 번호 6을 포함하는 DNA 백신이 제공된다. 그러한 백신이 일본 적삼목 알레르기에 대해 상당한 증거가 있는 환자에게 투여될 때, 백신은 알레르겐 Cry J1 및 Cry J2(서열 번호 7)를 포함하는 융합 또는 키메릭(이들 용어는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용됨) 단백질의 신생 합성을 가져온다. 키메릭 단백질 상에 존재하는 도메인들의 조합으로 인해, 그 단백질은 소포체로부터 엔도좀 경로 내로 안내되며, 그 결과 융합 단백질이 처리되어 MHC 소포 내에서 에피토프들로 되며, 이들 중 일부가 MHC 클래스 II 분자에 결합되게 되어, 향상된 체액성 면역 반응으로 이어진다.
본 발명의 다른 경우에, 주니페루스 아세이(Juniperus ashei) 속(genus)에 속하는 펙테이트 리아제인 Jun a 1의 전체 단백질 코딩 서열을 암호화하는 핵산이 알레르겐 도메인 내에 제공된다. Jun a 1은 Cry J1과의 고도의 서열 동일성을 나타내며, 둘 모두는 Cry J1과 유사한 효소 활성을 유지하고, 알려진 에피토프들에서 높은 유사성을 갖는다.
다른 폴리펩티드들이, Cry J1에 대해 교차-반응성(cross-reactive)이고 이러한 교차반응성은 펙테이트 리아제 패밀리 폴리펩티드들의 효소 활성에 관련된 공유 에피토프(shared epitope)들로 인한 것으로 잘 알려져 있다. 이러한 패밀리에는 편백나무(카마에시파리스 오브투사(Chamaecyparis obtusa)(Ch o 1))의 주요 알레르겐이 포함되며, 하기로부터 유래되는 알레르겐들이 포함된다: 주니페루스 아세이(Jun a 1), 주니페루스 비르기니아나(Juniperus virginiana)(Jun v 1), 쿠프레수스 아리조니카(Cuppressus arizonica)(Cup a 1), 주니페루스 옥시세드루스(Juniperus oxycedrus)(Jun o 1), 및 쿠프레수스 셈페르비렌스(Cupressus sempervirens)(Cups 1). 삼나무 과(쿠프레수스)로부터 유래되는 화분에 대해 알레르기 환자들 사이에 강한 교차-반응성이 있는 것으로 문헌에 나와 있다. 하기 표 I은 관련 단백질들 사이의 교차-반응성의 수준을 나타낸 표를 보여준다. 본 발명이 Cry J1 및 Cry J2에 관하여 상세히 기술하고 있지만, 본 명세서에 그리고 특히 표 I에 개시된 알레르겐들의 하나 이상이 Cry J1 및 Cry J2 서열에 더하여 또는 이들에 대한 대안으로서 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
[표 I]
코딩 영역에 대한 뉴클레오티드 서열을 상이한 코딩 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 내로 삽입하기 위한 소정 부위들(즉, 융합 부위들)이 다른 것들보다 더 유리한 것으로 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 도 1 내지 도 5에 교시된 알레르겐 서열의 위치는 본 발명에 교시된 조성물을 사용하기에 유리한 위치로서 교시된다. 알레르겐 서열의 위치를, 예를 들어 LAMP 폴리펩티드의 루멘 도메인 또는 다른 세포소기관내 안정화 도메인 내의 다른 위치들로 이동하는 것은 본 발명의 범주 내에 있다. 그러나, 알레르겐은 막횡단 도메인 또는 세포질 도메인 어느 것의 코딩 영역 내에도 위치하지 않는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 경우에, 알레르겐 서열은 막횡단 도메인과의 접합부로부터 5개의 아미노산 이내, 그리고 LAMP 폴리펩티드의 루멘 도메인의 5' N 말단 측 상에 있는 최대 20개의 아미노산까지 LAMP 폴리펩티드의 루멘 도메인 내로 삽입된다.
본 발명의 핵산은 정제된 또는 단리된 분자로서 제공될 수 있다. 핵산은 또한 조성물의 일부로서 제공될 수 있다. 조성물은 핵산으로 본질적으로 이루어질 수 있는데, 이는 핵산이 코딩 서열의 발현에 적합한 조성물 내의 유일한 핵산임을 의미한다. 대안적으로, 조성물은 본 발명의 핵산을 포함할 수 있다. 예시적인 실시 형태에서, 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 물질 또는 담체와 함께 본 발명의 핵산을 포함하는 약제학적 조성물이다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 세포에 의한 핵산의 흡수를 촉진시키는 물질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 특이적 세포 유형, 예컨대 면역 세포(예를 들어, APC)로의 핵산의 전달을 돕는 표적화 분자를 포함한다. 실시 형태에서, 핵산은 세포 또는 조직으로 핵산을 전달하기 위한 전달 비히클 또는 전달 벡터의 일부이다.
본 발명의 특정 경우에, 조성물은 2개의 DNA 백신들의 혼합물을 포함하는데, 여기서 하나의 백신은 하나의 알레르겐의 서열을 포함하고, 다른 하나의 백신은 다른 알레르겐의 서열을 포함한다. 2개의 백신 작제물들이 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 순차로 1:10에 이르기까지의 비로 함께 혼합될 수 있다. 바람직한 비는 1:1이다.
본 발명의 특정 경우에, Cry J1, Cry J2, 및/또는 Jun a2의 핵산은 핵산 전달 벡터 내에 존재한다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 핵산 전달 벡터는 항생제 저항성 유전자를 함유하지 않는데, 예컨대 미국 특허 출원 공개 제2008/006554호에 의해 교시된 핵산 전달 벡터, 또는 미국 특허 출원 공개 제2006/003148호에 개시되거나 이로부터 생성되는 벡터들과 같은 것이다. 본 발명의 특정 경우에, 핵산은 바이러스성 벡터, 예컨대 아데노바이러스성 벡터이다.
핵산 및 조성물은 환자에서 알레르기 반응을 감소시키기 위한 제제로서 신규하고 유용하다. 예를 들어, 핵산 및 조성물은 일본 적삼목 화분과 상관되거나, 또는 동종 화분 또는 알레르겐으로부터 기인되는 입증된 알레르기 반응을 갖는 환자에서 화분증을 감소시키는 데 유용하다. 다른 비제한적인 예로서, 핵산은 식품 알레르기, 예컨대 땅콩 또는 다른 너트에 대한 알레르기를 감소시키는 데 유용하다. 일본 적삼목 화분으로부터 기인되는 화분증을 치료하기 위해, 핵산 및 조성물이 항원 제시 세포를 형질감염시키도록 핵산 및 조성물을 전달하는 것은 Cry J1 및/또는 Cry J2 내에 함유된 에피토프들에 특이적인 면역글로불린 G(IgG)의 혈청 수준의 증가를 가져온다. 이러한 반응은 알레르기 증상의 감소에 유용하다. 돼지풀, 다른 나무 화분들, 및 식품을 포함한, 다른 알레르기들을 위한 알레르겐의 전달이 또한 IgG의 혈청 수준의 증가를 가져온다.
치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 본 방법은 하나 이상의 알레르겐에 대해 알레르기 반응을 앓고 있거나 그것이 발병될 위험이 있는 대상체를 예방적으로 치료하거나 치료학적으로 치료하는 방법이다. 본 방법은 본 발명에 따른 DNA 백신을 APC에 의한 DNA 백신의 흡수 및 발현을 일으키기에 충분한 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. DNA 백신의 발현은 APC 상에의 암호화된 알레르겐 에피토프(들)의 제시, 및 IgG 면역 반응의 발생을 가져온다.
본 발명의 특정 경우에, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 및/또는 다른 알레르겐 암호화 서열이 세포에 투여된다. 바람직한 실시 형태에서, 세포는 항원 제시 세포, 예컨대 수지상 세포이다. 바람직하게는, 수지상 세포는 인간 수지상 세포이다. 본 발명은 핵산 백신에 대한 효과적인 전달 방법인 것으로 당업계에 알려진 방법에 의해 투여될 수 있는데, 이에는 점막내 주사, 피하 주사, 전기천공, 유전자 총 백신접종(gene gun vaccination), 또는 리소좀-매개 이동이 포함된다.
본 발명은 일본 적삼목 화분과 상관된 화분증의 치료에 유용한 제형을 제공한다. 알레르겐의 단백질 코딩 서열을 암호화하는 DNA 플라스미드를 동물로 전달하는 것은 IFN-감마 생산을 증가시키고 IL-4 생산을 저하시킬 수 있는 것으로 이미 결정되어 있는데, 이는 특이적 알레르겐에 대해 알레르기가 있는 동물들을 치료하는 데 유용하다. 본 발명은 일본 적삼목 화분과 상관된 알레르기를 갖는 환자를 치료하기 위한 개선된 DNA 백신 조성물을 제공한다. 본 발명의 융합 단백질은 MHC 클래스 II 소포와 교차되는 특이적인 세포내 트래피킹 패턴을 가지며, 그 결과 면역 시스템에 대한 알레르겐 에피토프의 향상된 제시를 가져오며, 구체적으로는 향상된 항체 반응으로 이어진다. 본 발명에 의해 제공되는 핵산 및 조성물은 알레르기 면역요법을 수행하기에 유용하다.
본 발명은, 세포에 투여될 때 증가된 특이적 항체 반응을 가져오는 제형을 제공한다. 알레르겐에 대한 증가된 항체 반응은 IgE-매개 알레르기 질환을 치료하는 데 유용하다. IgE는 동족 알레르겐과의 결합시 그의 세포 제한(cellular restriction) 및 그 결과 생성된 세포내 시그널링과 관련된 소정의 특성을 갖는다. IgE는 B 세포가 Th2 세포에 의해 분비된 IL-4를 수용할 때 알레르겐에 대해 생성된다. 이는 B 세포가 IgE 클래스 항체들을 생산하도록 지시하는 것을 돕는다. B 세포에 의한 분비시, IgE는 비만 세포 및 호산구에 의해 발현되는 그의 고친화성 수용체인 Fc-eRI에 결합되며, 그 결과 이들 세포 및 그 동물은 향후의 알레르겐 노출에 대해 감작화되게 된다. 결과적으로, 알레르기의 증상은 알레르겐과의 근육 접촉, 흡입, 또는 섭취시에 촉발될 수 있다. 항체의 결합 특성으로 인해, 알레르기 증상을 감소시키는 한 가지 방법이 다른 항체 클래스들과의 경쟁을 통해 IgE에 의한 결합에 이용가능한 유리(free) 알레르겐을 킬레이트화하는 것임이 제안되어 왔다. 특히, IgG를 증가시키는 알레르기 제형이 알레르기 질환을 감소시키기 위한 방도인 것으로 제안되어 왔다. 본 명세서에 기술된 본 발명은 향상된 IgG 생산을 유도하며, 이에 따라 임상적으로 유의한 방식으로 IgG에 대한 IgE의 비의 감소를 일으킨다. 수행된 연구 결과는, 일수 98에, Cry J2-LAMP 작제물에 의해 유도된 IgG의 수준이 비변형 Cry J2를 암호화하는 뉴클레오티드의 전달에 의해 유도된 수준보다 더 큼을 나타낸다.
본 발명의 다른 경우에, Cry J1과 유사한 물질의 새로운 조성이 생성될 수 있도록, 그리고 환자에 대한 물질의 동종 조성물의 투여가 삼나무 화분과 상관된 알레르기를 치료하기에 유용한 치료학적 결과를 생성하도록, 펙테이트 리아제인 Cry J1의 아미노산 또는 핵산 서열과의 서열 상동성의 정도를 결정하기 위한, 삼나무의 화분에서 발견되는 펙테이트 리아제 폴리펩티드를 선택하는 방법이 교시된다.
실시예
이제, 본 발명의 예시적인 실시 형태를 참고하여 본 발명을 설명할 것이다. 하기 실시예는 독자에게 본 발명의 작제물의 구성 및 활성에 대한 더 나은 이해를 제공하는 것으로 의도되며, 본 발명의 범주에 대한 제한으로서 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: 일반적 재료 및 방법
면역화 및 혈청 수집
생후 6 내지 8주된 암컷 BALB/c 마우스를 미국 매릴랜드주 프레데릭 소재의 하를란 래버러토리즈(Harlan Laboratories)로부터 구매하고 미국 매릴랜드주 록빌에 있는 본 발명자들의 동물 시설에서 보관하였다. 100 ul 부피의 멸균 PBS 중 50 ug의 플라스미드 DNA를 사용하여 근육내 또는 진피내로 DNA 면역화를 제공하였다. 오비탈 블리딩(orbital bleed)에 의해 혈청을 얻었으며, 나중의 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다. 감작화를 위해, 5 ug/ml의 재조합 CRYJ2(rCRYJ2) 또는 재조합 CRYJ1(rCYRJ1)을, 200 ul의 전체 부피 중 100 ul의 명반(2 mg/ml)과 함께, 마우스에 주사하였다. 마우스를 매주 블리딩하고, ELISA에 의해 CRYJ 특이적 항체에 대해 혈청을 분석하였다.
기니아 피그
암컷 기니아 피그를 구매하고, 스프링 밸리 래버러토리즈(Spring Valley Laboratories)(미국 매릴랜드주 우드라인 소재)에서 보관하였다. 200 ul 부피의 멸균 식염수 중 100 ug의 플라스미드 DNA를 사용하여 근육내로 DNA 면역화를 제공하였다. 심장 블리딩(cardiac bleed)에 의해 혈청을 얻었으며, 나중의 분석을 위해 20℃에서 보관하였다.
CYRJ2-특이적 면역글로불린 반응의 검출
눈크 맥시소프(Nunc Maxisorp) 면역검정 플레이트를 4℃에서 하룻밤 PBS 중 5 ug/ml 농도의 rCRYJ2로 코팅하였다. PBS 중 1% BSA로 블로킹한 후, 혈청을 0.05% 트윈-20(Tween-20)을 함유하는 PBS(PBS-T) 중에 희석시키고, 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰들 상에서 고정된 CRYJ2에 결합된 IgG, IgG1, 또는 IgG2a를, 퍼옥시다제 접합된 염소 안티-마우스 IgG, IgG1 또는 IgG2a 항체(잭슨 래버러토리즈(Jackson Laboratories))를 사용하여 검출하였다. TMB 기질(KPL)을 첨가하고, TMB 정지 용액(Stop Solution)에 의해 효소 활성을 정지시켰다. 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 일부 경우에는, 슈어 정지 용액(Sure Stop Solution)(KPL)을 사용하였으며, 플레이트를 650 nm에서 판독하였다.
사이토카인 측정을 위한 비장세포의 제조
비장을 무균적으로 적출하고 얇게 잘라서 단일-세포 현탁액을 제조하였다. 1차 반응(primary response)을 연구하기 위하여, 10 ug/ml, 5 ug/ml, 또는 2.5 ug/ml의 rCRYJ2의 존재 하에서 또는 부재 하에서 72시간 동안 24웰 플레이트(4 x 105 세포/웰) 내에서 비장세포를 배양하였다.
사이토카인 검정
ELISA에 의해 IFN-감마 및 IL-4의 존재에 대해 상청액을 검정하였다. 매칭된 항체 쌍들을 IFN-감마 및 IL-4를 위해 사용하였으며, 제조업체의 사용설명서에 따라 수행하였다. 마우스 재조합 IFN-감마 및 IL-4를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 모든 항체 및 사이토카인은 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 구매하였다. IFN-감마 및 IL-4 검정의 검출 한계는 각각 20 및 10 pg/ml였다.
실시예 2: 작제물로부터의 알레르겐의 발현
본 발명의 핵산 작제물이 형질전환된 세포에서 하나 또는 다수의 알레르겐을 발현시키는 데 사용될 수 있음을 보여주기 위하여, 인간 293 세포들을 CryJ2-LAMP 플라스미드, CryJ1+J2-LAMP 플라스미드(도 4), CryJ1-LAMP 플라스미드, CryJ1 플라스미드(CryJ1 신호 서열이 결여되어 있음; 도 7), 및 베이스 플라스미드 벡터 단독(음성 대조군; 서열 번호 1)으로 형질감염시켰다. 실험의 결과가 도 9에 도시되어 있다.
도 9a는 안티-CryJ2 항체를 사용하여 검출했을 때의 형질감염 반응의 결과를 도시한다. 간단히 말하면, 30 마이크로그램의 세포 용해물을 전기영동하고, 이어서 면역블로팅을 위한 막으로 옮겼다. CryJ2 단일클론 항체를 사용하여 면역블로팅하고, 이어서 화학발광을 행함으로써 단백질을 검출하였다. 이 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, CryJ2 알레르겐 단독, 및 CryJ1+CryJ2 알레르겐을 포함하는 작제물은 검출되었지만(레인(lane) 2 및 3), 반면 다른 알레르겐들은 검출되지 않았다. 이 실험에서는, 레인 5에서의 작제물을 제외하고는, 실험 전에 CryJ1 및 CryJ2 알레르겐에 대한 천연-발생 신호 서열을 제거하였다. 이들 결과는, 본 발명의 작제물이 알레르겐의 발현에 적합하다는 것뿐만 아니라 다수의 알레르겐이 공-발현(co-express)될 수 있다는 것도 보여준다.
도 9b는 안티-CryJ1 항체를 사용하여 검출했을 때의 형질감염 반응의 결과를 도시한다. 간단히 말하면, 30 마이크로그램의 세포 용해물을 전기영동하고, 이어서 면역블로팅을 위한 막으로 옮겼다. CryJ1 단일클론 항체를 사용하여 면역블로팅하고, 이어서 화학발광을 행함으로써 단백질을 검출하였다. 이 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 천연-발생 신호 서열이 제거된 CryJ1 알레르겐을 포함하는 작제물과 같이(레인 5), CryJ1+CryJ2 알레르겐(천연 신호 서열이 결여되어 있음)을 포함하는 작제물이 검출되었다(레인 3). 그러나, 천연 신호 서열을 포함한 Cry1 알레르겐을 포함하는 작제물은 검출되지 않았다. 이들 결과는 본 발명의 작제물이 다수의 알레르겐의 발현 및 검출에 적합하다는 것과 천연-발생 신호 서열의 제거가 생산물을 발현 및 검출하는 데 중요하다는 것을 보여준다.
실시예 3: 작제물에 대한 MHC II 처리 경로를 지지하는 데이터
본 발명의 작제물로부터 생산된 키메릭 단백질이 MHC II 경로를 통해 처리되는지를 결정하기 위하여, 실험 한 세트를 수행하여 플라스미드 상의 코딩 영역으로서 투여될 때 또는 본 발명에 따른 작제물 상의 알레르겐 도메인으로서 투여될 때의 CryJ2 단백질에 대한 면역 반응을 비교하였다. 결과가 도 10의 패널 A 및 패널 B에 제공되어 있다.
더 구체적으로, 이 도면은 4회의 DNA 면역화 및 천연 그대로의(crude) 화분 추출물 감작화 후의 CryJ2 특이적 반응을 도시한다. 일수 0, 7, 14, 및 21에 CRYJ2-LAMP 플라스미드 DNA 또는 CRYJ2 플라스미드(도 8 참조) DNA를 사용하여 피하로 마우스 집단(n=5)을 면역화하였다. 마지막 DNA 면역화 후 6주(일수 77)째에, 명반 중 천연 그대로의 화분 추출물로 마우스를 감작화하고, 3주(일수 91) 후에 증진제(booster)를 제공하였다. 이 데이터는 각각의 시점에 대하여 풀링된(pooled) 혈청으로부터 생성된 값을 보여준다. CRYJ2-LAMP DNA를 투여받은 마우스에서의 IgG1(패널 A) 및 IgG2a(패널 B) 반응은 일수 112까지 상승된 상태를 유지하였으며, LAMP를 포함하지 않은 CRYJ2 플라스미드 DNA를 투여받은 마우스들보다 충분히 높았다. 따라서, 본 발명에 따른 작제물에 의한 알레르겐의 전달은 본 발명의 작제물이 관련되지 않은 알레르겐의 전달보다 월등한 MHC II 반응을 제공한다.
실시예 4: 투약 근거(Dosing Rationale) - 상이한 용량들의 작제물에 대한 면역 반응과 벡터 단독에 대한 면역 반응의 비교
도 11은, IgG2a 생산 및 IgG1 생산 둘 모두에 대한, 상이한 투약 수준에서의 4회의 DNA 면역화 후의 CryJ2-특이적 반응을 도시한다. 일수 0, 7, 14, 및 21에 CRYJ2-LAMP 플라스미드 DNA 또는 벡터 DNA 10 ug, 50 ug, 또는 100 ug을 근육내로 마우스 집단(n=5)에 제공하였다. 마지막 DNA 면역화 후 3주째에, 마우스를 희생시키고 사이토카인 유도 검정을 위해 비장을 적출하였다.
이 데이터는 각각의 백신 용량에 대하여 풀링된 혈청으로부터 생성된 값을 보여준다. CRYJ2-LAMP 플라스미드 DNA의 3개의 모든 농도는 IgG1 및 IgG2a 반응을 제공하였으며, 이때 50 ug 용량이 최고의 항체 반응을 제공한 것으로 나타났다. 벡터 단독으로는 상기 농도들 중 어느 것에서도 어떠한 항체 반응도 유도하지 않았다. 이들 데이터는, 면역 반응을 일으키기 위한 용량-의존성 반응이 있으며 그러한 면역 반응은 적어도 부분적으로 MHC II형 반응임을 보여준다.
실시예 5 : MHC II 경로를 통한 면역 반응을 보여주는 추가 데이터
이 실험 세트에서는, 마커로서 IL-4 및 IFN-감마를 사용하여, 자극된 비장 세포의 상청액에서의 사이토카인의 분비를 결정하였다. 구체적으로, 마우스(n=3)의 비장 세포를 일수 42에 수거하고, 10 ug/ml, 5 ug/ml, 2.5 ug/ml, 또는 0 ug/ml의 rCRYJ2의 존재 하에서 배양하였다. 나이브(naive) 마우스로부터의 비장 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. rCRYJ2로 자극된 비장세포의 IL-4 및 IFN-감마 수준을 ELISA에 의해 pg/ml 단위로 측정하였다.
이 데이터는 도 12의 패널 A 및 패널 B에 제공되어 있다. 이 데이터는 50 ug의 CRYJ2-LAMP 플라스미드 DNA를 투여받은 마우스가 더 낮은 용량의 플라스미드 DNA를 투여받은 마우스보다 IFN-감마(MHC II 면역 반응 경로의 활성화에 대한 확립된 마커)의 상당히 더 높은 발현을 가짐을 보여준다. 어떠한 집단에서도, MHC I 경로에 대한 확립된 마커인 IL-4 수준에 대해 보여지는 반응은 거의 없었다. 또한, 있다 하더라도 IL-5에 관한 반응도 거의 없었다(데이터는 도시되지 않음). 이들 결과는, 재조합 Cry J2 단백질에 의한 자극 후에 IFN-감마가 생산되고 IL-4가 생산되지 않은 것에 의해 나타난 바와 같이, Cry J2-LAMP DNA 면역화가 Th1 기억 세포의 동원을 유도하였고 Th2 세포의 동원을 유도하지 않았음을 나타낸다.
실시예 6: 사전에 CryJ2로 감작화된 마우스에서 CryJ2-LAMP DNA 백신에 의한 면역화의 치료학적 효과에 관한 연구
DNA-LAMP-CryJ2 백신의 치료학적 효과를 연구하기 위하여, 5 ug의 rCRYJ2 재조합 단백질의 3회 주사로 마우스 집단(n=5)을 감작화하고, 4주 후에, 일주(7일) 간격으로 제공된 CRYJ2-LAMP 플라스미드 DNA의 4회 주사로 처리하였다. DNA 면역화는 IgG2a 항체에 대한 증진 효과 및 IgG1 항체에 대한 일시적 증가를 유도하였는데, 이는 DNA 백신의 Th1-지향 조절 효과를 나타낸다. 일수 167 및 174에의 추가 2회의 DNA 면역화는 CRYJ2 특이적 IgG2a 반응을 증진시켰으며, IgG1 반응에서는 거의 변화가 없었다. 마우스의 시각적 검사는 신체적 손상 또는 피부 반응을 나타내지 않았다. 또한, 식욕에서도 변화가 없었으며 이들은 혼수 상태(lethargic)를 나타내지도 않았다. IgG1 및 IgG2a 역가에 대한 영향이 각각 도 13의 패널 A 및 패널 B에 도시되어 있다.
실시예 7: 마우스 비장 세포 배양액에서의 IFN-감마 및 IL-4의 유도
CryJ2-LAMP DNA 백신의 치료학적 효과를 또한 사이토카인 유도의 관점에서 연구하였다. 마우스(n=3)의 비장 세포를 일수 183에 수거하고, 다양한 농도의 rCRYJ2로 자극하였다. 나이브 마우스로부터의 비장 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. rCRYJ2로 자극된 비장세포의 IL-4 및 IFN-감마 수준을 ELISA에 의해 pg/ml 단위로 측정하였다. IFN-감마의 유의하게 상승된 발현이, 벡터 집단에서의 것과 비교하여, CRYJ2-LAMP 백신접종 집단에서 검출되었다. 그러나, IL-4 발현은 벡터 집단과의 어떠한 차이도 나타내지 않았다. CryJ2-LAMP DNA 면역화의 결과로서의 IFN-감마의 증가는, 추정컨대, 항원-특이적 Th1 세포의 동원 및 Th1 사이토카인 환경의 생성을 수반할 것이다. 이 실험으로부터 얻어진 데이터가 도 14의 패널 A 및 패널 B에 제공되어 있다.
실시예 8: 혈청 중의 순환 CryJ2 단백질의 검출
Cry J2 단백질, pDNA-Cry J2(LAMP 없음) 및 Cry J2-LAMP-vax로 마우스를 면역화하였다. 일수 0, 1, 2, 3, 4, 및 7에 혈청 샘플을 취하고, 고감도 샌드위치 면역검정(sensitive sandwich immunoassay)으로 유리 Cry J2 단백질의 존재에 대해 평가하였다. 유리 Cry J2가 단백질 및 비-LAMP 면역화에서 검출되었다. 그러나, Cry J2-LAMP-vax로 면역화된 마우스에 대해서는 어떠한 실험에서도 어떠한 시점에서도 유리 알레르겐이 전혀 검출되지 않았다(최소 검출가능한 수준 2 ng/ml). 이러한 언급을 지지하는 데이터가 도 12에 제공되어 있다.
본 발명에 따른 LAMP 백신은, 유리 알레르겐을 전신으로 환자 내로 도입하지 않고서 알레르기를 치료하는 유일한 제형일 것이다. 이는, 알레르겐의 전신 도입으로 인해 때때로 아나필락시 반응(anaphylactic reaction)을 가져올 수 있는 전통적인 면역요법과는 상이하다. 이 실험은 Cry J2-LAMP DNA 플라스미드를 투여받은 마우스가 유리 Cry J2 단백질을 갖지 않으며, 이에 따라 단백질 단독 또는 LAMP를 갖지 않는 Cry J2 DNA가 제공된 마우스에 대해 보여지는 바와 같은 체순환으로 방출되지 않음을 보여준다.
실시예 9: 기니아 피그에서의 DNA 백신의 유효성
다른 포유류에서의 본 핵산 작제물의 기능에 관한 과학적 이해를 확대시키기 위하여, CryJ2-LAMP DNA 백신으로 면역화되고, 이어서 재조합 CryJ2 단백질이 시험투여된 암컷 기니아 피그에서 연구를 수행하였다. 이 연구 결과가 도 16의 패널 A 및 패널 B에 도시되어 있다.
구체적으로, 일수 0, 7, 및 14에 암컷 기니아 피그에 100 ug의 CRYJ2-LAMP DNA 백신 또는 벡터 단독을 근육내 주사하였다. 일수 14에서의 마지막 DNA 백신 면역화 후 4주째에, 일수 42 및 49에 기니아 피그에 10 ug/ml의 rCRYJ2 단백질/명반을 피하 주사하였다. 일수 0, 21, 35, 63, 및 77에 기니아 피그로부터 혈청 샘플을 얻었다. 이 데이터는, CRYJ2-LAMP DNA를 투여받은 기니아 피그에 대한 평균 흡광도 값이 IgG2의 경우 일수 35까지 증가되었으며, IgG1 반응은 거의 없거나 전혀 없음을 보여준다. IgG2a의 증가는, 전형적으로 Th1 편향 반응에서 보여지는 것과 일치한다.
실시예 10: 다른 포유류에서의 추가 조사 - 안정성을 보여주는 독성 데이터
뉴질랜드 화이트 래빗에 4.128 mg의 CRYJ2-LAMP DNA를 근육내 주사하였다. 연령 및 성별-매칭된 대조군 래빗이 식염수를 단독으로 투여받았다. 일수 1, 14, 28, 42, 및 56에 래빗을 면역화하였다. 일수 1, 14, 28, 42, 56, 58, 및 85에 래빗으로부터 혈청 샘플을 얻었다. CryJ2-LAMP 플라스미드 또는 식염수의 다회 근육내(IM) 주사 후 1:100에서의 래빗 혈청의 평균 흡광도 값이 도 17에 도시되어 있다. 이 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 이 데이터는 식염수를 투여받은 래빗에 대한 평균 흡광도 값이 0.100 미만임을 보여준다. CRYJ2-LAMP DNA로 처리된 집단에서의 래빗의 흡광도 값은 일반적으로 일수 42까지 증가되었으며, 일부 경우에는 일수 85까지 증가되었다.
실시예 11: 식품 알레르기에 대한 적용가능성
최근 25년에 걸쳐, 땅콩 알레르기 환자에서의 감작화에 기초하여 8개의 중대한 땅콩 알레르겐을 확인하였다. 3개의 주요 땅콩 알레르겐은 땅콩 알레르기 환자의 IgE에 의해 가장 흔히 인식된다: 65 내지 100%는 63.5 kDa 종자 저장 비실린 패밀리 단백질인 Ara h1을 인식하고; 71 내지 100%는 17 kDa 종자 저장 콘글루틴 패밀리 단백질인 Ara h2를 인식하고; 45 내지 95%는 14 kDa 종자 저장 글리시닌 패밀리 단백질인 Ara h3을 인식한다. 땅콩-의존성 알레르기 반응 및 아나필락시를 촉발시키는 데 있어서 공통 원인체(causative agent)인 것에 더하여, 이들 3개의 단백질은 또한 더 강한 알레르기 반응을 촉진시키는 것으로 보인다. 땅콩 알레르기 면역요법에 대한 기초로서 이들 알레르겐을 표적화하는 것은, 땅콩 알레르기의 다양한 인구 중에서 강한 알레르기 반응으로부터 가장 폭넓은 보호를 제공할 수 있는 잠재성을 갖는다. 알레르기 면역요법으로서, 3개의 주요 알레르겐의 저자극성(hypoallergenic) 형태 및 가열 사균 애쥬번트(heat killed bacterium adjuvant)를 사용하는 제I상 임상 시험이 현재 진행 중이다. 이 시험은 계속 진행되고 있지만, 그러한 요법의 최종 상업화는 고도로 복잡한 제조 공정으로 인해 어려울 것이다.
식품 알레르기, 및 특히 땅콩 알레르기의 상승하는 발생률에 대처하기 위해, 본 발명에 따른 핵산 작제물을 생성하였다. 상기에 논의된 바와 같이, 본 작제물은 도 6a에 도시되어 있으며, 암호화된 키메릭 단백질의 개략도는 도 6b에 도시되어 있다. 이 작제물은 그것을 투여받은 대상체에서 주로 MHC II 반응을 발생시키는 데 사용될 수 있다. 단일 키메릭 단백질 내의 3개의 가장 일반적인 땅콩 알레르겐의 존재는 폭넓은 면역화를 가능하게 하며, 이는 인구에서의 대부분의 땅콩 알레르기를 치료할 것이다.
이 작제물을 발현시켰으며, 그 결과가 도 18에 도시되어 있다. 도 19는 3개의 모든 알레르겐이 웨스턴 블롯 상에서 단일 폴리단백질로서 발현되고 검출될 수 있음을 보여준다.
본 발명의 범주 또는 사상으로부터 벗어나지 않고서, 본 발명의 실시에서 그리고 핵산 작제물의 구성에서 다양한 변형 및 변경이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 명세 및 실시에 대한 고려로부터 본 발명의 다른 실시 형태가 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 명세 및 실시예는 단지 예시로서 간주될 수 있으며, 본 발명의 진정한 범주 및 사상은 하기의 특허청구범위에 의해 나타내고자 한다.
서열 목록에 대한 추가 서열
본 출원의 일부로서 제공된 공식 서열 목록에서 제공된 서열에 더하여, 하기의 서열이 본 발명의 일부를 구성한다:
1. 하기와 같은, Cryl -Cry2-LAMP 키메릭 작제물에 대한 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열:
서열 번호 6 - Cry J1+J2-LAMP
2. Ara H1 / H2/ h3 폴리단백질에 대한 코딩 영역의 핵산 서열:
서열 번호 8
2. 하기와 같은, Ara H1 / H2 / H3 폴리단백질 키메릭 작제물에 대한 코딩 영역의 아미노산 서열:
서열 번호 9 - AraH-LAMP
<서열 목록>
Claims (14)
- 하기 서열을 순차적인 순서로 포함하는 단리되거나 정제된 핵산:
신호 서열을 암호화하는 서열;
세포소기관내 안정화 도메인(intra-organelle stabilizing domain)을 암호화하는 서열;
알레르겐 도메인을 암호화하는 서열 - 알레르겐 도메인은 적어도 하나의 알레르겐을 포함하고 적어도 하나의 알레르겐은 알레르겐에 대한 천연 발생 신호 서열을 포함하지 않음 -;
막횡단 도메인을 암호화하는 서열; 및
엔도좀/리소좀 표적화 도메인(endosomal/lysosomal targeting domain)을 암호화하는 서열. - 제1항에 있어서, 세포소기관내 안정화 도메인은 리소좀 관련 막 단백질(lysosomal associated membrane protein, LAMP)을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산.
- 제1항에 있어서, 세포소기관내 안정화 도메인은 LAMP 폴리펩티드, DC-LAMP, LAMP2, LAMP-3, LIMP II, 또는 ENDOLYN을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산.
- 제1항에 있어서, 알레르겐 도메인을 암호화하는 서열은 2개 이상의 알레르겐 에피토프(allergenic epitope)를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산.
- 제1항에 있어서, 알레르겐 도메인을 암호화하는 서열은 2개 이상의 알레르겐을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산.
- 제5항에 있어서, 알레르겐은 2개 이상의 상이한 종으로부터 유래되는 핵산.
- 제1항에 있어서, 알레르겐은 Cry J1, Cry J2, Cry J3, CJP-4, CJP-6, CJP-8, CPA63, Cha o 1, Jun a 1, Jun v 1, Cup a 1, Jun o 1, Cup s 1, Cha o 2, Jun a 2, Cup a 2, Jun a 3, Jun r 3, Cup s 3, Cup a 3, Ch4A, Ch4-1, PT-1, 또는 LTP 알레르겐, 또는 적어도 하나의 알레르겐 에피토프를 갖는 이들의 일부분인 핵산.
- 제1항에 있어서, 숙주에서 면역 반응을 유도하는 DNA 백신인 핵산.
- 제1항에 있어서, 알레르겐 도메인은 2개 이상의 알레르겐을 암호화하는 서열을 포함하며, 각각의 알레르겐은 동일한 종으로부터 유래되는 핵산.
- 제1항에 있어서, 알레르겐 도메인은 2개 이상의 알레르겐을 암호화하는 서열을 포함하며, 각각의 알레르겐은 상이한 종으로부터 유래되는 핵산.
- 대상체(subject)의 알레르기 반응을 감소, 제거, 또는 예방하는 방법으로서, 제1항의 DNA 백신을, 알레르겐 에피토프에 특이적인 IgE 반응의 생성을 감소 또는 제거하기에 충분한 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제11항에 있어서, 알레르기 반응을 예방하는 방법.
- 제12항에 있어서, 적어도 하나의 임상 알레르기 증상을 감소, 제거, 또는 예방하는 방법.
- 제13항에 있어서, 적어도 하나의 임상 알레르기 증상을 예방하는 방법.
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