KR20080047395A - Ｔ세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한생분해성 나노입자 - Google Patents

Ｔ세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한생분해성 나노입자 Download PDF

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다이호야쿠힌고교 가부시키가이샤
미쯔루 아카시
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Abstract

본 발명의 T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자는 안전하고 또한 효율적인 펩티드 면역요법제로서 사용할 수 있어, 예를 들면 화분증, 통년성 알레르기성 비염 질환, 계절성 알레르기성 비염 질환 등에 대한 면역요법제로서 유용하다.

Description

Ｔ세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자{Biodegradable nanoparticle having T-cell recognizable epitope peptide immobilized thereon or encapsulated therein}
본 발명은 T세포 인식 에피토프 펩티드, 특히 화분증 환자의 T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자, 및/또는 이를 사용한 면역요법제에 관한 것이다.
화분증(花粉症)에 대한 면역요법은 1910년대에 화분의 추출액을 화분증 환자에게 소량으로부터 점차 증량하는 주사법을 실시하여 효과가 보여진 것에 기인하고 있다. 이후 이 방법의 유효성이 경험적으로 확인되어 보급된, 감감작요법(減感作療法)이라고도 불리는 치료법이다. 이 면역요법은, 약물 치료에 비교하여 근치(根治)를 기대할 수 있는 유일한 치료법으로서 평가되는 반면, 사용하는 항원이 화분의 추출액(또는 그 진액)인 점으로부터, 아나필락시스(anaphylaxis) 등의 부작용이 발생하는 경우가 있다. 이로 인해, 이들 부작용의 발현을 억제하기 위해 극미량밖에 투여할 수 없어, 투여기간이 수년에 이른다는 문제점을 안고 있는 점으로부터, 임상에서의 사용은 제한되고 있다.
천식이나 화분증 등으로 대표되는 알레르기 질환은 인터류킨-4, 5 또는 13과 같은 Th2 사이토카인이라고 불리는 사이토카인의 생산이 건강한 정상인에 비교하여 항진되어, 병태의 발증이나 진전에 깊이 관여하고 있는 것이 알려져 있다. 한편, 감감작요법을 실시한 환자에서는 면역응답이 거의 저하하지 않고, 말초혈 림프구의 사이토카인 생산 패턴이 Th2 사이토카인 우위였던 것이, IFN-γ로 대표되는 Th1 사이토카인 우위로 변화하는 것이 알려져 있다. 즉 면역요법에 의한 증상 개선 작용 메커니즘의 하나로서, Th2 사이토카인 생산의 억제, 및 Th1 사이토카인의 항진에 의한 작용 메커니즘이 생각되고 있다(비특허문헌 1, 2, 3).
삼나무 화분의 주요 알레르겐(allergen)으로서 Cryj1 및 Cryj2가 알려져 있다(비특허문헌 4, 5, 6). Cryj1 및 Cryj2 각각에 대해서는, 삼나무 화분증 환자의 90% 이상이 특이적인 IgE 항체를 갖고 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 7).
일반적으로 알레르겐은 마크로파지(macrophage)나 수상세포(dendritic cell) 등의 항원 제시 세포에 포착된 후에 소화되고, 소화를 받은 단편이 항원 제시 세포 표층의 MHC class II 단백질에 결합하여 항원 제시된다. 항원 제시되는 상기 단편은, MHC claaa II 단백질에 대한 친화성 등에 의해, 알레르겐에 있어서의 일부 특정영역에 제한된다. 이 특정영역 중, T세포가 특이적으로 인식하는 영역은 통상 「T세포 에피토프」라고 호칭되고, B세포가 특이적으로 인식하는 영역은 통상 「B세포 에피토프」라고 호칭된다. 현재, 이와 같은 T세포 에피토프로 되는 펩티드를 투여하는 면역요법이 주목되고 있고, 이하와 같은 이점을 들 수 있다.
(1) 펩티드가 B세포 에피토프를 결여하고 있으므로, 알레르겐에 특이적인 IgE 항체와 반응하지 않고, 종래의 조제(粗製) 또는 정제된 알레르겐에서 빈발했던 아나필 락시스 등의 부작용이 발생하기 어렵고,
(2) 소량 투여부터 치료를 시작하여, 펩티드가 유효 투여량에 도달하기까지의 기간을, 종래의 감감작요법에 비교하여 대폭으로 단축할 수 있다(비특허문헌 8).
당해 펩티드 면역요법의 상세한 작용 메커니즘에 대해서는 현상(現狀) 불명한 점이 많이 있으나,
(1) T세포 표면에 표출되는 T세포 수용체의 항원 결합 부위에 직접 펩티드가 결합하고, 통상의 T세포-항원 제시 세포를 매개로 하는 시그널에 의한 항원 및 부자극의 양 자극을 회피함으로써, T세포의 불활성화(아네르기-anergy) 또는 면역관용(immunological tolerance)을 유도하는 가능성,
(2) 대량의 펩티드를 투여함으로써 IgG 항체의 생산 항진 또는 T세포의 불활성화를 유도하는 가능성,
이 생각되고 있다(비특허문헌 3).
삼나무 화분증 환자의 T세포 인식 에피토프 펩티드로서는 현재까지 많은 것이 보고되어 있다. 동물시험에서는, 마우스의 삼나무 화분의 주요 알레르겐인 Cryj1 및 Cryj2의 각 T세포 인식 에피토프 펩티드를 사용하여, 주요 알레르겐 면역 전에 각 T세포 인식 에피토프 펩티드를 투여함으로써, T세포의 불활성화(아네르기) 또는 면역관용(immunological tolerance)을 유도할 수 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 9, 10, 11, 12).
이상과 같이, T세포 인식 에피토프 펩티드는 삼나무 화분증 등의 면역요법제로서 유용한 것은 주지의 사실이나, 일반적으로 생체 내에 펩티드를 투여함으로써, 이하와 같은 과제가 생각된다.
(1) 효소에 의한 분해를 받기 때문에, 유효한 농도를 일정하게 유지할 수 없다(안정성의 문제).
(2) 소화관막 투과성이 극히 낮으므로, 경구 투여에 문제가 있다.
(3) 점막 면역을 매개로 하는 반응을 유도할 목적으로 점막하에 투여해도, 조직 저류성(貯留性)에 문제가 있다.
상기의 과제는 드러그 딜리버리 시스템으로서 범용되는 나노입자를 응용함으로써 극복이 가능할 뿐 아니라, T세포 인식 에피토프 펩티드 단독으로의 효과에 비교하여, 나노입자에 고정화 또는 내포화하는 것에 의한 다른 상승(相乘)작용도 기대할 수 있다.
나노입자는 공중합체의 조성이나 관능기를 변화시킴으로써, 자기 조직화에 의해 다양한 구조체를 형성하는 것을 응용하여 제작된다. 그 형태를 이용하여 도료나 코팅재료, 집적재료, 또는 드러그 딜리버리 담체 등의 의용(醫用)재료 등으로 폭넓은 응용이 행해지고 있으나, 그 중에서도 의용재료로서의 응용은 특히 주목을 모으고 있다. 나노입자를 의용재료로서 사용하기 위해서는, 당해 나노입자 자체 및 그의 분해산물 또는 그의 대사물이 안전한 것 또는 무독 또는 저독성인 것이 바람직하다. 즉 생분해성·생체적합성인 나노입자(이하, 생분해성 나노입자)가 바람직하게 여겨지고 있다.
생분해성 나노입자로서는 이미, poly-D, L-lactide-co-glycolide(PLGA)(특허문헌 1)나 폴리시아노아크릴레이트 폴리머로 형성된 나노입자(특허문헌 2), 또는 낫토균으로부터 대량으로 생산 가능한 생분해성, 생체적합성을 갖는 폴리(γ-글루타민산)(γ-PGA)를 사용한 나노입자(특허문헌 3), 폴리(γ-글루타민산)(γ-PGA)와 페닐알라닌에틸에스테르(L-PAE)의 그래프트 공중합체로 되는 나노입자(비특허문헌 13) 등, 많은 보고예가 있다.
항원을 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자를 면역요법제로서 응용하는 것은, PLGA를 사용한 동물실험(마우스)에서의 보고가 이루어져 있다(비특허문헌 14, 15, 16). 그러나, 사용한 항원이 모두 주요 알레르겐(Bet v1/자작나무 항원, Ole e1/올리브 항원, phospholipase A2-coding vector/벌독)으로, 본 발명과 같이 T세포 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한 면역요법제로서의 보고예는 현재로서는 없다. 한편, T세포 에피토프 펩티드를 poly(lactide-co-glycolide)(PLG)에 내포화시켜 면역 원성을 항진시킨, 바이러스요법에 관해서도 보고되어 있다(비특허문헌 17). 그러나 상기 바이러스요법은 항체 생산을 증강하거나 하여 바이러스에 대한 면역을 증강시키는 것으로, 본 발명과 같은 Th1과 Th2 균형을 제어하는 전술의 면역요법과는 전혀 반대의 작용을 나타낸다.
이상과 같이, T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자의, 천식이나 화분증 등으로 대표되는 알레르기 질환에 대한 면역요법제로서의 용도는 보고가 없다.
[비특허문헌 1] Clin. Exp. Allergy 25: 828-838 (1995)
[비특허문헌 2] Clin. Exp. Allergy 27: 1007-1015 (1997)
[비특허문헌 3] Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 126: 63-70 (2000)
[비특허문헌 4] J. Allergy Clin. Immunol. 71: 77-86 (1983)
[비특허문헌 5] FEBS Letter 239: 329-332 (1988)
[비특허문헌 6] Allergy. 45: 309-312 (1990)
[비특허문헌 7] Clin. Exp. Allergy 25: 848-852 (1995)
[비특허문헌 8] Int. Arch. Allergy Immunol. 122: 229-237 (2000)
[비특허문헌 9] Immunology 107: 517-520 (2002)
[비특허문헌 10] J. Allergy Clin. Immunol. 102: 961-967 (1998)
[비특허문헌 11] Eur. J. Immunol. 32: 1631-1639 (2002)
[비특허문헌 12] Eur. J. Pharmacol. 510: 143-148 (2005)
[비특허문헌 13] Macromolecular Bioscience 5: 598-602 (2005)
[비특허문헌 14] Clin. Exp. Allergy 34: 315-321 (2004)
[비특허문헌 15] J. Control. Release 92: 395-398 (2003)
[비특허문헌 16] J. Allergy Clin. Immunol. 114: 943-950 (2004)
[비특허문헌 17] J. Immunol. Methods 195: 135-138 (1996)
[특허문헌 1] 일본국 특허공표 평9-504027호
[특허문헌 2] 일본국 특허공개 평8-530157호
[특허문헌 3] 일본국 특허공개 제2003-342367호
본 발명의 목적은 T세포 인식 에피토프 펩티드, 특히 화분증 환자의 T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자, 및/또는 이것을 사용한 면역요법제를 제공하는 것에 있다.
발명의 개시
본 발명은 이하의 발명에 관한 것이다.
(1) T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자.
(2) 폴리펩티드, 다당, 또는 폴리유기산 중 어느 하나를 주재료로 하는 나노입자를 사용하는, (1) 기재의 나노입자.
(3) 폴리펩티드가 폴리(γ-글루타민산)인, (2) 기재의 나노입자.
(4) 폴리펩티드가 폴리(γ-글루타민산)과 페닐알라닌에틸에스테르의 그래프트 공중합체인, (2)에 기재의 나노입자.
(5) T세포 인식 에피토프 펩티드가 나노입자에 내포된, (1) 내지 (4) 중 어느 하나 기재의 나노입자.
(6) T세포 인식 에피토프 펩티드가 나노입자 표면에 존재하는, (1) 내지 (4) 중 어느 하나 기재의 나노입자.
(7) T세포 인식 에피토프 펩티드가 삼나무 화분 T세포 인식 에피토프 펩티드인 (1) 내지 (6) 중 어느 하나 기재의 나노입자.
(8) (1) 내지 (7) 중 어느 하나 기재의 나노입자를 포함하는 면역요법제.
(9) 삼나무 화분증 치료 및/또는 예방을 위한 (8) 기재의 면역요법제.
(10) T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자의 면역요법제 제조를 위한 사용.
(11) 삼나무 화분증 치료 및/또는 예방을 위한, (10) 기재의 사용.
(12) T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자의 유효량을 포유동물에 투여하는 면역요법.
(13) 삼나무 화분증 치료 및/또는 예방을 위한, (12) 기재의 면역요법.
본 발명자들은 상기 사정을 감안하여 예의 연구를 거듭한 결과, T세포 에피토프 펩티드, 특히 화분증 환자의 T세포 인식 에피토프 펩티드를 변성 또는 분해하지 않고 생분해성 나노입자에 고정화 또는 내포화할 수 있어, 당해 생분해성 나노입자를 안전하고 또한 효율적인 펩티드 면역요법제로서 사용할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 명세서 중 「T세포 인식 에피토프 펩티드」란, T세포에 의해 인식되는, 항원으로 되는 펩티드를 말한다.
본 명세서 중 「고정화」란, 생분해성 나노입자의 표면에, 공유결합, 이온결합, 분자간력에 의한 결합법, 흡착에 의한 방법 또는 포괄법에 의해, 직접 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 링커를 매개로 하여 결합하는 것을 말한다.
본 명세서 중 「내포화」란, 생분해성 나노입자의 내부에 공유결합, 이온결합, 분자간력에 의한 결합법, 흡착에 의한 방법 또는 포괄법에 의해, 직접 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 링커를 매개로 하여 결합하는 것을 말한다.
본 발명은 T세포 에피토프 펩티드, 특히 화분증 환자의 T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자에 관한 것이다. 본 발명에 사용하는 생분해성 나노입자의 재료는 각종의 것을 사용할 수 있고, 그들은 당해 분야에 있어서 잘 알려져 있어, 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 생체에 투여하는 점으로부터 당해 나노입자 자체 및 그의 분해산물 또는 대사물이 안전한 것, 또는 무독 또는 저독성인 것이 바람직하다. 당해 나노입자의 바람직한 재료로서는 폴리펩티드, 다당, 폴리유기산, 또는 이들의 혼합물 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 폴리펩티드이다.
폴리펩티드를 주재료로 하는 생분해성 나노입자(이하, 「생분해성 폴리펩티드 나노입자」라고 칭한다.)는 천연 아미노산, 수식 아미노산(예를 들면, 에스테르화 아미노산 등) 또는 합성 아미노산, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것이어도 되나, 천연 아미노산으로 되는 것이 안전성이나 독성의 면에서 보다 바람직하다. 이와 같은 천연 아미노산으로 되는 바람직한 생분해성 폴리펩티드 나노입자의 예로서는, 폴리(γ-글루타민산) 나노입자, 폴리(ε-리신) 나노입자, 폴리(α-L-리신) 나노입자, 폴리(α-아스파라긴산) 나노입자 등을 들 수 있다. 또한, 생분해성 폴리펩티드 나노입자는 단일종의 아미노산으로 되어 있어도 되고, 2종 이상의 아미노산으로 되어 있어도 된다. 생분해성 폴리펩티드 나노입자에 있어서 전 구성 아미노산 간의 결합이 동일한 종류의 것이어도 되고, 상이한 종류의 것이어도 된다. 예를 들면, 전 구성 아미노산이 펩티드 결합에 의해 결합된 것이어도 되고, 부분적 또는 전체적으로 펩티드 결합 이외의 결합에 의해 아미노산이 결합된 것이어도 된다. 아미노산의 결합은 링커를 매개로 하는 것이어도 된다. 예를 들면, 친수성 폴리아미노산의 측쇄에 소수성 아미노산을 도입하여, 목적으로 하는 친수성-소수성의 균형으로 하는 것도 가능하다. 따라서, 예를 들면 폴리펩티드가 폴리(γ-글루타민산)과 페닐알라닌에틸에스테르의 그래프트 공중합체여도 된다. 또한, 본 발명의 생분해성 폴리펩티드 나노입자는 폴리펩티드를 주성분(바람직하게는, T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화하지 않은 상태에서 50 중량% 이상)으로 하는 것이고, 바람직하게는 폴리펩티드를 골격으로 하는 것이다. 본 발명의 생분해성 폴리펩티드 나노입자는 그 골격이나 그 외의 부분에 폴리펩티드나 아미노산 이외의 성분을 포함하고 있어도 되고, 포함하고 있지 않아도 된다.
다당을 주재료로 하는 생분해성 나노입자(이하, 「생분해성 다당 나노입자」를 칭한다.)는 천연 다당, 수식 다당 또는 합성 다당, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것이어도 되나, 천연 다당으로 되는 것이 안전성이나 독성의 면에서 보다 바람직하다. 이와 같은 천연 다당으로 되는 바람직한 생분해성 다당 나노입자의 예로서는, 풀루란 나노입자, 키토산 나노입자, 알긴산 나노입자, 펙틴 나노입자, 커드란 나노입자, 덱스트란 나노입자 등을 들 수 있다. 또한 생분해성 다당 나노입자는 단일종의 당으로 되어 있어도 되고, 2종 이상의 당으로 되어 있어도 된다. 또한, 생분해성 다당 나노입자는 전 구성 당이 동일한 종류의 결합에 의해 결합된 것이어도 되고, 부분적 또는 전체적으로 상이한 종류의 결합에 의해 결합된 것이어도 된다. 예를 들면 α-1, 6 결합과 α-1, 4 결합이 혼재하고 있어도 된다. 또한 당의 결합은 링커를 매개로 하는 것이어도 된다. 또한 본 발명의 생분해성 다당 나노입자는 다당을 주성분(바람직하게는, T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화하지 않은 상태에서 50 중량% 이상)으로 하는 것이고, 바람직하게는 다당을 골격으로 하는 것이다. 본 발명의 생분해성 다당 나노입자는 그 골격이나 그 외의 부분에 다당 이외의 성분을 포함하고 있어도 되고, 포함하고 있지 않아도 된다.
폴리유기산(폴리펩티드에 대해서는 전술과 같다)을 주재료로 하는 생분해성 나노입자(이하, 「생분해성 폴리유기산 나노입자」라고 칭한다.)는 천연 폴리유기산, 수식 폴리유기산 또는 합성 폴리유기산, 또는 이들의 혼합물로 되는 것이어도 되나, 천연 폴리유기산으로 되는 것이 안전성이나 독성의 면에서 보다 바람직하다. 이와 같은 천연 폴리유기산으로 되는 바람직한 생분해성 폴리유기산 나노입자의 예로서는, 폴리젖산 나노입자 등을 들 수 있다. 또한 생분해성 폴리유기산 나노입자는 단일종의 유기산으로 되어 있어도 되고, 2종 이상의 유기산으로 되어 있어도 된다. 또한, 생분해성 폴리유기산 나노입자는 전 구성 폴리유기산이 동일한 종류의 결합에 의해 결합된 것이어도 되고, 부분적 또는 전체적으로 상이한 종류의 결합에 의해 결합된 것이어도 된다. 또한, 폴리유기산의 결합은 링커를 매개로 하는 것이어도 된다. 또한 본 발명의 생분해성 폴리유기산 나노입자는 폴리유기산을 주성분(바람직하게는, T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화하지 않은 상태에서 50 중량% 이상)으로 하는 것이고, 바람직하게는 폴리유기산을 골격으로 하는 것이다. 본 발명의 생분해성 폴리유기산 나노입자는 그 골격이나 그 외의 부분에 폴리유기산이나 아미노산 이외의 부분을 포함하고 있어도 되고, 포함하고 있지 않아도 된다.
본 발명에 사용하는 생분해성 나노입자의 형상은 특별히 한정되지 않으나, 일반적으로는 구상(球狀)으로, 그 사이즈는 통상 80 ㎚~100 ㎛이고, 바람직하게는 100 ㎚~50 ㎛이다. 이와 같은 사이즈로 함으로써, 예를 들면 단위 중량당 입자 표면적 증가에 수반하는 T세포 인식 에피토프 펩티드 고정화량의 증가, 조직 저류성의 향상, 세포로 들어가는 것의 제어 등의 효과가 발생한다. 구상 이외의 형상의 나노입자에 대해서도, 바람직한 사이즈는 구상의 나노입자에 준한다.
본 발명에 사용하는 생분해성 나노입자는 공지의 방법을 적용함으로써 제조할 수 있다. 그 제조방법으로서는, 예를 들면 액중(液中)건조법, 분무건조법, 구형정석법, 용매치환법(침전·투석법), 직접 초음파분산법 등을 들 수 있다. 예를 들면 폴리(γ-글루타민산)으로 되는 생분해성 나노입자, 폴리(ε-리신)으로 되는 생분해성 나노입자는 용매치환법에 의해 제조할 수 있다. 생분해성 다당 나노입자는, 예를 들면 직접분산법에 의해 제조할 수 있다. 생분해성 폴리유기산 나노입자는, 예를 들면 에멀젼-액중건조법에 의해 제조할 수 있다. 이와 같은 방법은 적절히 선택 또는 조합하여, 생분해성 나노입자의 재료, 구성성분, 분자량, 사이즈, 전하 그 외의 파라미터를 목적에 따른 것으로 할 수 있다. 또한, 목적에 따라 나노입자를 결합하는 매트릭스 사이를 가교하고 있어도 된다.
생분해성 나노입자에 고정화 또는 내포화하는 T세포 인식 에피토프 펩티드는 각종의 것을 사용할 수 있다. T세포 인식 에피토프 펩티드로서는 삼나무 화분 T세포 인식 에피토프 펩티드가 바람직하고, 예를 들면 Cryj1에 대한 BALB/c 마우스의 T세포 인식 에피토프 펩티드로서 P1: 277-290(KQVTIRIGCKTSSS)(Yoshitomi T et al: Immunology 107: 517-520, 2002), Cryj2에 대한 BALB/c 마우스의 T세포 인식 에피토프 펩티드로서 P2: 70-83(HFTFKVDGIIAAYQ), P2: 246-259(RAEVSYVHVNGAKF)(Yoshitomi T et al: Immunology 107: 517-520, 2002, Hirahara S et al: J. Allergy Clin. Immunol. 102: 961-967, 1998, Murasugi T. et al: Eur. J. Pharmacol. 510: 143-148, 2005), Cryj1에 대한 인간 T세포 인식 에피토프 펩티드로서 보고되어 있는 p16-30, p81-95, p91-105, p106-120, p111-125, p151-165, p156-170, p191-205, p211-225, p231-245, p301-315, p316-330, p331-345 등, Cryj2에 대한 인간 T세포 인식 에피토프 펩티드로서 보고되어 있는 p66-80, p76-90, p81-95, p96-107, p141-155, p146-160, p181-195, p186-200, p236-250, p336-350, p346-360, p351-365(Sone T et al: J. Immunol. 161: 448-457, 1998, Hirahara K et al: J. Allergy Clin. Immunol. 108: 94-100, 2001) 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 인간 또는 마우스 삼나무 화분 T세포 인식 에피토프 펩티드이다. 이들 펩티드를 단독 또는 조합함으로써, 본 발명의 T세포 인식 에피토프 펩티드로서 이용 가능하다.
투여 대상의 상태, 예를 들면 동물종, 연령, 체중, 건강상태, 이미 걸려 있는 질병 또는 소인(素因)과 같은 예방 및/또는 치료 대상 질병의 종류 등에 따라서, T세포 인식 에피토프 펩티드를 적절하게 선택하여 생분해성 나노입자에 고정화 또는 내포화할 수 있다. 생분해성 나노입자에 고정화 또는 내포화하는 T세포 인식 에피토프 펩티드는 1종류여도 되고, 2종 이상이어도 된다.
생분해성 나노입자로의 T세포 인식 에피토프 펩티드의 고정화 또는 내포화는 각종 공지 방법으로 행할 수 있다. T세포 인식 에피토프 펩티드는 생분해성 나노입자에 직접 고정화 또는 내포화해도 되고, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 링커를 매개로 하여 고정화 또는 내포화해도 된다. 펩티드의 고정화 또는 내포화의 방법으로서, 예를 들면 공유결합, 이온결합, 분자간력에 의한 결합법, 흡착에 의한 방법 또는 포괄법 등이 알려져 있다. 예를 들면 생분해성 나노입자 상의 관능기와 T세포 인식 에피토프 펩티드가 갖는 관능기를 공유결합하여 고정화 또는 내포화해도 되고, 생분해성 나노입자의 전하와 T세포 인식 에피토프 펩티드의 전하가 상반하는 경우에는 이온결합에 의해 고정화 또는 내포화해도 된다. 포괄법으로서는, 예를 들면 폴리(γ-글루타민산) 생분해성 나노입자에 펩티드를 고정화하는 경우에는, 폴리(γ-글루타민산)에 소수성 아미노산을 공유결합에 의해 도입하고, 이를 유기용매에 용해하며, 다음으로 펩티드 수용액에 적하함으로써 고정화할 수 있다. 또한, 결합법, 흡착법 및/또는 포괄법을 적절하게 조합하여 펩티드를 생분해성 나노입자에 고정화 또는 내포화해도 된다. 이와 같은 고정화 또는 내포화의 양식은 사용목적(예를 들면 대상, 질병의 종류 등)에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
본 발명의 T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자에 있어서는, 상기 펩티드의 입체구조에는 영향을 미치지 않고, 예를 들면 동결건조 후에도 그의 고정화 또는 내포화 펩티드의 양이나 성질에 변화가 적으며, 장기간 보존 가능하다는 이점을 갖는다.
본 발명은 또 하나의 태양에 있어서, 전술의 펩티드를 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자를 포함하는 면역요법제에 관한 것이다. 전술과 같이 하여 얻어지는 T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자는 면역요법제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 면역요법제에 있어서, T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화하는 담체 및 애쥬번트(adjuvant)로서 사용되는 것은 생분해성 나노입자이고, 최종적으로는 상기 나노입자는 생체 내의 분해효소에 의해 분해된다. 본 발명의 면역요법제는 T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자 및 부형제 또는 담체, 목적에 따라 현탁화제, 등장화제, 방부제 등 그 외의 성분도 포함하는 것이다. 부형제 또는 담체는, 예를 들면 물, 에탄올 또는 글리세린과 같은 수성 매체, 또는 지방산, 지방산 에스테르 등의 유지류와 같은 비수성 매체 등을 들 수 있다. 본 발명의 면역요법제의 제형은 어느 것이어도 되고, 대상의 상태, 질병의 종류 등의 인자에 따라서 선택할 수 있다. 예를 들면, 적당한 수성 담체 중의 현탁액이어도 되고, 분말, 캡슐제, 정제 등이어도 된다. 동결건조한 면역요법제를, 투여 전에 적당한 부형제 또는 담체에 현탁하여 사용하는 것이어도 된다. 본 발명의 면역요법제의 투여방법 및 투여경로도 특별히 한정은 없고, 제형, 대상의 상태, 질병의 종류 등의 인자에 따라서 선택할 수 있다. 예를 들면 본 발명의 면역요법제를 주사, 수액 등, 또는 경구 투여에 의해 대상에 투여해도 된다.
또한 생분해성 나노입자의 재료나 구성성분, 분자량, 사이즈, 기타 파라미터를 적절히 변경하여, T세포 인식 에피토프 펩티드의 방출속도 및 방출시간을 조절하는 것도 가능하다. 이를 위한 방법도 당해 분야에 있어서 공지이다. 예를 들면 폴리(γ-글루타민산)과 소수성 아미노산의 그래프트 공중합체로 되는 나노입자의 경우, 소수성 아미노산의 종류, 함량을 제어함으로써, 서방성(徐放性)의 면역요법제를 얻는 것도 가능하다. 또한, 예를 들면 특정 장기 또는 부위에 국재(局在)하는 효소에 의해 분해될 수 있는 결합을, 생분해성 나노입자와 펩티드의 결합, 또는 생분해성 나노입자 중에 도입하여, 특정 장기 또는 부위에서 펩티드가 방출되도록 해도 된다.
본 발명의 면역요법제를 각종 질병의 예방 및/또는 치료를 목적으로서, 각종 대상에 투여할 수 있다. 본 발명의 면역요법제를 적용할 수 있는 대상은 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 포유동물이고, 보다 바람직하게는 인간이다. 본 발명의 면역요법제에 의해 예방 및/또는 치료되는 질병은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 화분증, 통년성 알레르기성 비염 질환, 계절성 알레르기성 비염 질환이고, 바람직하게는 화분증이다.
도 1은 생분해성 나노입자의 면역 유도효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 피하 투여에 의한 Th1 사이토카인 면역 유도효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 점안 투여에 의한 면역 조절효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 점비 투여에 의한 치료효과를 나타내는 그래프이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하에 시험예 및 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하나, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
(1) PEG(폴리에틸렌글리콜)화 마우스 삼나무 화분 T세포 인식 에피토프 펩티드의 제작
Cryj1에 대한 BALB/c 마우스의 T세포 인식 에피토프 펩티드로서 P1: 277-290; KQVTIRIGCKTSSS(이하, P1) 및 Cryj2에 대한 BALB/c 마우스의 T세포 인식 에피토프 펩티드로서 P2: 246-259; RAEVSYVHVNGAKF(이하, P2)를 선택하였다. 상기 펩티드의 PEG(폴리에틸렌글리콜)화는 (주)도오레 리서치센터에 합성 의뢰하여, Fmoc 고상합성법에 의해, PEG(폴리에틸렌글리콜)화 마우스 삼나무 화분 T세포 인식 에피토프 펩티드를 합성하였다.
(2) 마우스 삼나무 화분 T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화한 생분해성 나노입자의 합성
폴리(γ-글루타민산)(γ-PGA, 분자량 300,000) 607 ㎎(4.7 unit m㏖)을 54 mM의 탄산수소나트륨수용액(pH 8.5) 100 ㎖에 용해하였다. 다음으로, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(WSC) 901 ㎎(4.7 m㏖) 및 L-페닐알라닌에틸에스테르(L-PAE) 1080 ㎎(4.7 m㏖)을 첨가하고, 교반하면서 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 반응 후, 생성된 용액을 투석막(분자량 분획 50,000)을 사용하여 물로 3일간 투석을 행하고, 다음으로 동결건조하였다. 얻어진 동결건조물을 에탄올 100 ㎖에 첨가하고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 용액을 원심분리(1,500×g, 20분간)하고, 침전물을 감압 건조하여, 폴리(γ-글루타민산)과 페닐알라닌에틸에스테르의 그래프트 공중합체(γ-PGA-g-L-PAE)를 얻었다. γ-PGA-g-L-PAE를 10 ㎎/㎖의 농도로 DMSO에 용해하고, 이 용액을 등량의 생리식염수 용액에 적하하여, 나노입자를 조제하였다. 그 후, 투석, 동결건조에 의해 나노입자를 얻었다. 20 ㎎/㎖의 γ-PGA 나노입자 분산액에 등량의 1 ㎎/㎖의 WSC 수용액(20 mM 인산완충액 pH 5.8)을 첨가하 고, 실온에서 20분간 반응을 행하였다. 소정 시간 반응 후, 14,000×g으로 15분간 원심하고, WSC 용액을 제거 후, PBS에 용해시킨 1 ㎎/㎖의 펩티드 용액을 나노입자 농도가 5 ㎎/㎖가 되도록 첨가하여, 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 반응 후, 원심에 의해 펩티드 용액을 제거하고, 물로 재분산을 행하였다. 이 조작을 반복하여 미반응의 펩티드를 제거하고, 펩티드 고정화 나노입자 농도가 10 ㎎/㎖가 되도록 조제하였다. 나노입자의 펩티드 담지량(擔持量)은 로우리법(Lowry method)에 의해 정량하였다.
실시예 2
마우스 삼나무 화분 T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화한 생분해성 나노입자의 면역유도능
BALB/c 마우스(수컷, 6주령)의 양 발바닥 피하에, Cryj1 또는 Cryj2 T세포 인식 에피토프 펩티드(P1, P2)를 고정화한 생분해성 나노입자(펩티드 20 ㎍ 상당량), 또는 펩티드를 고정화하지 않은 나노입자의 현탁액 100 ㎕(편족 50 ㎕씩)를 주사하였다. 11일째에 국소 림프절을 적출하여 림프절 세포를 회수하고, RPMI1640 배지+10% 소 태아 혈청(FCS)에 현탁하였다. 또한, 각 군 모두 2마리의 마우스로부터의 세포를 합일하여 사용하였다. 세포를 96웰 배양 플레이트에 웰당 5×105개씩 파종하고, 추가로 항원자극으로서 종농도 20 ㎍/㎖의 P1 또는 P2, 또는 10 ㎍/㎖의 삼나무 화분 조(粗)정제 항원(Sugi Basic Protein: SBP)(아사히 푸드 앤드 헬스케어사)을 첨가하였다. 배양 개시 48시간 후에, 배양액의 반량을 [3H]트리튬-티미 딘(0.5 μ Ci)을 포함하는 새로운 배양액과 교환하였다. 그 16시간 후에 세포 하비스터(cell harvester)에 의해 세포를 유리필터 상에 회수하고, 액체 신틸레이션 카운터에 의해 [3H]트리튬 흡수량(티미딘 흡수량)을 측정하여 세포증식을 평가하였다. 단, 전술의 SBP는 Cryj1, Cryj2 양쪽을 포함하는 항원(알레르겐)이다.
그 결과를 도 1에 나타낸다. 최초에 주사한 T세포 인식 에피토프 펩티드(P1 또는 P2) 각각에 대한 특이적인 세포증식응답이 관찰되었다. 또한 양 에피토프 펩티드를 모두 포함하는 SBP에 대한 응답도 인정되었다. 또한, 펩티드를 고정화하지 않은 나노입자에 의한 응답은 인정되지 않았다.
이들 결과로부터, T세포 인식 에피토프 펩티드를 나노입자에 고정화하여도, 항원에 대해서 특이적인 면역응답을 유도할 수 있는 것이 명확해지고, 나노입자에 고정화된 T세포 인식 에피토프 펩티드가 변성 내지는 분해되지 않은 것이 확인되었다.
실시예 3
마우스 삼나무 화분 T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화한 생분해성 나노입자의 면역조절작용
(1) 피하 투여에 의한 Th1 사이토카인 면역유도
BALB/c 마우스(수컷, 10주령)의 양 발바닥 피하에, Cryj1 T세포 인식 에피토프 펩티드(P1)를 고정화한 생분해성 나노입자(펩티드 50 ㎍ 상당량)의 현탁액 100 ㎕(편족 50 ㎕씩)를 주사하였다. 16일째에 삼나무 화분 조정제 항원 SBP의 5 ㎍을 프로인트 불완전 애쥬번트에 현탁한 것을 오른쪽 발바닥에 주사하여 면역응답을 야기하였다. 그 5일 후에 국소 림프절 세포를 회수하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 96웰 배양 플레이트에 파종하여, 종농도 10 ㎍/㎖의 삼나무 화분 조정제 항원 SBP로 자극하였다. 세포증식은 실시예 2에 기재한 방법에 의해 측정하였다. Th1 사이토카인 생산 측정에 관해서는, 배양 개시 64시간 후에 상청을 회수하고, Bio-Plex 사이토카인 어세이 시스템(Bio Rad사제)을 사용한 샌드위치 ELISA에 의해, 인터페론-γ를 정량하였다.
그 결과를 도 2에 나타낸다. 항원자극에 대한 세포증식응답(티미딘 흡수량)에 관해서는, P1 고정화 나노입자를 피하 투여한 마우스 유래의 세포에서는, 피하 투여하지 않은 마우스 유래의 세포에 비해서, 약간 항진될 뿐 커다란 차는 보이지 않았다.
한편, 인터페론-γ의 생산량은 P1 고정화 나노입자 피하 투여 마우스 유래의 세포에서 현저한 증강이 보여졌다.
이들 결과로부터, T세포 인식 에피토프 펩티드 고정화 나노입자가 인터페론-γ 생산량을 현저하게 항진하는 것이 명확해졌다.
(2) 점막 투여에 의한 면역 조절
면역요법에 있어서는 점막을 매개로 한 항원 투여가 유망하다고 생각되고 있어, 결막(結膜)이 투여경로의 하나로서 생각되고 있다(J. Immunol, 2000, 164: 4543-4550). 이에, T세포 인식 에피토프 펩티드 고정화 생분해성 나노입자를 점안 투여함으로써, 그 후의 항원감작에 대한 응답에 주는 영향을 검토하였다.
BALB/c 마우스(수컷, 7주령)의 양안(兩眼) 결막 상에, Cryj2 T세포 인식 에피토프 펩티드(P2)의 생리식염수 용액(펩티드 5 ㎍) 또는 P2 고정화 나노입자 현탁액(펩티드 5 ㎍ 상당량)을 각각 10 ㎕, 계 8회(1~4 및 6~9일째) 적하 투여하였다. 16일째에 항원 감작으로서, 삼나무 화분 조정제 항원 SBP의 5 ㎍을 프로인트 불완전 애쥬번트에 현탁한 것을 오른쪽 발바닥에 주사하여 면역응답을 야기하였다. 그 5일 후에 국소 림프절 세포를 회수하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 96웰 배양 플레이트에 파종하여, 종농도 10 ㎍/㎖의 삼나무 화분 조정제 항원 SBP로 자극하였다. 세포증식은 실시예 2에 기재한 방법에 의해 측정하였다. 사이토카인 생산 측정에 관해서는, 배양 개시 64시간 후에 상청을 회수하고, Bio-Plex 사이토카인 어세이 시스템(Bio Rad사제)을 사용한 샌드위치 ELISA에 의해 인터류킨-5, 인터페론-γ를 정량하였다.
그 결과를 도 3에 나타낸다. 항원자극에 대한 세포증식응답(티미딘 흡수량)에 관해서는, 점안 투여 처치를 행하지 않은 마우스 유래 세포에 비해서, P2 단독 점안 투여 마우스 유래 세포에서 저하한 것에 대해, P2 고정화 나노입자 점안 투여 마우스 유래 세포에서는 거의 차는 보이지 않았다.
또한, Th2 사이토카인인 인터류킨-5 생산량은 점안 투여 처치를 행하지 않은 마우스 유래 세포에 비해서, P2 단독 점안 투여 마우스 유래 세포 및 P2 고정화 나노입자 점안 투여 마우스 유래 세포에서 거의 동일 정도 저하되어 있었다.
한편, Th1 사이토카인인 인터페론-γ 생산량은 점안 투여 처치를 행하지 않은 마우스 유래 세포에 비해서, P2 단독 점안 투여 마우스 유래 세포에서는 저하된 것에 대해서, P2 고정화 나노입자 점안 투여 마우스 유래 세포에서는 반대로 증가하였다.
이들 결과로부터, T세포 인식 에피토프 펩티드 단독 투여로는 Th2 사이토카인, Th1 사이토카인 모두를 저하시키는 것에 대해, T세포 인식 에피토프 펩티드 고정화 나노입자 투여로는 Th2 사이토카인 생산을 저하시키는 한편, Th1 사이토카인 생산은 항진시키는 것이 명확해졌다. 즉, T세포 인식 에피토프 펩티드 고정화 나노입자가 Th1과 Th2의 균형을 제어하고, 면역요법제로서 유용한 것을 시사하고 있다.
(3) 점비 투여에 의한 치료효과
삼나무 화분에 대해서 감작이 성립된 마우스에, 항원을 기관 내 투여한 경우의 염증세포 침윤에 대한 T세포 인식 에피토프 고정화 나노입자의 작용을 검토하였다.
BALB/c 마우스(수컷, 9주령, 1군 6마리)의 복강 내에, 삼나무 화분 조정제 항원 SBP의 5 ㎍을 알럼 2 ㎎에 현탁하고, 1주 간격으로 2회 주사하여 면역하였다. 최종 면역 2주 후에, 마취하에 Cryj1 T세포 인식 에피토프 펩티드(P1) 고정화 나노입자(P1-NP) 현탁액(펩티드 40 ㎍ 및 4 ㎍ 상당량)을 1일 간격으로 3회, 각각 20 ㎕ 양쪽 코에 점비 투여하였다. 무처치군(Sham군)에는, 매체인 인산완충액(PBS)을 투여하였다. 최종 점비 5주 후에, 마취하에 삼나무 화분 정제 항원 Cryj1 2 ㎍을 4회 기관 내 투여하였다(1일 1회, 3일간 연속한 뒤, 추가로 3일 후에 1회). 음성 대조군에는 항원 대신에 PBS를 투여하였다(Sham/PBS군). 최종 항원 기관 내 투여 2일 후에 마우스를 마취사시키고, 기관을 노출·절개 후, 기관지 캐뉼러를 장착하여, 1 ㎖의 0.1% 소 혈청 알부민(BSA) 함유 PBS로 3회 폐포(肺胞) 세정을 실시하고, 폐포 세정액(BALF)을 얻었다. 얻어진 BALF는 원심 후, 재차 0.1% BSA 함유 PBS에 현탁하고, 총 백혈구수를 세포수 측정장치에 의해 산출 후, 세포도말 표본을 제작하였다. 도말 표본은 라이트-김자 염색(Wright-Giemsa's stain)을 행하고, 일반적인 세포 분류에 따라 호산구, 호중구, 림프구·단구·마크로파지를 포함하는 단핵구로 나누어, 1 표본당 300개 이상의 세포를 카운트함으로써, 각 세포의 비율을 구하였다. 각 세포의 비율로부터 회수된 BALF 중의 침윤세포수(×104 cells/BALF)를 산출하였다.
그 결과를 도 4에 나타낸다. SBP를 면역한 마우스에 Cryj1을 기관 내 투여한 Sham/Cryj1군은, Sham/PBS군과 비교하여 BALF 중으로의 총 백혈구세포의 증가를 나타내고, 특히 침윤세포의 약 60%를 차지하는 호산구의 집적이 인정되었다. 한편, P1 고정화 나노입자 현탁액을 사전에 점비 투여한 군(P1-NP군)에서는, P1 고정화 나노입자(P1-NP) 40 ㎍, 4 ㎍ 투여군 모두 BALF 중으로의 총 백혈구세포수, 특히 호산구수 증가를 용량 의존적으로 억제하고, 특히 40 ㎍을 투여한 군은 유의(有意)하게 억제하였다.
이들 결과로부터, T세포 인식 에피토프 펩티드 고정화 나노입자는 삼나무 화분에 대해 감작이 성립된 후의 투여에 있어서도 치료효과를 발휘하여, 화분증 등의 면역요법제로서 유용하다.
본 발명에 의해, T세포 에피토프 펩티드, 특히 화분증 환자의 T세포 인식 에피토프 펩티드를 변성 또는 분해하지 않고 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자, 및/또는 이것을 포함하는 면역요법제를 제공하는 것이 가능하게 되었다. 또한 펩티드를 단체(單體)로 투여한 경우에 비교하여, 생분해성 나노입자에 고정화 또는 내포화함으로써, Th1/Th2 균형을 제어할 수 있다.
따라서, 본 발명의 상기 생분해성 나노입자는, 예를 들면 화분증, 통년성 알레르기성 비염 질환, 계절성 알레르기성 비염 질환 등에 대한 면역요법제로서 유용하다.

Claims (10)

  1. 삼나무 화분 T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 폴리(γ-글루타민산)을 주재료로 하는 나노입자.
  3. 제1항에 있어서, 폴리(γ-글루타민산)과 페닐알라닌에틸에스테르의 그래프트 공중합체인 나노입자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 나노입자를 포함하는 면역요법제.
  5. 제4항에 있어서, 삼나무 화분증 치료 및/또는 예방을 위한 면역요법제.
  6. 삼나무 화분증 치료 및/또는 예방을 위한, 삼나무 화분 T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자의 면역요법제 제조를 위한 사용.
  7. T세포 인식 에피토프 펩티드를 고정화 또는 내포화한 생분해성 나노입자의 유효량을 포유동물에 투여하는 면역요법.
  8. 제7항에 있어서, 삼나무 화분증 치료 및/또는 예방을 위한 면역요법.
  9. 제6항에 있어서, 폴리(γ-글루타민산)을 주재료로 하는 나노입자를 사용하는, 나노입자의 면역요법제 제조를 위한 사용.
  10. 제6항에 있어서, 폴리(γ-글루타민산)과 페닐알라닌에틸에스테르의 그래프트 공중합체인 나노입자를 사용하는, 나노입자의 면역요법제 제조를 위한 사용.
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