JP3911201B2

JP3911201B2 - 親−疎水性修飾ポリ（γ−グルタミン酸）

Info

Publication number: JP3911201B2
Application number: JP2002152198A
Authority: JP
Inventors: 満明石; 謙一郎日渡
Original assignee: BIOMEDICAL TECHNOLOGY HYBRID CO., LTD.
Current assignee: BIOMEDICAL TECHNOLOGY HYBRID CO., LTD.
Priority date: 2002-05-27
Filing date: 2002-05-27
Publication date: 2007-05-09
Anticipated expiration: 2022-05-27
Also published as: JP2003342367A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、親−疎水性基で修飾したポリ（γ−グルタミン酸）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリ（γ−グルタミン酸）はバチルス（Bacillus）属の微生物の発酵により非常に効率よく（例えば、培養液１ｌあたり５０ｇ）生産され、α−カルボキシル基に由来するカルボキシル基を側鎖に有する直鎖の水溶性の生分解性ポリマーである。このような特性を活かし、ポリ（γ−グルタミン酸）は、制ガン剤を化学結合を介して担持させるか、化学的な架橋によるゲル化を介してゲルマトリックス中に薬物を内包させるための薬物担体としての用途が提案されている（特開平６−９２８７０号、特開平６−２５６２２０号）。
【０００３】
上記の化学的に架橋をさせたポリ（γ−グルタミン酸）（以下、γ−ＰＧＡと略記する場合あり）は、その側鎖カルボキシル基を介して二官能性基により架橋させることで新たな用途を開拓したγ−ＰＧＡの誘導体といえる。
【０００４】
【発明の構成】
γ−ＰＧＡは、それ自体またはその上記のような誘導体としても有用なポリマー材料である。しかし、可能であれば、さらなる機能を付与したγ−ＰＧＡ誘導体の提供も望まれるであろう。かような観点からγ−ＰＧＡの機能化を検討してきたところ、γ−ＰＧＡの側鎖カルボキシル基の一部を介して、個別に、一定の親水性基および疎水基を導入することによりγ−ＰＧＡを修飾すると、あるものは水性媒体中で会合した分子集合体である高分子ミセルを形成することを見出した。このような高分子ミセルは、ミセル内に薬物等を内包することのできる新たな薬物担体としても利用できる。また、仮に、γ−ＰＧＡそれ単独では高分子ミセルを形成できない場合であっても、例えば疎水性基を介して、または残存するカルボキシル基を介して適当な薬物を物質的もしくは化学的に結合することにより薬物を内包した高分子ミセルを形成しうるものもある。こうして、本発明者らはγ−ＰＧＡに新たな機能を付与することに成功した。
【０００５】
したがって、本発明によれば、新たな機能を有する親−疎水性修飾γ−ＰＧＡが提供される。具体的には、本発明は、一般式（Ｉ）
【０００６】
【化２】

【０００７】
（式中、Ａは基−(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n−Ｒ¹であって、Ｒ¹はＣ₁−Ｃ₆アルキルまたはＣ₁−Ｃ₅アルキルカルボニルを表し、かつ、ｎは１、好ましくは１０〜２００のいずれかの整数を表し、
Ｂは基−ＣＨＲ²Ｒ³であって、Ｒ²はＣ₃−Ｃ₂₁アルキルを表し、かつ、Ｒ³は水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキルオキシカルボニルを表し、
ＸおよびＹは、独立して−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、
ｐ、ｑおよびｒは、独立して１以上の整数を表し、ｐ＋ｑ＋ｒの総数は２０〜２５００のいずれかの整数を表し、そして
各繰り返し単位は部分的にブロックを形成してもよいが、本質的にはランダムに存在する）
で表される修飾ポリ（γ−グルタミン酸）またはその塩を提供する。
【０００８】
【発明の具体的な態様】
一般式（Ｉ）における各基を定義するアルキルまたはアルキルカルボニルもしくはアルキルオキシカルボニルのアルキル部分は、共通して、直鎖または分岐鎖であることができる。したがって、Ｃ₁−Ｃ₆またはＣ₁−Ｃ₅アルキルの具体的なものとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔ−ペンチルが挙げられ、Ｃ₆アルキルとしてはｎ−ヘキシル、イソヘキシルが挙げられる。
【０００９】
また、一般式（Ｉ）におけるＢに関連する基−ＣＨＲ²Ｒ³におけるＲ²がＣ₃−Ｃ₂₁アルキルである場合は、上記したアルキルのうち、Ｃ₃（炭素原子数が３）以上のものに加えＣ₂₁までの分岐していてもよい長鎖脂肪炭化水素基である。
【００１０】
こうして定義されるアルキルのうち、Ｒ¹は、一般式（Ｉ）におけるＡ部が親水性ドメインを形成することを意図していることから炭素原子数３個までのアルキルが好ましい。もちろん、Ａ部の−(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n−Ｒ¹におけるｎ数が大きくなれば、Ｒ¹のアルキルの炭素数は６であってもよい。
【００１１】
このようなＡ部は一般式（Ｉ）で表される分子において親水性ドメインとして機能する限り、ｎ数には制限がないが、一般的には１以上、好ましくはｎは１０〜２００のいずれかの整数、より好ましくは４０〜１２０のいずれかの整数である。−Ｘ−Ａ部は、後述するとおり、通常、片末端にアミノ基または水酸基を有するポリエチレングリコール誘導体を、それらの基とγ−ＰＧＡの側鎖カルボキシルとの反応させることにより導入できるので、Ｘは、それぞれ−ＮＨ−または−Ｏ−であるのが好ましい。
【００１２】
他方、Ｂ部は疎水性ドメインを形成することを意図していることから、基−ＣＨＲ²Ｒ³が全体として疎水性を示すようにＲ²およびＲ³が選ばれる。さらに、γ−ＰＧＡが有する生分解性の特性を維持するには、Ｂ部も生体由来の化合物の残基を主とするものが好ましい。したがって、基−ＣＨＲ²Ｒ³は、該基をγ−ＰＧＡ主鎖に連結するＹの−ＮＨ−または−Ｏ−と一緒になって、カルボキシル基を保護した疎水性アミノ酸残基であるか、または高級脂肪族アルコールの残基であることが好ましい。
【００１３】
限定されるものでないが、Ｙが−ＮＨ−である場合の典型的な残基としては、例えば、バリン、ロイシンまたはイソロイシンのカルボン酸エステルに由来するものを挙げることができ、一方、Ｙが−Ｏ−である場合の典型的な残基としては、天然油脂およびロウ中の飽和アルコール、例えば、Ｃ₂₂のドコサノール、Ｃ₁₉の１６−メチルオクタデカノール、Ｃ₁₈のステアリルアルコール、Ｃ₁₆のセチルアルコール、Ｃ₁₂のラウリルアルコール、Ｃ₁₀のデカノール、Ｃ₈のオクタノールの残基であることができる。
【００１４】
ｐ、ｑおよびｒの総数は、後述するようにγ−ＰＧＡを原料として、それぞれ−Ｙ−Ｂおよび−Ｘ−Ａをグラフト化する場合には、原料γ−ＰＧＡの分子量により変動する。バチルスズブチルス（Bacillus subtilis）の発酵によって得られるγ−ＰＧＡは数十万の分子量を有するものが得られており、例えば、Ｆ−２０−１株からは分子量約３０万のγ−ＰＧＡが得られており、また、市販もされている。本発明の修飾γ−ＰＧＡは市販されているものをそのまま、または、バチルス、ズブチルスの菌株を培養することにより、また、高分子量のγ−ＰＧＡを必要により機械的もしくは化学的に加水分解することによって、分子量を低下させたものを出発原料として得ることができる。したがって、一般的には、ｐ、ｑおよびｒの総数は２０〜３０００、好ましくは１８０〜２４００のいずれかの整数であることができる。また、本発明の修飾γ−ＰＧＡでは、所期の機能を奏するためには、側鎖カルボキシル基、−ＣＯＹＢおよび−ＣＯＸＡをそれぞれ有する繰り返し単位が一緒に存在することが必須であるので、ｐ、ｑおよびｒは独立して１以上の整数である。
【００１５】
本発明の修飾γ−ＰＧＡは、約３０万の分子量のγ−ＰＧＡを原料に用い、−Ｙ−ＢをＬ−ロイシンメチルエステルから形成し、そして−Ｘ−ＡをＨ₂Ｎ(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_nＣＨ₃［ポリ（エチレンオキシド）の分子量５０００］を用いて形成した場合には、ｑ／（ｐ＋ｑ＋ｒ）の比が０.２５以上の一定値となるときには水中で会合した分子集合体である高分子ミセルを形成することができる。他方、上記の比が０.２５をかなり下廻わる場合には上記修飾γ−ＰＧＡは水溶性となり、それら単独では水中で高分子ミセルを形成しなくなる。
【００１６】
このような修飾γ−ＰＧＡの高分子ミセル形成能は、Ａ部およびＢ部を有する単位の各分子量、それらを構成する残基の種類によって異なる。また、修飾γ−ＰＧＡが高分子ミセルを形成しうる場合、Ａ部のｎ数を変動させることにより高分子ミセルの粒径を調製できるる。
【００１７】
このように高分子ミセルを形成できる修飾γ−ＰＧＡは、一般的に、疎水性薬物（疎水性薬物は、水可溶化を目的に公知のポリマーミセルに封入されることが知られているものであれば限定されず包含され、または、水難溶性薬物とも称されている広範な薬物が包含される）を水性溶媒中で共存させることにより、該薬物を内包した高分子ミセルを形成しうる。かような系では、必ずしも、もとの修飾γ−ＰＧＡそれ自体が高分子ミセルを形成し得ない場合であっても、薬物と−Ｙ−Ｂを有する単位による疎水性ドメインとの相互作用により、高分子ミセルが形成可能になるものと推測される。また、こうして形成された高分子ミセルは、ミセルの表面にカルボキシル基を露出し得るので、該基を利用してさらに修飾することも可能である。このような修飾は、生物学的な指向性を示す残基、例えば、抗体またはその機能性残基によることが可能であろう。
【００１８】
またさらに、仮に、修飾γ−ＰＧＡがそれ単独で高分子ミセルを形成できない場合であっても、上記のような疎水性薬剤と−Ｙ−Ｂ単位との相互作用に代え、カルボキシル基を有する単位を介して、例えば、疎水性（または場合によっては水可溶性）のアルカリ性薬物を結合させることにより、水性媒体中で該薬物を内包した高分子ミセルを形成することも可能となろう。
【００１９】
したがって、本発明の修飾γ−ＰＧＡは、必ずしも、単独で高分子ミセルを形成し得ないものであっても、例えば、薬物の担体として有用である。しかし、好ましくは、修飾γ−ＰＧＡ単独で高分子ミセルを形成し得るものが、上述のような薬物を内包せしめた場合であっても、より安定な高分子ミセルを形成しうるので好ましい。修飾γ−ＰＧＡがそれ単独で水性媒体中で高分子ミセルを形成しうるか否かは、当業者であれば、上記説明、または後述する実施例に示す高分子ミセルを形成しうる例を参照し、小実験を行うことにより、極めて容易に確認できる。なお、上記の高分子ミセルを形成する水性媒体には、水そのもの、また、緩衝化された水溶液、高分子ミセルの安定性に悪影響を及ぼさない範囲で水混和性の有機溶媒を含んでいてもよい水溶液が包含される。
【００２０】
また、本発明の修飾γ−ＰＧＡは、カルボキシル基を介して形成される塩、好ましくはアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム）の部分塩または完全な塩であることもできる。
【００２１】
以上に説明してきた本発明の修飾γ−ＰＧＡは、都合よくは、下記反応スキームに示すごとく、γ−ＰＧＡに、順次、−Ｙ−Ｂ部分および−Ｘ−Ａ部分を導入することによって製造できる。
反応スキーム：
【００２２】
【化３】

【００２３】
（各式におけるＡ、Ｂ、Ｘ、Ｙ、ｐ、ｑおよびｒは上記定義と同義である。）
こうして製造される一般式（Ｉ）で表される修飾γ−ＰＧＡにおける３種の繰り返し単位の各々は、場合によって部分的数個のブロックを形成していてもよいが、本質的にはランダムに存在するであろう。
【００２４】
【実施例】
以下、具体例を挙げ本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでない。
実施例：
（１） γ−ＰＧＡのＬ−ロイシンメチルエステルによる疎水性化
１.０ｇのγ−ＰＧＡ（Ｍｎ＝３.０×１０⁶、明治製菓（株））を０.３ＭのＮａＨＣＯ₃水溶液５０ｍｌに溶解した。この溶液とクロロホルム１５０ｍｌを混合、攪拌した。この溶液に所定量のＬ−ロイシンメチルエステル（Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）を溶解させた。溶液を氷冷し、ＷＳＣ（水溶性カルボジイミド、和光純薬（株））を加えて一時間氷温下で攪拌した。その後、室温で１２時間攪拌を行った。反応後クロロホルムを留去、残った水を取り除き、沈殿しているポリマーをアセトンに溶解した。これを水に対して再沈殿し、得られたものを減圧乾燥した。
【００２５】
【表１】

【００２６】
（２）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のグラフト化
上記（１）で得たロイシン化ＰＧＡ（Ｌｅｕ−ＰＧＡ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、
【００２７】
【化４】

【００２８】
塩酸塩（以下、ＰＥＧ−ＮＨ₂）およびブタノール（ＨＯＢｔ）を加えた。溶液を氷冷し、ＷＳＣを加えて１時間攪拌した。次いで、室温で１２時間攪拌した。反応後、溶液を水に対して３日間透析することで、溶液は白く濁り粒子が形成した。これを遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、１０分×３）によって精製し、微粒子の分散液を得た。原料および反応体の使用割合は表２のとおりであった。
【００２９】
【表２】

【００３０】
表２中、ＧＡｕｎｉｔはγ−グルタミン酸単位の存在割合を示す。
【００３１】
透析直後は、どちらのサンプルも薄く白濁していたが、例２−２は、３日目辺りで凝集して濁りが強くなり、沈殿も生じ始めた。これに対して例２−１は一週間以上、合成直後の状態を保っている。比較として、ロイシン化ＰＧＡをＤＭＦに溶解し、これを水に透析したが最初は白濁するものの例２−２のサンプルと同様に２−３日で、濁りが強くなり沈殿を生じ始めた。このことから、ＰＥＧをグラフト鎖として導入することで、粒子の分散安定性が向上した。
【００３２】
例２−１の粒子を動的光散乱によって解析した結果、平均粒径２４１ｎｍ、標準偏差５０ｎｍ、Ｃ.Ｖ.２１％であった。また、電子顕微鏡による観察結果からも微粒子が形成していることが確認された。また、得られた微粒子を蒸留水に分散させて導電度滴定を行った結果、ナノスフェア１０ｍｇ当たりに、２.６５×１０^-6（ｍｏｌ）のカルボキシル基が存在することが明らかとなった。

Claims

一般式（Ｉ）

（式中、Ａは基−(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n−Ｒ¹であって、Ｒ¹はＣ₁−Ｃ₆アルキルまたはＣ₁−Ｃ₅アルキルカルボニルを表し、かつ、ｎは１〜２００のいずれかの整数を表し、
Ｂは基−ＣＨＲ²Ｒ³であって、Ｒ²はＣ₃−Ｃ₂₁アルキルを表し、かつ、Ｒ³は水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキルオキシカルボニルを表し、
ＸおよびＹは、独立して−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、
ｐ、ｑおよびｒは、独立して１以上の整数を表し、ｐ＋ｑ＋ｒの総数は２０〜２５００のいずれかの整数を表し、そして
各繰り返し単位はランダムに存在する）
で表される修飾ポリ（γ−グルタミン酸）またはその塩。
−Ｘ−Ａが−ＮＨ−(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n−Ｒ^1aを表し、Ｒ^1aがＣ₁−Ｃ₃アルキルを表す請求項１記載の修飾ポリ（γ−グルタミン酸）またはその塩。
−Ｙ−Ｂが−ＮＨＣＨＲ^2aＲ^3a（ここで、Ｒ^2aはＣ₃−Ｃ₅アルキルであり、かつ、Ｒ^3aがＣ₁−Ｃ₃アルキルオキシカルボニルである。）または−ＯＣＨ₂Ｒ^2b（ここで、Ｒ^2bはＣ₈−Ｃ₂₀アルキルである。）を表す請求項１または２記載の修飾ポリ（γ−グルタミン酸）またはその塩。
−Ｘ−Ａが−ＮＨ−(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)_n−ＣＨ₃を表し、かつｎが１０〜１２０のいずれかの整数を表し、そして−Ｙ−Ｂが−ＮＨＣＨＲ^2aＲ^3aであって、かつ、Ｒ^2aがイソプロピル、２−ブチルプロピルまたは１−メチルプロピルを表し、Ｒ^3aがメトキシカルボニルを表す請求項１〜３のいずれかに記載の修飾ポリ（γ−グルタミン酸）またはその塩。
水性媒体中で高分子ミセルを形成することのできる請求項１〜４のいずれかに記載の修飾ポリ（γ−グルタミン酸）またはそのアルキル金属塩。