DK161168B - Immunometrisk fremgangsmaade til bestemmelse af haptener og analysesaet til anvendelse ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

DK 161168 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde af den i krav 1's indledning angivne art til bestemmelse af haptener, idet mærkede antistoffer bruges til måling af koncentrationen af haptener i biologiske prøver. Frem-5 gangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 1's kendetegnende del angivne.

Opfindelsen angår også et analysesæt til brug ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Analysesættet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved det i krav 2 10 angivne.

Immunobestemmelsesmetoder bruges vidt udbredt til måling af specifikke komponentmolekyler i biologiske prøver, navnlig i blodprøver for patienter til prognostiske, diagnostiske og andre kliniske formål. For tiden anvendes 15 der ved de vigtigste immunokemiske analytiske metoder radioaktive isotoper, molekyler med fluorescerende eller bioluminescerende egenskaber eller enzymer som fremmer farveændringer som prøvesignal. Disse enheder omtales i almindelighed som mærkninger eller markører.

20 De antistoffer (immunoglobuliner) der bruges til immunokemiske analyser er indtil for nylig blevet fremstillet i form af antisera i dyr (fx kaniner eller får) ved immunisering med et antigen, der sædvanligvis er analytten selv eller en analog til analytten, hvilket fremmer dannel-25 se af antistoffer som genkender analytten.

I tilfælde af små molekyler, benævnt haptener, er sidstnævnte metode særlig betydningsfuld fordi molekyler med mindre molekylvægt end ca. 5000 dalton ikke er fundamentalt immunogene og må konjugeres med et større bæremo-30 lekyle der sædvanligvis er et protein, fx okseserumalbu-min eller thyroglobulin. De antistoffer som er til stede i antisera frembragt mod hvert enkelt konjugeret hapten udviser polyvalens; dvs. at der er flere populationer antistoffer til stede i antiserumerne og hver af disse 35 genkender forskellige aspekter eller dele af molekyIkonfi-gurationen af det konjugerede hapten. Antistofferne afviger derfor fra hinanden med hensyn til specificitet. Den

DK 161168B

2 mangfoldighed af antistoffer som er til stede i et givet antiserum kan være fordelagtig i nogle henseender, navnlig når antigenet er et stort protein, eftersom det letter, dannelse af store antistof-antigen-komplekser med evne 5 til udfældning. Hvis der er behov for et rent præparat af specifikke antistoffer, som tilfældet er ved immunome-triske bestemmelser, må der benyttes komplicerede rensningsprocedurer og i almindelighed er disse af begrænset effektivitet. For nylig er disse problemer overvundet 1q ved udvikling af teknikker for produktion i stor målestok af monoklonale hybridomceller som udskiller et enkelt antistof med enestående affinitet og specificitet for et givet antigen. Imidlertid er to eller flere antistoffer, der genkender forskellige aspekter af et hapten med en ^5 molekylvægt på under 2000 dalton (fx steroider og mange lægemidler) ude af stand til samtidig at binde sig til et enkelt haptenmolekyle, og dette forhold har begrænset anvendelse af mærkede antistof- (immunometriske) immunbestemmelser for de fleste lavmolekylære forbindelser.

2q Ved konventionelle immunbestemmelsesmetoder kobles et rent præparat af analytten, eller en anaolog til analyt-ten, til en passende markør hvis natur bestemmer den anvendte påvisningsmetode. Fx bruges der ved radioimmunbestemmel-se en radioaktiv isotop som markør, og den kan kvantifice-25 res i et væske- eller krystal-scintillationsspektrometer.

Den mærkede analyt, eller analyt-analog, kan inkuberes ved en fast koncentration med en fast mængde antistof som genkender den mærkede analyt såvel som analytten selv. Der indtræder derfor konkurrence mellem mærket og umærket 30 analyt om antistof-bindingsstedet derfor, og den mængde mærket analyt som bindes af antistoffet vil være omvendt proportional med den tilstedeværende mængde umærket analyt. De dannede ;antistofbundne komplekser fraskilles, fx ved immunabsorption, fysisk-kemisk adsorption eller fældning 25 enten af antistofbundne komplekser eller ubundet analyt (mærket og umærket). Derefter måles antistofbundet mærket analyt og der konstrueres en standardkurve ud fra kendte analytkoncentrationer (standarder). Koncentrationen af 3

DK 161168 B

analytten i en ukendt prøve kan aflæses ud fra denne kurve.

I tilfælde af immunbestemmelser af små molekyler er den mærkede ligand den mærkede analyt eller et derivat af analytten (analog) som kan være covalent bundet til en 5 markør. Der er imidlertid generelt en grænse for det antal markører som kan kobles til et lille molekyle, og det bestemmes hovedsagelig af dets størrelse. Desuden kan derivatisering af små molekyler eller indførelse af mærker 125 med forholdsvis stor molekylstørrelse (fx I eller 1q et enzym) ændre antistoffets affinitet til den mærkede analyt i forholdt il dets affinitet til umærket analyt, og det på en sådan måde at nytteværdien af særlige antistoffer begrænses, fx antistoffer som genkender derivatsidekæden og udviser en såkaldt "broeffekt". Sidstnævnte 15 problem kan overvindes ved anvendelse af antistoffer (mono-klonale eller polyvalente) der udviser ringe affinitet til haptenets derivat-sidekæde, eller ved at der anvendes en anden derivat-sidekæde end den der er brugt til konstruktion af antigenet.

2q Immunometriske bestemmelser indebærer anvendelse af mærkede antistoffer i stedet for mærket analyt og er særlig nyttige til målinger af store molekyler, fx proteiner, som har to eller flere diskrete antigeniske steder eller epitoper. Ved denne bestemmelsestype bruges der 25 en eller flere antistofpopulationer som "fangende antistof" (catching antibody), der kan blive immobiliseret på en fastfase-bærer, eller de kan immuno-udfældes med et andet antistof som er specifikt rettet derimod. Det sidstnævnte er kun muligt hvis det "fangende antistof" er dannet i 3Q en anden art end det "mærkede antistof". Det "mærkede antistof" er et rent præparat af en eller flere antistofpopulationer som fortrinsvis genkender én eller flere anderledes epitoper end det "fangende antistof", selv om dette ikke er afgørende. Under inkuberingen med standard-25 mængder analyt, eller ukendte koncentrationer analyt i biologiske prøver, dannes der en "sandwich" (lagstruktur) mellem det "fangende antistof", analytten og det "mærkede antistof". Derfor vil i nærværelse af overskydende mængder

DK 161168 B

4 af både "fangende" og "mærkede" anstistoffer den mængde "mærket antistof" som knyttes til en sådan "sandwich" være direkte proportional med den tilstedeværende mængde analyt og derved er der tilvejebragt grundlag for en kvan-2 titativ måling.

Immunometriske teknikker frembyder talrige fordele i forhold til konventionelle konkurrerende immunbestemmelser, fx eliminerer de nødvendigheden af rene præparater af mærket analyt. Anvendelse af overskud af reagenser nedsætter også nødvendigheden af præcisionspipettering af reagenser, forøger reaktionskinetikken og nedsætter dermed inkuberingstiderne. Betydningen af denne teknik er imidlertid først for nylig blevet fuldt påskønnet, specielt efter at produktion af monoklonale antistoffer 5 i betydelig grad har forenklet problemet med fremstilling af store mængder antistoffer med entydig specificitet.

Ikke desto mindre har ananvendelse af immunometriske bestemmelser med mærkede antistoffer til lavmolekylære haptener været begrænset, hovedsagelig fordi det kan være 2Q sterisk umuligt for mere end ét antistof at reagere med et lille molekyle ad gangen.

Forsøg på at overvinde dette problem er gjort ved immobilisering af haptener konjugeret til proteiner (andre end dem der bruges til antigeniske formål), til 25 en fastfase-bærer, se europæisk patentpublikation nr.

0028132. Dette gør det muligt at der kan indtræde en konkurrerende reaktion for et mærket antistof-bindingssted mellem analyt og proteinkonjugeret hapten, se europæisk patentpublikation nr. 0028133 og britisk patentskrift 2q nr. 1550320. Under betingelser hvor der bruges en fast mængde proteinkonjugeret hapten og mærket antistof, er den mængde mærket antistof som har evne til at binde det proteinkonjugerede hapten omvendt proportional med den mængde analyt som er til stede i standarderne eller ukend-te prøver. Selv om denne protokoltype gør det muligt at bruge mærkede antistoffer i immunbestemmelser af små molekyler, påvirker den mængde proteinkonjugeret hapten, der sættes til systemet, delvis bestemmelsesområdet 5

DK 161168 B

og følsomheden, og de relative mængder proteinkonjugeret hapten som er til stede i enkelte prøverør eller cuvetter fastlægger (i betydeligt omfang) bestemmelsens præcision.

Dette er et særligt problem fordi effektiviteten af passiv, eller aktiv, adsorption af proteinmolekyler til fastfase-5 bærere er upålidelig og vanskelig at kontrollere. Desuden behøves der store mængder proteinkonjugeret hapten, hvis karakteristika kan ændre sig fra den ene portion til den anden.

De ovennævnte problemer er overvundet ved den fore- 10 liggende opfindelse, ifølge hvilken man fremstiller et proteinkonjugeret hapten ved anvendelse af et anderledes protein (fx thyroglobulin) end det der anvendtes til at konjugere haptenet med henblik på udvikling af antistof-fer mod haptenet (fx okseserumalbumin). Det konjugerede hapten kan bruges til affinitetsrensning af sub-populatio-ner af antistoffer fra et antiserum som udviser ringe genkendelse af andre områder af haptenet end dem der er til stede i det (anderledes) haptenkonjugat mod hvilket antiserumet blev udviklet, såfremt der bruges den samme 20 derivat-sidekæde. Desuden kan der også bruges en anden sidekæde eftersom dette vil eliminere binding af antistoffer som genkender og binder sig til sidekæden. Hovedfunktionen af det konjugerede hapten er imidlertid at virke som bærer for haptenet som er frit til at konkurrere med 25 analytten med hensyn til mærkede antistof-bindingssteder i en væskefase, i kraft af den kendsgerning at proteinet (thyroglobulin) kan fraskilles immunkemisk ved hjælp af overskud af antistoffer rettet imod det (fx anti-thyro-^ globulin-antiserum), og som kan være knyttet til en fast-fasebærer. På denne måde inkuberes en fast mængde proteinkonjugeret hapten sammen med et mærket antistof i nærværelse af variable mængder standarder eller ukendte serumprøver. Den mængde mærket antistof som er bundet til det proteinkonjugerede hapten vil være omvendt proportional 35 med mængden af analyt i standarderne eller de ukendte prøver. De proteinkonjugerede haptenmærkede antistofkom-

DK 161168 B

e plekser fjernes specifikt fra inkubaterne immunokemisk ved hjælp af antistoffer mod proteinet. Disse sidstnævnte antistoffer kan absorberes til reaktionsbeholderens/rørets vægge eller kobles til en fastfasebærer og fraskilles fy-5 sisk efter en kort inkuberingsperiode.

Det skal bemærkes at der fra britisk fremlæggelsesskrift nr.2 084 317 kendes en fremgangsmåde af stort set den i krav 1's indledning angivne art til gennemførelse af enzymbundet immunanalyse til bestemmelse af et antigen.

10 Ved denne fremgangsmåde mærker man et kendt antigen, som er kovalent bundet til en reaktant X, svarende til den ifølge nærværende fremgangsmåde anvendte haptenbærer, dog således at den ikke er makromolekylær, til dannelse af et konjugat. Dette konjugat omsættes i nærværelse af det til 15 bestemmelse værende antigen i flydende fase med en fast immunadsorbent der på overfladen har en bindingspartner for X, hvilken bindingspartner er inert i forhold til det til bestemmelse værende antigen, hvorpå den faste og den flydende adskilles og man bestemmer enzymaktiviteten i den 20 ene eller begge faser.

Ved denne kendte immunanalyse anvendes der ikke to forskellige makromolekylære bærere hvoraf den ene udnyttes til dannelse af et antistof mod haptenet og den anden til fremstilling af haptenkonjugatet. De beskrevne reaktanter 25 X/ altså haptenbærerne, er små molekyler, fx dinitrofenol, det dannede konjugats lave molekylvægt er ifølge skriftet fordelagtigt (side 5 linie 24-25). Det er ikke antydet i skriftet at man skulle kunne anvende to forskellige hapten-bærere, endsige det skulle være fordelagtigt. Det er det 30 imidlertid fordi man derved undgår krydsreaktioner (mellem antistoffet til haptenet og den makromolekylære bærer.

Makromolekylære proteiner som fx tyroglobulin har to klare fordele i sammenligning med små molekyler som hap-tenbærere: 35 1) Det er muligt at fæstne en meget større mængde hap- tener til et stort bæremolekyle end til et lille. De sig- 7

DK 161168 B

naler som fås fra bæremolekyler som er optaget af det immo-biliserede antistof er meget kraftigere end ellers, hvorved den nødvendige mængde immobiliseret antistof bliver mindre end ellers.

5 2) Antistoffers specificitet med hensyn til forbindel ser med små molekyler er mindre end i forhold til makromo-lekylære forbindelser.

US patentskrift nr. 4 200 436, der svarer til forannævnte britiske patentskrift nr. 1 550 320, angår en immu-10 nokemisk fremgangsmåde til måling af antigene stoffer ved anvendelse af et mærket antistof som danner en monovalent binding til antigenet.

Ved fremgangsmåden inkuberes haptenet med et mærket antistof og der tilsættes et uopløseligt konjugat bestående 15 af et hapten fæstnet til et protein. Den dannede faste fase skilles fra den flydende og til sidst bestemmes antistofmængden i den ene af faserne. Denne fremgangsmåde har de samme ulemper som den fra GB 2 084 317 kendte, nemlig at den tilsatte, med proteinet konjugerede haptenmængde ind-20 virker ugunstigt på målenøjagtigheden. Der behøves desuden store mængder hapten.

Den foreliggende fremgangsmåde gør det også muligt at foretage affinitetsrensning af polyvalente antistofpopulationer fra et antiserum som kun genkender epitoper 25 som er enestående for analytten og ikke derivat-sidekæden af analyt-haptenet. Dette opnås ved at man binder haptenet til et andet protein (fx thyroglobulin) end det der bruges til immuniseringsformål (fx okseserumalbumin). Thyroglobu-lin-haptenet immobiliseres på fx cyanogenbromid-aktiveret 30 "Sepharose" ® 4b CL, og antisera udviklet mod ét hapten-konjugat, fx okseserumalbumin-hapten, inkuberes med et andet, immobiliseret hapten-konjugat, fx thyroglobulin-hapten, så at antistofferne til haptenet selv immobiliseres selektivt. Efter grundig vask af thyroglobulin-hapten-35 affinitetsmatrixen, fjernes de anstistoffer der udviser den største affinitet til de regioner som er fælles for hapten og analyt, og ikke derivat-sidekæden, fra thyroglo- 8

DK 161168 B

bulin-hapten-affinitetsmatrixen ved konkurrence med overskydende analyt, der derefter fjernes fra antistoffet ved dialyse eller fysisk adsorption. Dette muliggør produktion af antistoffer med høj grad af specificitet for 5 det pågældende hapten.

Ved den foreliggende fremgangsmåde kan en hvilken som helst type protein eller syntetisk polypeptid, som har evne til at fremkalde et immunrespons, bruges til at konjugere haptenet. Desuden kan en hvilken som helst lille moleky-10 lær forbindelse, naturlig eller syntetisk (fx et lægemiddel, en hormon eller en anden biologisk aktiv, lavmolekylær forbindelse) måles ved teknikken ifølge opfindelsen.

Den beskrevne separationsmetode (fx under anvendelse af immobiliseret anti-thyroglobulin-antistof) kan også 15 anvendes i forbindelse med andre proteiner eller syntetiske molekyler og kan udstrækkes til at omfatte andre antistofsystemer hvor et immobiliseret antistof kan bruges til at binde og fraskille antistoffer rettet mod det protein som bruges til konjugering af haptenet.

20 Opfindelsen angår også et analysesæt til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Det indeholder (1) et mærket antistof til haptenet; (2) et konjugat af haptenet med en makromolekylær haptenbærer som er forskellig fra den der blev anvendt til udvikling af det mærkede 25 antistof (1); (3) midler til immobilisering af haptenkon-jugatet (2); og (4) kalibreringsstandarder for det til bestemmelse værende hapten.

Midlet til immobilisering af haptenkonjugatet, der bruges ved prøvemetoden, er fortrinsvis et antistof til 30 ikke-hapten-epitoperne af nævnte konjugat, der i sig selv er bundet til en fast bærer eller understøtningsmiddel, fx indersiden af et plastrør anvendt til bestemmelsen, eller et inert pulver såsom kaolin. Det er også muligt at bruge et andet bindingsmiddel som fx avidin, i hvilket 35 tilfælde avidin kan bindes til en fast fase og haptenet kan biotinyleres (dvs. bindes til biotin) eller vice versa (haptenet kan være bundet til avidin og den faste fase kan være biotinyleret).

9

DK 16116 8 B

Den markør der bruges ved den foreliggende fremgangsmåde kan være en hvilken som helst markør der sædvanemæssigt bruges ved immunometriske og lignende bestemmelsesmetoder, fx en radioisotop, et enzym eller et fluorescerende, fos-5 forescerende, luminescerende eller spin-mærket molekyle.

Tegningen og et eksempel tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

På tegningen viser fig. 1 en anskueliggørelse af fremgangsmåden ifølge 10 opfindelsen, og fig. 2 en standardkurve, opnået på den i eksemplet beskrevne måde, over bestemmelse af progesteron ved hjælp af kanin-antiserum i flydende fase og æsel-antikanin-anti-serum.

15 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan gennemføres på den måde der er skematisk anskueliggjort i figur 1.

Først blandes en standardanalyt, dvs. en prøve af det til bestemmelse værende hapten med kendt koncentration, eller en ukendt analyt som skal bestemmes, med protein-20 koblet hapten og mærket antistof til haptenet (udviklet mod et andet protein end det der var anvendt i protein-hapten-konjugatet). Desuden er der et antistof til det protein som er til stede i protein-hapten-konjugatet, immobiliseret ved tilknytning til en fast bærer, på fig.

25 i vist som den indvendige overflade af det reagensglas (fx af polystyren) der anvendes til bestemmelsen. Under inkubering binder haptenkonjugatet sig til det immobilise-rede antistof. Haptenet i analytten og det til den faste bærer bundne hapten konkurrerer om det mærkede antistof, 30 således at en del af markøren immobiliseres og den resterende del (der binder sig til haptenet i analytten) ikke immobiliseres. Dekantering af væskefasen efterlader følgelig kun den immobiliserede markør, der derefter kan måles. Under anvendelse af en serie analytter med kendte hapten-35 koncentration kan der konstrueres en standard-analyt-kurve, og ud fra den kan man aflæse mængden af hapten i en ukendt prøve.

10

DK 16116 8 B

Eksempel

Duplikatprøver på 50 μΐ af menneskeserumstandarder indeholdende kendte mængder progesteron (0, 1, 10, 30, 100 og 300 nmol/1) blev inkuberet (10 minutter ved 20°C) 12 5 5 i polystyren-reagensglas sammen med 100 μΐ I-mærket monoklonalt anti-progesteron-antistof (100000 cpm i prøvepuffer, dvs. fosfatpufret saltopløsning indeholdende fosfat (0,25 nmol/1), 0,9% NaCl, 0,625% laktose, 0,125% okse-gammaglobulin, 0,05% natriumazid, pH 7,6). Det monoklonale 10 antistof var blevet fremstillet mod progesteron-ll-hemisuc-cinat/okseserumalbumin og renset fra kulturmediet ved hjælp af protein A-"Sepharose" ® affinitetskromatografe-ring. Prøver på 100 μΐ af progesteron-ll-hemisuccinat/okse-thyroglobulin-konjugatet (1 nmol/1 i prøvepuffer) sattes 15 til alle reagensglassene undtagen to. Disse to reagensglas brugtes til overvågning af ikke-specifik binding og indeholdt 50 μΐ af det laveste progesteron-standardserum (0 125 nmol/1, I-mærket monoklonalt antistof og oksethyroglo-bulin (100 μΐ, 1 nmol/1 prøvepuffer). Efter yderligere 20 inkubering (30 min. ved 20°C) sattes der 100 μΐ kanin-antiokse-thyroglobulin-antiserum (1:500 i prøvepuffer) til alle reagensglassene, der derefter blev hvirvelblandet og inkuberet i 30 minutter ved 20°C. Prøver på 1 ml af kaolin-æsel-anti-kanin-antiserum sattes til alle glassene 25 og efter yderligere 30 minutter ved 20°C blev disse centrifugeret (2000 g i 10 minutter). De ovenstående væsker blev dekanteret og remanensen taltes i en mangerums gammatæller. Der konstrueredes en standardkurve og den er vist i fig. 2. I denne figur står B/Bg for den procentvise 30 binding af standarderne (minus uspecifik binding) i sammenligning med maksimal binding (nul-standard: Bg) minus uspecifik binding.

Hvis der udføres en lignende bestemmelse under anvendelse af en prøve indeholdende et ukendt progesteron, 35 gør bestemmelse af den procentvise binding (B/Bg), opnået for prøven, det muligt fra denne kurve at aflæse koncentrationen af progesteron i prøven.

Claims (3)

1. Immunometrisk fremgangsmåde til bestemmelse af et hapten, ved hvilken man fremstiller en blanding indeholden- ^ de (1) det til bestemmelse værende hapten, (2) et mærket antistof mod dette hapten, (3) et konjugat af haptenet med en makromolekylær haptenbærer i sådanne forhold at haptenet (1) og haptenkonjugatet (3) bindes til haptenbindings-stederne på det mærkede antistof (2), hvorpå man måler den 1q mængde markør som er bundet til det immobiliserede haptenkon jugat (3) af det til bestemmelse værende hapten (1), kendetegnet ved at den makromolekylære haptenbærer af haptenkonjugatet (3) er forskellig fra den haptenbærer som har været anvendt til fremstilling af antistoffet (2), og at man immobiliserer haptenkonjugatet (3) ved at omsætte det med overskud af det immobiliserede antistof, som er specifikt for den makromolekylære haptenbærer.

2. Analysesæt til bestemmelse af haptener ved den i krav 1 angivne fremgangsmåde, kendetegnet ved 2ø at det indeholder: (1) et mærket antistof mod haptenet; (2) et konjugat af haptenet med en makromolekylær bærer som er forskellig fra den der har været anvendt ved fremstilling af det mærkede antistof (1), 25 (3) midler til immobilisering af haptenkonjugatet (2), og (4) en kalibreringsstandard for det til bestemmelse værende hapten.

3. Analysesæt ifølge krav 2, kendetegnet 2Q ved at "midlerne (3) til immobilisering af haptenkonjugatet (2)" betyder et antistof mod den makromolekylære haptenbærer, der er bundet direkte eller indirekte til den faste bærer. 35