CN111190017A

CN111190017A - 一种增敏阻断缓冲液及其用途

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Publication number: CN111190017A
Application number: CN201911269757.XA
Authority: CN
Inventors: 王晓倩; 张付献; 王晓东
Original assignee: Shenzhen Aixin Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Aixin Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2020-05-22
Anticipated expiration: 2039-12-11
Also published as: CN111190017B

Abstract

本申请属于诊断试剂技术领域，公开了一种增敏阻断缓冲液，包含缓冲液、0.2％～10％(v/v)乙醇、0.1％～5％(w/v)PEG6000、0.01％～0.5％(w/v)羧甲基纤维素钠(M.W.90000)、0.005％～0.25％(w/v)泊洛沙姆188、0.05％～5％(w/v)的甜菜碱、0.1％(v/v)Tween20、0.045％(v/v)ProClin 300。缓冲液为pH5.8～8.0的磷酸缓冲盐溶液、pH6.8～8.2的HEPES缓冲盐溶液、pH6.1～7.5的PIPES缓冲盐溶液、pH6.5～7.9的MOPS缓冲盐溶液、pH7.1～9.0的Tris缓冲盐溶液。采用本发明所述增敏阻断缓冲液与待测样本同时孵育参与反应，检测结果的阴性标本的本底显著降低，阳性标本检测结果的信号值升高，在阻断非特异性与增敏特异性反应的双重作用下，检测结果的阳性样本信号值与阴性样本信号值的比值变大，提高了检测的灵敏度和特异度。本发明所述增敏阻断缓冲液可用于制备幽门螺杆菌尿液抗体检测盒的用途。

Description

一种增敏阻断缓冲液及其用途

技术领域

本发明属于诊断试剂技术领域，具体涉及一种增敏阻断缓冲液、试剂盒及应用。

背景技术

免疫诊断(immunodiagnosis)是应用免疫学的理论、技术和方法诊断各种疾病和测定免疫状态。免疫诊断试剂广泛应用于医院、第三方检测、血站、体检中心，主要用于感染类疾病检测、传染病检测、肿瘤检测、代谢标志物检测等。其中，免疫诊断包括放射免疫、酶联免疫、免疫层析、化学发光等。免疫诊断有以下几个特点：①特异性强，尽量不出现交叉反应，不出现假阳性，以保证诊断的准确性；②灵敏度高，能测出微量反应物质和轻微的异常变化，有利于早期诊断和排除可疑病例；③简便、快速、安全。

免疫层析分析(Immunochromatography assay,ICA)和酶联免疫吸附分析(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)作为免疫学分析中最常用且发展最为成熟的两大检测平台，因其简单、快速、方便、特异性强、成本低等优势被广泛应用于临床诊断领域，然而，这两种免疫学分析方法的最大局限性在于其检测灵敏度和特异度偏低，难以对微量目标待测物进行准确的分析，难以满足某些实际应用的需求。在一些特定的免疫检测项目上，如何提高这两大免疫学检测方法的灵敏度和特异度已成为这些检测项目亟待解决的主要问题。既往研究表明优化检测信号、降低背景信号，是提高分析方法灵敏度的有效途径之一，本研究拟从配方优化着手，提高了检测信号灵敏度和特异度，结果是优化的增敏阻断缓冲液改善了两大传统免疫检测平台的灵敏度和特异度。

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)，1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中分离成功，经过各国学者30年来研究证实，Hp在慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等消化道疾病致病中起到重要作用。大量流行病学调查证实，自然人群中Hp的感染率相当高，在全球人群的感染率超过50％，而且随着年龄的增加有递增趋势。幽门螺杆菌寄生在胃黏膜组织中，67％～ 80％的胃溃疡和95％的十二指肠溃疡是由幽门螺杆菌引起的。2017年10月27 日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单，幽门螺杆菌(感染) 在一类致癌物清单中。预防和控制胃癌已日益引起人们的关注。因此，国内外普遍共识认为及早发现幽门螺杆菌感染者，及时而有效地用抗菌素根除幽门螺杆菌，对预防和控制幽门螺杆菌引起的胃病甚至胃癌有重大意义。

检测Hp感染的方法有侵入性和非侵入性两类。侵入性方法依赖胃镜活检，包括快速尿素酶试验(RUT)、胃黏膜直接涂片染色镜检、胃黏膜组织切片染色镜检、细菌培养、基因检测、免疫快速尿素酶试验(IRUT)等。而非侵入性检测方法不依赖内镜检查，包括13C或14C尿素呼气试验(UBT)、粪便抗原检测、血清抗体检测等。由于侵入性方法采样需要通过做胃镜的手段来实现，因患者接受性差而受到限制，不能作为大面积筛查方法。而非侵入性方法，操作简单、临床上使用较普遍。目前尚未有幽门螺杆菌抗体检测试剂盒在临床上使用，主要原因之一为尿液抗体含量低导致常规检测方法灵敏度达不到要求，且有其他干扰物的存在易形成交叉干扰，对测试的特异性造成影响。

因此，本研究通过一种增敏阻断缓冲液与待测样本同时孵育参与反应，使检测结果的阴性标本的本底显著降低，阳性标本检测结果的信号值升高，在阻断非特异性与增敏特异性反应的双重作用下，检测结果的阳性样本信号值与阴性样本信号值的比值变大，提高了幽门螺杆菌尿液抗体检测的灵敏度和特异度，使尿液标本检测在临床上的使用成为可能。幽门螺杆菌尿液抗体检测为根本性的无创检测，有着其他检测方法不可比拟的优势，适合进行流行病学调查、青少年及儿童Hp感染筛查方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的幽门螺杆菌尿液抗体检测中灵敏度与特异度不高，提供一种增敏阻断缓冲液，能够提高试剂盒的阳性符合率与阴性符合率，使试剂盒的准确度达到较高的水平。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种增敏阻断缓冲液，包含缓冲液、0.2％～10％(v/v)乙醇、0.1％～5％ (w/v)PEG6000、0.1％(v/v)Tween20、0.045％(v/v)ProClin 300。

在一些实施方案中，所述增敏阻断缓冲液中还包括0.01％～0.5％(w/v) 羧甲基纤维素钠(M.W.90000)。

在一些实施方案中，所述的增敏阻断缓冲液中，还包括0.005％～0.25％ (w/v)泊洛沙姆188。

在本发明中，所述的增敏阻断缓冲液中还包括0.05％～5％(w/v)的甜菜碱。

进一步的，所述的增敏阻断缓冲液中，缓冲盐可以为pH5.8～8.0的磷酸缓冲盐溶液、pH6.8～8.2的HEPES缓冲盐溶液、pH6.1～7.5的PIPES缓冲盐溶液、 pH6.5～7.9的MOPS缓冲盐溶液、pH7.1～9.0的Tris缓冲盐溶液。

本发明还提供了一种ELISA检测的试剂盒，一种免疫层析试剂盒，包括上述的增敏阻断缓冲液。

在一些实施方案中，本发明采用配制不同增敏阻断缓冲液对阳性和阴性标本进行孵育检测，比较检测结果的阳性符合率及阴性符合率，并根据ELISA 试剂检测结果的OD值计算得到P/N(阳性结果与阴性结果的比值，反映了检测试验能够区分阳性和阴性的能力)，结果显示，本发明所述增敏阻断缓冲液可以明显提高P/N。体外诊断试剂检测实验中，P/N对试验的灵敏度和特异度影响很大，在特定的反应体系下，较高的P/N，意味着检测方法能更好区分阴性阳性的能力。故本发明所述增敏阻断缓冲液可以明显提高检测的灵敏度和特异度。本发明提供了上述的增敏阻断缓冲液，以及上述的增敏阻断缓冲液在制备幽门螺杆菌尿液抗体检测试剂盒中的用途。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种增敏阻断缓冲液、试剂盒及应用。本发明所述增敏阻断缓冲液包含缓冲液、0.2％～10％(v/v)乙醇、0.1％～5％ (w/v)PEG6000、0.1％(v/v)Tween20、0.045％(v/v)ProClin 300。采用本发明所述增敏阻断缓冲液稀释待测样本后进行检测反应，可以明显提高 P/N，进而提高检测试验的灵敏度和特异度，解决了假阳性、假阴性问题，检测试验的阳性符合率与阴性符合率均能达到95％以上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例2中5种不同增敏阻断缓冲液稀释阳性样本后进行酶联免疫吸附检测OD值结果统计图。

图2示实施例2中5种不同增敏阻断缓冲液稀释阴性样本后进行酶联免疫吸附检测OD值结果统计图。

具体实施方式

本发明公开了一种增敏阻断缓冲液、试剂盒及应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1、幽门螺杆菌尿液抗体检测试剂盒(胶体金法)的制备与检测一、制备检测试剂盒与检测尿液标本

1、制备胶体金颗粒：取800mL纯化水于圆底烧瓶置于磁力搅拌加热套中，再加入8mL浓度为1％(w/v)HAuCl₄，搅拌加热，待溶液沸腾后迅速加入15mL 浓度为1％(w/v)柠檬酸三钠，继续搅拌加热10分钟，得到酒红色的胶体金溶液，停止加热继续搅拌冷却至室温，过滤后保存在洁净的玻璃瓶中密封保存；

2、胶体金标记羊抗人IgG：量取100mL胶体金于洁净的烧杯中，搅拌均匀，使用0.2MK₂CO₃调pH至9.0，随后缓慢滴加0.5mg的羊抗鼠IgG，反应10min；再缓慢加入10mL浓度为10％(w/v)BSA，搅拌反应10min，再以18000g的离心力离心30min，去上清液，加入1％BSA重悬溶解后再次同以18000g的离心力离心30min，去上清液，加入保存液(2mM硼酸，含1％(w/v)BSA，5％(w/v) 蔗糖，0.045％(v/v)ProClin300,0.05％(v/v)Tween20,pH8.2)重悬复溶至体积1mL，作为免疫金浓缩液。

3.包被结合垫：将Fusion2聚酯膜切成25mm(宽)×300mm(长)的尺寸，将上述免疫金浓缩液用上述保存液稀释10倍，用HM3030型XYZ三维划膜喷金仪在结合垫上以5μL/cm的喷量喷金包被免疫金，之后在45℃鼓风干燥箱中干燥2h，装入铝箔袋中密封保存。。

4、包被硝酸纤维素膜(NC膜)：将鼠抗人IgG抗体用NC膜包被缓冲液 (0.01M PBS，5％海藻糖，pH7.4)稀释至0.5mg/mL，用HM3030型XYZ三维划膜喷金仪在NC膜的质控线(C线)位置以1μL/cm的包被量划C线；将用NC 膜包被缓冲液配制1mL检测线(T线)包被液，包被液含浓度为0.75mg/mL的幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A(CagA)重组蛋白，0.5mg/mL的空泡毒素 (VacA)重组蛋白，0.5mg/mL的尿素酶(Urease)重组蛋白，用HM3030型 XYZ三维划膜喷金仪在NC膜的T线位置以1μL/cm的包被量划T线；之后在45℃鼓风干燥箱中干燥2h，装入铝箔袋中密封保存。。

5、吸水垫剪裁：将吸水垫剪裁成25mm(宽)×300mm(长)的尺寸，装入铝箔袋密封保存。

6、检测卡的制备：将上述吸水垫、NC膜、结合垫依次粘贴在PVC底板上，制成大板，再用ZQ2002微电脑自动斩切机将大板裁成3.5mm宽的试纸条，再将试纸条装入检测卡上下夹片之间，制备成检测卡，装入铝箔袋中密封保存。

7、尿液标本的检测试验：用稀释液1与稀释液5(配方见下表1)分别稀释54份Hp血清抗体阳性的患者尿液样本，以及48份Hp血清抗体阴性的患者尿液样本，稀释比例为1:1，取稀释后的标本200μL加入到检测卡的加样孔中，室温反应15min，观察C、T线的显色情况。判断标准：C、T线均显色为阳性；仅C线显色为阴性；C线不显色为无效测试。

表1稀释液1、稀释液5配方构成表

8、结果分析

①稀释液1测试结果四格表与符合率

表2稀释液1四格表数据

稀释液1测试结果的阳性符合率为77.8％，阴性符合率为66.7％，总符合率为72.3％。

②稀释液5测试结果四格表与符合率

表3稀释液1四格表数据

稀释液5测试结果的阳性符合率为96.3％，阴性符合率为93.8％，总符合率为95.1％。

9、上述结果表明：在胶体金免疫层析试验方案中，优化后的稀释液5配方具有明显提高检测试验的灵敏度和特异度的效果，解决了常规配方的假阳性、假阴性问题，检测试验的阳性符合率与阴性符合率均能达到90％以上。

实施例2、幽门螺杆菌尿液抗体检测试剂盒(酶联免疫法)的制备与检测尿液标本

1、96孔板(广州洁特公司，高结合力)的包被

取100μg幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A(CagA)重组蛋白，50μg幽门螺杆菌空泡毒素(VacA)重组蛋白，50μg幽门螺杆菌尿素酶(Urease)重组蛋白加入到100mL碳酸盐缓冲液(0.05M CB，pH9.6)中，充分混匀后，在 96孔板中包被，每孔包被100μL，将包被板放入冰箱，在2～8℃环境下包被过夜。

2、包被板封闭

用洗涤液(0.01M PBS，含0.05％Tween20,pH7.2)洗板2次，每孔加入 150μL封闭液封闭，在室温(20～28℃)下封闭1h。封闭液成分为：1％(w/v) BSA，含3％(w/v)蔗糖，0.045％(v/v)ProClin300。

3、包被板干燥、置袋

封闭完成后，吸去封闭液，将封闭好的包被板放入鼓风干燥箱，37±2℃鼓风干燥2h。将干燥后的包被板装入铝箔袋，放入干燥剂，密封后于2～8℃保存。

4、尿液标本的检测试验

①标本孵育：用稀释液1～5(配方见下表4)分别稀释54份Hp血清抗体阳性的患者尿液样本(S-P)，以及48份Hp血清抗体阴性的患者尿液样本(S-N)，稀释比例为11倍，取各稀释后的标本100μL加入到包被板中，同时加入阳性对照(PC)、阴性对照(NC)和临界值对照(CO)，37℃反应30min；

表4稀释液1～5的配方构成表

②酶标孵育：先用洗涤液洗涤3次包被板，每次300μL洗涤液，吸去洗涤液；将HRP-羊抗人IgG稀释至1μg/mL，每孔100μL加入到包被板中，37℃反应 30min；

③TMB孵育：先用洗涤液洗涤3次包被板，每次300μL洗涤液，吸去洗涤液；每孔加入TMB底物100μL，37℃反应30min；

④终止与读值：每孔加入0.5M硫酸终止液100μL终止反应，在450nm处测吸光度OD值；以检测结果S/CO≥1判为阳性，S/CO＜1判为阴性。

⑤结果分析：分析不同缓冲液稀释尿液标本的检测结果，统计与血清学抗体检测结果，统计阳性符合率、阴性符合率以及总符合率，另外评价所有阳性患者标本结果和阴性患者标本OD值之和的P/N。

5、结果分析

①稀释液1的测试结果四格表与符合率

表5稀释液1四格表数据

稀释液1的测试结果阳性符合率为85.2％，阴性符合率为72.9％，总符合率为79.1％。P/N＝4.78。

②稀释液2的测试结果四格表与符合率

表6稀释液2四格表数

稀释液2的测试结果阳性符合率为87.0％，阴性符合率为81.3％，总符合率为84.2％。P/N＝6.53。

③稀释液3的测试结果四格表与符合率

表7稀释液3四格表数

稀释液3的测试结果阳性符合率为92.6％，阴性符合率为91.7％，总符合率为92.2％。P/N＝9.64。

④稀释液4的测试结果四格表与符合率

表8稀释液4四格表数

稀释液4的测试结果阳性符合率为96.3％，阴性符合率为95.8％，总符合率为96.1％。P/N＝13.01。

⑤稀释液5的测试结果四格表与符合率

表9稀释液5四格表数

稀释液5的测试结果阳性符合率为96.3％，阴性符合率为97.9％，总符合率为97.1％。P/N＝16.93。

图1和图2分别是以实施例2的上述试验数据做的OD值分布图，横坐标代表不同的稀释液，纵坐标为检测结果的OD值分布情况；

其中，图1为不同稀释液配方稀释阳性标本检测结果OD值分布情况，可以看出，优化后的配方阳性标本实验结果OD值没有下降，相反有增敏的效果，即检测结果OD值有所升高；

图2为不同稀释液配方稀释阴性标本检测结果OD值分布情况，可以看出，优化后的配方阴性标本实验结果OD值明显下降，有的阻断非特异反应的效果，检测结果OD值明显下降。

6、上述结果表明：在ELISA方案中，优化后的稀释液2～5配方具有提高检测试验的灵敏度和特异度的作用，不同程度的改善了假阳性、假阴性问题。稀释液5检测试验的阳性符合率与阴性符合率均达到95％以上。

Claims

1.一种增敏阻断缓冲液，包含缓冲液、0.2％～10％(v/v)乙醇、0.1％～5％(w/v)PEG6000、0.1％(v/v)Tween20、0.045％(v/v)ProClin 300。

2.根据权利要求1所述的增敏阻断缓冲液，还包括0.01％～0.5％(w/v)羧甲基纤维素钠(M.W.90000)。

3.根据权利要求2所述的增敏阻断缓冲液，还包括0.005％～0.25％(w/v)泊洛沙姆188。

4.根据权利要求2所述的增敏阻断缓冲液，还包括0.05％～5％(w/v)的甜菜碱。

5.根据权利要求1-4任一项所述的增敏阻断缓冲液，所述缓冲液为pH5.8～8.0的磷酸缓冲盐溶液、pH6.8～8.2的HEPES缓冲盐溶液、pH6.1～7.5的PIPES缓冲盐溶液、pH6.5～7.9的MOPS缓冲盐溶液、pH7.1～9.0的Tris缓冲盐溶液。

6.一种ELISA检测试剂盒，一种免疫层析检测试剂盒，包括权利要求1-5任一项所述的增敏阻断缓冲液。

7.权利要求1-5任一项所述的增敏阻断缓冲液在制备幽门螺杆菌尿液抗体检测试剂盒中的用途。