CN113917141A - 一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡及其制备方法，其中布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡，包括外壳和配套使用的样品稀释液，外壳内装配有试纸条，试纸条包括PVC底板，PVC底板上黏贴有样品垫、标记垫、包被膜和吸水垫，标记垫为玻璃纤维素膜，包被有有重组链球菌G蛋白与乳胶微球的偶联标记物；包被膜为硝酸纤维素膜，包被膜上涂设有一条包被有布氏杆菌脂多糖的检测线和一条包被有小鼠抗His标签单克隆抗体的质控线，本发明中的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡的制备成本低廉、方便快速，并且无需设备仪器及不需要专业人员的特点，可同时适用于牛、羊、猪血清或血液样品中布氏杆菌抗体的检测，提高使用范围。

Description

一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡及其制备方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体的说，涉及一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡及其制备方法。
背景技术
布氏杆菌（Brucella）是一种细胞内寄生小球杆状菌，革兰氏染色阴性，无荚膜，触酶、氧化酶阳性，可以在很多种家畜体内存活；布氏杆菌病（以下简称布病）是由布氏杆菌属细菌引起的人兽共患传染病，动物布病以羊、牛居多，其临床主要特征是母畜流产、乳腺炎，以及家畜不育和各种组织（如睾丸、关节）炎症。
布病在国内外广泛流行，至今已有170多个国家和地区报道发生过布病，严重威胁了人类健康和影响畜牧业发展，是国际贸易检疫中必检的传染病；布病在我国流行已久，被列为二类动物疫病，经多年防治，到20世纪80年代中后期得到有效控制。
但近年来，该病在我国北方大部分地区呈现反弹趋势，尤其是2000年以后，人间布病成为报告发病数上升速度最快的传染病之一，2015年人间布病已列全国甲、乙传染病发病顺位第7位，防控形势严峻；我国人间布病疫情主要分布于畜牧业较为发达的北方地区，且人间布病的发生与动物布病的发生呈现出明显的正相关性，所以从源头上控制畜间布病是减少人间病例最有效、最根本的措施，因而建立快速、有效的诊断方法迫在眉睫。
对于动物布氏杆菌病的诊断，相对病原学方法而言，血清学方法因其具有快速、简便、费用低等优点，目前仍然是动物布氏杆菌病诊断最常用的诊断方法。
根据GB/T 18646-2018国标中规定，虎红平板凝集试验抗原、乳牛全乳环状试验适用于家畜布病田间筛选试验和乳牛场布病的监测及诊断泌乳母牛布病的初筛试验，但是目前这几种方法存在操作不够简便、主观性太强和不适合高通量检测等缺点，逐渐被敏感性高、特异性强的ELISA方法、荧光偏振试验(FPA)等新的检测技术所取代。
但是ELISA方法和荧光偏振试验(FPA)技术均存在操作繁琐、耗时长、需要精密仪器设备、对操作人员要求较高，必须在实验室内进行，具有很大的局限性，因此，临床上急需一种简便、快速、敏感性和特异性也较高，又适于临床高通量检测的诊断方法来替代现有的布氏杆菌病初筛方法。
其中免疫层析技术因其具有简便、快速、敏感、特异、无需特殊仪器等优点而适于疫区现场大规模筛查和普查。
目前，市售的布氏杆菌抗体检测卡在原料的选择方面，采用的是鼠抗牛IgGFc 端的单克隆抗体或鼠抗羊IgGFc 端的单克隆抗体，灵敏度较低，成本较高，并且该检测卡仅仅适用于单独检测牛或羊来源的布氏杆菌抗体，不能同时作为检测牛、羊和猪等动物来源的样品的布氏杆菌抗体；另外，市售的布氏杆菌抗体检测卡中又以胶体金方法是最常见的，但是胶体金的烧制容易出现颗粒不均匀的现象，导致产品质量不稳定，均一性差，灵敏度相对较差。
发明内容
本发明要解决的主要技术问题是提供一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡及其制备方法，能够解决目前制备布氏杆菌抗体检测卡用的原料成本太高的问题；解决目前布氏杆菌抗体检测卡适用范围较窄的问题；解决传统的胶体金检测卡制备过程中胶体金的烧制容易出现颗粒不均匀的现象，导致产品质量不稳定，均一性差的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡，包括外壳和配套使用的样品稀释液，外壳内装配有试纸条，试纸条包括PVC底板，PVC底板上黏贴有样品垫、标记垫、包被膜和吸水垫，标记垫为玻璃纤维素膜，包被有有重组链球菌G蛋白与乳胶微球的偶联标记物；包被膜为硝酸纤维素膜，包被膜上涂设有一条包被有布氏杆菌脂多糖的检测线和一条包被有小鼠抗His标签单克隆抗体的质控线。
以下是本发明对上述技术方案的进一步优化：
样品稀释液包括基液，基液中加入有质量百分数为0.05%的NaN3，基液中还加入有体积百分数为0.5%的海藻糖溶液和0.5%的Tween-20；
所述基液为Tris溶液，Tris溶液的浓度为0.1mol/L，Tris溶液的 pH值为7.2。
进一步优化：外壳上开设有观察窗和加样孔，试纸条装配在外壳内后，包被膜位于观察窗位置处、样品垫位于加样孔位置处，外壳上设置有标记:“C”和“T”，标记“C”与质控线相对应，标记“T”与检测线相对应。
本发明还公开了一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳胶微球的处理：在乳胶微球清洗液中加入有质量百分数为0.05%的乳胶微球，在2～8℃条件下离心15分钟，离心速度为13000 r/min，弃上清，沉淀物中加入有与乳胶微球清洗液相同体积的清洗液重悬，重复清洗1次，悬浮后的乳胶微球溶液中，先加入浓度为20mg/mL的NHS溶液，再加入浓度为20mg/mL的EDC溶液，NHS溶液与悬浮后的乳胶微球溶液的体积比为1:20；EDC溶液与悬浮后的乳胶微球溶液的体积比为1:100；而后震荡15分钟，震荡速度为140～150 r/min；震荡完成后在2～8℃的条件下离心15分钟，离心速度为13000r/min，弃上清，沉淀物中加入原乳胶微球清洗液体积的乳胶微球保存液重悬；
S2、蛋白标记：在处理好的乳胶微球中按乳胶微球质量的1/10加入重组链球菌G蛋白，在室温震荡1小时，震荡速度为140～150 r/min，然后加入原乳胶微球清洗液1/10体积的封闭液，并在室温震荡30分钟，震荡速度为140～150 r/min；震荡完成后，在2～8℃的条件下离心15分钟，离心速度为13000 r/min，弃上清，沉淀物中加入原乳胶微球清洗液2.5倍体积的复溶液复溶；
S3、标记垫的制备：标记垫为玻璃纤维素膜，将步骤S2中复溶后的蛋白溶液在玻璃纤维素膜上进行铺垫，而后在37℃的室温中干燥2小时，即获得标记垫。
以下是本发明对上述技术方案的进一步优化：
该制备方法还包括：
S4、包被膜的制备：选择硝酸纤维素膜作为包被膜，将布氏杆菌脂多糖用划膜液稀释至浓度为0.8mg/mL，用于检测线划线；将小鼠抗His标签单克隆抗体用划膜液稀释至浓度为1.5mg/mL，用于质控线划线；采用三维划膜喷金仪依次以1μL/cm的浓度在硝酸纤维素膜上进行检测线和质控线的划线，而后在37℃的环境中烘干包被2小时，即获得包被膜。
进一步优化：该制备方法还包括：
S5、样品稀释液制备：样品稀释液的配方包括基液，基液中加入有质量百分数为0.05%的NaN3，基液中还加入有体积百分数为0.5%的海藻糖溶液和0.5%的Tween-20；
基液为Tris溶液，所述Tris溶液的浓度为0.1mol/L，Tris溶液的pH值为 7.2；
S6、检测卡的组装：将包被膜、标记垫、样品垫、吸水垫依次贴于PVC底板上，制得试纸条，将试纸条装入外壳中，得到布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡；
S7、包装：将组装好的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡连同干燥剂装入铝箔袋中密封，贴签，而后将样品稀释液管放入外包装盒内。
进一步优化：乳胶微球清洗液的配方为：pH值为6.1、浓度为25mmol/L的MES溶液。
进一步优化：乳胶微球保存液的配方为：pH值为8.5、浓度为25mmol/L的MES溶液。
进一步优化：封闭液的配方包括水，水中加入有质量百分数为1.0%的BSA；
复溶液的配方包括：pH 值为8.5、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液，Tris缓冲液中加入有质量百分数为：15%的蔗糖、1%的BSA、0.03%的PVP、0.03%的PEG20000和0.05%的NaN3，Tris缓冲液中还加入有体积百分数为0.3%的Tween-20。
进一步优化：划膜液的配方成分为：pH值为8.5、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液，Tris缓冲液中加入有质量百分数为1%的蔗糖。
本发明采用上述技术方案，具有如下有益效果：
本发明中的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡的制备成本低廉、方便快速及无需设备仪器及不需要专业人员的特点；可同时适用于牛、羊、猪血清或血液样品中布氏杆菌抗体的检测，提高使用范围。
本发明中的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡在制备过程中首次采用乳胶微球代替胶体金进行标记，能够使检测卡的制备工艺可重复性更好、灵敏度更高、稳定性更强。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
附图说明
图1为本发明实施例1的总体结构示意图；
图2为本发明实施例1中试纸条的结构示意图；
图3为本发明实施例1中检测卡在使用时阳性结果判定图；
图4为本发明实施例1中检测卡在使用时强阳性结果判定图；
图5为本发明实施例1中检测卡在使用时弱阴性结果判定图；
图6为本发明实施例1中检测卡在使用时只有检测线显示的无效结果判定图；
图7为本发明实施例1中检测卡在使用时无效结果判定图；
图8为本发明实施例2中不同标记pH值的实验结果；
图9为本发明实施例3中不同蛋白标记量的实验结果；
图10为本发明实施例4中不同封闭液配方的实验结果；
图11为本发明实施例5中不同复溶液的实验结果；
图12为本发明实施例6中不同划膜液的实验结果；
图13为本发明实施例7中检测线最佳划线浓度的实验结果；
图14为本发明实施例8中质控线最佳划线浓度的实验结果；
图15为本发明实施例9中敏感性的检测结果；
图16为本发明实施例10中特异性的检测结果；
图17为本发明实施例11中第一次批内重复试验的实验结果图；
图18为本发明实施例11中第二次批内重复试验的实验结果图；
图19为本发明实施例11中第三次批内重复试验的实验结果图；
图20为本发明实施例11中第一次批间重复试验的实验结果图；
图21为本发明实施例11中第二次批间重复试验的实验结果图；
图22为本发明实施例11中第三次批间重复试验的实验结果图；
图23为本发明实施例11中第四次批间重复试验的实验结果图。
图中：1-样品垫；2-PVC底板；3-标记垫；4-检测线（T线）；5-质控线（C线）；6-包被膜；7-吸水垫；8-外壳；81-观察窗；82-加样孔。
具体实施方式
实施例：请参阅图1-2，一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡，包括外壳8和配套使用的样品稀释液，所述外壳8内装配有试纸条。
所述试纸条包括PVC底板2，所述PVC底板2上由PVC底板2的一侧向另一次依次黏贴由样品垫1、标记垫3、包被膜6和吸水垫7。
所述包被膜6为硝酸纤维素膜。
在本实施例中，所述包被膜6采用Sartorius公司生产的型号为CN140的硝酸纤维素膜。
所述包被膜6上涂设有检测线4和质控线5，所述检测线4涂设在靠近标记垫3的位置处，所述质控线5涂设在靠近吸水垫7的位置处。
所述检测线4上包被有布氏杆菌脂多糖（LPS），所述质控线5上包被有小鼠抗His标签单克隆抗体。
在本实施例中，所述布氏杆菌脂多糖（LPS）是由“西宝生物科技（上海）股份有限公司”生产的，并且能够在市面上购买获得。
在本实施例中，所述小鼠抗His标签单克隆抗体是由“洛阳佰奥通实验材料中心”生产的，并且能够在市面上购买获得。
所述标记垫3为玻璃纤维素膜，包被有重组链球菌G蛋白与乳胶微球的偶联标记物。
在本实施例中，所述标记垫3采用型号为8964的玻璃纤维素膜。
所述外壳8上靠近试纸条的包被膜6的位置处开设有观察窗81。
所述试纸条装配在外壳8内后，所述包被膜6位于观察窗81位置处。
所述外壳8上位于观察窗81的两侧分别设置有标记:“C”和“T”，所述标记“C”与质控线5相对应，所述标记“T”与检测线4相对应。
所述外壳8上靠近试纸条的样品垫1的位置处开设有加样孔82。
所述试纸条装配在外壳8内后，所述样品垫1位于加样孔82位置处。
所述样品稀释液包括基液，基液中加入有质量百分数为0.05%的NaN3，基液中还加入有体积百分数为0.5%的海藻糖溶液和0.5%的Tween-20；
所述基液为Tris(三羟甲基氨基甲烷)溶液，所述Tris溶液的浓度为0.1mol/L，所述Tris溶液的 pH值为7.2。
本发明还公开了一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
S1、乳胶微球的处理：在乳胶微球清洗液中加入有质量百分数为0.05%的乳胶微球，并在环境温度为2～8℃的条件下进行离心工序，采用离心机进行离心工序，所述离心速度为13000 r/min，离心时间为15分钟，弃上清，沉淀物中加入有与乳胶微球清洗液相同体积的清洗液重悬，重复清洗1次。
在上述悬浮后的乳胶微球溶液中，先加入浓度为20mg/mL的NHS（N-羟基丁二酰亚胺）溶液，再加入浓度为20mg/mL的EDC（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酸氢二亚胺盐酸盐）溶液；NHS溶液与悬浮后的乳胶微球溶液的体积比为1:20；EDC溶液与悬浮后的乳胶微球溶液的体积比为1:100。
而后在室温中进行震荡，所述震荡速度为140～150 r/min，所述震荡时间为15分钟。
震荡完成后，在环境温度为2～8℃的条件下采用离心机进行离心工序，所述离心速度为13000 r/min，离心时间为15分钟，弃上清，获得沉淀物，在沉淀物中加入原乳胶微球清洗液体积的乳胶微球保存液重悬。
所述步骤S1中，乳胶微球的平均直径为100nm。
所述乳胶微球可由市面上直接购买获得。
所述步骤S1中，乳胶微球清洗液的配方为：pH值为6.1、浓度为25mmol/L的MES溶液。
所述步骤S1中，乳胶微球保存液的配方为：pH值为8.5、浓度为25mmol/L的MES（2-(N-吗啡啉）乙磺酸）溶液。
S2、蛋白标记：在处理好的乳胶微球中按乳胶微球质量的1/10加入重组链球菌G蛋白，而后在室温环境下进行震荡，震荡速度为140～150 r/min，震荡时间为1小时，然后加入原乳胶微球清洗液1/10体积的封闭液，并在室温环境下继续震荡，所述震荡速度为140～150 r/min，震荡时间为30分钟。
震荡完成后，在环境温度为2～8℃的条件下采用离心机进行离心工序，所述离心速度为13000 r/min，离心时间为15分钟，弃上清，获得沉淀物，在沉淀物中加入原乳胶微球清洗液2.5倍体积的复溶液复溶。
所述步骤S2中，乳胶微球与标记用的重组链球菌G蛋白的质量比为10:1。
所述步骤S2中，封闭液的配方包括水，水中加入有质量百分数为1.0%的BSA（牛血清白蛋白）。
所述步骤S2中，乳胶微球清洗液的体积与封闭液的体积比为10:1。
所述步骤S2中，复溶液的配方包括：pH 值为8.5、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液，Tris缓冲液中加入有质量百分数为：15%的蔗糖、1%的BSA、0.03%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、0.03%的PEG20000和0.05%的NaN3，Tris缓冲液中还加入有体积百分数为0.3%的Tween-20。
所述步骤S2中，乳胶微球清洗液的体积与复溶液的体积比为1:2.5。
在本实施例中，重组链球菌G蛋白能够在市面上购买的获得。
S3、标记垫的制备：所述标记垫3为玻璃纤维素膜，将步骤S2中复溶后的蛋白溶液在玻璃纤维素膜上进行铺垫，而后放置在37℃的室温环境中干燥2小时，即获得标记垫3，然后将标记垫3密封于锡箔袋内，常温保存备用。
所述步骤S2中，标记垫3上包被有重组链球菌G蛋白与乳胶微球的偶联标记物。
S4、包被膜的制备：选择硝酸纤维素膜作为包被膜，将布氏杆菌脂多糖（LPS）用划膜液稀释至浓度为0.8mg/mL ，用于检测线4（T线）划线。
将小鼠抗His标签单克隆抗体用划膜液稀释至浓度为1.5mg/mL，用于质控线5（C线）划线。
采用三维划膜喷金仪依次以1μL/cm的浓度在硝酸纤维素膜上进行检测线4和质控线5的划线。
划线完成后将其放置在37℃的环境中烘干包被2小时，即获得包被膜6，将包被膜6密封于锡箔袋内，常温保存备用。
所述三维划膜喷金仪的型号为HM3030。
所述步骤S4中，包被膜6上的质控线5（C线）上包被有小鼠抗His标签单克隆抗体；检测线4（T线）上包被有布氏杆菌脂多糖（LPS）。
所述步骤S4中，划膜液的配方成分为：pH值为8.5、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液，内含1%的蔗糖。
S5、样品稀释液制备：样品稀释液的配方包括基液，基液中加入有质量百分数为0.05%的NaN3，基液中还加入有体积百分数为0.5%的海藻糖溶液和0.5%的Tween-20。
所述基液为Tris溶液，所述Tris溶液的浓度为0.1mol/L，所述Tris溶液的pH值为7.2。
所述稀释液制备完成后，将稀释液装入稀释液管中。
在本实施例中，所述样品稀释液的具体配方为：pH值为8.5、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液100mL，Tris缓冲液中加入0.5g的海藻糖、0.5mL的Tween-20和0.05g 的NaN3。
S6、检测卡的组装：将包被膜6、标记垫3、样品垫1、吸水垫7依次贴于PVC底板2上，然后采用切条机进行切条，获得试纸条，将试纸条装入外壳8中，即得到布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡。
S7、包装：将组装好的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡连同干燥剂装入铝箔袋中密封，贴签，而后将样品稀释液管放入外包装盒内。
本发明还提供一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡的使用方法，该使用方法的步骤如下：
（1）在牲畜身上采取血清，将该血清装入一次性滴管中，采用一次性滴管向稀释液管中滴加2-3滴血清，搅拌均匀后，取混合液检测。
（2）将未开封的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡和检测样品恢复至室温。
（3）将布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡水平放置，用滴管向布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡的加样孔82缓慢逐滴加入4-5滴不含气泡的检测液。
（5）加样品液后，红色的液体从靠近加样孔82的观察窗81边缘涌出，朝另一方向流动。
（6）5~15分钟判断结果，15分钟后的结果仅作参考。
结果判断：如图3-图7所示，阳性：质控线5显示红色色带，检测线4也显示红色色带，无论颜色深浅均判为阳性。
阴性：质控线5显示红色色带，检测线4不显示红色色带，判为阴性。
无效：质控线5不显示红色色带，无论检测线4是否显示红色色带，该布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡均判为无效。
实施例2：在上述实施例1中，最佳蛋白标记pH值的确定：在乳胶微球的蛋白标记过程中，分别采用pH值为8.0、8.5和9.0的MES溶液进行标记，比较不同pH值对该布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡特异性和敏感性的影响，从而确定最佳蛋白标记pH值，实验结构如下表和图8所示。
下表为不同标记pH值的实验结果：
Figure 539390DEST_PATH_IMAGE001
上表中，“+”表示阳性；“-”表示阴性。
根据上表和图8可以看出，pH值为8.5时本发明中的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡检测线4敏感性较好，检测线4显色较好，pH值为8.0和 pH值为9.0时敏感性较差，均有假阴性出现，因此根据实验结果选择标记pH值为8.5。
实施例3，在上述实施例1中，最佳蛋白标记量的选择：在乳胶微球的蛋白标记过程中，分别采用标记蛋白与乳胶微球质量比例为1:15、1:10、1:5的比例进行标记，实验结构如下表和图9所示。
下表为不同蛋白标记量的实验结果：
Figure 140005DEST_PATH_IMAGE002
上表中，“+”表示阳性；“-”表示阴性。
根据上表和图9可以看出，标记蛋白与乳胶微球的质量比例为1:15时，敏感性较差，检测线显色较弱；质量比例为1:10时敏感性和特异性均较好，质量比例为1:5时本发明中的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡显色效果较1:10时无明显变化，因此根据实验结果最终选择标记蛋白与乳胶微球质量比例为1:10。
实施例4：在上述实施例1中，最佳封闭液配方的选择：采用终浓度为0.5%、1.0%、1.5%BSA溶液作为封闭液对标记蛋白后的乳胶微球进行封闭，实验结构如下表和图10所示。
下表为：不同封闭液配方的实验结果：
Figure 961330DEST_PATH_IMAGE003
上表中：“+”表示阳性；“-”表示阴性。
根据上表和图10可以看出，BSA溶液终浓度为0.5%时，特异性较差，有假阳性出现；BSA溶液终浓度为1%时敏感性和特异性均较好；BSA溶液终浓度为1.5%时敏感性相对较差，检测线显色较弱，因此根据实验结果最终选择BSA溶液终浓度为1.0%。
实施例5：在上述实施例1中，最佳复溶液的选择：采用不同复溶液进行复溶，复溶液配方如下表所示，根据不同复溶液配方对本发明中的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡特异性和敏感性的影响，确定最佳复溶液配方。
下表为：不同复溶液的配方：
Figure 372720DEST_PATH_IMAGE004
不同复溶液配方对本发明中的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡特异性和敏感性的影响，实验结构如下表和图11所示。
下表为：不同复溶液的实验结果：
Figure 545075DEST_PATH_IMAGE005
上表中，“+”表示阳性；“-”表示阴性。
根据上表和图11可以看出，从特异性方面来看，4组复溶液均无假阳性出现；从敏感性方面来看，复溶液3敏感性最高，检测线显色最好，所以，最终选用复溶液3，作为本产品的复溶液。
实施例6： 上述实施例1中，最佳划膜液配方的选择：采用不同的划膜液配方（如下表所示），将布氏杆菌脂多糖（LPS）稀释至0.8mg/mL，用于检测线4（T线）的划线，将小鼠抗His标签单克隆抗体稀释至1.5mg/mL用于质控线5（C线）的划线；根据不同划膜液配方对检测特异性和敏感性的影响，确定最佳划膜液配方。
下表为3种不同划膜液的配方：
Figure 182337DEST_PATH_IMAGE006
不同划膜液配方对检测特异性和敏感性的影响，实验结构如下表和图12所示。
下表为：不同划膜液的实验结果：
Figure 123748DEST_PATH_IMAGE007
上表中：“+”表示阳性；“-”表示阴性。
根据上表和图12可以看出，待选的3种缓冲体系中TRIS缓冲体系敏感性相对于PBST缓冲液体系和PBS缓冲液体系的敏感性和特异性均较好，其中，PBS缓冲液体系敏感性较差，检测线显色较弱；PBST缓冲体系特异性较差，有假阳性出现，因此，最终选择pH值为8.5的TRIS缓冲体系（浓度0.01mol/L）作为最佳划膜液配方。
实施例7： 上述实施例1中，检测线最佳划线浓度的确定：将布氏菌脂多糖（LPS）的浓度分别设为0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL用于检测线4（T线）划线，检测本发明中的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡的特异性和敏感性，确定检测线最佳划线浓度，实验结构如下表和图13所示。
下表为：检测线最佳划线浓度的实验结果：
Figure 971618DEST_PATH_IMAGE008
上表中：“+”表示阳性；“-”表示阴性。
根据上表和图13可以看出，布氏菌脂多糖（LPS）浓度为0.4mg/mL时敏感性较差，有假阴性；0.6mg/mL时检测线颜色较弱；0.8mg/mL时，敏感性较高，检测线显色较深；1.0mg/mL时检测线颜色相对0.8 mg/mL时显色效果无明显变化，所以，最终选择0.8mg/mL作为检测线的划线浓度。
实施例8：上述实施例1中，质控线最佳划线浓度的确定：将小鼠抗His标签单克隆抗体的浓度分别设为1.0mg/mL、1.25mg/mL、1.5mg/mL、1.75mg/mL用于质控线5（C线）划线。
检测线4（T线）用布氏菌脂多糖（LPS）进行划线，布氏菌脂多糖（LPS）的浓度设定为0.8mg/mL，划线量均为1µL/cm，划线完成后放置在37℃鼓风干燥箱2小时，观察质控线5的实验情况，确定质控线5最佳划线浓度，实验结构如下表和图14所示。
下表为：质控线5最佳划线浓度的实验结果：
Figure 365690DEST_PATH_IMAGE009
根据上表和图14可以看出，小鼠抗His标签单克隆抗体浓度为1.0mg/mL和1.25mg/mL时质控线5颜色较弱；1.5mg/mL时，质控线5显色较深；1.75mg/mL时质控线5显色相对1.5mg/mL时无明显变化，因此，最终选择1.5mg/mL作为质控线5的划线浓度，结果如表11和图8所示。
实施例9：敏感性检测：对布氏杆菌血清样品依次倍比稀释至1000IU/mL、500IU/mL、250IU/mL、125IU/mL、62.5IU/mL、31.3IU/mL、15.6IU/mL、7.8IU/mL和3.9IU/mL，而后采用本发明中的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡进行检测，检测结构如下表和图15所示。
下表为：敏感性检测结果：
Figure 58840DEST_PATH_IMAGE010
上表中“+”表示布氏杆菌抗体阳性，“-”表示布氏杆菌抗体阴性。
根据上表和图15可以看出，血清样品稀释至15.6IU/mL时检测结果均为阳性。
实施例10：特异性试验：采用本发明中的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡对布氏杆菌抗体阴性血清（牛源）（N1）、布氏杆菌抗体阴性血清（羊源）（N2）、布氏杆菌抗体阴性血清（猪源）（N3）、大肠杆菌O:157阳性血清（N4）、小肠结肠炎耶尔森菌O:9阳性血清（N5）、乙型副伤寒杆菌(S.paratyphi B)（N6）、沙门氏菌(S.E.)（N7）进行检测，检测结构如下表和图16所示。
下表为：特异性检测结果：
Figure 838446DEST_PATH_IMAGE011
上表中：“-”表示布氏杆菌抗体阴性。
根据上表和图16可以看出，采用本发明中的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡对布氏杆菌抗体阴性血清（牛源）、布氏杆菌抗体阴性血清（羊源）、布氏杆菌抗体阴性血清（猪源）、大肠杆菌O:157阳性血清、小肠结肠炎耶尔森菌O:9阳性血清、乙型副伤寒杆菌(S.paratyphi B)、沙门氏菌(S.E.)的检测结构均为阴性，因此本发明中的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡能够满足特异性要求。
实施例11：重复性试验：（1）批内重复试验：
采用同一批次本发明中的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡随机抽取5盒，对已知的30份布氏杆菌阳性血清样品和阴性血清样品进行检测，每个样品重复检测4次，检测结构如图17-图19所示。
所述图17-图19中，“+”表示阳性，“-”表示阴性；根据图17-图19可以看出，30份已知阳性样品均为阳性，30份已知阴性样品均为阴性。
（2）批间重复试验：采用3个批次本发明中的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡，每批随机抽取5盒，对已知的30份布氏杆菌抗体阳性血清样品和阴性血清样品进行检测，每个样品做4重复，检测结构如图20-图23所示。
所述图20-图23中，“+”表示阳性，“-”表示阴性。根据图20-图23可以看出，30份已知阳性样品均为阳性，30份已知阴性样品均为阴性。
对于本领域的普通技术人员而言，根据本发明的教导，在不脱离本发明的原理与精神的情况下，对实施方式所进行的改变、修改、替换和变型仍落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡，包括外壳（8）和配套使用的样品稀释液，外壳（8）内装配有试纸条，试纸条包括PVC底板（2），PVC底板（2）上黏贴有样品垫（1）、标记垫（3）、包被膜（6）和吸水垫（7），其特征在于：标记垫（3）为玻璃纤维素膜，包被有有重组链球菌G蛋白与乳胶微球的偶联标记物；包被膜（6）为硝酸纤维素膜，包被膜（6）上涂设有一条包被有布氏杆菌脂多糖的检测线（4）和一条包被有小鼠抗His标签单克隆抗体的质控线（5）。
2.根据权利要求1所述的一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡，其特征在于：样品稀释液包括基液，基液中加入有质量百分数为0.05%的NaN3，基液中还加入有体积百分数为0.5%的海藻糖溶液和0.5%的Tween-20；
所述基液为Tris溶液，Tris溶液的浓度为0.1mol/L，Tris溶液的 pH值为7.2。
3.根据权利要求2所述的一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡，其特征在于：外壳（8）上开设有观察窗（81）和加样孔（82），试纸条装配在外壳（8）内后，包被膜（6）位于观察窗（81）位置处、样品垫（1）位于加样孔（82）位置处，外壳（8）上设置有标记:“C”和“T”，标记“C”与质控线（5）相对应，标记“T”与检测线（4）相对应。
4.如权利要求1-3任一项所述的一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、乳胶微球的处理：在乳胶微球清洗液中加入有质量百分数为0.05%的乳胶微球，在2～8℃条件下离心15分钟，离心速度为13000 r/min，弃上清，沉淀物中加入有与乳胶微球清洗液相同体积的清洗液重悬，重复清洗1次，悬浮后的乳胶微球溶液中，先加入浓度为20mg/mL的NHS溶液，再加入浓度为20mg/mL的EDC溶液，NHS溶液与悬浮后的乳胶微球溶液的体积比为1:20；EDC溶液与悬浮后的乳胶微球溶液的体积比为1:100；而后震荡15分钟，震荡速度为140～150 r/min；震荡完成后在2～8℃的条件下离心15分钟，离心速度为13000 r/min，弃上清，沉淀物中加入原乳胶微球清洗液体积的乳胶微球保存液重悬；
S2、蛋白标记：在处理好的乳胶微球中按乳胶微球质量的1/10加入重组链球菌G蛋白，在室温震荡1小时，震荡速度为140～150 r/min，然后加入原乳胶微球清洗液1/10体积的封闭液，并在室温震荡30分钟，震荡速度为140～150 r/min；震荡完成后，在2～8℃的条件下离心15分钟，离心速度为13000 r/min，弃上清，沉淀物中加入原乳胶微球清洗液2.5倍体积的复溶液复溶；
S3、标记垫的制备：标记垫（3）为玻璃纤维素膜，将步骤S2中复溶后的蛋白溶液在玻璃纤维素膜上进行铺垫，而后在37℃的室温中干燥2小时，即获得标记垫（3）。
5.根据权利要求4所述的一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡的制备方法，其特征在于：该制备方法还包括：
S4、包被膜的制备：选择硝酸纤维素膜作为包被膜（6），将布氏杆菌脂多糖用划膜液稀释至浓度为0.8mg/mL，用于检测线（4）划线；将小鼠抗His标签单克隆抗体用划膜液稀释至浓度为1.5mg/mL，用于质控线（5）划线；采用三维划膜喷金仪依次以1μL/cm的浓度在硝酸纤维素膜上进行检测线（4）和质控线（5）的划线，而后在37℃的环境中烘干包被2小时，即获得包被膜（6）。
6.根据权利要求5所述的一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡的制备方法，其特征在于：该制备方法还包括：
S5、样品稀释液制备：样品稀释液的配方包括基液，基液中加入有质量百分数为0.05%的NaN3，基液中还加入有体积百分数为0.5%的海藻糖溶液和0.5%的Tween-20；
基液为Tris溶液，所述Tris溶液的浓度为0.1mol/L，Tris溶液的pH值为 7.2；
S6、检测卡的组装：将包被膜（6）、标记垫（3）、样品垫（1）、吸水垫（7）依次贴于PVC底板（2）上，制得试纸条，将试纸条装入外壳（8）中，得到布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡；
S7、包装：将组装好的布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡连同干燥剂装入铝箔袋中密封，贴签，而后将样品稀释液管放入外包装盒内。
7.根据权利要求6所述的一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡的制备方法，其特征在于：乳胶微球清洗液的配方为：pH值为6.1、浓度为25mmol/L的MES溶液。
8.根据权利要求7所述的一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡的制备方法，其特征在于：乳胶微球保存液的配方为：pH值为8.5、浓度为25mmol/L的MES溶液。
9.根据权利要求8所述的一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡的制备方法，其特征在于：封闭液的配方包括水，水中加入有质量百分数为1.0%的BSA；
复溶液的配方包括：pH 值为8.5、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液，Tris缓冲液中加入有质量百分数为：15%的蔗糖、1%的BSA、0.03%的PVP、0.03%的PEG20000和0.05%的NaN3，Tris缓冲液中还加入有体积百分数为0.3%的Tween-20。
10.根据权利要求9所述的一种布氏杆菌乳胶微球抗体检测卡的制备方法，其特征在于：划膜液的配方成分为：pH值为8.5、浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液，Tris缓冲液中加入有质量百分数为：1%的蔗糖。
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