CN112129942A - 一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条及其制备和应用 - Google Patents

一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条及其制备和应用，本发明的乳胶微球免疫层析试纸条通过优化乳胶微球抗体探针的制备，有效提高其检测鸡蛋样品的灵敏度，在保证产品灵敏度的前提下减少抗原、抗体的使用量，缩减检测耗时；通过调节样品垫配方以适应鸡蛋样品的检测要求，精简样品前处理步骤，仅通过一次提取吹干并复溶的步骤，即可完成样品前处理的操作；采用本发明的免疫层析试纸条对鸡蛋样品中残留TYL及TIM的检测，Cut‑Off值均能够达到8ng/g，灵敏度高，检测时间为5min，省时高效。

Description

一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条及其制备 和应用
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体地，涉及一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条及其制备和应用。
背景技术
泰乐菌素(Tylosin，TYL)和替米考星(Tilmicosin，TIM)均属于大环内酯类(Macrolides，MALs)药物，是禽畜专用抗生素。因其肠道吸收好，体内扩散快，血药浓度高，在临床上主要用于治疗和预防由支原体、金黄葡萄球菌、化脓杆菌等引起的各种呼吸道、肠道、生殖道和运动系统感染。其生物降解性很差，可以残留在动物食品中，例如牛奶，肉，蛋和蜂蜜等等，如果长期滥用或不合理使用这类药物，易引起过敏反应、听力减退，甚至肝肾的严重损害，对消费者健康造成威胁。根据我国发布国家标准GB 31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》中规定，两种药物在产蛋期均不可使用，因此作为一种高灵敏度的快速检测方法对于大量样品现场检测有着重要意义。
目前，国内外针对泰乐菌素和替米考星的检测方法有多种，包括含高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)在内的仪器分析方法、微生物法以及免疫分析法等等。仪器方法灵敏度高，特异性强，但需要昂贵的设备、专业的操作人员和繁琐的样品前处理，不适合大量样本的快速筛查；而免疫分析方法以其快速简单、成本低、灵敏度高、适合实际生产中现场监控及大规模样本筛查等优势，在食品中药物残留检测领域发展迅速。其中，免疫检测法目前应用最广泛的包括酶联免疫检测法(ELISA)以及免疫层析法(LFIAs)等。免疫层析法是将免疫和色谱层析技术相结合的检测方法，以标记物标记的抗体与目标待测物特异性结合为基础并通过标记物信号实现定性或定量的目的。该方法检测时间短，使用方便，前处理简单，且不需要专业培训过的人员即可简单的操作，成本低、携带十分方便，检测效果能满足需求，适合用于食品样品的现场检测。
针对TYL、TIM在食品样品中残留免疫层析检测方法主要为胶体金、荧光微球免疫层析法，暂未见关于乳胶微球免疫层析的相关报道，且绝大多数方法的Cut-Off值均较高，检测时间均超过了10min，公开号为CN102590516A的中国专利公开了一种检测TYL、TIL药物残留的免疫胶体金试纸条，可用于肌肉、肝脏和肾脏等组织中TIL、TYL药物残留的检测，但该方法需要通过反复多次提取的样品前处理的方式以达到降低基质效应的目的，前处理步骤较复杂，需多次提取，繁杂耗时，而且目前涉及样品主要包括肌肉、肝脏、蜂蜜以及牛奶等，关于鸡蛋样品中TYL、TIL的检测报道相对较少。因此，亟待开发一种高灵敏、高效、快速、简单的针对鸡蛋样品中TIL、TYL药物残留检测方法。
发明内容
本发明旨在提供一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条及其制备和应用，本发明的乳胶微球免疫层析试纸条通过优化乳胶微球抗体探针的制备，有效提高其检测鸡蛋样品的灵敏度，在保证产品灵敏度的前提下减少抗原、抗体的使用量，缩减检测耗时；通过调节样品垫配方以适应鸡蛋样品的检测要求，精简样品前处理步骤，仅通过一次提取吹干并复溶的步骤，即可完成样品前处理的操作；采用本发明的免疫层析试纸条对鸡蛋样品中残留TYL及TIM的检测，Cut-Off值均能够达到8ng/g，灵敏度高，检测时间为5min，省时高效。
本发明的首要目的是提供一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条。
本发明的另一目的是提供上述泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条的制备方法。
本发明的再一目的是提供一种利用上述试纸条检测鸡蛋样品中泰乐菌素及替米考星的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明提供了一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条，是由PVC板、样品垫、NC膜、吸水纸以及乳胶微球样品孔组成，所述乳胶微球样品孔中吸附了标记泰乐菌素单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液；
所述标记泰乐菌素单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液的制备包括以下步骤：
S1.溶解：向蓝色乳胶微球中加入pH 6.0的MES缓冲溶液，制备蓝色乳胶微球溶液；
S2.活化：在步骤S1溶液中加入0.5mg/mL EDC溶液、0.5mg/mL NHS溶液；200rpm反应15min，随后在2～4℃下10000～14000rpm，离心10～20min；
S3.标记：离心后去除上清液，加入0.01M PB溶液，再加入经0.01M PB稀释的泰乐菌素单克隆抗体溶液，200rpm反应1h；所述PB溶液的pH为7.4；
S4.封闭：在步骤S3反应后的溶液中加入20％(w/v)BSA溶液，200rpm反应3h，随后在2～4℃下10000～14000rpm，离心10～20min；
S5.复溶：去除上清液，加入复溶液，复溶液为pH 7.4的0.02M PB溶液，其中还含有0.5～1％Tween-20、3～5％海藻糖、0.5％BSA、0.3％PVP和0.03％procline-300。
本发明标记泰乐菌素单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液的制备过程中，通过对活化、标记的pH值及其时间，乳胶微球及抗体用量，抗体稀释液的选择，封闭时间以及抗体探针复溶液的配方优化，有效提高乳胶微球与泰乐菌素单克隆抗体的结合效率，影响标记的乳胶微球抗体探针在试纸条上的释放，通过对特定的抗体探针复溶液，提高标记效率和释放，使抗体探针可以有效与包被原或药物发生反应以提高灵敏度，保证效果的同时减少抗体原材料使用。
优选地，步骤S1所述MES缓冲溶液的浓度为0.05M。
优选地，步骤S1所述制备的蓝色乳胶微球溶液浓度为5mg/mL。
优选地，所述蓝色乳胶微球溶液、EDC溶液、NHS溶液的用量比为1mL：15μL：20μL。
优选地，步骤S3所述泰乐菌素单克隆抗体溶液浓度为0.062mg/mL。
优选地，步骤S3所述溶解沉淀的PB溶液与泰乐菌素单克隆抗体溶液的用量比为1mL：90μL。
本发明还提供上述试纸条的制备方法，包含以下步骤：
S1.划膜：泰乐菌素抗原TYL-CMO-BSA和羊抗鼠IgG通过pH 7.4的0.02MPB溶液稀释，将抗原TYL-CMO-BSA、羊抗鼠IgG划到NC膜上，抗原TYL-CMO-BSA为T线，羊抗鼠IgG为C线，划膜后干燥；
S2.样品垫处理：将玻纤膜浸泡于样品垫处理液中，取出至垂直放置无液体滴落，再将其水平放置干燥；所述样品垫处理液为pH 8.4的0.05M BBS缓冲液，其中还含有0.1％TritonX-100；
S3.试纸条组装：在PVC背板上贴上步骤S1制备的NC膜，PVC板的一端与样品垫重叠1～2mm相连，另一端与吸水纸重叠1～2mm相连，组装好后裁剪、干燥即得；
S4.乳胶微球样品孔的制备：将标记泰乐菌素单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液以3μL/孔的用量加入酶标孔中，干燥备用。
标记体系是指抗体与乳胶微球的标记过程，其中包括活化、标记的pH值及其时间，乳胶微球及抗体用量，抗体稀释液的选择，封闭时间以及抗体探针复溶液的配方优化。活化的pH值及时间会影响乳胶微球的结合效率，合适的条件则可以使其与抗体有效结合；标记pH值及时间是通过调节缓冲溶液的种类以及标记过程的时间使抗体和乳胶微球在合理的条件下稳定标记；封闭时间越长，则可以减少非特异性吸附；抗体探针复溶液的配方则会影响标记的乳胶微球抗体探针在试纸条上的释放，主要通过其表面活性剂的含量进行调节。本发明通过对以上各个条件的调控来提高标记效率和释放，使抗体探针可以有效与包被原或药物发生反应以提高灵敏度，可以保证效果的同时减少抗体原材料使用。
包被原种类的不同以及包被原的浓度较大程度的影响着抗体探针的反应，因此选择合适的包被原和相应浓度能够使反应过程中显色更快、并且使其更加灵敏。本发明通过调整包被原种类、包被原浓度以及包被液配方，对包被于硝酸纤维素膜上的包被原条件进行优化，可有效减少检测耗时以及增强灵敏度。
样品垫处理工艺中，缓冲液的选择可以影响样品液跑样时的pH值及其离子浓度，使液体处于一个合适抗体与药物或包被原反应的条件；表面活性剂的选择很大程度的影响了样品液的流动速度，本发明通过对缓冲溶液的种类、浓度、pH值，表面活性剂的种类及浓度的控制，使其可达到对样品液的二次前处理，调节了样品垫配方以适应鸡蛋样品的检测要求，可以降低样品液的基质效应，使样品前处理要求相对降低，不必通过更复杂的步骤降低基质效应，可以减少检测耗时。通过样品垫工艺优化适应鸡蛋样品的检测需求，通过特定的缓冲溶液的调节对样品液的pH值起到调节作用，使其处于合适的pH值及离子浓度条件以达到更好的检测效果；并通过一定浓度的表面活性剂，使样品液的检测流动速度在保证检测效果的同时能够有一定提高，使检测过程更加省时。
优选地，上述步骤S1所述泰乐菌素抗原TYL-CMO-BSA稀释后的浓度为0.096mg/mL，所述羊抗鼠IgG浓度为0.2mg/mL。
此外，本发明还请求保护利用上述方法制备得到的试纸条检测鸡蛋样品中泰乐菌素及替米考星的方法，包括以下步骤：
S1.鸡蛋样品前处理：将鸡蛋样品混合均匀，加入乙腈溶液，振荡、超声、离心，取上清液用氮气吹干后，加入复溶液复溶；所述复溶液为pH 7.4的0.02M PB溶液，其中还含有0.5～1％Tween-20；
S2.取经过前处理的鸡蛋样品加入乳胶微球样品孔中，孵育3min，再将检测试纸条样品垫端插入乳胶微球样品孔中，计时5min后将试纸条取出，通过T线、C线显色判断检测结果。
本发明通过对样品提取方式的调节以及样品复溶液配方的优化，仅通过一次提取吹干并复溶的步骤，即可完成样品前处理的操作，精简样品前处理步骤，提供针对鸡蛋样品的快速、准确检测方法。在乳胶微球抗体探针的制备上采用特定的活化、标记、封闭等步骤，有效提高鸡蛋样品的检测灵敏度，在保证产品灵敏度的前提下减少抗原、抗体的使用量，缩减检测耗时。
优选地，步骤S1所述鸡蛋样品与乙腈溶液的用量比为1～2g：2～6mL。
最优选地，步骤S1所述鸡蛋样品与乙腈溶液的用量比为2g：6mL。
优选地，步骤S1所述振荡的时间为2min。
优选地，步骤S1所述超声5min，超声功率为1000～2000w。
优选地，步骤S1所述离心为6000rpm离心5min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的乳胶微球免疫层析试纸条通过优化乳胶微球抗体探针的制备，有效提高其检测鸡蛋样品的灵敏度，在保证产品灵敏度的前提下减少抗原、抗体的使用量，缩减检测耗时；通过调节样品垫配方以适应鸡蛋样品的检测要求，精简样品前处理步骤，仅通过一次提取吹干并复溶的步骤，即可完成样品前处理的操作；采用本发明的免疫层析试纸条对鸡蛋样品中残留TYL及TIM的检测，Cut-Off值均能够达到8ng/g，灵敏度高，检测时间为5min，省时高效。
附图说明
图1为试纸条对泰乐菌素的检测Cut-Off值；
图2为不同pH的MES缓冲溶液对活化的影响；
图3为不同pH值缓冲体系对抗体偶联的影响；
图4为不同抗体稀释液对抗体偶联的影响；
图5为不同配方乳胶复溶液对抗体探针的影响；
图6为不同前处理方式对跑样速度和效果的影响；
图7为不同样品复溶液对跑样效果的影响；
图8为不同样品垫缓冲体系对跑样效果的影响；
图9为不同浓度及种类的表面活性剂对样品垫跑样效果的影响；
图10为不同含量PVP对样品垫跑样效果的影响；
图11为乳胶微球免疫层析法交叉反应结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
抗原TYL-CMO-BSA由本实验室自制；泰乐菌素单克隆抗体由本实验室自制；蓝色乳胶微球溶液于Bangs公司购买。
实施例1标记有蓝色乳胶微球的泰乐菌素单克隆抗体的制备
(1)溶解：在1.5mL离心管加入1mL MES溶液(0.05M，pH＝6.0)，随后加入0.5mg蓝色乳胶微球溶液(5mg/mL)；
(2)活化：在上述溶液中加入15μL 0.5mg/mL EDC溶液、20μL 0.5mg/mL NHS溶液；200rpm反应15min，随后在4℃下14000rpm，离心15min；
(3)标记：去除上清液，加入1mL PB溶液(0.01M，pH＝7.4)加入90μL经0.01M PB稀释100倍泰乐菌素单克隆抗体溶液(即0.062mg/mL)200rpm反应1h；
(4)封闭：在上述溶液中加入20μL 20％BSA溶液，200rpm反应3h，随后在4℃下14000rpm离心15min；
(5)复溶：去除上清液，加入200μL复溶液，即得到标记有蓝色乳胶微球的泰乐菌素单克隆抗体，4℃保存待用；其中复溶液为0.02M PB溶液(pH＝7.4)，其中含有0.5％Tween-20、5％海藻糖、0.5％BSA、0.3％PVP和0.03％procline-300。
实施例2泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条的制备
(1)划膜
抗原TYL-CMO-BSA浓度为0.096mg/mL，羊抗鼠IgG浓度为0.2mg/mL，抗原TYL-CMO-BSA和羊抗鼠IgG通过PB溶液(0.02M,pH＝7.4)稀释，通过喷金划膜仪将抗原TYL-CMO-BSA、羊抗鼠IgG划到NC膜上，用量为0.8μL/cm，划好后37℃烘箱干燥2h，并于阴凉干燥处密封保存备用。
(2)样品垫处理
将型号为SB08的玻纤膜浸泡于样品垫处理液中，充分浸泡后取出至垂直放置无液体滴落，并将其水平放置与37℃的烘箱中烘干3h，并将其密封保存于干燥阴凉处。其中，样品垫处理液配方为0.05M BBS(pH＝8.4)，其中含有0.1％TritonX-100。
(3)试纸条组装：在PVC背板上贴上步骤(1)制备的NC膜，PVC板的一端与样品垫重叠1～2mm相连，另一端与吸水纸重叠1～2mm相连，组装好后用裁条机裁剪成3.05mm，放入干燥剂待用；
(4)乳胶微球样品孔的制备：将实施例1制备的标记泰乐菌素单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液以3μL/孔的用量加入酶标孔中，37℃烘箱干燥30min，密封备用。
实施例3鸡蛋样品中泰乐菌素及替米考星的检测
1、检测方法
S1.鸡蛋样品前处理：将鸡蛋样品混合均匀，称取2g，加入6mL乙腈溶液，剧烈振荡2min，超声5min，常温下6000rpm离心5min，取上清液，在60℃下用氮气吹干后，用0.02M PB(含0.5％Tween-20)溶液(pH＝7.4)复溶，待用；
S2.用胶头滴管吸取2滴经过前处理的鸡蛋样品加入实施例2制备的乳胶微球样品孔中，孵育3min，再将检测试纸条样品垫端插入乳胶微球样品孔中，计时5min后将试纸条取出，通过T线、C线显色判断检测结果。
2、检测结果
根据设置的浓度梯度，试纸条的T线会随着药物浓度的增加显色减弱直至其完全消线，而刚好消线的浓度即为该方法的Cut-Off值，该值是肉眼判断TYL含量的指标。结果如图1所示，从结果可知乳胶微球免疫层析法对鸡蛋样品的Cut-Off值是：8ng/g，即T线完全消失的TYL浓度。与TYL的Cut-Off值的确定类似，该方法对鸡蛋中TIM的Cut-Off值为其T线完全消除的浓度是8ng/g。
实施例4乳胶微球最适活化pH值优化
1、实验方法
针对标记过程中调节活化缓冲溶液的pH值的步骤，按表1的方案进行标记：
表1
Figure BDA0002645092920000071
Figure BDA0002645092920000081
改变MES缓冲溶液pH值，按实施例2的方法制备乳胶微球免疫层析试纸条，按实施例3的方式对鸡蛋样品进行检测，根据检测结果中显色效果、检测限选择合适的pH值的MES溶液。
2、实验结果
如图2所示，MES缓冲液对于鸡蛋样品pH值越高，阳性样本检测效果相对较好，但pH值为6.5时T线显色已经太浅，因此在保证显色效果并兼顾灵敏度的情况下选择pH值为6.0的MES溶液作为活化缓冲液，此条件下T线完全消除，对鸡蛋样品的Cut-Off值能达到15ng/g。
实施例5乳胶微球标记缓冲溶液的优化
1、实验方法
针对标记过程中用于溶解离心后的乳胶微球以及提供一个合适的环境进行标记的缓冲溶液进行如下表2的方案的优化。
表2
Figure BDA0002645092920000082
改变乳胶微球标记缓冲溶液，按实施例2的方法制备乳胶微球免疫层析试纸条，按实施例3的方式对鸡蛋样品进行检测，根据检测结果中显色效果、检测限选择合适的pH值的缓冲溶液。
2、实验结果
如图3所示，对于不同标记缓冲液的几种样品，含有NaCl时标记过程出现大量絮状沉淀，超声也无法溶解，且检测结果效果差，阳性样本的检测结果中T线明显更深。对于鸡蛋样品，pH值越大，显色略微下降，但0.01M PB已经能够达到较低的检测限，因此优先选择显色强度更强的0.01M PB作为标记抗体的缓冲溶液。此条件下对鸡蛋样品Cut-Off值能达到14ng/g。
实施例6乳胶微球标记抗体稀释液的优化
1、实验方法
针对抗体标记中抗体稀释液优化，按如下表3方案将抗体原液稀释100倍进行标记。
表3
Figure BDA0002645092920000091
改变乳胶微球抗体稀释液，按实施例2的方法制备乳胶微球免疫层析试纸条，按实施例3的方式对鸡蛋样品进行检测。
2、实验结果
结果如图4所示，选用BSA以及抗体原液进行标记时显色很强，但灵敏度非常差，相对而言pH值较高的BB溶液以及含有NaCl的PBS溶液显色均稍弱，且灵敏度略好但仍然有明显可见的T线；因此选用灵敏度较高的条件，即0.01M PB作为抗体稀释液。此条件下对鸡蛋样品Cut-Off值分别能达到12ng/g。而西实验也充分证明了，适当的稀释抗体可以有效地提高其灵敏度，这一点从原液的结果与其他条件的结果对比就可以明显得出，而适当的抗体稀释液也能起到很好的作用，但不同抗体以及不同标记物情况各有不同。
实施例7乳胶复溶液的优化
1、实验方法
将0.02M PB、Tween-20、TritonX-100、海藻糖以及防腐剂等常用成分配置成成分及含量不同的金标复溶液，在封闭并离心去上清之后将标记抗体分别加入4个不同配方的乳胶复溶液各200μL。改变乳胶复溶液配方，按实施例2的方法制备乳胶微球免疫层析试纸条，按实施例3的方式对鸡蛋样品进行检测，根据显色效果、检测限、抗体释放效果等确定最合适的配方。
2、实验结果
结果如图5所示，复溶液配方中主要是针对Tween-20浓度进行调节(1～4号浓度逐渐增加)，其浓度越低，显色越强，且从样品垫上的颜色看出乳胶微球探针释放更为完全。同时兼顾灵敏度等因素，选择配方2，0.02M PB、0.5％Tween-20、0.5％BSA、5％海藻糖、0.3％PVP，0.03％Procline-300。结果可见，Tween-20对乳胶微球的释放存在很大影响。此条件下对鸡蛋样品Cut-Off值能达到9ng/g，T线完全消除。
实施例8样品提取方式的优化
1、实验方法
如下表4的提取方式，取2g猪肉或鸡蛋样品于离心管中，添加一定浓度的TYL后，加入相应体积的提取液，充分振荡2min，选择超声5min或不超声，然后6000rpm离心5min，取上清。若提取剂为有机溶剂则将上清氮吹至无液体后用2mL 0.02M PB复溶吹干后的残留物质。
表4
Figure BDA0002645092920000101
按实施例2的方法制备乳胶微球免疫层析试纸条，使用不同的提取方式，按实施例3的方式对鸡蛋样品进行检测，根据各种处理方式对显色效果、检测限、样品流动速度以及处理时间等因素综合考虑选择合适的提取方式。
2、实验结果
结果如图6所示，在方案1～4即不选用有机溶剂提取的情况下，样品的流动速度非常缓慢，特别是对于鸡蛋样品而言几乎影响了正常检测；而方案2、4、6、8即超声提取后显色效果均明显强于未超声的提取方式；增加乙腈用量对试纸条背景影响可以忽略。因此选用如下方案进行TYL的提取：取2g鸡蛋样品于离心管中加入6mL乙腈，充分振荡2min，超声5min，然后6000rpm离心5min，取上清。将上清氮吹至无液体后用2mL 0.02M PB复溶吹干后的残留物质。整个过程用时约25min。此条件下对鸡蛋样品Cut-Off值分别能达到8.5ng/g(即此浓度条件下T线完全消除)。
实施例9样品提取物复溶液的优化
1、实验方法
针对采用有机溶剂提取的方式，对复溶液配方以及复溶体积进行优化，如下表5所示。
表5
Figure BDA0002645092920000102
按实施例2的方法制备乳胶微球免疫层析试纸条，使用不同复溶液对样品进行提取，按实施例3的方式对鸡蛋样品进行检测，根据显色效果、检测限、样品流动速度等结果确定选用的复溶液配方是否浓缩。
2、实验结果
结果如图7所示，从图中可以明显看出，采用浓缩和原体积复溶的方式明显影响试纸条的背景，效果更明显，浓缩后基质效应使得T线显色大大下降，且对灵敏度略微有影响，因此优先考虑原体积复溶。三个配方分别为0.02M PB、0.02M PBS、0.02M PB(含0.5％Tween-20)，其中PBS显色强度明显不如其他两个配方，而配方3样品流动速度更快，灵敏度也较好，显色强度最大，因此选择配方3。此条件下对鸡蛋样品Cut-Off值分别能达到8.5ng/g。
实施例10样品垫缓冲体系的优化
1、实验方法
采用不同种类的缓冲体系、浓度及不同的pH值配置成不同的样品垫处理液配方，如表6所示。
表6
Figure BDA0002645092920000111
Figure BDA0002645092920000121
改变样品垫处理液中缓冲体系，按实施例2的方法制备乳胶微球免疫层析试纸条，按实施例3的方式对鸡蛋样品进行检测，根据不同样品基质的影响不同以及实际的检测结果、样品流动速度等确定合适的种类、浓度及pH值的缓冲溶液处理样品垫。
2、实验结果
如图8所示，对于鸡蛋样品，从样品的流动的快慢程度看，缓冲液的浓度越高，流动越慢，但并不明显且不至于导致样品无法正常检测；随着缓冲液浓度下降(7/9/11号以及8/10/12号)，其显色强度明显提高；随着pH值升高(7/8号、9/10号、11/12号、13/14号、15/16号、17/18号、19/20号)，其显色略微增强；在含有0.15M NaCl的情况下，缓冲溶液浓度变化对其显色变化趋势趋于平缓，显色略有提升且对阳性样品检测效果明显改善。综合考虑，选择18号配方，即0.05M BBS(pH＝8.4)的缓冲液，此条件下对鸡蛋样品Cut-Off值能达到8ng/g。
实施例11样品垫处理液中表面活性剂优化
1、实验方法
采用常见的不同种类的表面活性剂，调节其浓度进行优化，如表7所示。
表7
Figure BDA0002645092920000122
改变样品垫处理液中表面活性剂，按实施例2的方法制备乳胶微球免疫层析试纸条，按实施例3的方式对鸡蛋样品进行检测，根据显色效果、样品液流动速度等确定合适的表面活性剂及用量。
2、实验结果
如图9所示，图中1～4号所用表面活性剂为Tween-20、5～6号为TritonX-100，浓度逐渐升高。整体显色明显强一些。基本趋势都是随着表面活性剂浓度增大，显色明显增强。综合其显色的效果及灵敏度，选择配方5，即0.1％TritonX-100。此条件下对鸡蛋样品Cut-Off值能达到8ng/g。表面活性剂的含量变化明显改变了样品液流动的速度，因此检测速度也是本实验的考虑因素之一。
实施例12样品垫处理液中PVP含量的优化
1、实验方法
考察样品垫中添加不同PVP含量对检测效果的影响。具体的样品垫处理液中PVP含量如表8所示。
表8
Figure BDA0002645092920000131
改变样品垫处理液中PVP含量，按实施例2的方法制备乳胶微球免疫层析试纸条，按实施例3的方式对鸡蛋样品进行检测，根据显色效果、检测限确定合适的PVP用量。
2、实验结果
如图10所示，配方1～4PVP含量逐渐增加。相比缓冲体系以及表面活性剂，PVP含量对显色效果影响相对较小，但对于阳性样本检测效果区别较大，随着PVP含量增加，T线有越明显的阴影，消线不完全，选择配方1，即不含PVP。此条件下对鸡蛋样品Cut-Off值能达到8ng/g(即此浓度条件下T线完全消除)。
实施例13乳胶微球免疫层析法交叉反应
图11为乳胶微球免疫层析法交叉反应结果，从图中可以看出，该方法与ERY、SPI两种药物无交叉反应，T线颜色与添加TYL的浓度无关，且不同样品基质不影响其特异性，表明本发明的乳胶微球免疫层析试纸条特异性良好。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条，其特征在于，由PVC板、样品垫、NC膜、吸水纸以及乳胶微球样品孔组成，所述乳胶微球样品孔中吸附有由蓝色乳胶微球标记的泰乐菌素单克隆抗体；NC膜上划有泰乐菌素抗原TYL-CMO-BSA和羊抗鼠IgG，抗原TYL-CMO-BSA为T线，羊抗鼠IgG为C线；
所述蓝色乳胶微球标记的泰乐菌素单克隆抗的制备包括以下步骤：
S1.溶解：向蓝色乳胶微球中加入pH为5～6.5的MES缓冲溶液，制备蓝色乳胶微球溶液；
S2.活化：在步骤S1溶液中加入0.5mg/mL EDC溶液、0.5mg/mL NHS溶液；200rpm反应15min，随后在2～4℃下10000～14000rpm/min，离心10～20min；
S3.标记：将离心后的沉淀溶解至0.01M PB溶液中，再加入经0.01M PB稀释的泰乐菌素单克隆抗体溶液，200rpm反应1h；所述PB溶液的pH为7.4；
S4.封闭：在步骤S3反应后的溶液中加入20％(w/v)BSA溶液，200rpm反应3h，随后在2～4℃下10000～14000rpm/min，离心10～20min；
S5.复溶：去除上清液，加入复溶液，复溶液为pH 7.4的0.02M PB溶液，其中还含有0.5～1％Tween-20、3～5％海藻糖、0.5％BSA、0.3％PVP和0.03％procline-300。
2.根据权利要求1所述试纸条，其特征在于，所述标记泰乐菌素单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液的制备中，步骤S1所述MES缓冲溶液的浓度为0.05M，pH6.0。
3.根据权利要求1所述试纸条，其特征在于，所述标记泰乐菌素单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液的制备中，步骤S1所述制备的蓝色乳胶微球溶液浓度为5mg/mL。
4.根据权利要求1所述试纸条，其特征在于，所述蓝色乳胶微球溶液、EDC溶液、NHS溶液的用量比为1mL：15μL：20μL。
5.根据权利要求1所述试纸条，其特征在于，所述标记泰乐菌素单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液的制备中，步骤S3所述泰乐菌素单克隆抗体溶液浓度为0.062mg/mL。
6.根据权利要求1所述试纸条，其特征在于，步骤S3所述溶解沉淀的PB溶液与泰乐菌素单克隆抗体溶液的用量比为1mL：90μL。
7.权利要求1所述试纸条的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1.划膜：泰乐菌素抗原TYL-CMO-BSA和羊抗鼠IgG通过pH 7.4的0.02MPB溶液稀释，将抗原TYL-CMO-BSA、羊抗鼠IgG划到NC膜上，抗原TYL-CMO-BSA为T线，羊抗鼠IgG为C线，划膜后干燥；
S2.样品垫处理：将玻纤膜浸泡于样品垫处理液中，取出至垂直放置无液体滴落，再将其水平放置干燥；所述样品垫处理液为pH 8.4的0.05M BBS缓冲液，其中还含有0.1～0.5％TritonX-100；
S3.试纸条组装：在PVC背板上贴上步骤S1制备的NC膜，PVC板的一端与样品垫重叠1～2mm相连，另一端与吸水纸重叠1～2mm相连，组装好后裁剪、干燥即得；
S4.乳胶微球样品孔的制备：将标记泰乐菌素单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液以3μL/孔的用量加入酶标孔中，干燥备用。
8.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述泰乐菌素抗原TYL-CMO-BSA稀释后的浓度为0.096mg/mL，所述羊抗鼠IgG浓度为0.2mg/mL。
9.利用权利要求6所述方法制备得到的试纸条检测鸡蛋样品中泰乐菌素及替米考星的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.鸡蛋样品前处理：将鸡蛋样品混合均匀，加入乙腈溶液，振荡、超声、离心，取上清液用氮气吹干后，加入复溶液复溶；所述复溶液为pH 7.4的0.02M PB溶液，其中还含有0.5～1％Tween-20；
S2.取经过前处理的鸡蛋样品加入乳胶微球样品孔中，孵育3min，再将检测试纸条样品垫端插入乳胶微球样品孔中，计时5min后将试纸条取出，通过T线、C线显色判断检测结果。
10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，步骤S1所述鸡蛋样品与乙腈的用量比为1～2g：2～6mL。
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