CN209690323U - 一种黄曲霉毒素b1定量检测装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型提供了一种黄曲霉毒素B1定量检测装置，包括：读数仪，反应微孔，插在读数仪上内置样品参数的ID卡及试纸条，所述反应微孔中容置有乳胶微球偶联抗体，所述试纸条包括底板、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸；其中，所述样品垫与吸水纸设置在底板的两端，在样品垫与吸水纸之间为硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上标记有检测线和质控线；所述质控线靠近吸水纸一侧，检测线靠近样品垫一侧；所述样品垫上设有加入反应微孔的加样孔。本实用新型红色乳胶微球颜色鲜艳饱满，正红色，便于识别；乳胶微球产量至少50L‑100L，同批量是胶体金的5‑10倍。黄曲霉毒素B1偶联抗体为化学键偶合，比胶体金物理吸附稳定性好，准确度和精密度高，成本低，操作简单。

Description

一种黄曲霉毒素B1定量检测装置

技术领域

本实用新型涉及黄曲霉毒素检测领域，尤其涉及一种黄曲霉毒素B1定量检测装置。

背景技术

黄曲霉毒素是谷类及其他农作物常见的霉变菌，是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一类低分子化合物。污染粮食、油料作物的种子，其中以花生、玉米最易被污染，另外在小麦、高粱、巴西坚果、豆类和大米等重要粮食中也经常被检出。黄曲霉毒素的种类很多，主要有黄曲霉毒素B1、B2、B1、G1，其中以黄曲霉毒素B1毒性最强，含量最高，是总黄曲霉毒素的重要组成部分。黄曲霉毒素热稳定性很高，一旦产生便难以除去。对动物、植物和微生物具有很强的毒性，致癌力最强，还能引起突变和导致畸形。与人的肝癌有密切关系，也能引起人的急性中毒死亡。

黄曲霉毒素B1属于霉菌毒素的一种，目前粮油和谷物领域流行的霉菌毒素试纸条主要为胶体金定性产品，胶体金定量产品由于准确度、精密度和稳定性很难达到要求，一直难以占市场主导，客户只能靠酶联免疫试剂盒和仪器法如高效液相等，检测样品的具体含量，酶联免疫试剂盒和仪器法对人员和环境的要求较高，检测时间较长。我国国家标准GB2761-2017食品安全国家标准食品中真菌毒素国家限量黄曲霉毒素B1主要限量5-20ppb。

现有技术的缺陷和不足：

(1)目前市场流行的黄曲霉毒素B1试纸条主要为胶体金技术，胶体金本身为暗紫红色，颜色较浅，不易判别阴阳性。

(2)胶体金一批制金量最多约10L左右，粒径偏差较难精准控制，大量生产定量产品，不同批容易造成较大的差别。

(3)胶体金标记技术为物理吸附，较化学键偶联，产品稳定性较差。

(4)目前市场胶体金试纸条主要为定性产品，大多客户需要操作快速、简单、人员要求低、成本低、肉眼可视的定量产品。定量检测卡可以使客户降低对人员的要求，节省人力，尤其是原料筛选有很大的优势，之前一直是定性筛选，假阴性和假阳性较高。

(5)烧金、标记抗体工作量较大，工艺繁琐，产出少，浪费人力物力。

(6)由于AFB1抗体和抗原的特殊性，市面上进口产品胶体金标记AFB1技术的变异系数较大。参见文献《胶体金测试条法对粮食中黄曲霉毒素B1快速定量测定的研究》。

实用新型内容

本实用新型的目的在于解决现有技术中的上述缺陷，提供一种定量检测黄曲霉毒素B1的检测装置，能定量检测黄曲霉毒素B1的含量，测量精准，实验数据可靠，使用方便，成本低的黄曲霉毒素B1检测装置。

为了实现本实用新型目的，本实用新型提供一种技术方案：

一种黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，简称AFB1)定量检测装置，包括：读数仪，反应微孔，试纸条，插在读数仪上内置样品参数的ID卡，用于对插在读数仪内的试纸条进行读数，所述反应微孔中容置有乳胶微球偶联的黄曲霉毒素B1抗体，所述试纸条包括底板、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸；其中，

所述样品垫与吸水纸设置在底板的两端，在样品垫与吸水纸之间为硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上标记有检测线和质控线；所述质控线靠近吸水纸一侧，检测线靠近样品垫一侧；所述样品垫上设有样孔。

作为优选方案，所述质控线处设有羊抗鼠的IgG抗体捕获试剂；所述检测线处设有AFB1-OVA抗原捕获试剂。

作为优选方案，所述羊抗鼠的IgG抗体浓度为0.1-1.0mg/mL，所述AFB1-OVA抗原浓度为0.1-1.0mg/mL。

作为优选方案，所述乳胶微球偶联抗体中黄曲霉毒素B1抗体浓度为0.5-2mg/mL。

作为优选方案，所述吸水纸及样品垫分别与硝酸纤维素膜重叠1-2mm。

作为优选方案，所述吸水纸长为25cm，硝酸纤维素膜长为21cm、宽为3-4mm，样品垫长为20cm。

所述检测线和质控线之间的间隔为4-5mm。

作为优选方案，所述检测线和质控线之间的间隔为5mm。

作为优选方案，所述底板为PVC底板。

本实用新型提供了一种黄曲霉毒素B1定量检测装置，主要原理是：

将黄曲霉毒素B1(AFB1)抗体偶联于乳胶微球，包被于反应微孔中，将AFB1-OVA抗原固定在硝酸纤维素膜上作为检测线(T)，将羊抗鼠的IgG抗体固定在质控线作为对照线(C)，向偶联有黄曲霉毒素B1抗体的乳胶微球中加样检测，若样品中含有黄曲霉毒素B1，首先与黄曲霉毒素B1抗体结合形成复合物，此复合物在样品垫上向前涌动到检测线位置，由于偶联的黄曲霉毒素B1抗体表面位点被AFB1-OVA抗原占据，而使其不能与检测线的AFB1-OVA抗原结合，此检测限由于不能拦截微球而不显色或显色弱，将此检测结果视为阳性；而当样品中不含黄曲霉毒素B1时，乳胶微球涌动到检测线时将被AFB1-OVA抗原捕获。乳胶微球聚集于检测线上呈现出肉眼可见的鲜红色条带，此检测结果视为阴性，当检测线与质控线均为无色或质控线不显色，视为试纸条失效。

与现有技术相比，本实用新型具有的有益技术效果：

1)黄曲霉毒素B1检测装置检测均可实现定量，整个检测时间10-30min，反应时间7min即可检测出粮油和饲料中黄曲霉毒素B1的含量；

2)乳胶微球为正红色颜色鲜艳饱满，极好判别；

3)乳胶微球产量至少50-100L，同批量是胶体金的5-10倍；

4)乳胶微球所负载的黄曲霉毒素B1偶联抗体与黄曲霉毒素B1抗原为化学键偶合，比胶体金物理吸附稳定性好，准确度和精密度高；

5)黄曲霉毒素B1检测装置结构简单，操作方便，成本较低，提高检测效率，适用性广；

6)乳胶微球标记的黄曲霉毒素B1偶联抗体，产品CV值较小，同类产品进口厂家文献显示CV值。

附图说明

图1是本实用新型黄曲霉毒素B1定量检测装置示意图。

图2是本实用新型反应微孔的结构示意图。

图3是本实用新型试纸条的结构示意图。

图4是本实用新型试纸条另一种结构形式。

具体实施方式

如图1-4所示，一种黄曲霉毒素B1定量检测装置，包括：读数仪1，反应微孔2，试纸条4，插在读数仪1上内置样品参数的ID卡并对插在读数仪1内的试纸条4进行读数，所述反应微孔2中容置有乳胶微球偶联抗体，所述试纸条4包括底板41、样品垫42、硝酸纤维素膜43、吸水纸44；其中，

所述样品垫42与吸水纸44设置在底板41的两端，在样品垫42与吸水纸44之间为硝酸纤维素膜43，在硝酸纤维素膜43(NC膜)上标记有检测线45和质控线46；所述质控线46靠近吸水纸44一侧，检测线45靠近样品垫42一侧；所述样品垫42上设有加样孔47，从而对待测样品进行检测。

本实用新型黄曲霉毒素B1定量检测装置检测黄曲霉毒素B1的过程：

样品前处理：

(1)粉碎：将粮谷类样品进行粉碎；

(2)称量：称取5g粉碎好的样品于50ml离心管中；

(3)混匀：加入10mL 70％甲醇水，盖好盖子高速剧烈震荡混合3min，室温下静置2min；

(4)离心：静置或4000rpm离心5min；

(5)稀释：取上清液100μL加入900μL样品稀释液，混匀待测(检测范围125ppb-2500ppb)，本实用新型适合样品类型：粮油和谷物类。

检测过程：

1)预热：打开恒温孵育器开关，检测前升温到45±1℃；

2)标记样品：根据待检样本数量，取出相应数量的反应微孔和试纸条，在试纸条上标记区分样品；

3)加液：将反应微孔放置在恒温孵育器上，用移液枪吸取待检样本溶液120μL，加到反应微孔中，反复吸打10次以上至混匀；

4)孵育：将试纸条和加样后的反应微孔放置在孵育器上，在45±1℃条件下孵育2min；

5)反应：取出反应微孔，反复吸打4次以上，小心吸取反应后的液体120ul(±10ul)，根据样品顺序逐滴加入检测卡加样孔位置。

读取结果

6)读数仪系统：打开型号为E-K07的读数仪，插入相对应的本批定量产品ID卡和本批定量试纸条，设置读数仪进入“样品检测”模块，点击“定量检测”；

7)读取结果：取出试纸条并在1min内插入读数仪，点击“即时检测”，读取结果；

8)打印结果：点击“打印数据”，打印检测结果。

注：检测无效：质控区未出现C线，可能操作不当或试纸条已失效。应再次阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。

实施例1

样品处理

实验过程：采取三类不同浓度的待测谷物，每组样品设置7个平行实验，三个不同的实验员对同一样品进行检测，样品处理及检测过程如上述结果所述，试验结果如表1：

表1.黄曲霉毒素B1定量检测装置检测AFB1玉米评价结果

实验结果表明，本实用新型的黄曲霉毒素B1定量检测装置对样品检测精确度高，反应微孔回收率可到100％，精密度为RSD5.0-8.7％。

本实用新型中黄曲霉毒素B1检测装置中相关结构的制作

(1)反应微孔制作：

微球偶联抗体：乳胶微球中加入25mM的MES缓冲溶液，混匀，MES缓冲溶液离心洗涤。分别加入25mM的NHS和EDC反应液混匀；使1L乳胶微球中含有40μL NHS和EDC，孵育10min，离心，去上清液留沉淀，MES缓冲溶液离心洗涤。加入黄曲霉毒素B1抗体，混合均匀使黄曲霉毒素B1抗体浓度为0.5-2mg/mL并反应2h，离心去除上清液，加入1-2％的BSA封闭液进行封闭，混匀后静置1h、离心弃上清液，留沉淀；将微球悬浮于储存在10mM、pH为7的PBS缓冲溶液中，摇匀，于冰箱2-8℃保存。

微球偶联抗体的冻干：取(1)中制得的乳胶微球偶联黄曲霉毒素B1抗体用冻干稀释液稀释后，冻干于微孔中形成反应微孔。

(2)试纸条制作

AFB1-OVA抗原的制作

将化学性质较稳定的AFB1与卵白蛋白(ovalbumin，OVA)偶联获得抗原AFB1-OVA，通过对小鼠进行免疫，并进行后续细胞融合筛选，获得AFB1-OVA特异性单克隆抗体，该抗体对黄曲霉毒素B1抗原都具有识别能力。

试纸条的制作：

底板选用PVC底板，样品垫选用玻纤，将PVC底板用0.02M PBS浸润均匀后，37℃鼓风烘箱烘干过夜，切条为3-4mm宽度放入装有干燥剂的自封袋中待用。具体的，本实用新型使用0.02M PBS浸润的目的是增加离子浓度，使样品在样品垫上游动速度增加。PVC底板中间部分粘贴硝酸纤维素膜，右端是吸水纸，左端是样品垫。羊抗鼠IgG抗体和AFB1-OVA抗原分别作为参考线捕获试剂和检测线捕获试剂固定在试纸条的质控线(T线)和检测线(C线)处，通过肉眼观察参考线和检测线颜色强弱来判断试纸条的检测结果。C线羊抗鼠IgG抗体的浓度为0.1-1.0mg/mL；T线处AFB1-OVA半抗原浓度为0.1-1.0mg/mL，条宽度3-4mm。

吸水纸切为3-4mm宽度放入干燥自封袋中待用。

利用抗原和抗体的特异性反应，反应微孔中为乳胶微球偶联黄曲霉毒素B1的抗体复合物，样品中的抗原黄曲霉毒素B1与反应微孔中的复合物质反应，层析，到T线时与T线的包被抗原反应显色，剩余的复合物到C线与C线结合显色，本专利用的黄曲霉毒素B1抗体为黄曲霉毒素B1单克隆抗体。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本实用新型的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本实用新型进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本实用新型各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种黄曲霉毒素B1定量检测装置，包括：读数仪(1)，反应微孔(2)，试纸条(4)，插在读数仪(1)上内置样品参数的ID卡，其特征在于，所述反应微孔(2)中设有乳胶微球偶联的黄曲霉毒素B1抗体，所述试纸条(4)包括底板(41)、样品垫(42)、硝酸纤维素膜(43)、吸水纸(44)；其中，

所述样品垫(42)与吸水纸(44)设置在底板(41)的两端，在样品垫(42)与吸水纸(44)之间为硝酸纤维素膜(43)，在硝酸纤维素膜(43)上标记有检测线(45)和质控线(46)；所述质控线(46)靠近吸水纸(44)一侧，检测线(45)靠近样品垫(42)一侧；所述样品垫(42)上设有加样孔(47)。

2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1定量检测装置，其特征在于，所述质控线(46)处设有羊抗鼠的IgG抗体捕获试剂；所述检测线(45)处设有AFB1-OVA抗原捕获试剂。

3.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素B1定量检测装置，其特征在于，所述羊抗鼠的IgG抗体浓度为0.1-1.0mg/mL，所述AFB1-OVA抗原浓度为0.1-1.0mg/mL。

4.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1定量检测装置，其特征在于，所述乳胶微球偶联抗体中黄曲霉毒素B1抗体浓度为0.5-2mg/mL。

5.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1定量检测装置，其特征在于，所述吸水纸(44)及样品垫(42)分别与硝酸纤维素膜(43)重叠1-2mm。

6.根据权利要求5所述的黄曲霉毒素B1定量检测装置，其特征在于，所述吸水纸(44)长为25cm，硝酸纤维素膜(43)长为21cm、宽为3-4mm，样品垫(42)长为20cm。

7.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素B1定量检测装置，其特征在于，所述检测线(45)和质控线(46)之间的间隔为4-5mm。

8.根据权利要求7所述的黄曲霉毒素B1定量检测装置，其特征在于，所述检测线(45)和质控线(46)之间的间隔为5mm。

9.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1定量检测装置，其特征在于，所述底板(41)为PVC底板。