CN109142760B

CN109142760B - 一种快速准确检测饲料中粘杆菌素的试剂盒

Info

Publication number: CN109142760B
Application number: CN201810726159.XA
Authority: CN
Inventors: 陈义强; 李煜; 周金玉; 谢佩璐; 汪源; 王嘉熠; 张馨培; 金永鹏
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-07-04
Filing date: 2018-07-04
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2038-07-04
Also published as: CN109142760A

Abstract

本发明提供了一种快速准确检测饲料中粘杆菌素的试剂盒，该试剂盒利用一步法间接竞争ELISA和胶体金侧流免疫层析原理，可大大降低检测饲料中粘杆菌素时间，该试剂盒还包含一种含有TritonX‑100和柠檬酸钠的饲料前处理试剂，该试剂可显著降低粘杆菌素非特异性吸附，提高粘杆菌素的测定准确性。本发明的试剂盒无需特殊仪器，具有操作简便、成本低、检测限低、抗干扰能力强、检测结果准确的优点，适于基层实验室和现场检测，可推广使用。

Description

一种快速准确检测饲料中粘杆菌素的试剂盒

技术领域

本发明涉及饲料质量安全评价领域，具体地涉及一种快速准确检测饲料中粘杆菌素的试剂盒，更具体地涉及一种用于饲料前处理的试剂。

背景技术

在鸡、猪的集约化饲养中，由大肠杆菌或沙门式杆菌引起的动物疾病是一种常见病，感染面广、危害大。为了减少致病菌抗性的产生，世界范围内对抗生素的使用均有严格规定，人畜共用同种抗生素的现象日趋减少。其中，粘杆菌素对革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等有强大的抗菌作用，对绿脓杆菌作用尤其突出。粘杆菌素(colistin，CLS)是1947年从多粘菌素B.polymyxa或产气孢子杆菌B.aerobaillus的培养滤液中得到的一种碱性多肽类抗生素，又称为多粘菌素E，黏菌素，克利斯汀和抗敌素，它是一种至少含有30多种不同成分的混合物，主要为粘菌素A和粘菌素B，一般以硫酸盐形式存在。粘杆菌素是在20世纪40年代末发现，最早于20世纪50年代在日本和欧洲用于临床。然而，在20世纪80年代，粘杆菌素因其神经毒性和肾脏毒性被其它低毒性抗生素取代。但是，低毒性抗生素易产生耐药性，因而粘杆菌素成为21世纪抵抗多重耐药革兰氏阴性菌的最后一道防线。然而，近几年来超级基因MCR-1的发现使得抵抗革兰氏阴性菌的最后一道防线濒临瓦解。因此，农业部于2016年11月颁布了严禁在饲料中添加粘杆菌素的条令。

目前，粘杆菌素的分析方法有微生物学方法、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)、毛细管电泳法(CE)及薄层分析法(TLC)等。Leroy等(1989)运用微生物学方法检测了小牛体内粘杆菌素的含量，结果显示微生物学方法缺乏敏感性，选择性和检测时间偏长(21h)。薄层层析法(TLC)和毛细管电泳(CE)不能将硫酸粘杆菌素与甲烷磺酸粘杆菌素区分开，并且操作过程繁琐。高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)需要昂贵精密的仪器，并且需要专业的技术人员操作，不适于基层实验室和现场检测。同时，目前的仪器分析方法易受样品基质的干扰，影响检测的准确性。

粘杆菌素是由七环和末端的三肽组成的十肽菌素，尾部的脂肪酸通过酰胺键连接到末端的三肽，七环有亲水端和疏水端，三肽只有亲水端。带有正电荷的氨基酸和尾部的脂肪酸使粘杆菌素兼具亲脂亲油性，使粘杆菌素极易发生非特异性吸附，导致测定准确性下降。因此，本发明系统筛选了封闭剂的配方，解决了粘杆菌素的非特异性吸附问题，同时提供了一种简单、快速、可准确定性和定量检测粘杆菌素的分析方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种快速、高效提取饲料中粘杆菌素的试剂。

本发明的另一目的在于提供一种提取饲料中粘杆菌素的方法。

本发明的再一个目的在于提供一种快速准确检测饲料中粘杆菌素的试剂盒。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种饲料前处理试剂，其为含有Triton X-100和柠檬酸钠的三氯乙酸溶液。

本发明选用了不同封闭剂：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、曲拉通(Triton X-100)、吐温系列(Tween 20等)和牛血清蛋白(BSA)考察它们对粘杆菌素的非特异性吸附的影响效果，结果发现Triton X-100和BSA可显著降低粘杆菌素非特异性吸附。考虑到需用酸溶液对饲料样品提取，而BSA在酸性环境中易变性，不能达到显著降低粘杆菌素吸附的效果，所以本申请选择Triton X-100作为封闭剂，用于解决粘杆菌素非特异性吸附问题。

经过反复实验，本发明的饲料前处理试剂为含有0.01％～2％Triton X-100和0.01M～0.4M柠檬酸钠的三氯乙酸溶液，所述％为体积百分比。

优选地，本发明的饲料前处理试剂为含有0.1％～2％Triton X-100和0.05M～0.2M柠檬酸钠的1％～4％的三氯乙酸溶液。

更优选地，本发明的饲料前处理试剂为含有0.5％～1％Triton X-100和0.05M～0.1M柠檬酸钠的1％～2％的三氯乙酸溶液。

最优选地，本发明的饲料前处理试剂为含有1％Triton X-100和0.1M柠檬酸钠的2％的三氯乙酸溶液。

进一步地，本发明提高了上述饲料前处理试剂在提取饲料中粘杆菌素的应用。

所述的应用具体为待饲料粉碎后，将其与所述的饲料前处理试剂按照1:50-1:200g/ml的比例混匀。

混匀0.5-2h后，采用ELISA或胶体金免疫层析方法对混合溶液中的粘杆菌素进行检测。

本发明提供了含有上述饲料前处理试剂的快速准确检测饲料中粘杆菌素的试剂盒。

优选地，所述试剂盒为一步法ELISA试剂盒或胶体金免疫层析试剂条。

优选地，所述一步法ELISA试剂盒特点为一抗和二抗同时加入酶标板孔中同时进行反应，节约了操作时间。

本发明的饲料前处理试剂能够解决粘杆菌素非特异性吸附的问题，提高饲料中粘杆菌素的回收率，结合一步法ELISA和胶体金免疫层析试纸条对饲料中粘杆菌素进行定性和定量检测，无需复杂的样品前处理和贵重仪器，成本低、方便快捷、特异性强、准确率高、耗时少，能够消除饲料中其他成分对检测结果的干扰，实现饲料中粘杆菌素快速、准确、高通量测定，非常适合于基层实验室和现场快速检测，对饲料中粘杆菌素的检测具有重要意义。

附图说明

图1为一步法ci-ELISA、两步法ci-ELISA和cd-ELISA测定粘杆菌素的示意图。

图2为三种不同ELISA方法优化后的标准曲线。图中■标识为一步法间接ELISA标准曲线；图中▲标识为两步法间接ELISA标准曲线；图中◆标识为直接法ELISA标准曲线。

图3为不同材质离心管对CLS非特异性吸附的影响。

图4为不同封闭剂对CLS非特异性吸附的影响。

图5为一步法ci-ELISA测定粘杆菌素的标准曲线图。

图6为胶体金免疫层析法标准曲线的建立，其中A图为试纸条实际测定图，B图为拟合的标准曲线图。

图7为胶体金免疫层析法交叉反应，A，空白对照；B，青霉素；C，氯霉素；D，杆菌肽；E，四环素；F，恩诺沙星；G，磺胺二甲嘧啶。

具体实施方式

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。

实施例1

空白饲料中添加2mg/kg粘杆菌素，分别采用表1的配方进行提取，回收率如表1所示。由表可知，当提取液中不添加Triton X-100或柠檬酸钠时，回收率均不超过80％；当提取液中添加Triton X-100或柠檬酸钠，回收率可得到显著的提高，经测定，最优化的配方组合为1％Triton X-100，0.1M柠檬酸钠和2％三氯乙酸。

表1不同提取液配方对回收率的影响

组别	Triton X-100	柠檬酸钠	三氯乙酸	回收率(％)
					实验组1	1％	0.01M	2％	81.64
实验组2	1％	0.05	2％	92.34
					实验组3	1％	0.1M	2％	100.43
实验组4	1％	0.2M	2％	98.46
					实验组5	0.01％	0.1M	2％	77.58
实验组6	0.1％	0.1M	2％	86.39
					实验组7	2％	0.1M	2％	99.32
实验组8	1％	0.1M	0.5％	96.56
					实验组9	1％	0.1M	2％	98.03
实验组10	1％	0.1M	4％	101.87
					对照组1	1％	0	2％	77.67
对照组2	0％	0.1M	2％	66.25
					对照组3	0％	0	2％	70.83

本发明的一步法ELISA方法特点为一抗和二抗同时加入酶标板孔中同时进行反应，减少了试验操作步骤，节约了操作时间。

本发明比较了一步法间接竞争ELISA(ci-ELISA)、两步法间接竞争ELISA(ci-ELISA)和直接竞争ELISA(cd-ELISA)测定的灵敏度，三种ELISA的操作示意图见图1，比较三种ELISA的IC₅₀值和检测时间，选择最优的反应模式。

结果表明一步法ci-ELISA和两步法ci-ELISA灵敏度相近，且优于cd-ELISA(图2)。此外，一步法ci-ELISA较两步法ci-ELISA分析时间较短(表2)，因此，采用一步法ci-ELISA用于后期试验。

表2三种ELISA方法测定的IC50值和分析时间的比较

实施例2封闭剂的筛选实验

不同封闭剂对粘杆菌素吸附的效果:

粘杆菌素是由七环和末端的三肽组成的十肽抗菌素，尾部的脂肪酸通过酰胺键连接到末端的三肽，带有正电荷的氨基和尾部的脂肪酸使粘杆菌素具有亲水亲油特性，既可溶于水，又可溶于脂类，因此粘杆菌素极易发生非特异性吸附。为了降低粘杆菌素非特异性吸附，提高测定的准确度，大多数仪器方法报道采用多粘菌素B作内标及采用基质匹配标准曲线以保证检测的准确度。然而，这些方法操作过程繁琐，没有彻底解决粘杆菌素非特异性吸附问题。因此，本实施例考察了不同材质的离心管：塑料离心管(聚乙烯)、低吸附离心管(聚丙烯)、玻璃管(高硼硅)和玻璃进样小瓶(低硼硅)对降低粘杆菌素非特异性吸附的效果，整个实验方法参见实施例1的实验组3。结果表明，CLS在不同材质离心管中均存在不同程度非特异性吸附，且吸附率在29％～38％之间(图3)，说明不同材质离心管对降低粘杆菌素非特异性吸附没有显著影响。

本试验考察了封闭剂PVP、PEG、PVA、Triton 100、Tween 20和BSA对掩蔽粘杆菌素非特异性吸附的效果。结果表明，BSA和Triton 100可显著降低粘杆菌素非特异性吸附(图4)。考虑到饲料样品经酸溶液提取，而BSA在酸性溶液中变性不能达到理想的效果。因此，本试验采用Triton 100作为封闭剂。样品中粘杆菌素经提取液提取之后，取上清离心和调pH后，经一步法ci-ELISA测定，试验结果表明回收率偏低。

进一步考察提取和离心对回收率的影响，结果表明，调pH至中性后，金属离子可能形成氢氧化物沉淀，使提取液中的粘杆菌素吸附于沉淀导致回收率偏低。为了消除这一影响，本试验向提取液中添加0.1M柠檬酸钠络合重金属离子后，再调节pH至中性。通过优化，本试验最终采用含有1％Triton 100和0.1M柠檬酸钠的2％TCA对饲料样品进行提取。

实施例3一步法ELISA检测饲料中粘杆菌素

1、免疫原和包被原的制备：

10mg BSA和10mg OVA分别与10mg粘杆菌素溶于2mLpH＝6.0、0.05M的MES缓冲溶液，搅拌溶解，然后滴加200μL 50mg/mL的EDC，室温反应2h。0.9％氯化钠透析48h，每12h换一次透析液。

2、单克隆抗体的制备：

20只6-8周龄的雌性小鼠，平均分成两组。初次免疫，第一组每只小鼠15μg免疫原(以BSA含量计)，第二组每只小鼠60μg免疫原(以BSA含量计)。四周后，进行第二次免疫，免疫剂量同第一次免疫。第二次免疫四周后，进行第三次免疫，免疫剂量同上，第三次免疫一周后采血测定；第三次免疫四周后，进行第四次免疫，免疫剂量同上，免疫一周后采血测定。两次采血测定的抗血清效价一致后，选择血清效价高和抑制率较好的小鼠进行细胞融合，经过细胞培养、筛选，制备单克隆抗体。

3、采用实施例1中表1的第3组前处理试剂的配方提取饲料中的粘杆菌素。饲料样品经机器粉碎为40目，与前处理试剂经适宜比例1:100，g/mL)混合搅拌，搅拌时间：1h。

4、一步法ELISA：

(1)包被抗原：100μL/孔OVA-CLS(以OVA浓度计1μg/mL)，37℃孵育2h。

(2)封闭：150μL/孔0.1％BSA 37℃孵育1h

(3)一步法间接竞争：标准曲线组：50μL/孔一系列浓度梯度的粘杆菌素，随后每孔加入50μL一抗与酶标二抗适宜浓度混合液

样品组：样品提取液调pH至中性，每孔加50μL粘杆菌素标准溶液，随后每孔加入50μL一抗与酶标二抗适宜浓度混合液，37℃孵育45min

(4)显色：每孔加100μL显色液，显色10min

(5)终止：每孔加50μL 2N H₂SO₄

(6)检测：在450nm处测定吸光度值

(7)浓度计算：利用Originlab对标准曲线线性模拟，根据样品组吸光度值带入标准曲线得到样品组中粘杆菌素的浓度。

5、标准曲线和检测限

采用优化的反应条件，建立粘杆菌素的标准曲线，如图5所示。以B/B₀为10％～90％对应的粘杆菌素浓度范围作为本方法的检测范围，经测定，检测范围为1.7～58.8ng/mL。方法的灵敏度确定为20个空白样品浓度平均值加上3倍标准偏差。经测定，猪饲料中检测限为101.4μg/kg，鸡饲料中粘杆菌素的检测限为94.52μg/kg。

6、添加回收率的测定

以1.0、2.0和4.0mg/kg的粘杆菌素浓度添加空白猪和鸡配合饲料，每个浓度做3个重复，连续做3天，按照上述前处理方法提取，采用一步法ci-ELISA检测。结果表明，在1.0～4.0mg/kg的添加浓度下，回收率为81％～108％，变异系数小于12％(表3)，说明该法准确可靠，可用于饲料中粘杆菌素定性和定量测定。

表3饲料中CLS添加回收率(n＝4)

7、盲样测定

在样品测定者不知情的情况下，向10个空白饲料样品中添加不同浓度粘杆菌素。分别采用优化的提取液配方(1％Triton X-100，0.1M柠檬酸钠和2％三氯乙酸)和普通提取液(2％三氯乙酸)进行提取。采用建立的一步法ci-ELISA测定。测定结果表4所示，采用常规提取液，测定值普遍小于盲样添加值。采用本方法优化的提取液，测定值与盲样添加值基本一致，且无假阳性和假阴性结果出现，说明优化的提取液大大提高了测定的准确性。

表4盲样饲料样品测定结果

注：ND，未检出

实施例5胶体金免疫层析法检测饲料中粘杆菌素

(1)金标抗体制备：取1mL胶体金溶液(25nm)，利用0.1M K₂CO₃调节pH至pH7.0，加2μg抗粘杆菌素单克隆抗体(实验室自制)，反应10min，加1％BSA封闭10min，12000rpm离心5min，弃上清，2mM硼酸缓冲液复溶，再次离心，弃上清，用1mL金标抗体稀释液(0.5％Triton100、1％BSA和0.5％蔗糖的PBS(0.01M，pH7.4))溶解，加至酶标板孔中，每孔100μL，冻干备用。

(2)喷涂抗原和抗体：取包被抗原(CLS-BSA，0.25mg/mL，自制)和羊抗鼠二抗(0.5mg/mL，美国Abcam公司)喷涂于组装好的试纸条，37℃烘干4h，与样品垫、吸收垫组装成试纸条，备用。

(3)定性测定：往酶标板孔中加入样品液200μL，溶解金标抗体并混匀。将组装好的试纸条浸于微孔中，反应10min。通过肉眼观察检测线和控制线颜色深浅，可以初步判断样品阴、阳性。

(4)半定量测定：反应后的试纸条可用数字成像仪分析，利用软件Image J处理，得到标准孔试纸条检测线和控制线相对强度。以一系列浓度梯度粘杆菌素浓度作为横坐标，以每种粘杆菌素浓度对应的检测线与控制线相对强度作为纵坐标，建立标准曲线。同法可得到样品孔试纸条检测线与控制线相对强度，代入标准曲线即可得到待测样品中粘杆菌素含量。

(5)方法性能评价：

可视检测限：当检测线与控制线颜色相当时所对应的粘杆菌素浓度作为该法的可视检测限，经测定，该试纸条的可视检测限为3.7ng/mL(图6)。

仪器检测限：当检测线与控制线的相对强度下降20％时所对应的粘杆菌素浓度作为该法的仪器检测限，经计算，该试纸条的仪器检测限为0.87ng/mL(图6)。(0点其相对强度为2.02，当相对强度比0点下降20％，其相对强度的值约为1.62，代入标准曲线公式，即可得到其检测限)。

方法的准确度和精密度通过添加回收试验来考察，试验结果表明，在0.5～2.0mg/kg添加浓度范围内，粘杆菌素回收率在87％～115％之间，变异系数小于17％(表5)，说明该法准确度和精密度好，适于饲料中粘杆菌素现场快速准确监测。

表5饲料中粘杆菌素添加回收率(n＝4)

方法的特异性通过交叉反应来考察，利用组装好的试纸条分别对1μg/mL青霉素、氯霉素、杆菌肽、四环素、恩诺沙星和磺胺二甲嘧啶测定，并与空白对照。结果表明，这几种抗菌药测定结果与空白对照相近(图7)，说明青霉素、氯霉素、杆菌肽、四环素、恩诺沙星和磺胺二甲嘧啶对粘杆菌素的测定没有明显的交叉反应。

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种饲料前处理试剂，其特征在于，其为含有0.5％～1％Triton X-100和0.05M～0.1M柠檬酸钠的1％～2％的三氯乙酸溶液。

2.根据权利要求1所述的饲料前处理试剂，其特征在于：其为含有1％Triton X-100和0.1M柠檬酸钠的2％的三氯乙酸溶液。

3.权利要求1或2所述的饲料前处理试剂在提取样品中粘杆菌素的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，饲料粉碎后，与权利要求1或2所述的饲料前处理试剂按照1:50-1:200g/ml的比例混匀。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，混匀提取0.5-2h后，采用ELISA或胶体金免疫层析方法对混合溶液中的粘杆菌素进行检测。

6.一种快速准确检测饲料中粘杆菌素的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的饲料前处理试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为一步法ELISA试剂盒或胶体金免疫层析试剂条；所述一步法ELISA试剂盒为一抗和二抗同时加入酶标板孔中同时进行反应。