JP2003511701A - 乳汁中のハプトグロブビンを検出する乳腺炎の検定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 関連マーカーであるハプトグロビン（Ｈｐ）を利用して乳腺炎もしくは準臨床乳腺炎を予測または検出し、及び／または例えば乳牛における乳汁品質を試験する手段としてＨｐ−特異的抗体を用いる乳汁中のハプトグロビン（Ｈｐ）を検出する検定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】

本発明は、例えば、乳牛における乳腺炎または潜在性乳腺炎を予測または検出
する手段としての乳汁中のハプトグロビン（Ｈｐ）の検出のための検定法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】

乳腺炎は、乳汁廃棄、収量の減少、乳汁価値の低下、早期処分及び偶発的な死
亡率の増加を招くため、酪農業にとって非常に高くつき（エスルモント及びスピ
ンサー（Esslemont and Spincer）、１９９３年）、また、雌牛の状態に悪影響
を及ぼす主要な疾病の一つとして認識されている（メンジィス（Menzies）、１
９９５年）。従って、乳腺炎を早期に検出する方策を取ることは、家畜の早期治
療につながり、これにより、一般に乳汁品質及び動物の健康状態を維持しつつ乳
汁生産を改善するという点で特に有益である。

【０００３】 乳腺炎病原体の検出は、通常、乳腺炎診断の基礎をなす（ハーマン(Hamann)ら
、１９９７年）。例えば、黄色ブドウ球菌〔スタフィロコッカス・アウレウス(S
taphylococcus aureus)〕は乳牛における臨床的乳腺炎及び潜在性乳腺炎の原因
であることが知られている（エルスキン(Erskine) ら、１９８７年）。

【０００４】 例えば、英国特許出願ＧＢ９８／０３１３２号は、スタフィロコッカス・アウ
レウス抗原を乳牛から採取した血液試料と混合して使用し、血球中の増殖反応を
誘発する免疫学的検定方法を記載している。

【０００５】 さらに、乳腺炎検出の手段としての細胞増殖レベルの測定は、放射性ヌクレオ
チド添加後にシンチレーション計測を行なう方法を含め、多くの方法により測定
することができる。しかしながら、このような試験は、血液試料の採取という望
ましくない操作を含んでいる。

【０００６】 さらにこれに加えて、体細胞数計測（ＳＣＣ）が乳腺炎を検出するための手段
（高い体細胞数が乳腺炎状態を表わしている。）としてしばしば用いられている
（ピョレレ及びピョレレ(Pyoeraelae and Pyoeraelae) 、１９９７年）。しかし
ながら、この方法は望ましくない量の偽陽性結果が出ることがわかっており、不
正確な測定をもたらす。

【０００７】 乳腺炎を検出するために用いられる他の試験には、炎症性変化の検出を含むも
のが包含される。例えば急性相蛋白類として知られる一群の蛋白類は、感染、炎
症または外傷に反応して血中濃度に劇的な増加を示す。このような蛋白類にはハ
プトグロビン（Ｈｐ）、炭素反応性蛋白（ＣＲＰ）及び血清アミロイドＡ（ＳＡ
Ａ）が含まれる。

【０００８】 国際特許出願ＷＯ９５２２７６７号は、試料が乳汁である哺乳類におけるＣＲ
Ｐを測定するための検定法を開示している。しかしながら、ハーマンらによるそ
の後の研究（１９９７年）は、ＣＲＰレベルの測定が乳腺炎のような感染の予測
に使用できるのか否かについて疑問を提起した。

【０００９】 現在、血液、血清または血漿試料中の別の急性相蛋白、すなわちハプトグロビ
ンの検出に用いる検定法は、免疫学的検定方法；ヘモグロビン（Ｈｂ）へのＨｐ
の結合能力；またはハプトグロビン／ヘモグロビン複合体の過酸化酵素活性の測
定に基づいている。

【００１０】 ヒト血漿中のＨｐは、典型的には、ヒトＨｐ特異的抗血清を用いた抗体ベース
の方法により測定される。しかしながら、このような試験でもやはり血液試料の
採取が必要であり、さらに、何らかのかたちで血液分画を行なって血漿試料を得
なければならない場合が多い。これは時間がかかり、また、血液試料の採取を行
なう必要があることが理解されるであろう。

【００１１】 Ｈｐ−Ｈｂ結合に基づく最初の測定法は、Ｈｂの分光光度吸収特性が、Ｈｐ−
Ｈｂ複合体の形成により血漿試料中のＨｐの濃度に比例して変化するという知見
に基づいていた。英国特許出願ＧＢ９８／０３４０７号は、化学的手段を用いて
ハプトグロビン／ヘモグロビン複合体の過酸化酵素活性を測定することにより血
液中のＨｐを測定するための別法を開示している。しかしながら、乳汁中にはこ
のような測定法に影響する可能性のある非−Ｈｐ関連過酸化酵素活性が存在する
ため、この検定法は乳汁中のＨｐの測定には適用することができない。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】

本発明の目的は上記の問題点のいくつかを解消及び／または軽減することにあ
る。

【００１３】

【課題を解決するための手段】

本発明は、乳汁中のハプトグロビンが高い特異性をもって検出できるという本
発明者による発見等に基づいている。

【００１４】 従って、本発明は、 ａ）乳汁試料を得る工程、 ｂ）乳汁試料中に存在するハプトグロビンがハプトグロビン／抗体複合体を形成
するように、乳汁試料をハプトグロビン特異性抗体を含む試薬と接触させる工程
、及び ｃ）ハプトグロビン／抗体複合体を検出する工程 を含む乳汁試料中のハプトグロビンの存在をin vitroで検出するための免疫学的
検定方法を提供する。

【００１５】 測定法は、関連マーカーであるハプトグロビンを用いるもので、一般に乳腺炎
または潜在性乳腺炎を予測または検知するために使用される。

【００１６】 免疫学的検定方法は、抗原と抗体が反応して複合体を形成し、得られる複合体
が検出される多様な公知の手法のいずれかを採ることができる。このような手法
には、比濁法、拡散検定、凝集反応検定、ＥＬＩＳＡベース検定、放射線免疫検
定、免疫クロマトグラフィー、電気免疫学的検定、表面作用免疫学的検定などに
基づく免疫学的検定方法が含まれる。従って、ハプトグロビン特異性抗体を取り
入れるこの測定システムは、乳汁試料中に存在するいずれかのハプトグロビンが
抗体と接触することができるようにゲル、溶液、紙、膜、バイオセンサーなどの
形を取り得る。理想的には、このような形式は搾乳中に自動化されたシステムの
使用により、乳汁中のハプトグロビンを検出するために用いられる。

【００１７】 一つの実施形態としては、本発明の免疫測定法は単一放射状免疫拡散（ＳＲＩ
Ｄ）検定法の手法を取る。このような検定法において、乳汁は寒天（またはアガ
ロース）ゲルの層に切り込んだウエルに置かれて、ハプトグロビン特異性抗体を
含み適宜希釈された抗血清を含有する周囲の寒天中に拡散せしめられる。抗原の
濃度が高ければ高いほど拡散距離は拡がる。

【００１８】 ＳＲＩＤ測定法は、抗体と結合し沈殿した乳汁中のハプトグロビンによって形
成された沈殿リングのサイズから乳汁中のハプトグロビン抗原の濃度を検出し測
定するために使用することができる。沈殿リングは、当業者には公知の蛋白染色
法のような適当な手段により検出することができ、濃度既知のハプトグロビン抗
原を基準を用いて得られた標準校正曲線と相関させることができる。

【００１９】 上述した測定法の他の手法では、ハプトグロビン／抗体複合体を慣用の技術を
用いて検出することができる。例えば抗体は放射性同位元素、蛍光性マーカーま
たは好適な基質の添加で発色反応生成物を与えることができる酵素で、直接的ま
たは間接的にラベルすることができる。間接的なラベリングには、ハプトグロビ
ン／抗体複合体の抗体と特異的に反応するラベルされた抗体の添加が含まれる。

【００２０】 典型的には、試料はいずれの乳汁試料でもよい。一般的にいえば、試料はヒト
を含む哺乳動物のような任意の乳汁生産動物から得ることができる。しかしなが
ら、乳汁試料は、一般に乳汁生産を改善するために乳腺炎の早期検知が重要な雌
牛、羊及び山羊のような商業的な乳汁生産動物から得ることができる。 もし適切であれば、乳汁試料を測定に付する前に希釈することができる。

【００２１】 典型的には、高い力価のハプトグロビン特異性抗体を含有する血清の試料によ
り抗体を提供できる。別法として、ハプトグロビン特異性モノクローナル抗体を
使用することができる。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のような抗体
を得るための技術は当業者には周知である。

【００２２】 本発明を実施例によってさらに説明するが、本発明の範囲はこの実施例に限定
されるものではない。

【００２３】 実施例１ 乳腺炎を検出するための乳汁中ハプトグロビンの免疫学的検定方法試薬 原液 ・トリス緩衝塩類(saline)（ＴＢＳ）５００ｍｍｏｌ／ｌ 〔トリス(tris)ｐＨ７．４及び９．０％ＮａＣｌ〕 ・脱色液：エタノール：ｄＨ₂Ｏ：酢酸の９：９：２混合物 ・クーマシーブリリアントブルー染色液 〔Coomassie brilliant blue stain（Ｇ２５０）、脱色液中０．５％〕

【００２４】 使用溶液 ・蒸留水（ｄＨ₂Ｏ）で１０倍希釈されたＴＢＳ原液 ・0.9％ＮａＣｌの濃度既知ハプトグロビン血清試料における一連の希釈の標
準曲線（1.4〜0.02ｍｇ／ｍｌの範囲における標準濃度を与えるもの） 他の材料 ・アガロースとアガロースゲル取付け用ゲルボンド(Gelbond)シート〔英国プ
ーレ所在のシグマ・ケミ社(Sigma Chem Co,Poole,UK)〕

【００２５】 試料 グラスゴー大学で商業的に飼育している牛の群れにおいて、臨床的乳腺炎を有
する２９頭の乳牛からなる１／４区(quarter)から手搾りで乳汁試料が集められ
た。乳腺炎は、乳汁中の凝血塊(clot)の存在（軽症の乳腺炎と定義される。）に
よるか、または感染１／４区における凝血塊に加え観察し得る炎症の存在（中等
症の乳腺炎として定義される。）により診断した。試料はまた、体細胞数測定と
通常の細菌学検査にも付した。動物内対照区として用いるため、感染した１／４
区と筋向いの(diagonally opposite)１／４区からも乳汁試料を採取した。また
、動物間対照区として用いるため、同じ乳牛の群れの１６頭の健康な雌牛からな
る１／４区２群（筋向いに位置する）からも試料を採取した。

【００２６】 方法 アガロース（0.224gであり最終濃度として1.5％）をＴＢＳ緩衝液１５ｍｌに
添加し電子レンジ中で６０秒間加熱して溶解させた。溶けたアガロースを５６℃
にて水槽に入れ平衡させた。牛ハプトグロビンに対する羊の抗血清を適当量（0.
6ｍｌ）添加して緩やかにアガロースと混合した。この抗体含有アガロースをゲ
ルボンドの水平なシート（７５ｍｍ×１００ｍｍ）上に水平面となるように注ぎ
、凝固させた。アガロースに穴をあけて（直径2.0ｍｍ）、余分なアガロースを
除去した。試料（必要により0.9％ＮａＣｌで希釈）または標準液をウエル（８
μｌ）中にピペット注入し、アガロースゲルを調湿チャンバー中４℃にて４８時
間までインキュベートした。

【００２７】 アガロースゲルを目視検査し、次いで塩類（0.9％ＮａＣｌ）で３０分間洗浄
し、濾紙及び数層の吸湿紙でカバーし、そして３０分間重しをかけて加圧してゲ
ルから緩衝液と沈殿しない蛋白を搾った。ゲルは塩類で３０分間洗浄し、蒸留水
での最終洗浄と最終加圧によりさらに２サイクル加圧した。ゲルプレートを３７
℃培養器で乾燥し、次いでクーマシーブリリアントブルー染色液中に１０〜１５
分間置き、脱色液に移し素地が透明になるまで置いた。暗青色に染色された円形
沈殿物の直径を測定し、標準液からの結果を３サイクルログペーパーの濃度に対
してプロットした。標準曲線から試験結果を読み取った。

【００２８】 結果 ａ）感染１／４区及び筋向い対照１／４区から得た乳汁中のハプトグロビン 感染１／４区から得た乳汁中のハプトグロビンの濃度は＜0.02ｍｇ／ｍｌ（検
出不能）から2.15ｍｇ／ｍｌまでの範囲であった（表１、図１）。試料中の４例
はハプトグロビンが検出不能水準であった。対照的に乳腺炎感染１／４区と筋向
い１／４区からは２９例の乳汁試料のうち２５例でハプトグロビンが検出不能水
準であった。

【００２９】

【表１】

【００３０】 ｂ）健康な対照動物中の筋向い１／４区からの乳汁中のハプトグロビン 健康な雌牛の１／４区からの乳汁試料のどれもが（表２参照）検出可能な濃度
のハプトグロビンを有していなかった。

【００３１】

【表２】

【００３２】 ｃ）乳腺炎の検出のための乳汁中のハプトグロビン測定の評価

【表３】

【００３３】 これらの結果（表３）は、乳汁ハプトグロビンについての試験は乳腺炎罹患動
物の診断について１００％の特異性を有することを示し、偽陽性結果が得られな
いことを示す。このことは体細胞数計測のような現在使用されている試験に優る
大きな特長である。ハプトグロビンは検出不能水準量が正常な動物の血液循環中
に存在するが、感染または炎症の直接的結果として急性相反応中の血液にだけ現
れるという点からすれば、この発見は、ハプトグロビンの急性相反応に関係する
ものである。特定の理論に拘束されるものではないが、乳汁中のハプトグロビン
は血清ハプトグロビンに由来し、それ故、健康な乳牛においては乳汁中のハプト
グロビン濃度が常にこの検定法による検出限界よりも低くなると考えられる。さ
らに、ハプトグロビンは乳腺炎後の乳汁に現れて乳腺中の免疫細胞によりサイト
カイン(cytokine)の刺激を生ずると思われる。これらのメディエイター(mediato
r)は肝臓からのハプトグロビン放出の増大を導き、感染１／４区中では乳腺炎に
対する炎症反応のもう一つの結果である血液−乳腺関門の破損が起こるため、ハ
プトグロビンは血液から感染１／４区中に通過できるのである。

【００３４】 感染した１／４区を表面的に健康な１／４区の全てと比較すると、その結果は
乳汁ハプトグロビン試験の特異性が９３％であることを示している。これは感染
した１／４区とは反対の１／４区からの乳汁試料４例が検出可能なレベルのハプ
トグロビンを有していたためである。これらの表面的には健康な１／４区の若干
または全てが潜在性乳腺炎に罹患していた可能性があるが、これはさらに一層の
研究により確認する必要がある。これらの１／４区が潜在性乳腺炎に罹患してい
なかったとしても、なお乳汁の品質に影響する血清蛋白の漏洩が生じていたこと
は明らかであり、それ故に熟練のオペレーターにとって、ハプトグロビン試験が
乳汁品質の劣化並びに乳腺炎を検出することは明らかである。

【００３５】 乳腺炎マーカーとしての乳汁ハプトグロビンの感度は、感染１／４区からの乳
汁に４例の偽陰性結果が記録されたので、個々の動物の比較及び１／４区間の比
較の両方において８６％であった。

【００３６】

【発明の効果】

乳汁ハプトグロビンを測定することによる乳腺炎診断の重要な利点は、これら
の知見から導かれた陽性試験の高い特異性と予測値である。それ故、乳汁中のハ
プトグロビンのための陽性試験によりいずれの動物も乳腺炎を有するとして識別
され、従って治療を含む早期の処置を可能にするのである。 参考文献 １．エスルモント及びスピンサー（１９９３年）、ザ・デアリー・レポート第２
号，リーディング大学農学部(Esslemont and Spincer, (1993) The Dairy Repor
t No.2, Department of Agriculture, University of Reading)。 ２．メンジース他（１９９５年）、Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．， １３７，５３１〜５３
６頁 (Menzies et al., (1995) Vet. Rec., 137, 531-536)。 ３．ハーマン，Ｊ．他（１９９７年）、ミルヒヴィッセンシャフト ５２，５４
６〜５５０頁(Hamman, J. et al., (1997) Milchwissenschaft, 52, 546-550)。 ４．エルスキン他（１９８７年）、ＪＡＶＭＡ、１９０，１４１１〜１４１６頁
(Erskine et al, (1987) JAVMA, 190,1411-1416)。 ５．ピョレレ，Ｓ．及びピョレレ，Ｅ．（１９９７年）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃ
ｉ．，８０，２８２０〜２８２５頁(Pyoeraelae, S. and Pyoeraelae, E., (199
7) J. Dairy Sci., 80, 2820-2825)。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明方法の効果を示すための乳汁中のハプトグロビン濃度を表
すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フィッツパトリック，ジュリー，リディア イギリス国，グラスゴー ジー61 １キュ ーエイチ，ビアズデン・ロード，ユニバー シティー・オブ・グラスゴー・ベタリナリ ー・スクール，デパートメント・オブ・ベ タリナリー・クリニカル・スタディーズ (72)発明者 ノーラン，アンドレア，メアリー イギリス国，グラスゴー ジー61 １キュ ーエイチ，ビアズデン・ロード，ユニバー シティー・オブ・グラスゴー・ベタリナリ ー・スクール，デパートメント・オブ・ベ タリナリー・クリニカル・スタディーズ (72)発明者 マッコム，クリストファー イギリス国，グラスゴー ジー61 １キュ ーエイチ，ビアズデン・ロード，ユニバー シティー・オブ・グラスゴー・ベタリナリ ー・スクール，デパートメント・オブ・ベ タリナリー・クリニカル・スタディーズ Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA11 DA13

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）乳汁試料を得る工程、 ｂ）乳汁試料中に存在するハプトグロビンがハプトグロビン／抗体複合体を形成
   するように、乳汁試料をハプトグロビン特異性抗体を含む試薬と接触させる工程
   、及び ｃ）ハプトグロビン／抗体複合体を検出する工程 を含む乳汁試料中のハプトグロビンの存在をイン・ビトロ(in vitro)で検出する
   ための免疫学的検定方法。
2. 【請求項２】 前記免疫学的検定方法が、関連マーカーであるハプトグロビ
   ンによって乳腺炎または潜在性乳腺炎を予測し、または検出するために使用され
   る請求項１に記載の免疫学的検定方法。
3. 【請求項３】 前記免疫学的検定方法が、乳汁の品質を試験するために使用
   される請求項１に記載の免疫学的検定方法。
4. 【請求項４】 前記免疫学的検定方法が、比濁法、拡散検定、凝集反応検定
   、ＥＬＩＳＡベース検定、放射線免疫検定、免疫クロマトグラフィー、電気免疫
   学的検定、表面作用免疫学的検定などに基づく手法である先行するいずれかの請
   求項に記載の免疫学的検定方法。
5. 【請求項５】 前記免疫学的検定方法が、単一放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）
   検定の形をとる先行するいずれかの請求項に記載の免疫学的検定方法。
6. 【請求項６】 前記ハプトグロビン特異性抗体が、ゲル、溶液、紙、膜、バ
   イオセンサーなどに含有されている先行するいずれかの請求項に記載の免疫学的
   検定方法。
7. 【請求項７】 前記ゲルが、寒天（またはアガロース）ゲルの形をとる先行
   するいずれかの請求項に記載の免疫学的検定方法。
8. 【請求項８】 前記ハプトグロビン／抗体複合体が、ハプトグロビン特異性
   抗体を含む適宜希釈された抗血清を含有する寒天中に試料を拡散させることによ
   り形成される先行するいずれかの請求項に記載の免疫学的検定方法。
9. 【請求項９】 前記抗体が、放射性同位元素、蛍光性マーカーまたは適当な
   基質の添加で発色反応生成物を与えることができる酵素により、直接的または間
   接的にラベルされる先行するいずれかの請求項に記載の免疫学的検定方法。
10. 【請求項１０】 前記間接的ラベリングが、ハプトグロビン／抗体複合体の
    抗体と特異的に反応するラベルされた抗体の添加を含む先行するいずれかの請求
    項に記載の免疫学的検定方法。
11. 【請求項１１】 前記試料が、任意の乳汁生産動物から得られる先行するい
    ずれかの請求項に記載の免疫学的検定方法。
12. 【請求項１２】 前記乳汁生産動物が、ヒトを含む哺乳動物である先行する
    いずれかの請求項に記載の免疫学的検定方法。
13. 【請求項１３】 乳汁生産動物が、雌牛、羊、及び山羊のような商業的な乳
    汁生産動物である先行するいずれかの請求項に記載の免疫学的検定方法。
14. 【請求項１４】 前記試料が、検定に付す前に希釈される先行するいずれか
    の請求項に記載の免疫学的検定方法。
15. 【請求項１５】 前記免疫学的検定方法が、搾乳中、自動化されたシステム
    の使用により乳汁中のハプトグロビンを検出する先行するいずれかの請求項に記
    載の免疫学的検定方法。
16. 【請求項１６】 抗体が、高い力価のハプトグロビン特異性抗体を含有する
    血清試料により提供される先行するいずれかの請求項に記載の免疫学的検定方法
    。
17. 【請求項１７】 抗体が、ハプトグロビン特異性モノクローナル抗体である
    先行するいずれかの請求項に記載の免疫学的検定方法。