CN102286608A - 衣原体诊断方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于诊断衣原体感染的新方法，具体而言包括下列步骤：a)收集受试者的标本；b)检测标本中的α-甘露糖苷酶活性；c)α-甘露糖苷酶活性高于诊断实验临界值时，受试者即可诊断为衣原体阳性患者。本发明诊断方法中的衣原体为沙眼衣原体或肺炎衣原体，受试者标本可以是尿道分泌物、精液、前列腺液、尿液、宫颈分泌物、阴道分泌物、痰液或咽分泌物。本发明还涉及可用于所述方法的试剂盒，包括选自α-甘露糖苷酶显色底物或α-甘露糖苷酶产荧光底物的检测α-甘露糖苷酶活性的α-甘露糖苷酶酶促底物，这种试剂盒用途是诊断衣原体的有无。

Description

衣原体诊断方法和试剂盒

所属技术领域

本发明属于检测技术领域，涉及通过检测受试者标本α-甘露糖苷酶(α-mannosidase，α-Manase)活性，诊断受试者感染衣原体(Chlamydia)与否的方法和试剂盒。

背景技术

衣原体为革兰氏阴性病原体，在自然界中传播很广泛。它没有合成高能化合物ATP、GTP的能力，必须由宿主细胞提供，因而成为能量寄生物，多呈球状、堆状，有细胞壁，以一般寄生在动物细胞内。从前它们被划归病毒，后来发现自成一类。它是一种比病毒大、比细菌小的原核微生物，呈球形，直径只有0.3-0.5um，它无运动能力，衣原体广泛寄生于人类，哺乳动物及鸟类，仅少数有致病性。

已知的与人类疾病有关的衣原体有三种，分别是鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)。其中鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体仅引起肺部感染，而沙眼衣原体则可引起眼部、泌尿生殖道以及肺部感染。鹦鹉热衣原体可通过感染有该种衣原体的禽类，如鹦鹉、孔雀、鸡、鸭、鸽等的组织、血液和粪便，以接触和吸入的方式感染给人类。沙眼衣原体和肺炎衣原体主要在人类之间以呼吸道飞沫、母婴接触和性接触等方式传播。

目前检测衣原体技术发展很快，方法日渐增多，有细胞培养法、抗原抗体免疫学检测、生化检测以及核酸检测等方法，但这些方法应用于临床都存在这样或那样的问题。由于鹦鹉热衣原体不常见，临床上常见的是检测沙眼衣原体和肺炎衣原体。

1.细胞培养法：可选用McCoy细胞、Hela-229细胞和BHK细胞等对衣原体敏感的长成单层的细胞，最常用的是经放线菌酮处理的单层McCoy细胞，载体可用玻璃小瓶或塑料培养板，在底部可预置适当大小的盖玻片。接种标本后，1800-3000g离心1h，促进原体(Elementary body，EB)进入细胞。吸附1h，吸去上清液，加入含放线菌酮0.5ug/ml的1640维持液，35℃CO₂孵箱或密封培养，48-72h后取出盖玻片，漂洗、甲醇固定后，可作吉姆萨(Giemsa)、碘液或单克隆抗体荧光抗体染色，高倍显微镜或荧光显微镜下观察包涵体(Inclusionbody，IB)。必要时，亦可作盲目传1-3代。

资料上一般说细胞培养法的敏感性为80％-90％(但实际采用标本不到50％)，特异性为100％，是目前诊断衣原体感染最可靠的方法，因此是评价其他实验室诊断方法的金标准。这种方法除了灵敏度存在较大的问题，操作过于复杂也是此法不能用于常规临床检测的重要原因。

2.免疫层析法检测衣原体抗原：免疫层析法(Immunochromatography)是二十世纪九十年代兴起的一种基于免疫胶体金技术(Immune colloidal goldtechnique)的快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维膜(Nitrocellulose membrane)的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素膜一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。这种方法用于检测衣原体一般采用双抗体夹心检测衣原体脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)抗原。

此法由于操作简单方便，是目前检测衣原体最常运用的技术。但由于脂多糖分子量小，且在细胞壁内，需要一个提取方法，可能使抗原提取不出来或抗原被破坏，致使该方法灵敏度偏低。

3.微量免疫荧光法：微量免疫荧光(Micro-immunofluorescence，MIF)技术，是检测衣原体抗体较好的方法。检测肺炎衣原体抗体，特异性IgM滴度≥1∶16和(或)IgG≥1∶512或双份血清滴度4倍以上升高者，均可诊断急性感染。如IgM≤1∶16或IgG≤1∶512，则为既往感染。本方法特异性敏感性均较高，且可用于区分原发感染和再感染，是目前最常用且最敏感的血清学方法。此项技术可作分离物的血清学分型，也可严格应用于血清流行病学的研究。它可给人们提供多方面有用的资料：临床致病谱和感染的后果，在不同人群中流行病学的分布。

这是一种主观性较强的试验，因此观察者需要有丰富的实践经验。一般认为此法不适用于诊断衣原体的早期感染，且敏感性和特异性均不高。然而此方法作为流行病学调查，颇为简便。

4.核酸检测技术：这项技术用于检测衣原体主要有连接酶链反应(Ligasechain reaction，LCR)、转录介导的扩增试验(Transcription mediated amplification，TMA)、聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)、半巢式聚合酶链反应-微空板杂交法(Semi-nested polymerase chain reaction，Semi-nested PCR)、巢式聚合酶链反应(Nested polymerase chain reaction，nPCR)、实时荧光聚合酶链反应定量检测(Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)。

此类技术理论上灵敏度和特异性都比较高，但临床实际这两方面都存在较大的问题，而且此类方法操作复杂，技术要求高，不足于应用临床实际。

5.生化法检测衣原体：这是王则宇等在中国专利：生殖道沙眼衣原体快速诊断试剂(ZL01133660.9)介绍的一种方法。可通过检测衣原体侵入细胞产生包涵体富含糖原(Glycogen)，致使分泌物中糖含量明显增加，可通过检测糖含量来间接地检测衣原体的存在。

此法虽然相比细胞培养、酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immuno-sorbentassay，ELISA)以及核酸检测等操作简单，但由于还需要高温加热和离心等过程，与免疫层析法相比还是过于复杂。该技术的灵敏度虽然比较高，但特异性不足，比如念珠菌存在可造成假阳性，特别在女性月经周期和孕期，阴道上皮糖含量明显增加，也可能会造成假阳性。

鉴于沙眼衣原体和肺炎衣原体是人体健康的危害，以及现有检测衣原体方法存在的缺点，研究设计一种适合临床检测需要的衣原体快速检测方法显得尤为迫切！

发明概述

本发明人意外地研究发现，可以通过检测受试者标本α-甘露糖苷酶活性，直接诊断受试者标本衣原体的有无。基于这一意外发现，本发明涉及一种诊断衣原体感染的新方法，包括下列步骤：

a)收集受试者的标本；

b)检测标本中的α-甘露糖苷酶活性；

c)α-甘露糖苷酶活性高于诊断实验临界值时，受试者即可诊断为衣原体阳性患者。

本发明诊断方法中的衣原体为沙眼衣原体或肺炎衣原体，受试者标本可以是尿道分泌物、精液、前列腺液、尿液、宫颈分泌物、阴道分泌物、痰液或咽分泌物。

本发明还涉及一种衣原体诊断的试剂盒，包括选自α-甘露糖苷酶显色底物或α-甘露糖苷酶产荧光底物的检测α-甘露糖苷酶活性的α-甘露糖苷酶酶促底物，这种试剂盒用途是诊断衣原体的有无。

发明详述

α-甘露糖苷酶是指，按照国际生物化学联合会命名委员会(NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry)的命名规则，被分类为EC.3.2.1.24的酶，它主要参与甘露糖α-1，2、α-1，3、α-1，6糖苷键的水解过程。α-甘露糖苷酶为一个酶家族的总称，有多种类型，各有不同的底物特异性，位于细胞不同的部位。根据来源以及物理化学特性，主要是最适反应的pH，把它们分为3大类：酸性(溶酶体)、弱酸性(高尔基体)和中性(胞浆)。溶酶体或酸性α-甘露糖苷酶是大多数组织中占优势的α-甘露糖苷酶，具有酸性的最适pH 4.0-4.5，相对较稳定，Zn²⁺能激活其活性，位于细胞的溶酶体中。中性或胞浆α-甘露糖苷酶不稳定，它们需要中性的最适pH，金属离子对此酶活性无大的影响。弱酸性或高尔基体α-甘露糖苷酶的最适pH为5.5-6.0，介于酸性与中性之间，能被钙离子激活而被发现，主要位于高尔基体内。

目前有关α-甘露糖苷酶的研究文献(Kukuruzinska MA，Lennon K.ProteinN-glucosylation：molecular genetics and functional significance[J].Crit Rev OralBiol Med，1998，9(4)：415-448；Nilssen O，Berg T，Riise HM，et al.alpha-Mannosi-dosis：functional cloning of the lysosomal alpha-mannosidase cDNA and identifyca-tion of a mutation in two affected siblings[J].Hum Mol Genet，1997，6(5)：717-726；Pittis MG，Montalvo ALE，Heikinheimo P，et al.Funtional characterization offour novel MAN2B1 mutations causing juvenile onset alpha-mannosidosis[J].ClinChim Acta，2007，375：136-139；Kuokkanen E，Riise HM，Smith W，et al.Molecularand cellular characterization of novel{alpha}-mannosidosis mutations[J].HumMol Genet，2011，published online)主要涉及由α-甘露糖苷酶发生障碍导致的疾病，包括有先天性红细胞生成异常性贫血Ⅱ型(Congenital DyserythropoieticAnemia Type II，HEMPAS)和甘露糖苷贮积症(α-Mannosidosis)，没有涉及衣原体与α-甘露糖苷酶的关系。虽然文献(Greenwell P，Kakourou G，Rughooputh S.Analysis of glycosidases activity in Chlamydia trachomatis L2 serotype.InternetJournal of Medical Update，2006，Jan-Jun，1(1)：25-32)研究了Chlamydiatrachomatis，SA₂F(L2)包括α-甘露糖苷酶在内的十一种糖苷酶活性，虽然指出α-甘露糖苷酶可能存在Chlamydia trachomatis，SA₂F(L2)细胞表面，而且活性比较高，但没有提及是否可以通过检测α-甘露糖苷酶活性来指示Chlamydiatrachomatis，SA₂F(L2)的存在，更没有研究沙眼衣原体其它血清型、肺炎衣原体以及机体相应部位标本可能存在的其他微生物是否有α-甘露糖苷酶活性，是否可以通过检测α-甘露糖苷酶活性来直接指示受试者标本中衣原体的存在。

发明人意外地研究发现，沙眼衣原体和肺炎衣原体都有很强的α-甘露糖苷酶活性，而受试者相应部位标本可能存在的其他微生物如淋球菌、解脲支原体、人型支原体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔氏念珠江菌等都不具有或仅具有极弱的α-甘露糖苷酶活性，因此可以通过检测受试者标本的α-甘露糖苷酶活性，直接诊断受试者是否感染衣原体。

正是基于这一意外发现，本发明涉及一种诊断衣原体感染的新方法，包括下列步骤：

a)收集受试者的标本；

b)检测标本中的α-甘露糖苷酶活性；

c)α-甘露糖苷酶活性高于诊断实验临界值时，受试者即可诊断为衣原体阳性患者。

本发明诊断方法中的衣原体为沙眼衣原体或肺炎衣原体，受试者标本可以是尿道分泌物、精液、前列腺液、尿液、宫颈分泌物、阴道分泌物、痰液或咽分泌物。

本发明还涉及一种衣原体诊断的试剂盒，包括选自α-甘露糖苷酶显色底物或α-甘露糖苷酶产荧光底物的检测α-甘露糖苷酶活性的α-甘露糖苷酶酶促底物，这种试剂盒的用途是诊断衣原体的有无。

适合于本发明目的的α-甘露糖苷酶酶促底物，是为本领域技术人员所已知的能够证明α-甘露糖苷酶酶促活性的任何底物，这样的底物可以是显色底物或产荧光的底物。作为实例，可以提及基于吲哚酚衍生物的显色底物，基于萘酚衍生物的显色底物，基于萘胺衍生物的显色底物，基于硝基苯衍生物的显色底物，基于苯胺衍生物的显色底物，基于苯酚衍生物的显色底物，基于伞形酮衍生物的产荧光的底物以及基于香豆素衍生物的产荧光的底物。

本发明的一个优选方案采用的α-甘露糖苷酶酶促底物是基于吲哚酚衍生物的显色底物，这样的吲哚酚衍生物的实例包括对6-氯-3-吲哚-a-D-甘露糖苷、6-溴-3-吲哚-a-D-甘露糖苷、5-溴-3-吲哚-a-D-甘露糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚-a-D-甘露糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚-a-D-甘露糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚-N-甲基-a-D-甘露糖苷，其中对于5-溴-4-氯-3-吲哚-a-D-甘露糖苷是特别优选的。

本发明的另一个优选方案采用的α-甘露糖苷酶酶促底物是基于苯胺衍生物的显色底物，这样的苯胺衍生物的实例包括对氨基苯基-α-D-甘露糖苷(4-氨基苯基-α-D-甘露糖苷)、邻氨基苯基-α-D-甘露糖苷(2-氨基苯基-α-D-甘露糖苷)、间氨基苯基-α-D-甘露糖苷(3-氨基苯基-α-D-甘露糖苷)，其中对氨基苯基-α-D-甘露糖苷是特别优选的。

使用本发明的方法，可以把α-甘露糖苷酶酶促底物固化到固相载体以于化学的形式形成产品进行检测，也可以把α-甘露糖苷酶酶促底物配成溶液以液体的形式形成产品进行检测。这两种形式的产品都可以通过仪器进行自动化或半自动化操作，而且α-甘露糖苷酶酶促显色底物的这两种形式产品还可以直接通过肉眼观察颜色变化判断结果。承接固化α-甘露糖苷酶酶促底物的固相载体可以是棉浆纸、滤纸、玻璃纤维或塑料等。

针对不同的α-甘露糖苷酶酶促显色底物，为达到显色或颜色变化或提高灵敏度的效果，可以采用为本领域技术人员所已知的方法，比如针对基于吲哚酚衍生物的显色底物可以直接显色，也可以添加重氮盐(Diazonium salts)来增强显色的灵敏度；针对基于萘酚衍生物的显色底物，可以添加重氮盐或氧化剂(Oxidant)来显色；针对基于萘胺衍生物的显色底物，也可以添加重氮盐或氧化剂来显色；针对基于硝基苯衍生物的显色底物，可以制造碱性环境来显色；针对基于苯胺衍生物的显色底物，也可以添加重氮盐或氧化剂来显色；针对基于苯酚衍生物的显色底物，同样可以添加重氮盐或氧化剂来显色。

针对基于吲哚酚衍生物的α-甘露糖苷酶酶促显色底物，可以采用为本领域技术人员所已知的重氮盐来增强显色的灵敏度，比如固紫B盐(Fast violet Bsalt)、固蓝B盐(Fast violet B salt)等。

针对通过添加氧化剂来显色的α-甘露糖苷酶酶促显色底物，可以采用为本领域技术人员所已知的氧化剂，比如过氧化氢(Hydrogen peroxide)、过氧化脲(Urea hydrogen peroxide)、三氯化铁(Ferric trichloride)等。

针对通过添加氧化剂来显色的α-甘露糖苷酶酶促显色底物，标本中可能存在的氧化剂可能影响检测的特异性，可以采用为本领域技术人员所已知的方法，比如添加还原剂，添加的还原剂可以有维生素C(Vitamin C)、维生素E(VitaminE)、维生素K(Vitamin K)、巯基乙醇(Thioglycol)等。

通过本发明方法，不仅实现衣原体的快速检测，而且能够解决目前细菌鉴定仪不能诊断鉴别衣原体的缺点，把本发明的方法用于细菌鉴定仪，丰富细菌鉴定仪的功能。

实施例

实施例一：

一、本发明方法试剂制备：

配制100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.0，内含1％【v/v】Triton X-100)，即得α-D-甘露糖苷酶检测样品处理试剂。

称5-溴-4-氯-3-吲哚-a-D-甘露糖苷(SIGMA公司，CAS号125229-64-3)用100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.0，内含1％【v/v】Triton X-100)溶解后，使5-溴-4-氯-3-吲哚-a-D-甘露糖苷浓度达到1mg/ml，混合均匀，即得α-D-甘露糖苷酶检测显色试剂。

二、本发明试剂使用方法：

1、分泌物标本拭子，置于一洁净试管中，加入α-D-甘露糖苷酶检测样品处理试剂300-400μl，充分搅拌拭子，使拭子中的分泌物充分溶解于样品处理试剂中。

2、取检测条，每孔加入α-D-甘露糖苷酶检测显色试剂50-100μl，再加入上述已溶解分泌物的样品处理试剂50μl，振荡混合均匀，室温放置10分钟。

3、目测或仪器判读结果，其中目测根据颜色变化与否，仪器判读根据检测值与预置界值的差异与否。

实施例二：

一、本发明方法试剂制备：

称对氨基苯基-α-D-甘露糖苷(北京凯森莱公司，CAS号34213-86-0)用100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.0，内含1％【v/v】Triton X-100)溶解后，使其浓度达到2mg/ml，混合均匀。按15ul/片加到5mm边长的制片上，干燥过夜，即得α-D-甘露糖苷酶检测试剂。

称氯化钠用纯化水溶解后，使氯化钠浓度达到0.9％【w/v】，往此溶液中加维生素C，混合均匀，使维生素C的浓度达到0.125％【w/v】，即得α-D-甘露糖苷酶检测样品处理A试剂。

称过氧化脲用0.05％【w/v】酒石酸(Tartaric acid)溶液溶解后，使过氧化脲的浓度达到0.125％【w/v】，即得α-D-甘露糖苷酶检测样品处理B试剂。

二、本发明试剂使用方法：

1、分泌物标本拭子，置于一洁净试管中，加入α-D-甘露糖苷酶检测样品处理A试剂4滴(约200μl)和α-D-甘露糖苷酶检测样品处理B试剂4滴(约200μl)，充分搅拌拭子，使拭子中的分泌物充分溶解于样品处理试剂中。

2、取检测条，每孔加入上述已溶解分泌物的样品处理试剂1滴(约50μl)，振荡混合均匀，室温放置10分钟。

3、目测或仪器判读结果，其中目测根据颜色变化与否，仪器判读根据检测值与预置界值的差异与否。

临床基本情况

以实施例二的试剂为例。306例郑州大学第一附属医院性病门诊患者189例和妇科门诊患者117例，其中男性122例，用无菌拭子取尿道分泌物或前列腺按摩液各三份(尿道分泌物101例，前列腺按摩液21例)，女性184例，通过扩阴器，用无菌拭子取宫颈分泌物或阴道分泌物各三份(宫颈分泌物124例，阴道分泌物60例)。这些患者就诊前一周没有使用任何抗生素。

其中一份标本采用本发明方法检测α-D-甘露糖苷酶来指示沙眼衣原体的有无，一份标本采用细胞培养法直接检测沙眼衣原体的有无，另一份标本采用连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)检测沙眼衣原体核酸来指示沙眼衣原体的有无。沙眼衣原体细胞培养采用以McCoy细胞为宿主细胞、经放线菌酮处理的方法，LCR采用美国雅培公司(Abbott)LCx分析仪及相应的试剂盒，严格按试剂盒说明书操作。由于沙眼衣原体细胞培养虽然特异性可达100％，但其敏感性受各种因素的影响较大。因此本次临床得结果分析判断标准采用“扩大的金标准”(Expanded Gold Standard)即所有细胞培养阳性者均为真阳性，任意两种试验同时为阳性者判为真阳性。

三种沙眼衣原体检测方法检测306例标本结果

经卡方检验(Chi-square test)，本发明试剂盒X²＝0.2，P＞0.05，与扩大的金标准相比无显著性差异，细胞培养法X²＝19，P＜0.05，与扩大的金标准相比有显著性差异，LCR法X²＝0.2，P＞0.05，与扩大的金标准相比无显著性差异。临床结果表明本发明方法检测鉴别沙眼衣原体的灵敏度为96.49％，特异性为98.80％，灵敏度远高于细胞培养法，结合到本发明方法操作的简便性，本发明方法可以满足临床检测沙眼衣原体的需要。

Claims (10)

1.一种衣原体诊断方法，包括下列步骤：

a)收集受试者的标本；

b)检测标本中的α-甘露糖苷酶活性；

c)α-甘露糖苷酶活性高于诊断实验临界值时，受试者即可诊断为衣原体阳性患者。

2.如权利要求书1所述的衣原体诊断方法，其特征在于衣原体为沙眼衣原体或肺炎衣原体。

3.如权利要求书1所述的衣原体诊断方法，其特征在于受试者标本为尿道分泌物、精液、前列腺液、尿液、宫颈分泌物、阴道分泌物、痰液或咽分泌物。

4.一种衣原体诊断的试剂盒，包括选自α-甘露糖苷酶显色底物或α-甘露糖苷酶产荧光底物的检测α-甘露糖苷酶活性的α-甘露糖苷酶酶促底物。

5.如权利要求书4所述的衣原体诊断试剂盒，其特征在于试剂盒的用途是诊断衣原体的存在。

6.如权利要求书4所述的衣原体诊断试剂盒，其特征在于试剂盒根据受试者标本的不同，增减标本处理液、增强酶反应的增强剂以及祛除干扰的抗干扰剂。

7.如权利要求书4所述的衣原体诊断试剂盒，其特征在于试剂盒可以通过仪器进行自动化或半自动化操作，而且α-甘露糖苷酶酶促显色底物的这种形式检测试剂盒还可以直接通过肉眼观察颜色变化判断结果。

8.如权利要求书4所述的衣原体诊断试剂盒，其特征在于试剂盒使用的显色底物可以是基于吲哚酚衍生物的显色底物，或基于萘酚衍生物的显色底物，或基于萘胺衍生物的显色底物，或基于硝基苯衍生物的显色底物，或基于苯胺衍生物的显色底物，或基于苯酚衍生物的显色底物。

9.如权利要求书4所述的衣原体诊断试剂盒，其特征在于试剂盒使用的荧光底物可以是基于伞形酮衍生物的产荧光的底物，或基于香豆素衍生物的产荧光的底物。

10.如权利要求书4所述的衣原体诊断试剂盒，其特征在于试剂盒可以把α-甘露糖苷酶酶促底物固化到固相载体以干化学的形式进行检测，也可以把α-甘露糖苷酶酶促底物配成溶液以液体的形式进行检测。