CN111562372A - 一种检测肌酸激酶同工酶ck-mb的胶乳增强免疫比浊法试剂盒 - Google Patents

一种检测肌酸激酶同工酶ck-mb的胶乳增强免疫比浊法试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN111562372A
CN111562372A CN202010413849.7A CN202010413849A CN111562372A CN 111562372 A CN111562372 A CN 111562372A CN 202010413849 A CN202010413849 A CN 202010413849A CN 111562372 A CN111562372 A CN 111562372A
Authority
CN
China
Prior art keywords
reagent
concentration
latex
kit
microspheres
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010413849.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111562372B (zh
Inventor
陈小茹
吴向东
严小莉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Amtech Bioengineering Ltd inc
Original Assignee
Shenzhen Amtech Bioengineering Ltd inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Amtech Bioengineering Ltd inc filed Critical Shenzhen Amtech Bioengineering Ltd inc
Priority to CN202010413849.7A priority Critical patent/CN111562372B/zh
Publication of CN111562372A publication Critical patent/CN111562372A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111562372B publication Critical patent/CN111562372B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/557—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using kinetic measurement, i.e. time rate of progress of an antigen-antibody interaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/9123—Phosphotransferases in general with a nitrogenous group as acceptor (2.7.3), e.g. histidine kinases
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明提供一种检测肌酸激酶同工酶CK‑MB的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，其中R1试剂包含缓冲液、促凝剂、阻断剂、表面活性剂、保护剂、防腐剂，R2试剂包含缓冲液、CK‑MB抗体包被纳米微球、保护剂、防腐剂。试剂1中采用兔抗鼠IgM抗体或SeaBlock鱼血浆阻断剂作为阻断剂，并且在试剂2的CK‑MB抗体包被纳米微球中采用甘氨酸+乙醇胺+小牛血清三组份作为封闭剂，可以有效减少检测干扰。本申请的试剂盒具有抗干扰性强、灵敏度高、检测范围宽、重复性好、特异性高、稳定性好等优点，能够在生化仪上实现自动化检测，替代化学发光产品，降低检测成本，满足临床使用。

Description

一种检测肌酸激酶同工酶CK-MB的胶乳增强免疫比浊法试 剂盒
技术领域
本发明涉及免疫分析医学技术领域，具体涉及一种检测肌酸激酶同工酶CK-MB的胶乳增强免疫比浊法试剂盒。
背景技术
肌酸激酶(CK)分为胞浆型和线粒体型，胞浆型根据M亚基和B亚基的不同，分为CK-MM、CK-MB、CK-BB三种亚型，线粒体型由两个mt亚基组成CK-mt。CK-MB为杂化型肌酸激酶同工酶，为肌酸激酶中的一种形式，主要存在于心肌细胞中，是心肌损伤标志物之一。
CK-MB由于其具有较好的特异性和灵敏度曾被推荐为急性心肌梗塞(AMI)的诊断金标准。然而，由于骨骼肌中也存在少量CK-MB，在儿童骨骼肌中的CK-MB会更高，因此特异性不好，有造成误诊的风险。目前，CK-MB已经被新的金标准标志物cTnI所取代。尽管如此，CK-MB在急性冠脉综合征(ACS)和急性心肌梗塞(AMI)诊断中仍然具有重要的临床意义。
目前，常规的CK-MB的测定主要采用的是免疫抑制法，此方法测定CK-MB的活力，具有迅速、简洁、省时、较高的敏感性的优点，但是影响因素和缺陷众多。酶联免疫法(ELISA)是基于双抗夹心法检测血清中存在的CK-MB，特异性强，但需要人工进行操作，且检测时间较长。化学发光是基于双抗夹心法检测血清中存在的CK-MB，优点为特异性强，精密度优，缺点是价格昂贵，且基本被国外IVD巨头垄断。
胶乳增强免疫比浊法是一种抗原抗体结合动态测定方法，通过将待测的目的抗原相对应的抗体包被在胶乳微球上，使抗原抗体结合物的体积增大，在检测光路中，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而提高检测的灵敏度。还可以将不同平均粒径的胶乳微球组合使用，进一步提高检测的灵敏度和线性范围。但是，发明人在研究中发现，将胶乳增强免疫比浊法应用于血液样本中的CK-MB的检测时，样本中存在的类风湿因子(rheumatoidfactor,RF)会对检测造成干扰。另外，样品中的蛋白质等成分与抗体的非特异性结合导致背景信号，也会对检测造成干扰。
发明内容
为解决胶乳增强免疫比浊法检测肌酸激酶同工酶CK-MB时存在的干扰问题，本发明采用的技术方案如下：
一种检测肌酸激酶同工酶CK-MB的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，其中R1试剂包含缓冲液、促凝剂、阻断剂、表面活性剂、保护剂、防腐剂，R2试剂包含缓冲液、CK-MB抗体包被纳米微球、保护剂、防腐剂。
本发明试剂盒中的R1试剂和R2试剂的缓冲液可以为任何适合在胶乳增强免疫比浊法中使用的缓冲液。
在具体的实施方案中，R1试剂和R2试剂的缓冲液各自独立地选自磷酸缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液中的一种或更多种。因此，R1试剂和R2试剂的缓冲液类型可以相同也可以不同，在一些优选的实施方案中，R1试剂和R2试剂的缓冲液类型相同，但浓度可以不同。
在具体的实施方案中，R1试剂和R2试剂的缓冲液的pH值各自独立地在pH 4-9之间，优选pH 5-8之间。在具体的实施方案中，R1试剂和R2试剂的缓冲液的浓度各自独立地在10-500mM之间，优选20-100mM之间。
本发明试剂盒中的R1试剂的促凝剂可以为任何适合在胶乳增强免疫比浊法中使用的促凝剂。在具体的实施方案中，促凝剂为PEG或PVP等大分子聚合物，分子量在400至40,000道尔顿之间，优选1,000至10,000道尔顿，浓度在0.2％至5％(w/v)之间，优选0.5％至2％(w/v)之间。
本发明试剂盒中的R1试剂的阻断剂为兔抗鼠IgM抗体或SeaBlock鱼血浆阻断剂，浓度在0.05％-5％(w/v)之间，优选0.1％-2％(w/v)之间。SeaBlock鱼血浆阻断剂是美国EastCoast Bio公司出品的传统牛血清阻断剂的替代物，克服了哺乳动物来源的抗体交叉反应性的问题。
本发明试剂盒中的R1试剂的表面活性剂可为Tween系列表面活性剂或Triton系列表面活性剂中的一种或多种，浓度在0.02％-0.5％(w/v)之间，优选0.05％-0.2％(w/v)之间。Tween系列表面活性剂例如为Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81、Tween-85等。Triton系列表面活性剂例如为Triton X-15、Triton X-45、Triton X-100、Triton X-405等。
本发明试剂盒中的R2试剂的CK-MB抗体包被纳米微球中的纳米微球，为平均直径在100-250nm之间的小直径微球和平均直径在250-400nm之间的大直径微球按1:20-20:1体积比混合的复合纳米微球。具体地，小直径纳米微球与大直径微球的体积比可以为1:10、1:5、1:2、1:1、2:1、5:1或10:1，或者上述比例之间的任何比例。纳米微球在R2试剂中的浓度在0.02％-0.5％(w/v)之间，优选0.05％-0.2％(w/v)之间。
纳米微球可以是聚苯乙烯微球、聚丙烯酸微球和聚丙烯酸酯微球中的一种或多种，但也可以使用其他合适的纳米微球。纳米微球的表面官能团可为羧基或氨基。这些纳米微球可以市售获得，或者通过本领域公知的方法制备得到。
本发明试剂盒中的R1试剂和R2试剂的保护剂可为牛血清白蛋白(BSA)、小牛血清、卵清蛋白、蔗糖、海藻糖、葡萄糖和甘油中的一种或多种，浓度在0.05％-10％(w/v)之间，优选0.2％-2％(w/v)之间。
本发明试剂盒中的R1试剂和R2试剂的防腐剂可为叠氮钠、硫柳汞、ProClin300中的一种或多种，浓度在0.02％-0.5％(w/v)之间，优选0.05％-0.2％(w/v)之间。
在本发明的另一些实施方案中，本发明试剂盒还包括校准品和质控品。校准品和质控品包含缓冲液、防腐剂和稳定剂以及已知浓度的CK-MB。具体地，校准品中的CK-MB浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、300ng/mL以及上述浓度之间的2-6个浓度；质控品中的CK-MB浓度为5-50ng/mL和50-200ng/mL。
校准品和质控品中的缓冲液的种类、浓度范围和pH值范围可以参照R1试剂和R2试剂的缓冲液的浓度范围和pH值范围，防腐剂和稳定剂的种类和浓度范围可参照R1试剂和/或R2试剂的防腐剂和稳定剂的种类和浓度范围。
校准品和质控品可制备成液体形式或冻干粉形式。校准品的值可溯源至国际参考物质ERM-AD455/IFCC。
本发明的有益效果：
本发明的检测肌酸激酶同工酶CK-MB的胶乳增强免疫比浊法试剂盒在试剂1中采用兔抗鼠IgM抗体或SeaBlock鱼血浆阻断剂作为阻断剂，可以有效减少类风湿性因子(RF)造成的假阳性结果，减少对检测的干扰，并且在试剂2的CK-MB抗体包被纳米微球中采用甘氨酸+乙醇胺+小牛血清三组份作为封闭剂，可以有效减少背景信号对检测的干扰。本申请的试剂盒具有抗干扰性强、灵敏度高、检测范围宽、重复性好、特异性高、稳定性好等优点，能够在生化仪上实现自动化检测，替代化学发光产品，降低检测成本，满足临床使用。
附图说明
图1显示本发明的胶乳增强免疫比浊法试剂盒与化学发光免疫分析法测定试剂盒的方法学对比。
具体实施方式
下面通过具体实施方式并结合附图对本发明作进一步详细说明。应当理解，这些描述仅出于说明本发明的目的，并不意在以任何方式限制本发明。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域技术人员通常理解的含义相同。如果有冲突，以本说明书的定义为准。除另有说明的外，本文所用的化学物质和仪器可市售获得。本文中使用的材料、方法和示例仅作说明用途，无意作为限制，除非特别指明。
一、试剂盒的配制
1.R1试剂的配制
按“发明内容”部分所述的R1试剂的促凝剂、阻断剂、表面活性剂、保护剂、防腐剂组分的浓度比例，称取各组分溶于R1试剂的缓冲液中，充分搅拌以促进溶解，混合均匀，制得R1试剂。
在一个代表性的实施方案中，R1试剂的配方如下：
Figure BDA0002494214770000041
2.R2试剂的配制
从市售途径获得平均粒径在100-250nm之间、表面带有羧基的聚苯乙烯微球、聚丙烯酸微球或聚丙烯酸酯微球(小直径纳米微球)，用pH＝5.0-8.5的活化缓冲液(可选用磷酸缓冲液、Tris缓冲液或MES缓冲液)稀释至浓度为0.2-2％(w/v)，加入适量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，在4℃条件下进行活化反应0.5-2小时后，15000-20000rpm离心15-30min，去上清，向沉淀中加入pH＝5.0-8.5的活化缓冲液，超声分散，得到活化的纳米微球悬浊液。
然后，向活化的纳米微球悬浊液中加入适量的CK-MB抗体，在4℃条件下反应2-4小时后，加入足量的封闭剂封闭4-10小时，15000-20000rpm离心15-30min，去上清，用R2稀释液清洗1-4次，最后15000-20000rpm离心15-30min，得到CK-MB抗体包被的纳米微球。
然后用含有“发明内容”部分所述的R2试剂的缓冲液、保护剂、防腐剂的储存液重悬CK-MB抗体包被的纳米微球，超声分散，得到CK-MB抗体包被纳米微球胶乳A。
从市售途径获得平均粒径在250-400nm之间、表面带有羧基的聚苯乙烯微球、聚丙烯酸微球或聚丙烯酸酯微球(大纳米微球)，按以上同样的方式，制备得到CK-MB抗体包被纳米微球胶乳B。
将纳米微球胶乳A和纳米微球胶乳B按1:10-10:1的体积比混合，即制得R2试剂。
在一个代表性的实施方案中，R2试剂的配方如下：
Figure BDA0002494214770000051
二.试剂盒的测定方法
在全自动生化分析仪(例如日立7180全自动生化分析仪)上，用制备得到的试剂盒的R1试剂和R2试剂测定空白样本(空白限测试)、校准品和待测样本的CK-MB含量，测定参数和方法如下表1所示：
表1：R1试剂和R2试剂的测定参数和方法
Figure BDA0002494214770000052
Figure BDA0002494214770000061
以校准品浓度为横坐标，相应的吸光度变化△A为纵坐标，采用非线性拟合(spline)绘制出标准曲线。将未知CK-MB含量的待测样本测得的吸光度变化△A代入标准曲线中，即计算出待测样本的CK-MB含量。
三、阻断剂对类风湿因子(RF)造成的假阳性结果的影响
类风湿因子(RF)是一种抗人或动物IgG分子Fc片段抗原决定簇的抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体。RF在CK-MB样本中的存在会对CK-MB的含量检测造成的假阳性结果，从而干扰检测。本发明的试剂盒的一个特征在于R1试剂中加入了阻断剂为兔抗鼠IgM抗体或鱼抗鼠IgG抗体，以减少类风湿因子造成的假阳性结果。
为证实阻断剂的作用，参照上述“1.R1试剂的配制”中的代表性R1试剂，选择加入1.5％(w/v)兔抗鼠IgM抗体作为阻断剂，或者1.5％(w/v)鱼抗鼠IgG抗体作为阻断剂，或者不加入阻断剂，得到三种R1试剂，将它们与上述“2.R2试剂的配制”中的代表性R2试剂组合，得到三种试剂盒。
用市售的类风湿因子标准品配制含600IU/ml RF的CK-MB样本和不含600IU/ml RF的CK-MB样本，作为测试样本，按上述“二.试剂盒的测定方法”测定CK-MB含量，结果如下表2所示。
表2：阻断剂对RF造成的假阳性结果的影响
Figure BDA0002494214770000062
表2显示了在试剂盒不包含阻断剂的情况下，含600IU/ml RF的CK-MB样本与不CK-MB含600IU/ml RF的CK-MB样本检测到的CK-MB含量分别为150.29ng/ml和82.06ng/ml，回收率高达183.15％，说明RF对CK-MB的检测干扰严重。而在试剂盒包含兔抗鼠IgM抗体或鱼抗鼠IgG抗体的情况下，回收率比较接近100％，说明兔抗鼠IgM抗体或鱼抗鼠IgG抗体可以阻断RF对CK-MB检测的干扰。
四、封闭剂对背景信号的影响
本发明的另一个特征在于在R2试剂的配制中，采用甘氨酸+乙醇胺+小牛血清三组份混合物作为CK-MB抗体包被的纳米微球的封闭剂。
为证实该三组份混合物的作用，参照上述“2.R2试剂的配制”中的代表性R2试剂，选择了如下的封闭剂：(1)甘氨酸；(2)甘氨酸+乙醇胺的1:1体积比混合物；(3)甘氨酸+小牛血清的1:1体积比混合物；(4)甘氨酸+乙醇胺+小牛血清的1:1:1体积比混合物，得到四种R2试剂，将它们与上述“1.R1试剂的配制”中的代表性R1试剂组合，得到四种试剂盒。
用这四种试剂盒，按上述“二.试剂盒的测定方法”对CK-MB浓度分别为0、10、25、50、150、300的ng/mL的校准品测定反应度△A(如上所述，△A＝A2-A1)，结果如下表3所示。
表3：封闭剂对背景信号的影响
Figure BDA0002494214770000071
校准品0ng/mL反应度△A数值越小说明背景信号越低,对测量的影响越小。表3显示了甘氨酸+乙醇胺+小牛血清三组份的1:1:1体积比混合物作为胶乳微球和抗体包被的封闭剂,相比单独的甘氨酸、甘氨酸+乙醇胺的1:1体积比或者甘氨酸+小牛血清的1:1体积比作为CK-MB抗体包被的纳米微球的封闭剂，检测背景信号明显改善，有利于提高检测试剂的灵敏度。可以预见，甘氨酸+乙醇胺+小牛血清三组份可以作为作为胶乳微球和抗体包被的封闭剂，但优选的是甘氨酸+乙醇胺+小牛血清三组份的1:1:1体积比混合物。
实施例
以下通过具体的实施例及相应的测试例对本发明的试剂盒作进一步的举例说明。应指出的是，这些实施例和测试例并不构成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围由权利要求书限定。
实施例1
本实施例的试剂盒包括R1试剂和R2试剂。
R1试剂的配方如下：
Figure BDA0002494214770000081
R1试剂制备方法如下：
称取1g PEG10000、1.5g兔抗鼠IgM抗体、0.2g Tween-40、2g BSA和0.2g叠氮钠，加入100mL磷酸缓冲液(pH 5)中，充分搅拌以促进溶解，混合均匀，制得R1试剂。
R2试剂的配方如下：
Figure BDA0002494214770000082
R2试剂制备方法如下：
称取1g平均粒径为200nm、表面带有羧基的聚苯乙烯微球，用pH 5的磷酸缓冲液稀释至浓度为1％(w/v)，加入适量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，在4℃条件下进行活化反应1小时后，20000rpm离心15min，去上清，向沉淀中加入pH 5的磷酸缓冲液，超声分散，得到活化的聚苯乙烯纳米微球悬浊液。
然后，向活化的聚苯乙烯纳米微球悬浊液中加入适量的CK-MB抗体，在4℃条件下反应3小时后，加入足量的封闭剂封闭5小时，20000rpm离心15min，去上清，用pH 5的磷酸缓冲液清洗3次，最后20000rpm离心15min，去上清，得到CK-MB抗体包被的聚苯乙烯纳米微球。
称取2g BSA和0.2g叠氮钠，加入100mL Tris缓冲液(pH 5)中，充分搅拌以促进溶解。然后称取0.2g CK-MB抗体包被聚苯乙烯纳米微球，加入所得溶液中，搅拌均匀重悬，超声分散，得到CK-MB抗体包被聚苯乙烯纳米微球胶乳A。
称取1g平均粒径为300nm、表面带有羧基的聚苯乙烯微球，按以上同样的方式，制备得到CK-MB抗体包被聚苯乙烯纳米微球胶乳B。
将纳米微球胶乳A和纳米微球胶乳B按1:1的体积比混合，即制得R2试剂。
该试剂盒还可配备CK-MB浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、300ng/mL的校准品，和CK-MB浓度为5-50ng/mL和50-200ng/mL的质控品。
实施例2
本实施例的试剂盒包括R1试剂和R2试剂，其配方如下，制备方法参考实施例1。该试剂盒还可配备CK-MB浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、300ng/mL的校准品，和CK-MB浓度为5-50ng/mL和50-200ng/mL的质控品。
R1试剂的配方如下：
Figure BDA0002494214770000091
R2试剂的配方如下：
Figure BDA0002494214770000092
Figure BDA0002494214770000101
实施例3
本实施例的试剂盒包括R1试剂和R2试剂，其配方如下，制备方法参考实施例1。该试剂盒还可配备CK-MB浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、300ng/mL的校准品，和CK-MB浓度为5-50ng/mL和50-200ng/mL的质控品。
R1试剂的配方如下：
Figure BDA0002494214770000102
R2试剂的配方如下：
Figure BDA0002494214770000103
实施例4
本实施例的试剂盒包括R1试剂和R2试剂，其配方如下，制备方法参考实施例1。该试剂盒还可配备CK-MB浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、300ng/mL的校准品，和CK-MB浓度为5-50ng/mL和50-200ng/mL的质控品。
R1试剂的配方如下：
Figure BDA0002494214770000111
R2试剂的配方如下：
Figure BDA0002494214770000112
测试例
以实施例1制备的试剂盒为例，用日立7180全自动生化分析仪测试本发明的试剂盒的检测性能。
(1)空白限
以纯化水为空白样本，用试剂盒重复测试20次，计算20次测试结果的平均值(X)和标准差(SD)，X+2×SD即为空白限。结果如下表4所示，可见空白限不超过0.50ng/mL，表明测试的灵敏度良好。
表4：实施例1制备的试剂盒的检测空白限测试结果
Figure BDA0002494214770000121
(2)线性范围
用校准品稀释液(日立)等比稀释300ng/mL CK-MB样本，用实施例1制备的试剂盒测定稀释后的各样本，每个样本重复测定3次，求平均值，与理论浓度相比较，计算其相对偏差。结果如下表5所示，可见试剂盒线性范围可达0.5-300ng/mL，线性相关系数R＝1.000，表明线性范围宽，线性关系良好。
表5：实施例1制备的试剂盒的检测线性范围测试结果
Figure BDA0002494214770000122
(3)重复性
配制CK-MB浓度为20ng/mL(低值)和60ng/mL(高值)的CK-MB样本用实施例1制备的试剂盒分别重复测试CK-MB含量10次，计算平均值、标准差(SD)和变异系数(CV)。结果如下表6所示，可见重复性CV<5％，重复性良好。
表6：实施例1制备的试剂盒的检测重复性测试结果
测试数 低值(ng/mL) 高值(ng/mL)
1 21.70 58.62
2 20.05 62.36
3 21.48 58.57
4 21.34 61.59
5 21.33 60.22
6 19.77 60.16
7 19.63 59.94
8 18.97 57.34
9 19.77 62.78
10 20.68 61.78
平均值 20.47 60.34
SD 0.95 1.79
CV(％) 4.66％ 2.97％
(4)本发明的胶乳增强免疫比浊法试剂盒与化学发光免疫分析法测定试剂盒的方法学对比
用实施例1的试剂盒的试剂和校准品在日立7180全自动生化分析仪上建立标准曲线，并测定已知CK-MB浓度的样本的CK-MB值。已知CK-MB浓度的样本来自医院，其CK-MB值在医院的全自动化学发光免疫分析仪上测定。以本发明的胶乳增强免疫比浊法试剂盒的测定值为纵坐标，以化学发光免疫分析法测定试剂盒的测定值为横坐标，绘制曲线，如图1所示。可见，本发明的胶乳增强免疫比浊法试剂盒与化学发光免疫分析法测定试剂盒具有良好的相关性。
以上应用了具体实例对本发明进行了阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。本发明所属技术领域的技术人员依据本发明的构思，还可以做出若干简单推演、变形或替换。这些推演、变形或替换方案也落入本发明的权利要求范围内。

Claims (9)

1.一种检测肌酸激酶同工酶CK-MB的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，其中R1试剂包含缓冲液、促凝剂、阻断剂、表面活性剂、保护剂、防腐剂，R2试剂包含缓冲液、CK-MB抗体包被纳米微球、保护剂、防腐剂；
其中R1试剂和R2试剂的缓冲液各自独立地选自磷酸缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液中的一种或更多种，R1试剂和R2试剂的缓冲液的pH值各自独立地在pH 4-9之间，浓度各自独立地在10-500mM之间；
R1试剂的促凝剂为PEG或PVP，分子量在400至40,000道尔顿之间，浓度在0.2％至5％(w/v)之间；
R1试剂的阻断剂为兔抗鼠IgM抗体或SeaBlock鱼血浆阻断剂浓度在0.05％-5％(w/v)之间；
R1试剂的表面活性剂为Tween系列表面活性剂或Triton系列表面活性剂中的一种或多种，浓度在0.02％-0.5％(w/v)之间；
R2试剂的CK-MB抗体包被纳米微球中的纳米微球，为平均直径在100-250nm之间的小直径微球和平均直径在250-400nm之间的大直径微球按1:20-20:1体积比混合的复合纳米微球，浓度在0.02％-0.5％(w/v)之间，所述CK-MB抗体包被纳米微球用甘氨酸+乙醇胺+小牛血清的混合物进行封闭；
R1试剂和R2试剂的保护剂可为牛血清白蛋白(BSA)、小牛血清、卵清蛋白、蔗糖、海藻糖、葡萄糖和甘油中的一种或多种，浓度在0.05％-10％(w/v)之间；
R1试剂和R2试剂的防腐剂可为叠氮钠、硫柳汞、ProClin300中的一种或多种，浓度在0.02％-0.5％(w/v)之间。
2.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：
R1试剂和R2试剂的缓冲液的pH值各自独立地在pH 5-8之间，浓度各自独立地在20-100mM之间；
R1试剂的促凝剂的分子量在1,000至10,000道尔顿之间，浓度在0.5％至2％(w/v)之间；
R1试剂的阻断剂的浓度在0.1％-2％(w/v)之间；
R1试剂的表面活性剂的浓度在0.05％-0.2％(w/v)之间；
R2试剂的CK-MB抗体包被纳米微球中的纳米微球，为平均直径在100-250nm之间的小直径微球和平均直径在250-400nm之间的大直径微球按1:1体积比混合的复合纳米微球，浓度在0.05％-0.2％(w/v)之间，所述CK-MB抗体包被纳米微球用甘氨酸+乙醇胺+小牛血清的1:1:1体积比混合物进行封闭；
R1试剂和R2试剂的保护剂的浓度在0.2％-2％(w/v)之间；
R1试剂和R2试剂的防腐剂的浓度在0.05％-0.2％(w/v)之间。
3.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：
所述纳米微球为纳米微球为聚苯乙烯微球、聚丙烯酸微球和聚丙烯酸酯微球中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：
所述胶乳增强免疫比浊法试剂盒还包括校准品和质控品，所述校准品和质控品包含缓冲液、防腐剂和稳定剂以及已知浓度的CK-MB。
5.根据权利要求4所述的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：
所述校准品中的CK-MB浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、300ng/mL，所述质控品中的CK-MB浓度为5-50ng/mL和50-200ng/mL。
6.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：
R1试剂的配方如下：
Figure FDA0002494214760000021
R2试剂的配方如下：
Figure FDA0002494214760000022
7.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：
R1试剂的配方如下：
Figure FDA0002494214760000031
R2试剂的配方如下：
Figure FDA0002494214760000032
8.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：
R1试剂的配方如下：
Figure FDA0002494214760000033
R2试剂的配方如下：
Figure FDA0002494214760000034
Figure FDA0002494214760000041
9.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：
R1试剂的配方如下：
Figure FDA0002494214760000043
R2试剂的配方如下：
Figure FDA0002494214760000042
CN202010413849.7A 2020-05-15 2020-05-15 一种检测肌酸激酶同工酶ck-mb的胶乳增强免疫比浊法试剂盒 Active CN111562372B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010413849.7A CN111562372B (zh) 2020-05-15 2020-05-15 一种检测肌酸激酶同工酶ck-mb的胶乳增强免疫比浊法试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010413849.7A CN111562372B (zh) 2020-05-15 2020-05-15 一种检测肌酸激酶同工酶ck-mb的胶乳增强免疫比浊法试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111562372A true CN111562372A (zh) 2020-08-21
CN111562372B CN111562372B (zh) 2022-04-15

Family

ID=72074737

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010413849.7A Active CN111562372B (zh) 2020-05-15 2020-05-15 一种检测肌酸激酶同工酶ck-mb的胶乳增强免疫比浊法试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111562372B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112540177A (zh) * 2020-11-30 2021-03-23 美康生物科技股份有限公司 一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法
CN114264824A (zh) * 2021-12-13 2022-04-01 河南迈达斯实业有限公司 一种胶乳增强免疫比浊法测定d-二聚体含量的试剂盒及d-二聚体含量的检测方法
CN114487420A (zh) * 2022-01-14 2022-05-13 广西康柏莱科技有限公司 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒
CN114878829A (zh) * 2022-04-14 2022-08-09 广西康柏莱科技有限公司 一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒及其制备方法
CN117054657A (zh) * 2023-08-15 2023-11-14 北京豪迈生物工程股份有限公司 一种联合阻断剂及其在胶乳免疫比浊法检测中的应用
CN117491646A (zh) * 2023-11-13 2024-02-02 深圳上泰生物工程有限公司 一种心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5602041A (en) * 1994-08-26 1997-02-11 Sea Run Holdings, Inc. Fish serum as a blocking reagent
CN107607708A (zh) * 2017-03-31 2018-01-19 迈克生物股份有限公司 抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂
CN108548926A (zh) * 2018-03-22 2018-09-18 北京九强生物技术股份有限公司 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒
CN109541201A (zh) * 2018-12-27 2019-03-29 海格德生物科技（深圳）有限公司 一种提升免疫比浊法准确性的方法
CN110133247A (zh) * 2019-05-24 2019-08-16 深圳上泰生物工程有限公司 一种用于检测目的抗原的免疫胶乳比浊法测定试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5602041A (en) * 1994-08-26 1997-02-11 Sea Run Holdings, Inc. Fish serum as a blocking reagent
CN107607708A (zh) * 2017-03-31 2018-01-19 迈克生物股份有限公司 抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂
CN108548926A (zh) * 2018-03-22 2018-09-18 北京九强生物技术股份有限公司 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒
CN109541201A (zh) * 2018-12-27 2019-03-29 海格德生物科技（深圳）有限公司 一种提升免疫比浊法准确性的方法
CN110133247A (zh) * 2019-05-24 2019-08-16 深圳上泰生物工程有限公司 一种用于检测目的抗原的免疫胶乳比浊法测定试剂盒

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112540177A (zh) * 2020-11-30 2021-03-23 美康生物科技股份有限公司 一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法
CN114264824A (zh) * 2021-12-13 2022-04-01 河南迈达斯实业有限公司 一种胶乳增强免疫比浊法测定d-二聚体含量的试剂盒及d-二聚体含量的检测方法
CN114487420A (zh) * 2022-01-14 2022-05-13 广西康柏莱科技有限公司 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒
CN114878829A (zh) * 2022-04-14 2022-08-09 广西康柏莱科技有限公司 一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒及其制备方法
CN117054657A (zh) * 2023-08-15 2023-11-14 北京豪迈生物工程股份有限公司 一种联合阻断剂及其在胶乳免疫比浊法检测中的应用
CN117054657B (zh) * 2023-08-15 2024-04-02 北京豪迈生物工程股份有限公司 一种联合阻断剂及其在胶乳免疫比浊法检测中的应用
CN117491646A (zh) * 2023-11-13 2024-02-02 深圳上泰生物工程有限公司 一种心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111562372B (zh) 2022-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111562372B (zh) 一种检测肌酸激酶同工酶ck-mb的胶乳增强免疫比浊法试剂盒
CN111679086B (zh) 一种hbp的磁微粒化学发光法检测试剂盒及其制备方法
EP0974060B1 (en) Determination of % glycated hemoglobin
CN109613259A (zh) 一种高灵敏度、宽检测范围的人肝素结合蛋白测定试剂盒
US6835543B2 (en) Step agglutination immunoassay
US4780423A (en) Heterogeneous fluorescence assays using controlled pore glass particles
WO1998040750A9 (en) Determination of % glycated hemoglobin
CN110687286A (zh) 胶乳增强免疫比浊法试剂盒
CN110806487A (zh) 一种用于人肝素结合蛋白检测的试剂盒及其制备方法
US6316265B1 (en) Determination of % glycated hemoglobin
CN110824160A (zh) 抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒及其制备方法
CN111965342A (zh) 一种提高胶乳免疫比浊法线性范围和稳定性的方法、试剂及试剂盒
CN111766381B (zh) 一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒及其应用
CN114487420A (zh) 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒
US20040106157A1 (en) Immunological assay reagents and assay method
US6825000B1 (en) Immunoassay reagent and immunoassay method
CN112143484B (zh) 一种荧光微球活化剂复溶液及其应用
CN115201183A (zh) 一种单人份S100β蛋白化学发光测定试剂盒及其测定方法
CN114324865A (zh) 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法及应用
CN114137204A (zh) 一种kl-6测定试剂盒及其制备与检测方法
CN112034178A (zh) 一种c反应蛋白检测试剂盒
CN113030470B (zh) 肌酸激酶同工酶测定试剂盒
CN113125748B (zh) 一种用于检测心脏型脂肪酸结合蛋白的试剂盒
CN112858671B (zh) 制备类风湿因子检测试剂的方法、类风湿因子检测试剂、试剂盒和检测方法
CN118068007A (zh) 一种d-二聚体检测抗干扰试剂及其试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant