CN118068007A - 一种d-二聚体检测抗干扰试剂及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种D‑二聚体检测抗干扰试剂及其试剂盒，属于D‑二聚体检测技术领域。本发明提供的D‑二聚体检测抗干扰试剂中，各组分相互配合，解决了现有的检测试剂并不能避免其他干扰因子对准确性影响的问题。本发明提供的D‑二聚体检测抗干扰试剂能够避免血红蛋白、类风湿因子、胆红素、甘油三酯等干扰物质的干扰，使测定结果更准确。本发明提供的D‑二聚体检测试剂盒中试剂不易发生聚沉、均匀性较优；还能消除样本中干扰物质对试剂测定结果的干扰作用，使结果更准确；同时试剂的保存期限较长，适合在产业中推广应用。

Description

一种D-二聚体检测抗干扰试剂及其试剂盒

技术领域

本发明涉及D-二聚体检测技术领域，尤其涉及一种D-二聚体检测抗干扰试剂及其试剂盒。

背景技术

D-二聚体是交联纤维蛋白经纤溶酶作用后的终末产物，同时也是交联纤维蛋白经纤溶酶水解作用所产生的一种特异性纤维蛋白降解产物，D-二聚体水平的增高反映了体内继发性纤溶活性增强，可作为高凝状态较为敏感的指标，是纤维蛋白降解产物和纤溶亢进的分子标志物，当血管内血栓形成时产生大量交联纤维蛋白，纤溶酶活性继发性增强，血浆D-二聚体水平增高，因此，检测血浆D-二聚体水平对血栓性疾病的诊断及溶栓治疗监测等有重要意义，也是鉴别原发性和继发性纤溶的良好指标。

现有技术中，检测D-二聚体的方法主要有ELISA法、免疫金标定量、乳胶凝集法和免疫比浊法，前两种方法灵敏度、特异性高，但试剂盒供应少、成本高、操作复杂、检测耗时，需至少1个小时才能报出结果，不适合急诊情况下的检测应用。乳胶凝集法虽操作简便，费用不高，适用于不同地区和级别的医院和诊所；但其灵敏度不高，仅能检出400μg/L水平的D-二聚体，且局限于D-二聚体的定性或半定量。免疫比浊法测定D-二聚体的原理是将D-二聚体的单抗吸附于大小适中、均匀的聚苯乙烯颗粒上，当遇到标本中的D-二聚体抗原时，则使聚苯乙烯颗粒发生聚集，其程度与标本中含有的D-二聚体抗原量成正比。由于发生凝聚的区域内具有一个特殊的结构，即一个单抗有两个反应位点，这样一个单抗足以引发一次凝聚反应，且反应的程度与抗原的浓度成正比关系。但是市面上很多D-二聚体检测试剂存在均匀性差，稳定期短等问题，同时，在免疫测定中多会受到如类风湿因子和血红蛋白等干扰物质影响的情况，检测准确度较低。

中国专利CN110702895A公开了一种D二聚体检测试剂和方法、试剂制备方法及聚乙二醇的应用，其中D二聚体检测试剂包括聚乙二醇、缓冲液体系和无机盐；聚乙二醇为相对分子量6000 10000的聚乙二醇；无机盐用于调节缓冲液体系离子强度，利用低分子量聚乙二醇对血红蛋白与D二聚体相互作用进行干扰，减小血红蛋白对D二聚体与特异性抗体反应的影响，起到抗血红蛋白干扰的作用，提高了D二聚体检测的准确性。

但是现有的检测试剂并不能避免其他干扰因子对准确性的影响，有待进一步提升。

发明内容

本发明的目的在于提供一种D-二聚体检测抗干扰试剂及其试剂盒，能够避免血红蛋白、类风湿因子、胆红素、甘油三酯等干扰物质的干扰，使测定结果更准确。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种D-二聚体检测抗干扰试剂，包括以下组分：

脂肪酶、异嗜性抗体阻断剂和盐离子。

优选的，所述脂肪酶、异嗜性抗体阻断剂和盐离子的质量比为0.01～1:0.01～1:0.01～10。

优选的，所述盐离子选自氯化钠、氯化钾、乙二胺四乙酸二钠、亚铁氰化钾中的一种或几种。

本发明还提供了一种D-二聚体检测试剂盒，包括试剂1和试剂2；

所述试剂1以缓冲液为溶剂，含有表面活性剂、防腐剂和上述D-二聚体检测抗干扰试剂；

所述试剂2以缓冲液为溶剂，含有表面活性剂、盐离子、稳定剂、防腐剂和D-二聚体致敏胶乳颗粒；

在试剂1中，所述D-二聚体检测抗干扰试剂的浓度为0.03～12％。

优选的，所述缓冲液的缓冲pH为6.0～9.0，浓度为20～300mM。

优选的，所述缓冲液选自硼酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、MES缓冲液和Tris缓冲液中的一种或几种。

优选的，所述表面活性剂中含有A组分和B组分；

所述A组分选自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000和聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯中的一种或几种；

所述B组分选自吐温20、吐温80、TritonX-100、Brij-35中的一种或几种；

在试剂1或试剂2中，所述A组分的浓度为0.05～8％；

在试剂1或试剂2中，所述B组分的浓度为0.01～3％；

在表面活性剂中，所述A组分与B组分的体积比为0.01～800:1。

优选的，所述盐离子选自氯化钠、氯化钾、乙二胺四乙酸二钠、亚铁氰化钾中的一种或几种。

优选的，所述防腐剂选自叠氮化钠、ProClin300、苯甲酸钠中的一种或几种；

在试剂1或试剂2中，所述防腐剂的浓度为0.01～0.2％；

所述稳定剂选自甘油、BSA、海藻糖、乳糖、甘氨酸、蔗糖中的一种或几种；

在试剂2中，所述稳定剂的浓度为0.2～15％。

优选的，所述D-二聚体致敏胶乳颗粒为鼠抗人D-二聚体单克隆抗体与聚苯乙烯微球通过化学偶联得到的致敏胶乳颗粒；

所述D-二聚体致敏胶乳颗粒的微球粒径为80～300nm；

在试剂2中，所述D-二聚体致敏胶乳颗粒的浓度为0.8～4.5mg/mL。

本发明的有益效果：

本发明提供的D-二聚体检测抗干扰试剂中，各组分相互配合，能够有效避免检测样品中血红蛋白、类风湿因子、胆红素、甘油三酯等干扰物质的干扰，使测定结果更准确。

本发明提供的D-二聚体检测试剂盒中试剂不易发生聚沉、均匀性较优；还能消除样本中干扰物质对试剂测定结果的干扰作用，使结果更准确；同时试剂的保存期限较长，适合在产业中推广应用。

具体实施方式

本发明提供了本发明提供了一种D-二聚体检测抗干扰试剂，包括以下组分：脂肪酶、异嗜性抗体阻断剂和盐离子；本发明所述脂肪酶、异嗜性抗体阻断剂和盐离子的质量比优选为0.01～1:0.01～1:0.01～10；所述盐离子优选自氯化钠、氯化钾、乙二胺四乙酸二钠、亚铁氰化钾中的一种或几种。

本发明还提供了一种D-二聚体检测试剂盒，包括试剂1和试剂2；所述试剂1以缓冲液为溶剂，含有表面活性剂、防腐剂和上述D-二聚体检测抗干扰试剂；所述试剂2以缓冲液为溶剂，含有表面活性剂、盐离子、稳定剂、防腐剂和D-二聚体致敏胶乳颗粒；在试剂1中，所述D-二聚体检测抗干扰试剂的浓度优选为0.03～12％，具体的，试剂1中所述脂肪酶的浓度优选为0.01～1％；试剂1中所述异嗜性抗体阻断剂的浓度优选为0.01～1％；试剂1中所述盐离子的浓度优选为0.01～10％。

在本发明中，所述缓冲液的缓冲pH优选为6.0～9.0，浓度优选为20～300mM；优选的，所述缓冲液优选自硼酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、MES缓冲液和Tris缓冲液中的一种或几种；所述表面活性剂中含有A组分和B组分；所述A组分优选自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000和聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯中的一种或几种；所述B组分优选自吐温20、吐温80、TritonX-100、Brij-35中的一种或几种；在试剂1或试剂2中，所述A组分的浓度优选为0.05～8％；在试剂1或试剂2中，所述B组分的浓度优选为0.01～3％；在表面活性剂中，所述A组分与B组分的体积比优选为0.01～800:1。

在本发明中，试剂2中所述盐离子优选自氯化钠、氯化钾、乙二胺四乙酸二钠、亚铁氰化钾中的一种或几种，在试剂2中的浓度优选为0.01～10％；优选的，所述防腐剂优选自叠氮化钠、ProClin300、苯甲酸钠中的一种或几种；在试剂1或试剂2中，所述防腐剂的浓度优选为0.01～0.2％；所述稳定剂优选自甘油、BSA、海藻糖、乳糖、甘氨酸、蔗糖中的一种或几种；在试剂2中，所述稳定剂的浓度优选为0.2～15％；所述D-二聚体致敏胶乳颗粒优选为鼠抗人D-二聚体单克隆抗体与聚苯乙烯微球通过化学偶联得到的致敏胶乳颗粒；所述D-二聚体致敏胶乳颗粒的微球粒径优选为80～300nm；在试剂2中，所述D-二聚体致敏胶乳颗粒的浓度优选为0.8～4.5mg/mL。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例中用到的D-二聚体致敏胶乳颗粒(鼠抗人D-二聚体单克隆抗体通过化学偶联的方法与聚苯乙烯微球偶联的致敏胶乳颗粒)制备方法如下：

将聚苯乙烯微球用缓冲液稀释至浓度0.5％，加入终浓度375mg/L EDC和750mg/LNHS 37℃进行活化，0.5小时后离心去上清，用缓冲液重悬后加入鼠抗人D-二聚体单克隆抗体进行偶联，按照微球规格分别采用不同抗体和微球比例：粒径为200nm的微球按照1mg抗体：8mL微球进行偶联；粒径为100nm的微球按照1mg抗体：5mL微球进行偶联，2小时后加入2％ BSA溶液进行封闭，8小时后离心去上清。

实施例1

配置试剂盒，组分如下：

试剂1(R1)：

缓冲液选自磷酸盐缓冲液，缓冲pH为6.0，浓度为50mM。

表面活性剂选自聚乙二醇6000，浓度分别为8％。

抗干扰剂为脂肪酶，异嗜性抗体阻断剂，浓度分别为1％，0.05％。

盐离子选自氯化钠、亚铁氰化钾，浓度分别为5％，0.5％。

防腐剂选自叠氮化钠，浓度为0.1％。

试剂2(R2)：

缓冲液选自硼酸盐缓冲液，缓冲pH为8.5，浓度为200mM。

表面活性剂A组分选自聚乙二醇6000，浓度分别为0.01％，B组分选自TritonX-100，浓度为0.06％。

盐离子选自氯化钠，浓度分别为0.09％。

稳定剂选自海藻糖，浓度分别为1％。

防腐剂选自叠氮化钠，浓度为0.1％。

D-二聚体致敏胶乳颗粒为鼠抗人D-二聚体单克隆抗体通过化学偶联的方法与聚苯乙烯微球偶联的致敏胶乳颗粒，微球粒径为100nm和200nm，浓度分别为1.5mg/mL、2.5mg/mL，用配制好的试剂2缓冲溶液(含除D-二聚体致敏胶乳颗粒外的其他所有组分)重悬，混匀即得试剂2。

实施例2

配置试剂盒，组分如下：

试剂1(R1)：

缓冲液选自MES缓冲液，缓冲pH为7.0，浓度为100mM。

表面活性剂A组分选自聚乙二醇8000，浓度分别为3％，B组分选自Brij-35，浓度为3％。

抗干扰剂为脂肪酶，异嗜性抗体阻断剂，浓度分别为0.5％，0.01％。

盐离子选自氯化钾、亚铁氰化钾、乙二胺四乙酸二钠，浓度分别为1％，0.2％，0.01％。

防腐剂选自ProClin300，浓度为0.05％。

试剂2(R2)：

缓冲液选自甘氨酸缓冲液，缓冲pH为7.5，浓度为150mM。

表面活性剂A组分选自聚乙二醇8000，浓度分别为0.05％，B组分选自吐温20，浓度为0.05％。

盐离子选自氯化钾，浓度为0.1％。

稳定剂选自BSA、甘氨酸，浓度分别为0.2％，3％。

防腐剂选自ProClin300，浓度为0.05％。

D-二聚体致敏胶乳颗粒为鼠抗人D-二聚体单克隆抗体通过化学偶联的方法与聚苯乙烯微球偶联的致敏胶乳颗粒，微球粒径为80nm和300nm，浓度分别为0.8mg/mL、3.5mg/mL，用配制好的试剂2缓冲溶液(含除D-二聚体致敏胶乳颗粒外的其他所有组分)重悬，混匀即得试剂2。

实施例3

配置试剂盒，组分如下：

试剂1(R1)：

缓冲液选自Tris缓冲液，缓冲pH为9.0，浓度为20mM。

表面活性剂A组分选自聚乙二醇6000和聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯，浓度分别为4％，0.5％，B组分选自吐温80，浓度为0.1％。

抗干扰剂为脂肪酶，异嗜性抗体阻断剂，浓度分别为0.4％，0.1％。

盐离子选自亚铁氰化钾、乙二胺四乙酸二钠，浓度分别为0.1％，0.2％。

防腐剂选自ProClin300和苯甲酸钠，浓度分别为0.01％和0.03％。

试剂2(R2)：

缓冲液选自硼酸缓冲液，缓冲pH为7.0，浓度为300mM。

表面活性剂B组分选自吐温80和TritonX-100，浓度分别为0.1％和0.02％。

盐离子选自氯化钾，浓度为0.1％。

稳定剂选自BSA、乳糖，浓度分别为0.5％，2％。

防腐剂选自ProClin300和苯甲酸钠，浓度分别为0.01％和0.03％。

D-二聚体致敏胶乳颗粒为鼠抗人D-二聚体单克隆抗体通过化学偶联的方法与聚苯乙烯微球偶联的致敏胶乳颗粒，微球粒径为80nm和300nm，浓度分别为0.8mg/mL、3.5mg/mL，用配制好的试剂2缓冲溶液(含除D-二聚体致敏胶乳颗粒外的其他所有组分)重悬，混匀即得试剂2。

实验例1均匀性测试

以实施例1～3的产品为样品，以市售产品(含缓冲液和胶乳颗粒，不含干扰剂)为对照，进行实验。

测试两个水平血清或质控品，计算均匀性变异系数，结果如表1所示。

表1均匀性测试结果

结果显示，市售品的均匀性变异系数(CV)明显高于本发明试剂的均匀性变异系数。

实验例2抗干扰测试

样品同实验例1。

搜集混合血浆样本，充分混匀后平均分成5份，将血清与干扰物19:1的比例混合均匀，使干扰物的终浓度达到以下值：

对照样本：血清与0.1mol/L氢氧化钠溶液19:1混合；

HB干扰样本：血清与HB干扰物混合，配制血红蛋白(HB)终浓度为500mg/dL的血清样本；

BIL干扰样本：血清与BIL干扰物混合，配制胆红素(BIL)终浓度为18mg/dL的血清样本；

TG干扰样本：血清与TG干扰物混合，配制甘油三酯(TG)终浓度为2000mg/dL的血清样本；

RF干扰样本：血清与RF干扰物混合，配制类风湿因子(RF)终浓度为200IU/mL的血清样本。

结果如表2所示：

表2抗干扰测试结果

结果说明，市售品的抗干扰测试偏差比本发明实施例的抗干扰测试偏差大，说明本发明抗干扰能力更强。

实验例3热稳定性测试

样品同实验例1。

各组试剂37℃放置至少10天，过程中检测质控，重复10次取均值，进行显著性分析，p值应≥0.05。

结果如表3所示：

表3热稳定性测试结果

结果显示，市售品的37℃加速10天质控结果变化趋势显著，本发明实施例的变化趋势不显著,说明本发明试剂的稳定性更好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种D-二聚体检测抗干扰试剂，其特征在于，包括以下组分：

脂肪酶、异嗜性抗体阻断剂和盐离子。

2.根据权利要求1所述的D-二聚体检测抗干扰试剂，其特征在于，所述脂肪酶、异嗜性抗体阻断剂和盐离子的质量比为0.01～1:0.01～1:0.01～10。

3.根据权利要求1或2所述的D-二聚体检测抗干扰试剂，其特征在于，所述盐离子选自氯化钠、氯化钾、乙二胺四乙酸二钠、亚铁氰化钾中的一种或几种。

4.一种D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，包括试剂1和试剂2；

所述试剂1以缓冲液为溶剂，含有表面活性剂、防腐剂和权利要求1～3任一项所述的D-二聚体检测抗干扰试剂；

所述试剂2以缓冲液为溶剂，含有表面活性剂、盐离子、稳定剂、防腐剂和D-二聚体致敏胶乳颗粒；

在试剂1中，所述D-二聚体检测抗干扰试剂的浓度为0.03～12％。

5.根据权利要求4所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液的缓冲pH为6.0～9.0，浓度为20～300mM。

6.根据权利要求5所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液选自硼酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、MES缓冲液和Tris缓冲液中的一种或几种。

7.根据权利要求4所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂中含有A组分和B组分；

所述A组分选自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000和聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯中的一种或几种；

所述B组分选自吐温20、吐温80、TritonX-100、Brij-35中的一种或几种；

在试剂1或试剂2中，所述A组分的浓度为0.05～8％；

在试剂1或试剂2中，所述B组分的浓度为0.01～3％；

在表面活性剂中，所述A组分与B组分的体积比为0.01～800:1。

8.根据权利要求4所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述盐离子选自氯化钠、氯化钾、乙二胺四乙酸二钠、亚铁氰化钾中的一种或几种。

9.根据权利要求4所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂选自叠氮化钠、ProClin300、苯甲酸钠中的一种或几种；

在试剂1或试剂2中，所述防腐剂的浓度为0.01～0.2％；

所述稳定剂选自甘油、BSA、海藻糖、乳糖、甘氨酸、蔗糖中的一种或几种；

在试剂2中，所述稳定剂的浓度为0.2～15％。

10.根据权利要求4所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述D-二聚体致敏胶乳颗粒为鼠抗人D-二聚体单克隆抗体与聚苯乙烯微球通过化学偶联得到的致敏胶乳颗粒；

所述D-二聚体致敏胶乳颗粒的微球粒径为80～300nm；

在试剂2中，所述D-二聚体致敏胶乳颗粒的浓度为0.8～4.5mg/mL。