CN117491646A - 一种心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括包括缓冲液、促凝剂、表面活性剂和阻断剂，所述试剂R2包括缓冲液和H‑FABP抗体共价偶联纳米微球。本发明的试剂盒具有重复性好、特异性高、灵敏度高、稳定性好等优点，能够在生化仪上实现自动化检测，替代化学发光产品，降低检测成本，满足临床使用。

Description

一种心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及免疫分析技术领域，具体涉及一种心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒及其应用。

背景技术

脂肪酸结合蛋白(fatty acidbinding protein，FABP)分布于哺乳动物的心肌、小肠、肝脏、脂肪、脑、表皮等组织细胞中，已发现的FABP包括心脏型(H-FABP)等九种类型。H-FABP特异地存在于心肌组织中，约占心脏全部可溶性蛋白质的4％-8％。H-FABP与心肌细胞内的长链脂肪酸相结合，将其从细胞质膜向脂化和氢化部位运输，从而进入能量代谢体系氧化分解最终生成三磷酸腺苷(ATP)，为心肌收缩提供能量。H-FABP是急性心肌梗死(AMI)很早期的一个生物标志物。急性心肌梗死时，血清H-FABP在胸痛发生后2小时即出现显著升高，8.5小时左右达到峰值。如果在发病时及时介入诊断，辨别和对症治疗，对于提高患者生存率，改善预后意义重大，已逐渐被认为是心肌梗死早期诊断的重要生化指标之一。

传统的心肌标志物测定有心肌肌酸激酶、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(cTnI)、肌钙蛋白T(cTnT)和肌红蛋白(MYO)等。在检测及时性上，AMI发病时，见图1，H-FABP和MYO在2小时内即升高，在诊断上具有与MYO相同的时效性，明显早于CK-MB、cTnI和cTnT(约4-6小时后开始升高，12小时后达到峰值)，由于肌肉组织中的MYO含量两倍于心脏，在骨骼肌损伤时MYO可大量释放进入血液，而H-FABP特异地存在于心肌组织中，所以H-FABP的特异性优于MYO。

目前心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)检测常用的方法有如下几种：酶联免疫测定法(ELISA)、化学发光法、免疫胶体金法、荧光免疫层析测定法(FIA)、胶乳增强免疫比浊法等。ELISA法检测试剂太长，不能满足AMI时效要求；化学发光法检测时间也较长，需要专用仪器，试剂和仪器成本都很高；胶体金法和荧光免疫层析法其重复性和准确性尚有待提高，而胶乳增强的免疫比浊法由于操作简单、快速、准确，可利用传统生化分析仪检测等特点，综合性价比高，具有明显的优势。但现有的胶乳增强免疫比浊法也存在技术难点，如本身基于比浊法而检测灵敏度相对较低，胶乳本身配制或生产工艺不佳而导致稳定性欠佳，偶联工艺设计及控制不佳导致批间差大等缺点。

发明内容

为克服上述缺陷，本发明提供一种心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒及其应用。

本发明提供一种心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括包括缓冲液、促凝剂、表面活性剂和阻断剂，所述试剂R2包括缓冲液和H-FABP抗体共价偶联纳米微球。

进一步的，所述H-FABP抗体共价偶联纳米微球中的H-FABP抗体包括2-4种H-FABP单克隆抗体。

进一步的，所述试剂R1和试剂R2的缓冲液各自独立地选自磷酸缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液中的一种或多种，所述试剂R1和所述试剂R2的缓冲液的浓度各自独立地在10-500mM之间，pH值各自独立地在4-9之间。

进一步的，所述促凝剂为PEG或PVP，所述促凝剂的分子量为400-40000Da，所述促凝剂的浓度在0.2-5％(w/v)。

进一步的，所述阻断剂为主动阻断剂或被动阻断剂，所述主动阻断剂为鼠抗人HAMA抗体或兔抗人HAMA抗体，所述被动阻断剂为鼠IgG或兔IgG，浓度为0.02-5％。

进一步的，所述表面活性剂为Tween系列表面活性剂、Triton系列表面活性剂中的任意一种或多种，所述表面活性剂的浓度为0.02-0.5％(w/v)，所述Tween系列表面活性剂为Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81或Tween-85，Triton系列表面活性剂为TritonX-15、Triton X-45、Triton X-100或Triton X-405。

进一步的，所述试剂R1和试剂R2还包括保护剂，所述保护剂为牛血清白蛋白(BSA)、小牛血清、卵清蛋白、蔗糖、海藻糖、葡萄糖和甘油中的任意一种或多种，浓度为0.05-20％(w/v)。

进一步的，所述试剂R1和试剂R2还包括防腐剂，所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞和ProClin300中的任意一种或多种，浓度在0.02％-0.5％(w/v)。

进一步的，所述H-FABP抗体共价偶联纳米微球中的纳米微球为聚苯乙烯微球、聚丙烯酸微球和聚丙烯酸酯微球中的任意一种或多种，平均直径为130-380nm，浓度为0.02-0.5％(w/v)。和/或，所述纳米微球的表面修饰有官能团，所述官能团可为羧基或氨基。

进一步的，所述试剂盒还包括校准品和质控品，所述校准品和质控品包含缓冲液、防腐剂、保护剂和已知浓度的H-FABP，所述校准品中的H-FABP的浓度为0ng/mL、8.13ng/mL、16.25ng/mL、32.5ng/mL、65ng/mL、130ng/mL以及上述浓度之间的2-6个浓度，所述质控品中的H-FABP的浓度为5-15ng/mL和15-40ng/mL。

本发明还提供一种如上述的心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒的制备方法，所述H-FABP抗体共价偶联纳米微球的制备包括以下步骤：

S1.使用活化缓冲液稀释纳米微球，之后加入活化剂，在2-37℃条件下进行活化反应0.5-2小时后，离心去上清，向沉淀中加入pH为5.0-8.5的活化缓冲液，分散得到活化的纳米微球悬浊液；

S2.向活化的纳米微球悬浊液中加入2-4种H-FABP单克隆抗体，在2-37℃条件下条件下反应3-8小时；

S3.加入足量的乙醇胺封闭剂封闭4-18小时；

S4.离心去上清，用pH为7的Tris缓冲液清洗1-4次，再次离心去上清，用pH为7的Tris缓冲液重悬，得到H-FABP抗体共价偶联纳米微球。

进一步的，所述活化缓冲液磷酸缓冲液、醋酸缓冲液或MES缓冲液。

进一步的，所述活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

进一步的，所述步骤S2的2-4种H-FABP单克隆抗体同时加入、先后加入或各自分别偶联后合并加入。

本发明还提供一种心型脂肪酸结合蛋白的检测方法，使用如上述的试剂盒，包括以下步骤：

(1)将待测样本、校准品或纯水加入试剂R1中，搅拌混匀，温育约3-5min；

(2)再加入试剂R2，搅拌，温育反应25-40s，采用650-700nm检测波长，读取第一点吸光度A1，继续反应3-5min，读取第二点吸光度A2；

(3)用公式△OD＝A2-A1计算吸光度变化差值，以纯水作空白，将不同浓度校准品的吸光度变化差值及对应的浓度值，以非线性校准的模式确定校准曲线，通过将样本中的吸光度变化差值代入校准曲线，便可计算出相应的浓度值。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明的检测试剂盒的试剂R2采用共价偶联技术，与微球结合牢固，结合位置确定，并使用较大的纳米微球，将特异性的单克隆抗体偶联于胶乳微球，结合促凝剂的使用，解决常见的胶乳增强免疫比浊法所常见的灵敏度低，试剂存放稳定性不好、重复性不佳、批间差大等问题；

2、本发明提供的心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒在试剂R2中采用多个鼠抗人H-FABP单克隆抗体，单克隆抗体特异性强，批间差小，并且通过优化选择不同的抗体组合配对方式以及抗体在偶联时不同的工艺组合(如抗体偶联时加入的时机、加入的种类及数量、加入的方式等)，经过探索和优化，形成独特的工艺组合，使得不同批次间无显著差异，批间差可控，稳定性好，重复性好；

3、本发明的试剂盒具有重复性好、特异性高、灵敏度高、稳定性好等优点，能够在生化仪上实现自动化检测，替代化学发光产品，降低检测成本，满足临床使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同心机标志物AMI后不同时间的浓度水平变化图；

图2为本发明的试剂盒与化学发光免疫分析法测定试剂盒的方法学对比图；

图3为实施例1-5制备的试剂盒的长期稳定性图；

图4为实施例1-5制备的试剂盒的样本相关性图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例及附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。

本发明实施例提供一种心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中试剂R1包含缓冲液、促凝剂、表面活性剂和阻断剂，试剂R2包含缓冲液和H-FABP抗体共价偶联纳米微球。

其中，缓冲液能够控制pH，表面活性剂和阻断剂能够防止干扰。试剂R2包含缓冲液和H-FABP抗体共价偶联纳米微球，采用共价偶联技术，与微球结合牢固，结合位置确定，且使用的是较大的纳米微球，将特异性的无批间差的单克隆抗体的既定位置的氨基与较大的纳米微球上特定的活化羧基，发生特定的共价化学反应，通过控制抗体种类、数量，微球的种类、大小、数量，和活化剂及保护剂的添加量，使得这种化学反应偶联的微球抗体结合稳定牢固，可大大降低批间差，结合保护剂添加，可保持其长期稳定。较大微球的使用，可以大大提高灵敏度，结合促凝剂的使用，可进一步提高灵敏度，解决常见的胶乳增强免疫比浊法所常见的灵敏度低的问题。

其中，缓冲液能够调节pH，表面活性剂能够溶解样本中的脂类物质，促凝剂能够增加抗原抗体的结合速度和强度。

具体的，所述H-FABP抗体共价偶联纳米微球中的H-FABP抗体包括2-4种H-FABP单克隆抗体，在试剂R2中采用多个鼠抗人H-FABP单克隆抗体，单克隆抗体本身只对指定的抗原产生特异性免疫反应，因而特异性强；另外，单克隆抗体由于是单克隆的，方便重复生产，且不同生产批次之间没有批间差异。再者，通过多个单抗配合，一起使用，比使用单个抗体灵敏度更高，检测更为全面，批次间差异更小。

具体的，试剂R1和试剂R2的缓冲液可以为任何适合在胶乳增强免疫比浊法中使用的缓冲液。在具体的实施方案中，试剂R1和试剂R2的缓冲液各自独立地选自磷酸缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液中的一种或多种。在具体的实施方案中，试剂R1和试剂R2的缓冲液类型可以相同也可以不同。在一些优选的实施方案中，试剂R1和试剂R2的缓冲液类型相同，但浓度可以不同。

具体的，试剂R1和试剂R2的缓冲液的浓度各自独立地在10-500mM之间，优选的，在20-100mM之间。

具体的，试剂R1和试剂R2的缓冲液的pH值各自独立地在4-9之间，优选的，在5-8之间。

具体的，试剂R1的促凝剂可以为专用于在胶乳增强免疫比浊法中使用的促凝剂。在具体的实施方案中，促凝剂为PEG或PVP等大分子聚合物，分子量在400至40000道尔顿之间，优选的，在1000至30000道尔顿之间，浓度在0.2％-5％(w/v)之间，优选的，在0.5％-2％(w/v)之间。

具体的，试剂R1的阻断剂为主动阻断剂或被动阻断剂，所述主动阻断剂为鼠抗人HAMA抗体(RF为HAMA的一种)或兔抗人HAMA抗体等，所述被动阻断剂为鼠或兔等动物IgG，其浓度在0.02％-5％(w/v)之间，优选的，在0.05％-2％(w/v)之间。

具体的，试剂R1的表面活性剂可为Tween系列表面活性剂、Triton系列、或其它表面活性剂中的一种或多种，浓度在0.02％-0.5％(w/v)之间，优选的，在0.05％-0.2％(w/v)之间。Tween系列表面活性剂例如为Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81、Tween-85等。Triton系列表面活性剂例如为Triton X-15、Triton X-45、Triton X-100、Triton X-405等。

具体的，所述试剂R1和试剂R2还包括保护剂，主要要来保护试剂R1和试剂R2中有效物质免受或少受一定温度波动的破坏，保证其发挥正常的功能，同时也使微球保持稳定均一等。所述保护剂可为牛血清白蛋白(BSA)、小牛血清、卵清蛋白、蔗糖、海藻糖、葡萄糖和甘油中的一种或多种，浓度在0.05％-20％(w/v)之间，优选的，在0.2％-15％(w/v)之间。

具体的，所述试剂R1和试剂R2还包括防腐剂，防腐剂能够防止微生物污染，所述防腐剂可为叠氮钠、硫柳汞、ProClin300中的一种或多种，浓度在0.02％-0.5％(w/v)之间，优选的，在0.05％-0.2％(w/v)之间。

具体的，所述H-FABP抗体共价偶联纳米微球中的纳米微球可以是聚苯乙烯微球、聚丙烯酸微球和聚丙烯酸酯微球中的一种或多种，但也可以使用其他合适的纳米微球。具体的，所述纳米微球的平均直径在130-400nm之间，优选的，在150-370nm之间，浓度在0.02％-0.5％(w/v)之间，优选的，在0.05％-0.2％(w/v)之间。纳米微球的表面可修饰官能团，纳米微球的表面官能团可为羧基或氨基。这些纳米微球可以市售获得，或者通过本领域公知的方法制备得到。

具体的，所述试剂盒还包括校准品和质控品。具体的，校准品和质控品包含缓冲液、防腐剂、保护剂和已知浓度的H-FABP。其中，校准品和质控品中的缓冲液、防腐剂、保护剂的种类、浓度范围和pH值范围均可以参照试剂R1和试剂R2的缓冲液、防腐剂、保护剂的浓度范围和pH值范围。具体的，校准品和质控品可制备成液体形式或冻干粉形式。

具体的，校准品中的H-FABP的浓度为0ng/mL、8.13ng/mL、16.25ng/mL、32.5ng/mL、65ng/mL、130ng/mL以及上述浓度之间的2-6个浓度。

具体的，质控品中的H-FABP的浓度为5-15ng/mL和15-40ng/mL。

本发明实施例提供一种如上述的检测试剂盒的制备方法，所述H-FABP抗体共价偶联纳米微球的制备包括以下步骤：

S1.使用活化缓冲液稀释纳米微球，之后加入活化剂，在2-37℃条件下进行活化反应0.5-2小时后，离心去上清，向沉淀中加入pH为5.0-8.5的活化缓冲液，分散得到活化的纳米微球悬浊液；

S2.向活化的纳米微球悬浊液中加入2-4种H-FABP单克隆抗体，在2-37℃条件下条件下反应3-8小时；

S3.加入足量的乙醇胺封闭剂封闭4-18小时；

S4.离心去上清，用R2稀释液清洗1-4次，再次离心去上清，用R2稀释液重悬，得到H-FABP抗体共价偶联纳米微球。

具体的，步骤S1和步骤S4离心的离心力为15000g-60000g，离心时间为15-30min。

具体的，所述活化缓冲液磷酸缓冲液、醋酸缓冲液或MES缓冲液。

具体的，所述活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。

具体的，所述步骤S2中的2-4种H-FABP单克隆抗体可同时加入、先后加入、各自分别偶联后合并加入或其他方式加入。

具体的，所述R2稀释液为pH为7的Tris缓冲液。

本发明实施例还提供一种心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的检测方法，使用如上述的检测试剂盒，包括如下步骤：

(1)将4μL待测样本、不同浓度的校准品或纯水与200μL试剂R1混合，搅拌混匀，温育约3-5min；

(2)再加入50μL试剂R2，搅拌，温育反应25-40s，采用650-700nm检测波长，读取第一点吸光度A1，继续反应3-5min，读取第二点吸光度A2；

(3)用公式△OD＝A2-A1计算吸光度变化差值，以纯水作空白，将不同浓度校准品的吸光度变化差值及对应的浓度值，以非线性校准的模式确定校准曲线，通过将样本中的吸光度变化差值代入校准曲线，即可计算出相应的浓度值。

本发明实施例还提供一种如上述的检测试剂盒在检测待测样品心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)中的应用。

具体的，所述待测样品为血清。

以下结合具体实施例说明：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。

实施例1

本实施例的试剂盒包括试剂R1和试剂R2。

试剂R1的配方如下：

试剂R2的配方如下：

组分	每升用量
		缓冲液	50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH为7.0
偶联有抗人H-FABP抗体1，2，3，4的纳米微球	0.1％(w/v)，纳米微球的粒径为200nm
		表面活性剂	Tween-40，浓度为0.1％(w/v)
保护剂	BSA，浓度为3％(w/v)
		防腐剂	Proclin300，浓度为0.1％(w/v)

注：抗人H-FABP抗体1，2，3，4为抗原位点有差异的4种单克隆抗体。

试剂R1配制方法如下：

配制50mM pH为6.5的Tris缓冲液，称取8g PEG10000、2g Tween-40、10g BSA和1gProclin300，搅拌溶解，再加4g鼠抗HAMA抗体阻断剂混合均匀，制得试剂R1。

试剂R2配制方法如下：

称取1g平均粒径为200nm、表面带有羧基的聚苯乙烯微球，用pH为5的磷酸缓冲液稀释至浓度为1％(w/v)，加入适量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液和适量的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，在37℃条件下进行活化反应1小时后，38000g离心15min，去上清，向沉淀中加入pH为5的磷酸缓冲液，超声分散，得到活化的聚苯乙烯纳米微球悬浊液。然后，向活化的纳米微球悬浊液中加入适量的抗人H-FABP抗体1，2，3和4，在37℃条件下反应3小时后，加入足量的封闭剂封闭4小时，38000g离心15min，去上清，用pH为7的Tris缓冲液清洗3次，最后，38000g离心15min，去上清，得到抗人H-FABP抗体偶联的聚苯乙烯纳米微球。

称取3g BSA、0.1g Tween-40和0.1g Proclin300，加入100mLpH为7.0的Tris缓冲液中，充分搅拌以促进溶解。然后称取上述制备好的抗人H-FABP抗体偶联的聚苯乙烯纳米微球0.1g，加入所得溶液中，搅拌均匀重悬，超声分散，得到抗人H-FABP抗体偶联的聚苯乙烯纳米微球胶乳。

实施例2

本实施例的试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其配方如下，制备方法参考实施例1。

试剂R1的配方如下：

组分	每升用量
		缓冲液	50mM磷酸缓冲液，pH为6.5
促凝剂	PVP20000，浓度为0.5％(w/v)
		表面活性剂	Tween-80，浓度为0.2％(w/v)
保护剂	BSA，浓度为0.5％(w/v)
		阻断剂	兔抗HAMA抗体阻断剂，浓度为0.2％(w/v)
防腐剂	叠氮化钠，浓度为0.1％(w/v)

试剂R2的配方如下：

组分	每升用量
		缓冲液	50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH为7.0
偶联有抗人H-FABP抗体1，2的纳米微球	0.2％(w/v)，纳米微球的直径为400nm
		表面活性剂	Tween-40，浓度为0.1％(w/v)
保护剂	海藻糖，浓度为5％(w/v)
		防腐剂	Proclin300，浓度为0.1％(w/v)

实施例3

本实施例的试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其配方如下，制备方法参考实施例1。

试剂R1的配方如下：

试剂R2的配方如下：

实施例4

本实施例的试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其配方如下，制备方法参考实施例1。

试剂R1的配方如下：

组分	每升用量
		缓冲液	50mMHEPES缓冲液，pH为6.5
促凝剂	PVP20000，浓度为0.5％(w/v)
		表面活性剂	Triton-405，浓度为0.2％(w/v)
保护剂	BSA，浓度为1.0％(w/v)
		阻断剂	兔抗HAMA抗体阻断剂，浓度为0.1％(w/v)
防腐剂	叠氮化钠，0.1％(w/v)

试剂R2的配方如下：

实施例5

本实施例的试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其配方如下，制备方法参考实施例1。

试剂R1的配方如下：

组分	每升用量
		缓冲液	50mMHEPES缓冲液，pH为6.5
促凝剂	PVP20000，浓度为0.5％(w/v)
		表面活性剂	Triton-405，浓度为0.2％(w/v)
保护剂	BSA，浓度为1.0％(w/v)
		阻断剂剂	兔抗HAMA抗体阻断剂，浓度为0.1％(w/v)
防腐剂	叠氮化钠，浓度为0.1％(w/v)

试剂R2的配方如下：

以实施例1为例进行测试：

测试仪器：贝克曼库尔特AU680，测试步骤及相关参数如下：

将4μL待测样本与200μL试剂R1混合，搅拌混匀，温育约3-5min，再加入50μL试剂R2，搅拌，温育反应25-40s，采用650-700nm检测波长，读取第一点吸光度A1，继续反应3-5min，读取第二点吸光度A2；用公式△OD＝A2-A1计算吸光度变化差值，将纯水和校准品采用与待测样本同样的检测流程，以纯水作空白，将不同浓度校准品的吸光度变化差值及对应的浓度值，以非线性校准的模式确定校准曲线，通过将样本中的吸光度变化差值代入校准曲线，便可计算出相应的浓度值。

测试性能结果如下：

1、空白吸光度

以纯化水为空白样本，用试剂盒重复测试3次，计算3次测试结果的吸光度平均值。结果如下表所示，可见空白吸光度均值不超过1.2，表明测试的灵敏度良好。

实施例1制备的试剂盒的检测空白吸光度测试结果：

2、灵敏度

配制H-FABP浓度为5ng/mL的样本，用实施例1制备的试剂盒测试5ng/mL样本，每个样本重复测试3次，计算每个样本的吸光度变化差值，算出吸光度变化差值平均值。结果如下表所示，可见测定5ng/mL样本吸光度变化差值≥0.01，表明试剂的灵敏度良好。

实施例1制备的试剂盒的检测分析灵敏度测试结果：

3、重复性

配制H-FABP浓度为5ng/mL(低值)和15ng/mL(高值)的样本，用实施例1制备的试剂盒分别重复测试H-FABP含量10次，计算平均值、标准差(SD)和变异系数(CV)。结果如下表所示，可见重复性CV<10％，重复性良好。

实施例1制备的试剂盒的检测重复性测试结果：

测试数	低值(ng/mL)	高值(ng/mL)
			1	4.81	13.84
2	4.88	13.94
			3	4.68	14.07
4	4.75	14.05
			5	4.49	13.85
6	4.64	13.9
			7	4.82	14.27
8	5.06	13.8
			9	4.77	14.05
10	4.64	13.98
			平均值	4.77	13.98
标准差	0.17	0.14
			变异系数	3.54％	0.97％

4、线性范围

配制H-FABP浓度为2.5ng/mL(低值)和130.0ng/mL(高值)的样本，用2.5ng/mL样本等比稀释130.0ng/mL样本，用实施例1制备的试剂盒测定稀释后的各样本，每个样本重复测定3次，求平均值，与理论浓度相比较，计算其相对偏差。结果如下表所示，可见试剂盒线性范围可达2.5-130.0ng/mL，线性相关系数R＝0.9994，表明线性范围宽，线性关系良好。

实施例1制备的试剂盒的检测线性范围测试结果：

5、准确度

配制H-FABP浓度为8.12ng/mL、16.25ng/mL、32.50ng/mL、65.00ng/mL、130.00ng/mL五个浓度样本，用实施例1制备的试剂盒测定各样本，每个样本重复测定3次，求平均值，与理论浓度相比较，计算其相对偏差。结果如下表所示，可见相对偏差<10％，表明试剂盒准确良好。

实施例1制备的试剂盒的检测准确度测试结果：

6、校准品长期稳定性

配制H-FABP浓度为4.06ng/mL、8.12ng/mL、16.25ng/mL、32.50ng/mL、65.00ng/mL、130.00ng/mL六个浓度校准品，并保存于2-8℃条件下。从第0个月监测开始，按照规定的月份间隔(0、1、3、6、9、12、18、24)取出校准品，每次用实施例1制备的试剂盒测定各校准品，每个校准品测定1次，与第0个月测试的浓度相比较，计算其每次的浓度变化相对偏差，监测到第24个月后停止监测。结果如下表所示，可见相对偏差<10％，表明校准品稳定性良好。

实施例1制备的试剂盒的检测校准品稳定性测试结果：

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7、试剂盒长期稳定性

配制H-FABP浓度为4.06ng/mL、8.12ng/mL、16.25ng/mL、32.50ng/mL、65.00ng/mL、130.00ng/mL六个浓度校准品。除标准品外，试剂盒中的其他试剂保存于2-8℃条件下，从第0个月监测开始，按照规定的月份间隔(0、1、3、6、9、12、18、24)取出试剂盒测定各校准品，每个校准品测定1次，与第0个月测试的浓度相比较，计算其每次的浓度变化相对偏差，监测到第24个月后停止监测。结果如下表所示，可见相对偏差<10％，表明试剂盒稳定性良好。

实施例1制备的试剂盒的长期稳定性测试结果：

方法学比对：

用实施例1制备的试剂盒和校准品在贝克曼库尔特全自动生化分析仪上建立标准曲线，并测定已知H-FABP浓度的样本的H-FABP值。已知H-FABP浓度的样本来自医院，其H-FABP值在医院的全自动化学发光免疫分析仪上测定。以本发明的胶乳增强免疫比浊法试剂盒的测定值为纵坐标，以化学发光免疫分析法测定试剂盒的测定值为横坐标，绘制曲线，如图2所示。可见，本发明的胶乳增强免疫比浊法试剂盒与化学发光免疫分析法测定试剂盒具有良好的相关性。

与MYO的符合率比较：

由于MYO与H-FABP有较好的相关性，而H-FABP目前没有国际或国内标准物质，故将H-FABP与MYO进行符合率比较。用实施例1的试剂盒的试剂和校准品在贝克曼库尔特AU680全自动生化分析仪上建立标准曲线，并测定已临床确诊AMI阴阳性的已知MYO浓度的样本的H-FABP值。已知MYO浓度的样本来自医院，其MYO值在医院的全自动化学发光免疫分析仪上测定。

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如上表所示可见，本发明的胶乳增强免疫比浊法试剂盒与MYO试剂具有良好的符合率。

本实施例1-5制备的试剂盒有着不同的优化工艺，比较各实施例制备的试剂盒关键性能测试数据，测试比较结果如下：

实施例1-5的重复性：

配制H-FABP浓度为5ng/mL(低值)和15ng/mL(高值)的样本，用实施例1-5制备的试剂盒分别重复测试H-FABP含量20次，计算平均值、标准差(SD)和变异系数(CV)。结果如下表所示，可见重复性CV<10％，重复性良好。

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实施例1-5的准确度：

配制H-FABP浓度为8.12ng/mL、16.25ng/mL、32.50ng/mL、65.00ng/mL、130.00ng/mL五个浓度样本，用实施例1-5制备的试剂盒测定各样本，每个样本重复测定3次，求平均值，与理论浓度相比较，计算其相对偏差。结果如下表所示，可见相对偏差<10％，表明试剂盒准确良好。

实施例1-5的长期稳定性：

配制H-FABP浓度为16.25ng/mL的校准品。除标准品外，试剂盒中的其他试剂保存于2-8℃条件下，从第0个月监测开始，按照规定的月份间隔(0、1、3、6、9、12、18、24)取出试剂盒测定各校准品，每个校准品测定1次，与第0个月测试的浓度相比较，计算其每次的浓度变化相对偏差，监测到第24个月后停止监测。结果见图3所示，可见相对偏差<10％，表明试剂盒稳定性良好。

实施例1-5的样本相关性：

用实施例1-5制备的试剂盒和校准品在贝克曼库尔全自动生化分析仪上建立标准曲线，并测定已知H-FABP浓度的样本的H-FABP值。已知H-FABP浓度的样本来自医院，其H-FABP值在医院的全自动化学发光免疫分析仪上测定。以本发明的胶乳增强免疫比浊法试剂盒的测定值为纵坐标，以化学发光免疫分析法测定试剂盒的测定值为横坐标，绘制曲线，如图4所示。可见，本发明的胶乳增强免疫比浊法试剂盒与化学发光免疫分析法测定试剂盒具有良好的样本相关性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括包括缓冲液、促凝剂、表面活性剂和阻断剂，所述试剂R2包括缓冲液和H-FABP抗体共价偶联纳米微球。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述H-FABP抗体共价偶联纳米微球中的H-FABP抗体包括2-4种H-FABP单克隆抗体。

3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2的缓冲液各自独立地选自磷酸缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液中的一种或多种，所述试剂R1和所述试剂R2的缓冲液的浓度各自独立地在10-500mM之间，pH值各自独立地在4-9之间。

4.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述促凝剂为PEG或PVP，所述促凝剂的分子量为400-40000Da，所述促凝剂的浓度在0.2-5％(w/v)；

和/或，所述阻断剂为主动阻断剂或被动阻断剂，所述主动阻断剂为鼠抗人HAMA抗体或兔抗人HAMA抗体，所述被动阻断剂为鼠IgG或兔IgG，浓度为0.02-5％；

和/或，所述表面活性剂为Tween系列表面活性剂、Triton系列表面活性剂中的任意一种或多种，所述表面活性剂的浓度为0.02-0.5％(w/v)，所述Tween系列表面活性剂为Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81或Tween-85，Triton系列表面活性剂为TritonX-15、Triton X-45、Triton X-100或Triton X-405。

5.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2还包括保护剂，所述保护剂为牛血清白蛋白(BSA)、小牛血清、卵清蛋白、蔗糖、海藻糖、葡萄糖和甘油中的任意一种或多种，浓度为0.05-20％(w/v)；

和/或，所述试剂R1和试剂R2还包括防腐剂，所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞和ProClin300中的任意一种或多种，浓度在0.02％-0.5％(w/v)。

6.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述H-FABP抗体共价偶联纳米微球中的纳米微球为聚苯乙烯微球、聚丙烯酸微球和聚丙烯酸酯微球中的任意一种或多种，平均直径为130-380nm，浓度为0.02-0.5％(w/v)；

和/或，所述纳米微球的表面修饰有官能团，所述官能团可为羧基或氨基。

7.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括校准品和质控品，所述校准品和质控品包含缓冲液、防腐剂、保护剂和已知浓度的H-FABP，所述校准品中的H-FABP的浓度为0ng/mL、8.13ng/mL、16.25ng/mL、32.5ng/mL、65ng/mL、130ng/mL以及上述浓度之间的2-6个浓度，所述质控品中的H-FABP的浓度为5-15ng/mL和15-40ng/mL。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述H-FABP抗体共价偶联纳米微球的制备包括以下步骤：

S1.使用活化缓冲液稀释纳米微球，之后加入活化剂，在2-37℃条件下进行活化反应0.5-2小时后，离心去上清，向沉淀中加入pH为5.0-8.5的活化缓冲液，分散得到活化的纳米微球悬浊液；

S2.向活化的纳米微球悬浊液中加入2-4种H-FABP单克隆抗体，在2-37℃条件下条件下反应3-8小时；

S3.加入足量的乙醇胺封闭剂封闭4-18小时；

S4.离心去上清，用pH为7的Tris缓冲液清洗1-4次，再次离心去上清，用pH为7的Tris缓冲液重悬，得到H-FABP抗体共价偶联纳米微球。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述活化缓冲液磷酸缓冲液、醋酸缓冲液或MES缓冲液；

和/或，所述活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；

和/或，所述步骤S2的2-4种H-FABP单克隆抗体同时加入、先后加入或各自分别偶联后合并加入。

10.一种心型脂肪酸结合蛋白的检测方法，其特征在于，使用如权利要求1-7任一项所述的试剂盒，包括以下步骤：

(1)将待测样本、校准品或纯水加入试剂R1中，搅拌混匀，温育约3-5min；

(2)再加入试剂R2，搅拌，温育反应25-40s，采用650-700nm检测波长，读取第一点吸光度A1，继续反应3-5min，读取第二点吸光度A2；

(3)用公式△OD＝A2-A1计算吸光度变化差值，以纯水作空白，将不同浓度校准品的吸光度变化差值及对应的浓度值，以非线性校准的模式确定校准曲线，通过将样本中的吸光度变化差值代入校准曲线，便可计算出相应的浓度值。