KR102419508B1

KR102419508B1 - 신규한 메티실린-내성 황색포도상구균 검출 방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102419508B1
Application number: KR1020200132492A
Authority: KR
Inventors: 박경숙; 이소연; 윤경아; 권정선; 신용범
Original assignee: 대전보건대학교 산학협력단; 재단법인 바이오나노헬스가드연구단
Priority date: 2020-10-14
Filing date: 2020-10-14
Publication date: 2022-07-11
Also published as: KR20220049185A

Abstract

본 발명은 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)를 이용하는, 신규한 메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 검출 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서는 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)인 MRSA 프로브(MBL-AuNPs 접합체)와 MRSA의 응집 반응을 통해 높은 민감도로 MSSA와 MRSA를 구별하여 육안으로 신속하게 검출하였다. 따라서, 본 발명을 이용하면 고가의 검출기계나 고난이도의 기술을 이용하지 않아도 육안으로 응집 변화를 통해 MRSA의 신속, 정확한 진단 및 검출이 가능하고, 이를 통해 MRSA를 관리하는 데 필요한 신속한 임상적 처치를 제공하여 MRSA의 효율적인 치료에 크게 일조할 것으로 기대된다.

Description

신규한 메티실린-내성 황색포도상구균 검출 방법 및 이의 용도{Method for Detecting Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus and Uses Thereof}

본 발명은 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)를 이용하는, 신규한 메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 검출 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

황색포도상구균(S. aureus)은 경미한 피부 감염에서 폐렴, 수막염, 심내막염, 골수염 및 패혈증과 같은 심각하고 생명을 위협하는 감염에 이르는 다양한 질병을 유발할 수있는 가장 흔한 기회 주의적 인간 병원체 중 하나이다. 최근에 S. aureus, 특히, 메티실린-내성 S. aureus (methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에서 다중 약물 내성의 출현은 공중 보건에 심각한 위협이 되었고 의료 비용이 급격히 증가했다. 또한, MRSA는 다양한 항생제에 대한 내성이 빈번하여 감염성 질환 치료에 문제가 될 수 있다.

임상에서의 기존 MRSA 검출 방법은 디스크 확산, 브로스 희석 분석 및 노동 집약적이고 시간 소모적인 E-Test를 포함한 배양 기반 AST이다. 또한, 세균을 직접 측정하는 POCT법의 경우, 고비용적 측면과 검사 결과의 민감도 및 정확도를 신뢰할 수 있는 수준에 도달하지 못한 문제가 있다.

이에 대한 대안으로 qPCR, 항체 기반 ELISA, 핵산 혼성화와 같은 분자 진단 기술이 개발되었다. 최근에는 면역 PCR, 질량 분석 분석, 바이오 센서 기술과 같은 신속한 진단 기술도 보고되고 있다. 그러나, 훈련된 숙련자와 값 비싼 도구가 필요하기 때문에 여전히 한계가 있다.

또한, MRSA의 정확한 동정 방법으로는 분자생물학적 검사방법인 DNA probe나 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 이용하여 mecA 유전자를 직접 검출하는 방법과, immunoblotting이나 immunoradiometric assay(IRMA)를 이용하여 mecA 유전자의 산물인 PBP 2a를 검출하는 방법 등이 있으나, 특수장비나 고가의 시약, 복잡한 검사수기 및 검사시간 등 제반 여건이 일반검사실에서 통상적으로 이용하기에는 적합하지 않으며, 그 동안 전통적으로 사용해 왔던 항균제 감수성 검사법은 배양 시간만도 24시간이 소요되고 배지의 종류나 배양조건에 따라 내성 발현에 차이를 보이기 때문에 신속하고 정확한 결과를 기대하기는 어렵다.

또한, 환자의 검체에서 황색포도상구균이 배양되었을 때 이것이 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-resistant S. aureus; MRSA)인지 메티실린 민감성 황색포도상구균(methicillin-sensitive S. aureus; MSSA)인지에 대한 감별이 중요하다. 이는 자동화기계에 의한 생화학적 검사를 통해서 감별 진단할 수 있으나, 검사 결과를 얻기 위해서는 추가적으로 하루 이상의 시간이 필요하다. 게다가, MRSA와 MSSA를 빨리 감별하기 위한 방법들이 개발되어 있으나, 가격 등 여러 가지 제한점이 있어서 사용이 어려운 실정이다.

따라서, MSSA와 구별하여 MRSA를 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 기술의 개발 필요성이 당업계에서 시급히 요구되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상술한 종래 MRSA을 진단, 검출하는 방법에 대한 문제점을 해결하고, MRSA를 신속정확하며 간편하게 검출하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은, 중요한 숙주 방어 단백질이며 타고난 면역 체계의 렉틴 보체 경로를 활성화하는 칼슘 의존성 광범위한 옵소닌으로서 병원균과 같은 미생물 표면 탄수화물 분자에 결합할 수 있는 것으로 알려진 만노즈 결합 렉틴(Mannose-Binding Lectin, MBL)을 금나노 입자(AuNP)에 접합시켜 MBL-결합 금나노 입자(AuNP)인 MRSA 프로브(MBL-AuNP)를 제작하였고, 상기 본 발명의 MRSA 프로브를 MRSA와 혼합했을 때, 이들 간 결합으로 인해 육안으로 응집을 관찰하여 MRSA 존재 여부를 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일 목적은 메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)의 검출 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 감염의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 검출 또는 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)의 검출 방법을 제공한다:

(a) 대상으로부터 분리된 시료에 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)를 처리하는 단계; 및

(b) 상기 시료에서 응집이 발생하면 상기 시료 내 MRSA가 존재하는 것으로 판단하는 단계.

본 명세서에서, 용어 "시료(sample)"는 생체 시료, 환경 시료 및 식품 시료로부터 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 시료를 포함할 수 있다.

상기 생체 시료는 생체내 또는 시험관내로부터 수득한 생물학적 조직 또는 체액 기원의 시료를 포함하는 생물학적 대상체로부터 수득한 시료를 지칭할 수 있다. 구체적으로, 상기 생체 시료는 사람을 포함하는 포유동물로부터 단리된 체액 (예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 객담 또는 소변), 기관, 조직, 분획, 및 세포일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 생체 시료로부터의 추출물, 예를 들어, 생물학적 유체 (예를 들어, 혈액 또는 소변)로부터의 항체, 단백질 등을 포함할 수 있다.

상기 환경 시료는 수질 시료 또는 토양 시료를 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명은 본 발명의 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)에 의해 MRSA를 매우 효과적이고 간편하게 검출할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)", "MBL-AuNPs 접합체(결합체)", "MBL-AuNPs" 또는 "MRSA 프로브"는 MBL(Mannose-Binding Lectin)에 금나노입자(AuNP)를 접합(결합)시킨 접합체(결합체)를 의미하며, 본 명세서에서 혼용된다.

즉, 본 발명은 대상 시료 내 MRSA의 존재 여부를 판단하는 데에 있어서, MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)와 MRSA의 결합 과정에서 발생하는 응집 변화를 이용하여 육안으로 확인함으로써 간단하게 MRSA의 존재 여부를 판단할 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)는, 메티실린-민감성 황색포도상구균(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus, MSSA)에 결합하지 않으므로, MSSA와 구별된 MRSA-특이적 응집 현상을 나타내는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 감염의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:

(b) 상기 시료에서 응집이 발생하면 상기 시료 내 MRSA가 존재하는 것으로 판정하는 단계.

즉, 본 발명은 대상으로부터 분리된 시료 내 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)와 MRSA의 결합 과정에서 발생하는 응집 변화 정보를 이용하여 육안으로 확인함으로써 간단하게 대상의 MRSA의 감염 가능성, 감염 여부, 또는 S. aureus 종류의 진단에 관한 정보를 제공할 수 있다.

또한, 상기 방법에서, 미생물을 배양하는 단계 또는 미생물의 유전물질을 증폭하는 단계를 포함하지 않는다. 일반적으로, 생체 시료, 환경 시료, 또는 식품 시료 내 포함된 미생물은 미량인 경우가 많기 때문에, 종래 표지된 프로브를 미생물과 결합시켜 표지된 프로브로부터 방출되는 신호를 측정하는 방법은 효율성이 떨어지는 문제점이 있다. 측정 효율을 증가시키기 위해서 시료 내 미생물을 정제하거나, 미생물의 유전물질을 PCR 등의 방법으로 증폭시키거나 미생물을 배양하는 기술이 사용되고 있으나, 미생물을 정제하는 과정에서 변형이 일어날 수 있고, 유전물질을 증폭시키는 과정은 시간이 오래 걸리고 유전 정보를 모르는 경우 사용할 수 없으며, 미지의 미생물이 포함된 경우나 다수의 미생물이 포함된 경우 배양 조건을 설정하기가 어렵다.

그러나, 본 방법의 일 구체예에 따르면 본 발명의 MRSA 프로브를 시료에 처리하고 응집 현상을 관찰함으로써, 상술한 미생물을 배양하는 단계 또는 미생물의 유전물질을 증폭하는 단계를 포함하지 않고도 목적 대상인 MRSA을 MSSA와 구별하여 효율적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)를 포함하는, 메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 검출 또는 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 MRSA을 검출하는 것에 이용될 수 있다.

본 발명의 상기 키트는 MRSA 검출을 실시하기 위해 필요한 반응 구성성분의 보관 또는 전달을 위한 키트를 제공한다. 키트는 검출에 필요하거나 바람직한 의의 모든 구성성분을 포함할 수 있으며, 여기에는 시약 자체, 완충액, 제어 시약(예를 들어 조직 시료, 양성 및 음성 대조군 표적 올리고뉴클레오티드 등), 고체 지지체, 표지, 서면 및/또는 도면 사용 설명서 및 제품 정보, 저해제, 표지화 및/또는 검출 시약, 포장 환경 제어(예를 들어 얼음, 제습제 등) 등이 포함되나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 키트는 MRSA의 정확한 진단 뿐만 아니라 감염을 검출할 수 있으며, 이를 기반으로 보다 정확하게 MRSA 감염의 예후를 예측하고 치료에 적용될 수 있다.

본 발명의 키트는 상술한 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)을 구성으로 포함하여 MRSA와의 응집을 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명에서는 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)인 MRSA 프로브(MBL-AuNPs 접합체)와 MRSA의 응집 반응을 통해 높은 민감도로 MSSA와 MRSA를 구별하여 육안으로 신속하게 검출하였다. 따라서, 본 발명을 이용하면 고가의 검출기계나 고난이도의 기술을 이용하지 않아도 육안으로 응집 변화를 통해 MRSA의 신속, 정확한 진단 및 검출이 가능하고, 이를 통해 MRSA를 관리하는 데 필요한 신속한 임상적 처치를 제공하여 MRSA의 효율적인 치료에 크게 일조할 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 MRSA 프로브인 MBL-AuNPs 접합체를 사용한 MRSA 스크린 테스트를 개략적으로 보여준다. (A)는 AuNP-MBL 결합의 간단한 과정을 보여준다. (B)는 MRSA를 구체적으로 검출하기 위해 MRSA 프로브를 사용하여 설계된 MRSA 스크린 테스트를 개략적으로 보여준다.
도 2는 본 발명의 MRSA 프로브의 특성을 보여준다. MRSA 프로브는 DLS, Zeta Potential 및 FE-TEM으로 특성화되었다. (A) 동적 광산란(DLS) 및 (B) AuNP 또는 MRSA 프로브의 제타 전위 값 (n = 100)에 의해 측정된 평균 유체역학적 크기. (C) TEM 이미지 및 (D) AuNP 또는 MRSA 프로브의 크기 분포 (n = 100).
도 3은 다양한 박테리아와 본 발명의 MRSA 프로브의 결합(선택성) 테스트 결과를 보여준다. (A) E. coli, (B) E. coli O157:H7,(C) P. aeruginosa, (D) K. pneumonia, (E) S. flexneri, (F) S. enterica, (G) E. faecium, (H) S. epidermidis, (I) S. aureus (ATCC 29213), (J) S. aureus (ATCC 6538P, MSSA), (K) S. aureus (ATCC 43300, MRSA) 및 (L) 박테리아 부재(음성 대조군).
도 4는 FE-SEM 분석을 사용한 본 발명의 MRSA 프로브의 선택적 결합 테스트 결과를 보여준다. MSSA (A) 및 MRSA (B)로 BSA-AuNPs 응집 분석을 수행한 후 SEM 이미지. MSSA (C) 및 MRSA (D)로 MRSA 프로브 응집 분석을 수행한 후 SEM 이미지. 노란색 화살표는 BSA-AuNP 또는 MRSA 프로브를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 MRSA 프로브-기반 MRSA 스크린 테스트에 대한 염 농도에 따른 응집 효과를 보여준다.
도 6은 본 발명의 MRSA 프로브를 40 개의 임상 S. aureus 분리주에 처리했을 때 MRSA 선별 검사 결과를 보여준다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험 방법

박테리아 배양 및 성장 조건

본 실시예에 이용된 Escherichia coli (E. coli, ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa, ATCC 27853), Klebsiella pneumoniae (K. pneumonia, ATCC 13883), Shigella flexneri (S. flexneri, ATCC 29903) 및 Staphylococcus aureus (S. aureus, ATCC 6538P, MSSA)는 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, Korea); Enterococcus faecium (E. faecium, ATCC 19434), Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis, ATCC 14990) 및 S. aureus (ATCC 29213, MSSA)는 KCCM(Korean Culture Center of Microorganisms, Korea)으로부터 제공받았다. 본 실시예에서, S. aureus (ATCC 6538P)는 MSSA(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus)로서 음성 대조군으로 이용되었다. Salmonella enterica (S. enterica, ATCC 15277), MRSA (ATCC 43300), E. coli O157:H7 (ATCC 35150)는 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 제공받았다.

총 40 개의 임상 샘플로부터 분리된 S. aureus 분리체 (MRSA 20 개 및 MSSA 20 개)는 연세대학교(Prof. D. Yong, Yonsei University College of Medicine, Korea)로부터 제공받았다.

모든 콜로니-정제 균주는 15% 글리세롤(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 포함된 Luria-Bertani 브로스(LB, BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 최소 계대 배양한 후 이용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 다른 모든 화학 물질은 분석 등급이었으며 정제수는 Millipore 정수 시스템 (EMD Millipore, Bedford, MA, USA)에 의해 생산되었다.

재조합 MBL 단백질의 유전자 클로닝, 과발현 및 정제

c-말단에 6 개의 히스티딘 태그(6X His-tag)가 포함된 합성 만노스 결합 렉틴(mannose binding lectin, MBL) DNA(GenBank # BC096179)는 바이오니아(대전, 한국)에서 확보하였다. MBL DNA를 pAcGP67A (Pharmingen, San Diego, USA)에 클로닝하여 pAcGP67A-MBL-6X His-tag를 제작하였다. 단백질을 발현하기 위해 Trichoplusia ni BTI-TN-5B1-4 (High FiveTM) 곤충 세포 (Invitrogen, Carlsbad, USA)를 Insect Hi-Express 무혈청 배지에서 고역가 바이러스로 감염시키기 전까지 배양하였다. High Five^TM 곤충 세포를 사용하여 재조합 바큘로 바이러스로 감염시킨 후 MBL을 발현시켰다.

재조합 MBL을 정제하기 위해, 1L의 재조합 배큘로 바이러스에 감염된 곤충 세포 배양물을 감염 후 약 72 시간에 수확하고 세포를 15 분 동안 5000g에서 원심 분리하여 펠릿화하였다. 상층액을 결합 완충액 (50mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5M NaCl)으로 투석하여, 동일한 완충액으로 평형화된 Ni-NTA(Ni²⁺-nitrilotriacetic acid) 아가로스 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)에 로딩하고, 50mM 이미다졸을 함유하는 결합 완충액으로 세척하였다. 500mM 이미다졸을 함유하는 결합 완충액으로 MBL을 용출하여, 정제를 통해 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)으로 그 존재를 모니터링하였다. 용출된 당 단백질을 4℃에서 밤새 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)에서 Slide-A-Lyzer(3.5 K MWCO; Thermo Scientific, USA)로 투석하고 PBS(pH 7.4) 또는 5%(v/v) 글리세롤으로 -70℃에서 보관하였다. 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준으로 사용하는 Bradford 방법을 통해 결정되었다.

재조합 MBL 단백질-결합(conjugated) 금 나노 입자의 제작

구연산염(citrate)을 사용하여 염화금(III)(gold (III) chloride)을 환원시켜 금 나노 입자(Gold nanoparticles, AuNP)를 합성하였다. 125 mL의 물에 용해된 60 mg의 HAuCl₄를 가열시켰다. 그 후 HAuCl₄ 용액에 1% 구연산 나트륨(sodium citrate) 25mL를 교반하면서 첨가하고, 용액 색이 적색으로 변할 때까지 20 분간 더 가열시켰다.

냉각 후, 40ug의 단백질을 1mL의 AuNP 용액 (0.1mg/mL)에 첨가하고 혼합물 용액을 25℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 2% BSA 1 마이크로리터를 첨가하고 4℃에서 밤새 더 배양하여 결합체를 안정화시켰다. 결합되지 않은 단백질 또는 BSA는 0.1x PBS(pH 7.4)로 3 회 원심분리(15,000 rpm, 20 분)하여 제거되었다. 마지막으로, 결합체를 사용하기 위해 반응 완충액(20 mM Tris HCl pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, 10 mM MgCl₂)에 용해시켰다.

MBL 단백질-결합 금 나노 입자 (MRSA 프로브)의 특성 분석

유체역학적 크기 및 제타 전위 값은 입자 크기 분석기 (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., WR, UK)에 의해 특성화되었다. Disposable folded capillary cells(DTS1070, Malvern Instruments Ltd., WR, UK)를 유체역학적 크기 및 제타 전위 측정에 사용했다. AuNP 및 MBL-AuNP (MRSA 프로브)는 각각 D.W 및 Tris 완충액(pH7.4)으로 제작되었다.

AuNP 및 MRSA 프로브의 형태학적 특성은 200kV FE-TEM(field-emission transmission electron microscope, JEM-2100F, JEOL LTD, Tokyo, Japan)을 사용하여 분석되었다. AuNP 및 MRSA 프로브 분산액의 액적 x μg/mL을 Formvar/Carbon 그리드(TED PELLA, INC, Redding, CA, USA)에 떨어뜨리고 흄 후드에서 건조했다. AuNP 및 MRSA 프로브의 크기 분포는 ImageJ를 사용하여 이미지에서 분석되었다.

MRSA 프로브의 박테리어 결합 친화성 테스트

균주 선택성 분석의 경우, 지정된 박테리아 종 각각의 콜로니를 배양 브로 (LB)에 접종하였다. 진탕 배양기에서 16 내지 24 시간 배양한 후 PBS로 세척 하였다. 50㎕ MRSA 프로브에 50㎕ 박테리아 (1x10⁶개 세포/ml)를 첨가하고 5 분 동안 인큐베이션하였다.

MRSA 스크린 테스트의 최적화를 위해, 0.5% 효모 추출물, 1% 트립톤 및 각각의 NaCl 농도가 0.5, 1 또는 2% vol/vol로 보충된 고체 한천 플레이트에서 37℃에서 박테리아를 밤새 배양하였다. 2 개 또는 3 개의 박테리아 콜로니를 각 플라스틱 카드에 놓고 MRSA 프로브 1 방울(50㎕)을 첨가하였다. 박테리아와 MRSA 프로브를 막대를 사용하여 혼합하였다. MRSA가 혼합되었을 때 육안으로 감지하여 5 분 이내에 카드에서 눈에 띄는 응집체를 발견했다.

FE-SEM(Field-emission Scanning electron microscopy)

FE-SEM을 사용하여 MRSA 프로브의 세포 표면 결합을 시각화하기 위해, 응집체를 PBS의 4%(v/v) 포름알데히드 용액에 1 시간 동안 고정하고 DW로 탈수하여 Si-웨이퍼에 장착했다. 낮은 손상 모드에서 15kV의 전자빔으로 FE-SEM(Quanta 250 FEG, FEI, OR, USA)을 사용하여 Si-웨이퍼상의 응집체를 관찰하였다.

임상 샘플을 사용한 MRSA 스크린 테스트

0.5% 효모 추출물, 1% 트립톤 및 0.5% NaCl이 보충된 한천 플레이트에서 16 시간 인큐베이션한 후, 박테리아 콜로니를 골라 플라스틱 카드에 스트리킹하였다. 그런 다음 MRSA 프로브(1 방울, 50㎕)를 플라스틱 카드에 놓고 박테리아 세포를 혼합하였다. 20 개의 MRSA와 20 개의 MSSA를 포함하여 총 40 개의 임상 S. aureus 분리체가 테스트되었다. MRSA(ATCC 43300)는 본 실시예에서 양성 대조군으로 사용되었다. S. aureus (ATCC 29213) 및 S. aureus (ATCC 6538P; MSSA)도 MRSA 스크린 테스트를 위한 음성 대조군으로 사용되었다. 반응 5분 후 응집을 시각적으로 관찰하고 양성 대조군 및 음성 대조군과 비교하였다.

데이터 분석

민감도는 샘플이 테스트에 의해 진양성으로 결정된 경우 양성 결과의 백분율로 정의되고, 특이도는 샘플이 테스트에 의해 진음성으로 결정된 경우 음성 결과의 백분율로 정의되었다. 모든 공식은 다음과 같았으며 TP, TN 및 FP는 진 양성(truly positive), 진음성(true negative) 및 위양성(false positive)으로 표시되었다.

민감도 = TP/(TP+TN)

특이도 = TN/(TN+FP)

실시예 1. MBL-AuNP 결합체(MRSA 프로브)의 제조 및 특성화

본 발명자들은 MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)를 간단하고 빠르게 검출하는 MRSA 프로브를 만들기 위해, 먼저 곤충 세포 발현 시스템을 사용하여 재조합 MBL 단백질을 과발현하고 정제하였다. 정제된 재조합 MBL 단백질은 화학 반응없이 25℃에서 2 시간 동안 간단히 혼합하고 배양하여 AuNP와 결합되었다. 세척 단계 후, 본 발명자들은 DLS(dynamic size scattering) 및 FE-TEM(Field Emission Transmission Electron Microscope)으로 MRSA 프로브를 특성화하였다.

그 결과, 도 2A에 나타낸 바와 같이, 대조군인 AuNP의 유체역학적 크기는 16.62 ± 0.05 nm이고 PDI(polydispersity index)는 0.138 ± 0.02인 반면, 본 발명의 MRSA 프로브의 유체역학 크기와 PDI는 각각 177.47 ± 4.19 nm 및 0.346 ± 0.01로, AuNP에 비해 현저하게 증가되었다.

또한, 도 2B에 나타낸 바와 같이, AuNP의 제타 전위 값은 AuNP 표면에 재조합 MBL 단백질이 결합된 후 -32.93 ± 4.05에서 -2.75 ± 0.44로 감소되었고, 이를 통해 표면의 MBL-AuNP 안정화에 사용되는 완충액 성분이 제타 전위 감소를 유발한다는 것을 유추할 수 있다.

또한, 모양과 크기 분포를 관찰하기 위해 AuNP와 MRSA 프로브도 FE-TEM으로 분석했을 때, 도 2C 및 2D에 나타낸 바와 같이, FE-TEM 이미지 및 크기 분포는 AuNP 및 MRSA 프로브가 모두 구형이고 각각 평균 직경이 12.09 ± 1.32 nm 및 13.25 ± 1.36 nm임을 보여주었다.

실시예 2. 다양한 박테리아와 MRSA 프로브의 결합 테스트

본 발명자들은 다양한 박테리아 균주에 대한 본 발명의 MRSA 프로브의 응집을 육안으로 확인하기 위해, MRSA 프로브를 하기와 같이 다양한 박테리아 콜로니와 함께 인큐베이션한 후 결합 효율성을 측정하였다:

(A) E. coli, (B) E. coli O157:H7,(C) P. aeruginosa, (D) K. pneumonia, (E) S. flexneri, (F) S. enterica, (G) E. faecium, (H) S. epidermidis, (I) S. aureus (ATCC 29213, MSSA), (J) S. aureus (ATCC 6538P, MSSA), (K) S. aureus (ATCC 43300, MRSA) 및 (L) 음성 대조군(박테리아 부재).

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, MRSA 프로브를 첨가했을 때 MRSA를 포함하는 샘플인 (K)에서만 빨간색 침전물(응집)이 형성되었다.

반면, MSSA 뿐만 아니라, 음성 대조군 및 다른 박테리아 처리군에서는 이러한 응집이 관찰되지 않았다.

즉, 상기 결과는 본 발명의 MRSA 프로브가 MSSA와 MRSA를 구분하여, 선택적으로 MRSA에 결합하여 MRSA 프로브-MRSA 복합체를 형성(응집)함으로써 시료 내 MRSA의 존재를 육안으로 명백하게 확인할 수 있으므로, 본 발명의 MRSA 프로브에 의해 용이하고 신속하게 MRSA 검출할 수 있음을 나타낸다.

실시예 3. FE-SEM을 사용한 MRSA 표면에서의 MRSA 프로브 선택적 결합의 특성화

본 발명자들은 MRSA 표면에서 MRSA 프로브의 선택적 결합 능력을 시각화하기 위해 FE-SEM을 적용하였다. MRSA 또는 MSSA를 RT에서 5 분 동안 MRSA 프로브와 간단히 혼합하였다. 세척 후, SEM 이미지를 획득하여 MRSA 프로브의 결합 능력을 시각화하고 확인하였다.

그 결과, 도 4에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 MRSA 프로브의 응집체는 MRSA 표면에서 명확하게 관찰되었다. 응집된 MRSA 프로브와 MRSA를 비교해 보면 박테리아 주변에 BSA-AuNP가 없고 MRSA 프로브 자체는 박테리아 없이 응집되지 않았다.

반면, 본 발명의 MRSA 프로브는 MSSA와 응집체를 형성하지 않았다.

이러한 결과는 MRSA의 존재 하에서 MRSA 프로브의 응집이 박테리아 세포와 MRSA 프로브 사이의 특정 상호 작용에 의해 발생함을 입증한다.

실시예 4. 임상 샘플을 사용한 MRSA 스크린 테스트 검증

본 발명자들은 MRSA 선별 검사를 검증하기 위해 20 개의 MRSA를 포함하여 40 개의 임상 S. aureus 분리체 샘플을 사용하여, MRSA 프로브와 혼합한 후 5 분 이내에 육안으로 응집 여부를 관찰하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 임상 MRSA의 20 개는 MRSA 특이적-응집이 검출되었으나, MSSA의 18 개는 응집을 포함한 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.

이러한 MRSA 스크린 테스트의 민감도와 특이도는 각각 100%와 95%로 나타났다(표 1).

상기 결과는 본 발명의 MRSA 프로브-기반 MRSA 스크리닝 테스트가 고가의 장비나 숙련된 기술없이 육안으로 검출할 수 있는 빠르고 간단한 방법임을 시사한다.

MRSA (n=20)		MSSA (n=20)		민감도 (%)	특이도 (%)
TP	FN	TP	FP	민감도 (%)	특이도 (%)
20	0	18	2	100%	95%

TP, true positive; FN, false negative; FP, false positive

종합적으로, 본 발명에서는, 시료에 MRSA 프로브 첨가 후 MRSA 스크린 테스트를 통해 육안으로 신속하게 MRSA인지 MSSA인지 여부를 확인할 수 있다. 또한, MRSA 스크리닝 테스트를 검증하기 위해 MRSA 20 개를 포함하여 임상적으로 분리된 S. aureus 40 개를 사용했으며 결과는 100%의 민감도를 나타냈다. 이는 본 발명의 MSSA와 MRSA의 구별 검출을 위한 MRSA 프로브, 즉, MBL-AuNPs 접합체를 사용하는 MRSA 스크리닝 테스트가 육안에 의해 MRSA 검출이 가능함을 입증하였다.

따라서, 이러한 본 발명의 간단하고 정확한 MRSA 선별 검사를 통해 육안으로 신속하게 MRSA를 검출할 수 있고 단시간에 임상 치료의 기초를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

다음 단계를 포함하는 메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)의 검출 방법:
(a) 대상으로부터 분리된 시료에 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)를 처리하는 단계; 및
(b) 상기 시료에서 상기 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)가 메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 특이적으로 결합하여 응집이 발생하면 상기 시료 내 MRSA가 존재하는 것으로 판단하는 단계.
삭제
제1항에 있어서,
상기 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)는, 메티실린-민감성 황색포도상구균(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus, MSSA)에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 시료는 생체 시료, 환경 시료 및 식품 시료로부터 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
다음 단계를 포함하는 메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 감염의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법:
(a) 대상으로부터 분리된 시료에 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)를 처리하는 단계; 및
(b) 상기 시료에서 상기 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)가 메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 특이적으로 결합하여 응집이 발생하면 상기 대상은 MRSA에 감염된 것으로 판정하는 단계.
메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 특이적으로 결합하는 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)를 포함하는, 메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 검출 또는 감염 진단용 키트로서,
상기 메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)과 MBL(Mannose-Binding Lectin)-결합(conjugated) 금나노입자(AuNP)의 특이적 결합에 따른 응집 여부를 통해 메티실린-내성 황색포도상구균 검출 또는 감염을 진단할 수 있는 것을 특징으로 하는,
메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 검출 또는 감염 진단용 키트.