JP6370807B2 - 乳汁中のストレプトコッカス属の菌を検出する方法 - Google Patents
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Description
[1] ストレプトコッカス(Streptococcus)属の菌の溶菌方法であって、
家畜から得た乳汁に、リゾチーム、ラビアーゼおよびβ-N-アセチルグルコサミニダーゼからなる群より選択される少なくとも一つを含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程を含むが、
ストレプトコッカス属の菌が、ストレプトコッカス ウベリス(Streptococcus uberis)であり、溶菌剤が、リゾチームおよびラビアーゼの少なくとも一つを含有するか、または
ストレプトコッカス属の菌が、ストレプトコッカス アガラクチア(Streptococcus agalactiae)であり、溶菌剤が、リゾチーム、ラビアーゼおよびβ-N-アセチルグルコサミニダーゼからなる群より選択される少なくとも一つを含有する、方法。
[2] ストレプトコッカス属の菌の溶菌方法であって、家畜から得た乳汁に、少なくともリゾチームおよびラビアーゼを含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程を含む、方法。
[3] 乳汁中のストレプトコッカス属の菌を溶菌するための、リゾチーム、ラビアーゼおよびβ-N-アセチルグルコサミニダーゼからなる群より選択される少なくとも一つを含有するか、または少なくともリゾチームおよびラビアーゼを含有する、溶菌剤。
[4] 家畜の乳房炎を診断する方法において用いるための、[3]に記載の溶菌剤。
[5] [1]または[2]の方法を含み、溶菌により放出された菌体内由来の特定物質を検出する工程をさらに含む、家畜乳汁中のストレプトコッカス属の菌の検出方法。
[6] 特定物質の検出工程が、イムノクロマトグラフ方法により実施される、[5]に記載の方法。
[1] 乳汁中のストレプトコッカス属の菌の溶菌方法であって、
乳汁に、リゾチーム、ラビアーゼおよび非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程または、
乳汁に、リゾチーム、ラビアーゼおよびβ-N-アセチルグルコサミニダーゼからなる群より選択される少なくとも一つを含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程であって、このときストレプトコッカス属の菌が、ストレプトコッカス アガラクチアである、工程
を含む、溶菌方法。
[2] 該菌が、ストレプトコッカス ウベリスまたはストレプトコッカス アガラクチアである、[1]に記載の溶菌方法。
[3] 該非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよび/またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する、[1]または[2]に記載の溶菌方法。
[4] 乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、該非イオン界面活性剤の終濃度が、0.03%以上3%以下である、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の溶菌方法。
[5] 乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、該リゾチームの終濃度が、0.5mg/ml以上200mg/ml以下であり;および/または
乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、該ラビアーゼの終濃度が、0.05mg/ml以上20mg/ml以下である、[4]に記載の溶菌方法。
[6] [1]〜[5]のいずれか1項に定義した、乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程
を含み、
溶菌により放出された菌体内由来の特定物質を検出する工程
をさらに含む、乳汁中のストレプトコッカス属の菌の検出方法。
[7] 検出方法が、イムノクロマトグラフ方法により実施される[6]に記載の方法。
[8] 該イムノクロマトグラフ方法が、(1)特定物質を含む乳汁を、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第3部分またはそれより上流部に接触させる工程;および(2)該乳汁を該第2部分またはそれより下流部まで流し、該第2部分またはそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程:を含む、[7]に記載の検出方法。
[9] 該第1部分に、該特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている、[8]に記載の検出方法。
[10] 第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材より構成されている、 [8]または[9]に記載の検出方法。
[11] 第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい、[10]に記載の検出方法。
[12] [1]〜[5]のいずれか1項に定義された、溶菌剤。
[13] 家畜の乳房炎を診断する方法において用いるための、[12]に記載の溶菌剤。
[14] [12]または[13]に記載の溶菌剤と、
該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ装置と
を含む、乳汁中のストレプトコッカス属の菌の検出用キット。
[溶菌酵素]
本発明における溶菌酵素の種類は特に限定されず、任意の2種以上の溶菌酵素を適宜組み合わせて用いてもよい。本発明においては、リゾチーム、ラビアーゼおよびβ-N-アセチルグルコサミニダーゼからなる群より選択される少なくとも一つを用いることが好ましく、Streptococcus属の菌が、Streptococcus uberisである場合は、溶菌剤が、リゾチームおよびラビアーゼの少なくとも一つを含有することが好ましく;Streptococcus属の菌が、Streptococcus agalactiaeである場合は、溶菌剤が、リゾチーム、ラビアーゼおよびβ-N-アセチルグルコサミニダーゼからなる群より選択される少なくとも一つを含有することが好ましい。
水に溶かしたときに、電離してイオンとなる界面活性剤をイオン界面活性剤またはイオン性界面活性剤といい、イオンにならない界面活性剤を非イオン(ノニオン)界面活性剤という。イオン界面活性剤はさらに、陰イオン(アニオン)界面活性剤、陽イオン(カチオン)界面活性剤および両性界面活性剤に分類される。
特に好ましい態様においては、溶菌剤は、リゾチーム、ラビアーゼおよび非イオン界面活性剤を含有する。このような溶菌剤は種々のストレプトコッカス属の菌に有効であるが、特にストレプトコッカス ウベリスまたはストレプトコッカス アガラクチアに対して有効である。リゾチーム、ラビアーゼおよび非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤において、非イオン界面活性剤の特に好ましい例は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよび/またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、より好ましい例は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含む。このような溶菌剤における各成分の濃度は、乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、リゾチームの終濃度が、0.6mg/ml以上50mg/ml以下であり、ラビアーゼの終濃度が、0.05mg/ml以上20mg/ml以下であり、かつ非イオン界面活性剤の終濃度が、0.03%以上3%以下であるようにするとよい。リゾチーム、ラビアーゼおよび非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤のより好ましい態様は、乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、リゾチームの終濃度が、0.5mg/ml以上50mg/ml以下であり、ラビアーゼの終濃度が0.1mg/ml以上10mg/ml以下であり、かつ非イオン界面活性剤の終濃度が、0.10%以上2.6%以下である、
本発明の溶菌剤は、溶菌酵素および界面活性剤以外に、意図した効果を著しく損なわない限り、一種またはそれ以上の他の成分を含むことができる。溶菌酵素および界面活性剤以外の成分の好ましい例は、溶菌を促進する効果を有する物質である。具体的には、グルタルアルデヒド、ハロゲン化合物、クロルヘキシジン、アルコール類(例えば、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、2−ブタノール、2−メチル−1−プロパノール、2−メチル−2−プロパノール)、フェノール、過酸化水素、アクリノール、グアニジンおよびその塩、キレート剤、有機酸(例えば、デカン酸)およびその塩、多価アルコール類(例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、グリセリン、モノカプリリン)、ならびに2−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンおよびチオフェノールなどの還元剤をあげることができるが、これらに限定されない。
本発明においては、溶菌剤は、乳汁に混合して用いることができる。乳汁と溶菌剤との混合比は、溶菌酵素等の終濃度が適切に維持され、十分な溶菌率が確保できる限り、特に限定されない。乳汁に対して比較的少量の溶菌剤を用いる場合は、乳汁が希釈されない。したがって、より高い感度で菌体を検出できると期待できる。また乳汁に対して比較的大量の溶菌剤を用いる場合は、乳汁中の脂肪滴やタンパク質による影響が減じられ、より短時間で菌体を検出できると期待できる。乳汁と溶菌剤との混合物における乳汁の割合比(乳汁/(乳汁+溶菌剤)×100)は、高いほど検出感度を上げることができるとの観点からは、他の条件がいずれの場合であっても、例えば、5%以上とすることができ、10%以上とすることが好ましく、20%以上とすることがより好ましく、30%以上とすることがさらに好ましい。上限値は、他の条件がいずれの場合であっても、乾燥等の手段によって固形化した溶菌剤を用いることにより、乳汁の割合を100%とすることができる。また、他の条件がいずれの場合であっても、乳汁の割合は90%以下とすることができ、80%以下、70%以下、60%以下、または50%以下とすることができる。上限値は、混合の容易さ、溶菌剤の溶液としての安定性等を考慮して決定してもよい。
本発明により溶菌されたStreptococcus属の菌は、菌体由来の成分を抗原として、各種の免疫学的方法によりを検出することができる。ためには、例えばStreptococcus属の菌のリボソームL7/L12蛋白質からなる抗原をイムノクロマトグラフ法またはイムノクロマトグラフ法に代えて他の免疫学的測定方法により上記抗原を検出することもできる。イムノクロマトグラフ以外の免疫学的測定方法としては、例えば、イムノクロマトグラフ法、凝集反応法、酵素免疫測定法(ELISA法)、放射能免疫測定法(RIA法)、または蛍光免疫測定法(FIA法)などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
抗原抗体反応は、第1部分に保持されている「特定物質に対する標識された第一の抗体」と、第2部分に固定化された「特定物質に対する第二の抗体」を用いて、サンドイッチアッセイ法により検出することができる。あるいは抗原抗体反応は、第1部分に保持されている標識された特定物質と、第2部分に固定化された特定物質に対する抗体を用いて競合法にて検出してもよい。但し、本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法が好ましい。
本発明により、乳汁中のStreptococcus菌を検出できる。本発明でStreptococcus属の菌というときは、特に記載した場合を除き、Streptococcus uberis、Streptococcus agalactiae、Streptococcus dysgalactiae、Streptococcus equinus、Streptococcus canis、Streptococcus bovis、Streptococcus pluranimalium、Streptococccus parauberis、Streptococcus mutans、Streptococcus acidominimusが含まれる。本発明においては、溶菌酵素と界面活性剤が適切に配合された溶菌剤を用いることにより、牛等の家畜から得られた、脂肪球と高濃度のタンパク質を含有する乳汁そのものに含まれるStreptococcus 属の菌を検出することができる。
本発明に用いる抗体は、国際公開第00/06603号パンフレットに記載の方法で作製することができる。細菌リボゾームタンパク質L7/L12を抗原とする場合は、細菌リボゾームタンパク質L7/L12の全長タンパク質あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作製することができるが、全長タンパク質を抗原として作製することが好ましい。この部分ペプチドあるいは全長タンパク質をそのまま、またはキャリアタンパク質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでL7/L12リボソームタンパク質を認識する抗体(ポリクローナル抗体)を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、抗体としてはハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法により取得したモノクローナル抗体を適用することがより好ましいが、この場合はマウスが好ましい。当該モノクローナル抗体として、乳房炎の原因となる特定の細菌のリボゾームタンパク質L7/L12と反応し、前記特定の細菌以外の乳房炎の原因となる細菌のリボゾームタンパク質L7/L12とは反応しないモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、当該細菌による感染症にかかっているかどうかの診断に役立てることが可能となる。
(1)リボゾームタンパク質L7/L12抗体の作製 国際公開WO00/06603号パンフレットの実施例に記載の方法に準じて、L7/L12リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。当該モノクローナル抗体は、上記L7/L12リボゾームタンパク質の別のサイトに同時に結合しうる2種の組合せを選択した。
*2: 力価0.8mgリゾチーム/mg以上(和光純薬製品規格)
*3: > 80units/mg protein
終濃度がラビアーゼ0.5mg/ml、リゾチーム4.5mg/mlとなるように、クエン酸-リン酸Naバッファー/牛乳(混合体積比1:1)を用いて調整し、上記方法と同様に菌を処理した。ELISAにより溶菌率を算出した結果を図1に示す。すると、リゾチームやラビアーゼ単体の使用ではS. uberisまたはS. agalactiaeのどちらかの菌には不十分な溶菌活性であったものが、ある濃度範囲で混合して併用することにより、いずれの菌も高効率で溶菌できることが明らかとなった。
イムノクロマトグラフ装置は以下のように作製できる。(a)金コロイド標識含浸部材 BBInternational社製金コロイド溶液(粒径60nm)0.9mlに0.1M リン酸カリウム pH7.0を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体-1を100μg/ml加え室温で10分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%となるようにウシ血清アルブミン(BSA)10%水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をBSAでブロッキングして、金コロイド標識したモノクローナル抗体-1(以下、「金コロイド標識抗体」と記す)溶液を調製する。この溶液を遠心分離(15000×rpm、5分間)して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得る。この金コロイド標識抗体を0.25%BSA、2.5%スクロース、35mM NaClを含有する20mMトリス塩酸緩衝液(pH7)に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得る。10mm×300mmの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液2mlを含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材1(第1部分)とする。
イムノクロマト装置による牛乳汁の測定は以下の様に行った。マイクロチューブに終濃度1×105(CFU/ml)のストレプトコッカス ウベリスを添加した乳汁を300μl分取し、溶菌処理液を500μl添加し、室温で30分間処理した。牛乳汁は市販の飲用品を用いた。同混合溶液に上記イムノクロマトグラフ装置を試料添加用部材4から浸漬して、室温で30分静置して展開後、上記補足部位3で補足されたリボソームタンパク質L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉の有無を捕捉量に比例して増減する赤紫色のライン強度を測定した。各条件における溶菌効率を表3に示す。
ラビアーゼに併用するリゾチームの添加量について、実施例4と同様の手順で評価した。結果を表4に示す。リゾチームを適量添加すると、溶菌効率が向上する事が確かめられた。
界面活性剤の濃度について、実施例4と同様に評価した結果を表5に示す。TritonX100とTween20の添加量を適切化することにより、溶菌効率がさらに向上することが明らかとなった。
牛乳に各濃度のストレプトコッカスウベリスを添加した検体を、条件1および条件10の溶菌剤により処理し、イムノクロマトによる測定を実施した。出現した赤紫色のラインを目視により判定した(強陽性++、陽性+、陰性−)。
実施例6に記載の条件9に記載の溶菌剤に、さらに種々の添加剤を加え溶菌効率を評価した結果を表7に示す。
Claims (13)
- 乳汁中のストレプトコッカス ウベリスの菌の溶菌方法であって、
乳汁に、リゾチーム、ラビアーゼおよび非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程であって、
非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよび/またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、
該リゾチームの終濃度が、0.5mg/ml以上200mg/ml以下であり、
該ラビアーゼの終濃度が、0.05mg/ml以上20mg/ml以下であり、
該非イオン界面活性剤の終濃度が、0.03%以上3%以下である工程を含む、溶菌方法。 - 該溶菌剤が、さらにグアニジンおよびその塩、キレート剤、有機酸、ならびに多価アルコールからなる群より選択される一種またはそれ以上を含有する請求項1に記載の溶菌方法。
- 乳汁中のストレプトコッカス ウベリスの菌の検出方法であって、
1.乳汁に、リゾチーム、ラビアーゼおよび非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程であって、
非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよび/またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル であり、
該リゾチームの終濃度が、0.5mg/ml以上200mg/ml以下であり、
該ラビアーゼの終濃度が、0.05mg/ml以上20mg/ml以下であり、
該非イオン界面活性剤の終濃度が、0.03%以上3%以下である工程、
2.該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する材料を用いて該乳汁中の乳脂肪球を分離する工程、
3.溶菌により放出されたストレプトコッカス属の菌体内由来の特定物質を検出する工程
を1,2,3の順に実施する乳汁中の該菌の検出方法。 - 該溶菌剤が、さらにグアニジンおよびその塩、キレート剤、有機酸、ならびに多価アルコールからなる群より選択される一種またはそれ以上を含有する請求項3に記載の検出方法。
- 第2、第3の工程が、イムノクロマトグラフ方法により実施される請求項3または4に記載の検出方法。
- 該イムノクロマトグラフ方法が、(1)特定物質を含む乳汁を、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第3部分またはそれより上流部に接触させる工程;および(2)該乳汁を該第2部分またはそれより下流部まで流し、該第2部分またはそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程:を含む、請求項5に記載の検出方法。
- 該第1部分に、該特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている、請求項6に記載の検出方法。
- 第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材より構成されている、請求項6または7に記載の検出方法。
- 第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい、請求項8に記載の検出方法。
- 請求項1または2に定義された、リゾチーム、ラビアーゼおよび非イオン界面活性剤を含有する、乳汁中でストレプトコッカス ウベリスの菌を溶菌するための、溶菌剤。
- さらにグアニジンおよびその塩、キレート剤、有機酸、ならびに多価アルコールからなる群より選択される一種またはそれ以上を含有する請求項10に記載の溶菌剤。
- 家畜の乳房炎を診断する方法において用いるための、請求項10または11に記載の溶菌剤。
- 請求項10〜12のいずれか1項に記載の溶菌剤と、
該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ装置と
を含む、乳汁中のストレプトコッカス ウベリスの菌の検出用キット。
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