WO2015093546A1 - 乳汁中のストレプトコッカス属の菌を検出する方法 - Google Patents

乳汁中のストレプトコッカス属の菌を検出する方法 Download PDF

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bacteria
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貴光 内海
浩志 前花
松山　健二
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01096—Mannosyl-glycoprotein endo-beta-N-acetylglucosaminidase (3.2.1.96)
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/315—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci

Definitions

  • the present invention relates to a lysis method and a detection method for detecting bacteria of the genus Streptococcus that is a mastitis-causing bacterium from the milk of livestock.
  • Livestock milk represented by cows, sheep and goats is not aseptic and may contain some microorganisms due to disease or the environment. In particular, it is known that many microorganisms are eradicated in milk in diseases caused by infection of microorganisms in the breast. Mastitis is a typical livestock disease caused by microbial infection.
  • Mastitis is inflammation of the ductal system and mammary gland tissue, and is mainly caused by microorganisms invading, colonizing and proliferating in the breast. Mastitis affects many animals, but bovine mastitis, particularly in dairy cows, is said to affect 15-40% of all dairy cows and is one of the most important diseases for dairymen.
  • milk synthesis functions are hindered, resulting in not only a decrease in milk yield and, in some cases, halting lactation, but also significant economic losses such as treatment costs and milk price penalties due to deterioration in milk quality. Is given to dairymen.
  • labor burdens on dairy farmers will increase, such as individually milking mastitis-affected quarters to prevent infection.
  • Mastitis is caused by infection with various microorganisms.
  • bacteria belonging to the genus Streptococcus (sometimes called streptococci) are known as causative bacteria having a high occurrence frequency.
  • Culture methods are widely used as methods for detecting Streptococcus bacteria from milk.
  • the culture method takes several days to obtain results, and is not suitable for rapid identification of causative bacteria.
  • identification by antigen-antibody reaction using an antibody against a component specific to the causative bacterium, particularly immunochromatography is widely used as a rapid and simple test method because the result can be determined in several tens of minutes (for example, Patent Document 1).
  • the present inventors have also examined the immunochromatographic method as a method for detecting substances in the milk of livestock (Patent Document 2).
  • Non-patent Document 1 does not describe the lysis effect in a high protein, high fat solution such as milk.
  • Mastitis is caused by infection with various microorganisms such as bacteria, but the antibiotics that are effective for treatment differ depending on the causative bacteria. Therefore, early diagnosis and treatment of mastitis is very important. In addition, when a specific bacterium causes mastitis, it may be transmitted between other quarters of an individual or between individuals, and it is extremely important to identify causative bacteria present in milk quickly and easily.
  • the culture method widely used as a method for detecting bacteria has a problem that it takes several days to obtain a result.
  • an immunoassay method based on an antigen-antibody reaction such as an immunochromatography method has an advantage that a causative bacterium can be detected quickly and easily, and early antimicrobial treatment is possible.
  • the antigen is a microbial component
  • the microbial cell is lysed with high efficiency and the antigen in the microbial cell is released outside the microbial cell. There is a need.
  • the present invention uses livestock milk to detect whether or not the causative bacterium of mastitis is a genus of Streptococcus. Therefore, various Streptococcus genus bacteria are efficiently lysed in milk, and a specific antigen in the microbial cell is obtained.
  • An object to be solved is to provide a lysis method for releasing a substance, a lysis treatment solution and a detection method comprising an immunochromatography apparatus.
  • the present inventor contains at least lysozyme or labiase.
  • lyse Streptococcus agalactiae a lysate selected from lysozyme, labiase, and ⁇ -N-acetylglucosaminidase
  • lysis can be efficiently performed by using a lysis agent containing an enzyme.
  • lysis can be performed more efficiently by adding a specific amount of lysozyme to the rabiase enzyme, which is known to have a lytic effect.
  • the present inventors have found that it is possible to release L7 / L12 proteins in bacterial cells and that they can be used for highly sensitive detection of Streptococcus spp., And have completed the present invention.
  • the present invention provides the following.
  • [1] A method for lysis of bacteria belonging to the genus Streptococcus, A step of lysing the bacteria present in milk by mixing milk obtained from livestock with a lysing agent containing at least one selected from the group consisting of lysozyme, labiase and ⁇ -N-acetylglucosaminidase.
  • Bacteria Streptococcus is a Streptococcus uberis (Streptococcus uberis), lysing agent, or contains at least one lysozyme and Rabiaze, or bacteria genus Streptococcus is a Streptococcus agalactiae (Streptococcus agalactiae), lysing agent , Containing at least one selected from the group consisting of lysozyme, rabiase and ⁇ -N-acetylglucosaminidase.
  • [2] A method for lysis of bacteria belonging to the genus Streptococcus, comprising the step of lysing the bacteria present in milk by mixing milk obtained from livestock with a lysing agent containing at least lysozyme and labiase.
  • [3] contains at least one selected from the group consisting of lysozyme, labiase and ⁇ -N-acetylglucosaminidase, or at least contains lysozyme and labiase, for lysing Streptococcus bacteria in milk Lytic agent.
  • the lysing agent according to [3] for use in a method for diagnosing mastitis in livestock.
  • [5] A method for detecting Streptococcus spp.
  • the present invention also provides the following.
  • [1] A method for lysis of bacteria of the genus Streptococcus in milk, Mixing the lysozyme, labiase and a lysis agent containing a nonionic surfactant with milk to lyse the bacteria present in the milk, or Mixing a lysing agent containing at least one selected from the group consisting of lysozyme, rabiase and ⁇ -N-acetylglucosaminidase with milk to lyse the bacteria present in the milk, wherein streptococcus A lysis method comprising a step, wherein the bacterium of the genus is Streptococcus agalactia.
  • the final concentration of the lysozyme is 0.5 mg / ml or more and 200 mg / ml or less; and / or the lysis agent in the milk
  • the final concentration of the rabiase is 0.05 mg / ml or more and 20 mg / ml or less.
  • the immunochromatographic method includes: (1) a milk containing a specific substance, a first antibody labeled with the specific substance or a first part in which the labeled specific substance is retained, and the first part And a second part to which a second antibody against the specific substance is immobilized, and a part connected to the first part or the upstream of the second part, and removing milk fat globules in the milk Contacting the milk with the third portion or upstream thereof to a test piece having a third portion having a void that can be formed; and (2) the milk to the second portion or downstream thereof
  • the detection method according to [7] comprising: flowing and obtaining a signal detectable by the label in the second portion or a portion downstream thereof.
  • the lysis agent according to [12] or [13], The first antibody labeled with the specific substance or the first part holding the labeled specific substance and the second antibody linked to the downstream of the first part and the second antibody against the specific substance are immobilized.
  • a test piece having a second part and a third part connected upstream of the first part or the second part and having a cavity capable of removing milk fat globules in the milk.
  • a specific lytic enzyme In order to lyse Streptococcus uberis or Streptococcus agalactiae , a specific lytic enzyme must be used for each species, and in order to lyse bacteria as Streptococcus genus, rabiase and a specific amount of lysozyme should be used in combination. It was discovered that lysis can be performed with high efficiency.
  • FIG. 3 shows a schematic cross-sectional view of a test piece of an immunochromatography apparatus produced in Example 3.
  • 1 labeled antibody impregnated member (first part)
  • 2 membrane support for chromatographic development (second part)
  • 3 capture site
  • 4 sample addition member and fat globule removing member (third part)
  • 5 Absorbing member
  • 6 base material
  • 7 fat globule removing member (third part)
  • the present invention provides a lysing agent for lysing Streptococcus spp. In milk.
  • the lysis agent of the present invention contains a lytic enzyme.
  • the kind of lytic enzyme in the present invention is not particularly limited, and any two or more lytic enzymes may be used in appropriate combination. In the present invention, it is preferable to use at least one selected from the group consisting of lysozyme, rabiase and ⁇ -N-acetylglucosaminidase.
  • the lysing agent is lysozyme and Preferably, it contains at least one of labiase; when the bacterium of the genus Streptococcus is Streptococcus agalactiae , the lysing agent is at least one selected from the group consisting of lysozyme, labiase and ⁇ -N-acetylglucosaminidase It is preferable to contain.
  • Rabiaze (Labiase) is prepared from the culture supernatant of Streptomyces fulvissimus TU-6 strain is a complex enzyme that beta-N-acetyl -D- glucosaminidase, a muramidase mainly.
  • Rabiase can also be prepared from the culture supernatant of the above strain or can be obtained by purchasing a commercial product.
  • the final concentration is preferably 0.05 mg / ml or more, preferably 0.1 mg / ml or more, more preferably 0.5 mg / ml or more, and in any case, 20 mg / ml or less, preferably 10 mg / ml or less, more preferably 5 mg / ml or less.
  • the final concentration is preferably 0.05 mg / ml or more, preferably 0.1 mg / ml or more, more preferably 0.5 mg / ml or more, and in any case, 20 mg / ml or less, preferably 10 mg / ml or less, more preferably 5 mg / ml or less.
  • the final concentration is preferably 0.0005 units / ml or more, preferably 0.001 units / ml or more, more preferably 0.005 units / ml or more, and in any case, 0.2 units / ml or less, preferably It can be 0.1 units / ml or less, more preferably 0.05 units / ml or less.
  • the enzyme unit refers to the value as ⁇ -N-acetyl-D-glucosaminidase activity, unless otherwise specified, and p-nitrophenyl- ⁇
  • the enzyme activity that liberates 1 ⁇ mol of p-nitrophenol per minute is defined as 1 unit.
  • Lysozyme is a 14.6 kDa single peptide protein that lyses bacterial cells by cleaving the ⁇ (1-4) glycosidic bond between N-acetylmuramic acid and N-acetylglucosamine in the peptidoglycan layer. can do. Lysozyme can be obtained by purchasing a commercial product.
  • the final concentration is preferably 0.5 mg / ml or more, preferably 1 mg / ml or more, more preferably 5 mg / ml or more, and in any case, 200 mg / ml or less, preferably 100 mg / ml or less, more preferably 50 mg / ml or less.
  • the final concentration is preferably 0.5 mg / ml or more, preferably 1 mg / ml or more, more preferably 5 mg / ml or more, and in any case, 200 mg / ml or less, preferably 100 mg / ml or less, more preferably 50 mg / ml or less.
  • the final concentration of lysozyme is preferably 0.4 mg / ml or more, preferably 0.8 mg / ml or more, more preferably 4 mg / ml or more, and in each case, 160 mg / ml or less, Preferably it can be 80 mg / ml or less, more preferably 40 mg / ml or less.
  • the absorbance (640 nm) when a phosphate buffer suspension of a dried micrococcus lysodeikticus cell is used as a substrate It is a value based on the decrease in.
  • ⁇ -N-acetylglucosaminidase also called ⁇ -N-acetylhexosaminidase, is an enzyme that releases terminal ⁇ -linked N-acetylglucosamine and N-acetylgalactosamine from various substrates.
  • ⁇ -N-acetylglucosaminidase can be obtained by purchasing a commercial product.
  • the final concentration is preferably 0.5 mg / ml. Or more, preferably 1 mg / ml or more, more preferably 5 mg / ml or more, and in each case, 200 mg / ml or less, preferably 100 mg / ml or less, more preferably 50 mg / ml. ml or less.
  • the final concentration is preferably 0.05 units / ml or more, preferably 0.1 units / ml or more, more preferably 0.5 units / ml or more, and in any case, 200 ⁇ units / ml or less, preferably It can be 100 units / ml or less, more preferably 50 units / ml or less.
  • ⁇ -N-acetylglucosaminidase when referring to an enzyme unit, unless otherwise specified, an enzyme is used with p-nitrophenyl- ⁇ -N-acetyl-D-glucosamine as a substrate. Enzyme activity that releases 1 ⁇ mol of p-nitrophenol per minute when allowed to act is defined as 1 unit.
  • a high-efficiency lysis effect applicable to a wide range of Streptococcus spp. Can be achieved by additionally adding a lysozyme enzyme to the milk containing Streptococcus spp.
  • the rabiase is 1 mg / ml.
  • the addition amount of lysozyme to be added preferably is 3 mg / ml or more, more preferably 5 mg / ml or more, more preferably 7 mg / ml or more, more preferably 9 mg / ml or more, Preferably it is not more than 100 mg / ml, more preferably not more than 50 mg / ml, still more preferably not more than 20 mg / ml.
  • the addition amount as lysozyme to be further added to labiase 0.1 unit / ml is preferably 2.4 mg / ml or more, more preferably 4 mg / ml or more, more preferably 5.6 mg / ml or more, further preferably Contains 7.2 mg / ml or more, and in any case, it is preferably 80 mg / ml or less, more preferably 40 mg / ml or less, and still more preferably 16 mg / ml or less.
  • ionic surfactants Surfactants that ionize when dissolved in water are called ionic surfactants or ionic surfactants, and surfactants that do not become ions are called nonionic surfactants. Ionic surfactants are further classified into anionic (anionic) surfactants, cationic (cationic) surfactants and amphoteric surfactants.
  • a surfactant to the lysis agent in addition to the lysis enzyme.
  • the surfactant nonionic surfactants, cationic surfactants, anionic surfactants and amphoteric surfactants may be used alone or in combination.
  • the lysis agent of the present invention can contain a nonionic surfactant.
  • a nonionic surfactant any of the ester ether type, the ester type, and the ether type can be suitably used. More specifically, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, fatty acid Examples include sorbitan esters, alkyl polyglucosides, fatty acid diethanolamides, alkyl monoglyceryl ethers, and polysorbates (thick fatty acid sorbitan esters obtained by condensation of several tens of ethylene oxides), but are not particularly limited.
  • polysorbates more specifically polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate, polyoxyethylene (60) sorbitan monostearate, polyoxyethylene (65) sorbitan tristearate, and polyoxyethylene (20)
  • examples thereof include oxyethylene (80) sorbitan monooleate and the like, and polyoxyethylene alkylphenyl ether, more specifically polyoxyethylene (10) octylphenyl ether.
  • the content of the nonionic surfactant in the lysis agent (when a plurality of nonionic surfactants are used, the content as the total amount of nonionic surfactants) is, for example, a developing solution when using an immunochromatographic method.
  • the lower limit can be such that the final concentration when mixed with milk is 0.03% or more, preferably 0.05% or more. More preferably, it is 0.075% or more, more preferably 0.1% or more, and particularly preferably 0.3% or more.
  • the upper limit of the content of the nonionic surfactant only needs to be a level that does not significantly inhibit the reaction by the lytic enzyme or the antigen-antibody reaction, and in any case, it can be 10% or less, preferably It is 7.5% or less, more preferably 5% or less, further preferably 3% or less, and particularly preferably 2% or less.
  • any of carboxylate, sulfonate, sulfate ester, and the like can be suitably used. More specific examples include alkyl ether carboxylates, linear alkylbenzene sulfonates (LAS), ⁇ -olefin sulfonates (AOS), dialkyl sulfosuccinates, formaldehyde condensates of naphthalene sulfonates, alkyl sulfates Examples thereof include salts (AS), polyoxyethylene alkyl sulfates (AES) sulfated by adding ethylene oxide to higher alcohols, and phosphate esters such as higher alcohols and ethylene oxide adducts thereof.
  • AS salts
  • AES polyoxyethylene alkyl sulfates
  • phosphate esters such as higher alcohols and ethylene oxide adducts thereof.
  • sodium alkyl sulfates such as sodium dodecyl sulfate and sodium myristyl sulfate
  • sodium N-acyl sarcosine such as sodium N-lauroyl sarcosinate, sodium N-myristoyl sarcosinate, sodium dodecylbenzene sulfonate
  • hydrogen Examples thereof include sodium coconut fatty acid monoglyceride monosulfate, sodium lauryl sulfoacetate, N-acyl glutamate such as sodium N-palmitoyl glutamate, sodium N-methyl-N-acylalanine, and sodium ⁇ -olefin sulfonate.
  • an amine salt type or a quaternary ammonium salt type can be suitably used as the cationic surfactant. More specific examples include distearyldimethylammonium chloride, benzalkonium chloride, hexadecyltrimethylammonium chloride. Examples thereof include bromide, hexadecyltrimethylammonium bromide, and myristyltrimethylammonium bromide.
  • amphoteric surfactants include amino acids (alkylamino fatty acid salts), betaines (alkylbetaines), amine oxides (alkylamine oxides), and the like, but are not particularly limited. More specific examples include dimethylammoniopropane sulfonate, dodecyldimethylammoniobutylate, betaine laurate, and amidopropyl betaine.
  • More specific examples include n-Tetradecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, n-Decyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, n-Dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, n-Tetradecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, n-Hexadecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, N- Dodecyl-N, N- (dimethylammonio) butyrate.
  • the lysing agent contains lysozyme, labiase and a nonionic surfactant.
  • a lytic agent is effective against various Streptococcus bacteria, but is particularly effective against Streptococcus uberis or Streptococcus agalactia.
  • particularly preferred examples of the nonionic surfactant are polyoxyethylene alkylphenyl ether and / or polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, more preferred examples are Polyoxyethylene alkylphenyl ether and polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester are included.
  • the concentration of each component in such a lysing agent is such that the final concentration of lysozyme is 0.6 mg / ml or more and 50 mg / ml or less in the step of mixing the lysing agent in milk and lysing the bacteria present in the milk.
  • the final concentration of rabiase may be 0.05 mg / ml or more and 20 mg / ml or less, and the final concentration of the nonionic surfactant may be 0.03% or more and 3% or less.
  • the final concentration of lysozyme is 0.5 mg / kg in the step of lysing the bacterium present in the milk by mixing the lysing agent in the milk.
  • the final concentration of rabiase is 0.1 mg / ml or more and 10 mg / ml or less, and the final concentration of the nonionic surfactant is 0.10% or more and 2.6% or less.
  • the lysis agent of the present invention can contain one or more other components in addition to the lytic enzyme and the surfactant as long as the intended effect is not significantly impaired.
  • a preferable example of components other than the lytic enzyme and the surfactant is a substance having an effect of promoting lysis.
  • glutaraldehyde, halogen compounds, chlorhexidine alcohols (eg, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-1-propanol, 2-methyl- 2-propanol), phenol, hydrogen peroxide, acrinol, guanidine and salts thereof, chelating agents, organic acids (for example, decanoic acid) and salts thereof, polyhydric alcohols (for example, ethylene glycol, propylene glycol, diethylene glycol, glycerin, Monocaprylin) and reducing agents such as 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, cystine and thiophenol, but are not limited thereto.
  • alcohols eg, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-1-propanol, 2-methyl- 2-propanol
  • phenol hydrogen peroxide
  • the lower limit value of the final concentration when mixed with milk when either guanidine or a salt thereof (for example, guanidine thiocyanate) is used, the lower limit value of the final concentration when mixed with milk (when multiple types are used, the concentration as a total amount is indicated. The same)) can be 0.1 mM or more, preferably 1 mM or more, and more preferably 1 mM or more.
  • the upper limit of the final concentration when mixed with milk can be 500 mM or less, preferably 200 mM or less, and more preferably 100 mM or less.
  • the chelating agent examples include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and its salt, glycol etherdiaminetetraacetic acid (EGTA) and its salt, polyphosphoric acid and its salt, and metaphosphoric acid and its salt.
  • the lower limit of the final concentration when mixed with milk can be 0.001 mM or more, preferably It can be 0.01 mM or more, more preferably 0.1 mM or more.
  • the upper limit of the final concentration when mixed with milk can be 100 mM or less, preferably 10 mM or less, more preferably 5 mM or less, from the viewpoint of inhibiting inhibition of the antigen-antibody reaction. It can be.
  • the lysis agent can be used by mixing with milk.
  • the mixing ratio between the milk and the lysing agent is not particularly limited as long as the final concentration of the lytic enzyme or the like is appropriately maintained and a sufficient lysis rate can be secured. If a relatively small amount of lysing agent is used for the milk, the milk is not diluted. Therefore, it can be expected that the cells can be detected with higher sensitivity. Moreover, when using a comparatively large amount of lysing agent with respect to milk, the influence by the lipid droplets and protein in milk is reduced, and it can be expected that bacterial cells can be detected in a shorter time.
  • the ratio of milk in the mixture of milk and lysing agent (milk / (milk + lysing agent) ⁇ 100) is higher from the standpoint that the detection sensitivity can be increased, and any other conditions are applicable. However, for example, it can be 5% or more, preferably 10% or more, more preferably 20% or more, and further preferably 30% or more.
  • the upper limit can be set to 100% by using a lysis agent solidified by means such as drying, whatever the other conditions.
  • the ratio of milk can be 90% or less, 80% or less, 70% or less, 60% or less, or 50% or less.
  • the upper limit value may be determined in consideration of easiness of mixing, stability as a solution of the lysis agent, and the like.
  • milk may be simply mixed with a lysing agent.
  • the temperature at the time of mixing and the treatment time for the subsequent enzyme to act are not particularly limited as long as the lytic enzyme to be used can exert its activity, and may usually be room temperature. Those skilled in the art can appropriately design the time required for the processing time after mixing in consideration of the lysis rate. In the present invention, since a lytic enzyme having an appropriate combination and concentration for Streptococcus spp. Is used, the treatment time can be made shorter than when a normal lysis method is used.
  • the treatment time in the present invention is generally within several tens of minutes to several hours, more specifically within 240 minutes, preferably within 150 minutes, More preferably within 90 minutes, more preferably within 60 minutes, further preferably within 45 minutes, further preferably within 25 minutes, more preferably within 20 minutes, More preferably, it is within 15 minutes.
  • the treatment time can also be set to substantially 0 (milk and a lysis agent are mixed and immediately subjected to measurement).
  • the temperature can be 2 ° C. to 50 ° C., for example, 35 to 40 ° C., and can be appropriately designed in consideration of the enzyme used and the treatment time. In the treatment, it may be left still or stirred.
  • a surfactant can be used in combination with a lytic enzyme.
  • the treatment time may be shorter than when only the lytic enzyme is used, or the lysis rate may be increased even with the same treatment time.
  • the treatment time is generally between several tens of minutes to several hours, more specifically within 240 minutes, preferably within 150 minutes, more preferably within 90 minutes, It is more preferably within minutes, more preferably within 45 minutes, further preferably within 25 minutes, further preferably within 20 minutes, and further preferably within 15 minutes.
  • the treatment time can also be set to substantially 0 (milk and a lysis agent are mixed and immediately subjected to measurement).
  • the temperature can be 2 ° C. to 50 ° C., for example 35 ° C. to 40 ° C. in any case, and should be designed appropriately in consideration of the enzyme used and the processing time. Can do.
  • the treatment may be allowed to stand or may be stirred.
  • the liquid containing the target strain of the genus Streptococcus is treated with a nonionic surfactant at an appropriate concentration in advance, and then further subjected to ultrasonic treatment, unless otherwise specified.
  • the lysis rate can be set to 100% after sufficient enzyme treatment if necessary.
  • the bacteria belonging to the genus Streptococcus lysed according to the present invention can be detected by various immunological methods using components derived from bacterial cells as antigens.
  • the antigen can be detected by another immunoassay method instead of the immunochromatographic method or the immunochromatographic method using an antigen composed of the ribosome L7 / L12 protein of the genus Streptococcus.
  • immunoassay methods other than immunochromatography include immunochromatography, agglutination, enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), or fluorescence immunoassay (FIA). However, it is not limited to these.
  • a blocking substance for preventing non-specific adsorption or a substance for preventing a cross reaction with bacteria other than the target bacteria may be used.
  • a globulin that does not participate in the reaction with the antigen can be added.
  • the final concentration during the reaction can be 0.01 ⁇ g / ml or more, preferably 0.1 ⁇ g / ml or more, more preferably 1 ⁇ g / ml or more, In either case, from the viewpoint of not inhibiting the target antigen-antibody reaction, it can be 10 mg / ml or less, preferably 5 mg / ml or less, more preferably 1 mg / ml or less.
  • Such final concentration conditions are particularly suitable for immunochromatographic methods.
  • Antigen-antibody reaction is performed by sandwich assay using “labeled first antibody against specific substance” retained in the first part and “second antibody against specific substance” immobilized on the second part. It can be detected by the method. Alternatively, the antigen-antibody reaction may be detected by a competition method using a labeled specific substance held in the first part and an antibody against the specific substance immobilized in the second part. However, in the present invention, a sandwich assay method in which the detection sensitivity is high and the antibody detection line appears positive is preferable.
  • the immunochromatography apparatus is an apparatus for detecting a specific substance in milk by an immunochromatography method, and includes a first antibody labeled against the specific substance or a first part in which the labeled specific substance is retained. A second part linked downstream of the first part and immobilized with a second antibody against the specific substance, and linked to the first part or upstream of the second part, and in the milk A device comprising a test piece having a third portion with a void from which milk fat globules can be removed.
  • the fat globule removing member (third portion) 7 is installed downstream of the sample addition member 4 and upstream of the labeled antibody-impregnated member (first portion) 1.
  • the immunochromatography apparatus can be manufactured using a commercially available material by a known method.
  • the material used for the first part is not particularly limited as long as it can perform immunochromatography, but is preferably a fiber matrix such as a cellulose derivative, filter paper, glass fiber, cloth, cotton, or the like.
  • the material used for the second part is not particularly limited as long as it can perform immunochromatography, but is preferably nitrocellulose, mixed nitrocellulose ester, polyvinylidene fluoride, nylon or the like.
  • the material used for the third part preferably has voids that can remove milk fat globules with a diameter of 1 to 10 ⁇ m contained in the milk.
  • the third part needs to be arranged upstream of the second part made of a porous membrane having a pore diameter of several tens to several hundreds of nanometers, and is a position where the sample solution can first contact and pass. It is preferable that the first portion is disposed on the upstream side.
  • the gap of the third part is not limited as long as milk fat globules can be separated, and the retained particle size is preferably 0.1 to 10 ⁇ m, more preferably 1 to 3.5 ⁇ m.
  • the material is not particularly limited as long as it has voids in the above range, but is preferably a fiber matrix such as a cellulose derivative, filter paper, glass fiber, cloth, cotton or the like.
  • Retained particle size is the particle size of milk fat globules that are retained in the third portion without allowing milk fat globules having a particle size larger than that size to pass through the void, and the average pore size of the void in the third portion
  • milk fat globules having a particle size equal to or larger than 50%, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more. % Or more, and most preferably 98% or more is retained in the third portion without passing through the gap.
  • the percentage of milk fat globules retained can be measured by methods well known to those skilled in the art.
  • the GF / B provided by GE Healthcare Biosciences is the retention particle size (the particle diameter with a retention efficiency of 98%.
  • the retention particle size refers to this unless otherwise specified.
  • the product catalog it is possible to confirm the above particle size by methods well known to those skilled in the art.
  • the third part may use only a material having a specific holding particle size, and may be used by stepping together ones having a larger holding particle size in order to increase the separation efficiency of milk fat globules. .
  • the third part is composed of two or more members having voids capable of removing milk fat globules having different particle sizes, it is a preferred aspect of the present invention, and the third part is a first part disposed downstream. It is a further preferred embodiment of the present invention when it is constituted by a member and a second member disposed upstream, and the retained particle size of the second member is larger than the retained particle size of the first member.
  • the retained particle size of the first member disposed downstream is 1.0 to 2.0 ⁇ m
  • the retained particle size of the second member disposed upstream is It is preferably 3.0 to 3.5 ⁇ m.
  • the third part is a member having a small retained particle size and retained particles. It is preferable to configure a combination with a member having a large size.
  • the first part holds the labeled first antibody against the specific substance or the labeled specific substance.
  • the specific substance can be detected by a sandwich assay method.
  • the specific substance labeled in the first part can be detected by the competition method.
  • the sandwich assay method in which detection sensitivity is high, positive and an antibody detection line appears is preferable, the first part should retain the first antibody labeled with a specific substance. Is preferred.
  • first antibody labeled with a specific substance When the first antibody labeled with a specific substance is held in the first part, two types of antibodies are used: a first antibody against the specific substance and a second antibody against the specific substance.
  • the first antibody and the second antibody are antibodies that can simultaneously bind to the specific substance so that the specific substance can be detected by sandwich assay, and the first antibody recognizes the first antibody.
  • the epitope of the specific substance is preferably different from the epitope of the specific substance recognized by the second antibody.
  • the first antibody or specific substance held in the first portion is labeled.
  • the label used in the present invention include colored particles, enzymes, radioisotopes, and the like, but it is preferable to use colored particles that can be detected visually without the need for special equipment.
  • the colored particles include metal fine particles such as gold and platinum, non-metal particles, and latex particles, but are not limited thereto.
  • the colored particles may be any size as long as they can be transported downstream through the voids of the test piece, but a diameter of 1 nm to 10 ⁇ m is preferable. More preferably, it is 5 nm to 1 ⁇ m, and further preferably 10 nm to 100 nm.
  • Streptococcus bacteria in milk can be detected.
  • Streptococcus genus bacteria in the present invention unless otherwise described, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equinus, Streptococcus canis, Streptococcus bovis, Streptococcus pluranimalium, Streptococccus parauberis, Streptococcus mutans, include Streptococcus Acidominimus .
  • the specific substance to be measured in the present invention can be any substance that can be measured by an immunological method such as immunochromatography, but is preferably a bacterial component or a substance secreted by bacteria. More preferably, it is a bacterial L7 / L12 ribosomal protein. L7 / L12 ribosomal proteins have high detection sensitivity due to the presence of multiple copies in the cell.
  • the antibody used in the present invention can be prepared by the method described in WO 00/06603 pamphlet.
  • the bacterial ribosomal protein L7 / L12 can be prepared using the full-length protein of the bacterial ribosomal protein L7 / L12 or a partial peptide thereof as the antigen, but it is preferable to prepare the full-length protein as the antigen.
  • This partial peptide or full-length protein is directly or after cross-linking with a carrier protein, and then inoculated into an animal together with an adjuvant as necessary, and an antibody (polyclonal antibody) that recognizes the L7 / L12 ribosomal protein by recovering the serum. Serum can be obtained.
  • the antibody can be purified from the antiserum and used.
  • the animals to be inoculated include sheep, horses, goats, rabbits, mice, rats and the like, and sheep, rabbits and the like are particularly preferable for producing polyclonal antibodies.
  • the antibody it is more preferable to apply a monoclonal antibody obtained by a known method for producing a hybridoma cell. In this case, a mouse is preferable.
  • the monoclonal antibody a monoclonal antibody that reacts with ribosomal protein L7 / L12 of a specific bacterium that causes mastitis and does not react with ribosomal protein L7 / L12 of a bacterium that causes mastitis other than the specific bacteria. By screening, it can be used for diagnosis of whether or not the bacterium has an infection.
  • the antibody reacts with a component of a specific bacterium causing mastitis or a substance secreted by the bacterium, and does not react with a component of a bacterium causing mastitis other than the specific bacterium or a substance secreted by the bacterium.
  • a monoclonal antibody an antibody that recognizes other than ribosomal protein L7 / L12 as an antigen can be used.
  • the monoclonal antibody it is preferable to use a monoclonal antibody whose antigen-antibody reaction is not inhibited by contaminants other than the specific substance contained in the milk.
  • milk contains a large amount of protein such as casein, which may inhibit the reaction between a specific substance and a monoclonal antibody.
  • a monoclonal antibody against a specific substance is produced by a conventional method, for example, it may be preferable to appropriately select and use a monoclonal antibody in which the antigen-antibody reaction is not inhibited by casein or the like, or a monoclonal antibody that has little influence on the antigen-antibody reaction. is there.
  • a monoclonal antibody that specifically reacts with an antigen After manufacturing a monoclonal antibody that specifically reacts with an antigen according to a conventional method, such a monoclonal antibody is examined whether the antigen-antibody reaction is inhibited in the presence of contaminants such as casein, It can be easily obtained by selecting a monoclonal antibody that does not substantially inhibit the reaction.
  • Example 1 (1) Preparation of Ribosomal Protein L7 / L12 Antibody According to the method described in the Examples of International Publication WO00 / 06603, L7 / L12 ribosomal protein was obtained and a monoclonal antibody was prepared using the protein. As the monoclonal antibody, two types of combinations capable of simultaneously binding to other sites of the L7 / L12 ribosomal protein were selected.
  • S. uberis bacteria or S. agalactiae bacteria were stirred overnight in MOPSO buffer (0.1 M) containing 1% of the nonionic surfactant TritonX-100, followed by sonication (output 10%, 1 min). ⁇ 10 times) was used.
  • the previously prepared bacterial preparation and enzyme preparation were mixed at a volume ratio of 1: 1 and treated in a 37 ° C. incubator for 1 hour. This was diluted 100-fold with 0.05% Tween20 / PBS, 50 ⁇ l was added to the plate, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After removing the supernatant and washing several times with the washing solution, 50 ul of peroxidase-labeled monoclonal antibody-2 (1 ⁇ g / ml, 0.05% Tween20 / PBS) was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the lysis rate in each positive enzyme was calculated from the ratio of the lysis rate in the positive control as 100% and the absorbance of the positive control. The results are shown in Table 2, with + indicating lysis rate of 5% or more and-with lysis rate of less than 5%.
  • Lysozyme and labiase alone were effective against both bacteria.
  • ⁇ -N acetylglucosaminidase alone was effective against S. agalactiae .
  • Example 2 The final concentration is adjusted to 0.5 mg / ml rabiase and 4.5 mg / ml lysozyme using citric acid-Na phosphate buffer / milk (mixing volume ratio 1: 1), and the bacteria are treated in the same way as above. did.
  • the result of calculating the lysis rate by ELISA is shown in FIG.
  • what is the use of lysozyme and Rabiaze alone was S. Uberis or S.
  • Insufficient lytic activity on either bacteria agalactiae is, by using both mixed in a range of concentrations, none of the bacteria It became clear that lysis was possible with high efficiency.
  • An immunochromatography apparatus can be produced as follows.
  • (A) Colloidal gold label impregnated member Mix BBInternational's colloidal gold solution (particle size 60 nm) 0.9 ml with 0.1 M potassium phosphate pH 7.0, add gold colloid-labeled monoclonal antibody-1 at 100 ⁇ g / ml, and add 10 at room temperature. After allowing the antibody to bind to the gold colloid particle surface, add a 10% bovine serum albumin (BSA) aqueous solution so that the final concentration in the gold colloid solution is 1%. The surface is blocked with BSA to prepare a colloidal gold labeled monoclonal antibody-1 (hereinafter referred to as “gold colloid labeled antibody”) solution.
  • BSA bovine serum albumin
  • This solution is centrifuged (15000 ⁇ rpm, 5 minutes) to precipitate the colloidal gold labeled antibody, and the supernatant liquid is removed to obtain the colloidal gold labeled antibody.
  • the colloidal gold labeled antibody is suspended in a 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7) containing 0.25% BSA, 2.5% sucrose and 35 mM NaCl to obtain a colloidal gold labeled antibody solution.
  • a 10 mm ⁇ 300 mm belt-shaped glass fiber pad is impregnated with 2 ml of the colloidal gold labeled antibody solution and dried under reduced pressure at room temperature to obtain a colloidal gold labeled antibody impregnated member 1 (first part).
  • Capture site of complex of antigen and colloidal gold labeled antibody A nitrocellulose membrane having a width of 25 mm and a length of 300 mm is prepared as a membrane carrier 2 (second part) for chromatographic development of a chromatographic medium. A solution containing monoclonal antibody-2 1.5 mg / ml was applied in a line of 1 ⁇ l / cm at a position 10 mm from the end of the chromatographic development start side in the membrane carrier 2 for chromatographic development. Dry at 30 ° C. for 30 minutes, then dipped in 0.5% sucrose solution for 30 minutes and dried overnight at room temperature. This is the capture site 3 of the complex of ribosomal protein L7 / L12 antigen and colloidal gold labeled antibody.
  • FIG. 2 shows a cross-sectional view of the immunochromatograph device.
  • 25 mm GF / DVA manufactured by GE Healthcare Biosciences
  • Filter member 4 consisting of glass fiber with a thickness of 776 ⁇ m and a retention particle size of 3.5 ⁇ m
  • 20 mm GF / AVA GE Healthcare Biosciences
  • Filter member 7 consisting of glass fiber with a thickness of 299 ⁇ m and a retention particle size of 1.7 ⁇ m
  • filter paper is prepared as the absorbing member 5.
  • Example 4 Evaluation by immunochromatography 1 Milk milk was measured with an immunochromatography apparatus as follows. 300 ⁇ l of milk to which Streptococcus uberis having a final concentration of 1 ⁇ 10 5 (CFU / ml) was added was collected in a microtube, 500 ⁇ l of lysis treatment solution was added, and the mixture was treated at room temperature for 30 minutes. Commercial milk drinks were used for milk juice. The immunochromatograph device is immersed in the mixed solution from the sample addition member 4 and allowed to stand at room temperature for 30 minutes for development, and then the ribosomal protein L7 / L12 antigen and gold colloid-labeled antibody captured at the supplemental site 3 The intensity of the red-purple line that increases or decreases in proportion to the amount of capture was measured. Table 3 shows the lysis efficiency under each condition.
  • condition 2 using lysozyme together, and condition 3 adding Tween 20 which is a polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester as a surfactant further improves the lysis efficiency. It became clear. Moreover, when the conditions (comparative example 3) currently disclosed by the nonpatent literature 1 were retested, the low lysis efficiency was recognized.
  • Example 5 Evaluation of lytic activity by immunochromatography 2 The amount of lysozyme used in combination with rabiase was evaluated by the same procedure as in Example 4. The results are shown in Table 4. It was confirmed that lysis efficiency was improved by adding an appropriate amount of lysozyme.
  • Example 6 Evaluation of Surfactant Concentration by Immunochromatography Table 5 shows the results of evaluating the surfactant concentration in the same manner as in Example 4. It was revealed that the lysis efficiency was further improved by optimizing the addition amounts of Triton X100 and Tween 20.
  • Example 7 Sensitivity of detection of live bacteria in milk Samples prepared by adding Streptococcus uberis at various concentrations to milk were treated with the lysing agent under conditions 1 and 10, and measurement by immunochromatography was performed. The reddish purple line that appeared was visually judged (strong positive ++, positive +, negative-).
  • Example 8 Improvement of lysis efficiency by additives Table 7 shows the results of evaluating the lysis efficiency by adding various additives to the lysis agent described in Condition 9 described in Example 6.
  • the present invention can be used for rapid diagnosis of livestock mastitis by immunochromatography or the like.

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Abstract

　家畜の乳汁を用いて乳房炎の原因菌がStreptococcus属の菌であるか否かを検出するため、種々のStreptococcus属の菌を乳汁中で効率よく溶菌し、菌体内の特定抗原物質を放出させる溶菌方法、溶菌処理液およびイムノクロマト装置からなる検出方法を提供することを課題とする。ストレプトコッカス属の菌の溶菌方法であって、家畜から得た乳汁に、溶菌酵素を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在するストレプトコッカス属の菌を溶菌する工程を含む方法を提供する。溶菌酵素は、リゾチーム、ラビアーゼおよびβ-N-アセチルグルコサミニダーゼからなる群より選択される少なくとも一つである。

Description

乳汁中のストレプトコッカス属の菌を検出する方法
　本発明は、家畜の乳汁中から乳房炎原因菌であるStreptococcus属の菌を検出するための、溶菌方法および検出方法に関するものである。
　牛、羊、ヤギに代表される家畜の乳汁は無菌的なものではなく、疾患や環境が原因で何らかの微生物が混入している場合がある。特に乳房への微生物の感染による疾患ではしばしば乳汁中に多くの微生物を排菌することが知られている。微生物の感染が原因で引き起こされる代表的な家畜の疾患に乳房炎がある。
　乳房炎とは、乳管系、乳腺組織の炎症であり、主に微生物が乳房内に侵入・定着し、増殖することによって引き起こされる。乳房炎は多くの動物が罹患するが、特に乳牛における牛乳房炎は乳牛全体の15～40％が罹患すると言われ、酪農家にとって極めて重要な疾患の一つである。乳牛が乳房炎に罹患すると、乳汁の合成機能が阻害され、泌乳量の減少や場合によっては泌乳の停止が起こるだけでなく、治療費や、乳質の悪化による乳価のペナルティーなど多大な経済的損失を酪農家に与える。さらには、伝染防止のために乳房炎罹患分房を個別に搾乳するなど、酪農家にかかる労働負担も増加する。
　乳房炎は様々な微生物の感染によって引き起こされる。中でもストレプトコッカス(Streptococcus)属の細菌（連鎖球菌ということもある。）は、発生頻度の多い原因菌として知られている。
　乳汁からのStreptococcus属の細菌の検出方法としては培養法が広く用いられている。培養法は結果が得られるのに数日間を要し迅速な原因菌特定には適さない。一方、原因菌に特異的な成分に対する抗体を用いる抗原抗体反応による同定法、特にイムノクロマトグラフ法は、数10分で結果を判定できるため、迅速・簡便な検査方法として広く用いられている（例えば特許文献1）。本発明者らは、イムノクロマトグラフ法を、家畜の乳汁中の物質を検出するための方法としても検討してきた（特許文献2）。
　イムノクロマトグラフ法などの免疫測定法では、抗原が菌体内成分の場合は菌体を溶菌し、菌体内の抗原を菌体外に放出させる必要がある。他方、Streptococcus属の菌に対しては、ラビアーゼが溶菌活性を示すことが知られている（非特許文献1）。しかしながら、非特許文献１では乳汁のような高タンパク、高脂肪の溶液中での溶菌効果については記載されていない。
特開平1-244370号公報 特開2012-122921号公報
Microbiol Immunol 2009; 53: 45-48
　乳房炎は細菌など様々な微生物の感染によって引き起こされるが、原因菌によって治療に効果を示す抗生物質が異なる。したがって乳房炎の早期診断、治療は大変重要となる。また、特定の細菌が乳房炎を起こした場合では個体の他の分房や個体間に伝染することもあり乳汁中に存在する原因菌を迅速・簡便に同定することが極めて重要となる。
　菌の検出方法として広く用いられている培養法は、結果が得られるのに数日間を要するという問題がある。一方、イムノクロマトグラフ法などの抗原抗体反応に基づく免疫測定法は、迅速・簡便に原因菌を検出することが可能となり早期の抗菌薬治療が可能となる利点がある。免疫測定法にて原因菌の菌体内の特定物質を高感度に検出するには、抗原が菌体内成分の場合、菌体を高効率に溶菌し、菌体内の抗原を菌体外に放出させる必要がある。しかしながら、乳汁を検体として用いた場合、乳汁中に多量に含まれるカゼインなどのタンパク質や乳脂肪球などの影響により従来技術では溶菌が十分に行われないことが多い。発明者らの検討によると、乳汁を含む系では、一般的な溶菌酵素の活性が大きく低下することが判明している。このように乳汁中のStreptococcus属の菌を高効率に検出するための有効な溶菌方法は従来技術では知られていなかった。
　本発明は、家畜の乳汁を用いて乳房炎の原因菌がStreptococcus属の菌であるか否かを検出するため、種々のStreptococcus属の菌を乳汁中で効率よく溶菌し、菌体内の特定抗原物質を放出させる溶菌方法、溶菌処理液およびイムノクロマト装置からなる検出方法を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者は、乳汁中のStreptococcus uberisを効率的に溶菌するためには、少なくともリゾチームまたはラビアーゼを含む、Streptococcus agalactiaeを溶菌するためには、リゾチーム、ラビアーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼより選ばれる溶菌酵素を含む、溶菌剤を使用することで効率的に溶菌できることを見出した。さらに、乳汁中のStreptococcus属の溶菌処理を効率的に達成する為には、溶菌効果を有するとして知られているラビアーゼ酵素に、特定量のリゾチームをさらに追添することでより高効率に溶菌でき、菌体内のL7/L12タンパクを放出させることが可能であり、高感度なStreptococcus属の菌の検出に用いうることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、以下を提供する。
[1]  ストレプトコッカス（Streptococcus）属の菌の溶菌方法であって、
　家畜から得た乳汁に、リゾチーム、ラビアーゼおよびβ-N-アセチルグルコサミニダーゼからなる群より選択される少なくとも一つを含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程を含むが、
　ストレプトコッカス属の菌が、ストレプトコッカス　ウベリス（Streptococcus uberis）であり、溶菌剤が、リゾチームおよびラビアーゼの少なくとも一つを含有するか、または
　ストレプトコッカス属の菌が、ストレプトコッカス　アガラクチア（Streptococcus agalactiae）であり、溶菌剤が、リゾチーム、ラビアーゼおよびβ-N-アセチルグルコサミニダーゼからなる群より選択される少なくとも一つを含有する、方法。
[2]  ストレプトコッカス属の菌の溶菌方法であって、家畜から得た乳汁に、少なくともリゾチームおよびラビアーゼを含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程を含む、方法。
[3]  乳汁中のストレプトコッカス属の菌を溶菌するための、リゾチーム、ラビアーゼおよびβ-N-アセチルグルコサミニダーゼからなる群より選択される少なくとも一つを含有するか、または少なくともリゾチームおよびラビアーゼを含有する、溶菌剤。
[4]  家畜の乳房炎を診断する方法において用いるための、[3]に記載の溶菌剤。
[5]  [1]または[2]の方法を含み、溶菌により放出された菌体内由来の特定物質を検出する工程をさらに含む、家畜乳汁中のストレプトコッカス属の菌の検出方法。
[6]  特定物質の検出工程が、イムノクロマトグラフ方法により実施される、[5]に記載の方法。
　本発明は、以下も提供する。
[1]  乳汁中のストレプトコッカス属の菌の溶菌方法であって、
　乳汁に、リゾチーム、ラビアーゼおよび非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程または、
　乳汁に、リゾチーム、ラビアーゼおよびβ-N-アセチルグルコサミニダーゼからなる群より選択される少なくとも一つを含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程であって、このときストレプトコッカス属の菌が、ストレプトコッカス　アガラクチアである、工程
を含む、溶菌方法。
[2]  該菌が、ストレプトコッカス　ウベリスまたはストレプトコッカス　アガラクチアである、[1]に記載の溶菌方法。
[3]  該非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよび／またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する、[1]または[2]に記載の溶菌方法。
[4]  乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、該非イオン界面活性剤の終濃度が、0.03％以上3％以下である、[1]～[3]のいずれか１項に記載の溶菌方法。
[5]  乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、該リゾチームの終濃度が、0.5mg/ml以上200mg/ml以下であり；および／または
　乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、該ラビアーゼの終濃度が、0.05mg/ml以上20mg/ml以下である、[4]に記載の溶菌方法。
[6]   [1]～[5]のいずれか１項に定義した、乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程
を含み、
　溶菌により放出された菌体内由来の特定物質を検出する工程
をさらに含む、乳汁中のストレプトコッカス属の菌の検出方法。
[7]  検出方法が、イムノクロマトグラフ方法により実施される[6]に記載の方法。
[8]  該イムノクロマトグラフ方法が、（1）特定物質を含む乳汁を、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第3部分またはそれより上流部に接触させる工程；および（2）該乳汁を該第2部分またはそれより下流部まで流し、該第2部分またはそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程：を含む、[7]に記載の検出方法。
[9]  該第1部分に、該特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている、[8]に記載の検出方法。
[10]　第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材より構成されている、 [8]または[9]に記載の検出方法。
[11]　第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい、[10]に記載の検出方法。
[12]　 [1]～[5]のいずれか１項に定義された、溶菌剤。
[13]　家畜の乳房炎を診断する方法において用いるための、[12]に記載の溶菌剤。
[14]　 [12]または[13]に記載の溶菌剤と、
　該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ装置と
を含む、乳汁中のストレプトコッカス属の菌の検出用キット。
　Streptococcus uberisまたはStreptococcus agalactiaeを溶菌するためには、菌種ごとに特定の溶菌酵素を使用すること、またStreptococcus属として菌を溶菌するためには、溶菌酵素としてラビアーゼと特定量のリゾチームを併用することにより、高効率に溶菌できることを発見した。
酵素免疫測定法（ELISA）によるStreptococcus属の菌の検出における溶菌酵素の効果を示す。 実施例3で作製したイムノクロマトグラフ装置の試験片の断面模式図を示す。1：標識抗体含浸部材（第1部分）、2：クロマト展開用膜担体（第2部分）、3：捕捉部位、4：試料添加用部材かつ脂肪球除去用部材（第3部分）、5：吸収用部材、6：基材、および7：脂肪球除去用部材（第3部分）
　以下、本発明について更に詳細に説明する。なお、本発明において、数値範囲を「X～Y」で表すときは、両端の値を含む。「％」は、特に記載した場合を除き、質量に基づく割合を示す。「Aおよび（ならびに）／またはB」は、AとBの少なくとも一方の意であり、Aのみである場合、Bのみである場合、並びにAおよびBである場合がある。
　本発明は、乳汁中のStreptococcus属の菌を溶菌するための溶菌剤を提供する。本発明の溶菌剤は、溶菌酵素を含む。
［溶菌酵素］
　本発明における溶菌酵素の種類は特に限定されず、任意の2種以上の溶菌酵素を適宜組み合わせて用いてもよい。本発明においては、リゾチーム、ラビアーゼおよびβ-N-アセチルグルコサミニダーゼからなる群より選択される少なくとも一つを用いることが好ましく、Streptococcus属の菌が、Streptococcus uberisである場合は、溶菌剤が、リゾチームおよびラビアーゼの少なくとも一つを含有することが好ましく；Streptococcus属の菌が、Streptococcus agalactiaeである場合は、溶菌剤が、リゾチーム、ラビアーゼおよびβ-N-アセチルグルコサミニダーゼからなる群より選択される少なくとも一つを含有することが好ましい。
　ラビアーゼ（Labiase）は、Streptomyces fulvissimus TU-6 株の培養液上清より調製され、β－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミニダーゼ、ムラミダーゼを主体とする複合酵素である。ラビアーゼは、上記菌株の培養上清から調製することもでき、また市販品の購入により入手することが可能である。
　ラビアーゼを用いる場合、効率的に溶菌を行う等との観点からは、本明細書の実施例で用いたものを使用する場合には、終濃度として、好ましくは0.05 mg/ml以上、好ましくは0.1 mg/ml以上、より好ましくは0.5 mg/ml以上とすることができ、またいずれの場合も、20 mg/ml以下、好ましくは10 mg/ml以下、より好ましくは5 mg/ml以下とすることができる。あるいは、終濃度として、好ましくは0.0005 units/ml以上、好ましくは0.001 units/ml以上、より好ましくは0.005 units/ml以上とすることができ、またいずれの場合も、0.2 units/ml以下、好ましくは0.1 units/ml以下、より好ましくは0.05 units/ml以下とすることができる。なお、本明細書でラビアーゼに関し、酵素単位（unit）をいうときは、特に記載した場合を除き、β-N-アセチル-D-グルコサミニダ－ゼ活性としての値を指し、p-ニトロフェニル-β-N-アセチル-D-グルコサミンを基質として酵素を作用させたとき、1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離する酵素活性を1 unitとする。
　リゾチームは、14.6kDaの単一ペプチドのタンパク質であり、ペプチドグリカン層でN－アセチルムラミン酸とN－アセチルグルコサミンとの間のβ（1－4）グリコシド結合を切断することによりバクテリアの細胞を溶解することができる。リゾチームは市販品の購入により入手することが可能である。
　リゾチームを用いる場合、効率的に溶菌を行う等との観点からは、本明細書の実施例で用いたものを使用する場合には、終濃度として、好ましくは0.5 mg/ml以上、好ましくは1 mg/ml以上、より好ましくは5 mg/ml以上とすることができ、またいずれの場合も、200 mg/ml以下、好ましくは100 mg/ml以下、より好ましくは50 mg/ml以下とすることができる。あるいは、リゾチームの終濃度として、好ましくは0.4 mg/ml以上、好ましくは0.8 mg/ml以上、より好ましくは4 mg/ml以上とすることができ、またいずれの場合も、160 mg/ml以下、好ましくは80 mg/ml以下、より好ましくは40 mg/ml以下とすることができる。なお、本明細書でリゾチームに関し、リゾチームとしての量をいうときは、特に記載した場合を除き、Micrococcus Lysodeikticus乾燥菌体のリン酸緩衝液懸濁液を基質として作用させたときの吸光度（640nm）の減少に基づく値である。
　β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、β-N-アセチルヘキソサミニダーゼともよばれ、種々の基質から末端β結合N-アセチルグルコサミンおよびN-アセチルガラクトサミンを遊離させる酵素である。β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、市販品の購入により入手することが可能である。
　β-N-アセチルグルコサミニダーゼを用いる場合、効率的に溶菌を行う等との観点からは、本明細書の実施例で用いたものを使用する場合には、終濃度として、好ましくは0.5 mg/ml以上、好ましくは1 mg/ml以上、より好ましくは5 mg/ml以上とすることができ、またいずれの場合も、200 mg/ml以下、好ましくは100 mg/ml以下、より好ましくは50 mg/ml以下とすることができる。あるいは、終濃度として、好ましくは0.05 units/ml以上、好ましくは0.1 units /ml以上、より好ましくは0.5 units /ml以上とすることができ、またいずれの場合も、200 units /ml以下、好ましくは100 units /ml以下、より好ましくは50 units /ml以下とすることができる。なお、本明細書でβ-N-アセチルグルコサミニダーゼに関し、酵素単位（unit）をいうときは、特に記載した場合を除き、p-ニトロフェニル-β-N-アセチル-D-グルコサミンを基質として酵素を作用させたとき、1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離する酵素活性を1 unitとする。
　本発明ではStreptococcus属の菌を含有する乳汁中にラビアーゼ酵素に加え、さらにリゾチーム酵素を追加添加することにより、広範囲のStreptococcus属の菌に適用可能な、高効率の溶菌効果を達成できる。効率的に溶菌を行う等との観点からは、本明細書の実施例の項に記載したラビアーゼおよび本明細書の実施例の項に記載したリゾチームを用いる場合には、ラビアーゼ1 mg/mlに対して、追加添加するリゾチームの添加量は、好ましくは3 mg/ml以上、より好ましくは5 mg/ml以上、さらに好ましくは7 mg/ml以上、さらに好ましくは9 mg/ml以上を含み、また好ましくは100mg/ml以下、より好ましくは50 mg/ml以下、さらに好ましくは20 mg/ml以下である。あるいは、ラビアーゼ0.1 unit/mlに対して、さらに追加添加するリゾチームとしての添加量は、好ましくは2.4 mg/ml以上、より好ましくは4 mg/ml以上、さらに好ましくは5.6 mg/ml以上、さらに好ましくは7.2 mg/ml以上を含み、またいずれの場合も、好ましくは80mg/ml以下、より好ましくは40 mg/ml以下、さらに好ましくは16 mg/ml以下である。
［界面活性剤］
　水に溶かしたときに、電離してイオンとなる界面活性剤をイオン界面活性剤またはイオン性界面活性剤といい、イオンにならない界面活性剤を非イオン（ノニオン）界面活性剤という。イオン界面活性剤はさらに、陰イオン（アニオン）界面活性剤、陽イオン（カチオン）界面活性剤および両性界面活性剤に分類される。
　溶菌剤には、溶菌酵素に加えて界面活性剤を添加することにより、溶菌効果を高められることが期待できる。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤および両性界面活性剤を単独またはいずれかを組み合わせて用いてもよい。
　本発明の溶菌剤は非イオン界面活性剤を含有させることができる。非イオン界面活性剤の共存は、得られた溶菌液をイムノクロマトグラフ法に供する場合に特に好ましいと考えられる。非イオン性界面活性剤としては、エステルエーテル型、エステル型、エーテル型のいずれも好適に用いることができると考えられ、より具体的にはポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテル、ポリソルベート類（脂肪酸ソルビタンエステルにエチレンオキシドが数十分子縮合したもの）などがあげられるが、特に限定されない。特に好ましい例の一つは、ポリソルベート類、より特定すると、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン(60)ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン(65)ソルビタントリステアレート、およびポリオキシエチレン(80)ソルビタンモノオレエート等、ならびにポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、より特定するとポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル等である。
　溶菌剤中での非イオン界面活性剤の含量（複数の非イオン界面活性剤を用いる場合は、非イオン界面活性剤総量としての含量を指す。）は、例えばイムノクロマトグラフ法を用いる場合は展開液の流れが確保される限り、特に限定されないが、いずれの場合であっても、下限は、乳汁と混合した場合の終濃度が0.03％以上となるようにすることができ、好ましくは0.05％以上であり、より好ましくは0.075％以上であり、さらに好ましくは0.1％以上であり、特に好ましくは0.3％以上である。また非イオン界面活性剤の含量の上限値は、溶菌酵素による反応や抗原抗体反応を著しく阻害しない程度であればよく、いずれの場合であっても、10％以下とすることができ、好ましくは7.5％以下であり、より好ましくは5％以下であり、さらに好ましくは3％以下であり、特に好ましくは2％以下である。
　陰イオン界面活性剤としては、カルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、その他のいずれも好適に用いることができる。より具体的な例として、アルキルエーテルカルボン酸塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（LAS）、α－オレフィンスルホン酸塩（AOS）、ジアルキルスルホコハク酸塩、ナフタレンスルホン酸塩のホルムアルデヒド縮合物、アルキル硫酸エステル塩（AS）、高級アルコールにエチレンオキシドを付加して硫酸化したポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩（AES）、高級アルコールやそのエチレンオキシド付加物などのリン酸エステル塩等をあげることができる。さらに具体的な例として、ドデシル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸ナトリウム、N-ラウロイルザルコシン酸ナトリウム、N-ミリストイルザルコシン酸ナトリウム等のN-アシルザルコシン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水素添加ココナッツ脂肪酸モノグリセリドモノ硫酸ナトリウム、ラウリルスルホ酢酸ナトリウム、N-パルミトイルグルタミン酸ナトリウム等のN-アシルグルタミン酸塩、N-メチル-N-アシルアラニンナトリウム、α-オレフィンスルホン酸ナトリウムをあげることができる。
　陽イオン界面活性剤としては、アミン塩型、第４級アンモニウム塩型のいずれも好適に用いることができ、より具体的な例として、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド等をあげることができる。
　両性界面活性剤としては、アミノ酸系（アルキルアミノ脂肪酸塩）、ベタイン系 （アルキルベタイン）、アミンオキシド系（アルキルアミンオキシド）等があげられるが、特に限定されない。より特定された例としては、ジメチルアンモニオプロパンスルホネイト、ドデシルジメチルアンモニオブチレイト、ラウリル酸ベタイン、およびアミドプロピルベタインがあげられる。より具体的な例としては、n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、N-Dodecyl-N,N-(dimethylammonio)butyrateがあげられる。
［配合例］
　特に好ましい態様においては、溶菌剤は、リゾチーム、ラビアーゼおよび非イオン界面活性剤を含有する。このような溶菌剤は種々のストレプトコッカス属の菌に有効であるが、特にストレプトコッカス　ウベリスまたはストレプトコッカス　アガラクチアに対して有効である。リゾチーム、ラビアーゼおよび非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤において、非イオン界面活性剤の特に好ましい例は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよび／またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、より好ましい例は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含む。このような溶菌剤における各成分の濃度は、乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、リゾチームの終濃度が、0.6mg/ml以上50mg/ml以下であり、ラビアーゼの終濃度が、0.05mg/ml以上20mg/ml以下であり、かつ非イオン界面活性剤の終濃度が、0.03％以上3％以下であるようにするとよい。リゾチーム、ラビアーゼおよび非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤のより好ましい態様は、乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、リゾチームの終濃度が、0.5mg/ml以上50mg/ml以下であり、ラビアーゼの終濃度が0.1mg/ml以上10mg/ml以下であり、かつ非イオン界面活性剤の終濃度が、0.10％以上2.6％以下である、
［その他の成分］
　本発明の溶菌剤は、溶菌酵素および界面活性剤以外に、意図した効果を著しく損なわない限り、一種またはそれ以上の他の成分を含むことができる。溶菌酵素および界面活性剤以外の成分の好ましい例は、溶菌を促進する効果を有する物質である。具体的には、グルタルアルデヒド、ハロゲン化合物、クロルヘキシジン、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、２－メチル－１－プロパノール、２－メチル－２－プロパノール）、フェノール、過酸化水素、アクリノール、グアニジンおよびその塩、キレート剤、有機酸（例えば、デカン酸）およびその塩、多価アルコール類（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、グリセリン、モノカプリリン）、ならびに２－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンおよびチオフェノールなどの還元剤をあげることができるが、これらに限定されない。
　例えばグアニジンおよびその塩（例えば、グアニジンチオシアン酸塩）のいずれかを用いる場合、乳汁と混合した場合の終濃度の下限値（複数種類を用いる場合は、総量としての濃度を指す。上限値についても同じ。）は、0.1mM以上とすることができ、好ましくは1mM以上とすることができ、より好ましくは1mM以上とすることができる。いずれの場合も、乳汁と混合した場合の終濃度の上限値は、500mM以下とすることができ、好ましくは200mM以下とすることができ、より好ましくは100mM以下とすることができる。
　キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）およびその塩、グリコールエーテルジアミン四酢酸（EGTA）およびその塩、ポリリン酸及びその塩、並びにメタリン酸及びその塩が挙げられる。乳汁と混合した場合の終濃度の下限値（複数のキレート剤を用いる場合は、キレート剤総量としての濃度を指す。上限値についても同じ。）は、0.001mM以上とすることができ、好ましくは0.01mM以上とすることができ、より好ましくは0.1mM以上とすることができる。いずれの場合も乳汁と混合した場合の終濃度の上限値は、抗原抗体反応の阻害抑制の観点から、100mM以下とすることができ、好ましくは10mM以下とすることができ、より好ましくは5mM以下とすることができる。
［溶菌条件、溶菌率］
　本発明においては、溶菌剤は、乳汁に混合して用いることができる。乳汁と溶菌剤との混合比は、溶菌酵素等の終濃度が適切に維持され、十分な溶菌率が確保できる限り、特に限定されない。乳汁に対して比較的少量の溶菌剤を用いる場合は、乳汁が希釈されない。したがって、より高い感度で菌体を検出できると期待できる。また乳汁に対して比較的大量の溶菌剤を用いる場合は、乳汁中の脂肪滴やタンパク質による影響が減じられ、より短時間で菌体を検出できると期待できる。乳汁と溶菌剤との混合物における乳汁の割合比（乳汁／（乳汁＋溶菌剤）×100）は、高いほど検出感度を上げることができるとの観点からは、他の条件がいずれの場合であっても、例えば、5％以上とすることができ、10％以上とすることが好ましく、20％以上とすることがより好ましく、30％以上とすることがさらに好ましい。上限値は、他の条件がいずれの場合であっても、乾燥等の手段によって固形化した溶菌剤を用いることにより、乳汁の割合を100％とすることができる。また、他の条件がいずれの場合であっても、乳汁の割合は90％以下とすることができ、80％以下、70％以下、60％以下、または50％以下とすることができる。上限値は、混合の容易さ、溶菌剤の溶液としての安定性等を考慮して決定してもよい。
　本発明においては、乳汁は溶菌剤と単に混合すればよい。混合する際の温度、およびそれに続く酵素が作用するための処理時間は、用いる溶菌酵素が活性を発揮できる温度であれば特に限定されず、通常、室温でよい。混合後の処理時間のために必要な時間は、当業者であれば、溶菌率を考慮して、適宜設計することができる。本発明においては、Streptococcus属の菌に対して適切な組み合わせおよび濃度の溶菌酵素を用いているので、処理時間を、通常の溶菌方法を用いる場合よりも短くすることができる。本発明における処理時間は、いずれの場合であっても、概ね数十分間～数時間以内であり、より具体的には240分間以内とすることができ、150分以内とすることが好ましく、90分以内とすることがさらに好ましく、60分以内とすることがさらに好ましく、45分以内とすることがさらに好ましく、25分間以内とすることがさらに好ましく、20分以内とすることがさらに好ましく、15分以内とすることがさらに好ましい。処理時間を、実質0とする（乳汁と溶菌剤を混合して、直ちに測定に供する）こともできる。温度は、いずれの場合であっても、2℃～50℃、例えば35～40℃とすることができ、用いる酵素や処理時間を考慮して、適宜設計することができる。処理に際し、静置してもよく、また撹拌してもよい。このような短時間であっても、本発明に依れば必要な溶菌が達成でき、Streptococcus属の菌の検出が実施できる。本発明においては、さらに、溶菌酵素に界面活性剤を組み合わせて用いることもできる。この場合、処理時間を、溶菌酵素のみを用いる場合よりも短くできるか、または同じ処理時間であってもより溶菌率を高めることができる可能性がある。処理時間は、概ね数十分間～数時間以内であり、より具体的には240分間以内とすることができ、150分以内とすることが好ましく、90分以内とすることがさらに好ましく、60分以内とすることがさらに好ましく、45分以内とすることがさらに好ましく、25分間以内とすることがさらに好ましく、20分以内とすることがさらに好ましく、15分以内とすることがさらに好ましい。処理時間を、実質0とする（乳汁と溶菌剤を混合して、直ちに測定に供する）こともできる。界面活性剤と組み合わせる際も、温度は、いずれの場合であっても、2℃～50℃、例えば35～40℃とすることができ、用いる酵素や処理時間を考慮して、適宜設計することができる。処理に際しても同様に、静置してもよく、また撹拌してもよい。
　なお本発明で溶菌率というときは、特に記載した場合を除き、対象となるStreptococcus属の菌を含む液を、あらかじめ適切な濃度の非イオン界面活性剤で処理した後、さらに超音波処理し、必要に応じ十分な酵素処理を行ったものの溶菌率を100％とすることができる。
［検出手段］
　本発明により溶菌されたStreptococcus属の菌は、菌体由来の成分を抗原として、各種の免疫学的方法によりを検出することができる。ためには、例えばStreptococcus属の菌のリボソームL7/L12蛋白質からなる抗原をイムノクロマトグラフ法またはイムノクロマトグラフ法に代えて他の免疫学的測定方法により上記抗原を検出することもできる。イムノクロマトグラフ以外の免疫学的測定方法としては、例えば、イムノクロマトグラフ法、凝集反応法、酵素免疫測定法（ELISA法）、放射能免疫測定法（RIA法）、または蛍光免疫測定法（FIA法）などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
　免疫学的方法の実施に際し、非特異吸着を防ぐためのブロッキングのための物質や、対象菌以外の菌との交差反応を防ぐための物質を用いてもよい。特に、用いる抗体と黄色ブドウ球菌が保有するプロテインＡとの反応を防ぐために、抗原との反応に関与しないグロブリンを添加することができる。グロブリンを用いる場合、偽陽性を抑制するという観点からは、反応時の終濃度として、0.01μg/ml以上、好ましくは0.1μg/ml以上、より好ましくは1μg/ml以上とすることができ、またいずれの場合も、対象の抗原抗体反応を阻害しないという観点から、10mg/ml以下、好ましくは5mg/ml以下、より好ましくは1mg/ml以下とすることができる。このような終濃度の条件は、イムノクロマトグラフ法に特に適する。
　イムノクロマトグラフ法を用いる場合、典型的には、次のように実施することができる。
［イムノクロマトグラフ法、イムノクロマトグラフ装置］
　抗原抗体反応は、第1部分に保持されている「特定物質に対する標識された第一の抗体」と、第2部分に固定化された「特定物質に対する第二の抗体」を用いて、サンドイッチアッセイ法により検出することができる。あるいは抗原抗体反応は、第1部分に保持されている標識された特定物質と、第2部分に固定化された特定物質に対する抗体を用いて競合法にて検出してもよい。但し、本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法が好ましい。
　イムノクロマトグラフ装置は、イムノクロマトグラフ法によって乳汁中の特定物質を検出するための装置であって、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む装置である。具体的な試験片の構成としては、図2に断面模式図を示した試験片が挙げられる。図2においては、脂肪球除去用部材（第3部分）7は、試料添加用部材4の下流、かつ標識抗体含浸部材（第1部分）1の上流に設置されている。
　イムノクロマトグラフ装置は公知の方法にて市販の材料を用いて作製することができる。　第1部分に使用する材料は、イムノクロマトグラフを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、セルロース誘導体等の繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等である。
　第2部分に使用する材料は、イムノクロマトグラフを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、ニトロセルロース、混合ニトロセルロースエステル、ポリビニリデンフロライド、ナイロン等である。
　第3部分に使用する材料は、乳汁中に含まれる直径1～10数μmの乳脂肪球を除去できる空隙を有していることが好ましい。第3部分は、試料溶液が孔径数10～数100nmの多孔性のメンブレンからなる上記第2部分の上流側に配置されている必要があり、試料溶液が最初に接触・通過できる位置である、上記第1部分の上流側に配置されていることが好ましい。
　第3部分が有する空隙は乳脂肪球を分離できる大きさであればよく、保持粒子サイズは好ましくは0.1から10μmであり、より好ましくは1から3.5μmである。材料は上記の範囲の空隙を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはセルロース誘導体等繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等である。保持粒子サイズとは、そのサイズ以上の粒子サイズを有する乳脂肪球が空隙を通過できずに第3部分に保持される乳脂肪球の粒子サイズのことであり、第3部分の空隙の平均ポアサイズに実質的に対応しているが、そのサイズ以上の粒子サイズを有する乳脂肪球の50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、特に好ましくは90％以上、最も好ましくは98％以上が空隙を通過できずに第3部分に保持される。保持される乳脂肪球の割合は当業者に周知の方法で測定することができる。例えば、GEヘルスケアバイオサイエンス社から提供されているGF/Bは保持粒子サイズ（保持効率98％の粒子直径のこと。本明細書で保持粒子サイズというときは、特に記載した場合を除き、この意味である。）が1.0μmであることが同製品カタログにおいて明らかにされているが、当業者に周知の方法で上記の粒子サイズを確認することが可能である。
　上記第3部分は、特定の保持粒子サイズを有する材料のみを用いてもよく、乳脂肪球の分離効率を高めるために保持粒子サイズが大きいものから小さいものを段階的に張り合わせて用いてもよい。上記第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材により構成される場合は本発明の好ましい態様であり、第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい場合は本発明のさらに好ましい態様である。第3部分を2種の部材により構成する場合には、下流に配置された第一の部材の保持粒子サイズが1.0～2.0μmであり、上流に配置された第二の部材の保持粒子サイズが3.0～3.5μmであることが好ましい。高濃度で広い粒径分布を有する乳脂肪球を含む乳汁、好ましくは搾乳後の未希釈の乳汁から特定物質を高感度に検出するためは、第3部分を保持粒子サイズの小さな部材と保持粒子サイズの大きな部材との組み合わせにより構成することが好ましい。
　上記第1部分には、特定物質に対する標識された第一の抗体、または標識された特定物質が保持されている。第1部分に、特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている場合には、サンドイッチアッセイ法により特定物質を検出することができる。また、第1部分に標識された特定物質が保持されている場合には、競合法により特定物質を検出することができる。本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法の方が好ましいことから、第1部分には、特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されていることが好ましい。
　第1部分に特定物質に対する標識された第一の抗体を保持させる場合には、特定物質に対する第一の抗体と、特定物質に対する第二の抗体の、2種類の抗体を用いる。サンドイッチアッセイ法により特定物質を検出することができるように、上記第一の抗体と上記第二の抗体は、当該特定物質に同時に結合できることができる抗体であり、上記第一の抗体が認識する当該特定物質のエピトープは、上記第二の抗体が認識する当該特定物質のエピトープとは異なることが好ましい。
　本発明において、検出可能な信号を得るために、第1部分に保持される第一の抗体または特定物質は標識されている。本発明で用いる標識としては、着色粒子、酵素、ラジオアイソトープなどが挙げられるが、特殊な設備不要で目視によって検出可能な着色粒子を使用することが好ましい。着色粒子としては、金や白金などの金属微粒子、非金属粒子、ラテックス粒子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。着色粒子は、試験片の空隙内を通って下流に輸送されることができるサイズであればいかなるサイズでもよいが、直径が1nmから10μmが好ましい。より好ましくは、5nmから1μmであり、さらに好ましくは10nmから100nmである。
［検出対象］
　本発明により、乳汁中のStreptococcus菌を検出できる。本発明でStreptococcus属の菌というときは、特に記載した場合を除き、Streptococcus uberis、Streptococcus agalactiae、Streptococcus dysgalactiae、Streptococcus equinus、Streptococcus canis、Streptococcus bovis、Streptococcus pluranimalium、Streptococccus parauberis、Streptococcus mutans、Streptococcus acidominimusが含まれる。本発明においては、溶菌酵素と界面活性剤が適切に配合された溶菌剤を用いることにより、牛等の家畜から得られた、脂肪球と高濃度のタンパク質を含有する乳汁そのものに含まれるStreptococcus 属の菌を検出することができる。
　本発明で測定される特定物質は、イムノクロマトグラフ法等の免疫学的な方法で測定できる物質であれば何れでも可能であるが、細菌の成分または細菌が分泌する物質であることが好ましい。さらに好ましくは、細菌のL7/L12リボゾームタンパク質である。L7/L12リボソームタンパク質は、細胞内に多コピー存在するために検出感度が高い。
［抗体］
　本発明に用いる抗体は、国際公開第00/06603号パンフレットに記載の方法で作製することができる。細菌リボゾームタンパク質L7/L12を抗原とする場合は、細菌リボゾームタンパク質L7/L12の全長タンパク質あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作製することができるが、全長タンパク質を抗原として作製することが好ましい。この部分ペプチドあるいは全長タンパク質をそのまま、またはキャリアタンパク質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでL7/L12リボソームタンパク質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、抗体としてはハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法により取得したモノクローナル抗体を適用することがより好ましいが、この場合はマウスが好ましい。当該モノクローナル抗体として、乳房炎の原因となる特定の細菌のリボゾームタンパク質L7/L12と反応し、前記特定の細菌以外の乳房炎の原因となる細菌のリボゾームタンパク質L7/L12とは反応しないモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、当該細菌による感染症にかかっているかどうかの診断に役立てることが可能となる。
　抗体が乳房炎の原因となる特定の細菌の成分または該細菌が分泌する物質と反応し、前記特定の細菌以外の乳房炎の原因となる細菌の成分または該細菌が分泌する物質とは反応しないモノクローナル抗体であれば、リボゾームタンパク質L7/L12以外を抗原として認識する抗体であっても使用することができる。
　また、モノクローナル抗体としては、乳汁中に含まれる特定物質以外の夾雑物により抗原抗体反応が阻害されないモノクローナル抗体を用いることが好ましい。例えば、乳汁中にはカゼインなどのタンパク質が大量に含まれており、特定物質とモノクローナル抗体との反応を阻害する場合がある。特定物質に対するモノクローナル抗体を常法により製造するにあたり、例えばカゼインなどにより抗原抗体反応が阻害を受けないモノクローナル抗体や、抗原抗体反応への影響が少ないモノクローナル抗体を適宜選択して用いることが好ましい場合がある。このようなモノクローナル抗体は、通常の方法に従って抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を製造した後に、カゼインなどの夾雑物の存在下で抗原抗体反応が阻害されるか否かを調べて、実質的に反応の阻害を受けないモノクローナル抗体を選択することにより容易に取得することができる。
　実施例1：
(1)リボゾームタンパク質L7/L12抗体の作製　国際公開WO00/06603号パンフレットの実施例に記載の方法に準じて、L7/L12リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。当該モノクローナル抗体は、上記L7/L12リボゾームタンパク質の別のサイトに同時に結合しうる2種の組合せを選択した。
(2)ELISAによる溶菌活性の評価　S. uberisまたはS. agalactiae菌を1×109（cells/ml）となるように生理食塩水で調整して菌調整液とした。また、表1に示す6種の酵素は、1 mg/mlあるいは10 mg/mlとなるように各バッファーと市販の牛乳を体積比1：1で混合した液を用いて希釈し、酵素調整液とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 *1: β-N-Acetyl-D-glucosaminidase Activity: 19.13 U/g・powder    Protein: 24.00 mg/protein/g-powder    Lysis of lactic acid bacterium cells by 0.5%(w/v)Labiase
*2: 力価0.8mgリゾチーム/mg以上（和光純薬製品規格）
*3: > 80units/mg protein
　陽性コントロールとして、S. uberis菌またはS. agalactiae菌を、非イオン性界面活性剤TritonX-100を1％含むMOPSOバッファー（0.1M）中で終夜撹拌した後、超音波処理（出力10％、1min×10回）することにより得た菌調整液を用いた。
　10μg/mlのモノクローナル抗体-1（0.05％NaN3/PBS）50μlを96穴ELISAプレート（Nunc社Maxisorp ELISAプレート）に分注し4℃で一晩吸着させた。上澄み除去後、1％牛血清アルブミン溶液（PBS中）200μlを添加し、室温で1時間反応させてブロッキングした。上澄み除去後、洗浄液（0.05％Tween20/PBS）で数回洗浄した。
　先に準備した菌調整液と酵素調整液を体積比1：1となるように混合し、37℃インキュベータで1時間処理した。これを0.05％Tween20/PBSで100倍希釈し、プレートに50μl添加し、37℃にて1時間反応させた。上澄み液を除去し洗浄液で数回洗浄後、パーオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体-2（1μg/ml、0.05％Tween20/PBS）を50ul添加し、室温にて1時間反応させた。上澄み除去後さらに洗浄液で数回洗浄したのち、TMB溶液（KPL社製）を100μlずつ加え室温で10分間反応させ、1mol/lの塩酸を100μl添加して反応を停止したのち450nmにおける吸光度を測定した。
　陽性コントロールでの溶菌率を100％として、陽性コントロールの吸光度との比から、各酵素による溶菌率を算出した。5％以上の溶菌率を有するものを＋、溶菌率が5％未満のものを－とし、結果を表2に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　リゾチームおよびラビアーゼは、単独で双方の菌に効果があった。β-Nアセチルグルコサミニダーゼは、単独でS. agalactiaeに対して効果があった。
　実施例2：
　終濃度がラビアーゼ0.5mg/ml、リゾチーム4.5mg/mlとなるように、クエン酸-リン酸Naバッファー/牛乳（混合体積比1：1）を用いて調整し、上記方法と同様に菌を処理した。ELISAにより溶菌率を算出した結果を図1に示す。すると、リゾチームやラビアーゼ単体の使用ではS. uberisまたはS. agalactiaeのどちらかの菌には不十分な溶菌活性であったものが、ある濃度範囲で混合して併用することにより、いずれの菌も高効率で溶菌できることが明らかとなった。
　実施例3：イムノクロマトグラフ装置の作製
　イムノクロマトグラフ装置は以下のように作製できる。（a）金コロイド標識含浸部材　BBInternational社製金コロイド溶液(粒径60nm)0.9mlに0.1M リン酸カリウム pH7.0を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体-1を100μg/ml加え室温で10分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%となるようにウシ血清アルブミン（BSA）10%水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をBSAでブロッキングして、金コロイド標識したモノクローナル抗体-1（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製する。この溶液を遠心分離（15000×rpm、5分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得る。この金コロイド標識抗体を0.25%BSA、2.5%スクロース、35mM NaClを含有する20mMトリス塩酸緩衝液（pH7）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得る。10mm×300mmの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液2mlを含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材1（第1部分）とする。
（b）抗原および金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位　　幅25mm、長さ300mmのニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体2（第2部分）として用意する。　モノクローナル抗体-2 1.5mg/mlが含有されてなる溶液を、このクロマト展開用膜担体2におけるクロマト展開開始点側の末端から10mmの位置に1μl/cmでライン状に塗布して、これを50℃で30分間乾燥し、その後、0.5％スクロース溶液に30分浸し、一晩室温で乾燥させた。リボソームタンパク質 L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位3とする。
（c）イムノクロマトグラフ装置の作製　イムノクロマトグラフ装置断面図を図2に示す。上記標識抗体含浸部材1、上記クロマト展開用膜担体2の他に、試料添加用部材と脂肪球除去用部材（第3部分）とを兼ねる部材として25mmのGF/DVA（GEヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み776μm、保持粒子サイズ3.5μmのフィルター部材4）および20mmのGF/AVA（GEヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み299μm、保持粒子サイズ1.7μmのフィルター部材7）を貼り合わせ、さらに、吸収用部材5として濾紙を用意する。そして、これらの部材を基材6（厚さ254μm、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたもの）に貼り合せた後、5mm幅に切断し、イムノクロマトグラフ装置を作製する。
　実施例4：イムノクロマトによる評価１
　イムノクロマト装置による牛乳汁の測定は以下の様に行った。マイクロチューブに終濃度1×１０５（ＣＦＵ／ｍｌ）のストレプトコッカス　ウベリスを添加した乳汁を３００μｌ分取し、溶菌処理液を５００μｌ添加し、室温で３０分間処理した。牛乳汁は市販の飲用品を用いた。同混合溶液に上記イムノクロマトグラフ装置を試料添加用部材4から浸漬して、室温で30分静置して展開後、上記補足部位3で補足されたリボソームタンパク質L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉の有無を捕捉量に比例して増減する赤紫色のライン強度を測定した。各条件における溶菌効率を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ラビアーゼのみを使用した条件１と比較して、リゾチームを併用した条件２や、さらに界面活性剤としてポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであるＴｗｅｅｎ２０を添加した条件３では、溶菌効率が向上していることが明らかとなった。また、非特許文献１に開示されている条件（比較例３）を追試したところ、低い溶菌効率が認められた。
　実施例5：イムノクロマトによる溶菌活性の評価2
　ラビアーゼに併用するリゾチームの添加量について、実施例４と同様の手順で評価した。結果を表４に示す。リゾチームを適量添加すると、溶菌効率が向上する事が確かめられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　実施例6：イムノクロマトによる界面活性剤濃度の評価
　界面活性剤の濃度について、実施例４と同様に評価した結果を表５に示す。ＴｒｉｔｏｎＸ１００とＴｗｅｅｎ２０の添加量を適切化することにより、溶菌効率がさらに向上することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　実施例7：牛乳汁中の生菌の検出感度
　牛乳に各濃度のストレプトコッカスウベリスを添加した検体を、条件１および条件１０の溶菌剤により処理し、イムノクロマトによる測定を実施した。出現した赤紫色のラインを目視により判定した（強陽性＋＋、陽性＋、陰性－）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　実施例8：添加剤による溶菌効率の向上
　実施例６に記載の条件９に記載の溶菌剤に、さらに種々の添加剤を加え溶菌効率を評価した結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 ※モノカプリリン：東京化成工業(株)製　1-モノオクタノイルグリセロール
　本発明により、イムノクロマト法などによる家畜乳房炎の迅速診断に利用することができる。

Claims (14)

  1. 　乳汁中のストレプトコッカス属の菌の溶菌方法であって、
    　乳汁に、リゾチーム、ラビアーゼおよび非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程、または
    　乳汁に、リゾチーム、ラビアーゼおよびβ-N-アセチルグルコサミニダーゼからなる群より選択される少なくとも一つを含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程であって、このときストレプトコッカス属の菌が、ストレプトコッカス　アガラクチアである、工程
    を含む、溶菌方法。
  2. 　該菌が、ストレプトコッカス　ウベリスまたはストレプトコッカス　アガラクチアである、請求項１に記載の溶菌方法。
  3. 　該非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよび／またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する、請求項１または２に記載の溶菌方法。
  4. 　乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、該非イオン界面活性剤の終濃度が、0.03％以上3％以下である、請求項１～３のいずれか１項に記載の溶菌方法。
  5. 　乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、該リゾチームの終濃度が、0.5mg/ml以上200mg/ml以下であり；および／または
    　乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、該ラビアーゼの終濃度が、0.05mg/ml以上20mg/ml以下である、請求項４に記載の溶菌方法。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に定義した、乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程
    を含み、および
    　溶菌により放出された菌体内由来の特定物質を検出する工程
    をさらに含む、乳汁中のストレプトコッカス属の菌の検出方法。
  7. 　検出方法が、イムノクロマトグラフ方法により実施される請求項６に記載の方法。
  8. 　該イムノクロマトグラフ方法が、（1）特定物質を含む乳汁を、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第3部分またはそれより上流部に接触させる工程；および（2）該乳汁を該第2部分またはそれより下流部まで流し、該第2部分またはそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程：を含む、請求項７に記載の検出方法。
  9. 　該第1部分に、該特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている、請求項８に記載の検出方法。
  10. 　第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材より構成されている、請求項８または９に記載の検出方法。
  11. 　第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい、請求項１０に記載の検出方法。
  12. 　請求項１～５のいずれか１項に定義された、溶菌剤。
  13. 　家畜の乳房炎を診断する方法において用いるための、請求項１２に記載の溶菌剤。
  14. 　請求項１２または１３に記載の溶菌剤と、
    　該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ装置と
    を含む、乳汁中のストレプトコッカス属の菌の検出用キット。
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