CN114609387A - 抗体结合生物膜干涉技术的单增李斯特菌快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗体结合生物膜干涉技术的单增李斯特菌快速检测方法，包括以下步骤：一、传感器平衡；二、传感器活化；三、抗体固定化；四、一次封闭；五、二次封闭；六、样品检测及结果分析。本发明所述方法步骤少、无标记、实时监测、结果判断简单；操作简单易学，仅需要向样品板中添加配置好的试剂及制备好的样品即可上机检测，实时读取结合信号即可判断单增李斯特菌的存在；单增李斯特菌抗体可回收后重复使用，从而降低成本；配合相应的BLI系统，本发明可实现多个样品的同时检测；具有较好的特异性，可排除样品中非目标菌的干扰；检测时间短，根据样品中所含单增李斯特菌浓度的不同，单纯的样品检测环节只需要几分钟的时间。

Description

抗体结合生物膜干涉技术的单增李斯特菌快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种单增李斯特菌的快速检测方法，特别涉及抗体结合生物膜干涉技术的单增李斯特菌快速检测方法。

背景技术

单增李斯特菌属于革兰氏阳性李斯特菌，对低温、低pH和高盐浓度等极端条件的耐受性强。可引起一种严重的食源性疾病——李斯特菌病，它在老人、孕妇和免疫功能低下等人群中致死率高达20％-30％。此外，感染单增李斯特菌后，其潜伏期最长可达67天，这使得追踪单增李斯特菌暴发的源头变得极其困难。据统计，人类感染单增李斯特菌的主要来源为即食食品，其次是原奶和乳制品，以及海鲜产品。当每克食物中超过100个单增李斯特菌时，就有可能使人类感染李斯特菌病，因此，控制病原体和防止食物污染是当务之急。传统的培养方法是目前检验的金标准，但费时费力，不能满足批量检验的需要。因此，需要对食品中单增李斯特菌进行快速检测。分子生物学检测法耗时短而且大大降低了目标菌的检出限，但在实际的操作过程中需要专门的仪器和具有专业训练的实验操作人员，此外，由于实验过程中会存在靶细胞裂解、核酸降解等干扰，可能会导致假阴性结果。基于免疫的比色分析方法与传统的培养方法相比具有高通量和高特异性。然而，它们的灵敏度远远落后，因此，可能需要对单增李斯特菌进行富集。因此，为减少相关食源性疾病的发生，更为快速便捷、灵敏准确且易于操作的单增李斯特菌的新型检测方法亟需开发。

生物膜干涉(biolayer interferometry，BLI)技术是一种用于测量生物分子间相互作用的、实时的、灵敏且无标记的光学分析技术。该方法利用光纤生物传感器来实时检测分子结合与解离时传感器光学层厚度的变化。目前，生物膜干涉技术已经实现蛋白质-小分子、受体-病毒等相互作用的实时无标记检测。该技术采用无微流控系统，具有高灵敏度、免标记、快速、简便、可实时提供检测结果等优点，非常适合于对食源性致病菌进行快速、灵敏的检测。

本发明以抗体作为第二代氨基偶联传感器的生物识别元件对单增李斯特菌进行识别检测。若样品中存在单增李斯特菌，则菌体会被固定在表面的抗体特异性识别并结合，使传感器光学层厚度增加，干涉光谱产生位移，产生的响应信号被光谱仪实时检测记录从而实现单增李斯特菌的实时无标记快速检测。

发明内容

本发明的目的是为解决传统检测单增李斯特菌方法中步骤多、操作繁琐等问题而提供的抗体结合生物膜干涉技术的单增李斯特菌快速检测方法。

本发明提出了抗体结合生物膜干涉技术的单增李斯特菌快速检测方法。该方法包括传感器平衡、传感器活化、抗体固定化、一次封闭、二次封闭、样品检测及结果分析，其具体步骤如下：

步骤一、传感器平衡：将第二代氨基偶联传感器末端浸入纯水中预湿至少10分钟，以平衡传感器；

步骤二、传感器活化：将平衡后的第二代氨基偶联传感器浸入20mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和10mM N-羟基琥珀酰亚胺混合试剂中活化300-450秒；

步骤三、抗体固定化：将活化后的第二代氨基偶联传感器浸入用pH 4-6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释的浓度为12.5-100μg/mL的单增李斯特菌抗体溶液中固定化400-900秒；

步骤四、乙醇胺盐酸盐溶液一次封闭：将固定单增李斯特菌抗体后的第二代氨基偶联传感器浸入乙醇胺盐酸盐溶液(pH 8.5,1mol/L)中封闭300-450秒；

步骤五、牛血清白蛋白溶液二次封闭：将乙醇胺盐酸盐封闭后的第二代氨基偶联传感器浸入1％牛血清白蛋白溶液中封闭300-450秒；

步骤六、样品检测及结果分析：在牛血清白蛋白溶液中封闭后，将第二代氨基偶联传感器浸入含0.02％吐温-20的PBS磷酸盐缓冲溶液中平衡150-450秒，然后将其浸入样品中进行单增李斯特菌的检测，实时读取结合信号。对于定性分析，当结合信号大于等于有效信号值7.5pm时即可判定样品中含有单增李斯特菌；对于定量分析，将结合时间为3分钟、6分钟、9分钟、12分钟、15分钟时的结合信号y分别代入到下述菌浓度和结合信号间的数学公式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)：

C₃＝10^{ln(16.0772y+36.4640)^1.21041} (1)

C₆＝10^{ln(4.3871y+18.6685)^1.38114} (2)

C₉＝10^{ln(2.2272y+14.7671)^1.48963} (3)

C₁₂＝10^{ln(1.7052y+9.7888)^1.52373} (4)

C₁₅＝10^{ln(1.5160y+6.0640)^1.52825} (5)

求解所得C即为样品中单增李斯特菌的具体浓度，其中C₃、C₆、C₉、C₁₂和C₁₅分别代表结合时间为3分钟、6分钟、9分钟、12分钟和15分钟时求得的菌浓度，结合时间为3分钟、6分钟、9分钟、12分钟和15分钟时所对应的单增李斯特菌的最低检出限分别是1.32×10⁶CFU/mL、2.79×10⁵CFU/mL、1.37×10⁵CFU/mL、5.62×10⁴CFU/mL和2.34×10⁴CFU/mL。

本发明的有益效果：

本发明提供的抗体结合生物膜干涉技术的单增李斯特菌快速检测方法步骤少、无标记、实时监测、结果判断简单；操作简单易学，仅需要向样品板中添加配置好的试剂及制备好的样品即可上机检测，实时读取结合信号即可判断单增李斯特菌的存在；醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释后的单增李斯特菌抗体可回收后重复使用，从而降低检测成本；可实现高通量检测，配合相应的生物分子相互作用仪及配套使用的样品板，可实现多达95个样品的同时检测；具有较好的特异性，可排除样品中非目标菌的干扰；检测时间短，根据样品中所含单增李斯特菌浓度的不同，单纯的样品检测环节只需要几分钟的时间。例如当样品中的单增李斯特菌浓度在1.32×10⁶CFU/mL时，仅仅需要3分钟即可判断出样品中有单增李斯特菌的存在。

附图说明

图1为本发明所述检测方法的特异性检测结果示意图。

图2为本发明所述检测方法结合时间为3分钟、6分钟、9分钟、12分钟和15分钟时单增李斯特菌菌浓度和结合信号间的标准曲线图。

具体实施方式

下面写出具体的实施例，并给出更详细的实施步骤，实施例均按照本技术方案进行实施，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照试剂制造厂商所建议的条件。

实施例中用到的主要材料与试剂见表1，主要仪器设备见表2。

表1主要材料与试剂信息表

表2主要仪器设备信息表

实施例1：本技术方案的特异性考察

以单增李斯特菌为目标菌，以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌为非目标菌进行检测分析，具体步骤如下：

(1)用接种环将单增李斯特菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌分别接种到已灭菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，37℃、200rpm振荡培养15-18小时。将菌悬液离心，弃上清液后用PBS磷酸盐缓冲溶液洗涤两次，然后用含0.02％吐温-20的PBS磷酸盐缓冲溶液将单增李斯特菌的菌悬液浓度调整至1.6×10⁷CFU/mL和3.2×10⁶CFU/mL，将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌菌悬液浓度调整为8×10⁷CFU/mL，按顺序加入到96孔板对应的孔当中，待测。

(2)在96孔板相应位置依次加入纯水、20mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和10mM N-羟基琥珀酰亚胺的混合试剂、pH 4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释的浓度为50μg/mL的单增李斯特菌抗体溶液、乙醇胺盐酸盐溶液(pH 8.5,1mol/L)、1％的牛血清白蛋白溶液、含0.02％吐温-20的PBS磷酸盐缓冲溶液以及待检样品。

(3)提前将第二代氨基偶联传感器水合(传感器末端浸入纯水中)9分钟，然后将加样的96孔板放入Octet Red 96分子相互作用仪，运行系统。第二代氨基偶联传感器末端依次浸入纯水(60秒)、20mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和10mM N-羟基琥珀酰亚胺的混合试剂(300秒)、pH 4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释的浓度为50μg/mL的单增李斯特菌抗体溶液(400秒)、乙醇胺盐酸盐溶液(pH 8.5,1mol/L)(300秒)、1％的牛血清白蛋白溶液(300秒)、含0.02％吐温-20的PBS磷酸盐缓冲溶液(180秒)及待测样品(900秒)，系统运行时可实时观察到各步骤的相关情况。

(4)检测结果如图1所示，目标菌单增李斯特菌样品的信号值远在有效信号值(7.5pm)之上，而非目标菌大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌均无显著的结合信号，说明该方法具有较高的特异性。

实施例2：冰淇淋样品中单增李斯特菌的检测

(1)在冰淇淋样品中添加单增李斯特菌，调整最终浓度为1.6×10⁷CFU/mL得到所需的待测样品。

(2)(3)步骤同实例1中的(2)(3)。

(4)仪器运行时可实时观察检测信号值，检测到的结合信号值代入到菌浓度和结合信号间的数学公式计算可得回收到的菌浓度。表3为不同结合时间下目标菌的回收率试验结果，从表中可以看出回收率都在100％附近，说明该方法用于实际样品检测也有很高的准确率。另外，通过比较不同结合时间下菌的回收率可以看出随着结合时间的延长，菌的回收率也更加接近于100％，说明结合时间的延长可以在一定程度上使得检测结果更加准确。

表3冰淇淋样品中所添加目标菌的回收率试验结果

Claims (1)

1.抗体结合生物膜干涉技术的单增李斯特菌快速检测方法，其特征在于：包括传感器平衡、传感器活化、抗体固定化、一次封闭、二次封闭、样品检测及结果分析，其具体步骤如下：

步骤一、传感器平衡：将第二代氨基偶联传感器末端浸入纯水中预湿至少10分钟，以平衡传感器；

步骤二、传感器活化：将平衡后的第二代氨基偶联传感器浸入20mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和10mM N-羟基琥珀酰亚胺混合试剂中活化300-450秒；

步骤三、抗体固定化：将活化后的第二代氨基偶联传感器浸入用pH 4-6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释的浓度为12.5-100μg/mL的单增李斯特菌抗体溶液中固定化400-900秒；

步骤四、乙醇胺盐酸盐溶液一次封闭：将固定单增李斯特菌抗体后的第二代氨基偶联传感器浸入乙醇胺盐酸盐溶液(pH 8.5，1mol/L)中封闭300-450秒；

步骤五、牛血清白蛋白溶液二次封闭：将乙醇胺盐酸盐封闭后的第二代氨基偶联传感器浸入1％牛血清白蛋白溶液中封闭300-450秒；

步骤六、样品检测及结果分析：在牛血清白蛋白溶液中封闭后，将第二代氨基偶联传感器浸入含0.02％吐温-20的PBS磷酸盐缓冲溶液中平衡150-450秒，然后将其浸入样品中进行单增李斯特菌的检测，实时读取结合信号，对于定性分析，当结合信号大于等于有效信号值7.5pm时即可判定样品中含有单增李斯特菌；对于定量分析，将结合时间为3分钟、6分钟、9分钟、12分钟、15分钟时的结合信号y分别代入到下述菌浓度和结合信号间的数学公式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)：

C₃＝10^{ln(16.0772y+36.4640)^1.21041} (1)

C₆＝10^{ln(4.3871y+18.6685)^1.38114} (2)

C₉＝10^{ln(2.2272y+14.7671)^1.48963} (3)

C₁₂＝10^{ln(1.7052y+9.7888)^1.52373} (4)

C₁₅＝10^{ln(1.5160y+6.0640)^1.52825} (5)

求解所得C即为样品中单增李斯特菌的具体浓度，其中C₃、C₆、C₉、C₁₂和C₁₅分别代表结合时间为3分钟、6分钟、9分钟、12分钟和15分钟时求得的菌浓度，结合时间为3分钟、6分钟、9分钟、12分钟和15分钟时所对应的单增李斯特菌的最低检出限分别是1.32×10⁶CFU/mL、2.79×10⁵CFU/mL、1.37×10⁵CFU/mL、5.62×10⁴CFU/mL和2.34×10⁴CFU/mL。

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