DE3835784C1 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Legionella-Antigenen in Körperflüssigkeiten, in Gewebehomogenaten oder in anderen Legionella-Antigene enthaltenden Flüssigkeiten mit hierzu spezifischen Antikörpern unter Ausbildung eines markierten Antigen/Antikörper-Komplexes und dessen Erfassung anhand üblicher Immunoassays. Ferner betrifft sie einen besonders geeigneten Testkit zur Durchführung dieses Verfahrens.

Seit der Erstbeschreibung der Legionellose bestand das dringende Bedürfnis nach einem schnellen diagnostischen Verfahren zum Nachweis einer Legionellenerkrankung. Verfahren zum Nachweis von Legionella- Antigen wurden bereits vorgestellt, unterlagen aber der Einschränkung, daß sie einen nur engen Erregerbereich erfaßten und bisher aufgrund technischer Schwierigkeiten nicht für den Markt entwickelt werden konnten. So lagen die grundsätzlichen Probleme u. a. darin, daß keine Antikörper erzeugt werden konnten, die in "vivo prozessiertes" Antigen (z. B. Urinantigen) "genus-weit" erkennen konnten.

Verfahren der oben beschriebenen Art sind bekannt, so beispielsweise aus den Literaturstellen Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. (A) 1983, 225: 102-107, J. Clin. Microbiol. 1984, 20: 605-607, J. Infect. Dis. 1984, 152: 1007-1012, Ann. Microbiol. (Paris), 1983, 134A: 155-161, Am. J. Med. 1982, 72: 576-582 und J. Clin. Microbiol. 1982, 16: 1007-1011. Dabei spielt es keine wesentliche Rolle, in welcher Art von Flüssigkeiten die Legionella-Antigene vorkommen und nachgewiesen werden sollen, d. h., es kann es sich um Körperflüssigkeiten, wie Sputen, Trachealabsaugen, Serum, Liquor, Pleuraflüssigkeit oder Gewebehomogenate, z. B. aus Lunge, Herz oder Geweben anderer Organe, handeln. Grundsätzlich gestattet das Verfahren auch den Nachweis von Legionella-Antigenen in potentiell legionellahaltigen Flüssigkeiten, wie Trinkwasser, Oberflächenwasser, Industrieabwässer oder technisch genutztes Wasser zur Kühlung oder Befeuchtung oder andersartig genutztes Wasser aus wassertechnischen Anlagen.

In der Vergangenheit wurden von zahlreichen Arbeitsgruppen bereits Immunoassays entwickelt, die auf der Basis polyklonaler oder monoklonaler Antikörper den Nachweis von Legionella-Antigenen in Körperflüssigkeiten bezweckt haben. Diese Verfahren gehen bei der Antikörpergewinnung stets von der Bakterienzelle aus, die entweder ganz oder desintegriert zur Gewinnung der Antikörper-Fraktionen benutzt wurde. Die so gewonnenen Antikörper hatten den Nachteil, daß sie die in Körperflüssigkeiten vorliegenden Legionella-Antigene, die prozessiert sind, häufig nicht erfaßten. Auch waren sie ungeeignet, einen "genus-weiten" Nachweis verschiedenster Legionella-Bakterien zu gewährleisten. Dabei war nicht bedacht worden, daß die prozessierten Antigene häufig nur wenig antigenbindende Stellen aufweisen, wobei sie konservierte und auch neue antigene Determinanten tragen. Bei der Etablierung eines neuen Testsystems war es insbesondere wichtig, alle potentiell als Krankheitserreger beim Menschen in Betracht kommenden Legionella- Arten in einem universellen Test zu erfassen. Es bestand somit kein Test zur Verfügung, der es gestattete, Legionella-Antigene im Urin genus-weit zu erfassen.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, einen Test zu entwickeln, der über die bisherigen Verfahren insoweit hinausgeht, als er breiter anwendbar ist und alle bisher bekannten humanpathogenen Legionellen bzw. deren produzierte Antigene in Flüssigkeiten der oben beschriebenen Art nachweist.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß der Immunoassay hauptsächlich auf die Erfassung einer in vivo oder in vitro prozessierten Antigen-Fraktion eines apparenten Molekulargewichts von etwa 68 und/oder etwa 25 kDa, bestimmt durch die SDS-PAGE-Methode, ausgerichtet ist.

Die vorliegende Erfindung wurde wie folgt entwickelt: Zunächst wurden die Legionella-Antigene im Urin charakterisiert, wobei mittels Westernblottechnik die genus-weit kreuzreagierenden Antigene identifiziert wurden. Dabei konnte gezeigt werden, daß hauptsächlich zwei Molekulargewichtsfraktionen im Bereich von etwa 68 und 25 kDa (bestimmt mit dem SDS-PAGE-Verfahren) genus-weit kreuzreagieren. Diese Fraktionen können daher als ein weitgehend allen Spezies gemeinsames Antigen (common antigen) angesehen werden. Durch diese Untersuchung wurde somit die neue Erkenntnis gewonnen, daß ein in bisherigen Untersuchungen nicht festgestelltes "common antigen" vom Molekulargewicht von etwa 68 kDa im Urin vorliegt, was offenbar in der aufgeschlossenen Bakterienzelle nicht nachgewiesen werden kann. Gleichzeitig wurde erstmals gezeigt, daß im Zuge der menschlichen Legionellose eine Vielzahl unterschiedlicher Antigene im Urin mittels Immunoblottechnik identifiziert werden konnten. Es muß offenbleiben, ob das im Urin nachgewiesene "common antigen" eines Molekulargewichts von etwa 25 kDa mit dem in aufgeschlossenen Legionella-Zellen nachgewiesenen "common antigen" identisch ist.

Wenngleich den 25- und 68-kDa-Antigenfraktionen für die genus-weite Erfassung von prozessierten Legionella-Antigenen die größte Bedeutung für den Test zukommt, so wurden auch die übrigen erstmals von uns identifizierten und charakterisierten und teilweise prozessierten Urinantigenfraktionen im Bereich der Molekulargewichte etwa 100 bis 10 kDa bei der Schaffung eines zweckmäßigen Capture-Antikörpers berücksichtigt. Diesbezüglich wurde sichergestellt (Immunoblot-Verfahren), daß die zur Erzeugung der Capture-Antikörper benutzte "Vaccine" eine möglichst ausgeprägte Immunantwort, auch gegenüber den übrigen Urinantigenen der Fraktionen (100 bis 10 kDa) erzeugt. Diese, wohl nicht "genus-weite" z. T. aber "interspezies-weit" kreuzreagierenden Antikörper steigern, wie durch Versuche belegt wurde, erheblich die Empfindlichkeit des hier vorgestellten Tests.

Es ist durch Versuche belegt worden, daß Legionella-Antigene auch bei anderen Körperflüssigkeiten und dergleichen erfindungsgemäß nachgewiesen werden können, wie beispielsweise im Blut, Gewebehomogenat und in anderen Körperflüssigkeiten. Ferner ist in Immunoblotversuchen gezeigt worden, daß auch nicht prozessiertes Antigen, wie es in bakteriellen Zellaufschlüssen oder in Untersuchungsmaterialien aus anderen Keimquellen von Legionellen zur Verfügung steht, wie z. B. Umweltproben, Schwimmbadwasser oder anderen bereits oben bezeichneten Flüssigkeiten, erfindungsgemäß erfaßt werden kann.

Das Wesen der vorliegenden Erfindung liegt demzufolge in der Erkenntnis, daß die erwähnten Antigen-Fraktionen des apparenten Molekulargewichts von etwa 68 und/oder 25 kDa genus-weite Erfassung der Legionella-Antigene möglich ist. Auf die daraus resultierenden Vorteile wird später noch eingegangen werden. Um diesen Kerngedanken der Erfindung zu verwirklichen, ist man auf keinen speziellen Immunoassay beschränkt. Vielmehr ist der Fachmann anhand seiner allgemeinen Kenntnisse ohne weiteres im Stande, für den jeweiligen Anwendungsfall den besonders geeigneten Immunoassay zu wählen. So kann es sich dabei beispielsweise um einen kompetitiven Immunoassay, aber auch insbesondere um die sogenannten "Sandwich"-Assays handeln. Bevorzugt wird im allgemeinen ein "Sandwich"-Assay. Die nachfolgenden Erörterungen beziehen sich im wesentlichen auf diesen Assay. Sie sollen jedoch gleichermaßen, sofern möglich, auch für andere Immunoassays entsprechend gelten. Auch die Frage der Markierung ist nicht von kritischer Bedeutung. So unterliegt der Hersteller beispielsweise des Antikörper- Konjugats beim erfindungsgemäßen Verfahren keinen wesentlichen Beschränkungen. So kann die Markierung mit Radioisotopen (RIA) mit Enzymen (ELISA) und mit Fluoreszenz-Markern oder jeder anderen chromophoren Gruppe erfolgen. Bevorzugt wird ein Enzymimmunoassay (ELISA). Als Enzym wird vorzugsweise die Peroxidase oder alkalische Phosphatase herangezogen.

Bei der Ausgestaltung des für die Sandwich-Assays heranzuziehenden Antikörper- Konjugats sowie des Capture-Antikörpers lassen sich verschiedene Wege beschreiten. So kann beispielsweise der Capture-Antikörper auf eine möglichst weitgehende Erfassung der prozessierten Antigen- Fraktionen im Untersuchungsmaterial ausgerichtet sein, während das heranzuziehende Antikörper-Konjugat besondere Spezifität gegenüber den prozessierten Antigen-Fraktionen des apparenten Molekulargewichts von etwa 68 und/oder 25 kDa zeigt. Auch läßt sich grundsätzlich umgekehrt verfahren, d. h. die besondere Spezifität liegt beim Capture-Antikörper, während das Antikörper-Konjugat sich weitgehend an allen noch freien Epitope der bereits am Capture-Antikörper gebundenen prozessierten Antigen-Fraktionen anlagern kann. Der Antikörper sollte demzufolge als "Capture" so gestaltet sein, daß er seine Capture-Funktion möglichst optimal erfüllt. Dabei muß bedacht werden, daß er noch so viel Epitope freiläßt, daß das Antikörper-Konjugat in wünschenswertem Umfange gebunden wird. Dieses erfordert, daß der Capture-Antikörper und das Antikörper-Konjugat vorzugsweise unterschiedliche Spezifität aufweisen. Unter Beachtung dieses Grundgedankens wird das erfindungsgemäße Verfahren dadurch optimiert, daß ein Antikörper- Konjugat verwendet wird, das genus-weit Legionella-Antigene bindet und insoweit komplementär zum eingesetzten Capture-Antikörper ist und ferner an noch freie Epitope des vom Capture-Antikörper gebundenen Legionella-Antigens bindet. Selbstverständlich gibt es noch weitergehende Modifizierungen. Bevorzugt wird es allerdings, daß die zuerst erwähnte Variante herangezogen wird. Um hier eine Optimierung zu erreichen, sollten die Antikörper jeweils unterschiedliche Spezifität aufweisen. Detaillierte Ausführungen zu dieser bevorzugten Ausgestaltung gehen aus den nachfolgenden Erörterungen hervor.

Grundsätzlich kann das erfindungsgemäße Verfahren sowohl mit monoklonalen als auch polyklonalen Antikörpern durchgeführt werden. Aufgrund der gemachten Erfahrungen hat es sich jedoch gezeigt, daß polyklonalen Antikörpern im Rahmen der herangezogenen üblichen Immunoassays in diesem Test bisher der Vorzug zu geben ist. Die verwendeten polyklonalen Antikörper gewährleisten nicht nur die Bindung der oben präzise bezeichneten Antigen-Fraktionen, sondern auch die Bindung einer Vielzahl weiterer im Urin nachgewiesener Antigen-Fraktionen und stellen dadurch eine erheblich erweiterte Basis für die Bindung von Antigen mit dem Ergebnis der Steigerung der Empfindlichkeit des Nachweises dar.

Zur Herstellung der gewünschten Antikörper-Kombination (Capture-Antikörper/ Antikörper-Konjugat) kann beispielsweise wie folgt vorgegangen werden:

Zunächst werden solche Antigen-Fraktionen von Legionellen selektiert, die eine besonders optimale Erkennung der Urinantigene im Westernblotverfahren erlauben. Diese Antigen-Fraktionen werden in üblicher Weise zur Immunisierung von Versuchstieren benutzt und die Effektivität einer Antikörperbildung erneut im Immunoblotverfahren überprüft. Die Immunoglobuline, insbesondere die IgG-Fraktion, werden nach üblichen Separationsverfahren aus dem Hyperimmunserum von Tieren gewonnen. Dabei werden die jeweiligen Versuchstiere mit den genannten unterschiedlichen Antigen-Fraktionen immunisiert. Zur Gewinnung des Antiserums, aus dem das Konjugat hergestellt wird, wird vorzugsweise die 68-kDa-Antigen- Fraktion benutzt. Für die Gewinnung der Capture-Antikörper-Fraktion werden in einem Selektionsprozeß solche Antigen-Fraktionen zur Immunisierung benutzt, die sich in der Immunoblotanalyse bei der Erkennung der Urinantigene von Legionellen als besonders effektiv erwiesen haben. Über das präzise vorteilhafte Vorgehen finden sich in dem nachfolgenden Beispiel detaillierte Ausführungen.

Bei der Erfassung des im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgebildeten markierten Antigen/Antikörper-Komplexes spielt es für die Reaktion an Festphasen prinzipiell keine Rolle, welcher der gewonnenen Antikörper als Capture oder Konjugat benutzt und insoweit wahlweise immobilisiert wird. Vorzugsweise ist jedoch der Capture-Antikörper immobilisiert. Dabei ist das Wort "immobilisiert" weitestgehend zu verstehen. So kann der Capture-Antikörper auf einer Kunststoffoberfläche oder beliebigen anderen Trägermaterialien immobilisiert sein. Die äußere Gestalt der festen Phase spielt keine wesentliche Rolle. Es kann sich um plane Oberflächen handeln, jedoch auch um dispergierte Kügelchen oder um Materialien textiler Struktur. In dieser Aufzählung soll keine Beschränkung gesehen werden. Der Vorteil der Immobilisierung des Capture-Antikörpers liegt darin, daß die nachfolgende Erkennungsreaktion an einem definierten Ort abläuft.

Das Antikörper-Konjugat erhält vorzugsweise eine Spezifität gegenüber einer genus-weiten Antigen-Fraktion eines apparenten Molekulargewichts von etwa 68 kDa. Dieser Antikörper kann grundsätzlich in einfacher oder "Doppelsandwichtechnik" zur Detektion benutzt werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise die einfache Sandwich- Technik herangezogen, da hier weniger Fehlermöglichkeiten auftreten.

Die mit der Erfindung erzielbaren Vorteile sind insbesondere wie folgt zu umreißen: Der Vorteil des Tests liegt in einem schnellen Antigennachweis, der mit großer Empfindlichkeit, Spezifität und konventioneller technischer Ausrüstung durchgeführt werden kann. Er eignet sich für die breite Anwendung und die genus-weite Erfassung von Legionella-Antigenen in Körperflüssigkeiten, Gewebehomogenaten und anderen Untersuchungsmaterialien. Prinzipiell läßt sich der Test entweder als Plattentest nach der herkömmlichen ELISA-Technik oder im einfachen Eintauchverfahren mittels eines an Oberflächen fixierten Capture-Antikörpers durchführen. Somit erfüllt der hier entwickelte Test die bisher gestellten Anforderungen. Er kann auf das Format eines käuflichen Tests übertragen werden und erfaßt genus-weit alle bisher bekannten krankmachenden Legionella-Spezies beim Menschen und genügt ferner dem Anspruch eines raschen diagnostischen Verfahrens.

Die Erfindung soll anhand des nachfolgenden Beispiels noch näher erläutert werden.

Beispiel a) ELISA zum Nachweis des Legionella-Urinantigens

Biochemische und immunologische Charakterisierung des Urinantigens verschiedener Legionella-Spezies ergaben "genus-weite" Antigengemeinschaften. Das Urinantigen von Lp (Serogruppe 1) wurde gereinigt und zur Immunisierung von Kaninchen verwendet. Mit diesem Kaninchen-Hyperimmunserum wurden mit der Immunoblot-Technik kreuzreagierende Antigenbanden (Urin) ermittelt und ihre apparenten Molekulargewichte bestimmt. Aus der biochemischen Analyse der kreuzreagierenden (Urin)-Antigene der Molekulargewichtsbereiche 20-30 kDa und 50-70 kDa, ging hervor, daß sie aus dem Abbau der bakteriellen Zellhülle stammten.

Weitere Untersuchungen zur Entwicklung eines ELISA′s für den Frühnachweis von Legionella-Antigenen konzentrieren sich auf zwei Punkte:

• 1. Die Herstellung einer Vaccine (Immunisierung von Kaninchen), die Antikörper hoher Spezifität für Legionellaurinantigen (68/25 kDa) mit genus-weiter Reaktivität induziert.
• 2. Standardisierung eines Immunisierungsverfahrens zur Herstellung eines hochtitrigen Antiserums im Kaninchen und Übertragung dieses Systems auf den Hammel.

b) Herstellung der Vaccine

Die Bakteriensuspension von L. pneumophila, Serogruppe 1, wurde in einem Desintegrator (AEG, Typ DM 68/4-2) mit Glasperlen (⌀ 0,17-0,18 mm) B. Braun Melsungen AG) während 4 min bei CO₂-Kühlung aufgeschlossen. Nach dem Autoklavieren (20 min, 120°C, 1 atü) wurde die Zellhülle, die sich aus der Cytoplasmamembran (CM), dem Peptidoglycan (PG) und der äußeren Membran (OM) zusammensetzt, durch Zentrifugation gewonnen. Die Zellhülle wurde für die Immunisierung in PBS so resuspendiert, daß 1 ml der Suspension 2 mg Protein enthielt - Vaccine 1. Für die weiteren Immunisierungsversuche wurde die Zellhülle nach folgendem Schema fraktioniert:

c) Herstellung der Antiseren und Anwendung im ELISA

Jeweils 0,5 ml der vorbereiteten "Vaccinen" (1-4) wurden 1 : 1 mit komplettem Freudschen Adjuvans gemischt und Kaninchen an verschiedenen Stellen des Rückens subcutan (s. c.) und intramuskulär (i. m.) appliziert. Am 7. Tag erhielten die Tiere noch einmal 1 ml "Vaccine" i. m. Die nachfolgenden Immunisierungen erfolgten mit der gleichen Menge Antigen in 0,5 ml PBS 6 Wochen nach der Primärimmunisierung. An drei aufeinanderfolgenden Tagen wurde das Antigen vom 1. Tag i. m. in die Oberschenkel, am 2. und 3. Tag i. v. (in die Ohrvene) injiziert. Nach einer Woche wurde das gleiche Immunisierungsschema wiederholt. Die Blutentnahme erfolgte 14 Tage nach der letzten Immunisierung.

Die Immunisierung wurde wöchentlich, nach der Blutentnahme aus den Ohrvenen, anhand des mittels Immunoblot erfaßten Bandenmusters der Urinantigene verfolgt. Von besonderer Wichtigkeit war die Erfassung einer Reaktivität gegen die 25- und 68-kDa-Antigene, die mit Antisera der "Vaccine" 1 aus Kaninchen und Hammel in allen untersuchten positiven Urinen nachgewiesen werden konnten. Aus den Antiseren gegen die "Zellvaccine" sowie gegen das gereinigte und fraktionierte Urinantigen der Lp SG-1 wurden IgG-Fraktionen mittels Ionenaustauschchromatographie gewonnen und Peroxidase-Konjugate hergestellt. Hierzu wurden alle IgG-Präparationen gegen das Urinantigen über eine Humanserum- Agarosesäule chromatographiert, um eine eventuell vorhandene Spezifität gegen Humanserum-Proteine zu eliminieren.

Verschiedene Kombinationen von Capture und Konjugat wurden auf Empfindlichkeit und genus-weite Erkennung von Legionella-Urinantigenen in dem sogenannten "Antibody Sandwich Assay" getestet.

Zur Erprobung der genus-weiten Erkennung der Antigene wurden Meerschweinchenurine nach intraperitonealer Infektion mit verschiedenen Legionella Spezies sowie Humanurine von Patienten, bei denen eine Legionellose durch den kulturellen Nachweis gesichert wurde, eingesetzt. Die größte Empfindlichkeit und eine genus-weite Erfassung wurde mit den Antikörpern gegen die Vaccine 1 (als Capture) und den Antikörpern gegen das 68-kDa-Urinantigen (als Konjugat) erreicht. Diese Kombination ergab eine geringe Kreuzreaktivität mit 10fach konzentrierten Meerschweinchenurinen nach einer intraperitonealen Infektion mit E. coli, Ps. aeruginosa, Ps. fluoresces und B. pertussis, die jedoch durch Absorption des Captures mit E. coli aufgehoben werden konnte. Im endgültigen Test werden nur absorbierte Sera verwendet.

Claims (12)

1. Verfahren zum Nachweis von Legionella-Antigenen in Körperflüssigkeiten, in Gewebehomogenaten oder in anderen Legionella-Antigene enthaltenden Flüssigkeiten mit hierzu spezifischen Antikörpern unter Ausbildung eines markierten Antigen/Antikörper-Komplexes und dessen Erfassung anhand üblicher Immunoassays, dadurch gekennzeichnet, daß der Immunoassay auf die Erfassung einer in vivo oder in vitro prozessierten Antigen-Fraktion eines apparenten Molekulargewichts von etwa 68 und/oder etwa 25 kDa, bestimmt durch die SDS-PAGE-Methode, ausgerichtet ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ausbildung des markierten Antigen/Antikörper-Komplexes mindestens zwei Antikörper unterschiedlicher Spezifität verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Legionella- Antigene aus Urin erfaßt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Immunoassay mit polyklonalen Antikörpern durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß polyklonale "Capture"-Antikörper mit Spezifität gegenüber Legionella-Urin-Antigenen verwendet werden.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ausbildung des Antigen/Antikörper-Komplexes zunächst ein immobilisierter Capture-Antikörper verwendet wird.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ausbildung des Komplexes ein Antikörper-Konjugat verwendet wird, das gegenüber dem Capture-Antikörper eine unterschiedliche Spezifität aufweist.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzymimmunoassay durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzymimmunoassay mit Peroxidase oder alkalischer Phosphatase durchgeführt wird.

10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antikörper-Konjugat verwendet wird, das genus-weit Legionella-Antigene bindet und insoweit komplementär zum eingesetzten "Capture"-Antikörper ist und daher noch freie Epitope des an die Capture-Antikörper gebundenen Legionella-Antigens bindet.

11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antikörper-Konjugat verwendet wird, das Spezifität gegenüber einer Antigen-Fraktion eines apparenten Molekulargewichts von etwa 68 kDa aufweist.

12. Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß er a) ein Antikörper- Konjugat und b) einen Capture-Antikörper umfaßt, wobei darin mindestens ein Antikörper auf die Erfassung einer in vivo oder in vitro prozessierten Antigen-Fraktion eines apparenten Molekulargewichts von etwa 68 und/oder etwa 25 kDa, bestimmt durch die SDS-PAGE-Methode, ausgerichtet ist.