ES2302489B1 - Procedimiento para la deteccion de legionella spp mediante anticuerpo policlonal. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la detección de
Legionella spp. mediante anticuerpo policlonal.
La presente invención proporciona un antígeno
que se une a un anticuerpo anti-Legionella spp., un
procedimiento para la obtención del antígeno, el uso de dicho
antígeno como analito para la detección de Legionella spp. y
un procedimiento para la detección de Legionella spp. en una
muestra biológica basado en la utilización de un anticuerpo
policlonal, que permite una detección a nivel de género.
Description
Procedimiento para la detección de
Legionella spp. mediante anticuerpo policlonal.
La presente invención se encuadra en general en
el campo del análisis de aguas, y en concreto en la detección de
Legionella.
Legionella es el agente etiológico de de la
enfermedad de los legionarios, una infección humana similar a la
neumonía que se caracterizó por primera vez en 1976 y desde
entonces es reconocida como un importante patógeno pulmonar
responsable de gran número de infecciones nosocomiales.
Dentro de las Legionellas hay diversas especies,
de las que la más importante es la Legionella pneumophila ya
que es la que provoca la mayor parte de los casos de neumonía en
humanos. No obstante, existen otras 30 especies de Legionella
con potencial patógeno y dentro de ellas hay distintos serogrupos,
que en el caso de Legionella pneumophila hay identificados
más de 14 serogrupos.
La L. pneumophila es una bacteria gram
negativa, que habitualmente se encuentra en ambientes acuáticos,
sobre todo en aquellos ambientes que están cercanos a actividades
humanas como son las torres de refrigeración, los sistemas de
distribución de agua, y las aguas subterráneas.
En la actualidad se han desarrollado distintas
técnicas para la detección de Legionella como son los cultivos
bacterianos, sin embargo, estas bacterias necesitan unos
requerimientos especiales para su crecimiento, de tal forma que su
aislamiento en los medios microbiológicos comúnmente usados es de
gran dificultad, por lo que la gran mayoría de los laboratorios no
utilizan los cultivos o lo hacen inadecuadamente (Feeley JC.
Charcoal-yeast extract agar: primary isolation
medium for Legionella pneumophila. J Clin Microbiol 1979;
10:437-441).
Recientemente se están utilizando técnicas de
detección molecular basadas en la PCR, concretamente en
RT-PCR que detectan la legionella mediante la
amplificación de distintas dianas genéticas (Nele Wellinghausen,
et al. ``Detection of legionellae in Hospital water simples
by quantitative Real-Time Light Cycler PCR. Applied
and Environmental Microbiology, VOL. 67, No. 9, sep. 2001,
p3985-3993). Mediante estas técnicas los resultados
se obtienen rápidamente en el laboratorio, sin embargo, la mayoría
de las dianas utilizadas suelen estar quiescentes cuando el
microorganismo se encuentra en su medioambiente, por lo que no son
útiles para el diagnóstico de la legionela en muestras
medioambientales.
La presente invención proporciona un antígeno
que se une a un anticuerpo anti-Legionella spp, un
procedimiento para la obtención del antígeno y el uso de dicho
antígeno como analito para la detección de Legionella spp. La
presente invención proporciona un procedimiento para la detección
de Legionella spp, basado en la utilización de un anticuerpo
policlonal, que permite una detección a nivel de género, rápido
(15-30 minutos) y de gran sensibilidad. El sistema
permite la detección de Legionella spp tanto en suspensión
como recuperada de un filtro de 0,45 \mum, tras filtrar la
muestra en torre de filtración. De esta manera se puede llegar a una
sensibilidad de 10^{7} UFC/l, partiendo de muestras problema con
una concentración mínima de 10^{4} UFC/ml y un volumen de
muestreo de 1000 ml. Por lo tanto es un dispositivo útil en la
confirmación de la presencia de Legionella en cultivos
crecidos o colonias en el procedimiento rutinario de control de
este microorganismo en laboratorios de análisis.
Así pues, en un primer aspecto, la presente
invención se refiere a un antígeno que se une a un anticuerpo
anti-Legionella spp. donde dicho antígeno (antígeno de la
presente invención comprende la proteína ribosomal S3 de la
subunidad 30S, proteína ribosomal S4 de la subunidad 30S y el
factor de elongación Tu.
En un segundo aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para la obtención de un antígeno que se
une a un anticuerpo anti-Legionella spp. (antígeno de la
presente invención, caracterizado porque dicho antígeno se obtiene
mediante lisis celular de un cultivo de Legionella
pneumophila.
En un aspecto más particular de la presente
invención, la lisis celular se realiza con detergentes, enzimas
líticas, antibióticos, calor y/o sonicación.
En un aspecto más particular, los detergentes
utilizados en la presente invención son seleccionados de entre SDS,
tween, Tritón X-100, desoxicolato sódico y/o
nonidet.
En un aspecto más particular, los enzimas
líticos utilizados en la presente invención son seleccionados de
entre lisozima, proteinasa k y/o mutanolisina.
\newpage
En un aspecto más particular los antibióticos
utilizados en la presente invención son seleccionados de entre la
polimixina, colistina y/o surfactina.
En un tercer aspecto, la invención se refiere al
uso de un antígeno obtenido por el procedimiento descrito en la
presente invención como analito para la detección de
Legionella spp.
En un cuarto aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para la detección de Legionella
spp en una muestra biológica mediante la utilización de un
anticuerpo policlonal anti-Legionella caracterizado porque
comprende las siguientes etapas:
- a)
- tratamiento previo de la muestra biológica
- b)
- contactar la muestra biológica tratada en a) con un anticuerpo anti-Legionella
- c)
- detectar el compuesto antígeno-anticuerpo
En un aspecto más particular de la presente
invención, el anticuerpo policlonal anti-Legionella reacciona
con los antígenos proteína ribosomal S3 de la subunidad 30S,
proteína ribosomal S4 de la subunidad 30S y el factor de elongación
Tu.
En un aspecto más particular de la presente
invención, el anticuerpo anti-Legionella se encuentra
conjugado a partículas de oro coloidal.
En un aspecto más particular de la presente
invención, el anticuerpo policlonal anti-Legionella según
cualquiera de las reivindicaciones 8-10, donde el
anticuerpo anti-Legionella se encuentra inmovilizado actuando
como anticuerpo de captura en un sistema inmunoquímico.
En un aspecto más particular de la presente
invención, la etapa a) de tratamiento previo de la muestra
biológica consiste en una lisis celular.
En un aspecto más particular de la presente
invención, la lisis celular de la etapa a) se realiza con
detergentes, enzimas líticas, antibióticos, calor y/o
sonicación.
En un aspecto más particular, los detergentes
utilizados en la presente invención son seleccionados de entre SDS,
tween, Tritón X-100, desoxicolato sódico, y/o
nonidet.
En un aspecto más particular, los enzimas
líticos utilizados en la presente invención son seleccionados de
entre lisozima, proteinasa k, y/o mutanolisina.
En un aspecto más particular, los antibióticos
utilizados en la presente invención son seleccionados de entre
polimixina, colistina, y/o surfactina.
En un aspecto más particular, la muestra
biológica de la presente invención es una muestra de agua.
En un aspecto más en particular, la muestra
biológica de la presente invención está en suspensión líquida.
En un aspecto más en particular, la muestra
biológica de la presente invención está en filtro.
La figura 1 muestra la titulación de suero
policlonal frente a células intactas.
La figura 2 muestra la titulación de suero
policlonal frente a células lisadas.
La figura 3 se refiere a la titulación de suero
policlonal frente a las células lisadas. Reactividad cruzada.
La figura 4 muestra la caracterización del
anticuerpo obtenido por western blotting. MW: marcadores de peso
molecular, A: Western Bot con suero \alpha-Legionella; 1:
Extracto crudo de Escherichia coli, 2: Extracto crudo de
Campylobacter coli, 3: Extracto de Legionella
pneumophila tratado con TCA-acetona, 4: Extracto
crudo de Legionella pneumophila, B: Gel de poliacrilamida al
12.5%. 1: Extracto crudo de Escherichia coli, 2: Extracto
crudo de Campylobacter coli, 3: Extracto de Legionella
pneumophila tratado con TCA-acetona, 4: Extracto
crudo de Legionella pneumophila.
La figura 5 muestra el ensayo límite de
detección (10^{7} UFC/l)
La presente invención proporciona un antígeno
que se une a un anticuerpo anti-Legionella spp, un
procedimiento para la obtención del antígeno y el uso de dicho
antígeno como analito para la detección de Legionella spp. La
presente invención proporciona un procedimiento para la detección
de Legionella spp mediante la utilización de un anticuerpo
policlonal en muestras de agua mediante un sistema
inmunocromatográfico y/o ELISA.
Los presentes ejemplos pretenden ser
ilustrativos de la invención y nunca limitativos
El origen del antígeno fue un cultivo de 48
horas a 37ºC y 5% de CO2 en agar BCYE a partir de una estría de
Legionella pneumophila ATCC 33152, Pasado este periodo, se
resuspendió cada placa en 1 ml de caldo Ringer hasta conseguir una
suspensión del orden de 10^{9} UFC/ml. La suspensión se lavó tres
veces con caldo ringer mediante centrifugación a 14000 g y
recuperación del pellet celular con el fin de eliminar componentes
propios del medio de cultivo.
El antígeno se consiguió por lisado celular por
detergente (dodecil sulfato sódico-SDS). Para ello,
el pellet celular procedente de 1 ml de suspensión y lavado se
resuspendió en 1 ml de una solución de SDS al 1% y se dejó actuar
durante 10 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido este periodo
de tiempo se filtró por un filtro de 0,22 \mum de poro para
eliminar las células no lisadas.
La suspensión filtrante se caracterizó en cuanto
a concentración de proteína mediante el método EZQ (Molecular
Probes) y mediante electroforesis desnaturalizante en gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida de tinción con
Sypro Ruby.
Para la obtención del anticuerpo en primer lugar
se procedió a la inmunización del conejo, para ello se
administraron distintas dosis a conejos (Orthyctolagus
cuniculus) hembra de raza New Zealand White de 2,5 kg con la
pauta descrita en la tabla 1.
Día 0: Sangrado
preinmune
Extracción de 5-7 ml de sangre
de la arteria auricular. No se aplica anestesia.
\vskip1.000000\baselineskip
Día 0: 1ª inmunización subcutánea
0,8 mg de proteína + adyuvante completo de
Freund
No se aplica anestesia.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
Día 14: 2ª inmunización subcutánea
0,5 mg de proteína + adyuvante incompleto de
Freund
No es necesaria anestesia.
\vskip1.000000\baselineskip
Día 24: 1er sangrado.
Extracción de 5-7 ml de sangre
de la arteria auricular.
No es necesaria anestesia.
\vskip1.000000\baselineskip
Día 35: 3ª inmunización subcutánea
0,5 mg de proteína + adyuvante incompleto de
Freund
No es necesaria anestesia.
\vskip1.000000\baselineskip
Día 45: 2º sangrado
Extracción de 5-7 ml de sangre
de la arteria auricular.
No es necesaria anestesia.
\vskip1.000000\baselineskip
Día 56: 4ª inmunización subcutánea
0,5 mg de proteína + adyuvante incompleto de
Freund
No es necesaria anestesia.
\vskip1.000000\baselineskip
Día 66: Exanguinación final
Exanguinación cardíaca. Se obtuvieron
aproximadamente 150 ml de sangre. Se aplicó una preanestesia con
Dormicun (Midazolam) intramuscular en el glúteo. Una vez el animal
estuvo relajado se anestesió con Imalgéne 1000 (ketamina) i.m. en el
glúteo.
Una vez obtenida la sangre, el suero se obtuvo
por coagulación. Las inmunoglobulina se purificaron mediante resina
de proteína A. La purificación se realizó a media escala (10 ml)
utilizando el kit Montage Prosep (Millipore) o a pequeña escala 1 ml
en columna de Proteína A utilizando el sistema cinematográfico ÄKTA
Explorer (GE healthcare).
El anticuerpo quedó eluido en tampón citrato 0,3
M pH 3 neutralizado con tris 1 M. Se realizó un cambio de tampón
mediante ultrafiltración con un dispositivo de membrana tangencial
de tamaño de poro de 60 kDa (Millipore).
Tanto el suero como el anticuerpo purificado se
caracterizaron por ELISA directo. La caracterización del antisuero
producido para el desarrollo se muestra en las figuras 1 y 2.
Los títulos (máxima dilución del suero a la cual
presenta señal diferencial respecto al suero preinmune) de la
producción se muestran en la tabla 2.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\newpage
El anticuerpo se caracterizó mediante una
titulación ELISA para evaluar la máxima reactividad frente a
extractos de diferentes microorganismos preparados de manera
similar. Los resultados se muestran en la Figura 3.
Las cepas ensayadas fueron las siguientes:
Legionella pneumophila ATCC 33152,
Legionella anisa ATCC 35292, Bacillus subtilis CECT
498, Escherichia coil CECT 10536, Staphylococcus
aureus CECT 828, Listeria monocytogenes CECT 911.
Los títulos relativos de cada una de las
especies ensayadas se muestran en la tabla 3:
\vskip1.000000\baselineskip
Se observó como las reactividades mayores se
presentaron en las especies de Legionella ensayadas por lo que
comprobó que existe una dilución 1:1000 suero 1 \mug/ml de
anticuerpo a la cual el anticuerpo fue específico del género
Legionella. representado por las especies ensayadas.
Para la evaluación tanto de la reactividad
cruzada como del número de componentes proteicos que actuaron de
antígenos en la detección, se realizó un análisis por western
blotting del anticuerpo obtenido (figura 4), verificando la no
reactividad cruzada del anticuerpo frente a Escherichia coli
y Campylobacter coli. Observando tres componentes reactivos
principales.
Para la identificación de los antígenos
reactivos, se picaron las bandas proteicas del gel de
electroforesis compatibles con la reactividad en western blotting.
Los componentes identificados por MALDI-TOF se
muestran en la tabla 4:
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra analizable fue una suspensión de
células a partir de una-colonia crecida
en-placa o un filtro de 0,22 \mum utilizado en la
filtración de 1000 ml de agua. A la muestra se le aplicó un
tratamiento de lisis consistente en alguno de los siguientes
procedimientos
\bullet Calentamiento a 100ºC 10 minutos
\bullet Tratamiento con polimixina 5,3 mg/ml +
NaCl 9 g/l + calentamiento a 100ºC 10 minutos.
El dispositivo desarrollado se fabricó mediante
el siguiente protocolo:
A) Aplicación de los anticuerpos a la
membrana
- -
- Corte del rollo en tiras de 20 cm procurando que el corte sea a escuadra. Se utilizaron membranas HiFlow (Millipore SHF2400225)
- -
- Dilución de los anticuerpos en Tampón fosfato 10 mM, pH 7,4 en la siguiente proporción:
- -
- Línea de control: Polyclonal Goat anti-Rabbit (Dakocytomation Z0421) dilución directa. Para 500 tiras fue necesario un volúmen de 500 \mul. procedente de un volumen de 125 pi de anticuerpo. El volumen para cada tira de 30 cm fue de 30 \mul (60 tiras).
- -
- Línea de captura: Polyclonal anti Legionella spp. (desarrollo propio). Fue necesario un volumen de 500 \mul en lotes de 30 \mul. Dilución de trabajo 1:1.
- -
- Aplicación de una línea de control y una línea de captura de anticuerpos sobre la membrana a la concentración necesaria con el Biodot (Tasa volumen/cm: 1 \mul/cm).
- -
- Secado de las membranas durante 1 hora a temperatura ambiente.
- -
- Colocado de la membrana durante 30 minutos en una solución Triton X 100 al 0,5%.
- -
- Aclarado de la membrana en agua destilada y secado durante 30 minutos a 30ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
B) Conjugación del anticuerpo al oro y
preparación del pad del conjugado.
- -
- Preparación de un tubo con 15 ml del volumen de oro coloidal (pH 9) (Colloidal Gold 40 nm. Schleicher & Schuell Ref. 10534251) deseado (150 \mul/tira) y adición 1,5 ml de la dilución del anticuerpo de desarrollo propio gota a gota según la proporción calculada según titulación. Dilución del anticuerpo en Na-Borato 2 mM pH 9.
- -
- Agitación durante 10 minutos.
- -
- Adición de BSA de una solución stock al 10% hasta una concentración final del 1%.
- -
- agitación suavemente durante otros 10 minutos.
- -
- Centrifugación del conjugado a 16000 x g durante 45 minutos a 4ºC.
- -
- Resuspensión del pellet en TBS con BSA 1% concentrando 5 veces el volumen original.
- -
- Recorte de la membrana de conjugado (Millipore Glass Fiber Coniugate, 10 x 300 mm GFCP103000) en porciones de 30 cm.
- -
- Aplicación de 25 \mul de la mezcla a cada tira depositada sobre una superficie de vidrio cada 0,5 cm. O realizar aplicación automática con estos parámetros.
- -
- Secado a 40ºC durante 2 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
C) Montaje de las membranas
Como almohadilla absorbente se utilizó la
almohadilla comercial Absorbent Pad 17 x 300 mm CFSP173000 y como
almohadilla de la muestra se utilizó la almohadilla comercial
Sample Pad 17x 300 mm CFSP173000). Las tiras se montaron según
especificaciones por el siguiente orden:
- -
- Despegar el protector adhesivo de la parte superior de la membrana.
- -
- Pegar la tira absorbente, cuidando de que se solape con la capa de nitrocelulosa
- -
- Despegar el protector de la parte correspondiente al conjugado y el absorbente.
- -
- Pegar la tira del conjugado (previamente secada).
- -
- Pegar la tira del absorbente.
- -
- Colocar el laminado
- -
- Cortar el conjunto en unidades de 0,5 cm.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se analizaron un total de 15 muestras a las
cuales se aplicó el tratamiento de lisis y se inocularon a tres
niveles de contaminación. No se observó inhibición de la reacción
inmunoquímica en ninguna de las muestras por lo que se dedujo que al
menos en las muestras analizadas no existía ningún inhibidor que
impidiera el ensayo. Los resultados se muestran en la tabla 5
L: Lisada, SL; Sin Lisar. ND: No
Determinado
La calibración del lote de tiras utilizado
resultó de la siguiente manera. Según este ensayo el límite de
detección se asegura a 10^{7} UFC/ml (figura 5).
Debido a la baja sensibilidad del dispositivo se
aplicaron diferentes procedimientos de lisis simples o combinados a
diferentes diluciones de Legionella. Las suspensiones se
filtraron por 0,22 \mum para descartar la fracción no lisada y se
inmovilizaron en una placa de poliestireno. El ensayo consistió en
una dilución seriada del suero correspondiente al anticuerpo de
diseño propio según el ejemplo 2, la evaluación comparativa de cada
antígeno respecto a un suero control. El resultado de estos ensayos
fue la determinación de la dilución del suero mínima (título) a la
que se detectó una concentración determinada de Legionella.
Por lo tanto, cuanto mayor fue este valor mayor fue la reactividad
del suero frente a un antígeno porque se mantuvo la reactividad a
una dilución alta. Se realizaron diluciones de 40 a 20000 seriadas
al 50%. Por ello, el título para cada concentración y procedimiento
de lisis osciló entre >20000 (máxima reactividad) y < 40
(nula o muy baja reactividad). Se consideró para el cálculo del
título aquella dilución en la que el suero problema fuera mayor que
el control en al menos un 50% en unidades de absorbancia.
Los tratamientos aplicados fueron:
- -
- Tratamiento A: SDS 1%. Tratamiento durante 10 minutos. Compatible con un dispositivo de campo.
- -
- Tratamiento B: Tween 20 1%. Tratamiento durante 10 minutos. Compatible con un dispositivo de campo.
- -
- Tratamiento C: Lisis con Lisozima. Tratamiento de 30 minutos a 37ºC. Compatible con un dispositivo de campo.
\global\parskip1.000000\baselineskip
- -
- Tratamiento D: Lisis con Proteinasa K Tratamiento de 30 minutos a 60ºC. Compatible con un procedimiento de laboratorio.
- -
- Tratamiento E: Calentamiento a 95ºC 10 minutos. Compatible con un procedimiento de laboratorio.
- -
- Tratamiento F: Sonicación en baño de ultrasonidos 30 minutos a máxima potencia. Compatible con un procedimiento de laboratorio.
Adicionalmente se han probado los siguientes
tratamientos combinados.
Los resultados se muestran en la tabla 6
De este ensayo se puede concluir:
- Las tres concentraciones mayores ensayadas
(107 UFC/ml, 106 UFC/ml y 105 UFC/ml) se pueden detectar con la
mayoría de los tratamientos aplicados.
- Las tres concentraciones bajas ensayadas (104
UFC/ml, 103 UFC/ml y 102 UFC/ml) se pueden detectar con mayor
facilidad en tratamientos combinados Lisozima-Tween
y calentamiento.
- La concentración más baja (10 UFC/ml) se puede
detectar con mayor facilidad con tratamientos físicos
(calentamiento y sonicación y por el tratamiento combinado
SDS-calentamiento.
Claims (19)
1. Antígeno que se une a un anticuerpo
anti-Legionella spp. caracterizado porque dicho
antígeno comprende la proteína ribosomal S3 de la subunidad 30S,
proteína ribosomal S4 de la subunidad 30S y el factor de elongación
Tu.
2. Procedimiento para la obtención de un
antígeno que se une a un anticuerpo anti-Legionella spp.
según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho
antígeno se obtiene mediante lisis celular de un cultivo de
Legionella pneumophila.
3. Procedimiento para la obtención de un
antígeno que se une a un anticuerpo anti-Legionella spp.
según la reivindicación 2, donde la lisis celular se realiza con
detergentes, enzimas líticos, antibióticos, calor y/o
sonicación.
4. Procedimiento para la obtención de un
antígeno que se une a un anticuerpo anti-Legionella spp.
según la reivindicación 3, donde los detergentes son seleccionados
de entre SDS, tween, Tritón X-100, desoxicolato
sódico y/o nonidet.
5. Procedimiento para la obtención de un
antígeno que se une a un anticuerpo anti-Legionella spp.
según la reivindicación 3, donde los enzimas líticos son
seleccionados de entre lisozima, proteinasa k y/o mutanolisina.
6. Procedimiento para la obtención de un
antígeno que se une a un anticuerpo anti-Legionella spp.
según la reivindicación 2, donde los antibióticos son seleccionados
de entre la polimixina, colistina y/o surfactina.
7. Uso de un antígeno obtenido por un
procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones
2-6 como analito para la detección de
Legionella spp.
8. Procedimiento para la detección de
Legionella spp en una muestra biológica mediante la
utilización de un anticuerpo policlonal anti-Legionella
caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
- d)
- tratamiento previo de la muestra biológica
- e)
- contactar la muestra biológica tratada en a) con un anticuerpo anti-Legionella
- f)
- detectar el compuesto antígeno-anticuerpo.
9. Procedimiento para la detección de
Legionella spp en una muestra biológica mediante la
utilización de un anticuerpo policlonal anti-Legionella según
la reivindicación 8, donde el anticuerpo policlonal
anti-Legionella reacciona con los antígenos proteína
ribosomal S3 de la subunidad 30S, proteína ribosomal S4 de la
subunidad 30S y el factor de elongación Tu.
10. Procedimiento para la detección de
Legionella spp en una muestra biológica mediante la
utilización de un anticuerpo policlonal anti-Legionella según
cualquiera de las reivindicaciones 8-9, donde el
anticuerpo anti-Legionella se encuentra conjugado a
partículas de oro coloidal.
11. Procedimiento para la detección de
Legionella spp en una muestra biológica mediante la
utilización de un anticuerpo policlonal anti-Legionella
seguían cualquiera de las reivindicaciones 8-10,
donde el anticuerpo anti-Legionella se encuentra
inmovilizado actuando como anticuerpo de captura en un sistema
inmunoquímico.
12. Procedimiento para la detección de
Legionella spp en una muestra biológica mediante la
utilización de un anticuerpo policlonal anti-Legionella según
cualquiera de las reivindicaciones 8-11, donde la
etapa a) de tratamiento previo de la muestra biológica consiste en
una lisis celular.
13. Procedimiento para la detección de
Legionella spp en una muestra biológica mediante la
utilización de un anticuerpo policlonal anti-Legionella según
la reivindicación 12, donde la lisis celular se realiza con
detergentes, enzimas líticos, antibióticos, calor y/o
sonicación.
14. Procedimiento para la detección de
Legionella spp en una muestra biológica mediante la
utilización de un anticuerpo policlonal anti-Legionella según
la reivindicación 13, donde los detergentes son seleccionados de
entre SDS, tween, Tritón X-100, desoxicolato
sódico, y/o nonidet.
15. Procedimiento para la detección de
Legionella spp en una. muestra biológica mediante la
utilización de un anticuerpo policlonal anti-Legionella según
la reivindicación 13, donde los enzimas líticos son seleccionados de
entre lisozima, proteinasa k, y/o mutanolisina.
16. Procedimiento para la detección de
Legionella spp en una muestra biológica mediante la
utilización de un anticuerpo policlonal anti-Legionella según
la reivindicación 13, donde los antibióticos son seleccionados de
entre polimixina, colistina, y/o surfactina.
17. Procedimiento para la detección de
Legionella spp en una muestra biológica mediante la
utilización de un anticuerpo policlonal anti-Legionella según
cualquiera de las reivindicaciones 8-16, donde la
muestra biológica es una muestra de agua.
18. Procedimiento para la detección de
Legionella spp en una muestra biológica mediante la
utilización de un anticuerpo policlonal anti-Legionella según
la reivindicación 17, donde la muestra biológica está en suspensión
líquida.
19. Procedimiento para la detección de
Legionella spp en una muestra biológica mediante la
utilización de un anticuerpo policlonal anti-Legionella según
la reivindicación 17, donde la muestra está en filtro.
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