<Desc/Clms Page number 1>
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von polyklonalen Immunglobulinpräparatio- nen.
Höhere Organismen sind durch ein Immunsystem ausgezeichnet, das es vor potentiell gefähr- lichen Substanzen oder Mikroorganismen schützt. Wenn eine Substanz (Antigen) in den Körper eindringt, wird es als "fremd" erkannt und mit Hilfe des Immunsystems eliminiert. Auch "entartete" körpereigene Zellen werden vom Immunsystem üblicherweise erkannt und aus dem Verkehr gezogen.
Das adaptive Immunsystem des Menschen besteht aus zwei wesentlichen Komponenten, der humoralen und der zellulären Immunität. Die adaptive Immunantwort beruht auf der klonalen
Selektion von B- und T-Lymphozyten und erlaubt im Prinzip die Erkennung jedes beliebigen Anti- gens sowie den Aufbau eines immunologischen Gedächtnisses. Diese Merkmale des adaptiven
Immunsystems werden generell bei Impfungen nutzbringend angesprochen.
Jede B-Zelle produziert einen Antikörper mit bestimmter Bindungsspezifität. Dieser Antikörper befindet sich als spezifischer Rezeptor auch in der Membran der ihn produzierenden B-Zelle. Die humorale Immunantwort gegen als fremd erkannte Antigene beruht auf der selektiven Aktivierung derjenigen B-Zellen, die solche Antikörper produzieren, die an Epitope des jeweiligen Antigens binden können. Für die Antikörpervielfalt spielen DNA-Rearrangements im Verlauf der B-Zelldiffe- renzierung eine entscheidende Rolle.
Im menschlichen Serum befinden sich in grosser Menge Antikörper verschiedenster Spezifitä- ten, Isotypen und Subklassen. Die Gesamtkonzentration aller Immunglobuline im Serum beträgt
15-20 mg/ml; d. h., dass ca. 100 g Immunglobuline verschiedenster Spezifitäten dauernd im Blut zirkulieren. Es ist nicht möglich, die genaue Anzahl aller Antikörper mit unterschiedlicher Spezifität anzugeben, das Repertoir von unterschiedlichen B-Zell-Klonen in einem Menschen liegt bei etwa
109. Ein bestimmter Antikörper kann im Allgemeinen verschiedene, einander ähnliche Antigene binden, wenn auch mit unterschiedlicher Affinität und Avidität.
Das Immunsystem muss mit Hilfe endogener Regulationsmechanismen eine Homöostase be- züglich der Verteilung und Gewichtung dieser verschiedenen Spezifitäten aufrecht erhalten. Ein wesentlicher Mechanismus dafür ist das "idiotypische Netzwerk" (Ann. Immunol. 125C : 373-89 (1974)). Gegen jeden Idiotyp eines Antikörpers, welcher seine Bindungsspezifität bestimmt, gibt es anti-idiotypische Antikörper, die also an den Idiotyp des ersten Antikörpers im Sinne einer Antigen- erkennung binden. Nach diesem Erklärungsmodell sind die Wechselwirkungen zwischen den Idiotyp-spezifischen Rezeptoren auf Lymphozyten für die Regulation des Immunsystems verant- wortlich.
Diese Wechselwirkungen finden offensichtlich tatsächlich statt, da gezeigt worden ist, dass im Zuge einer Immunantwort auch anti-idiotypische Antikörper gegen die durch die Immun- antwort primär induzierten Antikörper entstehen. Da es gegen jeden Antikörper anti-idiotypische Antikörper gibt, sind Lymphozyten gegenüber Idiotypen von Antikörpern grundsätzlich nicht tolerant (William E. Paul, Hrsg., Fundamental Immunology, 3. Ausgabe, Raven Press Ltd. New York, 1993, Seiten 887-902).
Das Immunsystem besteht also aus Lymphozyt-Klonen, die über Immunglobuline, die von an- deren Klonen innerhalb des Netzwerkes produziert werden, stimuliert, bzw. reguliert werden. Unter dem Begriff Konnektivität versteht man den Vernetzungsgrad des Immunsystems. Ein Immunsy- stem mit geringer Konnektivität enthält relativ viele Immun-Zellklone, die nicht von idiotypischen/ anti-idiotypischen Wechselwirkungen beinflusst werden. Unter dieser Art von Wechselwirkungen sind nicht nur die direkten Wechselwirkungen zu verstehen, d. h. solche zwischen zwei Antikörper- bindungsstellen. Es werden vor allem die Wirkungen, die indirekt durch eine Reihe von Interaktio- nen von Antikörpern entstehen, verstanden. Dabei sind nicht nur die B-Zellen und Antikörper, sondern auch T-Zellen mit ihren Rezeptoren involviert (Immunol. Rev. (1988) 101:191-215).
Das gesamte Immun-Netzwerk besitzt eine gewisse "innere Struktur" innerhalb derer die B- Lymphozyten in verschiedene Kategorien fallen, d. h. Immunglobuline mit unterschiedlichen grund- sätzlichen Eigenschaften produzieren (Immunol. Rev. (1989) 110:37-61): . Antikörper, die Affinität zu fast allen anderen Immunglobulinen zeigen (also auch mit Auto- Affinität, d. h. sie reagieren auch mit sich selbst, "sticky antibodies") . Spiegelbild-Antikörper sind Antikörper, die Affinität zum Idiotyp eines bestimmten Antikör- pers haben.
. Antikörper, die schwache Affinität zu "sticky antibodies" haben.
<Desc/Clms Page number 2>
Je hoher die Konnektivität eines Netzwerkes ist, desto grösser ist die Vielfalt der miteinander vernetzenden Immunglobulinen. Alle diese Antikörper stehen in einem bestimmten Gleichgewicht.
Eine Verschiebung des Gleichgewichtes kann sich in pathologischen Phänomenen auswirken (Autoimmunerkrankungen, Allergie, Krebs, Anfälligkeit für Infektionskrankheiten). In diesem Zu- sammenhang ist das Auftreten von pathologischen Phänomenen zum Teil als unregulierte Expan- sion von autoreaktiven Klonen zu verstehen, die durch eine defekte oder verminderte Konnektivität verursacht ist.
Daten zeigen, dass der positive Effekt der therapeutischen Anwendung hoher Dosen von poly- klonalem Immunglobulin (IVIG) bei Autoimmunerkrankungen auf eine Wiederherstellung oder einer
Verbesserung der Konnektivität des Immunsystems zurückzuführen ist (Immunological Reviews (1989) 110 :135-149; J. Immunol. (2000) 51:408-414; Immunology Today (1994) 15 : 342; Dermatol. Clin. (2000) 18 : 447-457).In den US-Patentschriften 5,562,902 und 5,965,130 wird die Anwendung von IVIG zur Krebs- therapie beschrieben.
Eine der frühesten Anwendungen von gepooltem Immunglobulin ist die Vermeidung von Infek- tionskrankheiten. Das derart verwendete Immunglobulin kann bei intravenöser Gabe zu anaphylak- tischem Schock führen und wird deshalb in begrenzten Mengen (wenige Milliliter, was einigen hundert Milligramm Immunglobulin entspricht) intramuskulär verabreicht.
Es wurde auch beobachtet, dass die prophylaktische Gabe von Serumimmunglobulin zur Ver- meidung von Hepatitis, auch die Häufigkeit verschiedener Hautkrankheiten in der behandelten
Population senkte (Int. J. Dermatol. (2000) 39:628-631).
Es wurden verschiedene Theorien aufgrund unterschiedlicher experimenteller Beobachtungen über die Wirkungsweise von gepooltem Serumglobulin aufgestellt : . Die Beeinflussung der Phagozytose über die Fc-Fc-Rezeptor-Interaktion (Ann.Intern.Med.
(1991)115:294-307) . Regulation des idiotypischen/anti-idiotypischen Netzwerkes, Unterdrückung bestimmter Idio- typen (Int.J. Artif. Organs (1993) 16, Suppi.5:189-195) . Unterdrückung der Antikörperproduktion (Clin.Exp. Immunol. (1986) 65:409-415) . Immnglobulin-Zytokin Wechselwirkungen (Immunol. Rev. (1994) 139:5-19) . Neutralisation von Superantigenen und Toxinen (New Engl. J. Med. (1991) 324:1633-1639) . Beeinflussung des Komplementsystems (J. Neuroimmunol. (1996) 71:227-229) . Beschleunigung des Immunglobulin-Stoffwechsels (Immunol. Today (1997) 18:592-598) . Neutralisation von Bakterien, Pilzen und Viren (Goodman and Golman's The Pharmacologi- cal Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York (1996):1291-1308).
Obwohl der Mechanismus derartiger Immunglobulingaben nicht immer eindeutig nur einem Ef- fekt zugeschrieben werden kann, so ist doch zu beobachten, dass alle Anwender eine grosse Menge
Immunglobulin für die Therapie verwenden und von einer direkten Wirkung der verabreichten
Immunglobuline ausgehen. Die Mengen, die üblicherweise verwendet werden, sind einige hundert
Milligramm bis einige Gramm Immunglobulin pro kg Körpergewicht pro Tag, wobei die Behandlung meist mehr als einen Tag durchgeführt wird (Dermatol. Clin. (2000) 18:447-457).
Gepooltes, polyklonales Immunglobulin (wie z.B. intravenöses Immunglobulin, IVIG oder Im- munserumglobulin) wird durch Fraktionierung von gepoolten Seren, die von tausenden Spendern stammen präpariert. Die bis jetzt verwendeten hohen Dosen zur Therapie vieler immunologisch bedingter Krankheiten führt regelmässig zu einem Engpass in der Versorgung mit solchen Präparati- onen.
In der WO 92/15885 A1 wird die Herstellung einer Präparation, enthaltend monoklonale anti- idiotype Antikörper, zur Behandlung von HIV-Infektionen beschrieben. Geeignete monoklonale Antikörper wurden gemäss diesem Dokument aufgrund ihrer bestimmten Spezifität zu polyklonalen Antikörpern ausgewählt und zu einem Impfstoff formuliert. Polyklonale Antikörper selbst werden in der beschriebenen Präparation nicht verwendet. Auch wird das Ersetzen der monoklonalen Anti- körper durch polyklonale Antikörper für den Fachmann in diesem Dokument nicht angeregt.
Gemäss der WO 91/114651 A1 kommt anti-idiotypischer Antikörper als immunogenes Abbild ("mimic") eines bestimmten Antigens zum Einsatz. Hierbei werden sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper beschrieben, jedoch offenbart die WO 91/114651 A1 nur die Verwendung spezifischer anti-idiotypischer Antikörper zur Herstellung einer Vakzine und nicht polyklonale
<Desc/Clms Page number 3>
Antikörper unterschiedlicher Spezifitäten.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher darin, für derartige Erkrankungen eine neuartige und effiziente Therapiemöglichkeit zur Verfügung zu stellen, mit der auch solche Eng- pässe vermieden werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss gelöst, indem polyklonale Immunglobuline in einer völlig neuen Art und Weise eingesetzt werden, nämlich zur Immunisierung. Damit müssen erfindungs- gemäss nurmehr (im Vergleich zur passiven Immunisierung oder anderen Einsatzgebieten von
Immunglobulinen, insbesondere IVIGs im Stand der Technik) geringe Mengen an derartigem
Material eingesetzt werden, eben die Mengen, die für andere aktive Immunisierungen verwendet werden.
Durch Immunisierung wird eine Immunantwort ausgelöst, die die Konnektivität des Immunsy- stems wiederherstellt. Die in polyklonalen Immunglobulinen vorhandenen "sticky antibodies", bzw. die Antikörper, die eine schwache Affinität zu "sticky antibodies" haben erzeugen eine Immunant- wort, die eine Verstärkung dieser Antikörpertypen darstellen. Ebenso können bei autologer Anwen- dung durch die Immunisierung anti-idiotypische Antikörper gegen die im polyklonalen Immunglobu- lin vorhandenen pathologischen Autoantikörper induziert werden. Dies kann zu einer Abschwä- chung der Produktion der pathologischen Antikörper führen.
Demgemäss betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer polyklonalen Immunglobu- linpräparation zur Herstellung einer Impfstoff-Formulierung, enthaltend Antikörper unterschiedlicher
Spezifitäten, zur Immunisierung von Individuen der gleichen Spezies, aus denen die Immunglobuli- ne stammen. Beispielsweise werden erfindungsgemäss humane Immunglobulinpräparate zur
Behandlung am Menschen vorgesehen, während z. B. Rinder- oder Schweine-Immunglobuline zur
Behandlung von Rindern bzw. Schweinen eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung vermeidet, bzw. vermindert die oben erwähnten Nachteile des Stan- des der Technik, indem die Immunglobulinpräparate in kleiner Menge und derart angewendet werden, dass sie im Empfängerorganismus eine Immunantwort induzieren.
Gemäss der vorliegenden Erfindung kann dabei ein polyklonaler Immunglobulin pool (z. B. IVIG oder andere gamma-Globulin-Formulierungen) zur aktiven Immunisierung verwendet werden.
Die Immunglobulinpräparation wird dabei in einer für eine aktive Immunisierung typischen Men- ge dem Empfängerorganismus verabreicht. Die Route der Verabreichung entspricht ebenfalls einer für aktive Immunisierungen üblichen (z. B. subkutan, intradermal und intramuskulär), bevorzugt sind die subkutane, und intradermale Verabreichungsform.
Bevorzugter Weise wird als polyklonale Immunglobulinpräparation eine autologe Immunglobu- linpräparation zur aktiven Immunisierung des gleichen Individuums, aus dem die Präparation stammt, eingesetzt. Die autologe Verabreichung einer polyklonalen Immunglobulin-Präparation, d. h. die Verbreichung der Immunglobulinpräparation and das Individuum, aus dessen immunglobu- linhältiger Körperflüssigkeit das polyklonale Immunglobulin stammt, ist daher eine besonders vorteilhafte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Ein zusätzlicher Vorteil dieser autologen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, dass eine Infektion der Immunglobu- linpräparation aus anderen Individuen (z. B. Viren wie Hepatitis C oder HIV) wie sie bei gepoolten Präparationen vorkommen können, ausgeschlossen werden können.
Unter Individuen werden gemäss der vorliegenden Erfindung einzelne menschliche oder tierische Organismen verstanden, die Körperflüssigkeiten oder Gewebe besitzen, welche Antikörper enthalten. Bevorzugt wird die erfindungsgemässe Herstellung selbstverständlich in Vertebraten, besonders bevorzugt Säugetiere, insbesondere Menschen, verwendet.
Vorzugsweise werden zur polyklonalen Immunglobulinpräparation ein oder mehrere Adjuvan- tien gemischt. Unter Adjuvantien versteht man Stoffe, die die Immunatwort für ein gegebenes Immunogen qualitativ und/oder quantitativ verbessern können. Das polyklonale Immunglobulin nach der vorliegenden Erfindung wird in einer Form verabreicht, die es ermöglicht, eine Immun- antwort auszulösen. Um diese Immunantwort zu verstärken, kann daher die Immunglobulinpräpa- ration mit Adjuvantien, wie sie in der Immunologie üblich sind, verabreicht werden.
Als Beispiele für Adjuvantien, jedoch nicht auf diese eingeschränkt, seien erwähnt: Aluminium- hältige Adjuvantien, insbesondere Aluminiumhydroxid, Derivate von Lipopolysaccharid, Bacillus Calmette Guerin (BCG), Saponine und Derivate davon (z. B. QS-21), Liposomenbereitungen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhaltet demgemäss das Aufar-
<Desc/Clms Page number 4>
beiten der Antikörper-Präparationen als Impfstoff-Formulierung die Zugabe eines Stoffes, ausge- wählt aus der Gruppe der Adjuvantien, insbesondere Aluminium-hältige Adjuvantien, Lipopolysac- charid-Derivate, Bacillus Calmette Guerin, Liposome oder QS-21 (weitere bevorzugte Adjuvantien sind u. a. in Singh et al., Nat.
Biotechnol. 17 (1999), Seiten 1075-1081 beschrieben), immunstimu- lierende Zellen, insbesondere dendritische Zellen oder andere Antigen-präsentierende Zellen, aktive Agentien, vorzugsweise Zytokine, insbesondere Granulozyten-Makrophagenstimulierender
Faktor und/oder die Zugabe von Formulierhilfsstoffen, insbesondere Puffersubstanzen, Stabilisato- ren oder Lösungsvermittler, oder Mischungen dieser Substanzen.
In den Patentschriften US 5,965,130, sowie US 5,562,902 und EP-0 750 514-A sind zwar klei- nere Mengen angegeben (bei subkutaner Verabreichung 4 mg bis 20 Milligramm pro kg Körperge- wicht pro Tag), allerdings sind diese Mengen noch immer nicht im Bereich, der typischerweise für aktive Immunisierungen verwendet wird. Die typische Menge für aktive Immunisierungen liegt bei ca. 100 Nanogramm pro kg Körpergewicht bis 100 Mikrogramm pro kg Körpergewicht pro Immuni- sierung.
In den vorhin genannten US-Patentschriften ist ein Beispiel aufgeführt, in dem eine Menge von
200 Mikrogramm Immunglobulin, subkutan verabreicht, einen Effekt zeigt. Dieses Beispiel ist insofern irreführend, als hier die Immunglobulinpräparation nicht aus der gleichen Spezies stammt, in die es verimpft wird (Human-Immunglobulin wurde an eine Maus verimpft und die Menge bei
Mäusen angewandt wurde und damit wiederum eine Menge von ca. 1 Milligramm pro kg Körper- gewicht erreicht wurde.
Vorzugsweise werden von der polyklonalen Immunglobulinpräparation in der Impfstoff-Formu- lierung pro Immunisierung eine Menge von weniger als 200 Mikrogramm pro Kilogramm Körper- gewicht pro Immunisierung, vorzugsweise von weniger als 20 Mikrogramm pro Kilogramm Körper- gewicht, insbesondere von weniger als 5 Mikrogramm pro Kilogramm Körpergewicht, vorgesehen.
Es können aber auch Immunglobulin-Mengen von 200 Nanogramm bis 1 Mikrogramm pro Kilo- gramm Körpergewicht pro Immunisierung ausreichen. Üblicherweise wird die Dosis für eine Spe- zies vereinheitlicht und basiert auf dem mittleren Körpergewicht der jeweiligen Spezies.
Die Isolierung der Immunglobuline aus menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten, die
Immunglobuline enthalten (z.B. menschliches Serum oder Plasma) kann durch hinreichend be- kannte Methoden erfolgen. Dabei könnnen Fällungsmethoden, chromatographische (z.B. lonen- tausch-, hydrophobe Interaktionschromatographie oder Affinitätschromatographie mit immunglobu- linspezifischen Liganden wie anti-IgG oder anti-lgM oder Protein G und ähnliches), oder andere
Methoden oder Kombinationen verschiedener Methoden angewendet werden. Letztlich ist für die erfindungsgemässe Isolierung von Immunglobulinen aus einem Individuum nur notwendig, dass die erwünschten Immunglobuline im Wesentlichen von unerwünschten anderen Stoffen aus dem
Körper getrennt werden.
Bevorzugt ist eine Reinheit von 90%, besonders bevorzugt ist eine Rein- heit von 98%; jeweils bezogen auf den Gesamtproteingehalt. Wichtig für die vorliegende Erfindung ist dabei auch, dass durch das Herstellungsverfahren für das polyklonale Immunglobulin die Vielfalt der Immunglobuline weitgehend erhalten bleibt. Im Besonderen soll vorzugsweise kein Anreiche- rungs- oder Abreicherungsschritt (wie er z.B. in J. Immunol. (1985) 135 :1091-1096 ist) für bestimmte Immunglobulinspezifitäten im Herstellungsverfahren enthalten sein.
Die Immunglobulinpräparation im Sinne der vorliegenden Erfindung setzt sich vorwiegend aus IgG, IgM und IgA zusammen, es ist aber auch möglich, nur eine bestimmte Immunglobulinklasse (z. B. nur IgM oder IgA oder nur IgG) oder bestimmte Kombinationen von Immunglobulinklassen zu verwenden.
Der Begriff "Immunglobulin" oder "Antikörper" im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst daher auch Fragmente oder Derivate der gewonnenen Antikörper. Als Beispiele, jedoch nicht auf diese eingeschränkt, seien erwähnt : 2'-Fragmente, F (ab)'-Fragmente, z. B. nach an sich bekannten biochemischen Methoden (beispielsweise durch enzymatische Spaltung) hergestellt werden können. Der Begriff "Derivat" umfasst dabei z.B. Antikörperderivate, die nach an sich bekannten chemischen oder biochemischen Methoden hergestellt werden können. Insbesondere umfasst der Begriff auch Produkte, die erzeugt werden können durch chemische Kopplung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten mit Molekülen, die die Immunantwort verstärken können (wie z. B.
Tetanus-Toxoid, Pseudomonas-Exotoxin, Derivate von Lipid A, GM-CSF, IL-2, IL-12, C3d).
<Desc/Clms Page number 5>
Als Quelle für polyklonales Immunglobulin können Pools von Flüssigkeiten, die Immunglobuline enthalten, aus verschiedenen Individuen verwendet werden, es können aber auch immunglobulin- hältige Flüssigkeiten einzelner Individuen verwendet werden.
Demgemäss betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verwen- dung einer polyklonalen Immunglobulinpräparation in nativer Form, d.h. Immunglobuline, die ohne
An- oder Abreicherung für bestimmte Immunglobulinspezifitäten hergestellt wurden und damit in ihrer Zusammensetzung einer nativen, im jeweiligen Organismus bzw. in der jeweiligen Körperflüs- sigkeit (Blut, Lymphe, Kolostrum, etc. ) vorhandenen bzw. zirkulierenden Immunglobulin-Repertoirs entspricht.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung gemäss einem weiteren Aspekt die erfindungsgemässe
Verwendung von Immunglobulinen zur Herstellung einer Impfstoff-Formulierung, enthaltend Anti- körper unterschiedlicher Spezifitäten, zur Behandlung von Krebs, zur Behandlung von Autoimmun- erkrankungen, zur Verhinderung (Vorbeugung) oder Behandlung von Allergien und zur Behandlung von Infektionsanfälligkeit gegenüber viralen, bakteriellen oder Pilz-Infektionen; jeweils durch Immu- nisierung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Prophylaxe oder zur Be- handlung von Individuen, bei welchen eine erfindungsgemäss hergestellte Formulierung in einer effizienten Menge, vorzugsweise einige Mikrogramm bis einhundert Mikrogramm pro Kilogramm
Körpergewicht, an das Individuum, bei dem die Körperflüssigkeit entnommen worden ist, verab- reicht wird. Dieses Behandlungsverfahren ist vor allem bei Autoimmunerkrankungen, wie z.B.
Systemischer Lupus erythematosus, Autoimmun Thyroiditis, Systemischer Vaskulitis, Guillain-
Barre-Syndrom und anti-Faktor VIII:C-Autoimmunerkrankung, bei Allergien oder bei Krebs anwend- bar.
Die Behandlung von gesunden Individuen kann zur Vorbeugung von Infektionen (wie z. B. ver- schiedene Hauterkrankungen) erfindungsgemäss durchgeführt werden.
Die Behandlung im Allgemeinen kann sowohl für therapeutische als auch prophylaktische
Zwecke durchgeführt werden.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung einer autologen Immunglobulinpräparation zur Herstellung eines Mittels zur Immunmodulation.
Die Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Beispiele, auf die sie jedoch nicht einge- schränkt sein soll, näher erläutert.
Beispiel 1:
Herstellung einer Immunglobulinpräparation zur aktiven Immunisierung
0,83 ml einer Suspension von Alu-Gel (Alu-Gel S von Serva, 2%ige Suspension; Qualitätsgrad: Adjuvans zur Präparation von Vakzinen) wird unter sterilen Bedingungen mit 5ml einer Lösung von Rhesusaffen Immunglobulin (Sigma, USA, 14385 verdünnt auf 2,5 mg/ml in 1 mM Phosphatpuffer, pH 6,0 ; % NaCI) gemischt und eine Stunde bei Raumtemperatur sanft geschwenkt Die Sus- pension wird in 0,5 ml Aliquots in Durchstichfläschchen steril abgefüllt.
Beispiel 2:
Erhöhung der anti-Tumorzell Bindungsaktivität von Immunseren
Rhesusaffen werden mit je 0,5 ml des in Beispiel 1 hergestellten Impfstoffes viermal immuni- siert (Tag 0, 15, 29 und 60). Die Seren der Affen (Pre- und Immunseren) werden im Zell-ELISA auf Bindungsfähigkeit auf humane Tumorzellen getestet.
Es wird untersucht, ob sich in dem Affen-Immunserum Immunglobuline nachweisen lassen, die an humane Krebszellen binden. Dafür wird die KATO 111 Magenkrebszellinie herangezogen. Diese Untersuchungen werden mit Hilfe von Zell-ELISA Tests wie folgt durchgeführt:
Die Näpfchen einer Mikrotiterplatte werden mit je 100 #l einer Zellsuspension der zu testenden Zellinie in der Konzentration von 2x106 Zellen/ml in Medium A über Nacht bei +4 C inkubiert. Nach Absaugen des Überstandes wird die Platte mit je 50 #l Fixierlösung pro Näpfchen 5 Minuten bei
<Desc/Clms Page number 6>
Raumtemperatur inkubiert. Nach Absaugen des Überstandes werden je 200 #l Blockierungspuffer B zupipettiert und die Platte 1 Stunde bei 37 C inkubiert.
Nach zweimaligem Waschen mit je 200 #l Waschpuffer B werden je 100 #l Aliquots der zu testenden Affenseren in Verdünnungen von 1:10 bis 1:100 000 in Verdünnungspuffer B 1 Stunde bei 37 C inkubiert. Nach zweimaligem Waschen der Platte mit je 100 #l eiskaltem Waschpuffer B werden je 100 #l des Peroxidase- konjugierten anti-human-Ig Antikörpers (Zymed) in einer Verdünnung von 1:1000 in Verdünnungspuffer A zuge- setzt und 45 Minuten bei 37 C inkubiert. Die Platte wird dreimal mit je 100 #l eiskaltem Waschpuf- fer B gewaschen. Die Antikörperbindung wird durch Zusatz von je 100 #l des spezifischen Sub- strats nachgewiesen und die Farbreaktion durch Zugabe von je 50 #l Stopplösung nach ca.
5 Minuten abgebrochen. Die Auswertung erfolgt durch Messen der optischen Dichte (OD) bei 490nm (Wellenlänge der Referenzmessung ist 620nm).
Ergebnis (Verdünnung 1 :100 inTabelle 1 gezeigt):
Es zeigt sich eine deutliche Zunahme der Bindungsfähigkeit im Lauf der Immunisierung.
Tabelle1
Probe MOD
Präserum 250
Tag15 323
Tag29 845
Tag60 1224 Waschpuffer A : 2%NaCI
0,2% Triton X-1 00 in PBS deficient
Waschpuffer B : 0,05 % Tween 20 in PBS deficient Blockierungspuffer A : % foetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) in PBS deficient
Blockierungspuffer B : 1 % Rinderserumalbumin
0,1 % NaN3 in PBS deficient
Verdünnungspuffer A : 2% foetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) in PBS deficient Verdünnungspuffer B : deficient
Färbepuffer : 24,3 mM Zitronensäure 51,4 mM Na2HP04 pH-Wert : 5,0
Substrat : 40 mg o-Phenylendiamin Dihydrochlorid
100 ml Färbepuffer 20 #l H202 (30%)
Stopplösung: 4 N H2S04