BR112020000719A2

BR112020000719A2 - anticorpos agonistas que ligam o cd137 humano e seus usos

Info

Publication number: BR112020000719A2
Application number: BR112020000719-6A
Authority: BR
Inventors: Piotr Bobrowicz; Paul Widboom; Michael March Schmidt; Jason M. Lajoie; Robert V. Tighe Iii; Cheuk Lun Leung; Ugur ESKIOCAK
Original assignee: Compass Therapeutics Llc
Priority date: 2017-07-11
Filing date: 2018-07-11
Publication date: 2020-07-14
Also published as: SG10201913144TA; US10350292B1; US10279039B2; CN111278858A; WO2019014328A3; CO2020000214A2; JP2020526211A; US10434175B2; US20190060454A1; US20190125866A1; TW201920265A; JP2024042106A; EP3652209A2; US10279040B1; PE20200757A1; US20190099488A1; WO2019014328A2; IL271696A; US11752207B2; US20190269776A1

Abstract

A presente divulgação refere-se a, inter alia, compostos (por exemplo, anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antígeno) que se ligam a um epítopo de CD137 e agonizam CD137 e a utilização dos compostos em métodos para tratar ou melhorar um ou mais sintomas de câncer.

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para “ANTICORPOS AGONISTAS QUE LIGAM O CD137 HUMANO E SEUS USOS”

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório dos EUA nº de Série 62/531.259, depositado em 11 de julho de 2017; Pedido de Patente Provisório dos EUA nº de Série 62/531.190, depositado em 11 de julho de 2017; Pedido de Patente Provisório dos EUA nº de Série 62/568.231, depositado em 4 de outubro de 2017; Pedido de Patente Provisório dos EUA nº de Série 62/577.257, depositado em 26 de outubro de 2017; e Pedido de Patente Provisório dos EUA nº de Série 62/577.259, depositado em 26 de outubro de 2017 Todo o conteúdo dos pedidos acima é aqui incorporado por esta referência.

FUNDAMENTOS

[002] Nos últimos anos, um crescente corpo de evidências sugere que o sistema imunológico opera como uma barreira significativa à formação e progressão do tumor. O princípio de que células T de ocorrência natural com potencial ou atividade antitumoral existem em um paciente com câncer racionalizou o desenvolvimento de abordagens imunoterapêuticas em oncologia. As células imunes, como células T, macrófagos e células exterminadoras naturais, podem exibir atividade antitumoral e controlar efetivamente a ocorrência e o crescimento de tumores malignos. Antígenos específicos ou associados a tumores podem induzir células imunes a reconhecer e eliminar doenças malignas (Chen & Mellman, (2013) Imunidade 39(1):1-10). Apesar da existência de respostas imunes específicas do tumor, os tumores malignos frequentemente evadem ou evitam o ataque imune através de uma variedade de mecanismos imunomoduladores, resultando na falha no controle da ocorrência e progressão do tumor (Motz & Coukos, (2013) Imunidade 39(1):61-730). De fato, uma característica emergente do câncer é a exploração desses mecanismos imunomoduladores e a desativação de respostas imunes antitumorais, resultando em evasão tumoral e fuga da matança imunológica (Hanahan e Weinberg (2011) Cell 144(5):646-674).

[003] Novas abordagens na imunoterapia do câncer envolvem a neutralização desses mecanismos de evasão e fuga imunes e a indução do sistema imunológico endógeno a rejeitar tumores. CD137 (alternativamente conhecido como "membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 9" (TNFRSF9), 4-1BB e "induzido pela ativação de linfócitos" (ILA)) é uma proteína receptora co-estimuladora transmembranar pertencente à superfamília do fator de necrose tumoral. CD137 é um receptor co- estimulador de células T induzido após a ativação do TCR (Nam et al., (2005) Curr Cancer Drug Targets 5:357-363; Watts et al., (2005) Annu Rev Immunol 23:23-68). Além de sua expressão em células T CD4+ e CD8+ ativadas, o CD137 também é expresso em células T reguladoras CD4+CD25+, células exterminadoras naturais ativadas (NK) e NKT, monócitos, neutrófilos e células dendríticas.

[004] Sob condições fisiológicas, o CD137 é ligado pelo ligante CD137 (CD137L), uma molécula de membrana agonista presente nas células apresentadoras de antígenos, incluindo células B, monócitos, macrófagos e células dendríticas (Watts et al., (2005) Annu Rev Immunol 23:23-68). Mediante interação com seu ligante, o CD137 leva ao aumento da proliferação de células T induzida por TCR, produção de citocinas, maturação funcional e prolongada sobrevida das células T CD8+. O potencial da co-estimulação de CD137 usando vários agonistas (por exemplo, anticorpos agonísticos, proteína CD137L recombinante e aptâmeros específicos para CD137) em permitir que o sistema imunológico ataque tumores foi documentado em vários modelos (Dharmadhikari et al., (2016) Oncoimmunology 5(4):21113367 e suas referências). Um relatório recente sobre a avaliação clínica de um anticorpo CD137 agonístico

(Urelumab, BMS-663513; Bristol-Myers Squibb) documentou a observação de eventos adversos relacionados ao tratamento em indivíduos humanos, incluindo — indicações de hepatotoxicidade grave (transaminite) correlacionada com a dose de anticorpo (Segal et al., (2016) Clin Cancer Res 23(8):1929-1936). Por outro lado, um anticorpo agonístico diferente do CD137 (Utomilumab, PF-05082566; Pfizer) testado em combinação com um anticorpo anti-PD-1 (pembrolizumab), embora não resultando em nenhuma toxicidade limitante da dose, mostrou resultados comparáveis à terapia de anticorpo anti-PD-1 sozinha (Tolcher, A. et al., (2017) Clin Cancer Res 23(18): 5349-5357). Esses resultados destacam que, para pacientes com várias doenças e condições, incluindo câncer, passíveis de tratamento com um agonista de CD137, continua a haver uma necessidade não atendida de novos anticorpos agonísticos que se ligam ao CD137 humano e exibem características suficientes para o desenvolvimento de uma terapêutica segura e eficaz.

SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO

[005] A presente divulgação é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de novos anticorpos agonistas anti-CD137 que exibem imunidade antitumoral protetora em animais. Notavelmente, os anticorpos aqui descritos são eficazes contra diversos tipos de tumores e em uma ampla faixa de doses. Além disso, como exemplificado nos exemplos de trabalho, os anticorpos aqui descritos são terapeuticamente eficazes contra tumores muito grandes. Por exemplo, o tratamento de camundongos portadores de tumor com anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos resultou em regressão completa de tumores de até 1.800 mm?. Conforme estabelecido na FIG. 15, o tratamento desses camundongos também resultou em imunidade protetora. E coincidentes com a eficácia observada foram alterações imunofenotípicas positivas no microambiente do tumor, como aumento da infilttação de células imunes com reduções concomitantes nas células T reguladoras e populações esgotadas de células T (ver, por exemplo, FIGs. 22A-22D).

[006] Como descrito acima, o agonismo do CD137 foi associado a certos eventos adversos, incluindo mortes relacionadas à hepatotoxicidade em humanos (ver, por exemplo, Segal et al. (2017) Clin Cancer Res 23(8):1929-1935). Toxicidade semelhante resultante do tratamento com anticorpos agonistas anti-CD137 (como o anticorpo 3H3) também foi observada em modelos animais (ver, por exemplo, Bartkowiak et al. (2018) Clin Cancer Res 24(5):1138-1151). Ainda, os anticorpos agonistas anti- CD137 aqui descritos têm efeitos mínimos no fígado, conforme determinado por, por exemplo, níveis plasmáticos de enzimas hepáticas (por exemplo, alanina aminotransferase (ALT)) e infiltração de células imunes. Por exemplo, não houve evidência de aumento da infiltração de células imunes intra-hepáticas ou intra-esplênicas em camundongos tratados com os anticorpos. Assim, os anticorpos aqui descritos são não apenas altamente eficazes, mas também poupadores de certas toxicidades associadas ao agonismo de CD137.

[007] Embora a divulgação não esteja vinculada a nenhuma teoria ou mecanismo de ação específico, acredita-se que as propriedades terapêuticas superiores e poupadoras de toxicidade dos anticorpos aqui descritos derivem em parte de uma ou ambas de sua afinidade e do novo epítopo ao qual se ligam. Ou seja, os anticorpos aqui descritos compartilham um novo epítopo comum que é distinto daquele de outros anticorpos agonistas anti-CD137. E, como exemplificado nos exemplos de trabalho, o envolvimento desse epítopo pelos anticorpos aqui descritos dá origem a atividade in vitro diferenciada, como efeitos sobre a proliferação regulatória de células T, produção de citocinas por células T CD8* e macrófagos e sinalização intracelular, em comparação com anticorpos agonistas que se ligam a diferentes epítopos de CD137. Além disso, foi demonstrado que um intervalo de afinidade (um "ponto ideal") para anticorpos é particularmente ideal para a atividade antitumoral. Por exemplo, os anticorpos de afinidade intermediária mostraram ser mais eficazes contra tumores grandes em comparação com anticorpos com afinidade maior ou menor.

[008] Em vista do exposto, em alguns aspectos, a divulgação fornece anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Ko) entre cerca de 40 nM e cerca de 100 nM. Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno liga o CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 NM e cerca de 110 nM). Em alguns aspectos, a afinidade do anticorpo anti- CD137 com o CD137 humano é pelo menos duas (por exemplo, pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou 10) vezes maior que a afinidade do mAb10 para CD137 de camundongo. Em alguns aspectos, a afinidade do anticorpo anti-CD137 não é maior que 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 250, 200, 175, 150, 125, 110 ou 100 nM. Em alguns aspectos, a afinidade do anticorpo anti-CD137 com o CD137 humano é pelo menos duas (por exemplo, pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou 10) vezes maior que a afinidade do mMAb10 para CD137 de camundongo, mas não superior a 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 250, 200, 175, 150, 125, 110 ou 100 nM.

[009] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno se liga a um epítopo no CD137 humano que compreende um ou mais (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou todos os 25) dos amino ácidos 111-132 da SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou a porção de ligação ao antígeno se liga a um epítopo dentro dos aminoácidos 111-132 da SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclional isolado, ou porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou a porção de ligação ao antígeno se liga a todos ou a uma porção dos aminoácidos 111-132 da SEQ ID NO:3. Em alguns aspectos, o epítopo compreende K114 da SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos, o epítopo compreende os resíduos E111, T113 e K114 da SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos, o epítopo compreende os resíduos E111, T113, K114, N126 e 1132 da SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos, o epítopo compreende os resíduos E111, T113, K114 e P135 da SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos, o epítopo compreende os resíduos E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos, o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 110 nM).

[0010] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno liga o CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 40-100 nM (por exemplo, entre cerca de 40 nM e cerca de 100 nM) e se liga a um epítopo no CD137 humano compreendendo K114 da SEQ ID NO:

3. Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monocional isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno liga o CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e se liga a um epítopo no CD137 humano compreendendo K114 da SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos, o epítopo compreende os resíduos E111, T113 e K114 da SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos, o epítopo compreende os resíduos E111, T113, K114, N126 e 1132 da SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos, o epítopo compreende os resíduos E111, T113, K114 e P135 da SEQ ID NO:

3. Em alguns aspectos, o epítopo compreende os resíduos E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3.

[0011] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno liga o CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, cerca de 30 nM a cerca de 100 nM) e se liga a um epítopo no CD137 humano compreendendo uma sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos, o epítopo compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 ou 25 resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQ ID NO: 3.

[0012] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno liga o CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e se liga a um epítopo no CD137 humano localizado dentro dos resíduos de aminoácidos 111-135 da SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos, o epítopo é pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos. Em alguns aspectos, o epítopo é menor que 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8,7, 6 ou 5 aminoácidos.

[0013] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno liga o CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e se liga a um epítopo no CD137 humano compreendendo ELTK (correspondente aos resíduos de aminoácidos 111-114 da SEQ ID NO: 3). Em alguns aspectos, o epítopo compreende ainda um ou mais resíduos N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3.

[0014] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o epítopo é um epítopo não linear. Em qualquer um dos aspectos anteriores, a mutação do resíduo K114 da SEQ ID NO: 3 anula a ligação do anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno ao CD137 humano.

[0015] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno aqui descrita liga o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM, 30-95 nM, 45-95 nM, 50-90 nM, 55- 85 nM, 60-80 nM, 65-75 NM, 55-75 nM, 40-70 nM, 50-80 nM ou 60-90 nM. Em alguns aspectos, a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga a uma região de ligação não ligante do domínio extracelular do CD137 humano. Em alguns aspectos, a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno não inibe a interação entre CD137 e CD137L. Em alguns aspectos, a região de ligação não ligante abrange o domínio rico em cisteína (CRD) Ill e CRD IV. Em qualquer um dos aspectos anteriores, a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno não inibe a formação de um trímero de monômeros CD137:CD137L.

[0016] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou a porção de ligação ao antígeno:

[0017] (i) liga CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30- 100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[0018] (ii) liga-se a uma região de ligação não-ligante do domínio extracelular do CD137 humano; e

[0019] (iii) liga-se a um epítopo no CD137 humano incluindo K114 da SEQ ID NO: 3.

[0020] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou a porção de ligação ao antígeno:

[0021] (i) liga CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30- 100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[0022] (ii) não inibe a interação entre CD137 humano e ligante CD137 humano; e

[0023] (iii) liga-se a um epítopo no CD137 humano incluindo K114 da SEQ ID NO: 3.

[0024] Em alguns aspectos, a divulgação apresenta um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno: (i) liga o CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e (ii) não inibe a formação de um trímero de monômeros CD137:CD137L (ou seja, um complexo de trímero:trímero CD137:CD137L). Em alguns aspectos, a divulgação apresenta um anticorpo monocional isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno: (i) liga o CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-

100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e (ii) se liga a uma região de ligação não ligante do domínio extracelular do CD137 humano. Em alguns aspectos, a divulgação apresenta um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno: (i) liga o CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e (ii) não inibe a interação entre o ligante CD137 e CD137 humano.

[0025] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ ID NO: 126), em que X é qualquer aminoácido. Em alguns aspectos, a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXPFXLDXXYYYYYX (SEQ |D NO: 127), em que X é qualquer aminoácido. Em qualquer um dos aspectos anteriores, a mutação dos resíduos D95, L100, Y100E, Y100G, Y100H ou combinações dos mesmos, da CDR3 de cadeia pesada a alanina resulta em perda de ligação ao CD137 humano. Em qualquer um dos aspectos anteriores, a mutação dos resíduos P97, F98, D100A, Y100D, Y100F ou combinações dos mesmos à alanina resulta na redução da ligação ao CD137 humano. Em qualquer um dos aspectos anteriores, a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve, em que o CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68.

[0026] Em outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0027] (i) a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM); e

[0028] (ii) a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ ID NO: 126), em que X é qualquer aminoácido. Em alguns aspectos, X é qualquer aminoácido, exceto a alanina.

[0029] Em outro aspecto, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0030] (i) a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Ko) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM); e

[0031] (ii) a porção de ligação de anticorpo ou antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DX X2X3XaLX5X6X7X8Y X9Y YX10 (SEQ ID NO: 128), em que X: é qualquer aminoácido, em que X; é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xs; é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que X; é um aminoácido polar, em que Xs é um aminoácido polar e em que Xi é qualquer aminoácido. Em alguns aspectos, X, é prolina, X; é fenilalanina ou triptofano, Xs é ácido aspártico ou ácido glutâmico, X; é tirosina e X, é tirosina.

[0032] Em outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0033] (i) a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM); e

[0034] (ii) a sua porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno se liga especificamente a um epítopo no CD137 humano que compreende um ou mais resíduos E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3.

[0035] Em outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0036] (i) a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[0037] (ii) a sua porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno se liga especificamente a um epítopo no CD137 humano que compreende um ou mais resíduos E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3;

[0038] (iii) a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ I|D NO: 126), em que X é qualquer aminoácido; ou

[0039] (iv) combinações dos mesmos. Em alguns aspectos, X é qualquer aminoácido, exceto a alanina.

[0040] Em outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0041] (i) a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[0042] (ii) a sua porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno se liga especificamente a um epítopo no CD137 humano que compreende um ou mais resíduos E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3;

[0043] (iii) a porção de ligação de anticorpo ou antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DX X2X3XaLX5X6X7X8Y X9Y YX10 (SEQ ID NO: 128), em que X: é qualquer aminoácido, em que X; é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xs é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que X: é um aminoácido polar, em que Xs é um aminoácido polar e em que X10 é qualquer aminoácido; ou

[0044] (iv) combinações dos mesmos. Em alguns aspectos, X> é prolina, X; é fenilalanina ou triptofano, Xs é ácido aspártico ou ácido glutâmico, X; é tirosina e Xs é tirosina.

[0045] Em outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0046] (i) a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[0047] (ii) a sua porção de ligação ao anticorpo ou antígeno se liga especificamente a um epítopo no CD137 humano que compreende um ou mais resíduos E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQID NO: 3; e

[0048] (iii) a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ ID NO: 126), em que X é qualquer aminoácido. Em alguns aspectos, X é qualquer aminoácido, exceto a alanina.

[0049] Em outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0050] (i) a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[0051] (ii) a sua porção de ligação ao anticorpo ou antígeno se liga especificamente a um epítopo no CD137 humano que compreende um ou mais resíduos E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQID NO: 3; e

[0052] (iii) a porção de ligação de anticorpo ou antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DX XK2X3XaLX5sX6X7X8Y Xo9Y YX10 (SEQ ID NO: 128), em que X: é qualquer aminoácido, em que X; é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que X;s é um aminoácido polar, em que Xs é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xs é um aminoácido polar e em que X1 é qualquer aminoácido. Em alguns aspectos, X>, é prolina, X; é fenilalanina ou triptofano, Xs é ácido aspártico ou ácido glutâmico, Xz é tirosina e X, é tirosina.

[0053] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o epítopo compreende K114. Em qualquer um dos aspectos anteriores, o epítopo compreende E111, T113 e K114. Em qualquer um dos aspectos anteriores, o epítopo compreende E11, T113, K114, N126 e 1132. Em qualquer um dos aspectos anteriores, o epítopo compreende os resíduos E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3.

[0054] Em outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0055] (i) a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM); e

[0056] (ii) O anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno se liga especificamente a um epítopo compreendendo uma sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQ ID NO: 3.

[0057] Em outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0058] (i) a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[0059] (ii) o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno se liga especificamente a um epítopo compreendendo uma sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQ ID NO: 3;

[0060] (iii) a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ ID NO: 126), em que X é qualquer aminoácido; ou

[0061] (iv) combinações dos mesmos. Em alguns aspectos, X é qualquer aminoácido, exceto a alanina.

[0062] Em outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0063] (i) a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[0064] (ii) o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno se liga especificamente a um epítopo compreendendo uma sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQ ID NO: 3;

[0065] (iii) a porção de ligação de anticorpo ou antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DX1X2X3XaLX5sX6X7X8Y XoY YX10 (SEQ ID NO: 128), em que X: é qualquer aminoácido, em que X, é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xs; é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que X; é um aminoácido polar, em que Xs é um aminoácido polar e em que X10 é qualquer aminoácido; ou

[0066] (iv) combinações dos mesmos. Em alguns aspectos, X> é prolina, X; é fenilalanina ou triptofano, Xs é ácido aspártico ou ácido glutâmico, Xz é tirosina e X9 é tirosina.

[0067] Em outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0068] (i) a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Ko) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[0069] (ii) a sua porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno se liga especificamente a um epítopo compreendendo uma sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQID NO: 3; e

[0070] (iii) a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ I|D NO: 126), em que X é qualquer aminoácido. Em alguns aspectos, X é qualquer aminoácido, exceto a alanina.

[0071] Em outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0072] (i) a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[0073] (ii) a sua porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno se liga especificamente a um epítopo compreendendo uma sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQID NO: 3; e

[0074] (iii) a porção de ligação de anticorpo ou antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DX X2X3XaLX5X6X7XgY Xo9Y YX10 (SEQ ID NO: 128), em que X, é qualquer aminoácido, em que X, é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xs; é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xs é um aminoácido polar e em que X1 é qualquer aminoácido. Em alguns aspectos, X>, é prolina, X; é fenilalanina ou triptofano, Xs é ácido aspártico ou ácido glutâmico, Xz é tirosina e X9 é tirosina.

[0075] EM qualquer um dos aspectos anteriores, o epítopo compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQ ID NO: 3.

[0076] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0077] (i) a porção de ligação do anticorpo ou antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM); e

[0078] (ii) a sua porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno se liga especificamente a um epítopo compreendendo ELTK (correspondente aos resíduos de aminoácidos 111-114 da SEQ ID NO: 3).

[0079] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0080] (i) a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[0081] (ii) o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno se liga especificamente a um epítopo compreendendo ELTK (correspondente aos resíduos de aminoácidos 111-114 da SEQ ID NO: 3);

[0082] (iii) a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ I|D NO: 126), em que X é qualquer aminoácido; ou

[0083] (iv) combinações dos mesmos. Em alguns aspectos, X é qualquer aminoácido, exceto a alanina.

[0084] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0085] (i) a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[0086] (ii) o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno se liga especificamente a um epítopo compreendendo ELTK (correspondente aos resíduos de aminoácidos 111-114 da SEQ ID NO: 3);

[0087] (iii) a porção de ligação de anticorpo ou antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DX X2X3XaLX5X6X7X8Y X9Y YX10 (SEQ ID NO: 128), em que X: é qualquer aminoácido, em que X; é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xs é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que X: é um aminoácido polar, em que Xs é um aminoácido polar e em que X10 é qualquer aminoácido; ou

[0088] (iv) combinações dos mesmos. Em alguns aspectos, X> é prolina, X; é fenilalanina ou triptofano, Xs é ácido aspártico ou ácido glutâmico, X; é tirosina e Xs é tirosina.

[0089] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0090] (i) a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[0091] (ii) o anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo se liga especificamente a um epítopo compreendendo ELTK (correspondente aos resíduos de aminoácidos 111-114 da SEQ ID NO: 3) e

[0092] (iii) a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ ID NO: 126), em que X é qualquer aminoácido. Em alguns aspectos, X é qualquer aminoácido, exceto a alanina.

[0093] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que

[0094] (i) a porção de ligação do anticorpo ou do antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[0095] (ii) o anticorpo ou porção de ligação a antígeno do mesmo se liga especificamente a um epítopo compreendendo ELTK (correspondente aos resíduos de aminoácidos 111-114 da SEQ ID NO: 3) e

[0096] (iii) a porção de ligação de anticorpo ou antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DX XK2X3XaLX5sX6X7X8Y Xo9Y YX10 (SEQ ID NO: 128), em que X: é qualquer aminoácido, em que X; é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que X;s é um aminoácido polar, em que Xs é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xs é um aminoácido polar e em que X1 é qualquer aminoácido. Em alguns aspectos, X>, é prolina, X; é fenilalanina ou triptofano, Xs é ácido aspártico ou ácido glutâmico, Xz é tirosina e Xº é tirosina

[0097] EM qualquer um dos aspectos anteriores, o epítopo compreende os resíduos ELTK da SEQ ID NO: 3 (correspondendo aos resíduos de aminoácidos 111-114 da SEQ ID NO: 3). Em alguns aspectos, o epítopo compreende ELTK da SEQ ID NO: 3 (correspondente aos resíduos de aminoácidos 111-114 da SEQ ID NO: 3) e resíduos N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3.

[0098] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o epítopo é um epítopo não linear. Em alguns aspectos, a mutação do resíduo K114 do CD137 humano (SEQ ID NO: 3) anula a ligação do anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno ao CD137 humano.

[0099] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a porção de ligação de anticorpo ou antígeno do mesmo compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXPFXLDXXYYYYYX (SEQ ID NO: 128), em que X é qualquer aminoácido. Em alguns aspectos, a mutação dos resíduos D95, L100, Y100E, Y100G, Y100H, ou combinações dos mesmos, da CDR3 de cadeia pesada da porção de ligação de anticorpo ou antígeno aqui descrita, resulta em perda de ligação ao CD137 humano. Em alguns aspectos, a mutação dos resíduos P97, F98, D100A, Y100D, Y100F ou combinações dos mesmos da CDR3 de cadeia pesada da porção de ligação de anticorpo ou antígeno aqui descrita à alanina resulta em redução da ligação ao CD137 humano. Em outros aspectos, a mutação dos resíduos P97, F98, D100A, Y100D, Y100F, ou combinações dos mesmos, da CDR3 de cadeia pesada da porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno aqui descrita, para qualquer resíduo, exceto a alanina, resulta em um aumento na ligação ao CD137 humano.

[00100] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno, liga o CD137 humano a um (Kp) de cerca de 45-95 nM, 50-90 nM, 55-85 nM, 60-80 nM, 65-75 nM, 55-75 nM, 40-70 nM, 50-80 nM ou 60-90 nM. Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno, liga o CD137 humano a um (Kp) de cerca de 45 nM a cerca de 95 nM, cerca de 50 a cerca de 90 NM, cerca de 55 a cerca de 85 nM, cerca de 60 a cerca de 80 nM, cerca de 65 a cerca de 75 NM, cerca de 55 a cerca de 75 nM, cerca de 40 a cerca de 70 nM, cerca de 50 a cerca de 80 nM, ou cerca de 60 a cerca de 90 nM.

[00101] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve, em que a CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68.

[00102] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[00103] (a) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente; e

[00104] (b) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 51, 108 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente.

[00105] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4 e 101; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[00106] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em:

[00107] (a) SEQ ID NO: 4 e 6, respectivamente; e

[00108] (b) SEQ ID NO: 101 e 6, respectivamente.

[00109] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4 e 101; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

[00110] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em:

[00111] (a) SEQ ID NO: 4 e 6, respectivamente; e

[00112] (b) SEQ ID NO: 101 e 6, respectivamente.

[00113] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizada pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno compreende cadeias pesadas e leves compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[00114] (a) SEQ ID NOs: 129 e 133, respectivamente; e

[00115] (b) SEQ ID NOs: 131 e 133, respectivamente.

[00116] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno aqui descrita, é um agonista da atividade do CD137 humano.

[00117] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno aqui descrita, compete com o mAb1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mAb1, pela ligação ao epítopo do CD137 humano.

[00118] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente ao CD137, ou uma porção sua de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[00119] (a) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00120] (b) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 70, 79 e 90, respectivamente;

[00121] (c) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 71, 80 e 91, respectivamente;

[00122] (d) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 72, 81 e 92, respectivamente;

[00123] (e) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 73, 82 e 91, respectivamente;

[00124] (f) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 74, 83 e 93, respectivamente;

[00125] (9) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 75, 84 e 91, respectivamente;

[00126] (h) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 74, 85 e 94, respectivamente;

[00127] (i) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 76, 86 e 95, respectivamente;

[00128] (])) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 77, 87 e 93, respectivamente;

[00129] (k) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 88 e 90, respectivamente;

[00130] (1) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49, 57 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00131] (mM) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49, 58 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00132] (n) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49, 59 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00133] (0) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49, 60 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00134] (p) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 50, 61 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00135] (a) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 50, 58 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00136] (r) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 51, 62 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00137] (s) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada apresentadas nas SEQ ID NOs: 52, 63 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00138] (t) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 50, 64 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve apresentadas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00139] (u) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 50, 65 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00140] (v) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 51, 108 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00141] (w) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 107, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente; e

[00142] (x) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 109, 110 e 92, respectivamente.

[00143] Em outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 101 e 103; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 6, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 105.

[00144] Em outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve codificadas por sequências nucleotídicas selecionadas do grupo que consiste em:

[00145] (a) SEQ ID NOs: 5 e 7, respectivamente; e

[00146] (b) SEQ ID NOs: 102 e 7, respectivamente.

[00147] Em outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve codificadas por sequências de nucleotídeos selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[00148] (a) SEQ ID NO: 5 e 7, respectivamente;

[00149] (b) SEQ ID NO: 5 e 29, respectivamente;

[00150] (c) SEQ ID NO: 5 e 31, respectivamente;

[00151] (d) SEQ ID NO: 5 e 33, respectivamente;

[00152] (e) SEQ ID NO: 5 e 35, respectivamente;

[00153] (f) SEQ ID NO: 5 e 37, respectivamente;

[00154] (9) SEQ ID NO: 5 e 39, respectivamente;

[00155] (h) SEQ ID NO: 5 e 41, respectivamente;

[00156] (i) SEQ ID NO: 5 e 43, respectivamente;

[00157] ()) SEQ ID NO: 5 e 45, respectivamente;

[00158] (k) SEQ ID NO: 5 e 47, respectivamente;

[00159] (1) SEQ ID NO: 9 e 7, respectivamente;

[00160] (m) SEQ ID NO: 11 e 7, respectivamente;

[00161] (n) SEQ ID NO: 13 e 7, respectivamente;

[00162] (0) SEQ ID NO: 15 e 7, respectivamente;

[00163] (po) SEQ ID NO: 17 e 7, respectivamente;

[00164] (a) SEQ ID NO: 19 e 7, respectivamente;

[00165] (r) SEQ ID NO: 21 e 7, respectivamente;

[00166] (s) SEQ ID NO: 23 e 7, respectivamente;

[00167] (t) SEQ ID NO: 25 e 7, respectivamente;

[00168] (u) SEQ ID NO: 27 e 7, respectivamente;

[00169] (v) SEQ ID NO: 102 e 7, respectivamente;

[00170] (w) SEQ ID NO: 104 e 7, respectivamente; e

[00171] (x) SEQ ID NO: 5 e 106, respectivamente.

[00172] Em ainda outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve, em que CDR3 de cadeia pesada compreende o conjunto de sequências de aminoácidos adiante na SEQ ID NO: 68.

[00173] Em outro aspecto, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve, em que a CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ ID NO: 126), em que X é qualquer aminoácido. Em alguns aspectos, X é qualquer aminoácido, exceto a alanina.

[00174] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve, em que a CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos DXPFXLDXXYYYYX (SEQ ID NO: 127), em que X é qualquer aminoácido. Em alguns aspectos, X é qualquer aminoácido, exceto a alanina.

[00175] Em ainda outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve, em que a CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ I|D NO: 126), em que X é qualquer aminoácido e em que a mutação dos resíduos D95, L100, Y100E,

Y100G, Y100H, ou combinações dos mesmos, resulta na perda de ligação ao CD137 humano.

[00176] Em outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve, em que a CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos DXPFXLDXXYYYYX (SEQ ID NO: 127), em que X é qualquer aminoácido e em que a mutação dos resíduos P97, F98, D100A, Y100D, Y100F ou combinações dos mesmos à alanina resulta na redução da ligação ao CD137 humano.

[00177] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve, em que a CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos DXPFXLDXXYYYYX (SEQ ID NO: 127), em que X é qualquer aminoácido e em que a mutação dos resíduos P97, F98, D100A, Y100D, Y100F ou combinações dos mesmos para qualquer resíduo, exceto a alanina, resulta em um aumento na ligação ao CD137 humano.

[00178] Em ainda outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve, em que a CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos DX1X2X3X4LX5X6X7X8YX9IYYX10 (SEQ ID NO: 128) em que X1 é qualquer aminoácido, em que X2 é um aminoácido não polar, em que X3 é um aminoácido não polar, em que X4 é qualquer aminoácido, em que X5 é um aminoácido polar, em que X6 é qualquer aminoácido, em que X7 é qualquer aminoácido, em que X8 é um aminoácido polar, em que X9 é um aminoácido polar e em que X10 é qualquer aminoácido. Em alguns aspectos, em que X2 é prolina, em que X3 é fenilalanina ou triptofano, em que X5 é ácido aspártico ou ácido glutâmico, em que X8 é tirosina e X9 é tirosina.

[00179] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[00180] (a) SEQ ID NO: 4 e 6, respectivamente;

[00181] (b) SEQ ID NO: 4 e 28, respectivamente;

[00182] (c) SEQ ID NO: 4 e 30, respectivamente;

[00183] (d) SEQ ID NO: 4 e 32, respectivamente;

[00184] (e) SEQ ID NO: 4 e 34, respectivamente;

[00185] (f) SEQ ID NO: 4 e 36, respectivamente;

[00186] (9) SEQ ID NO: 4 e 38, respectivamente;

[00187] (h) SEQ ID NO: 4 e 40, respectivamente;

[00188] (1) SEQ ID NO: 4 e 42, respectivamente;

[00189] ()) SEQ ID NO: 4 e 44, respectivamente;

[00190] (k) SEQ ID NO: 4 e 46, respectivamente;

[00191] (|) SEQ ID NO: 8 e 6, respectivamente;

[00192] (m) SEQ ID NO: 10 e 6, respectivamente;

[00193] (n) SEQ ID NO: 12 e 6, respectivamente;

[00194] (0) SEQ ID NO: 14 e 6, respectivamente;

[00195] (p) SEQ ID NO: 16 e 6, respectivamente;

[00196] (a) SEQ ID NO: 18 e 6, respectivamente;

[00197] (r) SEQ ID NO: 20 e 6, respectivamente;

[00198] (s) SEQ ID NO: 22 e 6, respectivamente;

[00199] (t) SEQ ID NO: 24 e 6, respectivamente;

[00200] (u) SEQ ID NO: 26 e 6, respectivamente;

[00201] (v) SEQ ID NO: 101 e 6, respectivamente;

[00202] (w) SEQ ID NO: 103 e 6, respectivamente; e

[00203] (x) SEQ ID NO: 4 e 105, respectivamente.

[00204] Em outros aspectos, a divulgação fornece, um anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 101 e 103; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 6, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 105.

[00205] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas à sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em:

[00206] (a) SEQ ID NO: 4 e 6, respectivamente;

[00207] (b) SEQ ID NO: 4 e 28, respectivamente;

[00208] (c) SEQ ID NO: 4 e 30, respectivamente;

[00209] (d) SEQ ID NO: 4 e 32, respectivamente;

[00210] (e) SEQ ID NO: 4 e 34, respectivamente;

[00211] (f) SEQ ID NO: 4 e 36, respectivamente;

[00212] (9) SEQ ID NO: 4 e 38, respectivamente;

[00213] (h) SEQ ID NO: 4 e 40, respectivamente;

[00214] (i) SEQ ID NO: 4 e 42, respectivamente;

[00215] ()) SEQ ID NO: 4 e 44, respectivamente;

[00216] (k) SEQ ID NO: 4 e 46, respectivamente;

[00217] (1) SEQ ID NO: 8 e 6, respectivamente;

[00218] (m) SEQ ID NO: 10 e 6, respectivamente;

[00219] (n) SEQ ID NO: 12 e 6, respectivamente;

[00220] (0) SEQ ID NO: 14 e 6, respectivamente;

[00221] (p) SEQ ID NO: 16 e 6, respectivamente;

[00222] (a) SEQ ID NO: 18 e 6, respectivamente;

[00223] (r) SEQ ID NO: 20 e 6, respectivamente;

[00224] (s) SEQ ID NO: 22 e 6, respectivamente;

[00225] (t) SEQ ID NO: 24 e 6, respectivamente;

[00226] (u) SEQ ID NO: 26 e 6, respectivamente;

[00227] (v) SEQ ID NO: 101 e 6, respectivamente;

[00228] (w) SEQ ID NO: 103 e 6, respectivamente; e

[00229] (x) SEQ ID NO: 4 e 105, respectivamente.

[00230] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende sequências de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em:

[00231] (a) SEQ ID NOs: 129 e 133, respectivamente; e

[00232] (b) SEQ ID NOs: 131 e 133, respectivamente.

[00233] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende sequências de cadeia pesada e leve com sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 129 e 133, respectivamente.

[00234] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende sequências de cadeia pesada e leve com sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 131 e 133, respectivamente

[00235] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno se liga especificamente a e agoniza o CD137 humano.

[00236] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, exibe pelo menos uma ou mais das seguintes propriedades selecionadas do grupo que consiste em:

[00237] induz ou aumenta a dimerização de trímeros CD137;

[00238] induz ou aumenta a multimerização de trímeros CD137;

[00239] induz ou aumenta a ativação de células T;

[00240] induz ou aumenta uma resposta de células T citotóxicas;

[00241] induz ou aumenta a proliferação de células T;

[00242] induz ou aumenta a produção de citocinas; e

[00243] qualquer combinação de propriedades (a)-(f).

[00244] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, exibe pelo menos uma ou mais das seguintes propriedades em relação a um anticorpo de referência que liga o CD137 humano, selecionado a partir do grupo que consiste em:

[00245] (a) não induz nem aumenta a ativação de células T intra- hepáticas;

[00246] (b) não induz nem aumenta a proliferação intra-hepática de células T;

[00247] (c) não induz nem aumenta a ativação intrasplênica de células T;

[00248] (d) não induz nem aumenta a proliferação intrasplênica de células T;

[00249] (e) não induz nem aumenta a ativação de macrófagos;

[00250] (f) não induz nem aumenta a diferenciação de macrófagos;

[00251] (9) não induz nem aumenta a atividade da alanina aminotransferase (ALT); e

[00252] (h) qualquer combinação de propriedades (a) - (g). Em alguns aspectos, o anticorpo de referência é o urelumab.

[00253] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, induz ou aprimora a ativação de células T mediadas por CD137 humano no microambiente do tumor, mas não induz ou melhora significativamente a ativação de células T mediadas por CD137 humano no baço e/ou fígado.

[00254] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, induz ou melhora a ativação das células T no microambiente do tumor, mas não induz ou melhora significativamente a ativação das células T no baço e/ou fígado.

[00255] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno induz ou aprimora a resposta de células T citotóxicas mediada por CD137 humano no microambiente do tumor, mas não induz ou melhora significativamente a resposta de células T citotóxicas mediada por CD137 humano no baço e/ou fígado.

[00256] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, induz ou melhora uma resposta de células T citotóxicas no microambiente do tumor, mas não induz ou melhora significativamente uma resposta de células T no baço e/ou fígado.

[00257] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno induz a proliferação de células T mediada por CD137 humano no microambiente do tumor, mas não induz significativamente a proliferação de células T mediada por CD137 humano no baço e/ou fígado.

[00258] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno induz a proliferação de células T no microambiente do tumor, mas não induz significativamente a proliferação de células T no baço e/ou fígado.

[00259] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno induz a infiltração de células T mediada por CD137 humano no microambiente do tumor, mas não induz significativamente a infiltração de células T mediada por CD137 humano no baço e/ou fígado.

[00260] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno induz a infiltração de células T no microambiente do tumor, mas não induz significativamente a infiltração de células T no baço e/ou fígado.

[00261] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, induz ou aumenta a produção de citocinas mediada por CD137 humano no microambiente do tumor, mas não induz ou melhora significativamente a produção de citocinas mediada por CD137 humano no baço e/ou fígado.

[00262] Em qualquer um dos aspectos anteriores, as propriedades da porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno aqui descritas, não são dependentes da ligação ao receptor gama Fc. Em alguns aspectos, as propriedades da porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno aqui descritas são aprimoradas pela ligação ao receptor gama Fc.

[00263] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno compete com o mAb1 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente). Em alguns aspectos, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno compete com o mAb1 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente), mab8 (isto é, um anticorpo compreendendo o sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 101 e 6, respectivamente) ou mAb10 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 26 e 6, respectivamente). Em alguns aspectos, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno compete com mab8ãê (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 101 e 6, respectivamente). Em alguns aspectos, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno compete com mAb10 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 26 e 6, respectivamente).

[00264] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno compreende pelo menos as propriedades funcionais do mAb1 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ

ID NOs: 4 e 6, respectivamente). Em alguns aspectos, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno compreende pelo menos as propriedades funcionais do mMAb1 (ou seja, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente), mab8 (ou seja, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 101 e 6, respectivamente) ou mAb10 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 26 e 6, respectivamente). Em alguns aspectos, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno compreende pelo menos as propriedades funcionais do mab8 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 101 e 6, respectivamente). Em alguns aspectos, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno compreende pelo menos as propriedades funcionais do mAb10O (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 26 e 6, respectivamente).

[00265] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno possui um valor Kp pelo menos equivalente ao mAb1 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente). Em alguns aspectos, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno possui um Kp valor pelo menos equivalente ao mAb1 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente), mab8 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 101 e 6, respectivamente) ou mAb10 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 26 e 6, respectivamente). Em alguns aspectos, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno possui um valor Kp pelo menos equivalente a mab8 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 101 e 6, respectivamente). Em alguns aspectos, o anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno possui um valor Ko pelo menos equivalente a mAb10 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 26 e 6, respectivamente).

[00266] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado ou a sua porção de ligação ao antígeno, reage de forma cruzada com o CD137 cinomolgo e/ou CD137 de camundongo.

[00267] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, é selecionado a partir do grupo que consiste em uma IgG1, uma IgG2 e I1gG3, uma IgG4 e IgM e IgA1 e IgA? e I|gD e um anticorpo IgE. Em alguns aspectos, o anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, é um anticorpo I9gG1 ou anticorpo I9G4.

[00268] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado compreende uma região constante de cadeia pesada de IgG1 do tipo selvagem ou IgG4 do tipo selvagem. Em alguns aspectos, o anticorpo monoclional isolado compreende uma região constante de cadeia pesada de I|gG1 mutante. Em alguns aspectos, o anticorpo monocional isolado compreende uma região constante de cadeia pesada de IgG4 mutante. Em alguns aspectos, a região constante da cadeia pesada de IgG4 mutante compreende uma substituição em Ser228. Em alguns aspectos, a região constante da cadeia pesada de IlgG4 mutante compreende a substituição S228P.

[00269] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, se liga a um epítopo de CD137, em que os resíduos de aminoácidos que compreendem o epítopo ligado pelo anticorpo estão localizados dentro de 4 angstroms dos resíduos de aminoácidos que compreendem o paratopo do anticorpo mMAb1, aqui descrito.

[00270] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, se liga a um epítopo de CD137, em que uma mutação do epítopo ligado ao anticorpo inibe, reduz ou bloqueia a ligação ao anticorpo e ao anticorpo mAb1.

[00271] Em qualquer um dos aspectos anteriores, o anticorpo isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, é totalmente humano ou humanizado (isto é, um anticorpo totalmente humano ou humanizado ou sua porção de ligação ao antígeno).

[00272] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclional isolado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, como descrito aqui, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00273] Em outros aspectos, a divulgação fornece um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve, a cadeia pesada ou as cadeias leve e pesada de um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, aqui descrita. Em alguns aspectos, o ácido nucleico compreende as SEQ ID NOs: 5 e 7. Em alguns aspectos, o ácido nucleico compreende as SEQ ID NOs: 102 e 7. Em alguns aspectos, a divulgação fornece um vetor de expressão compreendendo o ácido nucleico aqui descrito. Em outros aspectos, a divulgação fornece uma célula transformada com um vetor de expressão aqui descrito.

[00274] Em outro aspecto, a divulgação fornece um método para a produção de um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, o método compreendendo a manutenção de uma célula aqui descrita sob condições que permitem a expressão do anticorpo monoclonal ou sua porção de ligação ao antígeno. Em alguns aspectos, o método para produzir o anticorpo monoclional que se liga especificamente ao CD137 humano, ou sua porção de ligação ao antígeno, compreende ainda obter o anticorpo monoclonal ou sua porção de ligação ao antígeno.

[00275] Em ainda outro aspecto, a divulgação fornece um método para induzir ou melhorar a dimerização de trímeros CD137 humanos em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclional isolado ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, como aqui descrito, ou uma composição farmacêutica aqui descrita.

[00276] Em outro aspecto, a divulgação fornece um método para induzir ou aprimorar a multimerização de trímeros CD137 humanos em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, conforme descrito aqui, ou uma composição farmacêutica aqui descrita.

[00277] Em outros aspectos, a divulgação fornece um método para induzir ou melhorar a ativação de células T mediada por CD137 humano em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade da mesma, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação ao antígeno, como descrito aqui, ou uma composição farmacêutica aqui descrita. Em alguns aspectos, a ativação das células T ocorre em um microambiente tumoral. Em outros aspectos, a ativação das células T não ocorre significativamente no baço e/ou fígado do indivíduo.

[00278] Em outro aspecto, a divulgação fornece um método para induzir ou melhorar uma resposta de célula T citotóxica mediada por CD137 humano em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade da mesma, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, como aqui descrito, ou uma composição farmacêutica aqui descrita. Em alguns aspectos, a resposta das células T citotóxicas ocorre em um microambiente tumoral. Em outros aspectos, a resposta das células T citotóxicas não ocorre significativamente no baço e/ou fígado do indivíduo.

[00279] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um método para induzir ou melhorar a produção de citocinas mediada por CD137 humano em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade da mesma, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, como aqui descrito, ou uma composição farmacêutica aqui descrita. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-2, TNFa, IL-13, IFNyou combinações dos mesmos. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-2. Em alguns aspectos, a citocina produzida é TNFa. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-13. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IFNy. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-2 e TNFa. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-2 e I|L-13. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-2 e IFNy. Em alguns aspectos, a citocina produzida é TNFae IL-13. Em alguns aspectos, a citocina produzida é TNFa e IFNy. Em alguns aspectos, a citocina produzida é I|L-13 e IFNy. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-2, TNFa e IL-13. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-2, TNFa e IFNy. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IFNy TNFae IL-13. Em outros aspectos, a produção de citocinas ocorre em um microambiente tumoral. Em ainda outros aspectos, a produção de citocinas não ocorre significativamente no baço e/ou fígado do indivíduo.

[00280] Em outro aspecto, a divulgação fornece um método para induzir ou melhorar a proliferação de células T mediada por CD137 humano em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade da mesma, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação ao antígeno, como descrito aqui, ou uma composição farmacêutica aqui descrita. Em alguns aspectos, a proliferação de células T ocorre em um microambiente tumoral. Em outros aspectos, a proliferação de células T não ocorre significativamente no baço e/ou fígado do indivíduo.

[00281] Em outro aspecto, a divulgação fornece um método para reduzir ou inibir o crescimento de tumores, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade da mesma, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, como aqui descrito, ou uma composição farmacêutica aqui descrita.

[00282] Em ainda outro aspecto, a divulgação fornece um método para o tratamento de um distúrbio mediado pelo CD137 humano em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade da mesma, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação ao antígeno, conforme descrito aqui, ou uma composição farmacêutica aqui descrita.

[00283] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um método para o tratamento de câncer em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade da mesma, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, como aqui descrito, ou uma composição farmacêutica aqui descrita . Em alguns aspectos, o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de melanoma, glioma, renal, de mama, hematológico e de cabeça e pescoço. Em alguns aspectos, o câncer hematológico é um linfoma de células B.

[00284] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um método para induzir uma resposta imune à memória antitumoral, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade da mesma, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclional isolado ou uma porção de ligação ao antígeno, conforme descrito aqui, ou um produto farmacêutico composição aqui descrita.

[00285] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a infiltração de células imunes em um microambiente de tumor é aumentada após a administração de um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno. Em alguns aspectos, as células imunes expressam CD45.

[00286] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a quantidade de células T reguladoras (Treg) é reduzida em um microambiente tumoral após a administração de uma porção de ligação de anticorpo ou antígeno. Em alguns aspectos, as células Treg expressam CD4, FOXP-3 e CD24.

[00287] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a quantidade de células de macrófagos é reduzida em um microambiente tumoral após a administração de um anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno. Em alguns aspectos, os macrófagos expressam CD45 e CD11b.

[00288] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a exaustão das células T é reduzida após a administração de um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno. Em alguns aspectos, a redução da exaustão de células T compreende uma diminuição na expressão de TIGIT, PD-1, LAG- 3 ou uma combinação dos mesmos. Em alguns aspectos, a redução da exaustão de células T compreende uma diminuição na expressão de TIGIT e PD-1.

[00289] Em qualquer um dos aspectos anteriores, a depleção de células T CD4+, células T CD8+, células exterminadoras naturais ou suas combinações reduz a eficácia do anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno.

[00290] Em outro aspecto, a divulgação fornece um método para detectar a presença ou ausência de CD137 humano em uma amostra biológica, compreendendo:

[00291] por uma amostra biológica em contato com um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno aqui descrita, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno é marcado com uma substância detectável; e

[00292] (b) detectar o anticorpo ou a porção de ligação ao antígeno ligada ao CD137 humano para assim detectar a presença ou ausência de CD137 humano na amostra biológica.

[00293] Em outro aspecto, a divulgação fornece um kit compreendendo um recipiente compreendendo um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno aqui descrita, e um carreador farmaceuticamente aceitável opcional, ou uma composição farmacêutica descrita aqui, e uma bula compreendendo instruções para administração do anticorpo ou composição farmacêutica, para tratar ou retardar a progressão do câncer ou reduzir ou inibir o crescimento do tumor em um indivíduo em necessidade do mesmo.

[00294] Em outro aspecto, a divulgação fornece um kit compreendendo um recipiente compreendendo um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno aqui descrita, e um carreador farmaceuticamente aceitável opcional, ou uma composição farmacêutica descrita aqui, e uma bula compreendendo instruções para administração do anticorpo ou composição farmacêutica sozinha ou em combinação com outro agente, para tratar ou retardar a progressão do câncer ou reduzir ou inibir o crescimento do tumor em um indivíduo em necessidade do mesmo.

[00295] Em outro aspecto, a divulgação fornece o uso de um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, como descrito aqui, para induzir ou melhorar a ativação de células T mediada por CD137 humano em um indivíduo. Em outros aspectos, a divulgação fornece o uso de um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, como aqui descrito, para induzir ou aprimorar a multimerização de trímeros CD137 humanos em um indivíduo. Em outro aspecto, a divulgação fornece o uso de um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, como aqui descrito, para induzir ou aprimorar uma resposta de célula T citotóxica mediada pelo CD137 humano em um indivíduo. Em outros aspectos, a divulgação fornece o uso de um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, como aqui descrito, para induzir ou melhorar a produção de citocinas mediada por CD137 humano em um indivíduo. Em outro aspecto, a divulgação fornece o uso de um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, como descrito aqui, para induzir ou melhorar a proliferação de células T mediada por CD137 humano em um indivíduo.

[00296] Em outro aspecto, a divulgação fornece o uso de um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, como aqui descrito, para reduzir ou inibir o crescimento do tumor em um indivíduo em necessidade do mesmo. Em outros aspectos, a divulgação fornece o uso de um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, como aqui descrito, para tratar um distúrbio mediado pelo CD137 humano em um indivíduo em necessidade do mesmo. Em outro aspecto, a divulgação fornece o uso de um anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, como aqui descrito, para tratar o câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo.

[00297] Em outro aspecto, a divulgação fornece o uso de um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, como descrito aqui, para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou retardamento da progressão do câncer ou redução ou inibição do crescimento do tumor em um indivíduo em necessidade. Em outros aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, como aqui descrito, na fabricação de um medicamento para tratar ou retardar a progressão do câncer ou reduzir ou inibir o crescimento do tumor em um indivíduo em necessidade do mesmo. Em outro aspecto, a divulgação fornece um anticorpo monoclional isolado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, como aqui descrito, para uso como um medicamento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00298] A FIG. 1 fornece gráficos que representam a distribuição de afinidades de ligação de clones amadurecidos por afinidade do anticorpo parental anti-CD137 mAb1.

[00299] A FIG. 2 fornece um esquema mostrando os resultados da varredura de alanina mAb1 CDRH3, medida pela afinidade de ligação (Kp) para CD137 humano ou de camundongo.

[00300] A FIG. 3A mostra a sequência de aminoácidos do CD137 humano em que os resíduos compreendendo um epítopo ligado por mAb1, MAb4 ou mAb5 são indicados em nedgrito.

[00301] A FIG. 3B é um gráfico que representa os dados de ligação cinética do MAb1 ao domínio extracelular do CD137 de camundongo e rato, conforme determinado por ressonância plasmônica de superfície.

[00302] A FIG. 3C fornece imagens de cristalografia de raio-x do CD137 humano ligado a CD137L (mostrado em cinza) e resíduos E111, T113, K114 e P135 mostrados como esferas.

[00303] A FIG. 3D fornece imagens de cristalografia de raio-x do CD137 humano ligado a CD137L (mostrado em cinza) na formação trimérica e os resíduos E111, T113, K114 e P135 mostrados como esferas.

[00304] A FIG. 4A fornece um gráfico de dispersão de dados citométricos de fluxo, representando um aumento na expressão de TIGIT

(superior) ou PD-1 (inferior) nas células T CD44+ em resposta a anticorpos anti-CD137.

[00305] A FIG. 4B fornece gráficos que mostram a quantificação de células T CD8+ CD44+ que expressam TIGIT (em cima) ou PD-1 (em baixo) no baço de camundongos após tratamento com anticorpos anti- CD137.

[00306] A FIG. 4C fornece gráficos que descrevem a quantificação de células T CD8+ no baço de camundongos após o tratamento com anticorpos anti-CD137, como porcentagem de células CD45+ (esquerda) ou número de células por baço (direita).

[00307] A FIG. 5A fornece gráficos mostrando volumes individuais de tumor CT26 em camundongos após tratamento com anticorpos anti-CD137 nas dosagens indicadas.

[00308] A FIG. 5B é um gráfico que mostra os volumes médios de tumor fornecidos na FIG. 5A.

[00309] A FIG. 5C é um gráfico de Kaplan-Meier mostrando a sobrevida global de camundongos com tumores após tratamento com anticorpos anti-CD137.

[00310] A FIG. 5D é um gráfico que mostra o volume do tumor em camundongos re-desafiados com células CT26 tumorigênicas.

[00311] A FIG. 6A fornece gráficos mostrando volumes individuais de tumores CT26 em camundongos após tratamento com anticorpos anti- CD137 parentais e com maturidade de afinidade.

[00312] A FIG. 6B é um gráfico que fornece os volumes médios de tumor fornecidos na FIG. 6A.

[00313] A FIG. 7 fornece gráficos representando a porcentagem de células T CD8+ ou CD4+, de células T esplênicas (em cima) e leucócitos infiltrantes de tumores (em baixo) após tratamento com anticorpos anti- CD137 nas dosagens indicadas.

[00314] A FIG. 8 fornece gráficos mostrando volumes individuais de tumores quando os camundongos foram tratados com mAb1, com ou sem anticorpos que empobrecem os linfócitos. As células T CD4+ foram esgotadas com GK1.5 (gráfico do meio), as células T CD8+ foram esgotadas com YTS169.4 (segundo gráfico à direita) e as células NK foram esgotadas com um anticorpo anti-asialo-GM1 (último gráfico à direita).

[00315] A FIG. 9 fornece gráficos mostrando volumes individuais de tumores em camundongos com tumores CT26 (carcinoma do cólon), EMT-6 (carcinoma da mama), tumores AZ20 (linfoma de células B) ou tumores MC38 (carcinoma do cólon) e tratados com mAb8 ou anticorpo de controle de isotipo.

[00316] As FIGs. 10A-10C mostram a eficácia antitumoral in vivo de anticorpos anti-CD137 administrados a 150 ug/camundongo. Os volumes tumorais individuais são mostrados em 10A, os volumes médios do tumor são mostrados em 10B e o percentual de sobrevida é mostrado em 10C.

[00317] As FIGs. 11A-11C mostram a eficácia antitumoral in vivo de anticorpos anti-CD137 administrados a 20 ug/camundongo. Os volumes tumorais individuais são mostrados em 11A, os volumes médios do tumor são mostrados em 11B e o percentual de sobrevida é mostrado em 11C.

[00318] A FIG. 12 fornece gráficos mostrando volumes individuais de tumores em camundongos com tumores CT26 e tratados com doses variáveis de mMAb1 (ou seja, 12,5, 25, 50, 100 ou 200ug) ou controle de isotipo.

[00319] As FIGs. 13A e 13B mostram a contribuição da ligação de Fc na eficácia antitumoral do mMAb1. A FIG. 13A mostra mAb1 como um isotipo IgG4 ou um isotipo IgG4 aglicosilado. Os volumes médios do tumor são mostrados na parte superior e os volumes individuais do tumor são mostrados na parte inferior. A FIG. 13B mostra mAb1 como um isotipo IgG4 ou um isotipo IgG1 aglicosilado. Os volumes médios do tumor são mostrados na parte superior e os volumes individuais do tumor são mostrados na parte inferior.

[00320] As FIGs. 14A-14D mostram a eficácia antitumoral in vivo de anticorpos —anti-CD137 em camundongos com grandes tumores estabelecidos (ou seja, 500 mm?) antes de receber tratamento. Os volumes tumorais individuais são mostrados em 14A e 14D, os volumes médios do tumor são mostrados em 14B e o percentual de sobrevida é mostrado em 14C.

[00321] A FIG. 15 fornece um gráfico de sobrevivência de Kaplan- Meier mostrando imunidade antitumoral protetora em camundongos previamente tratados com mAb1, mAb8 ou controle de isotipo das FIGs. 14A-14C e considerado curado, desafiado novamente com células CT26 em um flanco oposto.

[00322] A FIG. 16A fornece gráficos de dispersão de dados citométricos de fluxo, mostrando a expansão de células T intra-hepáticas CD45+ após tratamento com anticorpos anti-CD137 nas dosagens indicadas.

[00323] A FIG. 16B fornece gráficos representando a quantificação de células T CD8+ intra-hepáticas (esquerda) e células T CD4+ (direita) após tratamento com anticorpos anti-CD137 nas dosagens indicadas.

[00324] A FIG. 17A fornece gráficos que representam a porcentagem de células T CD3+, CD4+ ou CD8+, a partir de células T esplênicas após o tratamento de camundongos com anticorpos anti-CD137 maturados por afinidade.

[00325] A FIG. 17B fornece gráficos que mostram a porcentagem de células T CD3+, CD4+ ou CD8+ das células T do fígado após o tratamento de camundongos com anticorpos anti-CD137 maturados por afinidade.

[00326] A FIG. 18A fornece gráficos que representam a porcentagem de células T CD8+ CD44+ esplênicas que expressam TIGIT, PD-1 ou LAG3 após o tratamento de camundongos com anticorpos anti-CD137 maturados por afinidade.

[00327] A FIG. 18B fornece gráficos que representam a porcentagem de células T CD8+ CD44+ no fígado que expressam TIGIT, PD-1 ou LAG3 após o tratamento de camundongos com anticorpos anti-CD137 maturados por afinidade.

[00328] A FIG. 19A fornece gráficos que representam a porcentagem de células T CD4+ CD44+ esplênicas que expressam TIGIT, PD-1 ou LAG3 após o tratamento de camundongos com anticorpos anti-CD137 maturados por afinidade.

[00329] A FIG. 19B fornece gráficos que representam a porcentagem de células T CD4+ CD44+ no fígado que expressam TIGIT, PD-1 ou LAG3 após o tratamento de camundongos com anticorpos anti-CD137 maturados por afinidade.

[00330] As FIGs. 20A-20C fornecem gráficos de indicadores in vivo de toxicidade resultantes de múltiplas administrações de anticorpos anti- CD137 mAb1, mAb8 ou 3H3 em doses variadas. A FIG. 20A é um gráfico que mostra a porcentagem de células T CD8+ no fígado após a administração dos anticorpos anti-CD137. A FIG. 20B é um gráfico que mostra a atividade da alanina aminotransferase (ALT) no plasma de camundongos administrados com anticorpos anti-CD137. A FIG. 20C é um gráfico que mostra os níveis de TNFoa no plasma de camundongos administrados anticorpos anti-CD137.

[00331] A FIG. 21 fornece imagens representativas de fígados seccionados corados com hematoxilina e eosina (H&E) de camundongos tratados com mAb1, mAb8, 3H3 ou controle de isotipo como descrito nas FIGs. 20A-20C. As setas indicam infiltração de células imunes.

[00332] As FIGs. 22A-22D fornecem gráficos representativos de FACS mostrando reprogramação de células imunes no microambiente do tumor. Aos camundongos com tumores CT26 foram administradas doses múltiplas de mAb8 ou controle de isotipo (dias O, 3, 6 e 9). A FIG. 22A mostra a infiltração global de células imunes com base na expressão de CDA45. A FIG. 22B mostra redução nas células Treg, conforme medido pela expressão de FOXP-3 e CD25. A FIG. 22C mostra redução da exaustão de células T, medida pela expressão de PD-1 e TIGIT. A FIG. 22D mostra redução de macrófagos associados a tumores como medido pela expressão de F4/80 e CD11b.

[00333] A FIG. 23 mostra análise de imunofenotipagem de baços de camundongos com tumores CT26 e tratados com anticorpos anti-CD137 mAb1 e 3H3, ou controle de isótipo.

[00334] A FIG. 24 é um gráfico que mostra a concentração de IL-2 (pg/ml) produzida por células T murinas em um ensaio de estimulação OVA, quando estimulada com os anticorpos anti-CD137 indicados. Juntamente com o Atezolizumab (anticorpo anti-PD-L1), um anti-PD-1 murino (RMP1-14) foi usado como um comparador.

[00335] As FIGs. 25A e 25B são gráficos que mostram a porcentagem de células T CD8+ murinas expressando CD25 (25A) ou TIGIT (25B) quando estimulados com os anticorpos anti-CD137 indicados, em um ensaio de estimulação OVA. Juntamente com o Atezolizumab (anticorpo anti-PD-L1), um anti-PD-1 murino (RMP1-14) e anti-CD137 murino (3H3) foram usados como comparadores.

[00336] A FIG. 26 fornece gráficos de barras representando a quantificação de citocinas (IL-2, TNFa, IL-13 e IFNy) produzidas por células T CD3+ após a incubação com anticorpos anti-CD137 ligados a placas. Os níveis de citocinas são mostrados como um aumento dobrado sobre a ativação da linha de base por um anticorpo anti-CD3.

[00337] As FIGs. 27A-27C fornecem gráficos representando a resposta à dose da produção de IFNy em uma reação linfocitária mista após tratamento com anticorpos anti-CD137. Um anticorpo anti-PD1 (Keytruda; Merck) foi usado como controle.

[00338] A FIG. 28. é um gráfico mostrando a produção de IFNy de células T humanas co-cultivadas com células CHO manipuladas para expressar CD32 (células CHO-CD32) na presença de anticorpos anti- CD137 mAb1, mAb8, mAb4 ou mAb5, ou controle de isótipo.

[00339] A FIG. 29 é um gráfico que mostra a proliferação de células Treg quando co-cultivadas com células CHO manipuladas para expressar CD32 (células CHO-CD32) na presença ou ausência de anticorpos anti- CD137 mAb1, mAb8, mAb4 ou mAb5, controle de isotipo.

[00340] A FIG. 30 fornece gráficos mostrando sinalização NFxB e SRF em células CCL-119 transduzidas com repórteres de luciferase para NFxB ou SRF na presença de mMAb1, mAB8, mAb4 ou mAb5 em concentrações variáveis.

[00341] A FIG. 31 fornece gráficos mostrando a indução de IL-6, TNFaou IL-27 por macrófagos de camundongo derivados da medula óssea estimulados com agonista de TLR9 CpG na presença de anticorpos anti- CD137 mAb1, 3H3 ou LOB12.3 ou controle de isotipo.

[00342] A FIG. 32. fornece um gráfico mostrando a indução de TNFa por macrófagos derivados de monócitos humanos estimulados com LPS na presença de anticorpos anti-CD137 mAb1, mAb4 ou mAb5, ou controle de isótipo.

[00343] A FIG. 33 fornece um gráfico mostrando o efeito de anticorpos anti-cCD137 na diferenciação de macrófagos, conforme determinado pela expressão de CD64 de monócitos THP1 cultivados com PMA na presença de anticorpos anti-CD137 mAb1, mAb4 ou mAb5 ou controle de isotipo.

[00344] As FIGs. 34A-34C fornecem gráficos mostrando a porcentagem de hCD45+, hCD8+ ou hCD4+ de camundongos imunocompetentes que receberam PBMCs humanos e anticorpos anti- CD137 mAb1, mAb4 ou mAb5 ou controle de isótipo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00345] Foi demonstrado que a terapia do câncer com anticorpos agonistas anti-CD137 induz rejeições tumorais mediadas por imunidade em camundongos, e agentes análogos desse tipo estão atualmente sendo testados em pacientes com câncer. Relatórios anteriores indicaram que a administração de anticorpos anti-CD137 pode induzir acúmulos significativos de infiltrados policlonais de linfócitos T no fígado (Dubrot et al., (2010) Cancer Immunology, Immunotherapy 59(8):1223-1233), sugestivos de inflamação hepática e o potencial de toxicidade hepática induzida por medicamentos. Um relatório recente sobre a avaliação clínica de um anticorpo agonístico anti-CD137 (Urelumab, BMS-663513; Bristol-Myers Squibb) documentou a observação de eventos adversos relacionados ao tratamento em indivíduos humanos, incluindo indicações de hepatotoxicidade grave (transaminite) correlacionada com dose de anticorpo (Segal et al., (2016) Clin Cancer Res 23(8): 1929-1936).

[00346] A presente divulgação fornece anticorpos monocionais isolados, ou porções de ligação ao antígeno, que se ligam especificamente a um epítopo do CD137 humano e agonizam o CD137 humano. Em algumas modalidades, o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compete com o mAb1 pela ligação ao epítopo do CD137 humano. Em alguns aspectos, os anticorpos agonistas anti-CD137 da divulgação induzem a produção de citocinas e a expansão de células T CD8+ no microambiente tumoral e imunidade antitumoral protetora in vivo com uma redução concomitante no potencial de eventos relacionados à toxicidade, em comparação com o anticorpo anti-CD137 3H3 de camundongo (Melero et al. (1997) Nature Medicine 3(6):682-685; Uno et al. (2006) Nature Medicine 12(6):693-696) e a pelo menos dois anticorpos anti-CD137 humanos em desenvolvimento clínico (BMS-663513/Urelumab, Bristol- Meyers Squibb e PF-05082566/Utomilumab, Pfizer).

Definições

[00347] Os termos usados nas reivindicações e no relatório descritivo são definidos conforme estabelecido abaixo, a menos que especificado de outra forma.

[00348] Deve-se notar que, conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o(a)" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Além disso, a menos que de outra forma exigido pelo contexto, os termos no singular devem incluir pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular.

[00349] Como usado aqui, "cerca de" será entendido por aqueles versados na técnica e variará até certo ponto, dependendo do contexto em que é usado. Se houver usos do termo que não sejam claros para as pessoas comuns, dado o contexto em que é usado, "cerca de" significará mais ou menos 10% do valor específico.

[00350] Como aqui utilizado, o termo "agonista" refere-se a qualquer molécula que, parcial ou totalmente, promova, induza, aumente e/ou ative uma atividade biológica de um polipeptídeo nativo aqui divulgado (por exemplo, CD137). Moléculas — agonistas — adequadas incluem especificamente anticorpos agonistas ou fragmentos de anticorpos, fragmentos ou variantes de sequência de aminoácidos de polipeptídeos nativos, peptídeos, oligonucleotídeos antisense, pequenas moléculas orgânicas, etc. Em algumas modalidades, a ativação na presença do agonista é observada de uma maneira dependente da dose. Em algumas modalidades, o sinal medido (por exemplo, atividade biológica) é de pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de

30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 100% superior ao sinal medido com um controle negativo em condições comparáveis. Também divulgados neste documento, são métodos de identificação de agonistas adequados para uso nos métodos da divulgação. Por exemplo, esses métodos incluem, mas não estão limitados a, ensaios de ligação, como ensaio imuno-absorvente ligado a enzima (ELISA), sistemas Forte Bio O e radioimunoensaio (RIA). Estes ensaios determinam a capacidade de um agonista de se ligar ao polipeptídeo de interesse (por exemplo, um receptor ou ligante, por exemplo, CD137) e, portanto, indicam a capacidade do agonista de promover, aumentar ou ativar a atividade do polipeptídeo. A eficácia de um agonista também pode ser determinada usando ensaios funcionais, como a capacidade de um agonista de ativar ou promover a função do polipeptídeo. Por exemplo, um ensaio funcional pode compreender o contato de um polipeptídeo com uma molécula agonista candidata e a medição de uma alteração detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas ao polipeptídeo. A potência de um agonista é geralmente definida por seu valor ECso (concentração necessária para ativar 50% da resposta agonista). Quanto menor o valor de CEso maior a potência do agonista e menor a concentração necessária para ativar a resposta biológica máxima.

[00351] Conforme aqui utilizado, o termo "varredura de alanina" refere-se a uma técnica usada para determinar a contribuição de um resíduo de tipo selvagem específico para a estabilidade ou função(ões) (por exemplo, afinidade de ligação) de uma dada proteína ou polipeptídeo. À técnica envolve a substituição de um resíduo de alanina por um resíduo do tipo selvagem em um polipeptídeo, seguido de uma avaliação da estabilidade ou função(ões) (por exemplo, afinidade de ligação) do derivado substituído pela alanina ou polipeptídeo mutante e comparação com o polipeptídeo do tipo selvagem. Técnicas para substituir a alanina por um resíduo do tipo selvagem em um polipeptídeo são conhecidas na técnica.

[00352] O termo "melhora" referese a qualquer resultado terapeuticamente benéfico no tratamento de um estado de doença, por exemplo, câncer, incluindo profilaxia, diminuição da gravidade ou progressão, remissão ou cura do mesmo.

[00353] Como aqui utilizado, o termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos naturais e sintéticos, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de maneira semelhante aos aminoácidos naturais. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como os aminoácidos que são modificados posteriormente, por exemplo, hidroxiprolina, yY- carboxiglutamato e O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos se referem a compostos que têm a mesma estrutura química básica de um aminoácido que ocorre naturalmente, ou seja, um carbono que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metilsulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou estruturas peptídicas modificadas, mas mantêm a mesma estrutura química básica que um aminoácido que ocorre naturalmente. Os miméticos de aminoácidos referem-se a compostos químicos que possuem uma estrutura diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam de maneira semelhante a um aminoácido que ocorre naturalmente.

[00354] Os aminoácidos podem ser aqui referidos por seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Os nucleotídeos, da mesma forma, podem ser referidos por seus códigos de letra única comumente aceitos. Conforme usado aqui, um "aminoácido polar" refere-se a um aminoácido compreendendo uma cadeia lateral que prefere residir em um ambiente aquoso. Em algumas modalidades, um aminoácido polar é selecionado do grupo que consiste em: arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, histidina, lisina, serina, teronina e tirosina. Os aminoácidos polares podem ser positivos, carregados negativa ou neutralmente. Conforme usado aqui, um "aminoácido não polar" refere-se a um aminoácido selecionado do grupo que consiste em: alanina, cisteína, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano e valina.

[00355] Conforme aqui utilizado, uma "substituição de aminoácido" refere-se à substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido existente em uma sequência de aminoácidos predeterminada (uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de partida) por um segundo resíduo de aminoácido de "substituição" diferente. Uma "inserção de aminoácido" refere-se à incorporação de pelo menos um aminoácido adicional em uma sequência de aminoácidos predeterminada. Embora a inserção geralmente consista na inserção de um ou dois resíduos de aminoácidos, também podem ser feitas "inserções peptídicas" maiores, por exemplo, inserção de cerca de três a cerca de cinco ou até dez, quinze ou vinte resíduos de aminoácidos. O(s) resíduo(s) inserido(s) pode(m) ocorrer naturalmente ou não, como descrito acima. Uma "deleção de aminoácidos" refere-se à remoção de pelo menos um resíduo de aminoácido de uma sequência predeterminada de aminoácidos.

[00356] Conforme usado aqui, o termo "quantidade" ou "nível" refere- se a uma quantidade detectável, nível ou abundância de uma substância (por exemplo, uma proteína). Ao se referir a um polipeptídeo, como os descritos aqui, o termo "nível de expressão" em geral é usado de forma intercambiável e geralmente se refere a uma quantidade detectável de um polipeptídeo em uma amostra biológica (por exemplo, na superfície da uma célula).

[00357] Como usado aqui, o termo "anticorpo agonista anti-CD137" (usado de forma intercambiável com o termo "anticorpo anti-CD137") refere-se a um anticorpo que se liga especificamente a CD137 e, parcial ou totalmente, promove, induz, aumenta e/ou ativa atividade ou resposta biológica de CD137 e/ou vias a jusante mediadas por sinalização de CD137 ou outra função mediada por CD137. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 se liga a CD137 e permite a ligação de CD137L. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 se liga a CD137 e induz a multimerização de CD137. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 se liga a CD137 e induz a dimerização dos trímeros CD137. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 se liga a CD137 e induz a multimerização de trímeros CD137. Exemplos de anticorpos agonistas anti-CD137 são fornecidos neste documento. Os métodos para detectar a formação de um complexo trímero:trímero são conhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, a microscopia eletrônica demonstrou detectar tais complexos, ver, por exemplo, Won, E. The Journal of Biological Chemistry, vol. 285 (12): 9202- 9210 (2010)

[00358] Como usado aqui, o termo "anti-CD137 mAb1" (usado de forma intercambiável com "mMAb1") refere-se a um exemplo de anticorpo agonista anti-CD137 que compreende a sequência de aminoácidos de cadeia pesada variável (Vr):

[00359] EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQ

APGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCAKDSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 4),

[00360] e a sequência de aminoácidos de cadeia leve variável (V.):

[00361] DIQMTAOSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKP

GKAPKLLIYAASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQOPEDFATYYCQQG HLFPITFEGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 6).

[00362] Como usado aqui, o termo "anti-CD137 mAb8" (usado de forma intercambiável com "mAb8") refere-se a um anticorpo agonista anti- CD137 exemplar que compreende a sequência de aminoácidos de cadeia pesada variável ((Vn):

[00363] EVOLLESGGGLVQAPGGSLRLSCAASGFTFRNYAMSWVRQ

APGKGLEWVSAISGSGDTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCAKDSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS (SEQ |D NO: 101);

[00364] e a sequência de aminoácidos de cadeia leve variável (V.):

[00365] DIQMTAOSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKP

[00366] Como usado aqui, o termo "anti-CD137 mAb10" (usado de forma intercambiável com "mAb10") refere-se a um anticorpo agonista anti- CD137 exemplar que compreende a sequência de aminoácidos de cadeia pesada variável ((V+):

[00367] EVOLLESGGGLVQAPGGSLRLSCAASGFTFYGYAMSWVRQ

APGKGLEWVAAISGSGDSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCAKDSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS (SEQ |D NO: 26);

[00368] e a sequência de aminoácidos de cadeia leve variável (V.):

[00369] DIQMTAOSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKP

GKAPKLLIYAASSLAOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQAG HLFPITFEGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 6).

[00370] Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" refere-se a um anticorpo completo compreendendo dois polipeptídeos de cadeia leve e dois polipeptídeos de cadeia pesada. Os anticorpos completos incluem diferentes isotipos de anticorpos, incluindo anticorpos IgM, IgG, IgA, IgD e IgE. O termo "anticorpo" inclui um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico ou quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo primatizado, um anticorpo desimunizado e um anticorpo totalmente humano. O anticorpo pode ser produzido ou derivado de qualquer uma de uma variedade de espécies, por exemplo, mamíferos, como seres humanos, primatas não humanos (por exemplo, orangotango, babuínos ou chimpanzés), cavalos, gado, porcos, ovelhas, cabras, cães, gatos, coelhos, porquinhos da índia, gerbos, hamsters, ratos e camundongos. O anticorpo pode ser um anticorpo purificado ou recombinante.

[00371] Conforme usado aqui, os termos "fragmento de anticorpo", "fragmento de ligação ao antígeno", "porção de ligação ao antígeno" ou termos semelhantes se referem a um fragmento de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar a um antígeno alvo (por exemplo, CD137) e inibira atividade do antígeno alvo. Tais fragmentos incluem, por exemplo, um anticorpo de cadeia única, um fragmento Fv de cadeia única (scFv), um fragmento Fd, um fragmento Fab, um fragmento Fab' ou um fragmento F(ab')a. Um fragmento scFv é uma cadeia polipeptídica única que inclui as regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo a partir do qual o scFv é derivado. Além disso, intracorpos, minicorpos, triacorpos e diacorpos também estão incluídos na definição de anticorpo e são compatíveis para uso nos métodos aqui descritos. Ver, por exemplo, Todorovska et al. (2001) J. Immunol. Methods 248(1):47-66; Hudson e Kortt, (1999) J. Immunol. Methods 231(1):177-189; Poljak, (1994) Structure 2(12):1121-

1123; Rondon e Marasco, (1997) Annu. Rev. Microbiol. 51: 257-283, cujas divulgações são incorporadas aqui por referência na sua totalidade.

[00372] Como usado aqui, o termo "fragmento de anticorpo" também inclui, por exemplo, anticorpos de domínio único, como anticorpos de domínio único camelizados. Ver, por exemplo, Muyldermans et al., (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230-235; Nuttall et al., (2000) Curr. Pharm. Biotech. 1:253-263; Reichmann et al., (1999) J. Immunol. Meth. 231:25-38; Publicação de Pedido PCT nº WO 94/04678 e WO 94/25591; e patente dos EUA nº 6.005.079, todos os quais são incorporados aqui por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, a divulgação fornece anticorpos de domínio único compreendendo dois domínios VH com modificações de modo que os anticorpos de domínio único sejam formados.

[00373] Em algumas modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno inclui a região variável de um polipeptídeo de cadeia pesada e a região variável de um polipeptídeo de cadeia leve. Em algumas modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito compreende as CDRs do polipeptídeo de cadeia leve e cadeia pesada de um anticorpo.

[00374] O termo "célula apresentadora de antígeno" ou "APC" é uma célula que exibe antígeno estrangeiro complexado com MHC na sua superfície. Células T reconhecem esse complexo usando o receptor de células T (TOR). Exemplos de APCs incluem, entre outros, células dendríticas (DCs), células mononucleares do sangue periférico (PBMC), monócitos (como THP-1), células linfoblastóides B (como C1R.A2, 1518 B- LCL) e células dendríticas derivadas de monócitos (DCs). Algumas APCs internalizam antígenos por fagocitose ou por endocitose mediada por receptor.

[00375] O termo "apresentação de antígeno" refere-se ao processo pelo qual as APCs capturam antígenos e permitem seu reconhecimento pelas células T, por exemplo, como um componente de um conjugado MHC-I e/ou MHC-II.

[00376] Como aqui utilizado, o termo "apoptose" refere-se ao processo de morte celular programada que ocorre em organismos multicelulares (por exemplo, humanos). Os eventos bioquímicos e moleculares altamente regulados que resultam em apoptose podem levar a alterações morfológicas observáveis e características de uma célula, incluindo blebbing da membrana, encolhimento do volume celular, condensação e fragmentação cromossômica do DNA e deterioração do MRNA. Um método comum para identificar células, incluindo células T, em apoptose é expor as células a uma proteína conjugada com fluoróforo (Anexina V). A Anexina V é comumente usada para detectar células apoptóticas por sua capacidade de se ligar à fosfatidilserina no folheto externo da membrana plasmática, que é um indicador precoce de que a célula está passando pelo processo de apoptose.

[00377] Como usado aqui, o termo "liga-se a CD137 imobilizado", refere-se à capacidade de um anticorpo humano da divulgação se ligar a CD137, por exemplo, expresso na superfície de uma célula ou que está ligado a um suporte sólido.

[00378] Como usado aqui, o termo "anticorpo biespecífico" ou "bifuncional" refere-se a um anticorpo híbrido artificial com dois pares diferentes de cadeia pesada/leve e dois locais de ligação diferentes. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos, incluindo a fusão de hibridomas ou a ligação de fragmentos Fab". Ver, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., (1992) J. Immunol. 148:1547-1553.

[00379] Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, onde os dois pares de cadeia pesada/cadeia leve têm especificidades diferentes (Milstein e Cuello, (1983) Nature 305:537-539). Os domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo- antígeno) podem ser fundidos com sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão da região variável de cadeia pesada é preferencialmente com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo pelo menos parte das regiões de dobradiça, CH2 e CH3. Para mais detalhes dos métodos ilustrativos atualmente conhecidos para gerar anticorpos biespeciíficos, ver, por exemplo, Suresh et al., (1986) Methods Enzymol. 121:210; Publicação PCT nº WO 96/27011; Brennan et al., (1985) Science 229:81; Shalaby et al., J. Exp. Med. (1992) 175:217-225; Kostelny et al., (1992) J. Immunol. 148(5):1547-1553; Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Gruber et al., (1994) J. Immunol. 152:5368; e Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60. Os anticorpos biespecíficos também incluem anticorpos reticulados ou heteroconjugados. Os anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos usando quaisquer métodos convenientes de reticulação. Agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica e são divulgados na Patente dos EUA nº

4.676.980, juntamente com várias técnicas de reticulação.

[00380] Várias técnicas para produzir e isolar fragmentos de anticorpos biespeciíficos diretamente da cultura de células recombinantes também foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando zíperes de leucina. Ver, por exemplo, Kostelny et al. (1992) J Immunol 148(5):1547-1553. Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun podem ser ligados às porções Fab 'de dois anticorpos diferentes por fusão genética. Os homodímeros de anticorpos podem ser reduzidos na região de dobradiça para formar monômeros e depois reoxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos.

A tecnologia "diacorpo" descrita por Hollinger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 6444-6448 forneceu um mecanismo alternativo para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Por conseguinte, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios complementares VL e VH de outro fragmento, formando assim dois locais de ligação ao antígeno. Outra estratégia para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos pelo uso de dímeros de cadeia simples de Fv (scFv) também foi relatada. Ver, por exemplo, Gruber et al. (1994) J Immunol 152:5368. Alternativamente, os anticorpos podem ser "anticorpos lineares", conforme descrito em, por exemplo, Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062. Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que formam um par de regiões de ligação ao antígeno. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespeciíficos.

[00381] Anticorpos com mais de duas valências (por exemplo, anticorpos triespecíficos) são contemplados e descritos em, por exemplo, Tutt et al. (1991) J Immunol 147:60.

[00382] A divulgação também abrange formas variantes de anticorpos multiespecíficos, como as moléculas de imunoglobulina de domínio variável duplo (DVD-lg) descritas em Wu et al. (2007) Nat Biotechnol 25(11): 1290-1297. As moléculas de DVD-lg são projetadas de modo que dois domínios variáveis de cadeia leve (VL) diferentes de dois anticorpos parentais diferentes sejam ligados em tandem diretamente ou através de um ligante curto por técnicas de DNA recombinante, seguidas pelo domínio constante de cadeia leve. Do mesmo modo, a cadeia pesada compreende dois domínios variáveis de cadeia pesada (VH) diferentes ligados em tandem, seguidos pelo domínio constante CH1 e região Fc. Os métodos para produzir moléculas de DVD-lg a partir de dois anticorpos progenitores são ainda descritos, por exemplo, nas Publicações PCT nºs WO 08/024188 e WO 07/024715. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é uma imunoglobulina Fabs-in-Tandem, na qual a região variável de cadeia leve com uma segunda especificidade é fundida à região variável de cadeia pesada de um anticorpo inteiro. Tais anticorpos são descritos, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente Internacional nº WO 2015/103072.

[00383] Como usado aqui, "antígeno de câncer" refere-se a (i) antígenos específicos de tumores, (ii) antígenos associados a tumores, (iii) células que expressam antígenos específicos de tumores, (iv) células que expressam antígenos associados a tumores, (v) antígenos embrionários nos tumores, (vi) células tumorais autólogas, (vii) antígenos de membrana específicos para tumores, (viii) antígenos de membrana associados a tumores, (ix) receptores de fator de crescimento, (x) ligantes do fator de crescimento e (xi) qualquer outro tipo de antígeno ou célula ou material apresentador de antígeno associado a um câncer.

[00384] O termo "carcinoma" é reconhecido na técnica e refere-se a malignidades de tecidos epiteliais ou endócrinos, incluindo carcinomas do sistema respiratório, carcinomas do sistema gastrointestinal, carcinomas do sistema geniturinário, carcinomas testiculares, carcinomas da mama, carcinomas prostáticos, carcinomas do sistema endócrino e melanomas. Os anticorpos anti-CD137 aqui descritos podem ser usados para tratar pacientes que têm, que são suspeitos de ter, ou que podem estar em alto risco de desenvolver qualquer tipo de câncer, incluindo carcinoma renal ou melanoma. Carcinomas exemplares incluem aqueles formados a partir de tecido do colo do útero, pulmão, próstata, mama, cabeça e pescoço, cólon e ovário. O termo também inclui carcinosarcomas, que incluem tumores malignos compostos por tecidos carcinomatosos e sarcomatosos. Um "adenocarcinoma" refere-se a um carcinoma derivado de tecido glandular ou no qual as células tumorais formam estruturas glandulares reconhecíveis.

[00385] Como aqui utilizado, o termo "competir", quando usado no contexto de proteínas de ligação ao antígeno (por exemplo, imunoglobulinas, anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno) que competem pela ligação ao mesmo epítopo, refere-se a uma interação entre a ligação ao antígeno proteínas determinadas por um ensaio (por exemplo, um ensaio de ligação competitiva; um ensaio de bloqueio cruzado), em que uma proteína de ligação ao antígeno de teste (por exemplo, um anticorpo de teste) inibe (por exemplo, reduz ou bloqueia) a ligação específica de um antígeno de referência proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo de referência, como mAb1) a um antígeno comum (por exemplo, CD137 ou um fragmento do mesmo).

[00386] Em algumas modalidades, os anticorpos aqui descritos competem cruzadamente com o mAb1 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis das cadeias pesada e leve de SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente), mab8 (isto é, um anticorpo compreendendo as variáveis das cadeias pesada e leve sequências de SEQ ID NOs: 101 e 6, respectivamente) ou mAb10 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis das cadeias pesada e leve de SEQ ID NOs: 26 e 6, respectivamente).

[00387] Uma sequência de polipeptídeo ou aminoácido "derivada de" um polipeptídeo ou proteína designada refere-se à origem do polipeptídeo. Preferencialmente, a sequência de polipeptídeo ou aminoácido que é derivada de uma sequência específica tem uma sequência de aminoácidos que é essencialmente idêntica a essa sequência ou a uma porção dela, em que a porção consiste em pelo menos 10-20 aminoácidos,

preferencialmente pelo menos 20-30 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 30-50 aminoácidos, ou que de outro modo é identificável por um versado na técnica como tendo sua origem na sequência. Os polipeptídeos derivados de outro peptídeo podem ter uma ou mais mutações em relação ao polipeptídeo inicial, por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos que foram substituídos por outro resíduo de aminoácido ou que têm uma ou mais inserções ou deleções de resíduos de aminoácidos.

[00388] Um polipeptídeo pode compreender uma sequência de aminoácidos que não ocorre naturalmente. Tais variantes têm necessariamente menos de 100% de identidade ou semelhança de sequência com a molécula inicial. Em certas modalidades, a variante terá uma sequência de aminoácidos de cerca de 75% a menos de 100% de identidade ou similaridade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de partida, mais preferencialmente de cerca de 80% a menos de 100%, mais preferencialmente de cerca de 85% a menos de 100%, mais preferencialmente de cerca de 90% a menos de 100% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) e mais preferencialmente de cerca de 95% a menos de 100%, por exemplo, ao longo do comprimento da molécula variante.

[00389] Em certas modalidades, há uma diferença de aminoácidos entre uma sequência polipeptídica inicial e a sequência derivada da mesma. A identidade ou semelhança com relação a esta sequência é aqui definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos (ou seja, o mesmo resíduo) com os resíduos de aminoácidos iniciais, depois de alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a identidade de sequência percentual máxima. Em certas modalidades, um polipeptídeo consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de uma sequência apresentada na Tabela 3 ou na Tabela 4. Em certas modalidades, um polipeptídeo inclui uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de uma sequência estabelecida na Tabela 3 ou Tabela 4. Em certas modalidades, um polipeptídeo inclui uma sequência de aminoácidos contígua pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos contígua selecionada a partir de uma sequência estabelecida na Tabela 3 ou Tabela 4. Em certas modalidades, um polipeptídeo inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 ou 500 (ou qualquer número inteiro dentro desses números) aminoácidos contíguos de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de uma sequência estabelecida na Tabela 3 ou na Tabela 4.

[00390] Em certas modalidades, os anticorpos da divulgação são codificados por uma sequência de nucleotídeos. As sequências nucleotídicas da invenção podem ser úteis para várias aplicações, incluindo: clonagem, terapia genética, expressão e purificação de proteínas, introdução de mutações, vacinação de DNA de um hospedeiro em necessidade, geração de anticorpos para, por exemplo, imunização passiva, PCR, iniciador e geração de sonda e similares. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica da invenção compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em uma sequência nucleotídica selecionada a partir de uma sequência apresentada na Tabela 3 ou na Tabela 4. Em certas modalidades, uma sequência de nucleotídeos inclui uma sequência de nucleotídeos pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,

98% ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de uma sequência apresentada na Tabela 3 ou Tabela 4. Em certas modalidades, uma sequência de nucleotídeos inclui uma sequência de nucleotídeos contígua pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência nucleotídica contígua selecionada a partir de uma sequência estabelecida na Tabela 3 ou Tabela 4. Em certas modalidades, uma sequência de nucleotídeos inclui uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 ou 500 (ou qualquer número inteiro dentro desses números) nucleotídeos contíguos de uma sequência nucleotídica selecionada a partir de uma sequência estabelecida na Tabela 3 ou na Tabela 4.

[00391] Também será entendido por aquele versado na técnica que os anticorpos adequados para uso nos métodos divulgados neste documento podem ser alterados de modo que variem em sequência das sequências naturais ou nativas das quais foram derivadas, mantendo a atividade desejável das sequências nativas. Por exemplo, podem ser feitas substituições de nucleotídeos ou aminoácidos que levam a substituições conservadoras ou alterações em resíduos de aminoácidos "não essenciais". As mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, tais como mutagênese dirigida ao local e mutagênese mediada por PCR.

[00392] Os anticorpos adequados para uso nos métodos aqui divulgados “podem compreender substituições conservadoras de aminoácidos em um ou mais resíduos de aminoácidos, por exemplo, em resíduos de aminoácidos essenciais ou não essenciais. Uma "substituição conservadora de aminoácidos" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido possuindo uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais ramificadas beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não essencial em um polipeptídeo de ligação é de preferência substituído por outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeias laterais. Em certas modalidades, uma cadeia de aminoácidos pode ser substituída por uma cadeia estruturalmente semelhante que difere na ordem e/ou composição dos membros da família da cadeia lateral. Alternativamente, em certas modalidades, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte de uma sequência de codificação, como por mutagênese por saturação, e os mutantes resultantes podem ser incorporados nos polipeptídeos de ligação da invenção e rastreados quanto à sua capacidade de se ligar ao alvo desejado .

[00393] Como usado aqui, o termo "apresentação cruzada" do antígeno refere-se à apresentação de antígenos protéicos exógenos a células T por meio de moléculas MHC classe | e classe |l em APCs.

[00394] Como usado aqui, o termo "reação cruzada" refere-se à capacidade de um anticorpo da divulgação se ligar ao CD137 de uma espécie diferente. Por exemplo, um anticorpo da presente divulgação que se liga a CD137 humano também pode se ligar a outras espécies de CD137. Conforme usado aqui, a reatividade cruzada é medida detectando uma reatividade específica com antígeno purificado em ensaios de ligação (por exemplo, SPR, ELISA) ou ligação a, ou de outra forma funcionalmente interagindo com, células que expressam fisiologicamente CD137. Os métodos para determinar a reatividade cruzada incluem ensaios de ligação padrão, como descrito aqui, por exemplo, por análise por ressonância plasmônica de superfície (SPR) Biacore'"Y usando um instrumento SPR 2000 Biacore'Y (Biacore AB, Uppsala, Suécia) ou técnicas de citometria de fluxo.

[00395] Como usado aqui, o termo "resposta de linfócitos T citotóxicos (CTL)" refere-se a uma resposta imune induzida por células T citotóxicas. As respostas CTL são mediadas principalmente por células T CD8*.

[00396] Como aqui utilizado, o termo "dimerização" refere-se à formação de um complexo macromolecular por duas macromoléculas usualmente não covalentemente ligadas, como proteínas ou multímeros de proteínas. Homodimerização refere-se ao processo de dimerização quando as macromoléculas (por exemplo, proteínas) são de natureza idêntica. À heterodimerização refere-se ao processo de dimerização quando as macromoléculas (por exemplo, proteínas) são de natureza não idêntica. Os métodos para determinar a dimerização são conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, esses métodos incluem, entre outros, ensaio de dois híbridos de levedura, transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET), espectrometria de massa de proteínas, métodos de ondas evanescentes, cromatografia de exclusão de tamanho, ultracentrifugação analítica, técnicas de espalhamento, espectroscopia de RMN, calorimetria de titulação isotérmica, anisotropia de fluorescência, espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), recuperação de fluorescência após fotodegradação (FRAP), imagem por proximidade (PRIM) e complementação de fluorescência bimolecular (BiIFC) (ver, por exemplo, Gell D.A., Grant R.P., Mackay J.P. (2012) The Detection and

Quantitation of Protein Oligomerization. In: Matthews J.M. (eds) Protein Dimerization and Oligomerization in Biology. Advances in Experimental Medicine and Biology, vol 747. Springer, New York, NY; e Xie, Q. et al. Methods Mol Biol, 2011; 680: 3-28).

[00397] Conforme aqui utilizados, os termos "dimerização de CD137" referem-se à dimerização de dois trímeros de CD137. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a dimerização de CD137. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a dimerização de CD137 em relação à quantidade de dimerização na ausência de um anticorpo agonista anti-CD137. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a dimerização de CD137 em relação à quantidade de dimerização na presença de um anticorpo agonista anti-CD137 de referência. Em algumas modalidades, a dimerização é aumentada em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%.

[00398] Conforme usado aquiiy o termo "ECso" refere-se à concentração de um anticorpo ou de uma porção de ligação ao antígeno, que induz uma resposta, em um ensaio in vitro ou in vivo, que é de 50% da resposta máxima, ou seja, a meio caminho entre a resposta máxima e a linha de base.

[00399] Como aqui utilizado, o termo "dose eficaz" ou "dosagem eficaz" é definido como uma quantidade suficiente para atingir ou pelo menos parcialmente alcançar o efeito desejado. O termo "dose terapeuticamente eficaz" é definido como uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos parcialmente deter a doença e suas complicações em um paciente que já sofre da doença. Os valores efetivos para esse uso dependerão da gravidade do distúrbio que está sendo tratado e do estado geral do sistema imunológico do paciente.

[00400] Conforme usado aqui, o termo "epítopo" ou "determinante antigênico" refere-se a um determinante ou local em um antígeno (por exemplo, CD137) ao qual uma proteína de ligação a antígeno (por exemplo, uma imunoglobulina, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno) se liga especificamente. Os epítopos dos antígenos de proteínas podem ser demarcados em "epítopos lineares" e "epítopos conformacionais". Como aqui utilizado, o termo "epítopo linear" refere-se a um epítopo formado a partir de uma sequência linear e contígua de aminoácidos ligados. Epítopos lineares de antígenos protéicos são tipicamente retidos após a exposição a desnaturantes químicos (por exemplo, ácidos, bases, solventes, reagentes de reticulação, agentes caotrópicos, agentes redutores de ligação dissulfeto) ou desnaturantes físicos (por exemplo, calor térmico, radioatividade ou cisalhamento mecânico ou tensão) Em algumas modalidades, um epítopo é não linear, também conhecido como epítopo interrompido. Como aqui utilizado, o termo "epítopo conformacional" ou "epítopo não linear" refere-se a um epítopo formado a partir de aminoácidos não contíguos justapostos por dobragem terciária de um polipeptídeo. Os epítopos conformacionais são tipicamente perdidos com o tratamento com desnaturantes. Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3, 4, 5, 6,7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos em uma conformação espacial única. Em algumas modalidades, um epítopo inclui menos de 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 aminoácidos em uma conformação espacial única. Geralmente, um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, específico para uma molécula alvo específica, preferencialmente reconhecerá e se ligará a um epítopo específico na molécula alvo dentro de uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. Em algumas modalidades, um epítopo não inclui todos os aminoácidos do domínio extracelular do CD137 humano.

[00401] Também abrangidos pela presente divulgação estão os anticorpos que se ligam a um epítopo no CD137 que compreende todo ou uma porção de um epítopo reconhecido pelos anticorpos específicos aqui descritos (por exemplo, a mesma região ou sobreposição ou região entre ou abrangendo a região).

[00402] Conforme usado aqui, o termo "mapeamento de epítopos" refere-se a um processo ou método de identificação do local de ligação, ou epítopo, de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em seu antígeno de proteína alvo. Métodos e técnicas de mapeamento de epítopos são aqui fornecidos.

[00403] Como aqui utilizado, o termo "CD137" refere-se a um membro específico da família de proteínas transmembranares do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR). Nomes e acrônimos alternativos para CD137 na técnica incluem "membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral 9" (TNFRSF9), 4-1BB e "induzido pela ativação de linfócitos" (ILA) (Alderson et al., (1994) Eur J Immunol 24(9):2219-2227; Schwarz et al, (1993) Gene 134(2):295-298) Uma sequência de aminoácidos exemplar do CD137 humano de comprimento total, incluindo os domínios líder, transmembranar e citoplasmático, é apresentada na Tabela 4 (SEQ ID NO: 3) e aqui:

[00395] MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLADPCSNCPAGTFCDNN

RNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCT PGFHCLGAGCSMCEQDCKQAGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWT NCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPOQ!I ISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMR PVAQTTAQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL.

[00396] Conforme usado aqui, o termo "CD137L" ou "ligante CD137" refere-se a um membro da família de proteínas transmembranares do fator de necrose tumoral (TNF). Nomes e acrônimos alternativos para CD137L na técnica incluem "membro 9 da superfamília do fator de necrose tumoral" (TNFSF9) e ligante 4-1BB (4-1BBL) (Alderson et al., (1994) Eur J Immunol 24(9):2219- 2227). Uma sequência de aminoácidos exemplar de CD137L de comprimento total é apresentada na Tabela 4 (SEQ ID NO: 97).

[00397] Conforme usados aqui, os termos "funções efetoras mediadas por Fc" ou "funções efetoras de Fc" se referem às atividades biológicas de um anticorpo que não seja a função e o objetivo principal do anticorpo. Por exemplo, as funções efetoras de um anticorpo agnóstico terapêutico são as atividades biológicas além da ativação da proteína ou via alvo. Exemplos de funções de efeito de anticorpo incluem ligação a Cigqe citotoxicidade dependente do complemento; ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa dos receptores da superfície celular (por exemplo, receptor de células B); falta de ativação de plaquetas que expressam o receptor Fc; e ativação de células B. Muitas funções efetoras começam com a ligação de Fc a um receptor Fcy.

[00398] Como usado aqui, o termo "receptor Fc" refere-se a um polipeptídeo encontrado na superfície das células efetoras imunes, que é ligado pela região Fc de um anticorpo. Em algumas modalidades, o receptor Fc é um receptor Fcy. Existem três subclasses de receptores Fcy, FeyRI (CD64), FeyRII (CD32) e FycRII (CD16). Todos os quatro isotipos de IgG (I9G1, IgG2, IgG3 e IgG4) se ligam e ativam os receptores Fc, FcyRI, FOYRIIA e FeyRIINA. Fey RIIB é um receptor inibitório e, portanto, a ligação de anticorpos a esse receptor não ativa as respostas celulares e de complemento. FcyRI é um receptor de alta afinidade que se liga à IgG na forma monomérica, enquanto FCyRIIA e FeyRIIA são receptores de baixa afinidade que se ligam à IgG apenas na forma multimérica e têm uma afinidade ligeiramente menor. A ligação de um anticorpo a um receptor Fc e/ou Ciq é governada por resíduos ou domínios específicos nas regiões Fc. A ligação também depende dos resíduos localizados na região da dobradiça e na porção CH2 do anticorpo. Em algumas modalidades, a atividade agonística e/ou terapêutica dos anticorpos aqui descritos depende da ligação da região Fc ao receptor Fc (por exemplo, FeyR). Em algumas modalidades, a atividade agonística e/ou terapêutica dos anticorpos aqui descritos é aprimorada pela ligação da região Fc ao receptor Fc (por exemplo, FcyR).

[00399] Como usado aqui, o termo "padrão de glicosilação" é definido como o padrão de unidades de carboidratos que são covalentemente ligadas a uma proteína, mais especificamente a uma proteína de imunoglobulina. Um padrão de glicosilação de um anticorpo heterólogo pode ser caracterizado como sendo substancialmente semelhante aos padrões de glicosilação que ocorrem naturalmente em anticorpos produzidos pelas espécies do animal transgênico não humano, quando aquele versado na técnica reconheceria o padrão de glicosilação do anticorpo heterólogo como sendo mais semelhante ao referido padrão de glicosilação nas espécies do animal transgênico não humano do que nas espécies das quais os genes CH do transgene foram derivados.

[00400] Como usado aqui, o termo "câncer hematológico" inclui um linfoma, leucemia, mieloma ou uma malignidade linfóide, bem como um câncer do baço e dos linfonodos. Exemplos de linfomas incluem linfomas de células B (um câncer hematológico de células B) e linfomas de células T. Os linfomas de células B incluem os linfomas de Hodgkin e a maioria dos linfomas não-Hodgkin. Exemplos não limitativos de linfomas de células B incluem linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma de tecido linfático associado à mucosa, linfoma linfocítico de pequenas células

(sobreposições com leucemia linfocítica crônica), linfoma de células do manto (MCL), linfoma de Burkitt, linfoma mediastinal grande de células B, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de zona marginal nodal linfoma de células B, linfoma de zona marginal esplênico, linfoma intravascular de grandes células B, linfoma primário de cavidade, granulomatose linfomatóide. Exemplos não limitativos de linfomas de células T incluem linfoma extranodal de células T, linfomas cutâneos de células T, linfoma anaplásico de células grandes e linfoma de células T angioimunoblástico. As neoplasias hematológicas também incluem leucemia, como, sem limitação, leucemia secundária, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica e leucemia linfoblástica aguda. As neoplasias hematológicas incluem ainda mielomas, como, sem limitação, mieloma múltiplo e mieloma múltiplo latente. Outros cânceres hematológicos e/ou células B ou células T são englobados pelo termo malignidade hematológica.

[00401] Como usado aqui, o termo "anticorpo humano" inclui anticorpos com regiões variáveis e constantes (se presentes) de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da divulgação podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do local in vitro ou por mutação somática in vivo) (ver, por exemplo, Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474):856-859); Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg & Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, and Harding & Lonberg, (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). No entanto, o termo "anticorpo humano" não inclui anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outras espécies de mamíferos, como um camundongo,

foram enxertadas nas sequências estruturais humanas (ou seja, anticorpos humanizados).

[00402] Como usado aqui, o termo "anticorpo heterólogo" é definido em relação ao organismo não humano transgênico que produz esse anticorpo. Este termo refere-se a um anticorpo que possui uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácido nucleico codificante correspondente à encontrada em um organismo que não consiste no animal não humano transgênico e geralmente de uma espécie diferente da do animal não humano transgênico.

[00403] Os termos "induzir uma resposta imune" e "melhorar uma resposta imune" são usados de forma intercambiável e se referem à estimulação de uma resposta imune (ou seja, passivo ou adaptativo) a um antígeno específico. O termo "induzir", conforme usado em relação à indução de CDC ou ADCC, refere-se à estimulação de mecanismos específicos de morte celular direta.

[00404] Conforme aqui utilizado, um indivíduo "com necessidade de prevenção", "com necessidade de tratamento" ou "com necessidade de tratamento" refere-se a um que, a critério de um médico apropriado (por exemplo, médico, enfermeiro ou uma enfermeira no caso de humanos; um veterinário no caso de mamíferos não humanos) se beneficiaria razoavelmente de um determinado tratamento (como tratamento com uma composição compreendendo um anticorpo anti-CD137).

[00405] O termo "in vivo" refere-se a processos que ocorrem em um organismo vivo.

[00406] Como usado aqui, o termo "anticorpo isolado" pretende se referir a um anticorpo que está substancialmente livre de outros anticorpos com diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente ao CD137 humano está substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a outros antígenos que não o CD137). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epítopo pode, no entanto, ter reatividade cruzada com outras proteinas CD137 de diferentes espécies. No entanto, o anticorpo continua exibindo ligação específica ao CD137 humano em um ensaio de ligação específico, como aqui descrito. Além disso, um anticorpo isolado é tipicamente substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos químicos. Em algumas modalidades, uma combinação de anticorpos "isolados" com diferentes especificidades de CD137 é combinada em uma composição bem definida.

[00407] Conforme usado aqui, o termo "molécula de ácido nucleico isolado" refere-se a ácidos nucleicos que codificam anticorpos ou porções de anticorpos (por exemplo, Vx, Vi, CDR3) que se ligam a CD137, pretende-se referir a uma molécula de ácido nucleico na qual as sequências de nucleotídeos que codificam o anticorpo ou a porção de anticorpo estão livres de outras sequências de nucleotídeos que codificam anticorpos ou porções de anticorpos que se ligam a antígenos que não o CD137, que outras sequências podem flanqueiam naturalmente o ácido nucleico no DNA genômico humano. Por exemplo, uma sequência selecionada a partir de uma sequência apresentada na Tabela 3 ou na Tabela 4 corresponde às sequências nucleotídicas que compreendem a cadeia pesada (Vn) e cadeia leve (V.) em regiões variáveis de anticorpos monoclonais do anticorpo anti- CD137 aqui descritos.

[00408] Conforme usado aqui, "isótipo"” refere-se à classe de anticorpos (por exemplo, IgM ou IgGI) que é codificado por genes da região constante de cadeia pesada. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano da divulgação é do isotipo IG1. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano da divulgação é do isotipo IgG1 e compreende uma mutação. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano da divulgação é do isotipo I9G2. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano da divulgação é do isotipo IgG3. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano da divulgação é do isotipo IIG4. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano da divulgação é do isotipo IgG4 e compreende uma mutação. Em algumas modalidades, a mutação é uma substituição em Ser228. Em algumas modalidades, a substituição em Ser228 é S228P.

[00409] Como usado aqui, o termo "troca de isotipo" refere-se ao fenômeno pelo qual a classe, ou isótipo, de um anticorpo muda de uma classe de lg para uma das outras classes de lg.

[00410] Conforme usado aqui, o termo "KD" ou "Kp7'” refere-se à constante de dissociação de equilíbrio de uma reação de ligação entre um anticorpo e um antígeno. O valor de Kp é uma representação numérica da razão da constante de taxa baixa do anticorpo (kd) para a constante de taxa baixa do anticorpo (ka). O valor de Kp está inversamente relacionado à afinidade de ligação de um anticorpo a um antígeno. Quanto menor o valor de Kp maior a afinidade do anticorpo por seu antígeno. Afinidade é a força de ligação de uma única molécula ao seu ligante e é tipicamente medida e relatada pela constante de dissociação de equilíbrio (Ko), usada para avaliar e classificar os pontos fortes da ordem das interações bimoleculares.

[00411] Conforme usado aqui, o termo "kd" ou "ki"(alternativamente “kfora” ou “kKor') pretende referir-se à constante para a dissociação de um anticorpo de um complexo anticorpo/antígeno. O valor de kd é uma representação numérica da fração de complexos que se decompõe ou se dissociam por segundo e é expressa em unidades seg”.

[00412] Conforme usado aqui, o termo "ka" ou "ka'(alternativamente “kon” ou “kKon') pretende se referir à constante para a associação de um anticorpo com um antígeno. O valor de ka é uma representação numérica do número de complexos anticorpo/antígeno formados por segundo em uma solução de 1 molar (1M) de anticorpo e antígeno e é expresso em unidades M seg”.

[00413] Como usados aqui, os termos "ligado", "fundido" ou "fusão" são usados de forma intercambiável. Estes termos se referem à união de mais dois elementos ou componentes ou domínios, por qualquer meio, incluindo conjugação química ou meio recombinante. Os métodos de conjugação química (por exemplo, usando agentes de reticulação heterobifuncional) são conhecidos na técnica.

[00414] Conforme usado aqui, "administração local" ou "entrega local", refere-se à entrega que não depende do transporte da composição ou do agente para o tecido ou local alvo pretendido através do sistema vascular. Por exemplo, a composição pode ser entregue por injeção ou implantação da composição ou agente ou por injeção ou implantação de um dispositivo contendo a composição ou agente. Após a administração local na vizinhança de um local ou tecido alvo, a composição ou agente, ou um ou mais componentes do mesmo, pode difundir-se no local ou tecido alvo pretendido.

[00415] Conforme usado aqui, "moléculas MHC" refere-se a dois tipos de moléculas, MHC classe | e MHC classe Il. As moléculas MHC classe | apresentam antígeno para células T CD8+ específicas e as moléculas MHC classe |l apresentam antígeno para células T CD4+ específicas. Os antígenos entregues exogenamente às APCs são processados principalmente para associação a MHC classe |l. Por outro lado, os antígenos entregues endogenamente às APCs são processados principalmente para associação com MHC classe |.

[00416] Como usado aqui, o termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que exibe uma única especificidade e afinidade de ligação para um epítopo específico. Por conseguinte, o termo "anticorpo monoclonal humano" referese a um anticorpo que exibe uma especificidade de ligação única e que possui regiões constantes variáveis e opcionais derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma, que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humano e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada.

[00417] Como usado aqui, o termo "multimerização" refere-se à formação de um complexo macromolecular compreendendo mais de duas macromoléculas, como proteínas, tipicamente ligadas por interações não covalentes. Os métodos para determinar a multimerização são conhecidos daqueles versados na técnica e são descritos supra para dimerização. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a multimerizaçção de CD137. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a multimerização de CD137 em relação à quantidade de multimerização na ausência de um anticorpo agonista anti-CD137. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a multimerização de CD137 em relação à quantidade de multimerização na presença de um anticorpo agonista anti- CD137 de referência. Em algumas modalidades, a multimerização é aumentada em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%.

[00418] Conforme usado aqui, o termo "ocorrência natural" aplicado a um objeto refere-se ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência polipeptídica ou polinucleotídica que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada de uma fonte natural e que não foi intencionalmente modificada pelo homem no laboratório ocorre naturalmente.

[00419] Como aqui utilizado, o termo "isotipo não comutado" refere- se à classe isotípica de cadeia pesada que é produzida quando não ocorre a troca de isotipo; o gene CH que codifica o isotipo não comutado é tipicamente o primeiro gene CH imediatamente a jusante do gene VDJ reorganizado funcionalmente. A troca de isotipo foi classificada como troca de isotipo clássico ou não clássico. A troca de isotipo clássico ocorre por eventos de recombinação que envolvem pelo menos uma região de sequência de troca no transgene. A troca isotípica não clássica pode ocorrer por, por exemplo, recombinação homóloga entre humano co, e humano >, (dexclusão associada). Mecanismos alternativos de troca não clássicos, como intertransgene e/ou recombinação inter-cromossômica, entre outros, podem ocorrer e efetuar a troca de isotipo.

[00420] Como aqui utilizado, o termo "ácido nucleico" refere-se a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e seus polímeros na forma de fita simples ou dupla. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação semelhantes ao ácido nucleico de referência e são metabolizados de maneira semelhante aos nucleotídeos de ocorrência natural. Salvo indicação em contrário, uma sequência de ácido nucleico específica também inclui implicitamente variantes modificadas conservativamente (por exemplo, substituições de códons degeneradas) e sequências complementares e também a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições de códons degeneradas podem ser alcançadas gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de base mista e/ou desoxininosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., Biol. Chem. 260:2605-

2608, 1985; e Cassol et al., 1992; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91- 98, 1994). Para arginina e leucina, as modificações na segunda base também podem ser conservadoras. O termo ácido nucleico é usado de forma intercambiável com o gene, cDNA e mRNA codificado por um gene.

[00421] Os polinucleotídeos aqui utilizados podem ser compostos de qualquer polirribonucleotídeo ou polideoxribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. Por exemplo, os polinucleotídeos podem ser compostos de DNA de fita simples e dupla, DNA que é uma mistura de regiões de fita simples e dupla, RNA de fita simples e dupla e RNA que é uma mistura de regiões de fita simples e dupla, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que podem ser de fita simples ou, mais tipicamente, de fita dupla ou uma mistura de regiões de fita simples e dupla. Além disso, o polinucleotídeo pode ser composto de regiões de cadeia tripla compreendendo RNA ou DNA ou RNA e DNA. Um polinucleotídeo também pode conter uma ou mais bases modificadas ou estruturas de DNA ou RNA modificados para estabilidade ou por outros motivos. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases incomuns, como a inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita no DNA e RNA; assim, "polinucleotídeo" abrange formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas.

[00422] Um ácido nucleico é "operacionalmente ligado" quando é colocado em um relacionamento funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou intensificador está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se isso afeta a transcrição da sequência. No que diz respeito às sequências reguladoras da transcrição, operacionalmente ligada significa que as sequências de DNA que estão sendo ligadas são contíguas e, quando necessário, para unir duas regiões codificadoras de proteínas, contíguas e na estrutura de leitura. Para sequências de comutação, operacionalmente ligada indica que as sequências são capazes de efetuar a recombinação de comutação.

[00423] Conforme usado aqui, o termo "parátopo", também "local de ligação ao antígeno" refere-se a uma porção de um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que reconhece e se liga a um epítopo em um antígeno, compreendendo o conjunto de regiões determinantes da complementaridade (CDRs) localizadas em cadeias pesadas e leves variáveis.

[00424] Conforme — usado —aquiy "administração parenteral", "administrado — parenteralmente" e outras frases gramaticalmente equivalentes, referem-se a modos de administração diferentes da administração enteral e tópica, geralmente por injeção, e incluem, sem limitação, intravenosa, intranasal, intraocular, intramuscular, injeção e infusão intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, trans-traqueal, subcutânea, subcuticular, intra- articular, subcapsular, subaracnóidea, intra-espinhal, epidural, intracerebral, intracraniana, intracarotídea e intraesternal.

[00425] Conforme usado aqui, o termo "paciente" inclui indivíduos humanos e outros mamíferos que recebem tratamento profilático ou terapêutico.

[00426] O termo "identidade percentual", no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que possuem uma porcentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos iguais, quando comparados e alinhados para obter o máximo de correspondência, conforme medido usando um dos algoritmos de comparação de sequência descritos abaixo (por exemplo, BLASTP e BLASTN ou outros algoritmos disponíveis para pessoas habilitadas) ou por inspeção visual. Dependendo da aplicação, a "identidade percentual" pode existir em uma região da sequência que está sendo comparada, por exemplo, em um domínio funcional ou, alternativamente, em todo o comprimento das duas sequências a serem comparadas. Para comparação de sequências, normalmente uma sequência atua como uma sequência de referência à qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo de sequência são designados. O algoritmo de comparação de sequência calcula a identidade percentual da sequência para a sequência de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa designados.

[00427] O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de busca por similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), ou por inspeção visual (ver geralmente Ausubel et al., infra).

[00428] Un exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a porcentagem de identidade e similaridade de sequência é o algoritmo BLAST, descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). O software para realizar análises BLAST está disponível publicamente no site do National Center for Biotechnology Information.

[00429] Como geralmente usado aqui, "farmaceuticamente aceitável" refere-se aos compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo de um julgamento médico adequado,

adequados para uso em contato com tecidos, órgãos e/ou fluidos corporais de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outros problemas ou complicações proporcionais a uma relação benefício/risco razoável.

[00430] Como usado aquii, um "carreador farmaceuticamente aceitável" refere-se a, e inclui, todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis. As composições podem incluir um sal farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um sal de adição de ácido ou um sal de adição de base (ver, por exemplo, Berge et al. (1977) J Pharm Sci 66:1-19).

[00431] Conforme aqui utilizado, os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados de forma intercambiável para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um mimético químico artificial de um aminoácido correspondente natural, bem como a polímeros de aminoácidos naturais e a um polímero de aminoácidos não natural.

[00432] Conforme usado aqui, o termo "prevenção", quando usado em relação a uma condição, refere-se à administração de uma composição que reduz a frequência ou atrasa o aparecimento de sintomas de uma condição médica em um indivíduo em relação a um indivíduo que não receber a composição.

[00433] Conforme usado aqui, o termo "purificado" ou "isolado", conforme aplicado a qualquer uma das proteínas (anticorpos ou fragmentos) aqui descritos, refere-se a um polipeptídeo que foi separado ou purificado de componentes (por exemplo, proteínas ou outras moléculas biológicas ou orgânicas que ocorrem naturalmente) moléculas orgânicas) que naturalmente o acompanham, por exemplo, outras proteínas, lipídios e ácido nucléico em um procarionte que expressa as proteínas. Normalmente, um polipeptídeo é purificado quando constitui pelo menos 60 (por exemplo, pelo menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97 ou 99)%, em peso, da proteína total em uma amostra.

[00434] Conforme usado aqui, o termo "rearranjado" refere-se a uma configuração de um locus de imunoglobulina de cadeia pesada ou cadeia leve, em que um segmento V é posicionado imediatamente adjacente a um segmento DJ ou J em uma conformação que codifica essencialmente um domínio V4 ou Vi completo, respectivamente. Um locus de gene de imunoglobulina reorganizado pode ser identificado por comparação com o DNA da linhagem germinativa; um locus reorganizado terá pelo menos um elemento de homologia heptâmero/nonâmero recombinado.

[00435] Conforme aqui utilizado, o termo "agrupamento de receptores" refere-se a um processo celular que resulta no agrupamento ou acumulação local de um conjunto de receptores em um local celular específico, geralmente para induzir ou amplificar uma resposta de sinalização. Muitos receptores de proteínas ligam ligantes cognatos e agrupam-se, isto é, formam dímeros, trímeros, oligômeros ou multímeros, ao ligar seus ligantes cognatos. Por exemplo, os membros da superfamília do receptor PDGF e do receptor TNF formam dímeros e trímeros após a ligação ao ligando, respectivamente. O agrupamento induzido por ligantes cognatos (por exemplo, dimerização, multimerização) induz a transdução de sinal através do receptor. Por conseguinte, os anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, da presente divulgação podem ativar um receptor pela ligação a mais de um receptor e induzir ou estabilizar a dimerização, trimerização e/ou multimerização com ou sem ligação ao ligando cognato.

[00436] O agrupamento e a multimerização de receptores são necessários para a sinalização de TNFR (Wajant (2015) Cell Death Differ

22(11):1727-1741) e, em particular, para a ativação do TNFRSF. 4-1BB (CD137), CD40, GITR, CD27, DR3, DR5 e Fas são alguns dos receptores TNFSF conhecidos por exigir agrupamento para acionar a sinalização a jusante. A evidência experimental de que o receptor 4-1BB deve ser reticulado ao sinal vem de Rabu et al. Esses autores relataram que a forma 1-trímero do 4-1BBL humano não teve efeitos ativadores nas células T humanas, enquanto a ligação cruzada da proteína em 2 ou mais trímeros levou a uma proteína fortemente ativadora (Rabu et al., (2005) J Biol Chem 280:41472-41481). Por conseguinte, em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 induz a multimerização de 2 ou mais trímeros de CD137.

[00437] Conforme usado aquii, o termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira") pretende se referir a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos se destinam a se referir não apenas à célula em questão, mas também à descendência dessa célula. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, essa descendência pode não ser idêntica à célula- mãe, mas ainda está incluída no escopo do termo "célula hospedeira", conforme aqui utilizado.

[00438] Conforme usado aquii o termo "anticorpo humano recombinante" inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a partir dele, (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória de anticorpos humanos recombinantes e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a junção de sequências de genes de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes compreendem regiões variáveis e constantes que utilizam determinadas sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana são codificadas pelos genes da linhagem germinativa, mas incluem rearranjos e mutações subsequentes que ocorrem, por exemplo, durante a maturação do anticorpo. Como conhecido na técnica (ver, por exemplo, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125), a região variável contém o domínio de ligação ao antígeno, que é codificado por vários genes que se reorganizam para formar um anticorpo específico para um antígeno estranho. Além do rearranjo, a região variável pode ser modificada ainda mais por várias alterações únicas de aminoácidos (denominadas mutação somática ou hipermutação) para aumentar a afinidade do anticorpo com o antígeno estranho. A região constante mudará em resposta a um antígeno (ou seja, interruptor isotipo). Portanto, as moléculas de ácido nucleico reorganizadas e somaticamente mutadas que codificam os polipeptídeos de imunoglobulina de cadeia leve e de cadeia pesada em resposta a um antígeno podem não ter identidade de sequência com as moléculas de ácido nucleico originais, mas serão substancialmente idênticas ou semelhantes (ou seja, ter pelo menos 80% de identidade).

[00439] Conforme usado aqui, o termo "anticorpo de referência" (usado de forma intercambiável com "mAb de referência") ou "proteína de ligação ao antígeno de referência" refere-se a um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a um epítopo específico no CD137 humano e é usado para estabelecer um relacionamento entre si e um ou mais anticorpos distintos. Em algumas modalidades, a relação é a ligação do anticorpo de referência e um ou mais anticorpos distintos ao mesmo epítopo no CD137. Conforme usado aqui, o termo conota um anticorpo anti-CD137 que é útil em um teste ou ensaio, como os descritos aqui (por exemplo, um ensaio de ligação competitiva), como concorrente, em que o ensaio é útil para a descoberta, identificação ou desenvolvimento, de um ou mais anticorpos distintos que se ligam ao mesmo epítopo. As sequências de aminoácidos variáveis de cadeia pesada (Vn) e cadeia leve (V.) de um anticorpo de referência exemplar (mAb1) são fornecidas na Tabela 4 (Vx1, SEQ ID NO. 4; Vi2, SEQ |D NO. 6). Em algumas modalidades, o termo conota um anticorpo anti-CD137 que é útil em um teste ou ensaio, como um comparador, em que o ensaio é útil para distinguir características dos anticorpos (por exemplo, hepatotoxicidade, eficácia antitumoral). Em algumas modalidades, o anticorpo de referência é urelumab. Em algumas modalidades, o anticorpo de referência é utomilumabe.

[00440] Conforme usado aqui, os termos "ligação específica", "ligação seletiva", "liga seletivamente" e "liga-se especificamente", referem- se à ligação de anticorpos a um epítopo em um antígeno predeterminado. Normalmente, o anticorpo se liga a uma constante de dissociação de equilíbrio (Ko) de aproximadamente menos de 10º M, como aproximadamente menos de 107, 108 M, 10º M ou 10º M ou mais baixo quando determinado pela tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR) em um instrumento BIACORE 2000 usando CD137 humano recombinante como analito e anticorpo como ligante e se liga ao antígeno predeterminado com uma afinidade pelo menos duas vezes maior que sua afinidade pela ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) que não seja o antígeno predeterminado ou um antígeno intimamente relacionado. As frases "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usadas aqui de forma intercambiável com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".

[00441] Conforme usado aqui, o termo "sequência de troca" refere-se às sequências de DNA responsáveis pela recombinação da troca. Uma sequência de "doador de troca", geralmente uma u região de troca, será 5' (ou seja, a montante) da região do construto a ser excluída durante a recombinação de troca. A região de "aceitador de troca" estará entre a região do construto a ser excluída e a região constante de substituição (por exemplo, y, cetc.). Como não existe local específico onde a recombinação sempre ocorra, a sequência final do gene normalmente não será previsível a partir do construto.

[00442] Como usado aqui, o termo "indivíduo" inclui qualquer animal humano ou não humano. Por exemplo, os métodos e composições da presente invenção podem ser utilizados para tratar um indivíduo com um distúrbio imunológico. O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, como primatas não humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc.

[00443] Para ácidos nucleicos, o termo "homologia substancial" indica que dois ácidos nucleicos, ou suas sequências designadas, quando alinhados e comparados de maneira ideal, são idênticos, com inserções ou deleções de nucleotídeos apropriadas, em pelo menos cerca de 80% dos nucleotídeos, geralmente pelo menos cerca de 90% a 95%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 98% a 99,5% dos nucleotídeos. Alternativamente, existe uma homologia substancial quando os segmentos hibridizam sob condições de hibridação seletiva, para o complemento da cadeia.

[00444] A porcentagem de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (ou seja,% homologia = número de posições idênticas/número total de posições x 100), levando em consideração o número de intervalos e o comprimento de cada intervalo, que precisam ser introduzidos para o alinhamento ideal das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático, conforme descrito nos exemplos não limitativos abaixo.

[00445] A porcentagem de identidade entre duas sequências de nucleotídeos pode ser determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gceg.com), usando uma matriz NWSgapdna.CMP e uma diferença de peso de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A porcentagem de identidade entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos também pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (CABIOS, 4: 11- 17 (1989)), que foi incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de gap de 12 e uma penalidade de gap de 4. Além disso, a porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), que foi incorporado ao programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gceg.com), usando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de gap de 16, 14, 12, 10, 8, 6o0u4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3,4, 5ou6.

[00446] As sequências de ácido nucleico e proteína da presente divulgação podem ainda ser usadas como uma "sequência de consulta" para executar uma pesquisa em bancos de dados públicos para, por exemplo, identificar sequências relacionadas. Essas pesquisas podem ser realizadas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) do Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. As pesquisas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, escore = 100, wordlength = 12 para obter sequências nucleotídicas homólogas às moléculas de ácido nucleico da invenção. As pesquisas de proteínas BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, escore = 50, wordlength = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína da invenção. Para obter alinhamentos espaçados para fins de comparação, o Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et a/., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Ver http://www.ncbi.nIm.nih.gov.

[00447] Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisado celular ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado para longe de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de agarose e outros bem conhecidos na técnica. Ver, F. Ausubel, et al, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).

[00448] As composições de ácido nucleico da presente divulgação, embora frequentemente em uma sequência nativa (exceto locais de restrição modificados e semelhantes), de cDNA, genômico ou misturas dos mesmos podem ser mutadas, de acordo com técnicas padrão para fornecer sequências genéticas. Para sequências de codificação, essas mutações podem afetar a sequência de aminoácidos conforme desejado. Em particular, são contempladas sequências de DNA substancialmente homólogas ou derivadas de comutadores V, D, J, constantes nativas e outras sequências descritas aqui (onde "derivado" indica que uma sequência é idêntica ou modificada a partir de outra sequência).

[00449] Como aqui utilizado, o termo "microambiente tumoral" (alternativamente "microambiente cancerígeno"; TME abreviado) refere-se ao ambiente celular ou ambiente em que o tumor ou neoplasia existe, incluindo vasos sanguíneos circundantes, bem como células não cancerígenas, incluindo, mas não limitado a células imunes, fibroblastos, células inflamatórias derivadas da medula óssea e linfócitos. As moléculas sinalizadoras e a matriz extracelular também compreendem o TME. O tumor e o microambiente circundante estão intimamente relacionados e interagem constantemente. Os tumores podem influenciar o microambiente liberando sinais extracelulares, promovendo a angiogênese tumoral e induzindo tolerância imune periférica, enquanto as células imunes no microambiente podem afetar o crescimento e a evolução das células tumorais.

[00450] O termo "célula T" refere-se a um tipo de glóbulo branco que pode ser diferenciado de outros glóbulos brancos pela presença de um receptor de célula T na superfície celular. Existem vários subconjuntos de células T, incluindo, entre outros, células T auxiliares (também conhecidas como células Ty ou células T CD4*) e subtipos, incluindo células T Tr1, Trn2, THn3, TH17, TH9 e células T citotóxicas (ou seja, células Tc, células T CD8*, linfócitos T citotóxicos, células T exterminadoras), células T de memória e subtipos, incluindo células T de memória central (Tcv células T), células T efetoras de memória (células T Tem e Temra) e células T da memória residente (células T Trwm), células T reguladoras (células T tcp ou células T Treg supressoras) e subtipos, incluindo células CD4* FOXP3* Tres, células CD4* FOXP3' Treg, células Tr1, células Th3 e células Treg17, células T exterminadoras naturais (também conhecidas como células NKT), células T invariantes associadas à mucosa (MAlITs) e células T gama delta (células T vô), incluindo células T Vy9/V52. Qualquer uma ou mais das células T mencionadas ou não mencionadas pode ser o tipo de célula alvo para um método de uso da invenção.

[00451] Como usado aqui, o termo "ativação de células T" ou "ativação de células T" refere-se a um processo celular em que células T maduras, que expressam receptores de células T específicos de antígeno em suas superfícies, reconhecem seus antígenos cognatos e respondem entrando no ciclo celular, secretando citocinas ou enzimas líticas e iniciando ou tornando-se competentes para desempenhar funções efetoras baseadas em células. A ativação das células T requer pelo menos dois sinais para ser totalmente ativado. O primeiro ocorre após o envolvimento do receptor específico do antígeno das células T (TCR) pelo complexo de histocompatibilidade antígeno principal (MHC), e o segundo pelo envolvimento subsequente das moléculas co-estimuladoras (por exemplo, CD28). Esses sinais são transmitidos ao núcleo e resultam em expansão clonal das células T, regulação positiva de marcadores de ativação na superfície celular, diferenciação em células efetoras, indução de citotoxicidade ou secreção de citocinas, indução de apoptose ou uma combinação dos mesmos.

[00452] Como usado aqui, o termo "resposta mediada por células T" refere-se a qualquer resposta mediada por células T, incluindo, mas não se limitando a, células T efetoras (por exemplo, células T CD8*) e células T auxiliares (por exemplo, células CD4*). As respostas mediadas por células T incluem, por exemplo, citotoxicidade e proliferação de células T.

[00453] Conforme — usado — aqui, os termos "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "dose terapeuticamente eficaz", ou termos semelhantes usados aqui, significam uma quantidade de um agente (por exemplo, um anticorpo anti-CD137 ou um fragmento de ligação a antígeno) que será provocar a resposta biológica ou médica desejada (por exemplo, uma melhoria em um ou mais sintomas de um câncer).

[00454] Os termos "tratar", "tratando" e "tratamento", conforme aqui utilizados, referem-se a medidas terapêuticas ou preventivas aqui descritas. Os métodos de "tratamento" empregam a administração de um indivíduo, na necessidade de tal tratamento, um anticorpo humano da presente divulgação, por exemplo, um indivíduo na necessidade de uma resposta imune aprimorada contra um antígeno específico ou um indivíduo que possa finalmente adquirir tal um distúrbio, a fim de prevenir, curar, atrasar, reduzir a gravidade ou melhorar um ou mais sintomas do distúrbio ou distúrbio recorrente, ou para prolongar a sobrevivência de um indivíduo além do esperado na ausência de tal tratamento.

[00455] Como usado aqui, o termo "configuração não rearranjada" ou "linhagem germinativa" refere-se à configuração em que o segmento V não é recombinado de modo a ficar imediatamente adjacente a um segmento D ou J.

[00456] Como usado aqui, o termo "vetor" se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a um loop de DNA de fita dupla circular no qual segmentos adicionais de DNA podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos adicionais de DNA podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com origem bacteriana de replicação e vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, assim, são replicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão de utilidade nas técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados de forma intercambiável, pois o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. No entanto, a invenção pretende incluir outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovírus com defeito de replicação, adenovírus e vírus adenoassociados), que têm funções equivalentes.

[00457] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que é comumente entendido por um versado na técnica a que esta divulgação se refere. Os métodos e materiais preferidos são descritos abaixo, embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos também possam ser utilizados na prática ou no teste dos métodos e composições atualmente divulgados. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência na sua totalidade.

Anticorpos Anti-CD137 e Seus Fragmentos de Ligação ao Antígeno

[00397] A presente divulgação fornece anticorpos que se ligam especificamente e agonizam CD137. Em alguns aspectos, a divulgação fornece anticorpos agonistas anti-CD137 que são úteis para o tratamento de câncer. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 induzem a produção de citocinas. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aumentam o número de células T CD8+ no microambiente do tumor. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 induzem a imunidade antitumoral protetora. A divulgação também fornece anticorpos agonistas anti-CD137 que, mediante administração in vivo, não aumentam substancialmente populações de células T CD4+ e/ou CD8+ intrasplenéricas ou intra-hepáticas.

[00398] O CD137 humano é um polipeptídeo transmembrana de 255 aminoácidos (SEQ ID NO: 3; nº de adesão NM 001561; NP 001552) e um membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral fitogeneticamente conservado (TNFR). CD137 (alternativamente 4-1BB, superfamília TNFR 9) e seu ligante (CD137L) estão envolvidos na regulação de uma ampla gama de atividades imunes. O ligante CD137 reticula seu receptor, CD137, que é expresso nas células T ativadas, e co- estimula as atividades das células T. CD137 é uma molécula co- estimuladora induzida por ativação. Estudos recentes revelaram que os efeitos anticâncer mediados por CD137 são amplamente baseados em sua capacidade de ativar células T, em particular, induzir uma resposta de linfócitos T citotóxicos (CTL) e induzir a produção de citocinas, em particular altas quantidades de IFNy (Ye et al., (2014) Clin Cancer Res 20 (1):44-55). O ligante CD137 é uma proteína transmembranar na superfície da célula e transmite sinais para as células nas quais é expressa, um fenômeno conhecido como “sinalização reversa”. A expressão do ligante CD137 é encontrada na maioria dos tipos de leucócitos e em algumas células não imunes. Nas células monocíticas (monócitos, macrófagos e DCs), a sinalização do ligante CD137 induz ativação, migração, sobrevida e diferenciação.

[00399] Por conseguinte, em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, se liga e agoniza o CD137 e permite ou promove a ligação ao CD137L. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, se liga e agoniza o CD137. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 fornecidos pela divulgação se ligam e agonizam CD137 e coestimulam a ativação de células T.

[00400] Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, possui uma ou mais das seguintes propriedades ou características:

[00396] liga-se especificamente ao CD137 humano;

[00397] liga-se ao CD137 humano e cinomolgo; e

[00398] liga-se ao CD137 humano e de camundongo.

[00400] Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti- CD137, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, liga-se ao CD137 e co-estimula as atividades das células T. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, liga-se ao CD137 e induz ou aprimora a ativação de células T, uma resposta de linfócitos T citotóxicos (CTL), proliferação de células T, produção de citocinas ou um combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, liga-se ao CD137 e induz ou aprimora a ativação de células T, uma resposta de linfócitos T citotóxicos (CTL), proliferação de células T, produção de citocinas ou um combinação dos mesmos, em um microambiente tumoral. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, não induz nem aprimora significativamente a ativação de células T intra-hepáticas e/ou intrasplênicas e/ou proliferação de células T. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137, aqui descrito, liga-se a CD137 e induz a produção de IFNy. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos pela divulgação se ligam a CD137 e induzem a produção de 1IL-2, TNF-a, IL-13 ou uma combinação dos mesmos.

[00401] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 descritos aqui se ligam especificamente e agonizam CD137. Em algumas modalidades, o agonismo de CD137 é medido determinando a concentração de citocinas produzidas por células imunes. Os métodos para analisar a produção de citocinas são conhecidos na técnica e utilizados nos Exemplos. Em algumas modalidades, um aumento na produção de citocinas pelas células imunes indica agonismo de CD137. Em algumas modalidades, o agonismo de CD137 é medido analisando a proliferação de células T. Em algumas modalidades, um aumento na proliferação de células T indica agonismo de CD137. Em algumas modalidades, o agonismo de CD137 é medido medindo-se o nível de sinalização celular através da quantificação da fosforilação de moléculas relevantes ou da expressão de um repórter gênico após um promotor relevante. Em algumas modalidades, um aumento na sinalização celular indica agonismo de CD137. Em algumas modalidades, o agonismo de CD137 é medido medindo o volume de um tumor. Em algumas modalidades, uma diminuição no volume de um tumor indica agonismo de CD137.

[00402] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos — induzem, — aumentam ou estabiizam oligomerização, multimerização ou outro agrupamento de ordem superior de CD137. Em algumas modalidades, o agrupamento de CD137 na superfície celular é observado através de microscopia de fluorescência.

[00403] São aqui fornecidos anticorpos monocionais isolados ou seus fragmentos de ligação a antígenos, que se ligam e agonizam CD137. Em algumas modalidades, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, (i) ligam o CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM); (ii) ligam um epítopo no CD137 humano aqui descrito; e/ou (iii) compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ ID NO: 126).

Afinidade para CD137

[00399] Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, liga o CD137 humano com uma afinidade (Ko) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM ou entre cerca de 40 nM e cerca de 100 nM). Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo anti-CD137 com o CD137 humano é pelo menos duas (por exemplo, pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou 10) vezes maior que a afinidade do mAb10 para CD137 de camundongo. Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo anti-CD137 não é maior que 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 250, 200, 175, 150, 125, 110 ou 100 NM. Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo anti-CD137 com o CD137 humano é pelo menos duas (por exemplo, pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou 10) vezes maior que a afinidade do mAb10 para CD137 de camundongo, mas não superior a 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 250, 200, 175, 150, 125, 110 ou 100 nM. A afinidade do anticorpo é a força da ligação a um único polipeptídeo CD137. Em algumas modalidades, a afinidade é indicada pela constante de dissociação de equilíbrio (Ko). O valor de Kp está inversamente relacionado à afinidade de ligação de um anticorpo a um antígeno. Assim, quanto menor o Kp valor, maior a afinidade do anticorpo por seu antígeno.

[00401] Os métodos para determinar a afinidade de um anticorpo para seu antígeno são conhecidos na técnica. Um método exemplar para determinar a afinidade de ligação emprega ressonância plasmônica de superfície. A ressonância plasmônica de superfície é um fenômeno óptico que permite a análise de interações biospecíficas em tempo real pela detecção de alterações nas concentrações de proteínas dentro de uma matriz de biossensores, por exemplo, usando o sistema BlAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, NJ). Para mais descrições, ver Jonsson, U,., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26;

Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11 :620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; e Johnsson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

[00402] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 NM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Ko) de cerca de 40-100 nM. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-40 nM, 40-50 nM, 50-60 nM, 60-70 nM, 70-80 nM, 80-90 nM, 90-100 nM, 45-55 nM, 55-65 nM, 75-85 nM, 85-95 nM, 45-95 nM, 50-90 nM, 55-85 nM, 60-80 nM, 65-75 nM, 55-75 nM, 40-70 nM, 50-80 nM ou 60-90 nM. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 60-80 nM. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 60- 75 NM.

[00403] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 60-90 NM. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 50-80 nM. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 40-70 nM. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Ko) de cerca de 55-75 nM. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Ko) de cerca de 65-75 nM. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Ko) de cerca de 60-80 nM. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Ko) de cerca de 55-85 nM.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 50-90 nM.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Ko) de cerca de 45-95 nM.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Ko) de cerca de 85-95 nM.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Ko) de cerca de 75-85 nM.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 55-65 nM.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Ko) de cerca de 45-55 NM.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 80-90 nM.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Ko) de cerca de 70-80 nM.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Ko) de cerca de 60-70 nM.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Ko) de cerca de 50-60 nM.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Ko) de cerca de 40-50 nM.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-40 nM.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30 nM, cerca de 31 nM, cerca de 32 NM, cerca de 33 nM, cerca de 34 nM, cerca de 35 nM, cerca de 36 nM, cerca de 37 nM, cerca de 38 nM, cerca de 39 nM, cerca de 40 nM, cerca de 41 NM, cerca de 42 nM, cerca de 43 nM, cerca de 44 nM, cerca de 45 nM, cerca de 46 nM, cerca de 47 nM, cerca de 48 nM, cerca de 49 nM, cerca de 50 nM, cerca de 51 nM, cerca de 52 nM, cerca de 53 nM, cerca de 54 nM, cerca de 55 nM, cerca de 56 nM, cerca de 57 nM, cerca de 58 nM, cerca de 59 NM, cerca de 60 nM, cerca de 61 nM, cerca de 62 nM, cerca de 63 nM, cerca de 64 nM, cerca de 65 nM, cerca de 66 nM, cerca de 67 nM, cerca de 68 nM, cerca de 69 nM, cerca de 70 nM, cerca de 71 nM, cerca de 72 nM, cerca de 73 nM, cerca de 74 nM, cerca de 75 nM, cerca de 76 nM, cerca de 77 NM, cerca de 78 nM, cerca de 79 nM, cerca de 80 nM, cerca de 81 nM, cerca de 82 nM, cerca de 83 nM, cerca de 84 nM, cerca de 85 nM, cerca de 86 nM, cerca de 87 nM, cerca de 88 nM, cerca de 89 nM, cerca de 90 nM, cerca de 91 nM, cerca de 92 nM, cerca de 93 nM, cerca de 94 nM, cerca de 95 nM, cerca de 96 nM, cerca de 97 nM, cerca de 98 nM, cerca de 99 nM, cerca de 100 nM, cerca de 101 nM, cerca de 102 nM, cerca de 103 nM, cerca de 104 nM, cerca de 105 nM, um cerca de 106 nM, cerca de 107 nM, cerca de 108 nM, cerca de 109 nM ou cerca de 110 nM.

[00404] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de pelo menos 30 NM, mas inferior a 110 nM, pelo menos 31 nM, mas inferior a 109 nM, pelo menos 32 nM, mas inferior a 108 nM, pelo menos 33 nM, mas inferior a 107 NM, pelo menos 34 nM mas inferior a cerca de 106 nM, pelo menos 35 nM mas inferior a cerca de 105 nM, pelo menos 36 nM mas inferior a cerca de 104 nM, pelo menos 37 nM mas inferior a cerca de 103 nM pelo menos 38 NM mas inferior a cerca de 102 nM, pelo menos 39 nM mas inferior a cerca de 101 nM, pelo menos 40 nM mas inferior a cerca de 100 nM; pelo menos 41 nM mas inferior a cerca de 99 nM; pelo menos 42 nM mas inferior a cerca de 98 nM; pelo menos 43 nM mas inferior a cerca de 97 nM; pelo menos 44 nM mas inferior a cerca de 96 nM; pelo menos 45 nM mas inferior a cerca de 95 nM; pelo menos 46 nM mas inferior a cerca de 94 nM; pelo menos 47 nM mas inferior a cerca de 93 nM; pelo menos 48 nM mas inferior a cerca de 92 nM; pelo menos 49 nM mas inferior a cerca de 91 nM; pelo menos 50 nM mas inferior a cerca de 90 nM; pelo menos 51 nM mas inferior a cerca de 89 nM; pelo menos 52 nM mas inferior a cerca de 88 nM; pelo menos 53 nM mas inferior a cerca de 87 nM; pelo menos 54 nM mas inferior a cerca de 86 nM; pelo menos 55 nM mas inferior a cerca de 85 nM; pelo menos 56 nM mas inferior a cerca de 84 nM; pelo menos 57 nM mas inferior a cerca de 83 nM; pelo menos 58 nM mas inferior a cerca de 82 nM; pelo menos 59 nM mas inferior a cerca de 81 nM; pelo menos 60 nM mas inferior a cerca de 80 nM; pelo menos 61 nM mas inferior a cerca de 79 nM; pelo menos 62 nM mas inferior a cerca de 78 nM; pelo menos 63 nM mas inferior a cerca de 77 nM; pelo menos 64 nM mas inferior a cerca de 76 nM; ou pelo menos 65 nM mas inferior a cerca de 75 nM. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de pelo menos 40 nM, mas inferior a cerca de 100 nM.

[00405] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos apresentam reatividade cruzada com polipeptídeos CD137 de mais de uma espécie. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos se ligam ao CD137 cinomolgo e CD137 humano. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam CD137 de camundongo e CD137 humano. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam CD137 humano, CD137 de camundongo e CD137 cinomolgo.

Ligação com Epítopo no CD137

[00406] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, se liga a um epítopo no CD137 humano que compreende um ou mais (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou todos os 25) dos aminoácidos 111-132 da SEQ ID NO: 3 . Em algumas modalidades, o anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, se liga a um epítopo dentro dos aminoácidos 111-132 da SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos, a divulgação fornece um anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, se liga a todos ou a uma porção dos aminoácidos 111-132 da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, se liga a um epítopo do CD137 humano que compreende o resíduo K114 da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, se liga a um epítopo do CD137 humano compreendendo os resíduos E111, T113 e K114 da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, se liga a um epítopo do CD137 humano compreendendo os resíduos E111, T113, K114, Ni26 e 1132 da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, se liga a um epítopo do CD137 humano compreendendo E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, se liga a um epítopo do CD137 humano que compreende um ou mais resíduos E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3.

[00407] Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, se liga a um epítopo do CD137 humano que compreende uma sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 100 a 135, 101 a 135, 102 a 135, 103 a 135, 104 a 135, 105 a 135, 106 a 135, 107 a 135, 108 a 135, 109 a 135, 110 a 135 ou 111 a 135 da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti- CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, se liga a um epítopo do CD137 humano que compreende uma sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQ ID NO : 3. Em algumas modalidades, o epítopo compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQ ID NO: 3.

[00408] Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, se liga a um epítopo do CD137 humano nas posições de aminoácidos 100 a 135, 101 a 135, 102 a 135, 103 a 135, 104 a 135, 105 a 135, 106 a 135, 107 a 135, 108 a 135, 109 a 135, 110 a 135 ou 111 a 135 da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, se liga a um epítopo do CD137 humano dentro das posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o epítopo compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQ ID NO: 3.

[00409] Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, liga-se a um epítopo do CD137 humano que compreende ELTK (correspondente aos resíduos de aminoácidos 111-114 da SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido L112 pode ser outro resíduo de aminoácido.

[00410] Em algumas modalidades, o epítopo é um epítopo não linear. Em algumas modalidades, a mutação do resíduo de aminoácido K114 anula as ligações de um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, ao CD137 humano.

[00411] Em algumas modalidades, o anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, liga-se a um epítopo do CD137 humano que compreende uma sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQ ID NO: 3, em que o epítopo compreende pelo menos o aminoácido K114 e em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno se liga ao CD137 de camundongo e não se liga ao CD137 de rato. Em algumas modalidades, o epítopo é um epítopo não linear. Em algumas modalidades, o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno liga o CD137 de camundongo e o CD137 cinomolgo e não liga o CD137 de rato. Em algumas modalidades, a ligação de um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação a antígeno, aqui descrito, a CD137 humano, de camundongo, de rato e cinomolgo é determinada por ressonância plasmônica de superfície (SPR).

[00412] Em algumas modalidades, o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno se liga ao CD137 de camundongo, cinomolgo ou humano com uma afinidade que é pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500 ou 1000 vezes maior que a afinidade do anticorpo para CD137 de rato. Em algumas modalidades, o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno se liga ao CD137 de camundongo, cinomolgo ou humano com uma afinidade que é pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500 ou 1000 vezes maior que a afinidade do anticorpo para um polipeptídeo CD137 que não compreende uma lisina na posição 114 em relação ao CD137 humano da SEQ ID NO: 3.

[00413] Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, se liga a um epítopo do CD137 humano e compete com o mMAb1 pela ligação ao epítopo do CD137 humano. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, se liga e agoniza o CD137. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 fornecidos pela divulgação se ligam e agonizam CD137 e coestimulam a ativação de células T.

[00414] A presente divulgação fornece anticorpos que competem pela ligação a um epítopo no CD137 que compreende todo ou uma porção de um epítopo reconhecido por um ou mais anticorpos de referência específicos aqui descritos (por exemplo, mAb1). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 se ligam a um epítopo do CD137 humano e competem com um anticorpo de referência (por exemplo, mAb1) pela ligação ao epítopo do CD137 humano e em que o anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, se liga ao CD137 humano com uma constante de dissociação de equilíbrio Ko de 1 x 10º ou menos. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 se ligam a um epítopo no CD137, em que uma ou mais mutações no epítopo inibem, reduzem ou bloqueiam a ligação aos anticorpos e a um anticorpo de referência (por exemplo, mAb1). Em algumas modalidades, o anticorpo de referência é o anticorpo mAb1, aqui descrito. Em algumas modalidades, o anticorpo de referência é qualquer anticorpo fornecido na Tabela 3 ou na Tabela 4.

[00415] Por conseguinte, os anticorpos anti-CD137 fornecidos pela divulgação podem ser avaliados através de análise cristalográfica de raios-x de uma estrutura cristalina compreendendo um anticorpo ligado a CD137, ou um fragmento ou porção dela. Em alguns aspectos, os epítopos que se ligam aos anticorpos fornecidos pela divulgação são identificados pela determinação dos resíduos no antígeno CD137 humano que residem ou estão localizados dentro de 4 angstroms (À) de um resíduo de paratopo de anticorpo, por exemplo, mAb1.

[00416] Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é de pelo menos 3 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é de pelo menos 4 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é de pelo menos 5 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é de pelo menos 6 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é de pelo menos 7 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é de pelo menos 8 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é de pelo menos 9 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é de pelo menos 10 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é de pelo menos 12 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é de pelo menos 3 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é de pelo menos 13 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é de pelo menos 14 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é de pelo menos 15 resíduos de aminoácidos.

[00417] Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 25 resíduos de aminoácidos.

Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 24 resíduos de aminoácidos.

Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 23 resíduos de aminoácidos.

Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 22 resíduos de aminoácidos.

Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 21 resíduos de aminoácidos.

Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 20 resíduos de aminoácidos.

Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 19 resíduos de aminoácidos.

Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 18 resíduos de aminoácidos.

Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 17 resíduos de aminoácidos.

Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 16 resíduos de aminoácidos.

Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 15 resíduos de aminoácidos.

Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 14 resíduos de aminoácidos.

Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 13 resíduos de aminoácidos.

Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 12 resíduos de aminoácidos.

Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 11 resíduos de aminoácidos.

Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 10 resíduos de aminoácidos.

Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 9 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 8 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 7 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 6 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, o epítopo ligado pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos é menor que 5 resíduos de aminoácidos.

[00418] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos se ligam a um epítopo de menos de 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19,18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 aminoácidos e compreende o resíduo de aminoácido K114 da SEQ ID NO: 3.

Regiões Variáveis

[00419] Em algumas modalidades, são aqui fornecidos anticorpos monoclonais isolados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, compreendendo sequências variáveis de cadeias pesada e leve, conforme estabelecido nas Tabelas 3 e 4.

[00420] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem CDRs de cadeias pesada e leve selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[00421] (a) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00422] (b) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 70, 79 e 90, respectivamente;

[00423] (c) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 71, 80 e 91, respectivamente;

[00424] (d) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 72, 81 e 92, respectivamente;

[00425] (e) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 73, 82 e 91, respectivamente;

[00426] (f) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 74, 83 e 93, respectivamente;

[00427] (g) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 75, 84 e 91, respectivamente;

[00428] (h) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 74, 85 e 94, respectivamente;

[00429] (i) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 76, 86 e 95, respectivamente;

[00430] (])) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 77, 87 e 93, respectivamente;

[00431] (k) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 88 e 90, respectivamente;

[00432] (I) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49, 57 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00433] (mM) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49, 58 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00434] (n) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49, 59 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00435] (0) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49, 60 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00436] (p) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 50, 61 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00437] (a) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 50, 58 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00438] (r) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 51, 62 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00439] (s) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 52, 63 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00440] (t) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 50, 64 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00441] (u) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 50, 65 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00442] (v) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 51, 108 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00443] (w) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 107, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente; e

[00444] (x) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 109, 110 e 92, respectivamente.

[00445] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 101 e 103; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 6, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 105.

[00446] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem CDRs de cadeias pesada e leve, em que CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68.

[00447] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[00448] (a) SEQ ID NO: 4 e 6, respectivamente;

[00449] (b) SEQ ID NO: 4 e 28, respectivamente;

[00450] (c) SEQ ID NO: 4 e 30, respectivamente;

[00451] (d) SEQ ID NO: 4 e 32, respectivamente;

[00452] (e) SEQ ID NO: 4 e 34, respectivamente;

[00453] (f)| SEQ ID NO: 4 e 36, respectivamente;

[00454] (9) SEQ ID NO: 4 e 38, respectivamente;

[00455] (h) SEQ ID NO: 4 e 40, respectivamente;

[00456] (i) SEQ ID NO: 4 e 42, respectivamente;

[00457] (1) SEQ ID NO: 4 e 44, respectivamente;

[00458] (k) SEQ ID NO: 4 e 46, respectivamente;

[00459] (1) SEQ ID NO: 8 e 6, respectivamente;

[00460] (m) SEQ ID NO: 10 e 6, respectivamente;

[00461] (n) SEQ ID NO: 12 e 6, respectivamente;

[00462] (0) SEQ ID NO: 14 e 6, respectivamente;

[00463] (p) SEQ ID NO: 16 e 6, respectivamente;

[00464] (q) SEQ ID NO: 18 e 6, respectivamente;

[00465] (r) SEQ ID NO: 20 e 6, respectivamente;

[00466] (s) SEQ ID NO: 22 e 6, respectivamente;

[00467] (t) SEQ ID NO: 24 e 6, respectivamente;

[00468] (u) SEQ ID NO: 26 e 6, respectivamente;

[00469] (v) SEQ ID NO: 101 e 6, respectivamente;

[00470] (w) SEQ ID NO: 103 e 6, respectivamente; e

[00471] (x) SEQ ID NO: 4 e 105, respectivamente.

[00472] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 101 e 103; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 6, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 105.

[00473] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[00474] (a) SEQ ID NO: 4 e 6, respectivamente;

[00475] (b) SEQ ID NO: 4 e 28, respectivamente;

[00476] (c) SEQ ID NO: 4 e 30, respectivamente;

[00477] (d) SEQ ID NO: 4 e 32, respectivamente;

[00478] (e) SEQ ID NO: 4 e 34, respectivamente;

[00479] (f) SEQ ID NO: 4 e 36, respectivamente;

[00480] (g) SEQ ID NO: 4 e 38, respectivamente;

[00481] (h) SEQ ID NO: 4 e 40, respectivamente;

[00482] (1) SEQ ID NO: 4 e 42, respectivamente;

[00483] (]) SEQ ID NO: 4 e 44, respectivamente;

[00484] (k) SEQ ID NO: 4 e 46, respectivamente;

[00485] (1) SEQ ID NO: 8 e 6, respectivamente;

[00486] (m) SEQ ID NO: 10 e 6, respectivamente;

[00487] (n) SEQ ID NO: 12 e 6, respectivamente;

[00488] (o) SEQ ID NO: 14 e 6, respectivamente;

[00489] (p) SEQ ID NO: 16 e 6, respectivamente;

[00490] (q) SEQ ID NO: 18 e 6, respectivamente;

[00491] (r) SEQ ID NO: 20 e 6, respectivamente;

[00492] (s) SEQ ID NO: 22 e 6, respectivamente;

[00493] (t) SEQ ID NO: 24 e 6, respectivamente;

[00494] (u) SEQ ID NO: 26 e 6, respectivamente;

[00495] (v) SEQ ID NO: 101 e 6, respectivamente;

[00496] (w) SEQ ID NO: 103 e 6, respectivamente; e

[00497] (x) SEQ ID NO: 4 e 105, respectivamente.

[00498] Em algumas modalidades, são aqui fornecidos anticorpos que se ligam especificamente a CD137 humano que compreende regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve codificadas por sequências de nucleotídeos selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[00499] (a) SEQ ID NO: 5 e 7, respectivamente;

[00500] (b) SEQ ID NO: 5 e 29, respectivamente;

[00501] (c) SEQ ID NO: 5 e 31, respectivamente;

[00502] (d) SEQ ID NO: 5 e 33, respectivamente;

[00503] (e) SEQ ID NO: 5 e 35, respectivamente;

[00504] (f) SEQ ID NO: 5 e 37, respectivamente;

[00505] (g) SEQ ID NO: 5 e 39, respectivamente;

[00506] (h) SEQ ID NO: 5 e 41, respectivamente;

[00507] (i) SEQ ID NO: 5 e 43, respectivamente;

[00508] () SEQ ID NO: 5 e 45, respectivamente;

[00509] (k) SEQ ID NO: 5 e 47, respectivamente;

[00510] (1) SEQ ID NO: 9 e 7, respectivamente;

[00511] (m) SEQ ID NO: 11 e 7, respectivamente;

[00512] (n) SEQ ID NO: 13 e 7, respectivamente;

[00513] (o) SEQ ID NO: 15 e 7, respectivamente;

[00514] (p) SEQ ID NO: 17 e 7, respectivamente;

[00515] (q) SEQ ID NO: 19 e 7, respectivamente;

[00516] (r) SEQ ID NO: 21 e 7, respectivamente;

[00517] (s) SEQ ID NO: 23 e 7, respectivamente;

[00518] (t) SEQ ID NO: 25 e 7, respectivamente;

[00519] (u) SEQ ID NO: 27 e 7, respectivamente;

[00520] (v) SEQ ID NO: 102 e 7, respectivamente;

[00521] (w) SEQ ID NO: 104 e 7, respectivamente; e

[00522] (x) SEQ ID NO: 5 e 106, respectivamente.

[00523] Em algumas modalidades, são aqui fornecidos anticorpos que se ligam especificamente a CD137 humano, compreendendo regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve codificadas por sequências de nucleotídeos que possuem pelo menos 90%

de identidade com as sequências de nucleotídeos selecionadas do grupo que consiste em:

[00524] (a) SEQ ID NO: 5 e 7, respectivamente;

[00525] (b) SEQ ID NO: 5 e 29, respectivamente;

[00526] (c) SEQ ID NO: 5 e 31, respectivamente;

[00527] (d) SEQ ID NO: 5 e 33, respectivamente;

[00528] (e) SEQ ID NO: 5 e 35, respectivamente;

[00529] (f) SEQ ID NO: 5 e 37, respectivamente;

[00530] (9) SEQ ID NO: 5 e 39, respectivamente;

[00531] (h) SEQ ID NO: 5 e 41, respectivamente;

[00532] (i) SEQ ID NO: 5 e 43, respectivamente;

[00533] (]) SEQ ID NO: 5 e 45, respectivamente;

[00534] (k) SEQ ID NO: 5 e 47, respectivamente;

[00535] (1) SEQ ID NO: 9 e 7, respectivamente;

[00536] (m) SEQ ID NO: 11 e 7, respectivamente;

[00537] (n) SEQ ID NO: 13 e 7, respectivamente;

[00538] (0) SEQ ID NO: 15 e 7, respectivamente;

[00539] (p) SEQ ID NO: 17 e 7, respectivamente;

[00540] (q) SEQ ID NO: 19 e 7, respectivamente;

[00541] (r) SEQ ID NO: 21 e 7, respectivamente;

[00542] (s) SEQ ID NO: 23 e 7, respectivamente;

[00543] (t) SEQ ID NO: 25 e 7, respectivamente;

[00544] (u) SEQ ID NO: 27 e 7, respectivamente;

[00545] (v) SEQ ID NO: 102 e 7, respectivamente;

[00546] (w) SEQ ID NO: 104 e 7, respectivamente; e

[00547] (x) SEQ ID NO: 5 e 106, respectivamente.

[00548] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada é codificada por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 102 e 104; e em que a região variável de cadeia leve é codificada por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 7, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 e 106.

[00549] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada é codificada por uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade com uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 102 e 104; e em que a região variável de cadeia leve é codificada por uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade com uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 7, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 e 106.

[00550] Em algumas modalidades, são aqui fornecidos anticorpos anti-CD137 que se ligam especificamente ao CD137 humano e compreendem uma CDR3 de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ ID NO: 126), em que X é qualquer aminoácido. Em algumas modalidades, X é qualquer aminoácido, exceto a alanina. Em algumas modalidades, a mutação dos resíduos D95, L100, Y100E, Y100G e/ou Y100H da SEQ ID NO: 126, resulta na perda de ligação ao CD137 humano.

[00551] Em algumas modalidades, são aqui fornecidos anticorpos anti-CD137 que se ligam especificamente ao CD137 humano e compreendem uma CDR3 de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos DXPFXLDXXYYYYX (SEQ ID NO: 127), em que X é qualquer aminoácido. Em algumas modalidades, a mutação dos resíduos F98, D100A, Y100D e/ou Y100F e/ou Y100H da SEQ ID NO: 126, para alanina resulta em perda de ligação ao CD137 humano. Em algumas modalidades, a mutação dos resíduos F98, D100A, Y100D e/ou Y100F e/ou Y100H da SEQ ID NO: 126, para qualquer resíduo, exceto a alanina, resulta em um aumento na ligação ao CD137 humano.

[00552] Em algumas modalidades, são aqui fornecidos anticorpos anti-CD137 que se ligam especificamente ao CD137 humano e compreendem uma CDR3 de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos DX: X2X3X4aLXsXeX7X8Y XaY YX10 (SEQ ID NO: 128), em que X1 é qualquer aminoácido, em que X> é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xs; é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que Xs; é um aminoácido polar, em que X; é um aminoácido polar e em que X1w é qualquer aminoácido. Em algumas modalidades, X> é prolina, em que X; é fenilalanina ou triptofano, em que Xs é ácido aspártico ou ácido glutâmico, em que X;z é tirosina e em que X, é tirosina.

[00553] O papel de um resíduo de aminoácido dentro da CDR3 de cadeia pesada de um anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno, na ligação a um alvo especificado (por exemplo, CD137) pode ser determinado por métodos conhecidos por aquele versado na técnica. Em algumas modalidades, uma análise inicial usando a varredura de alanina é concluída para determinar os resíduos críticos para a ligação ao antígeno. Conforme descrito aqui, a varredura de alanina é uma técnica usada para determinar a contribuição de um resíduo específico do tipo selvagem para a estabilidade ou função(ões) (por exemplo, afinidade de ligação) de uma determinada proteína ou polipeptídeo. A técnica envolve a substituição de um resíduo de alanina por um resíduo do tipo selvagem em um polipeptídeo, seguido de uma avaliação da estabilidade ou função(ões) (por exemplo, afinidade de ligação) do derivado substituído pela alanina ou polipeptídeo mutante e comparação com o polipeptídeo do tipo selvagem. Em algumas modalidades, os resíduos identificados como não críticos são ainda avaliados para modular a ligação do anticorpo ao antígeno (por exemplo, aumentar ou diminuir a ligação). Um exemplo não limitativo dessa análise é a varredura profunda de mutações. Este método permite a avaliação de um grande número de mutações. Em algumas modalidades, cada resíduo de aminoácido dentro da CDR3 de cadeia pesada é mutado para cada resíduo de aminoácido (exceto a alanina) e a ligação é avaliada. Outros métodos para analisar o efeito de mutações de resíduos de aminoácidos são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, esses métodos são utilizados para avaliar o papel dos resíduos em todas as CDRs de cadeia pesada e de cadeia leve na ligação ao CD137 humano.

Anticorpos de Ligação a CD137 Exemplares

[00554] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 NM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 40-100 nM (por exemplo, entre cerca de 40 nM e cerca de 100 nM). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam um epítopo no CD137 humano descrito supra (por exemplo, compreendendo K114) Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ ID NO: 126). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e se liga a um epítopo no CD137 humano descrito supra (por exemplo, compreendendo K114). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de

30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ ID NO: 126). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam um epítopo no CD137 humano descrito supra (por exemplo, compreendendo K114) e compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ ID NO: 126). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma afinidade (Kp) de 30-100nM (por exemplo, entre cerca de 30 NM e cerca de 100 nM), liga um epítopo no CD137 humano descrito supra (por exemplo, compreendendo K114), e compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ ID NO: 126).

[00555] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137

[00556] (i) ligam CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM); e

[00557] (li)! compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DX: X2X3XaLX5sX6X7X8Y XoY YX10, em que X: é qualquer aminoácido, em que X2> é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xe é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que X; é um aminoácido polar, em que Xs é um aminoácido polar e em que X1o é qualquer aminoácido.

[00558] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137

[00559] (i) ligam CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM); e

[00560] (ii) ligam-se a um epítopo no CD137 humano compreendendo um ou mais resíduos E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3.

[00561] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137

[00562] (i) ligam CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[00563] (ii) ligam-se a um epítopo no CD137 humano compreendendo um ou mais resíduos E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3;

[00564] (1)! compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX, em que X é qualquer aminoácido; ou

[00565] (ii) combinações dos mesmos.

[00566] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137

[00567] (i) ligam CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[00568] (1) ligam-se a um epítopo no CD137 humano compreendendo um ou mais resíduos E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3;

[00569] (iii); compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DX X2X3XaLX5X6X7X8Y XoY YX10, em que X: é qualquer aminoácido, em que X2 é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xs é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que X; é um aminoácido polar, em que Xs é um aminoácido polar e em que X10 é qualquer aminoácido; ou

[00570] (iv) combinações dos mesmos.

[00571] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137

[00572] (i) ligam CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[00573] (ii) ligam-se especificamente a um epítopo no CD137 humano compreendendo um ou mais resíduos E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQID NO: 3; e

[00574] (ii); compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX, em que X é qualquer aminoácido.

[00575] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137

[00576] (1) ligam CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[00577] (ii) ligam-se a um epítopo no CD137 humano compreendendo um ou mais resíduos E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQID NO: 3; e

[00578] (ili)) compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DX X2X3XaLX5X6X7X8Y X9Y YX10, em que X; é qualquer aminoácido, em que X> é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xe é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que X;s é um aminoácido polar, em que Xs é um aminoácido polar e em que X10 é qualquer aminoácido.

[00579] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137

[00580] (i) ligam CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM); e

[00581] (ii) igam-se a um epítopo compreendendo uma sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQ ID NO: 3.

[00582] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137

[00583] (i) ligam CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[00584] (ii) igam-se a um epítopo compreendendo uma sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQ ID NO: 3;

[00585] (ilii)) compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX, em que X é qualquer aminoácido; ou

[00586] (iv) combinações dos mesmos.

[00587] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137

[00588] (i) ligam CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[00589] (ii) igam-se a um epítopo compreendendo uma sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQ ID NO: 3;

[00590] (ili)) compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DX X2X3XaLX5X6X7X8Y X9Y YX10, em que X; é qualquer aminoácido, em que X2 é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xs é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que X; é um aminoácido polar, em que Xs é um aminoácido polar e em que X1o é qualquer aminoácido; ou

[00591] (iv) combinações dos mesmos.

[00592] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137

[00593] (i) ligam CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[00594] (ii) igam-se a um epítopo compreendendo uma sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQID NO: 3; e

[00595] (iii)) compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX, em que X é qualquer aminoácido.

[00596] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137

[00597] (i) ligam CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[00598] (ii) igam-se a um epítopo compreendendo uma sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQID NO: 3; e

[00599] (iii)) compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DX X2X3XaLX5X6X7X8Y XoY YX10, em que X: é qualquer aminoácido, em que X2 é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xs é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que X; é um aminoácido polar, em que Xs é um aminoácido polar e em que X1o é qualquer aminoácido.

[00600] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137

[00601] (i) ligam CD137 humano com uma afinidade de cerca de 30- 100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM); e

[00602] (ii) ligam-se a um epítopo compreendendo ELTK (correspondente aos resíduos de aminoácidos 111-114 da SEQ ID NO: 3).

[00603] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137

[00604] (i) ligam CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[00605] (ii) ligam-se a um epítopo compreendendo ELTK (correspondente aos resíduos de aminoácidos 111-114 da SEQ ID NO: 3);

[00606] (iii); compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX, em que X é qualquer aminoácido; ou

[00607] (iv) combinações dos mesmos.

[00608] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137

[00609] (i) ligam CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[00610] (ii) ligam-se a um epítopo compreendendo ELTK (correspondente aos resíduos de aminoácidos 111-114 da SEQ ID NO: 3);

[00611] (iii)) compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DX X2X3XaLX5X6X7X8Y X9Y YX10, em que X; é qualquer aminoácido, em que X2 é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xe é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que X;s é um aminoácido polar, em que Xs é um aminoácido polar e em que X10 é qualquer aminoácido; ou

[00612] (iv) combinações dos mesmos.

[00613] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137

[00614] (i) ligam CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[00615] (1) ligam-se a um epítopo compreendendo ELTK (correspondente aos resíduos de aminoácidos 111-114 da SEQ ID NO: 3); e

[00616] (iii); compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX, em que X é qualquer aminoácido.

[00617] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137

[00618] (i) ligam CD137 humano a uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM);

[00619] (ii) ligam-se a um epítopo compreendendo ELTK (correspondente aos resíduos de aminoácidos 111-114 da SEQ ID NO: 3); e

[00620] (iii); compreendem uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DX: X2X3XaLX5sX6X7X8Y XoY YX10, em que X: é qualquer aminoácido, em que X2> é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xe é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que X;s é um aminoácido polar, em que Xs é um aminoácido polar e em que X10 é qualquer aminoácido.

[00621] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 descritos supra compreendem CDRs de cadeia pesada e leve selecionadas do grupo que consiste em:

[00622] (a) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente; e

[00623] (b) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 51, 108 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente.

[00624] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4e€ 101; e em que a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[00625] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em:

[00626] (a) SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente; e

[00627] (b) SEQ ID NOs: 101 e 6, respectivamente.

[00628] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em:

[00472] (a) SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente;

[00473] (b) SEQ ID NOs: 101 e 6, respectivamente; e

[00474] (c) SEQ ID NOs: 26 e 6, respectivamente.

[00629] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve codificadas por sequências de nucleotídeos selecionadas do grupo que consiste em:

[00475] (a) SEQ ID NOs: 5 e 7, respectivamente; e

[00476] (b) SEQ ID NOs: 102 e 7, respectivamente.

[00630] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve codificadas por sequências de nucleotídeos selecionadas do grupo que consiste em:

[00477] (a) SEQ ID NOs: 5 e 7, respectivamente;

[00478] (b) SEQ ID NOs: 102 e 7, respectivamente; e

[00479] (c) SEQ ID NOs: 27 e 7, respectivamente.

[00631] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4 e 101; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

[00632] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 26 e 101; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

[00633] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada é codificada por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 5 e 102; e em que a região variável de cadeia leve é codificada por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 7.

[00634] Em algumas “modalidades, os anticorpos anti-CD137 compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada é codificada por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 5, 27 e 102; e em que a região variável de cadeia leve é codificada por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 7.

[00635] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[00636] (a) SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente; e

[00637] (b) SEQ ID NOs: 101 e 6, respectivamente.

[00638] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[00639] (a) SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente;

[00640] (b) SEQ ID NOs: 101 e 6, respectivamente; e

[00641] (c) SEQ ID NOs: 26 e 6, respectivamente.

[00642] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve codificadas por sequências de nucleotídeos pelo menos 90% idênticas às sequências de nucleotídeos selecionadas do grupo que consiste em:

[00643] (a) SEQ ID NOs: 5 e 7, respectivamente; e

[00644] (b) SEQ ID NOs: 102 e 7, respectivamente.

[00645] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve codificadas por sequências de nucleotídeos pelo menos 90% idênticas às sequências de nucleotídeos selecionadas do grupo que consiste em:

[00646] (a) SEQ ID NOs: 5 e 7, respectivamente;

[00647] (b) SEQ ID NOs: 102 e 7, respectivamente; e

[00648] (c) SEQ ID NOs: 27 e 7, respectivamente.

[00649] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos têm pelo menos as propriedades funcionais de mAb1 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeias pesada e leve de SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente), mab8 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ ID NOs: 101 e 6, respectivamente) ou mAb10 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeia pesada e leve de SEQ

ID NOs: 26 e 6, respectivamente). Em algumas modalidades, as propriedades funcionais de um anticorpo aqui descrito incluem, mas não estão limitadas a: indução ou aprimoramento da dimerização de CD137; indução ou melhoria da multimerização de CD137; indução ou aumento da ativação de células T mediada por CD137; indução ou melhoria da resposta de células T citotóxicas mediada por CD137; indução ou aumento da proliferação de células T mediada por CD137; indução ou aumento da produção de citocinas mediada por CD137; falta de indução ou aumento da ativação de células T intra-hepática e/ou intrasplênica e/ou proliferação de células T; e redução ou inibição do crescimento do tumor.

[00650] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos ligam o CD137 humano a uma constante de dissociação de equilíbrio Ko pelo menos equivalente ao do mAb1 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeias pesada e leve de SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente), mab8ê (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeias pesada e leve de SEQ ID NOs: 101 e 6, respectivamente) ou mAb10 (isto é, um anticorpo compreendendo as sequências variáveis de cadeias pesada e leve de SEQ ID NOs: 26 e 6, respectivamente).

[00651] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humana ou uma região constante de cadeia pesada de IgG4 humana. Em algumas — modalidades, os anticorpos anti-cCD137 aqui descritos compreendem uma região constante de cadeia pesada de IgG1 de tipo selvagem humana ou uma região constante de cadeia pesada de IgG4 humana de tipo selvagem. Em algumas modalidades, os anticorpos anti- CD137 aqui descritos compreendem uma região constante de cadeia pesada de IgG1 de tipo selvagem humana, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem uma região constante de cadeia pesada de IgG1 mutante ou uma região constante de cadeia pesada de IgG4 mutante. Em algumas — modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem uma região constante de cadeia pesada de IgG4 mutante, em que a região constante de cadeia pesada de IgG4 mutante compreende uma substituição de aminoácidos no resíduo Ser228. Em algumas modalidades, a substituição de aminoácidos no resíduo Ser228 é S228P. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem uma região constante de cadeia pesada de IgG4, em que o resíduo de lisina c-terminal é removido. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem uma região constante de cadeia pesada de IgG4 em que o resíduo de lisina c-terminal é removido e compreende a substituição de aminoácidos S228P. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem uma região constante de cadeia pesada de IgG4, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2.

[00652] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem cadeias pesadas e leves compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 129 e 133, respectivamente. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem cadeias pesadas e leves compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 130 e 133, respectivamente. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem cadeias pesadas e leves compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 131 e 133, respectivamente.

[00653] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem cadeias pesadas e leves compreendendo as sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 132 e 133, respectivamente.

[00654] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem cadeias pesadas e leves que compreendem sequências de aminoácidos com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos, 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 129 e 133, respectivamente. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem cadeias pesadas e leves que compreendem sequências de aminoácidos com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos, 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 130 e 133, respectivamente. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem cadeias pesadas e leves que compreendem sequências de aminoácidos com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos, 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 131 e 133, respectivamente. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem cadeias pesadas e leves que compreendem sequências de aminoácidos com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos, 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 132 e 133, respectivamente.

Caracterização e Funções dos Anticorpos de Ligação a CD137 |. Afinidade

[00655] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito liga CD137 humano com uma afinidade (KD) de cerca de 40-100 nM (por exemplo, entre cerca de 40 nM e cerca de 100 nM), conforme determinado por um ensaio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito liga CD137 humano com uma afinidade (KD) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM), conforme determinado por um ensaio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito liga CD137 humano com uma afinidade (KD) de cerca de 45- 95 nM, 50-90 nM, 55-85 nM, 60-80 nM, 65-75 nM, 55-75 nM, 40-70 NM, 50- 80 nM ou 60-90 nM, conforme determinado por um ensaio de ligação ao antígeno.

[00650] Em algumas modalidades, o ensaio de ligação ao antígeno determina uma afinidade de ligação do anticorpo anti-CD137 para um polipeptídeo CD137. Em algumas modalidades, o ensaio de ligação ao antígeno é a ressonância plasmônica de superfície. Por conseguinte, em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito liga CD137 humano com uma afinidade (KD) de cerca de 40-100 nM (por exemplo, entre cerca de 40 nM e cerca de 100 nM) conforme determinado usando ressonância plasmônica de superfície. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito liga CD137 humano com uma afinidade (KD) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) conforme determinado usando ressonância plasmônica de superfície. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito liga CD137 humano com uma afinidade (KD) de cerca de 45-95 NM, 50-90 nM, 55-85 nM, 60-80 nM, 65-75 NM, 55-75 NM, 40-70 nM, 50-80 NM ou 60-90 nM, conforme determinado usando ressonância plasmônica de superfície.

[00651] A frase "ressonância plasmônica de superfície" inclui um fenômeno óptico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real pela detecção de alterações nas concentrações de proteínas em uma matriz de biossensores, por exemplo, usando o sistema BlAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, NJ). Para mais descrições, ver Jônsson, U,, et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jônsson, U,, et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; e Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.Em algumas modalidades, o ensaio de ligação ao antígeno é a interferometria de biocamada (BLI). Por conseguinte, em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito liga CD137 humano com uma afinidade (KD) de cerca de 40-100 nM (por exemplo, entre cerca de 40 nM e cerca de 100 nM), conforme determinado por interferometria de biocamada. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito liga CD137 humano com uma afinidade (KD) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM), conforme determinado utilizando interferometria de biocamada. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito liga CD137 humano com uma afinidade (KD) de cerca de 45-95 nM, 50-90 nM, 55-85 nM, 60-80 NM, 65-75 NM, 55-75 nM, 40-70 nM, 50-80 nM ou 60-90 nM, conforme determinado por interferometria de biocamada.

[00652] A frase "interferometria de biocamada" ou "BLI" inclui um fenômeno óptico que permite a medição de alterações sub-nanométricas na espessura de sua superfície de detecção de camada óptica. Em algumas modalidades, as biomoléculas se ligam a uma superfície do sensor e alteram a espessura da camada óptica. A magnitude da alteração da espessura da camada óptica é proporcional à massa ou peso molecular da molécula de ligação. Em algumas modalidades, CD137 é imobilizado na superfície do sensor para medir a ligação por um anticorpo, em que a ligação cria uma alteração no peso molecular para produzir uma alteração correspondente na espessura da camada óptica. Em algumas modalidades, a BLI é realizado com um sistema OCTET (ForteBio).

!. Efeitos das Células Imunes

[00653] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito induz ou melhora a produção de citocinas por uma célula imune, conforme determinado por um ensaio de citocinas. Em algumas modalidades, o ensaio de citocinas determina uma quantidade de pelo menos uma citocina secretada a partir de uma célula imune em contato com o anticorpo anti-CD137, em que um aumento na quantidade de pelo menos uma citocina indica indução ou aprimoramento da produção de citocinas pelo anti-CD137. Em algumas modalidades, um aumento na produção de citocinas é pelo menos 1 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou vezes mais em comparação com um anticorpo de controle (por exemplo, um anticorpo que não se liga a CD137 e não induz a produção de citocinas).

[00654] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito induz ou melhora a produção de citocinas por uma célula imune, conforme determinado por um ensaio de citocinas, em que o ensaio de citocinas compreende as seguintes etapas:

[00655] (1) por em contato a célula imune com o anticorpo anti- CD137; e

[00656] (ii) determinar uma quantidade de pelo menos uma citocina produzida pela célula imune,

[00657] em que um aumento na quantidade de pelo menos uma citocina indica que o anticorpo anti-CD137 induz ou melhora a produção de citocinas pela célula imune.

[00658] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito induz ou melhora a produção de citocinas por uma célula imune, conforme determinado por um ensaio de citocinas, em que o ensaio de citocinas compreende as seguintes etapas:

[00659] (i) por em contato a célula imune com um anticorpo anti- CD137; e

[00660] (ii) determinar uma quantidade de pelo menos uma citocina produzida pela célula imune, e

[00661] (iii) comparar a quantidade de pelo menos uma citocina produzida pela célula imune com uma quantidade secretada a partir de uma célula imune de referência,

[00662] em que a célula imune de referência é contatada com um anticorpo de controle e em que um aumento na quantidade de pelo menos uma citocina produzida a partir da célula imune em relação à célula imune de referência indica indução ou aprimoramento da produção de citocina mediada por CD137 humano.

[00663] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito induz ou melhora a produção de citocinas por uma célula imune, conforme determinado por um ensaio de citocinas, em que o ensaio de citocinas compreende as seguintes etapas:

[00664] (i) por em contato uma célula imune com um anticorpo anti- CD137;

[00665] (ii) determinar uma quantidade de pelo menos uma citocina produzida pela célula imune, e

[00666] (iii) comparar a quantidade de pelo menos uma citocina produzida pela célula imune com uma quantidade ou nível secretado a partir de uma célula imune de referência,

[00667] em que a célula imune de referência não é contatada com o anticorpo anti-CD137 e em que um aumento na quantidade de pelo menos uma citocina produzida a partir da célula imune em relação à célula imune de referência indica indução ou aprimoramento da produção de citocina mediada por CD137 humano pela célula imune.

[00668] Em algumas modalidades, pelo menos uma citocina é selecionada a partir de um grupo que consiste em IL-2, IFNy, TNFa, IL-13 e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a citocina é IL-2. Em algumas modalidades, a citocina é IFNy. Em algumas modalidades, a citocina é TNFa. Em algumas modalidades, a citocina é IL-13. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 induz ou aprimora a produção de |IL-

2. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 induz ou aprimora a produção de TNFa. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 induz ou aprimora a produção de IL-13. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-2. Em alguns aspectos, a citocina produzida é TNFa. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-13. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IFNy. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-2 e TNFa. Em alguns aspectos, a citocina produzida é |L-2 e 11-13. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-2 e IFNy. Em alguns aspectos, a citocina produzida é TNFae IL-13. Em alguns aspectos, a citocina produzida é TNFa e IFNy. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-13 e IFNy. Em alguns aspectos, a citocina produzida é |L-2, TNFa e IL-13. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-2, TNFa e IFNy. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IFNy, TNFa e IL-13.

[00669] Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula T. Em algumas modalidades, a célula imune de referência é uma célula T. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T CD8+.

[00670] Em algumas modalidades, o ensaio de citocinas é um ensaio de matriz de esferas de citocinas. Um ensaio de matriz de esferas de citocinas é um imunoensaio baseado em esferas que permite a determinação citométrica de fluxo multianalítico de várias citocinas em uma amostra. O uso de microesferas de diferentes tamanhos ou cores é a base de um ensaio de matriz de esferas de citocinas, em que cada microesfera (ou "esfera") é revestida com um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno (por exemplo, uma citocina). As esferas revestidas com anticorpos são então introduzidas em uma amostra em combinação com anticorpos detectores. Os complexos de anticorpo esfera:antígeno:detector são analisados por citometria de fluxo. Os ensaios de matriz de esferas de citocinas disponíveis comercialmente incluem, mas não estão limitados a, Sistemas de Matriz de Esferas Citométricas BD'Y (BD Biosciences) e Ensaios LuminexO (R&D Systems). Em algumas modalidades, a indução ou aprimoramento da produção de citocinas mediada por CD137 humano é determinada por um ensaio de matriz de esferas de citocinas. Em algumas modalidades, a indução ou aprimoramento da produção de citocinas mediada por CD137 humano é determinada por um Ensaio Luminex€O.

[00671] Em algumas modalidades, o ensaio de citocinas é um ensaio de Descoberta em Mesoescala (MSD) (Meso Scale Diagnostics; Rockville, MD). Um ensaio MSD é um ensaio comercialmente disponível, com base na detecção de anticorpos marcados por eletroquimiluminescentes que se ligam especificamente a um antígeno (por exemplo, uma citocina) de interesse. Um ensaio MSD compreende eletrodos de carbono de alta ligação no fundo dos poços de microplacas que permitem a conexão de reagentes biológicos (por exemplo, captura de anticorpos específicos para uma citocina). Os ensaios MSD usam marcadores eletroquimiluminescentes que são conjugados aos anticorpos de detecção. Uma amostra é adicionada aos poços da microplaca e a eletricidade é aplicada aos eletrodos da placa por um instrumento de MSD, levando à emissão de luz pelas etiquetas eletroquimiluminescentes. A intensidade da luz é medida para quantificar analitos (por exemplo, citocinas) na amostra. Em algumas modalidades, a indução ou aprimoramento da produção de citocinas mediada por CD137 humano é determinada por um ensaio de Descoberta em Mesoescala (MSD).

[00672] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito induz ou aprimora a ativação de células T conforme determinado por um ensaio de ativação de células T. Em algumas modalidades, o ensaio de ativação de células T determina uma quantidade de pelo menos uma citocina secretada a partir de células T contatadas com um anticorpo anti- CD137 aqui descrito, em que um aumento na quantidade de pelo menos uma citocina indica indução ou aprimoramento da célula T ativação. Em algumas modalidades, um aumento na produção de citocinas é pelo menos 1 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes mais em comparação com um anticorpo de controle (por exemplo, um anticorpo que não se liga a CD137 e não induz a produção de citocinas) .

[00673] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito induz ou aprimora a ativação de células T conforme determinado por um ensaio de ativação de células T, em que o ensaio de ativação de células T compreende as seguintes etapas:

[00674] (i) isolar células T de um indivíduo;

[00675] (ii) por as células T em contato com um anticorpo anti- CD137; e

[00676] (iii) determinar uma quantidade de pelo menos uma citocina secretada pelas células T após (ii),

[00677] em que um aumento no nível de pelo menos uma citocina indica que o anticorpo anti-CD137 induz ou melhora a ativação de células T.

[00678] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito induz ou aprimora a ativação de células T conforme determinado por um ensaio de ativação de células T, em que o ensaio de ativação de células T compreende as seguintes etapas:

[00679] (i) isolar células T de um indivíduo;

[00680] (ii) contatar as células T com um anticorpo anti-CD137;

[00681] (iii) determinar uma quantidade de pelo menos uma citocina secretada pelas células T; e

[00682] (iv) comparar a quantidade de pelo menos uma citocina produzida pelas células T com uma quantidade ou nível secretado pelas células T de referência,

[00683] em que as células T de referência não são contatadas com o anticorpo anti-CD137 e em que um aumento na quantidade de pelo menos uma citocina produzida a partir das células T em relação às células T de referência indica que o anticorpo anti-CD137 induz ou melhora a ativação de células T.

[00684] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito induz ou aprimora a ativação de células T conforme determinado por um ensaio de ativação de células T, em que o ensaio de ativação de células T compreende as seguintes etapas:

[00685] (i) isolar células T de um indivíduo;

[00686] (ii) contatar as células T com um anticorpo anti-CD137;

[00687] (iii) determinar uma quantidade de pelo menos uma citocina secretada pelas células T; e

[00688] (iv) comparar a quantidade de pelo menos uma citocina produzida pelas células T com uma quantidade secretada a partir das células T de referência,

[00689] em que as células T de referência são contatadas com um anticorpo de controle e em que um aumento na quantidade de pelo menos uma citocina produzida a partir das células T em relação às células T de referência indica que o anticorpo anti-CD137 induz ou melhora a ativação de células T.

[00690] Em algumas modalidades, o ensaio de ativação de células T compreende determinar o nível de pelo menos uma citocina secretada pelas células T após o contato com um anticorpo anti-CD137 aqui descrito, em que a pelo menos uma citocina é selecionada do grupo que consiste em IL-2 , IFNy, TNFo e IL-13. Em algumas modalidades, a citocina é 1L-2. Em algumas modalidades, a citocina é IFNy. Em algumas modalidades, a citocina é TNFa. Em algumas modalidades, a citocina é 11-13. Em algumas modalidades, o ensaio de ativação de células T compreende um ensaio de citocina, como os aqui descritos, para determinar a quantidade de pelo menos uma citocina. Em alguns aspectos, a citocina produzida é I|L-2. Em alguns aspectos, a citocina produzida é TNFa. Em alguns aspectos, a citocina produzida é I|L-13. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IFNy. Em alguns aspectos, a citocina produzida é I|L-2 e TNFa. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-2 e IL-13. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-2 e IFNy. Em alguns aspectos, a citocina produzida é TNFa e IL-13. Em alguns aspectos, a citocina produzida é TNFa e IFNy. Em alguns aspectos, a citocina produzida é I|L-13 e IFNy. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-2, TNFa e IL-13. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IL-2, TNFa e IFNy. Em alguns aspectos, a citocina produzida é IFNy, TNFa e IL-13.

[00691] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito induz ou aprimora a ativação de células T conforme determinado por um ensaio de ativação de células T, em que o ensaio de ativação de células T compreende detectar a expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação em células T e em que um aumento no nível de expressão de pelo menos um marcador de ativação indica indução ou aprimoramento da ativação de células T. Em algumas modalidades, "aumento na expressão da superfície" refere-se a pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% , 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de aumento na expressão da superfície em relação à expressão da superfície na presença de um anticorpo de controle ou na ausência de um anticorpo.

[00692] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito induz ou aprimora a ativação de células T conforme determinado por um ensaio de ativação de células T in vitro, em que o ensaio de ativação de células T compreende as seguintes etapas:

[00693] (i) isolar células T de um indivíduo;

[00694] (ii) por as células T em contato com um anticorpo anti- CD137; e

[00695] (iii) detectar a expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação nas células T,

[00696] em que um aumento na expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação indica que o anticorpo anti-CD137 induz ou melhora a ativação das células T.

[00697] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito induz ou aprimora a ativação de células T conforme determinado por um ensaio de ativação de células T, em que o ensaio de ativação de células T compreende as seguintes etapas:

[00698] (i) isolar células T de um indivíduo;

[00699] (ii) contatar as células T com um anticorpo anti-CD137;

[00700] (iii) determinar a expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação nas células T; e

[00701] (iv) comparar a expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação nas células T com a expressão da superfície do pelo menos um marcador de ativação nas células T de referência,

[00702] em que as células T de referência não são contatadas com o anticorpo anti-CD137 e em que um aumento na expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação nas células T em relação às células T de referência indica que o anticorpo anti-CD137 induz ou melhora a ativação das células T.

[00703] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito induz ou aprimora a ativação de células T conforme determinado por um ensaio de ativação de células T, em que o ensaio de ativação de células T compreende as seguintes etapas:

[00704] (i) isolar células T de um indivíduo;

[00705] (ii) contatar as células T com um anticorpo anti-CD137;

[00706] (iii) determinar a expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação nas células T,

[00707] (iv) comparar a expressão da superfície do pelo menos um marcador de ativação nas células T com a expressão da superfície do pelo menos um marcador de ativação nas células T de referência,

[00708] em que as células T de referência são postas em contato com um anticorpo de controle e em que um aumento na expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação nas células T em relação à expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação nas células T de referência indica que o anticorpo annti-CD137 induz ou melhora a ativação de células T.

[00709] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito induz ou aprimora a ativação de células T conforme determinado por um ensaio de ativação de células T in vivo, em que o ensaio de ativação de células T compreende as seguintes etapas:

[00710] (i) administrar o anticorpo anti-CD137 a um indivíduo;

[00711] (ii) isolar células T do indivíduo; e

[00712] (iii) detectar a expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação nas células T,

[00713] em que um aumento na expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação indica que o anticorpo anti-CD137 induz ou aprimora a ativação de células T mediada por CD137.

[00714] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito induz ou aprimora a ativação de células T conforme determinado por um ensaio de ativação de células T, em que o ensaio de ativação de células T compreende as seguintes etapas:

[00715] (i) administrar o anticorpo anti-CD137 a um indivíduo;

[00716] (ii) isolar células T do indivíduo;

[00717] (iii) determinar a expressão superficial de pelo menos um marcador de ativação nas células T após; e

[00718] (iv) comparar a expressão da superfície do pelo menos um marcador de ativação nas células T com a expressão da superfície do pelo menos um marcador de ativação nas células T de referência,

[00719] em que as células T de referência são isoladas de um indivíduo não administrado o anticorpo anti-CD137 e em que um aumento na expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação nas células T em relação às células T de referência indica que o anticorpo anti- CD137 induz ou melhora a ativação das células T.

[00720] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito induz ou aprimora a ativação de células T conforme determinado por um ensaio de ativação de células T, em que o ensaio de ativação de células T compreende as seguintes etapas:

[00721] (i) administrar o anticorpo anti-CD137 a um indivíduo;

[00722] (ii) isolar células T do indivíduo;

[00723] (iii) determinar a expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação nas células T; e

[00724] (iv) comparar a expressão da superfície do pelo menos um marcador de ativação nas células T com a expressão da superfície do pelo menos um marcador de ativação nas células T de referência,

[00725] em que as células T de referência são isoladas de um indivíduo contatado com um anticorpo de controle e em que um aumento na expressão da superfície do pelo menos um marcador de ativação nas células T em relação à expressão da superfície do pelo menos um marcador de ativação nas células T de referência indica que o anticorpo anti-CD137 induz ou melhora a ativação de células T.

[00726] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito não induz nem aprimora a ativação intra-hepática de células T, conforme determinado por um ensaio de ativação de células T in vivo, em que o ensaio de ativação de células T compreende as seguintes etapas:

[00727] (i) administrar o anti-CD137 a um indivíduo;

[00728] (ii) isolar células T do fígado do indivíduo;

[00729] (iii) detectar a expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação nas células T; e

[00730] (iv) comparar a expressão da superfície do pelo menos um marcador de ativação nas células T com a expressão da superfície do pelo menos um marcador de ativação nas células T de referência,

[00731] em que as células T de referência são isoladas de um indivíduo não administrado o anticorpo anti-CD137, opcionalmente, em que as células T de referência são isoladas de um indivíduo administrado um anticorpo de controle e em que uma ausência de um aumento na expressão da superfície do pelo menos um marcador de ativação nas células T em relação à expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação nas células T de referência indica que o anticorpo anti-CD137 induz ou melhora a ativação das células T.

[00732] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito não induz nem aprimora a ativação intrasplênica de células T, conforme determinado por um ensaio de ativação de células T in vivo, em que o ensaio de ativação de células T compreende as seguintes etapas:

[00733] (i) administrar o anti-CD137 a um indivíduo;

[00734] (ii) isolar células T do baço do indivíduo;

[00735] (iii) detectar a expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação nas células T; e

[00736] (iv) comparar a expressão da superfície do pelo menos um marcador de ativação nas células T com a expressão da superfície do pelo menos um marcador de ativação nas células T de referência,

[00737] em que as células T de referência são isoladas de um indivíduo não administrado o anticorpo anti-CD137, opcionalmente, em que as células T de referência são isoladas de um indivíduo administrado com um anticorpo de controle e em que uma ausência em um aumento na expressão da superfície do pelo menos um marcador de ativação nas células T em relação à expressão da superfície de pelo menos um marcador de ativação nas células T de referência indica que o anticorpo anti-CD137 induz ou melhora a ativação das células T.

[00738] Em algumas modalidades "não induz ou melhora", pretende se referir a ausência de uma atividade (por exemplo, ativação de células T) ou a falta de aumento de uma atividade em relação a um aumento por um anticorpo de referência.

[00739] Em algumas modalidades, uma expressão de superfície de um marcador de ativação de células T é equivalente à expressão de superfície na ausência de um anticorpo. Em algumas modalidades, uma expressão superficial de um marcador de ativação de célula T é menor que a expressão superficial na presença de um anticorpo de referência que induz ou aprimora a expressão superficial pelo menos 1 vez, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes ou 100 vezes mais em comparação para expressar a superfície na ausência de um anticorpo.

[00740] Em algumas modalidades, o pelo menos um marcador de ativação é selecionado do grupo que consiste em CD25, CD69 e CD40L. Em algumas modalidades, os um ou mais marcadores de ativação são CD?25.

[00741] Em algumas modalidades, as células T são isoladas de um indivíduo com um tumor. Em algumas modalidades, as células T são isoladas do tumor. Em algumas modalidades, o anticorpo de controle é um anticorpo de controle de isotipo.

[00742] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito induz ou melhora a infiltração de uma ou mais células imunes em um microambiente tumoral, conforme determinado por um ensaio de infiltração de células imunes. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- CD137 aqui descrito diminui a infiltração de uma ou mais células imunes em um microambiente tumoral, conforme determinado por um ensaio de infiltração de células imunes.

[00743] Em algumas modalidades, o ensaio de infiltração de células imunes determina uma quantidade de células imunes que expressam um ou mais marcadores de células imunes em um tumor. Em algumas modalidades, o um ou mais marcadores de células imunes é marcado com um anticorpo. Em algumas modalidades, o um ou mais marcadores de células imunes é selecionado a partir do grupo que consiste em CD45, CD25, FOXP3, CD4, CD8, F4/80, CD11b, TIGIT e PD-1. Em algumas modalidades, a quantidade de células imunes que expressam um ou mais marcadores de células imunes em um tumor é determinada por citometria de fluxo. Os métodos de quantificação de células imunes que expressam um ou mais marcadores de células imunes por citometria de fluxo são conhecidos na técnica.

[00744] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD137 induz ou aprimora a infiltração de uma ou mais células imunes em um microambiente tumoral em relação a um anticorpo de referência, conforme determinado por um ensaio de infiltração de células imunes. Em algumas modalidades, o anticorpo de referência é um anticorpo compreendendo o mesmo isótipo que o anticorpo anti-CD137 e não se liga especificamente a CD137. Em algumas modalidades, o anticorpo de referência é um anticorpo compreendendo o mesmo isótipo que o anticorpo anti-CD137 e se liga especificamente a CD137. Em algumas modalidades, o anticorpo de referência é um anticorpo compreendendo o isotipo diferente como o anticorpo anti-CD137 e não se liga especificamente a CD137. Em algumas modalidades, o anticorpo de referência é um anticorpo compreendendo um isótipo diferente do anticorpo anti-CD137 e se liga especificamente a CD137.

[00745] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito aumenta a infiltração de células imunes que expressam CD45 em um microambiente de tumor em um indivíduo, conforme determinado por um ensaio de infiltração de células imunes, em que o ensaio compreende as seguintes etapas:

[00746] (i) administrar o anticorpo anti-CD137 a um indivíduo com um tumor;

[00747] (ii) obter uma amostra do tumor;

[00748] (iii) por a amostra em contato com um anticorpo de detecção marcado com fluorescência que se liga especificamente a CD45, em que o anticorpo de detecção marca fluorescentemente as células imunes que expressam CD45; e

[00749] (iv) determinar uma quantidade de células imunológicas marcadas com fluorescência que expressam CD45 por citometria de fluxo,

[00750] em que um aumento na quantidade de células imunes a fluorescência que expressam CD45 no tumor indica que o anticorpo anti- CD137 induz ou melhora a infiltração de células imunes no microambiente do tumor. Em algumas modalidades, um aumento na quantidade de células imunes que expressam CD45 é de pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ou 80% do total de células no microambiente do tumor.

[00751] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito reduz ou inibe a infiltração de uma ou mais células imunes em um microambiente tumoral, conforme determinado por um ensaio de infiltração de células imunes. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD137 diminui a infiltração de uma ou mais células imunes em um microambiente tumoral em relação a um anticorpo de referência, conforme determinado por um ensaio de infiltração de células imunes. Em algumas modalidades, o anticorpo de referência é um anticorpo compreendendo o mesmo isótipo que o anticorpo anti-CD137 e não se liga especificamente a CD137. Em algumas “modalidades, o anticorpo de referência é um anticorpo compreendendo o mesmo isótipo que o anticorpo anti-CD137 e se liga especificamente a CD137. Em algumas modalidades, o anticorpo de referência é um anticorpo compreendendo o isotipo diferente como o anticorpo anti-CD137 e não se liga especificamente a CD137. Em algumas modalidades, o anticorpo de referência é um anticorpo compreendendo um isótipo diferente do anticorpo anti-CD137 e se liga especificamente a CD137. Em algumas modalidades, uma diminuição nas células imunes é inferior a 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5% do total de células em um microambiente de tumor.

[00752] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito diminui a infiltração de macrófagos associados a tumores em um microambiente de tumor em um indivíduo, conforme determinado por um ensaio de infiltração de células imunes, em que o ensaio compreende as seguintes etapas:

[00753] (1) obter uma amostra do tumor;

[00754] (ii) entrar em contato com a amostra com um ou mais anticorpos que marcam o macrófago associado ao tumor, em que o um ou mais anticorpos se ligam especificamente a um marcador de célula imune selecionado do grupo que consiste em F4/80, CD11b, CD45 e uma combinação dos mesmos; e

[00755] (iii) determinar uma quantidade de macrófagos associados a tumores marcados por citometria de fluxo. Em algumas modalidades, os macrófagos associados ao tumor são inferiores a 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5% de células imunes no microambiente tumoral. Em algumas modalidades, os macrófagos associados ao tumor expressam F4/80, CD11b e CDA45.

[00756] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito diminui a infiltração de células reguladoras T (Tregs) em um microambiente tumoral em um indivíduo, conforme determinado por um ensaio de infiltração de células imunes, em que o ensaio compreende as seguintes etapas:

[00757] (i) obter uma amostra do tumor;

[00758] (ii) por a amostra em contato com um ou mais anticorpos que marcam o macrófago associado ao tumor, em que o um ou mais anticorpos se ligam especificamente a um marcador de célula imune selecionado do grupo que consiste em CD25, FOXP-3, CD4 e uma combinação dos mesmos; e

[00759] (iii) determinar uma quantidade das células Treg marcadas por citometria de fluxo. Em algumas modalidades, as células Treg são inferiores a 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5% de células T CD4+ no microambiente do tumor. Em algumas modalidades, as células Treg expressam CD4, FOXP-3 e CD25.

[00760] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito protege as células T da exaustão de células T e/ou reverte a exaustão de células T conforme determinado por um ensaio de exaustão de células T. As células T esgotadas podem ser distinguidas de outras disfunções de células T, como anergia e senescência, com base em seus mecanismos moleculares subjacentes (Crespo et al., (2013) Curr Opin Immunol 25(2):241-221). Embora a anergia ocorra durante a preparação,

devido à ausência de sinais co-estimulatórios, e a senescência seja interrompida após uma proliferação extensa, as células T esgotadas surgem de células T que inicialmente ganharam e forneceram a função efetora da célula T, mas que exibem uma deterioração gradual da função efetiva da célula T devido a estimulação contínua do receptor de células T (TOR) a partir de antígenos persistentes e mediadores inflamatórios, os quais geralmente ocorrem em tumores (Wherry & Kurachi (2015) Nat Rev Immunol 15(8):486-99). As características da exaustão das células T incluem, mas não estão limitadas a, deterioração contínua da função in vivo e/ou ex vivo das células T, aumento da expressão de múltiplos receptores inibitórios (IRs) (por exemplo, PD-1, CTLA4, LAG-3, TIM-3, CD244, CD160, TIGIT), perda progressiva ou diminuição da secreção efetiva de citocinas (por exemplo, IL-2, interferon gama (IFNy), fator de necrose tumoral alfa (TNFa)), perda ou diminuição da produção de quimiocina CC (B-quimiocina), baixa capacidade de resposta a IL-7 e I|L-15, perda ou diminuição da capacidade proliferativa , perda ou diminuição da atividade citolítica in vivo e/ou ex vivo, metabolismo celular alterado e um perfil transcricional diferente em relação às células T não esgotadas. As células T severamente esgotadas podem sucumbir à exclusão (Yi et al., (2010) Immunology 129(4):474-481).

[00761] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito protege as células T da exaustão de células T e/ou reverte a exaustão de células T, conforme determinado por um ensaio de exaustão de células T, em que o ensaio de exaustão de células T determina uma quantidade ou nível de uma ou mais citocinas efetoras secretadas a partir de células T tratadas com um anticorpo anti-CD137 aqui descrito, em que a quantidade ou o nível de uma ou mais citocinas efetoras indica proteção ou reversão da exaustão das células T. Em algumas modalidades, o ensaio de exaustão de células T compreende as seguintes etapas:

[00762] (i) isolamento de células T de um indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano);

[00763] (ii) por em contato as células T com um antígeno que induz a exaustão das células T;

[00764] (iii) por em contato as células T com o anticorpo anti-CD137;

[00765] (iv) determinar uma quantidade de uma ou mais citocinas efetoras segregadas das células T; e;

[00766] (v) comparar a quantidade ou o nível de uma ou mais citocinas efetoras segregadas das células T com uma quantidade ou nível segregado das células T de referência,

[00767] em que as células T de referência não são contatadas com o antígeno que induz a exaustão das células T e em que a diferença na quantidade ou nível de uma ou mais citocinas efetoras secretadas pelas células T e células T de referência indica proteção de ou reversão da exaustão da célula T.

[00768] Em algumas modalidades, a uma ou mais citocinas efetoras é selecionada dentre |L-2, IFNy e TNFa. Em algumas modalidades, a quantidade ou o nível de uma ou mais citocinas efetoras é determinado por ELISA. ELISAs adequados para a determinação da quantidade ou nível de uma ou mais citocinas efetoras são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a quantidade ou o nível de uma ou mais citocinas efetoras é determinado por Descoberta em Mesoescala. Em algumas modalidades, a quantidade ou o nível de uma ou mais citocinas efetoras é determinada por qualquer um dos ensaios de produção de citocinas aqui descritos.

[00769] A disfunção gradual das células T exauridas é acompanhada pela expressão de IRs, que transmitem sinais inibitórios ao núcleo após a interação com ligantes nas células-alvo. Por conseguinte, em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito protege as células T da exaustão de células T e/ou reverte a exaustão de células T, conforme determinado por um ensaio de exaustão de células T, em que o ensaio de exaustão de células T determina um nível de expressão de um ou mais inibidores receptores em células T tratadas com um anticorpo anti-CD137 aqui descrito, em que o nível de expressão de um ou mais receptores inibidores indica proteção ou reversão da exaustão das células T. Em algumas modalidades, o ensaio de exaustão de células T compreende as seguintes etapas:

[00770] (i) isolamento de células T de um indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano);

[00771] (ii) por em contato as células T com um antígeno que induz a exaustão das células T;

[00772] (iii) por em contato as células T com o anticorpo anti-CD137;

[00773] (iv) determinar um nível de expressão de um ou mais receptores inibidores nas células T; e

[00774] (v) comparar o nível de expressão de um ou mais receptores inibitórios nas células T com uma quantidade ou nível secretado das células T de referência, em que as células T de referência não são contatadas com o antígeno que induz a exaustão das células T e em que a diferença no nível de expressão de um ou mais receptores inibitórios nas células T e células T de referência indicam proteção ou reversão da exaustão das células T.

[00775] Em algumas modalidades, um ou mais receptores inibitórios é selecionado a partir de TIGIT e PD-1. Em algumas modalidades, o nível de expressão de um ou mais receptores inibidores é determinado por citometria de fluxo. Os métodos para determinar os níveis de expressão de receptores inibitórios nas células imunes (por exemplo, células T) por citometria de fluxo são conhecidos na técnica.

[00776] Em algumas modalidades, a quantidade de células T esgotadas é inferior a 20%, 15%, 10% ou 5% do total de células T CD8+ ou CD4+ em um microambiente de tumor.

[00777] Onde os ensaios aqui descritos se referem a “isolar células T de um indivíduo”; deve entender-se que o ensaio pode ser realizado adequadamente em células T previamente isoladas de um indivíduo.

[00778] Onde os ensaios aqui descritos se referem a (i) administração do anticorpo anti-CD137 a um indivíduo e (ii) isolamento de células T do indivíduo; deve entender-se que o ensaio pode ser adequadamente realizado em células T previamente isoladas de um indivíduo ao qual o anticorpo anti-CD137 foi administrado.

[00779] Onde os ensaios aqui descritos se referem a “obtenção de uma amostra do tumor”; deve ser entendido que o ensaio pode ser realizado adequadamente em uma amostra de um tumor previamente isolado de um indivíduo.

[00780] Onde os ensaios aqui descritos se referem a (i) administração do anticorpo anti-CD137 a um indivíduo com um tumor e (ii) obtenção de uma amostra do tumor; deve ser entendido que o ensaio pode ser adequadamente realizado uma amostra de um tumor previamente isolado de um indivíduo ao qual o anticorpo anti-CD137 foi administrado.

um. Ligação ao Não-Ligante

[00781] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito se liga a uma região de ligação ao não-ligante de CD137, conforme determinado por um ensaio de ligação ao ligante. Um ensaio de ligação ao ligante (LBA) é um ensaio, ou um procedimento analítico, que fornece uma medida das interações que ocorrem entre duas moléculas de reagente (por exemplo, um polipeptídeo receptor e ligante). Adequadamente, o LBA fornece uma medida do grau de afinidade entre as duas moléculas de reagente (por exemplo, um polipeptídeo receptor e ligante). Por exemplo,

em algumas modalidades, um ensaio de ligação ao ligante é usado para determinar a presença, taxa, extensão da ligação ou combinações dos mesmos de uma molécula de ligante (por exemplo, CD137L) a um receptor (por exemplo, CD137). Em algumas modalidades, para determinar a presença, taxa e/ou extensão da ligação do ligante a um receptor, um ensaio de ligação ao ligante compreende detectar a formação de um complexo ligante:receptor. Em algumas modalidades, para determinar a presença, taxa e/ou extensão da ligação do ligante a um receptor, um ensaio de ligação ao ligante compreende determinar a dissociação de um complexo ligante:receptor.

[00782] Em algumas modalidades, a formação e/ou dissociação de um complexo ligante:receptor é determinada pela detecção de um ligante marcado com fluorescência no complexo com um receptor. Em algumas modalidades, a formação e/ou dissociação de um complexo ligante: receptor é determinada por detecção e/ou quantificação de uma quantidade de receptor marcado com fluorescência no complexo com um ligante. Em algumas modalidades, a formação e/ou dissociação de um complexo ligante:receptor é determinada pela detecção e/ou quantificação de uma quantidade de um anticorpo marcado com fluorescência que se liga especificamente ao complexo ligante:receptor. Os métodos para detectar e quantificar a fluorescência são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, polarização de fluorescência (FP) e anisotropia de fluorescência (FA).

[00783] Em algumas modalidades, a formação e/ou dissociação de um complexo ligante:receptor é determinada pela detecção e/ou quantificação de uma quantidade de um ligante marcado radioativamente no complexo com um receptor. Em algumas modalidades, a formação e/ou dissociação de um complexo ligante: receptor é determinada por detecção e/ou quantificação de uma quantidade de receptor marcado radioativamente no complexo com um ligante. Em algumas modalidades, a formação e/ou dissociação de um complexo ligante:receptor é determinada pela detecção e/ou quantificação de uma quantidade de um anticorpo marcado radioativamente que se liga especificamente ao complexo ligante:receptor. Os métodos para detectar e quantificar a radioatividade são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, autoradiografia quantitativa e contagem de cintilação.

[00784] Em algumas modalidades, a formação e/ou dissociação de um complexo ligante: receptor é determinada pela detecção e/ou quantificação de uma quantidade de um ligante marcado com bioluminescência no complexo com um receptor. Em algumas modalidades, a formação e/ou dissociação de um complexo ligante:receptor é determinada por detecção e/ou quantificação de uma quantidade de receptor marcado bioluminescentemente no complexo com um ligante. Em algumas modalidades, a formação e/ou dissociação de um complexo ligante: receptor é determinada pela detecção e/ou quantificação de uma quantidade de um anticorpo marcado com bioluminescência que se liga especificamente ao complexo ligante:receptor. Os métodos de detecção e quantificação da bioluminescência são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, luminometria.

[00785] Em algumas modalidades, a formação e/ou dissociação do complexo ligante: receptor é determinada por ressonância plasmônica de superfície (SPR), conforme descrito supra.

[00786] Em algumas modalidades, um ensaio de ligação ao ligante determina se um anticorpo que se liga especificamente a um receptor (por exemplo, um anticorpo anti-CD137) afeta a formação de um complexo ligante: receptor, determinando a presença, taxa e/ou extensão da ligação ao ligante a o receptor na presença do anticorpo. Em algumas modalidades, um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-CD137) que se liga especificamente a um receptor (por exemplo, CD137) e diminui, interrompe ou bloqueia a formação de um complexo ligante: receptor (por exemplo, um complexo CD137:CD137L) é conhecido como "anticorpo bloqueador de ligantes". Em algumas modalidades, um "anticorpo bloqueador de ligante" pode diminuir a formação de um complexo ligante: receptor (por exemplo, um complexo CD137:CD137L) em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50% em comparação com a formação do complexo ligante: receptor (por exemplo, o complexo CD137:CD137L) que ocorre na ausência do anticorpo bloqueador do ligante. Em algumas modalidades, um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-CD137) que se liga especificamente a um receptor (por exemplo, CD137) e não diminui, interrompe ou bloqueia a formação de um complexo ligante:receptor (por exemplo, um complexo CD137:CD137L) é referido como "anticorpo bloqueador não ligante". Em algumas modalidades, um "anticorpo bloqueador não ligante" pode diminuir a formação de um complexo ligante: receptor (por exemplo, um complexo CD137:CD137L) em menos de 10%, menos de 5%, menos de 2% ou menos de 1% em comparação com a formação do complexo ligante: receptor (por exemplo, o complexo CD137:CD137L) que ocorre na ausência do anticorpo bloqueador não ligante. Por conseguinte, em algumas modalidades, um ensaio de ligação ao ligante caracteriza um anticorpo que se liga a um receptor como um "anticorpo bloqueador de ligantes" ou um "anticorpo bloqueador de não ligantes".

[00787] Em algumas modalidades, um ensaio de ligação ao ligante caracteriza um anticorpo que se liga especificamente a um receptor e promove a formação de um complexo ligante:receptor. Em algumas modalidades, um ensaio de ligação ao ligante caracteriza um anticorpo que se liga especificamente a um receptor e estabiliza a formação de um complexo ligante: receptor. Em algumas modalidades, a indução e/ou estabilização da formação de um complexo ligante:receptor por um anticorpo contribui para o efeito agonístico do anticorpo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito agoniza o CD137, conforme determinado por um ensaio de ligação ao ligante.

[00788] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, liga-se ao CD137 e induz a ligação ao CD137L conforme determinado por um ensaio de ligação ao ligante (LBA).

[00789] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, se liga ao CD137 e induz a ligação ao CD137L conforme determinado por um ensaio de ligação ao ligante, em que o ensaio de ligação ao ligante compreende as seguintes etapas:

[00790] (i) combinação de um anticorpo anti-CD137 com CD137 e CD137L em várias concentrações, em que CD137 e CD137L formam um complexo CD137:CD137L e

[00791] (ii) detectar o complexo CD137:CD137L na presença do anticorpo anti-CD137 ao longo do tempo,

[00792] em que um aumento no complexo CD137:CD137L na presença do anticorpo anti-CD137 indica que o anticorpo anti-CD137 induz a ligação CD137L ao CD137. O aumento do complexo CD137:CD137L na presença do anticorpo anti-CD137 pode ser pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou pelo menos vezes maior que a quantidade de complexo CD137:CD137L na ausência do anticorpo anti-CD137.

[00793] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, aqui descrito, liga-se a uma região de ligação não ligante de CD137, conforme determinado por um ensaio de ligação ao ligante, em que o ensaio de ligação ao ligante compreende as seguintes etapas:

[00794] (i) combinação de um anticorpo anti-CD137 com CD137 e CD137L em várias concentrações, em que CD137 e CD137L formam um complexo CD137:CD137L e

[00795] (ii) detectar o complexo CD137:CD137L na presença do anticorpo anti-CD137 ao longo do tempo,

[00796] em que nenhuma alteração no complexo CD137:CD137L na presença do anticorpo anti-CD137 indica que o anticorpo anti-CD137 se liga a uma região de CD137 que não liga o ligante. Em algumas modalidades, menos de uma alteração de 2% no complexo CD137:CD137L indica que o anticorpo anti-CD137 se liga a uma região de CD137 que não liga o ligante. Em algumas modalidades, menos de uma alteração de 5% no complexo CD137:CD137L indica que o anticorpo anti-CD137 se liga a uma região de CD137 que não liga o ligante. Em algumas modalidades, menos de uma alteração de 10% no complexo CD137:CD137L indica que o anticorpo anti- CD137 se liga a uma região de CD137 que não liga o ligante.

[00797] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito se liga a uma região de ligação não ligante de CD137, conforme determinado por interferometria de biocamada. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito se liga a uma região de CD137 que não se liga ao ligante, conforme determinado por ressonância plasmônica de superfície (SPRi). Em algumas modalidades, CD137 e CD137L são aplicados sequencialmente a um sensor pré-carregado com um anticorpo anti-CD137 (ou seja, o anticorpo é capturado em um sensor). Em algumas modalidades, a ligação de um anticorpo anti-CD137 a uma região de ligação não ligante é indicada por um aumento na resposta após a exposição ao CD137L.

IV. Funções dos Anticorpos de Ligação a CD137

[00798] Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- CD137 aqui descritos se ligam ao CD137 humano com uma afinidade (Ko) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e inibem ou reduzem a exaustão de células T.

Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos se ligam ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e induzem ou melhoram a ativação das células T.

Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos se ligam ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e induzem ou aumentar a produção de citocinas pelas células imunes.

Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- CD137 aqui descritos se ligam ao CD137 humano com uma afinidade (Ko) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e induzem ou aumentam a proliferação de células T.

Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos se ligam ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e exibem eficácia antitumoral.

Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos se ligam ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e inibem ou reduzem a diferenciação e/ou ativação de macrófagos.

Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos se ligam ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e induzir ou melhorar a sinalização NFxB.

Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos se ligam ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e induzir ou melhorar a infiltração de células imunes em um microambiente de tumor. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos se ligam ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e não induzem hepatotoxicidade. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos se ligam ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e se ligam a um domínio de ligação não ligante no CD137 extracelular. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos se ligam ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e não inibe a interação CD137 e CD137L. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- CD137 aqui descritos se ligam ao CD137 humano com uma afinidade (Ko) de cerca de 30-100 nM (por exemplo, entre cerca de 30 nM e cerca de 100 nM) e se ligam a um epítopo compreendendo K114 da SEQ ID NO: 3.

[00799] Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a exaustão de células T e induzem ou aumentam a ativação de células T. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a exaustão de células T e induzem ou aumentam a produção de citocinas pelas células imunes. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a exaustão de células T e induzem ou aumentam a proliferação de células T. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a exaustão de células T e exibem eficácia antitumoral. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a exaustão de células T e inibem ou reduzem a diferenciação e/ou ativação de macrófagos. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a exaustão de células T e induzem ou aumentam NFxB sinalização. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a exaustão de células T e induzem ou aumentam a infiltração de células imunes em um microambiente de tumor. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a exaustão de células T e não induzem hepatotoxicidade. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a exaustão de células T e se ligam a um domínio de ligação não ligante no CD137 extracelular. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a exaustão de células T e não inibem a interação CD137 e CD137L. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a exaustão de células T e se ligam a um epítopo compreendendo K114 da SEQ ID NO: 3.

[00800] Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a ativação de células T e induzem ou aumentam a produção de citocinas pelas células imunes. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a ativação de células T e induzem ou aumentam a proliferação de células T. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a ativação de células T e exibem eficácia antitumoral. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a ativação de células T e inibem ou reduzem a diferenciação e/ou ativação de macrófagos. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a ativação de células T e induzem ou aumentam a sinalização NFxB. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a ativação de células T e induzem ou aumentam a infiltração de células imunes em um microambiente de tumor. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a ativação de células T e não induzem hepatotoxicidade. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a ativação de células T e se ligam a um domínio de ligação não ligante no CD137 extracelular. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a ativação de células Te não inibem a interação CD137 e CD137L. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a ativação de células T e se ligam a um epítopo compreendendo K114 da SEQ ID NO: 3.

[00801] Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a produção de citocinas pelas células imunes e induzem ou aumentam a proliferação de células T. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a produção de citocinas pelas células imunológicas e exibem eficácia antitumoral. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a produção de citocinas pelas células imunológicas e inibem ou reduzem a diferenciação e/ou ativação de macrófagos. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a produção de citocinas por células imunes e induzem ou aumentam a sinalização NFxB. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a produção de citocinas por células imunes e induzem ou aumentam a infiltração de células imunes em um microambiente tumoral. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a produção de citocinas pelas células imunes e não induzem hepatotoxicidade. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a produção de citocinas pelas células imunes e se ligam a um domínio de ligação não ligante no CD137 extracelular. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a produção de citocinas pelas células imunes e não inibem a interação CD137 e CD137L. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a produção de citocinas pelas células imunes e se ligam a um epítopo compreendendo K114 da SEQ ID NO: 3.

[00802] Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a proliferação de células T e exibem eficácia antitumoral. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a proliferação de células T e inibem ou reduzem a diferenciação e/ou ativação de macrófagos. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a proliferação de células T e induzem ou aumentam a sinalização NFxB. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a proliferação de células T e induzem ou aumentam a infiltração de células imunes em um microambiente de tumor. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a proliferação de células T e não induzem hepatotoxicidade. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a proliferação de células T e se ligam a um domínio de ligação não ligante no CD137 extracelular. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a proliferação de células T e não inibem a interação CD137 e CD137L. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a proliferação de células T e se ligam a um epítopo compreendendo K114 da SEQ ID NO: 3.

[00803] Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- CD137 aqui descritos exibem eficácia antitumoral e inibem ou reduzem a diferenciação e/ou ativação de macrófagos. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos exibem eficácia antitumoral e induzem ou aumentam a sinalização NFxB. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos exibem eficácia antitumoral e induzem ou aumentam a infiltração de células imunes em um microambiente tumoral. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos exibem eficácia antitumoral e não induzem hepatotoxicidade. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- CD137 aqui descritos exibem eficácia antitumoral e se ligam a um domínio de ligação não ligante no CD137 extracelular. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos exibem eficácia antitumoral e não inibem a interação CD137 e CD137L. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos exibem eficácia antitumoral e se ligam a um epítopo compreendendo K114 da SEQ ID NO: 3.

[00804] Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a diferenciação e/ou ativação de macrófagos e induzem ou aumentam a sinalização NFxfB. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a diferenciação e/ou ativação de macrófagos e induzem ou aumentam a infiltração de células imunes em um microambiente tumoral. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a diferenciação e/ou ativação de macrófagos e não induzem hepatotoxicidade. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a diferenciação e/ou ativação de macrófagos e se ligam a um domínio de ligação não ligante no CD137 extracelular. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a diferenciação e/ou ativação de macrófagos e não inibem a interação CD137 e CD137L. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos inibem ou reduzem a diferenciação e/ou ativação de macrófagos e se ligam a um epítopo compreendendo K114 da SEQ ID NO: 3.

[00805] Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a sinalização NFxB e induzem ou melhoram a infiltração de células imunes em um microambiente tumoral. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a sinalização NFxB e não induzem hepatotoxicidade. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a sinalização NFxB e ligação a um domínio de ligação não ligante no CD137 extracelular. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a sinalização NFxB e não inibem a interação CD137 e CD137L. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a sinalização NFxB e ligação a um epítopo compreendendo K114 da SEQ ID NO: 3.

[00806] Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a infiltração de células imunes em um microambiente tumoral e não induzem hepatotoxicidade. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a b infilttação de células imunes em um microambiente tumoral e se ligam a um domínio de ligação não ligante no CD137 extracelular. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a infiltração de células imunes em um microambiente tumoral e não inibem a interação CD137 e CD137L. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos induzem ou aumentam a infiltração de células imunes em um microambiente tumoral e se ligam a um epítopo compreendendo K114 da SEQ ID NO: 3.

[00807] Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- CD137 aqui descritos não induzem hepatotoxicidade e se ligam a um domínio de ligação não ligante no CD137 extracelular. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos não induzem hepatotoxicidade e não inibem a interação CD137 e CD137L. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos não induzem hepatotoxicidade e se ligam a um epítopo compreendendo K114 da SEQ ID NO: 3.

[00808] Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- CD137 aqui descritos se ligam a um domínio de ligação a não-ligante no CD137 extracelular e não inibem a interação CD137 e CD137L. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 aqui descritos se ligam a um domínio de ligação a não-ligante no CD137 extracelular e se ligam a um epítopo compreendendo K114 da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-CD137 descritos neste documento não inibem a interação com CD137 e CD137L e se ligam a um epítopo compreendendo K114 da SEQ ID NO: 3.

Mapeamento de Epítopos

[00809] A divulgação fornece anticorpos anti-CD137, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, que se ligam especificamente a um epítopo do CD137 humano e competem com um mAb de referência (por exemplo, mAb1) para ligação ao epítopo do CD137 humano. Os métodos para caracterizar, mapear ou elucidar o epítopo de um anticorpo anti- CD137 podem ser agrupados em métodos estruturais, funcionais ou computacionais. Um método estrutural particularmente adequado para determinar a arquitetura molecular precisa da interação entre um anticorpo e o antígeno correspondente ao qual ele se liga é a cristalografia de raios-x

(alternativamente, “co-cristalografia de raios-x”). Uma estrutura cristalina de um par anticorpo-antígeno ligado permite a determinação muito precisa de interações-chave entre aminoácidos individuais de ambas as cadeias laterais e átomos da cadeia principal, tanto no epítopo do antígeno quanto no paratopo do anticorpo. Os aminoácidos que estão dentro de 4 angstroms (À) um do outro são geralmente considerados em contato com resíduos. À metodologia normalmente envolve a purificação de anticorpos e antígenos, a formação e a purificação do complexo, seguidas de rodadas sucessivas de telas de cristalização e otimização para obter cristais com qualidade de difração. A solução estrutural é obtida após cristalografia de raios-X frequentemente em uma fonte de síncrotron. Outros métodos estruturais para o mapeamento de epítopos incluem, mas não estão limitados a, troca de hidrogênio-deutério acoplada à espectrometria de massa, espectrometria de massa acoplada por reticulação e ressonância magnética nuclear (RMN) (ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996); Abbott et al., (2014) Immunology 142(4):526-535).

[00810] Os métodos funcionais para o mapeamento de epítopos são bem conhecidos na técnica e tipicamente envolvem uma avaliação ou quantificação da ligação de anticorpos a proteínas inteiras, fragmentos de proteínas ou peptídeos. Os métodos funcionais para o mapeamento de epítopos podem ser utilizados, por exemplo, para identificar epítopos lineares ou conformacionais e/ou podem ser usados para inferir quando dois ou mais anticorpos distintos se ligam ao mesmo ou a epítopos semelhantes. Os métodos funcionais para o mapeamento de epítopos incluem, por exemplo, ensaios de imunotransferência e imunoprecipitação, em que peptídeos contíguos ou sobrepostos de CD137 são testados quanto à reatividade com um anticorpo anti-CD137, por exemplo, mAb1. Outros métodos funcionais para o mapeamento de epítopos incluem a varredura de oligopeptídeos baseada em matriz (também conhecida como "varredura de peptídeos sobrepostos" ou "análise pepscan"), mutagênese direcionada ao local (por exemplo, mutagênese por varredura de alanina) e mapeamento de mutagênese de alto rendimento (por exemplo, mapeamento de mutagênese por espingarda).

[00811] São conhecidos vários tipos de ensaios de ligação competitiva, por exemplo: radioimunoensaio direto ou indireto (RIA) em fase sólida, imunoensaio enzimático direto ou indireto (EIA) em fase sólida, ensaio de competição em sanduíche (ver Stahli et al, Methods in Enzymology 9:242 (1983)); EIA direta de biotina-avidina em fase sólida (ver Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); ensaio rotulado diretamente na fase sólida, ensaio sanduíche rotulado diretamente na fase sólida (ver Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); RIA de marcação direta de fase sólida usando marcador |-125 (ver Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); EIA direta de biotina-avidina em fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); e RIA com marcação direta. (Moldenhauer et al, Scand J. Immunol. 32:77 (1990)). Normalmente, esses ensaios envolvem o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície ou células sólidas e 1) uma proteína de ligação ao antígeno de teste não marcada e uma proteína de ligação ao antígeno de referência marcada ou 2) uma proteína de ligação ao antígeno de teste marcada e uma proteína de ligação ao antígeno proteína de referência de ligação ao antígeno. A inibição competitiva é medida através da determinação da quantidade de marcador ligado à superfície ou células sólidas na presença da proteína de ligação ao antígeno de teste. Normalmente, a proteína de ligação ao antígeno de teste está presente em excesso. As proteínas de ligação ao antígeno identificadas pelo ensaio de competição (proteínas de ligação ao antígeno concorrentes) incluem proteínas de ligação ao antígeno que se ligam ao mesmo epítopo que as proteínas de ligação ao antígeno de referência (por exemplo, mAb1) e proteínas de ligação ao antígeno que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente proximal a o epítopo ligado pela proteína de ligação ao antígeno de referência (por exemplo, mAb1) para ocorrência de impedimento estérico. Detalhes adicionais sobre métodos para determinar a ligação competitiva são fornecidos nos exemplos aqui. Geralmente, quando uma proteína de ligação a antígeno competidora está presente em excesso (por exemplo, cerca de 1, cerca de 5, 10, 20 ou 50 vezes ou excesso de 100 vezes), ela será inibida (por exemplo, reduzir ou bloquear) a ligação específica de uma proteína de ligação ao antígeno de referência a um antígeno comum em pelo menos cerca de 40-45%, cerca de 45-50%, cerca de 50-55%, cerca de 55-60%, cerca de 60-65%, cerca de 65-70%, cerca de 70-75% ou cerca de 75% ou mais. Em alguns casos, a ligação é inibida em pelo menos cerca de 80-85%, cerca de 85-90%, cerca de 90-95%, cerca de 95-97% ou cerca de 97% ou mais.

[00812] O método de mutagênese direcionada ao local envolve mutagênese direcionada ao local, onde aminoácidos críticos são identificados introduzindo sistematicamente substituições ao longo da sequência de proteínas e determinando os efeitos de cada substituição na ligação do anticorpo. Isto pode ser feito por "mutagênese de varredura de alanina" (Cunningham e Wells (1989) Science 244:1081-085), ou alguma outra forma de mutagênese pontual de resíduos de aminoácidos em CD137. Sem estar vinculado pela teoria, dois ou mais anticorpos (por exemplo, um anticorpo de teste e um anticorpo de referência, por exemplo, mAb1) têm o mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação do primeiro anticorpo reduzem ou eliminam ligação do segundo ou mais anticorpos.

[00813] O mapeamento da mutagênese por espingarda utiliza uma biblioteca abrangente de mutação de plasmídeo para o gene alvo, com cada clone na biblioteca portando uma mutação de aminoácido exclusiva e a biblioteca inteira cobrindo todos os aminoácidos na proteína alvo. Os clones que constitlem a biblioteca de mutações são dispostos individualmente em microplacas, expressos dentro de células de mamíferos vivos, e testados quanto à imunorreatividade com anticorpos de interesse. Os aminoácidos críticos para os epítopos de anticorpos são identificados por uma perda de reatividade e são então mapeados em uma estrutura de proteína para visualizar os epítopos. A expressão do antígeno da proteína alvo nas células dos mamíferos geralmente fornece a estrutura nativa do antígeno da proteína alvo, o que permite que as estruturas epitópicas lineares e conformacionais sejam mapeadas em proteínas complexas. (Paes et al., J. Am. Chem. Soc. 131 (20): 6952-6954 (2009); Banik e Doranz, Genetic Engineering and Biotechnology News 3(2): 25-28 (2010)).

[00814] O epítopo ligado por um anticorpo anti-CD137 também pode ser determinado usando métodos de varredura de peptídeos. Na varredura peptídica, as bibliotecas de sequências peptídicas curtas de segmentos sobrepostos da proteína alvo, CD137, são testadas quanto à sua capacidade de se ligar a anticorpos de interesse. Os peptídeos são sintetizados e passam por triagem quanto à ligação, por exemplo, utilizando ELISA ou BIACORE, ou em um chip, por qualquer um dos vários métodos para rastreamento em fase sólida (Reineke et al., Curr. Opin. Biotechnol. 12:59-64, 2001) como na metodologia "pepscan" (WO 84/03564; WO 93/09872).

[00815] Uma tecnologia recentemente desenvolvida denominada CLIPS (ligação química de peptídeos em andaimes) pode ser usada para mapear epítopos conformacionais. As extremidades soltas dos peptídeos são fixadas em estruturas sintéticas, de modo que o peptídeo em estrutura possa adotar a mesma estrutura espacial que a sequência correspondente na proteína intacta. A tecnologia CLIPS é usada para fixar peptídeos lineares em estruturas cíclicas (formato de 'loop único") e reunir diferentes partes de um local de ligação às proteínas (formato 'loop duplo', 'loop triplo' etc.), de modo a criar epítopos conformacionais que podem ser testados quanto à ligação de anticorpos. (Patente dos EUA nº 7.972.993).

[00816] Os epítopos ligados por anticorpos fornecidos pela divulgação também podem ser mapeados usando métodos computacionais. Nestes métodos, por exemplo, as bibliotecas de fragmentos peptídicos são exibidas na superfície do fago ou célula. Os epítopos são então mapeados por triagem de anticorpos contra esses fragmentos usando ensaios de ligação seletiva. Várias ferramentas computacionais foram desenvolvidas que permitem a previsão de epítopos conformacionais com base em peptídeos selecionados por afinidade linear, obtidos por meio de exibição de fagos (Mayrose et al., (2007) Bioinformatics 23:3244-3246). Também estão disponíveis métodos para a detecção de epítopos conformacionais por exibição em fagos. Sistemas de exibição microbiana também podem ser usados para expressar fragmentos antigênicos adequadamente dobrados na superfície celular para identificação de epítopos conformacionais (Cochran et al., J. Immunol. Meth. 287:147-158, 2004; Rockberg et al., Nature Methods 5:1039-1045, 2008).

[00817] Os métodos envolvendo proteólise e espectroscopia de massa também podem ser utilizados para determinar os epítopos de anticorpos (Baerga-Ortiz et al., Protein Sci. 2002 June; 1 1 (6): 1300-1308). Na proteólise limitada, o antígeno é clivado por diferentes proteases, na presença e na ausência do anticorpo, e os fragmentos são identificados por espectrometria de massa. O epítopo é a região do antígeno que fica protegida da proteólise após a ligação do anticorpo (Suckau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9848-9852, 1990). Métodos adicionais baseados em proteólise incluem, por exemplo, modificação química seletiva (Fiedler et al., Bioconjugate Chemistry 1998, 9(2):236-234, 1998), excisão de epítopos (Van de Water et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 1997, 85(3):229-235, 1997) e o método recentemente desenvolvido de troca de hidrogênio-deutério (H/D) (Flanagann N., Genetic Engineering and Biotechnology News 3(2): 25-28, 2010).

[00818] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos se ligam a um epítopo localizado dentro dos resíduos de aminoácidos 111-135 da SEQ ID NO: 3, conforme determinado por mutagênese e exibição em mamíferos. Em algumas modalidades, os anticorpos —anti-cCD137 aqui descritos se ligam a um epítopo compreendendo K114 da SEQ ID NO: 3, conforme determinado por mutagênese e exibição em mamíferos. Em algumas modalidades, os anticorpos —anti-cCD137 aqui descritos se ligam a um epítopo compreendendo E111, T113 e K114 da SEQ ID NO: 3, conforme determinado por mutagênese e exibição em mamíferos. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos se ligam a um epítopo compreendendo E111, T113, K114 e P135 da SEQ ID NO: 3, conforme determinado por mutagênese e exibição em mamíferos. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos se ligam a um epítopo compreendendo E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3, conforme determinado por mutagênese e exibição em mamíferos.

Métodos para a Produção de Anticorpos anti-CD137 e seus Fragmentos de Ligação a Antígenos

[00819] A divulgação também apresenta métodos para produzir qualquer um dos anticorpos anti-CD137 ou seus fragmentos de ligação ao antígeno aqui descritos. Em algumas modalidades, os métodos para a preparação de um anticorpo aqui descrito podem incluir a imunização de um indivíduo (por exemplo, um mamífero não humano) com um imunogênio apropriado. Os imunogênios adequados para gerar qualquer um dos anticorpos aqui descritos são apresentados aqui. Por exemplo, para gerar um anticorpo que se liga ao CD137, aquele versado na técnica pode imunizar um indivíduo adequado (por exemplo, um mamífero não humano, como um rato, um camundongo, um gerbil, um hamster, um cachorro, um gato, um porco, uma cabra, um cavalo ou um primata não humano) com um polipeptídeo CD137 completo, como um polipeptídeo CD137 humano completo, compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO. 3.

[00820] Um indivíduo adequado (por exemplo, um mamífero não humano) pode ser imunizado com o antígeno apropriado juntamente com imunizações de reforço subsequentes várias vezes suficientes para provocar a produção de um anticorpo pelo mamífero. O imunogênio pode ser administrado a um indivíduo (por exemplo, um mamífero não humano) com um adjuvante. Adjuvantes úteis na produção de um anticorpo em um indivíduo incluem, mas não estão limitados a, adjuvantes proteicos; adjuvantes — bacterianos, por exemplo, bactérias inteiras (BCG, Corynebacterium parvum ou Salmonella minnesota) e componentes bacterianos, incluindo esqueleto da parede celular, dimerolato de trealose, monofosforil lipídico A, resíduo extraível com metanol (MER) do tubérculo bacilo, adjuvante de Freund completo ou incompleto; adjuvantes virais; adjuvantes químicos, por exemplo, hidróxido de alumínio e iodoacetato e hemisuccinato de colesteril. Outros adjuvantes que podem ser utilizados nos métodos para induzir uma resposta imune incluem, por exemplo, proteínas da toxina do cólera e parapoxvírus. Ver também Bieg et al. (1999) Autoimmunity 31(1):15-24. Ver também, por exemplo, Lodmell et al. (2000) Vaccine 18:1059-1066; Johnson et al. (1999) J Med Chem 42:4640-4649; Baldridge et al. (1999) Methods 19:103-107; e Gupta et al. (1995) Vaccine 13(14): 1263-1276.

[00821] Em algumas modalidades, os métodos incluem a preparação de uma linhagem celular de hibridoma que secreta um anticorpo monoclonal que se liga ao imunogênio. Por exemplo, um mamífero adequado, como um camundongo de laboratório, é imunizado com um polipeptídeo CD137 como descrito acima. As células produtoras de anticorpos (por exemplo, células B do baço) do mamífero imunizado podem ser isoladas dois a quatro dias após pelo menos uma imunização de reforço do imunogênio e depois crescidas brevemente em cultura antes da fusão com células de uma linha celular de mieloma adequada. As células podem ser fundidas na presença de um promotor de fusão, como, por exemplo, vírus vaccinia ou polietilenoglicol. As células híbridas obtidas na fusão são clonadas e os clones celulares que secretam os anticorpos desejados são selecionados. Por exemplo, as células do baço de camundongos Balb/c imunizados com um imunogênio adequado podem ser fundidas com células da linha de células do mieloma PAI ou da linhagem de células do mieloma Sp2/0-Ag 14. Após a fusão, as células são expandidas em meio de cultura adequado, que é suplementado com um meio de seleção, por exemplo, meio HAT, em intervalos regulares, a fim de impedir que as células normais de mieloma cresçam demais nas células de hibridoma desejadas. As células de hibridoma obtidas são então pesquisadas quanto à secreção dos anticorpos desejados, por exemplo, um anticorpo que se liga ao CD137.

[00822] Em algumas modalidades, um especialista na técnica pode identificar um anticorpo anti-CD137 a partir de uma biblioteca com tendência não imune, como descrito, por exemplo, na patente dos EUA nº

6.300.064 (para Knappik et al.; Morphosys AG) e Schoonbroodt et al. (2005) Nucleic Acids Res 33(9):e81.

[00823] Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos podem envolver ou ser usados em conjunto com, por exemplo, tecnologias de exibição de fagos, exibição bacteriana, exibição de superfície de levedura, exibição viral eucariótica, exibição de células de mamíferos e anticorpo sem células (por exemplo, exibição ribossômica) técnicas de triagem (ver, por exemplo, Etz et al. (2001) J Bacteriol 183:6924-6935; Cornelis (2000) Curr Opin Biotechnol 11:450-454; Klemm et al. (2000) Microbiology 146:3025- 3032; Kieke et al. (1997) Protein Eng 10:1303-1310; Yeung et al. (2002) Biotechnol Prog 18:212-220; Boder et al. (2000) Methods Enzymology 328:430-444; Grabherr et al. (2001) Comb Chem High Throughput Screen 4:185-192; Michael et al. (1995) Gene Ther 2:660-668; Pereboev et al. (2001) J Virol 75:7107-7113; Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods 231:119-135; e Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol 18:1287-1292).

[00824] Os métodos para identificar anticorpos utilizando vários métodos de exibição de fagos são conhecidos na técnica. Nos métodos de apresentação de fagos, os domínios funcionais de anticorpos são apresentados na superfície das partículas de fagos que transportam as sequências polinucleotídicas que os codificam. Esse fago pode ser utilizado para exibir domínios de anticorpos de ligação ao antígeno, como Fab, Fv, ou fragmentos de anticorpo Fv estabilizados em ligação dissulfeto, expressos a partir de um repertório ou de uma biblioteca de anticorpos combinatória (por exemplo, humano ou murino). Os fagos utilizados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos, tais como fd e M13. Os domínios de ligação ao antígeno são expressos como uma proteína fundida de forma recombinante a qualquer uma das proteínas de revestimento do fago pill, pVIll ou plX. Ver, por exemplo, Shi et al. (2010) JMB 397:385-396. Exemplos de métodos de exibição de fagos que podem ser usados para produzir imunoglobulinas, ou seus fragmentos, aqui descritos incluem os divulgados em Brinkman et al. (1995) J Immunol Methods 182:41-50; Ames et al. (1995) J Immunol Methods 184:177-186; Kettleborough et al. (1994) Eur J Immunol 24:952-958; Persic et al. (1997) Gene 187:9-18; Burton et al. (1994) Advances in Immunology 57:191-280; e publicação PCT nºs WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982 e WO 95/20401. Métodos adequados também são descritos, por exemplo, nas patentes nºs 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717;

5.427.908; 5./50.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637;

5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108.

[00825] Em algumas modalidades, as bibliotecas de anticorpos de exibição de fagos podem ser geradas usando mRNA coletado de células B dos mamíferos imunizados. Por exemplo, uma amostra de células esplênicas compreendendo células B pode ser isolada de camundongos imunizados com polipeptídeo CD137 como descrito acima. O mMRNA pode ser isolado das células e convertido em cDNA usando técnicas padrão de biologia molecular. Ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2"º Edition,” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow and Lane (1988), supra; Benny K. C. Lo (2004), supra; e Borrebaek (1995), supra. O cDNA que codifica para as regiões variáveis dos polipeptídeos de cadeia pesada e cadeia leve de imunoglobulinas é usado para construir a biblioteca de exibição de fagos. Os métodos para gerar essa biblioteca são descritos em, por exemplo, Merz et al. (1995) J Neurosci Methods 62(1-2):213-9; Di Niro et al. (2005) Biochem J 388(Pt 3):889—894; and Engberg et al. (1995) Methods Mol Biol 51:355-376.

[00826] Em algumas modalidades, uma combinação de seleção e triagem pode ser empregada para identificar um anticorpo de interesse de, por exemplo, uma população de anticorpos derivados de hibridoma ou uma biblioteca de anticorpos de exibição de fagos. Métodos adequados são conhecidos na técnica e são descritos em, por exemplo, Hoogenboom (1997) Trends in Biotechnology 15:62-70; Brinkman et al. (1995), supra; Ames et al. (1995), supra; Kettleborough et al. (1994), supra; Persic et al. (1997), supra; e Burton et al. (1994), supra. Por exemplo, uma pluralidade de vetores fagomóides, cada um codificando uma proteína de fusão de uma proteína de revestimento de bacteriófago (por exemplo, pill, pVIll ou plX de fago M13) e uma região de combinação de antígeno diferente são produzidas usando técnicas padrão de biologia molecular e depois introduzidas em uma população de bactérias (por exemplo, E. coli). À expressão do bacteriófago em bactérias pode, em algumas modalidades, exigir o uso de um fago auxiliar. Em algumas modalidades, nenhum fago auxiliar é necessário (ver, por exemplo, Chasteen et al., (2006) Nucleic Acids Res 34(21):2145). Os fagos produzidos a partir das bactérias são recuperados e, em seguida, contatados com, por exemplo, um antígeno alvo ligado a um suporte sólido (imobilizado). O fago também pode ser contatado com o antígeno em solução, e o complexo é subsequentemente ligado a um suporte sólido.

[00827] Uma subpopulação de anticorpos rastreados usando os métodos acima pode ser caracterizada por sua especificidade e afinidade de ligação a um antígeno específico (por exemplo, CD137 humano) usando qualquer método baseado em imunológico ou bioquímico conhecido na técnica. Por exemplo, a ligação específica de um anticorpo a CD137, pode ser determinada, por exemplo, usando métodos imunológicos ou bioquímicos, tais como, mas não limitados a, um ensaio ELISA, ensaios SPR, ensaio de imunoprecipitação, cromatografia de afinidade e diálise de equilíbrio, como descrito acima. Os imunoensaios que podem ser usados para analisar a ligação imunoespecífica e a reatividade cruzada dos anticorpos incluem, entre outros, sistemas de ensaios competitivos e não competitivos usando técnicas como Western blots, RIA, ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima), imunoensaios de “sanduíche”, ensaios de imunoprecipitação, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes e imunoensaios de proteína A. Tais ensaios são rotineiros e bem conhecidos na técnica.

[00828] Entende-se que os métodos acima também podem ser usados para determinar se, por exemplo, um anticorpo anti-CD137 não se liga a CD137 humano de comprimento total e/ou proteínas CD137.

[00829] Nas modalidades em que as sequências de aminoácidos CDR selecionadas são sequências curtas (por exemplo, menos de 10 a 15 aminoácidos de comprimento), os ácidos nucleicos que codificam as CDRs podem ser quimicamente sintetizados como descrito em, por exemplo, Shiraishi et al. (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51(1):129-130 e Patente dos EUA nº 6.995.259. Para uma dada sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo aceitador, a região da sequência de ácido nucleico que codifica as CDRs pode ser substituída pelos ácidos nucleicos sintetizados quimicamente usando técnicas padrão de biologia molecular. As extremidades 5' e 3' dos ácidos nucleicos sintetizados quimicamente podem ser sintetizadas para compreender locais enzimáticos de restrição de extremidade pegajosa para uso na clonagem dos ácidos nucleicos no ácido nucleico que codifica a região variável do anticorpo doador. Alternativamente, fragmentos de ácidos nucleicos sintetizados quimicamente, capazes de codificar um anticorpo, podem ser unidos usando técnicas de montagem de DNA conhecidas na técnica (por exemplo, Gibson Assembly).

[00830] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos compreendem uma região constante da cadeia pesada alterada que tem função efetora reduzida (ou nenhuma) em relação à sua região constante inalterada correspondente. As funções efetoras que envolvem a região constante do anticorpo anti-CD137 podem ser moduladas alterando as propriedades da região constante ou Fc. As funções efetoras alteradas incluem, por exemplo, uma modulação em uma ou mais das seguintes atividades: citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento (CDC), apoptose, ligação a um ou mais receptores Fc e respostas pro-inflamatórias. A modulação refere-se a um aumento, diminuição ou eliminação de uma atividade da função efetiva exibida por um anticorpo em questão contendo uma região constante alterada em comparação com a atividade da forma inalterada da região constante. Em modalidades particulares, a modulação inclui situações nas quais uma atividade é abolida ou completamente ausente.

[00831] Uma região constante alterada com afinidade de ligação ao FcR alterada e/ou atividade ADCC e/ou atividade CDC alterada é um polipeptídeo que possui uma atividade de ligação FCcR aumentada ou diminuída e/ou atividade ADCC e/ou atividade CDCC em comparação com a forma inalterada do região constante. Uma região constante alterada que exibe ligação aumentada a um FcR liga pelo menos um FcR com maior afinidade do que o polipeptídeo inalterado. Uma região constante alterada que exibe ligação reduzida a um FcR liga pelo menos um FcR com afinidade menor do que a forma inalterada da região constante. Tais variantes que exibem ligação reduzida a um FCR podem possuir pouca ou nenhuma ligação apreciável a um FCcR, por exemplo, O a 50% (por exemplo, menos de 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41 , 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16 , 15,14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1%) da ligação ao FcR em comparação com o nível de ligação de uma sequência nativa constante de imunoglobulina ou região Fc ao FcR. Da mesma forma, uma região constante alterada que exibe atividade ADCC e/ou CDC modulada pode exibir atividade ADCC e/ou CDC aumentada ou reduzida em comparação com a região constante inalterada. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD137 compreendendo uma região constante alterada pode exibir aproximadamente O a 50% (por exemplo, menos de 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40 , 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10,9,8,7,

6, 5, 4, 3, 2 ou 1%) da atividade ADCC e/ou CDC da forma inalterada da região constante. Um anticorpo anti-CD137 aqui descrito compreendendo uma região constante alterada exibindo ADCC e/ou CDC reduzido pode exibir atividade de ADCC e/ou CDC reduzida ou inexistente.

[00832] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 aqui descrito exibe uma função efetiva reduzida ou inexistente. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 compreende uma região constante híbrida, ou uma porção dela, como uma região constante híbrida G2/G4 (ver, por exemplo, Burton et al. (1992) Adv Immun 51:1-18; Canfield et al. (1991) J Exp Med 173:1483-1491; e Mueller et al. (1997) Mol Immunol 34(6): 441-452). Ver acima.

[00833] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 pode conter uma região constante alterada exibindo citotoxicidade dependente de complemento aumentada ou reduzida (CDC). A atividade CDC modulada pode ser alcançada através da introdução de uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos em uma região Fc do anticorpo. Ver, por exemplo, patente dos EUA nº 6.194.551. Alternativa ou adicionalmente, os resíduos de cisteína podem ser introduzidos na região Fc, permitindo assim a formação de ligações dissulfeto inter-cadeia nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capacidade de internalização melhorada ou reduzida e/ou aumento ou diminuição da morte celular mediada por complemento. Ver, por exemplo, Caron et al. (1992) J Exp Med 176:1191-1195 e Shopes (1992) Immunol 148:2918-2922; publicação PCT nºs WO 99/51642 e WO 94/29351; Duncan e Winter (1988) Nature 322:738-40; e Patente dos EUA nºs 5.648.260 e 5.624.821.

Expressão e Purificação de Anticorpos Recombinantes

[00834] Os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno aqui descritos podem ser produzidos usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica da biologia molecular e química de proteínas. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica um ou ambos os polipeptídeos da cadeia pesada e leve de um anticorpo pode ser inserido em um vetor de expressão que contém sequências reguladoras da transcrição e da tradução, as quais incluem, por exemplo, sequências promotoras, locais de ligação ao ribossomo, início da transcrição e sequências de parada, sequências de início e parada de tradução, sinais de terminador de transcrição, sinais de poliadenilação e sequências de intensificador ou ativador. As sequências reguladoras incluem um promotor e sequências de início e parada da transcrição. Além disso, o vetor de expressão pode incluir mais de um sistema de replicação, de modo que possa ser mantido em dois organismos diferentes, por exemplo, em células de mamíferos ou insetos para expressão e em um hospedeiro procariótico para clonagem e amplificação.

[00835] Vários sistemas vetoriais possíveis estão disponíveis para a expressão de polipeptídeos de cadeia pesada e cadeia leve clonados a partir de ácidos nucleicos em células de mamíferos. Uma classe de vetores depende da integração das sequências gênicas desejadas no genoma da célula hospedeira. As células que possuem DNA estavelmente integrado podem ser selecionadas através da introdução simultânea de genes de resistência a medicamentos, como gpt E. coli (Mulligan e Berg (1981) Proc Natl Acad Sci EUA 78:2072) ou neo Tn5 (Southern e Berg (1982) Mol Appl Genet 1:327). O gene marcador selecionável pode ser ligado às sequências de genes de DNA a serem expressas ou introduzido na mesma célula por co-transfecção (Wigler et al. (1979) Cell 16: 77). Uma segunda classe de vetores utiliza elementos de DNA que conferem capacidades de replicação autônoma a um plasmídeo extracromossômico. Esses vetores podem ser derivados de vírus animais, como o papilomavírus bovino (Sarver et al. (1982) Proc Natl Acad Sci EUA, 79:7147), citomegalovírus, polioma vírus

(Deans et al. (1984) Proc Natl Acad Sci EUA 81:1292) ou vírus SV40 (Lusky e Botchan (1981) Natureza 293:79).

[00836] Os vetores de expressão podem ser introduzidos nas células de uma maneira adequada para a expressão subsequente do ácido nucleico. O método de introdução é amplamente ditado pelo tipo de célula alvo, discutido abaixo. Métodos exemplares incluem precipitação de CaPO., fusão de lipossomas, lipossomas catiônicos, eletroporação, infecção viral, transfecção mediada por dextrano, transfecção mediada por polibeno, fusão de protoplastos e microinjeção direta.

[00837] As células hospedeiras apropriadas para a expressão de anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno incluem células de levedura, bactérias, insetos, plantas e mamíferos. De particular interesse são bactérias como fungos E. coli como Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris, células de inseto como SF9, linhas celulares de mamífero (por exemplo, linhas celulares humanas), bem como linhas celulares primárias.

[00838] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser expresso e purificado de animais transgênicos (por exemplo, mamíferos transgênicos). Por exemplo, um anticorpo pode ser produzido em mamiíferos transgênicos não humanos (por exemplo, roedores) e isolado do leite como descrito em, por exemplo, Houdebine (2002) Curr Opin Biotechnol 13(6):625-629; van Kuik-Romeijn et al. (2000) Transgenic Res 9(2):155-159; e Pollock et al. (1999) J Immunol Methods 231(1-2):147-157.

[00839] Os anticorpos e seus fragmentos podem ser produzidos a partir das células cultivando uma célula hospedeira transformada com o vetor de expressão contendo ácido nucleico que codifica os anticorpos ou fragmentos, sob condições e por um período de tempo suficiente para permitir a expressão das proteínas. Tais condições para a expressão da proteína variarão com a escolha do vetor de expressão e da célula hospedeira e serão facilmente verificadas por aquele versado na técnica através de experimentação de rotina. Por exemplo, anticorpos expressos em E. coli podem ser redobrados a partir de organismos de inclusão (ver, por exemplo, Hou et al. (1998) Cytokine 10:319-30). Os sistemas e métodos de expressão bacteriana para seu uso são bem conhecidos na técnica (ver Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, and Molecular Cloning - A Laboratory Manual - 3º Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York (2001)). A escolha de códons, vetores de expressão adequados e células hospedeiras adequadas variará dependendo de vários fatores e pode ser facilmente otimizada conforme necessário. Um anticorpo (ou fragmento do mesmo) aqui descrito pode ser expresso em células de mamíferos ou em outros sistemas de expressão, incluindo mas não limitado a levedura, baculovírus e sistemas de expressão in vitro (ver, por exemplo, Kaszubska et al. (2000) Protein Expression and Purification 18:213-220).

[00840] Após a expressão, os anticorpos e seus fragmentos podem ser isolados. Um anticorpo ou seu fragmento pode ser isolado ou purificado de várias maneiras conhecidas pelos versados na técnica, dependendo de quais outros componentes estão presentes na amostra. Os métodos padrão de purificação incluem técnicas eletroforéticas, moleculares, imunológicas e cromatográficas, incluindo cromatografia de troca iônica, hidrofóbica, de afinidade e HPLC de fase reversa. Por exemplo, um anticorpo pode ser purificado usando uma coluna anti-anticorpo padrão (por exemplo, uma coluna de proteína A ou proteína G). Técnicas de ultrafiltração e diafiltração, em conjunto com a concentração de proteínas, também são úteis. Ver, por exemplo, Scopes (1994) “Protein Purification, 3º edition,” Springer-Verlag, New York City, New York. O grau de purificação necessário variará dependendo do uso desejado. Em alguns casos, não será necessária a purificação do anticorpo expresso ou seus fragmentos.

[00841] Os métodos para determinar o rendimento ou pureza de um anticorpo purificado ou fragmento do mesmo são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ensaio de Bradford, espectroscopia UV, ensaio de proteína Biuret, ensaio de proteína Lowry, ensaio de proteína amido preto, cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), espectrometria de massa (MS) e métodos eletroforéticos em gel (por exemplo, usando uma coloração de proteína como Coomassie Blue ou coloração de prata coloidal).

Modificação dos Anticorpos ou Fragmentos de Ligação a Antígenos dos Mesmos

[00842] Os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno podem ser modificados após sua expressão e purificação. As modificações podem ser modificações covalentes ou não covalentes. Tais modificações podem ser introduzidas nos anticorpos ou fragmentos, por exemplo, reagindo resíduos de aminoácidos direcionados do polipeptídeo com um agente de derivação orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou resíduos terminais. Os sítios adequados para modificação podem ser escolhidos usando qualquer um dentre uma variedade de critérios, incluindo, por exemplo, análise estrutural ou análise de sequência de aminoácidos dos anticorpos ou fragmentos.

[00843] Em algumas modalidades, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno podem ser conjugados com uma fração heteróloga. A fração heteróloga pode ser, por exemplo, um polipeptídeo heterólogo, um agente terapêutico (por exemplo, uma toxina ou um fármaco) ou uma marcação detectável como, mas não limitado a, uma marcação radioativa, uma marcação enzimática, uma marcação fluorescente, uma marcação de metal pesado, marcação luminescente ou marcação de afinidade, como biotina ou estreptavidina. Polipeptídeos heterólogos adequados incluem, por exemplo, um marcador antigênico (por exemplo, FLAG (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 98), polistidina (6-His; HHHHHH; SEQ ID NO: 99),

hemaglutinina (HA; YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 100), glutationa-S- transferase (GST) ou proteína de ligação à maltose (MBP)) para uso na purificação de anticorpos ou fragmentos. Os polipeptídeos heterólogos também incluem polipeptídeos (por exemplo, enzimas) que são úteis como marcadores de diagnóstico ou detectáveis, por exemplo, luciferase, uma proteína fluorescente (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP)) ou cloranfenicol acetil transferase (CAT). Marcadores radioativos adequados incluem, por exemplo, 32.P, 33P, 14C, 12SEU, 19!EU, Areia 3?H. Marcadores fluorescentes — adequados — incluem, sem limitação, fluorescência, isotiocianato de fluoresceína (FITC), proteína verde fluorescente (GFP), DyLight'Y 488, ficoceritrina (PE), iodeto de propídio (PI), PerCP, PE-Alexa Fluor& 700, Cy5, aloficocianina e Cy7. Marcadores luminescentes incluem, por exemplo, qualquer uma de uma variedade de quelatos de lantanídeos luminescentes (por exemplo, európio ou térbio). Por exemplo, os quelatos de európio adequados incluem o quelato de európio de ácido dietileno triamina pentaacético (DTPA) ou ácido tetraazaciclododecano-1,4,7,10- tetraacético (DOTA). Os marcadores enzimáticos incluem, por exemplo, fosfatase alcalina, CAT, luciferase e peroxidase de rábano silvestre.

[00844] Duas proteínas (por exemplo, um anticorpo e uma fração heteróloga) podem ser reticuladas usando qualquer um de vários reticuladores químicos conhecidos. Exemplos de tais reticuladores são aqueles que ligam dois resíduos de aminoácidos através de uma ligação que inclui uma ligação dissulfeto "impedida". Nestas ligações, uma ligação dissulfeto dentro da unidade de reticulação é protegida (por impedir grupos de ambos os lados da ligação dissulfeto) da redução pela ação, por exemplo, de glutationa reduzida ou da enzima dissulfeto redutase. Um reagente adequado, 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a(2-piridilditio) tolueno (SMPT) forma uma ligação entre duas proteínas utilizando uma lisina terminal em uma das proteínas e uma cisteína terminal na outra. Também podem ser utilizados reagentes heterobifuncionais que reticulam por uma porção de acoplamento diferente em cada proteína. Outros reticuladores úteis incluem, sem limitação, reagentes que ligam dois grupos amino (por exemplo, N-5-azido-2-nitrobenzoiloxissuccinimida), dois grupos sulfidril (por exemplo, 1,4-bis-maleimidobutano), um grupo amino e um grupo sulfidril (por exemplo, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida), um grupo amino e um grupo carboxil (por exemplo, 4-[p-azidosalicilamido]butilamina) e um grupo amino e um grupo guanidínio que está presente na cadeia lateral de arginina (por exemplo, p-azidofenil-glioxal monohidratado).

[00845] Em algumas modalidades, um marcador radioativo pode ser diretamente conjugado à estrutura de aminoácidos do anticorpo. Alternativamente, o marcador radioativo pode ser incluído como parte de uma molécula maior (por exemplo, 11 em meta-["*F!Iliodofenil-N- hidroxissuccinimida ([?!IJMIPNHS) que se liga a grupos amino livres para formar derivados meta-iodofenil (mIP) de proteínas relevantes (ver, por exemplo, Rogers et al. (1997) J Nucl Med 38.: 1221-1229) ou quelato (por exemplo, para DOTA ou DTPA) que por sua vez está ligado à estrutura da proteína. Os métodos para conjugar os marcadores radioativos ou moléculas/quelatos maiores que os contêm aos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno aqui descritos são conhecidos na técnica. Tais métodos envolvem incubar as proteínas com o marcador radioativo sob condições (por exemplo, pH, concentração de sal e/ou temperatura) que facilitam a ligação do marcador radioativo ou quelato à proteína (ver, por exemplo, Patente dos EUA 6.001.329).

[00846] Os métodos para conjugar um marcador fluorescente (às vezes chamado de "fluoróforo") a uma proteína (por exemplo, um anticorpo) são conhecidos na técnica da química de proteínas. Por exemplo, os fluoróforos podem ser conjugados com grupos amino livres (por exemplo, de lisinas) ou grupos sulfidril (por exemplo, cisteínas) de proteínas utilizando porções éster succinimidil (NHS) ou éster tetrafluorofenil (TFP) ligadas aos fluoróforos. Em algumas modalidades, os fluoróforos podem ser conjugados com uma fração de reticulador heterobifuncional, como sulfo- SMCC. Métodos de conjugação adequados envolvem a incubação de uma proteína de anticorpo, ou fragmento seu, com o fluoróforo sob condições que facilitam a ligação do fluoróforo à proteína. Ver, por exemplo, Welch e Redvanly (2003) “Handbook of Radiopharmaceuticals: Radiochemistry and Applications,” John Wiley and Sons (ISBN 0471495603).

[00847] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos podem ser modificados, por exemplo, com uma fração que melhora a estabilização e/ou retenção dos anticorpos em circulação, por exemplo, no sangue, soro ou outros tecidos. Por exemplo, o anticorpo ou fragmento pode ser PEGuilado como descrito em, por exemplo, Lee et al. (1999) Bioconjug Chem 10(6): 973-8; Kinstler et al. (2002) Advanced Drug Deliveries Reviews 54:477-485; e Roberts et al. (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476 ou HESilados (Fresenius Kabi, Germany; ver, por exemplo, Pavisié et al. (2010) /nt J Pharm 387(1-2):110-119). A fração de estabilização pode melhorar a estabilidade ou retenção do anticorpo (ou fragmento) em pelo menos 1,5 (por exemplo, pelo menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 ou 50 ou mais) vezes.

[00848] Em algumas modalidades, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno aqui descritos podem ser glicosilados. Em algumas modalidades, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito pode ser indivíduo a tratamento enzimático ou químico, ou produzido a partir de uma célula, de modo que o anticorpo ou fragmento tenha glicosilação reduzida ou ausente. Os métodos para a produção de anticorpos com glicosilação reduzida são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, na patente dos EUA nº 6.933.368; Wright et al. (1991) EMBO J 10(10):2717-2723; e Co et al. (1993) Mol Immunol 30:1361.

Composições e Formulações Farmacêuticas

[00849] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-CD137 com um diluente, veículo, —solubilizador, emulsificante, conservante e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.

[00850] Em certas modalidades, os materials de formulação aceitáveis são preferencialmente não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas. Em certas modalidades, os materiais de formulação são para administração sc e/ou IV. Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou preservar, por exemplo, pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou penetração de a composição. Em certas modalidades, os materiais de formulação adequados incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos (como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio); tampões (como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentes de volume (como manitol ou glicina); agentes quelantes (tais como ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA)); agentes complexantes (como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina); enchimentos; monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos (como glicose, manose ou dextrina); proteínas (como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas); agentes corantes, aromatizantes e diluentes; agentes emulsificantes; polímeros hidrofílicos (tais como polivinilpirrolidona); polipeptídeos de baixo peso molecular; contraíons formadores de sal (como sódio); conservantes (como cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (tais como glicerina, propileno glicol ou polietileno glicol); álcoois de açúcar (como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; surfactantes ou agentes molhantes (como plurônicos, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos como polissorbato 20, polissorbato 80, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes que melhoram a estabilidade (como sacarose ou sorbitol); agentes intensificadores de tonicidade (tais como halogenetos de metais alcalinos, preferencialmente cloreto de sódio ou potássio, manitol sorbitol); veículos de entrega; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1995). Em certas modalidades, a formulação compreende PBS; NaOAC 20 mM, pH 5,2, NaCl 50 MM; e/ou NAOAC 10 mM, pH 5,2, sacarose a 9%. Em certas modalidades, a composição farmacêutica ideal será determinada por aquele versado na técnica, dependendo, por exemplo, da via de administração pretendida, formato de entrega e dosagem desejada. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Em certas modalidades, essas composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo e/ou taxa de depuração in vivo do anticorpo anti-CD137.

[00851] Em certas modalidades, o veículo ou carreador primário em uma composição farmacêutica pode ser de natureza aquosa ou não aquosa. Por exemplo, em certas modalidades, um veículo ou carreador adequado pode ser água para injeção, solução salina fisiológica ou líquido cefalorraquidiano artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parentérica. Em certas modalidades, a solução salina compreende solução salina tamponada com fosfato isotônico. Em certas modalidades, solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina sérica são outros veículos exemplares. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem tampão Tris de cerca de pH 7,0-8,5 ou tampão de acetato de cerca de pH 4,0-5,5, que pode incluir ainda sorbitol ou um substituto adequado. Em certas modalidades, uma composição compreendendo um anticorpo anti-CD137 pode ser preparada para armazenamento misturando a composição selecionada com o grau de pureza desejado com agentes de formulação opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) na forma de um bolo liofiizado ou uma solução aquosa . Além disso, em certas modalidades, uma composição compreendendo um anticorpo anti-CD137 pode ser formulada como um liofilizado usando excipientes apropriados, como sacarose.

[00852] Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode ser selecionada para entrega parenteral. Em certas modalidades, as composições podem ser selecionadas para inalação ou entrega através do trato digestivo, como oralmente. A preparação de tais composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro da capacidade de um versado na técnica.

[00853] Em certas modalidades, os componentes da formulação estão presentes em concentrações aceitáveis para o local da administração. Em certas modalidades, os tampões são usados para manter a composição em pH fisiológico ou em um pH ligeiramente mais baixo, tipicamente dentro de uma faixa de pH de cerca de 5 a cerca de 8.

[00854] Em certas modalidades, quando a administração parenteral é contemplada, uma composição terapêutica pode estar na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável, livre de pirogênio, compreendendo um anticorpo ant-CD137, em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, um veículo para injeção parenteral é água destilada estéril, na qual um anticorpo anti-CD137 é formulado como uma solução isotônica estéril e adequadamente preservado. Em certas modalidades, a preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, como microesferas injetáveis, partículas biodegradáveis, compostos poliméricos (como ácido polilático ou ácido poliglicólico), esferas ou lipossomas, que podem fornecer o controle ou liberação sustentada do produto que pode ser entregue por injeção de depósito. Em certas modalidades, o ácido hialurônico também pode ser usado e pode ter o efeito de promover uma duração sustentada na circulação. Em certas modalidades, os dispositivos implantáveis de administração de drogas podem ser utilizados para introduzir a molécula desejada.

[00855] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica pode ser formulada para inalação. Em certas modalidades, um anticorpo anti- CD137 pode ser formulado como um pó seco para inalação. Em certas modalidades, uma solução de inalação compreendendo um anticorpo anti- CD137 pode ser formulada com um propulsor para entrega de aerossol. Em certas modalidades, as soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar é ainda descrita no pedido PCT nº PCT/US94/001875, que descreve a entrega pulmonar de proteínas quimicamente modificadas.

[00856] Em certas modalidades, é contemplado que as formulações possam ser administradas por via oral. Em certas modalidades, um anticorpo anti-CD137 que é administrado dessa maneira pode ser formulado com ou sem os carreadores usados habitualmente na composição de formas de dosagem sólidas, como comprimidos e cápsulas. Em certas modalidades, uma cápsula pode ser projetada para liberar a porção ativa da formulação no ponto do trato gastrointestinal quando a biodisponibilidade é maximizada e a degradação pré-sistêmica é minimizada. Em certas modalidades, pelo menos um agente adicional pode ser incluído para facilitar a absorção de um anticorpo anti-CD137. Em certas modalidades, diluentes, aromas, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de comprimidos e aglutinantes também podem ser empregados.

[00857] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica pode envolver uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD137 em uma mistura com excipientes não tóxicos que são adequados para a fabricação de comprimidos. Em certas modalidades, dissolvendo os comprimidos em água estéril, ou outro veículo apropriado, as soluções podem ser preparadas na forma de dose unitária. Em certas modalidades, excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, diluentes inertes, como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, tais como amido, gelatina ou acácia; ou agentes lubrificantes como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.

[00858] Composições farmacêuticas adicionais serão evidentes para os versados na técnica, incluindo formulações envolvendo um anticorpo anti-CD137 em formulações de entrega sustentada ou controlada. Em certas modalidades, técnicas para formular uma variedade de outros meios de entrega sustentada ou controlada, como carreadores de lipossomas, micropartículas biodegradáveis ou esferas porosas e injeções de depósito, também são conhecidas pelos versados na técnica. Ver, por exemplo, o Pedido PCT nº PCT/US93/00829, que descreve a liberação controlada de micropartículas poliméricas porosas para a entrega de composições farmacêuticas. Em certas modalidades, as preparações de liberação sustentada podem incluir matrizes poliméricas semi-permeáveis na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. As matrizes de liberação sustentada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilácidos (Patente dos EUA nº 3.773.919 e EP 058.481), copolímeros de ácido L- glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983 )), poli (2-hidroxietilmetacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) e Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), acetato de etileno e vinil (Langer et al., supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (EP

133.988). Em certas modalidades, as composições de liberação sustentada também podem incluir lipossomos, que podem ser preparados por qualquer um dos vários métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Eppstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); EP 036.676; EP

088.046 e EP 143.949.

[00859] A composição farmacêutica a ser usada para admnistração in vivo é tipicamente estéril. Em certas modalidades, isso pode ser conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis. Em certas modalidades, onde a composição é liofilizada, a esterilização usando este método pode ser realizada antes ou após a liofilização e reconstituição. Em certas modalidades, a composição para administração parentérica pode ser armazenada na forma liofilizada ou em uma solução. Em certas modalidades, as composições parentéricas geralmente são colocadas em um recipiente com uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasco de solução intravenosa com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.

[00860] Em certas modalidades, uma vez que a composição farmacêutica tenha sido formulada, ela pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou como um pó desidratado ou liofilizado. Em certas modalidades, essas formulações podem ser armazenadas em uma forma pronta para uso ou em uma forma (por exemplo, liofilizada) que é reconstituída antes da administração.

[00861] Em certas modalidades, são fornecidos kits para a produção de uma unidade de administração de dose única. Em certas modalidades, o kit pode conter um primeiro recipiente com uma proteína seca e um segundo recipiente com uma formulação aquosa. Em certas modalidades, são incluídos kits contendo seringas pré-cheias de uma e múltiplas câmaras (por exemplo, seringas líquidas e lioseringas).

[00862] Em certas modalidades, a quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-CD137 a ser empregado terapeuticamente dependerá, por exemplo, do contexto e objetivos terapêuticos. Aquele versado na técnica apreciará que os níveis de dosagem apropriados para o tratamento, de acordo com certas modalidades, variarão, portanto, dependendo, em parte, da molécula entregue, a indicação para a qual um anticorpo anti-CD137 está sendo usado, a via de administração e o tamanho (peso corporal, superfície corporal ou tamanho do órgão) e/ou condição (idade e estado geral de saúde) do paciente. Em certas modalidades, o clínico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico ideal.

[00863] Em certas modalidades, a frequência da dosagem levará em conta os parâmetros farmacocinéticos de um anticorpo anti-CD137 na formulação utilizada. Em certas modalidades, um clínico administrará a composição até que seja alcançada uma dosagem que atinja o efeito desejado. Em certas modalidades, a composição pode, portanto, ser administrada como uma dose única ou como duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo do tempo, ou como uma infusão contínua via dispositivo ou cateter de implantação. Um refinamento adicional da dosagem apropriada é feito rotineiramente por aqueles versados na técnica e está no âmbito das tarefas rotineiramente executadas por eles. Em certas modalidades, as dosagens apropriadas podem ser determinadas através do uso de dados de dose-resposta apropriados.

[00864] Em certas modalidades, a via de administração da composição farmacêutica está de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, por via oral, por injeção por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intra-parenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular,

subcutânea, intraocular, intra-arterial, intraportal, rotas intralesionais; por sistemas de liberação sustentada ou por dispositivos de implantação. Em certas modalidades, as composições podem ser administradas por injeção em bolus ou continuamente por infusão ou por dispositivo de implantação. Em certas modalidades, elementos individuais da terapia de combinação podem ser administrados por diferentes vias.

[00865] Em certas modalidades, a composição pode ser administrada localmente via implantação de uma membrana, esponja ou outro material apropriado no qual a molécula desejada tenha sido absorvida ou encapsulada. Em certas modalidades, onde um dispositivo de implantação é usado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado, e a entrega da molécula desejada pode ser via difusão, bolus de liberação programada ou administração contínua. Em certas modalidades, pode ser desejável usar uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-CD137 em uma maneira ex vivo. Em tais casos, células, tecidos e/ou órgãos que foram removidos do paciente são expostos a uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-CD137, após o qual as células, tecidos e/ou órgãos são subsequentemente implantados de volta ao paciente.

[00866] Em certas modalidades, um anticorpo anti-CD137 pode ser entregue implantando certas células que foram geneticamente modificadas, usando métodos como os aqui descritos, para expressar e secretar os polipeptídeos. Em certas modalidades, essas células podem ser células animais ou humanas e podem ser autólogas, heterólogas ou xenogênicas. Em certas modalidades, as células podem ser imortalizadas. Em certas modalidades, a fim de diminuir a chance de uma resposta imunológica, as células podem ser encapsuladas para evitar a infiltração dos tecidos circundantes. Em certas modalidades, os materiais de encapsulamento são tipicamente invólucros ou membranas poliméricas semi-permeáveis biocompatíveis que permitem a liberação do(s) produto(s) de proteínas, mas impedem a destruição das células pelo sistema imunológico do paciente ou por outros fatores prejudiciais dos tecidos circundantes.

Aplicações

[00867] As composições aqui descritas podem ser usadas em aplicações de diagnóstico e terapêuticas. Por exemplo, moléculas de ligação a antígeno marcadas de forma detectável podem ser usadas em ensaios para detectar a presença ou quantidade dos antígenos alvo em uma amostra (por exemplo, uma amostra biológica). As composições podem ser usadas em ensaios in vitro para estudar a inibição da função do antígeno alvo (por exemplo, sinalização ou resposta celular mediada por CD137). Em algumas modalidades, por exemplo, nas quais as composições se ligam e ativam um antígeno alvo (por exemplo, uma proteína ou polipeptídeo), as composições podem ser usadas como controles positivos em ensaios projetados para identificar novos compostos adicionais que também induzem a atividade da proteína alvo ou polipeptídeo e/ou são de outro modo úteis para o tratamento de um distúrbio associado à proteína ou polipeptídeo alvo. Por exemplo, uma composição ativadora de CD137 pode ser usada como controle positivo em um ensaio para identificar compostos adicionais (por exemplo, pequenas moléculas, aptâmeros ou anticorpos) que induzem, aumentam ou estimulam a função CD137. As composições também podem ser usadas em métodos terapêuticos, conforme elaborado abaixo.

Kits

[00868] Em algumas modalidades, a divulgação fornece um kit compreendendo um anticorpo anti-CD137 aqui descrito. Em algumas modalidades, um kit inclui um anticorpo anti-CD137, conforme divulgado neste documento, e instruções de uso. Os kits podem compreender, em um recipiente adequado, um anticorpo anti-CD137, um ou mais controles e vários tampões, reagentes, enzimas e outros ingredientes padrão bem conhecidos na técnica.

[00869] O recipiente pode incluir pelo menos um frasco, poço, tubo de ensaio, balão, frasco, seringa ou outro meio de recipiente, no qual um anticorpo anti-cCD137 pode ser colocado e, em alguns casos, adequadamente aliquotado. Onde um componente adicional é fornecido, o kit pode conter recipientes adicionais nos quais esse componente pode ser colocado. Os kits também podem incluir um meio para conter um anticorpo anti-CD137 e quaisquer outros recipientes de reagentes em confinamento próximo para venda comercial. Tais recipientes podem incluir recipientes de plástico injetado ou moldado por sopro, nos quais os frascos desejados são retidos. Recipientes e/ou kits podem incluir etiquetas com instruções de uso e/ou avisos.

[00870] Em algumas modalidades, um kit compreende um contendo compreendendo um anticorpo antrcCD137 e um carreador farmaceuticamente — aceitável, ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-CD137 e instruções para tratar ou retardar a progressão do câncer ou reduzir ou inibir o crescimento de tumores em um indivíduo em necessidade disso. Em algumas modalidades, um kit compreende um contendo compreendendo um anticorpo anti-CD137 e um carreador farmaceuticamente aceitável, ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-CD137 e instruções para administrar o anticorpo anti-CD137 a um indivíduo com necessidade, sozinho ou em combinação com outro agente, para tratar ou retardar a progressão do câncer ou reduzir ou inibir o crescimento do tumor no indivíduo.

Métodos de Uso

[00871] As composições da presente invenção têm numerosas utilidades in vitro e in vivo que envolvem a detecção e/ou quantificação de CD137 e/ou o agonismo da função CD137.

[00872] As composições descritas acima são úteis, inter alia, métodos para tratar ou prevenir uma variedade de cânceres em um indivíduo. As composições podem ser administradas a um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano, usando uma variedade de métodos que dependem, em parte, da via de administração. A via pode ser, por exemplo, injeção intravenosa ou infusão (IV), injeção subcutânea (SC), injeção intraperitoneal (IP), injeção intramuscular (IM) ou injeção intratecal (IT). À injeção pode ser em bolus ou em infusão contínua.

[00873] A administração pode ser conseguida por, por exemplo, infusão local, injeção ou por meio de um implante. O implante pode ser de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, como membranas sialásticas ou fibras. O implante pode ser configurado para liberação sustentada ou periódica da composição para o indivíduo. Ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente dos EUA nº 20080241223; Patentes dos EUA nº 5.501.856; 4.863.457; e 3.710.795; EP488401; e EP 430539, cujas divulgações são incorporadas aqui por referência na sua totalidade. A composição pode ser entregue ao indivíduo por meio de um dispositivo implantável baseado em, por exemplo, sistemas difusivos, erodíveis ou convectivos, por exemplo, bombas osmóticas, implantes biodegradáveis, sistemas de eletrodifusão, sistemas de eletro osmose, bombas de pressão de vapor, bombas eletrolíticas, bombas efervescentes, bombas piezoelétricas, sistemas baseados em erosão ou sistemas eletromecânicos.

[00874] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 ou um fragmento de ligação ao antígeno é administrado terapeuticamente a um indivíduo por meio de administração local.

[00875] Uma dose adequada de um anticorpo ou fragmento deste descrito aqui, cuja dose é capaz de tratar ou prevenir o câncer em um indivíduo, pode depender de uma variedade de fatores, incluindo, por exemplo, a idade, sexo e peso de um indivíduo a ser tratado e o composto inibidor particular utilizado. Por exemplo, uma dose diferente de um anticorpo anti-CD137 completo pode ser necessária para tratar um indivíduo com câncer em comparação com a dose de um fragmento de anticorpo Fab' de ligação a CD137 necessário para tratar o mesmo indivíduo. Outros fatores que afetam a dose administrada ao indivíduo incluem, por exemplo, o tipo ou gravidade do câncer. Por exemplo, um indivíduo com melanoma metastático pode exigir a administração de uma dosagem diferente de um anticorpo anti-CD137 do que um indivíduo com glioblastoma. Outros fatores podem incluir, por exemplo, outros distúrbios médicos que afetam o sujeito de forma simultânea ou prévia, a saúde geral do indivíduo, a disposição genética do indivíduo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de medicamentos e qualquer outra terapêutica adicional que são administrados ao indivíduo. Também deve ser entendido que uma dosagem e regime de tratamento específicos para qualquer indivíduo em particular também dependerão do julgamento do médico assistente (por exemplo, médico ou enfermeiro). Dosagens adequadas são aqui descritas. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos são eficazes em doses altas e baixas.

[00876] Uma composição farmacêutica pode incluir uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD137 ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito. Tais quantidades eficazes podem ser prontamente determinadas por um versado na técnica, com base, em parte, no efeito do anticorpo administrado ou no efeito combinatório do anticorpo e um ou mais agentes ativos adicionais, se mais de um agente for usado . Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento descrito aqui também pode variar de acordo com fatores como estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo (e um ou mais agentes ativos adicionais) de provocar uma resposta desejada no indivíduo, por exemplo, redução no crescimento do tumor. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD137 pode inibir (diminuir a gravidade ou eliminar a ocorrência de) e/ou prevenir um distúrbio específico e/ou qualquer um dos sintomas do distúrbio específico conhecido na técnica ou aqui descrito. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da composição são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

[00877] Doses humanas adequadas de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos descritos aqui podem ser ainda avaliadas em, por exemplo, estudos de escalonamento da dose da Fase |. Ver, por exemplo, van Gurp et al. (2008) Am J Transplantation 8(8):1711-1718; Hanouska et al. (2007) Clin Cancer Res 13(2, part 1):523-531; e Hetherington et al. (2006) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(10): 3499-3500.

[00878] Em algumas modalidades, a composição contém qualquer um dos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno aqui descritos e um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10 ou 11 ou mais) adicionais agentes terapêuticos de modo que a composição como um todo seja terapeuticamente eficaz. Por exemplo, uma composição pode conter um anticorpo anti-CD137 aqui descrito e um agente alquilante, em que o anticorpo e o agente estão cada um em uma concentração que, quando combinados, são terapeuticamente eficazes no tratamento ou prevenção de um câncer (por exemplo, melanoma) em um indivíduo.

[00879] A toxicidade e eficácia terapêutica de tais composições podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos conhecidos em culturas de células ou animais experimentais (por exemplo, modelos animais de qualquer um dos cânceres aqui descritos). Esses procedimentos podem ser utilizados, por exemplo, para determinar o LDso (a dose letal para 50% da população) e o DEso (a dose terapeuticamente eficaz em 50%

da população). A razão da dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o Índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LDso/EDso. É preferido um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que exibe um alto índice terapêutico. Embora composições que exibam efeitos colaterais tóxicos possam ser usadas, deve-se tomar cuidado para projetar um sistema de entrega que direcione esses compostos para o local do tecido afetado e para minimizar possíveis danos às células normais e, assim, reduzir os efeitos colaterais.

[00880] Os dados obtidos nos ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser utilizados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem de tais anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno está geralmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes dos anticorpos ou fragmentos que incluem o ED5so com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e a via de administração utilizada. Para um anticorpo anti-CD137 aqui descrito, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração plasmática circulante que inclua a CEso (isto é, a concentração do anticorpo que atinge uma inibição até a metade dos sintomas), conforme determinado na cultura de células. Essa informação pode ser usada para determinar com mais precisão doses úteis em humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência. Em algumas modalidades, por exemplo, onde a administração local (por exemplo, no olho ou em uma articulação) é desejada, a cultura celular ou a modelagem animal podem ser usadas para determinar uma dose necessária para alcançar uma concentração terapeuticamente eficaz no local.

[00881] Em algumas modalidades, os métodos podem ser realizados em conjunto com outras terapias para o câncer. Por exemplo, a composição pode ser administrada a um indivíduo ao mesmo tempo, antes ou depois da radiação, cirurgia, quimioterapia direcionada ou citotóxica, quimiorradioterapia, terapia hormonal, imunoterapia, terapia gênica, terapia de transplante celular, medicina de precisão, edição de genoma terapia ou outra farmacoterapia.

[00882] Conforme descrito acima, as composições aqui descritas (por exemplo, composições anti-CD137) podem ser usadas para tratar uma variedade de cânceres, tais como, sem limitação: Sarcoma de Kaposi, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, mieloblastos promielocócitos eritroleucemia mielomonocítica monociítica, leucemia crônica, leucemia mielocítica (granulocítica) crônica, leucemia mielocítica (granulocítica) crônica, leucemia linfocítica crônica, linfoma de células do manto, linfoma de células do manto, linfoma do sistema nervoso central linfoma, policitemia vera Linfoma, doença de Hodgkin, doença não- Hodgkin, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença em cadeia pesada, tumores sólidos, sarcomas e carcinomas, fibrosarcoma, mMixossarcoma, lipossarcoma, crondrosarcoma, osteossarcoma, osteogênico, osteogênico endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, sarcoma do cólon, carcinoma colorretal, câncer no pâncreas, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células escamosas, carcinoma de glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar,i, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do ducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilm, câncer cervical, câncer uterino, testículo,

pulmão testicular, pulmão carcinoma pulmonar de células, carcinoma pulmonar de células não pequenas, carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial, — glioma, —astrocitoma, — meduloblastoma, —craniofaringioma, ependimoma, — pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, “menangiomatoma, melanoma, nasma carcinoma basocelular, câncer de vias biliares, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer de cérebro e sistema nervoso central (CNS), câncer cervical, coriocarcinoma, câncer colorretal, câncer de tecido conjuntivo, câncer do sistema digestivo, câncer endometrial, câncer de esôfago, câncer de olho , câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, neoplasia intra-epitelial, rim c úlcera, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão (células pequenas, células grandes) melanoma, neuroblastoma; câncer de cavidade oral (por exemplo lábio, língua, boca e faringe), câncer de ovário, câncer de pâncreas, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer retal; câncer do sistema respiratório, sarcoma, câncer de pele, câncer de estômago, câncer de testículo, câncer de tireoide, câncer uterino e câncer do sistema urinário.

[00883] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito neste documento pode ser administrado a um indivíduo como uma monoterapia. Alternativamente, como descrito acima, o anticorpo ou seu fragmento pode ser administrado a um indivíduo como uma terapia combinada com outro tratamento, por exemplo, outro tratamento para um câncer. Por exemplo, a terapia combinada pode incluir a administração ao indivíduo (por exemplo, um paciente humano) de um ou mais agentes adicionais que fornecem um benefício terapêutico a um indivíduo que tem ou corre risco de desenvolver câncer. Os agentes quimioterapêuticos adequados para a administração concomitante com as composições da presente invenção incluem, por exemplo: taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina,

mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorubicina, dihidroxiantranoxidanoxidanoxidantransidroxantanonaxididroxiantranoxidani droxiantra, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos. Outros agentes incluem, por exemplo, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6- tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tioTEPA, clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), lomustina ciclofosfamida, bussulfano, dibromomaniitol, estreptozotocina, mitomicina C, cis-diclordiamina platina (11) (DDP), procarbazina, altretamina, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, nedaplatina, satraplatina ou ex-tretorrinotinotropina), antracíclina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e anthramycin (AMC)) e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina) e temozolomida. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 e um ou mais agentes ativos adicionais são administrados ao mesmo tempo. Em outras modalidades, o anticorpo anti-CD137 é administrado primeiro no tempo e os um ou mais agentes ativos adicionais são administrados segundo no tempo. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes ativos adicionais são administrados primeiro no tempo e o anticorpo anti-CD137 é administrado segundo no tempo.

[00884] Um anticorpo anti-CD137 ou um seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito pode substituir ou aumentar uma terapia administrada anteriormente ou atualmente. Por exemplo, ao tratar com um anticorpo anti-CD137 ou seu fragmento de ligação ao antígeno, a administração de um ou mais agentes ativos adicionais pode cessar ou diminuir, por exemplo, ser administrada em níveis ou dosagens mais baixos. Em algumas modalidades, a administração da terapia anterior pode ser mantida. Em algumas modalidades, uma terapia anterior será mantida até que o nível do anticorpo anti-CD137 atinja um nível suficiente para fornecer um efeito terapêutico. As duas terapias podem ser administradas em combinação.

[00885] Monitorar um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) para uma melhora em um câncer, como aqui definido, significa avaliar o indivíduo para uma mudança em um parâmetro de doença, por exemplo, uma redução no crescimento do tumor. Em algumas modalidades, a avaliação é realizada pelo menos uma (1) hora, por exemplo, pelo menos 2, 4, 6, 8, 12, 24 ou 48 horas, ou pelo menos 1 dia, 2 dias, 4 dias, 10 dias, 13 dias, 20 dias ou mais, ou pelo menos 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 10 semanas, 13 semanas, 20 semanas ou mais, após uma administração. O indivíduo pode ser avaliado em um ou mais dos seguintes períodos: antes do início do tratamento; durante o tratamento; ou após a administração de um ou mais elementos do tratamento. A avaliação pode incluir a avaliação da necessidade de tratamento adicional, por exemplo, a avaliação de uma dose, frequência de administração ou duração do tratamento. Também pode incluir avaliar a necessidade de adicionar ou descartar uma modalidade terapêutica selecionada, por exemplo, adicionar ou descartar qualquer um dos tratamentos para um câncer aqui descrito.

[00886] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 ou um fragmento de ligação a antígeno aqui descrito é administrado para modular uma resposta de células T em um paciente, por exemplo, aumentando a ativação e/ou proliferação de células T. A reticulação de CD137 aumenta fortemente a proliferação de células T, a produção e secreção de IFNy e a atividade citolítica das células T. Por conseguinte, em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-CD137, ou um fragmento de ligação a antígeno, da presente divulgação é administrado a uma patente que precisa para induzir ou aumentar a ativação de células T, melhorar a proliferação de células T, induzir a produção e/ou secreção de IFNy e/ou induzir uma resposta de células T citolíticas.

[00887] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137 ou um fragmento de ligação a antígeno aqui descrito é útil para modular ou alterar a população de células T em um paciente de uma população de células T Tr2/Treg para uma população de células T TH1/TH17, para assim melhorar ou aprimorar uma resposta antitumoral no paciente. Estudos demonstraram que, enquanto CD137 é expresso em ambos os subconjuntos de células T, células T Th1i e Th2, o CD137 é expresso em níveis mais altos nas células T CD8+ do que nas células T CD4+. Consequentemente, o CD137 co- estimula principalmente células T CD8+. Por conseguinte, um anticorpo anti-CD137, ou um fragmento de ligação ao antígeno, como descrito aqui, é administrado a um paciente para melhorar uma resposta antitumoral, por exemplo, modulando ou alterando a resposta da célula T e/ou a população de célula T no paciente de uma resposta de células T TH2/Treg e/ou população de células T para uma resposta de células TH1/TH17 e/ou população de células T no paciente.

[00888] Em alguns tipos de câncer (por exemplo, melanoma e câncer de ovário), os linfócitos infiltrantes de tumores (TILs) naturais podem ser enriquecidos por métodos otimizados de cultura de células e fornecer uma fonte de linfócitos reativos a tumores úteis para imunoterapia adotiva. À terapia TIL adotiva pode resultar em regressão tumoral durável para alguns tipos de câncer, o que garante o desenvolvimento e a otimização de abordagens baseadas em TIL para o câncer. Atualmente, a identificação e expansão de Tlls reativos a tumores naturais permanece desafiadora devido ao baixo nível e/ou raridade de células T CD8+ específicas do antígeno. A expressão de CD137 por células T é dependente da ativação, o que fornece uma oportunidade para capturar células T ativadas que expressam CD137 da circulação ou de amostras de tumor. Por conseguinte, um anticorpo anti-CD137, ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, como aqui descrito, pode ser empregado para o enriquecimento seletivo de células T ativadas, específicas do antígeno.

[00889] Em algumas modalidades, a eficácia dos anticorpos anti- CD137 aqui descritos depende de um sistema imunológico competente. Especificamente, em algumas modalidades, a depleção de células T CD4+, células T CD8+ e/ou células exterminadoras naturais reduz a eficácia dos anticorpos anti-CD137. Em algumas modalidades, a depleção de células T CD4+, células T CD8+ e/ou células exterminadoras naturais reduz a inibição ou redução do crescimento do tumor pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos. Em algumas modalidades, a depleção de células T CD4+, células T CD8+ e/ou células exterminadoras naturais reduz a inibição ou redução do crescimento do tumor pelos anticorpos anti-CD137 aqui descritos. Em algumas modalidades, a eficácia dos anticorpos anti-CD137 aqui descritos depende de uma infiltração de células imunes em um microambiente tumoral. Em algumas modalidades, a infiltração de células imunes em um microambiente de tumor é acoplada com uma falta de infiltração no baço e/ou fígado.

[00890] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos induzem uma resposta imune protetora da memória antitumoral. As células T da memória são um subconjunto de células T específicas do antígeno que persistem a longo prazo após terem encontrado e respondido ao antígeno cognato. Tais células expandem-se rapidamente para um grande número de células efetoras após a exposição ao antígeno cognato. Por conseguinte, em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos estimulam a produção de células T de memória para um antígeno de câncer. Em algumas modalidades, um indivíduo que recebeu um anticorpo anti-CD137 descrito neste documento para tratar ou curar um câncer, desenvolve células T de memória específicas ao câncer. Em algumas modalidades, um indivíduo que recebeu um anticorpo anti-CD137 aqui descrito para tratar ou curar um câncer, desenvolve uma resposta imune à memória antitumoral após reexposição ao câncer. Em algumas modalidades, a resposta imune à memória antitumoral compreende estimular células T de memória para se tornarem células efetoras. Em algumas modalidades, um indivíduo que recebeu um anticorpo anti-CD137 aqui descrito para tratar ou curar um câncer, desenvolve uma resposta imune da memória antitumoral a um antígeno do câncer.

[00891] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aqui descritos induzem uma reprogramação imunológica com um microambiente tumoral. Especificamente, em algumas modalidades, os anticorpos anti- CD137 induzem a infiltração imune; reduzir, inibir ou impedir a proliferação de Treg; reduzir, inibir ou impedir a proliferação de macrófagos associados a tumores; e proteger ou reverter a exaustão de células T.

[00892] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 induzem a infiltração de células imunes em um parente do microambiente tumoral. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 aumentam a infiltração de células imunes em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, em pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 105%, pelo menos 110%, pelo menos 115%, pelo menos 120%, pelo menos 125%, pelo menos 130%, pelo menos 135%, em 140%, pelo menos 145% ou pelo menos 150%. Em algumas modalidades, a infiltração de células imunes é determinada medindo o nível de expressão de CD45 em células isoladas de um microambiente de tumor. Os métodos para medir a expressão de proteínas são conhecidos dos versados na técnica e aqui descritos.

[00893] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 impedem ou inibem um aumento nas células Treg em um microambiente de tumor. Em algumas modalidades, a prevenção ou inibição é relativa à quantidade de células Treg em um microambiente de tumor na ausência de um anticorpo anti-CD137. Em algumas modalidades, a prevenção ou inibição de um aumento nas células Treg é relativa a um anticorpo de referência. Em algumas modalidades, as células Treg são detectadas pela expressão de CD25 e FOX-3P em células T CD4+ isoladas de um microambiente tumoral. Os métodos para medir a expressão de proteínas são conhecidos dos versados na técnica e aqui descritos.

[00894] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 impedem ou inibem um aumento nos macrófagos associados ao tumor em um microambiente tumoral. Em algumas modalidades, a prevenção ou inibição é relativa à quantidade de macrófagos associados ao tumor em um microambiente tumoral na ausência de um anticorpo anti-CD137. Em algumas modalidades, a prevenção ou inibição de um aumento nos macrófagos associados ao tumor é relativa a um anticorpo de referência. Em algumas modalidades, os macrófagos associados ao tumor são detectados pela expressão de CD11b e F4/80 em células imunes CD45+ isoladas de um microambiente tumoral. Os métodos para medir a expressão de proteínas são conhecidos dos versados na técnica e aqui descritos.

[00895] EM algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 protegem as células T da exaustão de células T em um microambiente tumoral. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD137 invertem a exaustão de células T em um microambiente de tumor. Em algumas modalidades, a exaustão de células T em um microambiente tumoral é reduzida na presença de um anticorpo anti-CD137 aqui descrito, em relação a um microambiente tumoral na ausência do anticorpo anti-CD137. Em algumas modalidades, a exaustão de células T é determinada pela análise de células T CD8+ ou células T CD4+ para expressão de receptores co-inibidores (por exemplo, PD-1, TIGIT ou LAG-3). Em algumas modalidades, a exaustão de células T é detectada pela expressão de PD-1 e TIGIT em células T CD4+ ou CD8+ isoladas de um microambiente tumoral.

[00896] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD137, ou um fragmento de ligação a antígeno, aqui descrito, pode ser empregado em métodos de detecção e/ou quantificação de CD137 humano em uma amostra biológica. Por conseguinte, um anticorpo anti-CD137, ou um fragmento de ligação ao antígeno, como aqui descrito, é usado para diagnosticar, prognosticar e/ou determinar a progressão da doença (por exemplo, câncer) em um paciente.

OUTRAS MODALIDADES

[00897] E1. Anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente a CD137 humano ou sua porção de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeias pesada e leve selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[00898] (a) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00899] (b) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 70, 79 e 90, respectivamente;

[00900] (c) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 71, 80 e 91, respectivamente;

[00901] (d) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 72, 81 e 92, respectivamente;

[00902] (e) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 73, 82 e 91, respectivamente;

[00903] (f) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 74, 83 e 93, respectivamente;

[00904] (g) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 75, 84 e 91, respectivamente;

[00905] (h) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 74, 85 e 94, respectivamente;

[00906] (i) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 76, 86 e 95, respectivamente;

[00907] (])) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 77, 87 e 93, respectivamente;

[00908] (k) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 88 e 90, respectivamente;

[00909] (1) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49, 57 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00910] (m) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49, 58 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00911] (n) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49, 59 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00912] (0) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49, 60 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00913] (po) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 50, 61 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00914] (a) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 50, 58 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00915] (r) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 51, 62 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00916] (s) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 52, 63 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00917] (t) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 50, 64 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00918] (u) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 50, 65 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00919] (v) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 51, 108 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

[00920] (w) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 107, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente; e

[00921] (x) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 109, 110 e 92, respectivamente.

[00922] E2. Anticorpo — monoclional isolado que se liga especificamente a CD137 humano, ou sua porção de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis da cadeia pesada e leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,26, 101 e 103; e em que a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 6, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 105.

[00923] E3. Anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente a CD137 humano, ou sua porção de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve, em que o CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68.

[00924] E4. Anticorpo — monoclional isolado que se liga especificamente ao CD137 humano, ou sua porção de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve incluindo sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[00925] (a) SEQ ID NO: 4 e 6, respectivamente;

[00926] (b) SEQ ID NO: 4 e 28, respectivamente;

[00927] (c) SEQ ID NO: 4 e 30, respectivamente;

[00928] (d) SEQ ID NO: 4 e 32, respectivamente;

[00929] (e) SEQ ID NO: 4 e 34, respectivamente;

[00930] (f) SEQ ID NO: 4 e 36, respectivamente;

[00931] (9) SEQ ID NO: 4 e 38, respectivamente;

[00932] (h) SEQ ID NO: 4 e 40, respectivamente;

[00933] (i) SEQ ID NO: 4 e 42, respectivamente;

[00934] ()) SEQ ID NO: 4 e 44, respectivamente;

[00935] (k) SEQ ID NO: 4 e 46, respectivamente;

[00936] (1) SEQ ID NO: 8 e 6, respectivamente;

[00937] (m) SEQ ID NO: 10 e 6, respectivamente;

[00938] (n) SEQ ID NO: 12 e 6, respectivamente;

[00939] (0) SEQ ID NO: 14 e 6, respectivamente;

[00940] (p) SEQ ID NO: 16 e 6, respectivamente;

[00941] (a) SEQ ID NO: 18 e 6, respectivamente;

[00942] (r) SEQ ID NO: 20 e 6, respectivamente;

[00943] (s) SEQ ID NO: 22 e 6, respectivamente;

[00944] (t) SEQ ID NO: 24 e 6, respectivamente;

[00945] (u) SEQ ID NO: 26 e 6, respectivamente;

[00946] (v) SEQ ID NO: 101 e 6, respectivamente;

[00947] (w) SEQ ID NO: 103 e 6, respectivamente; e

[00948] (x) SEQ ID NO: 4 e 105, respectivamente.

[00949] E5. Anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente a CD137 humano ou sua porção de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis da cadeia pesada e leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 101 e 103; e em que a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 6, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 105.

[00950] E6. Anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente a CD137 humano, ou sua porção de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste do:

[00951] (a) SEQ ID NO: 4 e 6, respectivamente;

[00952] (b) SEQ ID NO: 4 e 28, respectivamente;

[00953] (c) SEQ ID NO: 4 e 30, respectivamente;

[00954] (d) SEQ ID NO: 4 e 32, respectivamente;

[00955] (e) SEQ ID NO: 4 e 34, respectivamente;

[00956] (f) SEQ ID NO: 4 e 36, respectivamente;

[00957] (9) SEQ ID NO: 4 e 38, respectivamente;

[00958] (h) SEQ ID NO: 4 e 40, respectivamente;

[00959] (1) SEQ ID NO: 4 e 42, respectivamente;

[00960] ()) SEQ ID NO: 4 e 44, respectivamente;

[00961] (k) SEQ ID NO: 4 e 46, respectivamente;

[00962] (1) SEQ ID NO: 8 e 6, respectivamente;

[00963] (m) SEQ ID NO: 10 e 6, respectivamente;

[00964] (n) SEQ ID NO: 12 e 6, respectivamente;

[00965] (0) SEQ ID NO: 14 e 6, respectivamente;

[00966] (p) SEQ ID NO: 16 e 6, respectivamente;

[00967] (a) SEQ ID NO: 18 e 6, respectivamente;

[00968] (r) SEQ ID NO: 20 e 6, respectivamente;

[00969] (s) SEQ ID NO: 22 e 6, respectivamente;

[00970] (t) SEQ ID NO: 24 e 6, respectivamente;

[00971] (u) SEQ ID NO: 26 e 6, respectivamente;

[00972] (v) SEQ ID NO: 101 e 6, respectivamente;

[00973] (w) SEQ ID NO: 103 e 6, respectivamente; e

[00974] (x) SEQ ID NO: 4 e 105, respectivamente.

[00975] E7. Anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente a CD137 humano, ou sua porção de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve, em que o CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68.

[00976] E8. Anticorpo — monoclional isolado que se liga especificamente a CD137 humano, ou sua porção de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeias pesada e leve, em que o CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX, em que X é qualquer aminoácido.

[00977] E9. Anticorpo — monoclional isolado que se liga especificamente a CD137 humano, ou sua porção de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve, em que o CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos DKXPFXLDXXYYYYYX, em que X é qualquer aminoácido.

[00978] E10. Anticorpo —monoclional isolado que se liga especificamente a CD137 humano ou sua porção de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeias pesada e leve, em que o CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX, em que X é qualquer aminoácido, exceto para alanina.

[00979] E11. Anticorpo —monoclional isolado que se liga especificamente a CD137 humano ou sua porção de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende

CDRs de cadeia pesada e leve, em que o CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos DKXPFXLDXXYYYYYX, em que X é qualquer aminoácido, exceto para alanina.

[00980] E12. Anticorpo —monoclional isolado que se liga especificamente a CD137 humano, ou sua porção de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve, em que o CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos DKXXXXLXXXXYXYYX, em que X é qualquer aminoácido, e em que a mutação dos resíduos D95, L100, Y100E, Y100G, Y100H, ou combinações dos mesmos, resulta na perda de ligação ao CD137 humano.

[00981] E13. Anticorpo —monoclional isolado que se liga especificamente a CD137 humano, ou sua porção de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeias pesada e leve, em que o CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos DKXPFXLDXXYYYYYX, em que X é qualquer aminoácido e em que a mutação dos resíduos P97, F98, D100A, Y100D, Y100F ou combinações dos mesmos à alanina resulta na redução da ligação ao CD137 humano.

[00982] E14. Anticorpo —monoclional isolado que se liga especificamente a CD137 humano, ou sua porção de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeias pesada e leve, em que o CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos DXPFXLDXXYYYYYX, em que X é qualquer aminoácido e em que a mutação dos resíduos P97, F98, D100A, Y100D, Y100F ou combinações dos mesmos para qualquer resíduo, exceto a alanina, resulta em um aumento na ligação ao CD137 humano.

[00983] E15. Anticorpo —monoclional isolado que se liga especificamente a CD137 humano, ou sua porção de ligação ao antígeno,

em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeias pesada e leve, em que o CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos DX X2X3XaLXsXeX7Xg8Y XaY YX10, em que X; é qualquer aminoácido, em que X>, é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xs é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que X; é um aminoácido polar, em que Xs é um aminoácido polar e em que X1o é qualquer aminoácido.

[00984] E16. O anticorpo monoclonal isolado da modalidade 15, em que X, é prolina, em que X; é fenilalanina ou triptofano, em que Xs é ácido aspártico ou ácido glutâmico, em que X; é tirosina e em que X; é tirosina.

[00985] E17. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades 8 a 16, caracterizado pelo fato de que a sua porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compete com o mAb1.

[00986] E18. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades 8 a 16, caracterizado pelo fato de que a sua porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compete com mAb1, mAb8 ou mAb10.

[00987] E19. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 8-18, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende pelo menos as propriedades funcionais do mAb1.

[00988] E20. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 8-18, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende pelo menos as propriedades funcionais de MAb1, mAb8 ou mAb10.

[00989] E21. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades 8-20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno tem um Kp valor pelo menos equivalente ao mAb1.

[00990] E22. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades 8-20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno tem um Kp valor pelo menos equivalente a mAb1, mAb8 ou mMAb10.

[00991] E23. Anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que, quando ligado ao CD137 humano, o anticorpo monoclonal isolado, ou sua parte de ligação ao antígeno, se liga a pelo menos um dos resíduos de aminoácidos ligados pelo MAb1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mMAb1.

[00992] E24. Anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, em que, quando ligado ao CD137 humano, o anticorpo monoclonal isolado ou sua parte de ligação ao antígeno: (i) se liga a pelo menos um dos resíduos de aminoácidos ligado ao mAb1, ou a um fragmento de ligação ao antígeno do mAb1, e (ii) agoniza o CD137 humano.

[00993] pE25. O anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, de qualquer uma das modalidades 23-24, em que os resíduos de aminoácidos compreendendo o epítopo ligado pelo anticorpo estão localizados dentro de 4 angstroms dos resíduos de aminoácidos compreendendo o paratopo do anticorpo mAb1.

[00994] E26. O anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, de qualquer uma das modalidades 23-25, em que uma mutação do epítopo ligado ao anticorpo inibe, reduz ou bloqueia a ligação ao anticorpo e ao anticorpo mAb1.

[00995] E27. Anticorpo —monoclional isolado que se liga especificamente ao CD137 humano, ou sua porção de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 40-100 nM.

[00996] E28. Anticorpo —monoclional isolado que se liga especificamente a CD137 humano ou sua porção de ligação ao antígeno, em que

[00997] (1) a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 40-100 nM; e

[00998] (ii) a porção de ligação do anticorpo ou antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX, em que X é qualquer aminoácido.

[00999] E29. Anticorpo —monoclional isolado que se liga especificamente a CD137 humano ou sua porção de ligação ao antígeno, em que

[001000] (i) a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 40-100 nM; e

[001001] (ii) a porção de ligação de anticorpo ou antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DX X2X3XaLXsXeX7XgY XaYYX1w, em que X: é qualquer aminoácido, em que X, é um aminoácido não polar, em que X; é um aminoácido não polar, em que X, é qualquer aminoácido, em que Xs é um aminoácido polar, em que Xs; é qualquer aminoácido, em que X; é qualquer aminoácido, em que X; é um aminoácido polar, em que Xs é um aminoácido polar e em que X10o é qualquer aminoácido.

[001002] E30. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno da modalidade 27, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos DKPFXLDXXYYYYYX, em que X é qualquer aminoácido.

[001003] E31. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 28-30, em que a mutação dos resíduos D95, L100, Y100E, Y100G, Y100H, ou combinações dos mesmos, da CDR3 de cadeia pesada, resulta na perda de ligação ao CD137 humano.

[001004] E32. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 28-31, em que a mutação dos resíduos P97, F98, D100A, Y100D, Y100F ou combinações dos mesmos à alanina resulta na redução da ligação ao CD137 humano.

[001005] E33. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 28-31, em que a mutação dos resíduos P97, F98, D100A, Y100D, Y100F ou combinações dos mesmos a qualquer resíduo, exceto a alanina, resulta em um aumento na ligação ao CD137 humano.

[001006] E34. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de qualquer uma das modalidades 28 e 29-33, em que X é qualquer aminoácido, exceto a alanina.

[001007] E35. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de qualquer uma das modalidades 29 e 31-33, em que X2 é prolina, em que X; é fenilalanina ou triptofano, em que Xs é ácido aspártico ou ácido glutâmico em que X; é tirosina e em que X, é tirosina

[001008] E36. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 45-95 nM, 50-90 nM, 55-85 nM, 60-80 nM, 65-75 nM, 55-75 NM, 40-70 nM, 50-80 nM ou 60-90 nM.

[001009] E37. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 27-36, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeias pesada e leve, em que a CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68.

[001010] E38. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 27-37, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeias pesada e leve selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[001011] (a) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente; e

[001012] (b) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 51, 108 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente.

[001013] E39. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades 27-37, caracterizado pelo fato de que a sua porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeias pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4 e 101; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[001014] E40. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de qualquer uma das modalidades 27-37, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[001015] (a) SEQ ID NO: 4 e 6, respectivamente; e

[001016] (b) SEQ ID NO: 101 e 6, respectivamente.

[001017] E41. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 27-37, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4 e 101; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

[001018] E42. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades 27 a 37, caracterizado pelo fato de que a sua porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo constituído por:

[001019] (a) SEQ ID NO: 4 e 6, respectivamente; e

[001020] (b) SEQ ID NO: 101 e 6, respectivamente.

[001021] E43. O anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno se liga especificamente a e agoniza o CD137 humano.

[001022] E44. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno exibe pelo menos uma ou mais das seguintes propriedades:

[001023] (a) induz ou aumenta a dimerização de trímeros CD137;

[001024] (b) induz ou aumenta a multimerização de trímeros CD137;

[001025] (c) induz ou melhora a ativação de células T mediadas por CD137 humano;

[001026] (d) induz ou melhora uma resposta de células T citotóxicas mediada por CD137 humano;

[001027] (e) induz ou melhora a proliferação de células T mediada por CD137 humano;

[001028] (f) induz ou melhora a produção de citocinas mediada por CD137 humano;

[001029] (g) não induz nem melhora significativamente a ativação de células T intra-hepáticas e/ou intrasplênicas e/ou a proliferação de células T;

[001030] (h) liga-se ao CD137 humano com uma constante de dissociação de equilíbrio Ko de 1 x 10 ou menos; ou

[001031] (i) qualquer combinação de propriedades (a) - (h).

[001032] E45. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno da modalidade 44, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno induz ou aprimora a ativação de células T mediadas por CD137 humano no microambiente do tumor, mas não induz ou aprimora significativamente a ativação de células T mediadas por CD137 humano no baço e/ou fígado.

[001033] E46. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno da modalidade 44, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno induz ou aprimora a resposta das células T citotóxicas mediadas por CD137 humano no microambiente do tumor, mas não induz ou melhora significativamente a T citotóxica mediada por CD137 humano resposta celular no baço e/ou fígado.

[001034] E47. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno da modalidade 44, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno induz a proliferação de células T mediada por CD137 humano no microambiente do tumor, mas não induz significativamente a proliferação de células T mediada por CD137 humano no baço e/ou fígado.

[001035] E48. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno da modalidade 44, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno induz ou melhora a produção de citocinas mediada por CD137 humano no microambiente do tumor, mas não induz ou melhora significativamente a produção de citocina mediada por CD137 humano no baço e/ou fígado.

[001036] E49. O anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades 44-48, caracterizado pelo fato de que as propriedades do anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno não são dependentes da ligação ao receptor Fc.

[001037] E50. O anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades 44-49, caracterizado pelo fato de que as propriedades do anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno são aprimoradas pela ligação ao receptor Fc.

[001038] E51. O anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno reage de forma cruzada com o CD137 cinomolgo e/ou CD137 de camundongo.

[001039] E52. Anticorpo monoclional isolado agonístico que se liga ao CD1I37 humano e exibe pelo menos uma das seguintes propriedades:

[001040] (a) induz ou melhora a dimerização de trímeros CD137 humanos;

[001041] (b) induz ou aprimora a multimerização de trímeros CD137 humanos;

[001042] (c) induz ou melhora a ativação de células T mediadas por CD137 humano no microambiente do tumor, mas não induz ou melhora significativamente a ativação de células T mediadas por CD137 humano no baço e/ou fígado;

[001043] (d) induz ou aprimora uma resposta de célula T citotóxica mediada por CD137 humano no microambiente do tumor, mas não induz ou melhora significativamente a resposta de célula T citotóxica mediada por CD137 humano no baço e/ou fígado;

[001044] (e) induz ou melhora a produção de citocina mediada por CD137 humano no microambiente do tumor, mas não induz ou melhora significativamente a produção de citocina mediada por CD137 humano no baço e/ou fígado;

[001045] (f) induz ou melhora a proliferação de células T mediada por CD137 humano no microambiente do tumor, mas não induz ou melhora significativamente a proliferação de células T mediada por CD137 humano no baço e/ou fígado;

[001046] (9) liga-se ao CD137 humano com uma constante de dissociação de equilíbrio Ko de 1 x 108 ou menos; ou

[001047] (h) qualquer combinação das propriedades (a)-(g).

[001048] E53. O anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em uma IgG1, uma IgG2 e IgG3, uma IgG4 e IgM, e IgA1 e IgA2 e IgD, e um anticorpo IgE.

[001049] E54. O anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, da modalidade 53, em que o anticorpo é um anticorpo IgG1 ou anticorpo IgG4.

[001050] E55. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades anteriores, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[001051] E56. Um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica a cadeia leve, a cadeia pesada ou as cadeias leve e pesada do anticorpo monocional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, de qualquer uma das modalidades 1-54.

[001052] E57. Um vetor de expressão compreendendo o ácido nucleico da modalidade 56.

[001053] E58. Uma célula transformada com um vetor de expressão da modalidade 57.

[001054] E59. Método para produzir um anticorpo monocional que se liga especificamente ao CD137 humano, ou a uma porção de ligação ao antígeno, o método compreende a manutenção de uma célula de acordo com a modalidade 58 sob condições que permitem a expressão do anticorpo monoclonal ou sua porção de ligação ao antígeno.

[001055] E60. O método da modalidade 59, compreendendo ainda obter o anticorpo monocional ou sua porção de ligação ao antígeno.

[001056] E61. Método para induzir ou melhorar a dimerização de trímeros CD137 humanos em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de qualquer uma das modalidades 1-54, ou a composição farmacêutica da modalidade 55.

[001057] E62. Método para induzir ou aprimorar a multimerização de trímeros CD137 humanos em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de qualquer uma das modalidades 1-54, ou a composição farmacêutica da modalidade 55.

[001058] E63. Método para induzir ou aprimorar a ativação de células T mediada por CD137 humano em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de qualquer uma das modalidades 1-54, ou a composição farmacêutica da modalidade 55.

[001059] E64. O método da modalidade 63, em que a ativação da célula T ocorre em um microambiente de tumor.

[001060] E65. O método da modalidade 63, em que a ativação da célula T não ocorre significativamente no baço e/ou fígado do indivíduo.

[001061] E66. Método para induzir ou melhorar uma resposta de célula T citotóxica mediada por CD137 humano em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação ao antígeno, de qualquer uma das modalidades 1- 54, ou a composição farmacêutica da modalidade 55.

[001062] E67. O método da modalidade 66, em que a resposta da célula T citotóxica ocorre em um microambiente de tumor.

[001063] E68. O método da modalidade 66, em que a resposta da célula T citotóxica não ocorre significativamente no baço e/ou fígado do indivíduo.

[001064] E69. Método para induzir ou melhorar a produção de citocinas mediada por CD137 humano em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de qualquer uma das modalidades 1-54, ou a composição farmacêutica da modalidade 55.

[001065] E70. O método da modalidade 69, em que a citocina produzida é IL-2, TNFa, IL-13, IFNyou combinações dos mesmos.

[001066] E71. O método da modalidade 69 ou modalidade 70, em que a produção de citocinas ocorre em um microambiente de tumor.

[001067] E72. O método da modalidade 69 ou modalidade 70, em que a produção de citocinas não ocorre significativamente no baço e/ou fígado do indivíduo.

[001068] E73. Método para induzir ou melhorar a proliferação de células T mediada por CD137 humano em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclilonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de qualquer uma das modalidades 1-54, ou a composição farmacêutica da modalidade 55.

[001069] E74. O método da modalidade 73, em que a proliferação de células T ocorre em um microambiente de tumor.

[001070] E75. O método da modalidade 73, em que a proliferação de células T não ocorre significativamente no baço e/ou fígado do indivíduo.

[001071] E76. Método para reduzir ou inibir o crescimento de tumores, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclional isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de qualquer uma das modalidades 1-54, ou a composição farmacêutica da modalidade 55.

[001072] E77. Método para tratar um distúrbio mediado por CD137 humano em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou sua porção de ligação ao antígeno, de qualquer uma das modalidades 1-54, ou a farmacêutica composição da modalidade 55.

[001073] E78. Método para tratamento de câncer em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclional isolado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades 1-54, ou a composição farmacêutica da modalidade 55.

[001074] E79. O método da modalidade 78, em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de melanoma, glioma, renal e câncer de cabeça e pescoço.

[001075] E80. O método de qualquer uma das modalidades 76- 79, em que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno se liga ao receptor gama Fc.

[001076] E81. O método de qualquer uma das modalidades 76- 80, em que a depleção de células T CD4+, células T CD8+, células exterminadoras naturais, ou combinações das mesmas, reduz a eficácia do anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno.

[001077] E82. Método para detectar a presença ou ausência de CD137 humano em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende:

[001078] (i) por em contato uma amostra biológica com o anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-54, em que o anticorpo é marcado com uma substância detectável; e

[001079] (ii) detectar o anticorpo ligado ao CD137 humano para assim detectar a presença ou ausência de CD137 humano na amostra biológica.

EXEMPLOS

[001080] Embora a presente divulgação tenha sido descrita com referência às modalidades específicas da mesma, deve ser entendido pelos versados na técnica que várias mudanças podem ser feitas e equivalentes podem ser substituídos sem se afastar do verdadeiro espírito e escopo da divulgação. Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma situação específica, material, composição da matéria, processo, etapa ou etapas do processo, ao objetivo, espírito e escopo da presente divulgação. Todas essas modificações devem estar dentro do escopo da divulgação.

Exemplo 1: Anticorpos Monoclonais Humanos Sintéticos Produzidos na Exposição a Leveduras que se Liga a CD137 Humano Recombinante

[001081] O antígeno da proteína CD137 purificado foi biotinilado usando o Kit de Biotinilação EZ-Link Sulfo-NHS (Thermo Scientific). Os antígenos CD137 foram concentrados a -1 mg/mL e o tampão foi trocado em PBS antes da adição do reagente de biotinilação na proporção molar 1:7,5 (Kit EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinilação, Thermo Scientific, Cat 21425). À mistura foi mantida a 4ºC durante a noite antes de outra troca de tampão para remover biotina livre na solução. A biotinilação foi confirmada através da ligação do sensor de estreptavidina às proteínas marcadas em um ForteBio. A biotinilação bem-sucedida do antígeno da proteína CD137 foi confirmada por ligação detectável a um biossensor ligado à estreptavidina instalado no Interferômetro Red384 ForteBio Octet”VY (Pall ForteBio, Menlo Park, CA) de acordo com as diretrizes do fabricante (dados não mostrados).

[001082] Oito bibliotecas de anticorpos naive sintéticos à base de leveduras humanas, cada uma de diversidade —-10º foi projetada, gerada e propagada como descrito anteriormente (ver por exemplo, WO2009036379; WO2010105256; WO2012009568; Xu et ai., Protein Eng Des Sel. 2013 Out; 26(10):663-70). Foram realizadas oito seleções paralelas, utilizando as oito bibliotecas naíve contra a fusão de CD137-Fe humano biotinilado.

[001083] Nas duas primeiras rodadas de seleção, foi realizada uma técnica de classificação de esferas magnéticas utilizando o sistema Miltenyi MACS, essencialmente como descrito (Siegel et al., J. Inmunol Methods. Mar 2004;286(1-2):141-53). Resumidamente, células de levedura (-10%º células/biblioteca) foram incubadas com 10 mL de antígeno de fusão de CD137-Fc humano biotinilado 10 nM por 15 minutos à temperatura ambiente em tampão de lavagem FACS PBS com BSA a 0,1%. Após lavagem uma vez com 50 mL de tampão de lavagem gelada, o sedimento celular foi ressuspenso em 40 mL de tampão e 500 mL de Streptavidin MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha. Cat ft 130-048- 101) foram adicionados ao fermento e incubado por 15 minutos a 4ºC. Em seguida, as leveduras foram sedimentadas, ressuspensas em 5 mL de tampão de lavagem e carregadas em uma coluna MACS LS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha. Cat.% 130-042-401). Após os 5 mL terem sido carregados, a coluna foi lavada três vezes com 3 mL de tampão de lavagem FACS. A coluna foi então removida do campo magnético e a levedura foi eluída com 5 mL de meio de crescimento e depois cultivada durante a noite.

[001084] Após as duas rodadas do MACS, três rodadas de classificação foram realizadas usando citometria de fluxo (FACS), descritas nos três parágrafos a seguir.

Estratégia de seleção empregando 8 seleções paralelas com antígeno Fc

[001085] As oito bibliotecas das seleções MACS foram realizadas em três rodadas de seleções FACS. Aproximadamente 1x10º levedura por biblioteca foi sedimentada, lavada três vezes com tampão de lavagem e incubada com 10 nM de fusão CD137-Fc humana biotinilada e 10 nM de antígeno de fusão CD137-Fc murino biotinilado separadamente por 10 minutos à temperatura ambiente. A levedura foi então lavada duas vezes e corada com F(ab'), anti-humano de cabra Kappa-FITC diluído a 1:100 (Southern Biotech, Birmingham, Alabama, Cat % 2062-02) e estreptavidina- Alexa Fluor 633 (Life Technologies, Grand Island, NY, Cat & S21375) diluído a 1:500 ou Extravidina-ficoertirina (Sigma-Aldrich, St Louis, Cat f E4011) diluído a 1:50, reagentes secundários por 15 minutos a 4ºC. Após lavagem duas vezes com tampão de lavagem gelado, os sedimentos celulares foram ressuspensos em 0,4 mL de tampão de lavagem e transferidos para tubos do tipo com tampa filtrante. A classificação foi realizada usando um classificador FACS ARIA (BD Biosciences) e as portas de classificação foram determinadas para selecionar apenas a ligação a CD137. As populações de murinos e humanos selecionadas da primeira rodada do FACS foram antecipadas para a próxima rodada.

[001086] As segunda e terceira rodadas de FACS para as populações selecionadas acima envolveram tipos positivos de ligantes para reagentes de CD137 humano e/ou murino; ou negativo para diminuir os ligantes — poliespecíficos dos reagentes (Xuet al, PEDS. 2013 Out;26(10):663-70). Dependendo da quantidade de ligação poliespecífica ou de ligação ao alvo de uma saída de seleção específica, uma classificação positiva seguiu uma classificação negativa ou vice-versa, para enriquecer para uma população de ligação completa com quantidade limitada de ligação poliespecífica. As seleções de competição também foram realizadas com mAbs de controle da literatura. Para as seleções de competição, o mAb4 (urelumabe; Bristol-Myers Squibb; número CAS: 934823-49-1) e o MAb5 (utomilumabe; Pfizer; número CAS: 1417318-27-4) foram pré-complexados para fusão de CD137-Fc humano biotinilado. Os anticorpos que se ligam e não se ligam na presença dos mAbs de controle foram selecionados para o FACS. As saídas dessas rodadas foram semeadas e os isolados foram coletados para sequenciamento e caracterização.

Maturação por afinidade de clones identificados em seleções ingênuas

[001087] As cadeias pesadas da primeira rodada de classificação FACS contra as saídas de fusão de CD137 Fc humano biotinilado foram usadas para preparar bibliotecas de diversificação de cadeia leve usadas por quatro rodadas de seleção adicionais. A primeira destas rodadas de seleção utilizou contas de Miltenyi MACs conjugadas com fusão de CD137- Fc humano biotinilado 10 nM como antígeno.

[001088] Após as seleções de contas de MACs, três rodadas de classificação FACS foram realizadas. O primeiro desses ciclos utilizou fusão CD137-Fc humano biotinilado a 10 nM. A segunda rodada de FACS para o exposto acima envolveu classificações positivas para ligantes aos reagentes de CD137 de camundongo, classificações de competição com mAbs de controle mencionados anteriormente ou classificações negativas para diminuir ligantes de reagentes poliespecíficos conforme descrito acima. A terceira e última rodada de seleção de FACS foi realizada usando a fusão CD137 Fc murina biotinilada a 10 nM ou CD137 monomérico humano biotinilado a 50 nM. Colônias individuais de cada rodada de seleção FACS descritas acima foram selecionadas para caracterização de sequenciamento.

Produção e purificação de IgG e Fab

[001089] Os clones de levedura foram crescidos até a saturação e depois induzidos por 48 horas a 30ºC com agitação. Após a indução, as células de levedura foram sedimentadas e os sobrenadantes foram colhidos para purificação. As IgGs foram purificadas usando uma coluna de Proteína A e eluídas com ácido acético, pH 2,0. Os fragmentos Fab foram gerados por digestão com papaína e purificados sobre a matriz de afinidade CaptureSelect IgG-CH1 (LifeTechnologies, Cat t 1943200250).

Exemplo 2: Préclassificação de Epitopo e Determinação da Afinidade de Anticorpo Anti-CD137 Humano a CD137 Recombinante

[001090] A pré-classificação de epítopos dos anticorpos isolados no Exemplo 1 foi realizada em um sistema Forte Bio Octet Red384 (Pall Forte Bio Corporation, Menlo Park, CA) usando um ensaio padrão de pré- classificação em formato sanduíche. As IgGs do anticorpo de controle CD137 foram carregadas nos sensores AHQ e os locais de ligação a Fc desocupados no sensor foram bloqueados com um anticorpo IgG1 humano não relevante. Os sensores foram então expostos ao antígeno alvo 100 nM, seguido pela exposição aos anticorpos isolados identificados como descrito no Exemplo 1. Os dados foram processados usando o Software de Análise de Dados 7.0 da ForteBio. A ligação adicional pelo segundo anticorpo após a associação do antígeno indica um epítopo desocupado (não concorrente), enquanto nenhuma ligação indica bloqueio do epítopo (concorrente) (dados não mostrados).

[001091] A afinidade dos anticorpos CD137 foi determinada medindo suas constantes cinéticas (Kaka, Ko) no ForteBio Octet. As medições de afinidade ForteBio foram realizadas geralmente como descrito anteriormente (Estep et a/., MAbs. 2013 5(2):270-8). Resumidamente, as medições de afinidade do ForteBio foram realizadas carregando anticorpos (IgGs) on-line nos sensores AHQ. Os sensores foram equilibrados off-line no tampão de ensaio por 30 minutos e depois monitorados on-line por 60 segundos para o estabelecimento da linha de base. Para a medição ávida de pré-classificação, os sensores com I|gGs carregados foram expostos a antígenos 100 nM (CD137 humano, cino ou murino) por 3 minutos, depois foram transferidos para o tampão de ensaio por 3 minutos para medição fora da taxa. As medições de ligação monovalente foram obtidas carregando a fusão de CD137-Fc humano em sensores AHQ, seguida de exposição ao anticorpo 200 nM Fab em solução. Os dados da cinética foram ajustados usando um modelo de ligação 1:1 no software de análise de dados fornecido pelo ForteBio (dados não mostrados).

[001092] A determinação se os anticorpos estavam bloqueando o ligante também foi avaliada. Especificamente, foram realizadas experiências de bloqueio de ligantes no Octet HTX (ForteBio) e no MX96 SPRi sem marcação (Caterra). O mAb1 foi capturado no sensor Octet ou sensor de chip MX96. CD137 e CD137L foram aplicados sequencialmente aos sensores pré-carregados com mAb1. Um aumento na resposta após a exposição ao CD137L indicou não competição entre mAb1 e CD137L pela ligação ao CD137. Por outro lado, uma falta de alteração no sinal indicava concorrência, o que era o caso do anticorpo controle mAb5. O mAb1 não inibiu a ligação de CD137L a CD137 (dados não mostrados) e, portanto, foi considerado um anticorpo não bloqueador de ligantes.

Exemplo 3: Distribuição de Afinidades de Ligação de Anticorpos Anti- CD137 Maturados por Afinidade

[001093] Os anticorpos anti-CD137 maturados por afinidade foram gerados usando 2 bibliotecas mutantes. A primeira biblioteca continha mutações na cadeia pesada e a segunda biblioteca continha mutações na cadeia leve, em que a diversidade de doadores em CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve foi criada. As bibliotecas mutantes passaram por 3 rodadas de panagem de fagos com o objetivo de aumentar a afinidade e manter a reatividade cruzada com o CD137 de camundongo. Em cada rodada, uma etapa de competição fora da taxa foi empregada após a ligação inicial a antígenos biotinilados (ou seja, 1 hora de incubação com excesso de antígeno não marcado ou IgG parental a 37ºC).

[001094] Os anticorpos anti-CD137 resultantes de diferentes rodadas de seleção foram plotados em kd/Kka parcelas de duplo log. Constantes aparentes da taxa cinética de associação e dissociação (valores ka e Ka) foram determinadas em um leitor SPRi (MX96, Carterra) em um tampão de PBS-T 0,01% Anticorpos CD137 anti-humanos foram impressos covalentemente em um chip Carboximetildextrano-hidrogel 50L (Xantec bioanalytics) em um CFM (Carterra). Reagentes de ativação misturados recentemente (150 ml de EDC 0,4 M e 150 ml de sulfo-NHS 0,1 M em H20) foram usados para ativar a superfície do substrato SPR por 7 minutos. Anticorpos a 10 mg/ml em tampão de ácido acético pH 4,5 foram utilizados para impressão por 15 minutos. O chip impresso foi então lavado no leitor SPRi (MX96, Carterra) com etanolamina 1 M por 15 minutos. Para análise cinética, foi injetado sequencialmente o CD137 humano recombinante purificado, marcado com seu marcador humano (0, 2,05, 5,12, 12,8, 32, 80, 200, 500 nM). Para cada concentração, houve 5 minutos de associação seguidos por 10 minutos de dissociação. Os dados foram processados e analisados nos softwares SPR Inspection Tool e Scrubber. Os dados cinéticos foram referenciados com os pontos de referência intersticiais e com dupla referência a um ciclo-tampão e, em seguida, se ajustaram globalmente a um modelo de ligação 1:1 para determinar sua aparente associação e dissociação constantes da taxa cinética (valores ka e Ka). À razão kd/ka foi usada para derivar o valor Ko de cada interação antígeno/mAb, ou seja, Ko=Kkd/Ka.

[001095] Anticorpos com Kp (Kd/Ka) entre 10 e 20 nM são mostrados como triângulos na vertical, enquanto os com Kp abaixo de 10 nM são mostrados como triângulos de cabeça para baixo (FIG. 1). A maturação por afinidade apenas das cadeias pesadas (painéis superiores) ou apenas das cadeias leves (painéis inferiores) resultou no isolamento de anticorpos anti- CD137 com afinidades de ligação mais altas do que o anticorpo parental (MAb1) (FIG. 1). As regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve do mAb1 são apresentadas nas SEQ ID NOs: 4 e 6, respectivamente.

Exemplo 4: Identificação de Resíduos Cruciais de Ligação Compreendendo CDR3 de Cadeia Pesada (CDRH3) de Anticorpos anti- CD137

[001096] Para determinar quais resíduos de aminoácidos no CDRH3 são críticos para a ligação do mAb1 aos polipeptídeos CD137 de camundongo e humano, foi realizada a varredura de alanina. Foi gerado um conjunto de polinucleotídeos que codificam derivados da estrutura de leitura aberta mAb1, em que cada derivado continha uma única substituição de resíduo de alanina em uma posição de resíduo de aminoácido do tipo selvagem compreendendo CDRH3. As posições D95 a M100I da SEQ ID NO: 4 foram mutadas para alanina, substituindo o códon de tipo selvagem pelo códon de alanina GCC. As sequências de aminoácidos de cada CDRH3 de cada derivado substituído por mAb1 alanina são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 111-125. Os polinucleotídeos que codificam cada um dos derivados substituídos por 15 mAb1 alanina foram clonados individualmente em um vetor de expressão (aglico-lgG1, DID-2600) via Gibson Assembly. Cada derivado substituído por mAb1 alanina foi expresso e purificado usando técnicas padrão conhecidas na técnica. As afinidades de ligação de cada derivado mAb1 substituído por alanina para CD137 humano e de camundongo foram determinadas por medições de cinética Wasatch SPR para CD137 humano (huCD137) ou ensaios de ligação a células de equilíbrio para CD137 de camundongo (mMCD137).

[001097] A Tabela 1 fornece as constantes de dissociação calculadas (Kp) para cada mutante. Quando "Fraco" é observado na tabela, havia uma ligação mensurável acima do fundo, mas não havia confiança suficiente no ajuste da curva para atribuir um valor Kp preciso. Na Tabela 1, "NB” significa que não foi observada nenhuma ligação durante a determinação das afinidades de ligação e indica quais substituições de alanina no CDRH3 resultaram em um anticorpo que não se ligou a CD137.

Tabela 1: Afinidade de ligação (Kp) de clones de varredura de alanina para CD137 humano e de camundongo hucD137 mCD137 hucD137 mCD137 BR RE vio à EA Vias Fo Vs Set sea ns ns

EE CRE CORA CR NE Sltaaa alada E E E EE CR a

[001098] A retenção, enfraquecimento ou perda de afinidade de ligação resultante de mutações em alanina informaram a determinação de quais resíduos eram necessários para a ligação a CD137 e quais resíduos toleravam mutações. A FIG. 2 resume os dados de ligação para a varredura de alanina de CDRH3 com identidade de aminoácidos do tipo selvagem indicada em cada posição. As posições de CDRH3 são codificadas por cores com base nos efeitos da mutação da posição em alanina, como mostrado. Essa análise resultou na seguinte sequência de consenso: DXPFXLDXXYY YYYX. Quando os resíduos em negrito na sequência de consenso foram mutados para alanina, houve uma perda completa da ligação e, portanto, esses resíduos foram necessários para a ligação do mMAb1 ao CD137. Quando os resíduos em itálico na sequência de consenso foram mutados para alanina, o anticorpo ainda era capaz de se ligar a CD137, mas com uma afinidade mais fraca, indicando que esses resíduos tinham um papel parcial na ligação, mas não eram absolutamente necessários. Quando as posições de resíduos indicadas com um X na sequência de consenso foram mutadas para alanina, houve pouca ou nenhuma alteração na afinidade de ligação. Assim, esses resíduos toleraram mutações e não foram críticos para a interação de ligação.

Exemplo 5: Mapeamento de Epítopos por Varredura da Mutagênese da Saturação e Comparação de Homólogos

[001099] O mapeamento funcional do epitopo CD137 por varredura da biblioteca de mutagênese de saturação e comparação de homologia foi realizado para identificar resíduos importantes para a ligação do anticorpo ao CD137. Bibliotecas combinatórias de mutantes de CD137 com mutações de ponto único em todas as posições de resíduos para todas as substituições de aminoácidos possíveis, exceto cisteína, foram geradas e testadas quanto à sua capacidade de se ligar a MAb1, mAb4 e mAb5. Uma biblioteca que consiste em genes que codificam cada mutante pontual de CD137 foi sintetizada a partir de um fornecedor comercial e clonada em um vetor de expressão de exibição em mamíferos. A exibição em mamíferos foi usada para apresentar uma biblioteca de domínios extracelulares de CD137 humanos variantes, com cada variante tendo pelo menos uma mutação pontual em relação ao CD137 humano tipo selvagem.

[001100] A biblioteca de células que exibia variantes de CD137 foi corada com anticorpos não sobrepostos (i) mAb4 e mAb1 ou (ii) mAb4 e MAb5. As populações de células com ligação reduzida a um anticorpo, mas não ao outro, foram enriquecidas por FACS. Cada população foi sequenciada pelo sequenciamento lllumina para identificar mutações em posições que especificamente interromperam a ligação a cada anticorpo, mas não afetaram o dobramento correto de CD137 ou a ligação ao anticorpo não sobreposto.

[001101] Para o mAb1, o K114 foi identificado como o resíduo mais importante para a ligação ao CD137, com 34% de todas as mutações observadas ocorrendo nessa posição e todas as substituições de aminoácidos observadas. E111, T113 e P135 também são importantes para a ligação, com 10% das mutações observadas em cada uma dessas posições. Além disso, N126 e 1132 foram observados na população que teve redução parcial na ligação ao mAb1. A FIG. 3A mostra os resíduos compreendendo o epítopo para mAb1, mAb4 e mAb5. O mAb4 e o mAb5 tinham epítopos de ligação que eram distintos do MAb1. Para o mAb4, N42 foi o resíduo mais importante, com 50% de todas as mutações observadas nessa posição, seguido por R41 e D38. Para o mAb5, o 1132 foi o mais importante, com 32% de todas as mutações ocorrendo nessa posição, seguido por N126, G96, K114 e L95.

[001102] Os mutantes pontuais isolados da triagem da biblioteca foram expressos como proteínas solúveis e testados quanto à ligação ao mMAb1. Todas as 4 mutações testadas em K114 (R, E, N, T) aboliram a ligação ao mAb1. As mutações em T113 e P135 também interromperam a ligação. Os mutantes de 1/2 ponto em E111, 1/3 dos mutantes em N126 e 1/4 dos mutantes em 1132 não mostraram ligação. Da mesma forma, 3/3 dos mutantes em N42 não se ligaram ao mAb4 e 3/4 dos mutantes em 1132 não se ligaram ao mAb5.

[001103] Além disso, os homólogos de CD137 foram testados quanto à sua ligação ao mAb1. O mAb1 foi capaz de se ligar ao CD137 de camundongo, mas não ao CD137 de rato, como mostrado na FIG. 3B. Para determinar se havia uma diferença nos resíduos compreendendo o epítopo para o mAb1 entre CD137 de camundongo e CD137 de rato, as sequências de aminoácidos de homólogos de CD137 de humanos, macaco cinomolgo, rato e camundongo foram alinhadas para comparação. Todos os resíduos de aminoácidos compreendendo o epítopo mAb1 estão presentes em humanos, macacos cinomolgo e camundongos, mas não em ratos. A lisina 114 (K114) da sequência CD137 humana, bem como a lisina correspondente nas sequências CD137 de macaco cinomolgo e rato camundongo, é ácido glutâmico (E) na sequência CD137 de rato, indicando ainda que K114 da sequência CD137 humana é pelo menos um dos resíduos críticos de ligação ao mAb1.

[001104] As FIGs. 3C e 3D mostram a estrutura cristalina do CD137 humano ligado a CD137L (Bitra A et al., J Biol Chem 2018, 293 (26):9958-9969), em que os resíduos E111, T113, K114 e P135 são mostrados como esferas. Como pode ser visto, esses resíduos estão localizados longe do domínio de ligação ao ligante CD137 (CD137L), mostrado em cinza.

Exemplo 6: Efeito dos Anticorpos Anti-CD137 nos Reguladores Imunes e nas Células T CD8+ em Camundongos

[001105] Três anticorpos anti-CD137 gerados no Exemplo 1, MAb1, mAb2 e mAb3, foram ainda analisados quanto à sua eficácia. Estes anticorpos foram reativos cruzados com camundongos e compreendiam as regiões constantes do isotipo IgG4 humano contendo a mutação S228P para impedir o embaralhamento de Fab. O anticorpo monoclonal 3H3, conhecido por estimular a sinalização de CD137 de camundongo in vivo e induzir imunidade antitumoral (Melero et al. (1997) Nature Medicine 3(6):682-685; Uno et al. (2006) Nature Medicine 12(6):693-696), foi usado como um comparador (BioXcell cattt BE0239; número de lote 5926/1115). Notavelmente, o anticorpo 3H3 tem propriedades semelhantes às do urelumab (Bristol-Myers Squibb; Número CAS: 934823-49-1), um anticorpo agonista IgG4-S228P totalmente humano que tem como alvo o domínio extracelular do CD137, mas não bloqueia a ligação ao ligante. Além disso, IgG4 anti-rato foi usado como controle de isótipo (BioXcell cat tt! BEOO89; número de lote 5533/5679-316J1). Foram feitas diluições em PBS para alcançar a dose desejada por camundongos, como indicado, em 100 uL de volume de injeção.

[001106] Os anticorpos (100 y|ug) foram administrados intraperitonealmente nos dias O, 3, 6 a camundongos Balb/c fêmeas não portadores de tumor e os baços foram coletados no dia 9. Os níveis de expressão de PD-1 e TIGIT nas células T CD8+ CD44+ foram medidos por citometria de fluxo. Especificamente, foram obtidas suspensões de células únicas dos baços por interrupção mecânica e passando por um filtro de células de 40 um. Os glóbulos vermelhos foram lisados usando tampão ACK. As suspensões celulares foram coradas com os seguintes anticorpos: CD45 (clone 30-F11, eBioscience), CD8 (clone 53-6.7, BD Biosciences), CDA4 (clone RM-45, BD Biosciences), CD44 (clone IM7, eBioscience), PD-1 (RMP1-30, eBioscience) e TIGIT (GIGD7, eBioscience). A aquisição dos dados foi realizada no citômetro de fluxo MACSQuant Analyzer (Milenyi) e os dados foram analisados no software FlowJo, versão 10.

[001107] O anticorpo 3H3 causou um aumento significativo na expressão de PD-1 e TIGIT, enquanto apenas o anticorpo MAb1 aumentou a expressão em comparação com o mAb2 e o mAb3 (FIGs. 4A e 4B). Além disso, a expansão das células T CD8+ foi avaliada analisando a porcentagem de células CD45+ esplênicas ou o número de células T CD8+ por baço. Da mesma forma, o anticorpo 3H3 causou a maior expansão de células T CD8+, com o mAb1 resultando nos níveis mais altos de expansão de células T CD8+ em relação ao mMAb2 e mAb3 (FIG. 4C). Consequentemente, o mAb1 foi selecionado para testes adicionais.

Exemplo 7: Eficácia de Anticorpos Anti-CD137 em Camundongos Portadores de Tumor

[001108] Dada a capacidade do mMAb1 para melhorar a expansão das células T CD8+, como mostrado no Exemplo 6, o mAb1 foi ainda analisado quanto à atividade antitumoral usando um modelo subcutâneo de câncer de cólon singeneico. Especificamente, as células tumorais CT26 (passagem 3) foram mantidas em condições assépticas em meio DMEM (Gibco cat ft 11965-092), contendo 10% de FBS inativado por calor a 56ºC (Gibco 10438-034), piruvato de sódio 1 mM (Gibco cat. tt 11360-070), 1X NEAA (Gibco cat % 11140-050) e solução de vitamina 1X MEM (Gibco cat * 11120-052). As células foram mantidas a 37ºC e 5% de CO». Ao atingir 50-

70% de confluência, as células foram passadas na proporção de 1:10, por um total de duas passagens, antes da implantação in vivo. As células foram coletadas e contadas usando um Hemacitômetro (Hausser Scientific Bright- Line % 1492).

[001109] Camundongos fêmeas Balb/c foram adquiridos nos Laboratórios Charles River e tinham nove semanas de idade no início do estudo. Células tumorais CT26 (1 x 10º células por camundongo em 0,1 mL de PBS) foram injetadas subcutaneamente no flanco direito de cada camundongo e o volume do tumor foi calculado duas vezes por semana (Comprimento*(Largura'2)/2) usando paquímetros com mostrador. No dia 7 após a inoculação do tumor, os animais foram classificados em grupos de oito e os tratamentos foram iniciados. Os pesos corporais foram registrados três vezes por semana durante a duração do estudo.

[001110] mAb1 foi administrado em três dosagens diferentes (100, 50 ou 25 pug/camundongo), 3H3 em duas dosagens diferentes (50 ou 10 pgicamundongo) e o anticorpo de controle de isotipo na dosagem de 50 pg/camundongo. Todos os camundongos foram doseados por via intraperitoneal nos dias 0, 3,6e9,

[001111] Foi confirmada a expansão de células T CD8+ nos tumores in vivo para os anticorpos mAb1 e 3H3 (dados não mostrados). Os volumes tumorais individuais são mostrados na FIG. 5A e os volumes médios do tumor são mostrados na FIG. 5B. O tratamento com mAb1 resultou na inibição do crescimento do tumor em comparação com o grupo controle nas três doses. Além disso, o tratamento com mAb1 resultou em regressões completas em 6 de 8 camundongos no nível de dose de 25 ug, em 8 camundongos no nível de dose de 50 ug e 3 em 8 camundongos no nível de dose de 100 ug.

[001112] A sobrevida global em cada grupo de tratamento é mostrada na FIG. 5C. A forte atividade antitumoral do mMAb1 contra os tumores CT26 foi refletida como uma sobrevida global estendida. Sobrevida a longo prazo (>60 dias) foi observada em 80% dos camundongos no nível de dose de 25 ug, 62% nos camundongos no nível de dose de 50 ug e 38% nos camundongos no nível de dose de 100 ug.

[001113] Os camundongos sem tumor palpável no dia 70 foram considerados curados e novamente desafiados com injeção subcutânea de células CT26 no flanco oposto. Especificamente, camundongos com tumores erradicados foram injetados novamente com 1x10º células CT26 no flanco esquerdo e o volume do tumor foi calculado duas vezes por semana (Comprimento*(Largura"2)/2) usando paquímetros com mostrador. Cinco camundongos (naíive) não imunizados foram injetados da mesma maneira que um controle, respectivamente. Os resultados do experimento de re-desafio são mostrados na FIG. 5D. Vinte e dois dias após a injeção subcutânea de células CT26, nenhum dos camundongos re-desafiados formou tumores. Por outro lado, todos os camundongos naíve que foram injetados com as mesmas células formaram tumores. Portanto, todos os camundongos considerados curados rejeitaaam os tumores CT26, sugerindo que o mAb1 pode induzir memória protetora de longo prazo.

Exemplo 8: Eficácia de Anticorpos Anti-CD137 Maturados por Afinidade em Camundongos Portadores de Tumor

[001114] Os anticorpos monoclonais amadurecidos por afinidade gerados no Exemplo 4 foram analisados quanto à atividade antitumoral usando o mesmo modelo subcutâneo de câncer de cólon singeneico (CT26) essencialmente como descrito no Exemplo 7. Especificamente, 6 clones amadurecidos por afinidade (mMAb7-mAb12) foram gerados com regiões constantes de IgG4 e testados em conformidade. As sequências das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve são fornecidas na tabela abaixo, juntamente com seus valores Kp para CD137 de camundongo (determinado por ForteBio Octet, descrito no Exemplo 2) e CD137 humano (determinado por Carterra, descrito no Exemplo 4).

Anticorpo Cadeia Vr Cadeia V. Ligação ao | Ligação ao CD137 Ko (nM) | CD137 Ko de camundongo humano (nM Imabz —————|[sEQIDNOS j|seQIDNO6 12 eg || [mao ————— |[SEQIDNO:103 |sEQIDNO6 | 69 ana

[001115] O mAb1 parental, o anticorpo 3H3 (dados não mostrados) e um anticorpo isotipo IgG4 foram utilizados como controle. Todos os camundongos foram tratados com 50 ug de mAb/camundongo intraperitonealmente nos dias O, 3, 7 e 10. Os baços e fígados foram coletados no dia 13 após o início da terapia.

[001116] Os volumes tumorais individuais são mostrados na FIG. 6A e os volumes médios do tumor são mostrados na FIG. 6B. De acordo com os resultados do Exemplo 7, o tratamento com mAb1 parental resultou em uma redução no volume do tumor. Além disso, a administração de todos os clones amadurecidos por afinidade derivados de mAb1 (mMAb7-mMAb12) a camundongos portadores de tumor resultou em uma inibição do crescimento tumoral em comparação com camundongos tratados com o anticorpo de controle de isotipo.

Exemplo 9: Efeito dos Anticorpos Anti-CD137 nas Células T em Camundongos com Tumor

[001117] Para determinar o efeito dos anticorpos anti-CD137 (isto é, 3H3 e mAb1) no nível de células T em camundongos portadores de tumor, camundongos Balb/c com tumores CT26, conforme descrito no Exemplo 7, foram injetados intraperitonealmente com anticorpos nos dias O e 3, e os tecidos foram coletados no dia 7. O mAb1 foi administrado em três dosagens diferentes (100, 50 ou 25 ug/camundongo), 3H3 em duas dosagens diferentes (50 ou 10 ug/camundongo) e o anticorpo de controle do isotipo em uma dosagem de 50 ug/camundongo.

[001118] As suspensões de células únicas do baço foram obtidas como descrito no Exemplo 6 e as suspensões de células tumorais foram obtidas por digestão enzimática e mecânica usando kit de dissociação de tumores (Miltenyi cat & 130-096-730). As suspensões celulares foram tratadas com meio completo para inativar as enzimas e depois passadas por um filtro de células de 40 um. Os glóbulos vermelhos foram lisados usando tampão ACK. As células foram coradas com anticorpos contra CD45, CD8 e CD4 e analisadas como descrito no Exemplo 6.

[001119] AFIG.7 mostra o número de células T CD4+ e CD8+, como uma porcentagem de células CD45+, encontradas no baço e no tumor. Estes resultados indicaram que o mMAb1 expande seletivamente células T CD8+ infiltradas em tumores em comparação com células T esplênicas CD8+.

Exemplo 10: Efeito da Depleção de Linfócitos CD4+, CD8+ ou NK na Eficácia Antitumoral de Anticorpos Anti-CD137 Ih Vivo

[001120] Para avaliar o mecanismo de ação dos anticorpos anti- CD137, camundongos Balb/c com tumores CT26, como descrito no Exemplo 7, foram injetados intraperitonealmente com mAb1 sozinho ou em combinação com anti-CD4 (GK1.5), anti-cCD8 (YTS169.4) ou anticorpos anti-asialo-GM1 (células NK-alvo) para esgotar esses subconjuntos de linfócitos específicos dos animais. Aos camundongos tratados apenas com o anticorpo mMAb1 foram administrados 150 ug de anticorpo nos dias 6, 9, 12, 19 e 26. Os camundongos tratados com 150 ug de mAb1i em combinação com 500 ug de anticorpos anti-CD4, anti-CD8 ou 50 ul de anticorpos anti-asialo-GM1 administrados nos dias -1, 0, 5, 10, 156 20. O esgotamento efetivo foi confirmado pela análise FACS (dados não mostrados).

[001121] Os volumes tumorais individuais são mostrados na FIG.

8. De acordo com os resultados do Exemplo 7, o tratamento com mAb1 parental resultou em uma redução no volume do tumor. Além disso, a administração de mAb1 em combinação com anticorpos anti-CDA4, anti-CD8 ou anti-asialo-GM1 destruidores de linfócitos reduziu a atividade antitumoral do anticorpo mAb1. Estes resultados indicaram cooperação entre imunidade inata e adaptativa para eficácia antitumoral dos anticorpos anti- CD137 aqui descritos.

Exemplo 11: Eficácia Antitumoral de Anticorpos Anti-CD137 em Vários Modelos de Tumor

[001122] Para determinar se um anticorpo anti-CD137 tinha eficácia antitumoral em diferentes modelos de tumor, o mAb8 foi administrado a camundongos com tumores CT26 (carcinoma do cólon; conforme descrito acima), tumores EMT-6 (carcinoma da mama), tumores AZ2O (células B linfoma) ou tumores MC38 (carcinoma do cólon).

[001123] Paratodos os modelos de tumor, camundongos fêmeas foram adquiridos nos Laboratórios Charles River e tinham 7-9 semanas de idade no início do estudo. Para cada tipo de tumor foi utilizada a cepa singeneica de camundongo apropriada (Balb/c para CT26, EMT-6 e A20; C57BL/6 para MC38). Células tumorais EMT6 (5 x 10º) células por camundongo em 0,05 mL de PBS) foram injetadas na camada de gordura mamária direita de cada camundongo. Células tumorais CT26 (1 x 10º células por camundongo), células tumorais A20 (5 x 10º células por camundongo) e células tumorais MC38 (5 x 10º células por camundongo) foram injetadas subcutaneamente no flanco direito de cada camundongo e o volume do tumor foi calculado duas vezes por semana (Comprimento*(Largura"2)/2) usando paquímetros com mostrador. Ao atingir tumores de tamanho 50-100 mm?, os camundongos foram randomizados para receber mAb8 ou controle de isotipo (dia 0). Os camundongos com tumores EMTG6 ortopédicos receberam 12,5 ug nos dias 0,3,6 e 9. Os camundongos com tumores A20 (200 pug/camundongo) e MC38 (12,5 ug/camundongo) receberam 5 doses uma vez por semana. Todos os camundongos foram doseados por via intraperitoneal.

[001124] Como mostrado na FIG. 9, o mAb8 foi eficaz em todos os quatro modelos de tumor testados, indicando uma ampla gama de eficácia para diferentes tipos de câncer. O tratamento com mAb8 resultou em regressões tumorais em camundongos portadores de tumores 8/8 CT26, 3/8 EMT6, 5/8 A20 e atraso no crescimento na maioria dos demais camundongos portadores de EMT6, A20 e MC38.

Exemplo 12: Efeito da Dosagem de Anticorpos Anti-CD137

[001125] Para caracterizar ainda mais a eficácia antitumoral dos anticorpos anti-CD137, foi realizado um estudo de dosagem usando o mesmo modelo subcutâneo de câncer de cólon singeneico (CT26) essencialmente como descrito no Exemplo 7. Especificamente, o mAb1 parental e os anticorpos amadurecidos por afinidade mAb8 e mAb10 foram administrados intraperitonealmente em doses de 150 ug (dose alta) ou 20 vg (dose baixa) por camundongo nos dias O, 3, 6 e 9, com 8 camundongos por grupo de tratamento. Um grupo de camundongos (n=8) recebeu um controle de isotipo IgG4 na dose de 150 ug.

[001126] Os volumes individuais do tumor, o volume médio do tumor e a porcentagem de sobrevida dos camundongos tratados com 150 pg são mostrados na FIG. 10A, a FIG. 10B e FIG. 10C, respectivamente. Os volumes individuais do tumor, o volume médio do tumor e a porcentagem de sobrevida dos camundongos tratados com 20 ug são mostrados na FIG. 11A, a FIG. 11B e FIG. 11C, respectivamente. Estes resultados indicaram que o tratamento com o mAb1 parental e os anticorpos mAb8 e mAb10 maturados por afinidade resultaram em uma redução no volume do tumor e um aumento na sobrevivência do camundongo em doses altas e baixas.

[001127] Em um estudo de dosagem separado utilizando o modelo de tumor CT26, foram testadas doses adicionais de mAb1 dos pais. Especificamente, o mAb1 foi administrado intraperitonealmente nas seguintes doses: 12,5 ug, 25 ug, 50 ug, 100 ug e 200 ug. A FIG. 12 mostra os resultados do estudo de dosagem, indicando eficácia em uma ampla faixa de doses. O tratamento com mAb1 resultou em regressões tumorais em pelo menos 3/8 camundongos em cada nível de dose com faixa de dose ideal (50-100 pg/camundongo) levando a 7/8 camundongos com tumores erradicados.

Exemplo 13: Efeito da Ligação do Receptor Fc na Eficácia Antitumoral de Anticorpos Anti-CD137

[001128] Para determinar a contribuição da ligação do receptor Fc na atividade antitumoral de anticorpos anti-CD137, foram geradas versões IgG1 e IgG4 aglicosiladas de mAb1. Os tumores CT26 foram estabelecidos em camundongos como descrito no Exemplo 7. Os camundongos receberam 150 ug de (a) controle de isotipo; (b) mMAb1 como IgG4; (c) mMAb1 aglicosilado como IgG4; ou (d) mAb1 aglicosilado como IgG1.

[001129] Conforme mostrado nas FIGs. 13A e 13B, os isotipos de IgG4 e IgG1 aglicosilados do anticorpo mAb1 parental tiveram efeito reduzido no volume do tumor em comparação com o mAb1. No entanto, a eficácia não foi completamente abolida. Por conseguinte, estes resultados indicaram que, embora a eficácia antitumoral do mAb1 não seja totalmente dependente de Fc, é aumentada pela ligação ao receptor Fc.

Exemplo 14: Afinidade Entre Espécies de Anticorpos Anti-CD137

[001130] Os anticorpos anti-CD137 foram ainda testados quanto à sua ligação a CD137 de várias espécies. Especificamente, o mMAb1, o mAb8 e o mAb10 foram analisados quanto à ligação a CD137 humano, de camundongo, cinomolgo e canino. As experiências cinéticas foram realizadas no Octet HTX (ForteBio) em tampão cinético (1x PBS, pH 7,4, 0,1 mg/ml de BSA e 0,002% de Tween 20). Foram carregados Fc-, IgG2a-, ou CD137 marcado com His (humano, camundongo, cino ou canino) por 5 minutos em biossensores pré-hidratados, AHC, AMC ou NTA, respectivamente. Os sensores foram então mergulhados em Fabs (0, 5,12, 12,8, 32, 80, 200 e 500 nM) por 5 minutos de associação, seguidos por 15 minutos de dissociação. Os resultados foram analisados com ForteBio Data Analysis 9.0 e se ajustaram globalmente a um modelo de ligação 1:1 para determinar o Kp aparente. Kp para a ligação a CD137 humanos e de camundongo foi confirmado usando antígenos de diferentes fontes (ACRO Biosystems, Sino Biological e interno). Os resultados são mostrados na Tabela 2 abaixo. Tabela 2: Afinidade entre Espécies [Humano = [5070MM — jasM —joonv = &5j Exemplo 15: Efeito do Tamanho do Tumor na Eficácia Antitumoral de Anticorpos Anti-CD137

[001131] Para caracterizar ainda mais a eficácia antitumoral dos anticorpos anti-CD137, foi avaliada a eficácia antitumoral contra tumores grandes. Os tumores CT26 foram deixados crescer para aproximadamente 500 mm? antes do tratamento. Os anticorpos mAb1 parentais e mAb8 e mAb10 amadurecidos por afinidade foram administtados a 150 pg/camundongo (n=6 camundongos/grupo de tratamento) nos dias 0, 3,6 e 9 após o estabelecimento do tumor. O anticorpo de controle do isotipo IgG4 foi usado como um comparador.

[001132] Como mostrado nas FIGs. 14A-14C, o mAb1 parental, bem como o mAb8 e o mAb10 maturados por afinidade reduziram o volume do tumor (FIGs. 14A-14B) e aumento da sobrevida do camundongo (FIG. 14C) em relação ao controle do isotipo. O mAb8 resultou em eficácia antitumoral significativamente maior em comparação com o mMAb1 e o mAb10. Um estudo separado foi realizado comparando a eficácia do mAb8 e 3H3 contra tumores grandes usando o mesmo desenho de estudo, exceto que 25 ug dos anticorpos foram administrados nos dias 0, 7 e 14. A FIG. 14D fornece os resultados, mostrando que o 3H3 não teve eficácia contra tumores grandes, enquanto o mAb8 induziu a regressão do tumor.

[001133] Como descrito no Exemplo 14, o mAb8 tem uma afinidade pelo CD137 de camundongo que é comparável à afinidade do mAb1 pelo CD137 humano. Embora a divulgação não esteja vinculada a nenhuma teoria ou mecanismo de ação específico, acredita-se que os anticorpos agonistas anti-CD137 com afinidade intermediária possam ser ainda mais úteis no tratamento do câncer.

[001134] Os camundongos sem tumor palpável no dia 70 foram considerados curados e novamente desafiados com injeção subcutânea de células CT26 no flanco oposto. Especificamente, camundongos com tumores erradicados foram injetados novamente com 1x10º células CT26 no flanco esquerdo e o volume do tumor foi calculado duas vezes por semana (Comprimento*(Largura"2)/2) usando paquímetros com mostrador. Cinco camundongos (naíive) não imunizados foram injetados da mesma maneira que um controle, respectivamente. Os resultados do experimento de re-desafio são mostrados na FIG. 15. Oitenta dias após a injeção subcutânea de células CT26, nenhum dos camundongos re-desafiados formou tumores. Por outro lado, todos os camundongos naive que foram injetados com as mesmas células formaram tumores. Portanto, todos os camundongos considerados curados rejeitaam os tumores CT26, sugerindo que o mMAb1 pode induzir imunidade de memória protetora a longo prazo.

Exemplo 16: Toxicidade de Anticorpos Anti-CD137 em Camundongos Portadores de Tumor

[001135] Para determinar o efeito dos anticorpos anti-CD137 (isto é, 3H3 e mAb1) no nível de células T intra-hepáticas em camundongos portadores de tumor, os camundongos do Exemplo 7 foram analisados. Os linfócitos hepáticos foram coletados e analisados por citometria de fluxo. Especificamente, foram obtidas suspensões de células únicas do fígado usando o kit de dissociação hepática (Miltenyi cattf! 130-105-807) e o Dissociador MACS suave (Miltenyi). As suspensões celulares foram tratadas com meio completo para inativar as enzimas e depois passadas por um filtro de células de 40 um. Os glóbulos vermelhos foram lisados usando tampão ACK. As células foram coradas com anticorpos contra CD45, CD8 e CD4 e analisadas como descrito no Exemplo 3.

[001136] As FIGs. 16A e 16B mostram o número de células T CD4+ e CD8+, como uma porcentagem de células CD45+, encontradas no fígado de camundongos tratados. Os resultados indicaram que o mAb1 não induziu a infiltração de células T intra-hepáticas, demonstrando menor toxicidade em relação ao anticorpo 3H3.

Exemplo 17: Toxicidade de Anticorpos Anti-CD137 Maturados por Afinidade em Camundongos Portadores de Tumor

[001137] Para avaliar os efeitos relacionados à toxicidade mediados por anticorpos anti-CD137 (isto é, 3H3, mAb1l e mAb7-mAb12), a composição celular de baços e fígados de camundongos portadores de tumores do Exemplo 8 foi analisada após a administração do anticorpo.

[001138] As células T intra-hepáticas (fígado) e intra-esplênicas (baço) em camundongos portadores de tumores do Exemplo 8 foram coletadas e analisadas por citometria de fluxo. As células CD45+ dos fígados e baços foram avaliadas quanto à expressão de CD3+, CD4+ ou CD8+ após a administração de anticorpos anti-CD137 ou do anticorpo de controle de isotipo, conforme indicado. Os resultados são mostrados nas FIGs. 17A (esplênico) e 17B (fígado). Os resultados indicaram que a administração de mAb1 parental, bem como os anticorpos amadurecidos por afinidade (mMAb7-mAb12), tiveram pouco ou nenhum efeito sobre a porcentagem de células T intra-hepáticas ou intrasplênicas em relação à administração do anticorpo de controle de isotipo. Por outro lado, a administração do anticorpo 3H3 resultou em células T elevadas tanto no baço quanto no fígado em relação ao anticorpo de controle do isotipo, particularmente as células T CD3+ e as células T CD8+.

[001139] Além disso, as células T CD45+ CD8+ e as células T CD45+ CD4+ dos fígados e baços dos camundongos tratados foram avaliadas quanto à expressão de receptores co-inibidores TIGIT, PD-1 ou LAG-3, como indicadores de ativação ou exaustão de células T, a seguir administração de anticorpos anti-CD137 ou o anticorpo de controle de isotipo. Os níveis de expressão de TIGIT, PD-1 e LAG-3 em células T CD8+ e células T CD4+ foram medidos por citometria de fluxo, como descrito nos exemplos anteriores. Nas FIGs. 18A-18B e 19A-19B mostram que a administração do anticorpo 3H3 causou um aumento significativo na expressão desses receptores co-inibidores nas células T CD8+ e CD4+, enquanto a administração do mAb1 parental ou dos anticorpos mAb7- mAb12 maturados por afinidade resultou na expressão de TIGIT, PD-1 ou LAG-3 numa extensão semelhante à observada após a administração do anticorpo de controle do isótipo. Estes resultados indicaram que os anticorpos amadurecidos por afinidade não induziram ativação sistêmica de células T CD8+ ou de células T CD4+.

[001140] Tomados em conjunto, estes resultados indicam que os anticorpos mAb1 parentais e mAb7-mAb12 amadurecidos por afinidade exibem menor potencial de toxicidade in vivo relativa ao anticorpo comparador 3H3. A ausência de ativação e expansão sistêmica de células

T, principalmente no fígado, após o tratamento com mAb1 e anticorpos mMAb7-mMAb12 maturados por afinidade, pode se traduzir em menor possibilidade de hepatotoxicidade (transaminite) em pacientes.

Exemplo 18: Toxicidade de Doses Múltiplas de Anticorpos Anti- CD137 em Camundongos Portadores de Tumor

[001141] Para confirmar a falta de toxicidade induzida pelo mAb1, foi realizado um estudo de toxicidade de dose repetida. Especificamente, os camundongos foram administrados com anticorpos anti-CD137 mAb1, mMAb8 ou 3H3 semanalmente, durante 4 semanas. O mAb1 e o mAb8 foram administrados em 10, 20, 40 ou 80 mg/kg, enquanto que o 3H3 foi administrado em 10 ou 80 mg/kg. No dia 35, os níveis de alanina aminotransaminase (ALT) no plasma foram determinados usando um ensaio de atividade fluorométrica (Sigma, cat %& MAKOS2), as células T CD8+ no fígado foram determinadas por citometria de fluxo (como descrito acima) e concentração de TNFa no plasma foi determinada usando um ensaio de eletroquímica e eletroquímica (Meso Scale Discovery, kit personalizado) de acordo com as instruções do fabricantes.

[001142] A FIG. 20A mostra baixos níveis de células T CD8+ nos fígados de camundongos que receberam mAb1 e mAb8 em todas as 4 doses, enquanto o 3H3 induziu altos níveis de células T CD8+ nas doses baixa (10 mg/kg) e alta (80 mg/kg). A FIG. 20B mostra baixos níveis de atividade de ALT no plasma de camundongos administrados com mAb1 e mAb8 em todas as 4 doses, enquanto o 3H3 induziu altos níveis de ALT na dose de 80 mg/kg. A FIG. 20C mostra baixos níveis de TNFa no plasma de camundongos administrados com mAb1 mAb8 em doses baixas (10 mg/kg) e altas (80 mg/kg), enquanto o 3H3 induziu altos níveis de TNFa em doses baixas (10 mg/kg) e altas (80 mg/kg).

[001143] Além disso, os fígados de camundongos tratados que receberam 80 mg/kg dos anticorpos agonistas anti-cCD137 foram seccionados e corados com H&E. De cada animal, metade de um lobo hepático foi incorporado em OCT e congelado fresco em nitrogênio líquido. Seccionamento e coloração H&E foram realizados por um laboratório de histopatologia (Mass Histology Service, Inc) de acordo com procedimentos padrão. A FIG. 21 fornece os resultados, que mostram focos inflamatórios centrolobulares em camundongos que receberam 3H3 (ver setas), mas não mMAb1 ou mAb1 maturado por afinidade.

Exemplo 19: Reprogramação Imunológica com Anticorpos Anti- CD137

[001144] Para determinar o papel dos anticorpos anti-CD137 nas células imunes no microambiente tumoral, foi utilizado o modelo de tumor CT26. Especificamente, os tumores CT26 foram estabelecidos como descrito no Exemplo 7. O mAb8 foi administrado a camundongos nos dias 0, 3, 6 e 9 na dose de 25 ug. Os tumores foram analisados no dia 11, como descrito no Exemplo 16.

[001145] A infiltração global de células imunes no microambiente do tumor foi determinada medindo a quantidade de células vivas CD45+. Conforme mostrado na FIG. 22A, o mAb8 aumentou significativamente a infiltração de células imunes no microambiente do tumor.

[001146] O nível de células Treg no microambiente tumoral foi determinado medindo a quantidade de linfócitos infiltrantes de tumor CD25+ FOXP-3+ CD4+. Conforme mostrado na FIG. 22B, o mAb8 reduziu significativamente o nível de Tregs no microambiente tumoral.

[001147] O efeito do mAb8 na exaustão das células T foi determinado medindo o nível de expressão de PD-1+TIGIT+ nos linfócitos infiltrantes de tumor CD8+ ou CD4+ (TlLs). A FIG. 22C mostra os resultados para CD8+ Tlls, em que as células PD-1+TIGIT+ foram reduzidas no microambiente do tumor quando o mAb8 foi administrado. Resultados semelhantes foram observados para CD4+ TlLls (dados não mostrados). Estes resultados indicam que o mAb8 protege e/ou reverte a exaustão de células T.

[001148] Além disso, o efeito do mMAb8 nos macrófagos associados ao tumor foi analisado. Especificamente, as células F4/80+ CD11b+ CD45+ foram medidas e uma redução nos macrófagos associados ao tumor foi observada com o tratamento de mAb8.

[001149] Em um estudo separado, o efeito dos anticorpos anti- CD137 (ou seja, MAb1 e 3H3) em células imunes periféricas foi avaliado. Especificamente, os baços de camundongos portadores de tumor CT26 tratados com mAb1 ou 3H3 nos dias O e 3, na dose de 150 ug, foram analisados no dia 7. Como mostrado na FIG. 23, o anticorpo anti-CD137 3H3 induziu a expressão de TIGIT e PD-1 em células T CD8+ e CD4+, bem como aumentou as células CD8+ CD25+ e CD4+Foxp3+. Além disso, o 3H3 induziu as células efetoras de CD8+ e CD4+. Em contraste, o anticorpo anti-CD137 mAb1 não induziu significativamente células T CD8+TIGIT+PD- 1+, CD8+ CD25+ e CD4+ Foxp3+. Além disso, o mAb1 não induziu células de memória efetoras de CD8+ ou CD4+.

[001150] No geral, esses resultados indicam que os anticorpos anti- CD137 mAb1 e mAb8 induzem uma reprogramação imune dramática no microambiente do tumor e têm menos efeito, se houver, nas células imunes periféricas.

Exemplo 20: Aprimoramento da Ativação de Células T Murinas por Anticorpos Anti-CD137

[001151] A atividade agonística dos anticorpos anti-CD137 foi ainda analisada através da avaliação da estimulação da produção de I|L-2 em um ensaio de estimulação de ovalbumina murina. Em uma placa de 96 poços, células dendríticas tipo JAWS-Il foram plaqueadas a 10º células/poço e incubadas durante a noite na presença de IFNy murino (10 ng/mL). As células foram incubadas com 2ug/mL de peptídeo OVA/A2 e incubado por 2 horas a 37ºC, seguido de incubação com 10º células T CD8+ isoladas do baço de camundongo OT-l, que expressam OVA. Os anticorpos foram adicionados simultaneamente. Atezolizumab (anticorpo anti-PD-L1) e um anticorpo anti-PD-1 de camundongo (RMP1-14), juntamente com um controle de isotipo IgG4, foram utilizados como comparadores. A concentração de |IL-2 foi determinada por Descoberta em Mesoescala (MSD).

[001152] Conforme mostrado na FIG. 24, mAbê e mAb1O0 aumentaram significativamente a produção de IL-2.

[001153] Além de medir a produção de IL-2, as percentagens de células T CD25+ CD8+ e células TIGIT+CD8+ foram analisadas usando o mesmo ensaio de estimulação de ovalbumina murina. O anticorpo 3H3 foi incluído como um comparador. As FIGs. 25A e 25B mostram que o mAb8 e o mMAb10 aumentaram a expressão de CD25, um marcador de ativação, e pouparam a indução de TIGIT, um marcador de exaustão. Por outro lado, o 3H3 aprimorou a expressão do TIGIT.

Exemplo 21: Efeito dos Anticorpos Anti-CD137 na Indução de Citocinas

[001154] Para determinar o efeito dos anticorpos anti-CD137 na indução de citocinas pelas células T, foram utilizados anticorpos ligados à placa. Três anticorpos foram utilizados como comparadores: mAbA4, correspondente ao urelumabe (Bristol-Myers Squibb; número CAS: 934823- 49-1), um anticorpo agonístico IgG4-S228P totalmente humano que tem como alvo o domínio extracelular do CD137, mas não bloqueia a ligação ao ligante; mAb5, correspondente ao utomilumab (Pfizer; Número CAS: 1417318-27-4), um anticorpo agonista I9gG2-S228P totalmente humano que tem como alvo o domínio extracelular do CD137 e bloqueia a ligação ao ligante; e mAb6, um anticorpo agonista I9G4-S228P totalmente humano selecionado da mesma biblioteca que mAb1 e tem como alvo o domínio extracelular de CD137. O anticorpo mAb6 não bloqueia a ligação ao ligante.

[001155] As células T CD3+ humanas foram isoladas por seleção negativa e adicionadas a placas ligadas com anticorpos anti-CD137 e 1ug/ml de anti-CD3. Os anticorpos anti-CD137 foram adicionados em 1nM, 10nM, 50nNM ou 100nM. Os anticorpos foram revestidos durante a noite a 4ºC.

[001156] 72 horas após a adição das células T, níveis de IL-2, IFNy, TNFa e IL-13 foram avaliadas por kits Luminex (Luminex Corporation, Austin, TX), seguindo as instruções do fabricante. Anti-CD28 solúvel (2ug/mL) foi usado como controle de ativação de células T e a linha de base de ativação foi ajustada usando o anti-CD3 ligado à placa. A FIG. 26 mostra a alteração nas dobras em cada nível de citocina no que se refere à linha de base da ativação. O mAb4 (urelumab) mostrou o nível mais alto de indução de cada citocina, com o mAb1 mostrando um nível mais baixo de indução, mas maior em relação ao mAb5 (utomilumab) e mAb6. Estes resultados indicam que o mMAb1 agoniza CD137 menos que o mAb4 (urelumab) nas mesmas concentrações.

Exemplo 22: Indução de Interferon-gama (IFNy) por Anticorpos Anti- CD137

[001157] Para avaliar ainda mais a atividade agonística dos anticorpos anti-CD137, a produção de IFNy foi analisada em uma reação linfocitária mista (MLR). mAb2, mAb4 (urelumab), mAb5 (utomilumab) e Keytruda, um anticorpo humanizado que bloqueia PD-1 (Merck) e é conhecido por induzir IFNy produção, foram utilizados como comparadores.

[001158] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de leucopaques (HemaCare, Van Nuys, CA) derivados de três doadores humanos independentes (D985, D7603 e D5004). O total de células T foi enriquecido a partir de PBMC por seleção negativa usando separação de células imunomagnéticas (EasySep'""Y; Stemcell Technologies, Vancouver, BC). Os monócitos foram isolados de PBMCs usando separação celular imunomagnética (EasySep'"M; Stemcell Technologies, Vancouver, BC). As células T foram ressuspensas em RPM! completo a 1x10º concentração de células/ml e monócitos foram ajustados para 5x105 células/ml, respectivamente. Em uma placa de 96 poços, 100 ul de meio contendo células T foram semeados a 1x10º densidade de células/poço seguida de adição de 100 ul de suspensão de células de monócitos (razão E:T 2:1). Em seguida, foram adicionados 50 ul de meio contendo várias diluições de anticorpos CD137. As placas foram incubadas a 37ºC em uma incubadora de CO» por cinco dias. No final do período de incubação, os sobrenadantes da cultura foram coletados e os níveis de IFNy foram analisados por ensaio de MSD (Mesoscale Diagnostics, Rockville, MD). As FIGs. 27A-27C mostra a concentração de IFNy em pg/mL nas concentrações finais de anticorpos testados, conforme indicado. Estes resultados indicaram que o mAb1 agoniza CD137 menos que o mAb4 (urelumab), mas em uma extensão semelhante ao mAb5 (utomilumab) nas mesmas concentrações.

[001159] Em um estudo separado, a indução de IFNy foi medida utilizando células CHO projetadas para expressar CD32 (FCyRIIb) (células CHO-CD32). Especificamente, as células CHO-CD32 foram co-cultivadas com células T humanas na presença de anticorpos solúveis anti-CD3 e anti- CD137 mAb1, mAb8, mAb4 e mAb5.

[001160] Os PBMCs congelados foram descongelados e repousados durante a noite em meio de células T (TCM) em uma incubadora umidificada a 37ºC a 5% de CO?2. No dia seguinte, as células T CD3+ foram isoladas com um kit de isolamento de células T CD3 intocado (Stemcell 17951) antes de serem misturadas com células CHO (Gibco *% A29127) transduzidas para expressar CD32 humano (CHO-CD32), 250 ng/ml anti-

CD3 (clone OKT3) e os anticorpos anti-CD137 ou de controle. 100.000 células T foram misturadas juntamente com 50.000 células CHO-CD32. Após incubação a 37ºC por 3 dias, os sobrenadantes foram coletados para análise do interferon-gama secretado (IFNy) via MesoScale Discovery (MSD).

[001161] A FIG. 28. fornece os resultados, mostrando IFN induzido por mAb47y ao nível mais alto e em doses baixas. Por outro lado, o mAb5 não induziu quase nenhum produto de IFNy. Notavelmente, o mAb1 e o mAb8 forneceram uma resposta dependente da dose e IFN induzidoy produção entre os níveis induzidos pelo mAb4 e mAb5. No geral, esses resultados indicam que o mAb4 tem atividade superagonista, o mAb5 tem atividade mais fraca e o MAb1 e o mAb8 têm uma atividade intermediária em comparação com o mMAb4 e o mAb5.

Exemplo 23: Efeito dos Anticorpos Anti-CD137 nas Células Treg

[001162] Para caracterizar ainda mais o mecanismo de ação dos anticorpos anti-CD137, foi determinado o efeito dos anticorpos nas células Treg. Os Tregs humanos foram isolados usando o Kit de Isolamento de Células T Regulamentares EasySep'" Humanas CD4+ CD127/owCD25+ (Stemcell Technologies, Catttf 18063) e expandidos por 13 dias por imunocult anti-CD3/28 (Stemcell % 10971) em meio de célula T completo com 10% de FBS. Especificamente, as células CHO-CD32 descritas no Exemplo 21 foram co-cultivadas com células Treg humanas expandidas, marcadas com corante violeta Cell-trace (Thermo Fisher, Cat tt C34557) na presença de anti-CD3 solúvel (clone OKT3) e anticorpos anti-CD137 mAb1, mMAb8, mAb4, mAb5 e controle de isotipo. A proliferação de células Treg foi determinada no dia 4.

[001163] A FIG. 29 fornece os resultados, mostrando a proliferação de Treg fortemente induzida por mAb4, mesmo em baixas concentrações. Em contraste, o mMAb5 teve um efeito muito fraco na proliferação de Treg.

Notavelmente, o mAb1 e o mAb8 mostraram aumentos moderados na proliferação de Treg. No geral, esses resultados confirmam que o mAb4 possui atividade superagonista, o mAb5 possui atividade fraca e o mAb1 e o mAb8 possuem atividade intermediária.

Exemplo 24: Efeito dos Anticorpos Anti-CD137 na Sinalização Intracelular

[001164] Para avaliar ainda mais as diferenças entre os anticorpos agonísticos anti-CD137, a sinalização intracelular foi avaliada in vitro.

[001165] Especificamente, células T CCL-119 (ATCC; Cat & ATCC CCL-119) lentifcadas com NFKB (Qiagen; Cat 4% CLS-013L-1) ou SRF (Qiagen; Cat % CLS-010L-1) foram estimuladas com 250 ng/mL de anti-CD3 ligado à placa (clone OKT3) em conjunto com concentrações variadas de mMAb1 ligado, MAb8, mAb4, mAb5 e controle de isotipo. Após estimulação por 16 horas em meio RPM! sem aditivos, as células foram lisadas em tampão luciferase (Promega; Cat ft E263B) e as unidades de luz relativa (RLUs) foram adquiridas em um leitor de microplacas BioTek Synergy H1 (Cat tX 11-120-533). Os dados brutos de RLU foram então exportados para o Microsoft Excel e a indução de dobras foi calculada dividindo as RLUs de condições estimuladas em relação a controles não estimulados.

[001166] A FIG. 30 fornece os resultados, mostrando NFK mínimofB e atividade SRF do mAb4 e mAb5 em relação ao mAb1 e sua variante de afinidade maturada, mAb8. No geral, esses resultados indicam que o mAb1 induz sinalização intracelular de maneira diferente do MAb4 e mAb5.

Exemplo 25: Efeito dos Anticorpos Anti-CD137 na Ativação e Diferenciação de Macrófagos

[001167] Foi previamente demonstrado que a hepatotoxicidade induzida pelo anticorpo agonístico anticmCD137 3H3 estava associada à expansão de macrófagos e células T CD8+ nos fígados e aumento dos níveis de citocinas e atividade de ALT no soro. Além disso, o anticorpo 3H3 foi caracterizado como possuindo propriedades semelhantes às do urelumab. Conforme aqui descrito, o mAb1 não induz hepatotoxicidade. Consequentemente, os anticorpos agonísticos anti-CD137 foram analisados quanto ao seu efeito na ativação de macrófagos in vitro.

[001168] Especificamente, os macrófagos murinos derivados da medula óssea foram estabelecidos a partir de camundongos fêmeas C57BL/6 com 10 semanas de idade (Charles River Laboratories). Os ossos do fêmur e da tíbia foram extraídos da musculatura dos camundongos e a medula óssea foi lavada com PBS em tubos cônicos de 15 mL em gelo. As células foram centrifugadas a 1500 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi descartado. O sedimento celular foi quebrado e foram adicionados meios de cultura (RPMI, 20% de FBS, 50 uguml de M-CSF (Shenandoah Biotechnology, Inc.; Cat ft 200-08-100) e caneta/strep). As células foram filtradas em filtro de malha de 40 mícrons e semeadas em placas de Petri não tratadas com cultura de tecidos. Após 3 dias, foram adicionados 10 mL de meio a cada placa de Petri. No dia 7 da cultura, o meio foi removido e as células foram lavadas com PBS (10 mL) duas vezes. Tampão MACS (PBS, 2 uM EDTA e 0,5% de FBS) foram adicionados a cada placa e incubados a 37ºC por 10 minutos. As células foram coletadas das placas de Petri e centrifugadas a 1500 rpm por 5 minutos. Estes macrófagos derivados da medula óssea foram então estimulados com agonista TLR9 CpG na presença de 50 nm de anticorpos anti-CD137 mAb1, 3H3 ou LOB12.3 (anticorpo agonista CD137 específico de camundongo). A produção de IL-6, TNFa e IL-27 por macrófagos derivados da medula óssea de murino foi avaliada a partir de sobrenadantes da cultura após 48 horas, utilizando um ensaio de eletroquímica de incumprimento (Descoberta em Mesoescala, kit personalizado) de acordo com as instruções do fabricante. A FIG. 31 fornece os resultados, os quais indicam que o mAb1 não induziu a secreção de citocinas pró-inflamatórias por macrófagos, enquanto os anticorpos 3H3 e LOB12.3 o fizeram.

[001169] Os macrófagos derivados de monócitos humanos foram gerados por separação magnética de células CD14'* utilizando microesferas anti-CD14 (Miltenyi Biotech, Cat % 130-050-201) e com maturação de 7 dias na presença de 50ng/ml m-CSF. Os macrófagos derivados de monócitos humanos foram então estimulados com 10ng/mL de LPS na presença de 5 nm de anticorpos anti-CD137 mAb1, mAb4 ou mAb5. A produção de TNFa foi avaliada após 48 horas usando um ensaio de eletroquímica e umidade (Descoberta em Mesoescala, kit personalizado) de acordo com as instruções do fabricante. A FIG. 32. fornece os resultados, que indicam a ativação de macrófagos induzida por mAb4 e mAb5 significativamente mais do que o mAb1.

[001170] Além disso, os monócitos THP1 foram diferenciados em macrófagos com 2 uM

[001171] de 13-acetato de forbol 12-miristato (PMA; Sigma; P1585) durante a noite. Os macrófagos foram então cultivados na presença de 50nm de anticorpos anti-CD137 mAb1, mAb4 ou mAb5 e a expressão de CD64 foi medida 48 horas mais tarde usando citometria de fluxo (clone de anticorpo anti-c-humano APC CD64 10.1 APC; BioLegend; Cat %& 305013). À FIG. 33 fornece os resultados, que indicam diferenciação de macrófagos induzida por mMAb4 e mAb5 significativamente mais do que mAb1.

[001172] Embora a divulgação não esteja vinculada a nenhuma teoria ou mecanismo de ação específico, em geral, esses resultados sugerem que o mAb1 poupa a toxicidade hepática devido ao potencial reduzido para a ativação de macrófagos.

Exemplo 26: Expansão de células T CD8 humanas in vivo por anticorpos agonistas anti-CD137

[001173] Para testar o efeito de anticorpos agonísticos CD137 em células humanas in vivo, PBMCs humanos (7x10º) foram injetados por via intravenosa em camundongos NSG imunocomprometidos (NOD.Cg- Prkde* I/2rg""MISZJ; Laboratório Jacksony Cat f 005557) Os camundongos foram randomizados para grupos de 8 e receberam anticorpos CD137 (200 ug/camundongo) ou veículo controle nos dias 0,7 e

14. O sangue periférico de cada camundongo foi coletado nos dias 10, 20 e 29 para determinação de enxerto de CD45* humano (Clone de CD45 anti- FITC humano HI30; BioLegend; Cat ft 304038), CD8* (Alexa FluorO 647, clone anti-CD8a humano HIT8a; BioLegend; Cat t% 300918) e CD4* (Clone de CD4 anti-humano APC-Cy7 RPA-T4; Bd; Cat f 557871) usando citometria de fluxo.

[001174] As FIGs. 34A-34C mostram aumento geral no número de células hoD45* e hiper expansão sistêmica de células T CD8+ humanas em camundongos que receberam mAb4 à custa de células T CD4+ humanas. Notavelmente, o mAb1 não induziu a ativação excessiva de células T humanas. O potencial reduzido de mAb1 para ativar células T humanas na periferia pode contribuir para a redução do potencial de toxicidade.

TABELA 3: TABELA DE COMBINAÇÃO DE ANTICORPOS 4 | 6 ja [56 68 6 |78 8 | 4 j2 ja [5 je 70 |7 O | 4 ão a [56 68 |7 [8 fo | 4 3 ja [56 68 |72 [8 f[9& | 4 3 a [56 68 |73 [8 fo | 4 38 ja [56 68 |74 [8 [o | 4 38 ja [56 68 |7 [8 fo | 4 ja ag [56 68 |74 [8 [9 | 4 42 ja [56 68 |7 [8 [95 | 4 4 ag [56 68 |7 [8 [o | 4 ja ag [56 68 6 [8 O | [4 j165 ag [56 68 19 [10 [& | le |6 ja |5 68 6 |7% [8 | o 6 ja [58 68 6 |7% [8 | 2 6 ja ||58 68 je |78 [8 |

[MM [6 [4 Je Je [68 | [8 |) 6 6 [5 je je | |7 [8 || 8 6 [5 js je 6 |7 [8 || jo 6 [5 je je | | [8 || 2 6 [5 jog je 6 |7 [8 || 4 6 [5 je je 6 |7 [8 || 6 6 [5 je je |6& |7 [8 || [ot 6 [58 jo je 6 | [8 || [103 6 [107 |56 jeg |6& | [8 || 8 2 [4 5 jeg |70 |7 [o | 8 3 [4 |5 je |17 [8& [o || 8 32 [4 5 je |72 [8 [o | 8 3 [4 5 je |73 [8& [o || 8 38 [4 |5 jeg |7 [8 [903 || 8 38 [4 |5 jeg |7 [8 [o || 8 ja [4 |5 jeg |7 [86 [o | 8 [42 [4 |5 jeg |76 86 [o || 8 [4 [4 |5 je |7 |8& [03 || 8 ja [49 |57 je 6 8 [o | [8 [16 [49 5 jeg 19 [10 [9 | jo 2 [4 |58 jeg |70 |7 [o | jo 3 [4 |58 je |717 [8& [o || o 32 [4 j|58 je |72 [8 [o | jo 3 [4 |58 jeg |73 [8& [o || jo 38 [4 |58 je |7 [8 [903 || 0 38 [4 58 je |7 [8 [o || ja [4 |58 je |74 [86 [o | jo 42 [4 |58 je |76 86 [os || jo 4 [4 |58 je |7 |8& [03 || 0 ja [49 |58 je 6 8 [o || [10 [16 [49 j588 jeg 19 [170 [9 | 2 ja [4 |j58 jeg |70 |7 [0 | 2 3 [4 j|58 je |717 [8& [o || 2 32 [4 j58 jeg |72 [8 [o | 2 3 [4 |j58 je |73 [8 [o || 2 38 [4 |58 jeg |7 [8 [903 || 2 38 [4 |58 jeg |7 [8 [o || 2 ja [4 |58 jeg |74 [86 [o | 2 ja [4 |j58 jeg |76 [86 [os || 2 4 [4 |58 je |7 |8& [03 || 2 ja [49 |58 je 6 8 [o || 12 16 [49 j59 jeg 19 [170 [9 | mM 28 [4 je je |7 |7 [o | mM 3 [4 je je |717 [8& [o || mM 32 [4 je je |72 [8 [o | a 3 [4 je je | [8& [o || mM 38 [4 je je |7 [8 [903 || mM 38 [4 je je |7 [8 [o || mM ja [4 je je |7 [86 [o | mM ja [4 je je |76 86 [os || Ma 4 [4 je je |7 |8& [903 || mM ja [49 je je 6 8 [o || mM 1056 [49 je je [19 [170 [9 | 6 ja [5 je je |7o |7 o |

[16 [3 [5 Jo Je |717 [8& [on |) 6 32 [5 je je |72 [8 [o | 6 3 [5 je je |73 [8& [o || 6 38 [5 je je |7 [8 [og || 6 38 [5 je je |7 [8 [o || 6 ao [5 je je |7 [86 [o | 6 42 [5 je je |76 86 [os || 6 4 [50 je je |7 8 [o || 6 ja [50 je je 6 8 [o || 16 [16 [50 je jeg 19 [170 [o | 8 28 [5 js je |7 |7 [o | 8 3 [5 js je |7 [8& [o || 8 32 [5 js je |72 [8 [o | 8 3 [5 js je |73 [8& [o || 8 38 [5 js je |7 [8 [903 || 8 38 [5 js jeg |7 [8 [o || 8 ja [5 |58 je |7 [86 [o | 8 ja [5 js je |76 86 [os || 8 4 [50 |58 je |7 |8& [903 || 8 ja [5 |58 je 6 8 [o || 18 16 [5 j588 jeg 19 [170 [9 | jo 2 [5 je je |7 |7 [o | jo 3 [5 je je |717 [8& [o || jo 32 [5 je je |72 [8 [o | jo 3 [5 je je |73 [8& [o || jo 38 [5 je je |7 [8 [og || jo 38 [5 je je |7 [8 [o || jo 4 [5 je je |7 [86 [o | jo 42 [5 je je |76 86 [os || jo 4 [5 je je |7 8 [o || jo a [5 je je 6 8 [o | [20 106 [5 je je 19 [170 [o | 2 28 [52 je je |7 |7 [o | 12 3 [5 je je |717 [8& [o || 2 32 [5 jog je |72 [8 [o | 2 3 [52 jog je |73 [8& [o || 2 38 [5 je je |7 [8 [903 || 2 38 [5 je je |7 [8 [o || 2 ao [5 jog je |7 [86 [o | 2 42 [5 je je |76 86 [os || 2 4 [52 jog je |7 |8& [o || 2 a [5 jog je 6 8 [o | 2 106 [52 je jeg 19 [170 [9 | ja 28 [5 je je |7 |7 [o | 4 3 [5 je je |717 [8& [o || 4 32 [5 je je |72 [8 [o | 4 3 [5 je je |73 [8& [o || 4 38 [5 je je |7 [8 [og || 4 38 [5 je je |7 [8 [o || ja ja [5 je je |7 [86 [o | ja ja [5 je jeg |76 86 [os || a 4 [50 je je |7 |8& [03 || ja ja [5 je jeg 6 8 [o || [l24 16 [5 je je jiwQ [10 o |

[2 [2 [5 [66 68 |7o |7 [80 | 126 j3ão |56 je |68 |77 je jo || 126 j3 j|j506 je |6 |7 jê8 || || 126 j3 |j506 je |6 |733 je jo | 126 j36 |506 je |6 |74 jêg jo || 126 j38 |506 je |6 |7 ja jo || 126 j4o |506 je |6 |74 je jo | 126 j42 |j506 je |68 |76 je jo | 126 ja |506 je |68 |77 jr jog | 126 ja |j506 je |6 6 je || | 126 —j1o6 |j56 je |6 lJ19 j10 9 || [1101 128 51 j1%8 |6 |70 |7o 0 || [1101 j3ão 51 j1%g |68 |7 je jo || [1101 13 |51 j1%8 |6 |72 jê8 9 || [1101 j3a 51) j1%8 |6 |73 je jo | [1101 j3 |51 j1%8 |68 |74 jêg jo || [1101 j3 51 j1%8 |68 |7 ja 9 || [1101 jao |561 j1%8 |68 |74 je jo | [1101 ja |561) j1%8 |68 |76 je jo | [1101 ja |51) j1%8 |68 |77 jr jog | [1101 ja |561 j18 |68 6 jêe || | [1101 j1os 561) j1%68 |6 fJ19 j10 9 || [1108 28 j17 |j566 |68 |70 |79 0 || [1108 j3ã j17 |j566 |68 |77 je jo || [1108 13 j17 |j566 68 |72 jê8 9 || [1108 3a j17 |j566 |68 |733 je jo || [1108 13 j17 |j566 |68 |74 jêg jo || [1108 138 j17 |j566 |68 |7 ja jo || [1108 j4o j17 |j566 |68 |74 je jo | [1108 j4 —j17 |j566 |68 |76 je jo | [1108 ja j17 |j566 |68 |77 jr jog || [1108 ja —j17 |j566 |68 6 je || | [108 j16 j1o7 j566 68 jJ1i19 j10 9 |) TABELA 4: LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

NO 1 I9G1 humano ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV

HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR

WQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 2 IgG4 mutante | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV humano HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVES (truncamento K | K/GPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQED S228P/terminal | PEVOFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE C) YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL

VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW

QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG 3 CD137 humano | MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLAODPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPP (número de | NSFSSAGGQRTCDICRACKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGC acesso SMCEQDCKAGQAELTKKGCKDCCFGTFNDAQKRGICRPWTNCSLDGKSVL

NP 001552) VNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTA

LLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMR

PVOTTAEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 4 sequência de | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV aminoácidos SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK Vn1 DSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS

GAAGTGCAATTATTGGAATCCGGCGGCGGTTTAGTTCAGCCAGGTGG CTCTTTGAGGCTGAGTTGCGCAGCCTCTGGATTCACTTTTAGTTCGTAT

GCAATGTCGTGGGTTCGCCAGGCGCCCGGTAAGGGTCTGGAGTGGG Vi TGAGTGCTATTTCCGGCTCTGGCGGATCTACCTATTACGCCGACTCTG sequência — de | TEAMAGGTCGTTTTACCATAAGCCGCGACAATTCTAAGAATACTTTATA ácido nucleico | TETTCAMATGAATTCGCTGCGGGCAGAAGACACGGCCGTCTATTACTG

CGCAAAGGACTCACCTTTTCTATTAGACGACTACTACTACTACTACTAC

ATGGACGTATGGGGCAAGGGTACAACTGTCACCGTCTCCTCAGCTAG (9 sequência de | DIQMTOSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYA aminoácidos ASSLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQGHLFPITFGG va GTKVEIK 7 GATATTCAGATGACACAGAGCCCGTCATCAGTAAGTGCAAGCGTCGGA

GATCGGGTTACAATAACATGTCGTGCCTCGCAAGGAATTTCCTCCTGG sequência de | TIGGCCTGGTATCAGCAGAAACCTGGCAAAGCCCCCAAATTACTAATT ácido nucleico | TATGCCGCAAGCTCTCTGCAATCGGGTGTTCCTTCGCGGTTTTCTGGC vo TCTGGAAGTGGCACCGACTTCACGCTTACTATCTCTAGCCTTCAGCCG

GAGGATTTTGCTACCTACTACTGCCAACAAGGCCATTTATTCCCTATTA

CCTTTGGGGGCEGTACAMAAGTCGAGATCAAGCGTACG sequência de | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNYYAMSWVRQAPGKGLEWV aminoácidos SAIDGSGDNTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK Vr2 DSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS

GAAGTGCAATTATTGGAATCCGGCGGCGGTTTAGTTCAGCCAGGTGG CTCTTTGAGGCTGAGTTGCGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAACTATTAC

NE GCAATGTCTTGGGTTCGCCAGGCGCCCGGTAAGGGTCTGGAGTGGGT sequência — de GTCTGCAATCGATGGTTCTGGTGATAACACTACTTACGCCGACTCTGT ácido nucleico GAAAGGTCGTTTTACCATAAGCCGCGACAATTCTAAGAATACTTTATAT

CTTCAAATGAATTCGCTGCGGGCAGAAGACACGGCCGTCTATTACTGC GCAAAGGACTCACCTTTTCTATTAGACGACTACTACTACTACTACTACA

TGGACGTATGGGGCAAGGGTACAACTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC sequência de | EVALLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNYYAMSWVRQAPGKGLEWV aminoácidos AAISGSGDGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VH3 DSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS 11 GAAGTGCAATTATTGGAATCCGGCGGCGGTTTAGTTCAGCCAGGTGG

CTCTTTGAGGCTGAGTTGCGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAACTATTAC Vu3 GCAATGTCTTGGGTTCGCCAGGCGCCCGGTAAGGGTCTGGAGTGGGT sequência = de GGCAGCAATCTCTGGTTCTGGTGATGGTACTTACTACGCCGACTCTGT ácido nucleico GAAAGGTCGTTTTACCATAAGCCGCGACAATTCTAAGAATACTTTATAT

TGGACGTATGGGGCAAGGGTACAACTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC 12 VH4 EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNYYAMSWVRQAPGKGLEWV sequência de | SA/NSGSGDSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK aminoácidos DSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS 13 GAAGTGCAATTATTGGAATCCGGCGGCGGTTTAGTTCAGCCAGGTGG

NT CTCTTTGAGGCTGAGTTGCGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAACTATTAC sequência = de GCAATGTCTTGGGTTCGCCAGGCGCCCGGTAAGGGTCTGGAGTGGGT ácido nucleico GTCTGCAATCTCTGGTTCTGGTGATTCTACTTACTACGCCGACTCTGTG

AAAGGTCGTTTTACCATAAGCCGCGACAATTCTAAGAATACTTTATATC TTCAAATGAATTCGCTGCGGGCAGAAGACACGGCCGTCTATTACTGCG E E EEE

GGACGTATGGGGCAAGGGTACAACTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC 14 sequência de | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNYYAMSWVRQAPGKGLEWV aminoácidos AAISGGGDATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VH5 DSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS

GAAGTGCAATTATTGGAATCCGGCGGCGGTTTAGTTCAGCCAGGTGG

CTCTTTGAGGCTGAGTTGCGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAACTATTAC Vu5 GCAATGTCTTGGGTTCGCCAGGCGCCCGGTAAGGGTCTGGAGTGGGT sequência = de GGCAGCAATCTCTGGTGGTGGTGATGCAACTTACTACGCCGACTCTGT ácido nucleico GAAAGGTCGTTTTACCATAAGCCGCGACAATTCTAAGAATACTTTATAT

TGGACGTATGGGGCAAGGGTACAACTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC 16 sequência de | EVOLLESGGGLVOQPGGSLRLSCAASGFTFYGYAMSWVRQAPGKGLEWV aminoácidos SSISGSGDVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VH6 DSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS 7 GAAGTGCAATTATTGGAATCCGGCGGCGGTTTAGTTCAGCCAGGTGG

CTCTTTGAGGCTGAGTTGCGCAGCCTCTGGATTCACCTTTTATGGTTA VH6 CGCAATGTCTTGGGTTCGCCAGGCGCCCGGTAAGGGTCTGGAGTGGG sequência = de TGTCTTCTATCTCTGGTTCTGGTGATGTTACTTACTACGCCGACTCTGT ácido nucleico GAAAGGTCGTTTTACCATAAGCCGCGACAATTCTAAGAATACTTTATAT

TGGACGTATGGGGCAAGGGTACAACTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC sequência de | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYGYAMSWVRQAPGKGLEWYV aminoácidos AAISGSGDGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VH7 DSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS 19 GAAGTGCAATTATTGGAATCCGGCGGCGGTTTAGTTCAGCCAGGTGG

CTCTTTGAGGCTGAGTTGCGCAGCCTCTGGATTCACCTTITTATGGTTA

CGCAATGTCTTGGGTTCGCCAGGCGCCCGGTAAGGGTCTGGAGTGGG sequência de | TGEGCAGCAATCTCTGGTTCTGGTGATGGTACTTACTACGCCGACTCTG ácido nucleico | TEAMAGGTCGTTTTACCATAAGCCGCGACAATTCTAAGAATACTTTATA Vi7 TCTTCAAATGAATTCGCTGCGGGCAGAAGACACGGCCGTCTATTACTG

CGCAAAGGACTCACCTTTTCTATTAGACGACTACTACTACTACTACTAC

ATGGACGTATGGGGCAAGGGTACAACTGTCACCGTCTCCTCAGCTAG Cc sequência de | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNYAMSWVRQAPGKGLEWV aminoácidos SAISGFGESTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VH8 DSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS 21 GAAGTGCAATTATTGGAATCCGGCGGCGGTTTAGTTCAGCCAGGTGG

CTCTTTGAGGCTGAGTTGCGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGAAACTA sequência de CGCAATGTCTTGGGTTCGCCAGGCGCCCGGTAAGGGTCTGGAGTGGG ácido nucleico TGTCTGCAATCTCTGGTTTTGGTGAATCTACTTACTACGCCGACTCTGT

VB GAAAGGTCGTTTTACCATAAGCCGCGACAATTCTAAGAATACTTTATAT CTTCAAATGAATTCGCTGCGGGCAGAAGACACGGCCGTCTATTACTGC GCAAAGGACTCACCTTTTCTATTAGACGACTACTACTACTACTACTACA

TGGACGTATGGGGCAAGGGTACAACTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC 22 sequência de | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNYYAMNWVRQAPGKGLEWYV aminoácidos AAISGSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK Vo DSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS 23 GAAGTGCAATTATTGGAATCCGGCGGCGGTTTAGTTCAGCCAGGTGG sequência = de CTCTTTGAGGCTGAGTTGCGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAACTATTAC ácido nucleico GCAATGAACTGGGTTCGCCAGGCGCCCGGTAAGGGTCTGGAGTGGGT Vro GGCAGCAATCTCTGGTTCTGGTGGTAGAACTTACTACGCCGACTCTGT

GAAAGGTCGTTTTACCATAAGCCGCGACAATTCTAAGAATACTTTATAT CTTCAAATGAATTCGCTGCGGGCAGAAGACACGGCCGTCTATTACTGC E EEE RAAAE

TGGACGTATGGGGCAAGGGTACAACTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC 24 sequência de | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYGYAMSWVRQAPGKGLEWYV aminoácidos SAISGSGGNTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VH10 DSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS

GAAGTGCAATTATTGGAATCCGGCGGCGGTTTAGTTCAGCCAGGTGG

CTCTTTGAGGCTGAGTTGCGCAGCCTCTGGATTCACCTTTTATGGTTA sequência = de CGCAATGTCTTGGGTTCGCCAGGCGCCCGGTAAGGGTCTGGAGTGGG ácido nucleico TGTCTGCAATCTCTGGTTCTGGTGGTAACACTTCTTACGCCGACTCTGT Vi10 GAAAGGTCGTTTTACCATAAGCCGCGACAATTCTAAGAATACTTTATAT

TGGACGTATGGGGCAAGGGTACAACTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC 26 sequência de | EVOLLESGGGLVOQPGGSLRLSCAASGFTFYGYAMSWVRQAPGKGLEWV aminoácidos AAISGSGDSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK Vi11 DSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS 27 GAAGTGCAATTATTGGAATCCGGCGGCGGTTTAGTTCAGCCAGGTGG

CTCTTTGAGGCTGAGTTGCGCAGCCTCTGGATTCACCTTTTATGGTTA

CGCAATGTCTTGGGTTCGCCAGGCGCCCGGTAAGGGTCTGGAGTGGG sequência de | TGGCAGCAATCTCTGGTTCTGGTGATTCTACTTACTACGCCGACTCTG ácido nucleico | TEAMAGGTCGTTTTACCATAAGCCGCGACAATTCTAAGAATACTTTATA Vr11 TCTTCAAATGAATTCGCTGCGGGCAGAAGACACGGCCGTCTATTACTG

CGCAAAGGACTCACCTTTTCTATTAGACGACTACTACTACTACTACTAC

ATGGACGTATGGGGCAAGGGTACAACTGTCACCGTCTCCTCAGCTAG Cc 28 sequência de | DIQMTASPSTLSASVGDRVTITCRASQNIHNWLAWYQQKPGKAPKLLIYK aminoácidos ASGLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLAPDDFATYYCQQGDRFPLTFGG Vvi2 GTKVEIK 29 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGA

GACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAATATTCATAACTGG sequência — de | TIGGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATC ácido nucleico | TATAAGGCGTCTGGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGATTCAGCGGC v2 AGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAACCT

GATGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGGTGACAGATTCCCTCTCA

CTTTCEGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACG sequência de | DIQMTOSPSILSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKPPKLLIFKA aminoácidos SALESGVPSRFSGSGYGTDFTLTISNLAQPEDFATYFCQQGNSFPLTFGGG v3 TKVDIK 31 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCATCCTGTCTGCATCTGTAGGA

GACAGAGTCACTATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATCAGTAGGTG sequência — de | GTTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAACCCCCTAAACTCCTGAT ácido nucleico | CTTTAAGGCGTCTGCTTTAGAAAGTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGCGG v3 CAGTGGATATGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAACCTGCAGCC

TGAAGACTTTGCAACTTACTTCTGTCAACAGGGTAATAGTTTCCCTCTC

ACTTTCGGCGGAGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACG 32 sequência de | DIQMTASPSTLSASVGDRVTITCRASQNIDIWLAWYQWKPGKAPKLLIYKA aminoácidos SGLETGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLOPEDFATYYCQQGNQFPLTFGOAG

VA TRLEIK 33 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGA

GACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAATATTGATATCTGG sequência de | TIGGCCTGGTATCAGTGGAAACCAGGGAAGGCCCCTAAACTCCTGATC ácido nucleico | TATAAGGCGTCTGGTTTAGAAACTGGGGTCCCTTCAAGGTTCAGCGGC Va AGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCA

GAGGATTTTGCGACTTACTATTGTCAACAGGGTAACCAGTTCCCGCTC ACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGTACG

E Ermo] V.5 GTKVDIK

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGA

GACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATCGGTAGGTG sequência de | GTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGAT ácido nucleico | CTTTAAGGCGTCTGCTTTAGAAGTTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGG v.5 CAGTGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGC

CTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGGTAACAGTTTCCCGCT

CACTTTCGGCGGAGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACG 36 sequência de | DIQOLTASPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAA aminoácidos SALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQGDSFPLTFGGG Vv.6 TKVEIK 37 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGA

GACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAGCTG sequência — de | GTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGAT ácido nucleico | CTATGCTGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGG v6 CAGCGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCC

CGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGGTGACAGTTTCCCTCTC

ACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACG 38 sequência de | DIQMTAOSPSTLSASVGDTVTFSCRASQSINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYK aminoácidos ASALENGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLOPEDFATYYCQQGNSFPLTFGG VvL7 GTKVEIK 39 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGA

GACACAGTCACCTTCAGTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAACACCTGG sequência de | TIGGCCTGGTATCAGCAAAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTTATC ácido nucleico | TATAARGGCGTCTGCTTTAGAAAATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGC Vv7 AGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCT

GAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGGGAACAGTTTCCCTCTCA

CTTTCGGCEGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACG 40 sequência de | DIQMTASPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKA aminoácidos SALESGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLOPEDFATYYCQQGHSFPLTFGGG Vv.8 TKLEIK 41 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCOTGTCTGCATCTGTAGGA

GACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAGCTG sequência de | GTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTCAT ácido nucleico | CTATANRGGCGTCTGCTTTAGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGG v8 CGGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGC

CTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGGTCACAGTTTCCCTCT

CACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACG 42 sequência de | DIQOLTASPSSLSASVGDRVTITCRASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIFKA aminoácidos SALEGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQGNSFPITFGOG va TRLEIK 43 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGA

GACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTGACTG sequência — de | GTTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGTAAAGCCCCTAAACTCCTGAT ácido nucleico | CTTTAAGGCTTCTGCTTTAGAAGGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGG vo CAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCC

TGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGGTAACAGTTTCCCGATC

ACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGTACG 44 sequência de | DIQMTAOSPATLSASVGDRVTITCRASASVDRWLAWYQQKPGKAPNLLIYE aminoácidos ASALQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQGDSFPLTFGG VL10 GTKVEIK 45 sequência = de GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGCATCTGTTGGA ácido nucleico GACAGGGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTGTTGATAGGTG vio GTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTAAT

CTATGAGGCGTCTGCCTTACAAGGTGGGGTCCCGTCAAGGTTCAGCG GCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGC CTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGGTGATAGTTTCCCTCT

CACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACG 46 sequência de | DIQLTASPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAA aminoácidos SGLONGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLAPEDFATYYCQQGDRFPLTFGG vt GTKVEIK 47 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGA

GACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTG sequência de | GTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGAT ácido nucleico | CETATGCTGCATCCGGTTTGCAAAATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGG vo CAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCC

TGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGGTGACAGGTTCCCGCT

CACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACG [a | Vr CDR1 FTFSSYAMS [| Vr CDR1.1 FTFNYYAMS Vx CDR1.2 FTFYGYAMS Vx CDR1.3 FTFRNYAMS Vr CDR1.4 FTFNYYAMN Vr CDR1.5 FTFNYYAMXaa:, em que Xaa: = S ou N Vr CDR1.6 FTFXaa:Xaa:YAMS, em que Xaa1 = S, N, Y, R; Xaa2=S,N,Y,G 55 Vn CDR1.7 FTFXaa;Xaa: YAMXaas, em que Xaa1 = S, N, Y, R, Xaa2 = S, N, Y, G; Xaa3=SouN. Vr CDR2 SAISGSGGSTYY Vr CDR2.1 SAIDGSGDNTTY Vr CDR2.2 AAISGSGDGTYY Vr CDR2.3 SAISGSGDSTYY [ee Vr CDR2.4 AAISGGGDATYY Vr CDR2.5 SSISGSGDVTYY Vu CDR2.6 SAISGFGESTYY Vu CDR2.7 AAISGSGGRTYY Vu CDR2.8 SAISGSGGNTSY Vu CDR2.9 AAISGSGDSTYY [68 Vr CDR2.10 AAISGXaa1GXaa2Xaa3TYY, em que Xaa1 = S ou G; Xaa2 = D ou G, Xaa3 =S,RGA Vr CDR2.11 XaaiXaa:|Xaa:GXaaGXaasXaasTXaarY [68 Vx CDR3 AKDSPFLLDDYYYYYYMD

E e se — eg Es E es Es eg E e E [966 —[vrcoRa7z — | AQGXaaXaaeFPXaas TR

LAO A o 97 MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLA CD137L CPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQ humano NVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLE Uniprot ID -|LRRVVAGEGSGSVSLALHLAQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFG P41273 FOGRLLHLSAGAQRLGVHLHTEARARHAWAQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL

PSPRSE FB SINALIZAÇÃO DR

BE 101 sequência de | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNYAMSWVRQAPGKGLEWV aminoácidos SAISGSGDTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK Vn12 DSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS 102 GAAGTGCAATTATTGGAATCCGGCGGCGGTTTAGTTCAGCCAGGTGG

CTCTTTGAGGCTGAGTTGCGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGAAACTA sequência de CGCAATGTCTTGGGTTCGCCAGGCGCCCGGTAAGGGTCTGGAGTGGG ácido nucleico TGTCTGCAATCTCTGGTTCTGGTGATACTACTTACTACGCCGACTCTGT Vvu12 GAAAGGTCGTTTTACCATAAGCCGCGACAATTCTAAGAATACTTTATAT

TGGACGTATGGGGCAAGGGTACAACTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC 103 sequência de | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSYAMSWVRQAPGKGLEWYV aminoácidos SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK Vr13 DSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS 104 GAAGTGCAATTATTGGAATCCGGCGGCGGTTTAGTTCAGCCAGGTGG

CTCTTTGAGGCTGAGTTGCGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGGTTCTTA sequência = de CGCAATGTCTTGGGTTCGCCAGGCGCCCGGTAAGGGTCTGGAGTGGG ácido nucleico TGTCTGCAATCTCTGGTTCTGGTGGTTCTACTTACTACGCCGACTCTGT Vi13 GAAAGGTCGTTTTACCATAAGCCGCGACAATTCTAAGAATACTTTATAT

TGGACGTATGGGGCAAGGGTACAACTGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC 105 sequência de | DIQOLTASPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGDWLAWYQQKPGKAPKLLIYKA aminoácidos SGLOSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLAOPEDFATYYCQQGNQFPLTFGQ VL12 GTRLE 106 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGA

GACAGAGTAACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGATATTGGTGACTG sequência de | GTTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGA ácido nucleico | TETATAAGGCGTCTGGTTTACAAAGTGGGGTCCCATCAAGATTCAGTG v12 GCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACTATCAGCAACCTGCAGC

CAGAGGATTTTGCGACTTACTATTGTCAACAGGGTAACCAGTTCCCGC TCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAG

129 mAb1i cadeia | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV pesada SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK

DSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSES TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSLG 130 mAPb8 cadeia|GTEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRNYAMSWVRQAPGKGLE pesada V1 WVSAISGSGDTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC

AKDSPFLLDDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTS ESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNH

YTQKSLSLSLG 131 mAb8 cadeia| EVOLLESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTFRNYAMSWVRQAPGKGLEWV pesada V2 SAISGSGDTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK

KSLSLSLG 182 mMAbI1O cadeia | EVOQLLESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTFYGYAMSWVRQAPGKGLEWV pesada AAISGSGDSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK

KSLSLSLG 133 MAb1, mAB8 e | DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYA mAb10 cadeia | ASSLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGHLFPITFGG leve GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV

DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30-100 nM.

2. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno se liga a um epítopo no CD137 humano que compreende K114 da SEQ ID NO: 3.

3. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o epítopo compreende os resíduos E111, T113 e K114 da SEQ ID NO: 3.

4. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 3, caracterizado pelo fato de que o epítopo compreende os resíduos E111, T113, K114, N126 e 1132 da SEQ ID NO: 3.

5. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 244, caracterizado pelo fato de que o epítopo compreende os resíduos E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3.

6. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o epítopo compreende um ou mais resíduos E111, T113, K114, N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3.

7. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno se liga a um epítopo compreendendo uma sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQ ID NO: 3.

8. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o epítopo compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 resíduos de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos 111 a 135 da SEQ ID NO: 3.

9. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno se liga a um epítopo compreendendo ELTK (correspondente aos resíduos de aminoácidos 111- 114 da SEQ ID NO: 3).

10. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o epítopo compreende ainda um ou mais resíduos N126, 1132 e P135 da SEQ ID NO: 3.

11. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10, caracterizado pelo fato de que o epítopo é um epítopo não linear.

12. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 11, caracterizado pelo fato de que a mutação do resíduo K114 da SEQ ID NO: 3 anula a ligação do anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno.

13. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno se liga ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 45- 95 nM, 50-90 nM, 55-85 nM, 60-80 nM, 65-75 nM, 55-75 NM, 40-70 NM, 50- 80 nM ou 60-90 nM.

14. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,

caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno se liga a uma região de ligação não ligante do domínio extracelular do CD137 humano.

15. —Anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou parte de ligação ao antígeno: (i) liga-se ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30- 100 nM; (ii) liga-se a uma região de ligação não ligante do domínio extracelular do CD137 humano; e (iii) liga-se a um epítopo no CD137 humano incluindo K114, da SEQ ID NO: 3.

16. Anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou parte de ligação ao antígeno: (i) liga-se ao CD137 humano com uma afinidade (Kp) de cerca de 30- 100 nM; (ii) não inibe a interação entre CD137 humano e ligante CD137 humano; e (iii) liga-se a um epítopo no CD137 humano incluindo K114 da SEQ ID NO: 3.

17. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno não inibe a interação entre CD137 e CD137L.

18. —Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 15, caracterizado pelo fato de que a região de ligação não ligante abrange o domínio rico em cisteína (CRD) Ill e CRD IV.

19. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno compreende um CDR3 de cadeia pesada incluindo a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ ID NO: 126), em que X é qualquer aminoácido.

20. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 e 11-19, caracterizado pelo fato de o epítopo compreende E111, T113, Kil4 e P135 da SEQ ID NO: 3.

21. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende um CDR3 de cadeia pesada incluindo a sequência de aminoácidos DXPFXLDXXYYYYYX (SEQ ID NO: 127), em que X é qualquer aminoácido.

22. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que a mutação dos resíduos D95, L100, Y100E, Y100G, Y100H ou combinações dos mesmos, do CDR3 de cadeia pesada, à alanina resulta em perda de ligação ao CD137 humano.

23. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado pelo fato de que a mutação dos resíduos P97, F98, D100A, Y100D, Y100F ou combinações dos mesmos, à alanina resulta em redução da ligação ao CD137 humano.

24. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno não inibe a formação de um trímero de monômeros CD137:CD137L.

25. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 13, 14, 17-19 e 21-24, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno se liga a um epítopo localizado dentro dos resíduos de aminoácidos 111-135 da SEQ ID NO : 3.

26. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o epítopo é um epítopo não linear.

27. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno compreende CDRs de cadeias pesada e leve, em que CDR3 de cadeia pesada inclui a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68.

28. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno compreende CDRs de cadeias pesada e leve selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) sequências CDR1I, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente; e (b) sequências CDR1I, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 51, 108 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente.

29. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada inclui uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4 e 101; e em que a região variável de cadeia leve inclui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

30. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) SEQIDNOs:4e6, respectivamente; e (b) SEQIDNOs:101e6, respectivamente.

31. —Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4 e 101; e em que a região variável de cadeia leve inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

32. —Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve incluindo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) SEQIDNOs:4e6, respectivamente; e (b) SEQIDNOs: 101 e, respectivamente.

33. —Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno compreende cadeias pesadas e leves incluindo sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NOs: 129 e 133, respectivamente; e (b) SEQ ID NOs: 131 e 133, respectivamente.

34. —Anticorpo monocional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeias pesada e leve selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) sequências CDR1I, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente; (b) sequências CDR1I, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 70, 79 e 90, respectivamente; (c) “sequências CDR1I, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 71, 80 e 91, respectivamente;

(d) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 72, 81 e 92, respectivamente;

(e) sequências CDR1I, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 73, 82 e 91, respectivamente;

(f) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 74, 83 e 93, respectivamente;

(gd) sequências CDR1I, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 75, 84 e 91, respectivamente;

(h) sequências CDR1I, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 74, 85 e 94, respectivamente;

(i) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 76, 86 e 95, respectivamente;

() sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 77, 87 e 93, respectivamente;

(k) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 88 e 90, respectivamente;

(1) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49, 57 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

(m) sequências CDR1I, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49, 58 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

(n) sequências CDR1I, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49, 59 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

(o) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49, 60 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

(p) sequências CDR1I, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 50, 61 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

(a) sequências CDR1I, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 50, 58 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

(r) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 51, 62 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

(s) sequências CDR1I, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada apresentadas nas SEQ ID NOs: 52, 63 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

(t) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 50, 64 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve apresentadas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

(u) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 50, 65 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

(v) “sequências CDR1I, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 51, 108 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente;

(w) sequências CDRI, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 107, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 69, 78 e 89, respectivamente; e

(x) sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada estabelecidas nas SEQ ID NOs: 48, 56 e 68, respectivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve estabelecidas nas SEQ ID NOs: 109, 110 e 92, respectivamente.

35. — Anticorpo monocional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada inclui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 101 e 103; e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 6, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e

105.

36. —Anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeias pesada e leve, em que CDR3 de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68.

37. —Anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve, em que CDR3 de cadeia pesada inclui a sequência de aminoácidos DXXXXLXXXXYXYYX (SEQ ID NO: 126), em que X é qualquer aminoácido.

38. —Anticorpo monocional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende CDRs de cadeias pesada e leve, em que CDR3 de cadeia pesada inclui a sequência de aminoácidos DXPFXLDXXYYYYYX (SEQ ID NO: 128), em que X é qualquer aminoácido.

39. —Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve codificadas por sequências de nucleotídeos selecionadas do grupo que consiste em: (a) SEQIDNOs:5 e7, respectivamente; e (b) SEQIDNOs: 102 e7, respectivamente.

40. —Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizada pelo fato de que a mutação dos resíduos D95, L100, Y100E, Y100G, Y100H ou combinações dos mesmos à alanina resulta na perda da ligação ao CD137 humano.

41. —Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 40, caracterizada pelo fato de que a mutação dos resíduos P97, F98, D100A, Y100D, Y100F ou combinações dos mesmos à alanina resulta na redução da ligação ao CD137 humano.

42. —Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve codificadas por sequências de nucleotídeos que possuem pelo menos 90% de identidade com as sequências de nucleotídeos selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) SEQIDNOs:5e7, respectivamente; e (b) SEQIDNOs: 102 e7, respectivamente.

43. —Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve codificadas por sequências nucleotídicas com pelo menos 90% de identidade com as SEQ ID NOs: 5 e 7, respectivamente.

44, —Anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente a CD137 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve codificadas por sequências de nucleotídeos selecionadas do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO: 5 e 7, respectivamente; (b) SEQ ID NO: 5 e 29, respectivamente; (c) SEQ ID NO: 5 e 31, respectivamente; (d) SEQ ID NO: 5 e 33, respectivamente; (e) SEQ ID NO: 5 e 35, respectivamente; (f) SEQ ID NO: 5 e 37, respectivamente; (9) SEQ ID NO: 5 e 39, respectivamente; (h) SEQ ID NO: 5 e 41, respectivamente; (i) SEQ ID NO: 5 e 43, respectivamente; (]) SEQ ID NO: 5 e 45, respectivamente; (k) SEQ ID NO: 5 e 47, respectivamente; (1) SEQ ID NO: 9 e 7, respectivamente; (m) SEQ ID NO: 11 e 7, respectivamente; (n) SEQ ID NO: 13 e 7, respectivamente; (0) SEQ ID NO: 15 e 7, respectivamente; (p) SEQ ID NO: 17 e 7, respectivamente; (q) SEQ ID NO: 19 e 7, respectivamente; (r) SEQ ID NO: 21 e 7, respectivamente; (s) SEQ ID NO: 23 e 7, respectivamente; (t) SEQ ID NO: 25 e 7, respectivamente;

(u) SEQ ID NO: 27 e 7, respectivamente; (v) SEQ ID NO: 102 e 7, respectivamente; (w) SEQ ID NO: 104 e 7, respectivamente; e (x) SEQ ID NO: 5 e 106, respectivamente.

45. —Anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve incluindo sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) SEQIDNO:4e6, respectivamente; (b) SEQIDNO:4 «e 28, respectivamente; (c) SEQIDNO:4e30, respectivamente; (d) SEQIDNO:4 «e 32, respectivamente; (e) SEQIDNO:4 e 34, respectivamente; (f) SEQ ID NO: 4 e 36, respectivamente; (a) SEQIDNO:4 e 38, respectivamente; (h) SEQIDNO:4 e40, respectivamente; (1) SEQ ID NO: 4 e 42, respectivamente; () SEQ ID NO: 4 e 44, respectivamente; (k) SEQIDNO:48«e46, respectivamente; (c) SEQIDNO:8es6, respectivamente; (m) SEQIDNO:10eS6, respectivamente; (n) SEQIDNO:12e6, respectivamente; (o) SEQIDNO:14eS6, respectivamente; (p) SEQIDNO:16&e6, respectivamente; (a) SEQIDNO:18&e6, respectivamente; (r) SEQ ID NO: 20 e 6, respectivamente; (s) SEQIDNO:22 es, respectivamente;

(t) SEQ ID NO: 24 e 6, respectivamente; (u) SEQIDNO:26eS6, respectivamente; (v) SEQIDNO:101 e, respectivamente; (w) SEQID NO: 103 es, respectivamente; e (x) “SEQIDNO:4e105, respectivamente.

46. —Anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,26, 101 e 103; e em que a região variável de cadeia leve inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 6, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 105.

47. —Anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve incluindo sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácidos selecionadas no grupo consiste em: (a) SEQIDNO:4e6, respectivamente; (b) SEQIDNO:4 e 28, respectivamente; (c) SEQIDNO:4 «e 30, respectivamente; (d) SEQIDNO:4 e 32, respectivamente; (e) SEQIDNO:4 e 34, respectivamente; (f) SEQ ID NO: 4 e 36, respectivamente; (gq) SEQIDNO:4 e 38, respectivamente;

(h) SEQIDNO:4 e40, respectivamente; (1) SEQ ID NO: 4 e 42, respectivamente; () SEQ ID NO: 4 e 44, respectivamente; (k) SEQIDNO:48«e46, respectivamente; (c) SEQIDNO:8e6, respectivamente; (m) SEQIDNO:10eS6, respectivamente; (n) SEQIDNO:12e6, respectivamente; (o) SEQIDNO:14e6, respectivamente; (pb) SEQIDNO:16&eS6, respectivamente; (a) SEQIDNO:18&e6, respectivamente; (r) SEQ ID NO: 20 e 6, respectivamente; (s) SEQIDNO:22eS6, respectivamente; (t) SEQ ID NO: 24 e 6, respectivamente; (u) SEQIDNO:26 es, respectivamente; (v) SEQIDNO: 101 es, respectivamente; (w) SEQIDNO:103&eS6, respectivamente; e (x) “SEQIDNO:4e105, respectivamente.

48. —Anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende sequências de cadeia pesada e leve incluindo sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NOs: 129 e 133, respectivamente; e (b) SEQ ID NOs: 131 e 133, respectivamente.

49. —Anticorpo monoclional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende sequências de cadeia pesada e leve com sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 129 e 133, respectivamente.

50. —Anticorpo monocional isolado, ou sua porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno compreende sequências de cadeia pesada e leve com sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 131 e 133, respectivamente.

51. —Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno se liga especificamente a e agoniza o CD137 humano.

52. —Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno exibe pelo menos uma ou mais das seguintes propriedades selecionadas do grupo que consiste em: (a) induz ou aumenta a dimerização de trímeros CD137; (b) induz ou aumenta a multimerização de trímeros CD137; (c) induz ou aumenta a ativação de células T; (d) induz ou aumenta uma resposta de células T citotóxicas; (e) induzou aumenta a proliferação de células T; (f) induz ou aumenta a produção de citocinas de células imunes; e (g) qualquer combinação de propriedades (a)-(f).

53. —Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou antígeno exibe pelo menos uma ou mais das seguintes propriedades em relação a um anticorpo de referência que liga o CD137 humano, selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) não induz nem aumenta a ativação de células T intra- hepáticas;

(b) nãoinduz nem aumenta a proliferação intra-hepática de células T; (c) —nãoinduz nem aumenta a ativação intrasplênica de células T; (d) não induz nem aumenta a proliferação intrasplênica de células T; (e) nãoinduznem aumenta a ativação de macrófagos; (f) —nãoinduz nem aumenta a diferenciação de macrófagos; (gq) não induz nem aumenta a atividade da alanina aminotransferase (ALT); e (h) qualquer combinação de propriedades (a) - (g).

54. “Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de referência é o urelumabe.

55. —Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 54, caracterizado pelo fato de que as propriedades do anticorpo ou da porção de ligação ao antígeno não dependem da ligação ao receptor Fc.

56. Anticorpo monoclional isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 54, caracterizado pelo fato de que as propriedades do anticorpo ou da porção de ligação ao antígeno são aprimoradas pela ligação ao receptor Fc.

57. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno reage de maneira cruzada com o CD137 cinomolgo, CD137 de camundongo ou ambos.

58. —Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-47 e 51-57, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo IgG1, um IgG2, um IgG3, um IgG4, um IgM, um IgA1, um IgA2, IgD e IgE.

59. —Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgG1 ou anticorpo Ig9G4.

60. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-47 e 51-57, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humano do tipo selvagem ou IgG4 humano do tipo selvagem.

61. Anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-47 e 51-57, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada de IgG1 mutante.

62. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-47 e 51-57, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada de IgG4 mutante.

63. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada de IgG4 mutante compreende uma substituição em Ser228.

64. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada de IgG4 mutante compreende uma substituição de S228P.

65. Composição farmacêutica, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo monoclional isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

66. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência nucleotídica que codifica a cadeia leve, a cadeia pesada ou as cadeias leve e pesada do anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-64.

67. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 66.

68. Célula transformada, caracterizada pelo fato de que possui um vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 67.

69. Método para produzir um anticorpo monoclonal, ou uma porção de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao CD137 humano, caracterizado pelo fato de que o método compreende a manutenção de uma célula, de acordo com a reivindicação 68, sob condições que permitem a expressão do anticorpo monoclional ou da porção de ligação ao antígeno.

70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a obtenção do anticorpo monoclonal ou sua porção de ligação ao antígeno.

71. Método para induzir ou aprimorar a dimerização de trímeros CD137 humanos em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-64, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 65.

72. “Método para induzir ou aprimorar a multimerização de trímeros CD137 humanos em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-64, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 65.

73. “Método para induzir ou aumentar a ativação de células T em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclional isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-64, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 65 .

74. “Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a ativação das células T ocorre em um microambiente de tumor.

75. Método para induzir ou aumentar uma resposta de célula T citotóxica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-64, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 65.

76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que a resposta da célula T citotóxica ocorre em um microambiente de tumor.

77. Método para induzir ou aumentar a produção de citocinas de uma célula imune em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo em necessidade, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-64, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 65.

78. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que a citocina produzida é IL-2, TNFa, IL-13, IFNyou combinações dos mesmos.

79. Método, de acordo com a reivindicação 77 ou reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que a produção de citocinas ocorre em um microambiente de tumor.

80. Método para induzir ou melhorar a proliferação de células T em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo em necessidade da mesma, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-64, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 65 .

81. “Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que a proliferação de células T ocorre em um microambiente de tumor.

82. Método para reduzir ou inibir o crescimento de tumores, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclional isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-64, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 65.

83. Método para tratar um distúrbio mediado por CD137 humano em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-64, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 65.

84. Método para tratamento de câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclional isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-64, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 65.

85. — Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 84, caracterizado pelo fato de que a infiltração de células imunes em um microambiente de tumor é aumentada após a administração do anticorpo monoclonal isolado ou da porção de ligação ao antígeno.

86. — Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que as células imunes expressam CD45.

87. “Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 86, caracterizado pelo fato de que a quantidade de células T reguladoras (Treg) é reduzida em um microambiente tumoral após a administração do anticorpo monoclional isolado ou da porção de ligação ao antígeno.

88. — Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que as células Treg expressam CD4, FOXP-3 e CD25.

89. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 88, caracterizado pelo fato de que a quantidade de macrófagos é reduzida em um microambiente tumoral após a administração do anticorpo monoclonal isolado ou da porção de ligação ao antígeno.

90. “Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que os macrófagos expressam CD45 e CD11b.

91. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 90, caracterizado pelo fato de que a exaustão de células T é reduzida em um microambiente tumoral após a administração do anticorpo monocional isolado ou da porção de ligação ao antígeno.

92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que a redução da exaustão de células T compreende uma diminuição na expressão de TIGIT, PD-1, LAG-3 ou combinações dos mesmos.

93. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 92, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de melanoma, glioma, renal, mama, hematológico e cabeça e pescoço.

94. “Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o câncer hematológico é um linfoma de células B.

95. Método para induzir uma resposta imune à memória antitumoral, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo em necessidade da mesma, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclional isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-64, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 65.

96. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 71 a 95, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao anticorpo ou ao antígeno se liga ao receptor gama Fc.

97. “Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82 a 95, caracterizado pelo fato de que a depleção de células T CD4+, células T CD8+, células Natural Killer ou combinações das mesmas reduz a eficácia do anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno.

98. “Método para detectar a presença ou ausência de CD137 humano em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) por em contato uma amostra biológica com a porção de ligação de anticorpo ou antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, em que a porção de ligação de anticorpo ou antígeno é marcada com uma substância detectável; e (i))) detectar a porção de ligação do anticorpo ou antígeno ligada ao CD137 humano para detectar assim a presença ou ausência de CD137 humano na amostra biológica.

99. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um recipiente que inclui um anticorpo monoclional isolado ou uma porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, e um carreador farmaceuticamente aceitável opcional, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 65, e um folheto informativo incluindo instruções para administração do anticorpo ou composição farmacêutica, para tratar ou retardar a progressão do câncer ou reduzir ou inibir o crescimento de tumores em um indivíduo em necessidade do mesmo.

100. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um recipiente que inclui um anticorpo monoclional isolado ou uma porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, e um carreador farmaceuticamente aceitável opcional, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 65, e um folheto informativo incluindo instruções para administração do anticorpo ou composição farmacêutica sozinha ou em combinação com outro agente, para tratar ou retardar a progressão do câncer ou reduzir ou inibir o crescimento de tumores em um indivíduo em necessidade do mesmo.

101. Utilização de um anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-64, caracterizado pelo fato de que se dá para a fabricação de um medicamento para tratar ou retardar a progressão do câncer ou reduzir ou inibir o crescimento do tumor num indivíduo com necessidade do mesmo.

102. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, caracterizado pelo fato de que se dá na fabricação de um medicamento para tratar ou retardar a progressão do câncer ou reduzir ou inibir o crescimento do tumor em um indivíduo em necessidade do mesmo.

103. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, caracterizado pelo fato de que se dá para uso como um medicamento.