CN108367069A - 对于pd-1和ctla-4具有免疫反应性的双特异性分子及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及双特异性分子(例如，双抗体、双特异性抗体、三价结合分子等)，其具有对于PD‑1的表位免疫特异性的至少一个表位‑结合位点和对于CTLA‑4的表位免疫特异性的至少一个表位‑结合位点(即，“PD‑1xCTLA‑4双特异性分子”)。本发明的PD‑1xCTLA‑4双特异性分子能够同时结合PD‑1和结合CTLA‑4，尤其当这类分子排列在人细胞的表面上时。本发明涉及药物组合物，其包含这类PD‑1xCTLA‑4双特异性分子，并且涉及包括这类双特异性分子在治疗癌症和其他疾病和病况中的用途的方法。本发明也涉及使用这类PD‑1xCTLA‑4双特异性分子刺激免疫应答的方法。

Description

对于PD-1和CTLA-4具有免疫反应性的双特异性分子及其使用 方法
相关申请的交叉引用
本申请是美国专利申请系列号62/266,944(2015年12月14日提交；待决)的部分连续案，并且要求其优先权，该申请以其整体并入本文。
参考序列表
根据37C.F.R.1.821以及下面的条款，本申请包括一个或多个序列表，其以计算机可读的介质公开(文件名：1301_0134PCT_ST25.txt，2016年12月4日创建，大小为186,018字节)，该文件通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及双特异性分子(例如，双抗体、双特异性抗体、三价结合分子等)，其具有对于PD-1的表位免疫特异性的至少一个表位-结合位点和对于CTLA-4的表位免疫特异性的至少一个表位-结合位点(即，“PD-1 x CTLA-4双特异性分子”)。本发明涉及这类PD-1 xCTLA-4双特异性分子，其具有对于PD-1的一个(或两个)表位免疫特异性的两个表位-结合位点和对于CTLA-4的一个(或两个)表位免疫特异性的两个表位-结合位点。本发明也涉及这类PD-1 x CTLA-4双特异性分子，其另外包括免疫球蛋白Fc区。本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子能够同时结合至PD-1和结合至CTLA-4，尤其当这类分子排列在人细胞的表面上时。本发明涉及药物组合物，其包含这类PD-1 x CTLA-4双特异性分子，并且涉及包括这类双特异性分子在治疗癌症和其他疾病和病况中的用途的方法。本发明也涉及使用这类PD-1 x CTLA-4双特异性分子刺激免疫应答的方法。
背景技术
Ⅰ.免疫系统针对癌症的应答
哺乳动物免疫系统天然准备着识别和消除癌细胞(Topalian,S.L.等(2015)“Immune Checkpoint Blockade:A Common Denominator Approach to Cancer Therapy,”Cancer Cell 27:450-461)。在健康的个体中，免疫系统处于静态，受到各种不同的抑制受体和配体库(repertoire)的抑制。这类免疫“检查点”途径对于保持自身耐受性是重要的(即，防止受试者成立针对他/她自身细胞的免疫系统攻击(“自身免疫”反应)，并且在抗微生物或抗过敏免疫应答期间对于限制并生组织损伤也是重要的。在识别癌症抗原、检测微生物病原体或过敏原的存在后，一系列激活受体和配体诱导免疫系统的激活。这类激活导致巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)和抗原特异性、细胞毒性T-细胞的激活，并且促进各种细胞因子的释放，所有这些都用于抵抗对受试者健康的感知威胁(Dong,C.等(2003)“ImmuneRegulation by Novel Costimulatory Molecules,”Immunolog.Res.28(1):39-48；Viglietta,V.等(2007)“Modulating Co-Stimulation,”Neurotherapeutics 4:666-675；Korman,A.J.等(2007)“Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy,”Adv.Immunol.90:297-339)。当补偿的抑制免疫信号超过激活免疫信号时，免疫系统能够回到其正常的静态。
因此，癌症的疾病状态(事实上，感染疾病的疾病状态)可视为反映了对充分激活受试者免疫系统的失败。这样的失败可反映激活免疫信号的不充分呈递，或其可反映不能够充分缓解受试者中的抑制免疫信号。在一些情况下，研究人员已经确定了癌症细胞指派免疫系统逃避免疫系统检测(Topalian,S.L.等(2015)“Immune Checkpoint Blockade:ACommon Denominator Approach to Cancer Therapy,”Cancer Cell 27:450-461)。
尤其重要的是抗原呈递细胞的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)配体和CD4+T淋巴细胞的CD28和CTLA-4受体之间的结合(Sharpe,A.H.等(2002)“The B7-CD28Superfamily,”NatureRev.Immunol.2:116-126；Dong,C.等(2003)“Immune Regulation by NovelCostimulatory Molecules,”Immunolog.Res.28(1):39-48；Lindley,P.S.等(2009)“TheClinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation,”Immunol.Rev.229:307-321)。B7.1或B7.2与CD28的结合刺激T-细胞激活；B7.1或B7.2与CTLA-4的结合抑制这样的激活(Dong,C.等(2003)“Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,”Immunolog.Res.28(1):39-48；Lindley,P.S.等(2009)“The Clinical Utility OfInhibiting CD28-Mediated Costimulation,”Immunol.Rev.229:307-321；Greenwald,R.J.等(2005)“The B7Family Revisited,”Ann.Rev.Immunol.23:515-548)。CD28在T-细胞的表面上组成型表达(Gross,J.等(1992)“Identification And Distribution Of TheCostimulatory Receptor CD28In The Mouse,”J.Immunol.149:380–388)，而CTLA-4表达在T-细胞激活之后被快速上调(Linsley,P.等(1996)“Intracellular Trafficking OfCTLA4And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement,”Immunity 4:535–543)。因为CTLA-4是更高的亲和性受体(Sharpe,A.H.等(2002)“The B7-CD28Superfamily,”Nature Rev.Immunol.2:116-126；Topalian,S.L.等(2015)“ImmuneCheckpoint Blockade:A Common Denominator Approach to Cancer Therapy,”CancerCell 27:450-461)，因此结合首先启动T-细胞增殖(经CD28)，然后抑制T-细胞增殖(经CTLA-4的初期表达)，从而当不再需要增殖时，阻碍该作用。
II.CTLA-4
结合蛋白质-4的细胞毒性T-淋巴细胞(CTLA-4；CD152)是I型单次穿膜蛋白质，其形成二硫化物连接的同源二聚体(Schwartz J.C.等(2001)“Structural Basis For Co-Stimulation By The Human CTLA-4/B7-2 Complex,”Nature 410:604-608)。编码不同同等型(isoform)的可选的剪接变体已经被表征，包括用作单体的可溶性同等型(Magistrelli G.等(1999)“A Soluble Form Of CTLA-4 Generated By AlternativeSplicing Is Expressed By Nonstimulated Human T Cells,”Eur.J.Immunol.29:3596-3602；Oaks M.K.等(2000)“A Native Soluble Form Of CTLA-4,”Cell Immunol 201:144-153)。
CTLA-4主要是细胞内抗原，通过向细胞表面的有限运输和快速内化，其表面表达受到密切调控(Alegre M-L等(1996)“Regulation Of Surface And IntracellularExpression Of CTLA4 On Mouse T Cells,”J.Immunol.157:4762–4770；Linsley,P.S.等(1996)“Intracellular Trafficking Of CTLA-4 And Focal Localization TowardsSites Of TCR Engagement,”Immunity 4:535–543)。CTLA-4以低水平在幼稚效应T-细胞的表面上表达(Alegre,M.L.等(1996)“Regulation Of Surface And IntracellularExpression Of CTLA4 On Mouse T Cells,”J Immunol 157:4762-70)，并且在T调节细胞上组成型表达(Wang,X.B.等(2002)“Expression Of CTLA-4 By Human Monocytes,”Scand.J.Immunol.55:53-60)。
CTLA-4的细胞外区域包括单细胞外Ig(V)结构域，然后是跨膜(TM)区域和小的细胞内细胞质尾区(37个氨基酸)。细胞内尾区包含两个基于酪氨酸的基序，其与若干细胞内蛋白质，包括脂质激酶磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸酶类SHP-2和PP2A以及网格蛋白适体蛋白AP-1和AP-2相互作用(Rudd,C.E.等(2003)“Unifying Concepts In CD28,ICOS AndCTLA4 Co-Receptor Signalling,”Nat Rev Immunol.3:544-56)。CTLA-4与CD28相关，两个蛋白质在氨基酸水平具有约29％的同一性(Harper,K.(1991)“CTLA-4 And CD28Activated Lymphocyte Molecules Are Closely Related In Mouse And Human As ToSequence,Message Expression,Gene Structure,And Chromosomal Location,”J.Immunol.147:1037-1044)。
当幼稚T效应细胞通过其T-细胞受体(TCR)被激活时，CTLA-4被招募至细胞表面(Linsley,P.S.等(1996)“Intracellular Trafficking Of CTLA-4 And FocalLocalization Towards Sites Of TCR Engagement,”Immunity 4:535-43)。当CTLA-4在T-细胞表面上表达时，其与CD28(在T-细胞上组成型表达)竞争CD80/CD86，从而切断通过TCR的进一步信号传导，因此下调通过TCR信号传导的任何进一步的T-细胞应答(Carreno,B.M.等(2000)“CTLA-4(CD152)Can Inhibit T Cell Activation By Two DifferentMechanisms Depending On Its Level Of Cell Surface Expression,”J Immunol 165:1352-6；Chuang,E.等(1999)“Regulation Of Cytotoxic T Lymphocyte-AssociatedMolecule-4 By Src Kinases,”J Immunol 162:1270-7)。因此，CTLA-4用作T效应细胞激活的负调节子，其使得效应子功能消失并且控制T-细胞应答的效力和持久力(Linsley,P.S.等(1996)“Intracellular Trafficking Of CTLA-4 And Focal Localization TowardsSites Of TCR Engagement,”Immunity 4:535-43)。
另外，CTLA-4可在增强调节T-细胞对针对癌症的免疫应答的负作用中起到作用(Tai,Y.T.等(2012)“Potent in vitro And in vivo Activity Of An Fc-EngineeredHumanized Anti-HM1.24 Antibody Against Multiple Myeloma via AugmentedEffector Function,”Blood 119:2074-82)。与CD28相比，CTLA-4对于B7家族成员具有更高的亲和力，因此其在T-细胞上的表达控制T-细胞的显性(dominant)负调节(Allison,J.P.等(1995)“Manipulation Of Costimulatory Signals To Enhance Antitumor T-CellResponses,”Curr Opin Immunol 7:682-6)。还未充分理解CTLA-4有助于T调节细胞的抑制因子功能的机制，但是CTLA-4在T调节细胞上的表达增强了这些细胞的抑制功能(Tai,Y.T.等(2012)“Potent in vitro And in vivo Activity Of An Fc-Engineered HumanizedAnti-HM1.24Antibody Against Multiple Myeloma via Augmented EffectorFunction,”Blood 119:2074-82)。
据报道，CTLA-4的阻断增强了体外(Walunas,T.L.等(1994)“CTLA-4 CanFunction As A Negative Regulator Of T Cell Activation,”Immunity 1:405-413)和体内(Kearney,E.R.等(1995)“Antigen-Dependent Clonal Expansion Of A TracePopulation Of Antigen-Specific CD4+ T Cells in vivo Is Dependent On CD28Costimulation And Inhibited By CTLA-4,”J.Immunol.155:1032-1036)T-细胞应答，并且也提高了抗肿瘤免疫力(Leach,D.R.等(1996)“Enhancement Of Antitumor ImmunityBy CTLA-4Blockade,”Science 271:1734-1736)。因此，已经推荐使用抗CTLA-4抗体阻断CTLA-4，以提供针对疾病，尤其是其中免疫刺激可能是有益的人类疾病的新疗法，比如用于治疗癌症和感染性疾病(见，Leach,D.R.等(1996)“Enhancement Of Antitumor ImmunityBy CTLA-4 Blockade,”Science.271:1734-1736；和PCT公开号WO 01/14424、WO 00/37504)。CTLA-4功能的阻断剂的开发已经关注于使用单克隆抗体，比如伊匹单抗(ipilimumab)(见，例如，Hodi,F.S.等(2003)“Biologic Activity Of Cytotoxic TLymphocyte-Associated Antigen 4 Antibody Blockade In Previously VaccinatedMetastatic Melanoma And Ovarian Carcinoma Patients,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)100:4717-4717)和替西木单抗(tremelimumab)(Ribas,A.等(2005)“AntitumorActivity In Melanoma And Anti-Self Responses In A Phase I Trial With TheAnti-Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4 Monoclonal Antibody CP-675,206,”Oncologist 12:873-883)。
III.程序性死亡-1(“PD-1”)
程序性死亡-1(“PD-1”，也称为“CD279”)是广泛负调节免疫应答的T-细胞调节子的扩展的CD28/CTLA-4家族的I型膜蛋白质成员(Ishida,Y.等(1992)“Induced ExpressionOf PD-1,A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily,Upon ProgrammedCell Death,”EMBO J.11:3887-3895；美国专利申请公开号2007/0202100、2008/0311117、2009/00110667；美国专利号6,808,710、7,101,550、7,488,802、7,635,757、7,722,868；PCT公开号WO 01/14557)。
PD-1系统的受体-配体相互作用似乎比CD28/CTLA-4系统的那些甚至更复杂。PD-1在激活的T-细胞、B-细胞和单核细胞的细胞表面上表达(Agata,Y.等(1996)“ExpressionOf The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes,”Int.Immunol.8(5):765-772；Yamazaki,T.等(2002)“Expression Of Programmed Death1Ligands By Murine T-Cells And APC,”J.Immunol.169:5538-5545)并且以低水平在天然杀伤(NK)T-细胞中表达(Nishimura,H.等(2000)“Facilitation Of Beta SelectionAnd Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice,”J.Exp.Med.191:891-898；Martin-Orozco,N.等(2007)“Inhibitory Costimulation AndAnti-Tumor Immunity,”Semin.Cancer Biol.17(4):288-298)。
PD-1的细胞外区域由与CTLA-4中等同结构域具有23％同一性的单免疫球蛋白(Ig)V结构域组成(Martin-Orozco,N.等(2007)“Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,”Semin.Cancer Biol.17(4):288-298)。细胞外IgV结构域之后是跨膜区域和细胞内尾区。细胞内尾区包含位于基于免疫受体酪氨酸的抑制基序和基于免疫受体酪氨酸的转换基序中的两个磷酸化位点，这表明PD-1负调节TCR信号(Ishida,Y.等(1992)“Induced Expression Of PD-1,A Novel Member Of The Immunoglobulin GeneSuperfamily,Upon Programmed Cell Death,”EMBO J.11:3887-3895；Blank,C.等(2006)“Contribution Of The PD-L1/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion:An Update OnImplications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer,”Immunol.Immunother.56(5):739-745)。
通过结合B7-H1和B7-DC，PD-1介导其对免疫系统的抑制(也称为PD-L1和PD-L2，Flies,D.B.等(2007)“The New B7s:Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,”J.Immunother.30(3):251-260；美国专利号6,803,192、7,794,710；美国专利申请公开号2005/0059051、2009/0055944、2009/0274666、2009/0313687；PCT公布号WO 01/39722、WO02/086083)。
B7-H1和B7-DC在许多类型的人和鼠科动物组织，比如心脏、胎盘、肌肉、胎肝、脾、淋巴结和胸腺以及鼠科动物肝、肺、肾、胰腺的胰岛细胞和小肠的表面上广泛表达(Martin-Orozco,N.等(2007)“Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,”Semin.Cancer Biol.17(4):288-298)。在人中，已经发现B7-H1蛋白质在人内皮细胞(Chen,Y.等(2005)“Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal Tubular EpithelialCells,”Nephron.Exp.Nephrol.102:e81-e92；de Haij,S.等(2005)“Renal TubularEpithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And B7-H1”KidneyInt.68:2091-2102；Mazanet,M.M.等(2002)“B7-H1 Is Expressed By Human EndothelialCells And Suppresses T-Cell Cytokine Synthesis,”J.Immunol.169:3581-3588)、心肌(Brown,J.A.等(2003)“Blockade Of Programmed Death-1Ligands On Dendritic CellsEnhances T-Cell Activation And Cytokine Production,”J.Immunol.170:1257-1266)、合胞滋养层(syncyciotrophoblast)(Petroff,M.G.等(2002)“B7 Family Molecules:Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface,”Placenta 23:S95-S101)中表达。分子也由一些组织的驻留型巨噬细胞、已经被干扰素(IFN)-γ或肿瘤坏死因子(TNF)-α激活的巨噬细胞表达(Latchman,Y.等(2001)“PD-L2 Is A Second Ligand ForPD-1 And Inhibits T-Cell Activation,”Nat.Immunol 2:261-268)并在肿瘤中表达(Dong,H.(2003)“B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity,”J.Mol.Med.81:281-287)。
已经发现B7-H1和PD-1之间的相互作用为T和B-细胞提供了重要的负共刺激信号(Martin-Orozco,N.等(2007)“Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,”Semin.Cancer Biol.17(4):288-298)并且用作细胞死亡的诱导者(Ishida,Y.等(1992)“Induced Expression Of PD-1,A Novel Member Of The Immunoglobulin GeneSuperfamily,Upon Programmed Cell Death,”EMBO J.11:3887-3895；Subudhi,S.K.等(2005)“The Balance Of Immune Responses:Costimulation Verse Coinhibition,”J.Molec.Med.83:193-202)。更具体而言，已经发现低浓度的PD-1受体和B7-H1配体之间的相互作用导致强烈抑制抗原特异性CD8+ T-细胞增殖的抑制信号的传输；在更高的浓度下，与PD-1的相互作用不抑制T细胞增殖但是显着减少多种细胞因子的产生(Sharpe,A.H.等(2002)“The B7-CD28 Superfamily,”Nature Rev.Immunol.2:116-126)。已经发现可溶性B7-H1-Fc融合蛋白抑制静息和先前激活的CD4和CD8T-细胞，以及甚至来自脐带血的幼稚T-细胞的T细胞增殖和细胞因子产生(Freeman,G.J.等(2000)“Engagement Of The PD-1Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To NegativeRegulation Of Lymphocyte Activation,”J.Exp.Med.192:1-9；Latchman,Y.等(2001)“PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation,”NatureImmunol.2:261-268；Carter,L.等(2002)“PD-1:PD-L Inhibitory Pathway Affects BothCD4(+)and CD8(+)T-cells And Is Overcome By IL-2,”Eur.J.Immunol.32(3):634-643；Sharpe,A.H.等(2002)“The B7-CD28 Superfamily,”Nature Rev.Immunol.2:116-126)。
B7-H1和PD-1在抑制T-细胞激活和增殖中的作用已经提示这些生物分子可能用作用于治疗炎症和癌症的治疗性靶。因此，已经建议了抗PD-1抗体治疗感染和肿瘤以及上调适应性免疫应答的用途(见，美国专利申请公开号2010/0040614、2010/0028330、2004/0241745、2008/0311117、2009/0217401；美国专利号7,521,051、7,563,869、7,595,048；PCT公布号WO 2004/056875、WO 2008/083174)。下述文献已经报道了能够特异性结合PD-1的抗体：Agata,T.等(1996)“Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface OfStimulated Mouse T And B Lymphocytes,”Int.Immunol.8(5):765-772；和Berger,R.等(2008)“Phase I Safety And Pharmacokinetic Study Of CT-011,A HumanizedAntibody Interacting With PD-1,In Patients With Advanced HematologicMalignancies,”Clin.Cancer Res.14(10):3044-3051(也见，美国专利号8,008,449和8,552,154；美国专利公开号2007/0166281、2012/0114648、2012/0114649、2013/0017199、2013/0230514和2014/0044738；和PCT专利公开号WO 2003/099196、WO 2004/004771、WO2004/056875、WO 2004/072286、WO 2006/121168、WO 2007/005874、WO 2008/083174、WO2009/014708、WO 2009/073533、WO 2012/135408、WO 2012/145549和WO 2013/014668)。
但是，尽管所有这些现有技术的进步，仍需要改善的组合物，其能够更有力地引导身体的免疫系统攻击癌细胞或病原体感染的细胞，尤其以较低的治疗性浓度和/或减少的副作用。尽管适应性免疫系统可以是抵抗癌症和疾病的有力防御机制，但是其经常在肿瘤微环境中受到免疫抑制/逃避机制的阻碍，比如PD-1和CTLA-4的表达。此外，在肿瘤环境(milieu)中由肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞表达的共抑制分子可明显减弱针对癌细胞的T-细胞应答。另外，抗CTLA-4抗体的使用诱导称为“免疫相关的不利事件”(irAE)的被认同的副作用。IrAE包括结肠炎/腹泻、皮炎、肝炎、内分泌病和炎性肌病。据报道，这些独特的副作用的出现时由于在CTLA-4阻断时打破了免疫耐受(Di Giacomo,A.M.等(2010)“TheEmerging Toxicity Profiles Of Anti-CTLA-4抗体Across Clinical Indications,”Semin Oncol.37:499-507)。因此，克服这些局限的疗法将是非常有益的。
如下面详细地描述，本发明通过提供PD-1 x CTLA-4双特异性分子解决了这样的需要。这类双特异性分子能够结合存在于衰竭的和耐受的肿瘤浸润淋巴细胞和其他细胞类型表面上的PD-1和CTLA-4分子，从而能够损害这类细胞-表面分子响应他们各自配体的能力。因此，本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子用于阻断PD-1-和CTLA-4介导的免疫系统抑制，以便促进免疫系统的激活或继续激活。这些属性允许这类双特异性分子在刺激免疫系统方面，尤其在治疗癌症和病原体相关的疾病和病况方面具有效应。本发明涉及这些和其他目标。
发明内容
本发明涉及双特异性分子(例如，双抗体、双特异性抗体、三价结合分子等)，其具有对于PD-1的表位免疫特异性的至少一个表位-结合位点和对于CTLA-4的表位免疫特异性的至少一个表位-结合位点(即，“PD-1 x CTLA-4双特异性分子”)。本发明涉及这类PD-1 xCTLA-4双特异性分子，其具有对于PD-1的一个(或两个)表位免疫特异性的两个表位-结合位点和对于CTLA-4的一个(或两个)表位免疫特异性的两个表位-结合位点。本发明也涉及这类PD-1 x CTLA-4双特异性分子，其另外包括免疫球蛋白Fc区。本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子能够同时结合PD-1和CTLA-4，尤其当这类分子排列在人细胞的表面上时。本发明涉及药物组合物，其包含这类PD-1 x CTLA-4双特异性分子，并且涉及包括使用这类双特异性分子治疗癌症和其他疾病和病况的方法。本发明也涉及使用这类PD-1 x CTLA-4双特异性分子刺激免疫应答的方法。
详细地，本发明提供了双特异性分子，其具有能够免疫特异性结合PD-1的表位(一个或多个)的一个或多个表位-结合位点和能够免疫特异性结合CTLA-4的表位(一个或多个)的一个或多个表位-结合位点，其中分子包括：
(A)结合PD-1的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域；和
(B)结合CTLA-4的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域；
其中双特异性结合分子是：
(i)双抗体，所述双抗体是共价结合的复合物，其包括两条、三条、四条或五条多肽链；或
(ii)三价结合分子，所述三价结合分子是共价结合的复合物，其包括三条、四条、五条或更多条多肽链。
本发明涉及这类双特异性分子的实施方式，其中双特异性结合分子展示的活性相对于由两个单特异性分子展示的这样的活性增强了，在所述两个单特异性分子中，其中一个单特异性分子具有结合PD-1的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域，另一个单特异性分子具有结合CTLA-4的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。
本发明涉及所有这类双特异性分子的实施方式，其中当施用至需要其的受试者时，相对于通过施用结合CTLA-4的单特异性抗体，比如伊匹单抗引起的这类irAE，所述分子引起较少的免疫相关的不利事件(irAE)。
本发明另外涉及这类双特异性分子的实施方式，其中分子包括Fc区。本发明另外涉及这类双特异性分子的实施方式，其中Fc区是变异的Fc区，其包括：
(A)降低变异的Fc区对FcγR的亲和力的一个或多个氨基酸修饰；和/或
(B)延长变异的Fc区的血清半衰期的一个或多个氨基酸修饰。
本发明另外涉及这类双特异性分子的实施方式，其中降低变异的Fc区对FcγR的亲和力的修饰包括下述取代：L234A；L235A；或L234A和L235A，其中编号是如Kabat中EU索引的编号。
本发明另外涉及这类双特异性分子的实施方式，其中延长变异的Fc区的血清半衰期的修饰包括下述取代：M252Y；M252Y和S254T；M252Y和T256E；M252Y、S254T和T256E；或K288D和H435K，其中编号是如Kabat中EU索引的编号。
本发明另外涉及所有这类双特异性分子的实施方式，其中分子是双抗体并且包括能够免疫特异性结合PD-1的表位的两个表位-结合位点和能够免疫特异性结合CTLA-4的表位的两个表位-结合位点。
本发明另外涉及所有这类双特异性分子的实施方式，其中分子是三价结合分子并且包括能够免疫特异性结合PD-1的表位的两个表位-结合位点和能够免疫特异性结合CTLA-4的表位的一个表位-结合位点。
本发明另外涉及所有这类双特异性分子的实施方式，其中能够结合PD-1和CTLA-4分子的分子存在于细胞表面上。
本发明另外涉及所有这类双特异性分子的实施方式，其中分子能够同时结合PD-1和CTLA-4。
本发明另外涉及所有这类双特异性分子的实施方式，其中分子促进免疫细胞的刺激，尤其是，其中免疫细胞的刺激导致：
(A)免疫细胞增殖；和/或
(B)免疫细胞产生和/或释放至少一种细胞因子；和/或
(C)免疫细胞产生和/或释放至少一种裂解分子；和/或
(D)至少一种激活标志物的免疫细胞表达。
本发明另外涉及所有这类双特异性分子的实施方式，其中免疫细胞是T-淋巴细胞或NK-细胞。
本发明另外涉及所有这类双特异性分子的实施方式，其中能够免疫特异性结合PD-1的表位的表位-结合位点包括：
(A)PD-1 mAb 1的VH结构域(SEQ ID NO:47)和PD-1 mAb 1的VL结构域(SEQ IDNO:48)；或
(B)PD-1 mAb 2的VH结构域(SEQ ID NO:49)和PD-1 mAb 2的VL结构域(SEQ IDNO:50)；或
(C)PD-1 mAb 3的VH结构域(SEQ ID NO:51)和PD-1 mAb 3的VL结构域(SEQ IDNO:52)；或
(D)PD-1 mAb 4的VH结构域(SEQ ID NO:53)和PD-1 mAb 4的VL结构域(SEQ IDNO:54)；或
(E)PD-1 mAb 5的VH结构域(SEQ ID NO:55)和PD-1 mAb 5的VL结构域(SEQ IDNO:56)；或
(F)PD-1 mAb 6的VH结构域(SEQ ID NO:57)和PD-1 mAb 6的VL结构域(SEQ IDNO:58)；或
(G)PD-1 mAb 6-I VH的VH结构域(SEQ ID NO:86)和PD-1 mAb 6-SQ VL的VL结构域(SEQ ID NO:87)；或
(H)PD-1 mAb 7的VH结构域(SEQ ID NO:59)和PD-1 mAb 7的VL结构域(SEQ IDNO:60)；或
(I)PD-1 mAb 8的VH结构域(SEQ ID NO:61)和PD-1 mAb 8的VL结构域(SEQ IDNO:62)。
本发明另外涉及所有这类双特异性分子的实施方式，其中能够免疫特异性结合CTLA-4的表位的表位-结合位点包括：
(A)CTLA-4 mAb 1的VH结构域(SEQ ID NO:76)和CTLA-4 mAb 1的VL结构域(SEQID NO:77)；或
(B)CTLA-4 mAb 2的VH结构域(SEQ ID NO:78)和CTLA-4 mAb 2的VL结构域(SEQID NO:79)；或
(C)CTLA-4 mAb 3的VH结构域(SEQ ID NO:90)和CTLA-4mAb 3的VL结构域(SEQ IDNO:91)。
本发明另外涉及这类双特异性分子的实施方式，其中：
(A)能够免疫特异性结合PD-1的表位的表位-结合位点包括PD-1 mAb 6-I VH的VH结构域(SEQ ID NO:86)和PD-1 mAb 6-SQ的VL结构域(SEQ ID NO:87)；和
能够免疫特异性结合CTLA-4的表位的表位-结合位点(一个或多个)包括CTLA-4mAb 3的VH结构域(SEQ ID NO:90)和CTLA-4 mAb 3的VL结构域(SEQ ID NO:91)。
本发明另外涉及所有这类双特异性分子的实施方式，其中分子包括：
(A)具有SEQ ID NO:95的两条多肽链，和具有SEQ ID NO:96的两条多肽链；或
(B)具有SEQ ID NO:97的两条多肽链，和具有SEQ ID NO:98的两条多肽链；或
(C)具有SEQ ID NO:99的两条多肽链，和具有SEQ ID NO:100的两条多肽链；或
(D)具有SEQ ID NO:102的两条多肽链，和具有SEQ ID NO:103的两条多肽链；或
(E)具有SEQ ID NO:101的两条多肽链，和具有SEQ ID NO:100的两条多肽链；或
(F)具有SEQ ID NO:104的一条多肽链，具有SEQ ID NO:105的一条多肽链，具有SEQ ID NO:106的一条多肽链，和具有SEQ ID NO:107的一条多肽链；或(G)具有SEQ ID NO:108的一条多肽链，具有SEQ ID NO:105的一条多肽链，具有SEQ ID NO:109的一条多肽链，和具有SEQ ID NO:107的一条多肽链。
本发明另外涉及这类双特异性分子的实施方式，其中分子包括白蛋白-结合结构域，尤其是去免疫化的白蛋白-结合结构域。
本发明另外涉及药物组合物，其包括有效量的任何这类双特异性分子和药学上可接受的载体。
本发明另外涉及这类药物组合物或任何上述双特异性分子促进需要其的受试者的免疫介导的应答的刺激的用途，尤其地，其中这类分子促进免疫细胞的刺激，尤其是NK-细胞和/或T-淋巴细胞的刺激。本发明尤其涉及这样的实施方式，其中这样的刺激导致免疫细胞增殖、免疫细胞产生和/或细胞因子(例如，IFNγ、IL-2、TNFα等)的释放，免疫细胞产生和/或裂解分子(例如，粒酶、穿孔蛋白等)的释放，和/或激活标志物(例如，CD69、CD25、CD107a等)的免疫细胞表达。本发明进一步涉及治疗癌症或其他疾病的方法，其涉及使用或施用任何上述PD-1 x CTLA-4双特异性分子，以刺激免疫介导的应答。本发明尤其涉及这样的实施方式，其中任何上述PD-1 x CTLA-4双特异性分子的免疫刺激活性比联合或组合施用单独的抗PD-1抗体和单独的抗CTLA-4抗体(尤其地，其中这类抗体对于这类分子是单特异性的)更有效。本发明也涉及这样的实施方式，其中相对于通过联合或组合施用单独的抗PD-1抗体和单独的抗CTLA-4抗体刺激的这类细胞展示的增殖、细胞因子(例如，IFNγ、IL-2、TNFα等)的产生和/或释放、裂解分子的产生和/或释放，和/或激活标志物的表达，被上述PD-1 x CTLA-4双特异性分子刺激的免疫细胞，尤其是NK-细胞和/或T-淋巴细胞展示增强的增殖、改变的细胞因子(例如，IFNγ、IL-2、TNFα等)的产生和/或释放、改变的裂解分子的产生和/或释放，和/或改变的激活标志物的表达。本发明也涉及这样的实施方式，其中上述PD-1 x CTLA-4双特异性分子具有降低的irAE的发生率。本发明另外涉及这样的实施方式，其中任何上述PD-1 x CTLA-4双特异性分子被用于治疗与受抑制的免疫系统相关的疾病或病况，尤其是癌症或感染。
本发明另外涉及治疗与受抑制的免疫系统相关的疾病或病况的用途，或在治疗这类疾病或病况中的用途。本发明尤其涉及在治疗与受抑制的免疫系统相关的疾病或病况中的这类用途，或其中疾病或病况是癌症或感染(尤其地，感染特征在于存在细菌、真菌、病毒或原生动物病原体)的用途。
本发明尤其涉及这类用途，其中：
用途是治疗癌症，并且癌症特征在于存在选自由以下的细胞组成的组的癌症细胞：肾上腺肿瘤、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色细胞肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生小圆细胞瘤、室管膜细胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、不完全性骨纤维生成、骨的纤维发育异常、胆囊癌或胆管癌、胃癌、妊娠滋养层疾病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性的脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌、甲状旁腺瘤、儿科癌症、周围神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、眼色素层后黑素瘤(posterious uvealmelanoma)、罕见血液学疾病、肾转移癌症、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌和子宫癌；或
(A)用途是治疗感染，并且感染是慢性病毒、细菌、真菌和寄生虫感染，特征在于存在爱泼斯坦-巴尔病毒，甲肝病毒(HAV)；乙肝病毒(HBV)；丙肝病毒(HCV)；疱疹病毒(例如HSV-1、HSV-2、HHV-6、CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、水泡性口炎病毒(VSV)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、霍乱(Cholera)、白喉(Diphtheria)、肠杆菌属(Enterobacter)、淋球菌(Gonococci)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、脑膜炎球菌(Meningococci)、分歧杆菌(mycobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、Pneumonococci、立克次氏体细菌(rickettsia bacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷菌属(Serratia)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌属(Streptococci)、破伤风(Tetanus)、曲霉菌属(Aspergillus)(烟曲霉(A.fumigatus)、黑曲霉(A.niger)等)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、念珠菌属(Candida)(白色念珠菌(C.albicans)、克柔假丝酵母(C.krusei)、光滑念珠菌(C.glabrata)、热带念珠菌(C.tropicalis)等)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、毛霉目(Mucorales)的属(毛霉属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizopus))、申克氏胞丝菌(Sporothrix schenkii)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球霉菌(Coccidioides immitis)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、细螺旋体病(Leptospirosis)、包柔氏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、蠕虫寄生虫(钩虫、绦虫、吸虫、扁形虫(例如血吸虫(Schistosomia))、蓝氏贾第虫(Giardia lambia)、旋毛虫(trichinella)、脆双核阿米巴(Dientamoeba Fragilis)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)和杜氏利什曼虫(Leishmania donovani)。
本发明尤其涉及在治疗癌症中的这类用途，其中癌症是结直肠癌、肝细胞癌、神经胶质瘤、肾癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、膀胱癌、成神经细胞瘤；肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、急性髓细胞样白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性B成淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、急性浆细胞样树突细胞肿瘤(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括套细胞白血病(MCL)，和小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系统性肥大细胞增多症，或伯基特淋巴瘤。
附图说明
图1提供了具有两个表位-结合位点的代表性共价结合的双抗体的示意图，其包括两条多肽链，每条多肽链各具有E-螺旋或K-螺旋异源二聚体促进结构域(下面提供了可选的异源二聚体促进结构域)。半胱氨酸残基可存在于连接体和/或异源二聚体促进结构域中，如图3B中显示。识别相同表位的VL和VH结构域使用相同的阴影或填充式样显示。
图2提供了具有两个表位-结合位点的代表性共价结合的双抗体分子的示意图，其包括两条多肽链，每条多肽链各具有CH2和CH3结构域，使得缔合的链形成所有的或部分Fc区。识别相同表位的VL和VH结构域使用相同的阴影或填充式样显示。
图3A-3C提供了显示具有四个表位-结合位点的代表性共价结合的四价双抗体的示意图，其包括两对多肽链(即，总共四条多肽链)。每对的一条多肽具有CH2和CH3结构域，以便缔合的链形成所有的或部分Fc区。识别相同表位的VL和VH结构域使用相同的阴影或填充式样显示。两对多肽链可以相同。在其中两对多肽链相同并且VL和VH结构域识别不同表位的这类实施方式中(如图3A-3B中显示)，所得分子具有四个表位结合位点，并且就每个结合的表位而言是双特异性的和二价的。在其中VL和VH结构域识别相同的表位的这样的实施方式中(例如，相同的VL结构域CDR和相同的VH结构域CDR用在两条链上)，所得分子具有四个表位结合位点，并且就单个表位而言是单特异性的和四价的。可选地，两对多肽可以不同。在其中两对多肽链不同并且每对多肽的VL和VH结构域识别不同的表位的这类实施方式中(如通过图3C中不同的阴影和式样显示)，所得分子具有四个表位-结合位点，并且就每个结合的表位而言，是四特异性的和单价的。图3A显示了包含Fc区的双抗体，其包含包括半胱氨酸残基的肽异源二聚体促进结构域。图3B显示了包含Fc区的双抗体，其包含包括半胱氨酸残基的E-螺旋和K-螺旋异源二聚体促进结构域和连接体(具有任选的半胱氨酸残基)。图3C显示了包含Fc区的双抗体，其包含抗体CH1和CL结构域。
图4A和4B提供了包括三条多肽链的、具有两个表位结合位点的代表性共价结合的双抗体分子的示意图。多肽链中的两条各具有CH2和CH3结构域，以便缔合的链形成所有或部分Fc区域。包括VL和VH结构域的多肽链进一步包括异源二聚体促进结构域。识别相同表位的VL和VH结构域使用相同的阴影或填充图案显示。
图5提供了包括五条多肽链的、具有四个表位结合位点的代表性共价结合的双抗体分子的示意图。多肽链中的两条各具有CH2和CH3结构域，以便缔合的链形成包括所有或部分Fc区域的Fc区域。包括连接的VL和VH结构域的多肽链进一步包括异源二聚体促进结构域。识别相同表位的VL和VH结构域使用相同的阴影或填充图案显示。
图6A-6F提供了包含Fc区域的代表性三价结合分子的示意图，所述三价结合分子具有三个表位结合位点。图6A和6B分别示意性阐释了三价结合分子的结构域，所述三价结合分子包括具有不同结构域取向的两个双抗体型结合结构域和Fab型结合结构域，其中双抗体型结合结构域在Fc区域的N-末端或C-末端。图6A和6B中的分子包括四条链。图6C和6D分别示意性阐释了三价结合分子的结构域，所述三价结合分子包括在Fc区域的N-末端的两个双抗体型结合结构域，和连接的Fab型结合结构域，或scFv型结合结构域。图6E和6F中的三价结合分子分别示意性地阐释了三价结合分子的结构域，所述三价结合分子包括在Fc区的C-末端的两个双抗体型结合结构域，和其中轻链和重链经多肽间隔体连接的Fab型结合结构域，或scFv型结合结构域。图6C-6F中的三价结合分子包括三条链。识别相同表位的VL和VH结构域使用相同的阴影或填充式样显示。
图7通过显示示例性双特异性分子(PD-1 x LAG-3双特异性分子，命名为DART A)能够刺激细胞因子产生，达到比在联合或组合施用亲本抗PD-1和抗LAG-3抗体后观察到的水平更高的水平，阐释了本发明的原理。显示了来自用SEB(0.5ng/mL)刺激和用示例性双特异性分子(PD-1 x LAG-3双特异性分子DART A)或用抗PD-1和抗LAG-3抗体单独或组合处理的代表性供体的PBMC的IFNγ分泌特征。
图8A-8D显示了ELISA研究的结果，其测量了连续稀释的结合分子与人CTLA-4和人PD-1的结合。图8A-8B显示了CTLA-4 mAb 3 G4P、DART D、TRIDENT A或DARTB与已经涂覆到支撑板上的可溶性hCTLA-4-Avi-His(1μg/mL)(图8A)或hPD-1-His(1μg/mL)(图8B)的结合曲线。山羊抗人-Fc-HRP(1:10,000)用作二级检测分子以检测结合。图8C-8D显示了关于改变取向和结合结构域对结合的影响的研究的结果。在存在已经涂覆到支撑板上的可溶性人PD-1(图8C)或可溶性人CTLA-4-Avi-His(图8D)的情况下，温育包括CTLA-4mAb 1(例如，DART B)和CTLA-4mAb 3(例如，DART C和DART D)的CTLA-4结合结构域的PD-1 x CTLA-4双特异性分子。山羊抗人-Fcγ-HRP用作二级检测分子，以使用PICO化学发光底物检测结合。
图9A-9E显示了对DART D、TRIDENT A、PD-1 mAb 6 G4P和CTLA-4 mAb 3 G4P和对照三叉分子(trident)(具有针对RSV的两个结合位点和针对CTLA-4的一个结合位点)单独或以组合方式阻断结合配体与PD-1和CTLA-1结合的能力的评估的结果。使用ELISA试验，在存在等量的不相干抗原的情况下(图9A)和在存在等量的CTLA-4的情况下(图9B)，评估对PD-L1结合PD-1的阻断，并且，在存在等量的不相干抗原的情况下(图9C)和在存在等量的PD-1的情况下(图9D)和在存在四倍PD-1的情况下(图9E)评估对B7-1结合CTLA-4的阻断。
图10A-10B显示了对DART B、DART D、TRIDENT A、抗CTLA-4抗体CTLA-4 mAb 1、CTLA-4 mAb 3 G4P和hIgG对照抗体结合表达食蟹猴CTLA-4(图10A)或人CTLA-4(图10B)的CHO细胞的能力的评估的结果。使用抗人Fc二级抗体检测结合。
图11A-11B显示了对DART C、DART D、DART E、TRIDENT A、抗CTLA-4抗体CTLA-4mAb 1、CTLA-4 mAb 3 G1AA和抗PD-1抗体PD-1 mAb 6 G4P结合Jurkat细胞(其在它们的表面上表达huCTLA-4而不是PD-1)的能力的评估的结果。使用抗人FC二级抗体检测DART和TRIDENT分子与人CTLA-4的结合(FACS)。图11A显示了DART C、DART D、DART E、CTLA-4 mAb1、CTLA-4 mAb 3 G1AA和PD-1 mAb 6 G4P的结果。图11B显示了CTLA-4 mAb 1、CTLA-4 mAb3 G1AA、PD-1 mAb 6 G4P和TRIDENT A的结果。
图12A-12B显示了在基于细胞的试验中，对于DART D、TRIDENT A和抗CTLA-4抗体CTLA-4 mAb 1、CTLA-4 mAb 3 G1AA阻断CTLA-4配体B7-1和B7-2的能力的评估的结果。在存在Jurkat细胞和人工抗原呈递细胞(Promega)的情况下温育B7-1和B7-2的His标记的衍生物。使用抗His抗体检测His-B7-1和His-B7-2的结合。该评估的结果显示在图12A(His-B7-1)和图12B(His-B7-2)中。
图13显示了对DART C、DART D、TRIDENT A、CTLA-4mAb 3 G1AA和PD-1 mAb 6 G4P逆转(reverse)CTLA-4免疫检查点抑制信号的能力的评估的结果，如在IL-2/Luc-Jurkat-CTLA-4报告试验中通过增加的荧光素酶表达所显示的。在37℃，在存在所列举的结合分子(R:S＝1:0.3)的情况下温育IL-2/Luc-Jurkat-CTLA-4细胞30min，之后添加人工抗原呈递Raji细胞并且继续温育6小时。通过荧光素酶试验测定CTLA-4免疫检查点抑制信号的逆转。
图14显示了对DART D、TRIDENT A、PD-1 mAb 6 G4P和CTLA-4 mAb 3G1AA结合表达PD-1但是不表达CTLA-4的NSO细胞的能力的评估的结果。在存在细胞的情况下温育结合分子并且测量细胞的平均荧光指数。
图15A-15B显示了在基于细胞的试验中，对DART D、TRIDENT A、PD-1mAb 6 G4P和CTLA-4 mAb 3 G1AA阻断PD-1以及其配体PD-L1和PD-L2之间结合的能力的评估的结果。在存在这类结合分子的情况下温育PD-L1-PE或PD-L2-PE并且使用FACS评估它们结合NSO-PD-1细胞的能力。图15A(PD-L1)；图15B(PD-L2)。
图16显示了对DART D、TRIDENT A、CTLA-4 mAb 3 G1AA和PD-1 mAb 6 G4P阻断由PD-1/PD-L1相互作用导致的免疫抑制的能力的评估的结果。在存在PD-L1+CHO和Jurkat效应细胞的情况下温育结合分子，并且通过追踪CD3介导的激活的程度评估结合分子阻断免疫抑制(通过阻断PD-1/PD-L1相互作用)的能力(如通过在NFAT-luc/PD-1Jurkat试验中增加的荧光素酶表达所显示的；Promega)。
图17显示了在酶-片段互补试验中通过DiscoverX对DART D、TRIDENT A和阴性对照抗体共连接PD-1和CTLA-4的能力的评估的结果。将DiscoverX CP5铺板培养基中的U2OSCTLA-4(1-195)-PK PD-1(1-199)-EA细胞系#9的等分试样一式四份以5,000个细胞/孔铺在384孔平板上。使细胞在37℃/5％CO2附着4小时。然后，将每种结合分子的11点、1:3稀释系列添加至PD-1–CTLA-4细胞并且将DART D和TRIDENT A样品添加至PD-1–LAG-3细胞。使平板在37℃/5％CO2温育过夜(16hrs)。将PathHunter检测试剂添加至孔，其接着在室温在黑暗中温育1小时，然后在Envision亮度计上读取平板。
图18显示了对DART D、TRIDENT A、CTLA-4mAb 3 G1AA、PD-1 mAb 6 G4P以及CTLA-4 mAb 3 G1AA/PD-1 mAb 6 G4P的组合(Ab Combo 1)增强混合的淋巴细胞反应应答的能力的评估的结果。通过用GM-CSF(在温育期间第1天提供)和IL-4(在温育期间第7天提供)处理CD14+单核细胞产生单核细胞衍生的树突细胞。在温育期间第8天，通过用单核细胞衍生的树突细胞(在温育期间第8天提供)和抗CTLA-4和抗PD-1结合分子(在温育期间第8天提供)温育CD4+T细胞而引起MLR。IFN-γ的释放绘制在图18中。发现双特异性DART D和TRIDENT A分子两者相同程度地增强MLR应答或比单独的亲本抗体的组合稍好。呈现的数据包括七个系列(均与不同的结合分子相关：hIgG4对照；PD-1 mAb 6 G4P；CTLA-4 mAb 3 G1AA；CTLA-4mAb 3 G1AA/PD-1 mAb 6 G4P的组合(Ab Combo 1)；DART D；TRIDENT A；和hIgG1对照，分别从左到右)；每个系列包括6个柱子(均与提供的分子的不同浓度相关：0.016、0.08、0.4、2、10或50nM，分别从左到右)。
图19A-19D显示了使用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)肠毒素B型(SEB)再刺激试验，施用DART D、TRIDENT A、CTLA-4 mAb 3 G1AA、PD-1 mAb 6 G4P和CTLA-4mAb 1/PD-1 mAb 1的组合(Ab Combo 1)对T-细胞应答的作用。图19A-19B显示了在没有SEB刺激(图19A)或存在SEB刺激(图19B)的情况下，通过这类PBMC的PD-1对比CTLA-1的表达的荧光-激活细胞分选(FACS)点图。图19C显示了SEB刺激对IFN-γ分泌的作用。用金黄色葡萄球菌肠毒素B型(SEB)以0.5ng/ml刺激PBMC 48小时。接着，收获细胞、洗涤并且在96孔平板中与各种浓度的抗体和新鲜的SEB重新铺平板，达另外的48小时。接着，收获上清液并且通过流式细胞术ELISA分析IFN-γ产生。双特异性DART和TRIDENT蛋白质两者均显示IFN-γ应答的增加，这概括了用单独的亲本mAb的组合观察到的应答。在PBMC用高浓度(500ng/mL)的SEB培养72小时的SEB刺激试验中观察到了类似的结果。呈现出六个系列，每个与不同的结合分子相关。每个系列包括七个柱子，其涉及用25nM、6.25nM、1.56nM、0.39nM、0.09nM、0.02nM或0.006nM结合分子获得的结果(分别从左到右)。图19D显示了代表性供体的IL-2的释放。用0.5ng/ml SEB刺激PBMC 48小时，收获、洗涤并且在96孔板中与新鲜SEB和DART D、TRIDENT A、CTLA-4 mAb 3 G1AA、PD-1 mAb 6 G4P或CTLA-4mAb 3 G1AA/PD-1 mAb 6 G4P的组合(Ab Combo 1)任意之一一起重新铺平板，达另外的48小时，并且测量释放的IL-2。呈现了七个系列，每个与不同的结合分子或状况相关。每个系列包括三个柱子，其涉及用0.5nM、5nM或50nM结合分子获得的结果(分别从左到右)。当组合使用抗体时，以指示的浓度添加每种抗体，从而添加的抗体的总体浓度加倍。
图20A-20B显示了PD-1 x CTLA-4双特异性分子在移植物抗宿主疾病(GVHD)的植入PBMC的NOG鼠模型中的活性。在研究天(图20A)对已经以50mg/kg或500mg/kg的剂量接受DART D的小鼠经FACS进行CD3+T细胞计数(图20A)。在研究过程期间监测存活率并且以存活百分数绘制在图20B中。
图21A-21C显示了已经在研究的第1、8和15天以50mg/kg接受DART D(图21A)的食蟹猴，在研究的第1、8和15天以75mg/kg接受DART D食蟹猴(图21B)或在第1天以5mg/kg接受Trident A的食蟹猴(图21C)的血清浓度-时间曲线(使用6位字母数字编码)。
图22A-22B显示了DART D的施用对于治疗的食蟹猴中绝对淋巴细胞计数(ALC)的影响。图22A显示了以数千细胞/μl(th/μl)计的ALC。图22B显示了归一化至第1天(D1)的ALC的百分数改变。
图23A-23B显示了在已经接受以50mg/kg施用的DART D(图23A)或以75mg/kg施用的DART D(图23B)的食蟹猴中，CD4+T细胞增殖和T细胞上的PD-1占据(occupancy)。
图24A-24B显示了在已经接受以50mg/kg施用的DART D(图24A)或以75mg/kg施用的DART D(图24B)的食蟹猴中DART D施用对CD4+T细胞增殖的影响。
具体实施方式
本发明涉及双特异性分子(例如，双抗体、双特异性抗体、三价结合分子等)，其具有对于PD-1的表位免疫特异性的至少一个表位-结合位点和对于CTLA-4的表位免疫特异性的至少一个表位-结合位点(即，“PD-1 x CTLA-4双特异性分子”)。本发明涉及这类PD-1 xCTLA-4双特异性分子，其具有对于PD-1的一个(或两个)表位免疫特异性的两个表位-结合位点和对于CTLA-4的一个(或两个)表位免疫特异性的两个表位-结合位点。本发明也涉及这类PD-1 x CTLA-4双特异性分子，其另外包括免疫球蛋白Fc区。本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子能够同时结合PD-1和CTLA-4，尤其当这类分子排列在人细胞的表面上时。本发明涉及药物组合物，其包含这类PD-1 x CTLA-4双特异性分子，并且涉及包括这类双特异性分子在治疗癌症和其他疾病和病况中的用途的方法。本发明也涉及使用这类PD-1 xCTLA-4双特异性分子刺激免疫应答的方法。
T-细胞激活需要两种不同的信号(Viglietta,V.等(2007)“Modulating Co-Stimulation,”Neurotherapeutics 4:666-675；Korman,A.J.等(2007)“CheckpointBlockade in Cancer Immunotherapy,”Adv.Immunol.90:297-339)。通过在T-细胞的表面上表达的T-细胞受体(TCR)分子提供第一信号，所述T-细胞受体(TCR)分子已经识别已经与在抗原呈递细胞(APC)表面上表达的人白细胞抗原(HLA)关联的肽抗原。通过在APC上表达的共刺激配体：B7-1和B7-2和它们相应的在T-细胞上表达受体：CD28和CTLA-4的相关对的相互作用提供第二信号。
B7-1和B7-2分子与CD28的结合刺激T-细胞增殖并另外诱导CTLA-4增加的表达。CTLA-4是与B7-1和B7-2竞争结合CD28的负调节因子。因此，该过程在两个阶段中对疾病作出响应：初始阶段涉及刺激T-细胞增殖；随后的阶段“逐渐减少”免疫应答并且使受试者回到静息免疫状态。结合CD28的抗体可模拟B7-1或B7-2的结合，并且因此诱导或增强T-细胞效应子功能和根除肿瘤的免疫性的产生；这类抗体是共刺激的。相反，阻断CTLA-4结合B7-1和B7-2的抗体可防止T-细胞回到静息状态；因此，这类T-细胞维持持续的增殖，这可导致自身免疫性和免疫相关的不利事件(irAE)的产生(Wang,L.等(March 7，2011)“VISTA，ANovel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T-CellResponses,”J.Exp.Med.10.1084/jem.20100619:1-16；Lepenies,B.等(2008)“The RoleOf Negative Costimulators During Parasitic Infections,”Endocrine,Metabolic&Immune Disorders-Drug Targets 8:279-288)。尤其重要地是抗原呈递细胞的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)配体和CD4+T淋巴细胞的CD28和CTLA-4受体之间的结合(Sharpe,A.H.等(2002)“The B7-CD28 Superfamily,”Nature Rev.Immunol.2:116-126；Dong,C.等(2003)“Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,”Immunolog.Res.28(1):39-48；Lindley,P.S.等(2009)“The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-MediatedCostimulation,”Immunol.Rev.229:307-321)。B7.1或B7.2与CD28的结合刺激了T-细胞激活；B7.1或B7.2与CTLA-4的结合抑制了这类激活(Dong,C.等(2003)“Immune Regulationby Novel Costimulatory Molecules,”Immunolog.Res.28(1):39-48；Lindley,P.S.等(2009)“The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation,”Immunol.Rev.229:307-321；Greenwald,R.J.等(2005)“The B7 Family Revisited,”Ann.Rev.Immunol.23:515-548)。CD28在T-细胞的表面上组成型表达(Gross,J.等(1992)“Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28In TheMouse,”J.Immunol.149:380–388)，而CTLA-4表达在T-细胞激活之后被快速上调(Linsley,P.等(1996)“Intracellular Trafficking Of CTLA4And Focal Localization TowardsSites Of TCR Engagement,”Immunity 4:535–543)。因为CTLA-4是较高亲和性受体(Sharpe,A.H.等(2002)“The B7-CD28 Superfamily,”Nature Rev.Immunol.2:116-126)，结合首先启动T-细胞增殖(经CD28)，然后抑制T-细胞增殖(经CTLA-4的初期表达)，从而当不再需要增殖时阻碍该作用。
与上述相互作用同时，第二组受体和结合配体用于抑制免疫系统，从而用作闸(brake)，以缓解CD28/B7-1/B7-2介导的免疫应答的增强。这类辅助应答涉及在T-细胞的表面上表达的程序性细胞死亡-1蛋白质(PD-1)受体与相应的配体：在抗原呈递细胞(APCs)上表达的PD-L1和在上皮细胞上表达的PD-L2的结合(Chen L.等(2013)“MolecularMechanisms Of T-Cell Co-Stimulation And Co-Inhibition,”Nature ReviewsImmunology 13(4):227-242)。与结合CD28以直接刺激T-细胞应答的激动剂抗体相反，结合PD-1或PD-L1的抗体拮抗或阻断PD-1/PD-L1接合(engagement)并且因此通过防止负信号向T-细胞的递送而维持T-细胞激活。这样，结合PD-1或PD-L1的抗体扩大或维持了T-细胞增殖、细胞毒性和/或细胞因子分泌。总之，激动剂抗体，比如抗CD28，靶向正信号途径，因此是共刺激因子，而拮抗抗体，比如抗CTLA-4和抗PD-1，靶向负信号途径并且被称为检查点抑制剂。
如上所提供，CTLA-4和PD-1代表典型的检查点抑制剂，其对于T-细胞激活发挥不同的抑制作用。本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子能够结合存在于淋巴细胞的表面上的PD-1和CTLA-4细胞-表面分子，从而破坏这类细胞-表面分子相应它们各自受体的能力。不受任何理论或机制限制，发明人认为PD-1结合可释放T-细胞抑制(例如，在肿瘤位点和/或由于感染)并且CTLA-1结合可刺激多克隆激活和刺激。因此，本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子能够减弱PD-1和CTLA-4介导的免疫系统抑制，并且促进持续的免疫系统激活。本发明已经证明，靶向两个免疫调节途径的双特异性分子比单独的抗体的组合更有效。本发明也提供了PD-1:CTLA-4结合比例为1:1、1:2、2:2和2:1的PD-1 x CTLA-4双特异性分子，其允许完全阻断PD-1和CTLA-4以及当与PD-1共表达时偏向CTLA-4的阻断。因此，本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子与单独的抗PD-1和抗CTLA-4抗体的组合相比，提供了出乎意料的优势。另外，本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子可提供具有降低的irAE风险的免疫刺激。
I.抗体和它们的结合结构域
本发明的抗体是免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变结构域中的至少一个抗原识别位点而特异性结合至靶，比如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所使用，术语“抗体”指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、骆驼源化(camelized)抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物连接的双特异性Fvs(sdFv)、胞内抗体和任何上述的表位结合片段。尤其地，术语“抗体”包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，包含表位结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。如本文所使用，相对于其他IgG同种型，如果Fc区的氨基酸序列与特定的IgG同种型最同源，则认为Fc区属于该IgG同种型、类别或亚类。除了它们在诊断中已知的用途，已经证明抗体可用作治疗剂。抗体能够免疫特异性结合多肽或蛋白质或非蛋白质分子，因为在这样的分子上存在特定的结构域或部分或构象(“表位”)。包含表位的分子可具有免疫原性活性，以便其在动物中引起抗体产生反应；这类分子称为“抗原”。最近数十年已经看到对抗体的治疗潜能的兴趣的复兴，并且抗体已经成为一种主要类型的生物技术衍生的药物(Chan,C.E.等(2009)“The Use Of Antibodies In TheTreatment Of Infectious Diseases,”Singapore Med.J.50(7):663-666)。超过200种基于抗体的药物已经被批准使用或正在开发。
术语“单克隆抗体”指同质型(homogeneous)抗体群体，其中单克隆抗体包括参与抗原的选择性结合的氨基酸(天然产生的和非天然产生的)。单克隆抗体是高度特异性的，直接针对单个表位(或抗原位点)。术语“单克隆抗体”不仅仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且也包括其片段(比如Fab、Fab'、F(ab')2Fv)、单链(scFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白、人源化的单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和包括具有结合抗原的必要的特异性和能力的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构造(configuration)。就抗体的来源或制备其的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)而言，不旨在是限制性的。术语包括完整的免疫球蛋白以及上面根据“抗体”的定义描述的片段等。制备单克隆抗体的方法是本领域已知的。可采用的一种方法是Kohler,G.等(1975)“Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody OfPredefined Specificity,”Nature 256:495-497的方法或其改良。典型地，单克隆抗体在小鼠、大鼠或兔子中开发。通过用免疫原性量的细胞、细胞提取物或包含期望的表位的蛋白质制品免疫动物而产生抗体。免疫原可以是但不限于原代细胞、培养细胞系、癌细胞、蛋白质、肽、核酸或组织。用于免疫的细胞可被培养一段时间(例如，至少24小时)，然后将它们用作免疫原。细胞它们本身或联合非变性佐剂，比如Ribi，可用作免疫原(见，例如，Jennings,V.M.(1995)“Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,”ILARJ.37(3):119-125)。一般而言，在用作免疫原时，细胞应保持完整并且优选地有活性。相比于破裂的细胞，完整的细胞可允许抗原被免疫的动物更好地检测。变性或烈性佐剂，例如，弗氏佐剂的使用，可使细胞破裂，因此，其应用受阻。免疫原可以周期性间隔被多次施用，诸如两周一次或一周一次，或者可以以维持在动物(例如，在组织重组体中)中的生存力这样的方式被施用。可选地，对于期望的致病表位是免疫特异性的现有单克隆抗体和任意其他等价抗体可被测序，并通过本领域中已知的任意手段重组产生。在一个实施方式中，对这样的抗体测序，然后将多核苷酸序列克隆至载体用于表达或增殖。编码感兴趣的抗体的序列可在宿主细胞中保持在载体中，并且，可然后扩展和冷冻宿主细胞，用于将来的使用。这样的抗体的多核苷酸序列可用于基因操作，以产生本发明的单特异性或多特异性(例如，双特异性、三特异性和四特异性)分子以及亲和力优化的嵌合抗体、人源化抗体和/或犬源化(caninized)抗体，以改善抗体的亲和力或其他特征。人源化抗体的一般原理涉及保留抗体的抗原结合的部分的基本序列，同时用人抗体序列交换抗体的非人剩余部分。
天然抗体(比如IgG抗体)包括与两条重链复合的两条轻链。每条轻链包含可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。每条重链包含可变结构域(VH)，三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，和位于CH1和CH2结构域之间的铰链区。天然产生的免疫球蛋白(例如，IgG)的基本结构单元因此是具有两条轻链和两条重链的四聚体，通常作为约150,000Da的糖蛋白被表达。每条链的氨基端(“N-末端”)部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多氨基酸的可变结构域。每条链的羧基端(“C-末端”)部分限定了恒定区，其中轻链具有单个恒定结构域而重链通常具有三个恒定结构域和铰链区。因此，IgG分子的轻链的结构是n-VL-CL-c并且IgG重链的结构是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c(其中H是铰链区，n和c分别表示多肽的N-末端和C-末端)。IgG分子的可变结构域由互补决定区(CDR)和称为框架区段(FR)的非CDR区段组成，所述互补决定区(CDR)包含与表位接触的残基，所述框架区段一般维持结构和决定CDR环的定位，以便允许这类接触(尽管某些框架残基也可接触抗原)。因此，VL和VH结构域具有结构n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c。是(或可用作)抗体轻链的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分别命名为CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域。类似地，是(或可用作)抗体重链的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分别命名为CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域。因此，术语CDRL1结构域、CDRL2结构域、CDRL3结构域、CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域指当并入到蛋白质中时使得该蛋白质能够结合特异性表位的多肽，无论这样的蛋白质是否是具有轻链和重链的抗体或双抗体或单链结合分子(例如，scFv、BiTe等)或是另一类型的蛋白质。因此，如本文所使用，术语“表位结合片段”意指能够免疫特异性结合表位的抗体的片段，并且术语“表位结合位点”指包含表位结合片段的分子的部分。表位结合位点可包含这类抗体的1、2、3、4、5或所有6个CDR结构域，并且尽管能够免疫特异性结合这类表位，但可展示对与这样的抗体的表位不同的这样的表位的特异性、亲和力或选择性。但是，优选地，表位结合片段将包含这类抗体的所有6个CDR结构域。抗体的表位结合片段可以是单个多肽链(例如，scFv)，或可包括两条或更多条多肽链，每条链均具有氨基末端和羧基末端(例如，双抗体、Fab片段、Fab2片段等)。除非具体指出，否则本文所述的蛋白质分子的结构域的顺序是从N-末端至C-末端方向。
本发明尤其包括PD-1 x CTLA-4双特异性结合分子，其包括抗PD-1抗体的一个、两个或大于两个单链可变结构域片段(“scFv”)和抗CTLA-4抗体的一个、两个或大于两个单链可变结构域片段。通过使用短的连接肽连接轻链和重链可变结构域制备单链可变结构域片段。可修饰连接体，以提供另外的功能，比如允许药物附着或附着至固体载体。可经重组或合成产生单链变体。为了合成产生scFv，可使用自动合成仪。为了重组产生scFv，可将包含编码scFv的多核苷酸的适当的质粒引入到适当的宿主细胞中，所述宿主细胞是真核细胞，比如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，或原核细胞，比如大肠埃希氏菌(E.coli)。可通过常规操作比如多核苷酸的连接制备编码感兴趣的scFv的多核苷酸。可使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得scFv。
本发明也尤其包括PD-1 x CTLA-4双特异性分子，其包括人源化的抗PD-1和抗CTLA-4抗体。术语“人源化”抗体指一般使用重组技术制备的嵌合分子，其具有来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的分子的剩余免疫球蛋白结构。这类抗体的可变结构域的多核苷酸序列可用于遗传操作，以产生这类衍生物和改善这类抗体的亲和力或其他特征。人源化抗体的一般原则涉及保留抗体的抗原结合部分的基本序列，同时用人抗体序列交换抗体的非人剩余部分。人源化单克隆抗体有四个基本步骤。这些是：(1)确定开始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和预测的氨基酸序列；(2)设计人源化抗体或犬源化抗体，即，决定在人源化或犬源化过程中使用哪种抗体框架区域；(3)实际人源化或犬源化方法/技术；和(4)转染和表达人源化抗体。见，例如，美国专利号4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。
抗原结合位点可包括融合到恒定结构域融合上的完整的可变结构域或仅仅包括移植至适当框架区的这类可变结构域的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型或通过一个或多个氨基酸取代被修饰。这消除了人个体中作为免疫原的恒定区，但是仍保留对外源可变结构域的免疫应答的可能性(LoBuglio,A.F.等(1989)“Mouse/Human ChimericMonoclonal Antibody In Man:Kinetics And Immune Response,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86:4220-4224)。另一种方法不仅仅关注提供源自人的恒定区，而且也修饰可变结构域，以便重塑它们使其尽可能地与人形式接近。已知重链和轻链的可变结构域都包含三个互补决定区(CDR)，侧翼是四个框架区(FR)，所述互补决定区(CDR)对所讨论的抗原响应不同并且决定结合能力，所述框架区(FR)在给定物种中相对保守并且推定其为CDR提供支架。当针对特定抗原制备非人抗体时，通过将源自非人抗体的CDR移植在待修饰的人抗体中存在的FR上可“重塑”或“人源化”可变结构域。已经报道了该方法应用于各种抗体：Sato,K.等(1993)Cancer Res 53:851-856.Riechmann,L.等(1988)“Reshaping Human Antibodiesfor Therapy,”Nature 332:323-327；Verhoeyen,M.等(1988)“Reshaping HumanAntibodies:Grafting An Antilysozyme Activity,”Science 239:1534-1536；Kettleborough,C.A.等(1991)“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody ByCDR-Grafting:The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,”Protein Engineering 4:773-3783；Maeda,H.等(1991)“Construction Of ReshapedHuman Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,”Human Antibodies Hybridoma2:124-134；Gorman,S.D.等(1991)“Reshaping A Therapeutic CD4Antibody,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:4181-4185；Tempest,P.R.等(1991)“Reshaping AHuman Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial VirusInfection in vivo,”Bio/Technology 9:266-271；Co,M.S.等(1991)“HumanizedAntibodies For Antiviral Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:2869-2873；Carter,P.等(1992)“Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human CancerTherapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)89:4285-4289；和Co,M.S.等(1992)“ChimericAnd Humanized Antibodies With Specificity For The CD33Antigen,”J.Immunol.148:1149-1154。在一些实施方式中，人源化抗体保留所有的CDR序列(例如，人源化鼠抗体，其包含来自小鼠抗体的所有六个CDR)。在其他实施方式中，人源化抗体具有一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个)，其序列相对于初始抗体不同。
已经描述了包括源自非人免疫球蛋白的抗原结合位点的许多“人源化”抗体分子，包括具有啮齿动物或修饰的啮齿动物可变结构域和它们与人恒定结构域融合的相关的互补决定区(CDR)的嵌合抗体(见，例如，Winter等(1991)“Man-made Antibodies,”Nature349:293-299；Lobuglio等(1989)“Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man:Kinetics And Immune Response,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86:4220-4224(1989),Shaw等(1987)“Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody(17-1A)To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,”J.Immunol.138:4534-4538,and Brown等(1987)“Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human ChimericMonoclonal Antibody,”Cancer Res.47:3577-3583)。其他参考文献描述了移植至人支撑框架区(FR)的啮齿动物CDR，其然后与适当的人抗体恒定结构域融合(见，例如，Riechmann,L.等(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy,”Nature 332:323-327；Verhoeyen,M.等(1988)“Reshaping Human Antibodies:Grafting An AntilysozymeActivity,”Science 239:1534-1536；和Jones等(1986)“Replacing TheComplementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From AMouse,”Nature 321:522-525)。另外的参考文献描述了由重组修饰的啮齿动物框架区支撑的啮齿动物CDR。见，例如，欧洲专利公开号519,596。这些“人源化的”分子被设计，以使对啮齿动物抗人抗体分子的不利免疫应答最小化，所述不利免疫应答限制了这些部分在人接受者中治疗应用的持续时间和效力。也可使用的人源化抗体的其他方法，其公开在以下文献中：Daugherty等(1991)“Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning,CDR-Grafting,And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody DirectedAgainst The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,”Nucl.Acids Res.19:2471-2476和美国专利号6,180,377、6,054,297、5,997,867和5,866,692。
II.Fcγ受体(FcγR)
两条重链的CH2和CH3结构域相互作用，以形成Fc区域，其是被细胞Fc受体，包括但不限于Fcγ受体(FcγR)，识别的结构域。如本文所使用，术语“Fc区域”用于限定IgG重链的C-末端区域。示例性人IgG1的CH2-CH3结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:1)：
如Kabat中阐释的EU索引编号，其中X是赖氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG2的CH2-CH3结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:2)：
如Kabat中阐释的EU索引编号，其中X是赖氨酸(K)或不存在。示例性人IgG3的CH2-CH3结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:3)：
如Kabat中阐释的EU索引编号，其中X是赖氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG4的CH2-CH3结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:4)：
如Kabat中阐释的EU索引编号，其中X是赖氨酸(K)或不存在。
遍及本说明书，IgG重链的恒定区中残基的编号是如在Kabat等,SEQUENCES OFPROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,第五版.Public Health Service,NH1,MD(1991)(“Kabat”)中的EU索引的编号，其通过参考明确并入本文。术语“如在Kabat的EU索引”指人IgG1 EU抗体的编号。通过链中氨基酸的位置命名来自免疫球蛋白的成熟重链和轻链的可变结构域的氨基酸。Kabat描述了抗体的许多氨基酸序列，鉴定了每个亚组的氨基酸共有序列，并且为每个氨基酸赋予残基编号，并且，如Kabat定义的来鉴定CDR(应当理解，如Chothia,C.&Lesk,A.M.((1987)“Canonical structures for the hypervariable regions ofimmunoglobulins,”J.Mol.Biol.196:901-917)限定的CDRH1在之前的五个残基开始)。通过参考保守的氨基酸比对所讨论的抗体与Kabat中的共有序列中的一条，Kabat的编号方案可扩展至未包括在其纲要中的抗体。用于赋予残基编号的该方法已经成为本领域的标准并且容易鉴定在不同抗体，包括嵌合或人源化的变体中等同位置处的氨基酸。例如，在人抗体轻链50位的氨基酸占据与在小鼠抗体轻链的50位氨基酸的等同位置。
在抗体恒定区中的许多不同位置(例如，Fc位置，包括但不限于270、272、312、315、356和358位，如在Kabat阐释的EU索引编号)处已经观察到了多态性，因此示出的序列和现有技术的序列之间可能存在轻微的差别。已经充分表征了人免疫球蛋白的多态性形式。目前，已知18个Gm同种异型：G1m(1、2、3、17)或G1m(a、x、f、z)、G2m(23)或G2m(n)、G3m(5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m(b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5)(Lefranc,等,“The Human IgG Subclasses:Molecular Analysis Of Structure,Function And Regulation.”Pergamon,Oxford,pp.43-78(1990)；Lefranc,G.等1979，Hum.Genet.:50,199-211)。具体考虑本发明的抗体可并入任何免疫球蛋白基因的任何同种异型(allotype)、异同种异型(isoallotype)或单倍型(haplotype)，并且不限于本文提供的序列的同种异型、异同种异型或单倍型。此外，在一些表达体系中，CH3结构域的C-末端氨基酸残基(上面粗体显示的)可在翻译后去除。因此，CH3结构域的C-末端残基是本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子中的任选的氨基酸残基。本发明具体考虑缺少CH3结构域的C-末端残基的PD-1 x CTLA-4双特异性分子。本发明也具体考虑包括CH3结构域的C-末端赖氨酸残基的这类构建体。
如上所述，天然IgG抗体的Fc区能够结合细胞Fcγ受体(FcγR)。这类结合导致激活或抑制信号向免疫系统的传导。导致截然相反的功能的这类结合的能力反映了不同FcγR之间的结构差异，尤其反映了结合的FcγR是否具有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。不同细胞质酶向这些结构的募集控制了FcγR-介导的细胞应答的结果。包含ITAM的FcγRs包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，并且，当结合Fc区时激活免疫系统。FcγRIIB是唯一目前已知的包含ITIM的天然FcγR；当结合Fc区时，其用于阻碍或抑制免疫系统。人嗜中性粒细胞表达FcγRIIA基因。通过免疫复合物或特异性抗体交联的FcγRIIA聚类用于使ITAM与促进ITAM磷酸化的受体相关的激酶聚集。ITAM磷酸化充当Syk激酶的停泊位点，Syk激酶的激活导致下游底物(例如，PI3K)的激活。细胞激活导致促炎性介质的释放。FcγRIIB基因在B淋巴细胞上表达；其细胞外结构域与FcγRIIA是96％一致的，并且以不能区分的方式结合IgG复合物。ITIM在FcγRIIB的胞质结构域中的存在限定了FcγR的这种抑制性亚类。最近，确定了这种抑制的分子基础。当与激活FcγR共连接时，FcγRIIB中的ITIM变成磷酸化的，并且吸引肌醇聚磷酸盐5’-磷酸酶(SHIP)的SH2结构域，肌醇聚磷酸盐5’-磷酸酶(SHIP)水解由于含ITAM的FcγR介导的酪氨酸激酶激活而释放的磷酸肌醇信使，从而防止细胞内Ca++的流入。因此，FcγRIIB的交联抑制对FcγR连接的激活应答并抑制细胞应答。B-细胞激活、B-细胞增殖和抗体分泌因此被中止。
III.双特异性抗体、多特异性双抗体和双抗体
抗体结合抗原的表位的能力取决于抗体的VL和VH结构域的存在和氨基酸序列。抗体的轻链和重链的相互作用，尤其地，其VL和VH结构域的相互作用，形成天然抗体，诸如IgG，的两个表位结合位点之一。天然抗体能够结合仅仅一个表位种类(即，它们是单特异性的)，但是它们可结合该种类的多个拷贝(即，展示双价或多价)。
抗体和本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的结合结构域以“免疫特异性”方式结合表位。如本文所使用，如果抗体、双抗体或其他表位结合分子，相对于可选的表位，与另一分子的区域(即，表位)更经常、更快速、以更长的持久性和/或以更大的亲和力反应或缔合，则认为抗体、双抗体或其他表位结合分子“免疫特异性”结合该表位。例如，免疫特异性结合病毒表位的抗体是，相比其免疫特异性结合其他病毒表位或非病毒表位，以更大的亲和力、亲合力、更容易和/或以更大的持久性结合该病毒表位的抗体。通过阅读该定义，应理解，例如，免疫特异性结合第一靶的抗体(或部分或表位)可特异性或非特异性或优选或非优选结合第二靶。因此，“免疫特异性结合”不必要求(尽管其可包括)排他性结合。一般而言，但不是必要的，提及结合意思是“免疫特异性”结合。如果两个分子的结合展示受体结合它们各自配体的特异性，则认为两个分子能够彼此以“物理特异性”方式结合。
本发明的一个方面反映了这样的认识，抗体的功能可通过产生可同时结合一个或多个PD-1的表位并且也结合一个或多个CTLA-4的表位的基于多特异性抗体的分子而增强。对于具有针对PD-1的表位免疫特异性的大于一个表位-结合位点的分子，这类表位可彼此相同、重叠或彼此不同；与一个这类表位结合可竞争或不竞争与另一个这类表位结合。同样地，对于具有针对CTLA-4的表位免疫特异性的大于一个表位-结合位点的分子，这类表位可彼此相同、重叠或彼此不同；与一个这类表位结合可竞争或不竞争与第二个这类表位结合。明确考虑这类特征可独立地变化，以产生PD-1 x CTLA-4双特异性分子，其例如，具有：
(1)结合两个相同PD-1的表位的能力和结合下述的能力：
(a)两个相同的CTLA-4的表位；或
(b)两个重叠的CTLA-4的表位；或
(c)两个不同的CTLA-4的表位；
或
(2)结合两个重叠的PD-1的表位的能力和结合下述的能力：
(a)两个相同的CTLA-4的表位；或
(b)两个重叠的CTLA-4的表位；或
(c)两个不同的CTLA-4的表位；
或
(3)结合两个不同的PD-1的表位的能力和结合下述的能力：
(a)两个相同的CTLA-4的表位；或
(b)两个重叠的CTLA-4的表位；或
(c)两个不同的CTLA-4的表位。
为了提供比天然抗体具有更大能力的分子，已经开发了各种重组双特异性抗体形式(见，例如，PCT公布号WO 2008/003116、WO 2009/132876、WO 2008/003103、WO 2007/146968、WO 2009/018386、WO 2012/009544、WO 2013/070565)，其大部分使用连接肽，所述连接肽与其他表位结合片段(例如，scFv、VL、VH等)融合或在抗体核心中(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)或与多个表位结合片段(例如，两个Fab片段或scFvs)融合。可选的形式使用连接肽，以将表位结合片段(例如，scFv、VL、VH等)与二聚化结构域，比如CH2-CH3结构域，或可选的多肽融合(WO 2005/070966、WO 2006/107786A WO 2006/107617A、WO 2007/046893)。PCT公开号WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO 2010/136172公开了三特异性抗体，其中CL和CH1结构域由其各自的天然位置被转变，并且VL和VH结构域已经被多样化(WO 2008/027236、WO 2010/108127)，以允许它们结合大于一种抗原。PCT公开号WO 2013/163427和WO2013/119903公开了修饰CH2结构域，以包含包括结合结构域的融合蛋白加合物。PCT公开号WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公开了重组抗体，其Fc区已经用另外的VL和VH结构域替换，以便形成三价结合分子。PCT公开号WO 2003/025018和WO2003012069公开了重组双抗体，其单个链包含scFv结构域。PCT公开号WO 2013/006544公开了多价Fab分子，其作为单多肽链被合成，然后经历蛋白酶解，以产生异源二聚化结构。PCT公开号WO2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO2008/024188、WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO1991/003493公开了添加另外的结合结构域或功能集团至抗体或抗体部分(例如，添加双抗体至抗体的轻链或添加另外的VL和VH结构域至抗体的轻链和重链或添加异源融合蛋白或彼此链接多个Fab结构域)。
现有技术已经另外注意到产生在能够结合两个或多个不同表位种类(即，除了双价或多价之外显示双特异性或多特异性)方面不同于这样的天然抗体的双抗体的能力(见，例如，Holliger等(1993)“’Diabodies’:Small Bivalent And Bispecific AntibodyFragments,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90:6444-6448、US 2004/0058400(Hollinger等)；US 2004/0220388/WO 02/02781(Mertens等)；Alt等(1999)FEBS Lett.454(1-2):90-94；Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody ToBoth The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth FactorReceptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672；WO02/02781(Mertens等)；Olafsen,T.等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEADiabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For TumorTargeting Applications,”Protein Eng.Des.Sel.17(1):21-27；Wu,A.等(2001)“Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein IsMediated Through Variable Domain Exchange,”Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等(2004)“A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its FunctionalEnhancement By Fusion Of Human Fc Domain,”Abstract 3P-683,J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small RecombinantBispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588；Baeuerle,P.A.等(2009)“Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For CancerTherapy,”Cancer Res.69(12):4941-4944)。
双抗体的设计是基于被称为单链可变结构域片段(scFv)的抗体衍生物。这样的分子利用短连接肽连接轻链和/或重链可变结构域而制备。B Bird等(1988)(“Single-ChainAntigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426)描述了连接肽的例子，其在一个可变区的羧基末端和另一可变区的氨基末端之间桥接约3.5nm。已经设计和使用了其他序列的连接体(Bird等(1988)“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426)。连接体进而可被修饰用于另外的功能，比如药物的附着或附着至固体载体。可重组或合成产生单链变体。为了合成产生scFv，可使用自动合成仪。为了重组体产生scFv，可将包含编码scFv的多核苷酸的合适质粒引入适当的宿主细胞中，所述宿主细胞可以是真核细胞，比如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，或原核细胞，比如大肠埃希氏菌。可通过常规操作比如多核苷酸的连接制备编码感兴趣的scFv的多核苷酸。可使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得scFv。
双特异性结合分子(例如，非单特异性双抗体)的供应提供相比抗体的明显优势，包括但不限于足以共连接和/或共定位表达不同表位的不同细胞的“反式(trans)”结合能力和/或足以共连接和/或共定位由相同细胞表达的不同分子的“顺式(cis)”结合能力。因此，双特异性结合分子(例如，非单特异性双抗体)具有广泛的应用，包括治疗和免疫诊断。在各种应用中，双特异性在设计和工程化双抗体方面允许大的灵活性，提供对多聚抗原的增强的亲合力、不同抗原的交联和对特定细胞类型的导向靶向，这取决于两个靶抗原的存在。由于其增加的价、低离解速率和从循环中快速清除(对于小尺寸的双抗体，为～50kDa或以下)，本领域中已知的双抗体分子在肿瘤成像领域还显示特别的用途(Fitzgerald等(1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies ExpressedIn Pichia pastoris,”Protein Eng.10:1221)。
产生双特异性双抗体的能力已经导致它们(以“反式”)将两个细胞共连接在一起的用途，例如，通过共连接在不同的细胞表面上存在的受体(例如，将细胞毒性T-细胞与肿瘤细胞交联)(Staerz等(1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By TCells,”Nature 314:628-631；和Holliger等(1996)“Specific Killing Of LymphomaCells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,”Protein Eng.9:299-305；Marvin等(2005)“Recombinant Approaches To IgG-Like BispecificAntibodies,”Acta Pharmacol.Sin.26:649-658)。可选地，或另外，双特异性双抗体可用于(与“顺式”)共连接存在于相同细胞表面上的分子，比如受体等。共连接不同的细胞和/或受体可用于调节效应子功能和/或免疫细胞信号传导。但是，上述优势需要突出的成本。这类非单特异性双抗体的形成需要成功组装两个或更多个独特和不同的多肽(即，这样的形成需要通过不同多肽链种类的异源二聚化而形成双抗体)。该事实与单特异性双抗体不同，其通过一致的多肽链的同源二聚化而形成。由于至少两个不同的多肽(即，两个多肽种类)必须被提供以形成非单特异性双抗体并且由于这样的多肽的同源二聚化导致失活分子(Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant BispecificAntibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588)，这样的多肽的产生必须以防止相同种类的多肽之间的共价结合的方式完成(即，以便防止同源二聚化)(Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant BispecificAntibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588)。所以，现有技术教导了这类多肽的非共价缔合(见，例如，Olafsen等(2004)“Covalent Disulfide-LinkedAnti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For TumorTargeting Applications,”Prot.Engr.Des.Sel.17:21-27；Asano等(2004)“A DiabodyFor Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human FcDomain,”Abstract 3P-683,J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)“ConstructionOf A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588；Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-LikeBispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And TheInsulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。
但是，现有技术已经认识到由非共价缔合的多肽组成的双特异性双抗体不稳定并且容易解离成非功能单体(见，例如，Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And TheInsulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。
面对这样的挑战，本领域已经成功地开发了稳定的、共价结合的异源二聚非单特异性双抗体，称为(双亲和力重靶向试剂)双抗体；见，例如，美国专利公开号2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；欧洲专利公开号EP 2714079、EP 2601216、EP2376109、EP 2158221；和PCT公开号WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538；和Sloan,D.D.等(2015)“Targeting HIV Reservoir in Infected CD4T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules(DARTs)that Bind HIV Envelope and RecruitCytotoxic T Cells,”PLoS Pathog.11(11):e1005233.doi:10.1371/journal.ppat.1005233；Al Hussaini,M.等(2015)“Targeting CD123In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-TargetingPlatform,”Blood pii:blood-2014-05-575704；Chichili,G.R.等(2015)“A CD3xCD123 Bispecific DART ForRedirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia:Preclinical Activity AndSafety In Nonhuman Primates,”Sci.Transl.Med.7(289):289ra82；Moore,P.A.等(2011)“Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve OptimalRedirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,”Blood 117(17):4542-4551；Veri,M.C.等(2010)“Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment OfFcgamma Receptor IIb(CD32B)Inhibitory Function With A Novel BispecificAntibody Scaffold,”Arthritis Rheum.62(7):1933-1943；Johnson,S.等(2010)“Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-TargetingProtein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,”J.Mol.Biol.399(3):436-449)。这样的双抗体包括两条或多条共价复合的多肽并涉及将一个或多个半胱氨酸残基工程化到每个应用的多肽种类中，其允许形成二硫键，从而将一对或多对这类多肽链彼此共价结合。例如，将半胱氨酸残基添加至这样的构建体的C-末端已经被证明允许涉及的多肽链之间的二硫结合，稳定了产生的双抗体，而不干扰双抗体的结合特性。
已经描述了这类分子的许多变型(见，例如，美国专利公开号2015/0175697、2014/0255407、2014/0099318、2013/0295121、2010/0174053；2009/0060910；2007-0004909；欧洲专利公开号EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221、EP 1868650；和PCT公开号WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538、WO 2006/113665)并且提供在本文中。
用于期望四价分子而不需要Fc的应用的可选的构建体在本领域中是已知的，包括但不限于四价串联抗体，也称为“TandAbs”(见，例如美国专利公开号2005-0079170、2007-0031436、2010-0099853、2011-020667 2013-0189263；欧洲专利公开号EP 1078004、EP2371866、EP 2361936和EP 1293514；PCT公开号WO 1999/057150、WO 2003/025018，和WO2013/013700)，其通过每个具有VH1、VL2、VH2和VL2结构域的两条相同链的同源二聚化而形成。
III.优选的PD-1 x CTLA-4双特异性分子
本发明的一个实施方式涉及PD-1 x CTLA-4双特异性分子，其能够结合“第一表位”和“第二表位”，这类表位彼此不同。这类双特异性分子包括能够结合第一表位的“VL1”/“VH1”结构域和能够结合第二表位的“VL2”/“VH2”结构域。符号“VL1”和“VH1”分别表示结合这类双特异性分子的“第一”表位的轻链可变结构域和重链可变结构域。类似地，符号“VL2”和“VH2”分别表示结合这类双特异性分子的“第二”表位的轻链可变结构域和重链可变结构域。具体的表位是否命名为第一或第二表位无所谓；这类符号仅仅与本发明的结合分子的多肽链的结构域的存在和取向相关。在一个实施方式中，一种这类表位是人PD-1的表位并且另一种这类表位是CTLA-4的表位。在某些实施方式中，双特异性分子包括多于两个表位-结合位点。这类双特异性分子将结合至少一个PD-1的表位和至少一个CTLA-4的表位并且可进一步结合另外的PD-1的表位和/或另外的CTLA-4的表位。
本发明尤其涉及具有是它们能够协同结合至少一个PD-1的表位和至少一个CTLA-4的表位的抗体的表位-结合片段的PD-1 x CTLA-4双特异性分子(例如，双特异性抗体，双特异性双抗体，三价结合分子等)。协同选择这类分子的多肽结构域的VL和VH结构域，以便相同多肽链的VL结构域和VH结构域不能形成能够结合PD-1或CTLA-4的表位-结合位点。另外协同这样的选择，从而构成这类PD-1 x CTLA-4双特异性分子的多肽链组装形成对于至少一个PD-1的表位特异性的至少一个功能性抗原结合位点和对于至少一个CTLA-4的表位特异性的至少一个功能性抗原结合位点。
本发明尤其涉及这类PD-1 x CTLA-4双特异性分子，其相对于两个单特异性分子的这类活性展示增强的活性，在所述两个单特异性分子中，其中一个具有结合PD-1的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域和其中另一个具有结合CTLA-4的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。这类活性的例子包括减弱PD-1的活性、减弱CTLA-4的活性、增强免疫系统激活、增强效应子功能、增强抗肿瘤活性。如本文所使用，这样的活性的减弱指PD-1和/或CTLA-4抑制活性下降10％或更多、下降20％或更多、下降50％或更多、下降80％或更多或下降90％或更多，或完全消除这类PD-1和/或CTLA-4抑制活性。如本文所使用，这样的活性的增强指，相对于其中一个具有结合PD-1的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域和其中另一个具有结合CTLA-4的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域的两个单特异性分子展示的活性，通过PD-1和/或CTLA-4的表达存在介导的或或受PD-1和/或CTLA-4表达或存在影响的免疫系统-激活活性增强10％或更多、增强20％或更多、增强50％或更多、增强80％或更多、或增强90％或更多。免疫系统-激活活性的例子包括但不限于免疫细胞(例如，T-淋巴细胞、NK-细胞)增殖、免疫细胞产生和/或细胞因子的释放、免疫细胞产生和/或裂解分子(例如，粒酶、穿孔蛋白等)的释放和/或激活标志物的免疫细胞表达。在激活免疫系统时释放的细胞因子是本领域已知的，其包括但不限于：IFNγ、IL-2和TNFα(见，例如，Janeway Janeway,C.A.等2011)Immunobiology”第8版，Garland Science Publishing,NY；Banyer,J.L.(2000)“Cytokines in innate and adaptive immunity,”RevImmunogenet.2:359-373)。免疫细胞表达的激活标志物是本领域已知的并且包括但不限于CD69、CD25和CD107a(见，例如，Janeway,C.A.等(2011)Immunobiology”第8版GarlandScience Publishing,NY；Shipkova,M.和Wieland,E.(2012)“Surface markers oflymphocyte activation and markers of cell proliferation,”Clin Chim Acta 413:1338-1349)。
A.PD-1 x CTLA-4双特异性抗体
本发明包括能够同时结合PD-1和CTLA-4的双特异性抗体。在一些实施方式中，使用下面描述的任何方法产生能够同时结合PD-1和CTLA-4的双特异性抗体：PCT公开号WO1998/002463、WO 2005/070966、WO 2006/107786WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO2006/107617、WO 2007/046893、WO 2007/146968、WO 2008/003103、WO 2008/003116、WO2008/027236、WO 2008/024188、WO 2009/132876、WO 2009/018386、WO 2010/028797、WO2010028796、WO 2010/028795、WO 2010/108127、WO 2010/136172、WO 2011/086091、WO2011/133886、WO 2012/009544、WO 2013/003652、WO 2013/070565、WO 2012/162583、WO2012/156430、WO 2013/174873和WO 2014/022540，其每一篇通过引用以其整体并入本文。
B.缺少Fc区的PD-1 x CTLA-4双特异性双抗体
本发明的一个实施方式涉及双特异性双抗体，其包括第一多肽链和第二多肽链，并且最优选地由第一多肽链和第二多肽链构成，所述第一多肽链和第二多肽链的序列允许多肽链彼此共价结合，以形成能够同时结合PD-1和CTLA-4的共价缔合的双抗体。
双特异性双抗体的这类实施方式的第一多肽链在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能够结合PD-1或CTLA-4的单克隆抗体的VL结构域(即，VLPD-1或VLCTLA-4)、第一间插间隔体肽(连接体1)、能够结合CTLA-4(如果这类第一多肽链包含VLPD-1)或PD-1(如果这类第一多肽链包含VLCTLA-4)的单克隆抗体的VH结构域、任选地包含半胱氨酸残基的第二间插间隔体肽(连接体2)、异源二聚体促进结构域和C-末端(图1)。
双特异性双抗体的该实施方式的第二多肽链在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能够结合PD-1或CTLA-4的单克隆抗体的VL结构域(即，VLPD-1或VLCTLA-4，并且是未被选择包括在该双抗体的第一多肽链中的VL结构域)、间插间隔体肽(连接体1)、能够结合CTLA-4(如果这类第二多肽链包含VLPD-1)或PD-1(如果这类第二多肽链包含VLCTLA-4)的单克隆抗体的VH结构域、任选地包含半胱氨酸残基的第二间插间隔体肽(连接体2)、异源二聚体促进结构域和C-末端(图1)。
第一多肽链的VL结构域与第二多肽链的VH结构域相互作用，以形成对于第一抗原(即，PD-1或CTLA-4)特异性的第一功能性抗原-结合位点。同样地，第二多肽链的VL结构域与第一多肽链的VH结构域相互作用，以便形成对于第二抗原(即，CTLA-4或PD-1)特异性的第二功能性抗原-结合位点。因此，协同选择第一和第二多肽链的VL和VH结构域，以便双抗体的两条多肽链总共包括能够结合PD-1的表位和CTLA-4的表位的VL和VH结构域(即，它们总共包括VLPD-1/VHPD-1和VLCTLA-4/VHCTLA-4)。
最优选地，选择间插连接体肽(连接体1，其分开这类VL和VH结构域)的长度，以基本上或完全防止多肽链的VL和VH结构域彼此结合(例如由0、1、2、3、4、5、6、7、8或9个间插连接体氨基酸残基组成)。因此，第一多肽链的VL和VH结构域基本上或完全不能彼此结合。同样地，第二多肽链的VL和VH结构域基本上或完全不能彼此结合。优选的间插间隔体肽(连接体1)具有序列(SEQ ID NO:5)：GGGSGGGG。
基于促进这类二聚化的一个或多个多肽结构域(即，“异源二聚体促进结构域”)的选择来选择第二间插间隔体肽(连接体2)的长度和组成。典型地，第二间插间隔体肽(连接体2)包括3-20个氨基酸残基。尤其地，当采用的异源二聚体促进结构域(一个或多个)包括/不包括半胱氨酸残基时，使用包含半胱氨酸的第二间插间隔体肽(连接体2)。包含半胱氨酸的第二间插间隔体肽(连接体2)将包含1、2、3或更多个半胱氨酸。优选的包含半胱氨酸的间隔体肽(连接体2)具有序列SEQ ID NO:6：GGCGGG。可选地，连接体2不包括半胱氨酸(例如，GGG，GGGS(SEQ ID NO:7)、LGGGSG(SEQ ID NO:8)、GGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:9)、ASTKG(SEQID NO:10)、LEPKSS(SEQ ID NO:11)、APSSS(SEQ ID NO:12)等)并且使用包含半胱氨酸的异源二聚体促进结构域，如下面所描述。任选地，使用包含半胱氨酸的连接体2和包含半胱氨酸的异源二聚体促进结构域。
异源二聚体促进结构域在一条多肽链上可以是GVEPKSC(SEQ ID NO:13)或VEPKSC(SEQ ID NO:14)或AEPKSC(SEQ ID NO:15)，并且，在另一条多肽链上可以是GFNRGEC(SEQID NO:16)或FNRGEC(SEQ ID NO:17)(US2007/0004909)。
在优选的实施方式中，异源二聚体促进结构域将包括具有相反电荷的串联重复的螺旋结构域，例如，“E-螺旋”螺旋结构域(SEQ ID NO:18：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK)，其谷氨酸残基在pH 7形成负电荷，和“K-螺旋”结构域(SEQ ID NO:19：KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE)，其赖氨酸残基在pH 7形成正电荷。这类带电结构域的存在促进了第一和第二多肽之间的缔合，因此有助于异源二聚体形成。可以使用包括上述E-螺旋和K-螺旋序列的修饰的异源二聚体促进结构域，以便包括一个或多个半胱氨酸残基。这类半胱氨酸残基的存在允许在一条多肽链上存在的螺旋与另一多肽链上存在的互补螺旋成为共价结合的，从而彼此共价结合多肽链并且增加双抗体的稳定性。这样的尤其优选的例子是异源二聚体促进结构域包括修饰的E-螺旋，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:20)，和修饰的K-螺旋，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:21)。
如WO 2012/018687中公开，为了提高双抗体的体内药物代谢动力学特性，双抗体可被修饰，以在双抗体的一个或多个末端处包含血清结合蛋白的多肽部分。最优选地，血清结合蛋白的这类多肽部分设置在双抗体的C-末端。白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质并且在人中半衰期是19天。白蛋白具有若干小分子结合位点，这允许其非共价结合其他蛋白，从而延长它们的血清半衰期。链球菌属(Streptococcus)菌株G148的蛋白质G的白蛋白结合结构域3(ABD3)由形成稳定的三螺旋束的46个氨基酸残基组成并且具有广泛的白蛋白结合特异性(Johansson,M.U.等(2002)“Structure,Specificity,And Mode Of Interaction ForBacterial Albumin-Binding Modules,”J.Biol.Chem.277(10):8114-8120。因此，对于改善双抗体的体内药物代谢动力学特性，尤其优选的血清结合蛋白的多肽部分是来自链球菌蛋白质G的白蛋白结合结构域(ABD)，更优选地，链球菌属菌株G148的蛋白质G的白蛋白结合结构域3(ABD3)(SEQ ID NO:22)：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDEILAALP。
如在WO 2012/162068(通过引用并入本文)中公开，SEQ ID NO:22的“去免疫化”的变体具有削弱或消除II类MHC结合的能力。基于组合突变结果，对于形成这样的去免疫化的ABD，如下取代的组合被认为是优选的取代：66D/70S+71A、66S/70S+71A、66S/70S+79A、64A/65A/71A、64A/65A/71A+66S、64A/65A/71A+66D、64A/65A/71A+66E、64A/65A/79A+66S、64A/65A/79A+66D、64A/65A/79A+66E。变异的ABD具有修饰L64A、I65A和D79A或修饰N66S、T70S和D79A。具有下述氨基酸序列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID 66NAKS 70 A 71EGVKALIDE ILAALP(SEQ ID NO:23)，
或氨基酸序列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA 64 A 65NNAKT VEGVKALIA 79E ILAALP(SEQ ID NO:24)，
或氨基酸序列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS 66NAKS 70 VEGVKALIA 79E ILAALP(SEQ ID NO:25)，
的变异的去免疫化的ABD是尤其优选的，因为这类去免疫化的ABD展示基本上野生型结合，同时提供削弱的II类MHC结合。因此，具有ABD的这类双抗体的第一多肽链包含第三连接体(连接体3)，其优选地位于这类多肽链的E螺旋(或K螺旋)结构域的C-末端，以便插在E螺旋(或K螺旋)结构域和ABD(其优选地是去免疫化的ABD)之间。用于这类连接体3的优选的序列是SEQ IDNO:7：GGGS。
C.包含Fc区的PD-1 x CTLA-4双特异性双抗体
本发明的一个实施方式涉及能够同时结合PD-1和CTLA-4的包括Fc区的双特异性双抗体。添加IgG CH2-CH3结构域至双抗体多肽链之一或两条中，以便双抗体链的复合导致形成Fc区，延长了生物半衰期和/或改变了双抗体的价。将IgG CH2-CH3结构域并入到两条双抗体多肽上允许形成双链双特异性包含Fc-区域的双抗体(图2)。
可选地，仅仅在一条双抗体多肽上并入IgG CH2-CH3结构域允许形成更复杂的、包含Fc区的四链双特异性双抗体(图3A-3C)。图3C显示具有恒定轻链(CL)结构域和恒定重链CH1结构域的代表性四链双抗体，然而，可以可选地采用这类结构域的片段以及其他多肽(见，例如，图3A和3B，美国专利公开号2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；欧洲专利公开号EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221；和PCT公开号WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538)。因此，例如，代替CH1结构域，可采用源自人IgG的铰链区的、具有氨基酸序列GVEPKSC(SEQ ID NO:13)VEPKSC(SEQ ID NO:14)或AEPKSC(SEQ ID NO:15)的肽，并且代替CL结构域，可采用人κ轻链的C-末端6个氨基酸GFNRGEC(SEQID NO:16)或FNRGEC(SEQ ID NO:17)。包含代表性肽的四链双抗体显示在图3A中。可选地，或另外，可采用肽包括具有相反电荷的串联螺旋结构域的肽，比如“E-螺旋”螺旋结构域(SEQ ID NO:18：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK或SEQ ID NO:19：)；和“K-螺旋”结构域(SEQ ID NO:20：KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE或SEQ ID NO:21：)。代表性的、包含螺旋结构域的四链双抗体显示在图3B中。
本发明的包含Fc区的双特异性分子可包括另外的间插间隔体肽(连接体)，一般而言，这类连接体被并入在肽异源二聚体促进结构域(例如，E-螺旋或K-螺旋)和CH2-CH3结构域之间和/或CH2-CH3结构域和可变结构域(即，VH或VL)之间。典型地，另外的连接体将包括3-20个氨基酸残基。可在本发明的包含Fc区的双特异性双抗体分子中采用的连接体包括：GGGS(SEQ ID NO:7)、LGGGSG(SEQ ID NO:8)、GGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:9)、ASTKG(SEQ IDNO:10)、DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:26)、EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:27)、LEPKSS(SEQ IDNO:11)、APSSS(SEQ ID NO:28)和APSSSPME(SEQ ID NO:29)、LEPKSADKTHTCPPC SEQ ID NO:30)、GGC和GGG。SEQ ID NO:11可代替GGG或GGC使用，以易于克隆。另外，氨基酸GGG或SEQ IDNO:11之后紧接着是SEQ ID NO:26，以形成可选的连接体：GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:31)；和LEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:32)。除了连接体以外或代替连接体，本发明的包含Fc区的双特异性分子还可并入IgG铰链区。示例性铰链区包括：来自IgG1的EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:33)、来自IgG2的ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:34)、来自IgG4的ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:35)和ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:36)，包括稳定化S228P取代以减少链交换的IgG4铰链变体(如Kabat中阐释的EU索引编号)。
如图3A-3C中提供，本发明的包含Fc区的双特异性双抗体可包括四条不同的链。这类双抗体的第一和第三多肽链包含三个结构域：(i)包含VL1的结构域、(ii)包含VH2的结构域、(iii)异源二聚体-促进结构域、和(iv)包含CH2-CH3序列的结构域。第二和第四多肽链包含：(i)包含VL2的结构域、(ii)包含VH1的结构域和(iii)异源二聚体-促进结构域，其中异源二聚体-促进结构域促进第一/第三多肽链与第二/第四多肽链的二聚化。第三和第四多肽链的VL和/或VH结构域，以及第一和第二多肽链的VL和/或VH结构域可以相同或不同，以便允许单特异性、双特异性或四特异性的四价结合。符号“VL3”和“VH3”分别表示结合这类双抗体的“第三”表位的轻链可变结构域和可变重链结构域。类似地，符号“VL4”和“VH4”分别表示结合这类双抗体的“第四”表位的轻链可变结构域和可变重链结构域。本发明的包含Fc区的、代表性四链双特异性双抗体的多肽链的一般结构提供在表1中：
HPD＝异源二聚体促进结构域
在具体的实施方式中，本发明的双抗体是双特异性的、四价(即，具有四个表位-结合位点)、包含Fc的双抗体，其由总共四条多肽链构成(图3A-3C)。本发明的双特异性、四价、包含Fc的双抗体包括对于PD-1免疫特异性的两个表位-结合位点(其可能够结合相同的PD-1的表位或不同的PD-1的表位)，和对于CTLA-4免疫特异性的两个表位-结合位点(其可能够结合相同的CTLA-4的表位或不同的CTLA-4的表位)。
在进一步的实施方式中，包含Fc区的双特异性双抗体可包括三条多肽链。这类双抗体的第一多肽包含三个结构域：(i)包含VL1的结构域、(ii)包含VH2的结构域和(iii)包含CH2-CH3序列的结构域。这类双抗体的第二多肽包含：(i)包含VL2的结构域、(ii)包含VH1的结构域和(iii)促进与双抗体的第一多肽链异源二聚化和共价结合的结构域。这类双抗体的第三多肽包括CH2-CH3序列。因此，这类双抗体的第一和第二多肽链缔合在一起，以形成能够结合第一表位(即，PD-1或CTLA-4)的VL1/VH1结合位点，以及能够结合第二表位(即，CTLA-4或PD-1)的VL2/VH2结合位点。第一和第二多肽通过涉及在它们各自的第三结构域中的半胱氨酸残基的二硫键彼此结合。值得注意的是，第一和第三多肽链彼此复合，以形成经二硫键稳定的Fc区。这类双特异性双抗体具有增强的效价。图4A和4B阐释了这类双抗体的结构。这类包含Fc区的双特异性的双抗体可具有两个取向之一(表2):
HPD＝异源二聚体促进结构域
在具体的实施方式中，本发明的双抗体是双特异性、二价(即，具有两个表位-结合位点)、包含Fc的双抗体，其由总共三条多肽链构成(图4A-4B)。本发明的双特异性、二价、包含Fc的双抗体包括对于PD-1免疫特异性的一个表位-结合位点，和对于CTLA-4特异性的一个表位-结合位点。
在进一步的实施方式中，包含Fc区的双特异性双抗体可包括总共五条多肽链。在具体的实施方式中，五条多肽链的两条具有相同的氨基酸序列。这类双抗体的第一多肽链包含：(i)包含VH1的结构域、(ii)包含CH1的结构域和(iii)包含CH2-CH3序列的结构域。第一多肽链可以是抗体的重链，其包含VH1和重链恒定结构域。这类双抗体的第二和第五条多肽链包含：(i)包含VL1的结构域和(ii)包含CL的结构域。这类双抗体的第二和/或第五多肽链可以是抗体的轻链，其包含与第一/第三多肽链的VH1互补的VL1。第一、第二和/或第五多肽链可分离自天然产生的抗体。可选地，它们可以是重组构建的。这类双抗体的第三多肽链包含：(i)包含VH1的结构域、(ii)包含CH1的结构域、(iii)包含CH2-CH3序列的结构域、(iv)包含VL2的结构域、(v)包含VH3的结构域和(vi)异源二聚体-促进结构域，其中异源二聚体-促进结构域促进第三链与第四链的二聚化。这类双抗体的第四多肽包含：(i)包含VL3的结构域、(ii)包含VH2的结构域和(iii)促进与双抗体的第三多肽链异源二聚化和共价结合的结构域。
因此，这类双抗体的第一和第二，以及第三和第五多肽链缔合在一起，以形成能够结合第一表位的两个VL1/VH1结合位点。这类双抗体的第三和第四多肽链缔合在一起，以形成能够结合第二表位的VL2/VH2结合位点，以及能够结合第三表位的VL3/VH3结合位点。第一和第三多肽通过涉及在它们各自恒定区中的半胱氨酸残基的二硫键彼此结合。值得注意的是，第一和第三多肽链彼此复合，以形成Fc区。这类双特异性双抗体具有增强的效价。图5图解了这类双抗体的结构。应当理解，VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3结构域可以相同或不同，以便允许单特异性、双特异性或三特异性的结合。但是，如本文所提供，优选地选择这些结构域，以便结合PD-1和CTLA-4。
选择多肽链的VL和VH结构域，以便形成对于期望的表位特异性的VL/VH结合位点。通过多肽链的缔合形成的VL/VH结合位点可以相同或不同，以便允许单特异性、双特异性、三特异性或四特异性的四价结合。尤其地，可选择VL和VH结构域，以便双特异性双抗体可包括针对第一表位的两个结合位点和针对第二表位的两个结合位点，或针对第一表位的三个结合位点和针对第二表位的一个结合位点，或针对第一表位的两个结合位点，针对第二表位的一个结合位点和针对第三表位的一个结合位点(如图5中所描绘)。本发明的代表性包含Fc区的五链双抗体的多肽链的一般结构提供在表3中:
HPD＝异源二聚体促进结构域
在具体的实施方式中，本发明的双抗体是双特异性、四价(即，具有四个表位-结合位点)、包含Fc的双抗体，其由总共五条多肽链构成，具有对于PD-1免疫特异性的两个表位-结合位点(其可能够结合相同的PD-1的表位或不同的PD-1的表位)，和对于CTLA-4特异性的两个表位-结合位点(其可能够结合相同的CTLA-4的表位或不同的CTLA-4的表位)。在另一实施方式中，本发明的双特异性、四价、包含Fc的双抗体包括对于PD-1免疫特异性的三个表位-结合位点(其可能够结合相同的PD-1的表位或两个或三个不同的PD-1的表位)，和对于CTLA-4特异性的一个表位-结合位点。在另一实施方式中，本发明的双特异性、四价、包含Fc的双抗体包括对于PD-1免疫特异性的一个表位-结合位点，和对于CTLA-4特异性的三个表位-结合位点(其可能够结合相同的CTLA-4的表位或两个或三个不同的CTLA-4的表位)。
D.包含Fc区的PD-1 x CTLA-4双特异性三价结合分子
本发明的进一步实施方式涉及包括Fc区的双特异性三价结合分子，其包括能够同时结合PD-1的表位和CTLA-4上存在的表位。这类双特异性三价结合分子包括三个表位-结合位点，其中两个是双抗体型结合结构域，其提供结合位点A和结合位点B，并且其中一个是Fab型结合结构域(或scFv型结合结构域)，其提供结合位点C(见，例如，图6A-6F，和PCT公布号：PCT/US15/33081；和PCT/US15/33076)。这类双特异性三价分子因此包括能够结合第一表位的“VL1”/“VH1”结构域和能够结合第二表位的“VL2”/“VH2”结构域和能够结合这类三价分子的“第三”表位的“VL3”和“VH3”结构域。“双抗体型结合结构域”是双抗体，尤其是双抗体中存在的表位-结合位点的类型，如上所述。每个“Fab型结合结构域”和“scFv型结合结构域”是通过免疫球蛋白轻链的VL结构域和免疫球蛋白重链的互补VH结构域相互作用形成的表位-结合位点。Fab型结合结构域与双抗体型结合结构域的差异在于形成Fab型结合结构域的两条多肽链仅仅包括单个表位-结合位点，而形成双抗体型结合结构域的两条多肽链包括至少两个表位-结合位点。类似地，scFv型结合结构域与双抗体型结合结构域的差异也在于它们仅仅包括单个表位-结合位点。因此，如本文使用的Fab型和scFv型结合结构域与双抗体型结合结构域不同。
典型地，本发明的三价结合分子包括四条不同的多肽链(见图6A-6B)，但是，例如，通过彼此融合这类多肽链(例如，经肽键)或通过分开这类多肽链，以形成另外的多肽链，或通过经二硫键缔合更少的或另外的多肽链，分子可包括更少或更多数量的多肽链。图6C-6F通过示意性描绘具有三条多肽链的这类分子阐释了本发明的这个方面。如图6A-6F中提供的，本发明的三价结合分子可具有可选的取向，其中双抗体型结合结构域在Fc区的N-末端(图6A、6C和6D)或C-末端(图6B、6E和6F)。
在某些实施方式中，本发明的这类三价结合分子的第一多肽链包含：(i)包含VL1的结构域、(ii)包含VH2的结构域、(iii)异源二聚体-促进结构域和(iv)包含CH2-CH3序列的结构域。VL1和VL2结构域位于包含CH2-CH3的结构域的N-末端或C-末端，如表4(也见图6A和6B)中所显示。这类实施方式的第二多肽链包含：(i)包含VL2的结构域、(ii)包含VH1的结构域和(iii)异源二聚体-促进结构域。这类实施方式的第三多肽链包含：(i)包含VH3的结构域、(ii)包含CH1的结构域和(iii)包含CH2-CH3序列的结构域。第三多肽链可以是包含VH3和重链恒定区的抗体的重链，或包含这样的结构域的多肽。这类实施方式的第四多肽包含：(i)包含VL3的结构域和(ii)包含CL的结构域。第四多肽链可以是包含与第三多肽链的VH3互补的VL3的抗体的轻链，或包含这样的结构域的多肽。第三或第四多肽链可分离自天然产生的抗体。可选地，它们可经重组、合成通过其方式而构建。
第一和第二多肽链的轻链可变结构域通过间插间隔体肽与这类多肽链的重链可变结构域分开，所述间插间隔体肽长度太短而不允许它们的VL1/VH2(或它们的VL2/VH1)结构域缔合在一起形成能够结合第一或第二表位的表位结合位点。用于该目的的优选间插间隔体肽(连接体1)具有序列(SEQ ID NO:9)：GGGSGGGG。三价结合分子的其他结构域可通过任选地包括半胱氨酸残基的一个或多个间插间隔体肽(连接体)分开。尤其地，如上面提供，这类连接体通常被并入在可变结构域(即，VH或VL)和肽异源二聚体促进结构域(例如，E-螺旋或K-螺旋)之间和这类肽异源二聚体促进结构域(例如，E-螺旋或K-螺旋)和CH2-CH3结构域之间。上面提供了用于产生三价结合分子的示例性连接体，并且其也提供在PCT公布号：PCT/US15/33081和PCT/US15/33076中。因此，这类三价结合分子的第一和第二多肽链缔合在一起，形成能够结合第一表位的VL1/VH1结合位点，以及能够结合第二表位的VL2/VH2结合位点。这类三价结合分子的第三和第四多肽链缔合在一起而形成能够结合第三表位的VL3/VH3结合位点。
如上述，本发明的三价结合分子可包括三条多肽。包括三条多肽链的三价结合分子可通过将第四多肽N-末端的结构域连接至第三多肽的包含VH3的结构域(例如，使用间插间隔体肽(连接体4))而获得。可选地，使用包含下述结构域的本发明的三价结合分子的第三多肽链：(i)包含VL3的结构域、(ii)包含VH3的结构域和(iii)包含CH2-CH3序列的结构域，其中VL3和VH3通过间插间隔体肽彼此间隔开，所述间插间隔体肽足够长(至少9个或更多个氨基酸残基)，以便允许这些结构域的缔合形成表位-结合位点。对于该目的，一个优选的间插间隔体肽具有序列：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)。
应当理解，这类三价结合分子的VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3结构域可以不同，以便允许双特异性或三特异性的结合。但是，如本文提供的，选择这些结构域以便提供能够结合PD-1和CTLA-4的三价结合分子。
尤其地，可选择VL和VH结构域，以便三价结合分子包括针对PD-1的两个结合位点(其可能够结合相同的PD-1的表位或不同的PD-1的表位)和针对CTLA-4的一个结合位点，或针对PD-1的一个结合位点和针对CTLA-4的两个结合位点(其可能够结合相同的CTLA-4的表位或不同的CTLA-4的表位)，或针对PD-1的一个结合位点、针对CTLA-4的一个结合位点和针对不是PD-1或CTLA-4的第三抗原的一个结合位点。本发明代表性三价结合分子的多肽链的一般结构提供在图6A-6F和表4中：
HPD＝异源二聚体促进结构域
本发明的一个实施方式涉及双特异性三价结合分子，其包括针对PD-1的两个表位-结合位点和针对CTLA-4的一个表位-结合位点。
针对PD-1的两个表位-结合位点可结合相同的表位或不同的表位。本发明的另一实施方式涉及双特异性三价结合分子，其包括针对PD-1的一个表位-结合位点和针对CTLA-4的两个表位-结合位点。针对CTLA-4的两个表位-结合位点可结合相同的CTLA-4的表位或不同的CTLA-4的表位。如上面提供，这类双特异性三价结合分子可包括三、四、五或更多条多肽链。
V.恒定结构域和Fc区
本文提供了用于产生本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子(例如，抗体、双抗体、三价结合分子等)的抗体恒定结构域。
优选的CL结构域是人IgG CLκ结构域。示例性人CLκ结构域的氨基酸序列是(SEQID NO:38)：
可选地，示例性CL结构域是人IgG CLλ结构域。示例性人CLλ结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:39)：
如本文提供的，本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子可包括Fc区。本发明的这类分子的Fc区可以属于任何同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子可进一步包括CH1结构域和/或铰链区。当存在时，CH1结构域和/或铰链区可以属于任何同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，并且优选地与期望的Fc区属于相同的同种型。
示例性CH1结构域是人IgG1CH结构域。示例性人IgG1CH1结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:40)：
示例性CH1结构域是人IgG2CH结构域。示例性人IgG2CH1结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:41)：
示例性CH1结构域是人IgG4 CH1结构域。示例性人IgG4 CH1结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:42)：
一个示例性铰链区是人IgG1铰链区。示例性人IgG1铰链区的氨基酸序列是(SEQID NO:33)：EPKSCDKTHTCPPCP。
另一示例性铰链区是人IgG2铰链区。示例性人IgG2铰链区的氨基酸序列是(SEQID NO:34)：ERKCCVECPPCP。
另一示例性铰链区是人IgG4铰链区。示例性人IgG4铰链区的氨基酸序列是(SEQID NO:35)：ESKYGPPCPSCP。如本文所描述，IgG4铰链区可包括稳定化突变比如S228P取代。示例性稳定化IgG4铰链区的氨基酸序列是(SEQ ID NO:36)：ESKYGPPCPPCP。
本发明的包含Fc区的分子(例如，抗体、双抗体、三价分子等)的Fc区可以是完整的Fc区(例如，完整的IgG Fc区)或仅仅Fc区的片段。任选地，本发明的包含Fc区的分子的Fc区缺少C-末端赖氨酸氨基酸残基。
在传统的免疫功能中，抗体-抗原复合物与免疫系统的细胞的相互作用产生各种各样的应答，范围从效应子功能，比如抗体依赖性细胞毒性、肥大细胞脱粒和吞噬，到免疫调节信号，比如调节淋巴细胞增殖和抗体分泌。所有这些相互作用通过抗体或免疫复合物的Fc区与造血细胞上专用细胞表面受体的结合来启动。由抗体和免疫复合物引发的细胞应答的多样性由三种Fc受体：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的结构异质性造成。FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)和FcγRIII(CD16)是激活(即，免疫系统增强)性受体；FcγRIIB(CD32B)是抑制(即，免疫系统抑制)性受体。另外，与新生Fc受体(FcRn)的相互作用介导IgG分子从内体至细胞表面的再循环并且释放进入血液中。上面呈现了示例性野生型IgG1(SEQ ID NO:1)、IgG2(SEQ ID NO:2)、IgG3(SEQ ID NO:3)和IgG4(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。
Fc区的修饰可导致改变的表型，例如改变的血清半衰期、改变的稳定性、改变的对细胞酶的易感性或改变的效应子功能。因此，就效应子功能而言，可期望修饰本发明的包含Fc区的PD-1 x CTLA-4双特异性分子，例如，以便增强这类分子治疗癌症的效力。在某些情况下，例如在作用机制涉及阻断或拮抗，但是不杀伤携带靶抗原的细胞的抗体的情况下，期望降低或消除效应子功能。当涉及非期望的细胞，比如肿瘤和外源细胞时，其中FcγRs以低水平表达，例如，具有低水平的FcγRIIB肿瘤特异性B细胞(例如，非霍奇金淋巴瘤、CLL和伯基特淋巴瘤)，一般期望增加的效应子功能。本发明的分子具有这样的赋予的或改变的效应子功能活性，可用于治疗和/或预防其中期望增强的效应子功能活性效力的疾病、病症或感染。
因此，在某些实施方式中，本发明的包含Fc区的分子的Fc区可以是工程化的变异的Fc区。尽管本发明双特异性包含Fc区的分子的Fc区可以具有结合一个或多个Fc受体(例如，FcγR)的能力，但是更优选地这类变异的Fc区具有对FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)改变的结合(相对于野生型Fc区展示的结合)，例如，具有与激活性受体增强的结合和/或具有对抑制性受体基本上降低的结合能力或没有结合抑制性受体的能力。因此，本发明包含Fc区的分子的Fc区可包括完整的Fc区的一些或所有CH2结构域和/或一些或所有CH3结构域，或可包括变异的CH2和/或变异的CH3序列(其相对于完整的Fc区的CH2或CH3结构域，可包括，例如，一个或多个插入和/或一个或多个缺失)。这类Fc区可包括非Fc多肽部分，或可包括非天然完整Fc区的部分，或可包括非天然产生的取向的CH2和/或CH3结构域(比如，例如，两个CH2结构域或两个CH3结构域，或者在N-末端至C-末端方向上，连接至CH2结构域的CH3结构域等)。
鉴定为改变效应子功能的Fc区修饰是本领域已知的，包括增加与激活性受体(例如，FcγRIIA(CD16A)的结合的修饰和减少与抑制性受体(例如，FcγRIIB(CD32B)结合的修饰(例如，FcγRIIB(CD32B)(见，例如，Stavenhagen,J.B.等(2007)“Fc Optimization OfTherapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In VitroAnd Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating FcgammaReceptors,”Cancer Res.57(18):8882-8890)。表5列举了示例性修饰的示例性单、双、三、四和五取代(相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列)，其增加了与激活性受体的结合和/或降低了与抑制性受体的结合。
具有具有与CD32B降低的结合和/或与CD16A增加的结合的人IgG1 Fc区的示例性变体包含F243L、R292P、Y300L、V305I或P296L取代。这些氨基酸取代可以以任何组合存在于人IgG1 Fc区中。在一个实施方式中，人IgG1 Fc区变体包含F243L、R292P和Y300L取代。在另一实施方式中，人IgG1 Fc区变体包含F243L、R292P、Y300L、V305I和P296L取代。
在某些实施方式中，本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的Fc区优选地展示对FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)降低的(或基本上没有)结合(相对于野生型IgG1 Fc区(SEQ ID NO:1)展示的结合)。在具体的实施方式中，本发明的包括IgG Fc区的PD-1 xCTLA-4双特异性分子展示降低的ADCC效应子功能。在优选的实施方式中，这类PD-1 x CTLA-4双特异性分子的CH2-CH3结构域包括下述的任何1、2、3或4个取代：L234A、L235A、D265A、N297Q和N297G。在另一实施方式中，CH2-CH3结构域包含N297Q取代、N297G取代、L234A和L235A替换或D265A取代，因为这些突变消除了FcR结合。可选地，使用固有地展示对FcγRIIIA(CD16a)降低的(或基本上没有)结合和/或降低的效应子功能(相对于野生型IgG1 Fc区(SEQ ID NO:1)展示的结合和效应子功能)的天然产生的Fc区的CH2-CH3结构域。在具体的实施方式中，本发明的PD-1 xCTLA-4双特异性分子包括IgG2 Fc区(SEQ ID NO:2)或IgG4 Fc区(SEQ ID:NO:4)。当使用IgG4 Fc区时，本发明也包括引入稳定化突变，比如上述的铰链区S228P取代(见，例如，SEQID NO:36)。因为N297G、N297Q、L234A、L235A和D265A取代消除了效应子功能，在期望效应子功能的情况下，优选地将不采用这些取代。
对于具有降低的或消除的效应子功能的本发明的包含Fc区的分子的CH2和CH3结构域，优选的IgG1序列包括取代L234A/L235A(SEQ ID NO:43)：
其中，X是赖氨酸(K)或不存在。
可通过增加Fc区对于FcRn的结合亲和力而延长包括Fc区的蛋白质的血清半衰期。如本文使用的术语“半衰期”意思是分子的药物代谢动力学性质，是对在其施用之后分子的平均生存时间的衡量。半衰期可表示为从受试者的身体(例如，人患者或其他哺乳动物)或其特定区室消除百分之五十(50％)的已知量的分子需要的时间，例如，如在血清中测量的，即，循环半衰期，或在其他组织中测量的。一般而言，半衰期的增加导致施用的分子在循环中的平均停留时间(MRT)的增加。
在一些实施方式中，本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子包括变异的Fc区，其中变异的Fc区相对于野生型Fc区包括至少一个氨基酸修饰，使得分子具有延长的半衰期(相对于包括野生型Fc区的分子)。在一些实施方式中，本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子包括变异的IgG Fc区，其中变异的Fc区在选自下述的一个或多个位置处包括延长半衰期的氨基酸取代：238、250、252、254、256、257、256、265、272、286、288、303、305、307、308、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428、433、434、435和436。能够延长包含Fc区的分子的半衰期的许多突变是本领域已知的，包括，例如M252Y、S254T、T256E和其组合。例如，见美国专利号6,277,375、7,083,784、7,217,797、8,088,376；美国公开号2002/0147311、2007/0148164；和国际公开号WO 98/23289、WO 2009/058492和WO 2010/033279中描述的突变，其通过引用以它们的整体并入本文。具有延长的半衰期的PD-1 xCTLA-4双特异性分子也包括具有在Fc区残基250、252、254、256、257、288、307、308、309、311、378、428、433、434、435和436中的两个或更多个处包括取代的变异的Fc区的那些。尤其地，两个或更多个取代选自：T250Q、M252Y、S254T、T256E、K288D、T307Q、V308P、A378V、M428L、N434A、H435K和Y436I。
在具体的实施方式中，PD-1 x CTLA-4双特异性分子具有变异的IgG Fc区，其包括下述取代：
(A)M252Y、S254T和T256E；
(B)M252Y和S254T；
(C)M252Y和T256E；
(D)T250Q和M428L；
(E)T307Q和N434A；
(F)A378V和N434A；
(G)N434A和Y436I；
(H)V308P和N434A；或
(I)K288D和H435K。
在优选的实施方式中，PD-1 x CTLA-4双特异性分子具有变异的IgG Fc区，其包括下述的任何1、2或3个取代：M252Y、S254T和T256E。本发明进一步包括具有变异的Fc区的PD-1 x CTLA-4双特异性分子，所述变异的Fc区包括：
(A)改变效应子功能和/或FcγR的一个或多个突变；和
(B)延长血清半衰期的一个或多个突变。
对于具有增加的血清半衰期的本发明的包含Fc区的分子的CH2和CH3结构域，优选的IgG1序列包括取代M252Y、S254T和T256E(SEQ ID NO:80)：
其中，X是赖氨酸(K)或不存在。
如将注意到，SEQ ID NO:80的CH2-CH3结构域包括用丙氨酸在234和235位的取代，并且因此形成展示与FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)降低的(或基本上没有)结合的Fc区(相对于由野生型Fc区(SEQ ID NO:1)展示的结合)。本发明也包括这类IgG1 CH2-CH3结构域，其包括野生型丙氨酸残基，修饰Fc区的效应子功能和/或FγR结合活性的可选的和/或另外的取代。
对于具有延长的血清半衰期的本发明的包含Fc区的分子的CH2和CH3结构域，优选的IgG4序列包括取代M252Y、S254T和T256E(SEQ ID NO:81)：
其中，X是赖氨酸(K)或不存在。
对于其含有Fc区的第一和第三多肽链不一致的某些抗体、双抗体和三价结合分子，期望减少或防止两个第一多肽链的CH2-CH3结构域之间或两个第三多肽链的CH2-CH3结构域之间发生同源二聚化。这类多肽链的CH2和/或CH3结构域不需要序列相同，并且有利地被修饰以促进两条多肽链之间的复合。例如，氨基酸取代(优选以包括形成“杵(knob)”的大侧基的氨基酸例如色氨酸进行取代)可被引入CH2或CH3结构域中，以便空间干扰将防止与类似的突变结构域的相互作用并将迫使突变的结构域与其中互补或适应性突变已经被工程化的结构域——即“臼(hole)”(例如，用甘氨酸取代)——配对。这样的突变组可被工程化到任意对的、包括形成Fc区的CH2-CH3结构域的多肽中，以促进异源二聚化。蛋白质工程化以相对于同源二聚化利于异源二聚化的方法在本领域中是悉知的，尤其就工程化免疫球蛋白样分子而言，这些都包括在本文中(见例如，Ridgway等(1996)“‘Knobs-Into-Holes’Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,”Protein Engr.9:617-621；Atwell等(1997)“Stable Heterodimers From Remodeling TheDomain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,”J.Mol.Biol.270:26-35；和Xie等(2005)“A New Format Of Bispecific Antibody:HighlyEfficient Heterodimerization,Expression And Tumor Cell Lysis,”J.Immunol.Methods 296:95-101；其每一篇通过引用以其整体并入本文)。
通过修饰IgG Fc区以包含修饰T366W而产生优选的杵。通过修饰IgG Fc区以包含修饰T366S、L368A和Y407V而产生优选的臼。为了有助于从最终的双特异性的、异源二聚化的、包含Fc区的分子中纯化含臼的第三多肽链同源二聚体，优选地通过在435位的氨基酸取代(H435R)突变第三多肽链的含臼的CH2和CH3结构域的蛋白质A结合位点。因此，含臼的第三多肽链同源二聚体不结合蛋白质A，而双特异性的异源二聚体经在第一多肽链上的蛋白质A结合位点而保持其结合蛋白质A的能力。在可选的实施方式中，含臼的第三多肽链可并入在434和435位的氨基酸取代(N434A/N435K)。
对于本发明包含Fc区域的分子的第一多肽链的CH2和CH3结构域，优选的IgG1氨基酸序列具有“包含杵的”序列(SEQ ID NO:44)：
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
对于具有两条多肽链的本发明的包含Fc区域的分子的第二多肽链(或具有三、四或五条多肽链的包含Fc区域的分子的第三多肽链)的CH2和CH3结构域，优选的IgG1氨基酸序列具有“包含臼的”序列(SEQ ID NO:45)：
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
如将注意到，SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45的CH2-CH3结构域包括在234和235位用丙氨酸的取代，并且因此形成展示与FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)降低的(或基本上没有)结合的Fc区(相对于野生型Fc区(SEQ ID NO:1)展示的结合)。本发明也包括这类IgG1 CH2-CH3结构域，其包括野生型丙氨酸残基，修饰Fc区的效应子功能和/或FγR结合活性的可选的和/或另外取代。本发明也包括这类CH2-CH3结构域，其进一步包括一个或多个延长半衰期的氨基酸取代。尤其地，如上面提供，本发明包括这类包含臼的和这类包含杵的CH2-CH3结构域，其进一步包括M252Y/S254T/T256E。
对于本发明包含Fc区的分子的第一多肽链的进一步包括M252Y/S254T/T256E的CH2和CH3结构域，优选的IgG1氨基酸序列具有“包含杵的”序列(SEQ ID NO:82)：
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
对于本发明具有两条多肽链的、包含Fc区的分子的第二多肽链(或具有三、四或五条多肽链的包含Fc区的分子的第三多肽链)的进一步包括M252Y/S254T/T256E的CH2和CH3结构域，优选的IgG1氨基酸序列具有“包含臼的”序列(SEQ ID NO:83)：
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
对于本发明的包含Fc区的分子的第一多肽链的包括M252Y/S254T/T256E的CH2和CH3结构域，优选的IgG4氨基酸序列具有“包含杵的”序列(SEQ IDNO:84)：
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
对于本发明具有两条多肽链的、包含Fc区的分子的第二多肽链(或具有三、四或五条多肽链的包含Fc区的分子的第三多肽链)的包括M252Y/S254T/T256E的CH2和CH3结构域，优选的IgG4氨基酸序列具有“包含臼的”序列(SEQ IDNO:85)：
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
如将注意到，SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:85的CH2-CH3结构域包括M252Y/S254T/T256E取代，并且因此形成展示延长的血清半衰期的IgG4Fc区。本发明也包括IgG4 CH2-CH3结构域，其包括野生型M252/S254/T256残基。
优选地，第一多肽链具有“包含杵的”CH2-CH3序列，比如SEQ ID NO:44的序列。但是，如将认识到，“包含臼的”CH2-CH3结构域(例如，SEQ ID NO:45)可用于第一多肽链中，在这类情况下，“包含杵的”CH2-CH3结构域(例如，SEQ ID NO:44)用于本发明具有两条多肽链的、包含Fc区的分子的第二多肽链中(或用于具有三、四或五条多肽链的包含Fc区的分子的第三多肽链中)。
在其他实施方式中，本发明包括PD-1 x CTLA-4双特异性分子，其包括使用本领域已知的突变已经被工程化成相对于同源二聚化利于异源二聚化的CH2和/或CH3结构域，比如PCT公开号WO 2007/110205、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/06867中公开的那些，其所有通过引用以其整体并入本文。
VI.抗PD-1结合能力
对于PD-1免疫特异性的抗体是已知的(见，例如，美国专利申请号62/198,867、62/239,559、62/255,140；美国专利号8,008,449、8,552,154；PCT专利公开WO 2012/135408、WO2012/145549和WO 2013/014668)。可用于产生本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的优选的PD-1结合能力能够结合人PD-1(CD279)的连续或不连续(例如，构象)部分(表位)并且优选地也展示结合一个或多个非人物种，尤其是灵长类物种(和尤其是灵长类物种，比如食蟹猴)的PD-1分子的能力。可通过分离使用PD-1或其肽片段引起的分泌抗体的杂交瘤来制备另外期望的抗体。代表性人PD-1多肽(NCBI序列NP_005009.2；包括20个氨基酸残基信号序列，加下划线显示)和268个氨基酸残基成熟蛋白质)具有氨基酸序列(SEQ ID NO:46)：
可用于产生本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的优选的抗PD-1结合分子(例如，抗体)具有下述抗体的VL和/或VH结构域：抗人PD-1单克隆抗体“PD-1 mAb 1”(尼鲁单抗(nivolumab)，CAS登记号:946414-94-4，也称为5C4、BMS-936558、ONO-4538、MDX-1106并且由Bristol-Myers Squibb以售卖)；“PD-1 mAb 2”(派姆单抗(pembrolizumab)，(之前称为兰罗利珠单抗(lambrolizumab))，CAS登记号:1374853-91-4，也称为MK-3475、SCH-900475，并且由Merck以售卖)；“PD-1 mAb 3”(EH12.2H7；Dana Farber)，“PD-1 mAb 4”(皮地珠单抗，CAS登记号：1036730-42-3，也称为CT-011，CureTech,)，或表6中的任何抗PD-1抗体；并且更优选地具有这类抗PD-1单克隆抗体的VL区的1、2或所有3个CDRL和/或VH结构域的1、2或所有3个CDRH。最近已经鉴定了可用于本发明的方法和组合物的、具有独特的结合特征的另外的抗PD-1抗体(见，美国专利申请号62/198,867、62/239,559、62/255,140)。尤其地，优选的是具有下述抗体的人源化的VH和/或VL结构域的PD-1-结合分子：抗PD-1抗体“PD-1 mAb 5”(hPD-1 mAb 2，MacroGenics)；“PD-1 mAb6”(hPD-1 mAb 7，MacroGenics)；“PD-1 mAb 7”(hPD-1 mAb 9，MacroGenics)；或“PD-1 mAb 8”(hPD-1 mAb 15，MacroGenics)；和更优选地具有这类人源化的抗PD-1单克隆抗体的VL区的1、2或所有3个CDRL和/或VH结构域的1、2或所有3个CDRH。
A.PD-1 mAb 1
PD-1 mAb 1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:47)显示在下方(CDRH残基加下划线显示)。
PD-1 mAb 1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:48)显示在下方(CDRL残基加下划线显示)。
B.PD-1 mAb 2
PD-1 mAb 2的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:49)显示在下方(CDRH残基加下划线显示)。
PD-1 mAb 2的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:50)显示在下方(CDRL残基加下划线显示)。
C.PD-1 mAb 3
PD-1 mAb 3的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:51)显示在下方(CDRH残基加下划线显示)。
PD-1 mAb 3的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:52)显示在下方(CDRL残基加下划线显示)。
D.PD-1 mAb 4
PD-1 mAb 4的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:53)显示在下方(CDRH残基加下划线显示)。
PD-1 mAb 4的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:54)显示在下方(CDRL残基加下划线显示)。
E.PD-1 mAb 5
PD-1 mAb 5的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:55)显示在下方(CDRH残基加下划线显示)。
PD-1 mAb 5的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:56)显示在下方(CDRL残基加下划线显示)。
F.PD-1 mAb 6
PD-1 mAb 6的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:57)显示在下方(CDRH残基加下划线显示)。
其中X1是I或A
PD-1 mAb 6的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:58)显示在下方(CDRL残基加下划线显示)。
其中：X1是N或S和X2是Q或R；或
X1是N并且X2是Q；或
X1是S并且X2是Q；或
X1是S并且X2是R
在具体的实施方式中，PD-1 mAb 6的氨基酸序列包括：
(a)SEQ ID NO:57，其中X1是I；和SEQ ID NO:58，其中X1是N并且X2是Q；或
(b)SEQ ID NO:57，其中X1是I；和SEQ ID NO:58，其中X1是S并且X2是Q。
命名为“PD-1 mAb 6-I VH”的示例性抗PD-1VH结构域包括SEQ ID NO:57，其中X1是I并且具有氨基酸序列(SEQ ID NO:86)：
命名为“PD-1 mAb 6-SQ VL”的示例性抗PD-1 VL结构域包括SEQ ID NO:58，其中X1是S并且X2是Q并且具有氨基酸序列(SEQ ID NO:87)：
具有PD-1 mAb 6-I VH结构域和PD-1 mAb 6-SQ VL结构域的示例性抗PD-1抗体命名为“PD-1 mAb 6-ISQ”。
G.PD-1 mAb 7
PD-1 mAb 7的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:59)显示在下方(CDRH残基加下划线显示)。
其中：X1是V或A；X2是S或G；X3是V或T；X4是L或A；或
X1是V，X2是S，X3是V，和X4是L；或
X1是A，X2是G，X3是T，和X4是A
PD-1 mAb 7的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:60)显示在下方(CDRL残基加下划线显示)。
其中：X1是S或N和X2是N或D；或X1是S并且X2是N；或
X1是N并且X2是D
在具体的实施方式中，PD-1 mAb 7包括：
(a)SEQ ID NO:59，其中X1是V，X2是S，X3是V，和X4是L；和SEQ ID NO:60，其中X1是S并且X2是N；或
(b)SEQ ID NO:59，其中X1是A，X2是G，X3是T，和X4是A；和SEQ ID NO:60，其中X1是N并且X2是D。
H.PD-1 mAb 8
PD-1 mAb 8的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:61)显示在下方(CDRH残基加下划线显示)。
PD-1 mAb 8的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:62)显示在下方(CDRL残基加下划线显示)。
I.另外的抗PD-1抗体
可用于产生本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的另外的抗PD-1抗体提供在表6中。
J.示例性抗PD-1抗体
命名为“PD-1 mAb 6 G4P”的示例性抗PD-1抗体包括：具有PD-1 mAb 6I的VH结构域(SEQ ID NO:86)、IgG4 CH1结构域(SEQ ID NO:42)、稳定化的IgG 4铰链(SEQ ID NO:36)和缺少C-末端赖氨酸的IgG4 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:4)的重链；和具有PD-1 mAb 6SQ的VL结构域(SEQ ID NO:87)和κCL(SEQ ID NO:38)的轻链。
PD-1 mAb 6 G4P的完整重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:88)显示在下方。
PD-1 mAb 6 G4P的完整轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:89)显示在下方。
VII.抗CTLA-4结合能力
对于CTLA-4免疫特异性的抗体是已知的(见，例如，美国专利号6,984,720、6,682,736、7,034,121、7,109,003、7,132,281、7,411,057、7,605,238、7,807,797、7,824,679、8,017,114、8,143,379、8,318,916、8,491,895、8,784,815和8,883,984；美国专利公开2009/0123477、2009/0252741和2014/0105914；PCT专利公开号WO 00/37504、WO 01/14424、WO01/54732、WO 2006/029219、WO 2006/066568和WO 2012/120125；和表7)。可用于产生本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的优选的CTLA-4结合能力能够结合人CTLA-4的连续或不连续(例如，构象)部分(表位)并且优选地也展示结合一个或多个非人物种，尤其是灵长类物种(和尤其是灵长类物种，比如食蟹猴)的CTLA-4分子的能力。可通过分离使用CTLA-4或其肽片段产生的分泌抗体的杂交瘤制备另外期望的抗体。代表性人CTLA-4多肽(NCBI序列NP_005205.2；包括成熟蛋白的35个氨基酸残基信号序列(加下划线显示)和188个氨基酸残基)具有氨基酸序列(SEQ ID NO:75)：
可用于产生本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的优选的抗CTLA-4结合分子(例如，抗体)具有下述抗体的VL和/或VH结构域：抗人CTLA-4单克隆抗体“CTLA-4 mAb 1”(伊匹单抗(ipilimumab)，CAS登记号：477202-00-9，也称为MDX010，并且由Bristol-MyersSquibb以售卖)；“CTLA-4 mAb 2”(替西木单抗，CAS登记号：745013-59-6，也称为CP-675206)；“CTLA-4 mAb 3”(如表7中提供的4B6)或表7中的任何其他抗CTLA-4抗体；并且更优选地具有这类抗CTLA-4单克隆抗体的VL区的1、2或所有3个CDRL和/或VH结构域的1、2或所有3个CDRH。
A.CTLA-4 mAb 1
CTLA-4 mAb 1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:76)显示在下方(CDRH残基加下划线显示)。
CTLA-4mAb 1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:77)显示在下方(CDRL残基加下划线显示)。
B.CTLA-4 mAb 2
CTLA-4 mAb 2的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)显示在下方(CDRH残基加下划线显示)。
CTLA-4 mAb 2的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)显示在下方(CDRL残基加下划线显示)。
C.CTLA-4 mAb 3
CTLA-4 mAb 3的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:90)显示在下方(CDRH残基加下划线显示)。
CTLA-4 mAb 3的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:91)显示在下方(CDRL残基加下划线显示)。
D.另外的抗CTLA-4抗体
可用于产生本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的另外的抗CTLA-4抗体提供在表7中。
E.示例性抗CTLA-4抗体
命名为“CTLA-4 mAb 3 G1AA”的示例性抗CTLA-4抗体包括具有CTLA-4mAb 3的VH结构域(SEQ ID NO:90)、IgG1 CH1结构域(SEQ ID NO:40)、IgG1铰链(SEQ ID NO:33)和IgG1 CH2-CH3结构域取代L234A/L235A(SEQ ID NO:43)的重链。
CTLA-4 mAb 3 G1AA的完整重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:92)显示在下方。
命名为“CTLA-4 mAb 3 G4P”的可选的示例性抗CTLA-4抗体包括具有CTLA-4 mAb3的VH结构域(SEQ ID NO:90)、IgG4 CH1结构域(SEQ ID NO:42)、稳定化的IgG4铰链(SEQID NO:36)和缺少C-末端赖氨酸的IgG4CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:4)的重链。CTLA-4 mAb3 G4P的完整重链的氨基酸序列显示在下方(SEQ ID NO:93)。
CTLA-4 mAb 3 G1AA和CTLA-4 mAb 3 G4P的完整轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:94)显示在下方。
示例性抗CTLA-4抗体TLA-4 mAb 3 G1AA和CTLA-4 mAb 3 G4P都包括具有CTLA-4mAb 3(SEQ ID NO:91)的VL结构和κCL(SEQ ID NO:38)域的轻链。
VIII.示例性PD-1 x CTLA-4双特异性分子
A.具有E/K-螺旋的包含Fc区的示例性四链双抗体
产生三个包括E/K-螺旋异源二聚体促进结构域的、包含Fc区的示例性PD-1 xCTLA-4双特异性四链双抗体(命名为“DART B”、“DART C”和“DART D”)。下面详述这些包含Fc区的双抗体的结构。这些示例性PD-1 x CTLA-4双抗体旨在阐释，决不限制本发明的范围。
1.DART B
DARTB是包含Fc区的双特异性四链双抗体，其具有对于PD-1特异性的两个结合位点、对于CTLA-4特异性的两个结合位点、被工程化用于延长半衰期的变异的IgG4Fc区和E/K-螺旋异源二聚体促进结构域。DART B的第一和第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合CTLA-4的单克隆抗体的VL结构域(VLCTLA-4CTLA-4 mAb 1 VL)(SEQ IDNO:77)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1PD-1 mAb 6-I VH)(SEQ ID NO:86)、包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:6))、包含半胱氨酸的促进异源二聚体的(E-螺旋)结构域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:20))、稳定化的IgG4铰链区(SEQ ID NO:36)、包含取代M252Y/S254T/T256E和缺少C-末端残基的IgG4 CH2-CH3结构域的变体(SEQID NO:81)和C-末端。
DART B的第一和第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:95)：
DART B的第二和第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1PD-1 mAb 6-SQ VL)(SEQ ID NO:87)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、能够结合CTLA-4的单克隆抗体的VH结构域(VHCTLA-4CTLA-4 mAb 1VH)(SEQ ID NO:76)、包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:6))、包含半胱氨酸的促进异源二聚体的(K-螺旋)结构域(KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQ ID NO:21)和C-末端。
DART B的第二和第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:96)：
2.DART C
DARTC是包含Fc区的双特异性四链双抗体，其具有对于PD-1特异性的两个结合位点、对于CTLA-4特异性的两个结合位点、被工程化用于延长半衰期的变异的IgG4Fc区和E/K-螺旋异源二聚体促进结构域。DART C的第一和第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合CTLA-4的单克隆抗体的VL结构域(VLCTLA-4CTLA-4mAb 3VL)(SEQ IDNO:91)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1PD-1 mAb 6-I VH)(SEQ ID NO:86)、包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:6))、包含半胱氨酸的异源二聚体促进(E-螺旋)结构域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:20))、稳定化的IgG4铰链区(SEQ ID NO:36)、包括取代M252Y/S254T/T256E并且缺少C-末端残基的IgG4CH2-CH3结构域的变体(SEQ ID NO:81)和C-末端。
DART C的第一和第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:97)：
DART C的第二和第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1PD-1 mAb 6-SQ VL)(SEQ ID NO:87)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、能够结合CTLA-4的单克隆抗体的VH结构域(VHCTLA-4CTLA-4 mAb 3 VH)(SEQ ID NO:90)、包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ IDNO:6))、包含半胱氨酸的促进异源二聚体的(K-螺旋)结构域(KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQ ID NO:21)和C-末端。
DART C的第二和第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:98)：
3.DARTD
DARTD是包含Fc区的双特异性四链双抗体，其具有对于PD-1特异性的两个结合位点、对于CTLA-4特异性的两个结合位点、被工程化用于延长半衰期的变异的IgG4Fc区和E/K-螺旋异源二聚体促进结构域。DART D的第一和第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1PD-1 mAb 6-SQ VL)(SEQ IDNO:87)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、能够结合CTLA-4的单克隆抗体的VH结构域(VHCTLA-4CTLA-4 mAb 3 VH)(SEQ ID NO:90)、包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:6))、包含半胱氨酸的促进异源二聚体的(E-螺旋)结构域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:20))、稳定化的IgG4铰链区(SEQ ID NO:36)、包括取代M252Y/S254T/T256E并且缺少C-末端残基的IgG4 CH2-CH3结构域的变体(SEQID NO:81)和C-末端。
DART D的第一和第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:99)：
DART D的第二和第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合CTLA-4的单克隆抗体的VL结构域(VLCTLA-4CTLA-4 mAb 3VL)(SEQ ID NO:91)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1PD-1mAb 6-I VH)(SEQ ID NO:86)、包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ IDNO:6))、包含半胱氨酸的异源二聚体促进(K-螺旋)结构域(KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQ ID NO:21)和C-末端。
DART D的第二和第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:100)：
4.DARTF
DARTF是包含Fc区的双特异性四链双抗体，其具有对于PD-1特异性的两个结合位点、对于CTLA-4特异性的两个结合位点、被工程化以降低/消除效应子功能并且延长半衰期的变异的IgG1 Fc区和E/K-螺旋异源二聚体促进结构域。DART F的第一和第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1PD-1mAb 6-SQ VL)(SEQ ID NO:87)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、能够结合CTLA-4的单克隆抗体的VH结构域(VHCTLA-4CTLA-4 mAb 3 VH)(SEQ ID NO:90)、包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:6))、包含半胱氨酸的异源二聚体促进(E-螺旋)结构域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:20))、IgG1铰链区(SEQID NO:33)、包括取代L235A/L235A/M252Y/S254T/T256E并且缺少C-末端残基的IgG1 CH2-CH3结构域的变异的(SEQ ID NO:80)和C-末端。
DART F的第一和第三多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:101)是：
DART F的第二和第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合CTLA-4的单克隆抗体的VL结构域(VLCTLA-4CTLA-4 mAb 3 VL)(SEQ ID NO:91)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1PD-1 mAb 6-I VH)(SEQ ID NO:86)、包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ IDNO:6))、包含半胱氨酸的异源二聚体促进(K-螺旋)结构域(KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQ ID NO:21)和C-末端。
DART F的第二和第四多肽链的氨基酸序列与DART D的第二和第四多肽链的序列相同(SEQ ID NO:100)。
B.具有CL/CH1结构域的包含Fc区的示例性四链双抗体：DART E
产生命名为“DART E”、包括CL/CH1结构域的、包含Fc区的示例性PD-1 x CTLA-4双特异性四链双抗体。下面详述该包含Fc区的双抗体的结构。该示例性PD-1 x CTLA-4双抗体旨在阐释但决不限制本发明的范围。
DART E是包含Fc区的双特异性四链双抗体，其具有对于PD-1特异性的两个结合位点、对于CTLA-4特异性的两个结合位点、CL/CH1结构域和被工程化用于延长半衰期的变异的IgG4Fc区。DART E的第一和第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合CTLA-4的单克隆抗体的VL结构域(VLCTLA-4CTLA-4 mAb 3 VL)(SEQ ID NO:91)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1PD-1 mAb 6-I VH)(SEQ ID NO:86)、间插连接体肽(连接体2:LGGGSG(SEQ ID NO:8))、IgG4CH1结构域(SEQ ID NO:42)、稳定化的IgG4铰链区(SEQ ID NO：36)、包括取代M252Y/S254T/T256E并且缺少C-末端残基的IgG4 CH2-CH3结构域的变体(SEQ ID NO:81)和C-末端。
DART E的第一和第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:102)：
DART E的第二和第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1PD-1 mAb 6-SQ VL)(SEQ ID NO:87)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、能够结合CTLA-4的单克隆抗体的VH结构域(VHCTLA-4CTLA-4 mAb 3 VH)(SEQ ID NO:90)、间插连接体肽(连接体2：LGGGSG(SEQ ID NO:8))、κCL结构域(SEQ ID NO:38)和C-末端。
DART E的第二和第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:103)：
C.包含Fc区的示例性三价结合分子
产生包含Fc区的两个示例性PD-1 x CTLA-4双特异性四链三价结合分子(命名为“TRIDENT A”和“TRIDENT B”)。下面详述这些包含Fc区的三价结合分子的结构。下面也呈现了可产生的命名为“TRIDENT C”的三链变体。这些示例性PD-1 x CTLA-4三价结合分子旨在阐释但决不限制本发明的范围。
1.TRIDENT A
TRIDENT A是包含Fc区的双特异性四链三价结合分子，其具有对于PD-1特异性的两个结合位点、对于CTLA-4特异性的一个结合位点、被工程化的用于延长半衰期的变异的包含杵/臼的IgG4Fc区、E/K-螺旋异源二聚体促进结构域和CL/CH1结构域。TRIDENT A的第一多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD- 1PD-1 mAb 6-SQ VL)(SEQ ID NO:87)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1PD-1 mAb 6-I VH)(SEQ ID NO:86)、包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:6))、包含半胱氨酸的异源二聚体促进(E-螺旋)结构域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:20))、稳定化的IgG4铰链区(SEQ ID NO：36)、包括取代M252Y/S254T/T256E并且缺少C-末端残基的包含杵的IgG4 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:84)和C-末端。
TRIDENT A的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:104)：
TRIDENT A的第二多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1PD-1 mAb 6-SQ VL)(SEQ ID NO:87)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1PD-1 mAb 6-IVH)(SEQ ID NO:86)、包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:6))、包含半胱氨酸的异源二聚体促进(K-螺旋)结构域(KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQID NO:21))和C-末端。
TRIDENT A的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:105)：
TRIDENT A的第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合CTLA-4的单克隆抗体的VH结构域(VHCTLA-4CTLA-4 mAb 3 VH)(SEQ ID NO:90)、IgG4 CH1结构域(SEQ ID NO:42)、稳定化的IgG4铰链区(SEQ ID NO：36)、包括取代M252Y/S254T/T256E并且缺少C-末端残基的包含臼的IgG4 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:81)和C-末端。
TRIDENT A的第三多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:106)：
TRIDENT A的第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合CTLA-4的单克隆抗体的VL结构域(VLCTLA-4CTLA-4 mAb 3 VL)(SEQ ID NO:91)、κCL结构域(SEQ IDNO:38)和C-末端。
TRIDENT A的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:107)：
2.TRIDENT B
TRIDENT B是包含Fc区的双特异性四链三价结合分子，其具有对于PD-1特异性的两个结合位点、对于CTLA-4特异性的一个结合位点、被工程化以降低/消除效应子功能并且延长半衰期的变异的包含杵/臼的IgG1 Fc区、E/K-螺旋异源二聚体促进结构域和CL/CH1结构域。TRIDENT B的第一多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1PD-1 mAb 6-SQ VL)(SEQ ID NO:87)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1PD-1 mAb 6-I VH)(SEQID NO:86)、包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:6))、包含半胱氨酸的异源二聚体促进(E-螺旋)结构域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:20))、连接体(SEQ ID NO：31)、包括取代L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E并且缺少C-末端残基的包含杵的IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:82)和C-末端。
TRIDENT B的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:108)：
TRIDENT B的第二多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(VLPD-1PD-1 mAb 6-SQ VL)(SEQ ID NO:87)、间插连接体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(VHPD-1PD-1 mAb 6-IVH)(SEQ ID NO:86)、包含半胱氨酸的间插连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:6))、包含半胱氨酸的异源二聚体促进(K-螺旋)结构域(KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQID NO:21))和C-末端。
TRIDENT B的第二多肽链的氨基酸序列与TRIDENT A的第二多肽链的序列相同(SEQ ID NO:105)：
TRIDENT B的第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合CTLA-4的单克隆抗体的VH结构域(VHCTLA-4CTLA-4 mAb 3 VH)(SEQ ID NO:90)、IgG1 CH1结构域(SEQ ID NO:40)、IgG1铰链区(SEQ ID NO:33)、包括取代L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E并且缺少C-末端残基的包含臼的IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:83)和C-末端。
TRIDENT B的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:109)：
TRIDENT B的第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括：N-末端、能够结合CTLA-4的单克隆抗体的VL结构域(VLCTLA-4CTLA-4 mAb 3 VL)(SEQ ID NO:91)、κCL结构域(SEQ IDNO:38)和C-末端。
TRIDENT B的第四多肽链的氨基酸序列与TRIDENT A的第二多肽链的序列相同(SEQ ID NO:107)。
3.TRIDENT C
如本文提供的，可通过将两个分开的多肽链的结合结构域组合成(例如，融合编码多核苷酸等)到一条链中而产生包括三条多肽链的三价结合分子。可产生一种包含Fc区的双特异性三链三价结合分子，其具有对于PD-1特异性的两个结合位点、对于CTLA-4特异性的一个结合位点、被工程化用于延长半衰期的变异的包含杵/臼的IgG4 Fc区，和E/K-螺旋异源二聚体促进结构域(“TRIDENT C”)。TRIDENT C的第一和第二多肽链可以与上面提供的TRIDENT A的那些第一和第二多肽链相同。
在第一和第二链与TRIDENT A的那些相同的情况下，TRIDENT C的第三多肽链在N-末端至C-末端方向上可包括：N-末端、能够结合CTLA-4的单克隆抗体的VL结构域(VLCTLA- 4CTLA-4 mAb 3 VL)(SEQ ID NO:91)、间插间隔体肽(GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37))、能够结合CTLA-4的单克隆抗体的VH结构域(VHCTLA-4CTLA-4 mAb 3 VH)(SEQ ID NO:90)、稳定化的IgG4铰链区(SEQ ID NO：36)；包括取代M252Y/S254T/T256E并且缺少C-末端残基的包含臼的IgG4 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:85)和C-末端。
因此，TRIDENT C的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:110)：
IX.生产方法
本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子最优选地通过重组表达编码这类多肽的核酸分子而产生，如本领域熟知的。
可使用固相肽合法成常规制备本发明的多肽(Merrifield,B.(1986)“SolidPhase Synthesis,”Science 232(4748):341-347；Houghten,R.A.(1985)“General MethodFor The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides:SpecificityOf Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)82(15):5131-5135；Ganesan,A.(2006)“Solid-PhaseSynthesis In The Twenty-First Century,”Mini Rev.Med.Chem.6(1):3-10)。
在可选的方案中，可重组制备抗体和使用本领域已知的任何方法表达。可如下经重组制备抗体：首先从宿主动物分离制备的抗体，获得基因序列，和使用基因序列在宿主细胞(例如，CHO细胞)中重组表达抗体。可采用的另一方法是在植物(例如，烟草)或转基因奶中表达抗体序列。用于在植物或奶中重组表达抗体的适当的方法已经被公开了(见，例如Peeters等(2001)“Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants,”Vaccine 19:2756；Lonberg,N.等(1995)“Human Antibodies From Transgenic Mice,”Int.Rev.Immunol 13:65-93；和Pollock等(1999)“Transgenic Milk As A Method ForThe Production Of Recombinant Antibodies,”J.Immunol Methods 231:147-157)。制备抗体衍生物，例如，人源化抗体、单链抗体等的适当的方法是本领域已知的，并且已经在上面描述过了。在另一可选方案中，可通过噬菌体展示技术重组制备抗体(见，例如，美国专利号5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150；和Winter,G.等(1994)“MakingAntibodies By Phage Display Technology,”Annu.Rev.Immunol.12.433-455)。
包含感兴趣的多核苷酸(例如，编码本发明的PD-1 xCTLA-4双特异性分子的多肽链的多核苷酸)的载体可通过一些适当手段中的任意手段被引入到宿主细胞中，所述适当手段包括电穿孔；采用氯化钙、铷氯化物、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微弹轰击(microprojectile bombardment)；脂转染；和感染(例如，在载体是感染剂诸如痘苗病毒的情况下)。引入载体或多核苷酸的选择常常取决于宿主细胞的特征。
能够过表达异源DNA的任何宿主细胞均可用于表达感兴趣的多肽或蛋白质的目的。合适的哺乳动物宿主细胞的非限制性例子包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。
本发明包括多肽，其包括本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的氨基酸序列。可通过本领域已知的程序制备本发明的多肽。可通过抗体的蛋白水解或其他降解、如上述的重组方法(即，单个或融合多肽)或化学合成来产生多肽。抗体的多肽，尤其地，上至约50个氨基酸的较短的多肽，通过化学合成被常规制备。化学合成方法在本领域中是已知的，并且是商业上可得到的。
本发明包括PD-1 x CTLA-4双特异性分子的变体，包括不明显影响这类分子的特性的功能上等同的多肽以及具有增强的或降低的活性的变体。多肽的修饰在本领域中是常规操作，因而不需要在本文详细描述。修饰的多肽的实例包括这样的多肽：其具有氨基酸残基的保守取代、未明显有害改变功能活性的氨基酸的一个或多个缺失或添加，或使用化学类似物。可彼此保守取代的氨基酸残基包括但不限于：甘氨酸/丙氨酸；丝氨酸/苏氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；赖氨酸/精氨酸；和苯基丙氨酸/酪氨酸。这些多肽还包括糖基化和非糖基化多肽以及具有其它翻译后修饰的多肽，所述其它翻译后修饰，诸如例如，用不同糖进行糖基化、乙酰化和磷酸化。优选地，氨基酸取代应该是保守的，即，取代的氨基酸会具有与原始氨基酸类似的化学性质。这样的保守取代在本领域中是已知的，并且已经在上文提供实例。氨基酸修饰范围可从改变或修饰一个或多个氨基酸到区域诸如可变结构域的完全重新设计(redesign)。可变结构域中的变化可改变结合亲和力和/或特异性。修饰的其它方法包括利用本领域中已知的偶合技术，包括但不限于酶促手段、氧化取代和螯合。修饰可用于例如，连接标签用于免疫分析，诸如连接放射性部分用于放射免疫分析。修饰的多肽利用本领域中确定的方法制备，并且可利用本领域中已知的标准测定来筛选。
本发明包括融合蛋白，其包括本发明的一种或多种多肽或抗体。在一个实施方式中，提供了融合多肽，其包括轻链、重链或轻链和重链二者。在另一实施方式中，提供的融合多肽包括轻链、重链或轻链和重链二者。在另一实施方式中，融合多肽包含异源免疫球蛋白恒定区。在另一实施方式中，融合多肽包含由公共保藏的杂交瘤产生的抗体的轻链可变结构域和重链可变结构域。为了本发明的目的，抗体融合蛋白包含特异性结合PD-1和/或CTLA-4的一个或多个多肽结构域和其在天然分子中未连接的另外的氨基酸序列，所述另外的氨基酸序列例如，异源序列或来自另一区域的同源序列。
X.本发明的PD-1 x CTLA-4双分子的用途
本发明包括组合物，其包括药物组合物，所述药物组合物包含本发明的PD-1xCTLA-4双特异性分子(例如，双特异性抗体、双特异性双抗体、三价结合分子等)、源自这类分子的多肽、包括编码这类分子或多肽的序列的多核苷酸，和如本文所描述的其他试剂。
如上所讨论，PD-1和CTLA-4在负调节免疫应答(例如，免疫细胞增殖、功能和稳态)中起到重要的作用。本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子具有抑制PD-1功能的能力，因此逆转PD-1介导的免疫系统抑制。另外，本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子具有抑制CTLA-4功能的能力，因此通过阻断PD-1和CTLA-4介导的免疫系统抑制而加强免疫系统。本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子也允许完全阻断PD-1和CTLA-4，以及当与PD-1共表达时偏向CTLA-4的阻断。因此，本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子可用于缓解受试者的T-细胞衰竭和/或增强免疫应答(例如，T-细胞和/或NK-细胞介导的免疫应答)。尤其地，本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子可用于治疗与不期望的受抑制的免疫系统相关的任何疾病或病况，包括癌症和与病原体的存在相关的疾病(例如，细菌、真菌、病毒或原生动物感染)。
可由本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子治疗的癌症包括特征在于存在选自下述的细胞的癌症细胞的癌症：肾上腺肿瘤、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色细胞肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生小圆细胞瘤、室管膜细胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、不完全性骨纤维生成、骨的纤维发育异常、胆囊癌或胆管癌、胃癌、妊娠滋养层疾病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性的脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌、甲状旁腺瘤、儿科癌症、周围神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、眼色素层后黑素瘤、罕见血液学疾病、肾转移癌症、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌和子宫癌。
尤其地，本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子可用于治疗结直肠癌、肝细胞癌、神经胶质瘤、肾癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、膀胱癌、成神经细胞瘤；肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌和直肠癌。
可通过本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子治疗的感染包括慢性病毒、细菌、真菌和寄生虫感染。可通过本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子治疗的慢性感染包括爱泼斯坦-巴尔病毒、甲肝病毒(HAV)；乙肝病毒(HBV)；丙肝病毒(HCV)；疱疹病毒(例如HSV-1、HSV-2、HHV-6、CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、水泡性口炎病毒(VSV)、芽孢杆菌纲、柠檬酸杆菌属、霍乱、白喉、肠杆菌属、淋球菌、幽门螺旋杆菌、克雷伯氏菌属、军团菌属、脑膜炎球菌、分歧杆菌、假单胞菌属、Pneumonococci、立克次氏体细菌、沙门氏菌属、沙雷菌属、葡萄球菌属、链球菌属、破伤风、曲霉菌属(烟曲霉、黑曲霉等)、皮炎芽生菌、念珠菌属白色念珠菌、克柔假丝酵母、光滑念珠菌、热带念珠菌等)、新生隐球菌、毛霉目的属、犁头霉属、根霉属)、申克氏胞丝菌、巴西芽生菌、粗球霉菌、荚膜组织胞浆菌、细螺旋体病、包柔氏螺旋体、蠕虫寄生虫(钩虫、绦虫、吸虫、扁形虫(例如血吸虫)、蓝氏贾第虫、旋毛虫、脆双核阿米巴、布氏锥虫、克氏锥虫和杜氏利什曼虫。
XI.药物组合物
本发明的组合物包括原料药物组合物，其可用于制造药物组合物(例如，不纯的或非无菌组合物)和可用于制备单位剂型的药物组合物(即，适于施用至受试者或患者的组合物)。这类组合物包括预防上或治疗上有效量的本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子，或这类剂和药学上可接受的载体的组合。优选地，本发明的组合物包括预防上或治疗上有效量的本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子和药学上可接受的载体。本发明也包括这类药物组合物，其另外包括对特定的癌症抗原特异性的第二治疗性抗体(例如，肿瘤特异性单克隆抗体)，和药学上可接受的载体。
在具体的实施方式中，术语“药学上可接受的”表示获得联邦政府或州政府管理机构的许可或列于美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他通常获得认可的药典中，供用于动物，特别是用于人类。术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全)、赋形剂或媒介。一般而言，本发明组合物的成分被单独提供或以单位剂型混合在一起，例如作为标明活性剂的量的密封容器中的冻干粉或无水浓缩物，所述密封容器如安瓿或小袋(sachette)。当通过输注施用组合物时，其可以用含有无菌的药学级水或盐水的输注瓶分配。如果通过注射施用所述组合物，则可以提供一安瓿注射用无菌水或盐水，以便可以在施用前混合所述成分。
本发明也提供药物包装或试剂盒，其包括一个或多个容器，所述容器填充本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子，单独地或与这类药学上可接受的载体一起。另外，用于治疗疾病的一种或多种其他预防剂或治疗剂也可包括在药物包装或试剂盒中。本发明也提供了这样的药物包装或试剂盒，其包括一个或多个容器，所述容器填充本发明药物组合物的一种或多种成分。任选地与这类容器(一个或多个)关联的可以是管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的布告(notice)，所述布告反映了管理机构许可用于人类施用的制造、使用或销售。
本发明提供了可用于上述方法的试剂盒。试剂盒可包括任何本发明的PD-1 xCTLA-4双特异性分子。试剂盒可在一个或多个容器中进一步包括可用于治疗癌症的一种或多种其他预防剂和/或治疗剂。
XII.施用方法
通过向受试者施用有效量的本发明的融合蛋白或缀合分子或包括本发明的融合蛋白或缀合分子的药学组合物，可以提供本发明的组合物用来治疗、预防和改善与疾病、病症或感染相关的一种或多种症状。在优选的方面，这类组合物基本上是纯的(即，基本上不含限制其效果或产生不期望的副作用的物质)。在具体实施方式中，受试者是动物，优选哺乳动物，如非灵长类(例如牛、马、猫科动物、犬科动物、啮齿动物等)或灵长类(例如，猴子，如食蟹猴、人等)。在优选的实施方式中，受试者是人。
各种送递系统是已知的，并且可以用于施用本发明的组合物，例如封装于脂质体中、微粒、微胶囊、能表达抗体或融合蛋白的重组细胞、受体介导的内吞作用(见，例如，Wu等(1987)“Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNACarrier System,”J.Biol.Chem.262:4429-4432)、构建核酸作为逆转录病毒或其他载体的一部分等。
施用本发明的分子的方法包括但不限于肠胃外施用(例如皮内、肌肉、腹腔内、静脉内以及皮下)、硬膜外以及粘膜(例如鼻内和口腔途径)。在具体实施方式中，本发明的PD-1 x CTLA4结合分子经肌肉、静脉内或皮下施用。组合物可以通过任何方便途径施用，例如通过输注或弹丸注射、通过上皮或黏膜皮肤被覆(lining)(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。给药可以是全身的或局部的。另外，也可以应用肺给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，并且与雾化剂一起配制。见，例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公布号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，其每一篇通过引用以其整体并入本文。
本发明也使得本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的制剂包装在密封容器中，比如指示分子的数量的安瓿或小袋中。在一个实施方式中，这样的分子作为冻干无菌粉或无水浓缩物提供于密封容器中，并且可以用例如水或盐水重构至适当浓度，用于施用于受试者。优选地，本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子作为无菌冻干粉末提供在密封容器中。
本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的冻干制剂应在它们的初始容器中储存在2℃和8℃之间，并且分子应该在重构之后12小时内，优选地6小时内、5小时内、3小时内或1小时内施用。在可选的实施方式中，这样的分子以液体形式提供在指示分子、融合蛋白或缀合分子的量和浓度的密封容器中。优选地，这类PD-1 x CTLA-4双特异性分子在以液体形式提供时，被供应在密封容器中。
可通过标准临床技术确定本发明的这类制剂有效治疗、预防或改善与病症相关的一个或多个症状的量。制剂中采用的精确剂量还将取决于施用的路径和病况的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况决定。有效的剂量可从源自体外或动物模型测试系统的剂量响应曲线推断。
如本文所使用，在一个实施方式中，“有效量”的药物组合物是足够实现有益或期望的结果的量，所述结果包括但不限于临床结果，比如减少源自疾病的症状、减少感染的症状(例如，病毒量、发烧、疼痛、败血症等)或癌症的症状(例如，癌细胞的增殖、肿瘤存在、肿瘤转移等)，从而提高遭受疾的患者的生命质量，降低治疗疾病需要的其他药物治疗的剂量、比如经靶向和/或内化增强另一药物的作用、延迟疾病的进展，和/或延长个体的生存。
可在一次或多次施用中施加有效量。为了本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效量是这样的量，所述量足以：直接或间接地杀伤和/或减少癌症细胞的增殖，和/或消除、降低和/或延迟从癌症的原发位点(primary site)转移的发展；或减少感染病原体的增殖(或影响)和降低和/或延迟病原体介导的疾病的发展。在一些实施方式中，药物、化合物或药物组合物的有效量可联合或不联合另一药物、化合物或药物组合物实现。因此，“有效量”可在施用一种或多种化疗剂的背景下考虑，并且如联合一种或多种其他剂，可实现或实现期望的结果，则单剂可视为以有效量施用。尽管个体的需要不同，但是测定每种组分的有效量的最佳范围是本领域技术人员已知的。
对于本发明包括的PD-1 x CTLA-4双特异性分子，优选地基于接收受试者的体重(kg)确定施用至患者的剂量。对于本发明包括的PD-1 x CTLA-4双特异性分子，施用至患者的剂量通常是约0.01μg/kg至约150mg/kg受试者的体重或更多。
可通过修饰比如，例如脂质化而增强分子的吸收和组织渗透，来减少或改变施用的本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的剂量和频率。
对于用作单剂疗法，可计算向患者施用的本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的剂量。可选地，分子可与其他治疗组合物联合使用，并且向患者施用的剂量小于当所述分子用作单剂疗法时的剂量。
本发明的药物组合物可被局部施用至需要治疗的区域；这可通过例如，但不限于下述方式实现：局部注入、通过注射、或通过植入物的手段，所述植入物是多孔的、非多孔的或胶状材料，包括膜，比如硅橡胶膜或纤维。优选地，当施用本发明的分子时，必须注意使用不吸收该分子的材料。
本发明的组合物可在泡状体(vesicle)，尤其是脂质体中递送(见Langer(1990)“New Methods Of Drug Delivery,”Science 249:1527-1533)；Treat等,在Liposomes inthe Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein和Fidler(编辑)，Liss,New York，pp.353-365(1989)中；Lopez-Berestein,同上，pp.3 17-327)。
在本发明的组合物是编码本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的核酸的情况下，核酸可被体内施用，以通过如下方式促进其编码的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的表达：将其构建为适当的核酸表达载体的一部分并且施用其从而其成为细胞内的，例如，通过使用逆转录病毒载体(见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；生物弹道技术(Biolistic),Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，或通过与已知进入核的同源框样肽联合施用(见例如，Joliot等(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:1864-1868)等。可选地，可以将核酸引入细胞内并通过同源重组整合到宿主细胞DNA中，以进行表达。
用治疗或预防有效量的本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子治疗受试者可包括单治疗，或优选地，可包括一系列治疗。在优选的实施例中，用这类双抗体治疗受试者每周一次，持续约1至10周，优选地2至8周，更优选地约3至7周，和甚至更优选地持续约4、5或6周。本发明的药物组合物可每天施用一次、每天施用两次或每天施用三次。可选地，药物组合物可每周施用一次、每周两次、每两周一次、每月一次、每六周一次、每两个月一次、每年两次或每年一次。也将认识到，用于治疗的分子的有效剂量可随着具体治疗的疗程而增加或降低。
XIII.示例性实施方式
本发明尤其涉及实施方式E1-E26：
E1.一种双特异性分子，其具有能够免疫特异性结合PD-1的表位(一个或多个)的一个或多个表位-结合位点和能够免疫特异性结合CTLA-4的表位(一个或多个)的一个或多个表位-结合位点，其中这类分子包括：
(A)结合PD-1的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域；和
(B)结合CTLA-4的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域；
其中这类分子是：
(i)双抗体，这类双抗体是共价结合的复合物，其包括两条、三条、四条或五条多肽链；或
(ii)三价结合分子，这类三价结合分子是共价结合的复合物，其包括三条、四条、五条或更多条多肽链。
E2.实施方式E1的双特异性分子，其中这类分子相对于两个单特异性分子展示的这类活性展示增强的活性，所述两个单特异性分子其中一个具有结合PD-1的这类抗体的这类重链可变结构域和这类轻链可变结构域和其中另一个具有结合CTLA-4的这类抗体的这类重链可变结构域和这类轻链可变结构域。
E3.实施方式E1或E2的双特异性分子，其中相对于施用结合CTLA-4的单特异性抗体引起的这类irAE，这类分子在施用至需要其的受试者时引起更少的免疫相关的不利事件(irAE)。
E4.实施方式E3的双特异性分子，其中结合CTLA-4的所述单特异性抗体是伊匹单抗。
E5.实施方式E1-E4中的任何一个的双特异性分子，其中这类分子包括Fc区。
E6.实施方式E5的双特异性分子，其中这类Fc区是变异的Fc区，其包括：
(A)降低变异的Fc区对FcγR的亲和力的一个或多个氨基酸修饰；和/或
(B)延长变异的Fc区的血清半衰期的一个或多个氨基酸修饰。
E7.实施方式E6的双特异性分子，其中降低变异的Fc区对FcγR的亲和力的这类修饰包括下述取代：L234A；L235A；或L234A和L235A，其中这样的编号是如Kabat中的EU索引中的编号。
E8.实施方式E6或E7的双特异性分子，其中延长变异的Fc区的血清半衰期的这类修饰包括下述取代：M252Y；M252Y和S254T；M252Y和T256E；M252Y、S254T和T256E；或K288D和H435K，其中这样的编号是如Kabat中的EU索引中的编号。
E9.实施方式E1-E8的任何一个中的双特异性分子，其中这类分子是这类双抗体并且包括能够免疫特异性结合PD-1的表位的两个表位-结合位点和能够免疫特异性结合CTLA-4的表位的两个表位-结合位点。
E10.实施方式E1-E8的任何一个中的双特异性分子，其中这类分子是这类三价结合分子并且包括能够免疫特异性结合PD-1的表位的两个表位-结合位点和能够免疫特异性结合CTLA-4的表位的一个表位-结合位点。
E11.实施方式E1-E10的任何一个中的双特异性分子，其中能够结合PD-1和CTLA-4分子的这类分子存在于细胞表面上。
E12.实施方式E1-E11的任何一个中的双特异性分子，其中这类分子能够同时结合PD-1和CTLA-4。
E13.实施方式E1-E12的任何一个中的双特异性分子，其中这类分子促进免疫细胞的刺激。
E14.实施方式E13的双特异性分子，其中免疫细胞的这样的刺激导致：
(A)免疫细胞增殖；和/或
(B)免疫细胞产生和/或至少一种细胞因子的释放；和/或
(C)免疫细胞产生和/或至少一种裂解分子的释放；和/或
(D)至少一种激活标志物的免疫细胞表达。
E15.实施方式E13或E14的双特异性分子，其中这类免疫细胞是T-淋巴细胞或NK-细胞。
E16.实施方式E1-E15的任何一个中的双特异性分子，其中能够免疫特异性结合PD-1的表位的这类表位-结合位点包括：
(A)PD-1 mAb 1的VH结构域(SEQ ID NO:47)和PD-1 mAb 1的VL结构域(SEQ IDNO:48)；或
(B)PD-1 mAb 2的VH结构域(SEQ ID NO:49)和PD-1 mAb 2的VL结构域(SEQ IDNO:50)；或
(C)PD-1 mAb 3的VH结构域(SEQ ID NO:51)和PD-1 mAb 3的VL结构域(SEQ IDNO:52)；或
(D)PD-1 mAb 4的VH结构域(SEQ ID NO:53)和PD-1 mAb 4的VL结构域(SEQ IDNO:54)；或
(E)PD-1 mAb 5的VH结构域(SEQ ID NO:55)和PD-1 mAb 5的VL结构域(SEQ IDNO:56)；或
(F)PD-1 mAb 6的VH结构域(SEQ ID NO:57)和PD-1 mAb 6的VL结构域(SEQ IDNO:58)；或
(G)PD-1 mAb 6-I VH的VH结构域(SEQ ID NO:86)和PD-1 mAb 6-SQ VL的VL结构域(SEQ ID NO:87)；或
(H)PD-1 mAb 7的VH结构域(SEQ ID NO:59)和PD-1 mAb 7的VL结构域(SEQ IDNO:60)；或
(I)PD-1 mAb 8的VH结构域(SEQ ID NO:61)和PD-1 mAb 8的VL结构域(SEQ IDNO:62)。
E17.实施方式E1-E16的任何一个中的双特异性分子，其中能够免疫特异性结合CTLA-4的表位的这类表位-结合位点包括：
(A)CTLA-4 mAb 1的VH结构域(SEQ ID NO:76)和CTLA-4 mAb 1的VL结构域(SEQID NO:77)；或
(B)CTLA-4mAb 2的VH结构域(SEQ ID NO:78)和CTLA-4mAb 2的VL结构域(SEQ IDNO:79)；或
(C)CTLA-4mAb 3的VH结构域(SEQ ID NO:90)和CTLA-4mAb 3的VL结构域(SEQ IDNO:91)。
E18.实施方式17的双特异性分子，其中：
(A)能够免疫特异性结合PD-1的表位的这类表位-结合位点包括PD-1 mAb6-I VH的VH结构域(SEQ ID NO:86)和PD-1 mAb 6-SQ的VL结构域(SEQ ID NO:87)；和
(B)能够免疫特异性结合CTLA-4的表位的这类表位-结合位点包括CTLA-4mAb 3的VH结构域(SEQ ID NO:90)和CTLA-4mAb 3的VL结构域(SEQ ID NO:91)。
E19.实施方式E1-E18的任何一个中的双特异性分子，其中这类分子包括：
(A)具有SEQ ID NO:95的两条多肽链，和具有SEQ ID NO:96的两条多肽链；或
(B)具有SEQ ID NO:97的两条多肽链，和具有SEQ ID NO:98的两条多肽链；或
(C)具有SEQ ID NO:99的两条多肽链，和具有SEQ ID NO:100的两条多肽链；或
(D)具有SEQ ID NO:102的两条多肽链，和具有SEQ ID NO:103的两条多肽链；或
(E)具有SEQ ID NO:101的两条多肽链，和具有SEQ ID NO:100的两条多肽链；或
(F)具有SEQ ID NO:104的一条多肽链，具有SEQ ID NO:105的一条多肽链，具有SEQ ID NO:106的一条多肽链，和具有SEQ ID NO:107的一条多肽链；或(G)具有SEQ ID NO:108的一条多肽链，具有SEQ ID NO:105的一条多肽链，具有SEQ ID NO:109的一条多肽链，和具有SEQ ID NO:107的一条多肽链。
E20.一种药物组合物，其包括有效量的实施方式E1-E19的任何一个中的双特异性分子和药学上可接受的载体。
E21.实施方式E1-E19的任何一个中的双特异性分子，其中这类分子用于促进刺激需要其的受试者的免疫介导的应答。
E22.实施方式E1-E19的任何一个中的双特异性分子，其中这类分子用于治疗与受抑制免疫系统相关的疾病或病况。
E23.实施方式E22的双特异性分子，其中疾病或病况是癌症或感染。
E24.实施方式E23的双特异性分子，其中这类癌症特征在于存在选自下述的细胞的癌症细胞：肾上腺肿瘤、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色细胞肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生小圆细胞瘤、室管膜细胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、不完全性骨纤维生成、骨的纤维发育异常、胆囊癌或胆管癌、胃癌、妊娠滋养层疾病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性的脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌、甲状旁腺瘤、儿科癌症、周围神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、眼色素层后黑素瘤、罕见血液学疾病、肾转移癌症、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌和子宫癌。
E25.实施方式E24的双特异性分子，其中这类感染特征在于存在细菌、真菌、病毒或原生动物病原体。
E26.实施方式E25的双特异性分子，其中这类感染特征在于存在爱泼斯坦-巴尔病毒、甲肝病毒(HAV)；乙肝病毒(HBV)；丙肝病毒(HCV)；疱疹病毒(例如HSV-1、HSV-2、HHV-6、CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、水泡性口炎病毒(VSV)、芽孢杆菌纲、柠檬酸杆菌属、霍乱、白喉、肠杆菌属、淋球菌、幽门螺旋杆菌、克雷伯氏菌属、军团菌属、脑膜炎球菌、分歧杆菌、假单胞菌属、Pneumonococci、立克次氏体细菌、沙门氏菌属、沙雷菌属、葡萄球菌属、链球菌属、破伤风、曲霉菌属(烟曲霉、黑曲霉等)、皮炎芽生菌、念珠菌属白色念珠菌、克柔假丝酵母、光滑念珠菌、热带念珠菌等)、新生隐球菌、毛霉目的属、犁头霉属、根霉属)、申克氏胞丝菌、巴西芽生菌、粗球霉菌、荚膜组织胞浆菌、细螺旋体病、包柔氏螺旋体、蠕虫寄生虫(钩虫、绦虫、吸虫、扁形虫(例如血吸虫)、蓝氏贾第虫、旋毛虫、脆双核阿米巴、布氏锥虫、克氏锥虫和杜氏利什曼虫。
实施例
现在已经大体上描述了本发明，通过参考下述实施例其将更容易理解。下述实施例阐释了组合物在本发明的诊断或治疗方法中的各种方法。实施例旨在阐释但决不限制本发明的范围。
实施例1
双特异性分子提供增强的免疫应答刺激
产生对于调节两个免疫调节途径PD-1和LAG-3的独特细胞表面蛋白质具有特异性的双特异性分子并且命名为“DART A”。
DART A是包含Fc区的双特异性四链双抗体，其具有对于PD-1特异性的两个结合位点、对于LAG-3特异性的两个结合位点、被工程化用于延长半衰期的变异的IgG4 Fc区和包含半胱氨酸的E/K-螺旋异源二聚体促进结构域。如下面更详细地描述，DART A包括人源化抗PD-1抗体(hPD-1 mAb 6)和人源化抗LAG-3抗体(hLAG-3 mAb 1)的结合特异性(即，VH和VL结构域)。DART A的第一和第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:63)：
在SEQ ID NO:63中，氨基酸残基1-107对应能够结合LAG-3(hLAG-3mAb1)的人源化单克隆抗体的VL结构域的氨基酸序列；残基108-115对应间插间隔体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))；残基116-234对应能够结合PD-1的单克隆抗体的VH结构域(hPD-1 mAb 6，SEQ ID NO:57，其中X1是I)；残基235-240对应间插间隔体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:6))；残基241-268对应包含半胱氨酸的异源二聚体促进(E-螺旋)结构域(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:20))；残基269-280对应稳定化的IgG4铰链区(SEQID NO:36)；残基281-496对应包括取代M252Y/S254T/T256E并且缺少C-末端残基的IgG4CH2-CH3结构域的变体。
DART A的第二和第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:64)：
在SEQ ID NO:64中，氨基酸残基1-111对应能够结合PD-1的单克隆抗体的VL结构域(hPD-1 mAb 6，SEQ ID NO:58其中X1是S并且X2是Q)的氨基酸序列；残基112-119对应间插间隔体肽(连接体1:GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))；残基120-237对应能够结合LAG-3的人源化单克隆抗体(hLAG-3 mAb 1)的VH结构域；残基238-243对应包含半胱氨酸的间隔体连接体肽(连接体2:GGCGGG(SEQ ID NO:6))；残基244-271对应包含半胱氨酸的异源二聚体促进(K-螺旋)结构域(KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQ ID NO:21))。
在金黄色葡萄球菌肠毒素B型(“SEB”)试验中检测DART A刺激T-细胞的能力。SEB是微生物超抗原，其能够激活SEB-应答供体中大量的T-细胞(5-30％)。SEB结合肽结合槽(peptide binding grove)外面的MHC II，因此是MHC II依赖性的，但是是不受限制的和TCR介导的。T细胞的SEB-刺激导致寡克隆T细胞增殖和细胞因子产生(尽管可观察到供体变化性)。在SEB-刺激48小时内，PMBC上调PD-1和LAG-3，其中在96-孔板中伴随SEB-刺激的二次培养后第5天，进一步增强。SEB-刺激PBMC之后，免疫检查点蛋白质PD-1和LAG-3的上调限制了SEB再次刺激时的细胞因子释放。检测DART A通过检查点抑制增强细胞因子释放的能力并且与单独或组合的亲本抗PD-1和抗LAG-3抗体的活性比较。
简言之，使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)密度梯度离心方法，根据制造商的指导，从在健康供体知情同意的情况下获得自健康供体的全血(BiologicalSpecialty Corporation)纯化PBMC，然后使用Untouched Human T CellsKit(Untouched人T细胞试剂盒)(Life Technologies)，根据制造商的指导，纯化T细胞。在T-25大烧瓶中的RPMI-培养基+10％热失活的FBS+1％青霉素/链霉素中单独培养纯化的PBMC，2-3天，或与SEB(Sigma-Aldrich)，0.5ng/mL(初次刺激)，一起培养2-3天。在第一轮的SEB-刺激结束时，用PBS洗涤PBMC两次，并且在96孔组织培养板中立即以1-5x105细胞/孔的浓度铺平板，其在单独的培养中、在具有对照抗体的培养基中、在具有0.5ng/mL的SEB(二次刺激)和无抗体的培养基中，或在具有SEB和DART A、对照IgG或抗PD-1抗体+/-抗LAG-3mAb的培养基中，并且培养另外的2-3天。在二次刺激结束时，收获上清液，以使用针对IFNγ、TNFα、IL-10和IL-4的人DuoSet ELIS Kits(R&D Systems)，根据制造商的指导，测量细胞因子分泌。
在这些试验中，DART A(PD-1 x LAG-3双特异性分子)和抗PD-1和抗LAG-3抗体被使用的浓度为0.0061、0.024、0.09、0.39、1.56、6.25或25nM。对于这些研究，在使用抗体的组合时，以指示的浓度提供每种抗体，因此总的抗体浓度是每种抗体使用的浓度的两倍(即，0.0122、0.048、0.18、0.78、3.12、12.5或50nM)。图7显示了来自代表性供体(D：56041)的SEB-刺激的PBMC的IFNγ分泌特征。对于包括来自可选的PD-1和LAG-3抗体的VH/VL结构域的PD-1 x LAG-3双特异性分子，并且对于具有可选结构的PD-1 x LAG-3双特异性分子，看到了类似的结果(见，例如，图3C，和对于许多供体。
这些研究的结果表明，当再次刺激时，PD-1 x LAG-3双特异性分子显着增强了来自SEB-刺激PBMC的IFNγ产生。这些结果显示，靶向两个免疫调节途径的双特异性分子比靶向相同途径的单独的抗体的组合更有效。
实施例2
PD-1 x CTLA-4双特异性分子
可使用本文提供的和本领域已知的方法产生对于PD-1和CTLA-4具有特异性的双特异性分子。表8中提供了若干PD-1 xCTLA-4双特异性分子的多肽链的一般结构。尤其地，可产生包括两条多肽链的双特异性二价双抗体分子，其具有针对PD-1的一个结合位点和针对CTLA-4的一个结合位点，其中多肽链具有变型I的一般结构(也见，例如，图1)。可产生包括三条多肽链的双特异性二价双抗体分子，其具有针对PD-1的一个结合位点、针对CTLA-4的一个结合位点和Fc区，其中多肽链具有变型II的一般结构(也见，例如，图4A)。可产生包括四条多肽链的双特异性四价双抗体分子，其具有针对PD-1的两个相同的结合位点、针对CTLA-4的两个相同结合位点和Fc区，其中多肽链具有变型III或IV的一般结构(也见，例如，图3A-3C)。另外，可产生包括四条多肽链的双特异性三价分子，其具有针对PD-1的两个结合位点和针对CTLA-4的一个结合位点(或针对CTLA-4的两个结合位点和针对PD-1的一个结合位点)和Fc区，其中多肽链具有变型V的一般结构(也见，例如，图6A)。另外，可产生包括四条多肽链的双特异性二价抗体分子，其具有针对PD-1的一个结合位点、针对CTLA-4的一个结合位点和Fc区，其中多肽链具有变型VI的一般结构(也见，例如，美国专利号7,695,936和PCT专利公开WO 2011/143545)。
HPD＝异源二聚体促进结构域
对于表8中提供的双特异性分子的每种变型：
VL1和VH1是抗PD-1抗体的可变结构域并且VL2和VH2是抗CTLA-4抗体的可变结构域；或
VL1和VH1是抗CTLA-4抗体的可变结构域并且VL2和VH2是抗PD-1抗体的可变结构域。
对于变型V和VI：VL3和VH3是抗PD-1抗体的可变结构域或是抗CTLA-4抗体的可变结构域。
上面提供了可用于产生这类双特异性分子的连接体、异源二聚体促进结构域和恒定区(例如，CH1、铰链、CH2-CH3结构域)。尤其地，如本文详细描述的，对于第一和第三多肽链不同的分子，修饰CH2-CH3结构域，以促进异源二聚化并且减少或防止同源二聚化，例如通过修饰一条链上的CH2-CH3结构域以包括“臼”和修饰在另一条链上的CH2-CH3结构域以包括“杵”。如上所详述，铰链和/或CH2-CH3结构域可包括氨基酸取代，其稳定双特异性分子和/或改变效应子功能和/或延长血清半衰期。
实施例3
通用双特异性衔接子(adaptor)(“UBA”)分子
可选地，可构建双特异性分子(例如，双特异性抗体、双特异性双抗体、三价结合分子等)，其包括特异性结合PD-1(或CTLA-4)的一个表位-结合位点和特异性结合半抗原，例如荧光素异硫氰酸酯(也称为荧光异硫氰酸酯或FITC)的第二表位-结合位点。这类双特异性分子用作通用双特异性衔接子(“UBA”)分子，能够共连接对于PD-1(或CTLA-4)特异性的结合结构域与对于CTLA-4(或PD-1)特异性的荧光素-缀合的结合分子(例如，抗体、scFv等)。例如，这类通用双特异性衔接子分子的FITC-反应性臂可用于结合FITC标记的抗体，所述FITC标记的抗体结合CTLA-4(或PD-1)，从而产生适于结合PD-1和CTLA-4的通用双特异性衔接子分子。这类通用双特异性衔接子分子可用于快速评估双特异性分子。
抗荧光素抗体，4-4-20(“mAb 4-4-20”)可用作FITC-特异性结合结构域的来源(Gruber,M.等(1994)“Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific SingleChain Antibody Expressed In Escherichia coli,”J.Immunol.152(11)：5368-5374)。
mAb 4-4-20的重链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:65)(CDRH残基加下划线)：
mAb 4-4-20的轻链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:66)(CDRL残基加下划线)：
可使用本文提供的任何双特异性形式(见，例如，表1、2、3和4)。优选的双特异性分子仅仅包括一个半抗原(例如，荧光素)结合位点并且结合单半抗原标记的抗体，从而在所得复合物中展示1:1比例的通用衔接子双特异性分子与半抗原标记的抗体。可使用，例如，抗PD-1抗体和抗荧光素抗体的VL和VH结构域构建这类通用双特异性衔接子分子。优选地，这类通用双特异性衔接子分子是共价结合的双抗体或三价结合分子，其包括两条、三条、四条、五条或更多条多肽链。下面提供了可构建的代表性通用双特异性衔接子分子。
A.UBA 1
可产生的一种通用双特异性衔接子分子是包括两条多肽链的共价结合的双抗体，其包括一个PD-1表位-结合位点和一个荧光素结合位点(“UBA 1”)。
UBA 1的第一多肽链在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、mAb 4-4-20的VL结构域(SEQ ID NO:66)、间插间隔体肽(连接体1，GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、PD-1 mAb 6的VH结构域(SEQ ID NO:57，其中X1是I))、间插间隔体肽(连接体2，GGCGGG(SEQ ID NO:6))、E-螺旋异源二聚体促进结构域：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:18))和C-末端。
因此，UBA 1的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:67)：
UBA 1的第二多肽链在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、PD-1 mAb 6的VL结构域(SEQ ID NO:58，其中X1是S并且X2是Q))、间插间隔体肽(连接体1，GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、mAb 4-4-20的VH结构域(SEQ ID NO:65))、间插间隔体肽(连接体2，GGCGGG(SEQ IDNO:6))、K-螺旋异源二聚体促进结构域：KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQ ID NO:19))和C-末端。
因此，UBA 1的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:68)：
B.UBA 2
如上面提供，将IgG CH2-CH3结构域并入到双抗体，比如UBA 1的一条多肽链上允许形成更复杂的包含Fc区的四链双特异性双抗体。因此可产生的第二通用双特异性衔接子分子是包括四条多肽链的共价结合的双抗体，其包括两个PD-1表位-结合位点、两个荧光素结合位点和Fc区(“UBA 2”)。注意UBA 2可经两个荧光素结合位点结合两个荧光素标记的分子。
UBA 2的第一和第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、mAb 4-4-20的VL结构域(SEQ ID NO:66)、间插间隔体肽(连接体1，GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、PD-1 mAb 6的VH结构域(SEQ ID NO:57，其中X1是I))、间插间隔体肽(连接体2，GGCGGG(SEQ ID NO:7))、E-螺旋异源二聚体促进结构域：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:18))、间插间隔体肽(连接体3，GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:31))、包括取代L234A/L235A的IgG1 Fc区(SEQ ID NO:43)，其中X是K)，和C-末端。
因此，UBA 2的第一和第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:69)：
UBA 2的第二和第四多肽链与UBA 1的第二多肽链相同。因此，UBA 2的第二和第四多肽链每条均具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
C.UBA3
可产生的第三通用双特异性衔接子分子是包括三条多肽链的共价结合的双抗体，其包括一个PD-1表位-结合位点、一个荧光素结合位点和Fc区(“UBA3”)。
UBA 3的第一多肽链在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、mAb 4-4-20的VL结构域(SEQ ID NO:66)、间插间隔体肽(连接体1，GGGSGGGG(SEQ ID NO:5))、PD-1 mAb 6的VH结构域(SEQ ID NO:57，其中X1是I))、间插间隔体肽(连接体2，GGCGGG(SEQ ID NO:6))、E-螺旋异源二聚体促进结构域：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:18))、间插间隔体肽(连接体3，GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:31))、包括取代L234A/L235A的“包含杵的”IgG1 Fc区(SEQ ID NO:44，其中X是K))，和C-末端。
因此，UBA 3的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:70)：
UBA 3的第二多肽链可以与UBA 1的第二多肽链相同。因此，UBA 3的第二多肽链具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
UBA 3的第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括N-末端、间隔体肽(连接体3，DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:26))、包括取代L234A/L235A的“包含臼的”IgG1 Fc区(SEQ ID NO:45，其中X是K))，和C-末端。
因此，UBA 3的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:71)：
D.UBA 4
可产生的第四通用双特异性衔接子分子是包括四条多肽链的共价结合的三价结合分子，其包括两个PD-1表位-结合位点、一个荧光素结合位点和Fc区(“UBA 4”)。
UBA 4的第一多肽链与UBA 3的第一多肽链相同。因此，UBA 4的第一多肽链具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
UBA 4的第二多肽链与UBA 1的第二多肽链相同。因此，UBA 4具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
UBA 4的第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括PD-1 mAb 6的VH结构域(SEQID NO:57，其中X1是I))、IgG1 CH1结构域(SEQ ID NO:40)、IgG1铰链区(SEQ ID NO:33)、包括取代L234A/L235A的“包含臼的”IgG1 Fc区(SEQ ID NO:45，其中X是K))，和C-末端。
因此，UBA 4的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:72)：
UBA 4的第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括PD-1 mAb 6的VL结构域(SEQID NO:58，其中X1是S并且X2是Q))、CL结构域(例如，IgGκ结构域(SEQ ID NO:38)，和C-末端。
因此，UBA 4的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:73)：
E.UBA 5
可产生的第五通用双特异性衔接子分子是包括三条多肽链的共价结合的三价结合分子，其包括两个PD-1表位-结合位点、一个荧光素结合位点和Fc区(“UBA 5”)(见，例如，图6C-6D)。
UBA 5的第一多肽链与UBA 3的第一多肽链相同。因此，UBA 5的第一多肽链氨具有SEQ ID NO:70的基酸序列。
UBA 5的第二多肽链与UBA 1的第二多肽相同。因此，UBA 5的第二多肽链具有SEQID NO:68的氨基酸序列。
UBA 5的第三多肽链在N-末端至C-末端方向上包括PD-1 mAb 6的VL结构域(SEQID NO:58，其中X1是S并且X2是Q))、间插间隔体肽(连接体4，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37))、PD-1 mAb 6的VH结构域(SEQ ID NO:57，其中X1是I))、IgG1 CH1结构域(SEQ ID NO:40)、IgG1铰链区(SEQ ID NO:33)、包括取代L234A/L235A的“包含臼的”IgG1 Fc区(SEQ IDNO:45，其中X是K))，和C-末端。
因此，UBA 5的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:74)：
使用常规方法，可用荧光素标记抗CTLA-4抗体。当在存在上面提供的、具有结合PD-1表位-结合位点和结合荧光素的表位-结合位点的通用双特异性衔接子分子的情况下温育这类标记的分子时，它们形成PD-1 x CTLA-4双特异性分子，其可如下面描述地被测试。
鉴于本文提供的教导，将认识到不同的VH结构域、VL结构域、连接体、异源二聚体促进结构域和/或IgG恒定结构域可用于产生可选的通用双特异性衔接子分子。例如，抗CTLA-4抗体和/或不同抗PD-1抗体的VH和VL结构域可替代采用的抗PD-1抗体的VH和VL结构域被使用，以产生可选的或等价的通用双特异性衔接子分子。可选地，抗CTLA-4抗体的VH和VL结构域可代替抗荧光素抗体的VH和VL结构域被使用，以产生具有上面提供的变型I、II、III、V和VI的一般结构的PD-1 x CTLA-4双特异性分子。这类PD-1 x CTLA-4双特异性分子可直接用于下面描述的试验中。
实施例4
试验
可以任何各种方式表征本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子。尤其地，可分析本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子它们免疫特异性结合PD-1和CTLA-4分子(例如，如细胞表面上呈现的等)的能力，和/或可测定与抗原的相互作用的结合动力学。在双特异性分子包括Fc区(或其部分)的情况下，可分析它们展示Fc-FcγR相互作用的能力，例如，Fc区(或其部分)与FcγR的特异性结合、效应子功能的介导、信号传导等。可使用本领域已知的体外和体内试验测定本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的免疫调节活性和/或体内抗肿瘤效力。
A.制备免疫细胞和表达PD-1和/或CTLA-4的细胞
1.从人全血分离PBMC和免疫细胞亚群
从全血分离来自健康人供体的PBMC，例如，使用Ficoll梯度离心。简言之，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)1:1稀释全血。使稀释的血液(35mL)在50mL管中的15ml的Ficoll-PaqueTM Plus上分层并且使管在400x g(1320rpm)离心30分钟，制动停止(brake off)。将两相之间的血沉棕黄层收集至50mL管中，并且在600xg(1620rpm)离心5分钟。丢弃上清液并且用PBS洗涤细胞小球3次(例如，通过使管在600x g(1620rpm)离心5分钟)。使用台盼蓝染料测定存活的细胞计数。将PBMC再悬浮在完全培养基(例如，RPMI 1640，10％FBS，1％pen/strep)中并且在37℃用5％CO2温育过夜，或进一步被处理，以分离期望的免疫细胞亚群，比如T细胞，(例如，T regs、CD8、CD4)、NK细胞、树突细胞和单核细胞，如下面所描述。
使用商用制备试剂盒(例如，UntouchedTM人T细胞分离试剂盒，用于分离T-细胞、CD4 T-细胞、CD8 T-细胞、单核细胞、树突细胞(Life Technologies/ThermoFisherScientific)；Regulatory CD4+/CD35+T细胞试剂盒，用于分离T调节细胞(CD4+/CD25+)(ThermoFisher)等)，根据制造商的指导，容易从PBMC分离具体的免疫细胞亚群。分离之后，将免疫细胞亚群(例如，T细胞)再悬浮在适当的完全培养基(例如，RPMI1640，10％FBS，1％青霉素/链霉素，其可被补充以细胞因子(例如，IL-2、GM-CF、IL-4、TNF-α等)中，并且在37℃用5％CO2温育过夜。如本文提供的，这类纯化的亚群可用于评估PD-1和/或CTLA-4的细胞表面表达并且用于评估本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的免疫刺激活性。
2.从食蟹猴或猕猴(Rhesus Monkey)全血分离PBMC
从全血分离来自食蟹猴或猕猴的PMBC，例如使用Ficoll梯度离心。简言之，用无菌PBS以1:3稀释全血。将稀释的血液(35mL)在50mL聚丙烯离心机管中的15ml的90％Ficoll-PaqueTM Plus(90mL Ficoll+10mL PBS)上分层并且在室温以9931 x g(2000rpm)离心30分钟，制动停止。收集两个相之间的血沉棕黄层并且转移至干净的50mL管中，并且通过使管以600x g(1620rpm)离心5分钟用45mL PBS洗涤。丢弃上清液并且将小球用PBS清洗3x。接着，将食蟹猴或猕猴PBMC再悬浮在30ml的完全培养基中并且通过台盼蓝染料排阻法测定存活的细胞计数。
使用商用制备试剂盒(例如，全(Pan)T-细胞、CD4+ T-细胞和CD4+/CD25+ Treg分离试剂盒(Miltenyl Biotech))，根据制造商的指导，容易从非人灵长类PBMC分离具体的免疫细胞亚群。可选地，使用非人灵长类特异性的或交叉-活性mAb的流式细胞术分选可用于分选。
3.从分离的人单核细胞产生人不成熟或成熟的骨髓衍生的树突细胞(mDC)细胞
使用商业制备试剂盒(例如，UntouchedTM人单核细胞试剂盒(Life Technologies/ThermoFisherScientific)，根据制造商的指导，从供体衍生的纯化PBMC分离人单核细胞。通过在存在重组人粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(例如，hGM-CSF；Peprotech，100ng/ml)和重组人白介素-4(hIL-4；Peprotech，40ng/ml)的情况下，培养单核细胞(例如，在α最小基本培养基，其具有核苷(αMEM)培养基+2％人AB-阴性血清+1％青霉素/链霉素)5-7天，诱导分离的人单核细胞分化成人不成熟的mDC。收获不成熟的mDC并且通过使管在600x g(1620rpm)离心5分钟用PBS洗涤，以在异源混合淋巴细胞反应(allo-MLR)试验中的用作刺激细胞，比如下面详述的那些实验。
在某些allo-MLR实验中，通过添加TNFα或另外的细胞因子(IFNγ、IL-1β)和促分裂原(LPS)的混合物用于培养另外两天，诱导不成熟mDC分化(见，例如，Han,T.(2009)“Evaluation of 3Clinical Dendritic Cell Maturation Protocols Containing LPSand IFN-gamma,”J Immunother 32:399)。可通过流式细胞术，使用一种或多种下述抗体评估mDC的纯度、成熟和激活：抗CD14、抗CD80、抗CD83、抗CD86、抗HLA-DR；和适当的同种型对照。可在FACSCalibur/Fortessa (Becton Dickinson/BD Biosciences)上获取来自这类评估的流式细胞术数据并且使用FlowJo软件(TreeStar)分析。
4.PD-1和CTLA-4的表达
可使用本领域已知的方法产生表达PD-1和/或CTLA-4的细胞。例如，细胞(例如，NSO、Jurkat、CHO等)可使用包含适当的基因(例如，人PD-1基因)的逆转录病毒载体被工程化，以表达PD-1和/或CTLA-4。可选地，免疫细胞可被刺激，以诱导或增加PD-1和/或CTLA-4的表达。简言之，将如上述分离的纯化的免疫细胞(例如，PBMC、T-细胞、树突细胞等)在存在或不存在促分裂原的情况下培养2-6天，并且在未处理的(幼稚)和刺激细胞上，例如使用流式细胞术检验PD-1和/或CTLA-4的表达。商用抗PD-1和抗CTLA-4抗体可用于初步评估在幼稚细胞上和响应促分裂原刺激的表达式样。另外，或任选地，可使用本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子。
可用于这类研究的促分裂原是本领域熟知的，并且包括但不限于：CD3/CD28珠、脂多糖(LPS)、金黄色葡萄球菌肠毒素A-E型(例如，SEB)、佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)、植物凝集素(PHA)、伴刀豆球蛋白A(conA)、美洲商陆促分裂原(PWM)等。鉴定为诱导/增强PD-1和/或CTLA-4的表达的促分裂原(一种或多种)可用于功能试验，以评估本发明的PD-1 xCTLA-4双特异性分子的刺激活性。见，例如本文所述的“SEB”和“MLR”试验。
B.结合试验
可用于分析与PD-1或CTLA-4分子的免疫特异性结合、结合交叉反应性或Fc-FcγR相互作用的免疫试验包括但不限于使用下述技术的竞争性和非竞争性试验体系：比如蛋白质印迹、放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附试验)、“夹心”免疫试验、免疫沉淀试验、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫层析试验、免疫扩散试验、凝集试验、补体固定试验、免疫放射测定试验、荧光免疫试验和蛋白质A免疫试验等。(见，例如，Ausubel等,2008,Current Protocols in Molecular Biology)。通常通过标准抗体-抗原试验，比如Biacore竞争性试验、饱和度试验或免疫试验比如ELISA或RIA，测量或测定对于靶抗原的结合亲和力。使用本领域技术人员已知的任何技术的荧光激活细胞分选(FACS)用于基于免疫学或功能的试验，以表征本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子。
例如，可如上述制备PBMC。其中期望的免疫细胞亚集(例如，T调节、T助细胞、APC等)可分离自纯化的PBMC。然后，通过如下面描述的共染色和FACS分析，针对在各种细胞亚集(例如，T调节、T助细胞、APC等)上的PD-1和CTLA-4表达，检验分离的细胞。
1.细胞表面结合(饱和度试验)
在基于饱和度/稀释度的试验中，使用表达PD-1和/或CTLA-4的细胞(靶细胞)可测量PD-1 x CTLA-4双特异性分子结合在细胞表面上表达的PD-1和/或CTLA-4的能力。这类细胞可以是被刺激以表达PD-1和/或CTLA-4的免疫细胞，或被工程化以稳定超表达PD-1和/或CTLA-4分子的细胞系(例如，NSO细胞)。简言之，收获培养的靶细胞(例如，被工程化以表达PD1+的NSO细胞)，并且再悬浮(例如，约5x106细胞/ml)在封闭缓冲液(例如，FACS缓冲液+10％人AB血清)中。以等摩尔浓度(例如，总共200μl中的20nM)开始，制备PD-1 x CTLA-4双特异性分子，抗PD-1抗体、抗CTLA-4或抗PD-1和抗CTLA-4抗体的组合，用于在单独的微量滴定板中稀释，然后连续稀释(例如，1:4、1:5、1:10等)5-12次，以产生5-12点曲线。凭经验确定在所有实验中的最高开始浓度。将相同体积(例如，50μl)的每种稀释物添加至新的微量滴定板中，并且将靶细胞添加至每个孔(例如，0.25x106细胞/孔)中，并且温育(例如，在4-25℃，达30-120分钟)。洗涤细胞1-3次(例如，使微量滴定板在600x g(1620rpm)旋转5分钟，然后用封闭缓冲液洗涤并且使其再次旋转)并且再悬浮在封闭缓冲液中。对于二次级色，选择适当的二级试剂，例如山羊抗人Fc-APC可用于检测人初级抗体，而山羊抗小鼠IgG FcAlexa Fluor 647用于检测小鼠初级抗体。将选择的二级试剂在封闭缓冲液中稀释，并且基于单二级试剂的浓度，制备原料液，并且将相同体积/孔的二级混合物等分至单个孔并且温育(例如，在4-25℃，达30-120分钟)。如上述洗涤细胞并且再悬浮在封闭缓冲液中。通过流式细胞术分析染色的细胞。可在FACSCalibur/Fortessa(Becton Dickinson/Fortessa)上获取流式细胞术数据，使用FlowJo软件(TreeStar)作为平均荧光强度进行分析，并且绘图以及使用Prism6软件(Graphpad)中的log(激动剂)vs.应答-变量斜率(四参数)函数进行拟合。
3.受体/配体结合和信号传导试验
下面更详细地提供可用于分析本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子调节(例如，阻断、抑制、刺激等)配体结合和信号传导的能力的试验。
a.PD-1受体/配体结合
可使用表达PD-1的细胞(靶细胞)评估PD-1 x CTLA-4双特异性分子抑制PD-1结合PD-L1和/或PD-L2的能力。这类细胞可以是被刺激以表达PD-1的免疫细胞，或被工程化而表达PD-1分子的细胞系，例如用人PD-1基因经逆转录病毒转导的NSO-细胞。简言之，收获表达PD-1的细胞(例如，NSO/PDCD1(NSO-PD1+))并且再悬浮(例如，约1.5x106细胞/ml)在封闭缓冲液(例如，FACS缓冲液+10％人Ab血清)中，并且将其铺在微量滴定板中(例如，0.25x106细胞/孔)。以等摩尔浓度(例如，总共200μl中的20nM)开始，制备PD-1 x CTLA-4双特异性分子、抗PD-1抗体、抗CTLA-4，或抗PD-1和抗CTLA-4抗体的组合，用于在单独的微量滴定板中稀释并且连续稀释(例如，1:4、1:5、1:10等)5-12次，以产生5-12点曲线。根据经验确定在所有实验中的最高开始浓度。将相同体积(例如，50μl)的每种稀释物添加至包含靶细胞的微量滴定板的每个孔中。为了评估对PD-L1结合的抑制，将可溶性PD-L1融合蛋白(例如，hPD-L1(B7H1)TEV-hIgG1-Fc-生物素(Ancell))添加至每个孔中，未染色的阴性对照孔除外，并且温育(例如，在4-25℃，达30-120分钟)。为了评估对PD-L2结合的抑制，将可溶性PD-L2融合蛋白(例如，CD273(PD-L2)muIgG/生物素(Ancell))添加至每个孔中，未染色的阴性对照孔除外，并且温育(例如，在4-25℃，达30-120分钟)。洗涤细胞1-3次(例如，使微量滴定板在600x g(1620rpm)旋转5分钟，然后用封闭缓冲液洗涤，并且使其再次旋转)。将细胞再悬浮在封闭缓冲液中。除了未染色的阴性对照孔以外，添加用于检测PD-L1或PD-L2融合蛋白的合适的二级试剂(例如，链霉抗生物素-PE标记的二级试剂(eBiosciences))并且温育(例如，在4-25℃，达15-120分钟)。如上述洗涤细胞并且再悬浮在封闭缓冲液中。可通过流式细胞术分析染色的细胞。可在FACSCalibur/Fortessa(Becton Dickinson/Fortessa)上获取流式细胞术数据，并且使用FlowJo软件(TreeStar)，分析标记的sPD-L1或sPD-L2在存在PD-1 x CTLA-4双特异性分子、抗PD-1抗体、抗CTLA-4，或抗PD-1和抗CTLA-4抗体的组合的情况下损失的平均荧光强度，并且绘图以及使用Prism6软件(Graphpad)中的log(激动剂)vs.应答-变量斜率(四参数)函数进行拟合。
b.CTLA-4受体/配体结合
可使用表达CTLA-4的细胞(靶细胞)评估PD-1 x CTLA-4双特异性分子抑制CTLA-4结合CD80和/或CD86的能力。这类细胞可以是被刺激以表达CTLA-4的免疫细胞，或被工程化而表达CTLA-4的细胞系，例如用人CTLA-4基因经逆转录转导的NSO-细胞。简言之，收获表达CTLA-4的细胞并且再悬浮在封闭缓冲液(例如，FACS缓冲液+10％人Ab血清)中并且在微量滴定板中铺板(例如，0.25x106-1.0x106细胞/孔)。以等摩尔浓度(例如，总共200μl中的20nM)开始，制备PD-1 x CTLA-4双特异性分子、抗PD-1抗体、抗CTLA-4或抗PD-1和抗CTLA-4抗体的组合，用于在单独的微量滴定板中稀释并且连续稀释(例如，1:4、1:5、1:10等)5-12次，而产生5-12点曲线。根据经验确定在所有实验中的最高开始浓度。将相同体积(例如，50μl)的每种稀释物添加至包含靶细胞的微量滴定板的每个孔中。为了评估对CD80结合的抑制，将可溶性CD80融合蛋白(例如，hCD80-muIg-生物素)添加至每个孔，未染色的阴性对照孔除外，并且温育(例如，在4-25℃，达30-120分钟)。为了评估对CD86结合的抑制，将可溶性CD86融合蛋白(例如，hCD86-muIg-生物素)添加至每个孔，未染色的阴性对照孔除外，并且温育(例如，在4-25℃，达30-120分钟)。将细胞洗涤1-3次(例如，使微量滴定板在600x g(1620rpm)旋转5分钟，然后用封闭缓冲液洗涤，并且使其再次旋转)。将细胞再悬浮在封闭缓冲液中。除了未染色的阴性对照孔，添加用于检测CD80或CD86融合蛋白的合适的二级试剂(例如，链霉抗生物素-PE标记的二级试剂(eBiosciences))，并且温育(例如，在4-25℃，达15-120分钟)。如上述洗涤细胞并且再悬浮在封闭缓冲液中。可通过流式细胞术分析染色的细胞。可在FACSCalibur/Fortessa(BectonDickinson/Fortessa)上获取流式细胞术数据，并且使用FlowJo软件(TreeStar)分析标记的CD86或CD80在存在PD-1 x CTLA-4双特异性分子、抗PD-1抗体、抗CTLA-4，或抗PD-1和抗CTLA-4抗体的组合的情况下损失的平均荧光强度，并且绘图和使用Prism6软件(Graphpad)中的log(激动剂)vs.应答-变量斜率(四参数)函数进行拟合。
C.报告试验
可使用Promega开发的商业报告系统，根据制造商的指导，评估PD-1 xCTLA-4双特异性分子在阻断PD-1与PD-L1的相互作用中的功能活性。简言之，使用被工程化而用作刺激系(stimulator line)或报告细胞系的两个细胞系。从CHO-亲本系工程化刺激系，以表达PD-L1分子和T细胞激活剂，其是结合膜的抗CD3激动剂mAb[CHO/PDL1细胞]。报告细胞系从CD3阳性Jurkat亲本系被工程化，以在激活的T-细胞(NFAT)[NFAT-luc2/PD-1Jurkat细胞]的核因子的转录控制下表达荧光素酶报告构建体。当一起培养时，在CHO-PDL1细胞系上表达的抗CD3激动剂通过经Jurkat-NFAT-luc/PD-1细胞系上存在的TCR/CD3信号传导复合物的接合而介导的NFAT信号传导途径来驱动荧光素酶表达。在没有抗PD-1或抗PD-L1抗体的情况下，荧光素酶以相对于TCR/CD3信号传导的水平表达，但是通过用作闸的PD-1/PD-L1抑制轴的存在而被下调或抑制。在存在抑制PD-1/PD-L1信号传导的分子(例如，抗PD-1或抗PD-L1抗体)的情况下，该抑制轴或“闸”被释放，允许可测量的增强的荧光素酶表达。因此，可通过培养CHO/PDL1与NFAT-luc2/PD1Jurkat(3H-D5)而评估PD-1 x CTLA-4双特异性分子的PD-1抑制活性。简言之，将CHO-PDL1在微量滴定板中铺板(例如，以4.0x104细胞/孔)并且培养过夜(例如，在包含10％FBS+100ug/mL潮霉素B+500ug/mL G418的RPMI培养基中)。第二天，制备试验缓冲液(例如，制备RPMI+2％FBS以及试验缓冲液中5-12点连续稀释的PD-1 xCTLA-4双特异性分子，或抗PD-1抗体，其具有等摩尔当量(例如，100-200nM)的最高稀释点和5-12次连续稀释(例如，1:4、1:5、1:10等)。以下述顺序，从包含粘附CHO/PDL1细胞的微量滴定板去除培养基的一部分细胞，并且将每种稀释物的等分试样添加至CHO/PDL1细胞中。收获培养的NFAT-luc2/PD-1Jurkat细胞并且再悬浮在试验缓冲液中，并且将其添加(例如，以40μl/孔的5.0x104细胞/孔)至CHO/PDL1细胞中。温育共培养物(例如，在37℃，达6小时)。在温育结束时，重构Bio-Glo底物(Promega)并且将其添加至环境温度平衡的微量滴定板中。温育之后(例如，5-10分钟)，在VICTORTMX4 Multilabel板阅读器(Perkin Elmer#2030-0040)上，在450nm读取每个孔的光密度，以发光相对光单位(RLU)作为读数。然后可将数据绘图并且使用Prism6软件(Graphpad)中的log(激动剂)vs.应答-变量斜率(四参数)函数进行拟合。
类似的报告试验可用于CTLA-4信号传导(例如，CTLA-4阻断生物测定试剂盒(Promega))和/或可容易被产生，以分析PD-1 x CTLA-4双特异性分子在阻断CTLA-4与其各自配体的相互作用中的功能活性。
D.免疫调节试验
可用于分析本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的免疫调节活性的试验包括促分裂原刺激试验，比如上面详述的“SEB”试验，和混合淋巴细胞反应(MLR)试验，比如下面更详细提供的那些。预期本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子调节PD-1和CTLA-4抑制途径的能力在试验中与单独抗PD1和抗CTLA-4抗体或这类抗体的组合比较提供了增强的刺激。
如上述通过在Ficoll-PaqueTM梯度上离心从相同(自体)的血液或不相关(异源的)患者(一个或多个)健康的供体(一个或多个)血液分离PBMC或T细胞，并且再悬浮在完全培养基中。对于采用mDC的allo-MLR试验，如上所述纯化单核细胞并且使其成熟。对于单因素(单向)allo-MLR试验，将效应器细胞(例如，PBMC)与刺激细胞在微量滴定板中共培养。根据上下文，刺激细胞是DC，自体PBMC(对于auto-MLR，即，阴性对照)，或异源的PBMC(对于allo-MLR，即，阳性对照)。效应器:刺激细胞的比例通常是1:1或2:1，但是也可以改变。在存在等摩尔量的连续(例如，1:4、1:5、1:10等)稀释的PD-1 x CTLA-4双特异性分子、抗PD-1抗体、抗CTLA-4、抗PD-1和抗CTLA-4抗体的组合或相应的同种型mAb的情况下进行共培养。可如上述制备连续抗体稀释物。另外，在这类实验中用或不用抗CD3+/-抗CD28mAb刺激的单细胞群对照可用作对照。刺激细胞(刺激剂)被预先照射(例如，以45戈瑞[Gy](4500rads)使用3000Elan血液/细胞辐射器(Theratronics))，以防止刺激细胞的增殖并且允许测量仅仅应答细胞(效应器)的增殖。5-7天(调整该时间，以确保试验期间PD-1和CTLA-4的表达)之后，添加[3H]-胸苷(例如，1μCi/孔(Perkin Elmer))，持续另外的18-48个小时。在(例如，在TOPCount NXTβ-闪烁计数器(Perkin Elmer))中测量并入DNA的放射能。结果表示为每分钟的平均计数(cpm)或表示为刺激指数(SI)，其允许比较来自不同供体的结果。如下计算SI：刺激的细胞的平均计数/分钟(cpm)除以非刺激的细胞的平均cpm。对于PBMC-诱导的刺激，当SI≥3时，并且对于DC-诱导的刺激，SI≥6时，MLR应答被认为是正的。可选地，可使用基于CEFSE的增殖试验测量增殖(Boks,M.A.,等(2010)“An optimized CFSE basedT-cell suppression assay to evaluate the suppressive capacity of regulatoryT-cells induced by human tolerogenic dendritic cells,”Scand J Immunol 72:158–168)。
可用于评估本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的免疫刺激活性的另外的MLR试验是本领域已知的。见，例如，Davies,J.K.等(2011)“Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigenstimulation with co-stimulatory signal blockade,”Journal of VisualizedExperiments:JoVE,(49),2673；Kruisbeek,A.M.,等(2004)“Proliferative Assays forTcell Function,”Current Protocols in Immunology,60:III:3.12.1-3.12.20；Wallgren,A.C.等(2006)“The Direct Pathway Of Human T-Cell Allorecognition IsNot Tolerized By Stimulation With Allogeneic Peripheral Blood MononuclearCells Irradiates With High-Dose Ultraviolet,”Ba.Scand J of Immunol 63:90-96；Levitsky,J.等(2009)“The Human'Treg MLR'Immune Monitoring for Foxp3+Tregulatory cell generation,Transplantation 88:1303-11。
E.体内抗肿瘤试验
可在本领域已知的各种动物模型中评估本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子的抗肿瘤活性。用本发明的PD-1 x CTLA-4双特异性分子进行治疗预期抑制肿瘤形成和/或肿瘤生长，达到的程度比用单独抗PD1和抗CTLA-4抗体或这类抗体的组合达到的程度更大。
鼠科异种移植肿瘤模型尤其有用。简言之，小鼠被植入以感兴趣的癌症细胞系或肿瘤细胞，并且用以下进行治疗：(i)PD-1 x CTLA-4双特异性分子(ii)抗PD-1抗体(iii)抗CTLA-4抗体(iv)抗PD-1和抗CTLA-4抗体的组合，和(vi)无治疗对照，其可以是单独媒介和/或不相干的抗体。治疗可在植入之前开始(例如，1天之前(即，第-1天))；在植入的同一天开始(即，第0天)，或在形成肿瘤之后开始(例如，第7天)。动物可接收单次治疗或可接收多次治疗(例如，植入后每周一次)。随着时间的推移监测动物，以确定这些分子对肿瘤形成和/或生长的体内作用。可通过测量肿瘤并且确定肿瘤体积(高度x宽度x长度)来监测肿瘤的生长。显示完全的肿瘤退化的被治疗的动物可用于通过激发试验检验肿瘤特异性免疫性，所述激发试验使用相同的或肿瘤细胞并且使用不相干的肿瘤细胞作为对照。另外，可修饰这些模型，以包括与护理治疗的标准，比如化学疗法、辐射等的联合治疗。
可在这类异种移植模型中使用的许多可移植的癌细胞系是本领域已知的，包括但不限于：MDST8、SW480和SW620结直肠癌细胞；AGS胃癌细胞；UACC-62、A2058和LOX IMVI黑素瘤细胞；22rv前列腺癌细胞；AsPC-1和BxPc-3胰腺癌细胞；Caki-1、A498和786-0肾癌细胞；HT-1197膀胱癌细胞；4Τ1、MDA-MB-231、乳腺癌细胞；A549、WX322肺癌细胞；HT1080纤维肉瘤细胞；HBL-2人套细胞淋巴瘤细胞；Raji伯基特淋巴瘤细胞。尤其优选的是患者衍生的异种移植(PDX)模型。这类癌细胞系或患者衍生的肿瘤被移植到免疫系统受损的小鼠品种(例如，裸鼠、Scid小鼠、NOD小鼠、Rag 1缺陷型小鼠(null mice)等(见，例如，Belizario,J.E.,(2009)“Immunodeficient Mouse Models:An Overview,”Bentham Open 1874-2262/09)或人源化的小鼠，比如转基因人HLA-A2小鼠(见，例如，Shultz,L.D.,等(2012)“Humanizedmice for immune system investigation:progress,promise and challenges,”NatureRev Immunol 12:786-798)中，如上所述。另外，为了评估调节免疫检查点的分子，可用人免疫系统组分(例如，用人PBMC、干细胞、免疫祖细胞等重构)移植免疫缺陷小鼠，然后或同时植入期望的肿瘤细胞，并且进行治疗，如上面详细描述的。
实施例5
PD-1 x CTLA-4双特异性分子结合研究
产生若干PD-1 x CTLA-4双特异性分子，包括包含Fc区的双抗体和包括四条多肽链的包含Fc区的三价分子。产生了具有四条多肽链并且包括E/K-螺旋异源二聚体促进结构域的三个双抗体，并且给与命名“DART B”、“DART C”和“DART D”。产生具有四条链并且包括CH1/CL结构域的一个双抗体，并且给与命名“DART E”。产生具有四条链并且包括E/K-螺旋异源二聚体促进结构域和CH1/CL结构域的两个三价结合分子，并且给与命名“TRIDENT A”和“TRIDENT B”。
另外，产生了对于PD-1或CTLA-4具有特异性的若干抗体。产生了对于PD-1特异性的一个抗体，并且给与命名“PD-1 mAb 6 G4P”。产生对于CTLA-4特异性的三个抗体，并且给与命名“CTLA-4 mAb 1”、“CTLA-4 mAb 3 G1AA”和“CTLA-4 mAb 3 G4P”。
这些PD-1 x CTLA-4双特异性分子、抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体的结构和氨基酸序列提供在上面并且总结在下面表9中。
并入IgG4Fc区的分子也并入稳定化的IgG4铰链区。
**与伊匹单抗相同的氨基酸序列(见，例如，IMGT 3D和2D结构数据库登陆号8568_H和8568_L)
通过并入不同的VH和VL结构域，可容易产生包括可选的PD-1和/或CTLA-4表位-结合位点的另外PD-1 x CTLA-4双特异性分子。类似地，可如本文提供地，产生包括可选的连接体、Fc区和/或具有可选的结构的分子(见，例如，表8)。
A.ELISA结合研究
进行ELISA研究，以测量连续稀释的结合分子(抗体CTLA-4mAb 3 G4P、DART D、TRIDENT A或DARTB)与已经被涂布到支撑板上的可溶性hCTLA-4-Avi-His(1μg/mL)或hPD-1-His(1μg/mL)的结合。山羊抗人-Fc-HRP(1:10,000)用作检测结合的二级检测分子。这类研究的结果显示在表10和图8A-8B中。数据显示，具有针对PD-1和CTLA-4的两个结合位点的PD-1 x CTLA-4双特异性分子(例如，DART D和DART B)展示与PD-1和CTLA-4的结合，所述结合与它们各自的亲本抗PD-1和抗CTLA-4抗体的结合类似。具有针对PD-1的两个结合位点和针对CTLA-4的一个结合位点的PD-1 x CTLA-4双特异性分子(例如，TRIDENT A)展示与PD-1的结合，所述结合与亲本抗PD-1抗体的结合类似，并且展示与CTLA-4降低的结合(相对于亲本抗体的结合)，原因是包括针对CTLA-4的仅仅单个结合位点的三价分子降低的亲合力。对于具有IgG1 CH1和/或IgG1(AA/YTE)Fc区的DART F和TRIDENT B，观察到了类似的结合结果。
通过在存在已经被涂覆到支撑板上的可溶性人PD-1(图8C)，或可溶性人CTLA-4-Avi-His(图8D)的情况下，温育包括CTLA-4 mAb 1(例如，DART B)和CTLA-4 mAb 3(例如，DART C和DART D)的CTLA-4结合结构域的PD-1 x CTLA-4双特异性分子，研究改变取向和结合结构域对结合的影响。山羊抗人-Fcγ-HRP被用作二级检测分子，以使用PICO化学发光底物检测结合。结果表明，包括CTLA-4 mAb 1(例如，DART B)和CTLA-4 mAb 3(例如，DART C和DART D)的CTLA-4结合结构域的PD-1 x CTLA-4双特异性分子展示与CTLA-4类似的结合。未发现结合结构域的取向(即，在第一或第二链上的定位)显着改变与PD-1或CTLA-4的结合(比较DART C和DART D的结合)。
B.ELISA阻断研究
进行一系列ELISA试验，以评估本发明的双特异性分子阻断与PD-1和CTLA-1，单独地或组合，的配体结合的能力。在存在等量的不相干抗原的情况下和在存在等量的CTLA-4的情况下评估对PD-L1与PD-1的结合的阻断。将板涂布以1:1混合的His标记的可溶性人PD-1(shPD-1)和His标记的不相干抗原(irrAg)(各自2μg/ml)，或1:1混合的shPD-1和His标记的可溶性人CTLA-4(shCTLA-4)(各自2μg/ml)。以指示的浓度，将PD-1 mAb 6 G4P、DART D、TRIDENT A或对照TRIDENT(具有针对RSV的两个结合位点和针对CTLA-4的一个结合位点)与6μg/ml生物素标记的PD-L1预先混合5分钟，并且添加至板中。使用链霉抗生物素HRP(1:3,000)检测PD-L1结合。该评估的结果呈现在图9A-9B中。发现测试的所有PD-1结合分子能够抑制PD-L1结合至PD-1。
在存在等量的不相干抗原的情况下和在存在等量的或四倍的PD-1的情况下评估对B7-1与CTLA-4的结合的阻断。将板涂布以1:1混合的shCTLA-4和irrAg(各自2μg/ml)、1:1混合的shCTLA-4shPD-1(各自2μg/ml)、或1:4混合的shCTLA-4(0.8μg/ml)和shPD-1(3.2μg/ml)。将PD-1 mAb 6 G4P、DART D、TRIDENT A、CTLA-4 mAb 3 G4P或对照TRIDENT，以指示的浓度与0.2μg/ml生物素标记的B7-1预先混合5分钟，并且添加至板中。使用链霉抗生物素HRP(1:3,000)检测B7-1结合。该评估的结果呈现在图9C-9E中。发现测试的所有CTLA-4结合分子能够抑制B7-1结合至CTLA-4。发现通过其与固定的PD-1相互作用的PD-1结合臂的相互作用增强了对B7-1结合的TRIDENT A阻断(与不结合PD-1的对照TRIDENT相比)(图9D)。而且，在更好地模拟在刺激细胞上看到的相对表达水平的1:4 CTLA-4:PD-1条件下(见，图19A)，发现对B7-1结合的TRIDENT A阻断进一步被增强(即，与不结合PD-1的对照TRIDENT的曲线相比，TRIDENT A曲线进一步偏移)(图9E)。
这些ELISA研究的结果表明，测试的所有PD-1结合分子能够抑制PD-L1结合至PD-1(图9A-9B)。所有这类分子对于PD-1是二价的并且展示类似的抑制特征。测试的所有CTLA-4结合分子能够抑制B7-1结合至固定的CTLA-4(图9C-9E)，其中，在存在PD-1的情况下，包括两个PD-1结合位点和一个CTLA-4结合位点的分子展示更有效的抑制(图9D-9E)。因此，包括单CTLA-4结合位点的三价分子展示对于CTLA-4配体偏向PD-1的阻断，表明可通过调节价而调整CTLA-4相互作用。
C.研究
使用分析研究DART A、TRIDENT A和CTLA-4 mAb1与人CTLA-4和食蟹猴CTLA-4的结合亲和力。简言之，将His标记的可溶性CTLA-4(与包含组氨酸的肽融合的人或食蟹猴CTLA-4的细胞外部分)捕获在固定的抗5His(anti-PentaHis)上，然后使不同浓度(12.5-200nM)的CTLA-4结合分子经过固定的CTLA-4蛋白质。经分析测定结合的动力学(通过1:1Langmuir结合模型的亲和力(同时ka/kd)；或通过分开的ka/kd 1:1拟合的亲合力)。从这些研究计算的ka、kd和KD呈现在表11中。
*通过分开的ka/kd 1:1拟合的亲合力
通过1:1Langmuir结合模型的亲和力
DART D对于CTLA-4是二价的，并且展示的对于人和食蟹猴CTLA-4的结合亲和力是CTLA-4 mAb 1的约2至4倍以内。TRIDENT A对于CTLA-4是单价的，如鉴于其降低的亲合力所预期的，对于人和食蟹猴CTLA-4展示更低的亲和力。
使用分析来研究DART A、TRIDENT A、PD-1 mAb 6 G4P和CTLA-4 mAb3 G1AA与人PD-1的结合亲和力。将结合分子捕获在固定的F(ab)2山羊抗人Fc上，然后使不同浓度(6.25-100nM)的His标记的可溶性人PD-1经过固定的结合分子，并且经分析(Langmuir 1:1结合拟合)测定结合的动力学。来自这些研究的计算的ka、kd和KD呈现在表12中(n.d.，不可检测的)。
DART A、TRIDENT A、PD-1 mAb 6 G4P对于PD-1各自是二价的，并且展示相当的结合亲和力。如预期的，CTLA-4 mAb 3 G1AA对于人PD-1不展示任何可检测的结合。
D.基于CTLA-4细胞的试验
评估DART B、DART D、TRIDENT A、抗CTLA-4抗体CTLA-4 mAb 1、CTLA-4 mAb 3 G4P和hIgG对照抗体与表达食蟹猴CTLA-4(cynoCTLA-4)或人CTLA-4(huCTLA-4)的CHO细胞的结合。该评估的结果显示在图10A-10B中。在存在表达食蟹猴CTLA-4(图10A)或人CTLA-4(图10B)的CHO细胞的情况下温育结合分子。使用抗人Fc二级抗体检测与这类细胞的结合。结果显示，测试的所有分子能够结合在CHO细胞的表面上表达的人和食蟹猴CTLA-4。抗CTLA-4抗体展示与huCTLA-4类似的结合特征；二价、双特异性分子DART B和DART D展示比三价结合分子稍微下降的结合。对于CTLA-4是单价的TRIDENT A比对于CTLA-4具有更高价的分子展示更低的结合。对照抗体不结合。对于与cynoCTLA-4的结合，可看到类似的结果。
评估DART C、DART D、DART E、TRIDENT A、抗CTLA-4抗体CTLA-4mAb 1、CTLA-4 mAb3 G1AA和抗PD-1抗体PD-1 mAb 6 G4P与在它们的表面上表达huCTLA-4但是不表达PD-1的Jurkat细胞的结合。使用抗人FC二级Ab(FACS)检测DART和TRIDENT分子与人CTLA-4的结合。评估的结果显示在表13和图11A(DART C、DART D、DART E、CTLA-4mAb 1、CTLA-4mAb 3 G1AA和PD-1 mAb 6 G4P)和图11B(CTLA-4 mAb 1、CTLA-4 mAb 3 G1AA、 PD-1 mAb 6 G4P和TRIDENT A)中。如在图11A-11B中显示，PD-1抗体不结合CTLA-4，但是测试的所有CTLA-4结合分子能够结合在Jurkat细胞的表面上表达的huCTLA-4。抗CTLA-4抗体展示类似的结合特征；相比三价结合分子，二价双特异性分子DART C、DART D和DART E展示与Jurkat细胞稍微降低的结合。对于CTLA-4是单价的TRIDENT A比对于CTLA-4具有更高价键的分子展示更低的结合。
评估DART D、TRIDENT A和抗CTLA-4抗体CTLA-4mAb 1、CTLA-4 mAb 3 G1AA它们阻断CTLA-4配体B7-1和B7-2的能力。在存在CTLA-4 Jurkat细胞的情况下温育B7-1和B7-2的His标记的衍生物。使用抗His抗体检测His-B7-1和His-B7-2的结合。该评估的结果显示在图12A(His-B7-1)和图12B(His-B7-2)中。发现测试的所有分子能够抑制B7-1和B7-2结合在Jurkat细胞的表面上表达的CTLA-4。抗CTLA-4抗体展示类似的抑制特性；二价双特异性分子DART D是比三价结合分子效力稍低的抑制剂。对于CTLA-4单价的TRIDENT A比对于CTLA-4具有较高价的任何分子效力更低。对照抗体根本不抑制。上述ELISA研究提示，TRIDENT A，和具有两个PD-1结合位点和一个CTLA-4结合位点的类似分子在存在PD-1的情况下是更有效的抑制剂。
IL-2/Luc Jurkat细胞CTLA-4报告试验用于评估DART C、DART D、TRIDENT A、CTLA-4 mAb 3 G1AA和PD-1 mAb 6 G4P逆转CTLA-4免疫检查点抑制信号的能力，所述抑制信号如通过增加的荧光素酶表达所展示。所以，在存在这类分子(R:S＝1:0.3)的情况下，在37℃,温育IL-2/Luc-Jurkat-CTLA-4细胞30分钟，其后添加人工抗原呈递Raji细胞，并且继续温育6小时。人工抗原呈递细胞激活Jurkat报告细胞上的TCR/CD3复合物。评估的结果显示在图13中。测试的所有CTLA-4结合分子能够逆转CTLA-4免疫检查点抑制信号，如通过荧光素酶试验所测定的。对于CTLA-4是单价的TRIDENT A在该试验中比对于CTLA-4具有更高价的任何分子效力更低。对照抗体根本不抑制。上述的ELISA研究提示，TRIDENT A，和具有两个PD-1结合位点和一个CTLA-4结合位点的类似分子在存在PD-1的情况下更有效。
E.基于PD-1细胞的试验
评估DART D、TRIDENT A、PD-1 mAb 6 G4P和CTLA-4 mAb 3 G1AA它们结合表达PD-1但是不表达CTLA-4的NSO细胞的能力。使结合分子在存在细胞的情况下温育并且测量细胞的平均荧光指数。该评估的结果呈现在图14中。如预期的，CTLA-4抗体不结合，发现所有的双特异性结合分子能够结合在NSO细胞的表面上表达的PD-1。所有的双特异性分子对于PD-1是二价的并且展示与NSO细胞类似的结合。
评估DART D、TRIDENT A、PD-1 mAb 6 G4P，和CTLA-4 mAb 3 G1AA它们阻断细胞表面上表达的PD-1和其配体PD-L1和PD-L2之间结合的能力。使PD-L1-PE或PD-L2-PE在存在这类结合分子的情况下温育并且使用FACS评估他们结合NSO-PD-1细胞的能力。该评估的结果呈现在图15A(PD-L1)和图15B(PD-L2)中。如预期的，CTLA-4抗体不抑制，测试的所有PD-1结合分子能够抑制PD-L1(图15A)和PD-L2(图15B)与NSO细胞的表面上表达的PD-1的结合。所有的PD-1结合分子对于PD-1是二价的并且展示类似的抑制特性。
也在PD-1阻断报告试验中评估DART D、TRIDENT A、CTLA-4 mAb 3 G1AA和PD-1mAb 6 G4P。在存在PD-L1+CHO和Jurkat效应细胞的情况下温育这类结合分子，并且通过跟踪CD3介导的激活的程度评估结合分子阻断免疫抑制(通过阻断PD-1/PD-L1相互作用)的能力(如通过NFAT-luc/PD-1 Jurkat试验中增加的荧光素酶表达所显示；Promega)。该评估的结果呈现在图16中。测试的所有PD-1结合分子能够逆转PD-1免疫检查点抑制信号，如通过增加的荧光素酶表达所显示的。所有的PD-1结合分子对于PD-1是是二价的并且展示类似的抑制PD-1阻断T细胞信号传导的能力。在该系统中，CTLA-4抗体根本不抑制。
F.基于CTLA-4/PD-1细胞的试验
通过DiscoverX，检验DART D、TRIDENT A和阴性对照抗体它们在酶-片段互补试验中共连接PD-1和CTLA-4的能力。简言之，一式四份将U2OS CTLA-4(1-195)-PK PD-1(1-199)-EA细胞系#9的等分试样以5,000细胞/孔铺在384孔板上的DiscoverX CP5平板培养基中。使细胞在37℃/5％CO2附着4小时。接着，将每个结合分子的11点1:3稀释系列添加至PD-1-CTLA-4细胞中。在37℃/5％CO2将平板温育过夜(16小时)。将PathHunter检测试剂添加至孔中，其然后在室温在黑暗中被温育1小时，接着在Envision亮度计上读取平板。该评估的结果呈现在表14和图17(U2OS CTLA-4(1-195)-PK PD-1(1-199)-EA细胞系#9)中。双特异性DART D和TRIDENT A分子在共表达两种受体的细胞中都显示相当的PD-1和CTLA-4的共衔接，如通过酶-片段互补所显示的，表明本发明的双特异性分子能够同时结合PD-1和CTLA-4，并且进一步表明，当表达两种受体时，通过PD-1的锚定补偿了TRIDENT分子下降的CTLA-4亲合力。该发现与上述ELISA抑制研究一致。阴性对照未引起PD1-CTLA4细胞系中信号的显着增加。用更高浓度的TRIDENT A温育在U2OS PD1-CTLA4二聚化细胞系(S:B＝12.7)中引起强的信号增加。PD-1–CTLA-4细胞系中在剂量响应测试中用DART D应答的量级更小(S:B＝9.2)但是EC50值对于这两种分子类似(EC50＝20pM)。
评估了DART D、TRIDENT A、CTLA-4 mAb 3 G1AA、PD-1 mAb 6 G4P和CTLA-4 mAb 3G1AA/PD-1 mAb 6 G4P的组合(Ab Combo 1)增强混合淋巴细胞反应(MLR)的应答的能力。通过用GM-CSF(100ng/ml)和IL-4(10ng/ml)处理CD14+单核细胞(使用Miltenyi阳性选择试剂盒从PBMC分离)，然后培养细胞7天，产生单核细胞衍生的树突细胞。在第7天，收获细胞并且将其铺到96孔板中，然后培养24小时。在第8天，以200,000细胞/孔添加CD4+T-细胞(使用Myltenyi试剂盒通过阴性选择分离)和测试品并且培养3天。然后，使用用于IFN-γ的人DuoSet ELIS试剂盒(R&D Systems)，根据制造商的指导，测量培养上清液中的IFN-g水平。当组合使用抗体时，以指示浓度添加每种抗体，以便添加的抗体的总浓度加倍。IFN-γ的释放绘图在图18中。发现两种双特异性DART D和TRIDENT A分子都相同程度地增强MLR应答，或比单独的亲本抗体的组合稍好。
在金黄色葡萄球菌肠毒素B型(SEB)再刺激试验中，也评估了DART D、TRIDENT A、CTLA-4mAb 3 G1AA、PD-1 mAb 6 G4P和CTLA-4 mAb 1/PD-1 mAb 1的组合(Ab Combo 1)通过检查点抑制增强细胞因子释放的能力。一般而言，从健康的供体的全血纯化PBMC(例如，根据制造商的指导，使用Ficoll-Paque Plus密度梯度离心方法(GE Healthcare))。在T-25大烧瓶中的RPMI-培养基+10％热失活的FBS+1％青霉素/链霉素中，单独地或与0.5ng/mL(初次刺激)的SEB(例如，Sigma-Aldrich)一起，培养纯化的PBMC，达2-3天。在第一轮SEB-刺激结束时，用PBS洗涤PBMC两次并且立即在96孔组织培养板中以1-5x 105细胞/孔的浓度铺平板，仅在培养基中、在具有对照或测试品的培养基中、在具有0.5ng/mL的SEB(二次刺激)并且没有抗体的培养基中，或在具有SEB和对照IgG或测试品的培养基中，并且培养另外的2-3天。在二次刺激结束时，收获上清液，以测量细胞因子分泌(例如，根据制造商的指导，使用针对IFNγ、IL-2、TNFα、IL-10和IL-4的人DuoSet ELIS试剂盒(R&D Systems))。
图19A-19B显示了在不存在(图19A)或存在(图19B)SEB刺激的情况下，通过这类PBMC的PD-1vs.CTLA-1的表达的荧光-激活细胞分选(FACS)点图。图19C显示了SEB刺激对IFN-γ分泌的作用。用0.5ng/ml的金黄色葡萄球菌肠毒素B型(SEB)刺激PBMC 48小时。接着，收获细胞、洗涤并且与各种浓度的抗体和新鲜SEB重新铺在96孔平板中，达另外的48小时。然后，收获上清液，并且通过流式细胞术ELISA分析IFN-γ产生。两种双特异性DART和TRIDENT蛋白显示IFN-γ应答的增加，这概括了用单独亲本mAb的组合观察到的应答。在SEB刺激试验中看到了类似的结果，其中PBMC用高浓度(500ng/mL)的SEB培养72小时。为了进一步研究PD1 x CTLA-4双特异性分子对T-细胞应答的影响，用0.5ng/ml SEB的刺激PBMC 48小时、收获、洗涤、并且与新鲜SEB和DART D、TRIDENT A、CTLA-4 mAb 3 G1AA、PD-1 mAb 6G4P或CTLA-4 mAb 3 G1AA/PD-1 mAb 6 G4P的组合(Ab Combo 1)任意之一一起在96孔板中重新铺板，达另外的48小时，然后测量释放的IL-2(图19D)。图19A-19D显示了PD1 x CTLA-4双特异性分子的施用明显增强了T-细胞应答。当组合使用抗体时，以指示的浓度添加每种抗体，从而抗体的总浓度加倍。
实施例6
体内研究
A.PD-1 x CTLA-4双特异性分子在GVHD鼠科模型中的活性
在移植物抗宿主疾病(GVHD)的PBMC移植的NOG鼠科模型中评估代表性PD1 xCTLA-4双特异性二价分子DART D的活性。研究方案呈现在表15中。
经FACS在研究的第14天进行CD3+T细胞计数并且绘图在图20A中。在研究过程期间监测存活，并且作为存活百分数绘图在图20B中。在用500μg/kgDART D处理的动物中看到了增加的T细胞扩展和加速的GVHD，与T细胞免疫应答的增强一致。
B.PD-1 x CTLA-4双特异性分子的毒理学和药代动力学研究
在食蟹猴中，在非GLP(实验室管理规范(good laboratory practice))给药研究中，评估代表性PD1 x CTLA-4双特异性二价分子DART D，和代表性PD1 x CTLA-4双特异性三价分子TRIDENT A的安全性特征。另外，检验了若干标志物药效学活性。
在该研究中，评估当通过多次静脉内输注施用时，PD-1 x CTLA-4双特异性分子的潜在毒性。研究方案呈现在表16中。
因此，在50mg/kg剂量和递增至75mg/kg之间，提供了2-周间隔。在该研究中评估下述参数和端点(endpoint)：临床症状、体重、食品消耗、体温、临床病理学参数(对于组1-3，给药前、给药后23小时的凝聚、临床化学和血液学；对于组4，直至(out to)第22天的凝聚、临床化学和血液学)、生物分析和毒代动力学参数、流式细胞术(给药前和给药后23小时)、细胞因子(给药后2、6、22小时)。对于组4，仅仅在第8、15和22天评估抗药物-抗体。仅仅对于组1-3，在第三次给药后48小时进行尸检。也如下描述检查PD-1 x CTLA-4双特异性分子的体内结合和活性。
所有的动物均存活，直到按计划安乐死。在接收高达75mg/kg/周3次剂量的动物中没有不利的临床观察。尤其，没有观察到腹泻。组织病理学也不显着。在治疗组中，观察到了球蛋白水平的增加，并且在组2-3中观察到脾和胸腺的器官重量增加(见表17，组4未被尸检)，如在刺激免疫系统时所预期的。每个治疗组的血清浓度-时间曲线显示在图21A-21C中，并且与食蟹猴中包括人Fc区的分子一致。
已经报道了用抗CTLA-4抗体伊匹单抗处理后绝对淋巴细胞计数(ALC)的增加好像与临床益处以及总体存活相关(见，例如，Ku,G.Y.,等(2010)“Single-InstitutionExperience With Ipilimumab In Advanced Melanoma Patients In The CompassionateUse Setting:Lymphocyte Count After 2 Doses Correlates With Survival”Cancer116(7):1767-1775)，指示ALC可能是有用的药效学(PD)端点。在处理前和处理后第2、8、9、15和16天检验每个上述组中的ALC计数。通过在CD4+/PD-1+和CD8+/PD-1+T细胞群中，在针对每个猴子血液样品的两个条件下，测量抗人IgG4 Alexa 488+事件的平均荧光强度(MFI)，测定PD-1+T细胞上DART D或TRIDENT A结合位点的占据。在一个条件下，在存在过多DART D或TRIDENT A的情况下获得的MFI值用于确定每个细胞群体中PD-1+细胞上最大DARTD或TRIDENT A结合强度。在第二条件下，在存在过多阴性对照的情况下获得的MFI值用于确定在样品收集时在DART D或TRIDENT A-处理动物中展示的每个细胞群体中PD-1+细胞的结合强度。两个条件之间的差异用于如下计算DART D或TRIDENT A处理的动物中PD-1+T细胞亚集上DART D或TRIDENT A结合位点的占据％：
将绝对计数和归一化至第1天的变化百分数绘制在图22A(数千细胞/μl(th/μl))和图22B(归一化至第1天的ALC的变化百分数(D1))中。每个DART D处理组在处理之后随即展示ALC计数的初始下降，随后ALC增加至高出基线很多的水平。对于仅仅接受一个较低的剂量的TRIDENT A处理组，观察到类似的趋势。
另外，对上述组1-3，检验CD4+ T细胞增殖和T细胞上的PD-1占据。简言之，通过FACS分析CD3+/PD-1+ T细胞，以评估被DART D结合的细胞百分数。将35μg/mL的40微升的阴性对照分子(呼吸道合胞病毒(RSV)x荧光素IgG4、κFc DART)或测试品(DART D或TRIDENTA)添加至96深孔板。然后，将100微升充分混合的抗凝聚全血添加至每个孔中，使用移液管充分混合，并且在环境温度，在黑暗中温育45至75分钟。然后，将1000微升的1 x BD FACS裂解液添加至每个孔中，并且使用移液管混合；然后，在环境温度，在黑暗中温育板，达另外的10至20分钟。然后，使板在400x g离心5分钟并且丢弃上清液。在每个孔中添加1000微升的FACS缓冲液并且如洗涤步骤进行混合。然后，使板在400x g离心5分钟并且丢弃上清液。将细胞小球用20微升的Panel 1抗体混合物再悬浮并且在环境温度温育30至60分钟。如在之前的洗涤步骤中洗涤板。在温育结束时，再次洗涤板并且最终将细胞小球再悬浮在300微升的FACS缓冲液中并且用BD FACSCanto II细胞分析仪分析样品。分析的结果显示在图23A-23B中。
如图23A(针对以50mg/kg施用的DART D)和图23B(针对以75mg/kg施用的DART D)显示，PD-1占据(即，被DART D结合)在整个针对组2和3的处理期间最大。通过FACS评估增殖CD4+ T细胞的Ki-67(针对增殖的细胞标志物)的共表达。
将20微升的抗体混合物A(包含结合细胞表面标志物：CD45、CD3、CD4和CD8的抗体)添加至96深孔板中。然后，将50微升充分混合的抗凝聚全血添加至每个孔中，使用移液管充分混合，并且在环境温度，在黑暗中温育15至45分钟。然后，将500微升的1 x BD FACS裂解液添加至每个孔中并且使用移液管混合；然后，在环境温度，在黑暗中温育平板，达另外的10至20分钟。使板在1200rpm离心5分钟并且丢弃上清液。接着，将500微升的FACS缓冲液添加到每个孔中并且如洗涤步骤进行混合。然后，使板在1200rpm离心5分钟并且丢弃上清液。将细胞小球再悬浮在抗体混合物B(包含结合细胞内标志物，Ki 67的抗体)或再悬浮在iso抗体制剂(包含细胞内标志物的同种型对照)中，并且在黑暗中温育15至45分钟。洗涤之后，将细胞小球再悬浮在300微升的FACS缓冲液中并且用BD FACSCanto II细胞分析仪分析样品。从T细胞细胞内染色图，将CD4+和CD8+细胞的百分数确定为总CD45+白细胞设门细胞的分数。计数设门CD4+细胞中的Ki 67+的细胞事件并且CD4+/Ki 67+ T细胞(增殖性CD4 T细胞)的百分数被确定为总CD4+细胞的分数。以类似的方式，CD8+/Ki 67+ T细胞(增殖性CD8T细胞)的百分数被确定为总CD8+细胞的分数。分析的结果显示在图24A-24B中。
如图24A-24B中显示，在整个处理期间，在处理组2和3中，CD4+T细胞的增殖明显增强。该研究的结果指示，以高达75mg/kg的浓度施用PD1 x CTLA-4双特异性分子在食蟹猴中耐受良好。高出5mg/kg剂量许多，在5mg/kg剂量的情况下，对于用伊匹单抗治疗的食蟹猴已经报道了不利事件。分子展示了有利的药物代谢动力学特征并且观察到了许多标志物药效学活性，包括增加的淋巴细胞计数、增加的球蛋白水平、增加的脾和胸腺器官重量、增加的T细胞增殖(T细胞计数和Ki-67表达二者)和T细胞上最大的PD-1占据。
本说明书提到的所有出版物和专利通过参考并入本文，达到如同具体和单独指出每个单个出版物或专利申请通过参考以其整体并入的相同程度。尽管已经结合其具体实施方式描述了本发明，但是应当理解，其能够被进一步修改，并且本申请旨在覆盖大体上根据本发明原理并且包括与本公开的偏离的本发明的任何变型、用途或改变，只要在本发明所属领域的已知或习惯实践内并且如可应用至本文之前所阐释的本质特征。
序列表
<110> 宏观基因有限公司
莱斯利·S·约翰逊
G·齐齐李
K·沙哈
R·拉莫特-莫斯
P·A·摩尔
E·本维尼
Scott·科宁
<120> 对于PD-1和CTLA-4具有免疫反应性的双特异性分子及其使用方法
<130> 1301.0134PCT
<150> US62/266,944
<151> 2015-12-14
<160> 110
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(217)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
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<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
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<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
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<223> 示例性人IgG4的CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
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Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
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<213> 人工序列
<220>
<223> 间插间隔体肽(连接体1)
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1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含半胱氨酸的间隔体肽(连接体2)
<400> 6
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 可选的间隔体肽连接体2
<400> 7
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1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选的间隔体肽连接体2
<400> 8
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选的间隔体肽连接体2
<400> 9
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选的间隔体肽连接体2
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly
1 5
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选的间隔体肽连接体2
<400> 11
Leu Glu Pro Lys Ser Ser
1 5
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选的间隔体肽连接体2
<400> 12
Ala Pro Ser Ser Ser
1 5
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 异源二聚体促进结构域
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<211> 6
<212> PRT
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<221> MISC_FEATURE
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<223> 人IgG异源二聚体促进结构域的铰链区
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<211> 6
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<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> 人IgG异源二聚体促进结构域的铰链区
<400> 15
Ala Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> 人κ轻链异源二聚体促进结构域
<400> 16
Gly Phe Asn Gly Glu Cys
1 5
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> 人κ轻链异源二聚体促进结构域
<400> 17
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
1 5
<210> 18
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E-螺旋异源二聚体促进结构域
<400> 18
Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
20 25
<210> 19
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K-螺旋异源二聚体促进结构域
<400> 19
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
20 25
<210> 20
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含半胱氨酸的E-螺旋异源二聚体促进结构域
<400> 20
Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
20 25
<210> 21
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含半胱氨酸的K-螺旋异源二聚体促进结构域
<400> 21
Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
20 25
<210> 22
<211> 46
<212> PRT
<213> 停乳链球菌
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(46)
<223> 链球菌属菌株G148的蛋白G的白蛋白结合结构域3 (ABD3)
<400> 22
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys Ser Ala Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 23
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链球菌属菌株G148的蛋白G的白蛋白结合结构域3 (ABD3)的去免疫化的变体
<400> 23
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys Ser Ala Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 24
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链球菌属菌株G148的蛋白G的白蛋白结合结构域3 (ABD3)的去免疫化的变体
<400> 24
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Ala Ala Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Ala Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 25
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链球菌属菌株G148的蛋白G的白蛋白结合结构域3 (ABD3)的去免疫化的变体
<400> 25
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Ser Asn Ala Lys Ser Val Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Ala Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间插间隔体连接体
<400> 26
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间插间隔体连接体
<400> 27
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间插间隔体连接体
<400> 28
Ala Pro Ser Ser Ser
1 5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间插间隔体连接体
<400> 29
Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu
1 5
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间插间隔体连接体
<400> 30
Leu Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
<210> 31
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间插间隔体连接体
<400> 31
Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间插间隔体连接体
<400> 32
Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> 示例性IgG1铰链区
<400> 33
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> 示例性IgG2铰链区
<400> 34
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> 示例性IgG4铰链区
<400> 35
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含稳定化S228P取代的IgG4铰链变体
<400> 36
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间插间隔体肽
<400> 37
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> 示例性人IgG CL κ结构域
<400> 38
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 39
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(104)
<223> 示例性人IgG CL λ结构域
<400> 39
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
50 55 60
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
65 70 75 80
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
85 90 95
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100
<210> 40
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> 人IgG1 CH1结构域
<400> 40
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 41
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> 人IgG2 CH1结构域
<400> 41
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val
<210> 42
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> 人IgG4 CH1结构域
<400> 42
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 43
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1的包含取代L234A和L235A的CH2-CH3结构域(Kabat)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 43
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 44
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> “包含杵的”IgG1 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 44
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 45
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> “包含臼的”IgG1 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 45
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 46
<211> 288
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(288)
<223> 人PD-1, 包括信号序列(NCBI序列
NP_005009.2)
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(20)
<223> 信号序列
<400> 46
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 47
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(113)
<223> 抗人PD-1抗体PD-1 mAb 1 (尼鲁单抗)的VL结构域
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> 抗人PD-1抗体PD-1 mAb 1 (尼鲁单抗)的VL结构域
<400> 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗人PD-1抗体PD-1 mAb 2 (派姆单抗)的VL结构域
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗人PD-1抗体PD-1 mAb 2 (派姆单抗)的VL结构域
<400> 50
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 51
<211> 121
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(121)
<223> 鼠科抗人PD-1抗体PD-1 mAb 3 (EH12.2H7)的VH结构域
<400> 51
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Gln Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Ser Thr Gly Phe Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Arg Asp Ser Ser Gly Tyr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(111)
<223> 鼠科抗人PD-1抗体PD-1 mAb 3 (EH12.2H7)的VL结构域
<400> 52
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Phe Gly Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 53
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人抗体PD-1 mAb 4 (匹地利珠单抗(Pidilizumab))的VH结构域
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asp Ser Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Gly Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Val Gly Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 54
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人抗体PD-1 mAb 4 (匹地利珠单抗)的VL结构域
<400> 54
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Cys Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 55
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人PD-1抗体(PD-1 mAb 5)的VH结构域
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Met Ser Ile Ser Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 56
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人PD-1抗体(PD-1 mAb 5)的VL结构域
<400> 56
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 57
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 取代抗人PD-1抗体(PD-1 mAb 6)的VH结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (48)..(48)
<223> Xaa是异亮氨酸(I)或丙氨酸(A)
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Xaa
35 40 45
Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 58
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人PD-1抗体(PD-1 mAb 6)的VL结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> Xaa是天冬酰胺酸 (N)或丝氨酸(S)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> Xaa是谷氨酰胺 (Q)或精氨酸(R)
<400> 58
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Xaa Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Xaa Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 59
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人PD-1抗体(PD-1 mAb 7)的VH结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是缬氨酸(V)或丙氨酸(A)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> Xaa是丝氨酸(S)或甘氨酸(G)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (48)..(48)
<223> Xaa是缬氨酸(V)或苏氨酸(T)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> Xaa是亮氨酸(L)或丙氨酸(A)
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Xaa Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Val Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Xaa Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Phe Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人PD-1抗体(PD-1 mAb 7)的VL结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Xaa是丝氨酸(S)或天冬酰胺酸 (N)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> Xaa是天冬酰胺酸 (N)或天冬氨酸盐(D)
<400> 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Xaa Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Xaa Ala Lys Thr Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Ala Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 61
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人PD-1抗体(PD-1 mAb 8)的VH结构域
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Thr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人PD-1抗体(PD-1 mAb 8)的VL结构域
<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Lys Thr Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Ala Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 63
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-1 x LAG-3 DART A的第一和第三多肽链
<400> 63
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Val
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
115 120 125
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
130 135 140
Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asp
165 170 175
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser
180 185 190
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly
225 230 235 240
Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
245 250 255
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Ser Lys Tyr
260 265 270
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
275 280 285
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr
290 295 300
Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
305 310 315 320
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
325 330 335
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
340 345 350
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
355 360 365
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
370 375 380
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
385 390 395 400
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
405 410 415
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
420 425 430
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
435 440 445
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
450 455 460
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
465 470 475 480
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
485 490 495
<210> 64
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-1 x LAG-3 DART A的第二和第四多肽链
<400> 64
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
115 120 125
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
130 135 140
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Val
165 170 175
Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp
180 185 190
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ala Asp Tyr Phe Tyr Phe
210 215 220
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys
225 230 235 240
Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys
245 250 255
Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 65
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(118)
<223> mAb 4-4-20的VH结构域
<400> 65
Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Met Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Gly Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 66
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(112)
<223> mAb 4-4-20的VL结构域
<400> 66
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Phe Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 67
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用双特异性衔接子分子UBA-1的第一多肽链
<400> 67
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Phe Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
115 120 125
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
130 135 140
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser
165 170 175
Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
195 200 205
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser
210 215 220
Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
225 230 235 240
Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
260 265 270
Lys
<210> 68
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用双特异性衔接子分子 UBA-1的第二多肽链
<400> 68
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly
115 120 125
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala
130 135 140
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser
145 150 155 160
Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr
165 170 175
Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu
195 200 205
Arg Val Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly Ser Tyr Tyr Gly
210 215 220
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
225 230 235 240
Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu
245 250 255
Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 69
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用双特异性衔接子分子 UBA-2的第一和第三多肽链
<400> 69
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Phe Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
115 120 125
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
130 135 140
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser
165 170 175
Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
195 200 205
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser
210 215 220
Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
225 230 235 240
Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
260 265 270
Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
275 280 285
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
290 295 300
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
305 310 315 320
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
325 330 335
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
340 345 350
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
355 360 365
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
370 375 380
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
385 390 395 400
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
405 410 415
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
420 425 430
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
435 440 445
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
450 455 460
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
465 470 475 480
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
485 490 495
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210> 70
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用双特异性衔接子分子UBA-3的第一多肽链
<400> 70
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Phe Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
115 120 125
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
130 135 140
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser
165 170 175
Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
195 200 205
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser
210 215 220
Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
225 230 235 240
Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
260 265 270
Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
275 280 285
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
290 295 300
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
305 310 315 320
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
325 330 335
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
340 345 350
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
355 360 365
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
370 375 380
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
385 390 395 400
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
405 410 415
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
420 425 430
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
435 440 445
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
450 455 460
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
465 470 475 480
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
485 490 495
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210> 71
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用双特异性衔接子分子UBA-3的第三多肽链
<400> 71
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 72
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用双特异性衔接子分子UBA-4的第三多肽链
<400> 72
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 73
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用双特异性衔接子分子UBA-4的第四多肽链
<400> 73
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 74
<211> 575
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用双特异性衔接子分子UBA-5的第三多肽链
<400> 74
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val
130 135 140
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met
145 150 155 160
Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val
165 170 175
Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe Lys Asp
180 185 190
Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
245 250 255
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
260 265 270
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
275 280 285
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
290 295 300
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
305 310 315 320
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
325 330 335
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
340 345 350
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
355 360 365
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
370 375 380
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
385 390 395 400
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
405 410 415
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
420 425 430
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
435 440 445
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
450 455 460
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
465 470 475 480
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
485 490 495
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
500 505 510
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
515 520 525
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
530 535 540
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
545 550 555 560
His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565 570 575
<210> 75
<211> 223
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(223)
<223> 人CTLA-4, 包括信号序列 (NCBI序列NP_005205.2)
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(34)
<223> 信号序列
<400> 75
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 76
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(118)
<223> 抗人CTLA-4抗体CTLA-4 mAb 1 (伊匹单抗)的VH结构域
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 77
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(108)
<223> 抗人CTLA-4抗体CTLA-4 mAb 1 (伊匹单抗)的VL结构域
<400> 77
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 78
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(125)
<223> 抗人CTLA-4抗体CTLA-4 mAb 2(曲美利木单抗(Tremelimumab))的VH结构域
<400> 78
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 79
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> 抗人CTLA-4抗体CTLA-4 mAb 2 (曲美利木单抗)的VL结构域
<400> 79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 80
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含取代M252Y、S254T和T256E的IgG1 Fc区的CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 80
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 81
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含取代M252Y、S254T和T256E的IgG4 Fc区的CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 81
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
210 215
<210> 82
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含取代M252Y、S254T和T256E的IgG1 Fc区的CH2-CH3结构域的“包含杵的”变体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 82
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 83
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含取代M252Y、S254T和T256E的IgG1 Fc区CH2-CH3结构域的“包含臼的”变体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 83
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 84
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含取代M252Y、S254T和T256E的IgG4 Fc区的CH2-CH3结构域的“包含杵的”变体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 84
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
210 215
<210> 85
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含取代M252Y、S254T和T256E的IgG4 Fc区的CH2-CH3结构域的“包含臼的”变体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 85
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
210 215
<210> 86
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人PD-1抗体(PD-1 mAb 6 I VH)的VH结构域
<400> 86
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 87
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人PD-1抗体(PD-1 mAb 6 SQ VL)的VL结构域
<400> 87
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 88
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人PD-1抗体PD-1 mAb 6 G4P的重链
<400> 88
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 89
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人PD-1抗体PD-1 mAb 6 G4P的轻链
<400> 89
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 90
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(118)
<223> 抗人CTLA-4抗体CTLA-4 mAb 3的VH结构域
<400> 90
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 91
<211> 108
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(108)
<223> 抗人CTLA-4抗体CTLA-4 mAb 3的VL结构域
<400> 91
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 92
<211> 448
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(448)
<223> 抗人CTLA-4抗体mAb 3 G1AA的重链
<400> 92
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 93
<211> 444
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(444)
<223> 抗人CTLA-4抗体mAb 3 G4P的重链
<400> 93
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 94
<211> 215
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(215)
<223> 抗人CTLA-4抗体mAb 3 G1AA和mAb 3 G4P的轻链
<400> 94
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 95
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART B的第一和第三多肽链
<400> 95
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
115 120 125
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser
130 135 140
Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
145 150 155 160
Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu
165 170 175
Asp Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr
180 185 190
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
195 200 205
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr
210 215 220
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly
225 230 235 240
Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu
245 250 255
Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Ser Lys
260 265 270
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
275 280 285
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile
290 295 300
Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
305 310 315 320
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
325 330 335
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
340 345 350
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
355 360 365
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
370 375 380
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
385 390 395 400
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
405 410 415
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
420 425 430
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
435 440 445
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
450 455 460
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
465 470 475 480
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
485 490 495
Gly
<210> 96
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART B的第二和第四多肽链
<400> 96
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
130 135 140
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn
165 170 175
Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
180 185 190
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe
210 215 220
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys
225 230 235 240
Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys
245 250 255
Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 97
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART C的第一和第三多肽链
<400> 97
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
115 120 125
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser
130 135 140
Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
145 150 155 160
Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu
165 170 175
Asp Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr
180 185 190
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
195 200 205
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr
210 215 220
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly
225 230 235 240
Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu
245 250 255
Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Ser Lys
260 265 270
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
275 280 285
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile
290 295 300
Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
305 310 315 320
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
325 330 335
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
340 345 350
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
355 360 365
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
370 375 380
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
385 390 395 400
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
405 410 415
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
420 425 430
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
435 440 445
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
450 455 460
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
465 470 475 480
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
485 490 495
Gly
<210> 98
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART C的第二和第四多肽链
<400> 98
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
130 135 140
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn
165 170 175
Lys His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp
180 185 190
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe
210 215 220
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys
225 230 235 240
Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys
245 250 255
Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 99
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART D的第一和第三多肽链
<400> 99
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
130 135 140
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn
165 170 175
Lys His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp
180 185 190
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe
210 215 220
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys
225 230 235 240
Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
245 250 255
Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu
260 265 270
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
275 280 285
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
290 295 300
Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
305 310 315 320
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
325 330 335
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
340 345 350
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
355 360 365
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
370 375 380
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
420 425 430
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
435 440 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
450 455 460
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
465 470 475 480
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
485 490 495
Ser Leu Gly
<210> 100
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART D的第二和第四多肽链
<400> 100
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
115 120 125
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser
130 135 140
Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
145 150 155 160
Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu
165 170 175
Asp Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr
180 185 190
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
195 200 205
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr
210 215 220
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly
225 230 235 240
Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys
245 250 255
Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265
<210> 101
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART F的第一和第三多肽链
<400> 101
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
130 135 140
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn
165 170 175
Lys His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp
180 185 190
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe
210 215 220
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys
225 230 235 240
Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
245 250 255
Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Leu
260 265 270
Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
275 280 285
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
290 295 300
Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val
305 310 315 320
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
325 330 335
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
340 345 350
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
355 360 365
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
370 375 380
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
385 390 395 400
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
405 410 415
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
420 425 430
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
435 440 445
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
450 455 460
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
465 470 475 480
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
485 490 495
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
500
<210> 102
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART E的第一和第三多肽链
<400> 102
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
115 120 125
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser
130 135 140
Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
145 150 155 160
Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Trp Leu
165 170 175
Asp Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr
180 185 190
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
195 200 205
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Ala Tyr
210 215 220
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
245 250 255
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
260 265 270
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
275 280 285
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
290 295 300
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
305 310 315 320
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
325 330 335
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
340 345 350
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
355 360 365
Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val
370 375 380
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
385 390 395 400
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
405 410 415
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
420 425 430
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
435 440 445
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
450 455 460
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
465 470 475 480
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
485 490 495
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
500 505 510
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
515 520 525
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
530 535 540
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
545 550 555 560
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
565
<210> 103
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART E的第二和第四多肽链
<400> 103
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
130 135 140
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn
165 170 175
Lys His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp
180 185 190
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe
210 215 220
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
245 250 255
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
260 265 270
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
275 280 285
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
290 295 300
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
305 310 315 320
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
325 330 335
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340 345 350
<210> 104
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIDENT A的第一多肽链
<400> 104
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
115 120 125
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
130 135 140
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu
165 170 175
Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro
210 215 220
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
225 230 235 240
Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu
245 250 255
Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
260 265 270
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
275 280 285
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
290 295 300
Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
305 310 315 320
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
325 330 335
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
340 345 350
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
355 360 365
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
370 375 380
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
385 390 395 400
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
405 410 415
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
420 425 430
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
435 440 445
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
450 455 460
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
465 470 475 480
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
485 490 495
Leu Ser Leu Gly
500
<210> 105
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIDENT A的第二多肽链
<400> 105
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
115 120 125
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
130 135 140
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu
165 170 175
Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro
210 215 220
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
225 230 235 240
Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu
245 250 255
Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 106
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIDENT A的第三多肽链
<400> 106
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 107
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIDENT A的第四多肽链
<400> 107
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 108
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIDENT B的第一多肽链
<400> 108
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
115 120 125
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
130 135 140
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu
165 170 175
Thr Trp Leu Asp Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro
210 215 220
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
225 230 235 240
Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu
245 250 255
Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
260 265 270
Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
275 280 285
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
290 295 300
Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
305 310 315 320
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
325 330 335
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
340 345 350
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
355 360 365
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
370 375 380
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
385 390 395 400
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
405 410 415
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
420 425 430
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
435 440 445
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
450 455 460
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
465 470 475 480
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
485 490 495
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210> 109
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIDENT B的第三多肽链
<400> 109
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg
245 250 255
Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 110
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TRIDENT C的第三多肽链
<400> 110
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
115 120 125
Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser
130 135 140
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met His Trp Val
145 150 155 160
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr Phe Ile Ser Tyr
165 170 175
Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Gly Trp
210 215 220
Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
340 345 350
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Gly
465

Claims (24)

1.一种双特异性分子，其具有能够免疫特异性结合至PD-1的表位(一个或多个)的一个或多个表位-结合位点和能够免疫特异性结合至CTLA-4的表位(一个或多个)的一个或多个表位-结合位点，其中所述分子包括：
(A)结合PD-1的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域；和
(B)结合CTLA-4的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域；
其中所述分子是：
(i)双抗体，所述双抗体是共价结合的包括两条、三条、四条或五条多肽链的复合物；或
(ii)三价结合分子，所述三价结合分子是共价结合的包括三条、四条、五条或更多条多肽链的复合物。
2.权利要求1所述的双特异性分子，其中相对于两个单特异性分子展示的这类活性，所述分子展示增强的活性，所述两个单特异性分子中的一个具有结合PD-1的所述抗体的所述重链可变结构域和所述轻链可变结构域和其中另一个具有结合CTLA-4的所述抗体的所述重链可变结构域和所述轻链可变结构域。
3.权利要求1或2所述的双特异性分子，其中相对于通过施用结合CTLA-4的单特异性抗体引起的这类irAE，所述分子当施用至需要其的受试者时引起更少的免疫相关的不利事件(irAE)。
4.权利要求1-3中任一项所述的双特异性分子，其中所述分子包括Fc区。
5.权利要求4所述的双特异性分子，其中所述Fc区是变异的Fc区，其包括：
(A)降低所述变异的Fc区对FcγR的亲和力的一个或多个氨基酸修饰；和/或
(B)延长所述变异的Fc区的血清半衰期的一个或多个氨基酸修饰。
6.权利要求5所述的双特异性分子，其中降低变异的Fc区对FcγR的亲和力的所述修饰包括下述的取代：L234A；L235A；或L234A和L235A，其中所述编号是如Kabat中的EU索引中的编号。
7.权利要求5或6所述的双特异性分子，其中延长变异的Fc区的血清半衰期的所述修饰包括下述的取代：M252Y；M252Y和S254T；M252Y和T256E；M252Y、S254T和T256E；或K288D和H435K，其中所述编号是如Kabat中的EU索引中的编号。
8.权利要求1-7中任一项所述的双特异性分子，其中所述分子是所述双抗体并且包括能够免疫特异性结合至PD-1的表位的两个表位-结合位点和能够免疫特异性结合至CTLA-4的表位的两个表位-结合位点。
9.权利要求1-7中任一项所述的双特异性分子，其中所述分子是所述三价结合分子并且包括能够免疫特异性结合至PD-1的表位的两个表位-结合位点和能够免疫特异性结合至CTLA-4的表位的一个表位-结合位点。
10.权利要求1-9中任一项所述的双特异性分子，其中所述分子能够结合至存在于细胞表面上的PD-1和CTLA-4分子。
11.权利要求1-10中任一项所述的双特异性分子，其中所述分子能够同时结合PD-1和CTLA-4。
12.权利要求1-11中任一项所述的双特异性分子，其中所述分子促进免疫细胞的刺激。
13.权利要求12所述的双特异性分子，其中所述免疫细胞的刺激导致：
(A)免疫细胞增殖；和/或
(B)免疫细胞产生和/或释放至少一种细胞因子；和/或
(C)免疫细胞产生和/或释放至少一种裂解分子；和/或
(D)至少一种激活标志物的免疫细胞表达。
14.权利要求12或13所述的双特异性分子，其中所述免疫细胞是T-淋巴细胞或NK-细胞。
15.权利要求1-14中任一项所述的双特异性分子，其中能够免疫特异性结合至PD-1的表位的所述表位-结合位点包括：
(A)PD-1 mAb 1的VH结构域(SEQ ID NO:47)和PD-1 mAb 1的VL结构域(SEQ ID NO:48)；或
(B)PD-1 mAb 2的VH结构域(SEQ ID NO:49)和PD-1 mAb 2的VL结构域(SEQ ID NO:50)；或
(C)PD-1 mAb 3的VH结构域(SEQ ID NO:51)和PD-1 mAb 3的VL结构域(SEQ ID NO:52)；或
(D)PD-1 mAb 4的VH结构域(SEQ ID NO:53)和PD-1 mAb 4的VL结构域(SEQ ID NO:54)；或
(E)PD-1 mAb 5的VH结构域(SEQ ID NO:55)和PD-1 mAb 5的VL结构域(SEQ ID NO:56)；或
(F)PD-1 mAb 6的VH结构域(SEQ ID NO:57)和PD-1 mAb 6的VL结构域(SEQ ID NO:58)；或
(G)PD-1 mAb 6-I VH的VH结构域(SEQ ID NO:86)和PD-1 mAb 6-SQ VL的VL结构域(SEQ ID NO:87)；或
(H)PD-1 mAb 7的VH结构域(SEQ ID NO:59)和PD-1 mAb 7的VL结构域(SEQ ID NO:60)；或
(I)PD-1 mAb 8的VH结构域(SEQ ID NO:61)和PD-1 mAb 8的VL结构域(SEQ ID NO:62)。
16.权利要求1-15中任一项所述的双特异性分子，其中能够免疫特异性结合至CTLA-4的表位的所述表位-结合位点包括：
(A)CTLA-4 mAb 1的VH结构域(SEQ ID NO:76)和CTLA-4 mAb 1的VL结构域(SEQ IDNO:77)；或
(B)CTLA-4 mAb 2的VH结构域(SEQ ID NO:78)和CTLA-4 mAb 2的VL结构域(SEQ IDNO:79)；或
(C)CTLA-4 mAb 3的VH结构域(SEQ ID NO:90)和CTLA-4 mAb 3的VL结构域(SEQ IDNO:91)。
17.权利要求16所述的双特异性分子，其中：
(A)能够免疫特异性结合至PD-1的表位的所述表位-结合位点包括PD-1 mAb 6-IVH的VH结构域(SEQ ID NO:86)和PD-1 mAb 6-SQ的VL结构域(SEQ ID NO:87)；和
(B)能够免疫特异性结合至CTLA-4的表位的所述表位-结合位点包括CTLA-4 mAb 3的VH结构域(SEQ ID NO:90)和CTLA-4 mAb 3的VL结构域(SEQ ID NO:91)。
18.权利要求1-17中任一项所述的双特异性分子，其中所述分子包括：
(A)具有SEQ ID NO:95的两条多肽链和具有SEQ ID NO:96的两条多肽链；或
(B)具有SEQ ID NO:97的两条多肽链和具有SEQ ID NO:98的两条多肽链；或
(C)具有SEQ ID NO:99的两条多肽链和具有SEQ ID NO:100的两条多肽链；或
(D)具有SEQ ID NO:102的两条多肽链和具有SEQ ID NO:103的两条多肽链；或
(E)具有SEQ ID NO:101的两条多肽链和具有SEQ ID NO:100的两条多肽链；或
(F)具有SEQ ID NO:104的一条多肽链、具有SEQ ID NO:105的一条多肽链、具有SEQ IDNO:106的一条多肽链和具有SEQ ID NO:107的一条多肽链；或
(G)具有SEQ ID NO:108的一条多肽链、具有SEQ ID NO:105的一条多肽链、具有SEQ IDNO:109的一条多肽链和具有SEQ ID NO:107的一条多肽链。
19.一种药物组合物，其包括有效量的权利要求1-18中任一项所述的双特异性分子和药学上可接受的载体。
20.权利要求1-18中任一项所述的双特异性分子，其中所述分子用于促进刺激需要其的受试者的免疫介导的应答。
21.权利要求1-18中任一项所述的双特异性分子，其中所述分子用于治疗与受抑制的免疫系统相关的疾病或病况。
22.权利要求21所述的双特异性分子，其中所述疾病或病况是癌症或感染。
23.权利要求22所述的双特异性分子，其中所述癌症特征在于存在选自下述的细胞的癌症细胞：肾上腺肿瘤、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色细胞肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生小圆细胞瘤、室管膜细胞瘤、尤文氏瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、不完全性骨纤维生成、骨的纤维发育异常、胆囊癌或胆管癌、胃癌、妊娠滋养层疾病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性的脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌、甲状旁腺瘤、儿科癌症、周围神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、眼色素层后黑素瘤、罕见血液学疾病、肾转移癌症、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌和子宫癌。
24.权利要求22所述的双特异性分子，其中所述感染特征在于存在细菌、真菌、病毒或原生动物病原体。
CN201680069733.8A 2015-12-14 2016-12-12 对于pd-1和ctla-4具有免疫反应性的双特异性分子及其使用方法 Active CN108367069B (zh)

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