CN115243721A - Dgk抑制剂和检查点拮抗剂的组合 - Google Patents

Dgk抑制剂和检查点拮抗剂的组合 Download PDF

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Abstract

本申请提供了二酰基甘油激酶(DGK)抑制剂和用于治疗将受益于免疫系统刺激的疾病例如癌症和感染性疾病的方法，所述方法包括施用DGK抑制剂与PD1/PD‑L1轴拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂的组合。

Description

DGK抑制剂和检查点拮抗剂的组合
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年12月19日提交的美国临时申请号62/950,570的权益，将所述临时申请以其整体并入本文。
背景技术
人类癌症具有许多的遗传和表观遗传改变，产生了潜在地可被免疫系统识别的新抗原(Sjoblom等人,(2006)Science 314:268-74)。由T淋巴细胞和B淋巴细胞构成的适应性免疫系统具有强大的抗癌潜力，具有广泛的能力和精确的特异性以响应多样的肿瘤抗原。此外，免疫系统展现了相当大的可塑性和记忆组分。成功地利用适应性免疫系统的所有这些属性将使得免疫疗法在所有癌症治疗方式中是独特的。然而，尽管在临床前模型和患者中观察到对癌症的内源性免疫应答，但是这种应答是无效的，并且已确证的癌症被认为是“自身”的并且被免疫系统所耐受。促成这种耐受状态的肿瘤可能利用若干种不同的机制来主动破坏抗肿瘤免疫力。这些机制包括功能异常T细胞信号传导(Mizoguchi等人,(1992)Science 258:1795-98)、抑制性调控细胞(Facciabene等人,(2012)Cancer Res.72:2162-71)，以及增选内源“免疫检查点”，这用于下调适应性免疫应答强度并且保护正常组织免受肿瘤躲避免疫破坏而带来的附带伤害(Topalian等人,(2012)Curr.Opin.Immunol.24:1-6；Mellman等人(2011)Nature 480:480-489)。
二酰基甘油激酶(DGK)是介导二酰基甘油向磷脂酸转化从而终止通过TCR信号传导通路传播的T细胞功能的脂质激酶。因此，DGK用作细胞内检查点，并且对DGK的抑制预期增强T细胞信号传导通路和T细胞激活。支持性证据包括显示出高反应性T细胞表型和改善的抗肿瘤免疫活性的DGKα或DGKζ的敲除小鼠模型(Riese M.J.等人,Journal ofBiological Chemistry,(2011)7:5254-5265；Zha Y等人,Nature Immunology,(2006)12:1343；Olenchock B.A.等人,(2006)11:1174-81)。此外，观察到从人肾细胞癌患者分离的肿瘤浸润淋巴细胞过表DGKα，所述DGKα导致受抑制的T细胞功能(Prinz,P.U.等人,JImmunology(2012)12:5990-6000)。因此，DGKα和DGKζ被视为癌症免疫疗法的目标(RieseM.J.等人,Front Cell Dev Biol.(2016)4:108；Chen,S.S.等人,Front Cell Dev Biol.(2016)4:130；Avila-Flores,A.等人,Immunology and Cell Biology(2017)95:549-563；Noessner,E.,Front Cell Dev Biol.(2017)5:16；Krishna,S.,等人,Front Immunology(2013)4:178；Jing,W.等人,Cancer Research(2017)77:5676-5686。
发明内容
本文提供治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括向受试者施用DGKα、DGKζ或DGKα和DGKζ两者的抑制剂，例如式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1的化合物34，或其药学上可接受的盐与PD1/PD-L1轴拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂的组合。示例性的疾病或障碍包括那些受益于免疫系统刺激的疾病或障碍，例如癌症和感染性疾病。还提供了DGKα、DGKζ或DGKα和DGKζ两者的抑制剂，例如式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1至34的化合物或其药学上可接受的盐在用于制造用于治疗疾病或障碍，例如那些将受益于免疫系统刺激的疾病或障碍，例如癌症和感染性疾病的药物中的用途，并且其中所述抑制剂与PD1/PD-L1轴拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂组合施用。本文提供了DGKα、DGKζ或DGKα和DGKζ两者的抑制剂，例如式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1至34的化合物或其药学上可接受的盐在制造用于治疗疾病或障碍，例如那些将受益于免疫系统刺激的疾病或障碍，例如癌症和感染性疾病的药物中的用途，并且其中所述抑制剂与PD1/PD-L1轴拮抗剂和CTLA4拮抗剂组合施用。
还提供了PD1/PD-L1轴拮抗剂在制造用于治疗疾病或障碍，例如那些将受益于免疫系统刺激的疾病或障碍，例如癌症和感染性疾病的药物中的用途，并且其中所述拮抗剂与DGKα、DGKζ或DGKα和DGKζ两者的抑制剂，例如式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1至34的化合物，或其药学上可接受的盐和/或CTLA4拮抗剂组合施用。提供了PD1/PD-L1轴拮抗剂在制造用于治疗疾病或障碍，例如那些将受益于免疫系统刺激的疾病或障碍，例如癌症和感染性疾病的药物中的用途，并且其中所述拮抗剂与DGKα、DGKζ或DGKα和DGKζ两者的抑制剂，例如式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1至34的化合物，或其药学上可接受的盐和CTLA4拮抗剂组合施用。
还提供了CTLA4拮抗剂在制造用于治疗疾病或障碍，例如那些将受益于免疫系统刺激的疾病或障碍，例如癌症和感染性疾病的药物中的用途，并且其中所述拮抗剂与DGKα、DGKζ或DGKα和DGKζ两者的抑制剂，例如式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1至34的化合物，或其药学上可接受的盐和/或PD1/PD-L1轴拮抗剂组合施用。提供了CTLA4拮抗剂在制造用于治疗疾病或障碍，例如那些将受益于免疫系统刺激的疾病或障碍，例如癌症和感染性疾病的药物中的用途，并且其中所述拮抗剂与DGKα、DGKζ或DGKα和DGKζ两者的抑制剂，例如式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1至34的化合物，或其药学上可接受的盐和PD1/PD-L1轴拮抗剂组合施用。
示例性化合物，例如本文所述的式I的化合物及其药学上可接受的盐，描述于2019年6月26日提交的PCT/US2019/039131和2019年6月26日提交的PCT/US2019/039135中，两者的内容通过引用具体并入本文。示例性化合物，例如本文所述的式II化合物及其药学上可接受的盐，描述于2020年8月27日提交的PCT/US2020/048070中，其内容通过引用具体并入本文。
随着本公开文本继续，将以扩展的形式阐述新治疗方法的这些和其他特征。
附图说明
图1A和B显示了与不存在纳武单抗或伊匹单抗的相同测定相比，在MLR测定中用渐增浓度的DGKi和纳武单抗(A)或伊匹单抗(B)孵育的T细胞的IFN-γ分泌增强。
图2A-H显示，与仅用抗PD-1抗体和抗CTLA4抗体治疗的小鼠相比，DGKi与抗PD-1抗体和抗CTLA4抗体的三重组合减缓了肿瘤生长。图2A-H显示小鼠B16黑色素瘤细胞植入小鼠后，并用仅媒介物(图2A)、仅抗PD-1抗体(图2B)、抗PD-1抗体和抗CTLA4抗体(图2C)、DGKi和抗PD-1抗体(图2D)、DGKi和抗CTLA4抗体(图2E)、仅DGKi(图2F)、DGKi和抗PD-1抗体和抗CTLA4抗体(图2G)处理，随时间变化的肿瘤大小。图2H显示了用(i)抗PD-1抗体和抗CTLA4抗体，(ii)DGKi和抗PD1抗体，(iii)DGKi和CTLA4抗体和(iv)DGKi和抗PD1抗体和抗CTLA4抗体处理的小鼠中植入B16细胞后的平均肿瘤大小。
图3A-I显示在CT26小鼠模型中，用DGK抑制剂和抗PD-1抗体和/或抗CTLA4抗体的联合治疗产生改善的完全应答(图3A)，并且增加的应答水平与增加的AH1+CD8 T细胞(图3B)相关。
图4A-F显示DGK的抑制降低TCR激活所需的抗原阈值。图4A-F显示了从OT1 CD8 T细胞分泌的IL-2水平，所述OT1 CD8 T细胞与渐增水平的抗原一起孵育并且呈递肽OVA(A)、A2(B)、Q4(C)、T4(D)和Q4H7(E)之一，这表明DGK抑制将降低T细胞激活所需的肿瘤抗原浓度。图4F显示了图4A-E中所示的每种肽以1000ng/ml分泌的IL-2水平，以及用乱序肽获得的结果，其示出DGK抑制将增强由弱肿瘤抗原诱导的T细胞应答。
图5A和B显示DGK的抑制增加人CTL效应子功能并且增强肿瘤细胞杀伤。图5A显示了在DGKi浓度渐增的存在下，与肽一起孵育的T细胞的IFN-γ分泌水平。图5B显示在肿瘤细胞与增加的同源肽一起孵育后第3天增加的肿瘤细胞杀伤。
图6A和B表明DGKi可以克服降低的B2M水平以恢复T细胞效应子功能。图6A显示了HCT116细胞中B2M的CRISPR KO中β2微球蛋白的水平。图6B显示了DGKi增加IFN-γ水平。
图7显示了在存在或不存在CD8耗竭性抗体的情况下，在用DGKi化合物16和抗PD-1抗体处理的小鼠中，在CT26动物模型中肿瘤体积随着肿瘤细胞植入后天数的变化，表明CD8耗竭性抗体的存在减少肿瘤减小。
图8显示了在存在或不存在CD4耗竭性抗体的情况下，在用DGKi化合物16和抗PD-1抗体处理的小鼠中，在CT26动物模型中肿瘤体积随着肿瘤细胞植入后天数的变化，表明CD4耗竭性抗体的存在刺激肿瘤减小。
图9显示了在存在或不存在NK细胞耗竭性抗体的情况下，在用DGKi化合物16和抗PD-1抗体处理的小鼠中，在CT26动物模型中肿瘤体积随着肿瘤细胞植入后天数的变化，表明NK细胞耗竭性抗体的存在减少肿瘤减小。
图10显示DGKi与抗PD-1或抗CTLA4的组合能够在MC38肿瘤模型中引发完全的肿瘤消退(CR)。在仅用媒介物(图10A)、DGKi(图10B)、抗PD-1(图10C)、抗CTLA4(图10D)、DGKi和抗PD-1(图10E)或DGKi和抗CTLA4(图10F)处理后呈现单个动物的肿瘤体积。DGKi、抗PD-1和抗CTLA4单一疗法各自能够延缓肿瘤生长。DGKi和抗PD-1的组合在100％的受试动物中引发肿瘤CR，而DGKi和抗CTLA4的组合在70％的受试小鼠中引发CR。
图11显示在抗PD-1疗法中添加DGKi可以在MC38和CT26动物模型中引发肿瘤的完全消退(CR)，并且来自这些组的治愈动物发展出足以排斥肿瘤再次攻击的免疫记忆。在仅用媒介物(图11A和11E)、抗PD-1(图11B和11F)或抗PD-1和DGKi(图11C和11G)处理后呈现单个动物的肿瘤体积。DGKi与抗PD-1引发强大的组合效应，分别在MC38和CT26模型中导致100％和60％的肿瘤CR。为了评估治愈动物的免疫记忆，用10倍用于初始植入的肿瘤细胞数量再次攻击小鼠，并且测量肿瘤体积随着植入后天数的变化。MC38群组(图11D)和CT26群组(图11H)中的所有再次受攻击的动物自发排斥肿瘤，证实DGKi和抗PD-1联合疗法引发长期免疫记忆。
图12显示抗PD-1、抗CTLA4和DGKi三联疗法可以减少检查点抑制剂难治性B16F10肿瘤模型中的肿瘤生长。在仅用媒介物(图12A)、抗PD-1和抗CTLA4(图12B)、抗PD-1和DGKi(图12C)、抗CTLA4和DGKi(图12D)或抗PD-1、抗CTLA4和DGKi(图12E)处理后，呈现单个动物的肿瘤体积。每组的平均肿瘤体积在图12F中示出。
具体实施方式
本文提供了治疗增殖性疾病，例如癌症或病毒感染，或更一般地，受益于免疫系统刺激的疾病、障碍或病症，以及可以通过抑制DGKα和/或DGKζ酶活性来预防、改善或治愈的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的DGKα和/或DGKζ抑制剂或其药学上可接受的盐和(i)PD1/PD-L1轴拮抗剂(例如人PD1或人PD-L1的拮抗剂)和/或(ii)人CTLA4的拮抗剂。
定义
本领域技术人员在阅读以下具体实施方式后可更容易地理解治疗方法的特征和优点。应该理解的是，出于清楚原因而在前后单独实施方案中描述的治疗方法的某些特征也可组合成一个实施方案。相反，出于简洁的原因，在单个实施方案的上下文中所述的治疗方法的各种特征也可以被组合以形成其子组合。本文中确定为示例性或优选的实施方案旨在是说明性的而非限制性的。
除非本文另有明确说明，否则以单数形式作出的引用也可以包括复数形式。例如，“一个”和“一种”可以指代一个/一种、或者一个/一种或多个/多种。
如本文所用，短语“化合物和/或其药学上可接受的盐”是指至少一种化合物、所述化合物的至少一种盐或其组合。例如，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐包括式(I)的化合物、两种式(I)的化合物、式(I)的化合物的药学上可接受的盐、式(I)的化合物和式(I)的化合物的一种或多种药学上可接受的盐、以及式(I)的化合物的两种或更多种药学上可接受的盐。
除非另有指明，否则具有不饱和化合价的任何原子被假定为具有足以满足所述化合价的氢原子。
本文所阐述的定义优先于在通过引用并入本文的任何专利、专利申请和/或专利申请公开物中所阐述的定义。
下面列出的是本文所用的各种术语的定义。这些定义适用于如它们在整个说明书中单独地或作为较大基团的一部分使用(除非它们在特定情况下另有限制)的术语。
在说明书通篇中，本领域技术人员可选择基团和其取代基以提供稳定的部分和化合物。
根据本领域使用的惯例，在本文的结构式中使用
Figure BDA0003703349300000041
来描绘作为部分或取代基与核心或骨架结构的附接点的键。
如本文所用，术语“卤代”和“卤素”是指F、Cl、Br和I。
术语“氰基”是指基团-CN。
术语“氨基”是指基团-NH2。
术语“氧代基”是指基团＝O。
如本文所用的术语“烷基”是指含有例如从1至12个碳原子、从1至6个碳原子和从1至4个碳原子的支链和直链饱和脂族烃基两者。烷基的例子包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、和叔丁基)、和戊基(例如，正戊基、异戊基、新戊基)、正己基、2-甲基戊基、2-乙基丁基、3-甲基戊基、和4-甲基戊基。当数字出现在符号“C”之后的下标中时，下标更具体地定义了特定基团可能含有的碳原子的数目。例如，“C1-4烷基”表示具有一至四个碳原子的直链和支链烷基。
如本文所用，术语“氟烷基”旨在包括被一个或多个氟原子取代的支链和直链饱和脂族烃基。例如，“C1-4氟烷基”旨在包括被一个或多个氟原子取代的C1、C2、C3、和C4烷基。氟烷基的代表性例子包括但不限于-CF3和-CH2CF3。
术语“氰基烷基”包括被一个或多个氰基取代的支链和直链饱和烷基两者。例如，“氰基烷基”包括-CH2CN、-CH2CH2CN、和C1-4氰基烷基。
术语“氨基烷基”包括被一个或多个胺基团取代的支链和直链饱和烷基两者。例如，“氨基烷基”包括-CH2NH2、-CH2CH2NH2、和C1-4氨基烷基。
术语“羟烷基”包括被一个或多个羟基取代的支链和直链饱和烷基两者。例如，“羟烷基”包括-CH2OH、-CH2CH2OH和C1-4羟烷基。
术语“烯基”是指含有从2至12个碳原子和至少一个碳-碳双键的直链或支链烃自由基。示例性的此类基团包括乙烯基或烯丙基。例如，“C2-6烯基”表示具有二至六个碳原子的直链和支链烯基。
术语“炔基”是指含有从2至12个碳原子和至少一个碳至碳三键的直链或支链烃自由基。示例性的此类基团包括乙炔基。例如，“C2-6炔基”表示具有二至六个碳原子的直链和支链炔基。
如本文所用的术语“环烷基”是指通过从饱和环碳原子上除去一个氢原子而衍生自非芳族单环或多环烃分子的基团。环烷基的代表性例子包括但不限于环丙基、环戊基和环己基。当数字出现在符号“C”之后的下标中时，下标更具体地定义了特定环烷基可能含有的碳原子的数目。例如，“C3-6环烷基”表示具有三至六个碳原子的环烷基。
如本文所用的术语“烷氧基”是指通过氧原子与母体分子部分附接的烷基，例如甲氧基(-OCH3)。例如，“C1-3烷氧基”表示具有1至3个碳原子的烷氧基。
术语“氟烷氧基”和“-O(氟烷基)”表示通过氧键(-O-)附接的如上文定义的氟烷基。例如，“C1-4氟烷氧基”旨在包括C1、C2、C3和C4氟烷氧基。
术语“亚烷基(alkalenyl)”是指与核心或骨架结构具有两个附接点的饱和碳链。亚烷基具有结构-(CH2)n-，其中n是1或更大的整数。亚烷基键的例子包括-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-和-(CH2)2-4-。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断的范围内，适用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
化合物，例如式(I)的化合物，可形成可用于本文所述方法的药学上可接受的盐。除非另有说明，否则提及一种化合物应理解为包括提及其一种或多种药学上可接受的盐。术语“一种或多种盐”表示与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式药学上可接受的盐。此外，术语“一种或多种盐”可以包括两性离子(内盐)，例如当式(I)的化合物含有碱性部分(如胺或吡啶或咪唑环)以及酸性部分(如羧酸)时。药学上可接受的(即，无毒的，生理学上可接受的)盐是优选的，例如可接受的金属盐和胺盐，其中阳离子对该盐的毒性或生物活性无显著贡献。然而，其他盐可以例如用于可在制备期间采用的分离或纯化步骤中，并且因此在本文中考虑。化合物，例如式(I)的化合物的盐可以例如通过以下方式来形成：使化合物，例如式(I)的化合物与一定量的酸或碱(如当量的量)在介质(如所述盐在其中沉淀的介质)中或在水性介质中反应，随后冻干。
示例性酸加成盐包括乙酸盐(诸如与乙酸或三卤乙酸(例如三氟乙酸)形成的那些)、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐(与盐酸形成)、氢溴酸盐(与溴化氢形成)、氢碘化物、马来酸盐(与马来酸形成)、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐(与甲磺酸形成)、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(诸如与硫酸形成的那些)、磺酸盐(诸如本文中提到的那些)、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐(toluenesulfonate)(诸如甲苯磺酸盐(tosylate))、十一烷酸盐等。
示例性的碱性盐包括铵盐、碱金属盐，例如钠、锂和钾盐；碱土金属盐，例如钙和镁盐；钡、锌和铝盐；与有机碱(例如有机胺)形成的盐，例如与三烷基胺(如三乙胺)、普鲁卡因、二苄基胺、N-苄基-β-苯乙基胺、1-苯胺、N,N′-二苄基亚乙基-二胺、脱氢松香胺、N-乙基哌啶、苄胺、二环己基胺或类似的药学上可接受的胺以及与氨基酸形成的盐，所述氨基酸例如精氨酸、赖氨酸等。碱性含氮基团可以用诸如低级烷基卤化物(例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物)、硫酸二烷基酯(例如硫酸二甲基、二乙基、二丁基和酸二戊基酯)、长链卤化物(例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物)、芳烷基卤化物(例如苄基和苯乙基溴化物)等进行季铵化。优选的盐包括单盐酸盐、硫酸氢盐、甲磺酸盐、磷酸盐或硝酸盐。
化合物，例如式(I)的化合物可以作为无定形固体或结晶固体提供。可以采用冻干来提供呈固体的化合物，例如式(I)的化合物。
还应当理解，化合物例如式(I)的化合物的溶剂化物(例如水合物)也可以用于本文所述的方法中。术语“溶剂化物”是指化合物例如式(I)化合物与一个或多个溶剂分子(无论是有机的还是无机的)的物理缔合。此物理缔合包括氢键。在某些情况下，溶剂化物将是能够分离的，例如当一个或多个溶剂分子被掺在结晶固体的晶格中时。“溶剂化物”涵盖溶液相和可分离溶剂化物两者。示例性溶剂化物包括水合物、乙醇化物、甲醇化物、异丙醇化物、乙腈溶剂化物、和乙酸乙酯溶剂化物。溶剂化方法是本领域已知的。
各种形式的前药是本领域熟知的，并且描述于：
a)The Practice of Medicinal Chemistry,Camille G.Wermuth等人,Ch 31,(Academic Press,1996)；
b)Design of Prodrugs,由H.Bundgaard编辑,(Elsevier,1985)；
c)A Textbook of Drug Design and Development,P.Krogsgaard–Larson andH.Bundgaard,eds.第5章,第113-191页(Harwood Academic Publishers,1991)；以及
d)Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism,Bernard Testa和JoachimM.Mayer,(Wiley-VCH,2003)。
此外，可以在化合物，例如式(I)的化合物制备之后将其分离并且纯化以获得含有按重量计等于或大于99％的量的化合物，例如式(I)的化合物(“基本上纯的”)的组合物，然后如本文所述使用或配制所述组合物。此类“基本上纯的”化合物，例如式(I)的化合物，也在本文中考虑。
“稳定的化合物”和“稳定的结构”意在指示化合物足够稳健以经受住从反应混合物中分离至有用程度的纯度并且配制成有效的治疗剂。用于本文的化合物旨在表现为稳定的化合物。
本文所述的化合物旨在包括在本发明化合物中出现的原子的所有同位素。同位素包括原子数相同但质量数不同的那些原子。通过一般举例而非限制的方式，氢的同位素包括氘(D)和氚(T)。碳的同位素包括13C和14C。同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与本文所述那些类似的方法，使用适当的同位素标记的试剂代替原本采用的未经标记的试剂来制备。
如本文所用，“治疗”涵盖用于人中的疾病的治疗剂的任何给予或施用，并且包括抑制疾病或疾病或一种或多种疾病症状的进展、减缓疾病或其进展或其症状中的一种或多种、阻止其发展、部分或完全地减轻疾病或其症状中的一种或多种或防止疾病的一种或多种症状的复发。
除非另有明确说明，否则术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用用于指人。
“DGKα和/或DGKζ抑制剂”是指“DGKα和/或DGKζ酶活性抑制剂”，两者均指人DGKα和/或人DGKζ的抑制剂，例如具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列、不含DGKα中天然存在的氨基酸(例如，His尾部或某些N末端氨基酸)的DGKα，以及具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列、不含DGKζ中天然存在的氨基酸(例如，His尾部或某些N末端氨基酸)的DGKζ。
如本文所用的靶蛋白，例如DGK、PD-1、PD-L1和CTLA4，是指人靶蛋白，除非另有明确说明或上下文另有明确说明。例如，“鼠DGK”是指DGK的鼠形式，因为它是专门指出的。
“PD1”可与“PD-1”互换使用。
“CTLA4”可与“CTLA-4”互换使用。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指对于治疗受试者中的疾病或障碍以例如部分或完全地减轻一种或多种症状有效的药物的量。在一些实施方案中，有效量是指在必需剂量下并且持续必需的时间有效实现所需治疗或预防结果的量。
术语“癌症”在本文中用于指展现出异常高水平的增殖和生长的细胞群。癌症可以是良性的(也称为良性肿瘤)、恶性前的或恶性的。癌细胞可以是实体癌细胞或白血病癌细胞。适用于本文的治疗方法的癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体的非限制性例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食道癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌(包括鳞状细胞非小细胞肺癌)、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肾细胞癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌、黑色素瘤和各种类型的头颈癌(包括头和颈的鳞状细胞癌)。
术语“肿瘤生长”在本文中用于指由一个或多个包含癌症的细胞的增殖或生长，这引起癌症的大小或程度的相应增加。
与一种或多种其他治疗剂“组合”给予包括同时(并行)给予和以任何顺序连续(依次)给予。
治疗方法
本文提供了治疗增殖性疾病，例如癌症或病毒感染，或更一般地，受益于免疫系统刺激的疾病、障碍或病症，以及可以通过抑制DGKα和/或DGKζ酶活性来预防、改善或治愈的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的(i)DGKα和/或DGKζ抑制剂和(ii)PD1/PD-L1轴拮抗剂(例如人PD1或人PD-L1的拮抗剂)和/或人CTLA4的拮抗剂。本文提供了治疗增殖性疾病，例如癌症或病毒感染，或更一般地，受益于免疫系统刺激的疾病、障碍或病症，以及可以通过抑制DGKα和/或DGKζ酶活性来预防、改善或治愈的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的(i)DGKα和/或DGKζ抑制剂和(ii)PD1/PD-L1轴拮抗剂(例如人PD1或人PD-L1的拮抗剂)。本文提供了治疗增殖性疾病，例如癌症或病毒感染，或更一般地，受益于免疫系统刺激的疾病、障碍或病症，以及可以通过抑制DGKα和/或DGKζ酶活性来预防、改善或治愈的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的(i)DGKα和/或DGKζ抑制剂和人CTLA4的拮抗剂。在某些实施方案中，治疗增殖性疾病，例如癌症或病毒感染，或更一般地，受益于免疫系统刺激的疾病、障碍或病症，以及可以通过抑制DGKα和/或DGKζ酶活性来预防、改善或治愈的疾病、障碍或病症的方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的(i)DGKα和/或DGKζ抑制剂和(ii)PD1/PD-L1轴拮抗剂(例如人PD1或人PD-L1的拮抗剂)和人CTLA4的拮抗剂。
(i)DGKα和/或DGKζ抑制剂和(ii)PD1/PD-L1轴拮抗剂(例如，人PD1或人PD-L1拮抗剂)和/或人CTLA4拮抗剂的施用可以是同时的或顺序的。例如，在某些实施方案中，一种治疗癌症或可通过增加免疫应答来治疗的疾病的方法，包括首先向有需要的受试者施用DGKα和/或DGKζ抑制剂，然后稍后(例如，6小时、12小时、24小时、2天、3天或更长时间)，施用PD1/PD-L1轴拮抗剂(例如，人PD1或人PD-L1的拮抗剂)和/或人CTLA4拮抗剂。一种方法，例如治疗癌症的方法，可以包括治疗癌症或可通过增加免疫应答来治疗的疾病，包括首先向有需要的受试者施用PD1/PD-L1轴拮抗剂(例如，人PD1或人PD-L1的拮抗剂)和/或人CTLA4的拮抗剂，然后稍后(例如，6小时、12小时、24小时、2天、3天或更长时间后)施用DGKα和/或DGKζ。一种方法，例如治疗癌症的方法，可以包括首先施用DGKα和/或DGKζ抑制剂，然后稍后(例如，6小时、12小时、24小时、2天、3天或更长时间)施用PD1/PD-L1轴拮抗剂(例如人PD1或人PD-L1的拮抗剂)，并且同时施用人CTLA4的拮抗剂。一种方法，例如治疗癌症的方法，可以包括首先施用DGKα和/或DGKζ抑制剂，然后稍后(例如，6小时、12小时、24小时、2天、3天或更长时间)施用PD1/PD-L1轴拮抗剂(例如人PD1或人PD-L1的拮抗剂)，并且同时施用人CTLA4的拮抗剂。一种方法，例如治疗癌症的方法，可以包括首先施用PD1/PD-L1轴拮抗剂(例如人PD1或人PD-L1的拮抗剂)，并且同时施用人CTLA4的拮抗剂，然后随后(例如，6小时、12小时、24小时、2天、3天或更长时间后)施用DGKα和/或DGKζ抑制剂。
本文所述的方法可用于治疗癌症，例如晚期癌症、转移性癌症、实体瘤、晚期实体瘤、血液肿瘤、检查点抑制剂(或检查点拮抗剂)难治的癌症或在用检查点抑制剂治疗后进展的那些癌症。
用于治疗的癌症的非限制性例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、神经胶质瘤、胃肠道癌、肾癌(例如透明细胞癌)、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(例如肾细胞癌(RCC))、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤)、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和头颈癌症(或癌)、胃癌、生殖细胞瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤细胞、黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤，如皮肤或眼内恶性黑色素瘤)、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛门区域癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑癌、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症(包括石棉诱导的那些癌症)、病毒相关的癌症或病毒起源的癌症(例如人乳头瘤病毒(HPV相关或起源的肿瘤))以及源自两种主要血细胞谱系(即髓样细胞系(其产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞)或淋巴细胞系(其产生B、T、NK和浆细胞))中任一种的恶性血液病(例如所有类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴细胞性和/或骨髓性白血病，如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性骨髓性白血病(CML)、未分化AML(MO)、粒细胞白血病(Ml)、粒细胞白血病(M2；伴随细胞成熟)、早幼粒细胞白血病(M3或M3变体[M3V])、骨髓单核细胞性白血病(M4或M4变体伴随嗜酸性粒细胞增多症[M4E])、单核细胞性白血病(M5)、红白血病(M6)、巨核母细胞性白血病(M7)、孤立的粒细胞肉瘤和绿色瘤)；淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞血液恶性肿瘤(例如B细胞淋巴瘤)、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、间变性(例如Ki 1+)大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、肠T细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、前体T淋巴母细胞性淋巴瘤、T淋巴母细胞；和淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、移植后淋巴细胞增殖性疾病、真性组织细胞性淋巴瘤、原发中枢神经系统淋巴瘤、原发渗出性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤(LBL)、淋巴谱系造血肿瘤、急性淋巴母细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥散组织细胞淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)(也称为蕈样肉芽肿病或塞扎里综合征)、和伴有沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症的淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，如IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(也称为惰性骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤和多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞淋巴瘤；骨髓谱系造血肿瘤、间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；精原细胞瘤、畸胎癌、中枢神经肿瘤和外周神经肿瘤，包括星形细胞瘤、神经鞘瘤；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡状癌和畸胎癌、淋巴谱系造血肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤，包括但不限于T细胞障碍，如T细胞幼淋巴细胞性白血病(T-PLL)，包括小细胞和脑样细胞类型；T细胞型大颗粒淋巴细胞性白血病(LGL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多形和免疫母细胞亚型)；血管中心性(鼻)T细胞淋巴瘤；头颈癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌；急性骨髓淋巴瘤以及上述癌症的任何组合。本文所述的方法还可以用于治疗转移性癌症、不可切除的、难治性癌症(例如先前免疫疗法(例如使用阻断性CTLA-4或PD-1抗体)难治的癌症)和/或复发性癌症。
在某些实施方案中，将本文所述的组合治疗施用至患有已经展现出对先前治疗(例如使用免疫肿瘤学或免疫疗法药物的先前治疗)不充分应答或在先前治疗的基础上进展的癌症的患者。在一些实施方案中，癌症对先前治疗是难治性的或耐药性的，即内在难治性或耐药性的(例如，对PD-1途径拮抗剂的难治性的)或者获得的耐药性或难治性状态。例如，本文所述的组合治疗可以单独或与另一种疗法(例如与抗PD-1途径的拮抗剂治疗)组合施用至对第一疗法没有反应或没有充分反应的受试者或在治疗(例如抗PD-1途径拮抗剂治疗)后具有疾病进展的受试者。在其他实施方案中，将本文所述的组合治疗施用至先前未接受(即未用其治疗)免疫肿瘤学药剂(例如PD-1途径拮抗剂)的患者。
联合治疗可以进一步包括一种或多种额外的治疗，例如放射、手术或化学疗法。
本文所述的方法还可用于治疗已暴露于特定毒素或病原体的患者，例如患有感染性疾病的患者。因此，本公开文本还考虑了治疗受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的联合治疗，从而治疗受试者的感染性疾病。类似于如上文讨论的其对肿瘤的应用，组合治疗可以单独使用，或作为佐剂与疫苗组合使用，以刺激针对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。这种治疗方法可能特别有用的病原体的例子包括目前没有有效疫苗的病原体或常规疫苗不完全有效的病原体。这些包括但不限于HIV、肝炎病毒(甲型、乙型和丙型)、流感病毒、疱疹病毒、贾第虫(Giardia)、疟原虫(Malaria)、利什曼原虫(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。组合治疗可对于在感染过程中呈现改变的抗原的诸如HIV等剂的确定感染特别有用。
引起可通过本文所述方法可治疗的感染的致病病毒的一些例子包括HIV、肝炎(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒。
引起可通过本文所述方法可治疗的感染的致病细菌的一些例子包括衣原体属(chlamydia)、立克次体细菌(rickettsial bacteria)、分枝杆菌属(mycobacteria)、葡萄球菌属(staphylococci)、链球菌属(streptococci)、肺炎球菌属(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、变形杆菌属(proteus)、沙雷氏菌属(serratia)、假单胞菌属(pseudomonas)、军团菌属(legionella)、白喉、沙门氏菌属(salmonella)、芽孢杆菌属、霍乱、破伤风、肉毒杆菌、炭疽、鼠疫、钩端螺旋体病和莱姆病细菌。
引起可通过本文所述方法可治疗的感染的致病真菌的一些例子包括念珠菌(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉(Aspergillus)(烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、属毛霉目(Genus Mucorales)(毛霉菌属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizopus))、申克孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可通过本文所述方法可治疗的感染的致病寄生虫的一些例子包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴(Naegleriafowleri)、棘阿米巴属物种(Acanthamoeba sp.)、蓝氏贾第虫(Giardialambia)、隐孢子虫属物种(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystiscarinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微小巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)和巴西日圆线虫(Nippostrongylusbrasiliensis)。
在所有上述方法中，可以将组合治疗与其他形式的免疫疗法(例如本文所述的那些免疫疗法)结合，如细胞因子治疗(例如，干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或双特异性抗体疗法，其可以提供增强的肿瘤抗原呈递(参见例如Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444--6448；Poljak(1994)Structure 2:1121-1123)。
在某些实施方案中，方法包括向有需要的受试者例如患有癌症的受试者施用DGKα和/或DGKζ抑制剂与PD1/PD-L1轴拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂以及抑制CD4+T细胞的药剂和/或增强CD8+T细胞的药剂的组合。在某些实施方案中，抑制CD4+T细胞的药剂和增强CD8+T细胞的药剂可以是在肿瘤环境中局部起作用的药剂。
DGKα和/或DGKζ酶活性的示例性抑制剂
在某些实施方案中，DGKα和/或DGKζ抑制剂是DGKα的抑制剂。在某些实施方案中，DGKα和/或DGKζ抑制剂是DGKζ的抑制剂。在某些实施方案中，DGKα和/或DGKζ抑制剂抑制两种酶。可以如本文进一步所述的那样测量酶抑制水平。在某些实施方案中，DGKα和/或DGKζ抑制剂不是其他DGK酶的显著抑制剂。
在某些实施方案中，DGKα和/或DGKζ抑制剂增加免疫应答，例如通过增加T细胞活性。例如，DGKα和/或DGKζ抑制剂可以增加初级T细胞信号传导，如例如由pERK/pPKC信号传导增加所证明的，这可以如本文进一步所述的那样测量。在某些实施方案中，DGKα和/或DGKζ抑制剂具有以下一种或多种特性：(i)降低抗原刺激的阈值；(ii)增加CTL效应子功能；(iii)增强肿瘤细胞杀伤。当DGKα和/或DGKζ抑制剂增强肿瘤细胞杀伤时，这种活性可能依赖于CD8+T细胞，例如CT26动物模型中所示。当DGKα和/或DGKζ抑制剂增强肿瘤细胞杀伤时，这种活性可能依赖于NK细胞，例如CT26动物模型中所示。当DGKα和/或DGKζ抑制剂增强肿瘤细胞杀伤时，这种活性可能依赖于CD8+T细胞和NK细胞，例如CT26动物模型中所示。当DGKα和/或DGKζ抑制剂增强肿瘤细胞杀伤时，这种活性可能通过CD4细胞耗竭而增强，例如在CT-26动物模型中。在某些实施方案中，在CT-26动物模型中DGKα和/或DGKζ抑制剂增强AH1+四聚体抗原呈递。DGKα和/或DGKζ抑制剂优选包括一种或多种上述特性，并且可以包括所有这些特性。这些特性的这些存在可以通过进行本文所述的测定来确定，例如在实施例中标题为“生物测定”的部分中。
一种治疗疾病例如癌症的方法可以包括向有需要的受试者施用PD1/PD-L1轴拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂以及DGKα和/或DGKζ抑制剂，所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(I)的化合物：
Figure BDA0003703349300000101
或其药学上可接受的盐，其中：
R1为H、F、Cl、Br、-CN、被0至4个R1a取代的C1-3烷基、被0至4个R1a取代的C3-4环烷基、被0至4个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nRe或-P(O)ReRe；
每个R1a独立地为F、Cl、-CN、-OH、-OCH3或-NRaRa；
每个Ra独立地为H或C1-3烷基；
每个Re独立地为被0至4个R1a取代的C3-4环烷基或C1-3烷基；
R2为H、被0至4个R2a取代的C1-3烷基或被0至4个R2a取代的C3-4环烷基；
每个R2a独立地为F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、C3-4环烷基、C3-4烯基或C3-4炔基；
R3为H、F、Cl、Br、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C3-4环烷基、C3-4氟环烷基或-NO2；
R4为-CH2R4a、-CH2CH2R4a、-CH2CHR4aR4d、-CHR4aR4b或-CR4aR4bR4c；
R4a和R4b独立地为：
(i)C1-6烷基，被0至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、-NRaRa、-S(O)2Re或-NRaS(O)2Re；
(ii)C3-6环烷基、杂环基、苯基或杂芳基，各自被0至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-4羟烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟烷基)、-O(CH)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-6环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基和Rd；或
(iii)C1-4烷基，被一个选自C3-6环烷基、杂环基、芳基和杂芳基的环状基团取代，所述环状基团被0至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)和C3-6环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被0至3个Rf取代；
每个Rf独立地为F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被0至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基和-NRcRc；
R4c为C1-6烷基或C3-6环烷基，各自被0至4个选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基和-CN；
R4d为-OCH3；
每个Rc独立地为H或C1-2烷基；
Rd是苯基，被0至1个选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-CH3和-OCH3；
每个R5独立地为-CN、被0至4个Rg取代的C1-6烷基、被0至4个Rg取代的C2-4烯基、被0至4个Rg取代的C2-4炔基、被0至4个Rg取代的C3-4环烷基、被0至4个Rg取代的苯基、被0至3个Rg取代的噁二唑基、被0至4个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被0至4个Rg取代的杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；
每个Rg独立地为F、Cl、-CN、-OH、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-2O(C1-2烷基)或-NRcRc；
m是0、1、2或3；并且
n是0、1或2。
一种治疗疾病例如癌症的方法可以包括向有需要的受试者施用PD1/PD-L1轴拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂以及DGKα和/或DGKζ抑制剂，所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为H、F、Cl、Br、-CN、被0至4个R1a取代的C1-3烷基、被0至3个R1a取代的环丙基、被0至3个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nCH3或-P(O)(CH3)2；
每个R1a独立地为F、Cl或-CN；
每个Ra独立地为H或C1-3烷基；
R2为H或被0至2个R2a取代的C1-2烷基；
每个R2a独立地为F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、环丙基、C3-4烯基或C3-4炔基；
R3为H、F、Cl、Br、-CN、C1-2烷基、-CF3、环丙基或-NO2；
R4a和R4b独立地为：
(i)C1-4烷基，被0至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基和-NRaRa；
(ii)C3-6环烷基、杂环基、苯基或杂芳基，各自被0至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、-CH2OH、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟烷基)、-O(CH)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH)1-2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基和Rd；或
(iii)C1-3烷基，被一个选自C3-6环烷基、杂环基、苯基和杂芳基的环状基团取代，所述环状基团被0至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)和C3-4环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被0至3个Rf取代；
每个Rf独立地为F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被0至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基和-NRcRc；
R4c为C1-4烷基或C3-6环烷基，各自被0至4个选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基和-CN；
并且每个R5独立地为-CN、被0至4个Rg取代的C1-5烷基、被0至4个Rg取代的C2-3烯基、被0至4个Rg取代的C2-3炔基、被0至4个Rg取代的C3-4环烷基、被0至3个Rg取代的苯基、被0至3个Rg取代的噁二唑基、被0至3个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被0至4个Rg取代的杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa或-C(O)NRa(C3-4环烷基)。
一种治疗疾病例如癌症的方法可以包括向有需要的受试者施用PD1/PD-L1轴拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂以及DGKα和/或DGKζ抑制剂，所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
Figure BDA0003703349300000121
其中：
R1为-CN；
R2为-CH3；
R3为H、F或-CN；
R4为：
Figure BDA0003703349300000131
一种治疗疾病例如癌症的方法可以包括向有需要的受试者施用PD1/PD-L1轴拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂以及DGKα和/或DGKζ抑制剂，所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构或式之一(或其异构体)：
1-(双(4-氟苯基)甲基)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基)哌嗪-2-甲酸甲酯
Figure BDA0003703349300000132
4-((2R,5S)-4-(双(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-3-甲腈
Figure BDA0003703349300000133
(R)-8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2,7-二甲腈
Figure BDA0003703349300000141
8-[(2S,5R)-4-[(4-氯苯基)(5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000142
4-[(2S,5R)-4-[(4-氯苯基)(4-氟苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-6-甲氧基-1-甲基-1,2-二氢-1,5-萘啶-2-酮
Figure BDA0003703349300000143
8-[(2S,5R)-4-{[2-(二氟甲基)-4-氟苯基]甲基}-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000144
8-[(2S,5R)-4-[(4-氟苯基)(4-甲基苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000151
8-[(2S,5R)-4-[1-(2,6-二氟苯基)乙基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000152
8-((3R)-4-((4-氯苯基)(5-氟吡啶-2-基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2,7-二甲腈
Figure BDA0003703349300000153
8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000154
以及
8-[(2S,5R)-4-[双(4-甲基苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000161
一种治疗疾病例如癌症的方法可以包括向有需要的受试者施用PD1/PD-L1轴拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂以及DGKα和/或DGKζ抑制剂，所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(II)的化合物：
Figure BDA0003703349300000162
或其盐，其中：
R1为H、F、Cl、Br、-CN、-OH、被0至4个R1a取代的C1-3烷基、被0至4个R1a取代的C3-4环烷基、被0至4个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nRe或-P(O)ReRe；
每个R1a独立地为F、Cl、-CN、-OH、-OCH3或-NRaRa；
每个Ra独立地为H或C1-3烷基；
每个Re独立地为被0至4个R1a取代的C3-4环烷基或C1-3烷基；
R2为H、被0至4个R2a取代的C1-3烷基或被0至4个R2a取代的C3-4环烷基；
每个R2a独立地为F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、C3-4环烷基、C3-4烯基或C3-4炔基；
R4为-CH2R4a、-CH2CH2R4a、-CH2CHR4aR4d、-CHR4aR4b或-CR4aR4bR4c；
R4a和R4b独立地为：
(i)-CN或C1-6烷基，所述C1-6烷基被0至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、-NRaRa、-S(O)2Re或-NRaS(O)2Re；
(ii)C3-6环烷基、4至10元杂环基、苯基或5至10元杂芳基，各自被0至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-4羟烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(C1-4羟烷基)、-O(CRxRx)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-CH2NRaRa、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-(CRxRx)0-2NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-(CRxRx)1-2(C3-4环烷基)、-(CRxRx)1-2(吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二氟吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二甲基吗啉基)、-(CRxRx)1-2(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、(CRxRx)1-2(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-(CRxRx)1-2(甲基哌嗪酮基)、-(CRxRx)1-2(乙酰基哌嗪基)、-(CRxRx)1-2(哌啶基)、-(CRxRx)1-2(二氟哌啶基)、-(CRxRx)1-2(甲氧基哌啶基)、-(CRxRx)1-2(羟基哌啶基)、-O(CRxRx)0-2(C3-6环烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基环丙基)、-O(CRxRx)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CRxRx)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(四氢吡喃基)、-O(CRxRx)1-2(吗啉基)、-O(CRxRx)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、二氧戊环基、吡咯烷酮基和Rd；或
(iii)C1-4烷基，被一个选自C3-6环烷基、4至10元杂环基、单环或双环芳基或5至10元杂芳基的环状基团取代，所述环状基团被0至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)和C3-6环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被0至3个Rf取代；
每个Rf独立地为F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被0至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基和-NRcRc；
R4c为C1-6烷基或C3-6环烷基，各自被0至4个选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基和-CN；
R4d为-OCH3；
每个Rc独立地为H或C1-2烷基；
Rd是苯基，被0至1个选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-CH3和-OCH3；
每个R5独立地为-CN、被0至4个Rg取代的C1-6烷基、被0至4个Rg取代的C2-4烯基、被0至4个Rg取代的C2-4炔基、被0至4个Rg取代的C3-4环烷基、被0至4个Rg取代的苯基、被0至3个Rg取代的噁二唑基、被0至4个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被0至4个Rg取代的4至10元杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；
每个Rg独立地为F、Cl、-CN、-OH、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-2O(C1-2烷基)或-NRcRc；
m是0、1、2或3；并且
n是0、1或2。
一种治疗疾病例如癌症的方法可以包括向有需要的受试者施用PD1/PD-L1轴拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂以及DGKα和/或DGKζ抑制剂，所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为H、F、Cl、Br、-CN、-OH、被0至4个R1a取代的C1-3烷基、被0至3个R1a取代的环丙基、被0至3个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nCH3或-P(O)(CH3)2；
R2为H或被0至2个R2a取代的C1-2烷基；
每个R2a独立地为F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、环丙基、C3-4烯基或C3-4炔基；
R4a和R4b独立地为：
(i)-CN或C1-4烷基，所述C1-4烷基被0至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基和-NRaRa；
(ii)C3-6环烷基、4至10元杂环基、苯基或5至10元杂芳基，各自被0至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-2羟烷基、-CH2NRaRa、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、-(CH2)1-2NRxC(O)O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟烷基)、-O(CRxRx)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(CH2)1-2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-CRxRx(吗啉基)、-CRxRx(二氟吗啉基)、-CRxRx(二甲基吗啉基)、-CRxRx(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、-CRxRx(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-CRxRx(甲基哌嗪酮基)、-CRxRx(乙酰基哌嗪基)、-CRxRx(哌啶基)、-CRxRx(二氟哌啶基)、-CRxRx(甲氧基哌啶基)、-CRxRx(羟基哌啶基)、-O(CH2)0-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)0-2(甲基环丙基)、-O(CH2)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CH2)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CH2)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、-O(CH2)0-2(四氢吡喃基)、-O(CH2)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、二氧戊环基、吡咯烷酮基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基和Rd；或
(iii)C1-3烷基，被一个选自C3-6环烷基、4至10元杂环基、单环或双环芳基或5至10元杂芳基的环状基团取代，所述环状基团被0至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)和C3-4环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被0至3个Rf取代；
每个Rf独立地为F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被0至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基和-NRcRc；
R4c为C1-4烷基或C3-6环烷基，各自被0至4个选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基和-CN；
每个R5独立地为-CN、被0至4个Rg取代的C1-5烷基、被0至4个Rg取代的C2-3烯基、被0至4个Rg取代的C2-3炔基、被0至4个Rg取代的C3-4环烷基、被0至3个Rg取代的苯基、被0至3个Rg取代的噁二唑基、被0至3个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被0至4个Rg取代的4至10元杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；
每个Rx独立地为H或-CH3；并且
m是1、2或3。
一种治疗疾病例如癌症的方法可以包括向有需要的受试者施用PD1/PD-L1轴拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂以及DGKα和/或DGKζ抑制剂，所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(II)的化合物的或其药学上可接受的盐，其中m是2；一个R5是R5a，另一个R5是R5c；所述化合物具有式(III)的结构：
Figure BDA0003703349300000181
R5a为-CH3或-CH2CH3；并且
R5c为-CH3、-CH2CH3或-CH2CH2CH3。
一种治疗疾病例如癌症的方法可以包括向有需要的受试者施用PD1/PD-L1轴拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂以及DGKα和/或DGKζ抑制剂，所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(III)的化合物或其药学上可接受的盐，其中
Figure BDA0003703349300000191
R1为-CN；
R2为-CH3；
R5a为-CH3或-CH2CH3；并且
R5c为-CH3、-CH2CH3或-CH2CH2CH3。
一种治疗疾病例如癌症的方法可以包括向有需要的受试者施用PD1/PD-L1轴拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂以及DGKα和/或DGKζ抑制剂，所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构之一：
4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000192
包括4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-((S)-1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈和4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-((R)-1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；
4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000193
包括4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-((S)-1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈和4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-((R)-1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；
4-((2S,5R)-5-乙基-4-((4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000201
包括4-((2S,5R)-5-乙基-4-((S)-(4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈和4-((2S,5R)-5-乙基-4-((R)-(4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；
4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000202
包括4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-((S)-1-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈和4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-((R)-1-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；
4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000203
包括4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-((S)-1-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈和4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-((R)-1-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；
4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000211
包括4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-((S)-1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈和4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-((R)-1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；
4-((2S,5R)-4-((4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000212
包括4-((2S,5R)-4-((R)-(4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈和4-((2S,5R)-4-((S)-(4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；
4-((2S,5R)-4-((3-环丙基-1,2,4-噁二唑-5-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000213
包括4-((2S,5R)-4-((R)-(3-环丙基-1,2,4-噁二唑-5-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈和4-((2S,5R)-4-((S)-(3-环丙基-1,2,4-噁二唑-5-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；
4-((2S,5R)-4-((4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000221
包括4-((2S,5R)-4-((S)-(4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈和4-((2S,5R)-4-((R)-(4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；
4-((2S,5R)-4-(1-(4-(环丙基甲氧基)-2-氟苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000222
包括4-((2S,5R)-4-((S)-1-(4-(环丙基甲氧基)-2-氟苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈和4-((2S,5R)-4-((R)-1-(4-(环丙基甲氧基)-2-氟苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；
4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丁基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000223
包括4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-((S)-1-(4-(三氟甲基)苯基)丁基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈和4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-((R)-1-(4-(三氟甲基)苯基)丁基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈；
1-甲基-4-((2S,5R)-2-甲基-5-丙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000231
包括1-甲基-4-((2S,5R)-2-甲基-5-丙基-4-((S)-1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈和1-甲基-4-((2S,5R)-2-甲基-5-丙基-4-((R)-1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈。
PD1/PD-L1轴拮抗剂
可与DGK抑制剂组合的PD1/PD-L1轴拮抗剂包括以下。
PD1/PD-L1轴拮抗剂是人PD1的拮抗剂或人PD-L1的拮抗剂，其通过抑制阴性检查点来刺激免疫应答。拮抗剂可以是任何类型的分子，例如蛋白质、核酸或小分子。在某些实施方案中，PD1/PD-L1轴拮抗剂是特异性结合人PD1或人PD-L1的抗体。
本领域已知的抗PD-1抗体可用于本发明所述述的方法中。以高亲和力与PD-1特异性结合的多种人单克隆抗体已经公开在美国专利号8,008,449中。已经证明美国专利号8,008,449中披露的抗PD-1人抗体展现出以下特征中的一种或多种：(a)以1x10-7M或更小的KD与人PD-1结合，如使用Biacore生物传感器系统通过表面等离子体共振确定的；(b)基本上不与人CD28、CTLA-4或ICOS结合；(c)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中增加T细胞增殖；(d)在MLR测定中增加干扰素-γ产生；(e)在MLR测定中增加IL-2分泌；(f)与人PD-1和食蟹猴PD-1结合；(g)抑制PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合；(h)刺激抗原特异性记忆应答；(i)刺激抗体应答；以及(j)抑制体内肿瘤细胞生长。可用于本公开文本中的抗PD-1抗体包括与人PD-1特异性结合并且展现出前述特征中的至少一种、在一些方面至少五种的单克隆抗体。
其他抗PD-1单克隆抗体已经描述于例如以下中：美国专利号6,808,710、7,488,802、8,168,757和8,354,509，美国公开号2016/0272708，以及PCT公开号WO 2012/145493、WO 2008/156712、WO 2015/112900、WO 2012/145493、WO 2015/112800、WO 2014/206107、WO2015/35606、WO 2015/085847、WO 2014/179664、WO 2017/020291、WO 2017/020858、WO2016/197367、WO 2017/024515、WO 2017/025051、WO 2017/123557、WO 2016/106159、WO2014/194302、WO 2017/040790、WO 2017/133540、WO 2017/132827、WO 2017/024465、WO2017/025016、WO 2017/106061、WO 2017/19846、WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO2017/132825和WO 2017/133540，将所述文献中的每一篇均通过引用以其整体并入。
在一些方面，所述抗PD-1抗体选自纳武单抗(也称为
Figure BDA0003703349300000232
5C4、BMS-936558、MDX-1106和ONO-4538)、派姆单抗(Merck；也称为
Figure BDA0003703349300000233
帕博利珠单抗和MK-3475；参见WO 2008/156712)、PDR001(Novartis；参见WO 2015/112900)、MEDI-0680(AstraZeneca；也称为AMP-514；参见WO 2012/145493)、西米普利单抗(Regeneron；也称为REGN-2810；参见WO 2015/112800)、JS001(TAIZHOU JUNSHI PHARMA；也称为特瑞普利单抗(toripalimab)；参见Si-Yang Liu等人,J.Hematol.Oncol.10:136(2017))、信迪利单抗(sintilimab)、BGB-A317(Beigene；也称为替雷利珠单抗；参见WO 2015/35606和US 2015/0079109)、INCSHR1210(江苏恒瑞医药；也称为SHR-1210；参见WO 2015/085847；刘思扬等人，J.Hematol.Oncol.10:136(2017))、TSR-042(Tesaro Biopharmaceutical；也称为ANB011；参见WO2014/179664)、GLS-010(Wuxi/Harbin Gloria Pharmaceuticals；也称为WBP3055；参见Si-Yang Liu等人,J.Hematol.Oncol.10:136(2017))、AM-0001(Armo)、STI-1110(Sorrento Therapeutics；参见WO 2014/194302)、AGEN2034(Agenus；参见WO 2017/040790)、MGA012(Macrogenics，参见WO 2017/19846)、BCD-100(Biocad；Kaplon等人,mAbs10(2):183-203(2018)、和IBI308(Innovent；参见WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO2017/132825和WO 2017/133540)。
在一个方面，所述抗PD-1抗体是纳武单抗。纳武单抗是完全人IgG4(S228P)PD-1免疫检查点抑制剂抗体，其选择性地阻止与PD-1配体(PD-L1和PD-L2)的相互作用，从而阻断抗肿瘤T细胞功能的下调(美国专利号8,008,449；Wang等人,2014Cancer Immunol Res.2(9):846-56)。
在另一方面，所述抗PD-1抗体是派姆单抗。派姆单抗是针对人细胞表面受体PD-1(程序性死亡蛋白-1或程序性细胞死亡蛋白-1)的人源化单克隆IgG4(S228P)抗体。派姆单抗描述于例如美国专利号8,354,509和8,900,587中。
可用于所公开的方法中的抗PD-1抗体还包括分离的抗体，其与人PD-1特异性结合并且与本文所公开的任何抗PD-1抗体(例如，纳武单抗)交叉竞争与人PD-1的结合(参见例如，美国专利号8,008,449和8,779,105；WO 2013/173223)。在一些方面，所述抗PD-1抗体与本文所述的任何抗PD-1抗体(例如，纳武单抗)结合相同的表位。抗体交叉竞争结合抗原的能力指示这些单克隆抗体结合抗原的相同表位区域并且在空间上阻碍其他交叉竞争抗体与该特定表位区域的结合。预期这些交叉竞争抗体由于它们结合PD-1的相同表位区域而具有与参考抗体(例如，纳武单抗)非常相似的功能特性。在标准PD-1结合测定(如Biacore分析、ELISA测定或流式细胞术)中可以基于交叉竞争抗体与纳武单抗交叉竞争的能力容易地鉴定它们(参见例如，WO 2013/173223)。
在某些方面，与纳武单抗交叉竞争与人PD-1的结合或与纳武单抗结合人PD-1抗体的相同表位区域的抗体是单克隆抗体。对于施用于人受试者，这些交叉竞争抗体是嵌合抗体、工程化抗体或者人源化抗体或人抗体。可以通过本领域熟知的方法来制备和分离此类嵌合、工程化、人源化或人单克隆抗体。
可用于所公开的公开文本的方法中的抗PD-1抗体还包括上述抗体的抗原结合部分。已经充分地证明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。
适用于所公开的组合物和方法的抗PD-1抗体是以高特异性和亲和力与PD-1结合、阻断PD-L1和或PD-L2的结合并抑制PD-1信号传导途径的免疫抑制作用的抗体。在本文所公开的任何组合物或方法中，抗PD-1“抗体”包括与PD-1受体结合并且在抑制配体结合和上调免疫系统方面展现出与完整抗体相似的功能特性的抗原结合部分或片段。在某些方面，所述抗PD-1抗体或其抗原结合部分与纳武单抗交叉竞争与人PD-1的结合。
在某些方面，PD1/PD-L1轴拮抗剂是PD-L1的拮抗剂。本领域已知的抗PD-L1抗体可以用于本公开文本的组合物和方法中。可用于本公开文本的组合物和方法中的抗PD-L1抗体的例子包括美国专利号9,580,507中披露的抗体。已经证明美国专利号9,580,507中披露的抗PD-L1人单克隆抗体展现出以下特征中的一种或多种：(a)以1x10-7M或更小的KD与人PD-L1结合，如使用Biacore生物传感器系统通过表面等离子体共振确定的；(b)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中增加T细胞增殖；(c)在MLR测定中增加干扰素-γ产生；(d)在MLR测定中增加IL-2分泌；(e)刺激抗体应答；以及(f)逆转T调节细胞对T细胞效应细胞和/或树突细胞的作用。可用于本公开文本中的抗PD-L1抗体包括与人PD-L1特异性结合并且展现出前述特征中的至少一种、在一些方面至少五种的单克隆抗体。
在某些方面，抗PD-L1抗体选自：BMS-936559(也称为12A4，MDX-1105；参见例如U.S.专利号7,943,743和WO 2013/173223)、阿特珠单抗(Roche；也称为
Figure BDA0003703349300000241
MPDL3280A,RG7446；参见US 8,217,149；还参见Herbst等人(2013)J Clin Oncol 31(suppl):3000)、度伐鲁单抗(AstraZeneca；也称为IMFINZITM,MEDI-4736；参见WO 2011/066389)、阿维鲁单抗(Pfizer；也称为
Figure BDA0003703349300000251
MSB-0010718C；参见WO 2013/079174)、STI-1014(Sorrento；参见WO2013/181634)、CX-072(Cytomx；参见WO2016/149201),KN035(3D Med/Alphamab；参见Zhang等人,Cell Discov.7:3(2017年3月)、LY3300054(Eli Lilly Co.；参见例如WO 2017/034916)、BGB-A333(BeiGene；参见Desai等人,JCO 36(15suppl):TPS3113(2018))和CK-301(Checkpoint Therapeutics；参见Gorelik等人,AACR:摘要4606(2016年4月))。
在某些方面，所述PD-L1抗体是阿特珠单抗
Figure BDA0003703349300000252
阿特珠单抗是完全人源化IgG1单克隆抗PD-L1抗体。
在某些方面，所述PD-L1抗体是度伐鲁单抗(IMFINZITM)。度伐鲁单抗是人IgG1κ单克隆抗PD-L1抗体。
在某些方面，所述PD-L1抗体是阿维鲁单抗
Figure BDA0003703349300000253
阿维鲁单抗是人IgG1λ单克隆抗PD-L1抗体。
可用于所公开的方法中的抗PD-L1抗体还包括分离的抗体，其与人PD-L1特异性结合并且与本文所公开的任何抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗、度伐鲁单抗和/或阿维鲁单抗)交叉竞争与人PD-L1的结合。在一些方面，所述抗PD-L1抗体与本文所述的任何抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗、度伐鲁单抗和/或阿维鲁单抗)结合相同的表位。抗体交叉竞争结合抗原的能力指示这些抗体结合抗原的相同表位区域并且在空间上阻碍其他交叉竞争抗体与该特定表位区域的结合。预期这些交叉竞争抗体由于它们结合PD-L1的相同表位区域而具有与参考抗体(例如，阿特珠单抗和/或阿维鲁单抗)非常相似的功能特性。在标准PD-L1结合测定(如Biacore分析、ELISA测定或流式细胞术)中可以基于交叉竞争抗体与阿特珠单抗和/或阿维鲁单抗交叉竞争的能力容易地鉴定它们(参见例如，WO 2013/173223)。
在某些方面，与阿特珠单抗、度伐鲁单抗和/或阿维鲁单抗交叉竞争与人PD-L1的结合或与阿特珠单抗、度伐鲁单抗和/或阿维鲁单抗结合人PD-L1抗体的相同表位区域的抗体是单克隆抗体。对于施用于人受试者，这些交叉竞争抗体是嵌合抗体、工程化抗体或者人源化抗体或人抗体。可以通过本领域熟知的方法来制备和分离此类嵌合、工程化、人源化或人单克隆抗体。
可用于所公开的公开文本的方法中的抗PD-L1抗体还包括上述抗体的抗原结合部分。已经充分地证明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。
适用于所公开的方法的抗PD-L1抗体是以高特异性和亲和力与PD-L1结合、阻断PD-1的结合并且抑制PD-1信号传导途径的免疫抑制作用的抗体。在本文所公开的任何方法中，抗PD-L1“抗体”包括与PD-L1结合并且在抑制受体结合和上调免疫系统方面展现出与完整抗体相似的功能特性的抗原结合部分或片段。在某些方面，所述抗PD-L1抗体或其抗原结合部分与阿特珠单抗、度伐鲁单抗和/或阿维鲁单抗交叉竞争与人PD-L1的结合。
可用于本公开文本的抗PD-L1抗体可以是与PD-L1特异性结合的任何PD-L1抗体，例如与度伐鲁单抗、阿维鲁单抗或阿特珠单抗交叉竞争与人PD-1的结合的抗体，例如与度伐鲁单抗、阿维鲁单抗或阿特珠单抗结合相同表位的抗体。在特定方面，所述抗PD-L1抗体是度伐鲁单抗。在其他方面，所述抗PD-L1抗体是阿维鲁单抗。在一些方面，所述抗PD-L1抗体是阿特珠单抗。
CTLA4拮抗剂
可与DGK抑制剂组合的CTLA4拮抗剂包括以下。
CTLA-4拮抗剂是人CTLA-4的拮抗剂，其通过抑制阴性检查点来刺激免疫应答。拮抗剂可以是任何类型的分子，例如蛋白质、核酸或小分子。在某些实施方案中，CTLA-4拮抗剂是特异性结合人CTLA-4的抗体。
本领域已知的抗-CTLA-4抗体可用于本公开文本的方法中。本公开文本的抗CTLA-4抗体与人CTLA-4结合，从而破坏CTLA-4与人B7受体的相互作用。由于CTLA-4与B7的相互作用转导导致携带CTLA-4受体的T细胞失活的信号，因此相互作用的破坏有效地诱导、增强或延长此类T细胞的激活，从而诱导、增强或延长免疫应答。
以高亲和力与CTLA-4特异性结合的人单克隆抗体已经披露于美国专利号6,984,720中。其他抗CTLA-4单克隆抗体已经描述于例如以下中：美国专利号5,977,318、6,051,227、6,682,736和7,034,121，以及国际公开号WO 2012/122444、WO 2007/113648、WO 2016/196237和WO 2000/037504，将所述文献中的每一篇均通过引用以其整体并入本文。已经证明美国专利号6,984,720中披露的抗CTLA-4人单克隆抗体展现出以下特征中的一种或多种：(a)以至少约107M-1、或约109M-1、或约1010M-1至1011M-1或更高的平衡缔合常数(Ka)所反映的结合亲和力与人CTLA-4特异性结合，如通过Biacore分析确定的；(b)动力学缔合常数(ka)为至少约103、约104或约105m-1s-1；(c)动力学解离常数(kd)为至少约103、约104或约105m-1s-1；以及(d)抑制CTLA-4与B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的结合。可用于本公开文本的抗CTLA-4抗体包括与人CTLA-4特异性结合并展现出前述特征中的至少一种、至少两种或至少三种的单克隆抗体。
在某些方面，所述CTLA-4抗体选自伊匹单抗(也称为
Figure BDA0003703349300000261
MDX-010、10D1；参见美国专利号6,984,720)、MK-1308(Merck)、AGEN-1884(Agenus Inc.；参见WO 2016/196237)以及曲美木单抗(AstraZeneca；也称为替西木单抗(ticilimumab)，CP-675,206；参见WO 2000/037504和Ribas,Update Cancer Ther.2(3):133-39(2007))。在特定方面，所述抗CTLA-4抗体是伊匹单抗。
在特定方面，所述CTLA-4抗体是用于本文所公开的方法中的伊匹单抗。伊匹单抗是完全人IgG1单克隆抗体，所述抗体阻断CTLA-4与其B7配体的结合，从而刺激T细胞激活并改善患有晚期黑色素瘤的患者的总存活期(OS)。
在特定方面，所述CTLA-4抗体是曲美木单抗。
在特定方面，所述CTLA-4抗体是MK-1308。
在特定方面，所述CTLA-4抗体是AGEN-1884。
可用于所公开的方法中的抗CTLA-4抗体还包括分离的抗体，其与人CTLA-4特异性结合并与本文所公开的任何抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗和/或曲美木单抗)交叉竞争与人CTLA-4的结合。在一些方面，所述抗CTLA-4抗体与本文所述的任何抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗和/或曲美木单抗)结合相同的表位。抗体交叉竞争结合抗原的能力指示这些抗体结合抗原的相同表位区域并且在空间上阻碍其他交叉竞争抗体与该特定表位区域的结合。预期这些交叉竞争抗体由于它们结合CTLA-4的相同表位区域而具有与参考抗体(例如，伊匹单抗和/或曲美木单抗)非常相似的功能特性。在标准CTLA-4结合测定(如Biacore分析、ELISA测定或流式细胞术)中可以基于交叉竞争抗体与伊匹单抗和/或曲美木单抗交叉竞争的能力容易地鉴定它们(参见例如，WO 2013/173223)。
在某些方面，与伊匹单抗和/或曲美木单抗交叉竞争与人CTLA-4的结合或与伊匹单抗和/或曲美木单抗结合人CTLA-4抗体的相同表位区域的抗体是单克隆抗体。对于施用于人受试者，这些交叉竞争抗体是嵌合抗体、工程化抗体或者人源化抗体或人抗体。可以通过本领域熟知的方法来制备和分离此类嵌合、工程化、人源化或人单克隆抗体。
可用于所公开的公开文本的方法中的抗CTLA-4抗体还包括上述抗体的抗原结合部分。已经充分地证明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。
适用于所公开的方法的抗CTLA-4抗体是以高特异性和亲和力与CTLA-4结合、阻断CTLA-4的活性并破坏CTLA-4与人B7受体的相互作用的抗体。在本文所公开的任何组合物或方法中，抗CTLA-4“抗体”包括与CTLA-4结合并且在抑制CTLA-4与人B7受体的相互作用和上调免疫系统方面展现出与完整抗体相似的功能特性的抗原结合部分或片段。在某些方面，所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分与伊匹单抗和/或曲美木单抗交叉竞争与人CTLA-4的结合。
CTLA4拮抗剂还包括CTLA4抗体的变体。CTLA4抗体的示例性变体是非岩藻糖基化的抗CTLA4抗体，例如非岩藻糖基化的伊匹单抗，具有在肿瘤内选择性切割的遮盖物的可激活的CTLA4抗体，例如可激活的伊匹单抗，或非岩藻糖基化的可激活的CTLA-4抗体。在WO2014/089113和WO 2018/085555中提供了示例性的非岩藻糖基化和/或可激活的抗CTLA4抗体，例如伊匹单抗。
施用DGKα和/或DGKζ抑制剂和PD1/PD-L1轴或CTLA4拮抗剂
本文所述的化合物，例如根据式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1至34的化合物，和/或其药学上可接受的盐，可以通过适合于待治疗病症的任何方式施用，这可取决于对部位特异性治疗的需要或待递送的化合物的量。
本文还包括一类药物组合物，其包含化合物，例如式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1至34的化合物，和/或其药学上可接受的盐；和一种或多种无毒、药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或佐剂(在本文中统称为“载体”材料)和，如果需要，其他活性成分。化合物，例如式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1至34的化合物，可以通过任何合适的途径，优选以适合于这种途径的药物组合物的形式，并以对预期治疗有效的剂量施用。本文所述的化合物和组合物可以例如在含有常规药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的剂量单位配制品中口服、粘膜、或亲本地(包括血管内、静脉内、腹膜内、皮下、肌内、和胸骨内)施用。例如，药物载体可以含有甘露醇或乳糖和微晶纤维素的混合物。所述混合物可含有额外组分诸如润滑剂(例如硬脂酸镁)和崩解剂(例如交聚维酮)。可将所述载体混合物填充到明胶胶囊中或压制成片剂。药物组合物可例如以口服剂型或输注形式施用。
对于口服施用，本文所述的药物组合物可以呈例如片剂、胶囊、液体胶囊、混悬剂或液体的形式。优选将所述药物组合物制备成含有特定量的活性成分的剂量单位形式。例如，所述药物组合物可以以片剂或胶囊剂提供，所述片剂或胶囊剂包含在从约0.1至1000mg、优选从约0.25至250mg、更优选从约0.5至100mg范围内的量的活性成分。根据患者的状况和其他因素，对于人或其他哺乳动物的合适的日剂量可能有很大差异，但是可以使用常规方法确定。
本文中考虑的任何药物组合物可以例如经由任何可接受且合适的口服制剂口服递送。示例性的口服制剂包括但不限于例如片剂、锭剂、糖锭剂、水性和油性混悬剂、可分散散剂或颗粒剂、乳剂、硬和软胶囊剂、液体胶囊剂、糖浆和酏剂。旨在用于口服给予的药物组合物可以根据本领域已知的用于生产旨在用于口服给予的药物组合物的任何方法制备。为了提供药学上可口的制剂，药物组合物可以含有至少一种选自甜味剂、调味剂、着色剂、缓和剂、抗氧化剂、和防腐剂的试剂。
片剂可以例如通过将至少一种化合物，例如式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1至34的化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐与适合于制造片剂的至少一种无毒的药学上可接受的赋形剂混合来制备。示例性的赋形剂包括但不限于例如惰性稀释剂，例如像碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙和磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如像微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、玉米淀粉和海藻酸；粘合剂，例如像淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮和阿拉伯胶；以及润滑剂，例如像硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。另外，片剂可以是未包衣的，或通过已知技术包衣，以掩盖尝起来令人不快的药物的不良味道，或延迟胃肠道中活性成分的崩解和吸收，从而维持活性成分的作用持续更长时间。示例性的水溶性味道掩蔽材料包括但不限于羟丙基甲基纤维素和羟丙基纤维素。示例性的延时材料包括但不限于乙基纤维素和乙酸丁酸纤维素。
硬明胶胶囊可以例如通过将至少一种化合物，例如式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1至34的化合物，和/或其至少一种盐与至少一种惰性固体稀释剂(例如像碳酸钙、磷酸钙和高岭土)混合来制备。
软明胶胶囊可以例如通过将至少一种化合物，例如式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1至34的化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐与至少一种水溶性载体(例如像聚乙二醇)和至少一种油介质(例如像花生油、液体石蜡和橄榄油)混合来制备。
水性混悬剂可以例如通过将至少一种化合物，例如式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1至34的化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐与适合于生产水性混悬剂的至少一种赋形剂混合来制备。适于制备水性混悬剂的示例性赋形剂包括但不限于例如助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、海藻酸、聚乙烯基吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂，例如天然磷脂例如卵磷脂；环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合产物，例如十七乙烯-氧基鲸蜡醇；环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯；和环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。水性混悬剂还可以含有至少一种防腐剂，例如像对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯；至少一种着色剂；至少一种调味剂；和/或至少一种甜味剂，包括但不限于例如蔗糖、糖精和阿斯巴甜。
油性混悬剂可以例如通过将至少一种化合物，例如式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1至34的化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐悬浮在植物油(例如像花生油、橄榄油、芝麻油和椰子油)或者悬浮在矿物油(例如像液体石蜡)中来制备。油性混悬剂还可以含有至少一种增稠剂，例如像蜂蜡、硬石蜡和十六醇。为了提供可口的油性混悬剂，可以将上文已经描述的至少一种甜味剂和/或至少一种调味剂添加到油性混悬剂中。油性混悬剂还可以含有至少一种防腐剂，包括但不限于例如抗氧化剂，例如像丁基化羟基茴香醚和α-生育酚。
可分散散剂和颗粒剂可以例如通过将至少一种化合物，例如式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1至34的化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐与至少一种分散剂和/或润湿剂、至少一种助悬剂和/或至少一种防腐剂混合来制备。合适的分散剂、润湿剂和悬浮剂已如上文所述。示例性的防腐剂包括但不限于例如抗氧化剂，例如抗坏血酸。此外，可分散散剂和颗粒剂还可以含有至少一种赋形剂，包括但不限于例如甜味剂、调味剂和着色剂。
至少一种化合物，例如式(I)或(II)的化合物，例如选自化合物1至34的化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐的乳剂可以例如制备成水包油乳剂。包含式(I)或(II)的化合物，诸如选自化合物1至34的化合物的乳剂的油相可以由已知成分按已知方式构成。油相可以通过但不限于例如植物油(例如像橄榄油和花生油)、矿物油(例如像液体石蜡)及其混合物来提供。虽然所述相可以仅包含乳化剂，但是它可以包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油二者的混合物。合适的乳化剂包括但不限于例如天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂；衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如像脱水山梨糖醇单油酸酯；以及偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如像聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。优选地，亲水性乳化剂与亲脂性乳化剂一起被包括，所述亲脂性乳化剂充当稳定剂。还优选的是包含油和脂肪两者。一种或多种乳化剂与或不与一种或多种稳定剂一起构成所谓的乳化蜡，并且蜡与油和脂肪一起构成所谓的乳化软膏基质，其形成乳膏配制品的油性分散相。乳剂还可以含有甜味剂、调味剂、防腐剂和/或抗氧化剂。适用于用于治疗方法的配制品中的乳化剂和乳液稳定剂包括Tween 60、Span 80、鲸蜡硬脂醇、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸钠、单独或与蜡一起的二硬脂酸甘油酯或本领域熟知的其他材料。
所述化合物，例如式(I)或(II)的那些，诸如选自化合物1至34的化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐，还可以例如通过任何药学上可接受的且合适的可注射形式静脉内、皮下和/或肌内递送。示例性的可注射形式包括但不限于例如无菌水溶液，其包含可接受的媒介物和溶剂，例如像水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液；无菌水包油微乳剂；以及水性或油性混悬剂。
用于肠胃外施用的配制品可以呈水性或非水性等渗无菌注射溶液或混悬剂的形式。这些溶液和混悬剂可以使用提及用于在供口服施用的配制品中使用的一种或多种载体或稀释剂或者通过使用其他合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂由无菌散剂或颗粒剂制备。可以将化合物溶解在水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苯甲醇、氯化钠、黄芪胶和/或各种缓冲液中。其他佐剂和施用方式是制药领域中熟知且熟知的。活性成分也可以通过注射作为与合适的载体(包括盐水、右旋糖或水)或与环糊精(即Captisol)、共溶剂增溶(即丙二醇)或胶束增溶(即Tween 80)的组合物来施用。
无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬剂，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。所述可接受的可使用的媒介物和溶剂为水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌不挥发油通常用作溶剂或混悬介质。就该目的而言，可使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，脂肪酸(诸如油酸)可用于制备注射剂。
无菌可注射水包油型微乳剂可例如如下制备：1)将至少一种化合物，例如式(I)或(II)的化合物，例如选自化合物1至34的化合物，和/或其药学上可接受的盐，溶解于油相(例如大豆油与卵磷脂的混合物)中；2)将含有化合物，例如式(I)的化合物，和/或其药学上可接受的盐的油相与水和甘油的混合物组合；和3)处理该组合以形成微乳剂。
可以根据本领域已知的方法制备无菌水性或油性混悬剂。例如，可以用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(例如像1,3-丁二醇)制备无菌水溶液或混悬剂；并且可以用无菌无毒可接受溶剂或悬浮介质(例如像无菌非挥发性油，例如合成的甘油单酯或甘油二酯；和脂肪酸，例如像油酸)制备无菌油性混悬剂。
可用于药物组合物的药学上可接受的载体、佐剂和媒介物包括但不限于离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，自乳化药物递送系统(SEDDS)诸如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，用于药物剂型的表面活性剂诸如Tween类，聚乙氧基化蓖麻油诸如CREMOPHOR表面活性剂(BASF)，或其他类似的聚合物递送基质，血清蛋白诸如人血清白蛋白，缓冲物质诸如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水、盐或电解质(诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)，胶体二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。也可有利地使用环糊精诸如α-、β-和γ-环糊精或化学改性衍生物诸如羟基烷基环糊精(包括2-和3-羟基丙基环糊精)或其他可溶性衍生物以有助于递送具有在此所述式的化合物。
本文所述的药学活性化合物可根据药学常规方法加工以产生用于施用于患者(包括人类和其他哺乳动物)的药物。所述药物组合物可以经受诸如灭菌的常规制药操作和/或可以含有常规佐剂，诸如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲液等。此类组合物还可以包含佐剂，诸如润湿剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
所施用的化合物量和用本文所述的化合物和/或组合物对疾病病症进行治疗的给药方案取决于多种因素，包括受试者的年龄、体重、性别和医学状态、疾病类型、疾病严重性、施用途径和频率以及所使用的具体化合物。因此，所述给药方案可变化很大，但是可使用标准方法来常规确定。约0.001至100mg/kg体重、优选约0.0025与约50mg/kg体重之间、并且最优选约0.005至10mg/kg体重之间的日剂量可能是适当的。日剂量可以按一至四剂/天施用。其他给药时间安排包括每周一剂和每两天一剂。
出于治疗目的，通常将本文所述的活性化合物与一种或多种适于所指示的施用途径的佐剂组合。若口服施用，则可将所述化合物与乳糖、蔗糖、淀粉粉末、烷酸纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮和/或聚乙烯醇混合，然后压片或包囊以方便施用。此类胶囊剂或片剂可以含有控释配制品，其可以在活性化合物在羟丙基甲基纤维素中的分散体中提供。
本文所述的药物组合物包含至少一种化合物，例如式(I)化合物，和/或其至少一种药学上可接受的盐，和任选的选自任何药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的另外药剂。本文所述的替代组合物包含化合物，例如式(I)或(II)的化合物，诸如选自本文所述的化合物1至34的化合物，或其前药，以及药学上可接受的载体、佐剂或媒介物。
在一些方面，将本文所述的治疗方法中使用的抗PD-L1抗体以范围为约0.1mg/kg至约20.0mg/kg体重、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、约14mg/kg、约15mg/kg、约16mg/kg、约17mg/kg、约18mg/kg、约19mg/kg或约20mg/kg的剂量大约每2、3、4、5、6、7或8周施用一次。
在一些方面，将所述抗PD-L1抗体以约15mg/kg体重的剂量大约每3周施用一次。在其他方面，将所述抗PD-L1抗体以约10mg/kg体重的剂量大约每2周施用一次。
在其他方面，可用于本公开文本的抗PD-L1抗体是平剂量。在一些方面，将所述抗PD-L1抗体以约200mg至约1600mg、约200mg至约1500mg、约200mg至约1400mg、约200mg至约1300mg、约200mg至约1200mg、约200mg至约1100mg、约200mg至约1000mg、约200mg至约900mg、约200mg至约800mg、约200mg至约700mg、约200mg至约600mg、约700mg至约1300mg、约800mg至约1200mg、约700mg至约900mg或约1100mg至约1300mg的平剂量施用。在一些方面，将所述抗PD-L1抗体以至少约240mg、至少约300mg、至少约320mg、至少约400mg、至少约480mg、至少约500mg、至少约560mg、至少约600mg、至少约640mg、至少约700mg、至少720mg、至少约800mg、至少约840mg、至少约880mg、至少约900mg、至少960mg、至少约1000mg、至少约1040mg、至少约1100mg、至少约1120mg、至少约1200mg、至少约1280mg、至少约1300mg、至少约1360mg或至少约1400mg的平剂量以约1、2、3或4周的给药间隔施用。在一些方面，将所述抗PD-L1抗体以约1200mg的平剂量大约每3周施用一次。在其他方面，将所述抗PD-L1抗体以约800mg的平剂量大约每2周施用一次。在其他方面，将所述抗PD-L1抗体以约840mg的平剂量大约每2周施用一次。
在一些方面，将阿特珠单抗以约1200mg的平剂量大约每3周施用一次。在一些方面，将阿特珠单抗以约800mg的平剂量大约每2周施用一次。在一些方面，将阿特珠单抗以约840mg的平剂量大约每2周施用一次。
在一些方面，将阿维鲁单抗以约800mg的平剂量大约每2周施用一次。
在一些方面，将度伐鲁单抗以约10mg/kg的剂量大约每2周施用一次。在一些方面，将度伐鲁单抗以约800mg/kg的平剂量大约每2周施用一次。在一些方面，将度伐鲁单抗以约1200mg/kg的平剂量大约每3周施用一次。
在一些方面，将在本文所述的治疗方法中使用的抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以范围从0.1mg/kg至10.0mg/kg体重的剂量每2、3、4、5、6、7或8周施用一次。在一些方面，将所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以1mg/kg或3mg/kg体重的剂量每3、4、5或6周施用一次。在一个方面，将所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以3mg/kg体重的剂量每2周施用一次。在另一方面，将所述抗PD-1抗体或其抗原结合部分以1mg/kg体重的剂量每6周施用一次。
在一些方面，将所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以平剂量施用。在一些方面，将所述抗CTLA-4抗体以约10至约1000mg、约10mg至约900mg、约10mg至约800mg、约10mg至约700mg、约10mg至约600mg、约10mg至约500mg、约100mg至约1000mg、约100mg至约900mg、约100mg至约800mg、约100mg至约700mg、约100mg至约100mg、约100mg至约500mg、约100mg至约480mg或约240mg至约480mg的平剂量施用。在一个方面，将所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以至少约60mg、至少约80mg、至少约100mg、至少约120mg、至少约140mg、至少约160mg、至少约180mg、至少约200mg、至少约220mg、至少约240mg、至少约260mg、至少约280mg、至少约300mg、至少约320mg、至少约340mg、至少约360mg、至少约380mg、至少约400mg、至少约420mg、至少约440mg、至少约460mg、至少约480mg、至少约500mg、至少约520mg至少约540mg、至少约550mg、至少约560mg、至少约580mg、至少约600mg、至少约620mg、至少约640mg、至少约660mg、至少约680mg、至少约700mg或至少约720mg的平剂量施用。在另一方面，将所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以平剂量约每1、2、3、4、5、6、7或8周一次施用。
在一些方面，将伊匹单抗以约3mg/kg的剂量大约每3周施用一次。在一些方面，将伊匹单抗以约10mg/kg的剂量大约每3周施用一次。在一些方面，将伊匹单抗以约10mg/kg的剂量大约每12周施用一次。在一些方面，将伊匹单抗施用四个剂量。
化合物的制备方法
本文所述的化合物可通过有机化学领域的技术人员可用的多种方法来合成。制备本文涵盖的通用合成方案如下所述。这些方案是说明性的，并且不意在限制本领域技术人员可用于制备本文公开的化合物的可能技术。制备本文涵盖的化合物的不同方法对于本领域技术人员而言将是清楚的。通过通用方案中描述的方法制备的化合物的实施例在下文列出的实施例部分中给出。纯手性实施例的制备可以通过本领域技术人员已知的技术进行。例如，可以通过手性相制备型HPLC分离外消旋产物或非对映体来制备纯手性化合物。可替代地，可以通过已知的方法制备实施例化合物，以得到对映异构体或非对映异构体富集的产物。
本章节所述的反应和技术在适合于所用试剂和材料的溶剂中进行，并且适用于所进行的转化。此外，在下文给出的合成方法的描述中，应理解，所有提出的反应条件(包括选择溶剂、反应气氛、反应温度、实验的持续时间和后处理程序)被选择为对于该反应为标准的条件，本领域技术人员应当容易地认识到这一点。有机合成领域的技术人员应理解，分子的各部分上存在的官能团必须与所提出的试剂和反应相容。对与反应条件相容的取代基的此类限制对于本领域技术人员而言应是容易地清楚的，其中当存在不相容的取代基时需要替代方案。这将有时需要做出判断来修改合成步骤的顺序或选择一种特定的工艺方案而不是另一种，以便获得所希望的化合物。还将认识到，在此领域的任何合成途径的规划中的另一个主要考虑因素是明智地选择用于保护本文所述化合物中存在的反应性官能团的保护基团。为受过培训的从业者描述许多替代方案的权威解释是Wuts和Greene,Greene’sProtective Groups in Organic Synthesis,第四版,Wiley and Sons(2007)。
实施例
以下实施例说明了本公开文本的具体和优选实施方案，并不限制本公开的范围。除非另有说明，否则化学缩写和符号以及科学缩写和符号具有其通常和习惯的含义。本文定义了实施例和本申请其他地方采用的另外的缩写。常用中间体通常可用于制备多于一个实施例并且依序标识(例如，中间体1、中间体2等)并且缩写为Int.1或I1、Int.2或I2等。在一些情况下，描述中间体或实施例的替代制备。经常，合成领域的化学技术人员可以基于一种或多种考虑因素设计可能希望的替代制备，所述一种或多种考虑因素诸如较短的反应时间、较低廉的起始材料、易于操作或分离、提高产率、适合于催化、避免毒性试剂、专用仪器的可得性、和减少数量的线性步骤等。描述替代制法的意图进一步使得能够制备本公开文本的实施例。在一些情况下，概述的实施例和权利要求中的一些官能团可以用本领域已知的众所周知的生物等排替代方式(例如，用四唑或磷酸酯部分替代羧酸基团)替代。在氘代二甲基亚砜中收集的1H NMR数据在数据处理时使用水抑制。所报告的光谱未针对水抑制作用进行校正。与3.35ppm的水抑制频率相邻的质子展现出降低的信号强度。
缩写
Ac 乙酰基
anhyd. 无水的
aq. 水性
aza-HOBt 7-氮杂-1-羟基苯并三唑
Bn 苄基
1-BOC-哌嗪 哌嗪-1-甲酸叔丁酯
Bu 丁基
CV 柱体积
DCE 二氯乙烷
DCM 二氯甲烷
DEA 二乙胺
DIEA 二异丙基乙胺(Hunig碱)
DIPEA 二异丙基乙胺
DMA N,N-二甲基乙酰胺
DMF 二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
EA 乙酸乙酯
EDC 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
Et 乙基
h、hour或hr 小时
HATU (1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐)
HCl 盐酸
HPLC 高压液相色谱法
KHMDS 双(三甲基甲硅烷基)氨基钾
LC 液相色谱法
LCMS 液相色谱-质谱法
M 摩尔
mM 毫摩尔
Me 甲基
MHz 兆赫
mins 分钟
M+1 (M+H)+
MS 质谱法
n或N 正常
NaHMDS 双(三甲基甲硅烷基)酰胺钠
NBS N-溴代琥珀酰亚胺
nM 纳摩尔
NMP N-甲基吡咯烷酮
Ph 苯基
PYBROP 溴三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
RuPhos预催化剂 氯(2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II)
RT或Ret时间 保留时间
sat. 饱和的
t-BuOH 叔丁醇
TEA 三乙胺
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TLC 薄层色谱法
POCl3 三氯氧磷
第2代Xphos CAS号1310584-14-5
实施例1：在同种异体反应性MLR测定中，DGKi增强纳武单抗和伊匹单抗的活性
该实施例表明，DGK的抑制增强PD-1和CTLA-4抑制剂的活性，如由MLR测定中分泌的干扰素-γ(IFN-γ)水平增加所证明的。
该测定如下进行。使用Ficoll细胞分离从EDTA处理的全血中分离外周血单核细胞。使用Stemcell EasySep人T细胞富集试剂盒(Stemcell 19051)将细胞进一步分离为T细胞。将先前购买的冷冻单核细胞解冻并在37℃ CO2培养箱中用GMCSF和IL-4处理六天而分化成树突细胞(DC)。将T细胞以每孔100,000个细胞铺板到10％FBS RPMI培养基中的96孔圆底板中。将同种异体树突细胞以10:1的T细胞:未成熟DC比率添加到适当的孔中。将DGK抑制剂DGKi化合物15在DMSO中稀释，然后进一步稀释到10％FBS RPMI培养基中，并添加到T细胞:未成熟DC的适当孔中，最终DMSO浓度为0.1％，最终体积为250μl。将混合淋巴细胞反应置于培养箱中5天。第5天，移出130μl培养基，并且将10μl用于IFN-γELISA测定(BD cat555142)。
图1A和B所示的结果表明，DGK的抑制提高用PD-1或CTLA-4抑制剂处理的T细胞的IFN-γ分泌水平。
实施例2：在B16动物肿瘤模型中，DGK的抑制增强PD-1拮抗剂和CTLA4拮抗剂的组合活性
该实施例表明，相对于PD-1拮抗剂和CTLA4拮抗剂的组合，与PD-1拮抗剂和CTLA4拮抗剂同时施用DGKi产生增强的肿瘤减小活性。
该测定在B16肿瘤模型(人黑色素瘤模型)中进行。对小鼠施用抗PD-1抗体(针对小鼠PD-1的mIgG1-D265A单克隆抗体)、抗CTLA4抗体(针对小鼠CTLA4的mIgG2b单克隆抗体)、仅媒介物和/或DGKi，并且测量肿瘤生长。图2A-G所示的结果表明，使用单独的药剂或两种药剂的组合没有观察到显著的肿瘤减小，但是将DGKi与抗PD-1抗体和抗CTLA4抗体组合导致肿瘤减小(图2G)。
实施例3：在CT26动物肿瘤模型中，DGK的抑制增强PD-1抑制剂和/或CTLA-4抑制剂的活性
该实施例表明，在CT26模型中，施用DGK抑制剂增强由抗PD-1和/或抗CTLA4抗体诱导的肿瘤减小。
如下进行测定：将CT26细胞(来自ATCC的鼠结直肠癌细胞系)在10％胎牛血清(Invitrogen/ThermoFisher Scientific)和RPMI 1640培养基(Gibco/ThermoFisherScientific)中培养。从Envigo获得的雌性BALB/c小鼠达到6-8周龄。对于肿瘤植入(第0天)，以1x107个细胞/mL向小鼠右胁腹皮下注射0.1mL CT26细胞悬液。当肿瘤生长到约100mm3的预定体积时，通常在植入后10天左右，将小鼠随机化并分类到不同的对照组和治疗组，并且开始给药。DGKi化合物16在90％PEG400、5％乙醇和5％TPGS中配制，并且以10mL/kg体重的体积口服给予。将抗CTLA4(抗mCTLA4，mIgG2b)和抗PD1(针对小鼠PD-1的mIgG1-D265A单克隆抗体)和同种型对照用DPBS稀释至10mg/kg的剂量。通过腹膜内注射(I.P.)施用抗体疗法，每4天一次，共3剂(Q4Dx3)。每周两次用数显卡尺测量肿瘤体积，直到肿瘤已完全消退(0mm3)或达到1000mm3并且实施安乐死。对于AH1四聚体染色，从每只小鼠收集100μL血液到肝素锂管中。将血液用AH1四聚体(MBL)、抗Cd3、抗cd4和抗Cd8(Biolegend)染色。使用Lyse/Fix缓冲液(BD)裂解样品，并且在CantoX细胞仪(BD)上采集样品，并且在FlowJo(BD)中进行分析。
图3A-H所示的结果表明在CT26小鼠模型中，DGKi增强由(i)PD1抑制剂；(ii)CTLA-4抑制剂；(iii)PD1抑制剂和CTLA-4抑制剂诱导的肿瘤体积减小。图3I示出的结果表明DGKi增加了对AH1+四聚体肿瘤抗原呈阳性的CD8细胞的百分比。因此，在CT26模型中，联合治疗产生改善的完全应答并且与增加的AH1+T细胞相关。DGK抑制剂与CTLA4拮抗剂和PD1拮抗剂两者的组合产生最高数量的完全应答，即10个完全应答中有10个。
实施例4：DGK的抑制降低TCR激活所需的抗原阈值
该实施例表明，DGK抑制(1)增强由弱肿瘤抗原诱导的T细胞应答并且(2)降低T细胞激活所需的肿瘤抗原浓度。
该测定如下进行：从10％胎牛血清(Invitrogen/ThermoFisher Scientific)和RPMI 1640培养基(Gibco/ThermoFisher Scientific)中获得MC38细胞(鼠结肠腺癌细胞)并在其中培养。从AnaSpec获得OVA和异变(heteroclitic)肽变体，并且根据制造商的方案重新悬浮。将MC38细胞用1μg/mL肽或指定浓度脉冲3小时，然后洗掉游离肽。从JacksonLabs获得OT1小鼠(其是I类限制性TCR转基因的/C57B16背景，具有对卵清蛋白(OVA(SIINFEKL)或OVA肽的以下衍生物：A2(SAINFEKL)、Q4(SIIQFEKL)、T4(SIITFEKL)、Q4H7(SIIQFEHL)特异性的TCR，但不识别乱序肽FILKSINE)。这些肽的TCR结合亲和力如下表所示。将CD8 T细胞从OT1小鼠的总脾细胞(StemCell)中纯化，并且使用CD3/CD28珠(Invitrogen)激活，然后冷冻。将冷冻激活的OT-1CD8 T细胞在肽脉冲期间解冻并且用DGKi化合物15或对照化合物或DMSO铺板1小时。将MC38蛋白脉冲细胞添加到板中并且在37℃下共培养过夜。收集上清液并且使用AlphaLISA(PerkinElmer)测量IL-2。
肽 序列 K<sub>D</sub>(μM)
OVA SIINFEKL 1
A2 SAINFEKL 4
Q4 SIIQFEKL 36
T4 SIITFEKL 122
Q4H7 SIIQFEHL 167
乱序的 FILKSINE n.m.
图4A-F所示的结果表明，DGKi化合物15降低对T细胞抗原识别和激活的亲和力要求和抗原浓度要求两者。
实施例5：DGK的抑制增加人CTL效应子功能并且增强肿瘤细胞杀伤
该实施例表明，DGK的抑制增加CTL效应子功能和肿瘤细胞杀伤。
如下进行测定：从Cellomics获得HCT116-GFP(人结直肠癌)细胞。将HCT116-GFP用指定浓度的A2和B35肽(Astarte)脉冲1小时，接着冲洗。将细胞铺板并且使其粘附过夜。将CMV特异性人CD8 T细胞(Astarte)解冻，用DGKi化合物15处理1小时，然后添加到HCT116-GFP细胞中。在共培养后24小时收集上清液并且使用AlphaLISA(PerkinElmer)测量IFNg。使用荧光显微镜拍摄GFP的图像。
图5A和B所示的结果表明，DGKi化合物15增加人CTL效应子功能并且增强肿瘤细胞杀伤。
实施例6：DGK的抑制可以克服B2M水平降低以恢复T细胞效应子功能
许多人类肿瘤具有导致部分或完全丧失I类MHC的突变，I类MHC对T细胞识别和杀死肿瘤细胞是至关重要的。该实施例表明，DGK的抑制使T细胞能够识别具有较低MHC水平的肿瘤细胞。这些靶细胞不会被T细胞识别。
测定如下进行：从Cellomics获得HCT116-GFP并且在10％胎牛血清(Invitrogen/ThermoFisher Scientific)和RPMI 1640培养基(Gibco/ThermoFisher Scientific)中培养。通过核转染(Lonza)将B2M向导RNA(Synthego)引入HCT116-GFP细胞中。恢复后，将细胞铺板在各个孔中以产生单细胞克隆。对克隆进行B2M(Biolegend)染色并且通过流式细胞术进行评估。将克隆然后用1mg/mL的A2或B35肽(Astarte)脉冲1小时，接着冲洗。将细胞铺板并且使其粘附过夜。将CMV特异性人CD8 T细胞(Astarte)解冻，用DGKi化合物15处理1小时，然后添加到HCT116细胞中。在共培养后24小时收集上清液并且使用AlphaLISA(PerkinElmer)测量IFN-γ。
图6A和B所示的结果表明，DGKi化合物15增加了来自识别具有减少的I类MHC抗原的肿瘤细胞的T细胞的IFN-γ水平。
实施例7：凭借DGK抑制和PD1拮抗剂的治愈性肿瘤活性依赖于CD8+T细胞该实施例表明在CT26动物模型中，治愈性肿瘤活性依赖于CD8+T细胞。
如下进行测定：将CT26细胞(来自ATCC)在10％胎牛血清(Invitrogen/ThermoFisher Scientific)和RPMI 1640培养基(Gibco/ThermoFisher Scientific)中培养。从Envigo获得的雌性BALB/c小鼠达到6-8周龄。对于肿瘤植入(第0天)，以1x 107个细胞/mL向小鼠右胁腹皮下注射0.1mL CT26细胞悬液。将CD8耗竭性抗体(2.43，BioXCell)在PBS中稀释并且以100μg/小鼠给药。在第1天开始给药，并且每3-4天继续给药，直到研究完成。当肿瘤生长到约100mm3的预定体积时，通常在植入后10天左右，将小鼠随机化并分类到不同的对照组和治疗组，并且开始给药。将DGKi化合物16在90％PEG400、5％乙醇和5％TPGS中配制，并且以10mL/kg体重的体积口服给予，每3天一次，共5剂(Q3Dx5)，剂量为5mg/kg。将抗PD1抗体(针对小鼠PD-1的mIgG1-D265A单克隆抗体)和同种型对照用DPBS稀释至10mg/kg的剂量。通过腹膜内注射(I.P.)施用抗体疗法，每4天一次，共3剂(Q4Dx3)。每周两次用数显卡尺测量肿瘤体积，直到肿瘤已完全消退(0mm3)或达到1000mm3并且实施安乐死。
图7所示的结果表明，通过用抗PD-1拮抗剂和DGKi化合物16处理CT26小鼠获得的肿瘤体积减小通过CD8+细胞的耗竭而减少。
实施例8：凭借DGK抑制和PD1拮抗剂的肿瘤体积减小通过CD4细胞耗竭而增强
本实施例表明，通过DGK抑制剂和PD-1拮抗剂的组合获得的肿瘤减小通过CD4细胞的耗竭而进一步增强。
如下进行测定：将CT26细胞(来自ATCC)在10％胎牛血清(Invitrogen/ThermoFisher Scientific)和RPMI 1640培养基(Gibco/ThermoFisher Scientific)中培养。从Envigo获得的雌性BALB/c小鼠达到6-8周龄。对于肿瘤植入(第0天)，以1x 107个细胞/mL向小鼠右胁腹皮下注射0.1mL CT26细胞悬液。将CD4耗竭性抗体(GK1.5，BioXCell)在PBS中稀释并且以100μg/小鼠给药。在第1天开始给药，并且每3-4天继续给药，直到研究完成。当肿瘤生长到约100mm3的预定体积时，通常在植入后10天左右，将小鼠随机化并分类到不同的对照组和治疗组，并且开始给药。将DGKi化合物16在90％PEG400、5％乙醇和5％TPGS中配制，并且以10mL/kg体重的体积口服给予，每3天一次，共5剂(Q3Dx5)，剂量为5mg/kg。将抗PD1(针对小鼠PD-1的mIgG1-D265A单克隆抗体)和同种型对照(MOPC-21，BioXCell)用DPBS稀释至10mg/kg的剂量。通过腹膜内注射(I.P.)施用抗体疗法，每4天一次，共3剂(Q4Dx3)。每周两次用数显卡尺测量肿瘤体积，直到肿瘤已完全消退(0mm3)或达到1000mm3并且实施安乐死。
图8所示的结果表明，通过用抗PD-1拮抗剂和DGKi化合物16处理MC38小鼠获得的肿瘤体积减小通过CD4+细胞的耗竭而增强，可能是由于Treg细胞的耗竭。
实施例9：DGKi和抗PD1抗肿瘤功效需要NK细胞
该实施例表明在CT26动物模型中，由DGKi和PD1拮抗剂诱导的肿瘤减小活性依赖于NK细胞。
该测定基本上如实施例6和7中所述进行，但不是添加与CD4或CD8结合的抗体，而是从肿瘤注射后第4天开始以50μg/小鼠给药抗去唾液酸-GM1(Life Technologies)，并且继续每7天一次，直到研究结束。
图9所示的结果表明，在CT26小鼠模型中，NK细胞有助于DGKi化合物16与PD1抑制剂组合的抗肿瘤活性。
实施例10：式II的DGKi与抗PD-1或抗CTLA4的组合引发强大的功效
该实施例显示来自化合物17-34的组的示例性式II的DGKi与抗PD-1或抗CTLA4抗体一起在MC38动物模型中具有强抗肿瘤活性。
该测定如下进行。将小鼠结肠腺癌细胞系MC38维持在T75烧瓶中的10％胎牛血清(FBS，Invitrogen)和罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI)1640培养基(Gibco)中。简单地通过使用DPBS(杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水，Gibco)冲洗，让细胞静置几分钟并且轻敲烧瓶，细胞生长至亚融合并且每周传代两次。MC38细胞传代比率范围为1:16至1:20，具体取决于时间和融合度。对于体内植入，将细胞用DPBS冲洗，并且然后将细胞收集在冰上50mL锥形管中的冰冷HBSS(汉克平衡盐溶液，Gibco)中。将管以1300rpm旋转10分钟，小心除去上清液，并且将沉淀用HBSS洗涤并再次旋转。将沉淀重新悬浮在近似植入体积的HBSS中。使用Moxi-Z(Orflo)测量细胞浓度，并且使用HBSS调整至最终浓度。在Countess II(LifeTechnologies)上使用台盼蓝排除法测量细胞活力。将从Charles River Laboratories(纽约州金斯顿)获得的雌性C57Bl/6小鼠在6-8周龄时在内部接受并且适应3-7天。在肿瘤植入时(第0天)，使用带有25号针头的1mL结核菌素注射器以8.5x106个细胞/ml的浓度向小鼠皮下注射0.1mL MC38细胞，植入左胁腹和右胁腹两者。肿瘤生长到预定大小，约78mm，此时在第6天(植入后天数)将动物随机分为具有相似平均和中值肿瘤值的不同治疗组和对照组，其中每组n＝10。在第7天(植入后天数)开始治疗，其中肿瘤为约100mm3。将来自化合物17-34的组的式II的DGKi在90％PEG400、5％乙醇和5％TPGS中配制，并且以10mL/kg体重的体积口服给予，每天一次，共28剂(QDx28)，剂量为0.3mg/kg。将抗PD-1(针对小鼠PD-1的mIgG1-D265A单克隆抗体)、抗CTLA4(针对小鼠CTLA4的mIgG2b单克隆抗体)和相应的同种型对照(InVivoPlus小鼠IgG1，克隆MOPC-21和InVivoMab小鼠IgG2b，克隆MPC-11，(两者都来自BioX Cell(新罕布什尔州西黎巴嫩)抗PD-1和抗CTLA4分别的同种型对照)用DPBS稀释至10mg/kg的剂量。通过腹膜内注射(I.P.)施用抗体疗法，每4天一次，共3剂(Q4Dx3)。每周两次用数显卡尺测量肿瘤体积，直到肿瘤已完全消退(0mm3)或达到1000mm3并且实施安乐死。
图10所示的结果表明，单一药剂产生了适度的功效(图10B-D)，但DGKi与抗PD-1或抗CTLA4抗体的组合引发强大的抗肿瘤活性(分别地图10E和F)。
实施例11：在MC38和CT26动物模型中，式II的化合物与抗PD-1抗体的组合均显示出强抗肿瘤功效和持久免疫记忆
该实施例显示来自化合物17-34的组的示例性式II的DGKi与抗PD-1一起具有强的抗肿瘤功效，其可以在MC38和CT26动物模型中均引起完全的肿瘤消退和持久的免疫记忆。
该研究如下进行。如实施例10所述进行MC38动物模型研究。CT26研究如实施例3所示进行。DGKi和抗PD-1(与实施例10相同)如实施例10制备和施用。在肿瘤体积变化停滞10xTVDT(10x 4.2天＝42天)后，保留来自原始治疗范例的治愈动物。将这些动物以10倍的初始细胞浓度皮下植入右胁腹。将这些动物每周测量两次再持续42天以上的时间段，以评估T细胞记忆应答。
图11A-H所示的结果表明，式II的DGKi与抗PD-1抗体的组合在所测试的动物模型中产生强烈的抗肿瘤作用。此外，在MC38和CT26模型中用肿瘤细胞再次攻击导致移植细胞的100％排斥(图11D和H)。
实施例12：在B16F10动物模型中，式II的化合物与抗PD-1和抗CTLA4的组合相对于与抗PD-1或抗CTLA4的组合提供更强的功效
该实施例显示，在B16F10(黑色素瘤/MHCIlo)动物模型中，来自化合物17-34的组的示例性式II的DGKi与抗PD-1抗体和抗CTLA4抗体的三联组合产生比双联组合更强的抗肿瘤作用。
动物模型研究如下进行。将小鼠黑色素瘤肿瘤细胞系B16F10维持在T75烧瓶中的10％胎牛血清(FBS，Invitrogen)和杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(Gibco)中。简单地通过使用DPBS(杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水，Gibco)冲洗烧瓶，然后用胰蛋白酶(0.25％胰蛋白酶，Gibco)冲洗烧瓶，让细胞静置几分钟并且轻敲烧瓶，细胞生长至亚融合并且每周传代两次。B16F10细胞传代比率范围为1:18至1:20，具体取决于时间和融合度。对于体内植入，如上所述对细胞进行胰蛋白酶化，并且然后将细胞收集在冰上50mL锥形管中的冰冷HBSS(汉克平衡盐溶液，Gibco)中。将管以1300rpm旋转10分钟，小心除去上清液，并且将沉淀用HBSS洗涤并再次旋转。将沉淀重新悬浮在近似植入体积的HBSS中。使用Moxi-Z(Orflo)测量细胞浓度，并且使用HBSS调整至最终浓度。在Countess II(Life Technologies)上使用台盼蓝排除法测量细胞活力。将从Charles River Laboratories(北卡罗来纳州罗利)获得的雌性C57Bl/6小鼠在6-8周龄时在内部接受并且适应3-7天。在肿瘤植入时(第0天)，使用带有25号针头的1mL结核菌素注射器以1x107个细胞/ml的浓度向小鼠皮下注射0.1mLB16.F10细胞，植入右胁腹。当肿瘤生长到预定大小，约50mm3时开始治疗，此时在第8天(植入后天数)将动物随机分为具有相似平均和中值肿瘤值的不同治疗组和对照组，每组n＝10。将来自化合物17-34的组的式II的DGKi在90％PEG400、5％乙醇和5％TPGS中配制，并且以10mL/kg体重的体积口服给予，每天一次，共28剂(QDx28)，剂量为0.3mg/kg。将抗PD-1、抗CTLA4和相应的同种型对照(与实施例10中的相同)用DPBS稀释至10mg/kg的剂量。通过腹膜内注射(I.P.)施用抗体疗法，每4天一次，共3剂(Q4Dx3)。每周两次用数显卡尺测量肿瘤体积，直到肿瘤已完全消退(0mm3)或达到1000mm3并且实施安乐死。
图12A-F所示的结果表明，在B16F10动物模型中，三联疗法相对于双联疗法改善了应答。
实施例13：DGK抑制剂的合成
DGKi化合物1
4-((2R,5S)-4-(双(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-3-甲腈
Figure BDA0003703349300000371
DGKi化合物2
1-(双(4-氟苯基)甲基)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基)哌嗪-2-甲酸甲酯
Figure BDA0003703349300000381
DGKi化合物3
(R)-4-(4-(双(4-氟苯基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-3-甲腈
Figure BDA0003703349300000382
DGKi化合物4
(R)-8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2,7-二甲腈
Figure BDA0003703349300000383
DGKi化合物5
8-[(2S,5R)-4-[(4-氟苯基)(苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000384
DGKi化合物6和7
8-[(2S,5R)-4-[(4-氟苯基)(苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000391
DGKi化合物8
4-[(2S,5R)-4-[(4-氯苯基)(4-氟苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-6-甲氧基-1-甲基-1,2-二氢-1,5-萘啶-2-酮
Figure BDA0003703349300000392
DGKi化合物9
8-[(2S5R)-4-{[2-(二氟甲基)-4-氟苯基]甲基}-25-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-56-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000393
DGKi化合物10
8-[(2S,5R)-4-[(4-氟苯基)(4-甲基苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000401
DGKi化合物11
8-[(2S,5R)-4-[1-(2,6-二氟苯基)乙基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000402
DGKi化合物12-14
8-((2S,5R)-4-(1-(2,4-二氟苯基)丙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000403
中间体1
6-氰基-3-(N-甲基乙酰胺基)吡啶甲酸乙酯
Figure BDA0003703349300000404
在室温下向3-(N-甲基乙酰胺基)-1-(l1-氧烷基)-1l4-吡啶-2-甲酸乙酯(50g，210mmol)在DCM(500mL)中的搅拌的淡黄色溶液中添加三甲基甲硅烷基氰化物(39.4mL，294mmol)。将反应混合物搅拌10min并且将混合物冷却至-10℃。接下来，经15min通过50mL加料漏斗添加苯甲酰氯(34.1mL，294mmol)，然后经20min通过50mL加料漏斗缓慢添加TEA(41.0mL，294mmol)。在TEA添加期间观察到放热反应。反应混合物变成混浊混合物(TEA盐)，将其在相同温度下搅拌2.5h。将反应用10％NaHCO3溶液(500mL)淬灭并用DCM(3x300mL)萃取。将合并的有机溶液用盐水(2x250mL)洗涤，然后经Na2SO4干燥并浓缩，得到浅黄色粗材料。将粗材料通过正相RediSep硅胶柱在
Figure BDA0003703349300000413
上使用EA/石油醚作为洗脱剂进行纯化。将产物通过65-70％EA/石油醚分离，将级分浓缩，得到呈淡棕色液体的6-氰基3-(N-甲基乙酰胺基)吡啶甲酸乙酯(43g，83％产率)；LCMS：m/z＝248.0(M+H)；rt 1.255min；LC-MS方法：柱-KINETEX-XB-C18(75X3mm-2.6μm)；流动相A：10mM甲酸铵于水:乙腈(98:2)中；流动相B：10mM甲酸铵于水:乙腈(2:98)中；梯度：经4分钟20-100％B，流速1.0mL/min，然后在100％B下保持0.6分钟，流速1.5mL/min；然后梯度：经0.1分钟100-20％B，流速1.5mL/min。
中间体2
8-羟基-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000411
在-78℃下经10min向搅拌的6-氰基-3-(N-甲基乙酰胺基)吡啶甲酸乙酯(0.9g，3.64mmol)在四氢呋喃(10mL)中的搅拌溶液中添加KHMDS(4.80mL，4.37mmol)。将反应混合物搅拌15min。经30min将反应混合物缓慢升温至室温，然后再搅拌90min。将反应混合物冷却至0℃。用饱和碳酸氢钠溶液(70mL)淬灭反应。将混合物用乙酸乙酯(2x100mL)稀释。收集水层并用1.5N HCL酸化以将pH调节至约3.0。将混合物搅拌15min形成固体物质，将其通过布氏漏斗过滤，得到呈棕色固体的8-羟基-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈550mg，75％产率)。LCMS：m/z＝202.0(M+H)；rt 0.361min；LC-MS方法：柱-KINETEX-XB-C18(75X3mm-2.6μm)；流动相A：10mM甲酸铵于水:乙腈(98:2)中；流动相B：10mM甲酸铵于水:乙腈(2:98)中；梯度：经4分钟20-100％B，流速1.0mL/min，然后在100％B下保持0.6分钟，流速1.5mL/min；然后梯度：经0.1分钟100-20％B，流速1.5mL/min。
中间体3
8-氯-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000412
向8-羟基-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(0.55g，2.73mmol)在乙腈(10mL)中的搅拌溶液中添加POCl3(1.53mL，16.4mmol)。将反应混合物经5min加热至85℃并搅拌16h。在减压下浓缩反应混合物，得到粗材料。将反应混合物冷却至0℃。用饱和碳酸氢钠溶液(50mL)淬灭反应。用DCM(3x100mL)稀释反应。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并且在减压下蒸发，得到呈棕色固体的8-氯-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(0.25g，29.1％产率)。LCMS：m/z＝220.2(M+H)；rt 1.528min；LC-MS方法：柱-KINETEX-XB-C18(75X3mm-2.6μm)；流动相A：10mM甲酸铵于水:乙腈(98:2)中；流动相B：10mM甲酸铵于水:乙腈(2:98)中；梯度：经4分钟20-100％B，流速1.0mL/min，然后在100％B下保持0.6分钟，流速1.5mL/min；然后梯度：经0.1分钟100-20％B，流速1.5mL/min。
中间体4
立体化学：A
(氰基甲基)三甲基碘化鏻
Figure BDA0003703349300000421
(氰基甲基)三甲基碘化鏻根据Zaragoza,F.等人，J.Org.Chem.2001,66,2518-2521中描述的通用方法制备。在1L圆底烧瓶中，将在甲苯中的三甲基磷烷(100mL，100mmol)用THF(50.0mL)和甲苯(50.0mL)稀释，并且在冰浴上冷却。将反应混合物剧烈搅拌，同时滴加碘乙腈(7mL，16.7g，68.3mmol)，产生棕褐色沉淀物。移除冷却浴并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将烧瓶置于超声发生器中以破碎任何结块的固体。将反应混合物再搅拌4小时。通过过滤收集固体并在真空下干燥，得到(氰基甲基)三甲基碘化鏻(16.6g，68.3mmol，68.3％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.03(d,J＝16.4Hz,2H),2.05(d,J＝15.4Hz,9H)。
中间体5
立体化学：纯手性
8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈，TFA
Figure BDA0003703349300000422
向6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基三氟甲磺酸酯(65g，195mmol)和(2R,5S)-2,5-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(43.9g，205mmol)在乙腈(1.3L)中的溶液中添加DIPEA(0.102L，585mmol)。将溶液在80℃下搅拌6小时。除去溶剂，并且将粗残余物在硅胶上进行色谱分析(在100％乙酸乙酯中的产物Rf 0.4)。获得产物(2R,5S)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基)-2,5-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(75g，189mmol，97％产率)。LCMS：m/z＝398.2(M+H)；rt 2.7min。方法：柱-Kinetex XB-C18(75X3mm-2.6μm)，流速1mL/min；梯度时间4min；20％溶剂B至100％溶剂B；在254nm处监测(溶剂A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；溶剂B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵。
在0℃下向(2R,5S)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基)-2,5-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(30g，75mmol)在乙酸乙酯(1000mL)中的溶液中添加HCl(4M于二噁烷中)(189mL，755mmol)，并且使温度达到室温，同时搅拌6小时。LC/MS分析显示在0.60RT下约90％的产物质量以及在0.44RT下约4％的酰胺副产物质量(与腈水解一致)。将反应混合物用甲基叔丁基醚(MTBE，2000mL)稀释，搅拌15min，并且将产物的HCl盐过滤，用MTBE(100ml)洗涤。将HCl盐溶解在水(300ml)中并使用10％碳酸氢钠水溶液将pH调节至约8。将有机部分用DCM(5x 250ml)萃取。将合并的有机层用水(2x 300mL)洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩，得到8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(20g，65.2mmol，86％产率)。LCMS：m/z＝298.2(M+H)；rt 0.5min。方法：柱-Kinetex XB-C18(75X3mm-2.6μm)，流速1mL/min；梯度时间4min；20％溶剂B至100％溶剂B；在254nm处监测(溶剂A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；溶剂B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(d,J＝8.8Hz,1H),7.70(d,J＝12,3.2Hz,1H),6.29(s,1H),3.80(dd,J＝8.8Hz,1H)3.70(m,1H),3.65(s,3H),3.29(m,2H),2.80(m,2H),1.19(d,J＝6Hz,3H),1.15(d,J＝6Hz,3H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ161.9,155.0,138.5,137.0,128.2,125.0,122.2,117.2,111.3,56.5,51.9,50.0,49.5,29.0,18.8,15.4。
中间体6
8-氯-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000431
在含有8-羟基-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(192mg，0.780mmol)的2打兰小瓶中添加磁力搅拌棒和乙腈(3.1mL)。接下来，将DIEA(0.272mL，1.560mmol)添加到悬浮液中。将反应混合物搅拌1-2分钟直到反应混合物变为均匀的黄色溶液。向反应混合物中添加三氯氧磷(0.131mL，1.404mmol)。将小瓶在氮气下加盖，并且通向油起泡器。将反应混合物在室温搅拌1.5小时，然后将苄基三乙基氯化铵(200mg，0.878mmol)添加到反应混合物中。将小瓶在氮气气氛下加盖，并且浸入油浴(65℃)中并且加热1小时。将反应混合物冷却，并且使用旋转蒸发器在真空中除去反应挥发物。反应残余物溶解在乙酸乙酯中，倒入含有冰(约10mL)的烧杯中，并且然后转移到分液漏斗中。将水相用乙酸乙酯萃取。将有机萃取物合并，并且顺序地用1.5M K2HPO4、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤。将有机萃取物经硫酸镁干燥，过滤，并且在真空中除去溶剂以给出204mg棕色结晶固体。LCMS：柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：100％含0.05％三氟乙酸的水；流动相B：100％含0.05％三氟乙酸的乙腈；温度：40℃；梯度：经1.5分钟2-98％B，然后在98％B下保持0.5分钟；流速：0.8mL/min；检测：在220nm下的UV。保留时间＝1.01min.；观察到的加合物：[M+H]；观察到的质量：265.0(弱离子化)。1H NMR(氯仿-d)δ8.03(d,J＝8.8Hz,1H),7.89-7.97(m,1H),3.82(s,3H)。
中间体7
8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈，TFA
Figure BDA0003703349300000432
向6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基三氟甲磺酸酯(65g，195mmol)和(2R,5S)-2,5-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(43.9g，205mmol)在乙腈(1.3L)中的溶液中添加DIPEA(0.102L，585mmol)。将溶液在80℃下搅拌6小时。除去溶剂，并且将粗残余物在硅胶上进行色谱分析(在100％乙酸乙酯中的产物Rf 0.4)。获得产物(2R,5S)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基)-2,5-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(75g，189mmol，97％产率)。LCMS：m/z＝398.2(M+H)；rt 2.7min。方法：柱-Kinetex XB-C18(75X3mm-2.6μm)，流速1mL/min；梯度时间4min；20％溶剂B至100％溶剂B；在254nm处监测(溶剂A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；溶剂B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵。
在0℃下向(2R,5S)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基)-2,5-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(30g，75mmol)在乙酸乙酯(1000mL)中的溶液中添加HCl(4M于二噁烷中)(189mL，755mmol)，并且使温度达到室温，同时搅拌6小时。LC/MS分析显示在0.60RT下约90％的产物质量以及在0.44RT下约4％的酰胺副产物质量(与腈水解一致)。将反应混合物用甲基叔丁基醚(MTBE，2000mL)稀释，搅拌15min，并且将产物的HCl盐过滤，用MTBE(100ml)洗涤。将HCl盐溶解在水(300ml)中并使用10％碳酸氢钠水溶液将pH调节至约8。将有机部分用DCM(5x250mL)萃取。将合并的有机层用水(2x300mL)洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩，得到8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(20g，65.2mmol，86％产率)。LCMS：m/z＝298.2(M+H)；rt 0.5min。方法：柱-Kinetex XB-C18(75X3mm-2.6μm)，流速1mL/min；梯度时间4min；20％溶剂B至100％溶剂B；在254nm处监测(溶剂A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；溶剂B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(d,J＝8.8Hz,1H),7.70(d,J＝12,3.2Hz,1H),6.29(s,1H),3.80(dd,J＝8.8Hz,1H)3.70(m,1H),3.65(s,3H),3.29(m,2H),2.80(m,2H),1.19(d,J＝6Hz,3H),1.15(d,J＝6Hz,3H)。13C NMR(75MHz,氯仿-d)δ161.9,155.0,138.5,137.0,128.2,125.0,122.2,117.2,111.3,56.5,51.9,50.0,49.5,29.0,18.8,15.4。立体化学：纯手性。
合成DGKi化合物1的方法
4-((2R,5S)-4-(双(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-3-甲腈
Figure BDA0003703349300000441
向6-溴-3-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基三氟甲磺酸酯(80mg，0.194mmol)在乙腈(5mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.102mL，0.582mmol)和(2S,5R)-1-(双(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪的HCl盐(75mg，0.214mmol)。将反应混合物在85℃下搅拌过夜。在减压下除去溶剂并将残余物溶解在乙酸乙酯(15mL)中。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。将粗残余物通过硅胶柱色谱法纯化，使用24g快速柱，用石油醚中的50-80％EtOAc洗脱。将级分在减压下浓缩，得到4-((2R,5S)-4-(双(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-3-甲腈(95mg，85％产率)；LCMS：m/z＝578.2(M+H)；rt 3.916min。
合成DGKi化合物2的方法
1-(双(4-氟苯基)甲基)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基)哌嗪-2-甲酸甲酯
Figure BDA0003703349300000442
在氮气气氛下向8-氯-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(22.90mg，0.104mmol)在DMA(1mL)和叔丁醇(4mL)中的搅拌溶液中添加1-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-2-甲酸甲酯的TFA盐(40mg，0.087mmol)和碳酸铯(85mg，0.261mmol)，接着添加氯(2-二环己基膦基-2′,6′-二异丙氧基-1,1′-联苯基)[2-(2′-氨基-1,1′-联苯基)]钯(II)(3.37mg，4.34μmol)。将反应容器浸入70℃的油浴中。将浴温经2min升至90℃并将反应混合物搅拌16h。将反应混合物通过硅藻土床过滤并在高真空下浓缩，产生棕色胶状物。将粗材料用以下条件经由制备型HPLC纯化：柱：Sunfire C18，19x150mm，5μm颗粒；流动相A：含乙酸的10mM乙酸铵pH 4.5；流动相B：乙腈；梯度：经15分钟30-100％B，然后在100％B下保持5分钟；流量：17mL/min。将含有产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥以得到1-(双(4-氟苯基)甲基)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基)哌嗪-2-甲酸甲酯(3.5mg，6.23μmol，7.17％产率)。LCMS：m/z＝530.2(M+H)；rt 2.20min。LC-MS方法：柱-X Bridge BEH XPC18(50x2.1mm 2.5μm；流速1.1mL/min；梯度时间3min；温度：50℃，0％溶剂B至100％溶剂B；在220nm处监测(溶剂A：95％水:5％乙腈；10mM乙酸铵；溶剂B：5％水:95％乙腈；10mM乙酸铵)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm8.16(d,J＝8.8Hz,1H),8.08(d,J＝9.0Hz,1H),7.57(dd,J＝8.8,5.6Hz,2H),7.42-7.28(m,2H),7.22-7.08(m,4H),6.14(s,1H),5.17(s,1H),4.78(d,J＝12.2Hz,1H),3.64(d,J＝12.0Hz,1H),3.59(s,3H),3.54(s,3H),3.45-3.35(m,2H),3.15(dd,J＝12.5,3.9Hz,1H),3.04(td,J＝11.7,2.9Hz,1H),2.71-2.63(m,1H)。
合成DGKi化合物3的方法
(R)-4-(4-(双(4-氟苯基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-3-甲腈
Figure BDA0003703349300000451
向6-溴-3-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-4-基三氟甲磺酸酯(100mg，0.243mmol)在乙腈(8mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.127mL，0.728mmol)和(R)-1-(双(4-氟苯基)甲基)-2-甲基哌嗪的HCl盐(82mg，0.243mmol)。将反应混合物经5min加热至85℃并搅拌1h。在高真空下浓缩反应混合物，得到棕色胶状物。将粗化合物通过
Figure BDA0003703349300000452
使用12g硅胶柱；60-67％乙酸乙酯/石油醚纯化，得到呈棕色胶状物的(R)-4-(4-(双(4-氟苯基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-3-甲腈(90mg，42.7％产率)；LCMS：m/z＝566.0(M+2H)；rt 2.23min。LC-MS方法：柱-AQUITY UPLC BEH C18(3.0x50mm)1.7μm；流动相A：缓冲液:乙腈(95:5)；流动相B：缓冲液:乙腈(5:95)，缓冲液：10mM乙酸铵；梯度：经2.0分钟20-100％B，然后在100％B下保持0.2分钟，流速0.7mL/min。
合成DGKi化合物4的方法
(R)-8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2,7-二甲腈
Figure BDA0003703349300000461
在氮气下向(R)-4-(4-(双(4-氟苯基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢-1,5-萘啶-3-甲腈(90mg，0.159mmol)在NMP(5mL)中的搅拌溶液中添加锌(2.085mg，0.032mmol)和氰化锌(37.4mg，0.319mmol)。继续用氮气吹扫3min并且添加dppf(5.30mg，9.57μmol)和Pd2(dba)3(14.6mg，0.016mmol)。将反应混合物经5min加热至80℃并搅拌4h。将反应混合物通过硅藻土床过滤并且在高真空下浓缩，得到棕色胶状物。将粗材料通过制备型HPLC纯化。HPLC方法：柱-SUNFIRE C18(150mm x 19mm ID,5μm)；流动相A：10mM乙酸铵于水中；流动相B：乙腈；梯度：经3.0分钟40-60％B，流速17mL/min，然后在60-100％B下保持17分钟，流速17mL/min。将含有产物的级分合并并且在高真空下浓缩。然后将样品用(EtOH\H2O，1:3)稀释并且冻干过夜，得到呈淡黄色固体的(R)-8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)-3-甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2,7-二甲腈(50mg，61.4％产率)。LCMS：m/z＝511.2(M+H)；rt 3.520min。LC-MS方法：柱-KINETEX-XB-C18(75x3mm-2.6μ)；流动相A：10mM甲酸铵于水:乙腈(98:2)中；流动相B：10mM甲酸铵于水:乙腈(2:98)中；梯度：经4分钟20-100％B，流速1.0mL/min，然后在100％B下保持0.6分钟，流速1.5mL/min；然后梯度：经0.1分钟100-20％B，流速1.5mL/min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.26(d,J＝8.8Hz,1H),8.15(d,J＝9.0Hz,1H),7.56(dd,J＝11.9,8.7Hz,2H),7.57(dd,J＝11.7,8.8Hz,2H),7.16(t,J＝8.9Hz,4H),4.90(s,1H),4.10(d,J＝13.0Hz,1H),4.01(d,J＝12.5Hz,1H),3.86(dd,J＝12.2,2.9Hz,1H),3.66-3.55(m,1H),3.53(s,3H),3.08-2.97(m,1H),2.97-2.90(m,1H),2.90(s,1H),1.03(d,J＝6.6Hz,3H)。
合成DGKi化合物5的方法
8-[(2S,5R)-4-[(4-氟苯基)(苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000462
在2打兰密封反应容器中，将8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈,TFA(41.1mg，100μmol)、(4-氟苯基)(苯基)甲醇(28.3mg，140μmol)和(氰基甲基)三甲基碘化鏻(48.6mg，200μmol)在乙腈(200μl)中合并。添加Hunig碱(75μL，429μmol)，并且将反应混合物在110℃加热2小时。将反应混合物直接注射到12g硅胶柱上并且用己烷中的20-100％乙酸乙酯洗脱，得到为非对映异构体混合物的实施例182。分析LC\MS条件：注射体积＝3μL，开始％B 0，最终％B 100，梯度时间2min，流速1mL/min，波长220nm，溶剂对乙腈/水/TFA，溶剂A10％乙腈，90％水/0.05％TFA，溶剂B10％水，90％乙腈/0.05％TFA，柱Acquity BEH C18 21。X 50mm 1.7μm，烘箱温度＝40℃。LC\MS结果；保留时间1.4分钟，观察到的质量482.5(M+)。
将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；梯度：在47％B下保持0分钟，经20分钟47-87％B，然后在100％B下保持4分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥以得到14.4mg标题化合物(30％产率)。计算的分子量481.575。LC\MS条件QC-ACN-TFA-XB：观察到的MS离子482.2，保留时间1.6分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.18-8.10(m,1H),8.06(d,J＝8.8Hz,1H),7.68-7.48(m,4H),7.39-7.26(m,2H),7.25-7.08(m,3H),6.00(s,1H),4.67(br s,1H),4.59(br d,J＝6.7Hz,1H),3.76-3.62(m,1H),3.55(brd,J＝12.8Hz,1H),3.15-3.04(m,1H),2.90-2.81(m,1H),2.36(br dd,J＝17.4,11.9Hz,1H),1.35-1.28(m,3H),1.24(s,1H),1.07(br t,J＝5.6Hz,3H)。
合成DGKi化合物6和7的方法
8-[(2S,5R)-4-[(4-氟苯基)(苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000471
使用手性固相色谱法将实施例5分离成单独的非对映异构体：柱：Chiralpak OJ-H，21x250mm；5微米，流动相：90％CO2/10％甲醇，流量条件：45mL/min，检测器波长：225nm，注射详情：500μL，15mg溶于1mL甲醇/乙腈中。
第一个洗脱的非对映异构体，实施例6(66.4mg)，以20.2％产率被分离。使用分析型LC/MS以确定最终纯度。注射1条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.50min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射1结果：纯度：100.0％；观察到的质量：482.1；保留时间：2.49min。注射2条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B保持0.50min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射2结果：纯度：100.0％；观察到的质量：482.11；保留时间：1.75min。
第二个洗脱的非对映异构体，实施例7(71.7mg)，以21.9％产率被分离。使用分析型LC/MS以确定最终纯度。注射1条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.50min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射1结果：纯度：100.0％；观察到的质量：482.11；保留时间：2.51min。注射2条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B保持0.50min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射2结果：纯度：100.0％；观察到的质量：482.1；保留时间：1.76min。
合成DGKi化合物8的方法
4-[(2S,5R)-4-[(4-氯苯基)(4-氟苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-6-甲氧基-1-甲基-1,2-二氢-1,5-萘啶-2-酮
Figure BDA0003703349300000481
将4-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-6-甲氧基-1-甲基-1,5-萘啶-2(1H)-酮(50mg，0.165mmol)和1-(溴(4-氯苯基)甲基)-4-氟苯(49.5mg，0.165mmol)与二异丙基乙胺(0.173mL，0.992mmol)在乙腈(3mL)中合并，并且将反应混合物在55℃加热过夜。LC/MS表明反应完成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10-mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；梯度：在42％B下保持0分钟，经25分钟42-82％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥。计算的分子量521.03。LC\MS条件QC-ACN-AA-XB：观察到的MS离子521.1，保留时间2.77分钟。
合成DGKi化合物9的方法
8-[(2S,5R)-4-{[2-(二氟甲基)-4-氟苯基]甲基}-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000482
向8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(30mg，0.081mmol)的DMF(2mL)溶液中添加2-(二氟甲基)-4-氟苯甲醛(16.86mg，0.097mmol)。将溶液在室温下搅拌1小时。添加氰基硼氢化钠(15.22mg，0.242mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。LC/MS分析表明反应完成。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10-mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；梯度：在31％B下保持0分钟，经25分钟31-71％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥。产物的产率是13.0mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度是100％。使用分析型LC/MS以确定最终纯度。注射1条件：柱：WatersXBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.50min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射1结果：纯度：100.0％；观察到的质量：456.08；保留时间：1.39min。注射2条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B保持0.50min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射2结果：纯度：100.0％；观察到的质量：456.07；保留时间：2.22min。％B经3min，然后在100％B下保持0.50min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射2结果：纯度：100.0％；观察到的质量：456.07；保留时间：2.22min。
合成DGKi化合物10的方法
8-[(2S,5R)-4-[(4-氟苯基)(4-甲基苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000491
向8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈,TFA(68.6mg，60％wt.，0.1mmol)、(氰基甲基)三甲基碘化鏻(48.6mg，0.200mmol)和(4-氟苯基)(对甲苯基)甲醇(26.0mg，0.120mmol)在乙腈(0.3mL)中的混合物中添加Hunig碱(0.105mL，0.600mmol)。将反应混合物在110℃搅拌2小时，然后第二次添加(氰基甲基)三甲基碘化鏻(48.6mg，0.200mmol)、(4-氟苯基)(对甲苯基)甲醇(26.0mg，0.120mmol)和Hunig碱(0.058mL，0.300mmol)。将反应混合物在110℃再搅拌2小时。将粗反应混合物直接注射到12g Si-RediSep Rf上，通过己烷中的20-100％乙酸乙酯进行快速色谱。合并含有产物的级分并且通过真空干燥。将所得粗材料进一步用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；梯度：在20％B下保持0分钟，经25分钟20-60％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥。非对映体产物TFA盐的产量为47.1mg。
通过SFC-手性色谱法用以下条件将非对映体产物拆分为两种非对映体：柱：手性AD，30x250mm，5微米颗粒；流动相：80％CO2/20％IPA w/0.1％DEA；流速：100mL/min；柱温：25℃。作为第二洗脱峰，>91％de收集标题化合物。计算的分子量495.602。使用分析型LC/MS以确定最终纯度。注射1条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.50min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射1结果：纯度：97.6％；观察到的质量：496.26；保留时间：2.52min。注射2条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B保持0.50min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射2结果：纯度：98.2％；观察到的质量：496.28；保留时间：1.73min。
合成DGKi化合物11的方法
8-[(2S,5R)-4-[1-(2,6-二氟苯基)乙基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000501
向2-(1-溴乙基)-1,3-二氟苯(15.12mg，0.065mmol)和5-甲基-6-氧代-8-(哌嗪-1-基)-5,6-二氢-1,5-萘啶-2,7-二甲腈,TFA(34.0mg，60％wt.，0.05mmol)在乙腈(0.3mL)中的混合物中添加Hunig碱(0.052mL，0.300mmol)。将混合物在55℃下搅拌2小时。LCMS指示完全转化为产物。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10-mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；梯度：在37％B下保持0分钟，经20分钟37-77％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为12.1mg。计算的分子量437.495。使用分析型LC/MS以确定最终纯度。注射1条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.50min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射1结果：纯度：100.0％；观察到的质量：438.14；保留时间：2.36min。注射2条件：柱：Waters XBridgeC18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B保持0.50min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射2结果：纯度：100.0％；观察到的质量：438.14；保留时间：1.2min。
合成DGKi化合物12-14的方法
8-((2S,5R)-4-(1-(2,4-二氟苯基)丙基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000502
向8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(29.7mg，0.1mmol)和1-(1-溴丙基)-2,4-二氟苯(25.9mg，0.110mmol)在乙腈(0.3mL)中的混合物中添加Hunig碱(87μL，0.500mmol)。将混合物在55℃的热板上搅拌16小时。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；梯度：在3％B下保持0分钟，经25分钟3-43％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥。立体化学：非对映体混合物。
DGKi化合物12合成的非对映异构体混合物通过使用SFC-手性色谱法用以下条件下进一步分离以拆分两种纯手性非对映异构体：柱：手性OD，30x250mm，5微米颗粒；流动相：15％IPA/85％CO2w/0.1％DEA；流速：100mL/min；检测器波长：220nm。
收集DGKi化合物13(异构体1)作为95％de中的第一个洗脱液峰。立体化学：纯手性。
收集DGKi化合物14(异构体2)作为95％de的第二个洗脱液峰。立体化学：纯手性。
合成DGKi化合物15的方法
8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000511
将DMF用氮气鼓泡1小时。在1打兰小瓶中装入锌(0.95mg，0.015mmol)、溴(三叔丁基膦)钯(I)二聚体(9.96mg，0.013mmol)和4-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-6-溴-1-甲基-3-硝基-1,5-萘啶-2(1H)-酮(21.38mg，0.037mmol)。添加经鼓泡的DMF(0.3mL)并且将混合物在氮气下加盖并且浸入50℃油浴中15分钟。添加二氰基锌(2.86mg，0.024mmol)。将反应混合物在氮气下加盖并且浸入50℃油浴中3小时。LC/MS分析表明反应完成。用以下条件通过制备型LC/MS纯化粗材料：柱：XBridge C18，19x200mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；梯度：经15分钟50-90％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/分钟。将含有产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥。分离出标题化合物(11.4mg)，产率为59.7％。
替代合成：将8-氯-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈(750mg，2.83mmol)的DMF(6mL)溶液与1-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪(899mg，3.12mmol))组合，然后添加Hunig碱(0.990mL，5.67mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。LC/MS分析表明反应完成。将粗材料过滤并且通过制备型HPLC使用含乙酸铵的乙腈水溶液作为缓冲液进行纯化以得到1.02g黄色固体。使用两次分析型LC/MS注射以确定最终纯度。注射1条件：柱：WatersAcquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；温度：50℃；梯度：经3分钟0-100％B，然后在100％B下保持0.75分钟；流速：1.0mL/分钟；检测：在220nm下的UV。注射2条件：柱：Waters AcquityUPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；温度：50℃；梯度：经3分钟0-100％B，然后在100％B下保持0.75分钟；流速：1.0mL/分钟；检测：在220nm下的UV。注射1结果：纯度：100％；观察到的质量：517.0；保留时间：2.4分钟。注射2结果：纯度：98.4％；观察到的质量：517.0；保留时间：1.7分钟。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.88(d,J＝8.7Hz,1H),7.76(d,J＝8.9Hz,1H),7.40(dd,J＝8.5,5.5Hz,4H),7.02(t,J＝8.7Hz,4H),4.34(s,1H),3.68(s,3H),3.62-3.55(m,4H),2.64(br s,4H)。13C NMR(126MHz,氯仿-d)δ163.0,161.0,155.4,147.0,138.0,137.7,137.7,135.9,132.4,129.5,129.2,129.2,126.0,123.1,116.5,115.8,115.6,74.3,51.6,51.2,29.7。
合成DGKi化合物16的方法
8-[(2S,5R)-4-[双(4-甲基苯基)甲基]-2,5-二甲基哌嗪-1-基]-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈
Figure BDA0003703349300000521
向(氰基甲基)三甲基碘化鏻(46.2mg，0.19mmol)、二对甲苯基甲醇(23.46mg，0.108mmol)和8-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-5-甲基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈,TFA(72.4mg，54％wt，0.095mmol)在乙腈(0.3mL)中的混合物中添加Hunig碱(0.10mL，0.57mmol)。将反应混合物在110℃下搅拌2小时。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10-mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；梯度：在55％B下保持0分钟，经20分钟55-95％B，然后在100％B下保持4分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为23.4mg。计算的分子量491.639。使用分析型LC/MS以确定最终纯度。注射1条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mmx 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；温度：50℃；梯度：经3min0％B至100％B，然后在100％B下保持0.75min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射1结果：纯度：100.0％；观察到的质量：492.21；保留时间：2.77min。注射2条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B保持0.75min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射2结果：纯度：100.0％；观察到的质量：492.2；保留时间：1.71min。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.15(d,J＝8.5Hz,1H),8.04-8.09(m,1H),7.81(s,4H),7.57-7.63(m,2H),7.12-7.19(m,2H),6.00(s,1H),4.82(s,1H),4.52-4.63(m,1H),3.64-3.76(m,1H),3.51-3.58(m,4H),2.99-3.10(m,1H),2.86(br d,J＝8.5Hz,1H),2.28-2.37(m,1H),1.31(d,J＝6.5Hz,3H),1.07(d,J＝6.5Hz,3H)。13C NMR(100.66MHz,DMSO-d6)δppm 162.4,160.9,159.9,153.5,148.0,138.7,138.6,135.0,132.6,129.3(d,J＝8.0Hz),128.8(d,J＝10.0Hz),124.0,122.8,118.6,117.5,115.6,115.4,109.8,104.8,69.0,51.8,49.4,48.9,47.2,28.6,13.4,7.4。
参考文献：PCT/US2020/048070
DGKi化合物17和18
4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000531
向4-((2S,5R)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈,TFA(0.12g，0.27mmol)在乙腈(10mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.14mL，0.82mmol)、1-(1-氯丙基)-4-(三氟甲基)苯(0.12g，0.55mmol)和碘化钠(0.04g，0.27mmol)。在85℃下加热反应混合物16h。使反应混合物冷却至室温且在减压下移除溶剂，得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化[HPLC方法：柱：Sunfire C18,150x19mm ID,5μm；流动相A：10mM乙酸铵于水中；流动相B：乙腈；梯度：经18分钟0-100％B，然后在100％B下保持5分钟；流量：17mL/min]。将级分在减压下浓缩并且从EtOH/H2O(1:5)中冻干，获得化合物17和18。
化合物17：(10mg，7％产率)；LCMS：m/z＝513.3(M+H)；rt 2.52min；(LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x 2.1)mm，2.5μm流动相A：95％水:5％乙腈；10mM甲酸铵；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM甲酸铵；流量：1.1mL/min；温度：50℃；时间(min：0-4；％B：0-100；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.24(d,J＝6.6Hz,1H),7.98(d,J＝9.0Hz,1H),7.73(d,J＝8.1Hz,2H),7.56(d,J＝7.1Hz,2H),5.83-5.48(m,1H),4.98-4.86(m,1H),3.64(br.s.,1H),3.43(s,3H),3.08(d,J＝9.8Hz,1H),2.93-2.82(m,2H),2.42-2.26(m,1H),2.13-2.08(m,1H),1.98-1.82(m,3H),1.66-1.54(m,1H),1.44-1.31(m,1H),0.98-0.91(br.s.,3H),0.69-0.53(m,6H)。
化合物18：(3mg，2％产率)；LCMS：m/z＝513.3(M+H)；rt 2.54min；(LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x 2.1)mm，2.5μm流动相A：95％水:5％乙腈；10mM甲酸铵；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM甲酸铵；流量：1.1mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-4；％B:0-100；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.28-8.19(m,1H),8.01-7.95(m,1H),7.72(d,J＝7.8Hz,2H),7.58(d,J＝8.6Hz,2H),6.06-5.28(m,1H),5.08-4.76(m,1H),3.64-3.50(m,2H),3.43(s,3H),3.16-3.08(m,1H),2.25-2.14(m,2H),2.00-1.83(m,3H),1.57-1.53(m,3H),1.03-0.89(m,3H),0.65-0.54(m,6H)。
DGKi化合物19和20
4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000532
在室温向4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈,TFA(70mg，0.22mmol)在乙腈(2mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.12mL，0.67mmol)、1-(1-氯乙基)-4-(三氟甲基)苯(93mg，0.45mmol)、碘化钠(33.6mg，0.22mmol)，并且在85℃加热16h。将反应混合物冷却至室温并在减压下除去溶剂，将残余物溶解在乙酸乙酯(100mL)中。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩，得到粗产物，降其通过制备型HPLC纯化[HPLC方法：柱：Sunfire C18(150mm x 19.2mm ID，5μm)，流动相A＝10mM乙酸铵于水中，流动相B＝乙腈，流速：19mL/min]，将级分在减压下浓缩，用EtOH/H2O(1:5)稀释并且冻干，得到化合物19和20。
化合物19：(9mg，8％产率)；LCMS：m/z＝485.1(M+H)；rt 2.34min；(LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x 2.1mm),2.5μm；流动相A:95％水:5％乙腈；10mM乙酸铵；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM乙酸铵；流量：1.1mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-3；％B：0-100。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.32-8.17(m,1H),8.05-7.94(m,1H),7.76-7.66(m,2H),7.66-7.55(m,2H),6.11-5.42(m,1H),5.10-4.79(m,1H),3.78-3.59(m,2H),3.44(s,3H),3.17-3.05(m,1H),2.64-2.55(m,1H),2.26-2.09(m,1H),1.65-1.34(m,3H),1.31-1.16(m,5H),1.01(br t,J＝7.1Hz,3H)。
化合物20：(9mg，8％产率)；LCMS：m/z＝485.1(M+H)；rt 2.29min；(LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x 2.1mm),2.5μm；流动相A：95％水:5％乙腈；10mM乙酸铵；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM乙酸铵；流量：1.1mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-3；％B：0-100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.24(br d,J＝8.6Hz,1H),7.99(d,J＝9.0Hz,1H),7.73(d,J＝8.3Hz,2H),7.61(br d,J＝8.3Hz,2H),5.87-5.63(m,1H),5.10-4.79(m,1H),3.90-3.80(m,1H),3.44(s,3H),3.46-3.15(m,1H),2.89-2.73(m,2H),2.41-2.34(m,1H),1.63-1.34(m,5H),1.29(br d,J＝6.1Hz,3H),0.79-0.64(m,3H)。
DGKi化合物21和22
4-((2S,5R)-5-乙基-4-((4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000541
向4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈、TFA(0.5g，1.17mmol)在乙腈(10mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(1.02mL，5.86mmol)，接着添加2-(溴(4-氟苯基)甲基)-5-(三氟甲基)吡啶(0.78mg，2.35mmol)。在80℃下加热反应混合物3小时。使反应混合物冷却至室温且在减压下移除溶剂，得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化(HPLC方法：柱：INERTSIL ODS 21.2X 250mm，5μm；流动相A：0.1％TFA于水中；流动相B：乙腈；梯度：经14分钟30-80％B，然后在100％B下保持5分钟；流量：17mL/min)，在减压下浓缩级分并且从(EtOH/H2O，1:5)中冻干，得到化合物21和化合物22。
化合物21：140mg，21％产率；LCMS：m/z＝566.2(M+H)；rt 3.26min；(LCMS方法：柱：柱-Kinetex XB-C18(75X 3mm-2.6μm)，流动相A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；流动相B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵；流量：1.0mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-4；％B：0-100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.83(br s,1H),8.19-8.31(m,2H),7.95-8.12(m,2H),7.53-7.63(m,2H),7.12-7.26(m,2H),5.41-6.26(m,1H),4.79-5.20(m,2H),3.60-3.74(m,1H),3.44(s,3H),2.73-2.87(m,1H),2.22-2.42(m,2H),1.40-1.68(m,5H),0.53-0.71(m,3H)。
化合物22：155mg，23％产率；LCMS：m/z＝566.2(M+H)；rt 3.25min；(LCMS方法：柱：柱-Kinetex XB-C18(75X 3mm-2.6μm)，流动相A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；流动相B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵；流量：1.0mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-4；％B：0-100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.92(s,1H),8.17-8.27(m,2H),7.90-8.02(m,2H),7.60-7.67(m,2H),7.14-7.22(m,2H),5.52-6.07(m,1H),4.87-5.08(m,2H),3.39-3.71(m,4H),2.69-2.78(m,1H),2.37-2.45(m,1H),1.37-1.69(m,5H),0.58-0.77(m,3H)。
DGKi化合物23-24
(4-((2S,5R)-4-((4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲基)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000551
向4-((2S,5R)-5-乙基-2-甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(100mg，0.32mmol)在乙腈(5mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.3mL，1.60mmol)，接着添加2-(溴(4-氯苯基)甲基)吡啶(181mg，0.64mmol)。在80℃下加热反应混合物3小时。使反应混合物冷却至室温且在减压下移除溶剂，得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化(HPLC方法：柱：Cellulose-5(250*20ID)5微米；流动相A：0.1％DEA/IPA；流动相B：0.1％DEA/ACN；梯度：90％B，然后在100％B下保持5分钟；流量：18mL/min)，在减压下浓缩级分并且从(EtOH/H2O，1:5)中冻干，得到化合物23和化合物24。
化合物23：24mg，14％产率；LCMS：m/z＝514.2(M+H)；rt 2.94min；(LCMS方法：柱：柱-Kinetex XB-C18(75X 3mm-2.6μm)，流动相A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；流动相B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵；流量：1.0mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-4；％B：0-100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.52(d,J＝4.5Hz,1H),8.23(d,J＝9.0Hz,1H),7.96-8.02(m,1H),7.75-7.81(m,1H),7.59-7.68(m,3H),7.39(d,J＝8.5Hz,2H),7.22-7.29(m,1H),5.54-5.95(m,1H),4.81-5.07(m,2H),3.39-3.68(m,5H),2.69-2.76(m,1H),2.35-2.44(m,1H),1.37-1.67(m,5H),0.58-0.67(m,3H)。
化合物24：22mg，13％产率；LCMS：m/z＝514.2(M+H)；rt 2.94min；(LCMS方法：柱：柱-Kinetex XB-C18(75X3 mm-2.6μm)，流动相A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；流动相B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵；流量：1.0mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-4；％B：0-100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.41-8.45(m,1H),8.23(d,J＝9.0Hz,1H),7.96-8.02(m,1H),7.78-7.85(m,2H),7.53-7.61(m,2H),7.40(d,J＝8.5Hz,2H),7.20-7.26(m,1H),5.52-5.97(m,1H),4.87-5.04(m,1H),4.78-4.86(m,1H),3.37-3.71(m,4H),2.72-2.78(m,1H),2.54-2.63(m,1H),2.35-2.46(m,1H),1.40-1.64(m,5H),0.58-0.70(m,3H)。
DGKi化合物25和26
4-((2S,5R)-4-((3-环丙基-1,2,4-噁二唑-5-基)(4-氟苯基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000561
在室温下向2-((2R,5S)-4-(6-氰基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-2-(4-氟苯基)乙酸(0.045g，0.09mmol)、N-羟基环丙烷甲脒(9.4mg，0.09mmol)于DMF(2mL)中的搅拌溶液中添加BOP(0.01g，0.23mmol)和三乙胺(0.04mL，0.23mmol)。2小时后，将反应混合物在110℃加热3h。使反应混合物冷却至室温且在减压下蒸发，得到粗产物，将其经由制备型HPLC纯化。手性分离方法：柱：DAD-1-Cellulose-2(250X4.6mm)，5微米。流动相：0.1％DEA于乙腈中，流量：2.0mL\min。
化合物25：(1.9mg，6％产率)：LCMS：m/z，543.3(M+H)；rt 2.21min；LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x 2.1)mm，2.5μm；流动相A：95％水:5％乙腈；10mM乙酸铵；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM乙酸铵；流量：1.1mL/min；温度：50℃；时间(min)时间(min)：0-3；％B：0-100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.29-8.16(m,1H),8.06-7.92(m,1H),7.75-7.58(m,2H),7.26(m,2H),6.01-5.32(m,1H),5.28(br s,1H),5.00-4.79(m,1H),3.66-3.56(m,1H),3.43(s,3H),2.65-2.57(m,1H),2.44-2.34(m,2H),2.18-2.00(m,1H),1.95-1.74(m,2H),1.68-1.34(m,2H),1.15-1.02(m,2H),0.93-0.83(m,2H),0.81-0.62(m,6H)。
化合物26：(1.0mg，3％产率)：LCMS：m/z，543.3(M+H)；rt 2.20min；LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x 2.1)mm，2.5μm；流动相A：95％水:5％乙腈；10mM乙酸铵；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM乙酸铵；流量：1.1mL/min；温度：50℃；时间(min)时间(min)：0-3；％B：0-100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.23(d,J＝8.8Hz,1H),8.06-7.91(m,1H),7.62(dd,J＝6.2,7.5Hz,2H),7.26(t,J＝8.8Hz,2H),5.92-5.31(m,1H),5.29(s,1H),4.96-4.78(m,1H),3.60-3.50(m,1H),3.43(s,3H),3.25-3.10(m,1H),2.97-2.75(m,2H),2.27-1.65(m,3H),1.49-1.24(m,2H),1.11-0.97(m,2H),0.94-0.75(m,5H),0.74-0.50(m,3H)。
DGKi化合物27和28
4-((2S,5R)-4-((4-氟苯基)(5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000562
向4-((2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈(1g，3.35mmol)在乙腈(10mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(5.9mL，33.5mmol)，接着添加2-(溴(4-氟苯基)甲基)-5-(三氟甲基)吡啶(2.24g，6.70mmol)。在80℃下加热反应混合物4小时。使反应混合物冷却至室温且在减压下移除溶剂，得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化(HPLC方法：柱：Sunfire C18，150x19 mm ID，5μm；流动相A：0.1％TFA于水中；流动相B：乙腈:MeOH(1:1)；梯度：经20分钟50-100％B，然后在100％B下保持5分钟；流量：19mL/min)，在减压下浓缩级分并且从(EtOH/H2O，1:5)中冻干，得到化合物27和化合物28。
化合物27：110mg，6％产率；LCMS：m/z＝552.2(M+H)；rt 3.09min；(LCMS方法：柱：柱-Kinetex XB-C18(75X 3mm-2.6μm)，流动相A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；流动相B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵；流量：1.0mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-4；％B：20-100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.83(s,1H),8.22(d,J＝9.0Hz,2H),8.11-7.95(m,2H),7.71-7.58(m,2H),7.25-7.13(m,2H),5.76-5.44(m,1H),5.13-4.67(m,2H),3.86-3.49(m,1H),3.44(s,3H),3.19-3.08(m,1H),2.84(dd,J＝3.8,12.3Hz,1H),2.38-2.26(m,1H),1.67-1.39(m,3H),1.11-0.86(m,3H)。
化合物28：145mg，8％产率；LCMS：m/z＝552.2(M+H)；rt 3.09min；(LCMS方法：柱：柱-Kinetex XB-C18(75X 3mm-2.6μm)，流动相A：98％水:2％乙腈；10mM甲酸铵；流动相B：2％水:98％乙腈；10mM甲酸铵；流量：1.0mL/min；温度：50℃；时间(min)：0-4；％B：0-100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.91(s,1H),8.27-8.16(m,2H),7.99(d,J＝9.0Hz,2H),7.69-7.57(m,2H),7.23-7.13(m,2H),5.77-5.41(m,1H),5.09-4.62(m,2H),3.90-3.65(m,1H),3.44(s,3H),3.14-3.02(m,1H),2.80-2.74(m,1H),1.61-1.40(m,3H),1.10-0.93(m,3H)[1H被溶剂峰遮蔽]。
DGKi化合物29和30
4-((2S,5R)-4-(1-(4-(环丙基甲氧基)-2-氟苯基)丙基)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000571
向4-((2S,5R)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈,HCl(200mg，0.55mmol)在乙腈(5mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.3mL，1.65mmol)、碘化钠(83mg，0.55mmol)和1-(1-氯丙基)-4-(环丙基甲氧基)-2-氟苯(268mg，1.1mmol)。将反应混合物在80℃加热16h。使反应混合物冷却至室温。添加另一批1-(1-氯丙基)-4-(环丙基甲氧基)-2-氟苯(268mg，1.102mmol)并继续加热另外16h。将反应混合物冷却，在减压下除去溶剂并且将残余物溶解在乙酸乙酯(10x 20mL)中。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，在减压下浓缩，得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化。HPLC方法：柱：EXRS(20X250mm,5μm)，流动相A-10mM乙酸铵于水中，流动相A-B:乙腈，流量：20mL/min。
将级分1在减压下浓缩，并且将产物用(EtOH/H2O，1:5)稀释并且冻干，得到化合物29(35mg，11.6％产率)；LCMS：m/z，533.4[M+H]+，rt 1.57min；(LCMS方法：柱：KINETIX XBC18(75x3mm，2.6μm)；流动相A:10mM乙酸铵于水中(pH 3.3)，流动相B：乙腈。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm)8.23(d,J＝9.0Hz,1H),7.97(d,J＝9.0Hz,1H),7.33(m,1H),6.62-6.92(m,2H),5.29-6.06(m,1H),4.70-5.05(m,1H),3.82(m,3H),3.43(s,3H),2.99-3.10(m,1H),2.80-2.87(m,1H),2.63-2.78(m,1H),2.33(s,1H),1.74-2.11(m,3H),1.51-1.66(m,1H),1.17-1.46(m,3H),0.84-1.01(m,3H),0.61-0.78(m,6H),0.53-0.61(m,2H),0.29-0.35(m,2H)。
将级分2在减压下浓缩，并且将产物用(EtOH/H2O，1:5)稀释并且冻干，得到化合物30(37mg，12.35％产率)；LCMS：m/z，533.4[M+H]+，rt 2.72min；[(LCMS方法：柱：KINETIX XBC18(75x 3mm，2.6μm)；流动相A：10mM乙酸铵于水中(pH 3.3)，流动相B：乙腈。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)8.13-8.35(m,1H),7.98(m,1H),7.38(m,1H),6.61-6.89(m,2H),5.18-6.15(m,1H),4.66-5.13(m,1H),3.63-3.90(m,3H),3.43(s,3H),3.25(m,1H),3.00-3.15(m,1H),2.63-2.70(m,1H),2.26-2.38(m,1H),1.81(m,3H),1.35-1.61(m,2H),1.15-1.26(m,2H),0.88-1.00(m,3H),0.61-0.71(m,6H),0.51-0.59(m,2H),0.32(m,2H)。
DGKi化合物31和32
4-((2S,5R)-2,5-二乙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)丁基)哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000581
向4-((2S,5R)-2,5-二乙基哌嗪-1-基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈,HCl(0.4g，1.1mmol)在乙腈(10mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.6mL，3.31mmol)，接着添加1-(1-氯丁基)-4-三氟甲基)苯(0.783g，3.31mmol)和碘化钠(0.165g，1.102mmol)。将反应混合物在85℃加热16h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，用乙酸乙酯洗涤，并且在减压下浓缩滤液，得到粗化合物，将其通过制备型HPLC纯化[HPLC方法：柱：YMCExRS(250mm x 21.2mm，5μm)流动相A＝10mM乙酸铵pH 4.5于水中。流动相B＝乙腈梯度：经2分钟80％B，然后在100％B下保持16分钟；流量：19mL/min)，得到化合物31和32。
化合物31：(10mg，1.7％产率)，LCMS：m/z＝527.4(M+H)；rt 2.626min；[LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x 2.1mm)，2.5μm；流动相A：95％水:5％乙腈；10mM NH4OAC；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM NH4OAC；流量：1.1mL/min；温度：50℃；时间(min)]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.30-8.16(m,1H),7.98(d,J＝9.0Hz,1H),7.72(d,J＝8.3Hz,2H),7.56(br d,J＝7.8Hz,2H),5.86-5.44(m,1H),5.01-4.77(m,1H),3.730-3.718(m,1H),3.46(s,3H),3.43-3.35(m,1H)3.13-3.01(m,1H),2.93-2.75(m,2H),2.38-2.26(m,1H),2.17-1.74(m,3H),1.63-1.22(m,3H),1.01-0.86(m,4H),0.84-0.75(m,3H),0.73-0.54(m,3H)。
化合物32：(7.2mg，1.23％产率)，LCMS：m/z＝527.3(M+H)；rt 2.654min；[LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x 2.1)mm，2.5μm；流动相A：95％水:5％乙腈；10mM NH4OAC；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM NH4OAC；流量：1.1mL/min；温度：50℃；时间(min)]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.29-8.15(m,1H),7.96-8.02(m,1H),7.70(d,J＝8.1Hz,2H),7.58(br d,J＝8.1Hz,2H),6.09-5.22(m,1H),5.13-4.66(m,1H),3.68-3.52(m,2H),3.43(s,3H),3.28-3.04(m,2H),2.60-2.53(m,1H),2.25-2.12(m,1H),2.04-1.68(m,3H),1.60-1.29(m,3H),1.05-0.74(m,7H),0.59(t,J＝7.5Hz,3H)。
DGKi化合物33和34
1-甲基-4-((2S,5R)-2-甲基-5-丙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶并[3,2-d]嘧啶-6-甲腈
Figure BDA0003703349300000591
在室温在氩气气氛下向6-氯-1-甲基-4-((2S,5R)-2-甲基-5-丙基-4-(1-(4-(三氟甲基)苯基)乙基)哌嗪-1-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-2(1H)-酮(0.1g，0.19mmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加氰化锌(0.046g，0.39mmol)、锌(0.7mg，9.8μmol)和三乙胺(0.1mL，0.59mmol)，接着添加二氯[9,9-二甲基-4,5-双(二苯基膦基)氧杂蒽]钯(II)(0.015g，0.02mmol)。将反应混合物在90℃加热过夜。将反应混合物用EtOAc(50mL)稀释并通过
Figure BDA0003703349300000592
垫过滤，用额外的乙酸乙酯(2x 50mL)洗涤。将滤液用水(50mL)、盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩，得到粗产物，将其通过制备型HPLC纯化(HPLC方法：柱：YMCEXRS(250x19mm，5μm)；流动相A：10mM乙酸铵于水中pH～4.5；流动相B：乙腈流量：20mL/min)，得到化合物33和化合物34。
化合物33：(13mg，14％产率)。LCMS：m/z＝499.3[M+H]+；rt 2.376min；(LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x 2.1mm,2.5μm)；流动相A：95％水:5％乙腈；10mM NH4OAc；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM NH4OAC；流量：1.1mL/min；温度：50℃)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)＝8.22(br d,J＝8.8Hz,1H),7.98(d,J＝8.8Hz,1H),7.70-7.72(m,2H),7.59-7.61(m,2H),5.84-5.59(m,1H),5.10-4.67(m,1H),3.91-3.75(m,1H),3.38-3.43(m,4H),2.86-2.70(m,2H),2.47-2.36(m,1H),1.63-1.51(m,1H),1.47-1.18(m,8H),0.9-0.99(m,1H),0.75-0.59(m,3H)。
化合物34：(13mg，13％产率)；LCMS：m/z＝499.3[M+H]+；rt 2.436min；(LCMS方法：柱：XBridge BEH XP C18(50x 2.1mm,2.5μm)；流动相A：95％水:5％乙腈；10mM NH4OAc；流动相B：5％水:95％乙腈；10mM NH4OAC；流量：1.1mL/min；温度：50℃)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)＝8.25(br d,J＝2.4Hz,1H),8.06-7.92(m,1H),7.77-7.65(m,2H),7.65-7.54(m,2H),6.09-5.44(m,1H),5.04-4.68(m,1H),3.81-3.59(m,2H),3.44(s,3H),3.28-3.13(m,1H),2.52-2.61(m,1H),2.24-2.05(m,1H),1.72-1.48(m,2H),1.47-1.15(m,8H),0.98-0.75(m,3H)。
生物测定
本文所述化合物的药理特性可以通过许多生物测定来确认。
1.体外DGK抑制测定
使用挤出脂质体(DGKα和DGKζLIPGLO测定)或洗涤剂/脂质胶束底物(DGKα和DGKζ测定)进行DGKα和DGKζ反应。在50mM MOPS pH 7.5、100mM NaCl、10mM MgCl2、1μM CaCl2,和1mM DTT(测定缓冲液)中进行反应。使用洗涤剂/脂质胶束底物的反应还含有50mM辛基B-D-吡喃葡萄糖苷。对于洗涤剂/脂质胶束反应，脂质底物浓度为11mM PS和1mM DAG。对于挤出脂质体反应，脂质底物浓度为2mM PS、0.25mM DAG和2.75mM PC。在150μM ATP中进行反应。对于DGKα和DGKζ的酶浓度为5nM。
化合物抑制研究如下进行：将溶解于DMSO中的每种测试化合物的50nL液滴(对于每种化合物，最高浓度10mM，11个点连续3倍稀释倍数)转移至白色1536孔板(Corning3725)的孔中。通过将2.5mL 4x酶溶液(在测定缓冲液中的20nM DGKα或DGKζ(如下所述制备))和2.5mL 4x脂质体或4x洗涤剂/脂质胶束溶液(组成在以下所述)合并来制备5mL酶/底物溶液(2x最终反应浓度)并且将其在室温下孵育10分钟。接下来，将1μL 2x酶/底物溶液添加到含有测试化合物的孔中并且通过添加1μL 300uM ATP开始反应。允许反应进行1h，此后添加2μL Glo试剂(Promega V9101)并且孵育40分钟。接下来，添加4μL激酶检测试剂并且孵育30分钟。使用EnVision酶标仪记录发光。从由无酶对照反应产生的ATP转化(100％抑制)和由纯载体反应产生的ATP转化(0％抑制)计算出抑制百分比。以11种浓度评估化合物以确定IC50。
4x洗涤剂/脂质胶束的制备
通过以下方式制备洗涤剂/脂质胶束：将15g磷脂酰丝氨酸(Avanti 840035P)和1g二酰基甘油(800811O)合并，并且溶解在2L圆底烧瓶中的150mL氯仿中。通过旋转蒸发在高真空下除去氯仿。通过剧烈混合将所得的无色胶粘性油状物重新悬浮在400mL 50mM MOPSpH 7.5、100mM NaCl、20mM NaF、10mM MgCl2、1μM CaCl2、1mM DTT和200mM辛基葡糖苷中。将脂质/洗涤剂溶液分成5mL等分试样并且储存在-80℃。
4x脂质体制备
脂质组成是5mol％DAG(Avanti 800811O)、40mol％PS(Avanti 840035P)和55mol％PC(Avanti 850457)，对于4x脂质体溶液的总脂质浓度为15.2mg/mL。将PC、DAG和PS溶解在氯仿中，合并，并且在真空中干燥成薄膜。将脂质水合至在50mM MOPS pH 7.5、100mMNaCl、5mM MgCl2中20mM，并且冻融五次。将脂质悬浮液通过100nm聚碳酸酯过滤器挤出11次。进行动态光散射以确认脂质体的尺寸(半径为50-60nm)。将脂质体制剂储存在4℃下长达4周。
人DGKα和DGKζ的杆状病毒表达
根据制造商的方案使用Bac-至-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen)产生人DGK-α-TVMV-His-pFBgate和人DGK-ζ-转录变体-2-TVMV-His-pFBgate杆状病毒样品。用于表达DGK-α和DGK-ζ的DNA分别具有SEQ ID NO:1和3。以1:1500的病毒/细胞比使用受感染的Sf9细胞实现杆状病毒扩增，并且在转染后在27℃下生长65小时。
在来自GE Healthcare Bioscience的Cellbag 50L WAVE-Bioreactor系统20/50中进行每种蛋白质的表达放大。将12L 2×106个细胞/mL的在ESF921昆虫媒介(ExpressionSystem)中生长的Sf9细胞(Expression System，戴维斯(Davis)，加利福尼亚州)用病毒储备物以1:200的病毒/细胞比感染，并且在感染后在27℃下生长66--68小时。通过在
Figure BDA0003703349300000601
RC12BP离心机中在4℃下以2000rpm离心20min来收获受感染的细胞培养物。将细胞沉淀储存在-70℃直到纯化。
人DGK-α和DGK-ζ的纯化
从受Sf9杆状病毒感染的昆虫细胞糊纯化全长人DGKα和DGKζ(各自是含有TVMV-可切割的C末端Hexa-His标签序列(分别为SEQ ID NO:2和4)表达的并且如上所述产生)。通过氮气空化方法用氮气弹(Parr Instruments)裂解细胞，并且通过离心使裂解物澄清。在
Figure BDA0003703349300000602
Purifier Plus系统上使用三个连续的柱色谱步骤将澄清的裂解物纯化至约90％均匀度。这三步柱色谱法包括镍亲和树脂捕获(即HisTrap FF粗品，GE Healthcare)，然后是尺寸排阻色谱法(即对于DGK-α为HiLoad 26/600Superdex 200制备级，GE Healthcare，并且对于DGK-ζ为HiPrep 26/600Sephacryl S 300_HR，GE Healthcare)。第三步是离子交换色谱法，并且对于两种同种型有所不同。使用Q-Sepharose阴离子交换色谱法(GEHealthcare)精制DGKα。使用SP Sepharose阳离子交换色谱法(GE Healthcare)精制DGKζ。蛋白质以≥2mg/mL的浓度递送。两种蛋白质的配制缓冲液相同：50mM Hepes，pH 7.2，500mMNaCl、10％v/v甘油，1mM TCEP，和0.5mM EDTA。
2.Raji CD4 T细胞IL2测定
使用预激活的CD4 T细胞和Raji细胞在4μL体积中进行1536孔IL-2测定。在测定之前，通过用分别1.5μg/mL、1μg/mL和10μg/mL的α-CD3、α-CD28和PHA的处理将CD4 T细胞预激活。将Raji细胞用10,000ng/mL的葡萄球菌肠毒素B(SEB)处理。首先将连续稀释的化合物转移至1536孔测定板(Corning，#3727)，然后添加2μL预激活的CD4 T细胞(最终密度为6000个细胞/孔)和2μL经SEB处理的Raji细胞(2000个细胞/孔)。在37℃/5％CO2培养箱中培养24小时后，将4μl IL-2检测试剂添加到测定板(Cisbio，#64IL2PEC)中。在Envision阅读器上读取测定板。为了评价化合物的细胞毒性，将Raji或CD4 T细胞与连续稀释的化合物一起孵育。孵育24小时后，添加4μL Cell Titer Glo(Promega，#G7572)，并且在Envision阅读器上读取板。使用四参数逻辑斯谛公式y＝A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))计算50％有效浓度(IC50)，其中A和B分别表示最小和最大激活或抑制％，C是IC50，D是山坡并且x代表化合物浓度。
3.CellTiter-Glo CD8 T细胞增殖测定
将冷冻的幼稚人CD8 T细胞在RPMI+10％FBS中解冻，在37℃下孵育2h，并且计数。将384孔组织培养板在4℃下用20μl在普通RPMI中0.1μg/mL的抗人CD3包被过夜，将其从板上移除，然后将20k/40μL CD8 T细胞(具有0.5μg/ml可溶性抗人CD28)添加到每个孔中。在细胞铺板后立即将化合物用echo仪器添加(echoed)到细胞板。在37℃的培养箱中培养72h后，将10μL CellTiter-glo试剂(Promega目录号G7570)添加到每个孔中。将板剧烈摇动5min，在室温下再孵育15min，并且在Envision上读取CD8 T细胞增殖。在分析中，0.1μg/mL抗CD3和0.5μg/mL抗CD28刺激的CD8 T细胞信号为背景。在3μM下的参考化合物8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈用于设定100％范围，并且EC50在绝对50％下以归一化数据。
4.DGK AP1-报告基因测定
使用来自SABiosciences的Cignal Lenti AP1 Reporter报告基因(luc)试剂盒(CLS-011L)生成Jurkat AP1-荧光素酶报告基因。
使用Echo550仪器将化合物从Echo LDV板转移至384孔板(白色，实心底部，不透明的PE CulturPlate 6007768)的单独的孔。样品量为每孔30nL；并且每个源板一个目标板。通过将40mL细胞(2x20mL)转移至干净的50mL锥形管中来制备细胞悬液。通过离心(1200rpm；5min；环境温度)浓缩细胞。除去上清液，并且将所有细胞悬浮在RPMI(Gibco11875)+10％FBS中，以使浓度为1.35x106个细胞/mL。使用多通道移液器手动将细胞(30μL细胞悬浮液/孔)添加到含有化合物的384孔TC板中，4.0x104个细胞/孔。将细胞板在37℃和5％CO2下孵育20分钟。
在孵育过程中，通过将3μL aCD3(1.3mg/mL)与10mL培养基混合[最终浓度＝0.4μg/mL]来制备抗CD3抗体(αCD3)溶液。接下来，将1.5μl aCD3(1.3mg/mL)与0.5mL培养基混合[最终浓度＝4μg/ml]。20分钟后，将10μL培养基添加到第1列的所有孔(孔A至M)中，并且向第1列(行N至P)中添加每孔10μLαCD3(4ug/mL)用于参考。然后使用多通道移液器每孔添加10μLαCD3(0.4ug/mL)。将αCD3刺激的+/-化合物处理的细胞在37℃，5％CO2下孵育6小时。
在此孵育期间，将Steady-Glo(Promega E2520)试剂缓慢解冻至环境温度。接下来，使用多滴Combi-dispenser添加20μL Steady-Glo试剂/孔。通过离心(2000rpm，环境温度，10秒)除去气泡。将细胞在室温下孵育5分钟。通过使用Envision读板仪根据发光方案测量相对光单位(RLU)来表征样品。使用参考化合物8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈分析数据，以归一化100％抑制。
5.鼠细胞毒性T淋巴细胞测定
开发了抗原特异性细胞溶解T细胞(CTL)测定，以功能评估DGKα和DGKζ抑制剂增强效应T细胞介导的肿瘤细胞杀伤活性的能力。从OT-1转基因小鼠分离的CD8+T细胞识别抗原呈递细胞MC38，其呈递卵清蛋白来源的肽SIINFEKL。同源抗原的识别启动了OT-1抗原特异性CD8+T细胞的细胞溶解活性。
功能性CTL细胞如下产生：从8-12周龄小鼠分离OT-1脾细胞，并且在1μg/mL的SIINFEKL肽和10U/mL的mIL2的存在下扩增。三天后，添加具有mIL2 U/ml的新鲜培养基。在扩增的第5天，分离出CD8+T细胞并且准备使用。激活的CTL细胞可以冷冻储存6个月。单独地，将一百万个MC38肿瘤细胞用1μg/mL的SIINFEKL-OVA肽在37℃下脉冲3小时。用新鲜培养基洗涤细胞(三次)以除去过量肽。最后，将在96孔U底板中用DGK抑制剂预处理1小时的CTL细胞与负载抗原的MC38肿瘤细胞以1:10的比率合并。然后将细胞在700rpm下旋转5min，并且放置在37℃的培养箱中过夜。24小时后，收集上清液用于通过购自Perkin Elmer的AlphaLisa分析IFN-γ细胞因子水平。
6.PHA增殖测定
将来自冷冻储备物的植物血凝素(PHA)刺激的胚细胞在补充有10％胎牛血清(Sigma Aldrich，圣路易斯，密苏里州)的RPMI培养基(Gibco，ThermoFisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中孵育1小时，然后添加到384孔板的单独孔(10,000个细胞/孔)中。将化合物转移至384孔板的单独孔中，并且将经处理的细胞在含有人IL2(20ng/mL)的培养基中在37℃ 5％CO2下保持72h，然后根据制造商的说明(Promega，麦迪逊，威斯康星州)使用MTS试剂[3-(4,5-二甲基-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓]测量生长。在IL2刺激(0％抑制)与未刺激对照(100％抑制)之间比较值来计算抑制百分比。基于对IL2刺激与未刺激处理之间的倍数诱导的50％抑制来计算抑制浓度(IC50)的确定。
7.人CD8 T细胞IFN-γ测定
将冷冻的幼稚人CD8 T细胞在AIM-V培养基中解冻，在37℃下孵育2h，并且计数。将384孔组织培养板在4℃下用20μL在PBS中0.05μg/mL的抗人CD3包被过夜，将其从板上移除，然后将40,000个细胞/40微升CD8 T细胞(具有0.1μg/mL可溶性抗人CD28)添加到每个孔中。细胞铺板后，立即使用Echo液体处理器将化合物转移到细胞板上。在37℃培养箱中孵育20h后，将3微升/孔的上清液转移到新的384孔白色测定板中，以进行细胞因子测量。
使用AlphLISA试剂盒(目录号AL217)如制造商手册(Perkin Elmer)所述定量干扰素-γ(IFN-γ)。将来自每个孔的计数转换为IFN-γ浓度(pg/mL)。通过将0.05μg/mL抗CD3加0.1μg/mL抗CD28设置为基线，并且将3μM参考化合物8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈与抗CD3加抗CD28的共刺激设置为100％激活来确定化合物EC50值。
8.人CD8 T细胞pERK测定
将冷冻的幼稚人CD8 T细胞在AIM-V培养基中解冻，在37℃下孵育2h，并且计数。将CD8阳性T细胞以在AIM-V培养基中20,000个细胞/孔添加到384孔组织培养板中。将一种化合物添加到每个孔中，然后以0.3μg/mL的最终浓度添加珠结合的抗人CD3和抗CD28mAb。将细胞在37℃下孵育10分钟。通过添加来自AlphaLISA Surefire试剂盒的裂解缓冲液终止反应。(Perkin Elmer，目录号ALSU-PERK-A)。将裂解物(5μL/孔)转移到新的384孔白色测定板中进行pERK激活测量。
通过将抗CD3加抗CD28设置为基线，并且将3μM 8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈与抗CD3和抗CD28的共刺激设置为100％激活来确定化合物EC50。
9.人全血IFN-γ测定
将从健康供体获得的人静脉全血(22.5μL/孔)在湿润的95％空气/5％CO2培养箱中在37℃下用化合物预处理一小时。将血液用2.5μL抗人CD3和抗CD28 mAb各自以1μg/mL的最终浓度在37℃下刺激24小时。使用AlphLISA试剂盒(Cat#AL217)测量上清液中的IFN-γ。
通过将抗CD3加抗CD28设置为基线，并且将3μM参考化合物8-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)-5-甲基-7-硝基-6-氧代-5,6-二氢-1,5-萘啶-2-甲腈与抗CD3和抗CD28的共刺激设置为100％激活来确定化合物EC50。
表A
体外DGK抑制IC50活性值
Figure BDA0003703349300000631
表A列出了在DGKα和DGKζ脂质体(LIPGLO)测定中测量的体外DGK抑制IC50活性值。
本文所述的化合物具有作为DGKα和DGKζ酶中之一或两者的一种或多种抑制剂的活性，并且因此可以用于治疗与抑制DGKα和DGKζ活性相关的疾病。
编码hDGKα-(M1-S735)-Ct-TVMV-His的核苷酸序列：
0001 ATGGCCAAGG AGAGGGGCCT AATAAGCCCC AGTGATTTTG CCCAGCTGCA
0051 AAAATACATG GAATACTCCA CCAAAAAGGT CAGTGATGTC CTAAAGCTCT
0101 TCGAGGATGG CGAGATGGCT AAATATGTCC AAGGAGATGC CATTGGGTAC
0151 GAGGGATTCC AGCAATTCCT GAAAATCTAT CTCGAAGTGG ATAATGTTCC
0201 CAGACACCTA AGCCTGGCAC TGTTTCAATC CTTTGAGACT GGTCACTGCT
0251 TAAATGAGAC AAATGTGACA AAAGATGTGG TGTGTCTCAA TGATGTTTCC
0301 TGCTACTTTT CCCTTCTGGA GGGTGGTCGG CCAGAAGACA AGTTAGAATT
0351 CACCTTCAAG CTGTACGACA CGGACAGAAA TGGGATCCTG GACAGCTCAG
0401 AAGTGGACAA AATTATCCTA CAGATGATGC GAGTGGCTGA ATACCTGGAT
0451 TGGGATGTGT CTGAGCTGAG GCCGATTCTT CAGGAGATGA TGAAAGAGAT
0501 TGACTATGAT GGCAGTGGCT CTGTCTCTCA AGCTGAGTGG GTCCGGGCTG
0551 GGGCCACCAC CGTGCCACTG CTAGTGCTGC TGGGTCTGGA GATGACTCTG
0601 AAGGACGACG GACAGCACAT GTGGAGGCCC AAGAGGTTCC CCAGACCAGT
0651 CTACTGCAAT CTGTGCGAGT CAAGCATTGG TCTTGGCAAA CAGGGACTGA
0701 GCTGTAACCT CTGTAAGTAC ACTGTTCACG ACCAGTGTGC CATGAAAGCC
0751 CTGCCTTGTG AAGTCAGCAC CTATGCCAAG TCTCGGAAGG ACATTGGTGT
0801 CCAATCACAT GTGTGGGTGC GAGGAGGCTG TGAGTCCGGG CGCTGCGACC
0851 GCTGTCAGAA AAAGATCCGG ATCTACCACA GTCTGACCGG GCTGCATTGT
0901 GTATGGTGCC ACCTAGAGAT CCACGATGAC TGCCTGCAAG CGGTGGGCCA
0951 TGAGTGTGAC TGTGGGCTGC TCCGGGATCA CATCCTGCCT CCATCTTCCA
1001 TCTATCCCAG TGTCCTGGCC TCTGGACCGG ATCGTAAAAA TAGCAAAACA
1051 AGCCAGAAGA CCATGGATGA TTTAAATTTG AGCACCTCTG AGGCTCTGCG
1101 GATTGACCCT GTTCCTAACA CCCACCCACT TCTCGTCTTT GTCAATCCTA
1151 AGAGTGGCGG GAAGCAGGGG CAGAGGGTGC TCTGGAAGTT CCAGTATATA
1201 TTAAACCCTC GACAGGTGTT CAACCTCCTA AAGGATGGTC CTGAGATAGG
1251 GCTCCGATTA TTCAAGGATG TTCCTGATAG CCGGATTTTG GTGTGTGGTG
1301 GAGACGGCAC AGTAGGCTGG ATTCTAGAGA CCATTGACAA AGCTAACTTG
1351 CCAGTTTTGC CTCCTGTTGC TGTGTTGCCC CTGGGTACTG GAAATGATCT
1401 GGCTCGATGC CTAAGATGGG GAGGAGGTTA TGAAGGACAG AATCTGGCAA
1451 AGATCCTCAA GGATTTAGAG ATGAGTAAAG TGGTACATAT GGATCGATGG
1501 TCTGTGGAGG TGATACCTCA ACAAACTGAA GAAAAAAGTG ACCCAGTCCC
1551 CTTTCAAATC ATCAATAACT ACTTCTCTAT TGGCGTGGAT GCCTCTATTG
1601 CTCATCGATT CCACATCATG CGAGAGAAAT ATCCGGAGAA GTTCAACAGC
1651 AGAATGAAGA ACAAGCTATG GTACTTCGAA TTTGCCACAT CTGAATCCAT
1701 CTTCTCAACA TGCAAAAAGC TGGAGGAGTC TTTGACAGTT GAGATCTGTG
1751 GGAAACCGCT GGATCTGAGC AACCTGTCCC TAGAAGGCAT CGCAGTGCTA
1801 AACATCCCTA GCATGCATGG TGGCTCCAAC CTCTGGGGTG ATACCAGGAG
1851 ACCCCATGGG GATATCTATG GGATCAACCA GGCCTTAGGT GCTACAGCTA
1901 AAGTCATCAC CGACCCTGAT ATCCTGAAAA CCTGTGTACC AGACCTAAGT
1951 GACAAGAGAC TGGAAGTGGT TGGGCTGGAG GGTGCAATTG AGATGGGCCA
2001 AATCTATACC AAGCTCAAGA ATGCTGGACG TCGGCTGGCC AAGTGCTCTG
2051 AGATCACCTT CCACACCACA AAAACCCTTC CCATGCAAAT TGACGGAGAA
2101 CCCTGGATGC AGACGCCCTG TACAATCAAG ATCACCCACA AGAACCAGAT
2151 GCCCATGCTC ATGGGCCCAC CCCCCCGCTC CACCAATTTC TTTGGCTTCT
2201 TGAGCGGATC CTCGGAGACA GTGCGGTTTC AGGGACACCA CCACCATCAC
2251 CACTGA
(SEQ ID NO:1)
hDGKα-(M1-S735)-Ct-TVMV-His的氨基酸序列：
0001 MAKERGLISP SDFAQLQKYM EYSTKKVSDV LKLFEDGEMA KYVQGDAIGYEGFQQFLKIY 0060
0061 LEVDNVPRHL SLALFQSFET GHCLNETNVT KDVVCLNDVS CYFSLLEGGRPEDKLEFTFK 0120
0121 LYDTDRNGIL DSSEVDKIIL QMMRVAEYLD WDVSELRPIL QEMMKEIDYDGSGSVSQAEW 0180
0181 VRAGATTVPL LVLLGLEMTL KDDGQHMWRP KRFPRPVYCN LCESSIGLGKQGLSCNLCKY 0240
0241 TVHDQCAMKA LPCEVSTYAK SRKDIGVQSH VWVRGGCESG RCDRCQKKIRIYHSLTGLHC 0300
0301 VWCHLEIHDD CLQAVGHECD CGLLRDHILP PSSIYPSVLA SGPDRKNSKTSQKTMDDLNL 0360
0361 STSEALRIDP VPNTHPLLVF VNPKSGGKQG QRVLWKFQYI LNPRQVFNLLKDGPEIGLRL 0420
0421 FKDVPDSRIL VCGGDGTVGW ILETIDKANL PVLPPVAVLP LGTGNDLARCLRWGGGYEGQ 0480
0481 NLAKILKDLE MSKVVHMDRW SVEVIPQQTE EKSDPVPFQI INNYFSIGVDASIAHRFHIM 0540
0541 REKYPEKFNS RMKNKLWYFE FATSESIFST CKKLEESLTV EICGKPLDLSNLSLEGIAVL 0600
0601 NIPSMHGGSN LWGDTRRPHG DIYGINQALG ATAKVITDPD ILKTCVPDLSDKRLEVVGLE 0660
0661 GAIEMGQIYT KLKNAGRRLA KCSEITFHTT KTLPMQIDGE PWMQTPCTIKITHKNQMPML 0720
0721 MGPPPRSTNF FGFLSGSSET VRFQGHHHHH H 0751
(SEQ ID NO:2)
编码hDGKζ-(M1-A928)-转录变体-2Ct-TVMV-His的核苷酸序列：
0001 ATGGAGCCGC GGGACGGTAG CCCCGAGGCC CGGAGCAGCG ACTCCGAGTC
0051 GGCTTCCGCC TCGTCCAGCG GCTCCGAGCG CGACGCCGGT CCCGAGCCGG
0101 ACAAGGCGCC GCGGCGACTC AACAAGCGGC GCTTCCCGGG GCTGCGGCTC
0151 TTCGGGCACA GGAAAGCCAT CACGAAGTCG GGCCTCCAGC ACCTGGCCCC
0201 CCCTCCGCCC ACCCCTGGGG CCCCGTGCAG CGAGTCAGAG CGGCAGATCC
0251 GGAGTACAGT GGACTGGAGC GAGTCAGCGA CATATGGGGA GCACATCTGG
0301 TTCGAGACCA ACGTGTCCGG GGACTTCTGC TACGTTGGGG AGCAGTACTG
0351 TGTAGCCAGG ATGCTGCAGA AGTCAGTGTC TCGAAGAAAG TGCGCAGCCT
0401 GCAAGATTGT GGTGCACACG CCCTGCATCG AGCAGCTGGA GAAGATAAAT
0451 TTCCGCTGTA AGCCGTCCTT CCGTGAATCA GGCTCCAGGA ATGTCCGCGA
0501 GCCAACCTTT GTACGGCACC ACTGGGTACA CAGACGACGC CAGGACGGCA
0551 AGTGTCGGCA CTGTGGGAAG GGATTCCAGC AGAAGTTCAC CTTCCACAGC
0601 AAGGAGATTG TGGCCATCAG CTGCTCGTGG TGCAAGCAGG CATACCACAG
0651 CAAGGTGTCC TGCTTCATGC TGCAGCAGAT CGAGGAGCCG TGCTCGCTGG
0701 GGGTCCACGC AGCCGTGGTC ATCCCGCCCA CCTGGATCCT CCGCGCCCGG
0751 AGGCCCCAGA ATACTCTGAA AGCAAGCAAG AAGAAGAAGA GGGCATCCTT
0801 CAAGAGGAAG TCCAGCAAGA AAGGGCCTGA GGAGGGCCGC TGGAGACCCT
0851 TCATCATCAG GCCCACCCCC TCCCCGCTCA TGAAGCCCCT GCTGGTGTTT
0901 GTGAACCCCA AGAGTGGGGG CAACCAGGGT GCAAAGATCA TCCAGTCTTT
0951 CCTCTGGTAT CTCAATCCCC GACAAGTCTT CGACCTGAGC CAGGGAGGGC
1001 CCAAGGAGGC GCTGGAGATG TACCGCAAAG TGCACAACCT GCGGATCCTG
1051 GCGTGCGGGG GCGACGGCAC GGTGGGCTGG ATCCTCTCCA CCCTGGACCA
1101 GCTACGCCTG AAGCCGCCAC CCCCTGTTGC CATCCTGCCC CTGGGTACTG
1151 GCAACGACTT GGCCCGAACC CTCAACTGGG GTGGGGGCTA CACAGATGAG
1201 CCTGTGTCCA AGATCCTCTC CCACGTGGAG GAGGGGAACG TGGTACAGCT
1251 GGACCGCTGG GACCTCCACG CTGAGCCCAA CCCCGAGGCA GGGCCTGAGG
1301 ACCGAGATGA AGGCGCCACC GACCGGTTGC CCCTGGATGT CTTCAACAAC
1351 TACTTCAGCC TGGGCTTTGA CGCCCACGTC ACCCTGGAGT TCCACGAGTC
1401 TCGAGAGGCC AACCCAGAGA AATTCAACAG CCGCTTTCGG AATAAGATGT
1451 TCTACGCCGG GACAGCTTTC TCTGACTTCC TGATGGGCAG CTCCAAGGAC
1501 CTGGCCAAGC ACATCCGAGT GGTGTGTGAT GGAATGGACT TGACTCCCAA
1551 GATCCAGGAC CTGAAACCCC AGTGTGTTGT TTTCCTGAAC ATCCCCAGGT
1601 ACTGTGCGGG CACCATGCCC TGGGGCCACC CTGGGGAGCA CCACGACTTT
1651 GAGCCCCAGC GGCATGACGA CGGCTACCTC GAGGTCATTG GCTTCACCAT
1701 GACGTCGTTG GCCGCGCTGC AGGTGGGCGG ACACGGCGAG CGGCTGACGC
1751 AGTGTCGCGA GGTGGTGCTC ACCACATCCA AGGCCATCCC GGTGCAGGTG
1801 GATGGCGAGC CCTGCAAGCT TGCAGCCTCA CGCATCCGCA TCGCCCTGCG
1851 CAACCAGGCC ACCATGGTGC AGAAGGCCAA GCGGCGGAGC GCCGCCCCCC
1901 TGCACAGCGA CCAGCAGCCG GTGCCAGAGC AGTTGCGCAT CCAGGTGAGT
1951 CGCGTCAGCA TGCACGACTA TGAGGCCCTG CACTACGACA AGGAGCAGCT
2001 CAAGGAGGCC TCTGTGCCGC TGGGCACTGT GGTGGTCCCA GGAGACAGTG
2051 ACCTAGAGCT CTGCCGTGCC CACATTGAGA GACTCCAGCA GGAGCCCGAT
2101 GGTGCTGGAG CCAAGTCCCC GACATGCCAG AAACTGTCCC CCAAGTGGTG
2151 CTTCCTGGAC GCCACCACTG CCAGCCGCTT CTACAGGATC GACCGAGCCC
2201 AGGAGCACCT CAACTATGTG ACTGAGATCG CACAGGATGA GATTTATATC
2251 CTGGACCCTG AGCTGCTGGG GGCATCGGCC CGGCCTGACC TCCCAACCCC
2301 CACTTCCCCT CTCCCCACCT CACCCTGCTC ACCCACGCCC CGGTCACTGC
2351 AAGGGGATGC TGCACCCCCT CAAGGTGAAG AGCTGATTGA GGCTGCCAAG
2401 AGGAACGACT TCTGTAAGCT CCAGGAGCTG CACCGAGCTG GGGGCGACCT
2451 CATGCACCGA GACGAGCAGA GTCGCACGCT CCTGCACCAC GCAGTCAGCA
2501 CTGGCAGCAA GGATGTGGTC CGCTACCTGC TGGACCACGC CCCCCCAGAG
2551 ATCCTTGATG CGGTGGAGGA AAACGGGGAG ACCTGTTTGC ACCAAGCAGC
2601 GGCCCTGGGC CAGCGCACCA TCTGCCACTA CATCGTGGAG GCCGGGGCCT
2651 CGCTCATGAA GACAGACCAG CAGGGCGACA CTCCCCGGCA GCGGGCTGAG
2701 AAGGCTCAGG ACACCGAGCT GGCCGCCTAC CTGGAGAACC GGCAGCACTA
2751 CCAGATGATC CAGCGGGAGG ACCAGGAGAC GGCTGTGGGA TCCTCGGAGA
2801 CAGTGCGGTT TCAGGGACAC CACCACCATC ACCACTGA
(SEQ ID NO:3)
hDGKζ-(M1-A928)-转录变体-2Ct-TVMV-His的氨基酸序列：
0001 MEPRDGSPEA RSSDSESASA SSSGSERDAG PEPDKAPRRL NKRRFPGLRLFGHRKAITKS 0060
0061 GLQHLAPPPP TPGAPCSESE RQIRSTVDWS ESATYGEHIW FETNVSGDFCYVGEQYCVAR 0120
0121 mLQKSVSRRK CAACKIVVHT PCIEQLEKIN FRCKPSFRES GSRNVREPTFVRHHWVHRRR 0180
0181 QDGKCRHCGK GFQQKFTFHS KEIVAISCSW CKQAYHSKVS CFMLQQIEEPCSLGVHAAVV 0240
0241 IPPTWILRAR RPQNTLKASK KKKRASFKRK SSKKGPEEGR WRPFIIRPTPSPLMKPLLVF 0300
0301 VNPKSGGNQG AKIIQSFLWY LNPRQVFDLS QGGPKEALEM YRKVHNLRILACGGDGTVGW 0360
0361 ILSTLDQLRL KPPPPVAILP LGTGNDLART LNWGGGYTDE PVSKILSHVEEGNVVQLDRW 0420
0421 DLHAEPNPEA GPEDRDEGAT DRLPLDVFNN YFSLGFDAHV TLEFHESREANPEKFNSRFR 0480
0481 NKMFYAGTAF SDFLMGSSKD LAKHIRVVCD GMDLTPKIQD LKPQCVVFLNIPRYCAGTMP 0540
0541 WGHPGEHHDF EPQRHDDGYL EVIGFTMTSL AALQVGGHGE RLTQCREVVLTTSKAIPVQV 0600
0601 DGEPCKLAAS RIRIALRNQA TMVQKAKRRS AAPLHSDQQP VPEQLRIQVSRVSMHDYEAL 0660
0661 HYDKEQLKEA SVPLGTVVVP GDSDLELCRA HIERLQQEPD GAGAKSPTCQKLSPKWCFLD 0720
0721 ATTASRFYRI DRAQEHLNYV TEIAQDEIYI LDPELLGASA RPDLPTPTSPLPTSPCSPTP 0780
0781 RSLQGDAAPP QGEELIEAAK RNDFCKLQEL HRAGGDLMHR DEQSRTLLHHAVSTGSKDVV 0840
0841 RYLLDHAPPE ILDAVEENGE TCLHQAAALG QRTICHYIVE AGASLMKTDQQGDTPRQRAE 0900
0901 KAQDTELAAY LENRQHYQMI QREDQETAVG SSETVRFQGH HHHHH 0945
(SEQ ID NO:4)

Claims (42)

1.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的DGKα和/或DGKζ抑制剂和PD1/PD-L1轴拮抗剂。
2.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的DGKα和/或DGKζ抑制剂和CTLA4拮抗剂。
3.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的DGKα和/或DGKζ抑制剂、PD1/PD-L1轴拮抗剂和CTLA4拮抗剂。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中人DGKα和/或DGKζ抑制剂是DGKα的抑制剂，而不是DGKζ的显著抑制剂。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是DGKζ的抑制剂，而不是DGKα的显著抑制剂。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是DGKα和DGKζ的抑制剂。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ抑制剂不是其他DGK的显著抑制剂。
8.根据权利要求1和3-7中任一项所述的方法，其中所述PD1/PD-L1轴拮抗剂是PD1，例如人PD1的拮抗剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述PD-1拮抗剂是纳武单抗、派姆单抗或本文所述的任何其他PD-1拮抗剂。
10.根据权利要求1和3-7中任一项所述的方法，其中所述PD1/PD-L1轴拮抗剂是PD-L1，例如人PD-L1的拮抗剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述PD-L1拮抗剂是阿特珠单抗或本文所述的任何其他PD-L1拮抗剂。
12.根据权利要求2-11中任一项所述的方法，其中所述CTLA4拮抗剂是伊匹单抗或本文所述的任何其他CTLA4拮抗剂。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ拮抗剂增加初级T细胞信号传导，如例如由pERK/pPKC信号传导增加所证明的。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ抑制剂降低T细胞抗原识别和激活的抗原刺激阈值；降低T细胞抗原识别和激活的亲和力要求和/或降低T细胞抗原识别和激活的抗原浓度要求。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ抑制剂增加CTL效应子功能。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ抑制剂增强肿瘤细胞杀伤。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中在CT26动物模型中，所述DGKα和/或DGKζ抑制剂的抗肿瘤活性依赖于CD8+T细胞。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中在CT26动物模型中，所述DGKα和/或DGKζ抑制剂的抗肿瘤活性依赖于NK细胞。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在CT-26动物模型中，所述DGKα和/或DGKζ抑制剂的抗肿瘤活性通过CD4细胞耗竭而增强。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ抑制剂在CT-26动物模型中增强AH1+四聚体抗原呈递或克服B2M水平降低以恢复T细胞效应子功能。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(I)的化合物：
Figure FDA0003703349290000021
或其药学上可接受的盐，其中：
R1为H、F、Cl、Br、-CN、被0至4个R1a取代的C1-3烷基、被0至4个R1a取代的C3-4环烷基、被0至4个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nRe或-P(O)ReRe；
每个R1a独立地为F、Cl、-CN、-OH、-OCH3或-NRaRa；
每个Ra独立地为H或C1-3烷基；
每个Re独立地为被0至4个R1a取代的C3-4环烷基或C1-3烷基；
R2为H、被0至4个R2a取代的C1-3烷基或被0至4个R2a取代的C3-4环烷基；
每个R2a独立地为F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、C3-4环烷基、C3-4烯基或C3-4炔基；
R3为H、F、Cl、Br、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C3-4环烷基、C3-4氟环烷基或-NO2；
R4为-CH2R4a、-CH2CH2R4a、-CH2CHR4aR4d、-CHR4aR4b或-CR4aR4bR4c；
R4a和R4b独立地为：
(i)C1-6烷基，被0至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、-NRaRa、-S(O)2Re或-NRaS(O)2Re；
(ii)C3-6环烷基、杂环基、苯基或杂芳基，各自被0至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-4羟烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟烷基)、-O(CH)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-6环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基和Rd；或
(iii)C1-4烷基，被一个选自C3-6环烷基、杂环基、芳基和杂芳基的环状基团取代，所述环状基团被0至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)和C3-6环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被0至3个Rf取代；
每个Rf独立地为F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被0至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基和-NRcRc；
R4c为C1-6烷基或C3-6环烷基，各自被0至4个选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基和-CN；
R4d为-OCH3；
每个Rc独立地为H或C1-2烷基；
Rd是苯基，被0至1个选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-CH3和-OCH3；
每个R5独立地为-CN、被0至4个Rg取代的C1-6烷基、被0至4个Rg取代的C2-4烯基、被0至4个Rg取代的C2-4炔基、被0至4个Rg取代的C3-4环烷基、被0至4个Rg取代的苯基、被0至3个Rg取代的噁二唑基、被0至4个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被0至4个Rg取代的杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；
每个Rg独立地为F、Cl、-CN、-OH、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-2O(C1-2烷基)或-NRcRc；
m是0、1、2或3；并且
n是0、1或2。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为H、F、Cl、Br、-CN、被0至4个R1a取代的C1-3烷基、被0至3个R1a取代的环丙基、被0至3个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nCH3或-P(O)(CH3)2；
每个R1a独立地为F、Cl或-CN；
每个Ra独立地为H或C1-3烷基；
R2为H或被0至2个R2a取代的C1-2烷基；
每个R2a独立地为F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、环丙基、C3-4烯基或C3-4炔基；
R3为H、F、Cl、Br、-CN、C1-2烷基、-CF3、环丙基或-NO2；
R4a和R4b独立地为：
(i)C1-4烷基，被0至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基和-NRaRa；
(ii)C3-6环烷基、杂环基、苯基或杂芳基，各自被0至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、-CH2OH、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟烷基)、-O(CH)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH)1-2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-O(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基和Rd；或
(iii)C1-3烷基，被一个选自C3-6环烷基、杂环基、苯基和杂芳基的环状基团取代，所述环状基团被0至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)和C3-4环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被0至3个Rf取代；
每个Rf独立地为F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被0至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基和-NRcRc；
R4c为C1-4烷基或C3-6环烷基，各自被0至4个选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基和-CN；
并且每个R5独立地为-CN、被0至4个Rg取代的C1-5烷基、被0至4个Rg取代的C2-3烯基、被0至4个Rg取代的C2-3炔基、被0至4个Rg取代的C3-4环烷基、被0至3个Rg取代的苯基、被0至3个Rg取代的噁二唑基、被0至3个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被0至4个Rg取代的杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa或-C(O)NRa(C3-4环烷基)。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
Figure FDA0003703349290000041
其中：
R1为-CN；
R2为-CH3；
R3为H、F或-CN；
R4为：
Figure FDA0003703349290000042
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
Figure FDA0003703349290000043
Figure FDA0003703349290000051
Figure FDA0003703349290000061
Figure FDA0003703349290000071
Figure FDA0003703349290000072
或者
Figure FDA0003703349290000073
25.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(II)的化合物：
Figure FDA0003703349290000081
或其盐，其中：
R1为H、F、Cl、Br、-CN、-OH、被0至4个R1a取代的C1-3烷基、被0至4个R1a取代的C3-4环烷基、被0至4个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nRe或-P(O)ReRe；
每个R1a独立地为F、Cl、-CN、-OH、-OCH3或-NRaRa；
每个Ra独立地为H或C1-3烷基；
每个Re独立地为被0至4个R1a取代的C3-4环烷基或C1-3烷基；
R2为H、被0至4个R2a取代的C1-3烷基或被0至4个R2a取代的C3-4环烷基；
每个R2a独立地为F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、C3-4环烷基、C3-4烯基或C3-4炔基；
R4为-CH2R4a、-CH2CH2R4a、-CH2CHR4aR4d、-CHR4aR4b或-CR4aR4bR4c；
R4a和R4b独立地为：
(i)-CN或C1-6烷基，所述C1-6烷基被0至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基、-NRaRa、-S(O)2Re或-NRaS(O)2Re；
(ii)C3-6环烷基、4至10元杂环基、苯基或5至10元杂芳基，各自被0至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-4羟烷基、-(CH2)1-2O(C1-3烷基)、C1-4烷氧基、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(C1-4羟烷基)、-O(CRxRx)1-3O(C1-3烷基)、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-3NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-CH2NRaRa、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-(CRxRx)0-2NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-3烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-(CRxRx)1-2(C3-4环烷基)、-(CRxRx)1-2(吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二氟吗啉基)、-(CRxRx)1-2(二甲基吗啉基)、-(CRxRx)1-2(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、(CRxRx)1-2(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-(CRxRx)1-2(甲基哌嗪酮基)、-(CRxRx)1-2(乙酰基哌嗪基)、-(CRxRx)1-2(哌啶基)、-(CRxRx)1-2(二氟哌啶基)、-(CRxRx)1-2(甲氧基哌啶基)、-(CRxRx)1-2(羟基哌啶基)、-O(CRxRx)0-2(C3-6环烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基环丙基)、-O(CRxRx)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CRxRx)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、-O(CRxRx)0-2(四氢吡喃基)、-O(CRxRx)1-2(吗啉基)、-O(CRxRx)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基、二氧戊环基、吡咯烷酮基和Rd；或
(iii)C1-4烷基，被一个选自C3-6环烷基、4至10元杂环基、单环或双环芳基或5至10元杂芳基的环状基团取代，所述环状基团被0至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)和C3-6环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被0至3个Rf取代；
每个Rf独立地为F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被0至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基和-NRcRc；
R4c为C1-6烷基或C3-6环烷基，各自被0至4个选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基和-CN；
R4d为-OCH3；
每个Rc独立地为H或C1-2烷基；
Rd是苯基，被0至1个选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-CH3和-OCH3；
每个R5独立地为-CN、被0至4个Rg取代的C1-6烷基、被0至4个Rg取代的C2-4烯基、被0至4个Rg取代的C2-4炔基、被0至4个Rg取代的C3-4环烷基、被0至4个Rg取代的苯基、被0至3个Rg取代的噁二唑基、被0至4个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被0至4个Rg取代的4至10元杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；
每个Rg独立地为F、Cl、-CN、-OH、C1-3烷氧基、C1-3氟烷氧基、-O(CH2)1-2O(C1-2烷基)或-NRcRc；
m是0、1、2或3；并且
n是0、1或2。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为H、F、Cl、Br、-CN、-OH、被0至4个R1a取代的C1-3烷基、被0至3个R1a取代的环丙基、被0至3个R1a取代的C1-3烷氧基、-NRaRa、-S(O)nCH3或-P(O)(CH3)2；
R2为H或被0至2个R2a取代的C1-2烷基；
每个R2a独立地为F、Cl、-CN、-OH、-O(C1-2烷基)、环丙基、C3-4烯基或C3-4炔基；
R4a和R4b独立地为：
(i)-CN或C1-4烷基，所述C1-4烷基被0至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、-CN、-OH、-OCH3、-SCH3、C1-3氟烷氧基和-NRaRa；
(ii)C3-6环烷基、4至10元杂环基、苯基或5至10元杂芳基，各自被0至4个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-CN、-OH、C1-6烷基、C1-3氟烷基、C1-2溴烷基、C1-2氰基烷基、C1-2羟烷基、-CH2NRaRa、-(CH2)1-2O(C1-2烷基)、-(CH2)1-2NRxC(O)O(C1-2烷基)、C1-4烷氧基、-O(C1-4羟烷基)、-O(CRxRx)1-2O(C1-2烷基)、C1-3氟烷氧基、C1-3氰基烷氧基、-O(CH2)1-2NRcRc、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)、-P(O)(C1-2烷基)2、-S(O)2(C1-3烷基)、-(CH2)1-2(C3-4环烷基)、-CRxRx(吗啉基)、-CRxRx(二氟吗啉基)、-CRxRx(二甲基吗啉基)、-CRxRx(氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基)、-CRxRx(氧杂氮杂螺[3.3]庚基)、-CRxRx(甲基哌嗪酮基)、-CRxRx(乙酰基哌嗪基)、-CRxRx(哌啶基)、-CRxRx(二氟哌啶基)、-CRxRx(甲氧基哌啶基)、-CRxRx(羟基哌啶基)、-O(CH2)0-2(C3-4环烷基)、-O(CH2)0-2(甲基环丙基)、-O(CH2)0-2((乙氧基羰基)环丙基)、-O(CH2)0-2(氧杂环丁烷基)、-O(CH2)0-2(甲基氮杂环丁烷基)、-O(CH2)1-2(吗啉基)、-O(CH2)0-2(四氢吡喃基)、-O(CH2)0-2(噻唑基)、环丙基、氰基环丙基、甲基氮杂环丁烷基、乙酰基氮杂环丁烷基、(叔丁氧基羰基)氮杂环丁烷基、二氧戊环基、吡咯烷酮基、三唑基、四氢吡喃基、吗啉基、噻吩基、甲基哌啶基和Rd；或
(iii)C1-3烷基，被一个选自C3-6环烷基、4至10元杂环基、单环或双环芳基或5至10元杂芳基的环状基团取代，所述环状基团被0至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-3烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc、-NRaS(O)2(C1-3烷基)、-NRaC(O)(C1-3烷基)、-NRaC(O)O(C1-4烷基)和C3-4环烷基；
或者R4a和R4b与它们所附接的碳原子一起形成C3-6环烷基或3至6元杂环基，各自被0至3个Rf取代；
每个Rf独立地为F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基、-OCH2CH＝CH2、-OCH2C≡CH、-NRcRc或选自C3-6环烷基、3至6元杂环基、苯基、单环杂芳基和双环杂芳基的环状基团，每个环状基团被0至3个独立地选自以下的取代基取代：F、Cl、Br、-OH、-CN、C1-4烷基、C1-2氟烷基、C1-3烷氧基、C1-2氟烷氧基和-NRcRc；
R4c为C1-4烷基或C3-6环烷基，各自被0至4个选自以下的取代基取代：F、Cl、-OH、C1-2烷氧基、C1-2氟烷氧基和-CN；
每个R5独立地为-CN、被0至4个Rg取代的C1-5烷基、被0至4个Rg取代的C2-3烯基、被0至4个Rg取代的C2-3炔基、被0至4个Rg取代的C3-4环烷基、被0至3个Rg取代的苯基、被0至3个Rg取代的噁二唑基、被0至3个Rg取代的吡啶基、-(CH2)1-2(被0至4个Rg取代的4至10元杂环基)、-(CH2)1-2NRcC(O)(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcC(O)O(C1-4烷基)、-(CH2)1-2NRcS(O)2(C1-4烷基)、-C(O)(C1-4烷基)、-C(O)OH、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)O(C3-4环烷基)、-C(O)NRaRa或-C(O)NRa(C3-4环烷基)；
每个Rx独立地为H或-CH3；并且
m是1、2或3。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
Figure FDA0003703349290000101
R1为-CN；
R2为-CH3；
R5a为-CH3或-CH2CH3；并且
R5c为-CH3、-CH2CH3或-CH2CH2CH3。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，具有以下结构：
Figure FDA0003703349290000102
Figure FDA0003703349290000111
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤或血液(液体)肿瘤。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述癌症选自本文所述的癌症。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用一种或多种其他癌症治疗。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述一种或多种其他癌症治疗包括放射、手术、化学疗法或施用生物药物。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述一种或多种其他癌症治疗是施用生物药物并且所述生物药物是刺激免疫系统的药物。
34.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述方法不包括在用DGKα和/或DGKζ抑制剂、PD1/PD-L1轴拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂治疗期间施用另一种癌症治疗。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中在施用DGKα和/或DGKζ抑制剂、PD1/PD-L1轴拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂之前，所述受试者尚未用PD1/PD-L1轴拮抗剂或CTLA4拮抗剂治疗。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用DGKα和/或DGKζ抑制剂、PD1/PD-L1轴拮抗剂和CTLA4拮抗剂。
37.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述受试者对用检查点抑制剂的拮抗剂，例如PD1/PD-L1轴拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂的治疗是耐药性的或难治性的。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用DGKα和/或DGKζ抑制剂、PD1/PD-L1轴拮抗剂和CTLA4拮抗剂。
39.根据权利要求21或权利要求25所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用PD1/PD-L1轴拮抗剂和CTLA4拮抗剂。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用PD1/PD-L1轴拮抗剂和CTLA4拮抗剂，其中所述PD1/PD-L1轴拮抗剂是本文所述的PD1/PD-L1或CTLA4拮抗剂或其变体或衍生物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述PD1/PD-L1轴拮抗剂是纳武单抗或其变体，并且所述CTLA4拮抗剂是伊匹单抗或其变体，例如相对于伊匹单抗具有降低的毒性的变体。
42.根据权利要求1-3和6-41中任一项所述的方法，其中所述DGKα和/或DGKζ抑制剂是DGKα和DGKζ的抑制剂。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL294032A (en) 2019-12-24 2022-08-01 Carna Biosciences Inc Compounds that regulate diacylglycerol kinase
CN111097048A (zh) * 2019-12-27 2020-05-05 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） Dgka抑制剂在制备用于促进抗肿瘤免疫治疗功效的药物中的应用
US11926628B2 (en) 2021-06-23 2024-03-12 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
WO2022271677A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
AU2022299051A1 (en) 2021-06-23 2023-12-07 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5851795A (en) 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US6051227A (en) 1995-07-25 2000-04-18 The Regents Of The University Of California, Office Of Technology Transfer Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
AP1590A (en) 1998-12-23 2006-03-14 Pfizer Human monoclonal antibodies to CTLA-4.
BR0013581A (pt) 1999-08-23 2002-07-02 Dana Faber Cancer Inst Inc Pd-1, um receptor para b7-4, e usos para isto
CN1371416B (zh) 1999-08-24 2012-10-10 梅达里克斯公司 人ctla-4抗体及其应用
EP1261376A1 (en) 2000-01-27 2002-12-04 Genetics Institute, LLC Antibodies against ctla4(cd152), conjugates comprising same, and uses thereof
JP4511943B2 (ja) 2002-12-23 2010-07-28 ワイス エルエルシー Ｐｄ−１に対する抗体およびその使用
US7381401B2 (en) * 2004-01-08 2008-06-03 The University Of Chicago T cell anergy is reversed by active Ras and regulated by diacylglycerol kinase
EP2418278A3 (en) 2005-05-09 2012-07-04 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
AU2006265108C1 (en) 2005-07-01 2013-01-17 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (PD-L1)
CA2647282A1 (en) 2006-04-05 2007-10-11 Pfizer Products Inc. Ctla4 antibody combination therapy
EP3222634A1 (en) 2007-06-18 2017-09-27 Merck Sharp & Dohme B.V. Antibodies to human programmed death receptor pd-1
US8168757B2 (en) 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
PE20120341A1 (es) 2008-12-09 2012-04-24 Genentech Inc Anticuerpos anti-pd-l1 y su uso para mejorar la funcion de celulas t
KR101934071B1 (ko) 2009-11-24 2019-01-02 메디뮨 리미티드 Ｂ７―ｈ１에 대한 표적화된 결합 물질
CA2828940C (en) 2011-03-10 2024-04-16 Provectus Pharmaceuticals, Inc. Combination of local and systemic immunomodulative therapies for enhanced treatment of cancer
PL2699264T3 (pl) 2011-04-20 2018-08-31 Medimmune, Llc Przeciwciała i inne cząsteczki wiążące B7-H1 i PD-1
AU2012344260B2 (en) 2011-11-28 2017-09-07 Merck Patent Gmbh Anti-PD-L1 antibodies and uses thereof
US9212224B2 (en) 2012-05-15 2015-12-15 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies that bind PD-L1 and uses thereof
CN115093480A (zh) 2012-05-31 2022-09-23 索伦托药业有限公司 与pd-l1结合的抗原结合蛋白
CN116637183A (zh) 2012-12-03 2023-08-25 百时美施贵宝公司 强化免疫调变性Fc融合蛋白的抗癌活性
SI2992017T1 (sl) 2013-05-02 2021-04-30 Anaptysbio, Inc. Protitelesa, usmerjena proti programirani smrti-1 (PD-1)
WO2014194302A2 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind pd-1
CN104250302B (zh) 2013-06-26 2017-11-14 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd‑1抗体及其应用
CN108715615B (zh) 2013-09-13 2020-11-27 百济神州(广州)生物科技有限公司 抗pd1抗体及其作为治疗剂与诊断剂的用途
MY184154A (en) 2013-12-12 2021-03-23 Shanghai hengrui pharmaceutical co ltd Pd-1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical application thereof
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
US10239942B2 (en) 2014-12-22 2019-03-26 Pd-1 Acquisition Group, Llc Anti-PD-1 antibodies
MA42971A (fr) 2015-03-13 2018-08-15 Cytomx Therapeutics Inc Anticorps anti-pdl1, anticorps anti-pld1 activables, et leurs procédés d'utilisation
KR102492532B1 (ko) 2015-05-29 2023-01-30 아게누스 인코포레이티드 항-ctla-4 항체 및 이의 사용 방법
EP3307777A4 (en) 2015-06-11 2019-02-13 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. NOVEL ANTI-PD-L1 ANTIBODIES
JO3736B1 (ar) 2015-07-30 2021-01-31 Macrogenics Inc جزيئات رابطة لـ pd-1 وطرق استخدامها
WO2017020291A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Novel anti-pd-l1 antibodies
WO2017024465A1 (en) 2015-08-10 2017-02-16 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Pd-1 antibodies
WO2017024515A1 (en) 2015-08-11 2017-02-16 Wuxi Biologics (Cayman) Inc. Novel anti-pd-1 antibodies
IL293385A (en) 2015-08-11 2022-07-01 Omniab Inc New anti–pd–1 antibodies
AR105654A1 (es) 2015-08-24 2017-10-25 Lilly Co Eli Anticuerpos pd-l1 (ligando 1 de muerte celular programada)
CN107949573B (zh) 2015-09-01 2022-05-03 艾吉纳斯公司 抗-pd-1抗体及其使用方法
MX2018007089A (es) 2015-12-14 2019-01-30 Macrogenics Inc Moleculas biespecificas que tienen inmunorreactividad con pd-1 y ctla-4, y metodos de uso de las mismas.
KR20180101417A (ko) 2016-01-11 2018-09-12 아르모 바이오사이언시스 인코포레이티드 항원-특이적 cd8+ t 세포의 제조에서 인터루킨-10 및 이의 사용 방법
WO2017132827A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Pd-1 antibodies
EP3402255B1 (en) 2016-02-02 2021-03-31 Huawei Technologies Co., Ltd. Emission power verification method, user equipment, and base station
BR112019008223A2 (pt) 2016-11-03 2019-07-16 Bristol-Myers Squibb Company anticorpos anti-ctla-4 ativáveis e usos dos mesmos
US11090304B2 (en) * 2018-05-04 2021-08-17 Amgen Inc. KRAS G12C inhibitors and methods of using the same
CN112654621B (zh) * 2018-06-27 2024-05-14 百时美施贵宝公司 可作为t细胞活化剂的经取代萘啶酮化合物
US11866430B2 (en) * 2018-06-27 2024-01-09 Bristol-Myers Squibb Company Naphthyridinone compounds useful as T cell activators
AR119821A1 (es) * 2019-08-28 2022-01-12 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de piridopirimidinonilo sustituidos útiles como activadores de células t

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