BRPI0213846B1 - Composição que compreende um anticorpo que liga especificamente uma dr5 do receptor de trail e um ou mais agentes terapêuticos - Google Patents

Abstract

"métodos de induzir seletivamente a apoptose nas células alvo que expressam dr5, de inibir a proliferação de células alvo que expressam dr5 e de tratar um paciente tendo uma doença inflamatória ou doença autoimune, e, composição". um anticorpo da invenção interage com a dr5 humana ou com a dr4 humana para produzir efeitos agonísticos ou antagonísticos a jusante do receptor incluindo a inibição da proliferação celular e apoptose. métodos e usos para os anticorpos, opcionalmente em combinação com vários agentes terapêuticos, são detalhados, incluindo o tratamento de doença relacionada com a apoptose e tratamento do desenvolvimento celular desregulado.

Description

“COMPOSIÇÃO QUE COMPREENDE UM ANTICORPO QUE LIGA ESPECIFICAMENTE UMA DR5 DO RECEPTOR DE TRAIL E UM OU MAIS AGENTES TERAPÊUTICOS”

RECONHECIMENTOS

Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. Número 60/391.478, depositado em 24 de junho de 2002 e pedido provisório U.S. Número 60/346.402, depositado em 1 de novembro de 2001 e reivindica prioridade para o PCT/US01/14151, depositado em Maio de 2001, que é presentemente pendente. O PCT/US01/14151 reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. Número 60/201.344, depositado em 2 de maio de 2000. Os pedidos para os quais o presente pedido reivindica benefício são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

Esta invenção foi feita com o auxílio do governo sob a Subvenção NCI P50 CA 89019-01 concedido pelo National Cancer Institute e sob o NIH R03-AR44982 concedido pelo National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases. O governo tem certos direitos sobre a invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a um anticorpo capaz de ligar-se especificamente a um único tipo de receptor do ligando indutor de apoptose (daqui em diante aludido como “TRAIL”) relacionado com o fator de necrose de tumor (daqui em diante aludido como “TNF”), mais particularmente, a um anticorpo monoclonal que induz a apoptose em células in vivo e in vitro expressando o receptor de tipo único e terapias com base nisso.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

TRAIL é um membro da família TNF de proteínas, que

Petição 870190048446, de 23/05/2019, pág. 10/20 também inclui TNF-α e ligando Fas (1). Estas proteínas são indutores potentes da apoptose. Até agora, cinco receptores para TRAIL foram identificados, dois dos quais, DR4 (TRAIL-R1) e DR5 (TRAIL-R2) (2-7), são capazes de transduzir o sinal de apoptose enquanto os outros três DcRl (TRAIL-R3), DcR2 (TRAIL-R4) e osteoprotegerina (OPG) não transduzem o sinal de apoptose (8-12). Todos os cinco receptores para TRAIL compartilham homologia significante nos seus domínios de ligação de ligando extracelular. Similar ao Fas e ao receptor I do TNF (daqui em diante aludido como “TNFRI”), os segmentos intracelulares tanto de DR4 quanto de DR5 contêm um domínio morto e transduz um sinal de apoptose através de um caminho que envolve a proteína de domínio morto associado com Fas (daqui em diante aludida como “FADD”) e caspase 8 (6,7). Além de transduzir o sinal de apoptose, os receptores de DR4 e DR5 também podem ativar um caminho que envolve NFKb (6,7).

As funções biológicas de TRAIL que foram demonstradas incluem a capacidade de TRAIL para induzir seletivamente a apoptose de células de tumor transformadas, com as células normais sendo relativamente resistentes à apoptose mediada pelo TRAIL (13-15). Esta seletividade sugere que, ao contrário do ligando Fas, a administração de TRAIL está associada com níveis muito baixo de toxicidade como demonstrado pela administração sistêmica de TRAIL em um modelo de animal sem induzir toxicidade significante (13). Assim, o TRAIL foi proposto como um agente indutor da apoptose potente que pode ser um agente terapêutico adequado para o tratamento de câncer e outras doenças associadas com a proliferação celular anormal. O TRAIL também foi proposto ser um agente indutor da apoptose potente que pode ser adequado para o tratamento de doenças autoimunes e inflamatórias. Foi demonstrado que a apoptose mediada pelo TRAIL está envolvida na morte celular induzida pela ativação de células T, servindo assim como um mecanismo alternativo para ligar Fas (16,17). A apoptose mediada pelo TRAIL também pode funcionar na indução da apoptose de células T e outras células inflamatórias (18) e desempenha um papel na atividade de destruição de células NK (19-21) e na função imunomoduladora de células dendríticas (22, 23). Assim, a apoptose mediada pelo TRAIL também pode funcionar em imunoprivilégio e imunovigilância.

O sistema de receptor TRAIL é complexo e inclui pelo menos dois receptores mortos, DR4 e DR5 e pelo menos dois receptores não apoptóticos, DcRl e DcR2. Todos estes receptores não apenas compartilham uma alta homologia de seqüência de aminoácido, mas também exibe uma afinidade de ligação similar ao TRAIL (2-12). A capacidade dos receptores de DcRl e DcR2 para competir quanto a ligação de TRAIL sem induzir a apoptose sugere que eles podem atuar como receptores isca que bloqueiam ou modulam a atividade do ligando TRAIL. Além disso, foi reportado que as células não transformadas expressam níveis mais altos de receptores isca do que de células transformadas. Assim, foi proposto que a modulação diferencial da expressão dos receptores mortos e isca pode representar um mecanismo regulador chave que determina a suscetibilidade de células à apoptose mediada pelo TRAIL, mas devido à falta de anticorpos específicos de receptor (2).

Embora a expressão e o funcionamento de DR4 e DR5 tenham sido extensivamente estudados, o progresso tem sido impedido pela falta de anticorpos monoclonais específicos de receptor. A expressão de superfície celular de DR5 não foi documentada. Foi reportado que um painel de anticorpos receptores anti-TRAIL foi gerado que são capazes de induzir a apoptose de células de melanoma in vitro mas apenas na imobilização dos anticorpos, para promover a reticulação, e em alguns casos, as células requerem cultivo com actinomicina D (24). Diversos anticorpos anti-DR5 foram gerados (24). Entretanto, estes anticorpos monoclonais anti-DR5 previamente gerados têm atividade indutora de apoptose baixa in vitro, mesmo sob as condições de reticulação. Nenhuma atividade in vivo foi reportada. Estes anticorpos não foram usados para examinar a expressão de superfície celular de receptores TRAIL (24). Assim, existe uma necessidade quanto a um anticorpo monoclonal seletivo para cada receptor TRAIL específico que não seja apenas capaz de ligar-se ao receptor de superfície celular mas também induzir fortemente a apoptose de vários tipos de células anormais, incluindo células de tumor, tanto in vivo quanto in vitro sem a exigência quanto a reticulação ou imobilização. Um tal anticorpo pode não apenas fornecer um agente terapêutico potencial mas também uma ferramenta de diagnóstico para a análise funcional de receptor TRAIL. Existe uma necessidade particular para um anticorpo específico contra cada um dos receptores indutores de morte de DR4 e DR5.

No desenvolvimento ou progressão, de muitas doenças é freqüentemente o caso que as células não são suprimidas. Em muitas doenças autoimunes e condições inflamatórias, as células ativadas sobreviventes atacam tecidos ou células normais. Além disso, a progressão da tumorigênese e a formação de pano proliferativo da artrite reumatóide são caracterizados pela proliferação incontrolada de células. Assim, a apoptose insuficiente leva ao desenvolvimento de doença e os usos de ligando indutor de apoptose ou anticorpo monoclonal agonístico para realçar a apoptose são considerados como uma estratégia terapêutica potencial para eliminar aquelas células não desejadas.

Por exemplo, a artrite reumatóide (daqui em diante aludida como “RA”) é uma doença autoimune humana comum. O conhecimento corrente da fisiopatologia da RA é que as células T e células B autoimunes iniciam uma resposta inflamatória nas juntas, que direciona a hiperproliferação dos sinoviócitos. Como uma conseqüência da hiperproliferação das células sinoviais, as metaloproteínases (daqui em diante aludidas como “MMPs”) são super-produzidas, que leva ainda à destruição

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erosiva da cartilagem e do osso o que é característico da RA (25). Assim, o controle da hiperproliferação de células sinoviais inflamatórias é uma etapa chave no tratamento da RA. Os mecanismos moleculares que levam à hiperproliferação de células sinoviais são ainda desconhecidos. Embora as células sinoviais hiperproliferativas não sejam malignas e nem transformadas, muitos estudos têm sugerido que elas compartilham algumas características comuns com as células transformadas (46). Estas células, as chamadas, “sinoviócitos que parecem transformados”, são caracterizadas por um retículo endoplasmático bruto denso, núcleos irregulares numerosos e mudanças no esqueleto da célula normalmente na forma de fuso. Foi proposto que a incorporação dos oncogenes e genes derivados de vírus podería ser o gatilho primário para a aparecência transformada de células sinoviais de RA (46).

Pelo menos dois aspectos de RA sugerem que a apoptose desregulada pode contribuir para o processo de doença e que a eliciação terapêutica da apoptose pode ser um tratamento eficaz: a falta da supressão das células T ativadas sugere que existe morte celular induzida defeituosa pela ativação destas células T, que é um processo que envolve a apoptose mediada por Fas e a apoptose mediada pelo TRAIL e a natureza hiperproliferativa das células sinoviais de RA é um fator contribuinte nos estágios avançados da fisiopatologia de RA. De fato, foi mostrado que a administração de anticorpo anti-Fas na junta inflamatória inibe o desenvolvimento de artrite crônica em camundongos transgênicos tax, que são um modelo de animal para a RA humana (26). Além disso, a transdução localizada com o gene ligando fas por um vetor adenoviral é eficaz na prevenção da artrite induzida pelo colágeno (27). A inibição da proliferação de células sinoviais inflamatórias pelo realce da apoptose mediada por Fas é observada em ambos os casos. Embora o ligando Fas seja um indutor de apoptose forte em células sinoviais de RA, a aplicação de apoptose mediada por ligando Fas como uma terapia para seres humanos foi limitada pela toxicidade hepática letal. Assim, a apoptose induzida pelo receptor de TRAIL representa um produto terapêutico seguro e mais eficaz para o tratamento de RA do que a apoptose induzida pelo ligando de Fas. A apoptose induzida pelo receptor de TRAIL também representa um produto terapêutico seguro e mais eficaz para o tratamento de câncer do que a apoptose induzida pelo ligando de Fas. A apoptose mediada por TRAIL é conhecida por induzir especificamente a apoptose de células de tumor transformadas sem afetar as células normais. Foi mostrado que a administração sistêmica do TRAIL solúvel trimerizado não causou toxicidade em animais experimentais embora fosse capaz de induzir a regressão de tumores implantados (13, 28). O seu potencial como uma terapia adjuntiva para os tratamentos tradicionais foi ressaltado pela descoberta recente de que a expressão de DR5 e a suscetibilidade à apoptose induzida por TRAIL de células de câncer mamário é realçada pela radiação, sugerindo que combinada com radiação, a eficiência de TRAIL pode ser aumentada na terapia contra o câncer (29).

Além disso, o gene que codifica o receptor de TRAIL de DR5 foi mapeado até o cromossoma 8p21-22, locais com uma freqüência alta de mutação em algumas células cancerosas (30). Foi reportado que pelo menos dois tipos de células de tumor, a de câncer de pulmão pequena (31) e a de câncer de cabeça e pescoço (32) exibem mutações no domínio morto do gene de DR5. Assim, existe um necessidade para um anticorpo anti-DR5 na pesquisa contra o câncer para determinar o efeito da variação do epítopo receptor no desenvolvimento e progressão de canceres. Além disso, a funcionalidade das mutações do receptor de TRAIL pode demonstrar uma ferramenta de diagnóstico clínico útil quando usada em conjunção com outros biomarcadores na detecção precoce de canceres e como um prognosticador da agressividade do tumor.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo que reconhece um receptor de TRAIL de DR5 e que induz a apoptose em uma célula que expressa DR5 in vivo ou in vitro. Além disso é divulgado um anticorpo que reconhece DR5 mas não DR4, DcRl ou DcR2. É especificamente detalhado um anticorpo monoclonal para DR5 produzido por um hibridoma.

Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo que reconhece um Receptor TRAIL DR4 e que induz a apoptose em uma Célula que expressa DR4 in vivo ou in vitro. Além disso é divulgado um anticorpo que reconhece DR4 mas não DR5, DcRl ou DcR2. É especificamente detalhado um anticorpo monoclonal para DR4 produzido por um hibridoma.

Um método fornecido é a indução de apoptose em células alvo ou a inibição da proliferação da célula alvo contatando-se uma célula com uma quantidade terapêutica de um anticorpo capaz de ligar-se à DR5 ou DR4. Em várias formas de realização do método, a apoptose pode ser induzida ou a proliferação celular inibida contatando-se as células alvo com anticorpos contra outros receptores mortos.

Também é divulgado uma composição farmacológica que inclui uma quantidade terapêutica de anticorpo monoclonal ativo contra uma DR5, um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um recipiente encerrando o anticorpo e o veículo. Além disso é fornecido pela invenção o uso de um anticorpo que reconhece DR5 ou um anticorpo que reconhece DR4 para preparar um produto terapêutico para a apoptose seletiva de células anormais ou desreguladas.

Um anticorpo da presente invenção interage com um receptor do ligando indutor de apoptose relacionado com o fator de necrose de tumor tal como DR4, DR5, DrRl, DrR2 e OPG, induzindo a apoptose em uma célula que expresse um tal receptor. É divulgado um anticorpo da invenção capaz de ligar seletivamente um epítopo de receptor de ligando de fator de

necrose de tumor agonístico ou antagonístico.

A presente invenção fornece um tratamento para uma doença relacionada com a apoptose, câncer, doença inflamatória ou uma doença autoimune por um método que inclui contatar um tecido alvo tendo a doença com uma quantidade terapêutica de um anticorpo da invenção, isoladamente ou em combinação com outros anticorpos indutores de apoptose e/ou outros agentes ou tratamentos terapêuticos.

Além disso é descrito uma proteína de fusão que inclui uma seqüência de aminoácido do receptor de TRAIL antigênica tendo pelo menos dez bases, ligada a uma proteína de imunoglobulina ou fragmento desta capaz de evocar uma resposta imune dentro de um paciente.

A presente invenção fornece um método de terapia de gene em que uma célula alvo é transfectada com uma seqüência de ácido nucléico do receptor de TRAIL em um vetor de expressão de modo que o receptor de TRAIL seja expressado na célula alvo. A célula alvo é depois exposta a um anticorpo que seletivamente se liga ao receptor de TRAIL.

São fornecidas seqüências de ácido nucléico e seqüências de aminoácido que codificam as imunoglobulinas de cadeia pesada e leve de um anticorpo seletivo para DR5. As seqüências também são fornecidas para um anticorpo que seletivamente se liga a DR4. São também detalhados vetores que incluem uma seqüência de ácido nucléico da invenção e células hospedeiras transformadas com um vetor da invenção.

A presente invenção fornece um anticorpo de DR5 humanizado (por exemplo, TRA-8) e um DR4 humanizado (por exemplo, 2E12), assim como uma célula transfectada que produz o anticorpo de DR5 humanizado e uma célula transfectada que produz o anticorpo de DR4 humanizado.

Um processo para produzir um anticorpo de DR5 ou anticorpo de DR4 humanizados está descrito em que um hospedeiro é transformado com seqüências de ácido nucléico que codificam uma cadeia leve de imunoglobulina humanizada e um cadeia pesada de imunoglobulina humanizada depois do que o hospedeiro transformado é incubado por um período de pré determinado de tempo.

Também é descrito um processo para induzir a apoptose em células alvo ou para inibir a proliferação celular que inclui contatar uma célula alvo com uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um anticorpo de DR5 humanizado, um anticorpo de DR4 humanizado ou uma combinação de um anticorpo de DR5 e um anticorpo para um outro receptor morto (por exemplo, um anticorpo para DR4, na presença ou ausência de outros agentes e tratamentos terapêuticos.

Um kit comercial é fornecido para induzir apoptose que inclui um anticorpo TRA-8 humanizado seletivo para DR5 ou um anticorpo humanizado para DR4 (por exemplo, 2E12 humanizado), empacotado em um recipiente adequado e opcionalmente com instruções para o uso.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Caracterização de TRA-8. (a.) especificidade de ligação de TRA-8: análise de Western blot (painel superior): Proteínas de fusão recombinantes da família TNFR sondada com TRA-8 ou IgG antihumano. Linha 1: proteína de fusão DR5/hIgGl (imunógeno); Linha 2: DR4/hIgGl (TRAIL-R1); Linha 3: DR5/hIgGl; Linha 4: TRAIL-R3 (DcR-

l)/hIgGl; Linha 5: TRAIL-R4 (DcR-2)/hIgGl; Linha 6, CD95/hIgGl; Linha 7: TNFRI solúvel. Análise de ELISA (painel inferior): Os números de reservatórios se igualam àqueles da Western blot exceto o reservatório 8 que é uma proteína de fusão DR5/hIgGl de murino. (b.) Atividade de ligação de TRAIL e TRA-8 solúveis para DR5 e DR4: as placas de ELISA foram revestidas com DR5/hIgGl (painel esquerdo) ou DR4/hIgGl (painel central) e depois incubadas com TRAIL ou TRA-8. (c.) Análise de citometria de fluxo da expressão de superfície de DR5. Células Cos-7 transfectadas com vetor de expressão de pcDNA3 contendo o cDNA de DR5 de comprimento completo (histograma sólido), cDNA de DR4 (histograma aberto, linha sólida) ou vetor vazio (histograma aberto, linha tracejada). Quarenta e oito horas depois da transfecção, as células foram tingidas com TRA-8 seguido por IgGl anticamundongo conjugada a PE. (d.) reatividade imunoistoquímica in situ para DR5: lâminas Cytospin de células Cos-7 transfectadas com vetor de expressão ou controle de DR5 foram tingidas com TRA-8 48 horas depois da transfecção, (e.) Atividade de destruição de TRA-8: células Jurkat foram incubadas com as concentrações indicadas de TRA-8. A viabilidade celular foi determinada por ensaios de exclusão ATPLite, MTT e PI depois de cultura durante a noite. Os resultados dos ensaios ATPLite e MTT estão apresentados como porcentagem de controle do meio e o ensaio PI está apresentado como porcentagem de células negativas PI (f.) A análise de Western blot da ativação da caspase: as células Jurkat foram incubadas com 500 ng/ml de TRA-8 pelo tempo indicado. Os lisados celulares foram separados pela SDSPAGE a 15%, manchados e sondados com anticorpos anti-caspase. As setas indicam as subunidades clivadas de cada caspase. g. Ensaio de inibição de caspase: as células Jurkat foram incubadas com 50 ng/ml de TRA-8 durante a noite na presença de várias concentrações de inibidores de caspase indicados. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio ATPLite.

Figura 2. Expressão de superfície celular de DR5 e suscetibilidade à apoptose mediada pela DR5. Linhagens celulares de células T e B normais, recém isoladas de sangue periférico, célula T (a e a’), glioma (b e b’), célula de câncer prostático (c) e célula B (d) foram incubadas com TRA-8 ou anticorpo de controle de isotipo de IgGl de murino seguido por IgGl anti-camundongo de cabra conjugado a PE. Os histogramas abertos representam o controle de anticorpo isotípico enquanto os histogramas sólidos representam tingimento com TRA-8. A apoptose foi determinada pelo ensaio ATPLite depois de incubação durante a noite com TRAIL solúvel (círculos abertos) ou TRA-8 (círculos fechados) como mostrado ema,b’ ed.

Figura 3a’ A linhagem de célula T U937 foi incubada com TRA-8 ou anticorpo de controle de isotipo IgGl de murino. A apoptose foi determinada pelo ensaio ATPLite depois da incubação durante a noite com TRAIL solúvel (círculos abertos) ou TRA-8 (círculos fechados).

Figura 3 Linhagens celulares de glioma (b) e câncer prostático (c) foram incubadas com TRA-8 ou anticorpo de controle de isotipo IgGl de murino. A apoptose foi determinada pelo ensaio ATPLite depois da incubação durante a noite com TRAIL solúvel (círculos abertos) ou TRA-8 (círculos fechados)

A Figura 4 é uma série de gráficos que mostram a viabilidade celular para células Jurkat humanas depois da exposição às concentrações indicadas de (A) cepas de anticorpo TRA-1, -8 e -10 e (B) TRAIL na presença de uma concentração fixa das cepas de anticorpo da invenção representadas na Figura 4A;

Figura 5. Expressão de DR5 em tecidos normais e cancerosos: Os homogenados de tecidos normais e cancerosos foram sondados com TRA8 e desenvolvidos pela quimioluminescência. (a.) Análise de Western blot de proteína DR5 em tecidos normais: linha 1: fígado, linha 2: cérebro, linha 3: pulmão, linha 4: rim, linha 5: baço, linha 6: testículos. Linha 7: ovário, linha 8: coração, linha 9: pâncreas, b. análise de Western blot de proteína DR5 em tecidos cancerosos. A mancha do tecido canceroso contendo canceres do ovário (linha 1), pulmão (linha 2), fígado (linha 3), reto (linha 4), cérvix (linha 5), pele (linha 6), testículos (linha 7), tireóide (linha 8), útero (linha 10), estômago (linha 11), laringofaringe (linha 12) e pâncreas (linha 13) foi sondada. A imunoistoquímica in situ de tecidos humanos normais (c.) e de tecidos cancerosos (d.). As seções congeladas foram imunotingidas com TRA-8.

Figura 6. Atividade tumoricida de TRA-8. Os camundongos

SCID foram subcutaneamente inoculados com células 1321N1. Os camundongos foram injetados intravenosamente com uma única dose de 100 pg de TRA-8 no segundo dia depois da inoculação de tumor (a.) ou com três doses de 100 pg de TRA-8 começando 7 dias depois da inoculação de tumor (b) O desenvolvimento do tumor foi determinado pelo peso e histologicamente examinado com tingimento H&E. As fotografias mostram o desenvolvimento do tumor viável em camundongos de controle mas não em camundongos tratados com TRA-8 (c., painel superior) e tingimento com H&E de tumor (c., painel inferior). Os camundongos SCID foram intravenosamente injetados com 10⁶ células Jurkat e tratados com uma dose única de TRA-8 no segundo dia depois da injeção. Sete dias mais tarde, as células do baço foram colhidas, tingidas com anticorpo CD3 anti-humano e analisadas pela citometria de fluxo (d.) ou pela imunoistoquímica (e).

A Figura 7 mostra a expressão de DR5 na superfície celular em células sinoviais de RA (A) e O A (B). 1 x 10⁶ células primárias cultivadas sinoviais foram tingidas com TRA-8 purificadas por afinidade e seguido por anticorpo IgGl anti-camundongo de cabra conjugado com PE. 10.000 células viáveis analisadas por FACSvantage.

A Figura 8 é uma série de gráficos mostrando a viabilidade celular como uma função da apoptose induzida pela concentração de TRAIL e TRA-8 de cepas representativas de células sinoviais de RA (A) e OA (B) com várias concentrações do TRAIL solúvel recombinante (os círculos abertos) ou TRA-8 purificado por afinidade (os círculos fechados). A viabilidade celular é a porcentagem do cpm de células tratadas versus o cpm de células não tratadas.

A Figura 9 é uma série de gráficos mostrando a dependência da caspase de apoptose mediada pela DR5 de células sinoviais RA. As células sinoviais RA (RA512) são incubadas com 50 ng/ml de ligando Fas solúvel (quadrados abertos), anticorpo anti-Fas (CH-11) (quadrados fechados),

TRAIL solúvel (círculos abertos) ou anticorpo anti-DR5 (TRA-8) (círculos fechados) na presença de concentrações variáveis de inibidores da caspase. Depois da cultura durante a noite, a viabilidade celular é determinada pelo ATPLite.

A Figura 10A é um ensaio de mudança em gel eletroforético indicando a ativação de NFkb. Células RA1016 são incubadas com 20 ng/ml de TNF-a, 50 ng/ml de TRAIL solúvel ou 50 ng/ml de TRA-8 durante os pontos de tempo indicados antes de serem submetidas à eletroforese. As Figuras 10B e C são gráficos que mostram a produção de MMP-1 e MMP-3. 1 x 10⁶/ml de células sinoviais RA indicadas são incubados com as concentrações indicadas de TNF-a (os círculos abertos), TRAIL (os triângulos abertos) ou TRA-8 (o círculo fechado). Depois da cultura durante a noite, os sobrenadantes de cultura são coletados. Os níveis de MMPs em sobrenadantes de cultura são determinados pelo ELISA.

Figura 11. TRA-8 não induz a toxicidade hepatocelular. (a.) os tecidos hepáticos normais não expressam DR5. As seções de parafina de dois tecidos hepáticos normais, um tecido de carcinoma hepatocelular e a preparação em cytospin de células HepG2 foram preparadas para fingimento H&E e as seções congeladas correspondentes foram tingidas com TRA-8. (b.) Análise de citometria de fluxo de expressão de superfície celular de DR5. Hepatócitos, isolados de dois tecidos hepáticos normais e de um caso de tecido de carcinoma hepatocelular e células HepG2 foram tingidas com TRA8, anticorpo anti-Fas (DX2) ou um anticorpo de controle de isotipo. Os histogramas sólidos indicam fingimento com TRA-8 ou DX2 e os histogramas abertos são os controles de isotipo correspondentes.

Figura 12. TRAIL mas não TRA-8 induz a toxicidade hepatocelular. Hepatócitos humanos normais frescos foram mantidos em Meio de Cultura de Hepatócito. (a.) A apoptose de hepatócitos foi induzida com 1 pg/ml de TRAIL solúvel mais reticulador ou TRA-8 para os pontos de tempo indicados. A viabilidade celular foi determinada pelo ATPLite. Os resultados estão apresentados como porcentagem de células viáveis comparadas com o controle do meio. As barras sombreadas indicam TRAIL e as barras pretas indicam TRA-8. (b.) Os núcleos condensados de hepatócitos foram tingidos com Hoechst 33352 e analisados pela citometria de fluxo, (c.) Efeito de ciclo-heximida na apoptose de hepatócitos. Os hepatócitos foram cultivados em meio de controle ou com 1 pg/ml de TRAIL ou TRA-8 na presença (barras fechadas) ou ausência (barras abertas) de 1 pg/ml de cicloheximida durante 8 horas. A viabilidade celular foi determinada pelo ATPLite. Os resultados são apresentados como média ± SEM de culturas em triplicata de dois experimentos, d. Uma comparação da suscetibilidade de hepatócitos normal à apoptose mediada por DR5 e Fas. hepatócitos recém isolados foram incubados com as concentrações indicadas de TRAIL solúvel, TRA-8, FasL solúvel ou o mAb CHI 1 anti-Fas durante 6 horas. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio ATPLite. Os resultados são apresentados como a porcentagem de células viáveis comparadas com o controle do meio. Para hepatócitos normais, a média ± SEM de quatro indivíduos normais é apresentada. Os resultados de células de carcinoma hepatocelular de um paciente e células HepG2 são apresentadas como a média de culturas em triplicatas.

Figura 13. TRAIL induz a hepatite. Camundongos B6 foram intravenosamente inoculados com 10⁹ pfo de vetor adenoviral que codifica o comprimento completo de TRAIL humano sob o controle do elemento transcricional “Tet-on”. A expressão TRAIL foi induzida pela dose indicada de tetraciclina. (a.) Análise de Northem blot da expressão de TRAIL humana no fígado. 24 horas depois da inoculação do vetor e da indução com tetraciclina, o RNA total foi isolado dos fígados e sondado com cDNA de TRAIL humano ou β-actina. (b.) Níveis séricos de AST. 24 horas depois da transdução de TRAIL, os níveis séricos de AST foram determinados, (c.)

Morte celular mediada pelo TRAIL de hepatócitos infectados com vetor adenoviral: Os camundongos B6 foram intravenosamente inoculados com vetor adenoviral indutível com tetraciclina. 48 horas depois da inoculação, os hepatócitos de camundongos de controle inoculados e não inoculados foram isolados e incubados com concentrações indicadas de TRAIL durante 8 horas (painel esquerdo). A viabilidade celular de hepatócitos foi determinada pelo ensaio ATPLite. Os camundongos, inoculados com vetor adenoviral como acima, foram intravenosamente injetados com 10 pg de TRAIL humano solúvel 48 horas mais tarde. Os níveis séricos de AST foram medidos em 24 horas depois da injeção TRAIL (painel direito), (d. e e.) Análise histológica do dano hepático induzido pelo TRAIL. Os fígados foram coletados em 24 horas (d.) ou 7 dias (e.) depois da transdução com TRAIL. As seções de parafina foram tingidas com H&E e fotografadas em 100X (painel de topo) e 400X (painel inferior).

A Figura 14 é uma série de gráficos que mostram que as células T e B ativadas purificadas de PBMC humana expressam níveis aumentados de DR5 como determinado pela citometria de fluxo para células latentes (não cheios) e ativadas (sombreados).

A Figura 15 é um gráfico de viabilidade como uma função da concentração de TRA-8 para as células T e células B purificadas representadas na Figura 14 que foram estimuladas durante 48 horas com antiCD3 ou anti-μ, com células ativadas e destruídas coletadas pela densidade diferente de Ficoll-Paque. A viabilidade é determinada pelo ensaio ATPLite.

A Figura 16 é um histograma e plotagens de citometria de fluxo mostrando a expressão de CD3 em uma população de linfócito gated para camundongos NOD/SCID esgotados em célula NK injetados com PBMC humana e TRA-8 ou IgG (controle).

A Figura 17 mostra micrografias celulares tingidas com CD3 e TUNEL para tecido de baço de camundongo como detalhado no Exemplo 13.

A Figura 18 mostra a plotagem de citotoxicidade para as células da leucemia linfolítica crônica (CCL) e B normal humanas na presença de TRA-8, BISVHI e as suas combinações.

Figura 19(a). Ligação específica de 2E12 para DR4. As placas de ELISA foram revestidas com a forma solúvel de proteínas de fusão Fc de IgGl humana do receptor de TRAIL humano como indicado e incubadas com a concentração indicada de mAb 2E12, seguido por IgGl anti-camundongo conjugado a HRP. A reação foi desenvolvida com tampão de substrato TMB e os valores de OD foram medidos a 450/650 nM.

Figura 19(b). 2E12 se liga à DR4 da superfície celular. As células Cos-7 foram transfectadas com o vetor contendo o cDNA de comprimento completo para DR4 (histograma sólido) ou vetor de controle (histograma aberto). As células transfectadas foram tingidas com 10 pg/ml de 2E12 e IgGl anti-camundongo conjugado a PE. As células foram analisadas pela citometria de fluxo.

Figura 19(c). Atividade indutora de apoptose de 2E12. Células de linfoma Ramos B Humanas foram incubadas durante a noite com as concentrações indicadas de 2E12 na presença de 2 pg/ml de IgGl anticamundongo. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio ATPLite. (d) Ativação da caspase induzida por 2E12. As células Ramos foram tratadas com 2E12 e anticorpo IgG anti-camundongo durante os pontos de tempo indicados. A ativação da caspase e a divagem de PARP foram determinadas pela análise de Western blot usando anticorpos anticaspase ou PARP específicos.

Figura 20. O efeito de 2E12 e adriamicina em camundongos nus atímicos que carregam xenoenxertos de câncer mamário. Células 2LMP (3 x 10⁷) foram injetados subcutaneamente em camundongos nus atímicos no dia 0. Dois grupos de camundongos foram injetados intraperitonealmente com 200 pg de 2E12 nos dias 7, 10, 14, 17, 21 e 24. Dois grupos de camundongos receberam adriamicina i.v. (6 mg/kg) nos dias 8, 12 e 16. Um grupo de camundongos não recebeu nenhum anticorpo. Os dados são expressados como a mudança média no tamanho do tumor relativo ao tamanho no dia 7 (n = 8 camundongos/grupo).

Figura 21. O efeito de TRA-8, 2E12 e adriamicina em camundongos nus atímicos que carregam xenoenxertos de câncer mamário. As células 2LMP (3 x 10⁷) foram injetados s. c. em camundongos nus atímicos no dia 0. Dois grupos de camundongos foram injetados i.p. com 200 pg de TRA-8 e 2E12 nos dias 7, 10, 14, 17, 21 e 24. Dois grupos de camundongos receberam adriamicina i.v. (6 mg/kg) nos dias 8, 12 e 16. Um grupo de camundongos não receberam nenhum anticorpo. Os dados são expressos como a mudança média no tamanho do tumor relativo ao tamanho no dia 7 (n = 8 camundongos/grupo).

A Figura 22A mostra a análise citométrica de fluxo da expressão da superfície celular de DR-5 em um painel de linhagens celulares de câncer mamário humano. Células de câncer mamário foram colhidas usando EDTA e manchadas com lOpg/ml TRA-8 mAb por Ih a 4°C, seguido por IgGl de cabra anti-camundongo conjugado a PE, e então analisadas usando os softwares FACScan e CellQuest. Histogramas espessos indicam o manchamento por TRA-8, e histogramas estreitos indicam a incubação com o anticorpo de controle do isotipo de IgGl de camundongo. A Figura 22B mostra a citotoxicidade do TRA-8 para linhagens celulares de câncer mamário humano. Células foram tripsinizadas e replaqueadas a uma densidade de 1000 células/reservatório em uma placa de 96 reservatórios. O anticorpo TRA-8 foi adicionado após o plaqueamento das células, e incubado por 24h a 37°C. A viabilidade celular é avaliada 24h depois da adição de TRA-8 usando o ensaio ATPLite. Os níveis de ATP são reportados relativamente a células de controle não-tratadas como a média e SE de 2-3 experimentos independentes, cada um SEGUE A PÁG. 17a

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feito em triplicata.

A Figura 23A mostra a citotoxicidade do tratamento com combinação de TRA-8 e adriamicina em linhagens celulares de câncer mamário humano. Células (1000/reservatório) foram expostas a várias concentrações de adriamicina por 24h a 37°C começando 24h após o plaqueamento das células. O TRA-8 foi adicionado 24h após a adição da adriamicina, e os níveis de ATP foram determinados 24h depois. Os valores representam a média e SE de determinações triplicatas de 2-4 experimentos independentes, cada um feito em triplicata, e são reportados relativamente a células de controle não-tratadas. A Figura 22B mostra a citotoxicidade do tratamento com combinação de TRA-8 e paclitaxel m linhagens celulares de câncer mamário humano. Células (1000/reservatório) foram expostas a várias concentrações de paclitaxel por 24h a 37°C começando 24h após o plaqueamento das células. O TRA-8 foi adicionado 24h após a adição da paclitaxel, e os níveis de ATP foram determinados 24h depois. Os valores representam a média e SE de determinações triplicatas de 2-4 experimentos independentes, cada um feito em triplicata, e são reportados relativamente a células de controle não-tratadas.

A Figura 24 mostra o efeito do TRA-8 no crescimento tumoral em camundongos nus atímicos que carregam xenoenxertos de câncer mamário humano de 2LMP estabelecidos. Células 2LMP (3 x 10 ) foram injetadas subcutaneamente no dia 0. Dois grupos de camundongos foram injetados intraperitonealmente com 200 pg ou 600 pg de TRA-8 nos dias 7, 10, 14, 17, 21 e 24. Um grupo de camundongos não recebeu nenhum anticorpo. Os dados representam a mudança média no tamanho do tumor (produto de dois diâmetros) relativa ao tamanho no dia 7 (n=8 camundongos/grupo).

A Figura 25 mostra o efeito do TRA-8 e da adriamicina no SEGUE A PÁG. 17b

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crescimento tumoral em camundongos nus atímicos que carregam xenoenxertos de câncer mamário. Células 2LMP (3 x 10 ) foram injetadas subcutaneamente em camundongos nus atímicos no dia 0. Dois grupos de camundongos foram injetados intraperitonealmente com 200 pg de TRA-8 nos dias 7, 10, 14, 17, 21 e 24. Dois grupos de camundongos receberam adriamicina i.v. (6 mg/kg) nos dias 8, 12 e 16. Um grupo de camundongos não recebeu nenhum anticorpo. Os dados são expressos como a mudança média no tamanho do tumor (produto de dois diâmetros) relativo ao tamanho no dia 7 (n=6-8 camundongos/grupo).

A Figura 26 mostra o efeito do TRA-8 e do paclitaxel em camundongos nus atímicos que carregam xenoenxertos de câncer mamário. Células 2LMP (3 x 10 ) foram injetadas subcutaneamente em camundongos nus atímicos no dia 0. Dois grupos de camundongos foram injetados intraperitonealmente com 200 pg de TRA-8 nos dias 7, 10, 14, 17, 21 e 24. Dois grupos de camundongos receberam paclitaxel i.v. (20 mg/kg) nos dias 8, 12, 16, 20 e 24. Um grupo de camundongos não recebeu nenhum anticorpo. Os dados são expressos como a mudança média no tamanho do tumor (produto de dois diâmetros) relativo ao tamanho no dia 7 (n=8 camundongos/grupo).

A Figura 27 mostra o efeito do TRA-8, da adriamicina, e da radiação de ⁶⁰Co no crescimento tumoral em camundongos nus atímicos que carregam xenoenxertos de câncer mamário. Células 2LMP (3x10) foram injetadas subcutaneamente em camundongos nus atímicos no dia 0. Três grupos de camundongos foram injetados intraperitonealmente com 200 pg de TRA-8 nos dias 7, 10, 14, 17, 21 e 24. Dois grupos de camundongos receberam adriamicina i.v. (6 mg/kg) nos dias 8, 12 e 16. Quatro grupos de camundongos receberam 3 irradiações de Gy ⁶⁰Co nos dias 9 e 17. Um grupo de camundongos não recebeu nenhum anticorpo. Os dados são expressos SEGUE A PÁG. 17c

17c como a mudança média no tamanho do tumor (produto de dois diâmetros) relativo ao tamanho no dia 7 (n=8 camundongos/grupo).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A insuficiência para suprimir células é devido aos defeitos no sistema indutor de apoptose que são associados com defeitos que ilustrativamente incluem a expressão ou funcionamento do ligando, do receptor ou das moléculas reguladoras e efetoras intracelulares. A presente invenção produz um método para corrigir um sistema indutor de apoptose deficiente assim como para elucidar os defeitos específicos inerentes em um 10 dado sistema indutor de apoptose defeituoso.

A presente invenção diz respeito a uma nova classe de anticorpos monoclonais que têm atividade indutora de apoptose in vivo e in vitro seletiva contra os receptores TRAIL específicos, incluindo DR5, DR4, DcRl e DcR2. Assim, os anticorpos da presente invenção especificamente se 15 ligam a um dos receptores de TRAIL. Por “ligar seletivamente” ou “reconhecer especificamente” significa que o anticorpo se liga apenas a um receptor de TRAIL e mostra pouca ou nenhuma ligação aos outros tipos de receptores de TRAIL usando a análise de Western blot tradicional. Um

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4* «Lanticorpo de DR5 da presente invenção se liga seletivamente à DR5 e não apresenta nenhuma ligação acima de cerca de 1,5 vezes o fundo para DR4, DcRl ou DcR2. Similarmente, um anticorpo DR-4 da presente invenção se liga seletivamente a DR4 e não apresenta nenhuma ligação acima de cerca de 5 1,5 vezes o fundo para DR5, DcRl ou DcR2. A presente invenção tem utilidade como um reagente para pesquisar a sinalização de apoptose, assim como utilidade como um produto terapêutico eficaz contra as células que expressam receptores TRAIL, incluindo ilustrativamente classes amplas de células cancerosas, células que apresentam desregulagem do sistema de apoptose, linfócitos ativados ou outras células imunes ativadas (por exemplo, células linfóides e células mielóides), células viralmente infectadas e células sinoviais que proliferam anormalmente (por exemplo, células sinoviais da artrite reumatóide, incluindo células sinoviais inflamatórias, células linfóides e mielóides ativadas no sinóvio, cinoviócitos como macrófago e cinoviócitos como fíbroblastos) de doenças autoimunes. Os anticorpos de acordo com a presente invenção são específicos em tipos particulares de ligação de receptores de TRAIL a despeito da homologia entre eles. Os anticorpos da invenção produzem a apoptose alvejada apenas daquelas células que expressam um receptor de TRAIL alvo ou altemativamente, bloqueando a apoptose TRAIL de células que expressam um receptor alvo.

Um anticorpo monoclonal de DR5 ou um anticorpo monoclonal DR4 da presente invenção servem como um indutor potente de apoptose em células que expressam DR5 ou DR4, respectivamente, in vitro e como um indutor potente de apoptose in vivo. As seqüências de CDR 25 fragmentárias humanizadas enxertadas em espinhas dorsais de anticorpo humanizado e anticorpos de DR5 ou DR4 de proteína de fusão da presente invenção exibem propriedades apoptóticas similares.

Até agora, nenhum anticorpo monoclonal está disponível que se ligue à DR5 de superfície celular e que, mesmo em concentrações baixas, induza a apoptose de células que expressam DR5 tanto in vitro quanto in vivo na ausência de um reticulador. A presente invenção inclui um anticorpo de DR5 operativo como um agente terapêutico no tratamento de uma variedade de doenças. Embora o TRAIL solúvel tenha mostrado ser eficaz na indução da apoptose de células de tumor in vivo, a atividade de destruição pareceu ser muito baixa com as doses grandes e repetidas freqüentemente sendo requeridas (13). A presente invenção fornece um anticorpo purificado que se «. liga a um receptor de TRAIL de DR5, em que o dito anticorpo, na sua forma solúvel em concentrações baixas, tem atividade indutora de apoptose in vivo e fe 10 in vitro em células alvo que expressam DR5. Em uma forma de realização preferida, o anticorpo purificado liga o receptor de TRAIL de DR5 na ausência da reticulação de anticorpo. Preferivelmente, o anticorpo não induz apoptose significante de células de fibroblasto normais. Preferivelmente, a atividade indutora de apoptose é caracterizada por viabilidade menor do que -· 15 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ou qualquer porcentagem no meio, das células alvo nas concentrações de anticorpo de menos do que cerca de 0,1, 1, 5, 10 ou 20 pg/ml ou qualquer concentração no meio. O anticorpo purificado especificamente liga o receptor de TRAIL DR5 e não liga os receptores TRAIL DR4, DcRl ou DcR2 na análise de Western blot de rotina. Em uma 20 forma de realização preferida, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, preferivelmente tendo a mesma especificidade de epítopo como o hibridoma de camundongo-camundongo TRA-8 tendo Acesso ATCC Número PTA1428.

TRA-8, um de uma série de anticorpos de DR5 de acordo com a presente invenção, é farmaceuticamente eficaz em animais que carregam um transgene DR5 humano e também tem utilidade no estabelecimento de um modelo para a investigação do papel de DR5 e TRAIL.

Várias formas de realização da invenção fornecem anticorpos que induzem a apoptose na presença ou ausência de reticulação. Por exemplo, uma forma de realização preferida de anticorpo de DR5 (por exemplo, TRA8) induz a apoptose na ausência de reticulação. Reticulação inclui, por exemplo, reticulação por um anticorpo secundário. Outras formas de realização fornecem anticorpos que induzem a apoptose na presença de reticuladores, incluindo, por exemplo, uma forma de realização preferida do anticorpo de DR4 (2E12).

Assim, a invenção fornece um anticorpo purificado que especificamente liga um receptor TRAIL DR4, em que o dito anticorpo, na sua forma solúvel, tem atividade indutora de apoptose in vivo e in vitro em células alvo que expressam DR4. Como uma forma de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal tendo a mesma especificidade de epítopo como o hibridoma 2E12 tendo Acesso ATCC Número PTA-3798, depositado em 24 de outubro de 2001, tendo o nome designado “2E12 Clone de hibridoma Contra DR4 Humano,” em nome de The UAB Research Foundation. 2E12, um de uma série de anticorpos de DR4 da presente invenção, é farmaceuticamente ativo na redução do tamanho do tumor, quando comparado com animais de controle não tratados ou comparado com o tamanho do tumor antes do tratamento, in vivo em animais com canceres que expressam DR4.

Os anticorpos para DR5 são eficazes na forma solúvel em doses baixas, por doses baixas é intencionado doses ou concentrações de menos do que cerca de 0,01 a cerca de 1 pg/ml in vitro e menos do que cerca de 1 a 10 mg/kg in vivo. Uma característica preferida dos anticorpos da presente invenção é que eles induzem a apoptose seletivamente em células que expressam receptores de DR5, sem induzir a apoptose em hepatócitos, fibrócitos, sinoviócitos, etc., normais, não ativados, não transformados. Um anticorpo de acordo com a presente invenção incitado contra um receptor de TRAIL é colhido de acordo com a presente invenção a partir de um animal experimental mas pode ser fabricado por quaisquer métodos de produção ou síntese de anticorpo conhecidos na técnica. Humanizando-se o anticorpo de acordo com a presente invenção para manter a atividade de ligação do receptor enquanto se evoca uma resposta imune diminuída e terapeuticamente tolerável dentro de um paciente humano, um anticorpo de receptor antiTRAIL humanizado de acordo com a presente invenção é usado como agonista ou antagonista terapêuticos para um dado receptor de TRAIL. A presente invenção sendo operativa como um produto terapêutico in vivo visto que a reticulação secundária do anticorpo de receptor anti-TRAIL, opcionalmente, não é requerida.

A presente invenção estende-se além de um único anticorpo de receptor anti-TRAIL tendo efeitos apoptóticos agonísticos ou antagonísticos. Preferivelmente, dois ou mais anticorpos receptores anti-TRAIL são levados em contato com uma cultura celular in vitro ou um tecido corpóreo do paciente in vivo para criar um tratamento realçado. Por “tratamento realçado” é intencionado qualquer efeito aditivo, sinergístico ou potenciador. Por exemplo, a linhagem de célula de glioma U87 e as linhagem de célula hematopoiéticas U937 e Molt-4 são responsivas à exposição a uma exposição sinergística aos anticorpos anti-DR4 e anti-DR5 agonísticos ao passo que a exposição ao anticorpo anti-DR5 agonístico sozinho mostra apenas sucesso limitado na indução da apoptose.

Adicionalmente, os anticorpos receptores anti-TRAIL antagonísticos têm utilidade particular na presente invenção quando um anticorpo é específico para ligar um dos receptores isca DcRl, DcR2 ou OPG. O bloqueio seletivo de um receptor isca com um anticorpo de acordo com a presente invenção tem o efeito em tipos de célula que expressam receptores isca de mudar o equilíbrio da ligação TRAIL contra aqueles receptores TRAIL capazes de transduzir o sinal de apoptose. Assim, em uma outra terapia combinada de acordo com a presente invenção, um anticorpo de ligação ao receptor isca sensibiliza uma célula de expressão contra um sinal de apoptose agonístico que transduz a ligação ao receptor de TRAIL.

Em uma outra forma de realização, a presente invenção produz um método de elucidar epítopos agonísticos e antagonísticos de um dado receptor de TRAIL. Além disso, polimorfismos entre indivíduos associados com um dado receptor de TRAIL são elucidados de acordo com a presente invenção através do uso de um painel de anticorpos monoclonais cada um tendo uma variável ou região CDR diferentes. Um painel caracterizado de anticorpos monoclonais fornece a capacidade para definir epítopos e polimorfismos agonísticos e antagonísticos. Assim, um painel de anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção tem utilidade na descoberta de medicamento e/ou na triagem de paciente quanto propensão à doença.

Ainda uma outra forma de realização da presente invenção envolve proteínas de fusão incluindo um fragmento antigênico de um receptor de TRAIL ligado a uma proteína de imunoglobulina, polipeptídeo ou fragmento deste. Um fragmento do receptor de TRAIL que é definido como contendo um número suficiente de bases para evocar uma resposta imunogênica a um receptor de TRAIL nativo expressado em uma superfície celular do paciente. Um fragmento de fusão do receptor de TRAIL incluindo pelo menos dez aminoácidos. Uma proteína de fusão de imunoglobulina ou fragmento desta é aqui definido incluir uma proteína ou segmento de polipeptídeo nativos ou sintéticos tendo um número suficiente de bases de aminoácido para ativar uma resposta de cascata imunogênica dentro de um paciente. Um imunógeno da presente invenção incluindo uma fusão de um fragmento do receptor de TRAIL ligado a um fragmento de imunoglobulina tem utilidade como um produto terapêutico in vivo para evocar um anticorpo de receptor anti-TRAIL in situ dentro de um paciente.

Ainda em uma outra forma de realização, a presente invenção é operativa como uma terapia de gene. A invenção assim fornece um método de induzir seletivamente a apoptose em células alvo que compreende as etapas de transfectar as células alvo com um vetor que compreende uma seqüência de ácido nucléico expressável do receptor de TRAIL; expressando nas ditas células um receptor de TRAIL codificado pela dita seqüência de ácido nucléico do receptor de TRAIL; e contatar as ditas células com um anticorpo indutor de apoptose seletivo para a ligação ao dito receptor de

TRAIL. Em um aspecto da terapia de gene da presente invenção, as células . alvejadas são transfectadas com um vetor que carrega uma seqüência * expressável correspondente a um receptor de TRAIL, o vetor sendo convencional e escolhido com base na suscetibilidade da célula alvejada ao vetor. Os vetores da terapia de gene ilustrativamente incluem adenovírus, pAdCMV5. Nas células ou tecido alvejados que expressam o receptor de TRAIL transfectado, as células ou tecido são expostos a um anticorpo de acordo com a presente invenção específico para ligar o receptor de TRAIL . transfectado. É avaliado que o anticorpo de receptor anti-TRAIL é agonístico • 15 ou antagonístico a isso compatível com o resultado terapêutico desejado.

Os anticorpos da presente invenção também são operativos em conjunção com um sensibilizador. Um sensibilizador como aqui usado é definido incluir qualquer estímulo que induza a apoptose, incluindo luz ultravioleta, moléculas orgânicas incluindo especificamente a classe de 20 bisindolmaleimidas, metais pesados e espécies de radical livre.

No contexto da terapia contra o câncer, TRA-8, é capaz de induzir a apoptose da maioria das células de tumor sensíveis a TRAIL em uma maneira dependente de caspase na ausência da reticulação secundária. TRA-8 ou 2E12, sozinhos ou em combinação com outros anticorpos, exibem 25 uma atividade tumoricida forte in vivo. A capacidade de TRA-8 ou 2E12 para induzir a apoptose da maioria das células sensíveis a TRAIL confirma que DR5 ou DR4 sozinhos são suficientes para deflagrar a apoptose. A maioria das células de tumor aqui detalhadas expressam DR5 de superfície celular e a sua suscetibilidade para a morte celular induzida pelo TRA-8 igualou com a '

sua suscetibilidade ao TRAIL, indicando que DR5 é um receptor de morte primário para a apoptose mediada pelo TRAIL na maioria das células de tumor. Resultados similares foram obtidos com anticorpos específicos para DR4 (por exemplo, 2E12). Assim, a expressão diferencial de DR5 ou DR4 pelas células normais e cancerosas é operativa na seletividade da apoptose mediada pelo TRAIL. TRA-8 desvia os receptores isca para induzir a apoptose mediada pelo TRAIL. Apenas uma minoria de células de tumor resistentes ao TRAIL são sensíveis ao TRA-8, entretanto, indicando que os receptores isca não parecem desempenhar um papel principal na resistência de células de tumor à apoptose mediada pelo TRAIL.

Embora estudos anteriores tenham indicado que a administração sistêmica da forma solúvel de TRAIL em animais induz a regressão do tumor sem causar toxicidade^3,4,22, a forma ligada à membrana de TRAIL humano induz o dano hepático em camundongos como aqui mostrado. Entretanto, a toxicidade hepática de TRAIL é muito menos potente do que aquela do ligando Fas como demonstrado pela suscetibilidade menor dos hepatócitos normais ao dano induzido pelo TRAIL comparado ao ligando Fas e pela falta de letalidade de TRAIL in vivo. Assim, a titulação de TRAIL tem utilidade na terapia contra o câncer.

Como aqui detalhado, a ausência de níveis significantes da expressão da proteína DR5 pelos hepatócitos normais é mostrada e está associada com a resistência de hepatócito à apoptose induzida pelo TRA-8. A reticulação de DR5 com anticorpo monoclonal é insuficiente para organizar as formas homopoliméricas do receptor de morte capaz de deflagrar a apoptose.

Experimentos em sagüi não indicam nenhuma evidência de toxicidade hepática da administração de TRA-8. Assim, um anticorpo de DR5 monoclonal agonístico é provável seja mais seletivo e mais seguro do que o TRAIL solúvel como um agente terapêutico. Similarmente, a DR4 é expressada pelas células transformadas ou ativadas e não é expressada em quantidades apreciáveis ou apenas em quantidades muito mais baixas pelas células normais, por exemplo, fíbroblastos. A DR4 da presente invenção por si mesmo induz a apoptose de certas células alvo sem a destruição celular apreciável em células não alvo, como os fíbroblastos, etc. Como aqui usado na ausência de um efeito ou a falta de um efeito apreciável ou significante refere-se e inclui a ausência completa do efeito ou um efeito que seja menor do que ou igual ao fundo ou aos níveis de controle e não excede o fundo e os níveis de controle em mais do que 1,5 vez o fundo ou os níveis de controle.

Como um ensaio de triagem ou ferramenta de produção de imagem, a presente invenção é bem adaptada para detectar cachos menores de células de DR4 ou DR5 que ainda podem exibi a morfologia de célula normal. Por exemplo, o tingimento de seção celular in situ de células cancerosas humanas incluindo canceres pulmonares, prostáticos e hepáticos com anticorpos rotulados de acordo com a presente invenção facilmente identifica células cancerosas. Os anticorpos da presente invenção também são úteis na triagem de outras manifestações de doença, incluindo, por exemplo, várias doenças inflamatórias e autoimunes, como a artrite reumatóide. Tais triagens podem ser úteis mesmo antes do início de outros sintomas clínicos e podem ser usadas para triar pacientes em risco para a doença, de modo que o tratamento profilático possa ser iniciado antes da manifestação de outros sinais ou sintomas. Especificamente, as células cancerosas são observadas expressar níveis muito altos de DR5 quando comparados com células normais do mesmo tipo. Assim, a presente invenção tem utilidade como um método de triagem sensível para malignidades de estágio precoce dentro de tecido incluindo pelo menos pulmão, próstata, cólon, sangue, cérvix, mama e fígado. Um processo terapêutico é aqui detalhado para a inibição da proliferação celular anormal associada com doenças ilustrativamente canceres malignos e leucemias linfáticas entre outras.

A presente invenção é aqui detalhada com particularidade a um anticorpo monoclonal de DR5 anti-humano designado como TRA-8, tendo Acesso ATCC Número PTA1428. É avaliado que as técnicas e resultados detalhados com respeito ao anticorpo monoclonal de DR5 antihumano agonístico TRA-8 são totalmente extensíveis e aplicáveis aos 5 anticorpos de DR5 antagonísticos, assim como anticorpos incitados contra

DR4, DcRl e DcR2 que atuam tanto da maneira agonística quanto da maneira * antagonística. Assim, a presente invenção é aqui detalhada com respeito a um anticorpo indutor de apoptose específico para a DR4 humana. Em uma forma de realização, o anticorpo tem a mesma especificidade de epítopo como o φ 10 hibridoma 2E12, que foi depositado em 24 de outubro de 2001, para obter um número de acesso em nome da UAB Research Foundation, com a American

Type Culture Collection, Rockville, Md. A descrição do material depositado foi “Clone de Hibridoma 2E12 Contra a DR4 Humana,” com a designação de cepa 2E12 e o número do certificado de referência número PCT/US01/14151. Os níveis de expressão de um receptor de apoptose, tal como Fas, não se correlaciona necessariamente com a suscetibilidade das células à apoptose. Para a apoptose mediada pelo TRAIL, foi sugerido que a expressão dos receptores isca para TRAIL influencia a suscetibilidade das células. Além disso, foi sugerido que a DR5 deve estar associada com a DR4 para a transdução eficaz do sinal de apoptose através de FADD e do caminho da caspase 8. A disponibilidade de anticorpo anti-DR5 monoclonal agonístico permitiu a avaliação da regulagem da sinalização de DR5 e o seu papel relativo na apoptose mediada pelo TRAIL. A comparação da suscetibilidade das células à apoptose mediada pelo TRA-8 com a sua suscetibilidade à apoptose mediada pelo TRAIL oferece discernimento sobre o papel da DR5 na apoptose mediada pelo TRAIL e dos mecanismos que podem afetar a suscetibilidade. Vantagens similares são fornecidas pelo anticorpo de DR4.

Esta vantagem no geral estende-se aos anticorpos de DR5 e DR4 humanizados da presente invenção. Um clone molecular de um anticorpo para DR-5, por exemplo, é preparado por técnicas conhecida como detalhado com respeito aos seguintes Exemplos. A metodologia de DNA recombinante (33) é aqui operativa para construir seqüências de ácido nucléico que codificam uma molécula de anticorpo monoclonal ou região de ligação de antígeno desta.

A presente invenção permite a construção de anticorpos do receptor de TRAIL humanizados que são improváveis para induzir uma resposta de anticorpo anti-camundongo humano (daqui em diante aludido como “HAMA”) (34), embora ainda tenha uma função efetora de anticorpo eficaz. Anticorpos completamente humanos também podem ser fabricados imunizando-se camundongos capazes de fabricar um anticorpo completamente humano (por exemplo, camundongos geneticamente modificados para produzir anticorpos humanos), triando-se clones que se ligam a DR5 ou DR4, induz-se a apoptose e compete-se quanto ao epítopo TRA-8 ou 2E12. Ver, por exemplo, Lonberg e Huszar (1995) Human antibodies from transgenic mice, Int. Rev. Immunol. 13: 65 a 93, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade quanto aos métodos de produzir anticorpos completamente humanos. Como aqui usado, os termos “humano” e “humanizado,” em relação aos anticorpos, dizem respeito a qualquer anticorpo que se supõe evoque uma resposta imunogênica fraca terapeuticamente tolerável em um paciente humano.

A presente invenção fornece um anticorpo de DR5, um anticorpo anti-DR5 humanizado, imunoglobulinas de cadeia pesada e leve de TRA-8 e imunoglobulinas de cadeia pesada e leve humanizadas. A invenção também fornece um anticorpo de DR4, um anticorpo de DR4 humanizado, imunoglobulinas de cadeia pesada e leve do anticorpo de DR4 e imunoglobulinas de cadeia pesada e leve humanizadas, ácidos nucléicos que codificam os anticorpos e as cadeias pesada e leve, vetores que compreendem estes ácidos nucléicos e células que compreendem os vetores. Certas

6/^ truncagens destas proteínas ou genes realizam as funções reguladoras ou enzimáticas da proteína ou gene de seqüência completa. Por exemplo, as seqüências de ácido nucléico que codificam para estas podem ser alteradas pelas substituições, adições, supressões ou expressão multimérica que fornecem proteínas ou genes funcionalmente equivalentes. Devido à degenerescência das seqüências codificadores de ácido nucléico, outras seqüências que codificam substancialmente as mesmas seqüências de aminoácido como aquelas das proteínas que ocorrem naturalmente podem ser usadas na prática da presente invenção. Estas incluem, mas não são limitadas às seqüências de ácido nucléico incluindo todas ou porções das seqüências de ácido nucléico que codificam os polipeptídeos acima, que são alteradas pela substituição de códons diferentes que codificam um resíduo de aminoácido funcionalmente equivalente dentro da seqüência, produzindo assim uma mudança silenciosa. É avaliado que a seqüência de nucleotídeo de uma imunoglobina de acordo com a presente invenção tolera variações de homologia de seqüência de até 25% como calculado pelos métodos padrão (“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,” Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127 a 149, 1998, Alan R. Liss, Inc.) contanto que uma tal variante forme um anticorpo operativo que reconheça um receptor de TRAIL DR5.

Por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido dentro de uma seqüência de polipeptídeo podem ser substituídos por um outro aminoácido de uma polaridade similar que atua como um equivalente funcional, resultando em uma alteração silenciosa. Substitutos para um aminoácido dentro da seqüência podem ser selecionados de outros membros da classe à qual o aminoácido pertence (isto é, uma substituição conservativa). Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Também incluídos dentro do escopo da presente invenção estão as proteínas ou fragmentos ou derivados destes que são diferencialmente modificados durante ou depois da tradução, por exemplo, pela glicosilação, divagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outros ligandos celulares, etc. Além disso, o vetor recombinante que codifica as seqüências de ácido nucléico dos anticorpos da presente invenção podem ser engendradas de modo a modificar o processamento ou a expressão de um vetor. Outras modificações podem ser feitas no ácido nucléico ou na seqüência de aminoácido sem reduzir ou sem reduzir substancialmente a atividade de apoptose no anticorpo. Tais modificações podem ocorrer nas CDRs ou em regiões que não CDR usando técnicas que são rotina no ramo. Ver, por exemplo, Yang et al. (1995), J. Mol. Biol. 254: 392 a 403, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade quanto a métodos de mutagênese caminhante de CDR.

Adicionalmente, uma seqüência de ácido nucléico que codifica inibidor podem ser mutada in vitro ou in vivo para criar e/ou destruir seqüências de tradução, iniciação, e/ou terminação ou para criar variações nas regiões codificadoras e/ou formar novos sítios de endonuclease de restrição ou destruir os pré existentes, para facilitar ainda mais a modificação in vitro. Qualquer técnica para a mutagênese conhecida no ramo pode ser usada, incluindo mas não limitada à in vitro mutagênese locodirigida, J. Biol Chem. 253: 6551, uso de ligadores Tab (Pharmacia) e outros.

Os dados de cristalografia de raio X indicam que a dobra da imunoglobulina do anticorpo no geral forma uma estrutura cilíndrica longa que compreende duas camadas de folhas b antiparalelas, cada uma consistindo de três ou quatro cadeias b. Em uma região variável, três alças de cada um dos domínios V das cadeias H e L agrupam-se entre si para formar um sítio de ligação de antígeno. Cada um destas alças é denominada uma região determinante de complementaridade (CDR). As CDRs têm a variabilidade mais alta na seqüência de aminoácido com o anticorpo. As porções da região variável que não são parte de uma CDR são chamadas de “regiões de estrutura” (regiões “FR”) e no geral desempenham um papel na manutenção da estrutura de CDR. Preferivelmente, todas as CDRs de um dado anticorpo são enxertadas em um anticorpo aceitador, de modo a preservar a região de ligação para a região de epítopo do receptor de TRAIL. É avaliado que enxertar uma porção da quantidade total das CDRs em um doador é aqui operativo. É entendido que o enxerto no geral acarreta a substituição, resíduo por resíduo, de um aminoácido ou região, no lugar de um outro. Entretanto, ocasionalmente, em especial com a transferência de uma região, um ou mais resíduos podem ser adicionados ou omitidos ou substituídos, como desejado e que tais supressões e inserções, assim como substituições e inversões apropriadas, estão dentro da habilidade daqueles na técnica.

Um anticorpo da presente invenção é obtido, por exemplo, enxertando-se cada CDR de subunidade de cadeia L e cadeia H de um anticorpo de receptor anti-TRAIL monoclonal em uma região CDR correspondente de um anticorpo humano, humanizando deste modo um anticorpo monoclonal de camundongo eficaz contra um receptor TRAIL.

Os fragmentos de anticorpo que contém o idiotipo da molécula também são gerados e aqui operativos usando técnicas conhecidas. Por exemplo, tais fragmentos ilustrativamente incluem o fragmento (AB’)2 do receptor anti-TRAIL que pode ser produzidos pela digestão com pepsina da molécula de anticorpo, os fragmentos AB’ do receptor de anticorpo de TRAIL gerados através da redução das pontes de dissulfeto do fragmento (AB’)2 do receptor de TRAIL e o fragmento de anticorpo que são gerados tratando-se a . 31 molécula de anticorpo com papaína e um agente redutor.

Os anticorpos da presente invenção podem ser fabricado usando numerosas técnicas conhecidas no ramo. Por via de exemplo, o anticorpo monoclonal anti-DR5 TRA-8 pode ser obtido cultivando-se um hibridoma que, por sua vez, pode ser obtido pela imunização de um camundongo com DR5 humana e subsequentemente fundindo as células de baço ou células de linfonodo do camundongo com células de mieloma de camundongo.

A preparação de um anticorpo monoclonal ilustrativamente envolve as seguintes etapas:

a) purificação de uma biomacromolécula para o uso como um antígeno;

b) preparação de células que produzem anticorpo, depois de primeiro imunizar um animal usando injeções do antígeno, sangrando o animal e ensaiando o título de anticorpo, de modo a determinar quando remover o baço;

c) preparação de células de mieloma;

d) fundir as células que produzem anticorpo e células de mieloma;

e) selecionar um hibridoma que produz um anticorpo desejado;

f) preparar um único clone celular (clonagem);

g) opcionalmente, cultivar as células de hibridoma ou criar animais em que as células de hibridoma foram transplantadas, para a preparação em larga escala do anticorpo monoclonal; e

h) testar as atividades biológicas e a especificidade ou ensaiar as propriedades do agente marcador, do anticorpo monoclonal assim preparado.

O procedimento para a preparação de um anticorpo monoclonal é detalhada abaixo com referência às etapas descritas acima. Este . 32 método para preparar um anticorpo da presente invenção é intencionado ser apenas ilustrativo dos métodos de preparação e não é a este limitado. Outros procedimentos conhecidos podem ser seguidos ou o seguinte método modificado, por exemplo usando-se células que produzem anticorpo outras que não as células do baço e mieloma.

(a) Preparação de antígeno

Uma proteína recombinante (daqui em diante aludido como “DR5 recombinante humana” ou “DR4 recombinante humana”), eficaz como o antígeno, é obtida pela transfecção de células QBI-293A com o vetor de expressão pAdDR5-IgG para uma proteína de fusão que compreende o domínio extracelular de DR5 ou DR4 humanas e a região Fc de anticorpo IgGl humano (daqui em diante aludido como “IgG”), (conforme PTA-1428) para expressá-la usando-se o kit ADENOQuest (Quantum Biotechnologies Inc., Canada) e coletando e parcialmente purificando o produto da expressão. O plasmídeo pAdDR5-IgG é construído inserindo-se o DNA que codifica uma DR5 ou DR4 humana e proteína de fusão de IgG humana em pAdCMV5, que é um vetor de expressão para células de animal. Outros materiais, tais como o DNA que codifica DR5 ou DR4, o vetor e o hospedeiro, são aqui operativos.

A DR5 ou DR4 humanas e a proteína de fusão de IgG produzidas no sobrenadante de cultura das células QBI-293A transfectadas com o vetor pAdDR5-IgG podem ser parcialmente purificados pela cromatografia de afinidade de Proteína A-Sepharose ou cromatografia de afinidade de Proteína G-Sepharose ou cromatografia de troca iônica usando uma coluna Resource Q (nome comercial; Pharmacia).

Altemativamente, a DR5 ou DR4 purificadas obtidas a partir de membranas celulares de linhagens de célula humana são usadas como o antígeno. Além disso, visto que as estruturas primárias de DR4 e DR5 são conhecidas (conforme PTA-1428), um peptídeo que compreende a seqüência η

de aminoácido da SEQ ID NO. 1, pode ser quimicamente sintetizado por um método conhecido tal como o método Sanger e usado como o antígeno.

(b) Preparação de células que produzem anticorpo

Um camundongo é imunizado com o imunógeno produzido na etapa (a), misturado com um adjuvante, tal como o adjuvante completo ou incompleto de Freund ou alúmen. Outros animais experimentais adequados ilustrativamente incluem ratos, porquinhos da índia, coelhos, cães, galinhas, cavalos, porcos, vacas e ovelhas.

As vias de administração adequadas para imunizar um animal experimental incluem as vias de injeção subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica e intramuscular, com as injeções subcutâneas e intraperitoneais sendo preferidas.

As imunizações são opcionalmente realizadas por uma dose única ou, por diversas doses repetidas em intervalos apropriados (preferivelmente de 1 a 5 semanas). Os animais imunizados são monitorados quanto ao título de anticorpo nos seus soros e um animal com um título de anticorpo suficientemente alto é selecionado como a fonte de células que produzem anticorpo. Selecionar um animal com um título alto toma o processo subsequente mais eficiente. As células para a fusão subsequente são no geral colhidas do animal 3 a 5 dias depois da imunização final.

Os métodos para ensaiar títulos de anticorpo incluem várias técnicas bem conhecidas tais como radioimunoensaio (daqui em diante aludido como “RIA”), imunoensaio de enzima de fase sólida (daqui em diante aludido como “ELISA”), ensaio de anticorpo fluorescente e ensaio de hemaglutinação passiva, com RIA e ELISA preferidos por razões de sensibilidade, rapidez, precisão de detecção e potencial para automação.

A determinação de títulos de anticorpo pode ser realizada, por exemplo, por ELISA, como segue. Primeiro, a DR5 ou DR4 purificada ou parcialmente purificada é absorvida na superfície de uma fase sólida, tal como _À ». 34 t uma placa de ELISA de 96 reservatórios, seguido por bloqueio de qualquer superfície remanescente, à qual DR5 ou DR4 não foram ligadas, com uma proteína não relacionada com o antígeno, tal como a albumina sérica bovina (BSA). Depois de lavagem, as superfícies do reservatório são contatadas com amostras diluídas em série de soros de camundongo para permitir a ligação do anticorpo de DR5 ou DR4 nas amostras para o antígeno. Um anticorpo rotulado, anti-camundongo, como o anticorpo secundário, é adicionado para ser ligado ao anticorpo de camundongo. O rótulo pode incluir um rótulo enzimático, um rótulo fluorescente ou outros rótulos conhecidos na técnica. Depois de lavagem, o substrato de enzima é adicionado e os títulos de anticorpo são estimados determinando-se a mudança na absorbância devido ao desenvolvimento da cor causado pela alteração do substrato ou coisa parecida.

. (c) Preparação de células de mieloma

As células de linhagens de célula de camundongo estabelecidas servem como a fonte de células de mieloma, incluindo por exemplo camundongo resistente à 8-azaguanina, derivado de cepas de mieloma BALB/c P3X63Ag8U.l (P3-U1) (35), P3/NSI/l-Ag4-l(NS-l) (36). Sp2/0-Agl4 (SP-2) (37), P3X63Ag8.653 (653) (38) e P3X63Ag8 (X63) (39). A linhagem celular selecionada é transferida em série em um meio apropriado, tal como meio de 8-azaguanina. O meio de 8-azaguanina inclui o Meio de Dulbeeco Modificado de Iscove (daqui em diante aludido como “IMDM”) ou Meio Eagle Modificado de Dulbeeco (daqui em diante aludido como “DMEM”). O meio RPMI-1640 suplementado com glutamina, 2mercaptoetanol, gentamicina, soro fetal bovino (daqui em diante aludido como “FCS”) e 8-azaguanina. As células são depois transferidas a um meio normal, tal como meio ASF 104 (Ajinomoto, K. K.) contendo 10% de FCS, 3 •y a 4 dias antes da fusão, de modo a garantir que pelo menos 2 x 10 células estejam disponíveis no dia da fusão.

♦ *

(d) Fusão celular

Os linfócitos e células plasmáticas obtidas de qualquer parte adequada do animal são células precursoras para produzir o anticorpo. As fontes de linfócito ou célula plasmática ilustrativamente incluem baço, linfonodos, sangue periférico ou qualquer combinação apropriada destas, com as células de baço sendo a fonte mais comum.

Depois da última injeção de reforço, o tecido em que as células que produzem anticorpo estão presentes é removido de um camundongo tendo os títulos de anticorpo predeterminados. A técnica presentemente favorecida para a fusão de células de baço com células de mieloma preparadas na etapa c) utiliza polietileno glicol.

A técnica de fusão inclui lavar as células de baço e mieloma com meio isento de soro (tal como RPMI 1640) ou solução salina tamponada com fosfato (daqui em diante aludido como “PBS”) de modo que a relação numérica de células de baço para células de mieloma está aproximadamente entre 5:1 e 10:1 e depois centrifugadas. Depois o sobrenadante ter sido descartado e as células pelotizado suficientemente soltas, 1 ml de meio isento de soro contendo 50% de polietileno glicol (p/v) (p.m. 1.000 a 4.000) é adicionado às gotas com mistura. Subsequentemente, 10 ml de meio isento de soro são lentamente adicionados e depois centrifugadas. O sobrenadante é mais uma vez descartado e as células pelotizadas são colocadas em suspensão em uma quantidade apropriada de meio HAT contendo uma solução de hipoxantina, aminopterina e timidina (daqui em diante aludido como “HAT”) e interleucina-2 de camundongo (daqui em diante aludido como “IL-2”). A suspensão é depois dispensada nos reservatórios das placas de cultura (também aqui aludidas simplesmente como “placas”) e incubadas na presença de 5% v/v de CO2 a 37°C durante cerca de 2 semanas, com a adição suplementar de meio HAT como apropriado.

(e) Seleção de hibridomas . * 36

Quando a cepa de mieloma usada é resistente à 8-azaguanina, isto é, é deficiente na enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT), quaisquer células de mieloma não fundidas e quaisquer fusões de mieloma-mieloma são incapazes de sobreviver em meio HAT. Por outro lado, as fusões de células que produzem anticorpo entre si, assim como hibridomas de células que produzem anticorpo com células de mieloma podem sobreviver, a primeira tendo apenas uma vida limitada. Consequentemente, a incubação continuada em meio HAT resulta na seleção apenas dos hibridomas desejados.

Os hibridomas resultantes crescem em colônias que são depois transferidas em meio HAT que carece de aminopterina (meio HT). Em seguida, alíquotas dos sobrenadantes de cultura são removidas para determinar títulos de anticorpo anti-Fas, por exemplo, por ELISA. Quando a proteína de fusão mencionada acima é usada como o antígeno de ELISA, também é necessário eliminar clones que produzam um anticorpo que é especificamente ligado à região Fc da IgGl humana. A presença ou ausência de um tal clone podem ser verificadas, por exemplo, por ELISA usando FasIgGl ou IgGl, como o antígeno.

(f) Clonagem

Os hibridomas que mostraram produzir anticorpos específicos, usando um método similar àquele descrito na etapa b) para determinar títulos de anticorpo, são depois transferidos para uma outra placa para clonagem. Os métodos de clonagem adequados incluem: o método da diluição limitante, em que os hibridomas são diluídos para conter uma célula por reservatório de uma placa e depois cultivados; o método do ágar mole em que as colônias são recuperadas depois de cultivar em meio de ágar mole; um método de usar um micromanipulador para separar uma única célula por cultura; e “separação de um clone,” em que células únicas são separadas por um separador de célula.

O processo de clonagem, por exemplo, de acordo com o . · 37 método de diluição limitante é repetido de 2 a 4 vezes para cada reservatório que demonstre um título de anticorpo e clones tendo títulos de anticorpo estáveis são selecionados como hibridomas que produzem anticorpo antí-DR5 monoclonal. Os hibridomas que produzem um anticorpo de DR5 anticamundongo são selecionados por um método similar para se obter uma linhagem celular que produza anticorpo antí-DR5 monoclonal.

O hibridoma de camundongo-camundongo TRA-8 que é uma base para anticorpos da presente invenção foi depositado com a American Type Culture Collection em 1 de março de 2000 e tem o número de acesso PTA- 1428. O hibridoma 2E12 foi depositado com a American Type Culture Collection em 24 de outubro de 2001, como descrito acima e tem o número de acesso ATCC N° PTA-3798. Consequentemente, quando da preparação de um anticorpo usando o hibridoma de camundongo-camundongo TRA-8 ou qualquer outro hibridoma estabelecido, a preparação pode ser realizada seguindo-se um procedimento partindo da etapa (g) abaixo, com as etapas de (a) a (f) omitidas.

(g) Cultura de hibridoma para preparar anticorpo monoclonal

O hibridoma obtido pela clonagem é depois cultivada em meio normal, não em meio HT. A cultura em larga escala é realizada pela cultura em garrafa rolante, usando garrafas de cultura grandes ou pela cultura giratória. O sobrenadante da cultura em larga escala é depois colhido e purificado por um método adequado, tal como a filtração em gel, que é bem conhecida por aqueles habilitados na técnica, para obter um anticorpo de DR5 ou DR4 monoclonal que é uma base para os anticorpos da presente invenção. O hibridoma também pode ser cultivado intraperitonealmente em um camundongo singênico, tal como um camundongo BALB/c ou um camundongo nu/nu, para obter ascite contendo um anticorpo de DR5 ou DR4 monoclonal em quantidades grandes. Kits de purificação de anticorpo monoclonal comercialmente disponíveis (por exemplo, o Kit MAbTrap GII;

, . 38

Pharmacia) são convenientemente usados para purificar os anticorpos colhidos.

Os anticorpos monoclonais preparados como acima têm uma alta especificidade para DR5 ou DR4 humanas, respectivamente.

(h) Ensaio de anticorpo monoclonal

Os métodos de identificação adequados do isotipo e da subclasse do anticorpo monoclonal incluem o método de Ouchterlony, ELISA e RIA. Preferivelmente, um kit comercial é usado para a identificação, tal como um Kit Mouse Tipor (nome comercial; BioRad).

A quantificação da proteína pode ser realizada pelo método de Folin-Lowry ou pelo calculo com base na absorbância a 280 nm (1,4 (OD280) = 1 mg/ml de Imunoglobulina).

A identificação do epítopo que o anticorpo monoclonal reconhece é realizada como segue. Primeiro, várias estruturas parciais da molécula que o anticorpo monoclonal reconhece são preparadas. As estruturas parciais são preparadas pelo método em que vários peptídeos parciais da molécula são sinteticamente preparados pela técnica de síntese de oligopeptídeo conhecida ou pelo método em que o DNA que codifica o polipeptídeo parcial desejado é incorporado em um plasmídeo de expressão adequado e é expressado em um hospedeiro adequado, tal como E. coli, para produzir os peptídeos. No geral, ambos os métodos são freqüentemente usados em combinação para o objetivo acima. Por exemplo, uma série de polipeptídeos tendo apropriadamente comprimentos reduzidos, trabalhando a partir dos términos C ou N da proteína antigênica, podem ser preparado pelas técnicas de engendramento genético estabelecidos. Estabelecendo-se que os fragmentos reagem com o anticorpo, uma idéia aproximada do sítio do epítopo é obtida.

O epítopo é mais conclusivamente identificado sintetizando-se uma variedade de oligopeptídeos menores que correspondam a este ou

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mutantes do peptídeo usando técnicas de síntese de oligopeptídeo estabelecidas para determinar uma propriedade de ligação dos peptídeos ao anticorpo anti-DR5 monoclonal, por exemplo, que é uma base para a preparação do anticorpo da presente invenção e uma inibição competitiva da ligação do peptídeo a um antígeno com o anticorpo monoclonal. Kits comercialmente disponível, tais como o Kit SPOTs (Genosys Biotechnologies, Inc.) e uma série de kits de síntese de peptídeo multipin com base no método de síntese multipin (Chiron Corp.) podem ser convenientemente usados para se obter uma grande variedade de oligopeptídeos.

Um anticorpo da presente invenção tem as várias propriedades funcionais de a) a f) descritas abaixo, cada uma das quais é verificada, por exemplo, por um método descrito aqui abaixo.

a) Ligação específica de TRA-8 às células que expressam a DR5 humana.

Uma característica única da presente invenção é a capacidade para ligar a DR5 de superfície celular. Isto é demonstrado pela análise de citometria de fluxo de células que expressam a DR5. Primeiro, a ligação de superfície celular específica de DR5 é confirmada pelas células COS-7 transfectadas com o cDNA de comprimento completo que codifica a DR5 humana. Especificamente, TRA-8 apenas reconhece as células COS-7 transfectadas com DR5 mas não o vetor de controle vazio ou o vetor que codifica a DR4. Em segundo lugar, três origens diferentes: hematopoiética, glioma e câncer prostático de células de tumor maligno humanas são testadas. A maioria destas células de tumor transformadas expressaram níveis significantes de DR5 de superfície celular, embora os níveis de expressão variassem amplamente. Terceiro, dois painéis de células de fíbroblasto sinoviais primárias humanas de pacientes RA e OA são examinados. Todas as células sinoviais RA expressaram níveis significantemente mais altos de DR5 comparado com células OA.

b) Indução da apoptose de células de tumor maligno humanas in vitro na ausência de reticulação.

A capacidade de um anticorpo incitado de acordo com a presente invenção para reconhecer o receptor de TRAIL e para induzir diretamente a apoptose de células de tumor maligno humanas é determinada pelo ensaio de viabilidade celular (ATPLite) durante a cultura in vitro de células com várias concentrações de um anticorpo, especificamente TRA-8. A maioria das células de tumor são suscetíveis à apoptose induzida pelo TRA-8. Para algumas células, o TRA-8 exibiu uma atividade indutora de apoptose forte, por exemplo, o TRA-8 é capaz de induzir a apoptose de células Jurkat humana dentro dos níveis pg/ml. Consideravelmente, a apoptose induzida pelo TRA-8 não requer reticulação e na maioria das células, o TRA-8 exibiu uma atividade indutora de apoptose mais forte do que o TRAIL solúvel recombinante na presença do realçador.

c) Atividade tumoricida de TRA-8 in vivo.

A atividade tumoricida de TRA-8 é avaliada em dois modelos de célula de tumor SCID/humano. Primeiro, camundongos SCID são intravenosamente inoculados com as células Jurkat da leucemia humana e tratados com uma dose única (100 pg) de TRA-8. Os resultados mostram que a maioria das células Jurkat implantadas são eliminadas do sangue periférico e baço pelo tratamento com TRA-8, como determinado pela análise de citometria de fluxo e fingimento imunoistoquímico in situ de células Jurkat. Em segundo lugar, células de astrocitoma humano, 1321N1, são subcutaneamente inoculadas em camundongos SCID e os camundongos que carregam tumor são tratados com uma dose única de TRA-8. O desenvolvimento das células 1321N1 implantadas é significantemente inibido em camundongos tratados com TRA-8 como determinado pelos tamanhos de tumor e análises histológicas.

d) Identificação de células sinoviais RA pelo TRA-8

As células sinoviais primárias isoladas de 8 pacientes RA e 4 pacientes OA são testadas quanto a expressão de superfície celular de DR5. O TRA-8 é capaz de tingir positivamente todas as células RA mas tingir negativamente todas as células OA. Assim, RA é diferenciado de OA pela expressão de superfície de DR5 como detectado pelo TRA-8.

e) Indução de apoptose em células de fibroblasto sinovial RA pelo TRA-8

A capacidade de TRA-8 para induzir a apoptose de células sinoviais RA é determinada pelo ensaio de viabilidade celular durante a cultura in vitro na presença de várias concentrações de TRA-8. Todas as células RA exibem níveis altos a intermediários de suscetibilidade a 100 ng/ml de TRA-8. Em comparação, todas as células OA são essencialmente resistentes à apoptose induzida pelo TRA-8. Consideravelmente, o TRA-8 exibiu uma atividade indutora de apoptose melhor para células sinoviais RA do que o TRAIL solúvel com o realçador. Além disso, comparado ao anticorpo anti-Fas (CH-11), o TRA-8 exibiu uma seletividade melhor para células sinoviais RA.

f) O TRA-8 não induz a produção de MMPs em células sinoviais RA

Visto que o TRA-8 é capaz de induzir a ativação de NF-kb em células sinoviais RA como TNF-a, o efeito de TRA-8 na produção de MMP1 e MMP3 de células sinoviais é determinada. Enquanto o TNF-a induziu um aumento dependente da dose de MMPs, o TRA-8 é incapaz de induzir qualquer produção de MMPs e em algumas concentrações, o TRA-8 diminuiu levemente a produção de MMPs em células sinoviais RA.

g) O TRA-8 induz a ativação da caspase múltipla.

Visto que as caspases desempenham um papel crucial na indução da apoptose, a capacidade de TRA-8 para induzir a ativação da caspase é determinada em células Jurkat humanas. Quando as células Jurkat são incubadas com uma dose baixa (50 ng/ml) de TRA-8, a ativação de caspase 8, caspase 9 e caspase 3 é observada tão cedo quanto em 15 minutos depois da incubação como demonstrado pela análise de Western blot e análise de clivagem de caspase. Em termos de controle de tempo, o número e a concentração de ativação de caspase, os anticorpos da presente invenção incluindo o anticorpo demonstrativo TRA-8 exibiram uma atividade muito melhor do que quaisquer outros anticorpos indutores de apoptose conhecidos, tais como o anticorpo Fas anti-humano (CH-11).

O anticorpo 2E12 liga-se especificamente à DR4 na sua forma solúvel, tem atividade indutora de apoptose in vivo e in vitro em células alvo que expressam DR4 (incluindo por exemplo, células cancerosas, células sinoviais da artrite reumatóide, células imunes ativadas como linfócitos ativados e células viralmente infectadas), tem atividade tumoricida in vivo (preferivelmente, na ausência de toxicidade às células que não de tumor). Preferivelmente o anticorpo de DR4 da invenção tem atividade indutora de apoptose caracterizada por menos do que cerca de 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, ou 10% de viabilidade celular alvo nas concentrações de anticorpo de menos do que 30 pg/ml, 3 pg/ml, 0,3 pg/ml ou 0,03 pg/ml e atividade tumoricida caracterizada por 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de redução no tamanho do tumor. Assim, um anticorpo da presente invenção é uma substância tendo uma propriedade para induzir seletivamente a apoptose em células patogênicas como mostrado nos efeitos (a) e (g). Consequentemente, é útil como um agente profilático e terapêutico para as doenças associadas com a sobrevivência inapropriada das células ou a proliferação inapropriada das células, tais como aquelas atribuíveis à desregulagem de sistemas de apoptose incluindo o sistema Fas/ligando Faz.

A capacidade de um anticorpo da presente invenção para induzir a apoptose é confirmada cultivando-se células tais como a linhagem de célula da leucemia humana Jurkat (American Type Culture N° TIB-152) e a linhagem de célula de astrocitoma 1321N1 em meio no qual a amostra de teste foi adicionada e determinando a taxa de sobrevivência, por exemplo, por um ensaio ATPLite.

O anticorpo da presente invenção, especialmente os anticorpos de DR5 e DR4 tendo quase a mesma imunogenicidade aos seres humanos como aquela de anticorpos humanos, são usados como um agente para a profilaxia ou tratamento de doenças associadas com a sobrevivência ou proliferação inapropriadas de células, incluindo aquelas atribuíveis à desregulagem dos sistemas de apoptose nas doenças inflamatórias e autoimunes ilustrativamente incluindo o lupo eritematoso sistêmico, doença de Hashimoto, artrite reumatóide, doença enxerto-versus-hospedeiro, síndrome de Sjõgren, anemia perniciosa, doença de Addison, escleroderma, síndrome de Goodpasture, doença de Crohn, anemia hemolítica autoimune, esterilidade, miastenia grave, esclerose múltipla, doença de Basedow, púrpura trombocitopênica, diabete melito insulino-dependente, alergia; asma, doença atópica; arteriosclerose; miocardite; cardiomiopatia; nefrite glomerular; anemia hipoplástica; rejeição depois do transplante de órgão e malignidades numerosas de tecidos pulmonares, prostáticos, hepáticos, ovarianos, colônicos, cervicais, linfáticos e mamários. Os anticorpos da presente invenção podem ser usados para alvejar e seletivamente induzir a apoptose em células imunes ativadas incluindo linfócitos ativados, células linfóides, células mielóides e células sinoviais reumatóides (incluindo sinoviócitos inflamatórios, cinoviócitos como macrófago, cinoviócitos como fibroblastos) e em células viralmente infectadas (incluindo aquelas infectadas com HIV, por exemplo) contanto que estas células alvejadas expressem ou possam ser fabricadas para expressar os receptores TRAIL específicos (isto é, DR4 ou DR5).

Um tal agente profilático ou terapêutico pode ser administrado em várias formas. Os modos adequados de administração incluem a administração oral, tal como por tabletes, cápsulas, grânulos, pós e xaropes ou administração parenteral, tais como por injeção ou supositórios.

O anticorpo ou agente terapêutico podem ser administrados oral, retal, intracistemal, intraventricular, intracraniana, intratecal, intraarticular, intravaginal, parenteralmente (intravenosa, intramuscular ou subcutaneamente), localmente (pós, ungüentos ou gotas), intraperitoneal, transdermicamente, pela inalação ou como uma pulverização bucal ou nasal. A quantidade exata do anticorpo ou agente terapêutico requerida variará de paciente para paciente, dependente da idade, peso e condição geral do paciente, da gravidade da doença que está sendo tratada, da localização e tamanho do tumor, dos compostos particulares usados, do modo de administração e outros. Uma quantidade apropriada pode ser determinada por uma pessoa de habilidade comum na técnica usando apenas experimentação de rotina dadas as divulgações aqui. As dosagens únicas típicas de anticorpo variam de 0,1 a 10.000 microgramas, preferivelmente entre 1 e 100 microgramas. As concentrações de anticorpo típicas em um veículo variam de 0,2 a 2000 nanogramas por mililitro liberado. Para a injeção em uma junta, volumes de anticorpo e veículo variarão dependendo da junta, mas aproximadamente de 0,5 a 10 ml e preferivelmente de 1 a 5 ml, são injetados em um joelho humano e aproximadamente de 0,1 a 5 ml e preferivelmente de 1 a 2 ml no tornozelo humano.

Dependendo do modo intencionado de administração, o anticorpo ou agente terapêutico podem estar em composições farmacêuticas na forma de sólido, semi-sólido ou formas de dosagem líquidas, tais como, por exemplo, tabletes, supositórios, pílulas, cápsulas, pós, líquidos ou suspensões, preferivelmente em forma de dosagem unitária adequada para a administração única de uma dosagem exata. As composições incluirão uma quantidade eficaz do substrato selecionado em combinação com um veículo

334 farmaceuticamente aceitável e, além disso, pode incluir outros agentes medicinais, agentes farmacêuticos, veículoes ou diluentes. Por “farmaceuticamente aceitável” é intencionado um material que não seja biologicamente ou de outro modo indesejável, que possa ser administrado a um indivíduo junto com o substrato selecionado sem causar efeitos biológicos indesejáveis significantes ou interagir de uma maneira nociva com qualquer um dos outros componentes da composição farmacêutica na qual estão contidos.

As composições adequadas para a injeção parenteral podem compreender soluções, dispersões, suspensões ou emulsões aquosas, não aquosas estéreis fisiologicamente aceitáveis e pós estéreis para a reconstituição em soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Os exemplos de veículoes, diluentes, solventes ou veículos aquosos e não aquosos adequados incluem água, etanol, polióis (propileno glicol, polietileno glicol, glicerol e outros), misturas adequadas destes, óleos vegetais (tais como óleo de oliva) e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etila. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões e pelo uso de tensoativos.

Estas composições também podem conter adjuvantes tais como agentes conservantes, umectantes, emulsificantes e dispersantes. A prevenção da ação de microorganismos pode ser garantida pelos vários agentes antibacterianos e antifüngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e outros. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio e outros. A absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser realizada pelo uso de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

As formas de dosagem sólida para a administração oral incluem cápsulas, tabletes, pílulas, pós e grânulos. Em tais formas de dosagem sólida, o composto ativo é misturado com pelo menos um excipiente habitual inerte (ou veículo) tal como citrato de sódio ou fosfato de dicálcio ou (a) enchedores ou extensores, como por exemplo, amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol e ácido silícico, (b) aglutinantes, como por exemplo, carboximetil celulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose e acácia, (c) umectantes, como por exemplo, glicerol, (d) agentes desintegrantes, como por exemplo, ágar-ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido algínico, certos silicatos complexos e carbonato de sódio, (e) retardadores de solução, como por exemplo, parafina, (f) aceleradores de absorção, como por exemplo, compostos de amônio quaternários, (g) agentes de umectação, como por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerol, (h) absorventes, como por exemplo, caulim e bentonita e (i) lubrificantes, como por exemplo, talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietileno glicóis sólidos, lauril sulfato de sódio ou misturas destes. No caso de cápsulas, tabletes e pílulas, as formas de dosagem também podem compreender agentes de tamponização.

As composições sólidas de um tipo similar também podem ser utilizadas como enchedores em cápsulas de gelatina enchidas moles e duras usando tais excipientes como lactose ou lactose assim como polietileno glicóis de alto peso molecular e outros.

As formas de dosagem sólida tais como tabletes, drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser preparadas com revestimentos e cascas, tais como revestimentos entéricos e outros bem conhecidos na técnica. Elas podem conter agentes opacificadores e também podem se de composição tal que elas liberem o composto ou compostos ativos em uma certa parte do trato intestinal em uma maneira prolongada. Os exemplos de composições de embutir que podem ser usados são substâncias poliméricas e ceras. Os compostos ativos também podem estar na forma microencapsulada, se apropriado, com um ou mais dos excipientes mencionados acima.

As formas de dosagem líquida para a administração oral incluem emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Além dos compostos ativos, as formas de dosagem líquida podem conter diluentes inertes habitualmente usados na técnica, tais como água ou outros solventes, agentes solubilizadores e emulsificadores, como por exemplo, álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, álcool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, dimetilformamida, óleos, em particular, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de germe de milho, óleo de oliva, óleo de mamona e óleo de gergelim, glicerol, álcool tetraidrofurfurílico, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitano ou misturas destas substâncias e outras.

Além de tais diluentes inertes, a composição também pode incluir adjuvantes, tais como agentes de umectação, emulsificadores e agentes de suspensão, adoçantes, flavorizantes e agentes de perfume.

As suspensões, além dos compostos ativos, podem conter agentes de suspensão, como por exemplo, álcoois isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, metaidróxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar e tragacanto ou misturas destas substâncias e outras.

As composições para as administrações retais são preferivelmente supositórios que podem ser preparados misturando-se os compostos da presente invenção com excipientes ou veículoes não irritantes adequados tais como manteiga de cacau, polietileno glicol ou uma cera de supositório, que são sólidos nas temperaturas comuns mas líquidos na temperatura do corpo e portanto, fundem no reto ou cavidade vaginal e liberam o componente ativo.

As formas de dosagem para a administração tópica de um composto desta invenção incluem ungüentos, pós, pulverizações e inalantes. O componente ativo é misturado sob condições estéreis com um veículo fisiologicamente aceitável e quaisquer conservantes, tampões ou propelentes como possam ser requeridos. As formulações, ungüentos, pós e soluções oftálmicas também são consideradas como estando dentro do escopo desta invenção.

O termo “sais, ésteres, amidas e pró medicamentos farmaceuticamente aceitáveis” como aqui usado refere-se aqueles sais de carboxilato, sais de adição de aminoácido, ésteres, amidas e pró medicamentos dos compostos da presente invenção que estão dentro do escopo do julgamento médico idôneo, adequado para o uso em contato com os tecidos de pacientes sem toxicidade, irritação, respostas alérgicas indevidas e outros, proporcionado com uma relação de benefício/risco razoável e eficaz para o seu uso pretendido, assim como as formas zuiteriônicas, onde possível, dos compostos da invenção. O termo “sais” refere-se aos sais de adição de ácido inorgânicos e orgânicos, relativamente não tóxicos dos compostos da presente invenção. Estes sais podem ser preparados in situ durante a isolação e purificação final dos compostos ou reagindo-se separadamente o composto purificado na sua forma de base livre com um ácido orgânico ou inorgânico adequado e isolando o sal assim formado. Os sais representativos incluem os sais de bromidreto, cloridreto, sulfato, bissulfato, nitrato, acetato, oxalato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartarato, naftilato mesilato, glicoeptonato, lactobionato, metano sulfonato e lauril sulfonato e outros. Estes podem incluir cátions com base nos metais alcalinos e alcalinos terrosos, tais como sódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio e outros, assim como os cátions de amônio, amônio quaternário e de amina não tóxicos incluindo, mas não limitados a amônio, tetrametilamônio, tetraetilamônio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina e outros.

(Ver, por exemplo, S. M. Barge et al., ‘Pharmaceutical Salts,” J. Pharm. Sei., 1977, 66: 1 a 19 que é aqui incorporado por referência).

O termo “pró medicamento” refere-se aos compostos que são rapidamente transformados in vivo para produzir os compostos precursores das fórmulas acima, por exemplo, pela hidrólise no sangue.

Um debate completo é fornecido em T. Higuchi e V. Stella, “Pro-drugs as Novel Delivery Systems,” Vol. 14 da A.C.S. Symposium Series e em Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.

Uma célula alvo é uma célula de um animal ilustrativamente incluindo ser humano, primata não humano, gatos, cães, rato, camundongo, porquinho da índia, coelho, cabra, ovelha, vaca, cavalo, galinha, porco, sagüi e furão.

Além disso, o anticorpo ou agente terapêutico da presente invenção pode existir nas formas não solvatadas assim como solvatadas com solventes farmaceuticamente aceitáveis tais como água, etanol e outros. No geral, as formas solvatadas são consideradas equivalentes às formas não solvatadas para os propósitos da presente invenção.

As moléculas de anticorpo são purificadas por técnicas conhecidas ilustrativamente incluindo a cromatografia de absorção de amino ou de afinidade de amino, técnicas cromatográficas tais como a cromatografia líquida de alta pressão ou uma combinação destas.

Um outro aspecto da presente invenção inclui um produto farmacêutico para o uso na liberação do anticorpo biologicamente ativo de receptor anti-TRAIL ou receptor de anticorpo anti-TRAIL humanizado a um vertebrado. O produto farmacêutico inclui uma quantidade farmaceuticamente eficaz de anticorpo do receptor anti-TRAIL ou fragmento deste, um veículo farmaceuticamente aceitável e um recipiente incluindo o veículo e o anticorpo em uma forma estéril.

Em uma forma de realização preferida da invenção, uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um anticorpo da invenção inibe a proliferação celular ou induz a apoptose pelo contato com uma célula alvo ou com células alvo. Uma quantidade farmaceuticamente eficaz ou quantidade de um anticorpo que reconhece DR5 ou DR4 ou um anticorpo humanizado que reconhece DR5 ou DR4 é uma quantidade administrada a um indivíduo suficiente para causar um efeito desejado. Como aqui usado, os termos “quantidade farmaceuticamente eficaz” e “quantidade terapêutica” são sinônimas. Os efeitos desejados da administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de anticorpos que reconhecem DR5 ou DR4 incluem a morte de uma ou mais células alvo, a inibição do desenvolvimento de uma ou mais células alvo, o estímulo de DR5 ou DR4, respectivamente, a ligação a DR5 ou DR4, respectivamente, e níveis ou atividade de NFkB aumentados em uma célula alvo. Uma célula alvo é uma célula que expressa DR5 ou DR4 e ilustrativamente inclui células que se desenvolvem anormalmente e células de tumor tais como papilomas e verrugas; câncer mamário, câncer colônico, hepatomas, leucemias, câncer pulmonar, melanoma, mielomas, osteossarcomas, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer prostático, câncer da cabeça e pescoço, câncer tireóidico, câncer uterino, tumores do cérebro tais como astrocitomas, células imunes ativadas (por exemplo, linfócitos ativados, células linfóides e mielóides), células inflamatórias, células sinoviais da artrite reumatóide e células viralmente infectadas. In vivo, a célula alvo é uma célula de um indivíduo com uma condição patológica, incluindo aquelas onde a proliferação celular é anormal ou desregulada tal como câncer maligno ou benigno e artrite reumatóide.

Em uma outra forma de realização preferida, a célula alvo também é contatada por um agente terapêutico. Assim os anticorpos e composições da presente invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos. Os agentes terapêuticos incluem mas não são limitados a outros membros da família TNF, agentes quimioterapêuticos, anticorpos, antivirais, antiinflamatórios esteróides e não esteróides, agentes imunoterapêuticos convencionais, citocinas, quimiocinas e/ou fatores de crescimento. As combinações podem ser administradas concomitantemente (por exemplo, como uma mistura), separada mas simultaneamente (por exemplo, via linhas intravenosas separadas no mesmo paciente) ou seqüencialmente (por exemplo, um dos compostos ou agentes é dado primeiro seguido pelo segundo). Assim, os termos “combinação” ou “combinado” são usados para se referir à administração concomitante, simultânea ou seqüencial de dois ou mais agentes.

Em uma forma de realização a terapia de combinação inclui a administração de membros da família TNF. As moléculas de TNF, relacionadas com o TNF ou semelhantes ao TNF que podem ser administradas com o anticorpo da invenção incluem mas não são limitados às formas solúveis de TNF-α, linfotoxina-a (LT-a, também conhecido como TNF-β), LT-β (encontrado em ΕΤ-α2-β heterotrimérico complexo) OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-1BBL, DcR3, OX40L, TNF-γ (WO 96/14328 ), TRAIL, AIM-II (WO 97/34911), APRIL (J. Exp. Med. 188: 1185 a 1190), endocina-α (W098/07880), TR6 (WO 98/30694), OPG e fator de desenvolvimento de nervo (NGF) e formas solúveis de Fas, CD30, CD27, CD40 e 4-IBB, TR2 (WO 96/34095), DR3 (WO 97/33904), DR4 (WO 98/32856), TR5 (WO 98/30693), TRANK, TR9 (WO 98/56892), TRIO (WO 98/54202), 312C2 (WO 98/06842) e TR12 e formas solúveis de CD 154, CD70eCD153.

Em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com ligandos CD40 que ocorrem naturalmente, sintéticos ou engendrados (CD40L), incluindo, por exemplo, uma forma solúvel de CD40L (por exemplo, AVREND), fragmentos, variantes ou derivados biologicamente ativos de CD40L, anticorpos de CD40L (por exemplo, anticorpos agonísticos ou antagonísticos) e/ou anticorpos CD40 (por exemplo, agonísticos ou antagonísticos).

Já em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com um, dois, três, quatro, cinco ou mais dos seguintes: tacrolimus (Fujisawa), talidomida (por exemplo, Celgene), anti Tac (Fv)-PE40 (por exemplo, Protein Design Labs), inolimomab (Biotest), MAK195F (Knoll), ASM-981 (Novartis), receptor de interleucina I (por exemplo, Immunex), receptor do interleucina 4 (por exemplo, Immunex), ICM3 (ICOS), BMS-188667 (Bristol Myers Squibb), anti-TNF Ab (por exemplo, Therapeutic Antibodies), CG-1088 (Celgene), anticorpo monoclonal anti-B7 (por exemplo, Innogetics), MEDI-507 (BioTransplant) e ABX-CBL (Abgenix).

De acordo com a invenção, o anticorpo da invenção pode ser administrado com o ligando Fas (Fas-L) ou um anticorpo Fas que liga Fas e transduz o sinal biológico que resulta na apoptose. Preferivelmente, os anticorpos Fas utilizados de acordo com este método são anticorpos monoclonais.

Em certas formas de realização, os anticorpos da invenção são administrados em combinação com agentes anti-retrovirais, inibidores da transcriptase reversa de nucleosídeo, inibidores da transcriptase reversa de não nucleosídeo e/ou inibidores de protease. Os inibidores da transcriptase reversa de nucleosídeo que podem ser administrados em combinação com os anticorpos da invenção, incluem mas não são limitados à RETROVIR® (zidovudina/AZT) (Gaxo-Wellcome, Research Triangle Park, NC), vidEX® (didanosina/ddl) (Bristol-Myers Squibb, Nova Iorque), HIVID® (zalcitabina/ddC) (Roche, Nutley, Nova Jérsei), ZERITOD (estavudina) (Bristol-Myers Squibb). Os inibidores da transcriptase reversa de não nucleosídeo que podem ser administrados em combinação com o anticorpo da presente invenção incluem mas não são limitados a VERAMUNE® (nevirapina) (Boehringer Ingelheim/Roxanne, Columbus, Ohio), RESCRIPTOR® (delavirdina) (Pharmacia & Upjohn Company, Kalamazoo, Michigan) e SUSTIVA® (efavirenz) (Bristol-Myers Squibb).

Os inibidores de protease que podem ser administrados em combinação com os anticorpos da invenção incluem mas não são limitados à CRIXIVAN® (sulfato de indinavir) (Merck & Company, Whitehouse Station, NJ), NORVIR® (ritonavir) (Abbott Laboratories, Chicago, IL), INVIRASE® (saquinavir) (Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ) e VIRACEPT® (nelfinavir) (Agouron Pharmaceuticals, SanDiego, CA). Em uma forma de realização específica, agentes anti-retrovirais, inibidores da transcriptase reversa de nucleosídeo, inibidores da transcriptase reversa de não nucleosídeo e /ou inibidores de protease podem ser usado em qualquer combinação com as composições da invenção para tratar a AIDS e/ou prevenir ou tratar a infecção pelo HIV.

Em outras formas de realização, o anticorpo da invenção pode ser administrado em combinação com agentes de infecção anti-oportunístico. Os agentes anti-oportunísticos que podem ser administrados em combinação com as composições da invenção incluem, mas não são limitados à, trimetoprim- pentamidina, sulfametoxazol, DAPSONE® (Jacobus Pharmaceuticals, Princeton, NJ), ATOVAQUONE® (GlaxoSMithKline, Research Triangle Park, NC), ISONIAZID® (CIBA Pharmaceuticals, Summit, NJ), RIFADIN® (rifampina) (Hoechst-Marrion-Roussel, Kansas City, MO), PYRAZINAMIDE® (Ledelrle, Pearl River, NY), BIAXIN® (claritromicina) (Abbott Laboratories, Chicago, IL), ETHAMBUTOL® (Ledelrle, Pearl River, NY), RIFABUTIN® (Pharmacia & Upjohn Company, Kalamazoo, MI), AZITHROMYCIN® (Pfizer Inc., Nova Iorque, NY), GANCICLOVIR (Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ), FOSCARNET® (Astra, Westborough, MA), CIDOFOVIR® (Gilead Sciences, Foster City, CA), KETOCONAZOLE® (Janssen, Titusville, NJ), FLUCONAZOLE® (Pfizer Inc., Nova Iorque, NY),

ITRACONAZOLE® (Janssen, Titusville, NJ), ACYCLOVIR® (GlaxoWellcome, Research Triangle Park, NC), FAMCICOLCIR® (SmithKline Beecham Pharmaceuticals, Pittsburgh, PA), pirimetamina, leucovorina, NEUPOGEN® (filgrastim/GM-CSF) (Amgen, Thousand Oaks, CA) e LEUKINE® (sargramostim/GM-CSF) (Immunex, Seattle, WA).

Em uma forma de realização específica, o anticorpo da invenção é usado em qualquer combinação com trimetoprim-sulfametoxazol e/ou Atovaquona, Dapsona, Pentamidina, para tratar e/ou prevenir profilaticamente uma infecção de pneumonia Pneumocystis carinii oportunística.

Em uma outra forma de realização específica, o anticorpo da invenção é usado em qualquer combinação com Isoniazid, RIFADIN® (Merrell Dow Pharmaceuticals, Cincinnati, Ohio), Pirazinamida e/ou Etambutol para tratar e/ou prevenir profilaticamente uma infecção do complexo de Mycobacterium avium. Em uma outra forma de realização específica, o anticorpo da invenção é usado em qualquer combinação com Rifabutin, Claritromicina e/ou Azitromicina para tratar e/ou prevenir profilaticamente uma infecção oportunística por Mycobacterium tuberculosis. Em uma outra forma de realização específica, o anticorpo da invenção é usado em qualquer combinação com Ganciclovir, Foscamei e/ou Cidofovir, para tratar e/ou prevenir profilaticamente uma infecção oportunística por citomegalovírus. Em uma outra forma de realização específica o anticorpo da invenção é usado em qualquer combinação com Fluconazol, Traconazol e/ou cetoconazol para tratar e/ou prevenir profilaticamente uma infecção fungica oportunística. Em uma outra forma de realização específica o anticorpo da invenção é usado em qualquer combinação com Aciclovir e/ou Famcicolvir para tratar e/ou prevenir profilaticamente uma infecção oportunística pelo vírus simples do herpes tipo I e/ou tipo II. Em uma outra forma de realização específica, o anticorpo da invenção é usado em qualquer combinação com pirimetamina e/ou leucovorina para tratar e/ou prevenir profilaticamente uma infecção oportunística pelo Toxoplasma gondii. Em uma outra forma de realização específica, o anticorpo da invenção é usado em qualquer combinação com leucovorin e/ou NEUPOGEN® (Amgen, Thousand Oaks, CA) para tratar e/ou prevenir profilaticamente uma infecção bacteriana oportunística.

Em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com um agente antiviral. Os agentes antivirais que podem ser administrados incluem, mas não são limitados ao aciclovir, ribavirin, amantadina e remantidina.

Em uma outra forma de realização o anticorpo da invenção é administrado em combinação com um agente antibacteriano. Os agentes antibacterianos que podem ser administrados com as composições da invenção incluem, mas não são limitados à amoxicilina, aminoglicosídeos, beta-lactama (glicopeptídeo), betalactamases, clindamicina, cloranfenicol, cefalosporinas, ciprofloxacina, eritromicina, fluroquinolonas, macrolídeos, metronidazol, penicilinas, quinolonas, ritampin, estreptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, trimetoprim, trimetoprim-sulfantoxazol e vancomicina.

Os agentes imunossupressivos não específicos convencionais, que podem ser administrados em combinação com o anticorpo da invenção incluem, mas não são limitados aos esteróides, ciclosporina, análogos da ciclosporina, ciclofosfamida, metilprednisona, prednisona, azatioprina, FK506 (Fujisawa Pharmaceuticals, Deerfield, IL), 15 desoxiespergualina e outros agentes imunossupressivos que atuam pela supressão da função das células imunes respondedoras (incluindo, por exemplo, células T), diretamente (por exemplo, pela atuação sobre a célula imune) ou indiretamente (pela atuação sobre outras células mediadoras).

Em formas de realização específicas, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com imunossupressores. As preparações imunossupressoras que podem ser administradas com o anticorpo da invenção incluem, mas não são limitadas a ORTHOCLONE® (OKT3) (Ortho Biotech, Raritan, NJ), SANDRYMUNE® ORAL (ciclosporina) (Sandoz Pharmaceuticals, Hanover, NJ), PROGRAF® (tacrolimus) (Fujisawa

Pharmaceuticals, Deerfield, IL), CELLCEPT® (micofenolato) (Roche

Pharmaceuticals, Nutley, NJ), azatioprina, glicorticosteróides e

RAPANUJNF® (sirolimus) (Wyeth, Collegeville, PA). Em uma forma de realização específica, os imunossupressores em combinação com o anticorpo podem ser usados para prevenir a rejeição do transplante de órgão ou medula óssea.

Em uma forma de realização adicional, o anticorpo da invenção é administrado sozinho ou em combinação com uma ou mais preparações de imunoglobulina intravenosa. As preparações de imunoglobulina intravenosa que podem ser administradas com o anticorpo da invenção incluem, mas não são limitadas a, GAMMARE® (Centeon, Kankakee, IL), IVEEGAM® (Immuno-US Inc., Rochester, MI), SANDOGLOBULFN® (Sandoz Pharmaceuticals, Hanover, NJ), GAMMAGARD® (Baxter Healthcare, Glendale, CA) e GAMIMUNE® (Bayer Biological, West Haven, CT). Em uma forma de realização específica, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com preparações de imunoglobulina intravenosa na terapia de transplante (por exemplo, transplante de medula óssea).

Em uma forma de realização adicional, o anticorpo da invenção é administrado sozinho ou em combinação com um agente antiinflamatório. Os agentes antiinflamatórios que podem ser administrados com as composições da invenção incluem, mas não são limitados aos glicocorticóides e os anti-inflamatórios não esteroidais, derivados do ácido aminoarilcarboxílicos, derivados do ácido arilacético, derivado do ácido arilbutírico, ácidos arilcarboxílicos, derivados do ácido arilpropiônico, pirazóis, pirazolonas, derivados de ácido salicílico, tiazinocarboxamidas, ácido e-acetamidocapróico, S-adenosilmetionina, ácido 3-amino-4hidroxibutírico, amixetrina, bendazac, benzidamina, bucolome, difenpiramida, ditazol, emorfazona, guaiazulene, nabumetona, ninesulida, orgoteína, oxaceprol, paranilina, perisoxal, pifoxima, proquazona, proxazol e tenidap.

Em uma forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com a terapia de esteróide. Os esteróides que podem ser administrados em combinação incluem metilprednisolona (por exemplo, IV metilprednisolona). Em uma forma de realização específica o anticorpo da invenção é administrado em combinação com prednisona. Em uma outra forma de realização específica, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com prednisona e um agente imunossupressivo. Os agentes imunossupressivos que podem ser administrados e prednisona são aqueles aqui descritos e incluem, mas não são limitados à, azatioprina, ciclofosfamida e ciclofosfamida IV. Em uma forma de realização específica, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com metilprednisolona. Em uma outra forma de realização específica, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com metilprednisolona e um agente imunossupressivo. Os agentes imunossupressivos que podem ser administrados com metilprednisolona são aqueles aqui descritos e incluem, mas não são limitados à, azatioprina, ciclofosfamida e ciclofosfamida IV.

Em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com um antimalárico. Os antimalariais que podem ser administrados com as composições da invenção incluem, mas não são limitados à, hidroxicloroquina, cloroquina e/ou quinacrina.

Já em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com um NSAID. Opcionalmente, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com um, dois, três, quatro, cinco, «

» dez ou mais dos seguintes medicamentos: NRD-101 (Hoechst Marion Roussel, Kansas City, MO), diclofenac (Dimethaid, Ontario, CN), oxaprozin potássico (Monsanto), mecasermin (Chiron, Emeryville, CA), T-614 (Toyama), pemetrexed dissódico (Eli Lilly, Indianapolis, IN), atreleuton (Abbott, Chicago, IL), valdecoxib (Monsanto), eltenac (Byk Gulden, Melville, NY), campath, AGM-1470 (Takeda, Lincolnshire, IL), CDP-571 (Celltech, Rochester, NY), CM-101 (CarboMed, Nashville, TN), ML3000 (Merck), CB-2431 (KS Biomedix, Surrey, UK), CBF, BS2 (KS Biomedix, Surrey, UK), terapia de gene IL-Ira (Valentis, Burlingame, CA), JTE-522 (Japan Tobacco, Tóquio, Japão), paclitaxel (Angiotech, Vancouver, BQ, DW166HC (Dong Wha, Seoul, Coréia), mesilato de darbufelona (Pfizer Inc., Nova Iorque, NY), receptor de TNF 1 solúvel (sinergen; Amgen, Thousand Oaks, CA), IPR 6001 (Institute for Pharmaceutical Research), trocade (Hoffman-La Roche, Nutley, NJ), EF5 (Scotia Pharmaceuticals), BIIL-284 (Boehringer Ingelheim, Ridgefield, CT), BIIF-1149 (Boebringer Ingelheim, Ridgefield, CT), LEUKOVAX® (Inflammatics, Malvem, PA), MK-663 (Merck, Whitehouse Station, NJ), ST-1482 (Sigma-Tau, Gaithersburg, MD) e propionato de butixocort (Pfizer Inc., Nova Iorque, NY).

Já em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com um ou mais DMARDs. Assim, um, dois, três, quatro, cinco ou mais dos seguintes medicamentos podem ser usados: metotrexato, leflunomida, edatrexato, epiroprim, iometrexol, piritrexim, trimetrexato, brodimoprim, MX-68, ácido N-[4-[3-(2,4-diamino-6,7-diidro5H-ciclopenta[d]-pirimidin-5-il)propil]benzoil]-L-glutâmico, ácido N-[[5-[2(2-amino-l,4,5,6,7,8-hexaidro-4-oxipirirido[2,3-d]pirimidin-6il)etil]-2-tienil]carbonil]-L-glutâmico, ácido (R)N-[[5-[2-(2-amino-l ,4,5,6,7,8hexaidro-4oxopirido[2,3-d]pirimidin-6-il)etil]-2-tienil]-carbonil]L-glutâmico, ácido N((2,4-diamino-3,4,5,6,7,8-hexaidropirido[2,3-d]pirimidin-6-il)etil)-2-tienilcarbonil-L-glutâmico, ácido (S)-2-[[[4-carbóxi-4-[[4-[[(2,4-diamino-659

pteridinil)metil]amino]benzoil]amino]butil]amino]carbonil]benzóico, ácido N-[4[3-(2,4-diamino-l-H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-il)propil]benzoil]-Lglutâmico, 2,4-diamino-6-(N-(4-(fenilsulfonil)benzil)metilamino)quinazolina,

2,4-diamino-5-[4-[3-(4-ammofenil-4-sulfònilfenilamino)propóxi]-3,5dimetoxibenzil]pirimidina, ácido N-[4-4-(2,4-diamino-5-pirimidinil)butil]benzoil]-L-glutâmico, ácido N-[4-[3-(2,4-diamino-5-pirimidinil)propil]benzoil]-L-glutâmico, ácido N-[4-[2-(2,4-diamino-6-pteridinil)etil]-benzoil]4-metileno-DL-glutâmico e cloridreto de N-(l-metiletil)-N’[3-(2,4,5-triclorofenóxi)propóxi]imidodicarbonimídico diamida (PS 15), sulfasalazina, aurotiomalato de sódio, auranofin, ciclosporina, penicilamina, azatioprina, um medicamento antimalárico (por exemplo, como aqui descrito), ciclofosfamida, clorambucil, ouro, Enbrel (etanercept) (Wyeth-Ayerst Laboratories, Philadelphia, PA), anticorpo anti TNF e prednisolona. Em uma forma de realização mais preferida, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com um antimalárico, metotrexato, anti-TNF, Enbrel e/ou sulfasalazina.

Em uma forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com metotrexato. Em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com anticorpo anti-TNF. Em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com metotrexato e anticorpo antiTNF ou anticorpo anti-Fas. Em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com sulfasalazina.

Em uma outra forma de realização específica, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com metotrexato, anticorpo antiTNF, anticorpo anti-Fas e sulfasalazina. Em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com Enbrel. Em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com Enbrel e metotrexato. Em uma outra forma de realização, o

anticorpo da invenção é administrado em combinação com Enbrel, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, etroricoxib, misoprostol/diclofenaco sódico, valdecoxib, tiracoxib, rofecoxib, celecoxib, galantamina, mesilato de darbufelona, aceclofenac, ML-3000, anaquinra, hialuronato sódico, nimesulida, micofenolato mofetil, diacereína, sivelestst sódico, deflazacort, cloridreto de nalmefeno, samarium-153 lexidronam pentassódico, pentostatina, T-614, cloridreto de amiprilose, rocepafant, ampiroxicam, famesilato de prednisolona, meloxicam, diclofenaco sódico, lomoxicam, salazossulfapiridina, etodolac, maleato de flupirtina, ebselen, hidrato de tacrolimus, nabumetona, cloprednol, cinamato de piroxicam, proquazona, rimexolona, fenretinida, hidroxibenzoato de imidazol, droxicam, fentiazac, alfacalcidol, diacetato de halopredona, cloridreto de gusperimus, inosina pranobex, actarit, indometacina famesil, mizoribina, ácido tolfenâmico, diflunisal, piroxicam, oxaprozin, hialuronato sódico, bucilamina, ciclosporina, floctafenina, tenoxicam, palmitato de dexametasona, anfenac sódico, acemetacina, auranofin, lobenzarit dissódico ou qualquer combinação destes.

Em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com Enbrel, metotrexato e sulfasalazina. Em outras formas de realização, um ou mais antimaláricos são combinados com uma das combinações citadas acima. Em uma forma de realização específica, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com um antimalárico (por exemplo, hidroxicloroquina), Enbrel, metotrexato e sulfasalazina. Em uma outra forma de realização específica o anticorpo da invenção é administrado em combinação com um antimalárico (por exemplo hidroxicloroquina), sulfasalazina, anticorpo anti-TNF e metotrexato.

Em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com um agente quimioterapêutico. Os agentes quimioterapêuticos que podem ser administrados com as composições da invenção incluem mas não são limitados aos derivados de antibiótico (por exemplo doxorrubicina, bleomicina, daunorubicina e dactinomicina); antiestrogênios (por exemplo, tamoxifen); antimetabólitos (por exemplo, fluorouracila, 5FU, metotrexato, floxuridina, interferon alfa-2B, ácido glutâmico, plicamicina, mercaptopurina e 6-tioguanina); agentes citotóxicos (por exemplo, carmustina, BCNU, lomustina, CCNU, citosina arabinosida, ciclofosfamida, estramustina, hidroxiuréia, procarbazina, mitomicina, busulfan, cis-platina e sulfato de vincristina); hormônios (por exemplo, medroxiprogesterona, fosfato sódico de estamustina, etinil estradiol, estradiol, acetato de megestrol, metiltestosterona, difosfato de dietil-estilbestrol, clorotrianiseno e testolactona); derivados de nitrogênio mostarda (por exemplo, mefalen, corambucila, mecloretamina (nitrogênio mostarda) e tiotepa); esteróides e combinações (por exemplo, fosfato sódico de betametasona); e outros (por exemplo, dicarbazina, asparaginase, mitotant, sulfato de vincristina, sulfato de vinblastina e etoposida). Outros quimioterapêuticos incluem, por exemplo, CPT-11, deflunomida, cicloheximida e mitomicina.

Em uma forma de realização específica, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisona) ou qualquer combinação dos componentes de CHOP. Em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com Rituximab. Em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção é administrado com Rituxmab e CHOP ou Rituxmab e qualquer combinação dos componentes de CHOP.

Em uma forma de realização adicional, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com citocinas. As citocinas que podem ser administradas com as composições da invenção incluem, mas não são limitados à, GM-CSF, G-CSF, IL-lalfa, IL-Ibeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL- 13, IL- 14, IL- 15, IL-16, IL17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, anti-CD40, CD40L, IFN-alfa, IFN-beta, IFN62 gama, TNF-alfa e TNF-beta.

Em uma forma de realização adicional, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com fatores de desenvolvimento hematopoiéticos. Os fatores de desenvolvimento hematopoiéticos que podem ser administrados com as composições da invenção incluem, mas não são limitados a LEUKINE® (sargramostim) e NEUPOGEN® (filgrast).

Em formas de realização adicionais, o anticorpo da invenção é administrado em combinação com um ou mais outros regimes terapêuticos ou profiláticos, tais como, por exemplo, terapia de radiação.

Como usado do início ao fim, um “agente terapêutico” é um composto ou composição eficaz em melhorar uma condição patológica. O exemplo ilustrativo de um agente terapêutico inclui um composto anti-câncer, membros da família TNF, agentes anti-inflamatórios, agentes anti-virais, agentes anti-retrovirais, agentes anti-oportunísticos, antibióticos, agentes imunossupressívos, imunoglobulinas, agentes anti-maláricos, medicamentos anti-reumáticos modificadores de doença (DMARDs), citocinas, quimiocinas, fatores do crescimento e anticorpos secundários que promovem a apoptose das células alvo.

Um composto anti-câncer ou agente quimioterapêutico é um composto ou composição eficaz em inibir ou deter o desenvolvimento de uma célula que desenvolve anormalmente. Assim um tal agente pode ser usado terapeuticamente para tratar o câncer assim como outras doenças marcadas pelo crescimento celular anormal. Uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto anti-câncer é uma quantidade administrada a um indivíduo suficiente para causar a inibição ou detenção do desenvolvimento de uma célula que desenvolve anormalmente. Os exemplos ilustrativos de compostos anti-câncer incluem: bleomicina, carboplatina, clorambucila, cisplatina, colquicina, ciclofosfamida, daunorrubicina, dactinomicina, dietilstilbestrol doxorubicina, etoposide, 5-fluorouracila, floxuridina, melfalan, metotrexato, mitomicina, 6-mercaptopurina, teniposide, 6-tioguanina, vincristina e vinblastina. Além disso, os exemplos de compostos anti-câncer e agentes terapêutico são encontrados no The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15^a Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N. J. e Sladek et al. Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs, 1987, Powis et al. eds., Taylor e Francis, Nova Iorque, N.Y.

O anticorpo da presente invenção pode ser ainda combinado com outras terapias, tais como quimioterapia e/ou radioterapia no tratamento da malignidade e a eficácia terapêutica pode ser realçada pelos compostos indutores da apoptose, tais como bisindolilmaleimida VIII (BisVIII) ou outros agentes de sensibilizadores como SN-50 ou LY294002. Assim, em uma forma de realização, o anticorpo ou anticorpos da presente invenção podem ser combinados com BisVIII ou outro agente sensibilizador e um quimioterapêutico (por exemplo, adriamicina, etoposide, topetecan, taxotere ou paclitaxei). Em uma outra forma de realização, o anticorpo ou anticorpos da presente invenção podem ser combinados com um medicamento antiinflamatório não esteroidal (por exemplo, sulfeto de sulindac ou outros inibidores de COX-1 ou COX-2) um quimioterapêutico (por exemplo, adriamicina, etoposide, topetecan, taxotere ou paclitaxel). No tratamento de outras doenças, por exemplo, doenças autoimunes e inflamatórias, combinações de tratamento também podem ser usadas. Por exemplo, um anticorpo pode ser administrado em conjunção com outros agentes terapêuticos como agentes anti-inflamatórios, DMARDs, agentes quimioterapêuticos, metotrexato, bisindolilmaleimida VIII ou outros agentes sensibilizadores e outros. A radioterapia também pode ser combinada com outros agentes terapêuticos no tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes. Uma pessoa habilitada na técnica pode adaptar a forma de radioterapia às doenças inflamatórias ou autoimunes específicas (por exemplo, sinovectomia de radiação no tratamento da artrite).

A terapia que usa um anticorpo da presente invenção também pode ser combinada com terapia usando um outro anticorpo. Por exemplo, um anticorpo para DR5 pode ser administrado a um paciente em necessidade deste junto, antes ou a seguir da administração de um anticorpo para DR4, TNF, B7, ligando de CD40, CD40, CD20 “por exemplo, rituximabe”, Fas ou uma combinação destes. Tal terapia de anticorpo combinada pode ser ainda combinada com a administração de um ou mais agentes terapêuticos (por exemplo, quimioterapêuticos, doxorubicina e/ou metotrexato), radioterapia ou ambos.

Assim, a invenção fornece um método de induzir seletivamente a apoptose ou de inibir a proliferação em células alvo que expressam a DR5, compreendendo as etapas de (a) contatar as células alvo com uma quantidade terapêutica de um anticorpo que especificamente liga uma DR5 do receptor TRAIL, em que o dito anticorpo, na sua forma solúvel, tem atividade indutora de apoptose in vivo e in vitro nas células alvo que expressam DR5 e (b) contatar as células alvo com uma quantidade terapêutica de um ou mais agentes terapêuticos. Em uma forma de realização, uma ou ambas das etapas de contatar são opcionalmente realizadas in vivo. Em uma outra forma de realização, uma ou ambas as etapas de contatar são realizadas in vitro. As células alvo podem ser selecionadas a partir de células que apresentam a desregulagem do sistema de apoptose, neutrófilos, linfócitos ativados ou outras células imunes ativadas (por exemplo, células linfóides e células mielóides), células viralmente infectadas e células sinoviais que proliferam anormalmente (por exemplo, células sinoviais da artrite reumatóide incluindo células sinoviais inflamatórias, células linfóides e mielóides ativadas no sinóvio, sinoviócitos como macrófago e sinoviócitos como fibroblasto) de doenças autoimunes. Comparado com o anticorpo antiDR5 anteriormente publicado (24), a atividade indutora da apoptose do anticorpo TRA-8 demonstrativo da presente invenção é muito forte e é capaz de induzir a apoptose de células Jurkat com os níveis de pg/ml in vitro e demonstra atividade tumoricida in vivo superior quando comparado com o TRAIL solúvel anteriormente reportado. A administração intravenosa de uma dose única de TRA-8 é suficiente para inibir o desenvolvimento tanto de tumor sólido quanto de células de tumor hematopoiética, ao passo que a indução da regressão de tumor in vivo com o TRAIL solúvel requer dose muito alta (500 pg ao dia durante 10 dias). Os anticorpos receptores antiTRAIL da presente invenção parecem ser tão seguros quanto o TRAIL solúvel visto que o anticorpo TRA-8 exemplar não induz a apoptose de células de fibroblasto não transformadas. Resultados similares foram observados com anticorpos de DR4.

Os vetores da presente invenção incluem uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma imunoglobulina de cadeia pesada ou leve de um anticorpo de DR5 ou DR4 operavelmente ligados a um elemento regulador tal como um promotor ou realçador. “Operavelmente ligado” refere-se a um arranjo de seqüências de nucleotídeo configuradas de modo a realizar o seu funcionamento usual. Assim, um elemento regulador operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo é capaz de direcionar a transcrição, replicação e/ou tradução do polipeptídeo. Será reconhecido por aqueles habilitados na técnica que um único vetor opcionalmente inclui seqüências codificadoras para uma imunoglobulina tanto de cadeia pesada quanto leve de um anticorpo de DR5 ou DR4. Em uma forma de realização os vetores codificam imunoglobulinas de cadeia leve ou pesada humanizadas.

Os seguintes exemplos são apresentados abaixo para ilustrar os métodos e resultados de acordo com a presente invenção. Estes exemplos não são intencionados a serem inclusivos de todos os aspectos da presente invenção, mas ao invés ilustram métodos e resultados representativos. Estes exemplos não são intencionados a excluir equivalentes e variações da presente invenção que são evidentes a uma pessoa habilitada na técnica.

Exemplo 1. Preparação de antígeno DR5

1.1 Clonagem de cDNA de DR5

O DNA que codifica a proteína DR5 humana é clonado pelo seguinte método de RT-PCR usando:

a) Padrão

O RNA total de células HeLa é extraído usando-se Reagente TRIzol (GIBCO BRL). O padrão para a reação de PCR usou cDNA que é obtido usando-se o kit de síntese de cDNA First-Strand (Amersham Pharmacia Biotech) de acordo com o manual de instrução fornecido com o kit.

b) Preparadores de PCR

Os seguintes preparadores de oligonucleotídeo são sintetizados para a PCR:

5’-gacgatgcccgatctactttaaggg-3’ (DR5pl: SEQ IDNo. 1);

5’-ccactgggtgatgttggatggg-3’ (DR5p2: SEQ ID No. 2);

A menos que de outro modo especificado, todos os oligonucleotídeos nestes Exemplos são sintetizados pela Lifetechnologies. Todos os oligonucleotídeos são armazenados a -20°C depois de serem dissolvidos em água destilada.

c) Reação de PCR

Composição da solução de reação de PCR:

cDNA padrão, 5 μΐ de um total de 33 μΐ de reação preparador DR5pl, 10 pmol;

preparador DR5p2, 10 pmol;

x tampão de PCR concentrado (fornecido com o kit), 10 μΐ;

dNTPs (cada 2,5 mM), 4 μΐ; e

Taq polimerase (Promega), 5 unidades.

Água destilada estéril é adicionada à solução para um volume . * 67

i.

total de 100 μΐ. A menos que de outro modo especificado, as dNTPs são uma mistura eqüimolar de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (2,5 mM de cada).

A reação de PCR é conduzida como segue. A solução é primeiro aquecida a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo de aquecimento a 94°C durante 30 segundos, 52°C durante 1 minuto e 72°C durante 3 minutos, é repetido 40 vezes. Depois da conclusão deste procedimento, a solução de reação é aquecida a 72°C durante 10 minutos.

Os fragmentos de DNA amplificados, assim obtidos, são separados em um gel de agarose a 1% contendo 0,25 pg/ml de brometo de etídio. As faixas determinadas para conter os fragmentos de DNA desejados são cortados usando uma lâmina de barbear e o DNA é recuperado deste usando o kit gene Clean (BIO101). O fragmento de DNA é clonado usando o Kit de Clonagem TA (Invitrogen, CA), isto é realizado como segue.

O fragmento de DNA recuperado da solução de reação de PCR, junto com 50 ng de vetor pCR2.1 que é fornecido com o kit de Clonagem TA, é misturado com 1 μΐ de tampão de reação de ligase 10 X (6 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM de cloreto de magnésio, 5 mM de cloreto de sódio,,7 mM de β-mercaptoetanol, 0,1 mM de ATP, 2 mM de DTT, 1 mM de espermidina e 0,1 mg/ml de albumina sérica bovina), ao que 4 unidades de T4 DNA ligase (1 μΐ) foram adicionados. O volume total da mistura é ajustado a 10 μΐ com água desionizada estéril e a solução de ligase resultante é incubada a 14°C durante 15 horas.

Depois deste tempo, 2 μΐ da solução de reação de ligase são adicionados a 50 μΐ da cepa da E. coli competente TOP10F’, que são fornecidos com o kit de clonagem TA e levado à competência de acordo com o manual de instrução, ao que 2 μΐ de β-mercaptoetanol 0,5 M foram adicionados e a mistura resultante é mantida em gelo durante 30 minutos, depois a 42°C durante 30 segundos e mais uma vez em gelo durante 5 minutos. Em seguida, 500 μΐ de meio contendo 2% v/v de triptona, 0,5% p/v de extrato de levedura, 0,05% p/v de cloreto de sódio, 2,5 mM de cloreto de potássio, 1 mM de cloreto de magnésio e 20 mM de glicose (daqui em diante aludido como meio “SOC”) são adicionados à cultura e a mistura é incubada durante 1 hora a 37°C com agitação. Depois deste tempo, a cultura é espalhada sobre uma placa de caldo L ágar (1% v/v triptona, 0,5% p/v de extrato de levedura, 0,5% p/v de cloreto de sódio, 0,1% p/v de glicose e 0,6% p/v de bacto-agar (Difco)), contendo 100 pg/ml. As colônias resistentes à ampicilina que aparecem sobre a placa são selecionadas e raspadas com uma alça de transferência de platina e cultivadas em meio de caldo L contendo 100 pg/ml de ampicilina a 37°C, durante a noite, com agitação a 200 r.p.m. Depois da incubação, as células são colhidas pela centrifugação, da qual o DNA plasmídico é preparado pelo método alcalino. O fragmento EcoRIEcoRI DR5cDNA do plasmídeo assim obtido é subclonado no plasmídeo pcDNA3 (Invitrogen, CA). O comprimento completo do gene DR5 no pcDNA3 é seqüenciado e equiparado com a seqüência publicada. O plasmídeo assim obtido é designado como o plasmídeo pcDNA3-DR5.

1.2 Construção do vetor de expressão DR5-IgG

De modo a obter uma forma solúvel de DR5 humano que careça do domínio de transmembrana, um vetor plasmídico de expressão é construído. Este vetor é planejado para codificar uma proteína de fusão que compreenda o domínio extracelular da DR5 humana fundida ao IgGl Fc DNA humano (41). O DNA que codifica a DR5 humana que carece do domínio de transmembrana é obtido pela seguinte reação de PCR.

a) Padrão

O padrão para a reação de PCR usou o pcDNA3-DR5.

b) Preparadores de PCR

Os seguintes preparadores de oligonucleotídeo são sintetizados para a PCR:

5’-gacgatgcccgatctactttaaggg-3’ (DR5pl: SEQ ID No. 1);

5’-ggatccgtggacacattcgatgtc-3’ (DR5p3: SEQ ID No. 3);

A menos que de outro modo especificado, todos os oligonucleotídeos nestes Exemplos são sintetizados pela Lifetechnologies. Todos os oligonucleotídeos são armazenados a -20°C depois de serem dissolvidos em água destilada.

c) Reação de PCR

A reação de PCR é conduzida e o DNA amplificado isolado como para o Exemplo 1.1 (c).

O plasmídeo assim obtido é designado como o plasmídeo pCR-ADR5. O fragmento BamHI-EcoRl codificou o fragmento Fc humano que é recuperado a partir do pmFas-hlgGlFc é subclonado nos sítios de clonagem múltipla BamHI e EcoRI de pcDNA3. O plasmídeo assim obtido é designado pcDNAFc. Além disso, o fragmento BamHI-BamHI que codifica a região de DR5 solúvel humana que é recuperada de pCR-ADR5 é subclonado no sítio BamHI do plasmídeo pcDNAFc. O plasmídeo assim obtido é designado como o plasmídeo pcDNAADR5-Fc. O fragmento EcoRI que codifica a região IgG Fc humana da DR5 solúvel humana que é recuperada do plasmídeo pcDNAADR5-Fc é terminado abrupto usando-se o Fragmento Klenow da DNA polimerase (GIBCO BRL) e depois subclonado no vetor de transporte pAdCMV5 (Quantum Biotechnologies Inc., Canadá) que é terminado abrupto depois de cortar por BamHI. O plasmídeo assim obtido é designado pAdADR5-Fc.

1.3 Expressão e purificação da proteína de fusão DR5-IgGl humana

Células QBI-293A (fornecidas com o Kit ADENO-Quest) são co-transfectadas com pAdADR5-Fc e QBI-DNA viral (fornecido com o Kit ADENO-Quest) usando o Kit ADENO-Quest (Quantum Biotechnologies Inc., Canadá) de acordo com o manual de instrução. As placas virais recombinantes são cultivadas e tríadas quanto a expressão da proteína de fusão DR5-IgG pela análise de ELISA do sobrenadante. As placas positivas são amplificadas em células QBI-293A e armazenadas a -80°C como estoque viral. Cinqüenta placas (150 mm) de células QBI-293A são transfectadas com vírus recombinante pAdADR5-Fc a 10 m.o.i. (multiplicidade de Infecção). Os meios de cultura são colhidos depois da transfecção durante 48 horas.

As células transfectadas tendo o gene DR5-IgG são cultivadas até uma densidade de célula de 1 x 10⁶ células/ml pela incubação em 500 ml de meio DMEM (GIBCO), contendo 10% v/v de FCS, a 37°C em uma atmosfera de 5% v/v de CO₂ durante 2 dias. A cultura é depois centrifugada (1.000 r.p.m., 5 minutos) e o sobrenadante coletado. A purificação de DR5IgG a partir do sobrenadante é obtida usando a cromatografia de afinidade Proteína A-Sepharose CL-4B (Pharmacia) sob as seguintes condições:

coluna: coluna de Proteína A-Sepharose CL-4B (tamanho da coluna 2 ml; Pharmacia);

tampão de elução: 0,1 M de glicina (pH 2,4), 0,15 M de NaCl;

tampão de neutralização: 1M de Tris-HCl (pH 8,5).

Depois que todo o sobrenadante é aplicado à coluna, ela é lavada três vezes com 20 ml de PBS e depois 1 ml de tampão de elução é adicionado 10 vezes. A densidade ótica de cada fração eluída (1 ml) é medida. Da segunda fração até a quinta fração (com OD₂so >0,1) são coletadas e depois da adição de 100 μΐ de tampão de neutralização, os eluídos são colocados separadamente na tubulação de diálise e os eluídos dializados contra 1 litro de PBS (pH 7,5) a 4°C. O tampão de diálise sendo trocado duas vezes.

Os eluídos são depois ensaiados quanto a expressão do produto de gene DR5-IgG pelo ELISA. Primeiro, 100 μΐ de cada fração são colocados separadamente em reservatórios de uma microplaca de 96 reservatórios (Costar) e incubados a 37°C durante 1 hora. Depois deste tempo, a solução nos reservatórios é removida e a placa é lavada 3 vezes com 100 μΐ/reservatório de PBS contendo 0,1% v/v de Tween 20 (daqui em diante aludido como “PBS-Tween”). Depois da lavagem, PBS contendo 2% p/v de albumina sérica bovina (daqui em diante aludido como “BSA”) é adicionado em quantidades de 100 μΐ/reservatório e a placa é depois incubada a 37°C durante 1 hora. Depois deste tempo, os reservatórios são lavados 3 vezes mais com 100 μΐ/reservatório de PBS-Tween, depois do que 100 μΐ/reservatório de uma solução de anticorpo monoclonal IgGl anti-humano diluída 1000 vezes com PBS-Tween são adicionados a cada reservatório e a placa é mais uma vez incubada a 37°C durante 1 hora. Os reservatórios são depois lavados 3 vezes com 100 μΐ/reservatório de PBS-Tween. O sistema de substrato líquido de 3,3’,5,5’-Tetrametil-benzidina (daqui em diante aludido como “TMB”) (Sigma) é depois adicionado em uma quantidade de 100 μΐ/reservatório e a placa é deixada repousar na temperatura ambiente durante 5 minutos e depois a reação é interrompida pela adição de 100 μΐ/reservatório de H2SO4 0,2 N. A absorbância de cada reservatório é lida a 450 nm para estimar a concentração do anticorpo ligado, usando a absorbância a 650 nm como a leitura de controle. A absorbância é medida usando uma leitora de microplaca (Molecular Devices). A produção de DR5-IgGl é confirmada usando este método de ELISA. O peso molecular da proteína de fusão DR5-IgGl expressada é determinado usando a análise de western blotting em que a IgGl mAb anti-humana (Sigma) é usada para detectar o anticorpo no gel. O peso molecular da proteína de fusão DR5-IgGl expressada tem um peso molecular aproximado de 50 kDa. A pureza obtida sendo maior do que 90% como avaliado pela análise na SDS-PAGE e detecção da proteína pelo tingimento com azul de Coomassie.

Exemplo 2. Geração de anticorpos monoclonais contra a DR5 humana

2.1 Imunização

Camundongos Balb/c, fêmeas (Jackson Laboratory, Bar . ' 72 i

*

Harbor, ME) de 6 a 8 semanas de idade, são imunizados com a proteína de fusão DR5 humana/hlgGl purificada por afinidade. Para a imunização da almofada da pata inicial, a proteína de fusão (50 pg) é emulsificada em adjuvante completo de Freund (Difco, Detroit, MI). Os camundongos são depois reforçados com quatro injeções de 50 pg de proteína de fusão administrada sem adjuvante um dia sim um dia não. Três dias depois da última injeção, os linfócitos dos linfonodos locais são fundidos com células de mieloma NS-1 e os hibridomas são cultivados em meios F104 suplementados com 10% de soro fetal bovino. Os hibridomas positivos são selecionados pelo ELISA em que as placas são revestidas com 1 pg/ml de DR5/hIgGl ou a mesma quantidade de Fas/hlgGl como um controle. O isotipo dos hibridomas é determinado pelo ELISA usando um painel de anticorpos de cabra específicos do isotipo Ig de camundongo (Southem Biotechnology, Birmingham, AL). Os anticorpos monoclonais são purificados pela cromatografia de afinidade usando IgGl anti-camundongo ou proteína G (Sigma) imobilizadas.

2.2 Fusão celular

No terceiro dia depois da injeção de reforço, os linfonodos locais são removidos do camundongo e colocados em 10 ml de meio RPMI 1640 isento de soro (GIBCO BRL) contendo 50 unidades/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina e 300 pg/ml de ácido L-glutâmico e rompidos passando-se o órgão através de uma malha (Peneira de Célula; Falcon) usando uma espátula. A suspensão de célula resultante é centrifugada para pelotizar as células de linfonodos locais que são depois lavadas duas vezes com meio RPMI isento de soro. As células lavadas são depois recolocadas em suspensão em meio RPMI isento de soro e contadas.

Nesse meio tempo, as células NS1 de mieloma (American Type Culture Collection TIB18) foram cultivadas até uma densidade de célula não excedente a 1 χ 10⁸ células/ml em meio ASF104 (Ajinomoto, K. K.) contendo 10% v/v de FCS (Gibco BRL) (“meio ASF com soro”) a 37°C sob 5% v/v de CO2 e estas são do mesmo modo rompidas, lavadas, recolocadas em suspensão e contadas.

Uma quantidade da suspensão de célula NS1 calculada para conter 3 x 10⁷ células é misturada com uma quantidade da suspensão de célula do baço calculada para conter 3 x 10 células. A mistura resultante e centrifugada e o sobrenadante descartado. As seguintes etapas da fusão celular são realizadas mantendo sempre o tubo plástico contendo a pelota a 37°C em um béquer de água quente.

Um ml de polietileno glicol 1500 a 50% (p/v) (Boehringer Manheim) é depois lentamente adicionado ao tubo, todo o tempo agitando a pelota usando a ponta de uma pipeta. Subsequentemente, 1 ml de meio RPMI isento de soro, pré aquecido a 37°C, é lentamente adicionado em 2 porções, seguido pela adição de mais 7 ml de meio RPMI isento de soro. A mistura resultante é depois centrifugada, o sobrenadante descartado e 10 ml de meio HAT contendo 10% v/v de FCS são adicionados sob agitação suave com a ponta de uma pipeta. Um adicional de 20 ml de meio HAT contendo 10% v/v de FCS é adicionado e a suspensão é dispensada em microplacas de cultura celular de 96 reservatórios a 100 μΐ/reservatório e incubada a 37°C em uma atmosfera de 5% v/v de CO2. Depois de 7 ou 8 dias, 100 μΐ/reservatório de meio HAT fresco são usados para substituir o meio em qualquer dos reservatórios que exibam uma coloração amarelada. As células de fusão destes reservatórios são clonadas limitando-se a diluição como descrito abaixo.

2.3 Clonagem limitando-se a diluição

Os timos de camundongos BALB/c fêmeas de 4 a 10 semanas de idade (da Japan SLC, Inc.) são removidos, rompidos em uma malha (Peneira de Célula; Falcon) como descrito acima e as células rompidas são lavadas duas vezes com meio HT contendo 10% v/v de FCS. Uma quantidade

de células de timo que corresponde àquelas de um camundongo é colocada em suspensão em 30 ml de meio HT contendo 10% v/v de FCS para produzir uma suspensão de célula alimentadora. A preparação de célula de fusão obtida acima no Exemplo 2.2 é diluída com esta suspensão de célula alimentadora 10 a 100 vezes e ainda diluída em série com a suspensão de célula alimentadora para compor suspensões tendo densidades de células de fusão de 5, 1 e 0,5 células/ml. As amostras assim preparadas são dispensadas em reservatórios de microplacas de cultura celular de 96 reservatórios a 100 μΐ/reservatório e incubadas durante 5 dias a 37°C sob 5% v/v de CO₂.

2.4 Triagem

Os sobrenadantes de cultura dos hibridomas em desenvolvimento são triados pelo ELISA usando placas revestidas com 1 pg/ml DR5/hIgGl ou a mesma quantidade de Fas/hlgGl (41) como um controle. Os anticorpos ligados são detectados usando imunoglobulinas anticamundongo conjugadas à rábano peroxidase (HRP) (Southem Biotechnology, Birmingham, AL) com TMB (Sigma, St Louis, MI) como o substrato. A DR5-IgGl purificada a uma concentração de 1 pg/ml ou a mesma quantidade de Fas-hlgGl são introduzidas em um reservatório de uma PLACA DE EXTRAÇÃO DE ELISA/RIA de 96 reservatórios (Costar, NY). A placa é mantida em repouso a 4°C durante a noite para permitir a adsorção da proteína sobre a superfície do reservatório. Depois deste tempo, a solução nos reservatórios é descartada e cada reservatório é lavado 3 vezes com PESTween. Depois, 100 μΐ de PBS contendo 1% (p/v) de albumina sérica bovina (A3803; Sigma Chemicals Co.) são adicionados a cada reservatório e a placa é incubada a 37°C durante 1 hora. Os reservatórios são depois lavados mais 3 vezes com PBS-Tween e depois 50 μΐ de cada sobrenadante de cultura dos hibridomas em desenvolvimento é adicionado a cada reservatório. A placa é depois incubada a 37°C durante 1 hora e os reservatórios são mais uma vez lavados 4 vezes com PBS-Tween. Depois da lavagem, 50 μΐ de anticorpo de imunoglobulina anti-camundongo de cabra rotulado com rábano peroxidase (Southem Biotechnology, Birmingham, AL), diluídos 1000 vezes com PBS, são adicionados por reservatório e a placa é mais uma vez incubada a 37°C durante 1 hora, depois do que os reservatórios são lavados 4 vezes com PBSTween. O sistema de substrato líquido 3,3’,5,5’Tetrametil-benzidina (TMB) (Sigma) é depois adicionado em uma quantidade de 100 μΐ/reservatório e a placa é deixada repousar na temperatura ambiente durante 5 minutos e depois a reação é interrompida pela adição de 100 μΐ/reservatório de H2SO4 0,2 N. A absorbância de cada reservatório a 450 nm (controle 650 nm) é medida usando uma leitora de microplaca (Molecular Devices) e as células de fusão são selecionadas a partir da amostra que teve a absorbância (450 nm-650 nm, valores de OD; > 0,5) claramente mais alta do que aquela na qual nenhum sobrenadante de células de fusão foi adicionado (valores de OD; « 0,03). Além disso, os sobrenadantes de cultura dos hibridomas em desenvolvimento também são funcionalmente tríadas medindo-se a atividade indutora de apoptose usando célula Jurkat. Cinqüenta μΐ de meio RPMI contendo células Jurkat (1000 células por reservatório) e 5 μΜ Bisindolilmaleimida VIII (BisVIII, Alexis, San Diego, CA) são adicionados em placas de 96 reservatórios na presença de 50 μΐ dos sobrenadantes de cultura dos hibridomas em desenvolvimento. As células são cultivadas em um incubador umidificado a 37°C durante a noite. A apoptose é determinada pela viabilidade celular usando o kit ATPLite como instruído pelo fabricante (Packard Instruments) e as amostras são contadas usando o TopCounter (Packard Instruments).

2.5 Ligação por ELISA de TRAIL e TRA-8 aos receptores

As placas de ELISA são revestidas com 2 μg/ml de proteína de fusão DR4-Ig ou DR5-Ig durante a noite. Depois de bloquear com 3% de BSA, o TRAIL-FLAG ou TRA-8 solúveis são adicionados nas concentrações indicadas e incubados a 37°C durante uma hora. A ligação de TRAIL ou > ·* 76

TRA-8 é detectada pelo anticorpo anti-Flag conjugado a HRP (Alexis) ou IgGl anti-murino conjugado a HRP (Southem Biotechnology), respectivamente. As reações são desenvolvidas pelo tampão de substrato TMB e medidas pela Leitora de microplaca Benchmark (BioRad). Os valores de Kd são estimados pelo modelo de ligação de sítio único de regressão não linear usando o software GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA). Para o ELISA competitivo, 100 ng/ml de TRAIL-FLAG são adicionados e incubados na presença de várias concentrações de TRA-8. A ligação de TRAIL é determinada como acima.

2.6 Clonagem

As etapas descritas nos Exemplos 2.3 e 2.4 acima são repetidas 5 vezes para as células selecionada em 2.4, permitindo deste modo a seleção de diversos clones de hibridoma cada um dos quais produziu um único anticorpo que ligou DR5-IgG mas não ligou Fas-IgG. Como um resultado deste procedimento de seleção, um hibridoma camundongo-camundongo, designado TRA-8 e que produz uma ligação de anticorpo para DR5-IgG, mas não para Fas-IgG, é obtido. Este hibridoma, o TRA-8, foi depositado com a American Type Culture Collection em 1 de março de 2000 e foi designado o acesso No. PTA-1428.

A subclasse do anticorpo produzida pelo hibridoma de camundongo-camundongo TRA-8 (daqui em diante aludido simplesmente como “TRA-8”) é demonstrada ser IgGl, k, depois de testar com um kit de isotipagem de anticorpo monoclonal (Pierce).

Usando a nossa proteína de fiisão DR5 humana-IgGl como imunógeno, sete clones de hibridoma são obtidos pelas triagens iniciais por ELISA, todos os quais são fortemente positivos quanto à DR5-IgG mas não quanto à proteína de fusão Fas-IgG, indicando que os hibridomas obtidos produzem anticorpos que reconhecem a porção extracelular de DR5 mas não a porção Fc de IgGl (dados não mostrados).

2.7 Análise de Western blot

Os filtros para a análise de Westem blot de homogenados de tecido normal humano e canceroso são adquiridos da Geno Technology (St Louis, MO). Cada linha é carregada com uma quantidade igual de proteína como determinado por um anticorpo anti-3-actina. As manchas são sondadas com 1 pg/ml de TRA-8 durante a noite e seguido por IgGl anti-camundongo de cabra conjugado com HRP (Southem Biotechnology) na temperatura ambiente durante uma hora e desenvolvidas pela quimioluminescência.

2.8 Imunoistoquímica In situ

Tecidos humanos são obtidos a partir do Tissue Procurement Center of UAB. As seções congeladas são fixadas em etanol a 70%, bloqueadas com 10% de soro de cavalo em PBS e depois incubadas com 10 pg/ml de TRA-8 purificado por afinidade na temperatura ambiente durante 60 minutos. O kit ABC de IgG anti-camundongo com diaminobenzidina (Vector, Burlingame, CA) como o substrato colorimétrico é usado para visualizar a reatividade.

2.9 Análise de ativação da caspase

As células Jurkat (1 x 10⁶/ml) são incubadas com 500 ng/ml de TRA-8. As alíquotas (30 pg de proteína) do lisado celular são separadas em 15% SDS-PAGE, manchadas sobre uma membrana de náilon e as manchas são sondadas com anticorpos 8, 9 e 3 anti-caspase (BD Pharmingen, San Diego, CA) seguido por anticorpo secundário conjugado a HRP e visualização por quimioluminescência dos produtos clivados. O conjunto inibidor de caspase é adquirido da R&D Systems (Minneapolis, MN). Cada inibidor de caspase é adicionado na cultura nas concentrações indicadas.

Exemplo 3. Purificação de Anticorpo Monoclonal TRA-8

O hibridoma de camundongo-camundongo, TRA-8, é cultivado a uma densidade de célula de 1 x 10⁶ células/ml pela incubação em 500 ml de meio ASF, contendo 10% v/v de FCS, a 37°C sob 5% v/v de CO₂ durante 5 dias. A cultura é depois centrifugada (1.000 r.p.m., 5 minutos) e o sobrenadante coletado. A purificação de TRA-8 a partir do sobrenadante é obtida usando cromatografia de afinidade com Proteína G-Sepharose CL-4B (Pharmacia) sob as seguintes condições:

coluna: coluna de Proteína G-Sepharose CL-4B (tamanho da coluna 2 ml; Pharmacia);

tampão de elução: 0,1 M de Glicina (pH 2,4), 0,15 M de NaCl;

tampão de neutralização: 1 M de Tris-HCl (pH 8,5).

Depois que todo o sobrenadante é aplicado à coluna, 20 ml de PBS são lavados três vezes e depois tampão de elução é adicionado em volumes de 1 ml por 10 vezes. A densidade ótica de cada fração eluída (1 ml) é medida. As frações de N^s 2 a N^a 5 (> OD₂8o = 0,1) são coletadas separadamente.

Depois de adicionar 100 μΐ de tampão de neutralização, os eluídos são colocados na tubulação de diálise separadamente e os eluídos dializados contra 1 litro de PBS (pH 7,5) a 4°C. O tampão de diálise sendo trocado duas vezes. Esta amostra é ensaiada quanto a atividade de anticorpo anti-DR5 pelo ELISA usando a proteína de fusão DR5 humana-IgG preparada acima usando a técnica descrita acima.

Exemplo 4. Preparação de antígeno DR4, vetor de expressão DR4-IgG e anti-anticorpo de DR4 monoclonal

Os procedimentos dos Exemplos de 1 a 3 são repetidos com cDNA padrão de DR4 e preparadores no lugar daqueles detalhados no Exemplo 1 para obter um antígeno de DR4 que é utilizado como para os Exemplos 1.2 a 1.3 para se obter um anticorpo monoclonal específico contra DR4.

Exemplo 5. Anticorpo monoclonais contra DcRl e DcR2

Os anticorpos monoclonais são incitados contra os receptores isca DcRl e DcR2 substituindo-se o cDNA e preparadores correspondentes para criar os respectivos antígenos como para o Exemplo 1. Os vetores de expressão para as fusões DcRl ou DcR2 com imunoglobulina G e os anticorpos monoclonais purificados resultantes são criados como para os Exemplos 2 e 3.

Exemplo 6. A especificidade de um anticorpo monoclonal

Visto que todos os receptores para TRAIL e outras proteínas da família TNFR compartilham homologia significante, a especificidade de anticorpo TRA-8 exemplar para DR5 é determinada pela análise de Western blot usando duas proteínas de fusão DR5 humana-IgG diferentes e formas solúveis, recombinantes de outras proteínas relacionadas. Uma primeira proteína de fusão DR5-Ig é construída fundindo-se cDNA de resíduos 1 a 180 da porção extracelular de DR5 e cDNA que codifica a região constante da IgGl humana. O cDNA fundido é clonado em um vetor adenoviral recombinante (Quantum Biotechnogies, Inc., Montreal, Canadá). A proteína de fusão DR5/hIgGl expressada, que teve um peso molecular relativo de 50 kDa, é purificada usando uma coluna de afinidade IgG anti-humano (Sigma, St Louis, MO). Para a análise de Western blot de especificidade, uma segunda proteína de fusão DR5 recombinante humana/IgGl (aminoácidos de 52 a 212), assim como as proteínas de fusão TRAIL-R1, R3 e R4, são adquiridas da Alexis. As formas solúveis da Fas humana e TNFR1 são gentilmente fornecidas pelo Dr. Carl Edwards da Amgen, Inc., Thousands Oaks, CA, USA. As moléculas DR4, DcRl, DcR2, TNFR1, R4 e Fas humanas, recombinantes, solúveis usadas são proteínas de fusão com a IgGl humana. 0,5 pg de cada proteína é separado pela 10% SDS-PAGE e manchadas sobre uma membrana de nitrocelulose. As manchas são bloqueadas com 5% de leite em pó em PBS na temperatura ambiente durante uma hora e sondada com 1 pg/ml de anticorpo anti-DR5 monoclonal purificado (clone: TRA-8) ou 0,1 pg/ml de IgG anti-humano de cabra conjugado a HRP a 4 °C durante a noite. IgG anti-camundongo de cabra conjugado a rábano peroxidase (HRP) é usado como anticorpo secundário para detectar o TRA-8 ligado. As manchas são desenvolvidas pela quimioluminescência.

As células Cos-7 transfectadas com o vetor pcDNA3 (Clontech, Paio Alto, CA) contendo a DR5 ou DR4 de comprimento completo ou vetor vazio são usadas para a análise de citometria de fluxo. O cDNA de comprimento completo que codifica o TRAIL humano ou o ligando Fas de murino é clonado no vetor pTRE a jusante do promotor controlável de tetraciclina (Clontech). Os fragmentos Xhol-HindIII de pTRE-hTRAIL ou pTRE-mFasL são ainda clonados no vetor de transporte adenoviral pAdBN (Quantum Biotechnologies, Inc.). As células hospedeiras 293 são cotransfectadas com o pAd-TRE-hTRAIL ou pAd-TRE-mFasL linearizados e o DNA de fragmento grande de adenovírus. A expressão de TRAIL humano funcional ou ligando Fas de murino a partir das placas virais recombinantes é tríada usando um ensaio de liberação de ⁵¹Cr com Jurkat como os alvos.

TRA-8 fortemente reagido com a proteína de fusão DR5-IgG (-50 kDa), que é usado durante a imunização como mostrado na Figura Ia, DR5, #1 e fracamente com a segunda proteína de fusão DR5-IgG (-60 kD) como mostrado na Figura la, DR5, #2. Não existe nenhuma ligação significante de TRA-8 com a DR4, DcRl, DcR2, Fas (CD95) ou TNFR1. Estes resultados indicam que o TRA-8 reconhece os epítopos que são específicos para DR5 mas não compartilhados pelos outros membros da família.

O TRA-8 não reage com outros membros da superfamília do receptor TNF, tal como Fas (CD95) e receptor TNF 1, nem o TRA-8 reage cruzado com o homólogo de murino de DR5 como mostrado pelas relações de absorbância ótica para 450 nm e 650 nm, como os números de painel mais baixos de 1 a 7 (Fig. la, a coluna 8 do painel inferior). O TRAIL e o TRA-8 solúveis ligaram-se comparavelmente à DR5 imobilizada (Fig. 1b, painel esquerdo). Em comparação, o TRAIL ligou a DR4, mas o TRA-8 não exibe qualquer atividade de ligação à DR4 (Fig. 1b, painel central). Os valores de Kd para a ligação de TRAIL e TRA-8 à DR5 são estimados a 59 nM e 3 nM, respectivamente. Consideravelmente, o TRA-8 eficientemente compete com TRAIL quanto a ligação à DR5 mas não quanto a ligação à DR4, como mostrado no ELISA competitivo (Fig. 1b, painel direito). Estes resultados estabelecem a especificidade de TRA-8 para a DR5 humana.

O TRA-8 é capaz de detectar a expressão da superfície celular de DR-5, com a análise citométrica de fluxo indicando a ligação específica à superfície celular de células Cos-7 transfectada com a DR5 humana de comprimento completo, mas não de células Cos-7 transfectadas com DR4 ou vetor vazio (Fig. 1c). Similarmente, a imunoistoquímica in situ com TRA-8 demonstrou reatividade com células Cos-7 transfectadas com DNA de DR5 de comprimento completo mas não com aquelas transfectadas com vetor de controle (Fig. ld). O TRA-8 não induz a apoptose de células Cos-7 não transfectadas e a RT-PCR de RNA de células Cos-7 usando preparadores unidos que codificam a DR5 humana mostrou que nenhum dos produtos de PCR específicos. Além disso a análise funcional usando células Jurkat humanas como alvos mostraram que, na ausência de reticulação, o TRA-8 induz fortemente a morte da célula, demonstrado pelos três ensaios diferentes para a viabilidade celular incluindo ATPLite, MTT e exclusão de PI (Fig. le). Mais do que 50% de células Jurkat são mortas pelos níveis de nanograma de TRA-8 como mostrado pelo ensaio ATPLite. A atividade de destruição de TRA-8 é específico para DR5 visto que ela pode ser bloqueada pela proteína de fusão DR5-Ig mas não pela DR4-Ig (dados não mostrados). A clivagem das caspases 8, 9 e 3 podem ser detectadas pela análise de Western blot tão cedo quanto 30 minutos depois do tratamento com TRA-8 de células Jurkat (Fig. If) e a morte celular de células Jurkat é completamente inibida pelo inibidor de caspase geral (Z-VAD) (Fig. Ig). os inibidores da caspase individuais para a caspase 8, 3, 9 e 10 parcialmente inibiram a morte celular, indicando ainda mais que a morte celular mediada pelo TRA-8 é primariamente considerada um mecanismo apoptótico dependente da caspase.

Exemplo 7. Análise citométrica de fluxo da expressão de DR5 de superfície celular: Um receptor de morte principal em muitas células de tumor mas não em células normais

A capacidade de TRA-8 para ligar DR5 expressada na superfície celular e a especificidade desta reação é depois avaliada usando células COS-7 (American Type Culture Collection N^a CRL-1651) transfectadas com o vetor de expressão contendo a DR5 humana de comprimento completo ou cDNA de DR4 ou vetor vazio como controle. A IgGl anti-camundongo conjugado a Ficoeritrina (PE) (Pharmingen) é usada como o segundo anticorpo para detectar a ligação de TRA-8. A fluorescência de 1 x 10⁴ células é medida, usando um citômetro de fluxo (FACSVantage) sob as seguintes condições:

Comprimento de onda de excitação: 488 nm;

Comprimento de onda de detecção: 600 nm.

A análise de citometria de fluxo mostrou que o TRA-8 tingiu aproximadamente 30% de células COS-7 transfectadas com o vetor DR5 como mostrado no histograma sólido da Figura 1c. Esta porcentagem se assemelha à eficiência de transfecção como determinado pela análise de transfecção usando a proteína fluorescente verde (GFP) (dados não mostrados). A TRA-8 não tinge significantemente as células transfectadas com DR4 (o histograma aberto) ou vetor de controle (o histograma tracejado), indicando que o TRA-8 é específico para a DR5 de superfície celular.

Embora a expressão de DR5 em células de tumor foi extensivamente estudada ao nível de mRNA (o inserto satisfaz a REFERÊNCIA), a expressão de superfície de DR5 não foi documentada. Assim, a disponibilidade de anticorpo monoclonal anti-DR5 nos permite examinar os níveis de superfície de DR5 e correlacionar a expressão com a suscetibilidade das células para a apoptose mediada pelo TRAIL. O seguinte painel de células (1 x 10⁶) é incubado com 10 pg/ml de TRA-8 purificado por afinidade na temperatura ambiente durante 30 min e depois tingido com IgGl anti-camundongo conjugado a PE (Pharmingen) durante mais 30 minutos. 10.000 células viáveis são analisadas usando o citômetro de fluxo FACS vantagem sob as seguintes condições:

Comprimento de onda de excitação: 488 nm;

Comprimento de onda de detecção: 600 nm.

As cinco linhagens de célula hematopoiética testadas são as células Jurkat, CEM-6, Molt-4, H-9 e U937. A expressão de DR5 é detectável na superfície de células Jurkat, CEM-6, H-9 e U937 mas é quase não detectável em células Molt-4 como mostrado na Figura 2a e 2a’. Embora níveis altos de expressão de RNA de DR5 tenham sido anteriormente descritos (43), a análise de FACs indicou que estas células não expressam níveis altos da DR5 de superfície. Estes resultados indicam que a expressão de superfície celular de DR5 não se correlaciona com a expressão transcricional de DR5, que não é inesperado para um tal receptor. O nível de expressão de superfície celular de DR5 pode ser específico da linhagem de célula visto que a maioria das células de origem hematopoiética expressaram níveis baixos ao passo que a maioria das células de glioma e próstata expressaram níveis altos de DR5.

O anticorpo monoclonal TRA-8 é usado para determinar o papel da DR5 na indução de apoptose mediada por TRAIL examinando-se a sua expressão de superfície celular entre um painel de tipos diferentes de células de tumor humanas assim como a suscetibilidade destas células para a apoptose mediada tanto pelo TRAIL quanto pelo TRA-8. As células T de sangue periférico primárias não expressam níveis significantes de DR5 de superfície celular e são resistentes tanto à apoptose mediada pelo TRAIL quanto pelo TRA-8 (Figs. 2a, 2a’ e 3a’). Embora todas as cinco das linhagens de célula da leucemia T humanas testadas expressaram níveis relativamente baixos embora detectáveis de DR5 de superfície celular, duas delas (Jurkat e CEM-6) são altamente suscetíveis à apoptose mediada tanto pelo TRAIL quanto pelo TRA-8, indicando que a DR5 sozinha é suficiente para induzir a apoptose destas células. As células Molt-4 e U937 são parcialmente suscetíveis à apoptose mediada pelo TRAIL mas são relativamente resistentes à apoptose mediada pelo TRA-8, sugerindo que outros receptores TRAIL podem estar envolvidos na transdução de um sinal de apoptose. As células H9 são resistentes à apoptose mediada tanto pelo TRAIL quanto pelo TRA-8, implicando um bloqueio mediado por um caminho anti-apoptose intracelular.

O painel de células incluíram as linhagens de célula de glioma maligno humanas, Hs683, U251MG, D37MG, D54MG, U373MG, CH235MG, U87 e astrócitos humanos normais, que foram fornecidos pelo Dr. Yancey Gillespie do Neurosurgery Department of the University of Alabama em Birmingham. As linhagens de célula de câncer prostático humanas, Dul54, PC3 e LnCap, foram fornecidas pelo Dr. William Grizzle do Pathology Department of the University of Alabama em Birmingham que obteve as linhagens celulares a partir da American Type Culture Collection. As linhagens de célula T da leucemia humana, linfoma de célula B, HepG2 Jurkat (American Type Culture Collection TIB-152) e CCRF-CEM CEM-6 (American Type Culture Collection CCL-119); linhagens celulares de monócito, U937 (American Type Culture Collection CRL-2367); foram adquiridas da American Type Culture Collection. Todas as linhagens celulares acima são cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS. A linhagem celular de astrocitoma humano, 1321N1, foi gentilmente fornecida pelo Dr. Richard Jope do Psychiatry Department of the University of Alabama em Birmingham e cultivada em DMEM suplementado com 5% de FCS.

O TRAIL humano, recombinante, solúvel, adquirido da Alexis

Corporation (San Diego, CA), é uma proteína de fusão compreendida do domínio extracelular de TRAIL humano (resíduos de aminoácido de 95 a 281) fundidos ao término N a um FLAF-tag e um peptídeo ligador de 8 aminoácidos. Diferente do TRAIL alvejado a His anteriormente reportado, esta preparação de TRAIL sozinha não induz uma resposta apoptótica forte em células Jurkat e requer um anticorpo anti-FLAG como um reticulador para realçar a apoptose. O anticorpo anti-FLAG também foi adquirido da Alexis.

Todas as 10 células de glioma maligno humanas testadas expressaram níveis detectáveis de DR5 na superfície celular. A maioria expressou níveis de intermediário a alto de DR5 como mostrado na Figura 2b. Três linhagens, D-54MG, U373MG e CH-235MG expressaram níveis altos de DR5 enquanto seis linhagens, Hs-683, U251-MG, D37-MG, U87, SMKI e 1321N1, expressaram níveis intermediários de DR5. Apenas uma linhagem celular, a H-465 expressou níveis baixos de DR5. Todas as três linhagens de célula de câncer prostático expressaram níveis altos de DR5 como mostrado na Figura 2c.

Como as células T primárias normais, as células B primárias não expressam níveis significantes de DR5 e não sofrem apoptose depois do tratamento com TRAIL ou TRA-8 (Fig. 2d). Três (SKW6.4, EB-3 e Raji) das quatro Linhagens celulares de linfoma B testadas expressaram níveis relativamente altos de DR5 e são muito suscetíveis à apoptose mediada tanto pelo TRAIL quanto pelo TRA-8. A quarta linhagem celular, a Daudi, expressou níveis muito baixos de DR5 e é muito menos suscetível à apoptose mediada pelo TRAIL ou pelo TRA-8. Embora os astrócitos primários não expressem níveis detectáveis de superfície celular DR5 (Fig. 2b’), todas as quatro linhagem de células de glioma testadas expressaram níveis altos de DR-5. O nível mais alto de expressão de DR5 nas células de glioma do que nas células T e B não é acompanhado por uma suscetibilidade significantemente maior à apoptose mediada pelo TRAIL e DR5, sugerindo

3^2 que o nível de expressão de superfície celular de DR5 não está necessariamente correlacionado com o nível de apoptose de células de tumor. A RT-PCR, realizada para determinar os níveis de mensagem de DR4, DR5 e DCR2, detectou mensagem em todas as células testadas (Tabela 1).

Entretanto, no geral, as células normais primárias expressaram níveis relativamente baixos de DR5 comparado com as células de tumor transformadas.

Tabela 1: Análise de RT-PCR da expressão do receptor de TRAIL*

Células	DR5	DR4	DcR2
Células T primárias	< 0,001	< 0,001	0,015
Jurkat	0,10	< 0,001	0,21
CEM-6	0,50	0,59	0,25
Molt-4	0,10	< 0,001	0,05
H-9	0,73	0,61	0,07
Células B primárias	< 0,001	<0,001	0,024
SKW6.4	0,95	0,66	0,45
EB3	0,40	< 0,001	0,35
Raji	0,55	0,11	0,45
Daudi	0,73	0,36	0,63
Astrócitos normais	0,05	< 0,001	0,12
SH683	0,56	0,96	0,14
U87	0,44	0,56	0,21
D54	1,15	0,46	0,12
1321N1	0,25	0,35	0,05

* O RNA Total foi isolado das células e a RT-PCR foi realizada como descrito nos Métodos. Os produtos de PCR foram separados em 3% de gel de agarose e analisada pelo Fluor-S MAX Multilmager System (BioRad). Os valores são apresentados como uma razão em relação à β-actina.

Exemplo 8. Indução de apoptose in vitro em células malignas

Para determinar se TRA-8 induz a apoptose em células transformadas in vitro, todas as células de tumor positivas em DR5 são examinadas quanto a sua suscetibilidade para a apoptose induzida pelo TRA-8 ou TRAIL.

As células alvo (1 X 10³ por reservatório) são cultivadas em placas de 96 reservatórios na presença das concentrações indicadas de TRAIL solúvel mais reticulador (Alexis) ou TRA-8 a 37°C durante a noite. A viabilidade celular é determinada usando (1) o kit ATPLite de acordo com as instruções do fabricante (Packard Instruments, Meriden, CT); (2) o kit de proliferação/viabilidade celular MTT (Sigma); ou (3) tingimento PI de células mortas e analisadas pela citometria de fluxo. No final da cultura, as células são tingidas com 10 pg/ml de PI e as células negativas em PI são gated como células viáveis. Para a análise de núcleos condensados de hepatócitos, as células são tingidas com 10 ng/ml de Hoechst 33352 (Molecular Probes) e analisadas pela citometria de fluxo.

O anticorpo TRA-8 é capaz de induzir a apoptose na maioria das linhagens de célula de glioma maligna humana (9/10), em 2 das 3 linhagens de célula de câncer prostático e em 2 das 4 linhagens de células hematopoiéticas positivas em DR5. Ele não induz a apoptose na linhagem celular Molt-4, que expressou níveis de superfície celular quase indetectáveis de DR5. Os níveis de suscetibilidade das células à apoptose mediada pelo TRA-8, entretanto, variaram consideravelmente entre as linhagens celulares.

A variabilidade da suscetibilidade das células à apoptose induzida pelo anticorpo TRA-8 sugere que embora um nível mínimo de expressão de superfície celular de DR5 seja requerido, o nível de expressão de superfície celular de DR5 não é necessariamente o determinante primário de suscetibilidade e outros fatores influenciam este processo. Embora todas as células de glioma no geral tenham expressado níveis significantemente mais altos da DR5 de superfície do que as células hematopoiética, a suscetibilidade da célula de glioma à apoptose induzida pelo TRA-8 não é proporcionalmente aumentada comparado com as células hematopoiéticas. A suscetibilidade de cinco das linhagem de células de glioma, D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG e 1321N1 à apoptose induzida pelo TRA-8 é alto e é equivalente à sua suscetibilidade à apoptose mediada pelo TRAIL como mostrado na Figura 3b. Duas das linhagem de células de glioma, H-456 e SMK1, são muito menos suscetíveis à apoptose induzida pelo TRA-8. No caso das células H-456, a expressão de superfície de DR5 é baixa; entretanto, a expressão de

superfície de DR5 em SMK1 é similar às linhagens celulares mais suscetíveis, sugerindo que outros mecanismos poderiam desempenhar um papel na determinação da suscetibilidade à apoptose mediada pelo TRAIL. Embora todas as três linhagens de célula de câncer prostático expressem níveis altos de DR5, as células Dul45 são mais sensíveis à apoptose induzida pelo TRA8, as células PC3 são parcialmente sensíveis enquanto as células LnCAP são completamente resistentes como mostrado na Figura 3c. Entre as células hematopoiéticas, é descoberto que as Jurkat e CEM-6 são muito suscetíveis à apoptose pelo TRA-8 como mostrado na Figura 2a embora ambas destas linhagens celulares tenham sido descobertas expressar níveis baixos de DR5. Embora a DR5 seja detectável em células U937, estas células são resistentes à apoptose induzida pelo TRA-8. Similarmente, embora as células H-9 expressassem níveis detectáveis de DR5, as células H-9 são resistentes à apoptose induzida pelo TRA-8. Estes resultados implicaram na existência de mecanismos reguladores que influenciam a apoptose mediada pela DR5.

Anticorpos de ligação de superfície anti-DR5 adicionais são produzidos como pelos procedimentos dos Exemplos de 1 a 3. Dois anticorpos anti-DR5 adicionais designados TRA-1 e TRA-10 são estudados junto com TRA-8 para determinar a capacidade comparativa de induzir a apoptose e deste modo atuar como um agonista ou ao contrário bloquear a apoptose mediada pelo TRAIL, atuando desse modo como um antagonista. As Células Jurkat humanas são usadas como um alvo para determinar a atividade agonista e/ou antagonista dos três anticorpos anti-DR5 denominados TRA-1, TRA-8 e TRA-10. Como mostrado na Figura 4, a viabilidade celular é de cerca de 90%, 70% e 20% para TRA-10, TRA-1 e TRA-8, respectivamente na incubação durante a noite com 2,5 pg por ml. O TRA-8 induziu uma resposta apoptótica forte em uma maneira dependente da dose enquanto o TRA-1 induziu apenas uma resposta apoptótica moderada e o TRA-10 induziu apenas uma resposta fraca. O TRA-8 é portanto classificado como um anticorpo anti89

DR5 agonista. Na Figura 4, a viabilidade das células Jurkat humanas é mostrada como uma função dependente da dose da apoptose induzida por TRAIL. O TRA-10 bloqueou a apoptose de células Jurkat humanas a um grau signifícante em um estudo de apoptose induzida por TRAIL em dose baixa. Assim, o TRA-10 é classificado como um anticorpo anti-DR5 antagonista.

A suscetibilidade de cinco das linhagens de célula de glioma, D-37MG, D54-MG, U373MG, CH235-MG e 1321N1 para apoptose induzida pelo TRA-8 é equivalente à sua suscetibilidade à apoptose mediada pelo TRAIL como mostrado na Figura 3b, indicando que a apoptose induzida por TRAIL nestas células é mediada primariamente através da DR5. Além disso, duas das linhagens de célula de glioma, Hs683 e U251 -MG, são resistentes à apoptose induzida por TRAIL mas parcialmente sensíveis à apoptose induzida pelo TRA-8, indicando que os receptores isca funcionam nestas células e que o uso do anticorpo TRA-8 desviou este mecanismo regulador. Nas linhagens de célula de câncer prostático, a despeito da sensibilidade variável à apoptose induzida pelo TRA-8, esta se igualou à sensibilidade das células à apoptose induzida pelo TRAIL, mais uma vez sugerindo que a DR5 desempenha um papel principal de apoptose mediada pelo TRAIL nas células cancerosas prostáticas. Entre as células hematopoiéticas, é descoberto que as Jurkat e CEM-6 são muitos suscetíveis à apoptose mediada tanto pelo TRA-8 quanto pelo TRAIL. O nível de apoptose induzida pelo TRA-8 é comparável àquela induzida pelo TRAIL como mostrado nas Figuras 2a e 3a’. Apenas uma das linhagens de célula de glioma, U87 e duas linhagens de célula hematopoiética, U937 e Molt-4, exibiram sensibilidade à apoptose induzida por TRAIL mas são menos sensíveis ou resistentes à apoptose induzida pelo TRA-8. Uma linhagem celular, a linhagem celular H-9, expressou níveis detectáveis de DR5 mas é resistente à apoptose induzida por TRA-8 ou TRAIL. Embora níveis mínimos de expressão de DR5 sejam requeridos para a apoptose induzida pelo TRA-8, o nível de expressão de DR5 não prediz necessariamente a suscetibilidade das células à apoptose mediada pelo TRA8; receptores isca desempenham um papel na modulação da apoptose mediada pelo TRAIL em algumas células, mas não parecem desempenhar um papel principal na maioria das células testadas até agora; como previsto o anticorpo TRA-8 desvia os efeitos dos receptores isca; mutações funcionais do receptor de DR5 podem ocorrer nas células transformadas; e, finalmente, mecanismos reguladores intracelulares podem ser tão importantes ou mais importantes do que os receptores isca na definição da suscetibilidade das células à apoptose mediada pelo TRAIL e DR5.

Estudos anteriores têm mostrado que o mRNA para DR5 é distribuído amplamente em tecidos normais⁷. Para avaliar a expressão de DR5 ao nível da proteína, um painel de homogenados de tecido humano normal (Geno Technology, St. Louis, MO) é sondado com o anticorpo TRA-8 na análise de Western blot. entre nove tecidos humanos normais, o tecido cerebral é fracamente positivo (Fig. 5a, linha 2). A proteína DR5 não é detectável pela reatividade de TRA-8 em fígado (linha 1), pulmão (linha 3), rim (linha 4), baço (linha 5), testículos (linha 6), ovário (linha 7), coração (linha 8) ou pâncreas (linha 9). Em comparação, todos os treze tecidos cancerosos humanos tingiram positivamente com TRA-8 (Fig. 5b), incluindo canceres do ovário (linha 1), pulmão (linha 2), fígado (linha 3), reto (linha 4), cérvix (linha 5), pele (linha 6), testículos (linha 7), tireóide (linha 8), útero (linha 10), estômago (linha 11), laringofarínge (linha 12) e pâncreas (linha 13). Além disso, a imunoistoquímica in situ de tecidos normais e cancerosos com TRA-8 confirmaram que salvo umas poucas células positivas dispersas no baço, a expressão de DR5 em tecidos de mama, pulmão e baço normais não é detectável (Fig. 5c). Os tecidos cancerosos correspondentes incluindo carcinoma dutal de infiltração na mama, célula cancerosa pulmonar pequena e linfoma reagiram positivamente com TRA-8 (Fig. 5d). Entre um total de 22 tecidos cancerosos examinados, 5 de 6 canceres mamários, 2 de 2 canceres da cérvix, 4 de 5 canceres hepáticos, 5 de 8 linfomas, 2 de 2 canceres pulmonares e 2 de 2 canceres prostáticos reagiram positivamente com TRA-8. Estes resultados são compatíveis com aqueles da análise de citometria de fluxo e indicam que tecidos cancerosos expressam níveis mais altos de proteína DR5 do que os tecidos normais.

Exemplo 9. Atividade tumoricida de TRA-8 in vivo

Por várias razões, muitos agentes que se mostram promissores nos estudos in vitro não apresentam eficácia in vivo. E portanto importante testar a eficácia de TRA-8 em um modelo de animal in vivo, para realizar isto o anticorpo de DR5 anti-humano TRA-8 é administrado aos camundongos que carregam xenoenxertos humanos que expressam a molécula DR5 humana. Os camundongos usados são camundongos NOD/SCID (Jackson Laboratory) de 6 a 8 semanas de idade, que são inoculados subcutaneamente com células 1321N1 de astrocitoma humano (1 x 10⁷) ou inoculados intravenosamente com células Jurkat da leucemia humana (1 x 10 ). No dia 2 depois da inoculação do tumor, os camundongos são inoculados intravenosamente com TRA-8 (100 pg). Cinco dias depois do tratamento com TRA-8, o desenvolvimento do tumor 1321N1 é determinado pelo tamanho e peso da massa tumoral. O desenvolvimento de células Jurkat é determinado pelo peso do baço e pela porcentagem de células Jurkat positivas em CD3 humano no baço dos animais inoculados. As biópsias de tecidos tumorais são coletadas e histologicamente examinadas.

O tratamento precoce com uma única dose intravenosa de 100 pg de TRA-8 a um dia depois da inoculação de tumor inibiu completamente as células 1321N1 de formar um tumor sólido de (Fig. 6a). O tratamento tardio com três doses de 100 pg de TRA-8 em uma semana depois da inoculação do tumor reduziu o peso do tumor 4 vezes ou mais (Fig. 6b). A formação de tumor não é visível em animais tratados com TRA-8 em um ponto de tempo precoce (Fig. 6c, painel superior). A análise histológica revelou tecido tumoral dramaticamente degenerado em animais tratados com TRA-8 (Fig. 6c, painel inferior). Similarmente, o tratamento com TRA-8 inibiu a população do baço pelas células Jurkat como demonstrado pela escassez de células Jurkat positivas em CD3 no baço (Fig. 6d, 6e). A análise histológica do tumor implantado mostrou umas poucas células de tumor dispersas no tecido mole em animais tratados com TRA-8 enquanto os controles mostraram a formação de um tumor sólido como mostrado na Figura 6c. No modelo de célula Jurkat, o número de células Jurkat nos baços de animais tratados com TRA-8 é menor do que 2% comparado com quase 10% no baço de animais de controle como demonstrado pela análise de citometria de fluxo como mostrado na Figura 6a e no tingimento com CD3 in situ da Figura 6c.

Estes resultados confirmam a demonstração recente de que a administração sistêmica de TRAIL recombinante reticulado inibe o desenvolvimento de tumor in vivo (13). Estes resultados indicam que uma dose única de TRA-8 é altamente eficaz na eliminação de células de tumor in vivo.

Visto que um anticorpo anti-humano é usado em um modelo de murino, a toxicidade do tratamento com TRA-8 não pôde ser avaliada. Entretanto, o estudo de administração de TRAIL in vivo indicou que nenhuma toxicidade significante está associada com este tratamento (13).

Exemplo 10. As células sinoviais RA são suscetíveis à apoptose induzida por TRAIL e TRA-8

A maioria dos estudos da técnica anterior de apoptose mediada pelo TRAIL têm focalizado em células malignas. A apoptose mediada pelo TRAIL, de acordo com a presente invenção também é terapêutica em condições autoimunes e inflamatórias, tais como a R.A.

10.1 Análise citométrica de fluxo da expressão da DR5 de superfície celular em células sinoviais RA

A expressão de DR5 em um painel de oito células sinoviais cultivadas primárias de pacientes com RA é comparado com aquele em oito células sinoviais cultivadas primárias de pacientes com osteoartrite (daqui em diante aludido como “OA”). As oito culturas de célula sinovial RA primárias humanas RA-1014, RA-1016, RA-1021, RA-512, RA-707, RA-811, RA-716 e RA-929 são gentilmente fornecidas pelo Dr. M. Ohtsuki (Sankyo, Co. Ltd., Tóquio, Japão) e cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FCS, penicilina, estreptomicina e glutamina. As sete culturas celulares primárias de célula sinovial OA são isoladas a partir dos tecidos sinoviais de pacientes OA por um método da colagenase padrão e cultivadas sob as mesmas condições. O número de passagem de todas as células primárias está abaixo de 10. A expressão de DR5 é determinada pela análise FACs como descrito no Exemplo 5.

Todas as culturas primárias de células RA expressaram níveis altos de DR5 de superfície e existe pouca variação nos níveis de expressão entre estas células sinoviais isoladas de pacientes diferentes como mostrado na Figura 7a. Em comparação, a expressão de DR5 de superfície na superfície de células sinoviais isoladas dos pacientes OA é muito baixa ou indectável como para a Figura 7b. A célula sinovial transformada com SV40 são descobertas expressar níveis altos de DR5 comparáveis com aqueles exibidos pelas células RA. Em comparação, as células de fibroblasto não transformadas expressaram níveis baixos de DR5 comparáveis àqueles exibidos pelas células OA na Figura 7b.

10.2 Suscetibilidade das células sinoviais RA à apoptose mediada pelo TRA-8 ou TRAIL

No geral, todas as células sinoviais isoladas de pacientes RA são suscetíveis à apoptose induzida tanto pelo TRAIL quanto pelo anticorpo anti-DR5 e todas as células OA são resistentes à apoptose induzida pelo TRAIL e pelo anticorpo anti-DR5 como para a Figura 8a,b. Estes estudos indicam que o anticorpo TRA-8 alveja células alteradas em preferência às células normais. Além disso, o padrão da suscetibilidade ou resistência à apoptose induzida pelo TRAIL está correlacionado com aquele induzido pelo anticorpo anti-DR5, indicando que as células sinoviais primariamente utilizam DR5 para deflagrar a apoptose pelo TRAIL.

Como descrito para as células malignas, a suscetibilidade à apoptose induzida pelo TRAIL ou anticorpo anti-DR5 variou entre as células sinoviais RA embora expressando níveis similares de DR5. A RA-512 e a RA-707 são as mais suscetíveis visto que acima de 80% das células são mortas pelas concentrações de TRAIL ou TRA-8 abaixo de 20 ng/ml. ΚΑΙ 014, RA-811, RA-716 e RA929 estão entre aquelas com a suscetibilidade intermediária ao TRAIL ou TRA-8, com quase 100% de morte celular ocorrendo na presença de concentrações altas (> 50 ng/ml) de TRAIL ou TRA-8. Nas células RA-1016 e RA1021, embora a maioria (mais de 60%) das células são mortas por uma dose baixa de TRAIL ou TRA-8, uma porção de células sobreviveram na presença de concentrações altas de TRAIL ou TRA8, indicando que uma sub-população de células são resistentes à apoptose mediada pelo TRAIL. Em comparação, todas as células OA são muito menos suscetíveis à apoptose induzida pelo TRAIL e TRA-8. Não mais do que 60% das células são mortas nas OA52F e OA69F mesmo na presença de concentração alta de TRAIL ou TRA-8. As células OA72M são completamente resistentes à apoptose induzida pelo TRAIL ou TRA-8. As células sinoviais transformadas de SV40 também são suscetíveis à apoptose induzida pelo TRAIL e TRA-8 (dados não mostrados). Em comparação, as células de fibroblasto não transformadas pareceram ser resistentes ao TRAIL e TRA-8.

Foi mostrado anteriormente que a DR5 utiliza um caminho dependente de FADD/caspase 8 para deflagrar a apoptose (44). Para determinar a dependência da caspase da apoptose mediada pela DR5 de células sinoviais RA, as células RA são cultivadas com TRAIL ou antianticorpo de DR5 na presença de inibidores de caspase específicos. Entre oito inibidores de caspase testados, os inibidores de caspase 6, 8 e 10 são capazes de inibir a apoptose de células sinoviais RA induzidas tanto pelo TRAIL quanto pela DR5 como mostrado na Figura 9, indicando que estas três caspases estão envolvidas na apoptose mediada pela DR5.

10.3 TRA-8 ou TRAIL induzem a ativação de NF-Kb em células sinoviais RA sem a liberação aumentada de MMPs

Existe evidência considerável para sustentar o conceito de que existem ligações próximas entre a sinalização da apoptose e a sinalização da proliferação (45). Foi estabelecido que a DR5 é capaz de ativar um caminho NF-Kb além da transdução que sinaliza a apoptose e que a ativação de NF-Kb pode ser capaz de transduzir um sinal anti-apoptose. Portanto um ensaio de mudança em gel é realizado. As células são estimuladas com 50 ng/ml do TRAIL solúvel recombinante, ligando Fas na presença do realçador a 1 mg/ml ou 50 ng/ml de TRA-8 durante o tempo indicado. Os extratos nucleares são preparados e incubados com a sonda de oligo-DNA rotulada com [³²P] duplamente tingida. Os resultados são analisados usando o ciclone fosfaimager (TopCount NXT, Packard Instrument Company, CT). Depois as células sinoviais RA são incubadas com TNF-α ou TRAIL, NF-Kb é ativado em uma maneira dependente de tempo. O anticorpo TRA-8 é capaz de ativar fortemente o NF-Kb. Em comparação, o ligando Fas é incapaz de induzir a ativação de NF-Kb como para a Figura 10a.

Assim, embora os anticorpos TRAIL e TRA-8 induzam uma resposta de apoptose forte em células sinoviais RA, eles também ativam NFKb e a ativação de NF-Kb foi acreditada contribuir para o papel pró inflamatório do TNF-α na RA. Assim, é possível que o TRAIL, como o TNFa, possa servir como uma citocina pró-inflamatória. Para determinar se existe uma conseqüência biológica similar da ativação de NF-Kb induzida pelo

TRAIL e TNF-α, a produção de MMPs é determinada pelo ELISA. As células sinoviais são cultivadas em meio sozinho ou com 50 ng/ml de interleucina lb, 10 ng/ml de TNF-a, 50 ng/ml de TRAIL ou 50 ng/ml de TRA-8 durante a noite. Os níveis do MMP-1 e MMP-3 nos sobrenadantes de cultura são determinados pelos kits de ELISA.

Quando células sinoviais RA são incubadas com uma citocina pró inflamatória, o TNF-a ou IL-lb, a produção de MMP-1, 3 e 13 é aumentada comparado com o controle do meio como mostrado na Figura 10 b,c. Em comparação, o tratamento com TRAIL ou anticorpo anti-DR5 não está associado com a liberação aumentada destes MMPs.

Exemplo 11 A. Insuficiência para induzir a toxicidade hepatocelular

Para os ensaios de viabilidade celular de 24 horas, hepatócitos humanos normais frescos em placas de 96 reservatórios foram adquiridos da In Vitro Technology (Baltimore, MD). Os hepatócitos são cultivados no Meio de Cultura de Hepatócito contendo 1 pg/ml de TRAIL ou TRA-8 solúveis. Para ensaios de viabilidade de 6 horas, hepatócitos normais ou células cancerosas hepatocelulares são isolados de espécimes cirúrgicos frescos coletados da UAB Tissue Procurement Center. Todos os reagentes para a isolação de hepatócitos humanos incluindo tampão de perfusão de hepatócitos, meio de digestão, meio de lavagem e meio de ligação foram adquiridos da Gibco. As lâminas de tecido são digeridas no Meio de Digestão de Hepatócito a 37°C com agitação (50 rpm) durante uma hora. Os hepatócitos isolados são colhidos pela centrifugação em velocidade baixa (50 g, 3 min) e lavados com o Meio de Lavagem de Hepatócito seis vezes. Suspensão de célula única de hepatócitos é cultivada no Meio de Ligação contendo 10% de FCS em placas Matrigel de 96 reservatórios (BD) durante seis horas. Os hepatócitos não ligados são removidos lavando-se duas vezes com meio de ligação pré aquecido. Os hepatócitos ligados são ainda incubados com várias concentrações de TRAIL solúvel ou FasL na presença de reticulador ou TRA-8 ou CHI 1 durante 6 horas.

O TRAIL tem pelo menos dois receptores (DR4 e DR5) que são capazes de induzir apoptose. O TRA-8 é usado para determinar se a reticulação de DR5 sozinha é suficiente para induzir a apoptose de hepatócitos normais. A expressão de DR5 ao nível da proteína é examinada inicialmente em cinco tecidos de fígado humano normal e cinco tecidos de câncer hepático pela imunoistoquímica in situ usando TRA-8. Seções dos tecidos hepáticos normais apresentaram a arquitetura e a morfologia celular normais no fingimento com H&E (Fig. 1 la, painéis superiores esquerdos) na ausência de reatividade positiva com TRA-8 para DR5 (Fig. 11a, painéis inferiores esquerdos). Em comparação, o tecido de carcinoma hepatocelular humano reagiu positivamente com TRA-8 em um padrão compatível com a presença tanto na membrana celular quanto na citoplásmica de DR5 nas células cancerosas. A linhagem celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2 também é positivo quanto a DR5. Estes resultados são compatíveis entre os cinco tecidos hepáticos normais e apenas um (adenoma hepático) dos cinco tecidos cancerosos hepáticos é negativo em DR5. Estes resultados são compatíveis com os dados de Western blot, mostrados na Figura 5a, que, como com outros tecidos normais, o tecido hepático humano normal não expressa níveis significantes da proteína DR5. Além disso, a análise de Western blot de hepatócitos humanos normais isolados sondados com TRA-8 não revelaram níveis detectáveis de DR5.

A expressão de superfície celular de DR5 em hepatócitos humanos pela análise de citometria de fluxo demonstrou que hepatócitos normais recém preparados não expressam níveis detectáveis de DR5 de superfície celular (Fig. 11b, painéis de topo esquerdos). Nem é detectada em hepatócitos humanos normais que foram criopreservados ou colocados em cultura de duração curta. Em comparação, células de carcinoma hepatocelular recém isoladas assim como as células HepG2 expressam DR5 de superfície celular. Usando Fas como uma comparação, os hepatócitos normais, as células de carcinoma hepatocelular e as células HepG2 todas expressaram níveis equivalentes de Fas (Fig. 11b, painéis inferiores). Estes resultados são compatíveis com aqueles obtidos usando a imunoistoquímica in situ e Western blot e indicam que a DR5 de superfície celular é altamente expressada em células hepáticas cancerosas mas não em hepatócitos normais. A presença de níveis de mRNA para DR4, DR5, DcRl e DcR2 nos hepatócitos humanos, demonstrados pela RT-PCR²³, sugere que os 10 hepatócitos humanos podem expressar níveis muito baixos da proteína DR5 que estão abaixo do patamar para a detecção pelo TRA-8.

Para determinar se TRA-8 induz a toxicidade hepatocelular, a suscetibilidade de hepatócitos humanos normais à apoptose induzida pelo TRA-8 e pelo TRAIL solúvel mais reticulador é examinada. Quando 15 hepatócitos normais são cultivados na presença de uma concentração alta de

TRAIL, uma diminuição dependente do tempo na viabilidade celular é observada pelo ATPLite (Fig. 12a) e ensaios MTT. A morte celular mediada pelo TRAIL de hepatócitos normais pode ser observada tão cedo quanto quatro horas depois da adição de TRAIL. No final de uma cultura de 24 horas, 20 mais do que 80% dos hepatócitos são mortos pelo TRAIL. Em comparação, durante o mesmo período de cultura, TRA-8 não induz morte celular significante em hepatócitos normais. Os núcleos condensados tingidos com Hoechst, uma característica da apoptose, são aumentados em hepatócitos tratados com TRAIL mas não nos tratados com TRA-8 (Fig. 12b). O número 25 de hepatócitos apoptóticos está bem correlacionado com a viabilidade celular diminuída como determinado pelo ensaio ATPLite, sugerindo que a morte celular induzida por TRAIL de hepatócitos é mediada pela apoptose. Isto é confirmado pela capacidade de Z-VAD para inibir a toxicidade mediada pelo TRAIL de hepatócitos. Visto que a ciclo-heximida é um realçador de apoptose potente, o efeito deste composto sobre os hepatócitos tratados com TRAIL e TRA-8 é investigado. Durante uma cultura de quatro horas, a cicloheximida significantemente realçou a morte celular de hepatócitos induzida pelo TRAIL, com mais do que 70% de hepatócitos sendo mortos pelo TRAIL na presença de ciclo-heximida (Fig. 12c). Entretanto, o tratamento com cicloheximida é incapaz de realçar a morte celular mediada pelo TRA-8 em hepatócitos. Para comparar as características da apoptose induzida pelo TRA8 com aquela induzida pelo TRAIL em hepatócitos, hepatócitos normais assim como células cancerosas são incubadas com concentrações variáveis de TRAIL solúvel com reticulador ou TRA-8. Durante um período de cultura de 6 horas, o TRAIL induziu uma resposta apoptótica moderada em hepatócitos normais. Mais de 20% dos hepatócitos são mortos na presença de 500 ng/ml de TRAIL (Fig. 12d, superior esquerdo). O tratamento com TRA-8 de hepatócitos normais não evocou qualquer morte celular significante no mesmo período de tempo. Em comparação aos hepatócitos normais, as células de carcinoma hepatocelular primárias (Fig. 12d, superior central) e células HepG2 (Fig. 12d, superior direito) são altamente suscetíveis à apoptose mediada por TRAIL ou TRA-8. Mais de 80% de células de carcinoma hepatocelular e quase 100% de células HepG2 são mortas durante o período de cultura de 8 horas. Estes resultados indicam que os hepatócitos normais são completamente resistentes à apoptose mediada pelo TRA-8 e são muito menos suscetíveis à apoptose mediada pelo TRAIL do que o são as células cancerosas hepáticas. Usando ligando Fas e anticorpo anti-Fas (CH-11), não existe nenhuma diferença significante na suscetibilidade à apoptose mediada por Fas entre os hepatócitos normais, células de carcinoma hepatocelular e células HepG2 (Fig. 12d, painéis inferiores).

Exemplo Comparativo 11B. Indução de TRAIL ligado à membrana humana de hepatite in vivo

Camundongos B6 fêmeas de 8 a 10 semanas de idade são

100 intravenosamente injetados com 10⁹ pfu de Ád/hTRAIL com a quantidade igual de Ad/Tet-on. Os camundongos são alimentados com concentrações diferentes de tetraciclina em sua água de beber imediatamente depois da inoculação de vetores adenovirais. O dano hepático é determinado pelos níveis séricos de AST usando um kit de diagnóstico de AST (Sigma). A expressão de TRAIL é determinada pela análise de Northem blot.

Para determinar se a forma ligada à membrana de TRAIL induz dano ao fígado in vivo, um vetor adenoviral recombinante que codifica o TRAIL humano de comprimento completo (Ad/hTRAIL) é construído, a 10 expressão do qual está sob o controle do promotor indutível por tetraciclina.

. Vinte quatro horas depois da inoculação intravenosa de camundongos B6 com Ad/hTRAIL, a expressão induzida pela tetraciclina de TRAIL humano é observada no fígado em uma maneira dependente da dose como demonstrado pela análise de Northem blot (Fig. 13a). Os níveis de expressão de TRAIL 15 correlacionam-se bem com o dano ao fígado como mostrado por um aumento dependente da tetraciclina nos níveis séricos de transaminases, mais uma vez em uma maneira dependente da dose (Fig. 13b). Visto que a inoculação com vetor adenoviral por si pode aumentar a suscetibilidade de hepatócitos à apoptose mediada pelo TRAIL, os hepatócitos de camundongos inoculados 20 com Ad/TRAIL são isolados e testados quanto a morte celular mediada pelo TRAIL. Não existe nenhuma morte celular significantemente aumentada de hepatócitos infectados por Ad/TRAIL comparado com aquelas de camundongos de controle (Fig. 13c, painel esquerdo). Além disso, camundongos inoculados com Ad/TRAIL não exibem dano ao fígado 25 aumentado depois da injeção intravenosa de TRAIL humano solúvel. Assim, segue que a hepatite induzida pelo Ad/TRAIL é mediada pelos níveis altos de expressão de TRAIL na sua forma de membrana. A análise histológica de seções do fígado revelaram que o dano aos hepatócitos é evidente tão cedo quanto 24 horas depois da inoculação do vetor (Fig. 13d) e persistiu por pelo

101 menos 7 dias (Fig. 13e). Estas alterações patológicas no fígado também são dependentes de tetraciclina ocorridas em uma maneira dependente da dose. A fase precoce, dentro de 24 horas de tratamento, de dano ao fígado induzido pelo TRAIL é caracterizada pelos focos de necrose. A infiltração de células 5 inflamatórias não é observada neste estágio, mas a hemorragia ocorreu. No dia 7 depois da inoculação, o dano ao fígado difuso é evidente com desordem lobular acentuada, degeneração grave de hepatócitos com citoplasma irregularmente agrupados e espaços claros grandes e apoptose e necrose proeminentes. Um infiltrado extensivo de células mononucleares é uma *10 característica neste estágio. Estes resultados indicam que o TRAIL humano na sua forma ligada à membrana é capaz de induzir o dano ao fígado in vivo. A • despeito da propensão do TRAIL humano causar hepatite grave em camundongos, ele não induziu uma resposta letal. Em comparação, camundongos inoculados com vetores controlados com tetraciclina similares 15 que codificam o ligando Fas desenvolveram hepatite fulminante com apoptose e necrose massivas de hepatócitos acompanhadas pela hemorragia grave e pela mortalidade ocorrendo em uma maneira dependente da dose de tetraciclina dentro de 72 horas da inoculação. A taxa de mortalidade atingiu 100% dentro de 48 horas naqueles subgrupos que receberam 3 mg/ml ou mais 20 de tetraciclina. Em comparação, todos os camundongos que receberam Ad/hTRAIL, independente da dose de tetraciclina, ainda estão vivos quatro semanas depois da inoculação. Assim, segue que, in vivo, a forma ligada à membrana de TRAIL é um indutor menos potente de dano hepatocelular do que o ligando Fas. Eles ainda sugerem que o TRAIL pode induzir o dano ao 25 fígado através de um mecanismo que difere do mecanismo subjacente à toxicidade do ligando Fas.

Exemplo 12. Células T e B humanas ativadas expressam níveis aumentados de DR5.

Para determinar se a DR5 desempenha um papel na apoptose

102 mediada pelo TRAIL de células T e B ativadas, a expressão de superfície de DR5 em células T e B no repouso e ativadas usando TRA-8 é examinada. As células T humanas não estimuladas em PBMC não expressam níveis significantes de DR5 (Fig. 14). Em 48 horas depois do estímulo com antiCD3 ou Con-A, a expressão da DR5 de superfície celular é signifícantemente aumentada. Similarmente, as células B não estimuladas expressaram níveis muito baixo de DR5. O estímulo com anti-p mas não LPS resultou na expressão de superfície celular aumentada de DR5. Estes resultados indicam que tanto as células T quanto as B ativadas expressam níveis mais altos de DR5 de superfície celular. As células são tingidas com 20 pg/ml de TRA-8 e IgGl anti-camundongo PE.

Exemplo 13. As células T e B ativadas tomam-se suscetíveis à apoptose mediada pelo TRA-8

Para determinar se as células T e B ativadas são suscetíveis à apoptose mediada pelo TRA-8, as células T e B de PBMC humano são estimuladas com anti-CD3 ou anti-p in vitro durante 48 horas, respectivamente. As células viáveis e células blásticas em proliferação são coletadas pela centrifugação em gradiente e incubadas com várias concentrações de TRA-8. As células T e B não estimuladas não são suscetíveis à apoptose mediada pelo TRA-8 (Fig. 15). As células T e B estimuladas totais apresentaram uma suscetibilidade moderadamente aumentada à apoptose mediada pelo TRA-8, com 20% das células sendo mortas pelo TRA-8 depois de cultura durante a noite. As células T blásticas altamente proliferativas são ainda mais suscetíveis à apoptose mediada pelo TRA-8. Mais do que 70% das células T blásticas podem ser mortas pelo TRA-8. as células B blásticas também são mais suscetíveis à apoptose mediada pelo TRA-8 comparadas com as outras. Estes resultados indicam que as células T e B ativadas são suscetíveis à apoptose mediada pela DR5.

Exemplo 14. TRA-8 esgota as células T ativadas em seres

103 humanos/camundongos SCID

Para determinar a eficácia anti-célula T in vivo de TRA-8, camundongos NOD/SCID são intravenosamente injetados com 1 χ 10⁸ de PBMC humana. Normalmente, as células T humanas em camundongos SCID 5 são rapidamente ativadas em resposta ao estímulo xenogênico. As PBMC humanas/camundongos SCID são intraperitonealmente injetados com 100 pg de TRA-8 ou IgGl de controle a partir do dia de transferência, repetido diariamente durante três dias. Cinco dias depois da transferência, as células mononucleares são isoladas a partir do baço e tingidas com anticorpo CD3 10 anti-humano e a população de linfócito é gated pela análise de citometria de fluxo e as células T humanas positivas em CD3 são analisadas.

• Aproximadamente 30% dos linfócitos esplênicos são células T humanas como determinado pelo fingimento com CD3 anti-humano em camundongos tratados com controle. Entretanto, apenas umas poucas células T humanas 15 (menos do que 3%) são observadas entre os linfócitos esplênicos em camundongos tratados com TRA-8 (Fig. 16). O estudo histológico in situ revelou que no baço de camundongos de controle, as células T humanas são repopuladas no baço com apenas umas poucas células apoptóticas observadas como demonstrado pelo fingimento TUNEL. Em comparação, a repopulação 20 com células T humanas viáveis não é observada no baço de camundongos tratados com TRA-8, ao invés muitas células apoptóticas são observadas (Fig.

17). Estes resultados demonstram que o TRA-8 tem atividade anti-célula T in vivo e indica a utilidade dos anticorpos da invenção para o tratamento da doença GVH.

Exemplo 15. Atividade terapêutica anti-câncer do TRA-8

15.1 Expressão e função da DR5 em tecidos e linhagens celulares cancerosos humanos

i) Expressão de DR5 em tecidos cancerosos humanos pelo fingimento in situ com TRA-8. Para determinar se as células e tecidos

104 cancerosas diferentemente expressam níveis mais altos de DR5, um painel de tecidos cancerosos humanos incluindo mais de 20 canceres de mama, 6

	canceres ovarianos, 5 canceres de cólon e 5 canceres prostáticos são tingidos com TRA-8 para a imunoistoquímica. A maioria destes tecidos cancerosos
5	expressaram DR5 detectável. Os níveis de expressão de DR5 nestes tecidos cancerosos variaram. No geral, os tecidos cancerosos expressaram níveis mais altos de DR5 do que os tecidos não incluídos. Além disso, a expressão de DR5 aparentemente não está correlacionada com a mutação de p53.
*·	ii) A expressão e função de DR5 em linhagens de célula de câncer humano (Tabela 2). Nove linhagens de célula cancerosa mamária humana, três
•	linhagens de câncer ovariano, três linhagens de câncer colônico e três linhagens de câncer prostático são examinadas quanto a expressão de superfície celular de DR5 e suscetibilidade à apoptose induzida pelo TRA-8
15	in vitro. Ί das 9 linhagens de câncer mamário, 3 das 3 linhagens de câncer ovariano, 3 das 3 linhagens de câncer colônico e 3 das 3 linhagens de câncer prostático expressaram níveis variáveis de DR5 de superfície celular. Das 9 linhagens de câncer mamário, três são muito suscetíveis, três são intermediárias e três são resistentes à apoptose mediada pelo TRA-8. Todas as
20	três linhagens de câncer ovariano são muito suscetíveis. Uma das três linhagens de câncer colônico é muito suscetível, enquanto duas têm sensibilidade intermediária. Duas das três linhagens de câncer prostático têm sensibilidade intermediária e uma é resistente.

105

Tabela 2. Expressão e funcionamento da DR5 em células cancerosas humanas.

Linhagem celular	Origem	Expressão1	Suscetibilidade2
2LMP	mama	+	444-+
LCC6	mama	+++	44—H-
MB468	mama	+++	+44-
MB231	mama	-H-	I | |
ZR-75-1	mama	+44-	44-
SKBR3	mama	+	44-
MB453	mama	-H-	+
BT474	mama	+	-
DY36T2	mama	-	-
Caov-3	ovário	+	++++
OVCAR-3	Ovário	44	4-H-4
Skov-3	Ovário	+	444
WiDR	Cólon	1........1.........1	4-+++
HST29	cólon	44-	444-
T84	cólon	+	-H-
PC3	próstata	4H~4	4+
LnCap	próstata	| | 1'	+
Du-145	próstata	44-4	+

Nota: ¹ determinada pela citometria de fluxo, as células são tingidas com 20 pg/ml de TRA-8 e comparadas com o anticorpo de controle. ² determinada pelo ensaio ATPLite.

++++; mais de 80% de morte, 44-+; morte entre 60 a 80%, ++: morte entre 40 a 60%, +: morte entre 20 a 40%, - nenhuma morte.

iii) Citotoxicidade combinada de TRA-8 com adriamicina. Em diversas linhagens de câncer mamário, o efeito da adriamicina sobre a

Apoptose induzida pelo TRA-8 é examinado. Altas doses de adriamicina exibiram um efeito aditivo. Entretanto, em algumas das linhagens resistentes ao TRA-8, dose baixas de adriamicina sinergisticamente realçam a apoptose induzida pelo TRA-8.

iv) Atividade de ligação in vitro e in vivo de TRA-8 às células 10 cancerosas humanas. Usando TRA-8 rotulado com radioisótopo. A atividade de ligação de TRA-8 a uma linhagem de câncer mamário é examinada in vitro e in vivo em camundongos SCID implantados com tumor. A atividade de ligação in vitro às células cancerosas é estimada como um valor Kd de 3 nM, que é constante com a nossa estimativa anterior usando ELISA e pelo menos 15 50 vezes mais alta do que o TRAIL solúvel. In vivo, o TRA-8 localizou em

106 tecidos de tumor implantados.

15.2. Terapia de leucemia linfocítica crônica em camundongos NOD/SCID com TRA8

A leucemia linfocítica crônica (CLL) é uma forma comum de malignidade de célula B. a maior parte das células B malignas na CLL são do fenótipo maduro e são resistentes a muitos estímulos de apoptose. A expressão e o funcionamento da DR5 nas células B de cinco pacientes com CLL são examinados. Todos os pacientes tiveram contagens altas de células B periféricas como mostrado por mais que 95% de células B CD 19+ em PBMC.

Comparadas com as células B primárias normais, as células B CLL de todos *

os pacientes tiveram níveis mais altos de DR5 de superfície celular e são mais * suscetíveis à apoptose induzida pelo TRA-8 in vitro. De maneira interessante, as células B CLL também são sensíveis à citotoxicidade induzida pela bisindolmaleimida VIII (BisVIII). A seguir do tratamento combinado com 15 TRA-8 e BisVIII, quase 50% das células B CLL são mortas enquanto as células B normais permaneceram indiferentes (Fig. 18). A transferência de células B CLL em camundongos NOD/SCID resultou em cerca de 25% a 30% de células B CD 19+ repopuladas no baço dos camundongos receptores em cinco dias depois da transferência. Entretanto, três doses de 100 pg de 20 tratamento com TRA-8 eliminou completamente as células B CLL de quatro dos cinco pacientes no baço dos camundongos SCID receptores. Assim, TRA8 sozinho ou em combinação com outras substâncias é ativo como um agente terapêutico para a leucemia linfocítica crônica.

Exemplo 16. Clonagem de cDNA (1) Determinação das seqüências de aminoácido de terminal N das cadeias pesada e leve de TRA-8

De modo a se obter cDNAs das cadeias pesada e leve de TRA8, as seqüências de aminoácido de terminal N das cadeias pesada e leve de TRA-8 e os genes de TRA-8 clonados são determinados pelas técnicas

107 conhecidas.

Dez pg da solução contendo o anti-anticorpo humano de DR5 TRA-8 são submetidos à SDS-eletroforese em gel de poliacrilamida (“SDSPAGE”), usando uma concentração de gel de 12% p/v, voltagem constante de 5 100 V, durante 120 minutos. Depois da eletroforese, o gel é imerso em tampão de transferência 25 mM de Tris-HCl (pH 9,5), 20% de metanol, 0,02% v/v de SDS durante 5 minutos. Depois deste tempo, o teor de proteína do gel é transferido para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (“membrana de PVDF”; tamanho de poro 0,45 pm; Millipore, Japão), pré 10 embebida em tampão de transferência, usando um aparelho de manchamento (KS-8451; Marysol) sob condições de voltagem constante de 10 V, 4°C, ' durante 14 horas.

Depois deste tempo, a membrana de PVDF é lavada com tampão de lavagem 25 mM de NaCl, 10 mM de tampão de borato de sódio 15 (pH 8,0), depois tingida em uma solução de tingimento (50% v/v de metanol, 20% v/v de ácido acético e 0,05% p/v de Azul Brilhante de Coomassie) durante 5 minutos para localizar as faixas de proteína. A membrana de PVDF é depois destingida com 90% v/v de metanol aquoso e as faixas correspondentes à cadeia pesada, a faixa com a mobilidade mais baixa e 20 cadeia leve, a faixa com a mobilidade mais alta anteriormente localizada na membrana de PDVF são excisadas e lavadas com água desionizada.

A seqüência de aminoácido de terminal N das cadeias pesada e leve é determinada pelo método automatizado de Edman (Edman, P., et al., (1967), Eur. J. Biochem., 1, 80) usando um seqüenciador de proteína de fase 25 gasosa (PPSQ-10; Shimadzu Seisakusyo, K. K.).

A seqüência de aminoácido de terminal N da faixa que corresponde à cadeia pesada é determinada ser:

Glu-Val-Met-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Gly-SerLeu-Lys-Leu (SEQ ID No. 4 da Listagem de Seqüência);

108 e aquela da faixa que corresponde à cadeia leve é determinada ser: Asp-Ile-Val-Met-Thr-Gln-Ser-His-Lys-Phe-Met-Ser-Thr-Ser-Val-Gly-AspArg-Val-Ser (SEQ ID No. 5 da Listagem de Seqüência).

A comparação destas seqüências de aminoácido com o banco de dados de seqüência de aminoácido de anticorpos produzidos por Kabat et al. (Kabat E. A., et al., (1991), em “Sequences of Proteins of Immunological 5 Interest Vol. II,” U.S. Department of Health and Human Services) revelou que a cadeia pesada (cadeia γΐ) e a cadeia leve (cadeia k) de TRA-8 pertenceram aos subtipos 3 d e 1, respectivamente.

(2) Clonagem de cDNA

Com base nas descobertas acima, preparadores de 10“ oligonucleotídeo são sintetizados que esperar-se-ia hibridizassem com porções das regiões não traduzidas 5’ e as extremidades verdadeiras das regiões traduzidas 3’ dos genes pertencentes a estes subtipos de camundongo. Depois, os cDNAs que codificam as cadeias pesada e leve de TRA-8 são clonados pela seguinte combinação de transcrição reversa e PCR (RT-PCR):

a) Padrão

O RNA total do hibridoma de TRA-8 (ATCC No. PTA-1428) é extraído usando-se Reagente TRIzol (GIBCO BRL). O padrão para a reação de PCR usou o cDNA que é obtido usando-se o kit de síntese de cDNA FirstStrand (Amersham Pharmacia Biotech) de acordo com o manual de instrução 20 fornecido com o kit.

b) Preparadores de PCR

Os seguintes preparadores de oligonucleotídeo são sintetizados para a PCR:

5’-cagcactgaa cacggacccc-3’ (H5NCS1: SEQ ID No. 6 da Listagem de Seqüência);

5’-aaaggtaatt tattgagaag-3’ (H5NCS2: SEQ ID No. 7 da Listagem de Seqüência);

109

5’-cctcaccatg aacttcgggc-3’ (H5SS1: SEQ ID No. 8 da Listagem de Seqüência);

5’-ctgttgtatg cacatgagac-3’ (H5SS2: SEQ ID No. 9 da Listagem de Seqüência);

5’-gaagtgatgc tggtggagtc-3’ (H5CS1: SEQ ID No. 10 da Listagem de Seqüência);

5’-agtgtgaagt gatgctggtg-3’ (H5CS2: SEQ ID No. 11 da Listagem de Seqüência);

5’-tttaccagga gagtgggaga g-3’ (H3CR: SEQ ID No. 12 da Listagem de Seqüência);

5’-tgcagagaca gtgaccagag-3’ (H3VR: SEQ ID No. 13 da Listagem de Seqüência);

5’-tgtteaggac cagcatgggc-3’ (L5NCS1: SEQ ID No. 14 da Listagem de Seqüência),

5’-aagacatttt ggattctaac-3’ (L5NCS2: SEQ ID No. 15 da Listagem de Seqüência);

5’-tatcatgaag tctttgtatg-3’ (L5SS1: SEQ ID No. 16 da Listagem de Seqüência);

5’-gatggagaca cattctcagg-3’ (L5SS2: SEQ ID No. 17 da Listagem de Seqüência);

5’-gacattgtga tgacccagtc-3 ’ (L5CS: SEQ ID No. 18 da Listagem de Seqüência);

5’-ttaacactca ttcctgttga-3’ (L3CR: SEQ ID No. 19 da Listagem de Seqüência); e

5’-gactgggtca tcacaatgtc-3’ (LCSR: SEQ ID No. 20 da Listagem de Seqüência).

A menos que de outro modo especificado, todos os oligonucleotídeos nestes Exemplos são sintetizado pela Pharmacia Biotech. Todos os oligonucleotídeos são armazenados a -20°C depois de serem

110 *

dissolvidos em água destilada.

c) reação de PCR

Composição da solução de reação de PCR: cDNA padrão, 5 μΐ dos 33 μΐ totais da reação preparador DR5p 1,10 pmol;

preparador DR5p2,10 pmol;

tampão de PCR concentrado 10 x (fornecido com o kit), 10 μΐ; dNTPs (2,5 mM de cada), 4 μΐ; e

Taq polimerase (Promega), 5 unidades.

10. Agua destilada estéril é adicionada à solução até um volume total de 100 μΐ. A menos que de outro modo especificado, as dNTPs são uma mistura eqüimolar de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (2,5 mM de cada).

A reação de PCR é conduzida como segue. A solução é primeiro aquecida a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo de 15 aquecimento a 94°C durante 30 segundos, 52°C durante 1 minuto e 72°C durante 3 minutos, é repetido 40 vezes. Depois da conclusão deste procedimento, a solução de reação é aquecida a 72°C durante 10 minutos.

Os fragmentos de DNA amplificados, assim obtidos, são separados em um gel de agarose a 1% contendo 0,25 pg/ml de brometo de 20 etídio. As faixas determinadas conter os fragmentos de DNA desejados são cortadas usando uma lâmina de barbear e o DNA é recuperado destas usando o kit gene Clean (BIO101). O fragmento de DNA é clonado usando o vetor pGEM-T Easy (Promega). Isto é realizado como segue.

O fragmento de DNA recuperado da solução de reação de 25 PCR, junto com 50 ng de vetor pGEM-T Easy (fornecido com o kit), é misturado com 1 μΐ de tampão de reação de ligase 10 X (6 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM de cloreto de magnésio, 5 mM de cloreto de sódio, 7 mM de β-mercaptoetanol, 0,1 mM de ATP, 2 mM de DTT, 1 mM de espermidina e 0,1 mg/ml de albumina sérica bovina), ao qual 4 unidades de T4 DNA ligase

111 (1 μΐ) foram adicionadas. O volume total da mistura é ajustado a 10 μΐ com água desionizada estéril e a solução de ligase resultante é incubada a 14°C durante 15 horas. Depois deste tempo, 2 μΐ da solução de reação de ligase são adicionados a 50 μΐ da cepa E. coli competente JM109 (fornecida com o kit e 5 levada à competência de acordo com o manual de instrução) aos quais 2 μΐ de β-mercaptoetanol 0,5 M foram adicionados e a mistura resultante é mantida em gelo durante 30 minutos, depois a 42°C durante 30 segundos e mais uma vez em gelo durante 5 minutos. Em seguida, 500 μΐ de meio contendo 2% v/v de triptona, 0,5% p/v de extrato de levedura, 0,05% p/v de cloreto de sódio, 10 2,5 mM de cloreto de potássio, 1 mM de cloreto de magnésio e 20 mM de glicose (daqui em diante aludido como meio “SOC”) são adicionados à cultura e a mistura é incubada durante 1 hora a 37°C com agitação. Depois deste tempo, a cultura é espalhada sobre uma placa de caldo L ágar (1% v/v de triptona, 0,5% p/v de extrato de levedura, 0,5% p/v de cloreto de sódio, 15 0,1% p/v de glicose e 0,6% p/v de bacto-ágar (Difco)), contendo 100 pg/ml.

As colônias resistentes à ampicilina que aparecem na placa são selecionadas e raspadas com uma alça de transferência de platina e cultivadas em meio de caldo L contendo 100 pg/ml de ampicilina a 37°C, durante a noite, com agitação a 200 r.p.m. Depois da incubação, as células são colhidas pela 20 centrifugação, a partir da qual o DNA plasmídico é preparado pelo método alcalino. O plasmídeo obtido é designado como o plasmídeo pH62 para a cadeia pesada de TRA-8 ou pL28 para a cadeia leve de TRA-8. As cepas de E coli transfonnantes que abrigam este plasmídeo, designado como E. coli JM109/pH62 e E. coli JM109/pL28 foram depositados com o Intemational 25 Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial

Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japão em 20 de abril de 2001, de acordo com o Tratado de Budapest para o Depósito de Microorganismos e foram concedidos os números de acesso FERM BP-7560 e FERM BP-7561, respectivamente. As

112 seqüências de nucleotídeo destes DNAs que codificam a cadeia pesada e a cadeia leve de TRA-8 são confirmadas pelo método de didesóxi (Sanger, F. S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74: 5463 a 5467) usando o Analisador de DNA 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, 5 Japão).

As seqüências de nucleotídeo das cadeias pesada e leve de TRA-8 são dadas como as SEQ ID No. 21 e No. 22 da Listagem de Seqüência, respectivamente. As seqüências de aminoácido das cadeias pesada e leve de TRA-8 são dadas como SEQ ID No. 23 e No. 24 da Listagem de 10 Seqüência, respectivamente. As seqüências de aminoácido de terminal N das cadeias pesada e leve de TRA-8 estabelecidas acima se igualam perfeitamente. Além disso, quando as seqüências de aminoácido das cadeias pesada e leve são comparadas com o banco de dados de seqüências de aminoácido de anticorpos, é estabelecido que, para a cadeia pesada, os 15 nucleotídeo Nos. 58 a 414 na SEQ ID No. 21 constituíram a região variável, enquanto os nucleotídeo Nos. 415 a 1392 na SEQ ID No. 21 constituíram a região constante. Para a cadeia leve, os nucleotídeos Nos. 64 a 387 na SEQ ID No. 22 constituíram a região variável, enquanto os nucleotídeos Nos. 388 a 702 na SEQ ID No. 22 constituíram a região constante. As localizações e 20 seqüências das CDRs também são elucidadas acompanhando-se as homologias com o banco de dados. As seqüências de aminoácido de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada de TRA-8 são mostradas nas SEQ ID No. 25, No. 26 e No. 27, respectivamente. As seqüências de aminoácido de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de TRA-8 são mostradas nas SEQ ID 25 No. 28, No. 29 e No. 30, respectivamente.

Exemplo 17. Planejamento de uma Versão Humanizada do Anticorpo TRA-8 (1) Modelagem molecular de um região variável de TRA-8

A modelagem molecular da região variável de TRA-8 é

113 realizada pelo método no geral conhecido como modelagem de homologia (Methods in Enzymology, 203, 121 a 153, (1991)). As seqüências primárias de regiões variáveis de imunoglobulina humana registradas no Banco de Dados de proteína (Nuc. Acid Res. 28, 235 a 242 (2000)), para as quais as 5 estruturas tridimensionais derivadas da cristalografia de raio x estão disponíveis, são comparadas com as regiões de estrutura de TRA-8 determinadas acima. Como um resultado, 1NCD e 1HIL são selecionadas como tendo as homologias de seqüência mais altas com as regiões de estrutura para as cadeias leve e pesada de TRA-8, respectivamente. As 10 estruturas tridimensionais das regiões de estrutura são geradas combinando-se as coordenadas de 1NCD e 1HIL que correspondem às cadeias leve e pesada * de TRA-8, para obter o “modelo de estrutura”. Usando a classificação definida por Chothia et al., as CDRs de TRA-8 são classificadas como segue;

CDRLi, CDRL₂, CDRHi e CDRH₂ pertencem às classes canônicas 2,1,1,3, 15 respectivamente, enquanto CDRL3 não pertence a nenhuma das classes canônicas específicas. As alças de CDR de CDRLi, CDRL₂, CDRHi, CDRH₂ são fixadas às conformações inerentes às suas respectivas classes canônicas e integradas no modelo de estrutura. A CDRL₃ é designada a conformação de cacho 8A, de acordo com a classificação de Thomton et al. (J. Mol. Biol., 20 263, 800 a 815, (1996)) e a CDRH₃ é classificada em k(8)C usando a regra

H3 (FEBS letter 455, 188 a 197 (1999)). Depois, as conformações representativas para CDRL₃ e CDRH₃ são integradas no modelo de estrutura.

Finalmente, os cálculos de energia são realizados para eliminar os contatos interatômicos desfavoráveis, de modo a obter um modelo 25 molecular provável da região variável do TRA-8 em termos de energia. O procedimento acima é realizado usando o sistema de modelagem comum comercialmente disponível ABM (Oxford Molecular Limited, Inc.). Para o modelo molecular obtido, a exatidão da estrutura é ainda avaliada usando o software, PROCHECK (J. Appl, Cryst. (1993), 26, 283 a 291).

114 (2) Planejamento das sequências de aminoácido para TRA-8 humanizado.

A construção de anticorpos TRA-8 humanizados é realizada pelo método no geral conhecido como enxerto de CDR (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 10029 a 10033 (1989)). O anticorpo aceitador é escolhido com base na homologia de aminoácido na região de estrutura. As seqüências da região de estrutura em TRA-8 são comparadas com todas as seqüências de estruturas humanas no banco de dados Kabat de seqüências de aminoácido de anticorpos (Nuc. Acid Res. 29, 205 a 206 (2001)). Como um resultado, o anticorpo mAB58’CL é selecionado como um aceitador devido à homologia de seqüência mais alta de 80% com a região de estrutura. Os resíduos de aminoácido na região de estrutura para mAb58’CL são alinhados com aqueles para TRA-8 e as posições onde aminoácidos diferentes são usados são identificadas. A localização destes resíduos são analisadas usando o modelo tridimensional de TRA-8 construído acima e os resíduos doadores que devem ser enxertados no aceitador são escolhidos pelo critério dado por Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 10029 a 10033 (1989)). As seqüências de TRA-8 humanizadas são construídas como descrito no exemplo seguinte pela transferência de diversos resíduos doadores no anticorpo aceitador, mAb58’CL.

Exemplo 18. Construção de um Vetor de Expressão para a Cadeia Pesada do Anticorpo Humanizado (1) Construção de plasmídeo que carrega o DNA da região variável da cadeia pesada de TRA-8 Humanizado

De modo a determinar a atividade de TRA-8 humanizado, o plasmídeo que carrega a cadeia pesada de TRA-8 humanizado é construída como segue. Entretanto, é avaliado que a humanização de TRA-8 não é limitada a estes exemplos.

Como mostrado na SEQ ID No. 31 da Listagem de Seqüência,

115 a humanização das seqüências de aminoácido da cadeia pesada do anticorpo de DR5 anti-humano de camundongo TRA-8 acarretou substituir o 13° aminoácido (lisina), o 19° aminoácido (lisina), o 40° aminoácido (treonina), o 42° aminoácido (ácido glutâmico), o 44° aminoácido (arginina), o 84° aminoácido (serina), o 88° aminoácido (serina), o 93° aminoácido (metionina), o 114° aminoácido (treonina), o 115° aminoácido (leucina) com glutamina, arginina, alanina, glicina, glicina, asparagina, alanina, valina, leucina e valina, respectivamente.

O plasmídeo que carrega o DNA que codifica a região variável da cadeia pesada de TRA-8 humanizado (SEQ ID No. 31 da Listagem de Seqüência) é construído como segue.

A PCR é usada para construir as seguintes seqüências de DNA, cada um das quais compreendeu o descrito acima:

Os seguintes 12 oligonucleotídeos são sintetizados:

5’-ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac-3’ (A; SEQ ID No. 32);

5’-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg-3’ (B; SEQ ID No. 33);

5’-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag geaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta-3’ (C; SEQ ID No. 34);

5’-gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg-3’ (D; SEQ ID No. 35);

5’-tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3’ (E; SEQ ID No. 36);

5’-ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctc cacc aagggcccat cggtc3’ (F; SEQ ID No. 37);

5’-ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa-3’ (G; SEQ ID No. 38);

5’-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga

116 gtggacacct gtagctgttg-3’ (H; SEQID No. 39);

5’-tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag-3’ (I; SEQ ID No. 40);

5’-ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt tgcaacccac-3’ (J; SEQ ID No. 41);

5’-ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3’ (K; SEQ ID No. 42); e

5’-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc-3’ (L; SEQ ID No. 43).

_ Os seguintes 2 preparadores de PCR são sintetizados como descrito acima:

* 5’-ttggataagc ttggcttgac-3’ (Pl; SEQ ID No. 44); e

5’-gaccgatggg cccttggtgg a-3’ (P2; SEQ ID No. 45).

A síntese de DNA que codifica uma cadeia de polipeptídeo que compreende uma seqüência de sinal de secreção, uma região variável de cadeia pesada de TRA-8 humanizado e os 8 resíduos de aminoácido no término N da região IgG-CHl é realizada usando uma combinação de PCR respectivamente.

O fragmento de DNA é preparado como segue.

Composição da solução de reação de PCR:

oligonucleotídeo A, 10 pmol;

oligonucleotídeo B, 10 pmol; oligonucleotídeo C, 10 pmol; oligonucleotídeo D, 10 pmol; oligonucleotídeo E, 10 pmol;

oligonucleotídeo F, 10 pmol;

oligonucleotídeo G, 10 pmol; oligonucleotídeo H, 10 pmol;

oligonucleotídeo 1,10 pmol;

117 oligonucleotídeo J, 10 pmol;

oligonucleotídeo K, 10 pmol;

oligonucleotídeo L, 10 pmol;

preparador de oligonucleotídeo PI, 2 μΜ;

preparador de oligonucleotídeo P2, 2 μΜ;

tampão 10 X Pyrobest II, 10 μΐ;

mistura de dNTP, 8 μΐ;

Pyrobest DNA polimerase, 0,5 μΐ; e

Agua redestilada até um volume final de 50 μΐ.

A reação de PCR é conduzida como segue. A solução é primeiro aquecida a 94°C durante 5 minutos, depois do que um ciclo de aquecimento a 98°C durante 10 segundos, 55°C durante 30 segundos e 72°C durante 1 minuto, é repetido 7 vezes. Depois da conclusão deste procedimento, a solução de reação é aquecida a 72°C durante 15 minutos.

Um volume igual de fenol-clorofórmio (50% v/v de fenol saturado com água, 48% v/v de clorofórmio, 2% v/v de álcool isoamílico) é adicionado a 200 μΐ de cada um dos produtos de PCR e vigorosamente misturados durante 1 minuto. Depois deste tempo, a mistura é centrifugada a 10.000 X g e a camada aquosa é recuperada e misturada com um volume 20 igual de clorofórmio-álcool isoamílico (96% v/v de clorofórmio e 4% v/v de álcool isoamílico), que é mais uma vez vigorosamente a 10.000 X g e a camada aquosa é recuperada. A série de etapas relatada neste parágrafo é aludida, daqui em diante, como “extração de fenol”).

A precipitação com etanol é depois realizada na camada aquosa recuperada. Como usado e aqui aludido, a “precipitação com etanol” consiste de adicionar, com mistura, um décimo do volume de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e 2,5 volumes de etanol a 100% à solução a ser tratada e congelando a mistura usando gelo seco. A mistura resultante é depois centrifugada a 10.000 X g para recuperar o DNA como um precipitado.

118

Depois da extração de fenol e precipitação com etanol, o precipitado de DNA resultante é secado a vácuo, dissolvido em um mínimo de água redestilada e separado pela eletroforese a 3% em gel de agarose. Depois da eletroforese, o gel é tingido com uma solução aquosa a 1 pg/ml de 5 brometo de etídio para permitir a detecção de DNA sob luz UV. A faixa de DNA que corresponde ao DNA do TRA-8 humanizado é cortada usando uma lâmina de barbear e eluída a partir do gel usando o Kit Geneclean Spin (BIO 101, CA, USA). Depois da extração com fenol, o DNA eluído é depois concentrado pela centrifugação a 7.500 X g, seguido pela precipitação com 10 etanol e finalmente dissolvido em 5 μΐ de água destilada.

Cada DNA extraído resultante é clonado usando o vetor ’ pGEM-T Easy (Promega) como segue:

O fragmento de DNA recuperado da reação de PCR, 5 μΐ; tampão 10 X Taq polimerase, 1 μΐ;

mistura de dNTP, 1 μΐ

Taq polimerase (5 unidade/ml), 1 μΐ; e água redestilada até um volume final de 10 μΐ.

Depois cada solução acima é reagida a 70°C durante 30 minutos, cada solução de DNA e o vetor pGEM-T Easy são ligados usando 20 um Kit de Ligação de DNA Versão 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) usando o protocolo do fabricante.

Depois de 4 horas de incubação a 15°C, 2 μΐ da solução de reação incubada é misturada com 100 μΐ da cepa E. coli competente JM109 a uma densidade de célula de 1-2 x 10⁹ células/ml (Takara Shuzo Co., Ltd.) e a 25 mistura é mantida em gelo durante 30 minutos, depois a 42°C durante 30 segundos e mais uma vez em gelo durante 1 minuto. Depois, 500 μΐ de meio SOC (2% v/v de triptona, 0,5% p/v de extrato de levedura, 0,05% p/v de cloreto de sódio, 2,5 mM p/v de cloreto de potássio, 1 mM de cloreto de magnésio e 20 mM de glicose) são adicionados à mistura, que é incubada por

119 mais uma hora, com agitação. As cepas transformantes são depois isoladas e o DNA plasmídico é preparado a partir das cepas como descrito em “Molecular Cloning A Laboratory Manual”. As sequências de nucleotídeo destes DNAs que codificam a cadeia pesada de TRA-8 humanizado são confirmadas pelo 5 método de didesóxi (Sanger, F. S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74: 5463 a 5467) usando o Analisador de DNA 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japão).

Os plasmídeos resultantes são designados pHB14 (o plasmídeo que carrega o cDNA que codifica a cadeia pesada de TRA-8 humanizado). A 10 cepa transformante da E. coli que abriga este plasmídeo, designado como E.

coli JM109/pHB14 foi depositada com o Intemational Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japão em 20 de abril de 2001, de acordo com o Tratado de Budapest para o 15 Depósito de Microorganismos e foi concedido o número de acesso FERM BP-7556.

(2) Construção de plasmídeos de expressão que carregam o DNA da região variável da cadeia pesada de TRA-8 humanizado

Os vetores de expressão recombinantes para as células de 20 animal são construídos inserindo-se o DNA que codifica a cadeia pesada de TRA-8 humanizado (clonado como acima) como segue.

Um pg de plasmídeo pSRHHH3 (Pedido de patente europeu EP 0-909-816-A1) que carrega a região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal anti-Faz humanizado HFE7A e o DNA genômico da região 25 constante da IgGl humana, um vetor de expressão para células de mamífero, é digerido com as enzimas de restrição HindIII e Apal e separado pela eletroforese a 3% em gel de agarose. Depois da eletroforese, o gel é tingido com uma solução aquosa a 1 pg/ml de brometo de etídio para permitir a detecção de DNA sob luz UV. As faixas de DNA do vetor contendo o DNA

120 genômico da região constante da IgGl humana sem a região variável da cadeia pesada de HFE7A humanizada são cortadas usando uma lâmina de barbear e eluídas a partir do gel usando o Kit Geneclean Spin (BIO 101, CA, USA). Depois da extração com fenol, o DNA eluído é depois concentrado 5 pela centrifugação a 7.500 X g, seguido pela precipitação com etanol e finalmente dissolvido em 5 μΐ de água destilada e depois desfosforilado usando CIP. O plasmídeo resultante digerido, desfosforilado (100 ng) é ligado com 1 pg do fragmento de DNA pHB14 contendo o DNA que codifica a região variável da cadeia pesada de TRA-8 humanizado, que também foi 10 digerido com HindIII e Apal, usando um Kit de Ligação de DNA Versão 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). A mistura de ligação é depois usada para transformar a E. coli JM109, que é depois plaqueada em placas de LB ágar contendo 50 pg/ml de ampicilina.

Os transformantes obtidos por estes métodos são cultivados 15 em 2 ml de meio LB líquido contendo 50 pg/ml de ampicilina a 37°C durante a noite e o DNA plasmídico é subsequentemente extraído da cultura resultante pelo método alcalino-SDS.

O DNA plasmídico extraído é digerido com HindIII e Apal e submetido à eletroforese em gel de agarose a 3% p/v para confirmar a 20 presença ou ausência do inserto do DNA que codifica a região variável da cadeia pesada de TRA-8 humanizado. A inserção e orientação do fragmento de DNA desejado no vetor é confirmada pelo seqüenciamento de DNA usando um analisador de seqüência de gene (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). O plasmídeo de expressão resultante que carrega o 25 cDNA que codifica a cadeia pesada de TRA-8 humanizado é designado pHB14-l.

Exemplo 19. Construção de um Vetor de Expressão para a

Cadeia Leve do Anticorpo Humanizado (1) Construção de vetores para as cadeias leves das versões

121 humanizadas de anticorpo TRA-8

Como mostrado na SEQ ID No. 46 da Listagem de Seqüência, na humanização da seqüência de aminoácido da cadeia leve do anticorpo de DR5 anti-humano de camundongo TRA-8, o 8^o aminoácido (histidina), o 9^o 5 aminoácido (lisina), o 10° aminoácido (fenilalanina), o 11° aminoácido (metionina), o 13° aminoácido (treonina), o 20° aminoácido (serina), o 42° aminoácido (glutamina), o 43° (serina), o 60° aminoácido (ácido aspártico), o 63° aminoácido (treonina), o 77° aminoácido (asparagina), o 78° aminoácido (valina), o 80° aminoácido (serina) o 83° aminoácido (leucina), o 85° 1Q aminoácido (ácido aspártico), o 87° aminoácido (fenilalanina) e o 99° aminoácido (glicina) o 103° aminoácido (leucina) e o 108° aminoácido (alanina) a partir do término N da seqüência de aminoácido da cadeia leve de TRA-8 são substituídos com prolina, serina, serina, leucina, alanina, treonina, lisina, alanina, serina, serina, serina, leucina, prolina, fenilalanina, treonina, 15 tirosina, glutamina, valina e treonina respectivamente. A seqüência resultante é designada LM2.

Os plasmídeos de expressão que carregam este tipo de seqüência de aminoácido de cadeia leve humanizada do anticorpo de DR5 anti-humano TRA-8 é construído como segue.

1) Síntese de preparadores para preparar as regiões variável e constante da cadeia leve de TRA-8 humanizado

O DNA que codifica a cadeia de polipeptídeo LM2 (SEQ ID No. 46 da Listagem de Seqüência), cada uma das quais é uma fusão da região variável da cadeia leve do anticorpo anti-DR5 humanizado TRA-8 e a região 25 constante da cadeia leve da Ig humana (cadeia k), são respectivamente sintetizados usando-se as combinações de PCR.

Além disso para 7AL1P (SEQ ID No. 47) e 7ALCN (SEQ ID No. 48), os seguintes preparadores de oligonucleotídeo são sintetizados para a PCR:

122

5’-gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atcacaatgt caccagtgga-3’ (HKSPR11; SEQ ID No. 49);

5’-ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcacca tcacctgc-3’ (HKCDF11; SEQ IDNo. 50);

5’-agtgtgccgg gtggatgccc agtaaatcag tagtttagga gctttccctg gtttctg3’(HKCDR12; SEQ ID No. 51);

5’-tgggcatcca cccggcacac tggggtccca agcaggttta gtggcagt-3’ (HKCDF22; SEQ ID No. 52);

5’-ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagat ggt-3’ . (HKCDR22; SEQ ID No. 53); e

5’-cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggact gtg-3’ (HKCF12; SEQ ID No. 54).

2) Construção de plasmídeo pCR3.1/M2-l (clonagem da cadeia leve de TRA-8 humanizado)

O LM2-fragmento de DNA como definido na SEQ ID No. 55 da Listagem de Seqüência que codifica a seqüência de aminoácido como 5 definida na SEQ ID No. 46 da mesma é preparado realizando-se a PCR de 2 etapas, inserido em um vetor plasmídico e clonado na E. coli

a) Primeira etapa de PCR

O fragmento LM2-DNA-F1 que codifica uma seqüência de sinal de secreção e uma porção da região FRLj com um sítio de divagem de 10 enzima de restrição HindIII adicionado à extremidade 5’ é preparado sob as seguintes condições. Os plasmídeos padrão, pHSGHM17 e pSRPDHH, são obtidos seguindo-se a descrição no Pedido de patente europeu EP 0 909 816 Al.

Composição da solução de reação:

DNA plasmídico pHSGHM17 (Pedido de patente europeu EP

909 816 Al), 25 ng preparador de oligonucleotídeo 7AL1P, 50 pmol

123 preparador de oligonucleotídeo HKSPR11, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOxPCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase (PerkinElmer), 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR: Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por 10. aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

O fragmento LM2-DNA-F2 que codifica uma porção de FRLi, CDRLi, FRL₂ e CDRL₂ é preparado sob as seguintes condições.

Composição da solução de reação:

DNA plasmídico pL28, 25 ng preparador de oligonucleotídeo HKCDF 11,50 pmol preparador de oligonucleotídeo HKCDR12, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOxPCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 25 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

O LM2-fragmento de DNA-F3 que codifica CDRL₂, FRL₃ e uma porção de CDRL₃ é preparado sob as seguintes condições.

Composição da solução de reação:

124

	DNA plasmídico pSRPDHH (Pedido de patente europeu EP 0 909 816 Al), 25 ng preparador de oligonucleotídeo HKCDF22, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo HKCDR22, 50 pmol
5	coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOxPCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.
ίο.	Condições térmicas da PCR: Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo
	térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.
15	O LM2-fragmento de DNA-F4 que codifica CDRL3, FRL4 e a região constante com um sítio de divagem de enzima de restrição EcoRI adicionado à extremidade 3’ é preparado sob as seguintes condições. Composição da solução de reação: DNA plasmídico pSRPDHH, 25 ng
20	preparador de oligonucleotídeo HKCF12, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo 7ALCN, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOxPCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades
25	A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR. Condições térmicas da PCR: Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2

125 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

Os fragmentos de DNA amplificados depois da PCR são separados pela eletroforese em gel de poliacrilamida a 5%. O gel depois da 5 eletroforese é tingido com 1 pg/ml de brometo de etídio para detectar o DNA produzido sob luz UV. As respectivas faixas de DNA assim detectadas são excisadas com uma lâmina de barbear

b) Segunda etapa de PCR

O LM2-DNA em que os fragmentos LM2-F1-DNA, LM2-F210. DNA, LM2-F3-DNA e LM2-F4-DNA descritos acima são fundidos é preparado sob as seguintes condições.

Composição da solução de reação:

Fragmento de gel de LM2-F1-DNA preparado na primeira etapa de PCR,

Fragmento de gel de LM2-F2-DNA preparado na primeira etapa de PCR,

Fragmento de gel de LM2-F3-DNA preparado na primeira etapa de PCR,

Fragmento de gel de LM2-F4-DNA preparado na primeira 20 etapa de PCR preparador de oligonucleotídeo 7AL1P, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo 7ALCN, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5,0 μΐ tampão lOxPCR, 5,0 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo

126 térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

O LM2-fragmento de DNA assim preparado é inserido no plasmídeo pCR-3.1 DNA usando o Kit de clonagem Eukaryotic TA (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante e introduzido na E. coli competente TOPIOF’ contido no kit. As seqüências de nucleotídeo destes DNAs que codificam a cadeia leve de TRA-8 humanizado são confirmadas pelo método de didesóxi (Sanger, F. S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74: 5463 a 5467) usando o Analisador de DNA 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japão).

Os plasmídeos resultantes são designados pCR3.1/M2-l (o plasmídeo que carrega cDNA que codifica a região variável da cadeia leve de TRA-8 humanizado e uma região constante de cadeia leve da Ig humana).

O plasmídeo pCR3.1/M2-l obtido contendo o LM2-fragmento de DNA é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I.

Um μg do DNA do plasmídeo de clonagem pHSG399 é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I e depois desfosforilado com CIP. O DNA desfosforilado pHSG399 resultante e o LM2-fragmento de DNA, que foram digeridos com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I, são ligados usando o Kit de Ligação de DNA Versão 2.0 (Takara Shuzo, Co. Ltd.). Depois, a E. coli DH5ot é transformada com o DNA ligado e espalhada sobre meio LB agar contendo 0,1 mM de IPTG, 0,1% XGal e 50 μg/ml cloranfenicol (concentrações finais). Os transformantes brancos obtidos são cultivados em meio LB líquido contendo 50 pg/ml de cloranfenicol e DNA plasmídico é extraído da cultura resultante de acordo com o método alcalino-SDS. O DNA plasmídico extraído é digerido com Hind III e EcoR I e depois um clone que carrega o LM2-fragmento de DNA é selecionado pela eletroforese em gel de agarose a 1%.

127

Como um resultado do procedimento acima, o plasmídeo pHSG/M2-l-4 que carrega um fragmento de fusão da região variável da cadeia leve LM2 TRA-8 humanizado e a região constante da cadeia IgK humana é obtida. A cepa transformante da E. coli que abriga este plasmídeo, 5 designado como E. coli DH5a/pHSG/M2-l-4 foi depositado com o Intemational Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japão em 20 de abril de 2001, de acordo com o Tratado de Budapest para o Depósito de Microorganismos e foi concedido o 10 número de acesso FERM BP-7563.

3) Construção de Plasmídeo pSR/M2-l (plasmídeo de ' expressão para a cadeia leve de LM2 TRA-8 humanizado)

O plasmídeo pHSG/M2-l-4 obtido que carrega um fragmento de fusão da região variável da cadeia leve LM2 TRA-8 humanizada e a região 15 constante da cadeia IgK humana é digerido com as enzimas de restrição Hind

III e EcoR I.

Um pg de DNA do plasmídeo de clonagem pSRPDHH (Pedido de patente europeu EP 0909-816-A1) é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I e depois desfosforilado com CIP. O DNA de 20 pSRPDHH desfosforilado resultante e o fragmento de DNA HindIII-EcoRI obtido de pHSG/M2-l-4 são ligados usando o Kit de Ligação de DNA Versão 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Depois, a E. coli DH5a é transformada com o DNA ligado e espalhada sobre LB ágar. Os transformantes obtidos são cultivados em meio LB líquido contendo 100 pg/ml de ampicilina e o DNA 25 plasmídico é extraído da cultura resultante de acordo com o método alcalinoSDS. A inserção e a orientação do fragmento de DNA desejado no vetor pSRPDHH são confirmadas pelo seqüenciamento de DNA usando um analisador de seqüência de gene (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

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128

O plasmídeo de expressão resultante que carrega o cDNA que codifica a cadeia leve de TRA-8 humanizado é designado pSR/M2-l.

Exemplo 20. Produção de Anticorpo Humanizado

A transfecção de células COS-7, isto é, uma linhagem celular derivada de um rim de macaco, com os plasmídeos de expressão para a cadeia pesada de TRA-8 humanizado e a cadeia leve de TRA-8 humanizado obtidos acima é conduzida pelos métodos do reagente de transfecção FUGENE6 (Boehringer Mannheim Biochemica) de acordo com o manual de instrução fornecido com o kit.

'10 As células COS-7 (American Type Culture Collection No.

CRL-1651) são cultivadas até semi-confluentes (3 χ 10⁶ células/placa) em * uma placa de cultura (área de cultura: 57 cm²; Sumitomo Bakelite) contendo meio Eagle modificado de Dulbecco (daqui em diante aludido como “DMED”; Gibco BRL) suplementado com 10% de soro fetal bovino (daqui em 15 diante abreviado como “FCS”; Moregate).

Nesse meio tempo, 10 pg/placa (total 5 placas) do DNA plasmídico de expressão da cadeia pesada de DR5 humanizado (pHA15-l) e 10 pg/placa do DNA plasmídico de expressão da cadeia leve de DR5 humanizado preparado pelo método alcalino-SDS e centrifugação pelo 20 gradiente de densidade de cloreto de césio são misturados e depois precipitados com etanol, seguido pela suspensão em 5 μΐ/placa de dH₂O.

Depois 15 μΐ/placa de reagente de transfecção FUGENE6 é misturado com 180 μΐ/placa de DMEM sem FCS, esta solução de FUGENE (185 μΐ/placa) é misturada com 5 μΐ/placa de solução de DNA contendo 10 25 μg/placa do DNA plasmídico de expressão da cadeia pesada de DR5 humanizado e 10 pg/placa do DNA plasmídico de expressão da cadeia leve de DR5 humanizado. Depois de 15 minutos de incubação na temperatura ambiente, a suspensão de plasmídeo obtida (200 μΐ) é adicionada às placas COS-7 anteriormente preparadas. Depois de incubar em 5% de CO₂ a 37°C

129 durante 24 horas, o meio de cultura é mudado com D-MEM sem FCS. Depois de incubar em 5% de CO₂ a 37°C durante 72 horas, o sobrenadante de cultura é recuperado para purificar os produtos de expressão nos fluídos sobrenadantes. Pelo método como descrito acima, as células COS-7 são transfectadas com cada uma das seguintes combinações de plasmídeo:

(A) : nenhum DNA plasmídico (B) : co-transfecção de pHB14-l e pSR/M2-l

A cultura é depois centrifugada (1.000 r.p.m., 5 minutos) e coletado o sobrenadante. O sobrenadante é centrifugado mais uma vez (9.800 *10 r.p.m., 15 minutos) e filtrado com filtro de 0,45 pm (ADVANTEC TOYO

DISMIC-25cs, Cat # 25CS045 AS). A purificação de IgG a partir dos ' filtrados é obtida usando a cromatografia de afinidade da Proteína G-POROS (Applied Biosystems) sob as seguintes condições:

HPLC: BioCAD 700E (Applied Biosystems) coluna: cartucho sensor ProteínaG-ID (tamanho da coluna: 2,1 mm Dl x 30 mm LD, volume do leito: 0,1 ml; Cat # 2-1002-00, Applied Biosystems) tampão de elução: 0,1 M Glicina-HCl (pH 2,5) tampão de neutralização: 1M Tris-HCl (pH 8,5) detecção: 280 nm.

taxa de fluxo: 1 ml/min tamanho da fração: 0,5 ml/0,5 min tubo de fração: microtubo de polipropileno de 1,5 ml temperatura: 4°C

Depois que todos os filtrados são aplicados à coluna, 30 ml de

PBS (Sigma, Cat # 1000-3) é usado para lavar a coluna. Quando o tampão de elução é aplicado, o coletor de fração é iniciado. Cada microtubo de fração anteriormente continha 55 pl de NaCl 1 Μ, 110 pl de tampão de neutralização e 74 pl de albumina sérica bovina a 2 mg/ml (Sigma, Cat # A7030) em PBS.

130As frações de N^e 8 até N^s 10 são coletadas e dializadas contra 1 litro de PBS (pH 7,5) a 4 °C durante 1 dia usando Slide-A lyzer (Pierce, Cat # 66450). O tampão de diálise é mudado duas vezes.

A verificação da expressão dos anticorpos humanizados e o ensaio quantitativo dos produtos de expressão nos fluidos de sobrenadante de cultura preparados é realizada pelo ELISA com um anticorpo contra a IgG anti-humana.

A cada reservatório de uma placa de 96 reservatórios (MaxiSorp, Nunc), 100 μΐ de anticorpo policlonal específico de IgG Fc anti[10 humano de cabra (Kappel) dissolvido na concentração final de 0,5 pg/ml em tampão de absorção (0,05 M de hidrogeno carbonato de sódio, 0,02% azida de . sódio, pH 9,6) é adicionado e a placa é incubada a 37°C durante 2 horas para causar a adsorção do anticorpo. Depois, a placa é lavada com 350 μΐ de PBS() contendo 0,05% de Tween-20 (BioRad) (daqui em diante aludido como 15 “PBS-T”) cinco vezes. Aos reservatórios depois da lavagem, o sobrenadante de cultura diluído com D-MEM contendo 10% de FCS é adicionado e incubado a 37°C durante 2 horas. Depois de lavar mais uma vez com PBS-T, 100 μΐ de anticorpo policlonal específico de IgG Fc anti-humano de cabra rotulado com alcalino fosfatase (Jackson Immuno Research Lab.) diluído 20 10.000 vezes com PBS-T é adicionado a cada reservatório e incubado a 37°C durante 2 horas. Depois de lavar mais uma vez com PBS-T, uma solução do substrato de p-nitrofenil fosfato obtida do kit Alkaline Fosfatase Substrate (Bio Rad) é adicionado de acordo com o manual de instrução fornecido com o kit. Depois de incubar a 37°C durante 0,5 a 1 hora, a absorbância a 405 nm é 25 medida. Nos presentes experimentos, a imunoglobulina G de plasma humano subclasse 1 (IgGl) (Biopure AG) diluída com D-MEM contendo 10% de FCS até certas concentrações é usada como amostras de referência de concentração do anticorpo de DR5 humanizado contido nos fluidos de sobrenadante de cultura.

13>

Como um resultado, a expressão e os produtos purificados no sobrenadante de cultura são detectados especificamente com o anticorpo de IgG anti-humana. A quantidade de anticorpo de IgG humano é 8,96 pg (800 μΐ).

Exemplo 21. Atividade indutora de apoptose de Anticorpo Humanizado

Células Jurkat (ATCC No. TIB-152), são usadas para examinar a atividade indutora de apoptose do anticorpo purificado TRA-8 humanizado.

As células Jurkat cultivadas em meio RPMI1640 com 10% de FCS (Gibco BRL) a 37°C durante 3 dias na presença de 5% de CO₂ são dispensadas em cada reservatório de uma microplaca de 96 reservatórios (Sumitomo Bakelite) a 50 μΐ por reservatório. O TRA-8 humanizado preparado no Exemplo 20 é ajustado para ter a concentração do produto final de interesse de 100 ng/ml com meio RPMI1640 contendo 10% de FCS estimando-se suas concentrações nos fluidos de acordo com o método descrito no Exemplo 20. Cada uma das soluções dos produtos de expressão assim ajustados a 100 ng/ml é usada para produzir diluições em série repetindo-se a diluição serial de 2 vezes com RPMI1640 contendo 10% de FCS. Cada solução de TRA-8 humanizado diluída é adicionada a cada reservatório a 50 μΐ por reservatório. Depois de reagir a 37°C durante 12 horas, 50 μΐ de PMS a 25 μΜ (metossulfato de fenazina; Sigma Chemical Co.) contendo 1 mg/ml de XTT sal interno de (2,3-bis[2-metóxi-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazólio-5carboxianirida; Sigma Chemical Co.) é adicionado (concentrações finais de 250 μg/ml para XTT e 5 μΜ para PMS). Depois de incubar durante 3 horas, a absorbância a 450 nm, de cada reservatório é medida para calcular a viabilidade celular usando-se a capacidade de redução da mitocôndria como o índice.

A viabilidade das células em cada reservatório é calculada de

132acordo com a seguinte formula:

Viabilidade (%) = 100 x (a-b) / (c-b) em que “a” é a medida de um reservatório de teste, “b” é a medida de um reservatório sem células e “c” é a medida de um reservatório sem anticorpo adicionado.

Como um resultado, o produto de expressão preparado no Exemplo 20 (TR-A-8 humanizado) é demonstrado induzir a apoptose em células de linhagem celular de linfoma T que expressam o antígeno DR5 humano.

Exemplo 22. reatividade de TRA-8 às várias moléculas de DR5

De modo a determinar a reatividade de TRA-8 às várias moléculas DR5, a reatividade de TRA-8 é examinada usando linfócitos ativados como segue.

Primeiro, amostras de sangue periférico são coletadas de um ser humano (30 ml), sagüi (3 ml) e macaco cinomolgo (20 ml). As amostras de sangue tiveram 1 ml de heparina (Novoheparin; Novo) adicionado a elas e as amostras são depois lentamente dispostas em camadas sobre um volume igual de solução Ficoll-Paque PLUS ((Amersham Pharmacia Biotech.) peso específico: 1,077 para todos exceto o macaco cinomolgo, que teve um peso específico de 1,072) e centrifugadas a 1.700 r.p.m. durante 30 minutos de modo a obter uma fração de células mononucleares de sangue periférico. Esta fração de célula mononuclear é lavada duas vezes com solução salina equilibrada de Hanks e depois colocadas em suspensão em meio RPMI 1640 com 10% v/v de FCS até uma densidade de célula de 1 x 10⁶ células/ml. Fitoemaglutinina-P (PHA-P, Sigma Chemicals, Co.) é adicionada à suspensão resultante a uma concentração final de 5 pg/ml e a amostra incubada a 37°C sob 5% v/v de CO₂ durante 24 horas. Depois deste tempo, as células são recuperadas pela centrifogação, lavadas e recolocadas em suspensão em meio

133*

RPMI 1640 contendo 10% v/v de FCS. Depois, para ativar as células recuperadas, interleucina-2 (Amersham Pharmacia Biotech.) é adicionada à suspensão até uma concentração final de 10 unidades/ml e esta é incubada a 37°C sob 5% v/v de CO2 durante 72 horas.

Uma quantidade da preparação ativada calculada para conter 1 x 10⁶ células linfocíticas ativadas é colocada em um tubo de teste e colocada em suspensão em 50 μΐ de 0,5, 1,5, 10 pg/ml de TRA-8 em PBS ou 50 μΐ de PBS sozinho. A suspensão resultante é deixada repousar em gelo durante 1 hora, depois do que as células são lavadas 3 vezes com alíquotas de 500 μΐ de 10 PBS e depois colocada em suspensão em 50 μΐ de 20 pg/ml de anticorpo IgG anti-camundongo rotulado com FITC (Bioresource) em PBS. Usando as . células colocadas em suspensão em 500 μΐ de PBS como controles, as intensidades de fluorescência são medidas, usando um citômetro de fluxo (FACSCalibur; Becton Dickinson).

As distribuições dos números de célula pela intensidade de fluorescência são obtidas e as proporções dos números das células tingidas para aquelas de células total são calculadas. Além disso, cada valor Kd é calculada usando a concentração de TRA-8 e as proporções dos números das células tingidas para aquelas de células totais. Cada freqüência de reatividade 20 para linfócitos ativados de ser humano, sagüi e macaco cinomolgo é quase a mesma. Consequentemente, TRA-8 é capaz de ligar uma ampla faixa de DR5 de primata incluindo de ser humano contra o qual o TRA-8 é originalmente preparado.

Exemplo 23. Estudo de dose escalonada de TRA-8 em sagüis

Um estudo de toxicidade preliminar de dose escalonada de

TRA-8 é realizada usando 1 sagüi macho e 1 fêmea. Três conjuntos de dosagem intravenosa única, que são separadas por um período de retirada de 7 dias, são realizados. A dose de TRA-8 é ajustada a 50, 250 e 1250 pg/corpo. Quarenta e oito horas depois de cada tratamento, o sangue é coletado a partir . 134 da veia femural e o plasma é preparado. As atividades de aspartato aminotransferase e alanina aminotransferase do plasma são medidas usando um analisador (FUJI DRICHEM: Fuji Film Medicai Co., Ltd.). Todo o sangue é coletado sem qualquer anestesia. Como um resultado, nenhuma evidência indicando dano hepático é observada no exame bioquímico do plasma depois de cada tratamento.

Exemplo 24. Estudos farmacológicos in vitro e in vivo de TRA-8 contra células cancerosas

De modo a determinar se TRA-8 tem a eficácia terapêutica na terapia anti-câncer, a atividade in vitro de destruição do TRA-8 usando várias linhagens celulares cancerosas é examinada como segue.

Várias células cancerosas (2-8 x 10³ células/50 μΐ) cultivadas em meio RPMI1640 (para Jurkat), meio DMEM (para HCT-116), MEM-R (para WiDr) ou DMEM-F12 (para COL2-Jck) obtidos da Gibco BRL com 10% de FCS (Gibco BRL) a 37°C na presença de 5% de CO₂ são dispensadas em cada reservatório de uma microplaca de 96 reservatórios (Sumitomo Bakelite). O TRA-8 é ajustado para ter a concentração do produto final de interesse de 100 ng/ml com meio contendo 10% de FCS. A solução de TRA-8 (100 ng/ml) é usada para produzir diluições em série repetindo-se a diluição serial de 2 vezes com meio contendo 10% de FCS. Cada uma das soluções de TRA-8 diluídas é adicionada a cada reservatório a 50 μΐ por reservatório e incubada a 37°C. Depois de reagir a 37°C durante 72 horas, 50 μΐ de PMS a 25 μΜ (metossulfato de fenazina; Sigma Chemical Co.) contendo 1 mg/ml de XTT são adicionados (concentrações finais de 250 μg/ml para XTT e 5 pm para PMS). Depois de incubar durante 3 horas, a absorbância a 450 nm de cada reservatório é medida para calcular a viabilidade celular usando-se a capacidade de redução da mitocôndria como o índice.

A viabilidade das células em cada reservatório é calculada de acordo com a seguinte fórmula:

. 135“

Viabilidade (%) = 100 x (a-b) / (c-b) em que “a” é a medida de um reservatório de teste, “b” é a medida de um reservatório sem células e “c” é a medida de um reservatório sem anticorpo adicionado.

Os resultados são mostrado na Tabela 3, abaixo.

Tabela 3

Células	ED50 (pg/ml)
Jurkat	0,001 - 0,01
HCT-116	0,004 - 0,02
WiDr	0,007 - 0,03
COL2-Jck	2,28

- Várias linhagens celulares cancerosas são fortemente induzidas à apoptose pelo TRA-8 sob as condições in vitro.

Λ

Além disso, o efeito anti-tumor in vivo de TRA-8 em camundongos nus transplantados com células WiDr é determinado, porque o 10 TRA-8 não é reativo cruzado com DR5 de murino.

O anti-anticorpo humano de DR5 TRA-8 é administrado aos camundongos nus que carregam xenoenxertos humanos que expressam a molécula DR5 humana. Os camundongos usados foram camundongos BALb/c nus/nus de 6 semanas de idade (fêmeas, da Clea Japan Inc.), que 15 foram transplantados com linhagens celulares de câncer colônico humano WiDr (5 mm³). A um dia depois do transplante do tumor, estes camundongos transplantados são diariamente tratados com a injeção intra-articular de TRA8 (5 pg/corpo) até 14 vezes. O desenvolvimento do tumor WiDr é diariamente determinado pelo tamanho da massa tumoral. Os resultados são mostrados na 20 Tabela 4, abaixo.

. 136

Tabela 4

	8 dias	11 dias	15 dias	18 dias	22 dias	25 dias
Controle (PBS)	196	249	469	584	833	1193
SD	•4» 55	±77	± 149	±230	± 274	± 419
TRA-8	158	97	155	195	365	530
SD	±78	± 30	± 60	±58	±91	± 135

Neste modelo, embora todos os animais não tratados exibissem desenvolvimento de tumor visível, o desenvolvimento do tumor em animais tratados com TRA-8 é inibido como demonstrado pelo tamanho do tumor.

Este resultado indicou que o TRA-8 é eficaz na eliminação de células de tumor in vivo.

Exemplo 25. Estudo de Combinação de TRA-8

A linhagem de célula de câncer prostático humano PC-3 é • obtida da American Tissue Culture Collection (ATCC) e mantida em Mistura

Nutriente F-12K (21127-022, Gibco BRL) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS, Hyclone), 1% de L-Glutamina-200 mM (25030-149, Gibco BRL) e 0,5% de Solução de Penicilina Estreptomicina (P-7539, Sigma). O meio RPM 11640 (MED-008, IWAKI) suplementado com 10% de FBS e 0,5% de Solução de Penicilina Estreptomicina é usado no experimento seguinte. As células PC-3 que se desenvolvem exponencialmente são coletadas pela tripsinização e lavadas duas vezes com meio fresco. As células são depois contadas, recolocadas em suspensão em meio fresco a uma densidade de 5 x 10⁴ células/ml e distribuídas em triplicata em placas de 96 reservatório de fundo chato (3598, Coming-Coster) em um volume total de 100 μΐ/reservatório um dia antes do início do experimento. Um medicamento anticâncer representativo, Paclitaxel (169-18611, Wako) dissolvido em sulfóxido de dimetila (10 mg/ml) é diluído em meio fresco e depois adicionado às placas de 96 reservatórios contendo as células a 50 μΐ/reservatório. As concentrações finais de sulfóxido de dimetila são menores do que 0,1%.

Depois da incubação durante 24 horas a 37°C em atmosfera de CO₂ a 5%, o TRA-8 diluído em meio fresco é adicionado aos reservatórios. Depois da . 137 incubação durante um adicional de 24 horas, 50 μΐ de Meio Essencial Mínimo (11095-098, Gibco BRL) contendo 1 mg/ml de XTT e 25 mM de PMS é adicionado aos reservatórios e as placas são incubadas durante 6 horas. A OD450 é depois medida pelo SPECTRA MAX 250 (Molecular Devices) e a viabilidade celular é calculada como segue.

viabilidade celular (%) = (OD450 para o reservatório contendo células tratadas com Taxol e/ou TRA-8 (agente(s)) - OD450 para o reservatório não contendo células nem agente) x 100 / (OD450 para o reservatório contendo células sem agente - OD450 para o reservatório não contendo células nem agente)

O resultado do ensaio acima para TRA-8 combinado com um medicamento anti-câncer representativo, Paclitaxel, é seguido. O paclitaxel reduziu a viabilidade celular de células PC-3 em mais do que 40% dos sinais indicando que as células viáveis cancerosas ainda permaneceram em concentrações de até 200 nM. Notavelmente, a adição de 0,1 ng/ml de TRA-8 diminuiu enormemente a viabilidade celular das células cancerosas, até 10%, embora nenhuma redução na viabilidade celular é observada depois de uma única aplicação de TRA-8 nesta concentração. Este resultado claramente indica que o TRA-8 exibiu atividade anti-câncer sinergisticamente quando combinado com outros medicamentos anti-câncer.

Exemplo 26. Análise de Outros Anticorpos do Tipo Humanizado de TRA-8 (1) Planejamento de Anticorpos Humanizados

A construção de uma versão humanizada de TRA-8 é realizada pelo método no geral conhecida como enxerto de CDR. O anticorpo mAB58’CL é usado como um aceitador como descrito no Exemplo de Referência 2 e as regiões CDR do anticorpo TRA-8 são enxertadas no aceitador. Na região de estrutura, alguns aminoácidos são enxertados no aceitador a partir de TRA-8 ou seqüências de consenso humanas pelos

13» critérios dados por Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 10029 a 10033, (1989)) e sequências de TRA-8 humanizado são construídas como descrito abaixo.

(2) Construção de Plasmídeo Que Carrega o DNA da Região de Variável de Cadeia Pesada de Outros Tipos de TRA-8 Humanizados ou de Camundongo

Como mostrado na SEQ ID No. 56 da Listagem de Seqüência, a humanização do tipo H1 das sequências de aminoácido da cadeia pesada do anticorpo de DR5 anti-humano de camundongo TRA-8 acarretou substituir o 3^o aminoácido (metionina), o 13° aminoácido (lisina), o 19° aminoácido (lisina), o 40° aminoácido (treonina), o 42° aminoácido (ácido glutâmico), o 44° aminoácido (arginina), o 84° aminoácido (serina), o 88° aminoácido (serina), o 93° aminoácido (metionina), o 114° aminoácido (treonina), o 115° aminoácido (leucina) com glutamina, glutamina, arginina, alanina, glicina, glicina, asparagina, alanina, valina, leucina e valina, respectivamente.

Como mostrado na SEQ ID No. 59 da Listagem de Seqüência, a humanização do tipo H3 das seqüências de aminoácido da cadeia pesada do anticorpo de DR5 anti-humano de camundongo TRA-8 acarretou substituir o 13° aminoácido (lisina), o 19° aminoácido (lisina), o 40° aminoácido (treonina), o 42° aminoácido (ácido glutâmico), o 44° aminoácido (arginina), o 88° aminoácido (serina), o 93° aminoácido (metionina), o 114° aminoácido (treonina), o 115° aminoácido (leucina) com glutamina, arginina, alanina, glicina, glicina, alanina, valina, leucina e valina, respectivamente.

Como mostrado na SEQ ID No. 60 da Listagem de Seqüência, a humanização do tipo H4 das seqüências de aminoácido da cadeia pesada do anticorpo de DR5 anti-humano de camundongo TRA-8 acarretou substituir o 13° aminoácido (lisina), o 19° aminoácido (lisina), o 88° aminoácido (serina), o 93° aminoácido (metionina), o 114° aminoácido (treonina), o 115° aminoácido (leucina) com glutamina, arginina, alanina, valina, leucina e

139 valina, respectivamente.

Como mostrado na SEQ ID No. 61 da Listagem de Seqüência, o plasmídeo que carrega o DNA da região variável da cadeia pesada do TRA8 quimérico é designado como “tipo M”. Além disso, o TRA-8 humanizado 5 descrito nos Exemplos 17 e 18 é designado como “tipo H2”.

Os plasmídeos que carregam o DNA que codifica a região variável da cadeia pesada de TRA-8 humanizado ou quimérico são construídos como segue.

A PCR é usada para construir as seguintes seqüências de

DNA, cada uma das quais compreendeu o descrito acima:

Os seguintes 24 oligonucleotídeos são sintetizados:

» 5’-ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac-3’ (A; SEQ ID No. 32);

5’-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg-3’ (B; SEQ ID No. 33);

5’-tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg-3’ (B2; SEQ ID No. 57);

5’-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaa ctctcctgtg cagcctctgg-3’ (B3; SEQ ID No. 66);

5’-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta-3 ’ (C; SEQ ID No. 34);

5’-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggctgga gtgggttgca accattagta-3’ (C2; SEQ ID No. 64);

5’-gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg-3’ (D; SEQ ID No. 35);

5’-tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3’ (E; SEQ ID No. 36);

5’-tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3’ (E2; SEQ ID No. 62);

140

5’-tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3’ (E3; SEQID No. 67);

5’-ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc3’ (F; SEQIDNo. 37);

5’-ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc3’(F2; SEQ ID No. 68);

5’-ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa-3’ (G; SEQ ID No. 38);

5’-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3* (H; SEQ ID No. 39);

5’-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3’ (H2; SEQ ID No. 58);

5’-tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3’ (H3; SEQ ID No. 69);

5’-tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag-3’ (1; SEQ ID No. 40);

5’-tccagcctct tctctggagt ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag-3’ (12; SEQ ID No. 65);

5’-ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt tgcaacccac-3’ (J; SEQ ID No. 41);

5’-ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3’ (K; SEQ ID No. 42);

5’-ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3’ (K2; SEQ ID No. 63);

5’-ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3’ (K3; SEQ ID No. 70);

5’-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc-3’ (L; SEQ ID No. 43) e

5’-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccctt ggccccagta

14t gtccgtcgta atcatagagt cacc-3’ (L2; SEQ ID No. 71).

Os seguintes 2 Preparadores de PCR são sintetizados como descrito acima:

5’-ttggataagc ttggcttgac-3’ (Pl; SEQ ID No. 44); e 5’-gaccgatggg cccttggtgg a-3’ (P2; SEQ ID No. 45).

A síntese de DNA do tipo H1 que codifica uma cadeia de polipeptídeo que compreende uma seqüência de sinal de secreção, uma região variável de cadeia pesada de TRA-8 humanizado e os 8 resíduos de aminoácido no término N da região IgG-CHl é realizada usando uma combinação de PCR respectivamente.

O fragmento de DNA do tipo H1 é preparado como segue.

Composição da solução de reação de PCR: oligonucleotídeo A, lOpmol;

oligonucleotídeoB2, lOpmol;

oligonucleotídeo C, 10 pmol;

oligonucleotídeo D, 10 pmol;

oligonucleotídeo E, 10 pmol;

oligonucleotídeo F, 10 pmol;

oligonucleotídeo G, 10 pmol;

oligonucleotídeo H2, 10 pmol;

oligonucleotídeo I, 10 pmol;

oligonucleotídeo J, 10 pmol;

oligonucleotídeo K, 10 pmol;

oligonucleotídeo L, 10 pmol;

preparador de oligonucleotídeo Pl, 2 μΜ;

preparador de oligonucleotídeo P2, 2 μΜ;

tampão 10 x Pyrobest II, 10 μΐ;

mistura de dNTP, 8 μΐ;

Pyrobest DNA polimerase, 0,5 μΐ; e

142

Água redestilada até um volume final de 50 pl.

A reação de PCR é conduzida como segue. A solução é primeiro aquecida a 94°C durante 5 minutos, depois do que um ciclo de aquecimento a 98°C durante 10 segundos, 55°C durante 30 segundos e 72°C durante 1 minuto, é repetido 7 vezes. Depois da conclusão deste procedimento, a solução de reação é aquecida a 72°C durante 15 minutos.

Depois da extração com fenol e precipitação com etanol, o precipitado de DNA resultante é secado a vácuo, dissolvido em um mínimo de água redestilada e separado pela eletroforese a 3% em gel de agarose. Depois da eletroforese, o gel é tingido com uma solução aquosa a 1 pg/ml de brometo de etídio para permitir a detecção de DNA sob luz UV. As faixas de DNA que corresponde ao DNA tipo H1 são cortadas usando uma lâmina de barbear e eluídas a partir do gel usando o Kit Geneclean Spin (BIO 101, CA, USA). Depois da extração com fenol, o DNA eluído é depois concentrado pela centriíugação a 7.500 x g, seguido pela precipitação com etanol e finalmente dissolvido em 5 pl de água destilada.

A síntese de DNA do tipo H3 que codifica uma cadeia de polipeptídeo que compreende uma seqüência de sinal de secreção, uma região variável de cadeia pesada de TRA-8 humanizado e os 8 resíduos de aminoácido no término N da região IgG-CHl é realizada usando uma combinação de PCR respectivamente.

O fragmento de DNA do tipo H3 é preparado como segue. Composição da solução de reação de PCR:

oligonucleotídeo A, 10 pmol; oligonucleotídeo B, 10 pmol;

oligonucleotídeo C, 10 pmol; oligonucleotídeo D, 10 pmol, oligonucleotídeo E2, 10 pmol;

oligonucleotídeo F, 10 pmol;

143 oligonucleotídeo G, 10 pmol; oligonucleotídeo H, 10 pmol;

oligonucleotídeo I, 10 pmol; oligonucleotídeo J, 10 pmol;

oligonucleotídeo K2,10 pmol;

oligonucleotídeo L, 10 pmol;

preparador de oligonucleotídeo Pl, 2 μΜ; preparador de oligonucleotídeo P2, 2 μΜ;

tampão 10 x Pyrobest II, 10 μΐ;

mistura de dNTP, 8 μΐ;

Pyrobest DNA polimerase, 0,5 μΐ; e

Água redestilada até um volume final de 50 μΐ.

A reação de PCR é conduzida como segue. A solução é primeiro aquecida a 94°C durante 5 minutos, depois do que um ciclo de aquecimento a 98°C durante 10 segundos, 55°C durante 30 segundos e 72°C durante 1 minuto, é repetido 7 vezes. Depois da conclusão deste procedimento, a solução de reação é aquecida a 72°C durante 15 minutos.

Depois da extração com fenol e precipitação com etanol, o precipitado de DNA resultante é secado a vácuo, dissolvido em um mínimo de água redestilada e separado pela eletroforese a 3% em gel de agarose. Depois da eletroforese, o gel é tingido com uma solução aquosa a 1 pg/ml de brometo de etídio para permitir a detecção de DNA sob luz UV. As faixas de DNA que corresponde ao DNA tipo H3 são cortadas usando uma lâmina de barbear e eluídas a partir do gel usando o kit Geneclean Spin. Depois da extração com fenol, o DNA eluído é depois concentrado pela centrifugação a

7.500 x g, seguido por precipitação com etanol e finalmente dissolvido em 5 μΐ de água destilada.

A síntese de DNA do tipo H4 que codifica uma cadeia de polipeptídeo que compreende uma seqüência de sinal de secreção, uma região

144

	variável da cadeia pesada de TRA-8 humanizado e os 8 resíduos de aminoácido no término N da região IgG-CHl é realizada usando uma combinação de PCR respectivamente. O fragmento de DNA do tipo H4 é preparado como segue.
5	Composição da solução de reação de PCR: oligonucleotídeo A, 10 pmol; oligonucleotídeo B, 10 pmol; oligonucleotídeo C2, 10 pmol; oligonucleotídeo D, 10 pmol;
10 w A	oligonucleotídeo E2, 10 pmol; oligonucleotídeo F, 10 pmol;
4	oligonucleotídeo G, 10 pmol; oligonucleotídeo H, 10 pmol; oligonucleotídeo 12,10 pmol;
15	oligonucleotídeo J, 10 pmol; oligonucleotídeo K2,10 pmol; oligonucleotídeo L, 10 pmol; preparador de oligonucleotídeo Pl, 2 μΜ; preparador de oligonucleotídeo P2, 2 μΜ;
20	Tampão 10 x Pyrobest II, 10 μΐ; mistura de dNTP, 8 μΐ; Pyrobest DNA polimerase, 0,5 μΐ; e Água redestilada até um volume final de 50 μΐ. A reação de PCR é conduzida como segue. A solução é
25	primeiro aquecida a 94°C durante 5 minutos, depois do que um ciclo de aquecimento a 98°C durante 10 segundos, 55°C durante 30 segundos e 72°C durante 1 minuto, é repetido 7 vezes. Depois da conclusão deste procedimento, a solução de reação é aquecida a 72°C durante 15 minutos. Depois da extração com fenol e a precipitação com etanol, o

145 precipitado de DNA resultante é secado a vácuo, dissolvido em um mínimo de água redestilada e separada pela eletroforese a 3% em gel de agarose. Depois da eletroforese, o gel é tingido com uma solução aquosa a 1 μg/nll de brometo de etídio para permitir a detecção de DNA sob luz UV. As faixas de 5 DNA que correspondem ao DNA do tipo H4 são cortadas usando uma lâmina de barbear e eluídas a partir do gel usando o Kit Geneclean Spin. Depois da extração com fenol, o DNA eluído é depois concentrado pela centrifiigação a

7.500 x g, seguido por precipitação com etanol e finalmente dissolvido em 5 μΐ de água destilada.

A síntese de DNA do tipo M que codifica uma cadeia de * polipeptídeo que compreende uma seqüência de sinal de secreção, uma região * variável de cadeia pesada de TRA-8 quimérico e os 8 resíduos de aminoácido no término N da região IgG-CHl é realizada usando uma combinação de PCR respectivamente.

O fragmento de DNA do tipo M é preparado como segue.

Composição da solução de reação de PCR:

oligonucleotídeo A, 10 pmol; oligonucleotídeo B3, 10 pmol; oligonucleotídeo C2, 10 pmol;

oligonucleotídeo D, 10 pmol;

oligonucleotídeo E3, 10 pmol; oligonucleotídeo F2, 10 pmol; oligonucleotídeo G, 10 pmol; oligonucleotídeo H3, 10 pmol;

oligonucleotídeo 12,10 pmol;

oligonucleotídeo J, 10 pmol; oligonucleotídeo K3,10 pmol; oligonucleotídeo L2,10 pmol; preparador de oligonucleotídeo Pl, 2 μΜ;

146 preparador de oligonucleotídeo P2, 2 μΜ;

tampão 10 x Pyrobest II, 10 μΐ;

mistura de dNTP, 8 μΐ;

Pyrobest DNA polimerase, 0,5 μΐ; e água redestilada até um volume final de 50 μΐ.

A reação de PCR é conduzida como segue.

A solução é primeiro aquecida a 94°C durante 5 minutos, depois do que um ciclo de aquecimento a 98°C durante 10 segundos, 55°C durante 30 segundos e 72°C durante 1 minuto, é repetido 7 vezes. Depois da conclusão deste procedimento, a solução de reação é aquecida a 72°C durante 15 minutos.

Depois da extração com fenol e precipitação com etanol, o precipitado de DNA resultante é secado a vácuo, dissolvido em um mínimo de água redestilada e separada pela eletroforese a 3% em gel de agarose. Depois da eletroforese, o gel é tingido com uma solução aquosa de 1 pg/ml de brometo de etídio para permitir a detecção de DNA sob luz UV. As faixas de DNA que correspondem ao DNA do tipo M são cortadas usando uma lâmina de barbear e eluídas a partir do gel usando o Kit Geneclean Spin. Depois da extração com fenol, o DNA eluído é depois concentrado pela centriíugação a

7.500 x g, seguido por precipitação com etanol e finalmente dissolvido em 5 μΐ de água destilada.

Cada DNA extraído, resultante (tipo Hl, tipo H3, tipo H4 e tipo M) é clonado usando o vetor pGEM-T Easy (Promega) como segue:

O fragmento de DNA recuperado da reação de PCR (Hl, H3, H4 ou M), 5 μΐ;

tampão 10 x Taq polimerase, 1 μΐ;

dNTP mistura, 1 μΐ

Taq polimerase (5 unidade/ml), 1 μΐ; e água redestilada até um volume final de 10 μΐ.

147

Depois que cada solução acima é reagida a 70°C durante 30 minutos, cada solução de DNA e o vetor pGEM-T Easy são ligados usando um Kit de Ligação de DNA Versão 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) usando o protocolo do fabricante.

Depois de 4 horas de incubação a 15°C, 2 μΐ da solução de reação incubada são misturados com 100 μΐ da cepa E. coli competente JM109 a uma densidade de célula de 1 a 2 χ 10⁹ células/ml (Takara Shuzo Co., Ltd.) e a mistura é mantida em gelo durante 30 minutos, depois a 42°C durante 30 segundos e mais uma vez em gelo durante 1 minuto. Depois, 500 μΐ de meio SOC (2% v/v de triptona, 0,5% p/v de extrato de levedura, 0,05% p/v de cloreto de sódio, 2,5 mM p/v de cloreto de potássio, 1 mM de cloreto de magnésio e 20 mM de glicose) são adicionados à mistura, que é incubada por mais uma hora, com agitação. As cepas transformantes são depois isoladas e o DNA plasmídico é preparado a partir das cepas como descrito em “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”. A seqüência de nucleotídeo deste DNA que codifica a cadeia pesada de TRA-8 humanizado ou de camundongo é confirmada pelo método de didesóxi, respectivamente (Sanger, F. S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74: 5463 a 5467) usando o Analisador de DNA 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japão).

O plasmídeo resultante é designado pHA15 (o plasmídeo que carrega cDNA que codifica a cadeia pesada do tipo H1 de TRA-8 humanizado), pHClO (o plasmídeo que carrega o cDNA que codifica a cadeia pesada do tipo H3 do TRA-8 humanizado), pHD21 (o plasmídeo que carrega o cDNA que codifica a cadeia pesada do tipo H4 do TRA-8 humanizado) e pMll (o plasmídeo que carrega o cDNA que codifica a cadeia pesada de TRA-8 quimérico). As cepas de E coli transformante que abriga este plasmídeo, designadas como E. coli JM109/pHA15, E. coli JM109/pHC10, E. coli JM109/pHD21 e E. coli JM109/pMll foram depositado com o

148

Intemational Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japão em 20 de abril de 2001, de acordo com o Tratado de Budapest para o Depósito de Microorganismos e foi concedido o número de acesso FERM BP-7555, FERM BP-7557, FERM BP-7558 e FERM BP-7559, respectivamente.

(3) Construção de Plasmídeos de Expressão Que Carregam o DNA da Região Variável de Cadeia Pesada de Diversos Tipos de TRA-8 Humanizado ou de Camundongo

O vetor de expressão recombinante para as células de animal é construído inserindo-se o DNA que codifica a cadeia pesada do TRA-8 do tipo Hl, tipo H3 e tipo H4 humanizados ou tipo M quimérico (clonados acima) como segue.

Um pg do plasmídeo pSRHHH3 (Pedido de patente europeu EP 0 909 816 Al) que carrega a região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal anti-Fas humanizado HFE7A e o DNA genômico da região constante da IgGl humana, um vetor de expressão para células de mamífero, é digerido com as enzimas de restrição HindIII e Apal e separado pela eletroforese a 3% em gel de agarose. Depois da eletroforese, o gel é tingido com uma solução aquosa 1 pg/ml de brometo de etídio para permitir a detecção de DNA sob luz UV. As faixas de DNA do vetor contendo o DNA genômico da região constante da IgGl humana sem a região variável da cadeia pesada de HFE7A humanizado são cortadas usando uma lâmina de barbear e eluídas a partir do gel usando o Kit Geneclean Spin. Depois da extração com fenol, o DNA eluído é depois concentrado pela centrifugação a

7.500 x g, seguido pela precipitação com etanol e finalmente dissolvido em 5 pl de água destilada e depois desfosforilado usando CIP. O plasmídeo digerido, desfosforilado resultante (100 ng) é ligado com 1 pg do fragmento de DNA de pHA15, pHClO, pHD21 ou pMl 1 contendo o DNA que codifica

149 a região variável da cadeia pesada de TRA-8 humanizado ou quimérico, que também foi digerido com HindIII e Apal, usando um Kit de ligação de DNA Versão 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). A mistura de ligação é depois usada para transformar a E. coli JM 109, que é depois plaqueada em placas de LB ágar contendo 50 pg/ml de ampicilina.

Os transformantes obtidos por estes métodos são cultivados em 2 ml de meio LB líquido contendo 50 pg/ml de ampicilina a 37°C durante a noite e o DNA plasmídico é subsequentemente extraído da cultura resultante pelo método alcalino-SDS.

O DNA plasmídico extraído é digerido com HindIII e Apal e submetido à eletroforese em gel de agarose a 3% p/v para confirmar a presença ou ausência do inserto do DNA que codifica a região variável da cadeia pesada de TRA-8 humanizado ou quimérico. A inserção e orientação do fragmento desejado de DNA no vetor são confirmadas pelo seqüenciamento de DNA usando um analisador de seqüência de gene (Analisador de DNA ABI Prism 3700; Applied Biosystems). Os plasmídeos de expressão resultantes que carregam o cDNA que codifica a cadeia pesada de TRA-8 humanizado ou quimérico foram designados pHA15-l, pHC10-3, pHD21 -1 e pM 11-1, respectivamente.

(4) Construção de Vetores para as Cadeia Leves Humanizadas (4.1) Construção de um Vetor de Expressão para a Cadeia Leve do Anticorpo Humanizado (tipo LM1)

Como mostrado na SEQ ID No. 72 da Listagem de Seqüência, outra humanização (tipo LM1) das seqüências de aminoácido da cadeia leve do anticorpo de DR5 anti-humano de camundongo TRA-8 acarreta substituir o 3^o aminoácido (valina), 8° aminoácido (histidina), 9^o aminoácido (lisina), 10° aminoácido (fenilalanina), 11° aminoácido (metionina), 13° aminoácido (treonina), 20° aminoácido (serina), 42° aminoácido (glutamina), 43° (serina), 60° aminoácido (ácido aspártico), 63° aminoácido (treonina), 77° aminoácido

150 (asparagina), 78° aminoácido (valina), 80° aminoácido (serina) 83° aminoácido (leucina), 85° aminoácido (ácido aspártico), 87° aminoácido (fenilalanina) e 99° aminoácido (glicina) 103° aminoácido (leucina) e 108° aminoácido (alanina) a partir do Término N da seqüência de aminoácido da cadeia leve de TRA-8 são substituídos com glutamina, prolina, serina, serina, leucina, alanina, treonina, lisina, alanina, serina, serina, serina, leucina, prolina, fenilalanina, treonina, tirosina, glutamina, valina e treonina respectivamente. A seqüência resultante é designada LM1.

Os plasmídeos de expressão que carregam este tipo de seqüências de aminoácido de cadeia leve humanizada do anticorpo de DR5 anti-humano TRA-8 (tipo LM1, SEQ ID No. 72 da Listagem de Seqüência) são construídos como segue.

1) Síntese de preparadores para preparar as regiões variável e constante da cadeia leve de TRA-8 humanizado (tipo LM1)

O DNA que codifica a cadeia de polipeptídeo de LM1 (SEQ ID No. 72 da Listagem de Seqüência), cada um dos quais é uma fusão da região variável da cadeia leve do anticorpo anti-DR5 humanizado TRA-8 (tipo LM1) e a região constante da cadeia leve de Ig humano (cadeia k), são respectivamente sintetizadas usando-se combinações de PCR.

Além disso para 7AL1P (SEQ ID No. 47), 7ALCN (SEQ ID No. 48), HKCDF11 (SEQ ID No. 50), HKCDR12 (SEQ ID No. 51), HKCDF22 (SEQ ID No. 52), HKCDR22 (SEQ ID No. 53) e HKCF12 (SEQ ID No. 54).

Os seguintes preparadores de oligonucleotídeo são sintetizados para a PCR:

5’-gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga-3’ (HKSPR12; SEQ ID No. 77).

2) Construção de plasmídeo pCR3.1/LMl-2 (clonagem da cadeia leve do TRA-8 humanizado tipo LM1)

151

O fragmento de LM 1-DNA que codifica a seqüência de aminoácido como definida na SEQ ID No. 72 da mesma é preparado realizando-se a PCR de 2 etapas, inserido em um vetor plasmídico e clonado na E. coli.

a) Primeira etapa de PCR

O fragmento de LM1-F1-DNA que codifica uma seqüência de sinal de secreção e uma porção da região FRLi com um sítio de divagem de enzima de restrição HindlII adicionado à extremidade 5’ é preparado sob as seguintes condições. Os plasmídeos padrão, pHSGHM17 e pSRPDHH, são obtido seguindo-se a descrição em um Pedido de patente europeu EP 0 909 816 Al.

Composição da solução de reação:

DNA do plasmídeo pHSGHM17, 25 ng preparador de oligonucleotídeo 7AL1P, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo HKSPR12, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOxPCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase (PerkinElmer), 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

O fragmento de LM1-F2-DNA que codifica uma porção de FRLI, CDRLI, FRL2 e CDRL2 é preparado sob as seguintes condições. Composição da solução de reação:

DNA do plasmídeo pL28, 25 ng

152 preparador de oligonucleotídeo HKCDF11, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo HKCDR12, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOxPCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

O fragmento de LMI-F3-DNA que codifica CDRL2, FRL3 e uma porção de CDRL3 é preparado sob as seguintes condições.

Composição da solução de reação:

DNA do plasmídeo pSRPDHH, 25 ng preparador de oligonucleotídeo HKCDF22, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo HKCDR22, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOxPCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

O fragmento de LM1-F4-DNA que codifica CDRL3, FRL4 e a

153 região constante com um sítio de divagem de enzima de restrição EcoRI adicionado à extremidade 3’ é preparado sob as seguintes condições.

Composição da solução de reação:

DNA do plasmídeo pSRPDHH, 25 ng preparador de oligonucleotídeo HKCF12, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo 7ALCN, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOxPCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

Os fragmentos de DNA amplificados depois da PCR são separados pela eletroforese em gel de poliacrilamida a 5%. O gel depois da eletroforese é tingido com 1 pg/ml de brometo de etídio para detectar o DNA produzido sob luz UV. As faixas de DNA respectivas assim detectadas são excisadas com uma lâmina de barbear

b) Segunda etapa de PCR

LM 1-DNA no qual os fragmentos de LM1-F1-DNA, LM1-F2DNA, LM1-F3DNA e LM1-F4-DNA acima descritos são fundidos é preparado sob as seguintes condições.

Composição da solução de reação:

Fragmento de gel de LM1-F1-DNA preparado na primeira etapa de PCR,

Fragmento de gel de LM1-F2-DNA preparado na primeira ' 154 etapa de PCR,

Fragmento de gel de LM1-F3-DNA preparado na primeira etapa de PCR,

Fragmento de gel de LM1-F4-DNA preparado na primeira etapa de PCR preparador de oligonucleotídeo 7AL1P, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo 7ALCN, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5,0 μΐ tampão lOxPCR, 5,0 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

O fragmento LM 1-DNA assim preparado é inserido no plasmídeo pCR3.1DNA usando o kit de clonagem Eukaryotic TA (InVitrogen) seguindo o protocolo do fabricante e introduzido na E. coli competente TOP10F’ contido no kit. As seqüências de nucleotídeo destes DNAs que codificam a cadeia leve de TRA-8 humanizado (tipo LM1) são confirmadas pelo método de didesóxi (Sanger, F. S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74: 5463 a 5467) usando o Analisador de DNA 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japão).

Os plasmídeos resultantes são designados pCR3.1/LMl-2 (o plasmídeo que carrega cDNA que codifica a região variável da cadeia leve do TRA-8 humanizado (tipo LM1) e uma região constante de cadeia leve da Ig humana).

15*5

O plasmídeo pCR3.1/LMl-2 obtido contendo o fragmento LM 1-DNA é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I.

Um pg de DNA do plasmídeo de clonagem pHSG399 é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I e depois desfosforilado com CIP. O pHSG399 DNA desfosforilado resultante e o fragmento LM 1-DNA, que foi digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I, são ligados usando o Kit de ligação de DNA Versão 2.0 (Takara Shuzo, Co. Ltd.). Depois, a E. coli DH5a é transformada com o DNA ligado e espalhada sobre meio LB ágar contendo 0,1 mM de IPTG, 0,1% de X-Gal e 50 pg/ml de cloranfenicol (concentrações finais). Os transformantes brancos obtidos são cultivados em meio LB líquido contendo 50 pg/ml de cloranfenicol e DNA plasmídico é extraído da cultura resultante de acordo com o método alcalino-SDS. O DNA plasmídico extraído é digerido com Hind III e EcoR I e depois um clone que carrega o fragmento LM 1-DNA é selecionado pela eletroforese a 1% em gel de agarose.

Como um resultado do procedimento acima, o plasmídeo pHSG/M 1-2-2 que carrega um fragmento de fusão da região variável da cadeia leve LM1 TRA-8 humanizado e a região constante de cadeia IgK humana é obtida. A cepa transformante da E. coli que abriga este plasmídeo, designado como E. coli DH5a/pHSG/M 1-2-2 foi depositada com o International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japão em 20 de abril de 2001, de acordo com o Tratado de Budapest para o Depósito de Microorganismos e foi concedido o número de acesso FERM BP-7562.3)

3) Construção do plasmídeo pSR/LMl-2 (plasmídeo de expressão para a cadeia leve de LM1 TRA-8 humanizado)

O plasmídeo pHSG/M 1-2- obtido que carrega um fragmento de fusão da região variável da cadeia leve LM1 TRA-8 humanizado e a região

1$6 constante da cadeia IgK humana é digerida com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I.

Um pg do DNA do plasmídeo de clonagem pSRPDHH (Pedido de patente europeu EP 0 909 816 Al) é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I e depois desfosforilado com CIP. O DNA de pSRPDHH desfosforilado resultante e o fragmento de DNA HindIII-EcoRI obtido de pHSG/M 1-2-2 são ligados usando o Kit de ligação de DNA Versão 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Depois, a E. coli DH5a é transformada com o DNA ligado e espalhada sobre LB ágar. Os transformantes obtidos são cultivados em meio LB líquido contendo 100 pg/ml de ampicilina e o DNA plasmídico é extraído da cultura resultante de acordo com o método alcalinoSDS. A inserção e orientação do fragmento desejado de DNA no vetor pSRPDHH são confirmadas pelo seqüenciamento de DNA usando um analisador de seqüência de gene.

O plasmídeo de expressão resultante que carrega o cDNA que codifica a cadeia leve de LM1 TRA-8 humanizado é designado pSR/LMl-2.

(4.2) Construção de um Vetor de Expressão para a Cadeia Leve do Anticorpo Humanizado (tipo LM3)

Como mostrado na SEQ ID No. 73 da Listagem de Seqüência, outra humanização (tipo LM3) das seqüências de aminoácido da cadeia leve do anticorpo de DR5 anti-humano de camundongo TRA-8 acarreta substituir o 8^o aminoácido (histidina), 9^o aminoácido (lisina), 10° aminoácido (fenilalanina), 11° aminoácido (metionina), 13° aminoácido (treonina), 20° aminoácido (serina), 42° aminoácido (glutamina), 43° aminoácido (serina), 77° aminoácido (asparagina), 78° aminoácido (valina), 80° aminoácido (serina) 83° aminoácido (leucina), 85° aminoácido (ácido aspártico), 87° aminoácido (fenilalanina), 99° aminoácido (glicina) 103° aminoácido (leucina) e 108° aminoácido (alanina) a partir do término N da seqüência de aminoácido da cadeia leve de TRA-8 são substituídos com prolina, serina,

157 serina, leucina, alanina, treonina, lisina, alanina, serina, leucina, prolina, fenilalanina, treonina, tirosina, glutamina, valina e treonina, respectivamente. A seqüência resultante é designada LM3.

Os plasmídeos de expressão que carregam este tipo de seqüências de aminoácido de cadeia leve humanizada do anticorpo antihumano de DR5 TRA-8 (tipo LM3, SEQ ID No. 73 da Listagem de Seqüência) são construídas como segue.

1) Síntese de preparadores para preparar as regiões variável e constante da cadeia leve de LM3 TRA-8 humanizado

O DNA que codifica a cadeia de polipeptídeo LM3 (SEQ ID

No. 73 da Listagem de Seqüência), cada uma das quais é uma fusão da região variável da cadeia leve de TRA-8 de anticorpo anti-DR5 humanizado e a região constante da cadeia leve de Ig humana (cadeia k), são respectivamente sintetizados usando-se combinações de PCR.

Além disso para 7AL1P (SEQ ID No. 47) e 7ALCN (SEQ ID

No. 48), os seguintes preparadores de oligonucleotídeo são sintetizados para PCR:

5’-atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt ccagg-3’ (MOD1F1; SEQ ID No. 78);

5’-cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgctt cttaagctt3’ (MOD1R1; SEQ ID No. 79);

5’-ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga cagggtc-3’ (MOD1F22; SEQ ID No. 80);

5’-acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag-3’ (MOD1R22; SEQ ID No. 81);

5’-accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa ccaggaa-3’ (MOD1F3; SEQ ID No. 82);

5’-tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacaga tgcagacaaa ga-3’ (MOD1R3; SEQ ID No. 83);

15*8

5’-aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggt ttacaggcag t-3 ’ (MOD1F42; SEQ ID No. 84);

5’-cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgcttttc ctggtttctg ttggtaccag gc-3’ (MOD1R4; SEQ ID No. 85);

5’-gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc tat-3’ (MOD1F5; SEQ ID No. 86);

5’-actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac-3’ (MOD1R52; SEQ ID No. 87);

5’-tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc,-3’ (MOD1F6; SEQ ID, No. 88);

’-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac-3’ (MOD1R6; SEQ ID No. 89)

5’-aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g-3’ (MOD1F7; SEQ ID No. 90);

5’-gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc gaa,-3’ (MOD1R7; SEQ ID No. 91); e

5’-agatttcaac tgctcatcag atggrgggaa (LR17; SEQ ID No. 101).

2) Construção de plasmídeo pCR3.1ZLM3-3-44 (clonagem da cadeia leve de TRA-8 humanizado tipo LM3)

O fragmento LM3-DNA que codifica a seqüência de aminoácido como definida na SEQ ID No. 73 da mesma é preparado 5 realizando-se PCR de 2 etapas, inserida em um vetor plasmídico e clonada na

E. coli.

a) Primeira etapa de PCR

O fragmento LM3-F31B-DNA que codifica uma região de seqüência de sinal de secreção com um sítio de divagem de enzima de 10 restrição HindIII adicionado à extremidade 5’, FRL] CDRL_b FRL₂ e CDRL₂, FRL₃, CDRL₃, FRL₄ e uma porção da região constante é preparado sob as seguintes condições.

15*9

Composição da solução de reação:

preparador de oligonucleotídeo MOD1F1, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R1, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F22, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R22, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F3, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R3, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F42, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R4, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F5, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R52, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F6, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R6, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F7, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R7, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo 7AL1P, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo LR17, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOx PCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

O fragmento LM3-F31C-DNA que codifica uma porção da região constante com um sítio de clivagem de enzima de restrição EcoRI ' lóO adicionado na extremidade 3’ é preparado sob as seguintes condições.

O plasmídeo padrão, pSRPDHH, é obtido seguindo-se a descrição em um Pedido de patente europeu EP 0 909 816 Al.

Composição da solução de reação:

DNA plasmídico de pSRPDHH, 25 ng preparador de oligonucleotídeo MOD1F7, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo 7ALCN, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOxPCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

Os fragmentos de DNA amplificados depois da PCR são separados pela eletroforese a 5% em gel de poliacrilamida. O gel depois da eletroforese é tingido com 1 pg/ml de brometo de etídio para detectar o DNA produzido sob luz UV. As faixas de DNA respectivas assim detectadas são excisadas com uma lâmina de barbear.

b) Segunda etapa de PCR

O LM3-DNA em que os fragmentos LM3-F31B-DNA e LM3F31C-DNA descritos acima são fundidos é preparado sob as seguintes condições. Composição da solução de reação:

Fragmento de gel de LM3-F31B-DNA preparado na primeira etapa de PCR,

Fragmento de gel de LM3-F31C-DNA preparado na primeira etapa de PCR, lól preparador de oligonucleotídeo 7AL1P, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo 7ALCN, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5,0 μΐ tampão lOx PCR, 5,0 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

O fragmento LM3-DNA assim preparado é inserido no plasmídeo pCR3.1DNA usando o kit de clonagem Eukaryotic TA (InVitrogen) seguindo o protocolo do fabricante e introduzido na E. coli competente TOP10F’ contida no kit. As seqüências de nucleotídeo destes DNAs que codificam a cadeia leve de LM3 TRA-8 humanizado são confirmadas pelo método de didesóxi (Sanger, F. S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74: 5463 a 5467) usando o Analisador de DNA 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japão).

Os plasmídeos resultantes são designados pCR3.1/LM3-3-44 (o plasmídeo que carrega o cDNA que codifica a região variável da cadeia leve do LM3 TRA-8 humanizado e uma região constante de cadeia leve da Ig humana).

O plasmídeo obtido pCR3.1/LM3-3-44 contendo o fragmento LM3-DNA é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I.

Um pg do plasmídeo de clonagem pHSG399 DNA é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I e depois desfosforilado com CIP. O pHSG399 DNA desfosforilado resultante e o fragmento LM3-DNA,

- 1Ô2 que foi digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I, são ligados usando o Kit de ligação de DNA Versão 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Depois, a E. coli DH5a é transformadas com o DNA ligado e espalhada sobre meio LB ágar contendo 0,1 mM de IPTG, 0,1% X-Gal e 50 pg/ml de cloranfenicol (concentrações finais). Os transformantes brancos obtidos são cultivados em meio LB líquido contendo 50 pg/ml de cloranfenicol e o DNA plasmídico é extraído da cultura resultante de acordo com o método alcalinoSDS. O DNA plasmídico extraído é digerido com Hind III e EcoR I e depois um clone que carrega o fragmento LM3-DNA é selecionado pela eletroforese em gel de agarose a 1%.

Como um resultado do procedimento acima, o plasmídeo pHSG/M3-3-22 que carrega um fragmento de fusão da região variável da cadeia leve do LM3 TRA-8 humanizado e a região constante da cadeia IgK humana é obtido. A cepa transformante da E. coli que abriga este plasmídeo, designado como E. coli DH5a/pHSG/M3-3-22 foi depositado com o Intemational Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japão em 20 de abril de 2001, de acordo com o Tratado de Budapest para o Depósito de Microorganismos e foi concedido o número de acesso FERM BP-7564.

3) Construção do plasmídeo pSR/LM3-3-44-10 (plasmídeo de expressão para a cadeia leve do LM3 TRA-8 humanizado)

O plasmídeo pHSG/M3-3-22 obtido que carrega um fragmento de fusão da região variável da cadeia leve do LM3 TRA-8 humanizado e a região constante da cadeia IgK humana é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I.

Um pg do DNA do plasmídeo de clonagem pSRPDHH (Pedido de patente europeu EP 0 909 816 Al) é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I e depois desfosforilado com CIP. O DNA de ' 1Ó3 pSRPDHH desfosforilado resultante e o fragmento de DNA HindIII-EcoRI obtido de pHSG/M3-3-22 são ligados usando o Kit de ligação de DNA Versão 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Depois, a E. coli DH5a é transformada com o DNA ligado e espalhada sobre LB ágar. Os transformantes obtidos são cultivados em meio LB líquido contendo 100 pg/ml de ampicilina e o DNA plasmídico é extraído da cultura resultante de acordo com o método alcalinoSDS. A inserção e orientação do fragmento desejado de DNA no vetor pSRPDHH é confirmada pelo seqüenciamento de DNA usando um analisador de seqüência de gene (Analisador de DNA ABI Prism 3700; Applied Biosystems).

O plasmídeo de expressão resultante que carrega cDNA que codifica a cadeia leve de LM3 TRA-8 humanizado é designado pSR/LM3-344-10.

(4.3) Construção de um Vetor de Expressão para a Cadeia Leve do Anticorpo Humanizado (tipo LM4)

Como mostrado na SEQ ID No. 74 da Listagem de Seqüência, outra humanização (tipo LM4) das seqüências de aminoácido da cadeia leve do anticorpo de DR5 anti-humano de camundongo TRA-8 acarreta substituir o 8^o aminoácido (histidina), 9^o aminoácido (lisina), 10° aminoácido (fenilalanina), 11° aminoácido (metionina), 13° aminoácido (treonina), 20° aminoácido (serina), 42° aminoácido (glutamina), 43° aminoácido (serina), 77° aminoácido (asparagina), 78° aminoácido (valina), 80° aminoácido (serina) 83° aminoácido (leucina), 85° aminoácido (ácido aspártico), 99° aminoácido (glicina) 103° aminoácido (leucina) e 108° aminoácido (alanina) a partir do término N da seqüência de aminoácido da cadeia leve de TRA-8 são substituídos com prolina, serina, serina, leucina, alanina, treonina, lisina, alanina, serina, leucina, prolina, fenilalanina, treonina, glutamina, valina e treonina respectivamente. A seqüência resultante é designada LM4.

Os plasmídeos de expressão que carregam este tipo de ' ld4 seqüência de aminoácido da cadeia leve humanizada do anticorpo antihumano de DR5 TRA-8 (tipo LM4) (SEQ ID No. 74 da Listagem de Seqüência) são construídos como segue.

1) Síntese de preparadores para preparar as regiões variável e constante da cadeia leve de LM4 TRA-8 humanizado

O DNA que codifica a cadeia de polipeptídeo LM4 (SEQ ID No. 74 da Listagem de Seqüência), cada uma das quais é uma fusão da região variável de da cadeia leve do anticorpo anti-DR5 de TRA-8 humanizado e a região constante da cadeia leve de Ig humana (cadeia k), são respectivamente sintetizados usando-se combinações de PCR.

Além disso para 7AL1P (SEQ ID No. 47), 7ALCN (SEQ ID No. 48), MOD1F1 (SEQ ID No. 78), M0D1R1 (SEQ ID No. 79), MOD1F22 (SEQ ID No. 80), MOD1R22 (SEQ ID No. 81), MOD1F3 (SEQ ID No. 82), MOD1R3 (SEQ ID No. 83), MOD1F42 (SEQ ID No. 84), MOD1R4 (SEQ ID No. 85), MOD1F5 (SEQ ID No. 86), MOD1R52 (SEQ ID No. 87), MOD1F7 (SEQ ID No. 90) e MOD1R7 (SEQ ID No. 91), LR17 (SEQ ID No. 101), os seguintes preparadores de oligonucleotídeo são sintetizados para PCR: 5’-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag geaccaaggt ggaaatc-3’ (MOD1F62; SEQ ID No. 92) 5’-cgtccgatag ctgctatatt gctoacagaa atagattaca aaatcctccg gctgcag-3’ (MOD1R62; SEQ ID No. 93)

2) Construção de plasmídeo pCR3.1/LM4-5-3 (clonagem de cadeia leve do tipo LM4 de TRA-8 humanizado)

O fragmento LM4-DNA que codifica a seqüência de aminoácido como definido na SEQ ID No. 74 da mesma é preparado realizando-se a PCR de 2 etapas, inserido em um vetor plasmídico e clonado na£. coli)

a) Primeira etapa de PCR

O fragmento LM4-F41B-DNA que codifica uma região de ί/5ι * 1Ó5 seqüência de sinal de secreção com um sítio de divagem de enzima de restrição HindIII adicionado à extremidade 5’, FRL_b CDRL_b FRL₂ e CDRL₂, FRL₃, CDRL₃, FRL₄ e uma porção da região constante é preparada sob as seguintes condições.

Composição da solução de reação:

preparador de oligonucleotídeo MOD1F1, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R1, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F22, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R22, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F3, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R3, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F42, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R4, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F5, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R52, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F62, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R62, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F7, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R7, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo 7AL1P, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo LR17, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOxPCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2

166 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

O fragmento LM4-F41C-DNA que codifica uma porção da região constante com um sítio de divagem de enzima de restrição EcoRI adicionado à extremidade 3’ é preparado sob as seguintes condições.

Os plasmídeos padrão, pSRPDHH, são obtidos seguindo-se a descrição em um Pedido de patente europeu EP 0 909 816 Al.

Composição da solução de reação:

DNA plasmídico de pSRPDHH, 25 ng preparador de oligonucleotídeo MOD1F7, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo 7ALCN, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOxPCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR: Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

Os fragmentos de DNA amplificados depois da PCR são separados pela eletroforese em gel de poliacrilamida a 5%. O gel depois da eletroforese é tingido com 1 pg/ml de brometo de etídio para detectar o DNA produzido sob luz UV. As faixas de DNA respectivas assim detectadas são excisadas com uma lâmina de barbear.

b) Segunda etapa de PCR

LM4-DNA em que os fragmentos LM4-F41B-DNA e LM4F41C-DNA descritos acima são fundidos é preparado sob as seguintes condições.

• 1&7

Composição da solução de reação:

Fragmento de gel de LM4-F41B-DNA preparado na primeira etapa de PCR,

Fragmento de gel de LM4-F41C-DNA preparado na primeira etapa de PCR, preparador de oligonucleotídeo 7AL1P, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo 7ALCN, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5,0 μΐ tampão lOxPCR, 5,0 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestílada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

O fragmento de LM4-DNA assim preparado é inserido no plasmídeo pCR3.1DNA usando o kit de clonagem Eukaryotic TA (InVitrogen) seguindo o protocolo do fabricante e introduzido na E. coli competente TOP10F’ contida no kit. As seqüências de nucleotídeo destes DNAs que codificam a cadeia leve de LM4 TRA8 humanizado são confirmadas pelo método de didesóxi (Sanger, F. S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74: 5463 a 5467) usando o Analisador de DNA 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japão).

Os plasmídeos resultantes são designados pCR3.1/LM4-5-3 (o plasmídeo que carrega o cDNA que codifica a região variável da cadeia leve de LM4 TRA-8 humanizado e uma região constante de cadeia leve da Ig humana).

168

O plasmídeo pCR3.1/LM4-5-3 obtido contendo o fragmento LM4-DNA é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I.

Um pg do DNA pHSG399 plasmídico de clonagem é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I e depois desfosforilado com CIP. O DNA pHSG399 desfosforilado resultante e o fragmento LM4-DNA, que foi digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I, são ligados usando o Kit de ligação de DNA Versão 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Depois, a E. coli DH5a é transformada com o DNA ligado e espalhada sobre meio LB agar contendo 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal e 50 pg/ml de cloranfenicol (concentrações finais). Os transformantes brancos obtidos são cultivados em meio LB líquido contendo 50 pg/ml de cloranfenicol e o DNA plasmídico é extraído a partir da cultura resultante de acordo com o método alcalino-SDS. O DNA plasmídico extraído é digerido com Hind III e EcoR I e depois um clone que carrega o fragmento LM4-DNA é selecionado pela eletroforese em gel de agarose a 1%.

Como um resultado do procedimento acima, o plasmídeo pHSG/M4-5-3-l que carrega um fragmento de fusão da região variável da cadeia leve do LM4 TRA-8 humanizado e a região constante de cadeia IgK humana é obtido. A cepa transformante da E. coli que abriga este plasmídeo, designado como E. coli DH5a/pHSG/M4-5-3-l foi depositada com o Intemational Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japão em 20 de abril de 2001, de acordo com o Tratado de Budapest para o Depósito de Microorganismos e foi concedido o número de acesso FERM BP-7565.

3) Construção do plasmídeo pSR/LM4-5-3-3 (plasmídeo de expressão para a cadeia leve do LM4 TRA-8 humanizado)

O plasmídeo pHSG/M4-5-3-l obtido que carrega um fragmento de fusão da região variável da cadeia leve do LM4 TRA-8 “ 1Ó9 humanizado e a região constante of cadeia IgK humana é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I.

Um pg do DNA plasmídico de clonagem de pSRPDHH (Pedido de patente europeu EP 0 909 816 Al) é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I e depois desfosforilado com CIP. O DNA de pSRPDHH desfosforilado resultante e o fragmento de DNA HindIII-EcoRI obtido de pHSG/M4-5-3-l são ligados usando o Kit de ligação de DNA Versão 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Depois, a E. coli DH5a é transformada com o DNA ligado e espalhada sobre LB agar. Os transformantes obtidos são cultivados em meio LB líquido contendo 100 pg/ml de ampicilina e o DNA plasmídico é extraído a partir da cultura resultante de acordo com o método alcalino-SDS. A inserção e a orientação do fragmento desejado de DNA no vetor pSRPDHH é confirmada pelo seqüenciamento de DNA usando um analisador de seqüência de gene (Analisador de DNA ABI Prism 3700; Applied Biosystems).

O plasmídeo de expressão resultante que carrega o cDNA que codifica a cadeia leve de LM4 TRA-8 humanizado é designado pSRZLM4-5-

3-3.

(4.4) Construção de um Vetor de Expressão para a Cadeia Leve do Anticorpo Humanizado (tipo LM5)

Como mostrado na SEQ ID No. 75 da Listagem de Seqüência, outra humanização (tipo LM5) das seqüências de aminoácido da cadeia leve do anticorpo de DR5 anti-humano de camundongo TRA-8 acarreta substituir o 8^o aminoácido (histidina), 9^o aminoácido (lisina), 10° aminoácido (fenilalanina), 11° aminoácido (metionina), 13° aminoácido (treonina), 20° aminoácido (serina), 42° aminoácido (glutamina), 43° aminoácido (serina), 77° aminoácido (asparagina), 78° aminoácido (valina), 80° aminoácido (serina) 83° aminoácido (leucina), 103° aminoácido (leucina) e 108° aminoácido (alanina) a partir do término N da seqüência de aminoácido da

170 cadeia leve de TRA-8 são substituídos com prolina, serina, serina, leucina, alanina, treonina, lisina, alanina, serina, leucina, prolina, fenilalanina, valina e treonina respectivamente. A seqüência resultante é designada LM5.

Os plasmídeos de expressão que carregam este tipo de seqüências de aminoácido de cadeia leve humanizada do anticorpo antihumano de DR5 TRA-8 (tipo LM5) (SEQ ID No. 75 da Listagem de Seqüência) é construído como segue.

1) Síntese de preparadores para preparar as regiões variável e constante da cadeia leve de LM5 TRA-8 humanizado

O DNA que codifica a cadeia de polipeptídeo LM5 (SEQ ID No. 75 da Listagem de Seqüência), cada uma das quais é uma fusão da região variável de cadeia leve do anticorpo anti-DR5 TRA-8 humanizado e a região constante da cadeia leve de Ig humana (cadeia k), são respectivamente sintetizados usando-se combinações de PCR.

Além disso para 7AL1P (SEQ ID No. 47), 7ALCN (SEQ ID No. 48), MOD1F1 (SEQ ID No. 78), MOD1R1 (SEQ ID No. 79), MOD1F22 (SEQ ID No. 80), MOD1R22 (SEQ ID No. 81), MOD1F3 (SEQ ID No. 82), MOD1R3 (SEQ ID No. 83), MOD1F42 (SEQ ID No. 84), MOD1R4 (SEQ ID No. 85), MOD1R52 (SEQ ID No. 87), MOD1F7 (SEQ ID No. 90) e LR17 (SEQ ID No. 10 1), os seguintes preparadores de oligonucleotídeo são sintetizado para a PCR:

5’-gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcagat tat-3’ (MOD1F52; SEQ ID No. 94)

5’-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc-3’ (MOD1F63; SEQ ID No. 95)

5’-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag-3’ (MOD1R63; SEQ ID No. 96)

5’-gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccacc gaa-3’ (MOD1R72; SEQ ID No. 102)

171

2) Construção de plasmídeo pCR3.1/LM5-3-42 (clonagem de cadeia leve de TRA-8 humanizado tipo LM5)

O fragmento LM5-DNA que codifica a seqüência de aminoácido como definida na SEQ ID No. 75 da mesma é preparado 5 realizando-se a PCR de 2 etapas, inserido em um vetor plasmídico e clonado na E. coli.

a) Primeira etapa de PCR

O fragmento LM5-F51B-DNA que codifica uma região seqüência de sinal de secreção com um sítio de divagem de enzima de 10 restrição Hind III adicionado à extremidade 5’, FRLi, CDRLi, FRL₂, CDRL₂, FRL3, CDRL₃, FRL₄ e uma porção da região constante é preparada sob as seguintes condições.

Composição da solução de reação:

preparador de oligonucleotídeo MOD1F1, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1 RI, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F22, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R22, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F3, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R3, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F42, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R4,5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F52, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R52, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F63, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R63, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1F7, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo MOD1R72, 5 pmol preparador de oligonucleotídeo 7AL1P, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo LR17, 50 pmol ' 1?2 coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOx PCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

O fragmento LM5-F51C-DNA que codifica uma porção da região constante com um sítio de clivagem de enzima de restrição EcoRI adicionado na extremidade 3’ é preparado sob as seguintes condições. O plasmídeo padrão, pSRPDHH, é obtido seguindo-se a descrição em um Pedido de patente europeu EP 0 909 816 Al.

Composição da solução de reação:

DNA plasmídico de pSRPDHH, 25 ng preparador de oligonucleotídeo MOD1F7, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo 7ALCN, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOxPCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

173

Os fragmentos de DNA amplificados depois da PCR são separados pela eletroforese em gel de poliacrilamida a 5%. O gel depois da eletroforese é tingido com 1 pg/ml de brometo de etídio para detectar o DNA produzido sob luz UV. As faixas de DNA respectivas assim detectadas são excisadas com uma lâmina de barbear.

b) Segunda etapa de PCR

LM5-DNA em que os fragmentos LM5-F51B-DNA e LM5F51C-DNA acima descritos são fundidos é preparado sob as seguintes condições.

Composição da solução de reação:

Fragmento de gel de LM5-F51B-DNA preparado na primeira etapa de PCR,

Fragmento de gel de LM5-F51C-DNA preparado na primeira etapa de PCR, preparador de oligonucleotídeo 7AL1P, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo 7ALCN, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5,0 μΐ tampão lOxPCR, 5,0 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

O fragmento LM5-DNA assim preparado é inserido no plasmídeo pCR3.1DNA usando o kit de clonagem Eukaryotic TA (InVitrogen) seguindo o protocolo do fabricante e introduzido na E. coli

174 competente TOPIOF’ contida no kit. As seqüências de nucleotídeo destes DNAs que codificam a cadeia leve de LM5 TRA8 humanizado são confirmadas pelo método de didesóxi (Sanger, F. S., et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74: 5463 a 5467) usando analisador de DNA.

Os plasmídeos resultantes são designados pCR3.1/LM5-3-42 (o plasmídeo que carrega o cDNA que codifica a região variável da cadeia leve de LM5 TRA-8 humanizado e uma região constante de cadeia leve da Ig humana).

O plasmídeo pCR3.1ZLM5-3-42 obtido contendo o fragmento LM5-DNA é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I.

Um pg de DNA pHSG399 plasmídico de clonagem é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I e depois desfosforilado com CIP. O DNA pHSG399 desfosforilado resultante e o fragmento LM5-DNA, que foi digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I, são ligados usando o Kit de ligação de DNA Versão 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Depois, a E. coli DH5a é transformada com o DNA ligado e espalhada sobre meio LB agar contendo 0,1 mM de IPTG, 0,1% X-Gal e 50 pg/ml de cloranfenicol (concentrações finais). Os transformantes brancos obtidos são cultivados em meio LB líquido contendo 50 pg/ml de cloranfenicol e o DNA plasmídico é extraído a partir da cultura resultante de acordo com o método alcalino-SDS. O DNA plasmídico extraído é digerido com Hind III e EcoR I e depois um clone que carrega o fragmento LM5-DNA é selecionado pela eletroforese em gel de agarose a 10%.

Como um resultado do procedimento acima, o plasmídeo pHSG/M5-3-27 que carrega um fragmento de fusão da região variável da cadeia leve de LM5 TRA-8 humanizado e a região constante da cadeia leve da Ig humana é obtido.

3) Construção de plasmídeo pSR/ILM5-3-27-l (plasmídeo de expressão para a cadeia leve de LM5 TRA-8 humanizado)

175

O plasmídeo pHSG/M5-3-27 obtido que carrega um fragmento de fusão da região variável da cadeia leve de LM5 TRA-8 humanizado e a região constante of cadeia IgK humana é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I.

Um pg de DNA plasmídico de clonagem de pSRPDHH (Pedido de patente europeu EP 0 909 816 Al) é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I e depois desfosforilado com CIP. O DNA pSRPDHH desfosforilado resultante e o fragmento de DNA HindIII-EcoRI obtido de pHSG/M5-3-27 são ligados usando o Kit de ligação de DNA Versão 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Depois, a E. coli DH5a é transformada com o DNA ligado e espalhada sobre LB agar. Os transformantes obtidos são cultivados em meio LB líquido contendo 100 pg/ml de ampicilina e o DNA plasmídico é extraído a partir da cultura resultante de acordo com o método alcalino-SDS. A inserção e orientação do fragmento desejado de DNA no vetor pSRPDHH é confirmada pelo seqüenciamento de DNA usando um analisador de seqüência de gene (Analisador de DNA ABI Prism 3700; Applied Biosystems).

O plasmídeo de expressão resultante que carrega o cDNA que codifica a cadeia leve de LM5 TRA-8 humanizado é designado pSR/LM5-327-1.

(4.5) Construção de um Vetor de Expressão para a Cadeia Leve do Anticorpo Humanizado (tipo quimera)

A seqüência mostrada na SEQ ID No. 76 da Listagem de Seqüência, a seqüência de aminoácido da cadeia leve de TRA-8 do tipo quimera, é designada LM6.

Os plasmídeos de expressão que carregam este tipo de seqüência de aminoácido de cadeia leve humanizada do anticorpo anti-DR5 TRA-8 humano (tipo LM6) (SEQ ID No. 75 da Listagem de Seqüência) são construídos como segue.

- 176

1) Síntese de preparadores para preparar as regiões variável e constante da cadeia leve de LM6 TRA-8 humanizado

O DNA que codifica a cadeia de polipeptídeo LM6 (SEQ ID No. 75 da Listagem de Seqüência), cada uma das quais é uma fusão da região variável da cadeia leve de anticorpo anti-DR5 de camundongo TRA-8 (LM6 tipo) e a região constante da cadeia leve da Ig humana (cadeia k), são respectivamente sintetizados usando-se combinações de PCR.

Além disso para 7AL1P (SEQ ID No. 47) e 7ALCN (SEQ ID No. 48), os seguintes preparadores de oligonucleotídeo são sintetizados para a PCR: 5’-tgatgtggac atgaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a-3’ (HKSPR13; SEQ ID NO: ID No. 97).

5’-tgggttccag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c-3’ (MVF11; SEQ ID No. 98);

5’-aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagct tggtgcctc-3’ (MVR11; SEQ II) No. 99);

5’-aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc-3’(MCFll; SEQ ID No. 100).

2) Construção de plasmídeo pCR3.1/LM6-l-16 (clonagem de cadeia leve de TRA-8 humanizado tipo LM6)

O fragmento LM6-DNA que codifica a seqüência de aminoácido como definida na SEQ ID No. 75 da mesma é preparado realizando-se a PCR de 2 etapas, inserido em um vetor plasmídico e clonado na E. coli.

a) Primeira etapa de PCR

O fragmento LM6-F1-DNA que codifica uma seqüência de sinal de secreção e uma porção da região FRL1 com um sítio de clivagem de enzima de restrição HindIII adicionado à extremidade 5’ é preparado sob as seguintes condições. Os plasmídeos padrão, pHSGHM17 e pSRPDHH, são · 177 obtidos seguindo-se a descrição em um Pedido de patente europeu EP 0 909 816 Al.

Composição da solução de reação:

DNAplasmídicodepHSGHM17, 25 ng preparador de oligonucleotídeo 7AL1P, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo HKSPR13, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOx PCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase (PerkinElmer), 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

O fragmento LM6-F2-DNA que codifica uma porção de FRL], CDRL], FRL₂, CDRL₂, FRL₃, CDRL₃, FRL₄ e uma porção da região constante é preparado sob as seguintes condições.

Composição da solução de reação:

DNA plasmídico de pL28, 25 ng preparador de oligonucleotídeo MVF11, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo MVR12, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOx PCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

178

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

O fragmento LM6-F3-DNA que codifica uma porção de FRL4 e a região constante com um sítio de clivagem de enzima de restrição EcoRI adicionado na extremidade 3 ’ é preparado sob as seguintes condições.

Composição da solução de reação:

DNA plasmídico de pSRPDHH, 25 ng preparador de oligonucleotídeo MCF11, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo 7ALCN, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5 μΐ tampão lOxPCR, 5 μΐ ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

Os fragmentos de DNA amplificados depois da PCR são separados pela eletroforese em gel de poliacrilamida a 5%. O gel depois da eletroforese é tingido com 1 pg/ml de brometo de etídio para detectar o DNA produzido sob a luz UV. As faixas de DNA respectivos assim detectadas são excisadas com uma lâmina de barbear.

b) Segunda etapa de PCR

LM6-DNA em que os fragmentos LM6-F1-DNA, LM6-F2DNA e LM6F3-DNA acima descritos são fundidos é preparado sob as

179 seguintes condições.

Composição da solução de reação:

Fragmento de gel de LM6-F1-DNA preparado na primeira etapa de PCR,

Fragmento de gel de LM6-F2-DNA preparado na primeira etapa de PCR,

Fragmento de gel de LM6-F3-DNA preparado na primeira etapa de PCR, preparador de oligonucleotídeo 7AL1P, 50 pmol preparador de oligonucleotídeo 7ALCN, 50 pmol coquetel de dNTPs, 5,0 μΐ tampão 10xPCR,5,(^l ampliTaq DNA polimerase, 2,5 unidades

A solução de reação tendo a composição acima é ajustada até um volume final de 50 μΐ pela adição de água redestilada e usada na PCR.

Condições térmicas da PCR:

Aquecer a 94°C durante 2 minutos, depois do que um ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, repetido 30 vezes, seguido por aquecimento a 72°C durante 10 minutos.

O fragmento LM6-DNA assim preparado é inserido no plasmídeo pCR3.1DNA usando o kit de clonagem Eukaryotic TA (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante e introduzido na E. coli competente TOP10F’ contido no kit. As seqüências de nucleotídeo destes DNAs que codificam a cadeia leve de TRA-8 humanizado são confirmadas pelo método de didesóxi usando um analisador de DNA.

Os plasmídeos resultantes são designados pCR3.1/LM6-l-16 (o plasmídeo que carrega o cDNA que codifica a região variável da cadeia leve de TRA-8 de camundongo e um região constante de cadeia leve da Ig .< 18Ü <¹⁰ humana).

Ο plasmídeo pCR3.1/LM6-l-16 obtido contendo o fragmento LM6-DNA é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I.

Um pg de DNA pHSG399 plasmídico de clonagem é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoRI e depois desfosforilado com CIP. O DNA pHSG399 desfosforilado resultante e o fragmento LM6-DNA, que foi digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I, são ligados usando o Kit de ligação de DNA Versão 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Depois, a E. coli DH5a é transformada com o DNA ligado e espalhada sobre meio LB agar contendo 0,1 mM de IPTG, 0,1% de X-Gal e 50 pg/ml de cloranfenicol (concentrações finais). Os transformantes brancos obtidos são cultivados em meio LB líquido contendo 50 pg/ml de cloranfenicol e o DNA plasmídico é extraído a partir da cultura resultante de acordo com o método alcalino-SDS. O DNA plasmídico extraído é digerido com Hind III e EcoR I e depois um clone que carrega o fragmento LM6-DNA é selecionado pela eletroforese em gel de agarose a 10%.

Como um resultado do procedimento acima, o plasmídeo pHSG/M6-1-4-1 que carrega um fragmento de fusão da região variável da cadeia leve de TRA-8 de camundongo e a região constante de cadeia IgK humana é obtido. A cepa transformante da E. coli que abriga este plasmídeo, designada como E. coli DH5a/pHSG/M6-1-4-1 foi depositada com o Intemational Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japão em 20 de Abril de 2001, de acordo com o Tratado de Budapest para o Depósito de Microorganismos e foi concedido o número de acesso FERM BP-7566.

3) Construção de plasmídeo pSR/LM6-1-4-6 (plasmídeo de expressão para a cadeia leve de LM6 TRA-8 tipo quimera)

O plasmídeo pHSG/LM6-1-4-1 obtido que carrega um .· 1S1 fragmento de fusão da região variável da cadeia leve de TRA-8 de camundongo e a região constante da cadeia IgK humana é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I.

Um pg de DNA pSRPDHH plasmídico de clonagem é digerido com as enzimas de restrição Hind III e EcoR I e depois desfosforilado com CIP. O DNA de pSRPDHH desfosforilado resultante e o ’ fragmento de DNA HindIII-EcoRI obtido de pHSG/LM6-1-4-1 são ligados V usando o Kit de ligação de DNA Versão 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.).

Depois, a E. coli DH5a é transformada com o DNA ligado e espalhada sobre | 10 LB agar. Os transformantes obtidos são cultivados em meio LB líquido contendo 100 pg/ml de ampicilina e o DNA plasmídico é extraído a partir da cultura resultante de acordo com o método alcalino-SDS. A inserção e orientação do fragmento desejado de DNA no vetor é confirmada pelo seqüenciamento de DNA usando um analisador de seqüência de gene.

O plasmídeo de expressão resultante que carrega o cDNA que codifica a cadeia leve de TRA-8 (tipo quimera) é designado pSR/LM6-1-4-6.

(5) Produção de Anticorpo TRA-8 humanizado ou quimérico de tipos diversos

A transfecção de células COS-7 é conduzida pelos métodos de 20 reagente de transfecção FUGENE6 (Boehringer Mannheim Biochemica) de acordo com o manual de instrução fornecido com o kit.

As células COS-7 (American Type Culture Collection No. CRL-1651) são cultivadas até semi-confluentes (3 x 10⁶ células/placa) em uma placa de cultura (área de cultura: 57 cm²; Sumitomo Bakelite) contendo 25 meio Eagle modificado de Dulbecco (daqui em diante aludido como “DMED”; Gibco BRL) suplementados com 10% de soro fetal bovino (daqui em diante abreviado como “FCS”; Moregate).

Nesse meio tempo, 10 pg/placa (total de 5 placas) do DNA plasmídico de expressão da cadeia pesada de DR5 humanizado (pHA15-l) e

182 pg/placa do DNA plasmídico de expressão da cadeia leve de DR5 humanizado preparado pelo método alcalino-SDS e centrifugação por gradiente de densidade de cloreto de césio são misturados e depois precipitados com etanol, seguido pela suspensão em 5 μΐ/placa de dH₂O.

Depois 15 μΐ/placa de regente de transfecção FUGENE6 é misturado com 180 μΐ/placa de DMEM sem FCS, esta solução de FUGENE (185 μΐ/placa) é misturado com 5 μΐ/placa de solução de DNA contendo 10 pg/placa do DNA plasmídico de expressão da cadeia pesada de DR5 humanizado e 10 pg/placa do DNA plasmídico de expressão da cadeia leve de DR5 humanizado. Depois de 15 minutos de incubação na temperatura ambiente, a suspensão de plasmídeo obtido (200 μΐ) é adicionado às placas COS-7 anteriormente preparadas. Depois de incubar em 5% de CO₂ a 37°C durante 24 horas, o meio de cultura é mudado com DMEM sem FCS. Depois de incubar em 5% de CO₂ a 37°C durante 72 horas, o sobrenadante de cultura é recuperado para purificar os produtos de expressão nos fluidos sobrenadantes. Pelo método como descrito acima, as células COS-7 são transfectadas com cada uma das seguintes combinações de plasmídeo:

(A) : cotransfecção de pHA15-l e pSR/LMl-2 (H1L1) (B) : cotransfecção de pHB14-l e pSR/M2-l (H2L2) (C) : cotransfecção de pHB14-l e pSR/LM3-3-44-10 (H2L3) (D) : cotransfecção de pHB14-l e pSR/LM4-5-3-3 (H2L4) (E) : cotransfecção de pHC10-3 e pSR/M2-l (H3L2) (F) : cotransfecção de pHC10-3 e pSR/LM3-3-44-10 (H3L3) (G) : cotransfecção de pHC10-3 e pSR/LM4-5-3-3 (H3L4) (H) : cotransfecção de pHD21-l e pSR/LM5-3-27-l (H4L5) (I) : cotransfecção de pMl 1-1 e pSR/LM6-1-4-6 (Quimera)

A cultura é depois centrifugada (3.500 r.p.m., 15 minutos) e coletado o sobrenadante. O sobrenadante é filtrado com filtro 0,45 pm (ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs, Cat # 25CS045 AS). A purificação de

183

IgG a partir dos filtrados é obtida usando a cromatografia de afinidade da Proteína G-POROS (Applied Biosystems) sob as seguintes condições:

Sistema de HPLC: BioCAD 700E (Applied Biosystems) coluna: cartucho sensor de ProteínaG-ID (tamanho da coluna: 2,1 mmDI x 30 mm LD, volume do leito: 0,1 ml; Applied Biosystems) tampão de elução: 0,1 M Glicina-HCl (pH 2,5) tampão de neutralização: 1 M Tris-HCl (pH 8,5) detecção: 280 nm taxa de fluxo: 1 ml/min tamanho da fração: 0,5 ml/0,5 min tubo de fração: microtubo de polipropileno de 1,5 ml temperatura: 4°C

Depois que todos os filtrados são aplicados à coluna, 50 ml de PBS (Sigma, Cat # 1000-3) são usados para lavar a coluna. Quando o tampão de elução é aplicado, o coletor de fração é iniciado. Cada microtubo de fração anteriormente conteve 55 μΐ de NaCl 1 Μ, 110 μΐ de tampão de neutralização e 74 μΐ de 2 mg/ml de albumina sérica bovina (Sigma, Cat # A7030) em PBS. As frações de N^s 7 até N^s 8 são coletadas.

A verificação da expressão dos anticorpos humanizados e o ensaio quantitativo dos produtos de expressão nos fluidos de sobrenadante de cultura preparados são realizados pelo ELISA com um anticorpo contra IgG anti-humano.

A cada reservatório de uma placa de 96 reservatórios (MaxiSorp, Nunc), 100 μΐ de anticorpo policlonal específico de IgG Fc antihumano de cabra (Kappel) dissolvido na concentração final de 0,5 pg/ml em tampão de absorção (hidrogeno carbonato de sódio 0,05 M, 0,02% de azida de sódio, pH 9,6) é adicionado e a placa é incubada a 37°C durante 2 horas para causar a adsorção do anticorpo. Depois, a placa é lavada com 350 μΐ de PBS18’4

T cinco vezes. Aos reservatórios depois de lavar, o sobrenadante de cultura diluído com D-MEM contendo 10% de FCS é adicionado e incubado a 37°C durante 2 horas. Depois de lavar mais uma vez com PBS-T, 100 μΐ de anticorpo policlonal específico de IgG Fc anti-humano de cabra rotulado com alcalino fosfatase (Jackson Immuno Research Lab.) diluído 10.000 vezes com PBS-T é adicionado a cada reservatório e incubado a 37°C durante 2 horas. Depois de lavar mais uma vez com PBS-T, uma solução do substrato de pnitrofenil fosfato obtido do Kit de Substrato da Alcalino Fosfatase (Bio Rad) é adicionado de acordo com o manual de instrução fornecido com o kit. Depois de incubar a 37°C durante 0,5 a 1 hora, a absorbância a 405 nm é medida. Nos presentes experimentos, a imunoglobulina G de plasma humano subclasse I (IgGl) (Biopure AG) diluída com DMEM contendo 10% de FCS até certas concentrações é usada como amostras de referência de concentração do anticorpo de DR5 humanizado contido no sobrenadante de fluidos de cultura.

Como um resultado, a expressão e os produtos purificados no sobrenadante de cultura são detectados especificamente com o anticorpo de IgG anti-humano. A concentração final de anticorpo de IgG humano é 44,03 pg/ml (H1L1), 39,8 pg/ml (H2L2), 26,7 pg/ml (H2L3), 41,0 pg/ml (H2L4),

39,3 pg/ml (H3L2), 24,7 pg/ml (H3L3), 21,5 pg/ml (H3L4), 16,7 pg/ml (H4L5) e 18,3 pg/ml (quimera), respectivamente.

(6) Atividade indutora de apoptose de diversos tipos de Anticorpo Humanizado ou Anticorpo Quimérico

Células Jurkat (ATCC No. TIB-152), são usadas para examinar a atividade indutora de apoptose do anticorpo purificado TRA-8 humanizado.

As células Jurkat cultivadas em meio RPMI1640 com 10% de FCS (Gibco BRL) a 37°C durante 3 dias na presença de 5% de CO₂ são dispensadas em cada reservatório de uma microplaca de 96 reservatórios (Sumitomo Bakelite) a 50 μΐ por reservatório. O TRA-8 humanizado .· 185 preparado neste Exemplo 26 é ajustado para ter a concentração do produto final de interesse de 100 ng/ml com meio RPMI1640 contendo 10% de FCS estimando-se suas concentrações nos fluidos de acordo com o método descrito no Exemplo 26. Cada uma das soluções dos produtos de expressão assim ajustados a 100 ng/ml é usada para produzir diluições em série repetindo-se a diluição serial de 2 vezes com RPMI1640 contendo 10% de FCS. Cada solução de TRA-8 humanizado diluída (H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L3, H3L4, ou H4L5) é adicionada a cada reservatório a 50 μΐ por reservatório. Depois de reagir a 37°C durante 12 horas, 50 μΐ de PMS a 25 μΜ PMS contendo 1 mg/ml de XTT é adicionado (concentrações finais de 250 μg/ml para XTT e 5 μΜ para PMS). Depois de incubar durante 3 horas, a absorbância a 450 nm, de cada reservatório é medida para calcular a viabilidade celular usando-se a capacidade de redução da mitocôndria como o índice.

A viabilidade das células em cada reservatório é calculada de acordo com a seguinte fórmula:

Viabilidade (%) = 100 x (a-b) / (c-b) em que “a” é a medida de um reservatório de teste, “b” é a medida de um reservatório sem células e “c” é a medida de um reservatório sem anticorpo adicionado.

Como um resultado, os anticorpos humanizados testados são demonstrados induzir a apoptose em células de linhagem celular de linfoma T que expressam o antígeno DR5 humano.

Além disso, a atividade indutora de apoptose de TRA-8 humanizado para PC-3 é examinada pela adição de taxol de acordo com o método descrito no Exemplo 25.

A linhagem de célula de câncer prostático humano PC-3 (ATCCN. CRL-1435) é obtida da American Tissue Culture Collection (ATCC) e mantida em Mistura Nutriente F-12K (21127-022, Gibco BRL)

18*6 contendo 10% de soro fetal bovino (FBS, Hyclone), 1% de L-Glutamina-200 mM (25030-149, Gibco BRL) e 0,5% de Solução de Penicilina Estreptomicina (P-7539, Sigma). O meio RPMI1640 (MED-008, IWAKI) suplementado com 10% de FBS e 0,5% de Solução de Penicilina Estreptomicina é usado no experimento seguinte. As células PC-3 que se desenvolvem exponencialmente são coletadas pela tripsinização e lavadas duas vezes com meio fresco. As células são depois contadas, recolocadas em suspensão em meio fresco a uma densidade de 5 χ 10⁴ células/ml e distribuídas em triplicata em placas de 96 reservatório de fundo chato (3598, Coming-Coster) em um volume total de 100 μΐ/reservatório um dia antes do início do experimento. Um medicamento anti-câncer representativo, Paclitaxel (169-18611, Wako) dissolvido em sulfóxido de dimetila (10 mg/ml) é diluído em meio fresco e depois adicionado às placas de 96 reservatórios contendo as células a 50 μΐ/reservatório. As concentrações finais de sulfóxido de dimetila são menores do que 0,1%. Depois da incubação durante 24 horas a 37°C em atmosfera de CO₂ a 5%, o anticorpo TRA-8 humanizado (H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L2, H3L3, H3L4, ou H4L5) diluído em meio fresco é adicionado aos reservatórios. Depois da incubação durante um adicional de 24 horas, 50 μΐ de Meio Essencial Mínimo (11095098, Gibco BRL) contendo 1 mg/ml de XTT e 25 mM de PMS é adicionado aos reservatórios e as placas são incubadas durante 6 horas. A OD450 é depois medida pelo ARVO HTS 1420 Multilabel Counter (WallaC Berthold) e a viabilidade celular é calculada como segue.

viabilidade celular (%) = (OD450 para o reservatório contendo células tratadas com Taxol e TRA-8 humanizado (agente(s)) - OD450 para o reservatório não contendo células nem agente) x 100 / (OD450 para o reservatório contendo células sem agente - OD450 para o reservatório não contendo células nem agente).

Como um resultado, os anticorpos humanizados testados são

3 ' 18'7 demonstrados induzir a apoptose em células cancerosas da próstata humana que expressam o antígeno DR5 humano.

Exemplo 27. Produção de Anticorpo DR4

Uma proteína de fusão contendo o domínio extracelular de

DR4 humana (aminoácidos de 1 a 236) e a porção Fc da IgGl humana foi expressada em células Cos-7 transfectadas com um vetor adenoviral recombinante. A proteína de fusão foi purificada pela coluna de afinidade da proteína A. Camundongos Balb/c foram imunizados com a proteína de fusão purificada como descrito acima. Um clone de hibridoma, 2E12 (IgGl, k), 10 com ligação específica a DR4 e a capacidade de induzir a apoptose de células Ramos de linfoma B humano foi subclonado três vezes. A especificidade de ligação de 2E12 foi determinada pelo ELISA e a análise de Western blot usando DR5 humana, DcRl e DcR2 e proteína de fusão IgGl como antígenos de controle. A ligação de 2E12 à superfície celular de DR4 foi determinada 15 pela análise de citometria de fluxo de células Cos-7 transfectada com o cDNA de comprimento completo que codifica a DR4 humana. A atividade indutora de apoptose foi determinada incubando-se as células Ramos com 1 pg/ml de 2E12 na presença de IgGl anti-camundongo de cabra. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio ATPLite como descrito acima.

Exemplo 28. Caracterização de Anticorpo DR4

O anticorpo de DR4 monoclonal (2E12) é específico para a DR4 humana visto que ele não se liga a outros receptores TRAIL tais como DR5, DcRl e DcR2 no ELISA (Figura 19a). Ο 2E12 reconheceu o DR4 de superfície celular como demonstrado pela análise de citometria de fluxo de 25 células Cos-7 transfectadas com DR4 (Figura 19b). Ο 2E12 foi capaz de induzir a apoptose de células Ramos de linfoma na presença de reticulação de anticorpo secundário em uma maneira dependente da dose (Figura 19c). O tratamento in vitro de células Ramos com 2E12 resultou em uma ativação dependente do tempo de das caspases 8, 9 e 3 e a clivagem de PARP (Figura

1&

^Lf

19d). Estes resultados indicam que 2E12 é um anticorpo anti-DR4 agonístico, que induz a apoptose em uma maneira dependente da caspase.

Usando anti-DR4 (2E12), seguido por anticorpo IgGl anticamundongo de cabra conjugado a PE e citometria de fluxo, o anticorpo de DR4 foi mostrado ligar às células de uma linhagem celular de fibrossarcoma (Hs 913T) e diversas linhagens celulares de câncer mamário (2LMP, MDAMB231 e MDA-MB 453), mas mostrou pouca a nenhuma ligação a uma linhagem celular de fibroblasto dérmico normal humano (Malme-3).

Exemplo 29. Atividade tumoricida de anticorpos de DR4

A atividade tumoricida de 2E12 foi testada usando modelos de tumor de câncer mamário. Camundongos nus foram inoculados s.c. com a linhagem celular de câncer mamário humano, 2LMP. O tratamento com doses

i.p. de 200 pg de 2E12 ocorreu nos dias 7, 10, 14, 17, 21 e 24 depois da injeção de célula de tumor. Os animais receberam adriamicina i.v. (doxorubicina) (6 mg/kg) nos dias 8, 12 e 16. O tratamento com 2E12 e adriamicina (Figura 20) produziu desenvolvimento maior da inibição do tumor do que 2E12 ou adriamicina sozinhos.

A atividade tumoricida de TRA-8 em combinação com 2E12 foi testada usando os mesmos modelos de tumor de câncer mamário. O tratamento com doses i.p. de 200 pg de TRA-8 e 2E12 ocorreu nos dias 7, 10, 14, 17, 21 e 24 depois da injeção de célula de tumor. Os animais receberam adriamicina i.v. (6 mg/kg) nos dias 8, 12 e 16. O tratamento com TRA-8 mais 2E 12 ou TRA-8 mais 2E12 e adriamicina produziu 88% e 100% de regressão de tumor completa, respectivamente. (Figura 21).

Exemplo 30. Atividade tumoricida de anticorpos DR4/DR5 em combinação com outras terapias (1) Linhagens celulares e Reagentes

O subclone 2LMP da linhagem celular de câncer mamário humano MDA-MB-231, o subclone LCC6 de MDA-MB-435 e o subclone

189

DY36T2 de MDA-MB-361 foram obtidos do Dr. Marc Lipmann (Georgetown University, Washington, D.C.) e mantidos em MEM melhorado suplementado com 10% de FBS (Hyclone, Logan, UT). As linhas de célula cancerosa mamária humana MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT-474, SK-BR-3 e ZR-75-1 foram obtidas a partir do American Type Culture Collection (Manassas, VA). As células MDA-MB-231, MDA-MB453 e MDA-MB-468 foram cultivadas em DMEM suplementado com vitaminas MEM, aminoácidos não essenciais MEM, piruvato de sódio 1 mM e 10% de FBS. As células BT-474 foram cultivadas em RPM1 1640 suplementado com 10 ug/ml de insulina, 4,5 g/1 de glicose, 10 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sódio e 10% de FBS. As células SK-BR-3 foram cultivadas em meio de McCoy com 15% de FBS. As células ZR-75-1 foram cultivadas em meio F12K de Ham com 20% de FBS. Todas as linhagens celulares foram mantidas em meio isento de antibiótico a 37°C em uma atmosfera de CO2 a 5% e rotineiramente tríadas quanto a contaminação de micoplasma.

TRA-8 (IgGl) mAb purificado foi produzido na UAB e também fornecido pela Sankyo Co., Ltd. (Tóquio, Japão). O anticorpo IgGl anti-camundongo de cabra conjugado à ficoeritrina e o anticorpo de controle IgGl específico de isotipo foram obtidos da Southem Biotechnology Associates (Birmingham, AL). Adriamicina e paclitaxel foram adquiridos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) e foram preparados como soluções de estoque a 10 mM em H₂O destilada ou DMSO, respectivamente. Para os estudos de animal, a formulação clínica de paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Co., Princeton, NJ) foi obtida da University of Alabama at Birmingham Hospital Pharmacy (Birmingham, AL). Esta preparação foi diluída 1:5 em PBS imediatamente antes do uso.

(2) Análise de Imunofluorescência Direta e Citometria de Fluxo da Expressão de DR5

190

Células na fase de desenvolvimento exponencial foram lavadas uma vez com PBS de Dulbecco (deficiente em Ca²⁺ e Mg²⁺) e colhidas com 4 mM de EDTA/0,5% de KC1 a 37°C. As células foram coletadas pela centrifugação a 4°C durante 5 min a 1.000 rpm, lavadas uma vez e recolocadas em suspensão em PBS contendo 1% de BS A e 0,01% de azida de sódio (tampão FACS) a 4°C. As células foram incubadas com 10 pg/ml de TRA-8 purificado ou um anticorpo de controle de IgGl específico de isotipo durante 60 min a 4°C, lavadas uma vez com tampão, depois incubadas com 10 pg/ml de IgGl anti-camundongo de cabra conjugado com PE durante 20 min a 4 °C. Depois do fingimento do anticorpo, as células foram lavadas uma vez com tampão FACS e fixadas em paraformaldeído a 1% durante 15 min em gelo. As amostras foram analisadas em um Becton Dickinson FACScan (San Jose, CA) e os dados foram analisados usando o software CellQuest.

(3) Ensaio de Viabilidade Celular Usando ATPLite

As células foram tripsinizadas e recolocadas em suspensão em meio de cultura completo. Mil células por reservatório foram plaqueadas em placas pretas de 96 reservatórios oticamente claras (Costar #3904, Coming, NY) e incubadas durante a noite a 37°C antes de iniciar os tratamentos. Os medicamentos e o anticorpo foram diluídos em meio de cultura imediatamente antes do uso e a concentração final de DMSO foi sempre < 0,001%. A viabilidade celular foi ensaiada depois de 24 horas de exposição ao TRA-8 sozinho. Para tratamentos de combinação com medicamentos citotóxicos, as células foram pré tratadas com o medicamento durante 24 horas antes de adicionar o anticorpo e incubados por um adicional de 24 horas antes de ensaiar a viabilidade celular medindo-se os níveis de ATP celular usando o ensaio com base na luminescência ATPLite (Packard Instruments, Meriden, CT). O protocolo recomendado pelo fabricante foi seguido com a exceção de que todos os volumes de reação (meio de cultura e reagentes) foram reduzidos pela metade. Todas as amostras foram ensaiadas em

191 triplicata e são reportadas como a média ± SE de um mínimo de 3 experimentos independentes.

(4) Estudos de Terapia de TRA-8 Sozinho ou em Combinação com Quimioterapia ou Radiação em Camundongos Nus Atímicos Que Carregam Xenoenxertos de Câncer Mamário

Camundongos nus atímicos foram injetados s.c. com 3 x 10 células 2LMP. Em 7 dias depois da injeção de célula de tumor, 200 ou 600 pg (10 ou 30 mg/kg) de TRA-8 foram administrados i.p. seguidos por cinco injeções adicionais nos dias 10, 14, 17, 21 e 24. O desenvolvimento de tumores foi monitorado com o tempo. Em estudos subsequentes, os animais que carregam tumores s.c. de 2LMP foram injetados i.p. com 200 pg of TRA8 nos dias 7, 10, 14, 17, 21 e 24 sozinhos ou em combinação com adriamicina (6 mg/kg i.v., dias 8, 12 e 16) ou paclitaxel (20 mg/kg i.p., nos dias 8, 12, 16, 20 e 24). O tamanho do tumor e as taxas de regressão foram determinados. Além disso, um estudo foi realizado com TRA-8 e adriamicina usando o mesmo regime descrito acima em combinação com 3 irradiações de Gy ⁶⁰Co de xenoenxertos 2LMP nos dias 9 e 17.

(5) Análise de Apoptose em Xenoenxertos

Camundongos nus atímicos injetados s.c. com 3 x 10 2LMP células no dia 0 receberam 100 pg de TRA-8 i.p. nos dias 7 e 10. Grupos de 2 camundongos cada receberam adriamicina. (3 mg/kg) nos dias 8 e 11, paclitaxel (10 mg/kg) nos dias 8 e 11 ou a combinação de TRA-8 e adriamicina ou paclitaxel com a mesma dose e programa. Um grupo de camundongos não foi tratado. Os xenoenxertos foram dissecados para o estudo de apoptose no dia 14 depois da injeção de célula de tumor. A razão para a redução substancial na intensidade de tratamento comparado com o nosso protocolo de tratamento padrão foi para permitir tecido de tumor adequado para análise no dia 14. O ensaio Tunel para a apoptose em xenoenxertos de tumor foi realizada como segue. Seções de parafina de cinco

192 mícrons de tecido foram montadas em lâminas Superfrost/Plus e aquecidas a 58°C durante 1 hora. As seções de tecido foram desparafinizadas em três mudanças de xileno e reidratadas com uma mudança de etanol absoluto, 95% de etanol e 70% de etanol, cada em incrementos de 5 min. Depois, as seções foram colocadas em solução salina tamponada com Tris (0,5 M Tris base, 0,15 M de NaCl, 0,0002% de Triton X-100, pH 7,6). Os núcleos apoptóticos foram detectados usando um kit Apop Tag Peroxidase (Intergen, Purchase, NY). A proteinase K (20 pg/ml em H₂O destilada desionizada) foi adicionada aos espécimens de tecido e incubados na temperatura ambiente durante 15 min. As peroxidases endógenas foram extintas com uma solução aquosa de peróxido de hidrogênio durante 5 min. As seções foram tratadas com um tampão de equilíbrio durante 30 min e depois incubadas com o TdT/enzima (diluídos em mistura de reação de rotulação) durante 1 hora a 37°C usando coberturas de parafilm. Durante esta incubação, a enzima TdT liga as extremidades T-OH de fragmentos de DNA e catalisa a adição de desoxinucleotídeos rotulados com digoxigenina e não rotulados. Os controles negativos foram incubados com H₂O destilada (diluídos em mistura de reação de rotulação) ao invés da enzima. Um tampão de interrupção foi adicionado durante 10 min na temperatura ambiente para terminar a reação de rotulação. Um conjugado anti-digoxigenina foi adicionado a cada lâmina durante 30 min. O cromagen 3,3’DAB foi usado para visualizar a extremidade 3’-OH rotulada de fragmentos de DNA. As lâminas foram depois enxaguadas em água desionizada e levemente contra tingidas com hematoxilina, desidratadas usando álcoois graduados e xileno e coberto com lamínula usando Permount. Aproximadamente 10 campos aleatórios foram avaliados quanto a porcentagem de Tunel tingido e porcentagem de corpos apoptóticos intensamente tingidos por todo o tecido.

(6) Análise Estatística (A) Análise de Interação de TRA-8 com a Citotoxicidade de

193

Medicamento In Vitro

Os dados de citotoxicidade foram avaliados para determinar se a combinação dos efeitos citotóxicos foram aditivos, menos do que aditivos (antagonísticos) ou mais do que aditivos (sinergísticos). As relações de resposta de dose para os agentes sozinhos e em combinação foram modelados usando um modelo de superfície de resposta de segunda ordem com termos lineares, quadráticos e de interação para cada uma das 9 linhagens celulares (Montgomery, D.C. Design and Analysis of Experiments, Nova Iorque: Wiley, 2001), como recomendado por Gennings (Em Testing for Drug/Chemical Interactions: Definitions and Inference, pp. 457 a 468, 2000). Um termo de interação significante foi classificado como sinergístico ou antagonístico dependendo de se o termo de interação foi negativo com citotoxicidade mais do que aditiva ou positiva com citotoxicidade menos do que aditiva. Se o termo de interação não foi significante, depois da relação entre TRA-8 e adriamicina ou TRA-8 e paclitaxel pode ser considerado aditivo, contanto que os termos aditivos fossem significantes.

(B) Análise de Terapia com TRA-8, Quimioterapia, Radiação e Combinação de Experimentos de Animal Individuais

Os dados de 6 experimentos independentes foram analisados pelo experimento individual. As combinações de tratamento foram comparadas com respeito à eficácia anti-tumor in vivo, isto é, a inibição do desenvolvimento do tumor, que foi medido como três pontos finais; a extensão de tempos de duplicação do tumor, porcentagens de regressão do tumor e taxas de desenvolvimento com o tempo. O número real de dias em que o tumor duplicou em área de superfície (produto de dois diâmetros) em relação ao valor de referência no dia 7 depois da injeção de célula de tumor foi usado na análise do tempo de duplicação. O teste de Kruskal-Wallis não paramétrico foi usado para as comparações do tempo de duplicação do tumor médio entre os tratamentos. O teste exato de Fisher foi usado para comparar

194 as proporções de regressão de tumor e regressão livre de reincidência sobre os grupos de tratamento. Para determinar se qualquer terapia de combinação produziu inibição sinergística significante de desenvolvimento do tumor, isto é, mais do que aditiva, as curvas de desenvolvimento das medidas de área serial foram comparadas usando um método modelo misto linear nas primeiras 3 semanas depois do início da terapia (Lindsey, J.K. Models for Repeated Measurements, pp. 100 a 142, Oxford, 1993). Para testar quanto aos efeitos sinergísticos das terapias de combinação, um termo de interação foi incluído no modelo. Se o termo de interação foi significante e o efeito foi a inibição do desenvolvimento a uma taxa maior do que aditiva então a interação foi considerada sinergística.

(C) Análise Agregada de Efeitos da Terapia

Um total de 166 animais, 10 grupos de tratamento e 6 experimentos independentes foram incluídos na análise agregada. As combinações de tratamento foram comparadas com respeito à eficácia antitumor in vivo. As tempos de duplicação de tumor média foram analisadas usando o teste de Kruskal-Wallis e o teste exato de Fisher foi usado para comparar as proporção de regressões de tumor e as regressões livres de reincidência sobre os grupos de tratamento.

Todas as análises estatísticas foram conduzidas usando SASO (Sas/Stat User’s Guide, SAS OnlineDoc, Version 8, Cary NC: SAS Institute Inc., 1999).

(6) Expressão de DR5 e Citotoxicidade Induzida de TRA-8 em Linhagens Celulares de Câncer Mamário

Como ilustrado na Figura 22A, todas nove linhagens celulares de câncer mamário foram positivas em DR5 com graus variáveis de expressão de fortemente positivas (LCC6 e MDA-MB-453) a fracamente positivas (MDA-MB-468 e SK-BR-3). A Figura 22B ilustra a citotoxicidade induzida pelo TRA-8 das nove linhagens celulares. Quatro linhagens celulares foram

195 sensíveis à citotoxicidade induzida pelo TRA-8 com concentrações IC50 de 17 a 299 ng/ml (LCC6, 2LMP, MDA-MB-231, MDA-MB-468), enquanto outras foram bastante resistentes (DY36T2, BT-474, MDA-MB-453). Não houve uma boa correlação de expressão de DR5 e grau de citotoxicidade induzida 5 pelo TRA-8 como ilustrado pelas linhagens celulares MDA-MB-453 e MDAMB-468.

Os efeitos do TRA-8 sobre a citotoxicidade induzida pela quimioterapia foram depois examinados com adriamicina (Figura 23A) e paclitaxel (Figura 23B). Uma análise para testar quanto a interação entre os 10 efeitos do anticorpo e medicamento está resumida na Tabela 5. Não houve nenhuma interação sinergística significante entre TRA-8 e paclitaxel, com a maioria das interações sendo aditivas. Quatro de nove linhagens celulares preencheram os critérios para uma interação sinergística entre TRA-8 e adriamicina. A linhagem celular 2LMP demonstrou boa sensibilidade ao 15 TRA-8, assim como sensibilidade à adriamicina ou paclitaxel. Esta linhagem celular foi escolhida para explorar a eficácia in vivo de anticorpo e/ou medicamentos.

Tabela 5. Efeitos da Interação In Vitro para Tratamentos de Combinação
TRA-8 + Adriamicina	TRA-8 + Paclitaxel
Linhagem celular Interação valor pa	Interação valor pa

LCC6	Sinergística	< 0,001	Aditiva	0,624
MDA-MB-453	Sinergística	< 0,001	Nenhuma respostac	0,615
2LMP	Aditiva	0,153	Aditiva	0,937
MDA-MB-231	Aditiva	0,663	Aditiva	0,064
BT-474	Sinergística	<0,001	NDb	0,992
ZR-75-1	Sinergística	0,013	Aditiva	0,172
DY36T2	NDb	0,808	NDb	0,798
MDA-MB-468	Aditiva	0,184	Aditiva	0,724
SK-BR-3	Aditiva	0,361	Nenhuma resposta0	0,871

^a o valor p refere-se à signifícância do termo interação sinergística. Se tanto os efeitos do TRA-8 quanto os do medicamento foram significantes e o termo interação foi significante, então os efeitos de combinação foram considerados sinergísticos. Se o valor p de interação não é < 0,05 então os efeitos de combinação foram considerados aditivos.

^b Não determinada porque o efeito do TRA-8 não foi significante, mas o efeito da adriamicina/paclitaxel foi significante.

^c Não houve nenhuma resposta de dose significante para cada um dos agentes.

(7) Efeitos Anti-Tumor In Vivo de TRA-8 Sozinho ou em

196

Combinação com Quimioterapia e/ou Radiação

TRA-8 nas doses de 200 pg e 600 pg duas vezes por semana durante 6 doses produziu uma inibição similar de desenvolvimento do tumor para tumores 2LMP s.c. bem estabelecidos (Figura 24). Nos três experimentos independentes adicionais, os 200 pg de dose/programa produziram inibição estatisticamente significante de desenvolvimento do tumor (p < 0,004, teste de Kruskal-Wallis nas tempos de duplicação do tumor) comparado com os controles não tratados e esta dose e programa foram selecionados para outros estudos. A Figura 25 ilustra os efeitos de TRA-8, adriamicina ou uma combinação de TRA-8 e adriamicina na eficácia anti-tumor. Quando comparada aos controles não tratados, a terapia com TRA-8 sozinho ou TRA8 mais adriamicina produziu inibição significante do desenvolvimento do tumor (p = 0,002 teste de Kruskal-Wallis), enquanto a adriamicina não diferiu dos controles. A combinação de TRA-8 mais adriamicina produziu maior inibição do desenvolvimento do que cada agente sozinho (p = 0,002), assim como regressões significantemente mais completas de tumor (quatro) do que cada agente sozinho onde nenhuma regressão completa foi observada (p < 0,001, teste exato de Fisher). In vivo o sinergismo de TRA-8 e adriamicina foi avaliado usando uma análise de curva de desenvolvimento inicial. O termo interação foi significante (p < 0,001) e sinergístico. A interação sinergística foi corroborada em um segundo experimento independente.

Os efeitos de TRA-8 e paclitaxel foram estudados neste mesmo modelo com observações similares (Figura 26). Quando comparado com os controles não tratados, o TRA-8 e o TRA-8 mais paclitaxel produziram inibição significante de desenvolvimento do tumor (p < 0,001, teste de Kruskal-Wallis). O desenvolvimento do tumor em animais tratados com TRA-8 mais paclitaxel foi significantemente diferente do que o paclitaxel sozinho (p = 0,008) e produziu 3/8 da regressão completa quando comparado com nenhuma para cada agente sozinho. A análise das curvas de

197 desenvolvimento do tumor iniciais demonstraram que o efeito sinergístico foi quase significante (p = 0,063) enquanto os efeitos aditivos foram significantes (p < 0,001).

Finalmente, os efeitos de TRA-8, adriamicina e radiação com ⁶⁰Co foram analisados como agentes únicos e em várias combinações como ilustrado na Figura 27. Houve diferenças significantes globais com respeito às tempos de duplicação do tumor (P< 0,001) e comparações múltiplas indicaram que a terapia tripla com TRA-8, adriamicina e ⁶⁰Co produziram a inibição do desenvolvimento do tumor que foi significantemente diferente do que todos os outros grupos tratados, enquanto ambos os grupos de terapia dupla (adriamicina mais TRA-8 ou ⁶⁰Co mais TRA-8) foram diferentes do que cada grupo de agente único (p < 0,001). Os animais tratados com radiação de ⁶⁰Co sozinha não diferem dos controles não tratados (p = 0,926). Todas as combinações de tratamento de duas vias tiveram efeitos sinergístico significantes (p < 0,001). As regressões completas foram observadas em 6/8 animais que receberam a terapia tripla e 4 animais não tiveram a recorrência do tumor em 180 dias de acompanhamento.

(8) Análise agregada de Efeitos da Terapia

Os estudos anti-tumor in vivo foram compreendidos de 166 animais e as tempos de duplicação de tumor e a freqüência de regressão de tumor completa para todos os animais em cada grupo de tratamento foram analisadas (Tabela 6). A análise ANOVA para as tempos de duplicação de tumor média indicaram diferenças significantes entre os grupos de tratamento (p < 0,001), com comparações múltiplas revelando que o TRA-8 + paclitaxel, TRA-8 + adriamicina e TRA-8 + adriamicina + ⁶⁰Co tiveram tempos de duplicação de tumor médios significantemente mais longos do que qualquer grupo de tratamento carecendo de TRA-8. A adição de TRA-8 a qualquer modalidade de tratamento produziu um tempo de duplicação de tumor mais longo do que aquela modalidade sozinha. Similarmente, o teste de Kruskal

198

Wallis sobre o tempo médio para a duplicação do tumor revelou que as médias foram significantemente diferentes no global (p < 0,001). As comparações aos pares usando o teste de classificação assinalada de Wilcoxin revelou padrões similares para o tempo médio para a duplicação do tumor como as comparações múltiplas do ANOVA. Esta análise subestima a inibição do desenvolvimento produzida pela maioria dos tratamentos eficazes em que os grupos que não atingiram uma duplicação de tumor até o final do experimento foram designados no dia do término do experimento. A Tabela 6 também fornece a freqüência da regressão completa de tumor e a freqüência da persistência daquela regressão até o final do experimento. Não houve regressão completa de tumor observada nos animais tratados com cada regime de quimioterapia ou radiação atestando que o desenvolvimento do tumor e a agressividade do tumor estabeleceram bem. A partir do teste exato de Fisher, houve diferenças significantes na freqüência das regressões completas do tumor entre os grupos de tratamento (p < 0,001). Trinta dos 166 animais obtiveram a regressão completa e 28 destes receberam TRA-8 sozinho ou em combinação com outras modalidades. A regressão completa ocorreu em 1/42 dos animais de controle: 1/54 dos animais que receberam quimioterapia, radiação ou uma combinação; e 28/68 de TRA-8 sozinho ou regimes de combinação de TRA-8. Os grupos tratados com TRA-8 tiveram uma freqüência significantemente maior (p < 0,001) de regressão completa. Similarmente, 14/68 animais que receberam TRA-8 ou combinações de TRA8 não tiveram o redesenvolvimento do tumor comparados com 1/42 dos controles e 0/52 dos animais tratados com quimioterapia e/ou radiação. As regressões isentas de reincidência tiveram períodos de observação de 99 a 171 dias (146 ± 24 dias).

199

Tabela 2. Resultados Agregados de Tempo de Duplicação e Regressão Completa de
	Tumores 2LMP
			Regressões Completas
		Tempo de Duplicação do Tumor (dias)	Total (%)	Nenhuma reincidência (%)	Período de observação média (dias)
Tratamento	# de Animais	(média/inter mediário)
Controles não tratados	44 (42)a	12/8	1 (2%)	1 (2%)	177
“Co	8(7)	14/10	0	0	186
Adriamicina	31 (28)	17/18	0	0	197
Paclitaxel	7(5)	25/20	0	0	-
Adriamicina + ¾	8(8)	39/36	1 (13%)	0	197
TRA-8	30 (26)	47/23	6 (20%)	5 (17%)	159
TRA-8 + 60Co	8(8)	65/50	3 (38%)	1 (13%)	186
TRA-8 + Paclitaxel	8(8)	71/62	3 (38%)	1 (13%)	148
TRA-8 + Adriamicina	14(12)	81/64	10(71%)	3 (21%)	185
TRA-8 + Adriamicina + 60Co	8(6)	>140/179	6 (75%)	4 (50%)	192
Os números em parênteses são os números de animais não censurados

(9) Apoptose em Tumores Tratados

A indução da apoptose em xenoenxertos 2LMP seguintes ao tratamento com TRA8, adriamicina, paclitaxel, TRA-8 + adriamicina e TRA8 + paclitaxel foi avaliada usando a técnica TUNEL. Nos animais não 5 tratados, os tumores tiveram 4% de células tingidas (1% intenso), enquanto os tratamentos com adriamicina ou paclitaxel tiveram 8% (6% intenso) e 7% (2% intenso) de células tingidas. Os animais tratados com TRA-8 sozinho tiveram apoptose surpreendente com 25% (15% intenso) de células tingidas. TRA-8 mais adriamicina teve 28% (22% intenso) e TRA-8 mais paclitaxel 10 teve 26% (12% intenso) de células tingidas.

Quaisquer patentes ou publicações mencionadas no relatório descritivo são indicativas do nível daqueles habilitados na técnica à qual a invenção pertence. Estas patentes e publicações são aqui incorporadas por

200 referência no mesmo grau como se cada publicação individual estivesse específica e individualmente indicada estar incorporada por referência.

A presente invenção não é limitada no escopo pelos depósitos dados como referência acima ou pelas formas de realização divulgadas nos exemplos que são intencionados como ilustrações de uns poucos aspectos da invenção e quaisquer formas de realização que sejam funcionalmente equivalente estão dentro do escopo desta invenção. Várias modificações da invenção além daquelas aqui mostradas e descritas tomar-se-ão evidentes por aqueles habilitados na técnica e são intencionadas a situar-se dentro do escopo das reivindicações anexas.

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Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende (a) um anticorpo que liga especificamente uma DR5 do receptor de TRAIL, em que o dito anticorpo, na sua forma solúvel, tem atividade indutora de apoptose in vivo e in vitro nas células alvo que expressam a DR5 e, em que o anticorpo possui uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma CDR1 compreendendo a SEQ ID NO: 25, uma CDR2 compreendendo a SEQ ID NO: 26, e uma CDR3 compreendendo a SEQ ID NO: 27, e em que a região variável da cadeia leve compreende uma CDR4 compreendendo a SEQ ID NO: 28, uma CDR5 compreendendo a SEQ ID NO: 29, e uma CDR6 compreendendo a SEQ ID NO: 30, e (b) um ou mais agente ou agentes terapêuticos, em que quando o agente ou agentes terapêuticos são um agente ou agentes quimioterapêuticos, o agente ou agentes quimioterapêuticos são selecionados a partir do grupo consistindo em leflunomida, dactinomicina, tamoxifeno, interferon a-2b, ácido glutâmico, plicamicina, mercaptopurina, 6-tioguanina, carmustina, BCNU, lomustina, CCNU, citosina arabosida, estramustina, hidroxiuréia, procarbazina, busulfan, medroxiprogesterona, fosfato sódico de estramustina, etinil estradiol, estradiol, acetato de megestrol, metiltestosterona, difosfato de dietilestilbestrol, clorotrianiseno, testolactona, mefalen, corambucila, mecloretamina, tiotepa, betametasona fosfato de sódio, dicarbazina, asparaginase, mitotano, sulfato de vincristina e sulfato de vinblastina.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente ou agentes terapêuticos são selecionados do grupo que consiste emmembros da família TNF, agentes antiinflamatórios, agentes antivirais, agentes anti-retrovirais, agentes anti-oportunístico, antibióticos, agentes imunossupressivos, imunoglobulinas, agentes antimaláricos, medicamentos anti-reumáticos modificadores da doença, citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento e segundo anticorpo que promove a

   Petição 870190048446, de 23/05/2019, pág. 11/20 apoptose ou bloqueia a proliferação das células alvo.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. 4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de um paciente tendo uma doença inflamatória ou doença autoimune.
5. 5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes terapêuticos são agentes quimioterapêuticos.
6. 6. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes quimioterapêuticos sãociclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e predisona ou um subconjunto destes.
7. 7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar rituximab.
8. 8. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes terapêuticos são membros da família TNF.
9. 9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o membro ou membros da família TNF são ligandos CD40 ou fragmentos ou derivados destes.
10. 10. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o membro ou membros da família TNF são ligandos Fas ou um fragmento ou derivado destes.
11. 11. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes terapêuticos são agentes antiinflamatórios.
12. 12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes antiinflamatórios são agentes antiinflamatórios não esteroidais.

    Petição 870190048446, de 23/05/2019, pág. 12/20
13. 13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os agentes antiinflamatórios não esteroidais são inibidores COX-1 ou inibidores COX-2.
14. 14. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes antiinflamatórios são agentes antiinflamatórios esteroidais.
15. 15. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes terapêuticos são agentes antivirais.
16. 16. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes terapêuticos são agentes anti-retrovirais.
17. 17. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes terapêuticos são agentes anti-oportunísticos.

    18. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes terapêuticos são antibióticos. 19. Composição de acordo com a reivindicação 1,

    caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes terapêuticos são agentes imunossupressivos.

    20. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes terapêuticos são preparações de imunoglobulina. 21. Composição de acordo com a reivindicação 1,

    caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes terapêuticos são agentes antimaláricos.
18. 22. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes terapêuticos são agentes

    Petição 870190048446, de 23/05/2019, pág. 13/20 anti-artrite reumatóide.
19. 23. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes terapêuticos são citocinas.
20. 24. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes terapêuticos são quimiocinas.
21. 25. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente ou agentes terapêuticos são fatores de crescimento.
22. 26. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é um segundo anticorpo que promove a apoptose ou bloqueia a proliferação das células alvo.
23. 27. Composição de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo DR4, um anticorpo TNF, um anticorpo B7, um anticorpo de ligando CD40, um anticorpo CD40, um anticorpo CD20 e um anticorpo Fas.
24. 28. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória ou autoimune são selecionadas do grupo que consiste de 1upo eritematoso sistêmico, doença de Hashimoto, artrite reumatóide, doença do enxerto-versws-hospedeiro, síndrome de Sjogren, anemia perniciosa, doença de Addison, escleroderma, síndrome de Goodpasture, doença de Crohn, anemia hemolítica autoimune, esterilidade, miastenia grave, esclerose múltipla, doença de Basedow, trobocitopenia trombótica, púrpura trombopênica, diabete melito dependente de insulina, alergia; asma, doença atópica; arteriosclerose; miocardite; cardiomiopatia; nefrite glomerular; anemia hipoplástica.