JP2007500844A - ヒト抗cd20抗体のアッセイとその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アンタゴニスト又は抗体に対する中和抗体を検出するためのアッセイと、該アッセイの使用に関する。
リンパ球は造血プロセス中に骨髄で生産される多種類の白血球の一つである。リンパ球には、主として2つの集団:Bリンパ球(B細胞)とTリンパ球(T細胞)がある。ここで特に関心のあるリンパ球はB細胞である。
B細胞は骨髄で成熟し、それらの細胞表面で抗原結合性抗体を発現する骨髄から放出される。まず、未変性B細胞は、その膜結合性抗体が特異的な抗原と遭遇すると、急速に分割し始め、その子孫は記憶B細胞及び「形質細胞」と称されるエフェクター細胞に分化する。記憶B細胞はより長い寿命を持ち、最初の親細胞と同じ特異性を有する膜結合性抗体を発現し続ける。形質細胞は膜結合性抗体を産出しないが、代わりに分泌可能な形態の抗体を産出する。分泌抗体はホルモン免疫の主要なエフェクター分子である。
B細胞リンパ腫でCD20が発現すると、この抗原は、このようなリンパ腫の「ターゲティング」のための候補薬として提供され得る。本質において、このようなターゲティングは以下のようなものが一般的である:B細胞のCD20表面抗原に特異的な抗体を患者に投与する。これらの抗-CD20抗体は正常及び悪性B細胞の双方のCD20抗原(見かけ上)に特異的に結合し:CD20表面抗原に結合した抗体は、新生物B細胞を破壊及び減少に至らしめ得る。さらに、腫瘍を破壊する可能性のある化学剤又は放射活性ラベルを、該薬剤が新生物B細胞に特異的に「送達」されるように、抗-CD20抗体にコンジュゲートさせることもできる。アプローチに関係なく、第1の目的は腫瘍を破壊することであり;特定のアプローチは利用する特定の抗-CD20抗体により決定され、よってCD20抗原をターゲティングするために有用なアプローチはかなり多様である。
B細胞系列の細胞により発現した分化段階に特異的な抗原を認識する付加的な抗体が同定されている。これらのなかには、CD21抗原に対するB2抗体;CD22抗原に対するB3抗体;及びCD10抗原(CALLAとも称される)に対するJ5抗体がある。1997年1月21日に公開された米国特許第5,595,721号を参照。
米国特許出願第2003/0068664号(Albitarら)には、リツキシマブに対するヒト抗-キメラ抗体(HACA)を測定するためのELISAアッセイが記載されている。
ここでの実施例1には、B細胞表面マーカー、つまりCD20抗原と結合する抗体に対する中和抗体を検出するための補体依存性細胞傷害性(CDC)アッセイの開発について記載されている。CDC活性は、種々の濃度のCD20抗体の存在下又は不在下において、ヒト補体と共にCD20陽性細胞をインキュベートすることにより測定した。ついで、生存細胞を定量化することにより細胞傷害性度を測定した。アッセイの性能に対する血清マトリックス効果を試験した。血清は、EC50値に有意なシフトを示さないで40%までの耐容性を示すことができた。ついで、CD20抗体で治療された全身性エリテマトーデス(SLE)の患者の血清サンプルを、抗体反応(HACA)を用いてテストした。CD20抗体のCDC活性は、HACA血清を用いて完全に又は部分的にブロックすることができ、これはテストされたサンプルにおける中和活性を示している。これに対して、CD20抗体で治療する前の血清サンプルでは、何の中和活性も示されなかった。このアッセイは、抗-薬剤抗体反応の性質を特徴付けるものである;よって、薬剤の安全性及び効果を評価するのに有用である。
さらに本発明は、患者にCD20に結合する抗体を投与し;CD20抗体の生物活性をブロックするための、患者からの生体サンプルの能力を測定することを含む、免疫治療法を提供するものである。
他の側面では、本発明は、治療抗体で治療された患者からの生体サンプルと治療抗体の存在下、治療用抗体が結合する抗原を発現する細胞を補体に暴露し;治療用抗体の細胞傷害アッセイ(CDC)活性を測定することを含み、CDC活性の低下により、生体サンプルにおける中和抗体の存在が示される、治療用抗体に対して中和抗体を検出する方法に関する。
さらに、アンタゴニストの生物活性をブロックするための、アンタゴニストで治療された患者からの生体サンプルの能力を測定することを含む、B細胞マーカーに結合するアンタゴニストの効果を評価するための方法を提供する。
さらなる実施態様では、本発明は、患者に、B細胞表面マーカーに結合する抗体を投与し;抗体の生物活性をブロックするための、患者からの生体サンプルの能力を測定することを含む、免疫治療法に関する。
1.定義
特に定義しない限り、ここで「生体サンプル」とは、患者から得られたサンプルを意味する。サンプルは、ヒト抗-マウス抗体(HAMA)、ヒト抗-キメラ抗体(HACA)又はヒト抗-ヒト抗体(HAHA)等の、患者を治療する薬剤又は抗体に結合する抗体を含む。生体サンプルは、例えば血清、患者から回収された抗体、血漿、細胞溶解物、ミルク、唾液、及び他の分泌物、好ましくは血清であってよい。
「生物活性」なる表現は、ここで、抗体又はアンタゴニストの測定可能な機能を称する。種々の活性が考慮され、限定するものではないが、補体依存性細胞傷害性(CDC)、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)、アポトーシス、細胞(例えば腫瘍細胞)の成長阻害等が含まれる。
抗体又はアンタゴニストの生物活性を「ブロックする」ための、生体サンプル(又は、当該問題における薬剤に対し、患者に産生される抗体)の能力は、活性の部分的な及び完全なブロックの双方を称する。
「CD20」抗原は、〜35kDa、末梢血液又はリンパ系器官の90%以上のB細胞の表面で見出される非グルコシル化リンタンパク質である。CD20は初期のプレB細胞発育中に発現し、形質細胞分化まで残る。CD20は正常なB細胞及び悪性のB細胞の双方に存在する。文献におけるCD20の他の名称には「Bリンパ球制限抗原」及び「Bp35」が含まれる。CD20抗原は、例えばClarkら, PNAS(USA)82:1766(1985)に記載されている。
、アジソン病、クレーブス病、自己免疫多腺性症候群(又は多腺性内分泌症候群)、インシュリン依存性真性糖尿病(IDDM)とも称されるI型糖尿病、及びシーハン症候群;自己免疫性肝炎、リンパ球様間質性肺炎(HIV)、閉塞性細気管支炎(非移植)対NSIP、ギラン・バレー症候群、大血管脈管炎(リウマチ性多発性筋痛及び巨細胞(高安)動脈炎を含む)、中血管脈管炎(川崎病及び結節性多発性動脈炎)、強直性脊椎炎、バーガー病( Berger's disease)(IgA腎症)、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアック病(グルテン性腸症)、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、冠動脈疾患、寒冷凝集素症、獲得第VIII因子阻害、ループス腎炎等が含まれる。
このような枯渇は、種々のメカニズム、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)及び/又は補体依存性細胞傷害性(CDC)、B細胞増殖阻害、及び/又はB細胞死の誘発(例えばアポトーシス)を介して達成される。本発明の範囲内に含まれるアンタゴニストには、抗体、合成又は天然配列ペプチド、イムノアドヘシン、通常は細胞傷害剤とコンジュゲート又は融合してB細胞表面マーカーに結合する小分子アンタゴニストが含まれる。好ましいアンタゴニストには抗体が含まれる。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のFcRsを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。その細胞が少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を実行することが望ましい。ADCCを媒介するヒト白血球の例には、末梢血液単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞傷害性T細胞及び好中球が含まれるが、PBMCsとNK細胞が好適である。
「成長阻害」アンタゴニスト又は抗体は、アンタゴニストが結合する抗原を発現する細胞の増殖を防止又は低減するものである。例えば、アンタゴニスト又は抗体はインビトロ及び/又はインビボでB細胞の増殖を防止又は低減可能である。
「アポトーシスを誘発する」アンタゴニスト又は抗体は、アネキシンVの結合、DNAの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び/又は膜小胞の形成(アポトーシス体と呼ばれる)等の標準的なアポトーシスアッセイにより決定されるような、例えばB細胞のプログラム細胞死を誘発するものである。
「抗体断片」は無傷の抗体の一部、好ましくはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2及びFv断片;ダイアボディー;線状抗体;単鎖抗体分子;及び抗体断片から形成された多重特異的抗体が含まれる。
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化する能力を表す、残りの「Fc」断片が産生される。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有し、さらに抗原を架橋させ得るF(ab')2断片が生じる。
またFab断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(CH1)を含む。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されていることによりFab断片とは異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基(類)が少なくとも1つの遊離チオール基を担持しているFab'に対するここでの命名である。F(ab')2抗体断片は、間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体は異なるクラスに割り当てることができる。無傷の抗体には5つの主たるクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらのいくつかはさらにサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及びIgA2に分割される。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び3次元構造はよく知られている。
「ダイアボディ(diabodies)」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を称し、その断片は同じポリペプチド鎖(VH-VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第404,097号;国際公開第93/11161号;及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
ここでの目的において、「免疫療法」とは、抗体を用いた哺乳動物(好ましくはヒト患者)の治療方法を称するものであって、抗体は「コンジュゲートしない」又は「裸」抗体であってよく、又は抗体は、一又は複数の細胞傷害剤(類)等の、非相同分子(類)又は薬剤とコンジュゲート又は融合してもよく、よって「免疫コンジュゲート」が生じる。
、例えばHu M195(Jurcicら Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995)及びCMA-676又はCDP771;抗-CD22抗体、例えばLL2又はLymphoCide(Juweidら Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995);抗-EpCAM抗体、例えば17-1A(PANOREX(登録商標));抗-GpIIb/IIIa抗体、例えばabciximab又はc7E3 Fab (REOPRO(登録商標));抗-RSV抗体、例えばMEDI-493(SYNAGIS(登録商標));抗-CMV抗体、例えばPROTOVIR(登録商標);抗-HIV抗体、例えばPRO542;抗-肝炎抗体、例えば抗-Hep B抗体 OSTAVIR(登録商標);抗-CA 125抗体 OvaRex; 抗-イディオタイプGD3エピトープ抗体BEC2;抗-αvβ3抗体VITAXIN(登録商標);抗-ヒト腎細胞癌抗体、例えばch-G250;ING-1;抗-ヒト 17-1A抗体(3622W94); 抗-ヒト大腸腫瘍抗体(A33);GD3ガングリオシドに対する抗-ヒトメラノーマ抗体R24;抗-ヒト扁平上皮癌(SF-25);及び抗-ヒト白血球抗原(HLA)抗体、例えばSmart ID10及び抗-HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)が含まれる。
ここで、用語「リツキシマブ」又は「RITUXAN(登録商標)」は、一般的に、ここで特に出典明示により取り込まれる米国特許第5,736,137号において「C2B8」と呼称され、CD20抗原に対するキメラマウス/ヒトモノクローナル抗体に設計されたものを称する。抗体はマウス軽鎖及び重鎖可変領域配列、及びヒト定常領域配列を含むIgG1カッパ免疫グロブリンである。リツキシマブは約8.0nMのCD20抗原に対する結合親和性を有する。
hu2H7 v16の可変軽鎖ドメイン:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (配列同定番号:1)
hu2H7 v16の可変重鎖ドメイン:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS( 配列同定番号:2).
好ましいヒト化2H7 v16は、軽鎖アミノ酸配列:
MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列同定番号3);及び
重鎖アミノ酸配列:
MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列同定番号:4)
を含む。
「治療」は、治癒的処置、予防的及び防止的措置の両方を称する。治療が必要なものとは、既に疾患又は疾病に罹っているもの、並びに疾患又は疾病が防止されているものを含む。よって、哺乳動物は疾患又は疾病を患っていると診断されるか、又は疾病にかかりやすいか、又はこれの影響を受けやすいものであってよい。
「治療的有効量」なる表現は、当該問題の疾病又は病状を防止、改良又は治療するのに有効なアンタゴニスト又は抗体の量を称する。
ここで使用される場合、「ドナー」なる用語は、そこから移植片を得るための、死亡した又は生存している哺乳動物種を称する。好ましくはドナーはヒトである。ヒトドナーでは、主要血液型の境界が交じると、同種移植片の生存率が損なわれるため、主要ABO血液型が同じで、健康診断で正常であり、自ら志願した血縁関係のあるドナーであることが好ましい。しかしながら、A、B又はABレシピエントへ、O型ドナーの腎臓を移植することはできる。
ここで「中和抗体」とは、関心のある抗原(例えば治療用抗体、例えばCD20抗体)にのみ結合するのではなく、ある程度、抗原の生物活性を阻害する抗体を称する。
この発明は、少なくとも部分的に、B細胞表面マーカーに結合するアンタゴニスト又は治療用抗体(例えば、CD20に結合する抗体)に対し、中和抗体を検出するためのアッセイに関する。アッセイは、抗体又はアンタゴニストの生物活性をブロックするための、抗体又はアンタゴニストで治療された患者からの生体サンプルの能力を測定するものである。ブロック活性は、抗体又はアンタゴニストの効果の低減度合いを示し得る。
サンプルは、一般的に、患者を抗体又はアンタゴニストで治療する前及び/又は後に、患者から得られる。通常、生体サンプルは、一連の時点で、例えば治療前から、治療サイクルの間中、患者から得られる。このアッセイの実施を妨害する薬剤を回避するために、生体サンプルは、通常、薬剤のウォッシュアウトが生じたときに取り出されるであろう。例えば、ベースライン、3、6及び9ヶ月でのサンプルがテストされ得る。患者が後日再治療されるならば、ベースライン、及び3又は6ヶ月でのサンプルが、中和抗体用にテストされ得る。
生体サンプルは、ヒト抗-マウス抗体(HAMA)、ヒト抗-キメラ抗体(HACA)又はヒト抗-ヒト抗体(HAHA)等の、患者を治療する抗体又はアンタゴニストに結合する抗体を含み得る。HAHAはヒト化又はヒト治療用抗体のいずれかに対する。一実施態様において、サンプルは、このような抗体を含有することが測定されるものである。例えば患者からの血清は、以下の実施例1又は米国特許出願第2003/0068664号(Albitarら)におけるELISAアッセイを介して、当該問題における薬剤に対する抗体を含有することが見出され得る。
アッセイに使用される生体サンプルは、血清、血漿、細胞溶解物、ミルク、唾液、及び他の分泌物、並びに、一又は複数の任意のこのような生物検体から回収された抗体であってよい。好ましくは、患者からの血清は、ここでアッセイにかけられる。
自己免疫疾患を治療するために、抗体又はアンタゴニストで治療される患者にアッセイを使用することが特に望ましい。種々の自己免疫疾患がここで記載されるが、例示的なものには、関節リウマチ(RA)、全身性エリテマトーデス(SLE)、ヴェーゲナー病、炎症性大腸炎、突発性又は免疫性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症(MS)、乾癬、IgA腎症、IgM多発性神経障害、重症筋無力症、脈管炎、真性糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血が含まれる。
アンタゴニスト又は抗体がB細胞表面マーカー、例えばCD20抗原に結合する場合、患者は、自己免疫疾患、B細胞悪性腫瘍を有している可能性が高く、またアンタゴニスト又は抗体は、外来抗原に対する免疫反応をブロックするのに使用され得る(例えば、ここで外来抗原は免疫原性治療剤、又は移植片である)。
好ましくは、アッセイではCDC活性が検査される。本発明のこの実施態様では、抗体又はアンタゴニストが結合する抗原(例えばB細胞表面マーカー、特にCD20)を発現する細胞を、抗体又はアンタゴニスト、並びに抗体又はアンタゴニストで治療される患者からの生体サンプルの存在(又は不在)下、補体(好ましくはヒト補体)に暴露してよい。本出願では、任意の順序で同時に又は逐次、4つの成分(細胞、補体、抗体又はアンタゴニスト、及び生体サンプル)を暴露することが考えられており;これら全ての可能性は、「治療用抗体とそれで治療される患者からの生体サンプルの存在下、治療用抗体が結合する抗原を発現する細胞を、補体に暴露」なる表現に包含される。しかしながら、本発明の好ましい実施態様においては、生体サンプル(例えば血清)が、抗体又はアンタゴニスト活性を中和可能なように、抗体又はアンタゴニストと組み合わせられ、ついで、細胞と補体が、この混合物に添加される。
細胞、例えばアンタゴニスト又は抗体が結合する抗原を発現する癌性B細胞の成長を阻害する、アンタゴニスト又は抗体の能力は、種々のアッセイにより評価することができる。Tajiら Jpn J. Cancer Res 89:748-56 (1998)には、CD20抗体によるCD20-陽性Bリンパ腫細胞系の成長阻害度の測定方法が記載されている。
本発明の方法は、B細胞表面マーカーに結合するアンタゴニスト又は治療用抗体を使用するか、これを導入したものである。従って、このようなアンタゴニスト又は抗体を生産するための方法を以下に記載する。
アンタゴニスト又は抗体の製造又はスクリーニングに使用される抗原は、例えば所望のエピトープを含む抗原又はそれらの一部の可溶形態のものであってよい。あるいは、又は付加的に、アンタゴニスト又は抗体を生産又はスクリーニングするために、その細胞表面に抗原を発現する細胞を使用することもできる。アンタゴニスト又は抗体の生産に有用な他の形態の抗原は当業者には明らかであろう。好ましくは、抗原は、B細胞表面マーカー、例えばCD20抗原である。
好ましいアンタゴニストは抗体であるが、ここでは抗体以外のアンタゴニストを考慮することとする。例えば、アンタゴニストには細胞傷害剤(例えば上述したもの)と融合又はコンジュゲートしてもよい小分子アンタゴニストが含まれ得る。小分子のライブラリーは、抗原に結合する小分子を同定するために、ここで関心あるB細胞表面マーカーに対してスクリーニングされる。さらに小分子は、その拮抗特性がスクリーニングされ、及び/又は細胞傷害剤とコンジュゲートされ得る。
また、アンタゴニストは、理論的設計又はファージ表示(例えば、1998年8月13日に公開された国際公開第98/35036号)により生産されるペプチドであってもよい。一実施態様において、分子は「CDR模倣物」又は抗体のCDRに基づいて設計された抗体類似物が選択されてもよい。このようなペプチドはそれら自体で拮抗作用を示すが、ペプチドの拮抗特性を高める又は添加するために、細胞傷害剤とペプチドを融合させてもよい。
他の実施態様において、アンタゴニストは、免疫グロブリンFc領域等の免疫グロブリンに融合するCD20のような、B細胞表面マーカーに結合するペプチド又はタンパク質等の、結合ドメインを含むイムノアドヘシンである。
以下に、本発明で使用される抗体アンタゴニストの生産のための例示的技術を示す。
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに関連する抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基によるコンジュゲート)、N-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、又はRとR1が異なったアルキル基であるR1N=C=NRによりコンジュゲートさせることが有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート100μg又は5μg(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント3容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。1ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の1/5ないし1/10のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。数日ないし14日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び/又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために適切に使用される。
モノクローナル抗体は実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, モノクローナル抗体: Principles及びPractice,pp.59-103(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培養培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、HGPRT欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(HAT培地)。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び/又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal antibodies:Principles and Practice, pp.59-103(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培養培地には、例えば、D-MEM又はRPMI-1640培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する1つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術に記載されている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、ヒト抗体の該当する配列を高頻度可変領域配列で置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか;Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))に本質的に従って実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのFR残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993);Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993); Bruggermanら, Year in Immuno., 7:33 (1993);米国特許第5,591,669号、同5,589,369号及び同5,545,807号を参照されたい。
また、ヒト抗体は、活性化B細胞によりインビトロで生産してもよい(例えば米国特許第5,567,610号及び同5,229,275号を参照)。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical及びBiophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')2断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片の生産のための他の技術は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Fv断片(scFV)である。国際公開第93/16185号;米国特許第5,571,894号;及び米国特許第5,587,458号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているような「線形抗体」であってもよい。このような線形抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってよい。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、B細胞表面マーカーの2つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体は第1のB細胞表面マーカーに結合し、さらに第2のB細胞表面マーカーに結合する。あるいは、抗B細胞表面マーカー結合アームは、B細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)等のIgG(FcγR)に対するFcレセプター、又はT細胞レセプター分子(例えばCD2又はCD3)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はB細胞に細胞傷害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はB細胞表面マーカー結合アーム及び細胞傷害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばF(ab')2二重特異性抗体)として調製することができる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し単離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のFab'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)を結合してなる。従って、一つの断片のVH及びVLドメインは他の断片の相補的VL及びVHドメインと強制的に対形成させられ、2つの抗原結合部位を形成する。単鎖Fv(sFv)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。三又はそれ以上の抗原結合部位を有する抗体は、特に出典明示によりここに取り込まれる、国際公開第01/77342号(Miller及びPresta)に記載されている。
ここでの方法に使用され、製造品に包含されるアンタゴニスト又は抗体は、通常、細胞傷害剤とコンジュゲートされる。
このようなアンタゴニスト又は抗体-細胞傷害剤コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は上述したものである。
また、ここではカリケアマイシン、メイタンシン(maytansine)(米国特許第5,208,020号)、トリコセン(trichothene)、及びCC1065等の、一又は複数の小分子毒素とアンタゴニスト又は抗体とのコンジュゲートが考察される。本発明の一実施態様において、アンタゴニスト又は抗体は一又は複数のメイタンシン分子(例えば、アンタゴニスト又は抗体1分子当たり、約1〜10のメイタンシン分子)とコンジュゲートされる。例えば、メイタンシンはMay-SH3に還元され、修飾されたアンタゴニスト又は抗体と反応するMay-SS-Meに転化され(Chariら, Cancer Research, 52:127-131(1992))、メイタンシノイド-アンタゴニスト又は抗体コンジュゲートを生産する。
本発明では、核酸分解活性を有する化合物(例えば、リボヌクレアーゼ又はDNAエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ;DNase)とコンジュゲートしたアンタゴニスト又は抗体をさらに考慮する。
種々の放射活性同位体も放射性コンジュゲートアンタゴニスト又は抗体の生成に利用できる。具体例にはAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32及びLuの放射性同位体が含まれる。
別法として、アンタゴニスト又は抗体及び細胞傷害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製され得る。
このようなコンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞傷害形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ;スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ;非毒性5-フルオロシトシンを抗癌剤5-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ;プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンB及びL)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの;D-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なD-アラニルカルボキシペプチダーゼ;炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβ-ガラクトシダーゼ;β-ラクタム類で誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβ-ラクタマーゼ;及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンVアミダーゼ又はペニシリンGアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。アンタゴニスト又は抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
アンタゴニスト又は抗体の他の修飾をここで考察する。例えば、アンタゴニスト又は抗体は種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレン、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーに結合してもよい。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG-誘導ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、所定の孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のFab'断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲートされ得る。化学療法剤は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)を参照。
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類のものに交換することが必要であろう。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、N-結合又はO-結合の何れかである。N-結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を称する。アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニン(ここでXはプロリンを除く任意のアミノ酸)というトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。O-結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを称するが、5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
変更されたFc領域グリコシル化を有する抗体は、特に出典明示によりここに取り込まれる、国際公開第02/079255号(Reff及びDavies)及び国際公開第03/035835号(Presta)に記載されている。
アンタゴニスト又は抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、天然源からの単離(自然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又はオリゴヌクレオチド媒介(又は部位指向性)突然変異誘発、PCR突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による初期調製されたアンタゴニスト又は抗体の変異体又は非変異体の調製を含む。
本発明で使用されるアンタゴニスト又は抗体の治療用調製物は、所望される程度の純度を持つアンタゴニスト又は抗体を、凍結乾燥された調製物又は水性溶液の形態で、任意の製薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスファート、シタラート、及び他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンズアルコニウムクロリド;ベンズエトニウムクロリド;フェノール;ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);及び/又はトゥイーン(TWEEN)TM、プルロニクス(PLURONICS)TM、又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
皮下投与に適した凍結乾燥調製物は、国際公開第97/04801号及び米国特許第6,267,958号(Andyaら)に記載されている。このような凍結乾燥調製物は適切な希釈剤で高濃度タンパク質に再構成され、再構成された調製物はここで治療される哺乳動物に皮下的に投与され得る。
ここでの調製物は、特に治療的指示に必要な1以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補足的活性を有するものをさらに含有する。例えば、細胞傷害剤、化学療法剤、サイトカイン又は免疫抑制剤をさらに提供することが望ましい。このような他の薬剤の有効量は、調製物中に存在するアンタゴニスト又は抗体の量、疾患又は疾病又は治療の種類、及び上述した他の要因に依存する。これらは一般的に、同じ用量、上述にて使用したような投与経路、又は上述にて使用した用量の1〜99%で使用される。
インビボ投与に使用される調製物は滅菌されなくてはならない。これは滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
本発明では、抗体及びアンタゴニストを用いた種々の疾病及び疾患の治療を考察している。抗体又はアンタゴニストがB細胞表面マーカー、例えばCD20に結合している場合、治療される病状には、B細胞悪性腫瘍(特に出典明示によりここに取り込まれる米国特許第6,455,043B1号, Grillo-Lopezを参照)、及び自己免疫疾患(特に出典明示によりここに取り込まれる国際公開第00/67796, Curdら)が含まれる。またB細胞表面マーカーに結合するアンタゴニスト又は抗体は、外来抗原に対する免疫反応をブロックするのにも使用され、例えばここで外来抗原は免疫原性剤又は移植である(特に出典明示によりここに取り込まれる国際公開第01/03734号, Grillo-Lopezらを参照)。
ここに開示されている種々の効能において、アンタゴニスト又は抗体を含有する組成物は、良好な医学的実務に合致する方式で調製され、調薬され、そして投与される。このときに考慮する因子は、治療される特定の疾患又は病状、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、疾患又は病状の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療実務者に知られた他の要因を含む。投与されるアンタゴニスト又は抗体の治療的有効量は、そのような考察によって決定される。
一般的な提案として、腸管外投与されるアンタゴニスト又は抗体の治療的有効量は、患者体重1kg当たり1日に約0.1〜20mgであり、用いられるアンタゴニスト又は抗体の典型的な初期範囲は約2〜10mg/kgの範囲である。
患者へのタンパク質アンタゴニストの投与の他に、本出願では、遺伝子治療によるアンタゴニスト又は抗体の投与が考慮されている。例えば、細胞内抗体を産生するための遺伝子治療の使用に関連しており、1996年3月14日に公開された国際公開第96/07321号が参照される。
本発明のさらなる詳細を、以下の非限定的実施例により例証する。本明細書における全ての引用文の開示は、特に出典明示によりここに取り込まれる。
リツキシマブに対する中和抗体を検出するための補体依存性細胞傷害性アッセイ
リツキシマブは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)、補体依存性細胞傷害性(CDC)、又はその双方を介して、CD20+B細胞を枯渇させることにより、その生物学的機能を作用させる。インビトロにおいて、CDC活性は、種々の濃度のリツキシマブの存在下又は不在下で、ヒト補体と共にCD20+WIL2-Sリンパ腫細胞をインキュベートすることにより測定可能である。ついで、ALAMAR BLUE(登録商標)を使用し、生存細胞を定量化することにより、細胞傷害性が測定される(Gazzano-Santoroら, J. Immunol. Methods 202 163-171 (1997))。
この実施例においては、結果としてHACAになる、リツキシマブで治療された患者からの血清サンプルを同定した。ついで、免疫枯渇により確認されたHACA陽性血清を、以下に記載する中和抗体アッセイにかけた。HACAアッセイは、捕捉試薬としてリツキシマブ、検出試薬としてビオチン化リツキシマブを用いた架橋態様である。アッセイはリツキシマブに対するポリクローナルヤギ抗体を用いて作成された較正標準曲線を有する。アッセイにおけるサンプルの最小希釈度は、1RU(相対単位)/mLにて、最低スタンダードで1/5である。サンプル反応が5RU/mL(値を1/5希釈ファクターで補正)以下であると、HACAに対して陰性であるとみなす。
要約すると、本実施例は、リツキシマブで治療された患者の血清における中和活性を検出するための、細胞ベースの機能アッセイ、補体依存性細胞傷害性(CDC)アッセイを記述している。このアッセイは抗-薬剤抗体反応の性質を特徴付けるのに大いに有用であり;よって、薬剤の安定性及び効能を評価する際には貴重になるであろう。
自己免疫疾患の治療
本発明の一実施態様では、ここで記載されるアッセイは、自己免疫疾患を有する患者の治療計画に関連して使用されうる。例示的な自己免疫疾患には、若年性関節リウマチを含む関節リウマチ(RA)、ループス腎炎を含む全身性エリテマトーデス(SLE)、ヴェグナー病、炎症性大腸炎、突発性又は免疫性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症(MS)、乾癬、IgA腎症、IgM多発性神経障害、重症筋無力症、脈管炎、真性糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血が含まれる。
CD20に結合する抗体(例えばリツキシマブ又はヒト化2H7)を、当該問題である自己免疫疾患を治療するための有効量、患者に投与する。例えば抗体は、毎週375mg/m2を4又は8週、もしくは1000mgを1及び15日で投与されてもよい。抗体は、自己免疫疾患を治療するための一又は複数の他の薬剤、例えば上述の部分に列挙された免疫抑制剤、化学療法剤及び/又はサイトカイン類;任意の一又は複数の疾患緩和抗リウマチ剤(DMARD)、例えばヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、メトトレキサート、レフルノミド、アザチオプリン、D-ペニシラミン、金(経口用)、金(筋内用)、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌タンパク質A免疫吸着;静注用免疫グロブリン(IVIG);非ステロイド性抗炎症剤(NSAID);グルココルチコイド(例えば関節注射);コルチコステロイド(例えば、メチルプレドニゾロン及び/又はプレドニゾン);葉酸塩;抗腫瘍壊死因子(TNF)抗体、例えばエタネルセプト/ENBRELTM、インフリキシマブ/REMICADETM、D2E7 (Knoll)又はCDP-870 (Celltech);IL-1Rアンタゴニスト(例えばKineret);1L-10アンタゴニスト(例えばIlodecakin);血液凝固調節剤(例えばWinRho);IL-6アンタゴニスト/抗-TNF(CBP 1011);CD40アンタゴニスト(例えばIDEC 131);Ig-Fcレセプターアンタゴニスト(MDX33);免疫調節剤(例えば、サリドマイド又はImmuDyn);抗-CD5抗体(例えばH5g1.1);マクロファージインヒビター(例えばMDX 33);共刺激ブロッカー(例えば、 BMS 188667又はトレリマブ);補体インヒビター(例えば、h5G1.1、3E10、又は抗-分解促進因子(DAF)抗体);又はIL-2アンタゴニスト(zxSMART)と併用してもよい。
ついで、HACA又はHAHAを含有することが示された血清を、上述した実施例1に記載されたようにして中和抗体についてテストする。同量の前治療された対応物(すなわちHACA及びHAHA陰性)と比較して、与えられた濃度にて、リツキシマブ又はヒト化2H7の約20%又はそれ以上の活性を中和するサンプルは、リツキシマブ又はヒト化2H7に対する中和抗体に対して陽性であると考えられる。陽性の結果は、自己免疫疾患の治療において抗体の効果が低下したことを示す。
B細胞悪性腫瘍の治療
CD20陽性B細胞悪性腫瘍、例えばリンパ球優位型ホジキン病(LPHD)を含むホジキン病、非ホジキンリンパ腫(NHL)、濾胞中心細胞(FCC)リンパ腫、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、ヘアリー細胞白血病、形質細胞様リンパ性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、AIDS又はHIV-関連リンパ腫、多発性骨髄腫、中枢神経系(CNS)リンパ腫、移植後リンパ増殖症候群(PTLD)、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症(リンパ形質細胞性リンパ腫)、粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫、又は辺縁帯リンパ腫/白血病が、この実施例に従って治療される。
CD20に結合する抗体(例えばリツキシマブ又はヒト化2H7)を、当該B細胞悪性腫瘍を治療するための有効量で患者に投与する。例えば抗体は、毎週375mg/m2を4又は8週投与することができる。
場合によっては、CD20抗体は、一又は複数の化学療法剤と組み合わせられる。CD20抗体と組み合わせられる好ましい化学療法剤は、アルキル化剤又はアントラサイクリンベースの化学療法剤又はフルダラビンベースの化学療法剤;シスプラチン、フルダラビン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、及び/又はビンクリスチンである。抗体と組み合わせるのに特に所望される化学療法剤には、限定されるものではないが:シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾン(CHOP) (Czuczmanら J Clin Oncol 17:268-76 (1999));シクロホスファミド、ビンクリスチン、及びプレドニゾン(CVP);フルダラビン(例えば、CLL治療のため);フルダラビン、シクロホスファミド、及びミトキサントロン(FCM);又はドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、及びダカルバジン(ABVD)等である。
ついで、HACA又はHAHAを含有することが示された血清を、上述した実施例1に記載されたようにして中和抗体についてテストする。同量の前治療された対応物(すなわちHACA及びHAHA陰性)と比較して、与えられた濃度にて、リツキシマブ又はヒト化2H7の約20%又はそれ以上の活性を中和するサンプルを、リツキシマブ又はヒト化2H7に対する中和抗体に対して陽性であると考えられる。中和抗体の存在は、B細胞悪性腫瘍の治療において抗体の効果が低減していることを示す。
外来抗原に対する免疫反応のブロック
本実施例では、抗-CD20抗体は、治療用タンパク質(例えばマウス抗体又は免疫毒素)、遺伝子治療用ウイルスベクター、血液因子(例えば第VIII因子)、血小板、又は移植片等の外来抗原に対する免疫反応をブロックするために使用される。
CD20抗体の適切な用量は、毎週与えて375mg/m2で4又は8回注入である。CD20抗体を投与すると、患者における免疫反応が低下し又はなくなり、よって治療の成功が容易になる。
急性拒絶の予防の他にも、CD20抗体は急性拒絶の治療に使用してもよい。CD20の適切な用量は上述した通りである。CD20抗体は、急性拒絶の治療において、CD3モノクローナル抗体及び/又はコルチコステロイド類と組み合わせられてもよい。
またCD20抗体は、(a)「慢性」アロ移植片拒絶の治療又は予防のために、移植後期間の後期に単独で、又は他の免疫抑制剤及び/又は共刺激封鎖と組み合わせて;(b)耐性包含療法の一部として;又は(c)異種移植の設定に使用されてもよい。
ついで、HACA又はHAHAを含むことが示された血清を、上述した実施例1に記載されたようにして中和抗体についてテストする。同量の前治療された対応物(すなわちHACA及びHAHA陰性)と比較して、与えられた濃度にて、リツキシマブ又はヒト化2H7の約20%又はそれ以上の活性を中和するサンプルを、リツキシマブ又はヒト化2H7に対する中和抗体に対して陽性であると考えることができる。中和抗体反応が検出された場合、これは、抗体が、当該外来抗原に対する免疫反応をブロックする能力が低下したことを示す。
Claims (21)
- CD20に結合する抗体の効果を評価する方法において、CD20抗体で治療された患者からの生体サンプルの、CD20抗体の生物活性をブロックする能力を測定することを含む、方法。
- 生物活性が、補体依存性細胞傷害性(CDC)、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)、アポトーシス、及び細胞成長の阻害性からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 生物活性が、補体依存性細胞傷害性(CDC)である、請求項1に記載の方法。
- CD20抗体がリツキシマブである、請求項1に記載の方法。
- CD20抗体がヒト化2H7である、請求項1に記載の方法。
- 生体サンプルが、CD20抗体に結合する患者からの抗体を含む、請求項1に記載の方法。
- 生体サンプルを、患者からの生体サンプルにおいて、CD20抗体に結合する患者からの抗体の存在を決定するアッセイにかける、請求項6に記載の方法。
- 生体サンプルが患者からの血清を含む、請求項1に記載の方法。
- 患者が自己免疫疾患を有している、請求項1に記載の方法。
- 自己免疫疾患が、関節リウマチ(RA)、全身性エリテマトーデス(SLE)、ヴェーゲナー病、炎症性大腸炎、突発性又は免疫性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症(MS)、乾癬、IgA腎症、IgM多発性神経障害、重症筋無力症、脈管炎、真性糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、糸球体腎炎、及び自己免疫性溶血性貧血からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 患者がB細胞悪性腫瘍を有している、請求項1に記載の方法。
- B細胞悪性腫瘍が、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫(NHL)、濾胞中心細胞(FCC)リンパ腫、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、ヘアリー細胞白血病、形質細胞様リンパ性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、AIDS又はHIV-関連リンパ腫、多発性骨髄腫、中枢神経系(CNS)リンパ腫、移植後リンパ増殖症候群(PTLD)、ヴァルデンストレーム病、粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫、及び辺縁帯リンパ腫/白血病からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 患者が、外来抗原に対する免疫反応をブロックするCD20抗体で治療される、請求項1に記載の方法。
- 外来抗原が治療剤を含む、請求項13に記載の方法。
- 外来抗原が、抗体、毒素、遺伝子治療用ウイルスベクター、移植片、病原菌及びアロ抗原からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 外来抗原が移植片である、請求項13に記載の方法。
- アッセイが、CD20抗体と生体サンプルの存在下、補体にCD20陽性細胞を暴露させ、ついで暴露細胞の生存率を測定することを含む、請求項3に記載の方法
- CD20に結合する抗体を患者に投与し;
患者からの生体サンプルの、CD20抗体の生物活性をブロックする能力を測定する;
ことを含む免疫治療法。 - 治療用抗体に対する中和抗体を検出する方法において、
治療用抗体とそれで治療される患者からの生体サンプルの存在下で、治療用抗体が結合する抗原を発現する細胞を補体に暴露させ;
治療用抗体の補体依存性細胞傷害性(CDC)活性を測定することを含み、CDC活性の低下により、生体サンプルにおける中和抗体の存在が示される方法。 - B細胞表面マーカーに結合するアンタゴニストの効果を評価する方法において、アンタゴニストで治療された患者からの生体サンプルの、アンタゴニストの生物活性をブロックする能力を測定することを含む方法。
- 患者にB細胞表面マーカーに結合する抗体を投与し;
患者からの生体サンプルの、抗体の生物活性をブロックする能力を測定する;
ことを含む免疫治療法。
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