BR122021009041B1 - Métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica - Google Patents

Métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica Download PDF

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Abstract

A presente invenção se refere aos métodos para a produção eficiente de anticorpos e outros complexos de proteína multimérica (coletivamente referidas no presente como proteínas heteromultimérica) capazes de especificamente se ligar a superior a um alvo. Os alvos, por exemplo, podem ser epítopos diferentes localizados em uma molécula simples ou localizados em moléculas diferentes.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO DE PATENTE RELACIONADO
[001] O presente pedido de patente reivindica o benefício de prioridade do pedido provisório da patente US 1961/989.509 depositado em 06 de maio de 2014, que está incorporado no presente como referência na sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002]A presente invenção se refere aos métodos para a produção de proteínas heteromultiméricas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] Os anticorpos monoclonais do tipo IgG contêm dois braços de ligação ao antígeno idênticos e um domínio constante (Fc). Os anticorpos com uma especificidade diferente nos seus braços de ligação, em geral, não ocorrem na natureza e, por conseguinte, precisam ser trabalhados com o auxílio da engenharia química (por exemplo, a ligação cruzada química e similares), DNA recombinante e/ou a tecnologia de fusão de células.
[004] Os anticorpos biespecíficos simultaneamente podem se ligar a dois antigênios diferentes. Esta propriedade possibilita o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que não são possíveis com os anticorpos monoclonais convencionais. O painel grande de formatos de anticorpos biespecíficos imaginativos que foram desenvolvidos reflete o forte interesse para estas moléculas. Vide Berg J, Lotscher E, KS Steimer, et al., “Bispecific antibodies that mediate killing of cells infected with human immunodeficiency virus of any strain”, Proc Natl Acad Sci EUA (1991) 88 (11): 4.723-4.727 e Fischer N e Leger O., “Biospecific Antibodies: Molecules That Enable Novel Therapeutic Strategies”, Pathobiology (2007) 74: 3-14.
[005] Outra classe de moléculas proteínas multiespecíficas é a fusão recombinante. As proteínas de fusão recombinante consistem em domínio extracelular das proteínas imunorreguladoras e o domínio constante (Fc) de imunoglobulina (Ig) representa uma classe crescente de agentes terapêuticos humanos. As imunoadesinas combinam a região de ligação de uma sequência de proteína, com uma especificidade desejada, com o domínio efetor de um anticorpo. As imunoadesinas possuem duas propriedades importantes que são significativas para o seu potencial como agentes terapêuticos: a especificidade alvo, e a estabilidade farmacocinética (meia-vida in vivo de que é comparável à de anticorpos). As imunoadesinas podem ser utilizadas como antagonistas para inibir ou bloquear as interações deletérias ou como agonista para imitar ou intensificar as respostas fisiológicas. Vide Chamow SM, Zhang DZ, Tan XY, et al., “A humanized, bispecific immunoadhesin-antibody that retargets CD3+ effectors to kill HIV-1-infected cells”, J Hematother 1995; 4 (5): 439-446.
[006] Outras moléculas multiespecíficas foram discutidas em outros locais. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a: Fisher et al., Pathobiology (2007) 74: 3-14 (revisão de diversos formatos biespecíficos); patente US 6.660.843, depositada em 09 de dezembro de 2003 de Feige et al., (peptibodies); publicação de pedido de patente 2002/004.587 depositado em 10 de janeiro de 2002 (multispecific antibodies); patente US 7.612.181 depositada em 03 de novembro de 2009 de Wu et al. (Dual Variable Domain format); patente US 6.534.628, Nord K. et al., Prot Eng (1995) 8: 601-608, Nord K. et al., Nat Biotech (1997) 15: 772-777, e Gronwall et al., Biotechnol Appl Biochem. (2008) Jun; 50 (Pt 2): 97-112 (Aficorpos); Martens et al., Clin Cancer Res (2006), 12: 6.144-6.152 e Jin et al., Cancer Res (2008) 68 (11): 4.360-4.368 (one armed antibodies);. Bostrom et al., Science (2009) 323: 1.610-1.614 (Dual Action Fab, aka mixed valency antibodies). Outros formatos são conhecidos dos técnicos no assunto.
[007]A produção dos materiais de grau clínico continua sendo um desafio para as moléculas multiespecíficas descritas acima. Conforme observado acima, existem muitos caminhos para a produção de moléculas com braços de ligação mistos, isto é, braços de ligação que não são idênticos entre si. Cada um destes métodos possui as suas desvantagens.
[008]A ligação cruzada química é um trabalho intensivo, uma vez que as espécies em questão ainda podem precisar ser purificadas a partir de homodímeros e outros subprodutos indesejáveis. Além disso, as etapas de modificação química podem alterar a integridade das proteínas, por conseguinte, conduzindo à fraca estabilidade. Por conseguinte, este método muitas vezes é ineficaz e pode conduzir à perda de atividade de anticorpo.
[009]A tecnologia de fusão celular (por exemplo, os hibridomas híbridos) expressam duas cadeias pesadas e duas cadeias leves que aleatoriamente montam a condução para a geração de 10 combinações de anticorpos. Os anticorpos heteromultiméricos desejados apenas são uma pequena fração dos anticorpos produzidos dessa maneira. A purificação das proteínas heteromultiméricas desejadas dramaticamente reduz os rendimentos de produção e aumenta os custos de fabricação.
[010]As técnicas de DNA recombinante são utilizadas para gerar diversos formatos heteromultiméricos, por exemplo, o Fv de cadeia simples, diacorpos, e similares, que não compreendem um domínio de Fc. Uma grande desvantagem deste tipo de molécula de anticorpo é a falta do domínio Fc e, por conseguinte, a capacidade do anticorpo para desencadear uma função efetora (por exemplo, a ativação do complemento, ligação do receptor Fc, e similares). Por conseguinte, é desejado um anticorpo biespecífico que compreenda um domínio Fc funcional.
[011]As técnicas de DNA recombinante também são utilizadas para gerar os anticorpos biespecíficos de “saliência no orifício”. Vide pedido de patente US 2003/0.078.385 (Arathoon et al., -. Genentech). Uma limitação desta estratégia é que as cadeias leves dos dois anticorpos parentais precisam ser idênticas para evitar o pareamento incorreto e formação de moléculas indesejadas e/ou inativas devido a ser expressas na mesma célula.
[012] Por conseguinte, continua a existir uma necessidade de métodos alternativos para a produção de proteínas heteromultiméricas. A presente invenção descrita fornece tais métodos. Estes e outros aspectos e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição da presente invenção fornecida no presente.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[013]A presente invenção fornece os métodos eficazes e inovadores da produção de complexos multiespecíficos de imunoglobulina (por exemplo, os anticorpos multiespecíficos) e outras proteínas multiméricas (coletivamente referidas no presente como proteínas heteromultiméricas) nas células de mamíferos através de métodos conhecidos no estado da técnica. Vide publicação WO 2013/055958 e WO 2011/133886.
[014] Por conseguinte, em um primeiro aspecto, fornecem os métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve, e (ii) um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado a uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira capaz de expressar um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e uma primeira cadeia leve; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira capaz de expressar um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e uma segunda cadeia leve; e, (c) da obtenção de um meio de cultura combinado para a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira, em que o meio de cultura combinado compreende a proteína heteromultimérica, e em que a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cada uma, uma célula de mamífero. Em determinadas realizações, o meio de cultura combinado foi obtido sem a interrupção da membrana celular das primeiras e segundas células hospedeiras. Em determinadas realizações, o método ainda compreende a adição de um agente de redução ao meio de cultura combinado.
[015]Também são fornecidos os métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve, e (ii) um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados, através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira capaz de expressar um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e uma primeira cadeia leve, em que um primeiro homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o primeiro ponto de clivagem e duas primeiras cadeias leves é segregado; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira capaz de expressar um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e uma segunda cadeia leve, em que um segundo homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o segundo ponto de clivagem e duas segundas cadeias leves é segregado; (c) da obtenção de um meio de cultura combinado para a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira sem a interrupção da membrana celular das primeiras e segundas células hospedeiras, em que o meio de cultura combinado compreende o primeiro homodímero e o segundo homodímero; (d) da incubação do meio de cultura combinado sob condições de redução suficientes para possibilitar a formação da proteína heteromultimérica, e; (e) da obtenção da proteína heteromultimérica, em que a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cada uma, uma célula de mamífero. Em determinadas realizações, o método ainda compreende a adição de um agente de redução para o meio de cultura combinado. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem compreendem uma primeira e segunda cadeia pesada. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações descritas no presente, o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e a primeira cadeia leve compreendem um primeiro meio anticorpo. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações descritas no presente, o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e a segunda cadeia leve compreendem um segundo meio anticorpo.
[016] Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a obteção do meio de cultura combinado compreende: (1) a colheita de um primeiro meio de cultura para a primeira cultura de células hospedeiras; (2) a colheita de um segundo meio de cultura para a segunda cultura de células hospedeiras; e, (3) a combinação do primeiro meio de cultura e o segundo meio de cultura para se obter o meio de cultura combinado.
[017] Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a obteção do meio de cultura combinado compreende o meio de cultura de colheita de uma cultura de células combinadas que compreende a primeira célula hospedeira e a célula hospedeira. Em determinadas realizações, o meio de cultura combinado foi obtido sem a interrupção da membrana celular das primeiras e segundas células hospedeiras.
[018]As primeiras e segundas células hospedeiras nos métodos da presente invenção podem ser cultivadas em qualquer configuração que possibilita a expressão e isolamento dos polipeptídeos de interesse. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são separadamente cultivadas antes da combinação para a cultura de células combinadas.
[019] Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, os métodos ainda compreendem a etapa de cultura da cultura de células combinadas a uma temperatura de cerca de 25° C a cerca de 40° C. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o meio de cultura combinado é incubado durante cerca de 24 horas a cerca de 7 dias após o meio de cultura combinado ser obtido. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o meio de cultura combinado é incubado a cerca de 4° C a cerca de 8° C. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o meio de cultura combinado é agitado.
[020] Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, os métodos ainda compreendem o isolamento da proteína heteromultimérica a partir do meio de cultura combinado. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a proteína heteromultimérica é isolada utilizando uma coluna A de proteína. Em determinadas realizações, a proteína heteromultimérica adicionalmente é purificada utilizando os métodos conhecidos no estado da técnica.
[021] Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, os métodos ainda compreendem a adição de um agente de redução para o primeiro meio de cultura de células e/ou para o segundo meio de cultura de células antes ou após os primeiros e segundos meios de cultura de células serem colhidos. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, os métodos ainda compreendem a adição de um agente de redução ao meio de cultura da cultura de células combinadas antes do meio de cultura da cultura de células combinadas ser colhido. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o agente de redução é adicionado a cerca de 4 a cerca de 24, cerca de 5 a cerca de 20, cerca de 10 a cerca de 20, cerca de 10 a cerca de 15, ou cerca de 15 a cerca de 18 horas antes da etapa de colheita. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o agente de redução é adicionado a cerca de 15 horas antes da etapa de colheita.
[022] Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, os métodos ainda compreendem a adição de um agente de redução ao meio de cultura de células combinadas. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o meio de cultura combinado que contém o agente de redução ainda é incubado durante cerca de 4 horas a cerca de 7 dias. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o meio de cultura combinado que contém o agente de redução ainda é incubado durante cerca de 15 horas. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o agente de redução é adicionado ao meio de cultura combinado antes do isolamento da proteína heteromultimérica a partir do meio de cultura combinado. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o meio de cultura combinado que contém o agente de redução é incubado durante, pelo menos, cerca de 24 horas antes do isolamento da proteína heteromultimérica. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o meio de cultura combinado que contém o agente de redução é incubado durante, pelo menos, cerca de 48 horas antes do isolamento da proteína heteromultimérica. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a proteína heteromultimérica é isolada utilizando uma coluna A de proteína.
[023] Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o agente de redução é selecionado a partir do grupo que consiste em glutationa, 2-mercaptoetanol, 2- mercaptoetilamina, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), cisteína, ditiotreitol, cisteinditiotreitol, ditiolbutilamina, ou suas combinações. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o agente de redução é a glutationa, e em que a glutationa é adicionada a uma concentração de cerca de 5 mM a não superior a cerca de 20 mM. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o agente de redução é a glutationa, e em que a glutationa é adicionada a uma concentração de cerca de 2 mM a cerca de 10 mM. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o agente de redução é a glutationa, e em que a glutationa é adicionada a uma concentração de cerca de 5 mM para menos de cerca de 20 mM. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o agente de redução é a glutationa, e em que a glutationa é adicionada a uma concentração de cerca de 15 mM.
[024] Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer das realizações acima, a primeira célula hospedeira é uma linhagem de célula estável. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer das realizações acima, a segunda célula hospedeira é uma linhagem de célula estável. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a primeira célula hospedeira é a célula CHO. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a segunda célula hospedeira é a célula CHO.
[025] Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a proporção entre a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira é ajustada de maneira que a proporção molar do polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e do polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem é de cerca de 1:10 a cerca de 10:1 em que a primeira cultura de células hospedeiras e a segunda cultura de células hospedeiras são combinadas para a formação de uma cultura combinada. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a proporção molar do polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem expressa através da primeira célula hospedeira e do polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem expressa através da segunda célula hospedeira é de 1:1 em que a cultura da célula hospedeira e a segunda cultura de células hospedeiras são combinadas para a formação de uma cultura combinada.
[026] Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, os polipeptídeos contendo o ponto de clivagem compreendem uma região Fc ou sua variante. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o polipeptídeo contendo o primeiro e/ou segundo ponto de clivagem compreende uma cadeia pesada de anticorpo.
[027] Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o primeiro domínio de heterodimerização compreende uma modificação da saliência na interface e o segundo domínio de heterodimerização compreende uma modificação do orifício na interface. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a modificação da saliência compreende a substituição de um resíduo de amino ácido original a partir do primeiro domínio de heterodimerização com um resíduo de amino ácido com uma cadeia secundária superior ao resíduo de amino ácido original. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o resíduo de amino ácido de substituição é selecionado a partir do grupo que consiste em triptofano, fenilalanina, tirosina e a arginina. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a modificação do orifício compreende a substituição de um resíduo de amino ácido original a partir do segundo domínio de heterodimerização com um resíduo de amino ácido com uma cadeia secundária inferior ao resíduo de amino ácido original. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o resíduo de amino ácido de substituição é selecionado a partir do grupo que consiste em serina, treonina, valina e alanina. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a modificação da saliência compreende a substituição T366W (numeração EU). Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a modificação do orifício compreende duas ou mais substituições de amino ácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em T366S, L368A e Y407V (numeração EU).
[028] Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, dita ligação de intercadeias de dissulfureto está entre as regiões de clivagem. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a proteína heteromultimérica é um anticorpo. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a proteína heteromultimérica é um anticorpo biespecífico. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, dito anticorpo é um anticorpo humanizado ou humano. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o anticorpo é um anticorpo de comprimento total. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o anticorpo é um fragmento de anticorpo que compreende, pelo menos, uma porção de domínio CH2 e/ou CH3 humano. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em IgG, IgA e IgD. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o anticorpo é o IgG. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o anticorpo é o IgG1, IgG2 ou IgG4. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a primeira cadeia leve e a segunda cadeia leve compreendem as sequências diferentes de domínio variável.
[029] Em um outro aspecto, são fornecidos os métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve, e (ii) um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma cultura combinada de uma primeira célula hospedeira e uma segunda célula hospedeira, em que a primeira célula hospedeira é capaz de expressar o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e a primeira cadeia leve, em que a segunda célula hospedeira é capaz de expressar o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e a segunda cadeia leve, e em que a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cada uma, uma célula de mamífero; (b) da adição de um agente de redução para a cultura combinada; e (c) da colheita de um meio de cultura combinado a partir da cultura combinada sem a interrupção da membrana celular, em que o meio de cultura combinado compreende a proteína heteromultimérica.
[030] Em determinadas realizações, a primeira célula hospedeira segrega um primeiro homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o primeiro ponto de clivagem e duas primeiras cadeias leves, em que a segunda célula hospedeira segrega um segundo homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o segundo ponto de clivagem e duas segundas cadeias leves, em que a cultura combinada compreende o primeiro homodímero e o segundo homodímero. Em determinadas realizações, a adição do agente de redução para a cultura combinada possibilita a formação da proteína heteromultimérica.
[031] Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o agente de redução é adicionado após a cultura combinada ser cultivada durante não superior a cerca de 18 dias. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o meio de cultura combinado é colhido de 4 horas a 24 horas após o agente de redução ser adicionado. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a etapa de colheita de um meio de cultura combinado compreende a remoção da primeira célula hospedeira e da segunda célula hospedeira a partir do meio de cultura combinado. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o meio de cultura combinado é incubado durante 4 horas a 7 dias.
[032] Em determinadas realizações, os métodos ainda compreendem a etapa de ajuste da célula: a proporção de células entre a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira de uma cultura combinada. Em determinadas realizações, a célula: a proporção de células é ajustada de maneira que a proporção molar do polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem (com a cadeia leve associada) expressa a partir da primeira célula hospedeira para o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem (com a cadeia leve associada) expressa a partir da segunda célula hospedeira em uma cultura combinada alcança uma proporção molar desejada. Em determinadas realizações, a célula hospedeira é uma linhagem de célula estável. Em determinadas realizações, a linhagem celular estável é estavelmente transfectada com a(s) molécula(s) de ácido nucleico que é(são) capaz(es) de expressar um polipeptídeo contendo o ponto de clivagem e uma cadeia leve.
[033] Deve ser compreendido que os métodos da presente invenção podem incluir outras etapas que, em geral, são as etapas de rotina evidentes para iniciar e/ou completar o processo englobado através dos métodos da presente invenção, conforme descrito no presente. Por exemplo, em uma realização, a etapa (a) de um método da presente invenção é precedida por uma etapa em que um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem é introduzido em uma primeira célula hospedeira, e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem é introduzido em uma segunda célula hospedeira. Em uma realização, os métodos da presente invenção ainda compreendem uma etapa de purificação das proteínas heteromultiméricas que contêm a especificidade de ligação para, pelo menos, dois alvos distintos.
[034] Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e a primeira cadeia leve (ou a sua cadeia leve associada) compreendem um primeiro domínio de ligação de um primeiro alvo. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e a segunda cadeia leve (ou a sua cadeia leve associada) compreendem um segundo domínio de ligação para um segundo alvo. Os primeiros e segundos alvos podem ser diferentes epítopos localizados em uma molécula simples ou localizados em moléculas diferentes.
[035] Em um outro aspecto, é fornecida uma proteína heteromultimérica produzida através de qualquer um dos métodos acima. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a proteína heteromultimérica é um anticorpo biespecífico. Também são fornecidas as composições que compreendem uma proteína heteromultimérica produzida através de qualquer um dos métodos acima (tal como um anticorpo biespecífico) e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[036]As proteínas heteromultiméricas da presente invenção em geral, são capazes de se ligar, de preferência especificamente, aos antigênios. Tais antigênios, por exemplo, incluem os antigênios tumorais, fatores de regulação da sobrevivência celular, fatores de regulação da proliferação celular, moléculas associadas com (por exemplo, conhecidas ou suspeitas a contribuirem funcionalmente) desenvolvimento ou diferenciação do tecido, moléculas da superfície celular, linfocinas, citocinas, moléculas envolvidas em regulação do ciclo celular, moléculas envolvidas em vasculogênese e moléculas associadas com (por exemplo, conhecidas ou suspeitas a contribuirem funcionalmente) a angiogênese. Um antígeno para o qual uma proteína heteromultimérica da presente invenção é capaz de ligação pode ser um membro de um subconjunto de uma das categorias mencionadas acima, em que o(s) outro(s) subconjunto(s) de dita categoria compreende(m) outras moléculas / antigênios que possuem uma característica distinta (em relação ao antígeno de interesse). Um antígeno de interesse também pode ser considerado por pertencer a duas ou mais categorias. Em uma realização, a presente invenção fornece uma proteína heteromultimérica que, de preferência especificamente, se liga a um antígeno de tumor que não é uma molécula de superfície celular. Em uma realização, um antígeno de tumor é uma molécula da superfície celular, tal como um polipeptídeo do receptor. Em outro exemplo, em algumas realizações, uma proteína heteromultimérica da presente invenção, de preferência especificamente, se liga a um antígeno de tumor que não é um fator de diferenciação de aglomeração. Em um outro exemplo, uma proteína heteromultimérica da presente invenção é capaz de se ligar, de preferência especificamente, a um fator de diferenciação de aglomeração, que em algumas realizações, por exemplo, não é o CD3 ou CD4. Em algumas realizações, uma proteína heteromultimérica da presente invenção é um anticorpo do anti-VEGF. Em algumas realizações, uma proteína heteromultimérica da presente invenção é um anticorpo biespecífico selecionado a partir do grupo que consiste em IL-1alfa/IL-1beta, IL-12/IL-18; IL- 13/IL-9; IL-13/IL-4; IL-13/IL-5; IL-5/IL-4; IL-13/IL-lbeta; IL-13/IL-25; IL-13/TARC; IL-13/MDC; IL-13/MEF; IL-13/TGF-β; agonista IL-13/LHR; IL-12/TWEAK, IL- 13/CL25; IL-13/SPRR2a; IL-13/SPRR2b; IL-13/ADAM8, IL-13/PED2, IL17A/IL17F, CD3/CD19, CD138/CD20; CD138/CD40; CD19/CD20; CD20/CD3; CD38/CD138; CD38/CD20; CD38/CD40; CD40/CD20; CD-8/IL-6; CD20/BR3, TNFalfa/TGF-beta, TNFalfa/IL-1beta; TNFalfa/IL-2, TNF alfa/IL-3, TNFalfa/IL-4, TNFalfa/IL-5, TNFalfa/IL6, TNFalfa/IL8, TNFalfa/IL-9, TNFalfa/IL- 10, TNFalfa/IL-11, TNFalfa/IL-12, TNFalfa/IL-13, TNFalfa/IL-14, TNFalfa/IL-15, TNFalfa/IL-16, TNFalfa/IL-17, TNFalfa/IL-18, TNFalfa/IL-19, TNFalfa/IL-20, TNFalfa/IL-23, TNFalfa/IFNalfa, TNFalfa/CD4, TNFalfa/VEGF, TNFalfa/MIF, TNFalfa/ICAM-1, TNFalfa/PGE4, TNFalfa/PEG2, ligante TNFalfa/RANK,. TNFalfa/Te38; TNFalfa/BAFF; TNFalfa/CD22; TNFalfa/CTLA-4; TNFalfa/GP130; TNFα/IL-12p40; VEGF/HER2, VEGF-A/HER2, VEGF-A/PDGF, HER1/HER2, VEGF-A/VEGF-C, VEGF-C/VEGF-D, HER2/DR5,VEGF/IL-8, VEGF/MET, receptor VEGFR/MET, VEGFR/EGFR, HER2/CD64, HER2/CD3, HER2/CD16, HER2/HER3; EGFR/HER2, EGFR/HER3, EGFR/HER4, IL- 13/CD40L, IL4/CD40L, TNFR1/IL-1R, TNFR1/IL-6R, TNFR1/IL-18R, EpCAM/CD3, MAPG/CD28, EGFR/CD64, CSPGs/RGM A; CTLA-4/BTNO2; IGF1/IGF2; IGF1/2/Erb2B; MAG/RGM A; NgR/RGM A; NogoA/RGM A; OMGp/RGM A; PDL-I/CTLA-4; and RGM A/RGM B, IL1β/IL18, NRP1/VEGFA, VEGFA/NRP2, cMET/EGFR, ALK1/BMP9, VEGFA/α5β1, HER1/HER3-BU, e CMV. Em algumas realizações, uma proteína heteromultimérica da presente invenção se liga a, pelo menos, duas moléculas alvo selecionadas a partir do grupo que consiste em: α5β1, ALK1, BMP9, IL-1alfa, IL-1beta, TARC, MDC, MEF, TGF-β, agonista LHR, TWEAK, CL25, SPRR2a, SPRR2b, ADAM8, PED2, CD3, CD4, CD16, CD19, CD20, CD22, CD28, CD40, CD38, CD64, CD138, CD-8, BR3, TNFalfa, TGF-beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL- 10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-17A, IL-17F, IL-18, IL-19, IL- 20, IL-23, IL-25, IFNalfa, MIF, ICAM-1, PGE4, PEG2, ligante RANK, Te38, BAFF, CTLA-4, GP130, IL-12p40, VEGF, VEGF-A, PDGF, HER1, HER2, HER3, HER3-BU, HER4, VEGF-C, VEGF-D, DR5, cMET, MET, receptor MET, VEGFR, EGFR, CD40L, TNFR1, IL-1R, IL-6R, IL-18R, EpCAM, MAPG, CSPGs, BTNO2, IGF1, IGF2, IGF1/2, Erb2B, MAG, NgR, NogoA, NRP1, NRP2, OMGp, PDL-I, RGM A e RGM B. Em algumas realizações, uma proteína heteromultimérica da presente invenção se liga ao CD3 e, pelo menos, uma molécula alvo adicional selecionada a partir de BLR1, BR3, CD19, CD20, CD22, CD72, CD79A, CD79B, CD180 (RP105), CR2, FcRH1, FcRH2, FcRH5, FCER2, FCRL4, HLA-DOB, e NAG14.
[037]As proteínas heteromultiméricas podem ser modificadas para intensificar e/ou adicionar as características desejadas adicionais. Tais características incluem as funções biológicas tais como as funções efetoras imunitárias, uma meia-vida / depuração in vivo desejável, biodisponibilidade, biodistribuição ou outras características farmacocinéticas. Tais modificações são bem conhecidas no estado da técnica e também podem ser empiricamente determinadas, e podem incluir as modificações através das porções que podem ou não podem ser à base de peptídeo. Por exemplo, os anticorpos podem ser glicosilados ou aglicosilados, em geral, dependendo, pelo menos em parte, da natureza da célula hospedeira. De preferência, os anticorpos da presente invenção são aglicosilados. Um anticorpo aglicosilado produzido através de um método da presente invenção posteriormente pode ser glicosilado, por exemplo, utilizando nos métodos de glicosilação in vitro, bem conhecidos no estado da técnica. Conforme descrito acima e no presente, as proteínas heteromultiméricas da presente invenção podem ser produzidas em uma célula procariótica, tal como, por exemplo, o E. coli. As proteínas heteromultiméricas produzidas de E. coli, em geral, são aglicosiladas e não possuem as funções biológicas normalmente associadas com os perfis de glicosilação encontrados na célula hospedeira de mamífero (por exemplo, a CHO) produziram as proteínas heteromultiméricas.
[038]A presente invenção também fornece os imunoconjugados que compreendem uma proteína heteromultimérica da presente invenção conjugada com uma porção heteróloga. Qualquer porção heteróloga seria adequada, desde que a sua conjugação ao anticorpo substancialmente não reduzisse a função desejada e/ou característica do anticorpo. Por exemplo, em algumas realizações, um imunoconjugado compreende uma porção heteróloga que é um agente citotóxico. Em algumas realizações, dito agente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste em um isótopo radioativo, um agente quimioterapêutico e uma toxina. Em algumas realizações, dita toxina é selecionada a partir do grupo que consiste em calichemicina, maitansina e tricotena. Em algumas realizações, um imunoconjugado compreende uma porção heteróloga que é um marcador detectável. Em algumas realizações, dito marcador detectável é selecionado a partir do grupo que consiste em um isótopo radioativo, um membro de um par de ligante e receptor, um membro de um par de enzimas e substrato e um membro de um par de transferência de energia de ressonância de fluorescência.
[039] Em um outro aspecto, as células hospedeiras são fornecidas que compreendem um polinucleotídeo ou vetor recombinante que codifica um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem da proteína heteromultimérica descrita acima, em que a célula hospedeira não expressa um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem da proteína heteromultimérica. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o polipeptídeo contendo o ponto de clivagem é uma cadeia pesada de anticorpo. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, o polipeptídeo contendo o ponto de clivagem está emparelhado com uma cadeia leve de anticorpo. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a célula hospedeira é uma linhagem de célula estável. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a célula hospedeira é uma célula de mamífero. Em determinadas realizações, de acordo com (ou conforme aplicado) qualquer uma das realizações acima, a célula hospedeira é uma célula CHO.
[040] Outros objetos, aspectos e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da Descrição Detalhada da Invenção a seguir. Deve ser entendido, no entanto, que a Descrição Detalhada da Invenção e os Exemplos específicos, embora indicando as realizações de preferência da presente invenção, são fornecidos apenas a título de ilustração, uma vez que diversas alterações e modificações dentro do âmbito e espírito da presente invenção, serão evidentes para um técnico no assunto a partir da Descrição Detalhada da Invenção.
[041]Todas as referências citadas no presente são incorporadas como referência na sua totalidade.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[042]A Figura 1A ilustra um meio anticorpo totalmente oxidado. Não é mostrado a “saliência” ou “orifício” ou outros domínios de heterodimerização. O meio anticorpo representado nesta Figura é um isotipo IgG1. Um técnico no assunto irá considerar que outros isotipos de imunoglobulina podem ser visualizados como meio anticorpos com as correspondentes ligações intra e intercadeia. Em um Ab intacto, as cisteínas de clivagem irão formar as ligações de intercadeias de dissulfureto.
[043]A Figura 1B ilustra um anticorpo biespecífico de comprimento total. Não são representadas as ligações de intercadeia de dissulfeto na região de clivagem.
[044]A Figura 2 mostra os diagramas de fluxo de duas análises que podem ser utilizados para determinar a porcentagem (%) do meio anticorpo e a porcentagem (%) do anticorpo biespecífico covalente.
[045]A Figura 3 mostra a porcentagem (%) de anticorpo biespecífico formado quando um agente de redução é adicionado a uma cultura de células combinadas que compreende o primeiro anti-Alvo A de expressão da célula hospedeira de mamífero (saliência) e um segundo anti-Alvo B de expressão da célula hospedeira de mamífero (orifício) em 4 horas, 15 horas ou 24 horas antes da colheita do meio de cultura combinado.
[046]A Figura 4 mostra as aglomerações de captura de saliência e orifício que foram executadas em Tris-glicina SDS PAGE a 4 a 20%.
[047]A Figura 5A mostra o cromatograma de amostras separadas com base na hidrofobicidade para o anti-Alvo G em que o homodímero e o meio anticorpo coeluído em um pico largo. A Figura 5B mostra o cromatograma de amostras separadas com a base na hidrofobicidade para o anti-Alvo H.
[048]A Figura 6 mostra os resultados de espectrometria de massa para o anticorpo biespecífico anti-Alvo G / anti-Alvo H.
[049]A Figura 7A mostra os resultados de uma experiência de espectrometria de massa com a ionização de eletropulverição de tempo-de-voo (ESI-TOF MS) realizada em meio de cultura combinado não tratado e tratado com GSH, em que os anticorpos de meio de anti-Alvo A e anti-Alvo B foram segregados. A Figura 7B mostra uma ampliação do intervalo a partir de m/z de pico do anticorpo biespecífico. A Figura 7C mostra uma ampliação do intervalo de m/z de pico do meio anticorpo. ABREVIAÇÕES - ADCC = citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos; - API = imunoadesinas de antipatogênio; - BPI = bactericida / proteína de aumento de permeabilidade; - C1q = fator complementar 1q; - CD = aglomeração de diferenciação; - CDC = citotoxicidade dependente do complemento; - CH1 ou CH1 = primeiro domínio constante da cadeia pesada; - CH2 ou CH2 = segundo domínio constante da cadeia pesada; - CH3 ou CH3 = terceiro domínio constante da cadeia pesada; - CH4 ou CH4 = quarto domínio constante da cadeia pesada; - CL ou CL = domínio constante da cadeia leve; - CTLA = molécula associada ao linfócito T citotóxico; - Fc = fragmento cristalizável; - Fc(R = receptor gama para a porção Fc de IgG; - HIV = vírus da imunodeficiência humana; - ICAM = molécula de adesão intercelular; - BsAb = anticorpo biespecífico; - BsDb = diacorpo biespecífico; - dsFv = Fv estabilizado de dissulfureto; - Fc = fragmento constante de um anticorpo; - Fd = VH + CH1 de um anticorpo; - FcR = receptor Fc; - Fv = fragmento variável de um anticorpo; - IgG = imunoglobulina G; - mAb = anticorpo monoclonal; - PBL = linfócitos do sangue periférico; - scDb = diacorpo de cadeia simples; - scFv = Fv de cadeia simples; - (scFv)2 = tandem scFv-scFv; - Tandab = diacorpo tandem; - VH ou VH = domínio variável da cadeia pesada de um anticorpo, e -VL ou VL = domínio variável da cadeia leve de um anticorpo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[050]A presente invenção será descrita em detalhes por meio de referência, exclusivamente utilizando as seguintes definições e exemplos. Todas as patentes e publicações, incluindo todas as sequências descritas em tais patentes, e publicações referidas no presente são expressamente incorporadas como referência.
[051]A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente possuem o mesmo significado que normalmente entendido por um técnico no assunto em que a presente invenção pertence. Singleton, et al., Dictionary Of Microbiology And Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley e Sons, New York (1994), e Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary Of Biology, Harper Perennial, NY (1991) fornecem uma das técnicas com um dicionário geral de muitos dos termos utilizados na presente invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos no presente possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, estão descritos os métodos e materiais de preferência. Os intervalos numéricos são inclusivos dos números que definem o intervalo. A menos que indicado de outra maneira, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita na orientação 5’ a 3’; as sequências de amino ácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação de amino para carbóxi, respectivamente. Os médicos são especialmente direcionados a Sambrook et al., 1989, e Ausubel FM et al., 1993, para as definições e termos do estado da técnica. Deve ser entendido que a presente invenção não está limitada à metodologia, protocolos, e reagentes determinados descritos, uma vez que estes podem variar.
[052] Os intervalos numéricos são inclusivos dos números que definem o intervalo.
[053]A menos que indicado de outra maneira, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita na orientação 5’ para 3’; as sequências de amino ácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carbóxi, respectivamente.
[054] Os cabeçalhos apresentados no presente não são limitações dos diversos aspectos ou realizações da presente invenção, que podem ser obtidos como referência da especificação como um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo estão mais completamente definidos como referência à especificação como um todo.
I. DEFINIÇÕES
[055] O termo “heteromultímero”, “complexo heteromultimérico”, ou “proteína heteromultimérica” se refere a uma molécula que compreende um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve, e um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto. O heteromultímero pode compreender um “heterodímero” formado através do polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem, a primeira cadeia leve, o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem, e a segunda cadeia leve. De maneira alternativa, o heteromultímero, por exemplo, pode formar um anticorpo biespecífico. Os polipeptídeos do heteromultímero podem interagir entre si através de uma ligação não peptídica, covalente (por exemplo, a ligação de dissulfureto) e/ou uma interação não covalente (por exemplo, as ligações de hidrogênio, ligações iônicas, forças de van der Waals, e/ou interações hidrofóbicas).
[056] Conforme utilizado no presente, o termo “domínio de heteromultimerização” se refere às alterações ou adições a uma molécula biológica, de maneira a promover a formação do heteromultímero e impedir a formação do heteromultímero. Qualquer domínio de heterodimerização que possui uma forte preferência para a formação de heterodímeros através de homodímeros está dentro do âmbito da presente invenção. Os exemplos ilustrativos incluem, mas não estão limitados, por exemplo, ao pedido de patente US 2003/0.078.385 (Arathoon et al. - Genentech; descrevendo a saliência em orifícios); WO 2007/147901 (Kj^rgaard et al., Novo Nordisk: descrevendo as interações iônicas); WO 2009/089004 (Kannan et al., Amgen: descrevendo os efeitos de direção eletrostática); WO 2011/034605 (Christensen et al., Genentech; descrevendo as espirais enroladas). Vide também, por exemplo, Pack, P. & Plueckthun, A., Biochemistry 31, 1.579-1.584 (1992) descrevendo o fecho de leucina ou Pack et al., Bio/Technology 11, 1.271-1.277 (1993) descrevendo o motivo de hélice-retorno-hélice. A expressão “domínio de heteromultimerização” e “domínio de heterodimerização” são utilizados indiferentemente no presente.
[057]A frase “polipeptídeo contendo o ponto de clivagem”, conforme utilizada no presente, se refere a um polipeptídeo que compreende uma região correspondente à região de clivagem de uma imunoglobulina, conforme é entendido no estado da técnica, por exemplo, a região entre os domínios CH1 e CH2 da cadeia pesada. O termo “região de clivagem”, “sequência de clivagem”, e suas variações, conforme utilizados no presente, incluem o significado conhecido no estado da técnica, que é ilustrado, por exemplo, em Immunobiology de Janeway, (Garland Science, Taylor & Grupo Francis, LLC, NY) (7a ed, 2008); Bloom et al., Protein Science (1997), 6: 407415; Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209: 193-202. Vide também, por exemplo, Burton, Moles. Immunol. 22: 161-206 (1985) e Papadea, C. e I. J. Check (1989) “Human immunoglobulin G and immunoglobulin G subclasses: biochemical, genetic, and clinical aspects.” Crit Rev Clin Lab Sci 27 (1): 27-58. Será considerado por um técnico no assunto que o número de amino ácidos, bem como o número de resíduos de cisteína disponíveis para a formação de ligação de intercadeias de dissulfureto varia a partir de as classes e isotipos de imunoglobulinas. Todas essas regiões de clivagem podem estar nos polipeptídeos contendo o ponto de clivagem e estão dentro do âmbito da presente invenção. Em determinadas realizações, o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem compreende uma primeira cadeia pesada do anticorpo. Em determinadas realizações, a primeira cadeia pesada está associada com uma primeira cadeia leve para a formação de um primeiro meio anticorpo. O termo “anticorpo” é utilizado no presente no seu sentido mais amplo e se refere a qualquer molécula de imunoglobulina (Ig) que compreende duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, e qualquer fragmento, mutante, variante ou sua derivação, desde que exibam a atividade biológica desejada (por exemplo, o epítopo de atividade de ligação). Os exemplos de anticorpos incluem os anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, os anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpo, conforme descrito no presente. Um anticorpo pode ser humano, humanizado e/ou maturado da afinidade.
[058] Como uma estrutura de referência, conforme utilizado no presente, um anticorpo irá se referir à estrutura de uma imunoglobulina G (IgG). No entanto, um técnico no assunto iria entender / reconhecer que um anticorpo de qualquer classe de imunoglobulina pode ser utilizado no método da presente invenção descrito no presente. Para melhor entendimento, uma molécula de IgG contém um par de cadeias pesadas idênticas (HCs) e um par de cadeias leves idênticas (LCs). Cada LC possui um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL), enquanto cada HC possui uma variável (VH) e três domínios constantes (CH1, CH2, e CH3). Os domínios CH1 e CH2 estão ligados através de uma região de clivagem. Esta estrutura é bem conhecida no estado da técnica. Referência é feita à Figura 1B.
[059] Conforme utilizado no presente, o termo “meio anticorpo” se refere a uma cadeia pesada de imunoglobulina associada a uma cadeia leve de imunoglobulina. Um meio anticorpo exemplificativo está representado na Figura 1A. Um técnico no assunto irá considerar de imediato que um meio anticorpo também pode possuir um domínio de ligação ao antígeno que consiste em um domínio simples variável.
[060] O termo “maxicorpo” se refere a uma proteína de fusão que compreende um scFv fundido com um polipeptídeo Fc. Referência é feita à Figura 8a da publicação WO 2009/089004. Referência é feita à Figura 2 da publicação WO 2009/089004 para um maxicorpo biespecífico.
[061] O termo “domínio CH2” de uma região Fc de IgG humano normalmente se estende a cerca de 231 resíduos a cerca de 340 de IgG, de acordo com o sistema de numeração da EU. O domínio CH2 é único em que não está intimamente emparelhado com outro domínio. Em vez disso, as duas cadeias de carboidrato ramificadas ligadas ao N estão interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Foi especulado que o carboidrato pode fornecer um substituto para o pareamento de domínio- domínio e auxiliar a estabilizar o domínio CH2. Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985).
[062] O termo “domínio CH3” compreende o esticamento de resíduos C-terminais para um domínio CH2 em uma região Fc (isto é, a cerca de resíduo de amino ácido 341 a cerca de resíduo de amino ácido 447 de um IgG, de acordo com o sistema de numeração EU).
[063] O termo “região Fc”, conforme utilizado no presente, em geral, se refere a um complexo de dímero que compreende as sequências de polipeptídeo C-terminais de uma cadeia pesada de imunoglobulina, em que uma sequência de polipeptídeo C-terminal é aquela obtida através da digestão com a papaína de um anticorpo intacto. A região Fc pode compreender as sequências de Fc nativas ou variantes. Embora os limites da sequência de Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a sequência de Fc de IgG humano de cadeia pesada, em geral, é definida para esticar a partir de um resíduo de amino ácido a cerca da posição Cys226, ou a cerca da posição Pro230, à carboxila C-terminal da sequência Fc. A menos que especificado de outra maneira no presente, a numeração dos resíduos de amino ácidos na região Fc ou na região constante é de acordo com o sistema de numeração EU, também denominado índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. A sequência de Fc de uma imunoglobulina, em geral, compreende dois domínios constantes, um domínio CH2 e um domínio CH3, e opcionalmente compreende um domínio CH4. O termo “polipeptídeo Fc” se refere no presente a um dos polipeptídeos que formam uma região Fc, por exemplo, um Fc monomérico. Um polipeptídeo Fc pode ser obtido de qualquer imunoglobulina adequada, tal como os subtipos IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, IgA, IgE, IgD ou IgM. A região Fc compreende as porções carboxi-terminais de ambas as cadeias H mantidas juntas através do dissulfito. As funções efetoras de anticorpos são determinadas através das sequências na região Fc; esta região também é a parte reconhecida através dos receptores Fc (FcR) encontrados em determinados tipos de células. Em algumas realizações, um polipeptídeo Fc compreende parte ou a totalidade de uma sequência de clivagem de tipo selvagem (em geral, no seu N-terminal). Em algumas realizações, um polipeptídeo Fc não compreende uma sequência de clivagem de tipo selvagem ou funcional.
[064] Uma “região Fc funcional” possui uma “função efetora” de uma região Fc de sequência nativa. Os exemplos de “funções efetoras” incluem a ligação de C1q; CDC; ligação do receptor de Fc; ADCC; fagocitose; regulação negativa de receptores da superfície celular (por exemplo, o receptor de célula B; BCR), e similares. Tais funções efetoras, em geral, requerem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas utilizando as diversas análises conforme descritas, por exemplo, nas definições da presente invenção.
[065] Uma “região Fc de sequência nativa” compreende uma sequência de amino ácidos idêntica à sequência de amino ácidos de uma região Fc encontrada na natureza. As regiões Fc humanas de sequência nativa incluem uma região de Fc de IgG1 humanp de sequência nativa (não A e alotipos A); região Fc de IgG2 humana de sequência nativa; região Fc de IgG3 humana sequência nativa; e região Fc de IgG4 humana de sequência nativa, bem como as suas variantes de ocorrência natural.
[066] Uma “região Fc variante” compreende uma sequência de amino ácidos que difere de uma região Fc de sequência nativa em virtude de modificação com o ácido, pelo menos, um amino ácido, de preferência uma ou mais substituição(ões) de amino ácidos. De preferência, a região Fc variante possui, pelo menos, uma substituição de amino ácidos em comparação com uma região Fc de sequência nativa ou com a região Fc de um polipeptídeo progenitor, por exemplo, a cerca de uma a cerca de dez substituições de amino ácidos, e, de preferência, a cerca de uma a cerca de cinco substituições de amino ácidos em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo progenitor. A região Fc variante no presente, de preferência, irá possuir, pelo menos, cerca de 80% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo progenitor, e de preferência, pelo menos, cerca de 90% de homologia com este, de preferência, pelo menos, cerca de 95%, pelo menos, cerca de 96%, pelo menos, cerca de 97%, pelo menos, cerca de 98% ou, pelo menos, cerca de 99% de homologia com este.
[067] O termo “componente Fc”, conforme utilizado no presente, se refere a uma região de clivagem, um domínio CH2 ou um domínio CH3 de uma região Fc.
[068] Em determinadas realizações, o polipeptídeo contendo o ponto de clivagem compreende uma região Fc de IgG, de preferência, derivado a partir de uma região Fc de IgG humano de tipo selvagem. O termo Fc de IgG humano de “tipo selvagem” se refere a uma sequência de amino ácidos de ocorrência natural dentro da população humana. É evidente que, tal como a sequência de Fc ligeiramente pode variar entre indivíduos, uma ou mais alterações podem ser realizadas para uma sequência de tipo selvagem e ainda permanecer no âmbito da presente invenção. Por exemplo, a região Fc pode conter alterações adicionais que não estão relacionadas com a presente invenção, tal como uma mutação em um local de glicosilação ou a inclusão de um amino ácido não natural.
[069] O termo “região variável” ou “domínio variável” se refere ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo, em geral, possuem estruturas similares, com cada domínio que compreende quatro regiões conservadas estruturais (FR) e as três regiões hipervariáveis (HVRs). (Vide, por exemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6a ed., W. H. Freeman e Co., página 91 (2007).) Um domínio simples VH ou VL pode ser suficiente para conferir a especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno especial podem ser isolados utilizando um domínio VH ou VL a partir de um anticorpo que se liga ao antígeno para a varredura de uma biblioteca de domínios complementares VL ou VH, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).
[070] O termo “Fab”, conforme utilizado no presente, se refere a um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo. Conforme observado acima, a papaína pode ser utilizada para digerir um anticorpo intacto. A digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antígeno, isto é, os fragmentos “Fab”, e um fragmento “Fc” residual (isto é, a região Fc, acima). O fragmento Fab consiste em uma cadeia L inteira em conjunto com o domínio da região variável da cadeia H (VH) e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH1).
[071]A expressão “braço de ligação ao antígeno”, “braço de ligação à molécula alvo”, “braço de ligação do alvo” e suas variações, conforme utilizado no presente, se refere a um componente de uma proteína heteromultimérica da presente invenção que possui a capacidade de especificamente ligar um alvo de interesse. Em geral, e de preferência, o braço de ligação ao antígeno é um complexo de sequências polipeptídicas de imunoglobulina, por exemplo, as sequências de domínio variável e/ou CDR de uma imunoglobulina de cadeia leve e pesada.
[072] O termo “alvo” ou “molécula alvo” se refere a uma porção reconhecida por um braço de ligação da proteína heteromultimérica. Por exemplo, se a proteína heteromultimérica for um anticorpo, em seguida, o alvo pode ser epítopos em uma molécula simples ou em moléculas diferentes, ou um agente patogênico ou uma célula tumoral, dependendo do contexto. De maneira similar, se a proteína heteromultimérica for uma proteína de fusão do receptor Fc, o alvo seria o parceiro de ligação cognato para o receptor. Um técnico no assunto irá considerar que o alvo é determinado pela especificidade de ligação do braço de ligação do alvo e que diferentes braços de ligação do alvo podem reconhecer diferentes alvos. Um alvo, de preferência, se liga a uma proteína heteromultimérica da presente invenção com afinidade superior a 1 uM Kd (de acordo com a análise de Scatchard). Os exemplos de moléculas alvo incluem, mas não estão limitados às proteínas solúveis do soro e/ou seus receptores, tais como as citoquinas e/ou receptores de citoquina, adesinas, fatores de crescimento e/ou os seus receptores, hormônios, partículas virais (por exemplo, a proteína RSVF, CMV, StaphA, gripe, vírus da hepatite C), micorganismos (por exemplo, as proteínas de células bacterianas, células de fungos), adesinas, proteínas CD e os seus receptores.
[073] Um exemplo de um anticorpo “intacto” ou de “comprimento total” é aquele que compreende um braço de ligação ao antígeno bem como um CL e, pelo menos, os domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2, e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, os domínios constantes de sequência nativa humana) ou suas variantes de sequência de amino ácidos.
[074] O termo “acoplamento” conforme utilizado no presente, se refere às etapas necessárias para ligar os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem entre si, por exemplo, a formação de uma ligação covalente. Essas etapas compreendem a redução, recozimento e/ou oxidação de resíduos de cisteína nos polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem para a formação de uma ligação de intercadeias de dissulfureto. O acoplamento pode ser alcançado através da ligação cruzada química ou a utilização de um sistema redox. Vide, por exemplo, Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1998) 217: 1-10 e Zhu et al., Cancer Lett, (1994) 86: 127134.
[075] O termo “anticorpo multiespecífico” é utilizado no sentido mais amplo e especificamente abrange um anticorpo que possui a especificidade poliepitópica. Tais anticorpos multiespecíficos incluem, mas não estão limitados a um anticorpo que compreende um domínio de cadeia pesada variável (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL), em que a unidade de VHVL possui a especificidade poliepitópica, anticorpos que possuem dois ou mais domínios VL e VH com cada unidade VHVL se ligam a um epítopo diferente, anticorpos que possuem dois ou mais domínios simples variáveis com cada domínio variável simples se liga a um epítopo diferente, anticorpos de comprimento inteiros, fragmentos de anticorpos tais como o Fab, Fv, dsFv, scFv, diacorpo, diacorpos biespecíficos e triacorpos, fragmentos de anticorpo que foram ligados de maneira covalente ou não covalente. O termo “especificidade poliepitópica” se refere à capacidade para especificamente se ligar a dois ou mais epítopos diferentes no mesmo ou diferente alvo(s). O termo “monoespecífico” se refere à capacidade para se ligar apenas a um epítopo. De acordo com uma realização, o anticorpo multiespecífico é um anticorpo IgG que se liga a cada epítopo com uma afinidade de 5 μM a 0,001 pM, 3 μM a 0,001 pM, 1 μM a 0,001 pM, 0,5 μM a 0,001 pM, ou 0,1 μM a 0,001 pM. Um desenho ilustrativo de um biespecífico é fornecido na Figura 1B.
[076] O termo “fragmentos de anticorpo” compreende uma porção de um anticorpo intacto, de preferência, que compreende a ligação ao antígeno ou a uma região variável do anticorpo intacto. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem os fragmentos Fab, Fab’, F(ab')2, e Fv; diacorpos (dB); diacorpos em tandem (taDb), anticorpos lineares (por exemplo, patente US 5.641.870; Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1.057-1.062 (1995)); os anticorpos de um braço, anticorpos simples de domínio variável, minicorpos, moléculas de anticorpo de cadeia simples; anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo (por exemplo, incluindo, mas não limitado ao Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc).
[077]A expressão “anticorpos de domínio simples” (sdAbs) ou “ anticorpos de domínio variável simples (SVD)” em geral, se refere aos anticorpos em que um domínio variável simples (VH ou VL) pode conferir a ligação ao antígeno. Em outras palavras, o domínio variável simples não precisa interagir com outro domínio variável, para reconhecer o antígeno alvo. Os anticorpos de domínio único consistem em um domínio simples variável de anticorpo monomérico (VH ou VL) de cada braço de ligação de antígeno. Os exemplos de anticorpos de domínio simples incluem os derivados de camelídeos (camelos e lamas) e peixes cartilaginosos (por exemplo, os tubarões) e aqueles derivados a partir de métodos recombinantes a partir de seres humanos e os anticorpos de camundongos (Nature (1989) 341: 544-546; Dooley e Flajnik, Dev Comp Immunol (2006) 30: 43-56; Muyldermans et al., Trend Biochem Sci (2001) 26: 230-235; Holt et al., Trends Biotechnol (2003): 21: 484-490; publicações WO 2005/035572; WO 2003/035694; Davies e Riechmann, FEBS Lett (1994) 339: 285 -290; publicações WO 2000/29004; WO 02/051870). Um anticorpo simples de domínio variável pode estar presente em um braço da ligação ao antígeno (por exemplo, homo ou hetero-multímero) com outras regiões variáveis ou domínios variáveis, caso em que não é um anticorpo de domínio simples.
[078]A expressão “anticorpos lineares”, em geral, se refere aos anticorpos descritos em Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1.057-1.062 (1995). Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que, em conjunto com os polipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação ao antígeno. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.
[079] O termo “saliência-em-orifício” ou tecnologia “KNH”, conforme mencionado no presente, se refere à tecnologia de direcionar o pareamento de dois polipeptídeos em conjunto in vitro ou in vivo através da introdução de uma protuberância (saliência) para um polipeptídeo e uma cavidade (orifício) no outro polipeptídeo em uma interface em que eles interagem. Por exemplo, os KnHs foram introduzidos em interfaces de ligação de Fc:Fc, interfaces de CL:CH1 ou interfaces de VH/VL de anticorpos (por exemplo, as publicações US 2007/0.178.552, WO 1996/027011, WO 1998/050431 e Zhu et al., (1997) Protein. Science 6: 781-788). Isto é especialmente útil na direção do pareamento de duas cadeias pesadas diferentes em conjunto durante a fabricação de anticorpos multiespecíficos. Por exemplo, os anticorpos multiespecíficos que possuem o KnH nas suas regiões Fc ainda podem compreender os domínios variáveis simples ligados a cada região Fc, ou ainda podem compreender diferentes domínios variáveis de cadeia pesada que emparelhar com os domínios variáveis da cadeia leve similares ou diferentes. A tecnologia KnH também pode ser utilizada para emparelhar dois domínios extracelulares dos receptores diferentes em conjunto ou quaisquer outras sequências polipeptídicas que compreendem as sequências de reconhecimento de alvo diferentes (por exemplo, incluindo aficorpos pepticorpos, e outras fusões de Fc).
[080] O termo “Fv” consiste em um dímero de um domínio de região variável de cadeia pesada e leve em associação não covalente e próxima. A partir da dobradura destes dois domínios, emanam seis alças hipervariáveis (3 voltas cada a partir da cadeia H e L) que contribuem para que os resíduos de aminoácidos se liguem ao antígeno e confiram especificidade de ligação do antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um domínio simples variável (ou metade de um Fv que apenas compreende três CDRs específicos para um antigênio) possui a capacidade de reconhecer e ligar o antígeno, embora em menor afinidade do que o site de ligação inteiro.
[081] O termo “Fv de cadeia simples”, também abreviado como “sFv” ou “scFv” são fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios de anticorpos VH e VL ligados a uma cadeia polipeptídica simples. De preferência, o polipeptídeo sFv adicionalmente compreende um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL, que possibilita que o sFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno. Para uma revisão do sFv, vide Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, volume 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, páginas 269 - 315 (1994); Malmborg et al., J. Immunol. Methods 183: 7-13, 1995.
[082] O termo “diacorpos” se refere a pequenos fragmentos de anticorpos preparados a partir da construção de fragmentos sFv (vide o parágrafo anterior), com ligantes curtos (cerca de 5 a 10 resíduos) entre os domínios VH e VL, de tal maneira que o pareamento intercadeia mas não intracadeia, dos domínios V é obtido, resultando em um fragmento bivalente, isto é, um fragmento que possui dois locais de ligação ao antígeno. Os diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos “cruzados” sFv, em que os domínios VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em diferentes cadeias polipeptídicas. Os diacorpos estão descritos com mais detalhes, por exemplo, nas publicações EP 404.097; WO 1993/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6.444 - 6.448 (1993).
[083] O termo “anticorpo de um braço” ou “anticorpos de um braço” se refere a um anticorpo que compreende (1) um domínio variável ligado através de uma ligação peptídica ao polipeptídeo que compreende um domínio CH2, um domínio CH3 ou um domínio CH2-CH3 e (2) um segundo domínio CH2, CH3 ou CH2-CH3, em que um domínio variável não está ligado através de uma ligação peptídica a um polipeptídeo que compreende o segundo domínio CH2, CH3 ou CH2-CH3. Em uma realização, o anticorpo de um braço compreende 3 polipeptídeos (1) um primeiro polipeptídeo que compreende um domínio variável (por exemplo, VH), CH1, CH2 e CH3, (2) um segundo polipeptídeo que compreende um domínio variável (por exemplo, VL) e um domínio CL, e (3) um terceiro polipeptídeo que compreende um domínio CH2 e CH3. Em outra realização, o anticorpo de um braço possui uma região de clivagem parcial que contém os dois resíduos de cisteína que formam as ligações de dissulfureto que ligam as cadeias pesadas constantes. Em uma realização, os domínios variáveis do anticorpo de um braço formam uma região de ligação ao antígeno. Em uma outra realização, os domínios variáveis do anticorpo de um braço são domínios variáveis simples, em que cada um domínio simples variável é uma região de ligação ao antígeno. Em uma realização, o anticorpo de um braço é um domínio simples variável de anticorpo.
[084] Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos “quiméricos” em que uma porção da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos específicos, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é(são) idênticas ou homólogas às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como os fragmentos de tais anticorpos, enquanto apresentarem a atividade biológica desejada (patente US 4.816.567; e Morrison et al., Proc Natl Acad Sci EUA. 81: 6.851-6.855 (1984)). Os anticorpos quiméricos de interesse no presente incluem os anticorpos primatizados que compreendem as sequências de ligação ao antígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, o macaco do velho mundo, símeo, e similares) e as sequências da região constante humana.
[085]As formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, os roedores) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada de anticorpo não humano. Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não a humana (anticorpo do doador, tais como o camundongo, rato, coelho ou primatas não humanos, que possuem a especificidade, afinidade e/ou capacidade desejada de anticorpo, afinidade, e capacidade desejada. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos correspondentes não humanos. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender os resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo do ador. Estas modificações são realizadas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado substancialmente irá compreender todos, pelo menos um e, normalmente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma sequência de imunoglobulina não humana, e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado, opcionalmente, também irá compreender, pelo menos, uma porção da região constante da imunoglobulina (Fc), normalmente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, vide, por exemplo, Jones et al., Nature 321: 522 - 525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323 - 329 (1988), e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593 - 596 (1992).
[086] O termo “pepticorpo” ou “pepticorpos” se refere a uma fusão de peptídeos aleatoriamente gerados com um domínio de Fc. Vide patente US 6.660.843, depositada em 09 de dezembro de 2003 de Feige et al., (Incorporada como referência na sua totalidade). Eles incluem um ou mais peptídeos ligados ao N-terminal, C-terminal, cadeias secundárias de amino ácidos, ou mais de um destes locais. A tecnologia de pepticorpo possibilita a concepção de agentes terapêuticos que incorporam os peptídeos que possuem como alvo um ou mais ligantes ou receptores, peptídeos tumorais migrantes, peptídeos de transporte de membrana, e similares. A tecnologia de pepticorpo provou útil na concepção de um número de tais moléculas, incluindo os peptídeos de restrição de dissulfureto e lineares, “multímeros de peptídeos em tandem” (isto é, superior a um peptídeo de uma cadeia simples de um domínio de Fc). Vide, por exemplo, patente US 6.660.843; pedido de patente US 2003/0195156, depositado em 16 de outubro de 2003 (correspondente à publicação WO 2002/092620, depositada em 21 de novembro de 2002); pedido de patente US 2003/0.176.352, depositado em 18 de setembro de 2003 (correspondente à publicação WO 2003/031589, depositada em 17 abril, 2003); patente US 6.835.809 (correspondente à publicação WO 2000/24770, depositada em 04 de maio de 2000); pedido de patente US 2003/0.229.023, depositado em 11 de dezembro, 2003; publicação WO 2003/057134, depositada em 17 de julho de 2003; pedido de patente US 2003/0.236.193, publicação em 25 de dezembro de 2003 (correspondente à PCT / US 2004/010989, depositada em 08 de abril de 2004); patente US 6.919.426, depositada em 18 de setembro de 2003 (correspondente à publicação WO 2004/026329, depositada em 01 de abril de 2004), cada um dos quais está incorporado no presente como referência na sua totalidade.
[087] O temo “aficorpos” ou “aficorpo” se refere à utilização de uma proteína ligada através da ligação peptídica a uma região Fc, em que a proteína é utilizada como um andaime para fornecer uma superfície de ligação de uma molécula alvo. A proteína muitas vezes é uma proteína de ocorrência natural, tal como a proteína A estafilocócica ou o domínio B de ligação IgG, ou a proteína Z derivada (vide Nilsson, et al., (1987), Prot Eng 1, 107-133, e patente 5.143.844) ou um fragmento ou seu derivado. Por exemplo, os aficorpos podem ser criados a partir de variantes de proteínas Z com afinidade alterada de ligação à(s) molécula(s) alvo(s), em que um segmento da proteína Z foi mutado através da mutagênese aleatória, para criar uma biblioteca de variantes capazes de se ligar a uma molécula alvo. Os exemplos de aficorpos incluem a patente US 6.534.628, Nord K. et al., Prot Eng 8: 601-608 (1995) e K Nord et al., Nat Biotech 15: 772-777 (1997). Biotechnol Appl Biochem. Junho de 2008; 50 (Pt 2): 97-112.
[088] Conforme utilizado no presente, o termo “imunoadesina” indica as moléculas que combinam a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga (uma “adesina”) com as funções efetoras dos domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma sequência de amino ácidos com uma especificidade de ligação desejada, em que a sequência de amino ácidos é diferente do reconhecimento de antígeno e do local de ligação de um anticorpo (isto é, é “heteróloga” em comparação com uma região constante de um anticorpo), e uma sequência de domínio constante de imunoglobulina (por exemplo, sequência CH2 e/ou CH3 de um IgG). As sequências de adesina exemplificativos incluem as sequências de amino ácidos contíguos que compreendem uma porção de um receptor ou um ligante que se liga a uma proteína de interesse. As sequências de adesina também podem ser sequências que se ligam a uma proteína de interesse, mas não são sequências receptoras ou ligantes (por exemplo, as sequências de adesina em pepticorpos). Tais sequências polipeptídicas podem ser selecionadas ou identificadas por diversos métodos, que incluem as técnicas de exibição em fagos e métodos de triagem de rendimento elevado. A sequência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tais como os subtipos IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, IgA (incluindo IgA 1 e IgA 2), IgE, IgD ou IgM.
[089] O termo “complexo” ou “complexado”, conforme utilizado no presente, se refere à associação de duas ou mais moléculas que interagem entre si através de ligações e/ou forças (por exemplo, as forças hidrofílicas e hidrofóbicas de van der Waals) que são ligações não peptídicas. Em uma realização, o complexo é heteromultimérico. Deve ser entendido que o termo “complexo de proteína” ou “complexo polipeptídeo”, conforme utilizado no presente, inclui os complexos que possuem uma entidade não de proteína conjugada com uma proteína no complexo de proteínas (por exemplo, incluindo, mas não limitado às moléculas químicas, tais como uma toxina ou um agente de detecção).
[090] Uma proteína heteromultimérica da presente invenção “que se liga a um antígeno de interesse é aquela que se liga ao alvo com afinidade suficiente de maneira que a proteína heteromultimérica é útil como agente de diagnóstico e/ou terapêutico no direcionamento de uma proteína ou de uma célula ou tecido que expressa o alvo, e não significativamente reage de maneira cruzada com outras proteínas. Em tais realizações, a extensão da ligação da proteína heteromultimérica para uma proteína “não alvo” será inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo a sua proteína alvo especial, conforme determinado por análise de triagem de células ativadas por fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA) ou teste ELISA. Em relação à ligação de um polipeptídeo a uma molécula alvo, o termo “ligação específica” ou “especificamente se liga” ou é “específico para” um polipeptídeo especial ou um epítopo em um alvo polipeptídeo especial significa a ligação que é mensuravelmente diferente de uma interação não específica (por exemplo, uma interação não específica pode ser a ligação à albumina de soro bovino ou caseina). A ligação específica pode ser medida, por exemplo, através da determinação da ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula de controle. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada por meio da competição com uma molécula de controle que é similar ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não marcado. Neste caso, a ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado para uma sonda é inibida competitivamente pelo excesso de alvo não marcado. O termo termo “ligação específica” ou “especificamente se liga” ou é “específico para” um polipeptídeo especial ou um epítopo em um alvo polipeptídeo especial, conforme utilizado no presente, pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula que possui um Kd para o alvo de, pelo menos, cerca de 200 nM, de maneira alternativa, pelo menos, cerca de 150 nM, de maneira alternativa, pelo menos, cerca de 100 nM, de maneira alternativa, pelo menos, cerca de 60 nM, de maneira alternativa, pelo menos, cerca de 50 nM, de maneira alternativa, pelo menos, cerca de 40 nM, de maneira alternativa, pelo menos, cerca de 30 nM, de maneira alternativa, pelo menos, cerca de 20 nM, de maneira alternativa, pelo menos, cerca de 10 nM, de maneira alternativa, pelo menos, cerca de 8 nM, de maneira alternativa, pelo menos, cerca de 6 nM, de maneira alternativa, pelo menos, cerca de 4 nM, de maneira alternativa, pelo menos, cerca de 2 nM, de maneira alternativa, pelo menos, cerca de 1 nM, ou superior. Em uma realização, o termo “ligação específica” se refere a uma ligação em que a proteína heteromultimérica se liga a um polipeptídeo especial ou epítopo em um polipeptídeo especial, sem substancialmente se ligar a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo.
[091] O termo “afinidade de ligação”, em geral, se refere à resistência da soma total de interações não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e o seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra maneira, conforme utilizado no presente, o termo “afinidade de ligação” se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre os membros de um par de ligação (por exemplo, o anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para o seu parceiro Y, em geral, pode ser representada pela constante de dissociação (Kd). Por exemplo, o valor de Kd pode ser cerca de 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM, ou mais forte. A afinidade pode ser medida através dos métodos comuns conhecidos no estado da técnica, incluindo aqueles descritos no presente. Os anticorpos de afinidade baixa, em geral, se ligam ao antígeno lentamente e tendem a se dissociar facilmente, enquanto os anticorpos de afinidade elevada, em geral, se ligam ao antígeno mais rapidamente e tendem a permanecer mais tempo ligados. Uma variedade de métodos de medição da afinidade de ligação é conhecida no estado da técnica, qualquer um dos quais pode ser utilizado para os propósitos da presente invenção.
[092] Em uma realização, o “Kd” ou “valor de Kd, de acordo com a presente invenção, é medido utilizando as análises de ressonância de plasmons de superfície utilizando um BIAcoreTM-2000 ou um BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25° C, com alvo imobilizado (por exemplo, o antígeno) chips CM5 a cerca de 10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, os chips biossensores de dextrano carboximetilados (CM5, BIAcore Inc.) são ativados com o cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)- carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS), de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com o acetato de sódio a 10 mM, pH 4,8, para 5 μg/mL (cerca de 0,2 μM) antes da injeção a uma taxa de fluxo de 5 μl/minuto para alcançar cerca de10 unidades de resposta (UR) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, a etanolamina a 1 M é injetada para bloquear os grupos não reagidos. Para as medições da cinética, duas diluições em série de Fab (por exemplo, de 0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com Tween 20 a 0,05% (PBST) a 25° C com uma taxa de fluxo de cerca de 25 μl/minuto. As taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas utilizando um modelo de ligação de um-para-um de Langmuir simples (BIAcore Evaluation Software versão 3.2) através da montagem simultânea do sensorgrama de associação e dissociação. A constante de dissociação do equilíbrio (Kd) é calculada como a proporção entre Koff / Kon. Vide, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999). Se a taxa on exceder 106 M-1 S-1 através da análise de ressonância de plasmons de superfície acima, por conseguinte, a taxa on pode ser determinada utilizando uma técnica de resfriamento brusco de fluorescência que mede o aumento ou redução na intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm passa-faixa (band-pass)), a 25° C de um anticorpo do anti-antígeno de 20 nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno, conforme medido em um espectrômetro, espectrofotômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ou espectrofotômetro SLM-AMINCO® da série 8000 (ThermoSpectronic) com um cuvete agitado.
[093] Os termos “biologicamente ativo” e “atividade biológica” e “características biológicas” em relação a uma proteína heteromultimérica da presente invenção, tal como um seu anticorpo, fragmento ou derivado, se refere à capacidade de se ligar a uma molécula biológica, exceto quando especificado em contrário.
[094] O termo “isolado”, quando utilizado para descrever os diversos polipeptídeos do heteromultímero se refere a um heteromultímero que foi separado e/ou recuperado a partir de uma célula ou cultura de célula a partir da qual foi expressado. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são os materiais que iriam interferir com as utilizações diagnósticas ou terapêuticas para o heteromultímero, e podem incluir as enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em determinadas realizações, o heteromultímero será purificado (1) superior a 95% em peso de proteína, conforme determinado através do método de Lowry, e de maior preferência, superior a 99% em peso, (2) a um grau suficiente para obter, pelo menos, 15 resíduos da sequência de amino ácidos N-terminal ou interna através da utilização de um sequenciador de copo rotativo, ou (3) à homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições de redução ou de não redução utilizando a Coomassie de coloração azul ou, de preferência, prata. Habitualmente, entretanto, o polipeptídeo isolado será preparado através de, pelo menos, uma etapa de purificação.
[095] Os heteromultímeros da presente invenção em geral, são purificados até à homogeneidade substancial. Os termos “substancialmente homogêneo”, “forma substancialmente homogênea” e “homogeneidade substancial” são utilizados para indicar que o produto é substancialmente isento de subprodutos originados a partir de combinações indesejadas de polipeptídeo (por exemplo, os homomultímeros).
[096] Expressa em termos de pureza, o termo “homogeneidade substancial” se refere à quantidade de subprodutos que não excede 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 4%, 3%, 2% ou 1% em peso ou é inferior a 1% em peso. Em uma realização, o subproduto é inferior a 5%.
[097] O termo “molécula biológica” se refere a um ácido nucleico, uma proteína, um carboidrato, um lipídeo, e suas combinações. Em uma realização, a molécula biológica existe na natureza.
[098] O termo “ligado” ou “ligações, conforme utilizado no presente, significa um ligante de ligação peptídica direta entre uma primeira e segunda sequência de amino ácido ou um ligante que envolve uma terceira sequência de amino ácido que é o peptídeo ligado na e entre a primeira e segunda sequência de amino ácidos. Por exemplo, um peptídeo ligante ligado ao término do C-terminal de uma sequência de amino ácidos e ao término do N-terminal de outra sequência de amino ácidos.
[099] O termo “ligante”, conforme utilizado no presente, significa uma sequência de amino ácidos de dois ou mais amino ácidos de comprimento. O ligante pode consistir em amino ácidos polares ou não polares neutros. Um ligante, por exemplo, pode ser de 2 a 100 amino ácidos de comprimento, tal como entre 2 e 50 amino ácidos de comprimento, por exemplo, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 amino ácidos de comprimento. Um ligante pode ser “clivável”, por exemplo, por autoclivagem, ou clivagem enzimática ou química. Os locais de clivagem em sequências de amino ácidos e enzimas e químicos que clivam em tais locais são bem conhecidos no estado da técnica e também estão descritos no presente.
[0100] O termo uma “corrente”, conforme utilizado no presente, se refere a um ligante de amino ácidos que junta duas outras sequências de amino ácidos. Uma corrente, conforme descrito no presente pode ligar o N- terminal de um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina com o C- terminal de um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina. Em realizações especiais, uma corrente está entre cerca de 15 e 50 amino ácidos de comprimento, por exemplo, entre 20 e 26 amino ácidos de comprimento (por exemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou 26 amino ácidos de comprimento). Uma corrente pode ser “clivável”, por exemplo, por autoclivagem, ou clivagem enzimática ou química utilizando os métodos e reagentes padrões no estado da técnica.
[0101]A clivagem enzimática de um “ligante” ou uma “corrente” pode envolver a utilização de uma endopeptidase, tais como, por exemplo, Lys- C, Asp-N, Arg-C, V8, Glu-C, quimotripsina, tripsina, pepsina, papaína, trombina, Genenase, Fator Xa, TEV (protease de cisteína do vírus causticador de tabaco), enterocinase, HRV C3 (protease C3 de rinovírus humano), Kininogenase, bem como a convertase de pró-proteina de tipo subtilisina (por exemplo, a furina (PC1), PC2, ou PC3) ou convertase dibásica de N-arginina. A clivagem química pode envolver a utilização, por exemplo, da hidroxilamina, N- clorossuccinimida, N-bromossuccinimida, ou brometo de cianogênio.
[0102] O termo “local de clivagem para a endopeptidase Lys-C”, conforme utilizado no presente, é um resíduo de lisina em uma sequência de amino ácidos que pode ser clivado no lado C-terminal através de endopeptidase Lys-C. A endopeptidase Lys-C cliva no lado C-terminal de um resíduo de lisina.
[0103] O termo um “agente caotrópico” se refere a uma substância hidrossolúvel que interrompe a estrutura tridimensional de uma proteína (por exemplo, um anticorpo) através da interferição com a estabilização das interações intramoleculares (por exemplo, as ligações de hidrogênio, forças de van der Waals, ou efeitos hidrofóbicos). Os exemplos de agentes caotrópicos incluem, mas não estão limitados à ureia, guanidina-HCl, perclorato de lítio, histidina e arginina.
[0104] O termo um “detergente” se refere a uma substância hidrossolúvel que interrompe a estrutura tridimensional de uma proteína (por exemplo, um anticorpo) através da interferência com a estabilização das interações intramoleculares (por exemplo, as ligações de hidrogênio, forças de van der Waals, ou efeitos hidrofóbicos), mas que não impede de maneira permanente a estrutura da proteína como a causa de uma perda de atividade biológica (isto é, não desnaturam a proteína). Os exemplos de detergentes suaves incluem, mas não estão limitados ao Tween (por exemplo, o Tween- 20), Triton (por exemplo, o Triton X-100), NP-40 (fenoxilpolietoxiletanol nonila), Nonidet P-40 (fenoxilpolietoxiletanol octila), e sulfato de dodecila de sódio (SDS).
[0105]As “funções efetoras” do anticorpo se referem às atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc de sequência de amino ácidos variante) de um anticorpo e variam com o isotipo de anticorpo. Os exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: a ligação de C1q e citotoxicidade dependente do complemento; a ligação ao receptor de Fc; a citotoxicidade mediada através de células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores da superfície celular (por exemplo, o receptor de célula B); e a ativação de células B.
[0106] O termo “citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos” ou “ADCC” se refere a uma maneira de citotoxicidade em que o Ig segregado ligado aos receptores Fc (FcRs) presente em determinadas células citotóxicas (por exemplo, as células assassinas naturais (NK), neutrófilas, e macrófagos) possibilita que estas células efetoras citotóxicas especificamente se liguem a uma célula alvo antigene e posteriormente matam a célula alvo com os agentes citotóxicos. Os anticorpos “armam” as células citotóxicas e são absolutamente necessários para tal matança. As células primárias para mediar o ADCC, células NK, somente expressam o FCYRIII, enquanto que os monócitos expressam o FCYRI, FCYRII e FCYRIII. A expressão de FcR nas células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, uma análise de ADCC in vitro, conforme descrito na patente US 5.500.362 ou 5.821.337 pode ser realizada. As células efetoras úteis para tais análises incluem as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (NK). De maneira alternativa ou adicional, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como o descrito em Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 95: 652-656 (1998).
[0107] O termo “receptor de Fc” ou “FcR” descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR, de preferência, é um FcR humano. Além disso, um FcR, de preferência, é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui os receptores das subclasses FcyRI, FcyRII, e FcyRIII, incluindo as formas de variantes alélicas e de emenda alternativa destes receptores. Os receptores FcyRII incluem o FcyRIIA (um “receptor de ativação”) e FcyRIIB (um “receptor de inibição”), que possuem as sequências de amino ácidos similares que principalmente diferem nos seus domínios citoplasmáticos. A ativação do receptor FcyRIIA contém um motivo imunorreceptor de ativação com base em tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático. A inibição do receptor de FcyRIIB contém um motivo imunorreceptor de inibição com base em tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático (vide a revisão de M. Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). Os FcR são revisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Outros FcR, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados através do termo “FcR” no presente. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgG materno para o feto (Guyer et al., J. Immunol 117: 587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).
[0108]As “células efetoras humanas” são leucócitos que expressam um ou mais FcR e desempenham funções efetoras. De preferência, as células expressam, pelo menos, o FcyRIII e executam a função efetora de ADCC. Os exemplos de leucócitos humanos que medeiam o ADCC incluem as células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células assassinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilas; com as células PBMCs e NK sendo de preferência. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa, por exemplo, a partir do sangue.
[0109] O termo “citotoxicidade dependente do complemento” ou “CDC” se refere à lise de uma célula alvo na presença de complemento. A ativação da via clássica do complemento é iniciada através da ligação do primeiro componente do sistema do complemento (C1q) aos anticorpos (da subclasse adequada) que estão ligados ao seu antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemento, uma análise de CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996), pode ser realizada.
[0110] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere a uma quantidade de um anticorpo, fragmento de anticorpo, ou derivado para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo. No caso de tumor (por exemplo, um tumor canceroso), a quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, um anticorpo multiespecífico ou fragmento de anticorpo) pode reduzir o número de células cancerosas; reduzir o tamanho do tumor primário; inibir (isto é, atrasar até certo ponto e, de preferência, interromper) a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; inibir (isto é, atrasar até certo ponto e, de preferência, interromper) a metástase do tumor; inibir, até certo ponto, o crescimento do tumor; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados ao distúrbio. Para a extensão do anticorpo ou do fragmento de anticorpo pode prevenir o crescimento e/ou matar as células cancerosas existentes, pode ser citostático e/ou citotóxico. Para a terapia de câncer, a eficácia in vivo, por exemplo, pode ser medida avaliando o tempo de sobrevivência, o tempo para a progressão da doença (TTP), taxas de resposta (RR), duração da resposta, e/ou qualidade de vida.
[0111] O termo “reduzir ou inibir” se refere à capacidade para causar uma redução global, de preferência, de 20% ou superior, de maior preferência, de 50% ou superior e, de maior preferência ainda, de 75%, 85%, 90%, 95%, ou superior. Reduzir ou inibir pode se referir aos sintomas do distúrbio a ser tratado, a presença ou o tamanho das metástases, o tamanho do tumor primário, ou o tamanho ou número de vasos sanguíneos em distúrbios angiogênicos.
[0112] Os termos “câncer” e “canceroso” se referem ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que normalmente é caracterizada através do crescimento / proliferação desregulado de células. Estão incluídos nesta definição os cânceres benignos e malignos. Os exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados ao carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Mais exemplos especiais de tais cânceres incluem o câncer de células escamosas, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritoneu, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou do estômago, incluindo o câncer gastrintestinal, câncer pancreático, glioblastoma, glioma, câncer do colo do útero, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, endometrial ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer do rim (por exemplo, o carcinoma de células renais), câncer do fígado, câncer da próstata, câncer vulvar, câncer da tiróide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pênis, melanoma, e diversos tipos de câncer de cabeça e pescoço. O termo “fase precoce do câncer” se refere a um câncer que não é invasivo ou metastático ou é classificado como um Estágio 0, I ou II do câncer. O termo “pré-canceroso” se refere a uma condição ou a um crescimento que normalmente precede ou se desenvolve em um câncer. O termo “não metastático” se refere a um câncer que é benigno ou que permanece no local primário e não foi penetrado no sistema linfático ou vaso sanguíneo ou tecidos diferentes do local primário. Em geral, um câncer não metastático é qualquer tipo de câncer que é um câncer de Estágio 0, I, ou II, e, ocasionalmente, o câncer de Estágio III.
[0113] O termo “distúrbio alérgico ou inflamatório” no presente é uma doença ou distúrbio que resulta de um hiperativação do sistema imunitário de um indivíduo. Os exemplos de distúrbios alérgicos ou inflamatórios incluem, mas não estão limitados à asma, psoríase, artrite reumatóide, dermatite atópica, esclerose múltipla, lúpus sistêmico, eritematoso, eczema, transplante de órgãos, degeneração mucular relacionada com a idade, doença de Crohn, colite ulcerosa, esofagite eosinofílica, e doenças autoimunes associadas com a inflamação.
[0114] O termo “doença autoimune” no presente é uma doença ou distúrbio decorrente e direcionada contra os próprios tecidos de um indivíduo ou um seu cosegregado ou sua manifestação ou sua condição resultante. Os exemplos de doenças ou distúrbios autoimunes incluem, mas não estão limitados à artrite (artrite reumatóide, tais como a artrite aguda, artrite reumatóide crônica, artrite gotosa, artrite gotosa aguda, artrite inflamatória crônica, artrite degenerativa, artrite infecciosa, artrite de Lyme, artrite proliferativa, artrite psoriática, artrite vertebral, e artrite reumatoide juvenil, osteoartrite, artrite crônica progrediente, artrite deformante, poliartrite crônica primaria, artrite reativa, e espondilite anquilosante), doenças da pele hiperproliferativas inflamatórias, psoríase, tais como a psoríase em placas, psoríase gutatte, psoríase pustular, e psoríase das unhas, dermatite incluindo a dermatite de contato, dermatite de contato crônica, dermatite alérgica, dermatite de contato alérgica, dermatite herpetiforme, e dermatite atópica, síndrome IgM hiper ligada ao x, urticária tais como a urticária alérgica crônica e urticária idiopática crônica, incluindo a urticária autoimune crônica, polimiosite / dermatomiosite, dermatomiosite juvenil, necrólise epidérmica tóxica, esclerodermia (incluindo a esclerodermia sistêmica), esclerose, tais como a esclerose sistêmica, esclerose múltipla (MS) tais como o MS spino-ótico, MS progressivo primário (PPMS), e MS recidivante remitente (RRMS), esclerose sistêmica progressiva, aterosclerose, arteriosclerose, esclerose disseminada, e esclerose atáxica, doença inflamatória do intestino (IBD) (por exemplo, a doença de Crohn, doenças gastrointestinais mediadas por autoimunes, colite, tais como a colite ulcerativa, colite ulcerosa, colite microscópica, colite colagenosa, colite poliposa, enterocolite necrotizante, e colite transmural, e doença do intestino inflamatório autoimune), pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangite esclerosante primária, episclerite), síndrome de angústia respiratória, incluindo o síndrome da angústia respiratória adulta ou aguda (ARDS), meningite, inflamação de toda ou parte da úvea, irite, coroidite, um distúrbio hematológico autoimune, espondilite reumatóide, perda súbita da audição, doenças mediadas por IgE, tais como a rinite anafilaxia e alérgica e atópica, encefalite, tal como a encefalite de Rasmussen e/ou encefalite de tronco e límbica, uveíte, tais como a uveíte anterior, uveíte anterior aguda, uveíte granulomatosa, uveíte não granulomatosa, uveíte facoantigênica, uveíte posterior, ou uveíte autoimune, glomerulonefrite (GN), com e sem o síndroma nefrótico, tal como o glomerulonefrite crônico ou agudo, tal como o GN primário, GN imunomediado, GN membranoso (nefropatia membranosa), GN idiopático membranoso ou nefropatia membranosa idiopática, GN proliferativo de membrano ou membranoso (MPGN), incluindo o tipo I e tipo II, e GN rapidamente progressivo, condições alérgicas, reação alérgica, eczema incluindo o eczema alérgico ou atópico, asma, tais como a asma da bronquite, asma brônquica, asma autoimune, condições que envolvem a infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas, doença crônica pulmonar inflamatória, miocardite autoimune, deficiência de adesão dos leucócitos, lúpus eritematoso sistêmico (LES) ou lúpus eritematoso sistêmico tais como o SLE cutâneo, lúpus eritematoso cutâneo subagudo, síndrome de lúpus neonatal (NLE), disseminatus lupus eritematoso, lúpus (incluindo o nefrite, cerebritis, pediátrica, não renal, extra-renal, discóide, alopecia), diabetes do melito juvenil (Tipo I), incluindo a diabetes do melito dependente de insulina pediátrica (IDDM), diabetes do melito adulta (diabetes do Tipo II), diabetes autoimunes, diabetes insípida idiopática, respostas imunológicas associadas com a hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citoquinas e linfitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo a granulomatose linfomatóide, granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculite, incluindo a vasculite (incluindo a vasculite de grandes vasos (incluindo a polimialgia reumática e arterite (de Takayasu) de células gigantes), vasculite de recipiente médio (incluindo a doença de Kawasaki e poliartrite nodosa), poliarterite microscópica, vasculite do CNS, vasculite necrotizante, cutânea, ou de hipersensibilidade, necrosante sistêmica, e vasculite associada ao ANCA, tais como a vasculite ou síndrome de Churg-Strauss (CSS)), artrite temporária, anemia aplástica, anemia aplástica autoimune, anemia positiva de Coombs, anemia hemolítica de anemia de Diamond Blackfan ou anemia hemolítica imune incluindo a anemia hemolítica autoimune (AIHA), anemia perniciosa (anemia perniciosa), doença de Addison, anemia pura dos glóbulos vermelhos ou aplasia (PRCA), deficiência de Fator VIII, hemofilia A, neutropenia autoimune, pancitopenia, leucopenia, doenças envolvendo os leucócitos diapedese, distúrbios inflamatórios CNS, síndrome de lesão de múltiplos órgãos, tais como aquelas doenças secundárias a septicemia, trauma ou hemorragia, doenças mediadas por antígeno-anticorpo, doença da membrana basal anti-glomerular, síndrome do anticorpo do antifosfolipídeo, neurite alérgica, Behcet ou doença de Bechet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, sindroma de Stevens-Johnson, penfigóide, tais como o penfigóide bolhoso e penfigóide de pele, pênfigo (incluindo o pênfigo vulgar, pênfigo foliáceo, penfigóide da membrana de muco de pênfigo, e eritematoso pênfigo), poliendocrinopatias autoimunes, doença ou síndrome de Reiter, complexo de nefrite imune, nefrite mediada por anticorpos, neuromielite ótica, polineuropatias, neuropatia crônica, tais como as polineuropatias de IgM ou neuropatia mediada por IgM, trombocitopenia (desenvolvido por pacientes com enfarte do miocárdio, por exemplo), incluindo a púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) e trombocitopenia autoimune ou mediada imune, tais como a púrpura idiopática trombocitopénica (ITP), incluindo a ITP aguda ou crônica, doença autoimune do testículo e ovário, incluindo a orquite autoimune e ooforite, hipotiroidismo primário, hipoparatiroidismo, doenças endócrinas autoimunes, incluindo a tiroidite tal como a tiroidite autoimune, doença de Hashimoto, tiroidite crônica (tiroidite de Hashimoto), ou tiroidite subaguda, doença da tiróide autoimune, hipotiroidismo idiopático, doença de grave, síndromes poliglandulares, tais como as síndromes autoimunes poliglandulares (ou síndromes de endocrinopatia poliglandular), síndromes paraneoplásicas, incluindo as síndromes paraneoplásicas neurológicas, tais como a síndrome miastênica de Lambert-Eaton ou síndrome de Eaton-Lambert, ou síndrome da pessoa ou homem rígido, encefalomielite tais como a encefalomielite de alergia ou encefalomielite alérgica e encefalomielite alérgica experimental (EAE), miastenia grave, tais como a miastenia associada ao timoma grave, degeneração cerebelar, neuromiotonia, opsoclonia ou síndrome mioclonias de opsoclonia (OMS) e neuropatia sensorial, neuropatia motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatite autoimune, hepatite crônica, hepatite lúpica, hepatite de células gigantes, hepatite ativa crônica ou hepatite ativa crônica autoimune, pneumonite intersticial linfóide, bronquiolite obliterante (não transplante) versus NSIP, síndrome de Guillain-Barré, doença de Berger (nefropatia de IgA), nefropatia de IgA idiopática, dermatose de IgA linear, cirrose biliar primária, pneumonocirrose, síndrome de enteropatia autoimune, doença celíaca, doença celíaca, celíaca espru (enteropatia do glúten), espru refratário, espru idiopático, crioglobulinemia, esclerose lateral amilotrofíca (ALS; doença de Lou Gehrig), doença da artéria coronariana, doença do ouvido autoimune, tal como a doença do ouvido interna autoimune (AIED), perda auditiva autoimune, opsoclonia síndrome mioclonia (OMS), policondrite, tal como a policondrite refratária ou recidivante, proteinose alveolar pulmonar, amiloidose, esclerite, um linfocitose não canceroso, um linfocitose primário, que inclui a linfocitose de células B monoclonais (por exemplo, a gamopatia monoclonal benigna e garnmopatia monoclonal de significado indeterminado, MGUS), neuropatia periférica, síndrome paraneoplástica, canalopatias tais como a epilepsia, enxaqueca, arritmia, distúrbios musculares, surdez, cegueira, paralisia periódica, e canalopatias de SNC, autismo, miopatias inflamatórias, glomeruloesclerose segmentar focal (FSGS), oftalmopatia endócrina, uveoretinite, coriorretinite, distúrbio hepatológica autoimune, fibromialgia, insuficiência endócrina múltipla, síndrome de Schmidt, adrenalite, atrofia gástrica, demência presenil, doenças desmielinizantes tais como as doenças autoimunes desmielinizantes, nefropatia diabética, síndrome de Dressler, alopecia areata, síndrome de CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodactilia e telangiectasia), infertilidade autoimune masculina e feminina, doença mista do tecido conjuntivo, doença de Chagas, febre reumática, aborto recorrente, pulmão do fazendeiro, eritema multiforme, síndrome pós-cardiotomia, síndrome de Cushing, pulmão pássaro- estravagante, angeíte granulomatosa alérgica, angeíte linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolite, tais como a alveolite alérgica e alveolite fibrosante, doença intersticial pulmonar, reação transfusão, lepra, malária, leishmaniose, quipanosomiase, esquistossomose, ascaridíase, aspergilose, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocardite, endomiocardiofibrose, fibrose pulmonar intersticial difusa, fibrose pulmonar intersticial, fibrose pulmonar idiopática, fibrose cística, endoftalmite, eritema elevatum et diutinum, eritroblastose fetal, faciitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariasis, ciclite, tais como a ciclite crônica, ciclite heterocrônica, iridociclite, ou ciclite de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, vírus da imunodeficiência humana (HIV), infecção ecovirus, cardiomiopatia, doença de Alzheimer, infecção por parvovírus, infecção por vírus da rubéola, síndromes pós-vacinação, infecção da rubéola congênita, infecção por vírus Epstein-Barr, caxumba, síndrome de Evan, insuficiência gonadal autoimune, coreia de Sydenham, nefrite pós-estreptocócica, tromboangeíte ubiterana, tireotoxicose, tabes dorsalis, coroidite, polimialgia de células gigantes, oftamopatia endócrina, pneumonite por hipersensibilidade crônica, ceratoconjuntivite seca, ceratoconjuntivite epidêmica, síndrome idiopática nefrítica, nefropatia com alterações mínimas, lesão familiar e isquemia- reperfusão benigna, autoimunidade da retina, inflamação das articulações, bronquite, doença das vias respiratórias obstrutivas crônicas, silicose, aftas, estomatite aftosa, distúrbios arterioscleróticos, aspermiogenese, hemólise autoimune, doença de Boeck, crioglobulinemia, contratura de Dupuytren, endoftalmia facoanafilática, enterite alérgica, eritema nodoso hansênico, paralisia facial idiopática, síndrome de fadiga crônica, febre reumática, doença de Hamman-Rich, perda auditiva sensoneural, hemoglobinúria paroxismática, hipogonadismo, ileíte regional, leucopenia, mononucleose infectiosa, mielite transversal, mixedema idiopático primário, nefrose, oftalmia simfática, orquite granulomatosa, pancreatite, acuta poliradiculite, pioderma gangrenoso, tiroidite de Quervain, atrofia espênica adquirida, infertilidade devido aos anticorpos dos antiespermatozóides, timoma não maligno, vitiligo, SCID e doenças associadas ao vírus de Epstein-Barr, síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), doenças parasitárias, tais como a Leishmania, síndrome do choque tóxico, intoxicação alimentar, condições que envolvem infiltração de células T, deficiência de adesão de leucócitos, respostas imunológicas associadas com a hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citoquinas e linfitos T, doenças envolvendo a diapedese de leucócitos, síndrome de lesão de múltiplos órgãos, doenças mediadas pelo complexo antígeno-anticorpo, doença da membrana basal glomerular, neurite alérgica, poliendocrinopatias autoimunes, ooforite, mixedema primário, gastrite atrófica autoimune, oftalmia simpatética, doenças reumáticas, doenças do tecido conjuntivo misto, síndrome nefrótica, insulite, insuficiência poliendócrina, neuropatia periférica, síndrome autoimune poliglandular do tipo I, hipoparatiroidismo idiopático adulto (AOIH), alopecia total, cardiomiopatia dilatada, epidermólise bolhosa adquirida (EBA), hemocromatose, miocardite, síndrome nefrótica, colangite esclerosante primária, sinusite purulenta ou não purulenta, sinusite aguda ou crônica, etmóide, sinusite frontal, maxilar, ou esfenoidal, um distúrbio relacionado com eosinófilos, tal como a eosinofilia, eosinofilia de infiltração pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, pneumonia eosinofílica crônica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilose broncopneumônica, aspergiloma, ou granulomas contendo os eosinófilos, anafilaxia, espondiloartrites seronegativos, doença autoimune poliendócrina, colangite esclerosante, esclera, episclera, candidíase mucocutânea crônica, síndrome de Bruton, hipogamaglobulinemia transitória da infância, síndroma de Wiskott-Aldrich, ataxia telangiectasia, distúrbios autoimunes associados com as doenças do colagênio, reumatismo, doença neurológica, distúrbio isquémico de reperfusão, redução na resposta da pressão arterial, disfunção vascular, antgiectasis, lesão tecidual, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral, e doença associada à vascularização, distúrbios da hipersensibilidade alérgica, glomerulonefrites, lesão de reperfusão, lesão de reperfusão do miocárdio ou outros tecidos, dermatoses com componentes inflamatórios agudos, meningite purulenta aguda ou outros distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central, distúrbios inflamatórias orbitais e oculares, síndromes associadas de transfusão de granulócito, toxicidade induzida por citocinas, inflamação grave aguda, inflamação crônica intratável, pielite, pneumonocirose, retinopatia diabética, distúrbio diabético da artéria grande, hiperplasia endarterial, úlcera péptica, valvite e endometriose.
[0115] O termo “agente citotóxico” conforme utilizado no presente, se refere a uma substância que inibe ou previne a função de uma célula e/ou causa a destruição de uma célula. O termo pretende incluir os isótopos radioativos (por exemplo, o At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, Ra223, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos, por exemplo, o metotrexato, adriamicina, alcalóides vinca (vincristina, vinblastina, etoposídeo), doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucil, daunorrubicina ou outros agentes intercalantes, enzimas e seus fragmentos tais como as enzimas nucleolíticas, antibióticos, e toxinas tais como as toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou de origem animal, incluindo os fragmentos e/ou variantes, e os diversos agentes antitumorais, anticancerígenos, e quimioterapêuticos descritos no presente. Outros agentes citotóxicos estão descritos no presente. Um agente tumoricida provoca a destruição das células tumorais.
[0116] Um “agente quimioterápico” é um composto químico útil no tratamento de câncer. Os exemplos de agentes quimioterápicos incluem os agentes alquilantes, tal como o tiotepa e a ciclofosfamida Cytoxan®; sulfonatos de alquila tais como o busulfano, improsulfano e piposulfano; aziridinas, tais como a benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo a altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente a bulatacina e a bulatacinona); delta-9- tetrahidrocanabinol (dronabinol, Marinol®); beta-lapachona; lapachol; colchicina, ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo o topotecano análogo sintético (Hycamtin®), CPT-11 (irinotecano, Camptosar®), acetilcamptotecina, scopolectina e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo os análogos sintéticos da adozelesina, carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposídeo; criptoficinas (especialmente a criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictiina; espongistatina; mostardas de nitrogênio tais como o clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosuréias, tais como a carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos, tal como os antibióticos de enediina (por exemplo, a calicheamicina, especialmente a calicheamicina gamma1 (vide, por exemplo, Agnew, Chem Intl Ed Engl. 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluindo a dinemicina A; uma esperamicina, bem como o cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de cromoproteínas enedina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina Adriamycin® (incluindo a morfolina doxorrubicina, cianomorfolina doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, tais como a mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos, tais como o metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como a denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como a fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como a ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tais como a calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais, tais como a aminoglutetimida, mitotano, trilostana; reabastecedor de ácido fólico, tais como o ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosilada, amino ácido levulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tais como a maitansina e a ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2’,2”-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente a toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina (Eldisine®, Fildesin®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo (“Ara-C”); tiotepa; taxóides, por exemplo, o paclitaxel Taxol® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), formulação de nanopartículas de albumina manipulada geneticamente do paclitaxel AbraxaneTM (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, IL), e doxetaxel Taxotere® (Rhône- Poulenc Rorer, Antony, França); cloranbucila; gemcitabina (Gemzar®); 6- tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina, tais como a cisplatina e carboplatina; vinblastina (Velban®); platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (Oncovin®); oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (Navelbina®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides, tais como o ácido retinóico; capecitabina (Xeloda®); sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de alguma das situações acima, bem como as combinações de dois ou mais dos acima, tais como CHOP, uma abreviatura para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviatura de um regime de tratamento com oxaliplatina (Eloxatin®) combinado com o 5-FU e a leucovovina.
[0117]Também estão incluídos nesta definição os agentes anti- hormonais que agem para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos dos hormônios que podem promover o crescimento do câncer, e frequentemente estão sob a forma de tratamento corporal sistêmico, ou integral. Eles podem ser hormônios próprios. Os exemplos incluem anti-estrógenos e moduladores seletivos dos receptores de estrógeno (SERMs) incluindo, por exemplo, o tamoxifeno (incluindo o Nolvadex® tamoxifeno), o raloxifeno Evista®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno Fareston®; anti-progesterona; receptor de estrógeno de reguladores negativos (ERDs); agentes que funcionam para suprimir ou desligar os ovários, por exemplo, os agonistas do hormônio liberador do hormônio luteinizante (LHRH), tais como o acetato de leuprolida Lupron® e Eligard®, acetato de leuprolida, acetato de goserelina, acetato de buserelina e tripterelina; outros anti-andrógenos, tais como a flutamida, nilutamida e bicalutamida; e inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrógeno nas glândulas adrenais, tais como, por exemplo, o 4(5)-imidazólicos, aminoglutetimida, acetato de megestrol (Megase®, exemestano Aromasina®, formestania, fadrozol, vorozol Rivisor®, letrozol Femara® e anastrozol Arimidex®. Além disso, tal definição de agentes quimioterápicos inclui os bifosfonatos, tais como o clodronato (por exemplo, Bonefos® ou Ostac®), etidronato Didrocal®, NE-58095, ácido zoledrônico/ zoledronato Zometa®, o alendronato Fosamax®, pamidronato Aredia®, tiludronato Skelid® ou risedronato Actonel®, bem como a troxacitabina (um análogo do nucleosídeo da citosina 1,3-dioxolano); oligonucleotídeos anti-sense, especialmente aqueles que inibem a expressão dos genes nas vias de sinalização envolvidas na proliferação celular aberrante, tal como, por exemplo, alfa PKC, Raf, H-Ras e receptor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas tal como a vacina Theratope® e vacinas de terapia gênica, por exemplo, vacina Allovectina®, vacina Leuvectina® e vacina Vaxid®; inibidor da topoisomerase 1 Lurtotecan®; rmRH Abarelix®; ditosilato de lapatinib (uma pequena molécula inibidora da tirosina quinase dupla ErbB-2 e EGFR, também conhecida como GW572016); e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de quaisquer dos acima.
[0118] Um “agente inibidor do crescimento”, quando utilizado no presente se refere a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula in vitro ou in vivo. Por conseguinte, o agente inibidor do crescimento pode ser um que significativamente reduz a porcentagem de células na fase S. Os exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem os agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um local diferente da fase S), tais como os agentes que induzem a captura de G1 e a captura da fase M. Os bloqueadores da fase M clássicos incluem as vincas (por exemplo, a vincristina e vinblastina), taxanos e inibidores da topoisomerase II, tais como a doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposídeo, e bleomicina. Aqueles agentes que capturam G1 também se manifestam na captura da fase S, por exemplo, os agentes alquilantes do DNA, tal como o tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracila e Ara-C. Mais informações podem ser encontradas em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., capítulo 1, intitulado “Regulação do ciclo celular, oncogenes, antineoplásicos e drogas” (“Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs”) por Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente página 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são drogas anticancerígenas ambas derivadas a partir da árvore de teixo. O docetaxel (Taxotere®, Rhone-Poulenc), derivado do teixo europeu, é um análogo semissintético do paclitaxel (Taxol®, Bristol-Myers Squibb). O paclitaxel e o docetaxel promovem a montagem de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina e estabiliza os microtúbulos por prevenção da despolimerização, o que resulta na inibição da mitose nas células.
[0119] O termo “terapia anticâncer”, conforme utilizado no presente, se refere a um tratamento que reduz ou inibe o câncer em um indivíduo. Os exemplos de terapia anticâncer incluem a radioterapia citotóxica, assim como a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente citotóxico, um agente quimioterapêutico, um agente inibidor do crescimento, uma vacina contra o câncer, um inibidor da angiogênese, uma pró-droga, uma citocina, uma citocina antagonista, um corticosteróide, um agente imunossupressor, um antiemético, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, ou um analgésico para o indivíduo.
[0120] O termo “pró-droga”, utilizado no presente pedido se refere a um precursor ou forma derivada de uma substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxica para as células tumorais em comparação à droda original e é capaz de ser enzimaticamente ativada ou se transformar em forma original mais ativa. Vide, por exemplo, Wilman, “Prodrugs in Câncer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, páginas 375-382, 615a Reunião em Belfast (1986) e Stella et al., “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (Ed.), páginas 247-267, Humana Press (1985). As pró-drogas incluem, mas não se limitam às pró-drogas que contêm o fosfato, pró-drogas que contêm o tiofosfato contendo, pró-drogas que contêm o sulfato, pró-drogas que contêm os peptídeos, pró- drogas modificados por D-aminoácidos, pró-drogas glicosiladas, pró-drogas que contêm os e-lactâmicos, pró-drogas que contêm a fenóxi acetamida opcionalmente substituída, ou pró-drogas que contêm fenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outras pró-drogas de 5- fluorouridina que podem ser convertidas na droga citotóxica livre mais ativa. Os exemplos de drogas citotóxicas que podem ser derivadas em uma forma de pró-droga para a utilização na presente invenção incluem, mas não estão limitados, aos agentes quimioterapêuticos descritos acima.
[0121] O termo “citoquina” é um termo genérico para as proteínas liberadas por uma população celular que agem sobre outra célula como mediadores intercelulares. Os exemplos de tais citoquinas são as linfoquinas, monoquinas e hormônios polipeptídicos tradicionais. Estão incluídos entre as citoquinas os hormônios do crescimento tais como o hormônio do crescimento humano (hGH), hormônio do crescimento humana N-metionila e o hormônio de crescimento bovino; hormônio da paratireóide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; prorelaxina; hormônios glicoproteicos, tais como o hormônio estimulante do folículo (FSH), hormônio estimulante da tiróide (TSH), e o hormônio luteinizante (LH); fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblastos (FGF); prolactina; lactogênio placentário; fator de necrose tumoral-alfa e -beta; substância inibidora muleriana; peptídeo associado à gonadotropina de camundongo; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento dos nervos tal como o NGF-alfa; fator de crescimento de plaquetas; fatores de crescimento transformantes (TGF) tais como o TGF-alfa e TGF-beta; fator de crescimento de insulina tipo I e II; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutores; interferonas, tais como os fatores estimuladores de colônias de interferon-alfa, -beta e -gama (CSFs) tais como os macrófagos CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como a IL-1, IL-1alfa, IL- 1beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-18, um fator de necrose tumoral tal como o TNF-alfa ou TNF-beta; e outros fatores polipeptídicos incluindo o LIF e ligante do conjunto (KL). Conforme utilizado no presente, o termo “citoquina” inclui as proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equivalentes biologicamente ativos das citoquinas de sequência nativa.
[0122] O termo “antagonista de citoquina” significa uma molécula que parcialmente ou completamente bloqueia, inibe ou neutraliza uma atividade biológica de, pelo menos, uma citoquina. Por exemplo, os antagonistas de citocina podem inibir a atividade de citoquinas através da inibição de expressão e/ou secreção de citoquinas, ou através da ligação a uma citocina ou a um receptor de citoquina. Os antagonistas de citocinas incluem os anticorpos, peptídeos sintéticos ou sequência nativa, imunoadesinas, e antagonistas de moléculas pequenas que se ligam a um receptor de citocina ou citocinas. O antagonista de citoquina opcionalmente é conjugado com ou fundido com um agente citotóxico. Os antagonistas de TNF exemplares são o etanercept (Enbrel®), infliximab (Remicade®) e adalimumab (HumiraTM).
[0123] O termo “agente imunossupressor”, conforme utilizado no presente, se refere às substâncias que agem para suprimir ou mascarar o sistema imunitário do indivíduo a ser tratado. Isto inclui as substâncias que suprimem a produção de citoquinas, regulam negativamente ou suprimem a expressão de auto-antígeno, ou mascaram os antigênios de MHC. Os exemplos de agentes imunossupressores incluem as pirimidinas 2-amino-6-aril- 5-substituídas (vide patente US 4.665.077); micofenolato de mofetil tal como o Cellcept®; azatioprina (Imuran®, AZASAN® / 6-mercaptopurina; bromocriptina; danazol; dapsona; glutaraldeido (que mascara os antigênios de MHC, conforme descrito na patente US 4.120.649); anticorpos anti-idiotipicos para antigênios de MHC e fragmentos de MHC; ciclosporina A; esteróides, tais como os corticosteróides e glucocorticosteróides, por exemplo, a prednisona, prednisolona, tais como o Pediapred® (fosfato de sódio de prednisolona) ou Orapred® (solução oral de prednisolona de fosfato de sódio), metilprednisolona, e dexametasona; metotrexato (oral ou subcutâneo) (Rheumatrex®, TrexallTM); hidroxicloroquina / cloroquina; sulfasalazina; leflunomida; antagonistas de citoquinas ou receptores de citoquinas incluindo os anticorpos do anti- interferon-Y, -β, ou -α, anticorpos de fator-α de necrose anti-tumorais (infliximab ou adalimumab), imunoadesina anti-TNFα de (Enbrel®, etanercept), anticorpos de fator-β de necrose anti-tumorais, anticorpos anti-interleucina-2 e anticorpos anti-receptor IL-2; anticorpos anti-LFA-1, incluindo os anticorpos anti-CD18 e anti-CD11a; anticorpos anti-L3T4; globulina heteróloga anti-linfócita; anticorpos policlonais pan-T, ou anticorpos monoclonais anti-CD3 ou anti-CD4 / CD4a,; peptídeo solúvel que contém um domínio de ligação de LFA-3 (publicação WO 1990/08187); estreptoquinase; TGF-β; estreptodornase; RNA ou DNA do hospedeiro; FK506; RS-61443; desoxispergualina; rapamicina; receptor de células T (Cohen et al., patente US 5.114.721.); fragmentos de receptor de células T (. Offner et al., Science 251: 430-432 (1991); publicação WO 1990/11294; Ianeway, Nature 341: 482 (1989); e publicação WO 1991/01133); Os anticorpos do receptor de células T (patente EP 340.109) tais como o T10B9; ciclofosfamida (Cytoxan®); dapsona; penicilamina (Cuprimine®); troca de plasma; ou imunoglobulina intravenosa (IVIG). Estes podem ser utilizados isoladamente ou em combinação entre si, em especial as combinações de esteróide e um outro agente imunossupressor ou combinações de tais seguidos por uma dose de manutenção com um agente não esteróide para reduzir a necessidade de esteróides.
[0124] O termo “analgésico” se refere a uma droga que age para inibir ou suprimir a dor em um indivíduo. Os analgésicos exemplificativos incluem as drogas não esteróides anti-inflamatórios (AINEs), incluindo o ibuprofeno (Motrin®), naproxeno (Naprosyn®), ácido acetilsalicílico, indometacina, sulindac, e tolmetina, incluindo os seus sais e seus derivados, bem como diversos outros medicamentos utilizados para reduzir as dores lancinantes que podem ocorrer, inclusive os anticonvulsivantes (gabapentina, feniloina, carbamazepina) ou antidepressivos tricíclicos. Os exemplos específicos incluem o acetaminofeno, aspirina, amitriptilina (Elavil®), carbamazepina (Tegretol®), fenitoína (Dilantin®), gabapentina (Neurontin®), (E)- N-vanilil-8-metil-6-noneamid (Capsaicin®), ou um bloqueador do nervo.
[0125] O termo “corticosteróides” se refere a qualquer uma de diversas substâncias de ocorrência natural ou sintéticas, com a estrutura química geral de esteróides que imitam ou aumentam os efeitos dos corticosteróides de ocorrência natural. Os exemplos de corticosteróides sintéticos incluem a prednisona, prednisolona (incluindo a metilprednisolona), triamcinolona dexametasona, e betametasona.
[0126] O termo “vacina contra o câncer”, conforme utilizado no presente, é uma composição que estimula uma resposta imunitária em um indivíduo contra um câncer. As vacinas contra o câncer, em geral, consistem em uma fonte de material associado a um câncer ou células (antígeno) que pode ser autóloga (a partir de si própria) ou alogênica (de outros) para o indivíduo, em conjunto com outros componentes (por exemplo, os adjuvantes) para estimular ainda mais e aumentar a resposta imunitária contra o antígeno. As vacinas contra o câncer podem resultar na estimulação do sistema imunitário do indivíduo para produzir anticorpos para um ou diversos antigênios específicos, e/ou para produzir as células T assassinas para atacar as células cancerosas que possuem esses antigênios.
[0127] O termo “radioterapia citotóxica”, conforme utilizado no presente, se refere à terapia de radiação que inibe ou previne a função de células e/ou causa a destruição de células. A terapia de radiação pode incluir, por exemplo, a irradiação com feixe externo ou a terapia com um agente radioativo marcado, tal como um anticorpo. O termo pretende incluir a utilização de isótopos radioativos (por exemplo, os At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, Ra223, P32 e isótopos radioativos de Lu).
[0128] O termo “indivíduo” é um vertebrado, tal como um mamífero, por exemplo, um ser humano. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados aos animais de fazenda (tais como as vacas), animais de esporte, animais de estimação (tais como os gatos, cães e cavalos), primatas, camundongos e ratos.
[0129] Salvo quando indicado de outra maneira pelo contexto, os termos polipeptídeo contendo o “primeiro” ponto de clivagem e polipeptídeo contendo o “segundo” ponto de clivagem, e suas variações, são meramente identificadores genéricos, e não devem ser tomados para identificar um polipeptídeo específico ou um determinado polipeptídeo ou componente de anticorpos da presente invenção.
[0130] Os reagentes comercialmente disponíveis referidos nos Exemplos, caso adequado, foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante, salvo indicação em contrário. A fonte das células identificadas nos Exemplos seguintes, caso adequado, e ao longo da descrição, pelos números de acesso ATCC é a American Type Culture Collection, Manassas, VA. A menos que indicado de outra maneira, a presente invenção utiliza os procedimentos normalizados de tecnologia de DNA recombinante, tais como os descritos acima e nos seguintes livros de texto: Sambrook et al., acima;. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates e Wiley Interscience, Nova Iorque, 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc., Nova Iorque, 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.
[0131]Ao longo desta especificação e reivindicações, o termo “compreender”, e as variações tais como “compreende” e “que compreende”, serão entendidas implicando a inclusão de um número inteiro ou grupo de inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de inteiros.
[0132] Entende-se que os aspectos e realizações da presente invenção descrita no presente incluem “que consiste em” e/ou “essencialmente consiste em” aspectos e realizações.
[0133] Referência à “cerca de” um valor ou parâmetro inclui no presente (e descreve) as variações que são direcionadas a esse valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição se refere a “cerca de X” inclui a descrição de “X.
[0134] Conforme utilizado no presente e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem as referências plurais a menos que o contexto claramente dite o contrário. Entende-se que os aspectos e variações da presente invenção descritos no presente incluem “que consiste em” e/ou “essencialmente consiste em” aspectos e variações.
II. MÉTODOS PARA A PREPARAÇÃO PROTEÍNAS HETEROMULTIMÉRICAS NAS CÉLULAS HOSPEDEIRAS DE MAMÍFERO
[0135]A produção de proteínas heteromultiméricas, por exemplo, os anticorpos multiespecíficos, utilizando as técnicas atuais apresentam desvantagens, incluindo a produção de uma mistura de produtos, rendimento reduzido e redução e/ou eliminação de função efetora, entre outros. Por conseguinte, é desejável produzir as proteínas heteromultiméricas de maneira eficiente e em níveis elevados.
[0136]A produção de moléculas de anticorpo, por diversos meios, em geral, é bem compreendida. A patente US 6331415 (Cabilly et al.,), por exemplo, descreve um método para a produção recombinante de imunoglobulina, em que as cadeias pesadas e leves são simultaneamente expressas a partir de um único vetor ou por dois vetores separados em uma única célula. Wibbenmeyer et al., (1999, Biochim Biophys Acta 1.430 (2): 191 202). E Lee e Kwak (2003, J. Biotechnology 101:189-198) descrevem a produção de anticorpos monoclonais a partir de cadeias pesadas e leves produzidos separadamente, utilizando os plasmídeos expressos em culturas separadas de E. coli. Diversas outras técnicas relevantes para a produção de anticorpos estão descritas, por exemplo, em Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988) e publicação WO 2006/028936. No entanto, cada um deles apresentam desvantagens, tais como a baixa produtividade, a utilização de produtos químicos.
[0137] Os métodos fornecidos no presente são com base na descoberta surpreendente de que um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e uma primeira cadeia leve expressa e segregada a partir de uma primeira célula hospedeira de mamífero e um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e uma segunda cadeia leve expressa e segregada por uma segunda célula hospedeira de mamífero se montam para a formação de uma proteína heteromultimérica em um meio de cultura combinado. Conforme discutido em maiores detalhes abaixo, o meio de cultura combinado pode ser obtido por cultura da primeira célula hospedeira de mamífero em uma primeira cultura de célula, a cultura de uma segunda célula hospedeira de mamífero em uma segunda cultura de células, a colheita do primeiro e segundo meios de cultura sem interromper a célula membrana das primeiras e segundas células hospedeiras, e combinando a colheita dos primeiros e segundos meios de cultura para se obter o meio de cultura combinado que compreende a proteína heteromultimérica. De maneira alternativa, o meio de cultura combinado pode ser obtido através da cultura das primeiras e segundas células hospedeiras de mamífero em uma cultura de células combinadas, e a colheita da cultura combinada do meio de cultura da célula combinada que compreende a proteína heteromultimérica. Em determinadas realizações, a etapa de colheita compreende a remoção das primeiras e/ou segundas células hospedeiras sem a interrupção da membrana celular.
[0138] Os métodos fornecidos no presente são surpreendentes, uma vez que se acreditava que, em geral, o sistema de controle de qualidade de proteínas de células eucarióticas (tais como as células de mamíferos) não pode produzir eficientemente os anticorpos incompletos. Vide, por exemplo, Spiess et al., (2013) Nature, 31 (8): 753-758.
[0139] Os Depositantes também surpreendentemente descobriram que uma proteína heteromultimérica pode ser formada com um rendimento elevado sob condições de redução em um meio de cultura combinado que compreende um primeiro homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o primeiro ponto de clivagem e duas primeiras cadeias leves, que foram segregadas por uma primeira célula e um segundo homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o segundo ponto de clivagem e duas segundas cadeias leves que foram segregadas a partir de uma segunda célula hospedeira.
[0140] Por conseguinte, em determinadas realizações, são fornecidos os métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve, e (ii) um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira capaz de expressar e segregar um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e uma primeira cadeia leve, (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira capaz de expressar e segregar um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e uma segunda cadeia leve; e, (c) da obtenção de um meio de cultura combinado para a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira sem a interrupção da membrana celular das primeiras e segundas células hospedeiras, em que o meio de cultura combinado compreende a proteína heteromultimérica, e em que a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cada uma, uma célula de mamífero.
[0141] Em determinadas realizações, são fornecidos os métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve, e (ii) um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira capaz de expressar um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e uma primeira cadeia leve, em que um primeiro homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o primeiro ponto de clivagem e duas primeiras cadeias leves é segregado; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira capaz de expressar um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e uma segunda cadeia leve, em que um segundo homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o segundo ponto de clivagem e duas segundas cadeias leves é segregado; (c) da obtenção de um meio de cultura combinado para a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira, em que o meio de cultura combinado compreende o primeiro homodímero e o segundo homodímero; (d) da incubação do meio de cultura combinado sob condições de redução, e; (e) da obtenção da proteína heteromultimérica, em que a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cada uma, uma célula de mamífero.
[0142] Em determinadas realizações, o meio de cultura combinado é obtido sem a interrupção da membrana celular das primeiras e segundas células hospedeiras. Em determinadas realizações, o método ainda compreende a adição de um agente de redução. Em determinadas realizações, as condições de redução são suficientes para possibilitar a formação da proteína heteromultimérica.
[0143] Em determinadas realizações, o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e a primeira cadeia leve compreendem um primeiro meio anticorpo. Em determinadas realizações, o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e a segunda cadeia leve compreendem um segundo meio anticorpo.
[0144] Em determinadas realizações, cerca de 99%, cerca de 95%, cerca de 90%, cerca de 85%, cerca de 80%, cerca de 75%, cerca de 70%, cerca de 65%, cerca de 60%, cerca de 55%, cerca de 50%, cerca de 45%, cerca de 40%, cerca de 35%, cerca de 30%, cerca de 25%, cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, ou inferior a cerca de 5% (tal como cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2%, ou cerca de 1%) do polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e primeira cadeia leve (por exemplo, o primeiro meio anticorpo) presente no meio de cultura combinado está na forma de um primeiro homodímero antes da incubação sob condições de redução ou antes da adição de um agente de redução, incluindo qualquer intervalo entre estes valores. Em determinadas realizações, cerca de 10% a cerca de 75%, cerca de 20% a cerca de 65%, ou cerca de 30% a cerca de 55% do polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e primeira cadeia leve (por exemplo, o primeiro meio anticorpo) presente no meio de cultura combinado está na forma de um primeiro homodímero antes da incubação sob condições de redução ou antes da adição de um agente de redução.
[0145] Em determinadas realizações, cerca de 99%, cerca de 95%, cerca de 90%, cerca de 85%, cerca de 80%, cerca de 75%, cerca de 70%, cerca de 65%, cerca de 60%, cerca de 55%, cerca de 50%, cerca de 45%, cerca de 40%, cerca de 35%, cerca de 30%, cerca de 25%, cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, ou inferior a cerca de 5% (tal como cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2%, ou cerca de 1%) do polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e segunda cadeia leve (por exemplo, o anticorpo de segunda metade) presente no meio de cultura combinado está na forma de um segundo homodímero antes da incubação sob condições de redução ou antes da adição de um agente de redução, incluindo qualquer intervalo entre estes valores. Em determinadas realizações, cerca de 10% a cerca de 75%, cerca de 20% a cerca de 65%, ou cerca de 30% a cerca de 55% do polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e segunda cadeia leve (por exemplo, o segundo meio anticorpo) presente no meio de cultura combinado está na forma de um segundo homodímero antes da incubação sob condições de redução ou antes da adição de um agente de redução.
[0146] Em determinadas realizações, o meio de cultura combinado compreende inferior a cerca de 75%, inferior a cerca de 70%, inferior a cerca de 65%, inferior a cerca de 60%, inferior a cerca de 55%, inferior a cerca de 50%, menos de cerca de 45%, inferior a cerca de 40%, inferior a cerca de 35%, inferior a cerca de 30%, inferior a cerca de 20%, inferior a cerca de 19%, inferior a cerca de 18%, inferior a cerca de 17%, inferior a cerca de 16 %, inferior a cerca de 15%, inferior a cerca de 14%, inferior a cerca de 13%, inferior a cerca de 12%, inferior a cerca de 11%, inferior a cerca de 10%, inferior a cerca de 9%, inferior a cerca de 8%, inferior a cerca de 7%, inferior a cerca de 6% a inferior a cerca de 5%, inferior a cerca de 4%, inferior a cerca de 3%, inferior a cerca de 2% ou inferior a cerca de 1% do primeiro homodímero após a incubação sob condições de redução ou após a adição de um agente de redução, incluindo qualquer intervalo entre estes valores. Em determinadas realizações, o meio de cultura combinado compreende inferior a cerca de 2% a cerca de 20%, inferior a cerca de 5% a cerca de 15%, ou inferior a cerca de 10% a cerca de 15% do primeiro homodímero após a incubação sob condições de redução ou após a adição de um agente de redução.
[0147] Em determinadas realizações, o meio de cultura combinado compreende inferior a cerca de 75%, inferior a cerca de 70%, inferior a cerca de 65%, inferior a cerca de 60%, inferior a cerca de 55%, inferior a cerca de 50%, menos de cerca de 45%, inferior a cerca de 40%, inferior a cerca de 35%, inferior a cerca de 30%, inferior a cerca de 20%, inferior a cerca de 19%, inferior a cerca de 18%, inferior a cerca de 17%, inferior a cerca de 16 %, inferior a cerca de 15%, inferior a cerca de 14%, inferior a cerca de 13%, inferior a cerca de 12%, inferior a cerca de 11%, inferior a cerca de 10%, inferior a cerca de 9%, inferior a cerca de 8%, inferior a cerca de 7%, inferior a cerca de 6% a inferior a cerca de 5%, inferior a cerca de 4%, inferior a cerca de 3%, inferior a cerca de 2% ou inferior a cerca de 1% do segundo homodímero após a incubação sob condições de redução ou após a adição de um agente de redução, incluindo qualquer intervalo entre estes valores. Em determinadas realizações, o meio de cultura combinado compreende inferior a cerca de 2% a cerca de 20%, inferior a cerca de 5% a cerca de 15%, ou inferior a cerca de 10% a cerca de 15% do segundo homodímero após a incubação sob condições de redução ou após a adição de um agente de redução.
[0148] Em determinadas realizações, é fornecido um método para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve, e (ii) um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira que compreende um primeiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e um segundo ácido nucleico que codifica a primeira cadeia leve; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira que compreende um terceiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e um quarto ácido nucleico que codifica a segunda cadeia leve; e, (c) da obtenção de um meio de cultura combinado para a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira, em que o meio de cultura combinado compreende a proteína heteromultimérica, e em que a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cada uma, uma célula de mamífero. Em determinadas realizações, os primeiros e segundos ácidos nucleicos são uma molécula de ácido nucleico; enquanto que em determinadas outras realizações, os primeiros e segundos ácidos nucleicos são moléculas de ácido nucleico diferentes. Em determinadas realizações, os terceiros e quartos ácidos nucleicos são uma molécula de ácido nucleico; enquanto que em determinadas outras realizações, os terceiros e quartos ácidos nucleicos são moléculas de ácido nucleico diferentes.
[0149] Em determinadas realizações, a presente invenção fornece os métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve, e (ii) um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira que compreende um primeiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e um segundo ácido nucleico que codifica a primeira cadeia leve, em que a primeira célula hospedeira é capaz de expressar o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e a primeira cadeia leve, e em que um primeiro homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o primeiro ponto de clivagem e duas primeiras cadeias leves é segregado; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira que compreende um terceiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e um quarto ácido nucleico que codifica a segunda cadeia leve, em que a segunda célula hospedeira é capaz de expressar o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e a segunda cadeia leve, e em que um segundo homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o segundo ponto de clivagem e duas segundas cadeias leves é segregado; (c) da obtenção de um meio de cultura combinado para a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira sem a interrupção da membrana celular das primeiras e segundas células hospedeiras, em que o meio de cultura combinado compreende o primeiro homodímero e o segundo homodímero; (d) da incubação do meio de cultura combinado sob condições de redução suficientes para possibilitar a proteína de heteromultimérica, e; (e) da obtenção da proteína heteromultimérica, em que a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cada uma, uma célula de mamífero. Em determinadas realizações, os primeiros e segundos ácidos nucleicos são uma molécula de ácido nucleico; enquanto que em determinadas outras realizações, os primeiros e segundos ácidos nucleicos são moléculas de ácido nucleico diferentes. Em determinadas realizações, os terceiros e quartos ácidos nucleicos são uma molécula de ácido nucleico; enquanto que em determinadas outras realizações, os terceiros e quartos ácidos nucleicos são moléculas de ácido nucleico diferentes. Em determinadas realizações, o método ainda compreende a adição de um agente de redução ao meio de cultura combinado.
[0150] Em determinadas realizações, é fornecido um método para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um primeiro meio anticorpo que compreende um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve e (ii) um segundo meio anticorpo que compreende um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira que compreende um primeiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e um segundo ácido nucleico que codifica a primeira cadeia leve; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira que compreende um terceiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e um quarto ácido nucleico que codifica a segunda cadeia leve; e, (c) da obtenção de um meio de cultura combinado para a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira, em que o meio de cultura combinado compreende a proteína heteromultimérica, e em que a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cada uma, uma célula de mamífero. Em determinadas realizações, o método ainda compreende a adição de um agente de redução ao meio de cultura combinado.
[0151] Em determinadas realizações, a presente invenção fornece os métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um primeiro meio anticorpo que compreende um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve e (ii) um segundo meio anticorpo que compreende um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira que compreende um primeiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e um segundo ácido nucleico que codifica a primeira cadeia leve, em que a primeira célula hospedeira é capaz de expressar o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e a primeira cadeia leve, e em que um primeiro homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o primeiro ponto de clivagem e duas primeiras cadeias leves é segregado; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira que compreende um terceiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e um quarto ácido nucleico que codifica a segunda cadeia leve, em que a segunda célula hospedeira é capaz de expressar o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e a segunda cadeia leve, e em que um segundo homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o segundo ponto de clivagem e duas segundas cadeias leves é segregado; (c) da obtenção de um meio de cultura combinado para a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira sem a interrupção da membrana celular das primeiras e segundas células hospedeiras, em que o meio de cultura combinado compreende o primeiro homodímero e o segundo homodímero; (d) da incubação do meio de cultura combinado sob condições de redução suficientes para possibilitar a formação da proteína heteromultimérica, e; (e) da obtenção da proteína heteromultimérica, em que a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cada uma, uma célula de mamífero. Em determinadas realizações, o método ainda compreende a adição de um agente de redução ao meio de cultura combinado.
[0152] Em determinadas realizações, a presente invenção fornece os métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve, e (ii) um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira de mamífero, que compreende um primeiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e um segundo ácido nucleico que codifica a primeira cadeia leve em uma primeira cultura de células; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira de mamífero, que compreende um terceiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e um quarto ácido nucleico que codifica a segunda cadeia leve em uma segunda cultura de células; (c) da colheita de um primeiro meio de cultura a partir da primeira célula hospedeira de mamífero; (d) da colheita de um segundo meio de cultura a partir da segunda célula hospedeira de mamífero; e (e) da combinação do primeiro meio de cultura e do segundo meio de cultura para se obter o meio de cultura combinado, em que o meio de cultura combinado compreende a proteína heteromultimérica. Em determinadas realizações, a colheita do primeiro meio de cultura compreende a remoção da primeira célula hospedeira da primeira cultura de células. Em determinadas realizações, a colheita do segundo meio de cultura compreende a remoção da segunda célula hospedeira a partir da segunda cultura de células. Em determinadas realizações, o método ainda compreende a adição de um agente de redução ao meio de cultura combinado.
[0153] Em determinadas realizações, são fornecidos os métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve, e (ii) um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira que compreende um primeiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e um segundo ácido nucleico que codifica a primeira cadeia leve em uma primeira cultura de células em que a primeira célula hospedeira é capaz de expressar o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e a primeira cadeia leve, e em que um primeiro homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o primeiro ponto de clivagem e duas primeiras cadeias leves é segregado; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira que compreende um terceiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e um quarto ácido nucleico que codifica a segunda cadeia leve em uma segunda cultura de células, em que a segunda célula hospedeira é capaz de expressar o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e a segunda cadeia leve, e em que um segundo homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o segundo ponto de clivagem e duas segundas cadeias leves é segregado; (c) da colheita de um primeiro meio de cultura a partir da primeira célula hospedeira de mamífero, em que o primeiro meio de cultura compreende o primeiro homodímero; (d) da colheita de um segundo meio de cultura a partir da segunda célula hospedeira de mamífero, em que o segundo meio de cultura compreende o segundo homodímero; (e) da combinação do primeiro meio de cultura e do segundo meio de cultura para se obter o meio de cultura combinado, em que o meio de cultura combinado compreende o primeiro homodímero e o segundo homodímero; (f) da incubação do meio de cultura combinado sob condições de redução suficientes para possibilitar a formação da proteína heteromultimérica, e; (g) da obtenção da proteína heteromultimérica, em que a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cada uma, uma célula de mamífero. Em determinadas realizações, a colheita do primeiro meio de cultura compreende a remoção da primeira célula hospedeira da primeira cultura de células. Em determinadas realizações, a colheita do segundo meio de cultura compreende a remoção da segunda célula hospedeira a partir da segunda cultura de células. Em determinadas realizações, o método ainda compreende a adição de um agente de redução ao meio de cultura combinado.
[0154] Em determinadas realizações, a presente invenção fornece os métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um primeiro meio anticorpo que compreende um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve e (ii) um segundo meio anticorpo que compreende um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os primeiros e segundos meio anticorpos estão ligados por, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira de mamífero, que compreende um primeiro ácido nucleico que codifica um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e um segundo ácido nucleico que codifica uma primeira cadeia leve em uma primeira cultura de células; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira de mamífero, que compreende um terceiro ácido nucleico que codifica um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e um quarto ácido nucleico que codifica uma segunda cadeia leve em uma segunda cultura de células; (c) da colheita de um primeiro meio de cultura a partir da primeira célula hospedeira de mamífero; (d) da colheita de um segundo meio de cultura a partir da segunda célula hospedeira de mamífero; e (e) da combinação do primeiro meio de cultura e do segundo meio de cultura para se obter o meio de cultura combinado, em que o meio de cultura combinado compreende a proteína heteromultimérica. Em determinadas realizações, a colheita do primeiro meio de cultura compreende a remoção da primeira célula hospedeira da primeira cultura de células. Em determinadas realizações, a colheita do segundo meio de cultura compreende a remoção da segunda célula hospedeira a partir da segunda cultura de células.
[0155] Em determinadas realizações, são fornecidos os métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um primeiro meio anticorpo que compreende um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve e (ii) um segundo meio anticorpo que compreende um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira que compreende um primeiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e um segundo ácido nucleico que codifica a primeira cadeia leve de uma primeira cultura de células, em que a primeira célula hospedeira é capaz de expressar o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e a primeira cadeia leve, e em que um primeiro homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o primeiro ponto de clivagem e duas primeiras cadeias leves é segregado; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira que compreende um terceiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e um quarto ácido nucleico que codifica a segunda cadeia leve em uma segunda cultura de células, em que a segunda célula hospedeira é capaz de expressar o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e a segunda cadeia leve, e em que um segundo homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o segundo ponto de clivagem e duas segundas cadeias leves é segregado; (c) da colheita de um primeiro meio de cultura a partir da primeira célula hospedeira de mamífero, em que o primeiro meio de cultura compreende um primeiro homodímero; (d) da colheita de um segundo meio de cultura a partir da segunda célula hospedeira de mamífero, em que o segundo meio de cultura compreende o segundo homodímero; (e) da combinação do primeiro meio de cultura e do segundo meio de cultura para obter um meio de cultura combinado, em que o meio de cultura combinado compreende o primeiro homodímero e o segundo homodímero; (f) da incubação do meio de cultura combinado sob condições de redução suficientes para possibilitar a formação da proteína heteromultimérica, e; (g) da obtenção da proteína heteromultimérica, em que a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cada uma, uma célula de mamífero. Em determinadas realizações, a colheita do primeiro meio de cultura compreende a remoção da primeira célula hospedeira da primeira cultura de células. Em determinadas realizações, a colheita do segundo meio de cultura compreende a remoção da segunda célula hospedeira a partir da segunda cultura de células. Em determinadas realizações, o método ainda compreende a adição de um agente de redução ao meio de cultura combinado.
[0156] Em determinadas realizações, a presente invenção fornece os métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve, e (ii) um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira de mamífero, que compreende um primeiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e um segundo ácido nucleico que codifica a primeira cadeia leve; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira de mamífero, que compreende um terceiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e um quarto ácido nucleico que codifica a segunda cadeia leve; e (c) da colheita do meio de cultura de uma cultura de células combinadas que compreende a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira para se obter um meio de cultura combinado para a primeira célula hospedeira de mamífero e a segunda célula hospedeira de mamífero, em que o meio de cultura combinado compreende a proteína heteromultimérica.
[0157] Em determinadas realizações, são fornecidos os métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve, e (ii) um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira de mamífero, que compreende um primeiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e um segundo ácido nucleico que codifica a primeira cadeia leve, em que a primeira célula hospedeira é capaz de expressar o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e a primeira cadeia leve, e em que um primeiro homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o primeiro ponto de clivagem e duas primeiras cadeias leves é segregado; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira de mamífero, que compreende um terceiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e um quarto ácido nucleico que codifica a segunda cadeia leve, em que a segunda célula hospedeira é capaz de expressar o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e a segunda cadeia leve, e em que um segundo homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o segundo ponto de clivagem e duas segundas cadeias leves é segregado; (c) da colheita do meio de cultura de uma cultura de células combinadas que compreende a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira para se obter um meio de cultura combinado para a primeira célula hospedeira de mamífero e a segunda célula hospedeira de mamífero, em que o meio de cultura da cultura de células combinadas compreende o primeiro homodímero e o segundo homodímero; (d) da incubação do meio de cultura sob condições de redução suficientes para possibilitar a formação da proteína heteromultimérica, e; (e) da obtenção da proteína heteromultimérica, em que a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cada uma, uma célula de mamífero. Em determinadas realizações, o método ainda compreende a adição de um agente de redução ao meio de cultura combinado.
[0158] Em determinadas realizações, a presente invenção fornece os métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um primeiro meio anticorpo que compreende um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve e (ii) um segundo meio anticorpo que compreende um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados, através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira de mamífero, que compreende um primeiro ácido nucleico que codifica um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e um segundo ácido nucleico que codifica uma primeira cadeia leve; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira de mamífero, que compreende um terceiro ácido nucleico que codifica um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e um quarto ácido nucleico que codifica uma segunda cadeia leve; e (c) da colheita do meio de cultura de uma cultura de células combinadas que compreende a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira para se obter um meio de cultura combinado para a primeira célula hospedeira de mamífero e a segunda célula hospedeira de mamífero, em que o meio de cultura combinado compreende a proteína heteromultimérica.
[0159] Em determinadas realizações, são fornecidos os métodos para a preparação de uma proteína heteromultimérica que compreende (i) um primeiro meio anticorpo que compreende um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve, e (ii) um segundo meio anticorpo que compreende um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem possui um segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira de mamífero, que compreende um primeiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e um segundo ácido nucleico que codifica a primeira cadeia leve, em que a primeira célula hospedeira é capaz de expressar o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e a primeira cadeia leve, e em que um primeiro homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o primeiro ponto de clivagem e duas primeiras cadeias leves é segregado; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira de mamífero, que compreende um terceiro ácido nucleico que codifica o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e um quarto ácido nucleico que codifica a segunda cadeia leve, em que a segunda célula hospedeira é capaz de expressar o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e a segunda cadeia leve, e em que um segundo homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o segundo ponto de clivagem e duas segundas cadeias leves é segregado; (c) da colheita do meio de cultura de uma cultura de células combinadas que compreende a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira para se obter um meio de cultura combinado para a primeira célula hospedeira de mamífero e a segunda célula hospedeira de mamífero, em que o meio de cultura da cultura de células combinadas compreende o primeiro homodímero e o segundo homodímero; (d) da incubação do meio de cultura sob condições de redução suficientes para possibilitar a formação da proteína heteromultimérica, e; (e) da obtenção da proteína heteromultimérica, em que a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cada uma, uma célula de mamífero. Em determinadas realizações, o método ainda compreende a adição de um agente de redução ao meio de cultura combinado.
[0160] Em determinadas realizações, a cultura da cultura de células combinadas que compreende a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira é realizada a uma temperatura entre cerca de 25°C e 40°C. Em determinadas realizações, a cultura da cultura de células combinadas que compreende a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira é realizada a uma temperatura entre cerca de 30°C e 37°C. Em determinadas realizações, a cultura da cultura de células combinadas que compreende a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira é realizada a um pH entre cerca de 7,2 e 8,7.
[0161] Em determinadas realizações, o meio de cultura combinado é incubado a uma temperatura entre cerca de 4°C e 40°C. Em determinadas realizações, o meio de cultura combinado é incubado a uma temperatura entre cerca de 30°C e 37°C. Em determinadas realizações, o meio de cultura combinado é incubado a uma temperatura entre cerca de 4° C e 8° C.
[0162] Em determinadas realizações, o meio de cultura combinado é agitado. Em determinadas realizações, o meio de cultura combinado é agitado durante cerca de 6 horas, cerca de 12 horas, cerca de 18 horas, cerca de 24 horas, cerca de 1 dia, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 6 dias, cerca de 7 dias, cerca de 8 dias, ou superior a 8 dias após o meio de cultura combinado ser obtido. Em algumas realizações, a cultura combinada é intermitentemente agitada.
[0163] Em determinadas realizações, os métodos ainda compreendem o isolamento da proteína heteromultimérica (tal como um anticorpo biespecífico) a partir do meio de cultura combinado. Em determinadas realizações, a proteína heteromultimérica (tal como um anticorpo biespecífico) é isolada utilizando uma coluna A de proteína.
[0164] Em determinadas realizações, os métodos incluem a adição de um agente de redução durante a produção da proteína heteromultimérica (tal como um anticorpo biespecífico). Em determinadas realizações dos métodos fornecidos no presente, o agente de redução utilizado é a glutationa, 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), cisteína, ditiotreitol, cisteinditiotreitol, ditiolbutilamina, ou suas combinações. Em determinadas realizações, o agente de redução é a glutationa reduzida. Em determinadas realizações, o agente de redução não é o 2-mercaptoetanol. Em determinadas realizações, o agente de redução não é o ditiotreitol.
[0165] Em determinadas realizações em que as primeiras e segundas células hospedeiras de mamífero são cultivadas separadamente, isto é, cultivadas em culturas separadas, o agente de redução é adicionado ao primeiro meio de cultura de células e ao segundo meio de cultura de célula antes dos primeiros e segundos meios de cultura de células serem colhidos e combinadas para se obter o meio de cultura combinado. Em determinadas realizações em que as primeiras e segundas células hospedeiras de mamífero são cultivadas na mesma cultura, o agente de redução é adicionado ao meio de cultura da cultura de células combinadas antes da cultura de células combinadas ser colhida para se obter o meio de cultura combinado.
[0166] Em determinadas realizações, o agente de redução é adicionado a cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas, cerca de 24 horas, cerca de 25 horas, cerca de 26 horas, cerca de 27 horas, cerca de 28 horas, cerca de 29 horas, ou cerca de 30 horas antes da etapa de colheita, incluindo qualquer intervalo entre estes valores.
[0167] Em determinadas realizações, o agente de redução é adicionado ao meio de cultura combinado. Em determinadas realizações, o meio de cultura combinado que contém o agente de redução é incubado durante cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 15 horas, cerca de 18 horas, cerca de 21 horas, cerca de 24 horas, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, a cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 6 dias, ou cerca de 7 dias, incluindo qualquer intervalo entre estes valores.
[0168] Em determinadas realizações, o agente de redução (tal como a glutationa) é adicionada à cultura de células combinadas para alcançar a concentração final de cerca de 5 mM, cerca de 6 mM, cerca de 7 mM, cerca de 8 mM, cerca de 9 mM, cerca de 10 mM, cerca de 11 mM, cerca de 12 mM, cerca de 13 mM, cerca de 14 mM, cerca de 15 mM, cerca de 16 mM, cerca de 17 mM, cerca de 18 mM, cerca de 19 mM, cerca de 20 mM, cerca de 21 mM, cerca de 22 mM, cerca de 23 mM, cerca de 24 mM, cerca de 25 mM, cerca de 26 mM, cerca de 27 mM, cerca de 28 mM, cerca de 29 mM, ou cerca de 30 mM, incluindo qualquer intervalo entre estes valores. Em determinadas realizações, o agente de redução (tal como a glutationa) é adicionada à cultura de células combinadas para alcançar uma concentração final inferior a 20 mM. Em determinadas realizações, o agente de redução (tal como a glutationa) é adicionada à cultura de células combinadas para alcançar uma concentração final não superior a 20 mM.
[0169] Em determinadas realizações, o agente de redução é adicionado ao meio de cultura combinado antes do isolamento da proteína heteromultimérica (tal como um anticorpo biespecífico) a partir do meio de cultura combinado. Em determinadas realizações, o meio de cultura combinado que contém o agente de redução é incubado durante cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 15 horas, cerca de 18 horas, cerca de 21 horas, cerca de 24 horas, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 6 dias, ou cerca de 7 dias, antes do isolamento da proteína heteromultimérica (tal como o anticorpo biespecífico) a partir do meio de cultura combinado que contém o agente de redução, incluindo qualquer intervalo entre estes valores. Em algumas realizações, a proteína heteromultimérica é isolada utilizando uma coluna A de proteína.
[0170] Em determinadas realizações, o agente de redução (tal como a glutationa) é adicionado ao meio de cultura combinado para alcançar a concentração final de cerca de 5 mM, cerca de 6 mM, cerca de 7 mM, cerca de 8 mM, cerca de 9 mM, cerca de 10 mM, cerca de 11 mM, cerca de 12 mM, cerca de 13 mM, cerca de 14 mM, cerca de 15 mM, cerca de 16 mM, cerca de 17 mM, cerca de 18 mM, cerca de 19 mM, cerca de 20 mM, cerca de 21 mM, cerca de 22 mM, cerca de 23 mM, cerca de 24 mM, cerca de 25 mM, cerca de 26 mM, cerca de 27 mM, cerca de 28 mM, cerca de 29 mM, ou cerca de 30 mM. Em determinadas realizações, o agente de redução (tal como a glutationa) é adicionado ao meio de cultura combinado para alcançar uma concentração final inferior a 20 mM. Em determinadas realizações, o agente de redução (tal como a glutationa) é adicionado ao meio de cultura combinado para alcançar uma concentração final não superior a 20 mM.
[0171] Em determinadas realizações dos métodos, a primeira célula hospedeira é uma linhagem de célula estável. Em determinadas realizações, a segunda célula hospedeira é uma linhagem de célula estável. Em determinadas realizações, a primeira célula hospedeira é uma célula CHO. Em determinadas realizações, a segunda célula hospedeira é uma célula CHO. Em determinadas realizações em que a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cultivadas na mesma cultura, a proporção entre a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira no tempo inicial da cultura combinada é de cerca de 1:10, cerca de 1:9, cerca de 1:8, cerca de 1:7, cerca de 1:6, de cerca de 1:5, cerca de 1:4, 1: 3, cerca de 1:2, cerca de 1:1, cerca de 2: 1, cerca de 3: 1, cerca de 4: 1, cerca de 5: 1, cerca de 6: 1, cerca de 7: 1, cerca de 8: 1, cerca de 9: 1 ou cerca de 10:1.
[0172] Conforme utilizado no presente, o termo “proporção molar” se refere à proporção entre o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem associada com a primeira cadeia leve (tal como um primeiro meio anticorpo) que foi expressa e/ou segregada para o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem associado com a segunda cadeia leve (tal como um segundo meio anticorpo) que foi expressa e/ou segregada. Em algumas realizações, a proporção molar do polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem associada com a primeira cadeia leve e o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem associada com a segunda cadeia leve está entre cerca de 1,5, cerca de 1:4, cerca de 1:3, cerca de 1:2, cerca de 1:1, cerca de 2: 1, cerca de 3: 1, cerca de 4: 1, ou cerca de 5: 1, incluindo qualquer intervalo entre estes valores. Em algumas realizações, a proporção molar do polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem associada com a primeira cadeia leve e o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem associada com a segunda cadeia leve é cerca de 1:1. Em algumas realizações, a proporção molar do primeiro meio anticorpo e o segundo meio anticorpo está entre cerca de 1,5, cerca de 1:4, 1: 3, cerca de 1:2, cerca de 1:1, cerca de 2: 1, sobre 3: 1, cerca de 4: 1, ou cerca de 5:1, incluindo qualquer intervalo entre estes valores. Em algumas realizações, a proporção molar do primeiro meio anticorpo e o segundo meio anticorpo é de cerca de 1:1.
III. PROTEÍNAS HETEROMULTIMÉRICAS
[0173]Também são fornecidas pela presente invenção as proteínas heteromultimérica produzidas através de qualquer um dos métodos descritos no presente. Em determinadas realizações a proteína heteromultimérica compreende uma região Fc de anticorpo ou sua variante (por exemplo, uma variante com função alterada ADCC). Em determinadas realizações, a proteína heteromultimérica compreende uma porção significativa de uma região Fc de anticorpo ou sua variante (por exemplo, uma variante com função alterada ADCC). Em determinadas realizações, a proteína heteromultimérica compreende uma cadeia pesada que apenas compreende uma porção dos domínios CH1, CH2 e/ou CH3. Em determinadas realizações, a proteína heteromultimérica é um fragmento de anticorpo que apenas compreende uma porção dos domínios CH1, CH2 e/ou CH3. Em determinadas realizações, a proteína heteromultimérica é um anticorpo. Em determinadas realizações, a proteína heteromultimérica é um anticorpo biespecífico. Em determinadas realizações, a proteína heteromultimérica é um anticorpo humanizado. Em determinadas realizações, a proteína heteromultimérica é um anticorpo humano. Em determinadas realizações, o anticorpo é um IgG (tal como IgG1, IgG2, ou IgG4), IgA, ou um IgD. Em determinadas realizações, a primeira cadeia leve e a segunda cadeia leve da proteína heteromultimérica compreendem sequências diferentes de domínio variável. Em determinadas realizações, os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem da proteína heteromultimérica produzida através dos métodos fornecidos no presente compreendem uma região Fc ou sua variante. Em determinadas realizações, os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem da proteína heteromultimérica compreendem uma cadeia pesada de anticorpo.
OMÍNIOS DE HETEROMULTIMERIZAÇÃO
[0174]As proteínas heteromultiméricas compreendem um domínio de heteromultimerização. Para a produção de uma população substancialmente homogênea de molécula heterodimérica, o domínio de heterodimerização deve possuir uma forte preferência para a formação de heterodímeros através de homodímeros. Embora as proteínas heteromultiméricas exemplificadas no presente utilizem as saliências na tecnologia de orifícios para facilitar a heteromultimerização, aqueles técnicos no assunto irão considerar outros domínios de heteromultimerização úteis na presente invenção.
SALIÊNCIAS NOS ORIFÍCIOS
[0175]A utilização de saliências nos orifícios como um método de produção de anticorpos multiespecíficos é bem conhecida no estado da técnica. Vide patente US 5.731.168 concedida em 24 de março de 1998 atribuída a Genentech, publicação de patente PCT WO 2009/089004 depositada em 16 de julho de 2009 e atribuída a Amgen, e publicação de patente PCT 2009/0182127 depositada em 16 de julho de 2009 e atribuída a Novo Nordisk A / S. Vide também Marvin e Zhu, Acta Pharmacologica Sincia (2005) 26 (6): 649-658 e Kontermann (2005) Acta Pharacol. Sin, 26: 1-9. Uma breve discussão é fornecida no presente.
[0176]O termo “protuberância” se refere a, pelo menos, uma cadeia secundária de amino ácido, que se projeta a partir da interface de um primeiro polipeptídeo e, por conseguinte, está posicionada em uma cavidade compensatória na interface adjacente (isto é, a interface do segundo polipeptídeo) de maneira a estabilizar o heteromultímero e, por conseguinte, favorecer a formação do heteromultímero sobre a formação do homomultímero, por exemplo. A protuberância pode existir na interface original ou pode ser sinteticamente introduzida (por exemplo, alterando o ácido nucleico que codifica a interface). Normalmente, o ácido nucleico que codifica a interface do primeiro polipeptídeo é alterado para codificar a protuberância. Para alcançar este objeto, o ácido nucleico que codifica, pelo menos, um resíduo de amino ácido “original” na interface do primeiro polipeptídeo é substituído por ácido nucleico que codifica, pelo menos, um resíduo de amino ácido “importado” que possui um volume de cadeia secundária superior ao resíduo de amino ácido original. Será considerado que pode existir uma quantidade superior a um resíduo importado original e correspondente. O limite superior para o número de resíduos originais que são substituídos é o número total de resíduos na interface do primeiro polipeptídeo. Os volumes das cadeias secundárias dos diversos resíduos de amino ácidos são mostrados na Tabela 1 abaixo: TABELA 1 PROPRIEDADES DE RESÍDUOS DE AMINO ÁCIDO
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- a amino ácido de peso molecular inferior ao da água. Valores de Handbook of Chemistry and Physics, 43a ed. Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961; - b Valores de A. A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24: 107-123, 1972; e - c Valores de C. Chothia, J. Mol. Biol. 105: 1-14, 1975. A área de superfície acessível é definida nas Figuras de 6 a 20 desta referência.
[0177] Os resíduos importados de preferência para a formação de uma protuberância, em geral, são os resíduos de amino ácidos de ocorrência natural e, de preferência, são selecionados a partir de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W). Aqueles de maior preferência são o triptofano e tirosina. Em uma realização, o resíduo original para a formação da protuberância possui um volume de cadeia secundária pequeno, tal como a alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina ou valina.
[0178] O termo “cavidade” se refere a, pelo menos, uma cadeia secundária de amino ácido que é rebaixada a partir da interface de um segundo polipeptídeo e, por conseguinte, pode acomodar uma protuberância correspondente na interface adjacente de um primeiro polipeptídeo. A cavidade pode existir na interface original ou pode ser introduzida sinteticamente (por exemplo, alterando o ácido nucleico que codifica a interface). Normalmente, o ácido nucleico que codifica a interface do segundo polipeptídeo é alterado para codificar a cavidade. Para alcançar este objeto, o ácido nucleico que codifica, pelo menos, um resíduo de amino ácido “original” na interface do segundo polipeptídeo é substituído por DNA que codifica, pelo menos, um resíduo de amino ácido “importado” que possui um volume de cadeia secundária inferior ao resíduo de amino ácido original. Será considerado que pode existir superior a um resíduo importado original e correspondente. O limite superior para o número de resíduos originais que são substituídos é o número total de resíduos na interface do segundo polipeptídeo. Os volumes das cadeias secundárias dos diversos resíduos de amino ácidos são mostrados na Tabela 1 acima. Os resíduos importados de preferência para a formação de uma cavidade normalmente são resíduos de ocorrência de amino ácidos e, de preferência, são selecionados a partir de alanina (A), serina (S), treonina (T) e valina (V). De maior preferência são os de serina, alanina ou treonina. Em uma realização, o resíduo original para a formação da cavidade possui um volume de cadeia secundária grande, tal como a tirosina, arginina, fenilalanina ou triptofano.
[0179] Um resíduo de amino ácido “original” é aquele que é substituído por um resíduo “importado”, que pode possuir um volume de cadeia secundária inferior ou superior ao resíduo inicial. O resíduo de amino ácido importado pode ser um resíduo de amino ácido de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, mas de preferência é o último. Os resíduos de amino ácidos de “ocorrência natural” são aqueles resíduos codificados pelo código genético e listados na Tabela 1 acima. O termo resíduo de amino ácido de “ocorrência não natural” significa um resíduo que não é codificado pelo código genético, mas que é capaz de covalentemente se ligar ao(s) resíduo(s) de amino ácido adjacente(s) na cadeia polipeptídica. Os exemplos de resíduos de amino ácidos de ocorrência não natural são a norleucina, ornitina, norvalina, homo-serina e outros análogos de resíduos de amino ácidos, tais como os descritos em Ellman et al., Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991), por exemplo. Para gerar tais resíduos de amino ácidos de ocorrência não natural, os procedimentos de Noren et al., Science 244: 182 (1989) e Ellman et al., acima podem ser utilizados. Resumidamente, isto envolve quimicamente ativar um tRNA supressor com um resíduo de amino ácido de ocorrência não natural, seguido por transcrição e tradução de RNA in vitro. O método da presente invenção envolve a substituição de, pelo menos, um resíduo de amino ácido original, mas superior a um resíduo original pode ser substituído. Normalmente, não superior ao total de resíduos na interface do primeiro ou segundo polipeptídeo irá compreender os resíduos de amino ácidos originais que são substituídos. Normalmente, os resíduos originais para substituição estão “enterrados”. O termo “enterrado” significa que o resíduo é essencialmente inacessível ao solvente., em geral, o resíduo importado não é a cisteína para evitar uma possível oxidação ou pareamento incorreto de ligações de dissulfureto.
[0180] A protuberância está “posicionada” na cavidade, o que significa que a localização espacial da protuberância e cavidade na interface do primeiro polipeptídeo e segundo polipeptídeo, respectivamente, e os tamanhos da protuberância e cavidade são de tal maneira que a protuberância pode estar localizada na cavidade sem significativamente perturbar a associação normal dos primeiros e segundos polipeptídeos na interface. Uma vez que as protuberâncias, tais como Tyr, Phe e Trp normalmente não se estendem perpendicularmente em relação ao eixo da interface e possuem conformações de preferência, o alinhamento de uma protuberância com uma cavidade correspondente se baseia na modelação do par de protuberância / cavidade com base em uma estrutura tridimensional, tal como a obtida por cristalografia de raios X ou ressonância magnética nuclear (MNR). Isto pode ser alcançado utilizando as técnicas amplamente aceitadas no estado da técnica. O termo “ácido nucleico original ou modelo” significa que o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de interesse que pode ser “alterado” (isto é, geneticamente modificado ou mutado) para codificar uma protuberância ou cavidade. O ácido nucleico original ou de partida pode ser um ácido nucleico de ocorrência natural ou pode compreender um ácido nucleico que foi submetido à alteração anterior (por exemplo, um fragmento de anticorpo humanizado). O termo “alteração” do ácido nucleico significa que o ácido nucleico original mutado por inserção, eliminação ou substituição de, pelo menos, um códon codificador de um resíduo de amino ácido de interesse. Normalmente, um códon que codifica um resíduo inicial é substituído por um códon que codifica um resíduo importado. As técnicas para a modificação genética de um DNA desta maneira foram revistas em Mutagenesis: A Practical Approach, M.J. McPherson, Ed, (IRL Press, Oxford, Reino Unido (1991), e incluem a reação em cadeia de mutagênese direcionada ao local, mutagênese de cassete e mutagênese de reação de cadeia polimerase (PCR), por exemplo. Por mutação de um ácido nucleico original / molde, um polipeptídeo original / molde codificado pelo ácido nucleico original / modelo, por conseguinte, é correspondentemente alterado.
[0181]A protuberância ou cavidade pode ser “introduzida” na interface de um primeiro ou um segundo polipeptídeo por meios sintéticos, por exemplo, por meio de técnicas recombinantes, síntese de peptídeos in vitro, técnicas para a introdução de resíduos de amino ácidos ocorrência não natural anteriormente descritas, por acoplamento químico ou enzimático de peptídeos ou alguma combinação destas técnicas. Consequentemente, a protuberância ou cavidade que é “introduzida” é “de ocorrência não natural” ou “não nativa”, o que significa que não existe na natureza ou no polipeptídeo original (por exemplo, um anticorpo monoclonal humanizado).
[0182] Em geral, o resíduo de amino ácido importado para a formação da protuberância possui um número relativamente pequeno de “rotômeros” (por exemplo, cerca de 3 a 6). Um “rotômero” é uma conformação energeticamente favorável de uma cadeia secundária de amino ácido. O número de rotômeros dos diversos resíduos de amino ácidos é revisado em Ponders e Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987).
[0183] Em algumas realizações dos métodos fornecidos no presente, o primeiro domínio de heterodimerização da proteína heteromultimérica compreende uma modificação da saliência na interface, e o segundo domínio de heterodimerização compreende uma modificação do orifício. Em determinadas realizações, a modificação da saliência compreende a substituição de um resíduo de amino ácido original a partir do primeiro domínio de heterodimerização com um resíduo de amino ácido com uma cadeia secundária superior ao resíduo de amino ácido original. Em determinadas realizações, o resíduo de amino ácido de substituição com a cadeia secundária maior é um triptofano, uma fenilalanina, uma tirosina, ou uma arginina. Em determinadas realizações, a modificação da saliência compreende a substituição de T366W (numeração EU). Em determinadas realizações, a modificação do orifício compreende a substituição de um resíduo de amino ácido a partir do segundo domínio de heteromultimerização que possui um resíduo de amino ácido com uma cadeia secundária menor. Em determinadas realizações, o amino ácido de substituição que possui a cadeia secundária menor é uma serina, treonina, valina, ou alanina. Em algumas realizações, a modificação do orifício compreende duas ou mais substituições de amino ácidos que compreende o T366S, L368A e/ou Y407V (numeração EU).
IV. VETORES, CÉLULAS HOSPEDEIRAS E MÉTODOS RECOMBINANTES
[0184] Para a produção recombinante de uma proteína heteromultimérica (por exemplo, um anticorpo) da presente invenção, a codificação do ácido nucleico é isolada e inserida em um vetor replicável para a clonagem adicional (amplificação de DNA) ou para a expressão. O DNA que codifica o anticorpo é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando as sondas oligonucleotídicas que são capazes de especificamente se ligar a genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. A seleção do vetor, em parte, depende da célula hospedeira a ser utilizada, em geral, as células hospedeiras são de origem mamífera. Será considerado que as regiões constantes de qualquer isótipo podem ser utilizadas para este propósito, incluindo as regiões constantes de IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, e que essas regiões constantes podem ser obtidas a partir de quaisquer espécies humana ou animal.
A. GERAÇÃO DAS PROTEÍNAS HETEROMULTIMÉRICA UTILIZANDO AS CÉLULAS HOSPEDEIRAS DE MAMÍFERO
[0185] Os componentes do vetor, em geral, incluem, mas não estão limitados a um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor, e uma sequência de terminação da transcrição.
I. COMPONENTE DA SEQUÊNCIA DE SINAL
[0186] Um vetor para utilização em uma célula hospedeira de mamífero também pode conter uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo que possui um local de clivagem específico no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeo de interesse. A sequência de sinal heteróloga de preferência selecionada é uma que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Na expressão nas células de mamífero, as sequências de sinal de mamífero bem como os comandos de secreção virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex, estão disponíveis. O DNA para tal região precursora está ligado em uma estrutura de leitura ao DNA que codifica a(s) proteína(s) heteromultimérica(s) desejada(s) (por exemplo, os anticorpos).
II. ORIGEM DE REPLICAÇÃO
[0187] Em geral, uma origem do componente de replicação não é necessária para os vetores de expressão de mamíferos. Por exemplo, a origem de SV40 normalmente pode ser utilizada, mas apenas devido a que contém o promotor precoce.
III. COMPONENTE DO GENE DE SELEÇÃO
[0188] Os vetores de expressão e de clonagem podem conter um gene de seleção, também denominado um marcador selecionável. Os genes de seleção típicos codificam as proteínas que (a) conferem resistência aos antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, a ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b) complementam as deficiências auxotróficas, quando relevante, ou (c) fornecem os nutrientes críticos não disponíveis em meios complexos.
[0189] Um exemplo de um esquema de seleção utiliza uma droga para a parada do crescimento de uma célula hospedeira. Essas células que são transformadas com êxito em um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência à droga e, por conseguinte, sobrevivem ao regime de seleção. Os exemplos de tal seleção dominante utilizam as drogas de neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
[0190] Um outro exemplo de marcadores selecionáveis adequados para as células de mamífero são aqueles que possibilitam a identificação de células competentes para absorver o ácido nucleico do anticorpo, tais como o DHFR, a quinase de timidina, metalotioneina-I e -II, de preferência, os genes de metalotioneina de primatas, deaminase adenosina, ornitina descarboxilase, e similares.
[0191] Por exemplo, as células transformadas com o gene de seleção DHFR primeiramente são identificadas por meio de cultura de todos os transformantes em um meio de cultura que contém o metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira adequada para quando o DHFR do tipo selvagem for empregado é a linhagem celular do ovário de hamster chinês (CHO) deficiente na atividade de DHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096).
[0192] De maneira alternativa, as células hospedeiras (especialmente os hospedeiros de tipo selvagem que contêm o DHFR endógeno) transformadas ou cotransformadas com as sequências de DNA que codificam um anticorpo, proteína DHFR de tipo selvagem, e outro marcador selecionável, tal como o aminoglicosídeo 3’-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas através do crescimento celular no meio que contém um agente de seleção para o marcador selecionável tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, a canamicina, neomicina ou G418. Vide, por exemplo, a patente US 4.965.199.
IV. COMPONENTE DO PROMOTOR
[0193] Os vetores de expressão e de clonagem normalmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operavelmente ligado ao ácido nucleico do(s) polipeptídeo(s) contendo o ponto de clivagem desejado. São conhecidas as sequências promotoras para as células de mamífero. Virtualmente todos os genes de mamíferos possuem uma região rica em AT localizada cerca de25 a 30 bases a montante do local em que a transcrição é iniciada. Outra sequência descoberta de 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT em que N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes de mamífero é uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para a adição da cauda poli A à extremidade 3' da sequência de codificação. Todas estas sequências são adequadamente inseridas em vetores de expressão de mamíferos.
[0194]A transcrição do(s) polipeptídeo(s) contendo o ponto de clivagem desejado e a transcrição da(s) cadeia(s) leve(s) a partir de vetores nas células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, a partir dos promotores obtidos dos genomas de vírus, tais como, por exemplo, o vírus polioma, vírus da varíola aviária, adenovírus (tais como o adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e Virus Simian 40 (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamífero, por exemplo, o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, ou a partir de promotores de choque térmico, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira.
[0195] Os promotores iniciais e tardios do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição SV40 que também contém a origem de replicação viral SV40. O promotor inicial imediato do citomegalovírus é convenientemente obtido como um fragmento de restrição HindIII E. Um sistema para a expressão do DNA em hospedeiros mamíferos utilizando o vírus do papiloma bovino como vetor está descrito na patente US 4.419.446. Uma modificação desse sistema está descrita na patente US 4.601.978. Vide também Reyes et al., Nature 297: 598 - 601 (1982) sobre a expressão do cDNA do interferon humano em células de camundongos sob o controle de um promotor de quinase de timidina a partir do vírus herpes simplex. De maneira alternativa, a repetição terminal longa do Vírus do Sarcoma de Rous pode ser utilizada como o promotor.
V. COMPONENTE DO ELEMENTO INTENSIFICADOR
[0196]A transcrição de DNA que codifica o(s) polipeptídeo(s) contendo o ponto de clivagem e a(s) cadeia(s) leve(s) por células hospedeiras de mamífero pode ser aumentada através da inserção de uma sequência intensificadora no vetor. Muitas sequências intensificadoras são agora conhecidas a partir dos genes de mamíferos (por exemplo, a globina, elastase, albumina, a-fetoproteína, e os genes de insulina). Além disso, pode ser utilizado um intensificador a partir de um vírus de célula eucariótica. Os exemplos incluem o intensificador SV40 do lado tardio da origem de replicação (bp 100 - 270), o intensificador do promotor inicial do citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem de replicação e intensificadores de adenovírus. Vide também Yaniv, Nature 297: 17 - 18 (1982) para uma descrição dos elementos intensificadores para a ativação dos promotores eucarióticos. O intensificador pode ser unido no vetor em uma posição 5’ ou 3’ na sequência de codificação do anticorpo-polipeptídeo, desde que a intensificação seja alcançada, mas, em geral, é localizado em um local 5' do promotor.
vi. COMPONENTE DE TERMINAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO
[0197] Os vetores de expressão utilizados nas células hospedeiras de mamífero normalmente também irão conter as sequências necessárias para a terminação da transcrição e para a estabilização do mRNA. Tais sequências normalmente estão disponíveis a partir do 5’ e, ocasionalmente, 3’, as regiões não traduzidas dos DNAs ou cDNAs virais ou de mamíferos. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida de RNAm que codifica um anticorpo. Um componente de terminação da transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino. Vide a publicação WO 1994/11026 e o vetor de expressão descrito no mesmo.
vii. SELEÇÃO E TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS
[0198]As células hospedeiras adequadas para a clonagem ou expressão de DNA nos vetores do presente incluem as células de mamíferos descritas no presente, incluindo as células hospedeiras de vertebrados. A propagação de células de vertebrados na cultura (cultura de tecidos) se tornou um procedimento de rotina. Os exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamífero úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para o crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen. Virol 36:59 (1977).); células de rim de bebês hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês / -DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci EUA 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol Reprod 23: 243-251 (1980).); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO- 76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).
[0199]As células hospedeiras são transformadas com a expressão ou vetores de clonagem descritos acima para o(s) polipeptídeo(s) contendo o ponto de clivagem desejado que contém e a produção da(s) cadeia(s) leve(s) e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme adequado para induzir os promotores, selecionar os transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas. Em algumas realizações, a célula hospedeira é uma célula hospedeira transfectada de maneira estável. Em determinadas realizações, a célula hospedeira é uma linhagem de célula estável.
viii. CULTURA DAS CÉLULAS HOSPEDEIRAS
[0200]As células hospedeiras utilizadas para produzir um polipeptídeo(s) contendo o ponto de clivagem desejado e a(s) cadeia(s) leve(s) da presente invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Os meios comercialmente disponíveis tais como F10 de Ham (Sigma), Meio Mínimo Essencial ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultura das células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth Enz, 58:44 (1979), Barnes et al., Anal Biochem.102: 255 (1980), patentes US 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; publicações WO 1990/03430; WO 1987/00195; ou patente US 30.985 pode ser utilizado como meio de cultura para as células hospedeiras Qualquer um destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como a insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como o cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tais como o HEPES), nucleotídeos (tais como a adenosina e timidina), antibióticos (tal como a droga gentamicina™), elementos vestigiais (definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais no intervalo micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos em concentrações adequadas que serão conhecidas dos técnicos no assunto. As condições de cultura, tais como a temperatura, pH e similares, são aquelas previamente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para a expressão, e serão evidentes para o técnico no assunto.
IX. PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS HETEROMULTIMÉRICAS
[0201] Quando se utilizam as técnicas recombinantes, os polipeptídeos contendo o ponto de clivagem associados com os polipeptídeos de cadeia leve pode ser intracelularmente produzida, ou diretamente segregada para o meio. Se os polipeptídeos contendo o ponto de clivagem e polipeptídeo de cadeia leve forem intracelularmente produzidos, como uma primeira etapa, os detritos particulados, das células hospedeiras ou dos fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, através da centrifugação ou ultrafiltração. Quando o polipeptídeo contendo o ponto de clivagem associado com o polipeptídeo de cadeia leve for segregado para o meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão em geral, são primeiramente concentrados utilizando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como o PMSF pode ser incluído em qualquer uma das etapas anteriores para inibir a proteólise e os antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios.
[0202]A composição do heteromultímero preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, a cromatografia em hidroxilapatite, eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, com a cromatografia de afinidade sendo a técnica de purificação de preferência. A adequabilidade da proteína A como ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que está presente no anticorpo. A proteína A pode ser utilizada para purificar os anticorpos que são com base em cadeias pesadas de Y1 , Y2, ou Y4 humano (Lindmark et al., J. Immunol Meth 62: 1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongo e para y3 humano (Guss et al., EMBO J. 5: 1.5671.575 (1986)). A matriz à qual o ligante de afinidade está ligado muito frequentemente é a agarose, mas estão disponíveis outras matrizes. As matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro de poro controlado ou poli(estireno-divinil)benzeno possibilitam as taxas de fluxo mais rápidas e menores tempo de processamento que podem ser obtidos com a agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX® (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para a purificação. Outras técnicas de purificação de proteínas, tais como o fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação do etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografia em sílica, cromatografia em cromatografia Sepharose® de heparina em uma resina de troca de ânion ou cátion (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE e precipitação de sulfato de amônio também estão disponíveis, dependendo do anticorpo a ser recuperado.
[0203]Após qualquer(quaisquer) etapa(s) de purificação preliminar, a mistura que compreende o anticorpo de interesse e os contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interação hidrofóbica de pH baixo utilizando um tampão de eluição em um pH entre cerca de 2,5 a 4,5, de preferência realizado em baixas concentrações de sal (por exemplo, de cerca de 0 a 0,25 M de sal). A produção das proteínas heteromultiméricas, de maneira alternativa ou adicional, (de qualquer um dos métodos específicos anteriores) pode compreender a diálise de uma solução que compreende uma mistura dos polipeptídeos.
V. FORMAÇÃO / MONTAGEM DE PROTEÍNAS HETEROMULTIMÉRICAS
[0204]A formação da proteína heteromultimérica completa envolve a remontagem do polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem, a primeira cadeia leve, o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem, e a segunda cadeia leve através da formação de ligação de dissulfureto que na presente invenção é referida como redobragem. A redobragem inclui a associação do polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem com o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e a formação de ligações de intercadeias de dissulfureto, por exemplo, para a formação de um anticorpo biespecífico. Por conseguinte, em algumas realizações dos métodos fornecidos no presente, a ligação de intercadeias de dissulfureto da proteína heteromultimérica está entre as regiões de clivagem os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem. A redobragem, também denominada renaturação, na presente invenção é realizada in vitro.
[0205] Uma vez que os polipeptídeos contendo o ponto de clivagem e as cadeias leves associadas são segregadas a partir da célula, os domínios de heteromultimerização irão direcionar a associação das proteínas heteromultiméricas. A formação de intercadeias de dissulfureto do polipeptídeo contendo o ponto de clivagem associado continua. A proteína heteromultimérica ligada ao dissulfureto resultante, em seguida, é purificada. Opcionalmente, pode ser formulada para os propósitos de investigação, diagnósticos, terapêuticos ou outros.
vi. MOLÉCULAS ALVO
[0206] Os exemplos de moléculas que podem ser alvo de uma proteína heteromultimérica da presente invenção incluem, mas não estão limitados às proteínas do soro solúveis e os seus receptores e outras proteínas ligadas por membrana (por exemplo, as adesinas).
[0207] Em outra realização, a proteína heteromultimérica da presente invenção é capaz de se ligar a uma, duas ou mais citocinas, proteínas relacionadas com a citocina e receptores de citocina selecionados a partir do grupo que consiste em BMPl, BMP2, BMP3B (GDFlO), BMP4, BMP6, BMP8, CSFl (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGFl (aFGF), FGF2 (bFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNAl, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNBl, IFNG, IFNWl, FELl, FELl (Epselon), FELl (ZETA), IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL17B, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA (TNF-b), LTB, TNF (TNF-a), TNFSF4 (ligante OX40), TNFSF5 (ligante CD40), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (ligante CD27), TNFSF8 (ligante CD30), TNFSF9 (ligante 4- 1BB), TNFSFl0 (TRAIL), TNFSF1l (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, ILlR1, IL1R2, IL1RL1, LL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, ILl0RA, ILl0RB, IL1lRA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIFl, HGF, LEP (leptina), PTN, e THPO.
[0208] Em outra realização, uma molécula alvo é uma quimioquina, receptor de quimiocina, ou uma proteína relacionada com a quimiocina selecionada a partir do grupo que consiste em CCLl (I-309), CCL2 (MCP -1 / MCAF), CCL3 (MIP-Ia), CCL4 (MIP-Ib), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP- 3), CCL8 (mcp-2), CCLH (eotaxina), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-Id), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MDP-3b), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (SLC / exodus-2), CCL22 (MDC / STC-I), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2 / eotaxin-2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaxin-3), CCL27 (CTACK / ILC), CCL28, CXCLl (GROl), CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP 10), CXCL11 (I- TAC), CXCL12 (SDFl), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL1 (SCYDl), SCYEl, XCLl (limfotactina), XCL2 (SCM-Ib), BLRl (MDR15), CCBP2 (D6 / JAB61), CCRl (CKRl / HM145), CCR2 (mcp-lRB / RA), CCR3 (CKR3 / CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5 / ChemR13), CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6), CCR7 (CKR7 / EBIl), CCR8 (CMKBR8 / TERl / CKR- Ll), CCR9 (GPR-9-6), CCRLl (VSHKl), CCRL2 (L-CCR), XCRl (GPR5 / CCXCRl), CMKLRl, CMKORl (RDCl), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCRlO), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Ra), IL8RB (IL8Rb), LTB4R (GPR16), TCPlO, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1, CSF3, GRCClO (ClO), EPO, FY (DARC), GDF5, HDFlA, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREMl, TREM2 e VHL.
[0209] Em outra realização as proteínas heteromultiméricas da presente invenção são capazes de se ligar a um ou mais alvos selecionados a partir do grupo que consiste em ABCFl; ACVRl; ACVRlB; ACVR2; ACVR2B; ACVRLl; AD0RA2A; Aggrecan; AGR2; AICDA; AIFl; AIGl; AKAPl; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPTl; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOCl; AR; AZGPl (zinc-a-glicoproteína); B7.1; B7.2; BAD; BAFF (BLys); BAGl; BAIl; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRl (MDR15); BMPl; BMP2; BMP3B (GDFlO); BMP4; BMP6; BMP8; BMPRlA; BMPRlB; BMPR2; BPAGl (plectina); BRCAl; C19orflO (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANTl; CASP1; CASP4; CAVl; CCBP2 (D6 / JAB61); CCLl (1-309); CCLIl (eotaxina); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP-Id); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (MCP-1); MCAF; CCL20 (MIP-3a); CCL21 (MTP-2); SLC; exodus-2; CCL22 (MDC / STC-I); CCL23 (MPIF- 1); CCL24 (MPIF-2 / eotaxin-2); CCL25 (TECK); CCL26 (eotaxin-3); CCL27 (CTACK / ILC); CCL28; CCL3 (MTP-Ia); CCL4 (MDP-Ib); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNAl; CCNA2; CCNDl; CCNEl; CCNE2; CCRl (CKRl / HM145); CCR2 (mcp-lRB / RA);CCR3 (CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5 / ChemR13); CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6); CCR7 (CKR7 / EBIl); CCR8 (CMKBR8 / TERl / CKR-Ll); CCR9 (GPR-9-6); CCRLl (VSHKl); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CDlC; CD20; CD200; CD22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81; CD83; CD86; CDHl (E-cadherina); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKNlA (p21Wapl/Cipl); CDKNlB (p27Kipl); CDKNlC; CDKN2A (P16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CERl; CHGA; CHGB; quitinase; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3;CLDN7 (claudin-7); CLN3; CLU (clusterina); CMKLRl; CMKORl (RDCl); CNRl; COL18A1; COLlAl; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSFl (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF);CTLA4; CTNNBl (b-catenina); CTSB (catepsina B); CX3CL1 (SCYDl); CX3CR1 (V28); CXCLl (GROl); CXCL10 (IP-10); CXCLIl (I- TAC / IP-9); CXCL12 (SDFl); CXCL13; CXCL14;CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78 / LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo); CYB5; CYCl; CYSLTRl; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCLl; DPP4; E2F1; ECGFl; EDGl; EFNAl; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESRl; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCERlA; FCER2; FCGR3A; FGF; FGFl (aFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FELl (EPSILON); FILl (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRTl (fibronectina); FLTl; FOS; FOSLl (FRA-I); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEBl; GAGECl; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNASl; GNRHl; GPR2 (CCRlO); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCClO (ClO); GRP; GSN (Gelsolin); GSTPl; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIFlA; HDPl; histamina e receptores de histamina; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOXl; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-a; IFNAl; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFNgamma; DFNWl; IGBPl; IGFl; IGFlR; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-I; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1A; IL1B; ILlF10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HYl; IL1Rl; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2; IL1RL1; IL1RL2, ILlRN; IL2; IL20; IL20RA; IL21R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (glicoproteína 130); EL7; EL7R; EL8; IL8RA; DL8RB; IL8RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA;INSL3; INSL4; IRAKI; ERAK2; ITGAl; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (a6 integrina); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b 4 integrina); JAGl; JAKl; JAK3; JUN; K6HF; KAIl; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLKlO; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (queratina 19); KRT2A; KHTHB6 (queratina H do tipo específico de cabelo); LAMAS; LEP (leptina); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG or Omgp; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIBl; midquina; MEF; MIP-2; MKI67; (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3 (metalotionectin-III); MTSSl; MUCl (mucina); MYC; MYD88; NCK2; neurocano; NFKBl; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR- Nogo66 (Nogo); NgR- p75; NgR-Troy; NMEl (NM23A); N0X5; NPPB; NROBl; NR0B2; NRlDl; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR1I2; NR1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRPl; NRP2; NT5E; NTN4; ODZl; OPRDl; P2RX7; PAP; PARTl; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAMl; PF4 (CXCL4); PGF; PGR;fosfacano; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDCl; PPBP (CXCL7); PPID; PRl; PRKCQ; PRKDl; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21Rac2); RARB; RGSl; RGS13; RGS3; RNFIlO (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2 (lipofilina B); SCGB2A1 (mamaglobina 2); SCGB2A2 (mamaglobina 1); SCYEl (citoquina ativada por monócito endotelial); SDF2; SERPINAl; SERPINA3; SERP1NB5 (maspina); SERPINEl (PAI-I); SERPDMF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPl; SPRRlB (Sprl); ST6GAL1; STABl; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCPlO; TDGFl; TEK; TGFA; TGFBl; TGFBlIl; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRl; TGFBR2; TGFBR3; THlL; THBSl (trombospondin-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TMP3; fator do tecido; TLRlO; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFIlA; TNFRSFlA; TNFRSFlB; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSFlO (TRAIL); TNFSFl 1 (TRANCE); TNFSF12 (APO3L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (ligante OX40); TNFSF5 (CD40 ligand); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (ligante CD27); TNFSF8 (CD30 ligand); TNFSF9 (ligante 4-1BB); TOLLIP; receptores do tipo Toll; TOP2A (topoisomerase Ea); TP53; TPMl; TPM2; TRADD; TRAFl; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREMl; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; versicano; VHL C5; VLA-4; XCLl (limfotactina); XCL2 (SCM- Ib); XCRl(GPR5 / CCXCRl); YYl; e ZFPM2.
[0210]As moléculas alvo moleculares de preferência para os anticorpos englobados pela presente invenção incluem as proteínas CD, tais como CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD20, CD34; CD64, CD200 membros da família de receptores ErbB tais como o receptor de EGF, receptor HER2, HER3 ou HER4; moléculas de adesão celular tais como LFA-1, Mac1, p150.95, VLA- 4, ICAM-1, integrina VCAM, alfa4 / beta7, e a integrina alfaV / beta3 incluindo as saus subunidades alfa ou beta (por exemplo, o anti-CD11a, anti-CD18 ou anti-CD11b); fatores de crescimento tais como o VEGF-A, VEGF-C; fator do tecido (TF); interferona alfa (alfaIFN); TNFalfa, uma interleucina, tais como o IL- 1beta, IL-3, IL-4, IL-5, IL-8, IL-9, IL-13, IL17A / F, IL-18, IL-13Ralfa1, IL13Ralfa2, IL -4R, IL-5R, IL-9R, IgE; antígenos do grupo sanguíneo; receptor flk2 / FLT3; receptor da obesidade (OB); receptor mpl; CTLA-4; RANKL, RANK, proteína RSV F, proteína C e similares.
[0211] Em uma realização, as proteínas heteromultiméricas da presente invenção ligam a proteína relacionada com o receptor de lipoproteína de densidade baixa (LRP)-1 ou PRL-8 ou um receptor de transferrina e, pelo menos, um alvo selecionado a partir do grupo que consiste em (1) beta- secretase (BACE1 ou BACE2), (2) alfa-secretase, (3) gama-secretase, (4) tau- secretase, (5) proteína precursora da amilóide (APP), (6) receptor de morte 6 (DR6), (7) peptídeo amilóide beta, (8) alfa-sinucleína, (9) Parkin, (10) Huntingtina, (11) p75 NTR, e (12) caspase-6.
[0212] Em uma realização, as proteínas heteromultiméricas da presente invenção se ligam a, pelo menos, duas moléculas alvo selecionadas a partir do grupo que consiste em: IL-1alfa e IL-1beta, IL-12 e IL-18; IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-5 e IL-4; IL-13 e IL-1beta; IL-13 e IL- 25; IL-13 e TARC; IL-13 e MDC; IL-13 e MEF; IL-13 e TGF-β; IL-13 e agonista LHR; IL-12 e TWEAK, IL-13 e CL25; IL-13 e SPRR2a; IL-13 e SPRR2b; IL-13 e ADAM8, IL-13 e PED2, IL17A e IL17F, CD3 e CD19, CD138 e CD20; CD138 e CD40; CD19 e CD20; CD20 e CD3; CD38 e CD138; CD38 e CD20; CD38 e CD40; CD40 e CD20; CD-8 e IL-6; CD20 e BR3, TNFalfa e TGF-beta, TNFalfa e IL- 1beta; TNFalfa e IL-2, TNF alfa e IL-3, TNFalfa e IL-4, TNFalfa e IL-5, TNFalfa e IL6, TNFalfa e IL8, TNFalfa e IL-9, TNFalfa e IL-10, TNFalfa e IL-11, TNFalfa e IL-12, TNFalfa e IL-13, TNFalfa e IL-14, TNFalfa e IL-15, TNFalfa e IL-16, TNFalfa e IL-17, TNFalfa e IL-18, TNFalfa e IL-19, TNFalfa e IL-20, TNFalfa e IL-23, TNFalfa e IFNalfa, TNFalfa e CD4, TNFalfa e VEGF, TNFalfa e MIF, TNFalfa e ICAM-1, TNFalfa e PGE4, TNFalfa e PEG2, TNFalfa e ligante RANK, TNFalfa e Te38; TNFalfa e BAFF; TNFalfa e CD22; TNFalfa e CTLA-4; TNFalfa e GP130; TNFα e IL-12p40; VEGF e HER2, VEGF-A e HER2, VEGF-A e PDGF, HER1 e HER2, VEGF-A e VEGF-C, VEGF-C e VEGF-D, HER2 e DR5,VEGF e IL-8, VEGF e MET, VEGFR e MET receptor, VEGFR e EGFR, HER2 e CD64, HER2 e CD3, HER2 e CD16, HER2 e HER3; EGFR(HER1) e HER2, EGFR e HER3, EGFR e HER4, IL-13 e CD40L, IL4 e CD40L, TNFR1 e IL-1R, TNFR1 e IL-6R e TNFR1 e IL-18R, EpCAM e CD3, MAPG e CD28, EGFR e CD64, CSPGs e RGM A; CTLA-4 e BTNO2; IGF1 e IGF2; IGF1/2 e Erb2B; MAG e RGM A; NgR e RGM A; NogoA e RGM A; OMGp e RGM A; PDL-I e CTLA-4; e RGM A e RGM B.
[0213] Os antigênios solúveis ou seus fragmentos, opcionalmente conjugados com outras moléculas, podem ser utilizados como imunogênios para gerar os anticorpos. Para as moléculas transmembranares, tais como os receptores, seus fragmentos (por exemplo, o domínio extracelular de um receptor) podem ser utilizadas como imunogênio. De maneira alternativa, as células que expressam a molécula transmembranar podem ser utilizadas como o imunogênio. Tais células podem ser derivadas de uma fonte natural (por exemplo, as linhagens celulares de câncer) ou podem ser células que foram transformadas através de técnicas recombinantes para expressar a molécula transmembranar. Outros antigênios e suas formas úteis para a preparação de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto.
vii. ANÁLISES DA ATIVIDADE
[0214]As proteínas heteromultiméricas da presente invenção podem ser caracterizadas pelas suas propriedades físicas / químicas e funções biológicas por diversas análises conhecidas no estado da técnica.
[0215]As proteínas heteromultimérica purificadas ainda podem ser caracterizadas por uma série de análises incluindo, mas não limitada à sequenciação N-terminal, análise de amino ácidos, cromatografia líquida de exclusão por tamanho de pressão elevada não desnaturante (HPLC), espectrometria de massa, cromatografia de troca iônica e digestão com papaína.
[0216] Em determinadas realizações da presente invenção, as imunoglobulinas no presente produzidas são analisadas quanto à sua atividade biológica. Em algumas realizações, as imunoglobulinas da presente invenção são testadas quanto à sua atividade de ligação ao antígeno. As análises de ligação ao antígeno que são conhecidas no estado da técnica e podem ser utilizadas no presente incluem, sem limitação, quaisquer análises de ligação direta ou competitivas utilizando as técnicas tais como western blots, radioimunoanálises, ELISA (Análise Imunosorvente Ligada à Enzima), imunoanálises “sanduíche”, análisesde imunoprecipitação, imunoanálises fluorescentes, e imunoanálises de proteína A. Uma análise de ligação ao antígeno ilustrativo é fornecida abaixo na seção de Exemplos.
[0217] Em uma realização, a presente invenção contempla um anticorpo alterado que possui algumas, mas não todas as funções efetoras, o que torna um candidato desejado para muitas aplicações em que a semivida do anticorpo in vivo ainda é importante para determinadas as funções efetoras (tais como o complemento e ADCC) são desnecessárias ou deletérias. Em determinadas realizações, as atividades Fc da proteína heteromultimérica produzida são medidas para assegurar que apenas as propriedades desejadas sejam mantidas. As análises de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser realizadas para confirmar a redução / depleção de atividades CDC e/ou ADCC. Por exemplo, as análises de ligação ao receptor Fc (FcR) podem ser realizadas para assegurar que a proteína heteromultimérica não possua a ligação FCYR (por conseguinte, provavelmente não possuem a atividade ADCC), mas retém a capacidade de ligação de FcRn. As células primárias para mediar as células ADCC, NK, expressam Fc(RIII apenas, enquanto os monócitos expressam Fc(RI, Fc(RII e Fc(RIII. A expressão FcR nas células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Um exemplo de uma análise in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse está descrita na patente US 5.500.362 ou 5.821.337. As células efetoras úteis para tais análises incluem as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (NK). De maneira alternativa ou adicional, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal conforme descrito em Clynes et al., PNAS (EUA) 95: 652-656 (1998). As análises de ligação C1q também podem ser realizadas para confirmar que o anticorpo é capaz de se ligar ao C1q e, por conseguinte, não possui a atividade CDC. Para avaliar a ativação do complemento, uma análise de CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996), pode ser realizada. A ligação FcRn e as determinações de meia-vida / depuração in vivo / também pode ser realizada utilizando os métodos conhecidos no estado da técnica.
viii. PROTEÍNAS CONJUGADAS
[0218]A presente invenção também fornece as proteínas conjugadas, tais como os anticorpos conjugados ou imunoconjugados (por exemplo, “conjugados do anticorpo-droga” ou “ADC”), que compreendem qualquer uma das proteínas heteromultiméricas descritas no presente (por exemplo, um anticorpo produzido de acordo com os métodos descritos no presente), em que uma das regiões constantes da cadeia leve ou da cadeia pesada é conjugada com uma molécula química tal como um agente corante ou citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, uma droga, um agente inibidor do crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado). Em especial, conforme descrito no presente, a utilização de domínios de heteromultimerização possibilita a construção de anticorpos que contêm duas cadeias pesadas diferentes e HC1 (HC2), bem como duas cadeias leves diferentes (LC1 e LC2). Um imunoconjugado construído utilizando os métodos descritos no presente pode conter o agente citotóxico conjugado a uma região constante de apenas uma das cadeias pesadas (HC1 ou HC2) ou apenas uma das cadeias leves (LC1 ou LC2). Além disso, uma vez que o imunoconjugado pode possuir o agente citotóxico ligado à apenas uma cadeia pesada ou leve, a quantidade do agente citotóxico a ser administrada a um indivíduo é reduzida em relação à administração de um anticorpo com o agente citotóxico ligado a ambas as cadeias pesadas ou leves. Reduzindo a quantidade de agente citotóxico sendo administrada a um indivíduo limita os efeitos secundários adversos associados com o agente citotóxico.
[0219]A utilização de conjugados anticorpo-droga para a entrega local de agentes citotóxicos ou citostáticos, isto é, as drogas para matar ou inibir as células tumorais no tratamento do câncer (Syrigos e Epenetos, Anticancer Research 19: 605-614 (1999); Niculescu-Duvaz e Springer, Adv Drg Del Rev. 26: 151-172 (1997); patente US 4.975.278) possibilita a entrega direcionada da molécula de droga aos tumores, e a sua acumulação intracelular, em que a administração sistêmica destes agentes de drogas não conjugadas podem resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para as células normais bem como as células de tumor que se procura eliminar (Baldwin et al., Lancet (15 de março de 1986): 603-605 (1986); Thorpe, (1985) “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al., páginas 475-506). A máxima eficácia com uma toxicidade mínima é procurado desta maneira. Ambos os anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais foram descritos como úteis para estas estratégias (Rowland et al., Cancer Immunol. Immunother 21: 183-187 (1986)). As drogas utilizadas nestes métodos incluem a daunomicina, doxorrubicina, metotrexato e vindesina (Rowland et al., (1986) acima). As toxinas utilizadas em conjugados anticorpo-toxina incluem as toxinas bacterianas tais como a toxina da difteria, toxinas dos vegetais tal como a ricina, toxinas de moléculas pequenas, tais como a geldanamicina (Mandler et al., Jour do Nat Cancer Inst 92 (19): 1.573-1.581. (2000); Mandler et al., Bioorganic & Med Chem Letters 10:1.025-1.028 (2000); Mandler et al., Bioconjugate Chem. 13: 786-791 (2002)), maitansinoides (patente EP 1.391.213; Liu et. al., Proc Natl Acad Sci EUA 93: 8.618-8.623 (1996)), e caliqueamicina (Lode et al., Cancer Res. 58: 2.928 (1998);. Hinman et al., Cancer Res 53: 3.336-3.342 (1993)). As toxinas podem afetar os seus efeitos citotóxicos e citostáticos através dos mecanismos que incluem a ligação à tubulina, ligação de DNA, ou a inibição da topoisomerase. Algumas drogas citotóxicas tendem a ser inativas ou menos ativas quando conjugadas com os anticorpos grandes ou ligantes de receptor de proteína.
[0220] Os agentes quimioterapêuticos úteis na geração de imunoconjugados estão descritos no presente (por exemplo, acima). As toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem a cadeia A de difteria, fragmentos ativos não ligantes da toxina da difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Vide, por exemplo, a publicação WO 1993/21232 depositada em 28 de outubro, 1993. Uma variedade de radionuclidos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Os exemplos incluem o 212Bi, 131I, 131In, 90Y, e 186Re. Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico são produzidos utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais, tais como o N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)-propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como o adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tais como o suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tal como o glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis (p- azidobenzoíl) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como a bis-(p- diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como o tolueno-2,6- diisocianato), e compostos de flúor bis-ativos (tais como o 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al, Science, 238: 1.098 (1987). O ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo de agente quelante para a conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Vide, por exemplo, a publicação WO 1994/11026.
[0221] Os conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de moléculas pequenas, tais como a caliqueamicina, maitansinoides, dolastatinas, aurostatinas, um tricoteceno e CC1065, e os derivados destas toxinas que possuem atividade de toxina, também são contemplados no presente. Os detalhes a respeito de tais toxinas de moléculas pequenas são fornecidos na publicação WO 2008/021290.
I. MAITANSINA E MAITANSINOIDES
[0222] Em algumas realizações, o imunoconjugado compreende um anticorpo (comprimento total ou fragmentos) da presente invenção conjugado a uma ou mais moléculas de maitansinoide.
[0223] Os maitansinoides são inibidores mitóticos que agem por meio da inibição da polimerização de tubulina. A maitansina foi isolada pela primeira vez a partir do leste Africano do arbusto Maytenus serrata (patente US 3.896.111). Posteriormente, foi descobrerto que determinados micróbios também produzem os maitansinoides, tais como o maitansinol e ésteres em C3 de maitansinol (patente US 4.151.042). O maitansinol sintético e seus derivados e análogos estão descritos, por exemplo, nas patentes US 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533.
[0224]As porções de droga de maitansinoide são porções de droga atrativas em conjugados de droga e anticorpo, uma vez que são os seguintes: (i) relativamente acessíveis para a preparação através da fermentação ou modificação química, derivatização dos produtos de fermentação, (ii) passíveis de derivatização com os grupos funcionais adequados para a conjugação através dos ligantes não de dissulfureto aos anticorpos, (iii) estáveis no plasma, e (iv) eficazes contra uma variedade de linhagens celulares tumorais.
[0225] Os imunoconjugados que contêm os maitansinoides, métodos desua produção, e a sua utilização terapêutica estão descritos, por exemplo, nas patentes US. 5.208.020, 5.416.064 e patente europeia EP 0.425.235 B1, cujas descrições estão expressamente incorporadas no presente como referência. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 93: 8.618-8.623 (1996) descreveram os imunoconjugados que compreendem um maitansinoide designado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 direcionado contra o câncer colorrectal humano. O conjugado mostrou ser altamente citotóxico para as células do câncer do cólon em cultura e apresentou a atividade antitumoral em uma análise de crescimento tumoral in vivo. Chari et al., Cancer Research. 52: 127-131 (1992) descrevem os imunoconjugados em que um maitansinoide foi conjugado através de um ligante de dissulfureto ao anticorpo de murino A7 ligando a um antígeno em linhagens celulares de câncer de cólon humano, ou a outro anticorpo monoclonal de murino TA.1 que liga o HER-2 / oncogene neu. A citotoxicidade do conjugado TA.1-maitansinoide foi testada in vitro na linhagem celular de câncer de mama humano SK-BR-3, que expressa 3 x 105 HER-2 antigênios de superfície por célula. O conjugado de droga alcançou um grau de citotoxicidade similar à droga sem maitansinoide, que podia ser aumentado através do aumento do número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticorpo. O conjugado A7-maitansinoide mostrou baixa citotoxicidade sistêmica nos camundongos.
[0226] Os conjugados anticorpo-maitansinoide são preparados através da ligação química de um anticorpo para uma molécula de maitansinoide, sem significativamente diminuir a atividade biológica, do anticorpo ou da molécula de maitansinoide. Vide, por exemplo, a patente US 5.208.020 (cuja descrição está expressamente incorporada no presente como referência). Uma média de 3 a 4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticorpo demonstrou eficácia no aumento da citotoxicidade de células alvo sem negativamente afetar a função ou solubilidade do anticorpo, embora fosse esperado que até mesmo uma molécula de toxina / anticorpo aumentasse a citotoxicidade através da utilização de anticorpo nu. Os maitansinoides são bem conhecidos no estado da técnica e podem ser sintetizados através de técnicas conhecidas ou isoladas a partir de fontes naturais. Os maitansinoides adequados estão descritos, por exemplo, na patente US 5.208.020 e nas outras patentes e publicações de não patente referidas anteriormente. Os maitansinoides de preferência são o maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, tais como diversos ésteres de maitansinol.
[0227] Existem muitos grupos de ligação conhecidos no estado da técnica para a produção dos conjugados anticorpo-maitansinoide, incluindo, por exemplo, os descritos na patente US 5.208.020 ou na patente EP 0.425.235 B1, Chari et al, Cancer Research 52: 127-131 (1992), e publicação de pedido de patente US 2005/0.169.933, cujas descrições estão expressamente incorporadas no presente como referência. Os conjugados de anticorpo- maitansinoide que compreendem o componente de ligação SMCC podem ser preparados conforme descrito na publicação do pedido de patente US 2005/0.169.933. Os grupos ligantes incluem os grupos dissulfureto, grupos tioéter, grupos de ácido lábeis, grupos fotolábeis, grupos peptidase lábeis, ou grupos esterases lábeis, conforme descrito nas patentes identificadas acima, os grupos dissulfureto e tioéter sendo de preferência. Os grupos de ligação adicionais estão descritos e exemplificados no presente.
[0228] Os conjugados do anticorpo e maitansinoide podem ser preparados utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais tais como o N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)-propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como o adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tais como o suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tal como o glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis (p-azidobenzoíl) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como a bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como o tolueno- 2,6-diisocianato), e compostos de flúor bis-ativos (tais como o 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Os agentes de acoplamento especialmente, de preferência, incluem o N-succinimidil-3--(2-piridiltio)propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem J. 173: 723-737 (1978)) e N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para fornecer uma ligação de dissulfeto.
[0229] O ligante pode ser ligado à molécula de maitansinoide em diversas posições, dependendo do tipo de ligação. Por exemplo, uma ligação éster pode ser formada através da reação com um grupo hidroxila utilizando as técnicas de acoplamento convencionais. A reação pode ocorrer na posição C-3 que possui um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com a hidroximetila, na posição C-15 modificada com um grupo hidroxila, e na posição C-20 que possui um grupo hidroxila. Em uma realização de preferência, a ligação é formada na posição C-3 de maitansinol ou de um análogo de maitansinol.
II. AURISTATINAS E DOLASTATINAS
[0230] Em algumas realizações, o imunoconjugado compreende um anticorpo da presente invenção conjugado às dolastatinas ou análogos peptídicos de dolostatina e derivados, as auristatinas (patentes US 5.635.483 e 5.780.588). As dolastatinas e auristatinas demonstraram interferir com a dinâmica dos microtúbulos, hidrólise de GTP, e divisão nuclear e celular (Woyke et al., Antimicrob Agents and Chemother 45 (12): 3.580-3.584 (2001)) e possuem a atividade anticancerígena (patente US 5.663.149) e atividade antifúngica (Pettit et al, Antimicrob Agents Chemother 42: 2.961-2.965 (1998)). A porção de droga de dolastatina ou auristatina pode estar ligada ao anticorpo por meio do terminal N-(amino) ou terminal C-(carboxila) da porção de droga peptídica (publicação WO 2002/088172).
[0231]As realizações de auristatina exemplificativas incluem as porções de droga de monometilauristatina DE e DF ligadas ao N-terminal, descrita em “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”, publicação do pedido de patente US 2005/0.238.649, cuja descrição está expressamente incorporada como referência na sua totalidade.
[0232] Normalmente, porções de droga à base em peptídeos podem ser preparadas através da formação de uma ligação peptídica entre dois ou mais amino ácidos e/ou fragmentos de peptídeo. Tais ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese em fase líquida (vide E. Schroder e K. Lübke, “ The Peptides ”, Volume 1, páginas 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de peptídeos. As porções de droga de auristatina / dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos de: patentes US 5.635.483 e 5.780.588; Pettit et al., J. Nat. Prod. 44: 482-485 (1981); Pettit et al, AntiCancer Drug Design. 13: 47-66 (1998); Poncet, Curr. Pharm. Des. 5: 139-162 (1999); e Pettit, Fortschr. Chem. Org. Naturst. 70:1-79 (1997). Vide também Doronina, Nat. Biotechnol. 21 (7): 778-784 (2003); e “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”, publicação do pedido de patente US 2005/0.238.649, incorporada no presente como referência na sua totalidade (que descreve, por exemplo, os ligantes e métodos para a preparação de compostos monometilvalina, tais como o MMAE e MMAF conjugados com ligantes).
III. CALIQUEAMICINA
[0233] Em outras realizações, o imunoconjugado compreende um anticorpo da presente invenção conjugado com uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos de caliqueamicina é capaz de produzir rupturas no DNA de cadeia dupla em concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família de caliqueamicina, vide patentes US 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, e 5.877.296 (todas de American Cyanamid Company). Os análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados ao Y11, α2I, α3I, N-acetil-YiI, PSAG e θIi (Hinman et al., Cancer Research. 53: 3.336-3.342 (1993), Lode et al., Cancer Research. 58: 2.925-2.928 (1998) e as patentes mencionadas acima da American Cyanamid US). Outra droga anti- tumoral que o anticorpo pode ser conjugado é o QFA, que é um antifolato. A caliqueamicina e o QFA possuem locais de ação intracelular e não atravessam facilmente a membrana plasmática. Por conseguinte, a absorção celular destes agentes através de internalização mediada por anticorpo amplamente intensifica os seus efeitos citotóxicos.
iv. OUTROS AGENTES CITOTÓXICOS
[0234] Outros agentes antitumorais que podem ser conjugados com os anticorpos da presente invenção ou preparados de acordo com os métodos descritos no presente incluem o BCNU, streptozoicina, vincristina e 5- fluorouracila, a família de agentes conhecidos coletivamente como complexo LL-E33288 descrita nas patentes US 5.053.394 e 5.770.710, assim como as esperamicinas (patente US 5.877.296).
[0235]As toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem a cadeia A de difteria, fragmentos ativos não de liganção da toxina da difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e o tricotecenos (vide, por exemplo, publicação WO 1993/21232, publicada em 28 de outubro de 1993).
[0236]A presente invenção ainda contempla um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um composto com a atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma endonuclease de DNA tal como uma desoxirribonuclease; DNase).
[0237] Para a destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreender um átomo altamente radioativo. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Os exemplos incluem os At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, Ra223, P32 e isótopos radioativos de Lu. Quando o conjugado é utilizado para a detecção, que pode compreender um átomo radioativo para estudos de cintigrafia, por exemplo, o Tc99m ou I123, ou um marcador de rotação para a ressonância magnética nuclear de imagem (NMR) (também conhecida como imagiologia de ressonância magnética, mri), tal como o iodo-123 novamente, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
[0238] Os radiomarcadores ou outros marcadores podem ser incorporados no conjugado de maneiras conhecidas. Por exemplo, o peptídeo pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado através de síntese química de amino ácidos utilizando os precursores de amino ácidos adequados envolvendo, por exemplo, o flúor-19 em vez de hidrogênio. Os marcadores tal como o Tc99m ou I123, Re186, Re188 e In111 podem estar ligados por meio de um resíduo de cisteína no peptídeo. O ítrio-90 pode estar ligado por meio de um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al., Biochem Biophys Res Commun 80: 49-57 (1978)) pode ser utilizado para incorporar o iodo-123. “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy” (Chatal, CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhes.
[0239] Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser produzidos utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais tais como o N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)-propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como o adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tais como o suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tal como o glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis (p-azidobenzoíl) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como a bis-(p-diazoniobenzoil)- etilenodiamina), diisocianatos (tais como o tolueno-2,6-diisocianato), e compostos de flúor bis-ativos (tais como o 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al, Science 238: 1.098 (1987). O ácido ácido triaminepentacético de 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno de carbono-14 marcado (MX-DTPA) é um agente quelante exemplificativo para a conjugação do radionucleótido com o anticorpo. Vide, por exemplo, publicação WO 1994/11026. O ligante pode ser um “ligante clivel” facilitando a liberação da droga citotóxica na célula. Por exemplo, um ligante de ácido-lábil, um ligante sensível às peptidases, um ligante fotolábil, ligante de dimetila ou ligante contendo o dissulfureto (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992); patente US 5.208.020) podem ser utilizados.
[0240] Os compostos da presente invenção expressamente contemplam, mas não estão limitados ao ADC preparado com os reagentes de ligação cruzada: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo- MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC e sulfo-SMPB e SVSB (succinimidil-(4- vinilsulfona)benzoato) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, a partir de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EUA). Vide as páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
V. PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS CONJUGADOS
[0241] Nos anticorpos conjugados da presente invenção, um anticorpo é conjugado com uma ou mais porções (por exemplo, as porções de droga), por exemplo, cerca de 1 a cerca de 20 porções por anticorpo, opcionalmente através de um ligante. Os anticorpos conjugados podem ser preparados por diversas vias, que empregam as reações de química orgânica, condições e reagentes conhecidos dos técnicos no assunto, incluindo: (1) a reação de um grupo nucleofílico de um anticorpo com um reagente ligante bivalente através de uma ligação covalente, seguida pela reação com uma porção de interesse; e (2) a reação de um grupo nucleofílico de uma porção com um reagente ligante bivalente através de uma ligação covalente, seguida pela reação com o grupo nucleofílico de um anticorpo. Os métodos adicionais para a preparação de anticorpos conjugados estão descritos no presente.
[0242] O reagente ligante pode ser composto de um ou mais componentes de ligantes. Os componentes de ligação exemplificativos incluem o 6-maleimidocaproil (“MC”), maleimidopropanoil (“PM”), valina-citrulina (“val- cit”), alanina-fenilalanina (“Ala-Phe”), p-aminobenziloxicarbonila (“BAP”), N- succinimidil 4-(2-piridiltio)pentanoato (“PEP”), carboxilato de N-succinimidil 4- (N-maleimidometil)ciclo-hexano-1 (“SMCC”), e N-succinimidil (4-iodo- acetil)aminobenzoato (“SIAB”). Os componentes de ligação adicionais são conhecidos no estado da técnica e alguns estão descritos no presente. Vide também “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”, publicação do pedido de patente US 2005/0.238.649, cujos conteúdos estão incorporados no presente como referência na sua totalidade.
[0243] Em algumas realizações, o ligante pode compreender os resíduos de amino ácidos. Os componentes de ligação de amino ácidos exemplificativos incluem um dipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo ou um pentapeptídeo. Os dipeptídeos exemplificativos incluem: a valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou ala-phe). Os tripeptídeos exemplificativos incluem: a glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina- glicina (gly-gly-gly). Os resíduos de amino ácidos que compreendem uma componente de ligação de amino ácidos incluem aqueles de ocorrência natural, bem como os amino ácidos menores e análogos de amino ácidos de ocorrência não natural, tal como a citrulina. Os componentes de ligação de amino ácidos podem ser concebidos e optimizados na sua seletividade para a clivagem enzimática por enzimas determinadas, por exemplo, uma protease associada ao tumor, catepsina B, C e D, ou uma protease de plasmina.
[0244] Os grupos nucleófilos nos anticorpos incluem, mas não estão limitados aos: (i) grupos amina N-terminal, (ii) grupos de cadeia secundária de amina, por exemplo, a lisina, (iii) grupos de cadeia secundária de tiol, por exemplo, a cisteína, e (iv) grupos amino ou hidroxila de açúcar, em que o anticorpo é glicosilado. Os grupos amina, tiol e hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir para formar as ligações covalentes com os grupos eletrófilos em porções ligantes e reagentes ligantes incluindo: (i) os ésteres ativos tais como os ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformatos e haletos de ácido; (Ii) os halogenetos de alquila e benzila tais como as haloacetamidas; (Iii) os aldeídos, cetonas, grupos carboxila e maleimida. Determinados anticorpos possuem os dissulfuretos de intercadeias redutíveis, isto é, pontes de cisteína. Os anticorpos podem ser tornados reativos para a conjugação com os reagentes ligantes através do tratamento com um agente de redução tal como o DTT (ditiotreitol). Cada ponte de cisteína, por conseguinte, teoricamente, forma dois nucleófilos de tiol reativos. Os grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos nos anticorpos através da reação de lisinas com o 2- iminotiolano (reagente de Traut) resultando na conversão de uma amina em um tiol. Os grupos tiol reativos podem ser introduzidos no anticorpo (ou seu fragmento) através da introdução de um, dois, três, quatro, ou mais resíduos de cisteína (por exemplo, a preparação de anticorpos mutantes que compreende um ou mais resíduos não nativos de amino ácido de cisteína).
[0245] Os anticorpos conjugados da presente invenção também podem ser produzidos através da modificação do anticorpo para introduzir as porções eletrofílicas, que podem reagir com os substituintes nucleofílicos no reagente ligante ou droga ou outra porção. Os açúcares de anticorpos glicosilados podem ser oxidados, por exemplo, com os reagentes oxidantes de periodato, para formar os grupos aldeído ou cetona que podem reagir com o grupo amina de reagentes ligantes ou de drogas ou outras porções. Os grupos de base de imina de Schiff resultantes formar uma ligação estável ou podem ser reduzidos, por exemplo, por reagentes de boroidreto para formar as ligações de amina estáveis. Em uma realização, a reação da porção carboidrato de um anticorpo glicosilado com a galactose oxidase ou metaperiodato de sódio pode gerar os grupos carbonila (aldeído e cetona) na proteína que pode reagir com os grupos adequados na droga ou outra porção (Hermanson, Bioconjugate Techniques). Em outra realização, as proteínas que contêm resíduos de serina ou treonina N-terminais podem reagir com metaperiodato de sódio, resultando na produção de aldeído no lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan e Stroh (1992), Bioconjugate Chem. 3: 138 - 46; US 5.362.852). Esse aldeído pode ser reagido com uma molécula de droga ou nucleófilo ligante.
[0246] De maneira similar, os grupos nucleófilos em uma porção (tal como uma porção de droga) incluem, mas não estão limitados a: amina, tiol, hidroxila, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e grupos aril hidrazida capazes de reagir para formar as ligações covalentes com os grupos eletrofílicos sobre as porções da droga e reagentes ligantes que incluem: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos e haletos ácidos; (ii) haletos de alquila e benzila, tais como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila e grupos maleimida.
[0247] De maneira alternativa, pode ser produzida uma proteína de fusão que compreende o anticorpo e o agente citotóxico, por exemplo, por meio de técnicas recombinantes ou síntese de peptídeos. O comprimento de DNA pode compreender as regiões correspondentes codificadoras das duas porções do conjugado, sejam eles adjacentes entre si ou separados por uma região codificadora de um peptídeo de ligação, que não destrói as propriedades desejadas do conjugado. Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser conjugado com um “receptor” (tal como a estreptavidina) para utilização no pré- direcionamento de tumores, em que o conjugado de anticorpo e receptor é administrado ao paciente, seguido pela remoção do conjugado não ligado da circulação, utilizando um agente de depuração e, em seguida, a administração de um “ligante” (tal como a avidina) que é conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo).
IX. UTILIDADE
[0248] Os presentes métodos fornecidos no presente encontram aplicabilidade industrial na produção de proteínas heteromultiméricas. Os métodos da presente invenção reduzem a quantidade de trabalho envolvido em duas fermentações e isolamento separados, uma vez que são dificuldades técnicas inerentes a duas fermentações separadas. Além disso, a eliminação das etapas de recozimento e redox dos procedimentos dos métodos anteriores pode aumentar o rendimento e reduzir a complexidade e os custos de processamento.
[0249]As proteínas heteromultiméricas descritas no presente encontram utilidade, por exemplo, nos métodos terapêuticos in vitro, ex vivo e in vivo. A presente invenção fornece diversos métodos com base na utilização de uma ou mais destas moléculas. Em determinadas condições patológicas, é necessário e/ou desejável utilizar as proteínas heteromultiméricas, por exemplo, os anticorpos multiespecíficos. A presente invenção fornece estas proteínas heteromultiméricas, que podem ser utilizadas para uma variedade de propósitos, por exemplo, como agentes terapêuticos, profiláticos e de diagnóstico. Por exemplo, a presente invenção fornece os métodos para o tratamento de uma doença, ditos métodos compreendem a administração, a um indivíduo com necessidade de tratamento, de uma proteína heteromultimérica da presente invenção, em que a doença é tratada. Qualquer uma das proteínas heteromultiméricas da presente invenção descritas no presente pode ser utilizada nos métodos terapêuticos (ou profiláticos ou de diagnóstico) descritos no presente.
[0250] Por exemplo, quando a proteína heteromultiméricos é multivalente, um benefício valioso é a avidez intensificada que representa para o seu antígeno. Além de possuir a afinidade intrínseca elevada em uma unidade de ligação (isto é, um fragmento Fab) para a base de antígeno, os anticorpos IgG normais também exploram o efeito de avidez para aumentar a sua associação com os antigênios, como resultado da sua ligação bivalente em direção ao alvo.
[0251] Uma proteína heteromultimérica direcionada contra dois epítopos separados na mesma molécula de antígeno pode não apenas fornecer o benefício da avidez de ligação intensificada (devido à ligação bivalente), mas também pode adquirir propriedades inovadoras que não estão associadas a nenhum um dos anticorpos parentais. Por conseguinte, as proteínas heteromultiméricas da presente invenção encontram utilização, por exemplo, no bloqueio de interações receptor-ligante.
[0252]As proteínas heteromultiméricas descritas no presente também encontram utilização na aplicação de bloqueio simultaneamente às vias de sinalização de dois alvos com uma molécula.
X. UTILIZAÇÕES TERAPÊUTICAS
[0253]As proteínas heteromultiméricas tais como os anticorpos e fragmentos de anticorpos descritos no presente (por exemplo, um anticorpo e/ou seu fragmento produzido de acordo com os métodos descritos no presente) podem ser utilizados para as aplicações terapêuticas. Por exemplo, essas proteínas heteromultiméricas podem ser utilizadas para o tratamento de tumores, incluindo os tumores pré-cancerosos, não metastáticos, metastáticos, e cancerígenos (por exemplo, o câncer de fase inicial), para o tratamento de distúrbios alérgicos ou inflamatórios, ou para o tratamento de doença autoimune, ou para o tratamento de um indivíduo em risco de desenvolver o câncer (por exemplo, o câncer de mama, câncer colorrectal, câncer de pulmão, carcinoma de célula renal, glioma, ou câncer de ovário), um distúrbio alérgico ou inflamatório, ou uma doença autoimune.
[0254] O termo “câncer” abrange um conjunto de distúrbios proliferativos, incluindo, mas não limitado aos crescimentos pré-cancerosos, tumores benignos, e tumores malignos. Os tumores benignos permanecem localizados no local de origem e não possuem a capacidade de se infiltrar, invadir, ou metastizar para locais distantes. Os tumores malignos irão invadir e danificar outros tecidos ao seu redor. Eles também podem possuir a capacidade de romper a partir do local em que eles iniciaram e se espalharem para outras partes do corpo (metástases), normalmente através da corrente sanguínea ou através do sistema linfático, em que os nódulos linfáticos estão localizados. Os tumores primários são classificados pelo tipo de tecido a partir do qual eles surgem; os tumores metastáticos são classificados pelo tipo de tecido a partir do qual as células cancerosas são derivados. Ao longo do tempo, as células de um tumor maligno e se tornam mais anormais, parecem menos como as células normais. Esta mudança na aparência das células cancerosas é denominada o grau do tumor e as células cancerosas estão descritas como sendo bem diferenciadas, moderadamente diferenciadas, pobremente diferenciadas, ou indiferenciadas. As células bem diferenciadas são completamente normais em aparecência e se assemelham às células normais que lhes deram origem. As células indiferenciadas são células que se tornaram tão anormais que não é mais possível determinar a origem das células.
[0255] O tumor pode ser um tumor sólido ou um tumor de tecido não sólido ou macio. Os exemplos de tumores de tecido macio incluem a leucemia (por exemplo, a leucemia mielóide crônica, leucemia mielóide aguda, leucemia linfoblástica aguda adulta, leucemia mielóide aguda, leucemia linfoblástica de células B aguda madura, leucemia linfocítica crônica, leucemia polinfocítica, ou leucemia de células pilosas), ou linfoma (por exemplo, o linfoma de não Hodgkin, linfoma cutâneo de células T, ou doença de Hodgkin). Um tumor sólido inclui qualquer tipo de câncer de sangue de outros tecidos do corpo, da medula óssea, ou do sistema linfático. Os tumores sólidos ainda podem ser separados naqueles de origem de células epiteliais e naqueles de origem de células não epiteliais. Os exemplos de tumores sólidos de células epiteliais incluem os tumores do trato gastrointestinal, cólon, mama, próstata, pulmão, rim, fígado, pâncreas, ovários, cabeça e pescoço, cavidade oral, estômago, duodeno, intestino delgado, intestino grosso, ânus, vesícula biliar, lábio, nasofaringe, pele, útero, órgão genital masculino, órgãos do aparelho urinário, bexiga e pele. Os tumores sólidos de origem epitelial não incluem os sarcomas, tumores cerebrais e tumores ósseos.
[0256] Os cânceres epiteliais, em geral, evoluem a partir de um tumor benigno para um estágio pré-invasivo (por exemplo, o carcinoma in situ), para um câncer maligno, que penetrou na membrana basal e invadiu o estroma subepitelial.
[0257] Os complexos proteicos multiespecíficos também podem ser utilizados nestas aplicações terapêuticas, e os anticorpos que se ligam ao HER2, em especial, podem ser utilizados para o tratamento do câncer de mama, câncer colorrectal, câncer de pulmão, carcinoma de célula renal, glioma, ou câncer de ovário.
[0258] Outros indivíduos que são candidatos para receber as composições da presente invenção possuem, ou estão em risco de desenvolver, a proliferação anormal de tecido fibrovascular, acne rosácea, síndrome de deficiência imunológica adquirida, oclusão da artéria, ceratite atópica, úlceras bacterianas, doença Bechets, tumores transmitidos pelo sangue, doença obstrutiva carotídea, neovascularização coróide, inflamação crônica, descolamento crônico da retina, uveíte crônica, vitreíte crônica, utilização excessiva da lente de contato, rejeição de enxerto da córnea, neovascularização da córnea, neovascularização de enxerto da córnea, doença de Crohn, doença de Eales, ceratoconjuntivite epidêmica, úlceras fúngicas, infecções por herpes simplex, infecções de herpes zoster, síndromes de hiperviscosidade, sarcoma de Kaposi, leucemia, degeneração de lipídeos, doença de Lyme, queratólise marginal, úlcera de Mooren, infecções por micobactérias diferentes da lepra, miopia, doença neovascular ocular, fossas óticas, síndroma de Osler-Weber (Osler- Weber-Rendu), osteoartrite, doença de Paget, pares planitis, penfigóide, filectenulosis, poliarterite, complicações pós-laser, infecções por protozoários, pseudoxantoma elástico, pterígio ceratite de secura, queratotomia radial, neovascularização da retina, retinopatia da prematuridade, fibroplasia retrolental, sarcoidose, esclerite, anemia de células falciformes, síndrome do Sogren, tumores sólidos, doença de Stargart, doença de Steven Johnson, ceratite límbica superior, sífilis, lúpus sistêmico, degeneração marginal de Terrien, toxoplasmose, tumores do sarcoma de Ewing, tumor de neuroblastoma, tumores de osteossarcoma, tumor de retinoblastoma, tumores de rabdomiossarcoma, colite ulcerosa, oclusão da veia, deficiência de vitamina A, sarcoidose de Wegener, angiogênese indesejada associada com diabetes, doenças parasitárias, cicatrização anormal de feridas, hipertrofia após a cirurgia, lesão ou trauma (por exemplo, a lesão pulmonar aguda / ARDS), inibição de crescimento do cabelo, inibição de ovulação e formação do corpo lúteo, inibição da implantação, e inibição do desenvolvimento do embrião no útero.
[0259] Os exemplos de distúrbios alérgicos ou inflamatórios ou de doenças autoimunes ou distúrbios que podem ser tratados utilizando um anticorpo produzido de acordo com os métodos descritos no presente incluem, mas não estão limitados à artrite (a artrite reumatóide, tais como a artrite aguda, artrite reumatóide crônica, artrite gotosa, artrite gotosa aguda, artrite inflamatória crônica, artrite degenerativa, artrite infecciosa, artrite de Lyme, artrite proliferativa, artrite psoriática, artrite vertebral, e artrite reumatóide, osteoartrite, artrite progressiva crônica, artrite deformante, poliartrite primaria crônica, artrite reativa juvenil, e espondilite anquilosante), doenças de pele hiperproliferativas inflamatórias, psoríase, tais como a psoríase em placas, psoríase gutatte, psoríase pustulosa, e psoríase das unhas, dermatite incluindo a dermatite de contato, dermatite de contato crônica, dermatite alérgica, dermatite de contato alérgica, dermatite herpetiforme, e dermatite atópica, síndrome hiper-IgM ligada ao X, urticária, tais como a urticária alérgica crônica e urticária idiopática crônica, incluindo a urticária autoimune crônica, polimiosite / dermatomiosite, dermatomiosite juvenil, necrólise epidérmica tóxica, esclerodermia (incluindo a esclerodermia sistêmica), esclerose tais como a esclerose sistêmica, esclerose múltipla (MS) tais como a doença espino-ótica MS, progressiva primária MS (PPMS), e recidivante remitente MS (EMRR), progressiva sistêmica da esclerose múltipla, aterosclerose, arteriosclerose, esclerose disseminada, e esclerose atáxica, doença inflamatória do intestino (IBD) (por exemplo, a doença de Crohn, doenças gastrointestinais mediadas autoimunes, colite, tais como a colite ulcerativa, colite ulcerosa, colite microscópica, colite colagenosa, colite poliposa, enterocolite necrotizante, e colite transmural, e doença autoimune do intestino inflamatório), pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangite esclerosante primária, episclerite), síndrome de angústia respiratória, incluindo a síndrome da angústia respiratória aguda ou adulta (ARDS), meningite, inflamação de toda ou parte da úvea, irite, coroidite, um distúrbio hematológico autoimune, espondilite reumatóide, perda súbita de audição, doenças mediadas por IgE tais como a anafilaxia e rinite alérgica e atópica, encefalite, como a encefalite de Rasmussen e encefalite límbica e/ou tronco cerebral, uveíte, tais como a uveíte anterior, uveíte anterior aguda, uveíte granulomatosa, uveíte não granulomatosa, uveíte facoantigênica, uveíte posterior, ou uveíte autoimune, glomerulonefrite (GN) com e sem a síndrome nefrótica, tal como a glomerulonefrite crônica ou aguda, como a GN primária, GN imune mediada, GN membranosa (nefropatia membranosa), GN idiopática nefropatia membranosa ou idiopática membranosa, GN membrano- ou membranosa proliferativa (GNMP), incluindo o tipo I e tipo II, e GN rapidamente progressiva, condições alérgicas, reação alérgica, eczema incluindo o eczema alérgico ou atópico, asma, tais como a asma da bronquite, asma brônquica, e asma autoimune, condições que envolvem a infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas, doença inflamatória pulmonar crônica, miocardite autoimune, deficiência de adesão de leucócitos, lúpus eritematoso sistêmico (SLE) ou lúpus de eritemátodos sistêmico, tal como o SLE cutâneo, lúpus eritematoso cutâneo subagudo, síndrome de lúpus neonatal (NLE), lupus disseminatus eritematoso, lúpus (incluindo o nefrite, cerebritis, pediátrico, não renal, extrarrenal, discóide, alopecia), diabetes do melito juvenil (Tipo I), incluindo o melito pediátrico de diabetes dependente de insulina (IDDM), melito adulto de diabetes (diabetes Tipo II), diabetes autoimune, diabetes insípida idiopática, respostas imunológicas associadas com a hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citoquinas e linfitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose, incluindo a granulomatose linfomatoide, granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculite, incluindo a vasculite (incluindo a vasculite de grandes vasos (incluindo a polimialgia reumática e de célula gigante (arterite de Takayasu)), vasculite de vaso médio (incluindo a doença de Kawasaki e poliartrite nodosa), poliarterite microscópica, vasculite CNS, vasculite de hipersensibilidade, necrotizante, ou cutânea, vasculite necrosante sistêmica e vasculite associada ao ANCA, tal como a vasculite ou síndrome de Churg-Strauss (CSS)), artrite temporal, anemia aplástica, anemia aplástica autoimune, anemia de Coombs positivo, anemia diamante Blackfan, anemia hemolítica ou anemia hemolítica imune incluindo a anemia hemolítica autoimune (AHAI), anemia perniciosa (perniciosa anemia), doença de Addison, anemia ou aplasia pura dos glóbulos vermelhos (AEP), deficiência de fator VIII, hemofilia A, neutropenia autoimune, pancitopenia, leucopenia, doenças envolvendo a diapedese de leucócitos, distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central, síndrome de lesão de múltiplos órgãos, tais como aqueles de secundário a septicemia, trauma ou hemorragia, doenças mediadas pelo complexo antígeno-anticorpo, doença antiglomerular da membrana basal, síndrome de anticorpo do antifosfolipídeo, neurite alérgica, Behcet ou doença de Behcet, sindrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, sindroma de Stevens-Johnson, penfigóide, tais como o penfigóide bolhoso e penfigóide da pele, pênfigo (incluindo o pênfigo vulgar, pênfigo foliáceo, pênfigo penfigóide do muco membrana e pênfigo eritematoso), poliendocrinopatias autoimunes, doença ou síndrome de Reiter, nefrite de complexo imune, nefrite mediada por anticorpos, neuromielite ótica, polineuropatias, neuropatia crônica, tais como as polineuropatias de IgM ou neuropatia mediada por IgM, trombocitopenia (desenvolvida por pacientes com enfarte do miocárdio, por exemplo), incluindo a púrpura trombótica trombocitopénica (TTP) e trombocitopenia autoimune ou imunomediada, tais como a púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), incluindo a ITP aguda ou crônica, doença autoimune do testículo e ovário incluindo a orquite e ooforite autoimune, hipotiroidismo primário, hipoparatiroidismo, doenças endócrinas autoimunes, incluindo a tiroidite tal como a tiroidite autoimune, doença de Hashimoto, tiroidite crônica (tiroidite de Hashimoto), ou tiroidite subaguda, doença da tiróide autoimune, hipotiroidismo idiopático, doença de Grave, síndromes poliglandulares, tais como as síndromes autoimunes poliglandulares (ou síndromes de endocrinopatia poliglandular), síndromes paraneoplásicas, incluindo as síndromes paraneoplásicas neurológicas, tais como a síndrome miastênica de Lambert-Eaton ou síndrome de Eaton-Lambert, síndrome da pessoa rígida ou do homem rígido, encefalomielite tais como a encefalomielite alérgica ou encefalomielite de alergia e encefalomielite experimental alérgica (EAE), miastenia grave, tais como a miastenia associada ao timoma grave, degeneração cerebelar, neuromiotonia, opsoclonia ou síndrome de mioclonia opsoclonia (OMS) e neuropatia sensorial, neuropatia motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatite autoimune, hepatite crônica, hepatite lúpica, hepatite de célula gigante, hepatite ativa crônica ou hepatite autoimune ativa crônica, pneumonite intersticial linfóide, bronquiolite obliterante (não transplante) versus NSIP, síndrome de Guillain-Barré, doença de Berger (nefropatia por IgA), nefropatia idiopática por IgA, dermatose de IgA linear, cirrose biliar primária, pneumonocirrose, síndrome de enteropatia autoimune, doença celíaca, doença celíaca, celíaca espru (enteropatia do glúten), espru refratário, espru idiopático, crioglobulinemia, esclerose lateral amilotrofíca (ALS; doença de Lou Gehrig), doença da artéria coronariana, doença do ouvido autoimune, tal como a doença do ouvido interna autoimune (AIED), perda auditiva autoimune, opsoclonia síndrome mioclonia (OMS), policondrite, tal como a policondrite refratária ou recidivante, proteinose alveolar pulmonar, amiloidose, esclerite, um linfocitose não canceroso, um linfocitose primário, que inclui a linfocitose de células B monoclonais (por exemplo, a gamopatia monoclonal benigna e garnmopatia monoclonal de significado indeterminado, MGUS), neuropatia periférica, síndrome paraneoplástica, canalopatias tais como a epilepsia, enxaqueca, arritmia, distúrbios musculares, surdez, cegueira, paralisia periódica, e canalopatias de SNC, autismo, miopatias inflamatórias, glomeruloesclerose segmentar focal (FSGS), oftalmopatia endócrina, uveoretinite, coriorretinite, distúrbio hepatológica autoimune, fibromialgia, insuficiência endócrina múltipla, síndrome de Schmidt, adrenalite, atrofia gástrica, demência presenil, doenças desmielinizantes tais como as doenças autoimunes desmielinizantes, nefropatia diabética, síndrome de Dressler, alopecia areata, síndrome de CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodactilia e telangiectasia), infertilidade autoimune masculina e feminina, doença mista do tecido conjuntivo, doença de Chagas, febre reumática, aborto recorrente, pulmão do fazendeiro, eritema multiforme, síndrome pós-cardiotomia, síndrome de Cushing, pulmão pássaro- estravagante, angeíte granulomatosa alérgica, angeíte linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolite, tais como a alveolite alérgica e alveolite fibrosante, doença intersticial pulmonar, reação transfusão, lepra, malária, leishmaniose, quipanosomiase, esquistossomose, ascaridíase, aspergilose, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocardite, endomiocardiofibrose, fibrose pulmonar intersticial difusa, fibrose pulmonar intersticial, fibrose pulmonar idiopática, fibrose cística, endoftalmite, eritema elevatum et diutinum, eritroblastose fetal, faciitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariasis, ciclite, tais como a ciclite crônica, ciclite heterocrônica, iridociclite, ou ciclite de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, vírus da imunodeficiência humana (HIV), infecção ecovirus, cardiomiopatia, doença de Alzheimer, infecção por parvovírus, infecção por vírus da rubéola, síndromes pós-vacinação, infecção da rubéola congênita, infecção por vírus Epstein-Barr, caxumba, síndrome de Evan, insuficiência gonadal autoimune, coreia de Sydenham, nefrite pós-estreptocócica, tromboangeíte ubiterana, tireotoxicose, tabes dorsalis, coroidite, polimialgia de células gigantes, oftamopatia endócrina, pneumonite por hipersensibilidade crônica, ceratoconjuntivite seca, ceratoconjuntivite epidêmica, síndrome idiopática nefrítica, nefropatia com alterações mínimas, lesão familiar e isquemia- reperfusão benigna, autoimunidade da retina, inflamação das articulações, bronquite, doença das vias respiratórias obstrutivas crônicas, silicose, aftas, estomatite aftosa, distúrbios arterioscleróticos, aspermiogenese, hemólise autoimune, doença de Boeck, crioglobulinemia, contratura de Dupuytren, endoftalmia facoanafilática, enterite alérgica, eritema nodoso hansênico, paralisia facial idiopática, síndrome de fadiga crônica, febre reumática, doença de Hamman-Rich, perda auditiva sensoneural, hemoglobinúria paroxismática, hipogonadismo, ileíte regional, leucopenia, mononucleose infectiosa, mielite transversal, mixedema idiopático primário, nefrose, oftalmia simfática, orquite granulomatosa, pancreatite, acuta poliradiculite, pioderma gangrenoso, tiroidite de Quervain, atrofia espênica adquirida, infertilidade devido aos anticorpos dos antiespermatozóides, timoma não maligno, vitiligo, SCID e doenças associadas ao vírus de Epstein-Barr, síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), doenças parasitárias, tais como a Leishmania, síndrome do choque tóxico, intoxicação alimentar, condições que envolvem infiltração de células T, deficiência de adesão de leucócitos, respostas imunológicas associadas com a hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citoquinas e linfitos T, doenças envolvendo a diapedese de leucócitos, síndrome de lesão de múltiplos órgãos, doenças mediadas pelo complexo antígeno-anticorpo, doença da membrana basal glomerular, neurite alérgica, poliendocrinopatias autoimunes, ooforite, mixedema primário, gastrite atrófica autoimune, oftalmia simpatética, doenças reumáticas, doenças do tecido conjuntivo misto, síndrome nefrótica, insulite, insuficiência poliendócrina, neuropatia periférica, síndrome autoimune poliglandular do tipo I, hipoparatiroidismo idiopático adulto (AOIH), alopecia total, cardiomiopatia dilatada, epidermólise bolhosa adquirida (EBA), hemocromatose, miocardite, síndrome nefrótica, colangite esclerosante primária, sinusite purulenta ou não purulenta, sinusite aguda ou crônica, etmóide, sinusite frontal, maxilar, ou esfenoidal, um distúrbio relacionado com eosinófilos, tal como a eosinofilia, eosinofilia de infiltração pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, pneumonia eosinofílica crônica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilose broncopneumônica, aspergiloma, ou granulomas contendo os eosinófilos, anafilaxia, espondiloartrites seronegativos, doença autoimune poliendócrina, colangite esclerosante, esclera, episclera, candidíase mucocutânea crônica, síndrome de Bruton, hipogamaglobulinemia transitória da infância, síndroma de Wiskott-Aldrich, ataxia telangiectasia, distúrbios autoimunes associados com as doenças do colagênio, reumatismo, doença neurológica, distúrbio isquémico de reperfusão, redução na resposta da pressão arterial, disfunção vascular, antgiectasis, lesão tecidual, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral, e doença associada à vascularização, distúrbios da hipersensibilidade alérgica, glomerulonefrites, lesão de reperfusão, lesão de reperfusão do miocárdio ou outros tecidos, dermatoses com componentes inflamatórios agudos, meningite purulenta aguda ou outros distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central, distúrbios inflamatórias orbitais e oculares, síndromes associadas de transfusão de granulócito, toxicidade induzida por citocinas, inflamação grave aguda, inflamação crônica intratável, pielite, pneumonocirose, retinopatia diabética, distúrbio diabético da artéria grande, hiperplasia endarterial, úlcera péptica, valvite e endometriose.
[0260]Além de utilizações terapêuticas, os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados para outros propósitos, incluindo os métodos de diagnóstico, tais como os métodos de diagnóstico para as doenças e condições descritas no presente.
XI. DOSAGENS, FORMULAÇÕES E DURAÇÃO
[0261]As proteínas da presente invenção serão formuladas, dosadas e administradas de uma maneira consistente com a boa prática médica. Os fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular a ser tratado, o paciente particular a ser tratado, o estado clínico do paciente, a causa do distúrbio, o local de entrega do agente, o método de administração, o cronograma de administração, a interação droga-droga dos agentes a serem combinados, e de outros fatores conhecidos dos praticantes de medicina. A “quantidade terapeuticamente eficaz” das proteínas a ser administradas será governada por estas considerações, e é a quantidade mínima necessária para prevenir, melhorar ou tratar um distúrbio especial (por exemplo, um câncer, distúrbio alérgico ou inflamatório, ou distúrbio autoimune). As proteínas não precisam ser, mas opcionalmente, são formuladas com um ou mais agentes normalmente utilizados para prevenir ou tratar o distúrbio. A quantidade eficaz de tais outros agentes dependem da quantidade de proteínas presentes na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos acima. Estes, em geral, são utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração, conforme utilizado no presente, anteriormente ou cerca de 1 a 99% das dosagens empregadas até o momento. Em geral, o alívio ou tratamento de um câncer envolve a redução de um ou mais sintomas ou problemas médicos associados com o câncer. A quantidade terapeuticamente eficaz da droga pode realizar uma ou uma combinação dos seguintes: a redução (por, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou superior) o número de células cancerosas; a redução ou inibição do tamanho do tumor ou carga de tumor; a inibição (isto é, reduzir até certo ponto e/ou interromper) a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; a redução da secreção o hormôniol no caso de adenoma; a redução da densidade de vasos; a inibição da metástase do tumor; a redução ou inibição do crescimento do tumor; e/ou o alívio até certo ponto de um ou mais dos sintomas associados ao câncer. Em algumas realizações, as proteínas são utilizadas para prevenir a ocorrência ou reocorrência do câncer ou de um distúrbio autoimune no indivíduo.
[0262] Em uma realização, a presente invenção pode ser utilizada para aumentar a duração da sobrevivência de um indivíduo humano suscetível, ou diagnosticado com um câncer ou distúrbio autoimune. A duração da sobrevivência é definida como o tempo desde a primeira administração da droga até à morte. A duração de sobrevivência também pode ser medida pela proporção de risco estratificada (RH) do grupo de tratamento versus o grupo de controle, que representa o risco de morte de um objeto durante o tratamento.
[0263] Em ainda outra realização, o tratamento da presente invenção, significativamente aumenta a taxa de resposta em um grupo de seres humanos suscetíveis para ou diagnosticados com um câncer que são tratados com diversas terapias anticancerosas. A taxa de resposta é definida como a porcentagem de indivíduos tratados que responderam ao tratamento. Em um aspecto, o tratamento de combinação da presente invenção, utilizando as proteínas da presente invenção e a cirurgia, terapia de radiação, ou um ou mais agentes quimioterapêuticos, significativamente aumenta a taxa de resposta no grupo de indivíduos tratados em comparação com o grupo tratado com cirurgia, radioterapia ou quimioterapia isoladamente, o aumento contendo um p-valor de qui-quadrado inferior a 0,005. As medições adicionais de eficácia terapêutica no tratamento de cânceres estão descritas na publicação do pedido de patente US 2005/0.186.208.
[0264] Em determinadas realizações, é fornecida uma composição que compreende uma proteína heteromultimérica produzida de acordo com qualquer dos métodos descritos no presente e um veículo farmaceuticamente aceitável. As formulações terapêuticas são preparadas utilizando os métodos padrão conhecidos no estado da técnica, através da mistura do ingrediente ativo que possui o grau desejado de pureza com excipientes ou estabilizantes opcionais fisiologicamente aceitáveis, (Remington’s Pharmaceutical Sciences (20a edição), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). Os veículos aceitáveis incluem a solução salina, ou tampões, tais como o fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; os antioxidantes incluindo o ácido ascórbico; os polipeptídeos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como a albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tais como a polivinilpirrolidona, amino ácidos tais como a glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo a glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como o EDTA; álcoois de açúcar tal como o manitol ou sorbitol; Os contraíons formadores de sal, tais como o sódio; e/ou tensoativos não iônicos tais como o TWEENTM, PLURONICSTM, ou PEG.
[0265] Opcionalmente, mas de preferência, a formulação contém um sal farmaceuticamente aceitável, de preferência, o cloreto de sódio e, de preferência, a cerca de concentrações fisiológicas. Opcionalmente, as formulações da presente invenção podem conter um conservante farmaceuticamente aceitável. Em algumas realizações a concentração de conservante varia a partir de 0,1 a 2,0%, normalmente, em v/v. Os conservantes adequados incluem os conhecidos no estado das técnicas farmacêuticas. O álcool benzílico, fenol, m-cresol, metilparabeno, e propilparabeno são os conservantes de preferência. Opcionalmente, as formulações da presente invenção podem incluir um tensoativo farmaceuticamente aceitável a uma concentração de 0,005 a 0,02%.
[0266]A presente formulação também pode conter superior a um composto ativo conforme necessário para a indicação especial a ser tratada, de preferência, aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente entre si. Tais moléculas adequadamente estão presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
[0267] Os ingredientes ativos também podem ser retidos em microcápsulas preparadas, por exemplo, através das técnicas de coacervação ou através da polimerização interfacial, por exemplo, a hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, nos sistemas de liberação dos medicamentos coloidais (por exemplo, os lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Estas técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, acima.
[0268]As preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Os exemplos adequados das preparações de liberação sustentada incluem as matrizes semipermeáveis dos polímeros hidrófobos sólidos que contêm a proteína heteromultimérica, essas matrizes estão na forma de artigos formados, por exemplo, os filmes, ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem os poliésteres, hidrogéis (por exemplo, o poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(álcool de vinila)), polilactidos (patente US 3.773.919), copolímeros do ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato, etileno- acetato de vinila não degradável, copolímeros degradáveis do ácido glicólico do ácido láctico, tais como o Lupron Depot™ (microesferas injetáveis compostas do copolímero do ácido glicólico do ácido láctico e acetato de leuprolide) e ácido butírico do poli-D-(-)-3-hidróxi. Enquanto os polímeros tais como o acetato de etileno-vinila e ácido láctico-ácido glicólico possibilitam a liberação de moléculas durante um período de tempo superior a 100 dias, determinados hidrogéis liberam as proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando a(s) proteína(s) heteromultimérica(s) encapsulada(s) permanece(m) no corpo durante um longo tempo, pode(m) desnaturar ou agregar como resultado de exposição a umidade a 37° C, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. As estratégias racionais podem ser concebidas para a estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação for a formação de ligações S-S intermoleculares através de troca tio-dissulfureto, a estabilização pode ser alcançada modificando os resíduos de sulfidrilo, liofilizando a partir de soluções ácidas, controlando o teor de umidade, utilizando os aditivos adequados, e desenvolvendo as composições específicas de matriz de polímeros.
[0269]As proteínas descritas no presente (por exemplo, uma proteína heteromultimérica tal como um anticorpo multiespecífico produzido de acordo com os métodos descritos no presente) são administradas a um indivíduo humano, de acordo com os métodos conhecidos, tais como a administração intravenosa como um bolus ou através da infusão contínua durante um período de tempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutânea, intra-articular, intrassinovial, intratecal, oral, tópica, ou inalatória. A administração local pode ser especialmente desejada se os efeitos secundários extensivos ou toxicidade estão associados com o antagonismo à molécula alvo reconhecida pelas proteínas. Uma estratégia ex vivo também pode ser utilizada para as aplicações terapêuticas. As estratégias ex vivo envolvem a transfecção ou transdução de células obtidas a partir do indivíduo com um polinucleotídeo que codifica uma proteína da presente invenção. As células transfectadas ou transduzidas, em seguida, são devolvidas ao indivíduo. As células podem ser qualquer um de uma ampla variedade de tipos, incluindo, sem limitação, as células hematopoiéticas (por exemplo, as células da medula óssea, macrófagos, monócitos, células dendríticas, células T ou células B), fibroblastos, células epiteliais, células endoteliais, queratinócitos, ou acélulas musculares.
[0270] Em um exemplo, o complexo de proteína (por exemplo, uma proteína heteromultimérica tal como um anticorpo multiespecífico produzido de acordo com os métodos descritos no presente) é localmente administrado, por exemplo, através da injeção direta, em que o distúrbio ou a localização do tumor permite, e as injeções podem ser periodicamente repetidas. O complexo de proteína também pode ser sistemicamente entregue ao indivíduo ou diretamente para as células tumorais, por exemplo, para um tumor ou um leito do tumor após a excisão cirúrgica do tumor, a fim de prevenir ou reduzir a recorrência local ou metástase.
xii. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO
[0271] Uma outra realização da presente invenção é um artigo de fabricação contendo um ou mais proteínas heteromultiméricas descritas no presente, e os materiais úteis para o tratamento ou diagnóstico de um distúrbio (por exemplo, um distúrbio autoimune ou câncer). O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo ou bula no ou associado com o recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, as garrafas, frascos, seringas, e similares. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como o vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para o tratamento da condição e pode possuir uma entrada de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável através de uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos, um agente ativo na composição é uma proteína heteromultimérica (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo) da presente invenção. O rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição em especial. O rótulo ou bula ainda irá ainda compreender as instruções para a administração da composição de proteína heteromultimérica ao indivíduo. Os artigos de fabricação e conjuntos que compreendem as terapias de combinação descritas no presente também são contemplados.
[0272]A “bula” se refere às instruções habitualmente incluídas em embalagens comerciais de medicamentos que contêm informações sobre as indicações, utilização, dosagem, administração, contraindicações e/ou advertências sobre a utilização de tais produtos terapêuticos. Em determinadas realizações, a bula indica que a composição é utilizada para o tratamento do câncer de mama, câncer colorrectal, câncer de pulmão, carcinoma de célula renal, glioma, ou câncer de ovário.
[0273]Além disso, o artigo de fabricação ainda pode compreender um segundo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como a água bacteriostática para injeção (BWFI), soro fisiológico tamponado com fosfato, solução de dextrose e solução de Ringer. Ainda pode incluir outros materiais considerados do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
[0274] Os conjuntos também são fornecidos que são úteis para diversos propósitos, por exemplo, para a purificação ou a imunoprecipitação de um antígeno a partir de células. Para o isolamento e purificação de um antígeno. o conjunto pode conter uma proteína heteromultimérica acoplada às esferas (por exemplo, as esferas de sepharose). Os conjuntos podem ser fornecidos que contêm a(s) proteína(s) heteromultimérica(s) para a detecção e quantificação do antígeno, in vitro, por exemplo, em um ELISA ou um Western blot. Tal como acontece com o artigo de manufactura, o conjunto compreende um recipiente e um rótulo ou bula no ou associado com o recipiente. O recipiente contém uma composição que compreende, pelo menos, uma proteína heteromultimérica (por exemplo, os anticorpo ou fragmento de anticorpo multiespecífico) da presente invenção. Os recipientes adicionais podem ser incluídos, que contêm, por exemplo, os diluentes e tampões ou anticorpos de controle. O rótulo ou bula pode fornecer uma descrição da composição, bem como as instruções para a utilização de diagnóstico pretendida ou in vitro.
[0275] A descrição escrita anteriormente é considerada suficiente para possibilitar que um técnico no assunto possa praticar a presente invenção. Os seguintes exemplos são oferecidos apenas para os propósitos ilustrativos, e não se destinam a limitar o âmbito da presente invenção de nenhuma maneira.na verdade, diversas modificações da presente invenção em adição às apresentadas e descritas no presente serão evidentes para os técnicos no assunto a partir da descrição antecedente e estão dentro do âmbito das reivindicações anexas.
[0276] Na descrição experimental a seguir, se aplicam as seguintes abreviações: eq (equivalentes); M (Molar); μM (micromolar); N (Normal); mol (moles); mMol (milimoles); μmol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramas); mg (miligramas); kg (quilogramas); μg (microgramas); L (litros); mL (mililitros); μl (microlitros); cm (centímetros); mm (milimetros); μm (micrômetros); nm (nanômetros); ° C. (graus centígrados); h (horas); min (minutos); sec (segundos); msec (milissegundos); ADCC (citotoxicidade celular dependente de anticorpo)); BsAb (anticorpo biespecífico); CL (domínio constante da cadeia leve); CH (domínio constante da cadeia pesada); CMC (citotoxicidade mediada por complemento); Fab (fragmento de ligação ao antígeno); Fc (fragmento cristalizado); Fv (fragmento variável (VL + VH)); EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico); HC (cadeia pesada); IGFR (receptor do fator de crescimento tipo insulina); LC (cadeia leve); scFv (cadeia simples do fragmento variável (VL e VH amarrado por um ligante de amino ácido); VEGF (fator de crescimento endotelial vascular); VEGFR2 (receptor do fator de crescimento endotelial vascular 2); VH (domínio variável pesado); LV (domínio variável leve).
EXEMPLOS
[0277] A presente invenção é descrita em maiores detalhes nos Exemplos seguintes que não pretendem de nenhuma maneira limitar o âmbito da presente invenção, conforme reivindicado. As Figuras anexas são destinadas a ser consideradas como parte integrante da memória descritiva e descrição da presente invenção. Todas as referências citadas no presente são especificamente incorporadas como referência, com tudo o que está aí descrito. Os Exemplos seguintes são fornecidos para ilustrar, mas não para limitar a presente invenção reivindicada.
EXEMPLO 1 A PROPORÇÃO MOLAR DE COMPONENTES MONOMÉRICOS DE UM ANTICORPO BIESPECÍFICO, EM UMA CULTURA DE CÉLULAS COMBINADAS PODE SER CONTROLADA PELO AJUSTE DA CÉLULA: ÍNDICE DA CÉLULA
[0278]O exemplo a seguir mostra que a proporção molar dos meios anticorpos da saliência e do orifício quando duas linhagens celulares de mamíferos (células CHO), cada uma expressa o meio anticorpo da saliência ou o meio anticorpo do orifício, foram cultivadas da mesma cultura.
[0279]Os estudos da produção foram realizados para determinar o título de produção (isto é, a quantidade total de anticorpo produzido por células, incluindo o heterodímero, homodímero e o meio anticorpo monomérico) para cada linhagem celular. As linhagens celulares individuais foram passadas a cada 3 ou 4 dias em meio de sucessão de semente até que os dados de titulação de produção nas linhagens celulares individuais se tornaram disponíveis.
[0280]As duas linhagens celulares, em seguida, foram cultivadas e induzidas para expressar o meio anticorpo da saliência ou o meio anticorpo do orifício em culturas separadas. As culturas de linhagens celulares individuais da saliência e orifícios foram passadas em balão de agitação de 40 mL em volume a cada 3 ou 4 dias em meio de sucessão de sementes. No dia em que as culturas deveriam ser combinadas, a contagem de células foi medida por meio de Vicell (Beckman Coulter).
[0281]As culturas separadas, em seguida, foram combinadas nas proporções específicas da célula hospedeira da saliência:da célula hospedeira do orifício. A proporção da célula hospedeira da saliência:da célula hospedeira do orifício foi calculada com base na titulação de produção conhecido para as linhagens celulares individuais. Para cada produção em pequena escala, foram necessárias cerca de 40x106 células. Utilizando a contagem de Vicell (células/mL), foi possível determinar o volume de cada linhagem celular necessário para ser adicionado à cultura combinada para alcançar a proporção desejada da célula hospedeira da saliência:da célula hospedeira do orifício. O volume adequado de cada uma das linhagens celulares da saliência e do orifício foi combinado no novo balão de agitação com um volume final de 40 mL em meio de produção.
[0282] 15 horas antes da colheita, a solução de estoque de glutationa (GSH) foi preparada através da dissolução de GSH em arginina a 1 M (pH = 9,0) em 400 mM de ácido succínico para uma concentração final de 250 mM de GSH. A solução de estoque de GSH foi adicionada à cultura de produção de maneira que a concentração final de GSH era de 15 mM. O meio de cultura combinado, em seguida, foi colhido, e a porcentagem (%) do meio anticorpo do orifício e a porcentagem (%) do meio anticorpo da saliência para cada cultura combinada foram determinadas por meio de fase inversa em condições de redução. A porcentagem (%) do anticorpo biespecífico covalente formado para cada proporção testada foi determinada conforme descrito na Figura 2.
[0283]Estas experiências foram realizadas com os seguintes pares do meio anticorpo da saliência / do meio anticorpo do orifício: - anti-Alvo A (saliência) / anti-Alvo B (orifício); - anti-Alvo C (saliência) / anti-Alvo D (orifício); - anti-Alvo D (saliência) / anti-Alvo C (orifício); e - anti-Alvo E (saliência) / anti-Alvo F (orifício).
[0284]Os resultados destas experiências são apresentados na Tabela 2 abaixo: TABELA 2
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- * N / D = não determinado.
[0285] Conforme mostrado na Tabela 2, os rendimentos da porcentagem (%) do anticorpo biespecífico covalente foram aprimorados quando a proporção molar do meio anticorpo da saliência:meio anticorpo do orifício era cerca de ou próxima de 1:1. A proporção molar ideal para a formação de biespecífico provavelmente seria determinada para cada anticorpo biespecífico específico. A proporção molar do meio anticorpo da saliência:meio anticorpo do orifício que produz uma proporção molar do meio anticorpo da saliência:meio anticorpo do orifício de 1:1 varia com a linhagem celular e é experimentalmente determinada.
EXEMPLO 2 VARIANDO O MOMENTO DA ADIÇÃO DE UM AGENTE DE REDUÇÃO E DA CONCENTRAÇÃO DE AGENTE DE REDUÇÃO ADICIONADOS DURANTE A PRODUÇÃO DO ANTICORPO BIESPECÍFICO EM UMA CULTURA DE CÉLULAS COMBINADAS
[0286] O exemplo a seguir mostra a adição do agente de redução, durante diferentes estágios da produção de um anticorpo biespecífico que compreende o anti-Alvo A (saliência) e anti-Alvo B (orifício). Duas linhagens celulares de mamífero, que expressam, anti-Alvo A (saliência) ou anti-Alvo B (orifício), foram inicialmente cultivadas e induzidas para expressar o meio anticorpo da saliência ou o meio anticorpo do orifício em culturas separadas, que, em seguida, foram combinadas em diversas culturas de produção separadas para alcançar uma proporção molar de 1:1 de anti-Alvo A (saliência): anti-Alvo B (orifício), conforme descrito acima. A solução de estoque de GSH foi adicionado às culturas de produção, 24 horas, 15 horas ou 4 horas antes da colheita para uma concentração final de 2 mM, 4 mM, ou 10 mM ou as culturas foram deixadas sem tratamento. O meio de cultura combinado de cada uma das culturas de produção, em seguida, foi colhido, e a porcentagem (%) do meio anticorpo do orifício e a porcentagem (%) do meio anticorpo da saliência para cada cultura combinada foram determinadas por meio de fase inversa em condições de redução. A porcentagem (%) do anticorpo biespecífico covalente formado para cada proporção testada foi determinada conforme descrito na Figura 2.
[0287] Conforme mostrado na Figura 3, o rendimento de anticorpo covalente biespecífico em culturas de produção com uma concentração final de GSH de 10 mM foi aprimorado em comparação ao rendimento do anticorpo biespecífico em culturas de produção concentração de GSH final de 2 mM ou 4 mM ou do grupo de controle não tratado. O estágio de produção em que o GSH foi adicionado não mostrou afetar o rendimento do anticorpo covalente biespecífico.
[0288] Em outras experiências, as linhagens celulares, que expressam, o anti-Alvo A (saliência) ou anti-Alvo B (orifício), foram inicialmente cultivadas e induzidas para expressar o meio anticorpo da saliência ou o meio anticorpo do orifício em culturas separadas que, em seguida, foram combinadas em diversas culturas de produção separada para alcançar uma proporção molar 0,82: 1 ou uma proporção molar de 1:1 de anti-Alvo A (saliência): anti-Alvo B (orifício), conforme descrito acima. A solução de estoque de GSH foi adicionada às culturas de produção 15 horas antes da colheita para uma concentração final de 5 mM ou 10 mM ou sem tratamento (“0 mM”). A viabilidade das células de cada cultura de células combinadas foi determinada no momento da colheita e a porcentagem (%) do anticorpo biespecífico formado em cada condição de teste, em seguida, foi determinada através da análise de troca iônica, conforme mostrado na Figura 2. Os resultados das experiências estão apresentados na Tabela 3 abaixo: TABELA 3
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- *Título se refere à quantidade total de anticorpo produzido pelas duas linhagens celulares na cultura combinada, por exemplo, incluindo o homodímero, heterodímero, e meio anticorpo monomérico.
[0289] Conforme mostrado na Tabela 3, o rendimento do anticorpo biespecífico covalente nas culturas de produção que possuem uma concentração final de 10 mM de GSH foi aprimorado em comparação ao rendimento do anticorpo biespecífico nas culturas de produção da concentração final de GSH de 5 mM ou não tratadas. A adição de GSH-se à cultura de células combinadas para uma concentração final de até 10 mM não mostrou afetar a viabilidade celular ou a produção global de anticorpo. A formação de dissulfureto misto indesejada ou proteína de cifragem não foi observada a 10 mM de GSH (dados não mostrados).
[0290] Foram realizadas experiências similares com duas outras linhagens celulares de mamíferos, cada expressando o anti-Alvo D (saliência) ou anti-Alvo C (orifício). As duas linhagens celulares foram inicialmente cultivadas e induzidas para expressar o anti-Alvo D (saliência) ou anti-Alvo C (orifício) em culturas separadas que, em seguida, foram combinadas em diversas culturas de produção separadas para alcançar uma proporção molar de 0,82:1 de anti-Alvo D (saliência): anti-Alvo C (orifício), conforme descrito acima. A solução de estoque de GSH foi adicionada às culturas de produção de 15 horas antes da colheita a uma concentração final de 10 mM, 15 mM, ou 20 mM ou sem tratamento (“0 mM”). A viabilidade das células de cada cultura de células combinadas foi determinada no momento da colheita, e a porcentagem (%) do anticorpo biespecífico formado em cada condição de teste, em seguida, foi determinada conforme mostrado na Figura 2. Os resultados destas experiências são mostrados na Tabela 4 abaixo: TABELA 4
Figure img0005
- *Título se refere à quantidade total de anticorpo produzido pelas duas linhagens celulares na cultura combinada, por exemplo, incluindo o homodímero, heterodímero, e meio anticorpo monomérico que foram capturados por uma coluna de proteína.
[0291] Conforme mostrado na Tabela 4, o rendimento do anticorpo biespecífico covalente nas culturas de produção que possuem uma concentração final de 20 mM de GSH foi aprimorado em comparação ao rendimento do anticorpo biespecífico em culturas de produção concentração final de 10 mM de GSH, ou de 15 mM ou sem tratamento. A adição de GSH-se à cultura de células combinadas para uma concentração final de até 20 mM não mostrou afetar o título. Quando o GSH foi adicionado às culturas de produção para uma concentração final de 20 mM, no entanto, foi observada a modificação covalente do meio anticorpo por GSH (dados não mostrados).
EXEMPLO 3 PRODUÇÃO DO ANTICORPO BIOESPECÍFICO FORMADO NO MEIO DE CULTURA COMBINADO EM COMPARAÇÃO COM UMA MONTAGEM IN VITRO
[0292] As experiências adicionais foram realizadas utilizando o antiAlvo E (saliência) e anti-Alvo F (orifício) para comparar o rendimento de anticorpo biespecífico obtidas por uma cultura combinada da célula hospedeira de mamífero (por exemplo, as células CHO) que expressam o anti-Alvo E e células de mamíferos (por exemplo, as células CHO) que expressam o anti-Alvo F para o rendimento do anticorpo biespecífico, obtido por combinação in vitro anti-Alvo E purificado (saliência) e anti-Alvo F purificado (orifício) utilizando uma coluna A de proteína. Resumidamente, duas linhagens celulares de mamíferos, cada um expressando o anti-Alvo E (saliência) ou anti-Alvo F (orifício), foram inicialmente cultivadas e induzidas para expressar o meio anticorpo da saliência ou o meio anticorpo do orifício em culturas separadas. As culturas separadas, em seguida, são combinadas e cultivadas por um período adicional de tempo. O meio de cultura combinado foi colhido, e a porcentagem (%) do anticorpo biespecífico formado, em seguida, foi determinada através de uma análise de troca catiônica conforme mostrado na Figura 2. Em paralelo, o anticorpo biespecífico foi formado através da combinação de anti-E-alvo purificado (saliência) e anti-Alvo F (orifício) in vitro (vide, por exemplo, publicação WO 2013/055958). O rendimento final de anticorpo biespecífico formado em ambas as condições foi comparável (dados não apresentados).
EXEMPLO 4 PRODUÇÃO BIESPECÍFICOS
[0293]As experiências adicionais foram realizadas utilizando o anti-Alvo G (saliência) e anti-Alvo H (orifício) para testar se o anticorpo biespecífico anti-Alvo G / anti-Alvo H pode ser formado a partir de uma preparação de anticorpo purificada anti-Alvo G que compreende o anti-Alvo G / homodímero do anti-Alvo G e uma preparação de meio anticorpo de anti-Alvo H purificado que compreende um anti-Alvo H / homodímero do anti-Alvo H. as culturas separadas de células hospedeiras de mamíferos (por exemplo, as células CHO) que transitoriamente expressam o meio anticorpo do anti-Alvo G (saliência) e as células hospedeiras de mamífero (por exemplo, as células CHO) que transitoriamente expressam o meio anticorpo do anti-Alvo H (orifício) foram cultivadas e colhidas, conforme descrito acima.
[0294] Cada meio anticorpo foi capturado em uma coluna A da proteína MabSURE SELECT de 5mL. A coluna, em seguida, foi lavada com 10 volumes de coluna (CV) dos seguintes tampões: um tampão de equilíbrio que consiste em Tris a 50 mM, pH 8,0, NaCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,05%, Triton X-114 a 0,05%, um tampão de lavagem que consiste em citrato de sódio a 25 mM, pH 6,0. Cada braço foi eluído em acetato de sódio a 0,15 M, pH 2,7. A identidade de cada meio anticorpo foi confirmada por MS.
[0295] No caso do biespecífico, cada meio anticorpo foi independentemente titulado para pH 5,0 utilizando a arginina Tris a 1M 1:10, pH 9,0, em seguida, combinado em conjunto em uma proporção de 1:1. A mistura, em seguida, foi titulada para pH 8,5 utilizando 1:10 de arginina Tris a 1 M, pH 9,0 e deixado à temperatura ambiente durante 3 dias após a adição de um excesso de 0,5 M recentemente preparado de L-glutationa reduzida (Sigma Aldrich) a uma proporção molar de 1: 200. A reação foi verificada por MS para o ID biespecífico.
[0296] As aglomerações da captura da saliência e do orifício foram executadas em de 4 a 20% de Tris-Glicina SDS-PAGE, revelando a presença de bandas correspondentes ao peso molecular de meio anticorpo e homodímero em cada aglomeração de captura. Vide Figura 4. Além disso, após a captura de MabSURE SELECT, 0,5 mg de cada um foi carregado em uma coluna de hidrofobicidade (2,1 x 100 mM). O tampão de corrida foi o fosfato de potássio a d25 mM, sulfato de amônio a 1 M, pH 6,5 e o tampão de eluição era o fosfato de potássio a 25 mM, pH 6,5, isopropanol a 25%. Os cromatogramas refletiram a heterogeneidade observada com o gel, e também revelou as diferenças no tempo de retenção do pico principal. Vide as Figuras 5A e 5B, que mostram os cromatogramas para o anti-Alvo G (saliência) e anti-Alvo H (orifício), respectivamente. As quantidades de meio anticorpo e homodímero nas aglomerações de captura podem variar dependendo dos anticorpos específicos.
[0297]Após o tratamento de glutationa, a biespecífico também foi carregado na coluna de hidrofobicidade. O cromatograma revelou um pico principal único (superior a 90%), com tempo de retenção entre aqueles de cada meio anticorpo. Vide Figura 6. O MS confirmou que o pico principal foi biespecífico. Estes resultados sugerem que existe homodímero covalente presente nas aglomerações de captura do meio anticorpo, e o homodímero é capaz de ser interrompido utilizando as condições de montagem citadas acima e está disponível para a formação do biespecífico.
[0298]As condições de montagem dos biespecíficos ainda foram examinadas através da comparação do conjunto de anti-Alvo A (saliência) e anti-Alvo B (orifício) em meio de cultura combinado na ausência de GSH versus na presença de GSH a 10 mM.
[0299] As células CHO foram transfectadas utilizando o Lipofectamine 2000, de acordo com a recomendação do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). As células transfectadas foram selecionadas em diferentes concentrações de MSX (metionina-sufoximina, 25 e 50 μM). As colônias selecionadas foram avaliadas quanto à produção de anticorpos por amostragem de sobrenadante a partir de colônias e análise por ELISA. Para a produção de aglomeração estável, com base nos títulos de ELISA, os 48 melhores clones foram combinados e ampliados. Os clones individuais também foram expandidos e ampliados para a avaliação da produtividade de anticorpos para determinar os melhores clones.
[0300] Em seguida, 40 L de cultura foram utilizados e as células foram semeadas a 1,2 x 106 células / mL em 2,8 L de meio de cultura. A cultura foi regularmente dividida e agitada a 90 rpm e mantida a um ponto ajustado de pH de 7,0 a cerca de 0,03 e oxigênio dissolvido a 30% (dO2). O GSH a 15 mM foi adicionado no dia 11, seguido pela colheita de células no dia 12.
[0301] O meio de cultura livre de células tratadas e não tratada de GSH foram cada processado em MabSURE SELECT e as aglomerações de captura foram analisadas utilizando ESI-TOF. Vide a Figura 7A. A Figura 7B mostra uma ampliação do intervalo de m/z de pico do anticorpo biespecífico (pico direito, conforme mostrado na 7A). A Figura 7C mostra um alargamento do intervalo de m/z do pico do meio anticorpo (pico à esquerda, conforme mostrado na 7A).
[0302] As Figuras de 7A a C mostram que as abundâncias do pico do homodímero e meio anticorpo são visivelmente reduzidas quando o GSH a 10 mM foi adicionado à cultura, demonstrando que a formação do biespecífico é direcionada pelo teor do meio anticorpo e do homodímero presente na cocultura. A extensão de cada homodímero participa na formação de anticorpo biespecífico depende do meio de anticorpo especial.
[0303] Os técnicos no assunto irão reconhecer que diversas realizações são possíveis dentro do âmbito e do espírito da presente invenção. A presente invenção será descrita no momento em maiores detalhes com referência aos seguintes Exemplos não limitantes. Os Exemplos seguintes ainda ilustram mais a presente invenção, mas, é evidente, não devem ser interpretados de maneira alguma como limitando o seu âmbito.

Claims (40)

1. MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA PROTEÍNA HETEROMULTIMÉRICA, caracterizado por compreender (i) um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve, e (ii) um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem que possui o segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados por, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira capaz de expressar um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e uma primeira cadeia leve, em que um primeiro homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o primeiro ponto de clivagem e duas primeiras cadeias leves é segregado; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira capaz de expressar um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e uma segunda cadeia leve, em que um segundo homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o segundo ponto de clivagem e duas segundas cadeias leves é segregado; (c) da obtenção de um meio de cultura combinado para a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira sem a interrupção da membrana celular das primeiras e segundas células hospedeiras, em que o meio de cultura combinado compreende o primeiro homodímero e o segundo homodímero; (d) da incubação do meio de cultura combinado sob condições de redução suficientes para possibilitar a formação da proteína heteromultimérica, e; (e) da obtenção da proteína heteromultimérica, em que a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cada uma, uma célula de mamífero.
2. MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA PROTEÍNA HETEROMULTIMÉRICA, caracterizado pelo fato de que compreende (i) um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve, e (ii) um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem que possui o segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados por, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma primeira célula hospedeira capaz de expressar um primeiro homodímero, em que o primeiro homodímero compreende dois polipeptídeos contendo o primeiro ponto de clivagem e as suas cadeias leves associadas; (b) da cultura de uma segunda célula hospedeira capaz de expressar um segundo homodímero, em que o segundo homodímero compreende dois polipeptídeos contendo o segundo ponto de clivagem e suas cadeias leves associadas; (c) da obtenção de um meio de cultura combinado para a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira; (d) da incubação do meio de cultura combinado sob condições de redução suficientes para possibilitar a formação da proteína heteromultimérica, e; (e) da obtenção da proteína heteromultimérica.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela obtenção do meio de cultura combinado compreender: (1) a colheita de um primeiro meio de cultura para a primeira célula hospedeira; (2) a colheita em um segundo meio de cultura para a segunda célula hospedeira; e, (3) a combinação do primeiro meio de cultura e do segundo meio de cultura para se obter o meio de cultura combinado.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela obtenção do meio de cultura combinado compreender a colheita do meio de cultura de uma cultura de células combinadas que compreende a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira serem separadamente cultivadas antes da combinação para a cultura de células combinadas.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizado por ainda compreender a etapa de cultura da cultura de células combinadas a uma temperatura de cerca de 25° C a cerca de 40° C.
7. MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA PROTEÍNA HETEROMULTIMÉRICA, caracterizado por compreender (i) um polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem que possui um primeiro domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem está associado com uma primeira cadeia leve, e (ii) um polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem que possui o segundo domínio de heterodimerização, em que o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem está associado com uma segunda cadeia leve, em que o segundo domínio de heterodimerização interage com o primeiro domínio de heterodimerização em uma interface, e em que os polipeptídeos contendo o primeiro e segundo ponto de clivagem estão ligados por, pelo menos, uma ligação de intercadeias de dissulfureto, o método compreende as etapas: (a) da cultura de uma cultura combinada de uma primeira célula hospedeira e uma segunda célula hospedeira, em que a primeira célula hospedeira é capaz de expressar o polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e a primeira cadeia leve, em que a segunda célula hospedeira é capaz de expressar o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem e a segunda cadeia leve, e em que a primeira célula hospedeira e a segunda célula hospedeira são cada uma, uma célula de mamífero; (b) da adição de um agente de redução para a cultura combinada; e (c) da colheita de um meio de cultura combinado a partir da cultura combinada sem a interrupção da membrana celular, em que o meio de cultura combinado compreende a proteína heteromultimérica.
8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela primeira célula hospedeira segregar um primeiro homodímero que compreende dois polipeptídeos contendo o primeiro ponto de clivagem e duas primeiras cadeias leves, em que a segunda célula hospedeira segrega um segundo homodímero que compreende dois polipeptídeos que contêm uma segunda clivagem e duas segundas cadeias leves.
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizado pela etapa de colheita de um meio de cultura combinado compreender a remoção da primeira célula hospedeira e da segunda célula hospedeira a partir do meio de cultura combinado.
10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por ainda compreender a agitação do meio de cultura combinado.
11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por ainda compreender o isolamento da proteína heteromultimérica a partir do meio de cultura combinado.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender a adição de um agente de redução para o primeiro meio de cultura de células e/ou o segundo meio de cultura de células antes ou após o primeiro e segundo meios de cultura de células serem colhidos.
13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6 e 10 a 12, caracterizado por compreender a adição de um agente de redução ao meio de cultura da cultura de células combinadas antes do meio de cultura da cultura de células combinadas ser colhido.
14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, caracterizado pelo agente de redução ser adicionado a cerca de 4 a cerca de 24 horas antes da etapa de colheita.
15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo agente de redução ser adicionado a cerca de 15 horas antes da etapa de colheita.
16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado por ainda compreender a adição de um agente de redução ao meio de cultura de células combinadas.
17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo meio de cultura combinado que contém o agente de redução ainda ser incubado durante cerca de 4 horas a cerca de 7 dias.
18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo meio de cultura combinado que contém o agente de redução ainda ser incubado durante cerca de 15 horas.
19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo agente de redução ser adicionado ao meio de cultura combinado antes do isolamento da proteína heteromultimérica a partir do meio de cultura combinado.
20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo meio de cultura combinado que contém o agente de redução ser incubado durante, pelo menos, cerca de 24 horas antes do isolamento da proteína heteromultimérica.
21. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 20, caracterizado pelo agente de redução ser selecionado a partir do grupo que consiste em glutationa, 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina, tris(2- carboxietil)fosfina (TCEP), cisteína, cisteína, ditiotreitol, cisteinditiotreitol, ditiolbutilamina, ou suas combinações.
22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo agente de redução ser a glutationa, e em que a glutationa é adicionada a uma concentração de: (a) cerca de 5 mM a não superior a cerca de 20 mM; (b) cerca de 2mM a cerca de 10mM; (c) cerca de 5mM a cerca de menos de 20mM; ou (d) cerca de 15mM.
23. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pela primeira célula hospedeira ser uma linhagem de célula estável, a segunda célula hospedeira ser uma linhagem de célula estável, ou ambas primeira e segunda células hospedeiras serem linhagens de células estáveis.
24. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pela primeira célula hospedeira ser a célula CHO, em que a segunda célula hospedeira é a célula CHO, ou em que ambas primeira e segunda células são células CHO.
25. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pela proporção da primeira célula hospedeira e da segunda célula hospedeira ser ajustada de maneira que a proporção molar do polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem e do polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem é de cerca de 1:10 a cerca de 10:1 quando a primeira cultura da célula hospedeira e a segunda cultura da célula hospedeira são combinadas para a formação de uma cultura combinada.
26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pela proporção molar do polipeptídeo contendo o primeiro ponto de clivagem expressa através da primeira célula hospedeira e o polipeptídeo contendo o segundo ponto de clivagem expressa através da segunda célula hospedeira ser de cerca de 1:1 quando a cultura da célula hospedeira e a segunda cultura da célula hospedeira são combinadas para a formação de uma cultura combinada.
27. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelos polipeptídeos contendo o ponto de clivagem compreenderem uma região Fc ou sua variante.
28. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo polipeptídeo contendo o primeiro e/ou segundo ponto de clivagem compreender uma cadeia pesada de anticorpo.
29. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo primeiro domínio de heterodimerização compreender uma modificação da saliência na interface e o segundo domínio de heterodimerização compreender uma modificação do orifício na interface em que a modificação da saliência compreende a substituição de um resíduo de aminoácido original a partir do primeiro domínio de heterodimerização com um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral maior do que o resíduo de aminoácido original; e em que a modificação do orifício compreende uma substituição de um resíduo de aminoácido original a partir do segundo domínio de heterodimerização com um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral menor do que o resíduo de aminoácido original.
30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo resíduo de amino ácido com uma cadeia lateral maior do que o resíduo de aminoácido original ser selecionado a partir do grupo que consiste em triptofano, fenilalanina, tirosina e a arginina.
31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo resíduo de amino ácido com uma cadeia lateral menor do que o resíduo de aminoácido original ser selecionado a partir do grupo que consiste em serina, treonina, valina e alanina.
32. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pela modificação da saliência compreende a substituição T366W (numeração EU).
33. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32, caracterizado pela modificação do orifício compreender duas ou mais substituições de amino ácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em T366S, L368A e Y407V (numeração EU).
34. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pela dita ligação de intercadeias de dissulfureto estar entre as regiões de clivagem.
35. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pela proteína heteromultimérica ser um anticorpo.
36. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35 caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo biespecífico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo de comprimento total, ou um fragmento de anticorpo que compreende pelo menos uma porção de domínio CH2 e/ou CH3 humano.
37. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 36, caracterizado pelo anticorpo ser selecionado a partir do grupo que consiste em IgG, IgA e IgD.
38. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo anticorpo ser o IgG.
39. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo anticorpo ser o IgG1, IgG2 ou IgG4.
40. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizado pela primeira cadeia leve e a segunda cadeia leve compreenderem as sequências diferentes de domínio variável.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2727012C2 (ru) * 2014-05-06 2020-07-17 Дженентек, Инк. Получение гетеромультимерных белков с использованием клеток млекопитающих
CN110267977A (zh) 2016-08-10 2019-09-20 亚洲大学校产学协力团 细胞因子免疫球蛋白Fc融合异二聚体和包含其的药物组合物
AU2017388894A1 (en) * 2016-12-29 2019-08-08 Development Center For Biotechnology KLK6-mediated CNS-specific antibody prodrug activation
TW202016151A (zh) 2018-06-09 2020-05-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
AU2019318087A1 (en) * 2018-08-08 2021-03-04 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding NKG2D, CD 16 and a tumor-associated antigen
CN113286808A (zh) 2018-10-23 2021-08-20 蜻蜓疗法股份有限公司 异二聚体Fc融合蛋白
CN116670166A (zh) 2020-12-07 2023-08-29 Ucb生物制药有限责任公司 多特异性抗体和抗体组合

Family Cites Families (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
IL47062A (en) 1975-04-10 1979-07-25 Yeda Res & Dev Process for diminishing antigenicity of tissues to be usedas transplants by treatment with glutaraldehyde
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
US4665077A (en) 1979-03-19 1987-05-12 The Upjohn Company Method for treating rejection of organ or skin grafts with 6-aryl pyrimidine compounds
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
SE8505922D0 (sv) 1985-12-13 1985-12-13 Kabigen Ab Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
IL85746A (en) 1988-03-15 1994-05-30 Yeda Res & Dev Preparations comprising t-lymphocyte cells treated with 8-methoxypsoralen or cell membranes separated therefrom for preventing or treating autoimmune diseases
FI891226A (fi) 1988-04-28 1989-10-29 Univ Leland Stanford Junior Reseptordeterminanter i anti-t-celler foer behandling av autoimmunsjukdom.
EP0435911B1 (en) 1988-09-23 1996-03-13 Cetus Oncology Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
WO1990008187A1 (en) 1989-01-19 1990-07-26 Dana Farber Cancer Institute Soluble two domain cd2 protein
ES2062519T5 (es) 1989-03-21 2003-07-16 Immune Response Corp Inc Vacunacion y metodos contra enfermedades originadas a partir de respuestas patogenicas mediante poblaciones especificas de linfocitos t.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ES2112838T5 (es) 1989-07-19 2004-09-01 Connetics Corporation Peptidos receptores de celulas t como agentes terapeuticos para enfermedades autoinmunitarias y malignas.
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
WO1992010209A1 (en) 1990-12-04 1992-06-25 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
DE69233528T2 (de) 1991-11-25 2006-03-16 Enzon, Inc. Verfahren zur Herstellung von multivalenten antigenbindenden Proteinen
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
EP0752248B1 (en) 1992-11-13 2000-09-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
JP4213224B2 (ja) 1997-05-02 2009-01-21 ジェネンテック，インコーポレーテッド ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
ME00238B (me) 1998-10-23 2011-02-10 Kirin Amgen Inc Mimičko vezivanje dimernog trombopoitetinskog peptida za mp1 receptor sa trombopoietičkom aktivnošću
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
AU2001247616B2 (en) 2000-04-11 2007-06-14 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
CA2447832C (en) 2000-12-22 2012-09-25 Jamshid Tanha Phage display libraries of human vh fragments
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
NZ529267A (en) 2001-05-11 2006-05-26 Amgen Inc Peptides and related molecules that bind to tall-1
AU2002345673B2 (en) 2001-06-13 2007-04-26 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
WO2004081026A2 (en) 2003-06-30 2004-09-23 Domantis Limited Polypeptides
US7332474B2 (en) 2001-10-11 2008-02-19 Amgen Inc. Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
US7205275B2 (en) 2001-10-11 2007-04-17 Amgen Inc. Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
PT1523496E (pt) 2002-07-18 2011-09-29 Merus B V Produção de misturas de anticorpos de forma recombinante
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
EA201492217A1 (ru) 2002-10-17 2015-06-30 Генмаб А/С Человеческие моноклональные антитела против cd20
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
MXPA05012723A (es) 2003-05-30 2006-02-08 Genentech Inc Tratamiento con anticuerpos anti-vgf.
ES2605443T3 (es) 2003-11-06 2017-03-14 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de auristatina con anticuerpos anti-HER2 o anti-CD22 y su uso en terapia
MX2007002856A (es) 2004-09-02 2007-09-25 Genentech Inc Metodos para el uso de ligandos receptores de muerte y anticuerpos c20.
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
JP5461181B2 (ja) 2006-07-25 2014-04-02 メルク パテント ゲーエムベーハー ポリマーブレンドとその有機発光素子での使用
EP2520935A3 (en) 2006-08-09 2013-02-13 Homestead Clinical Corporation Organ-specific proteins and methods of their use
EP2071927A2 (en) * 2006-09-28 2009-06-24 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleotide sequencing
NZ614857A (en) * 2007-03-29 2015-04-24 Genmab As Bispecific antibodies and methods for production thereof
LT2592148T (lt) * 2007-10-12 2018-12-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Baltymų ekspresavimas iš kelių nukleorūgščių
US20090162359A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8592562B2 (en) 2008-01-07 2013-11-26 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
SG10201408401RA (en) 2009-09-16 2015-01-29 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
SG10201800757TA (en) 2010-04-20 2018-02-27 Genmab As Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
CN102946906B (zh) * 2010-04-23 2015-07-15 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 生产异源多聚体蛋白质
RU2013140685A (ru) * 2011-02-04 2015-03-10 Дженентек, Инк. ВАРИАНТЫ Fc, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
CN107266577B (zh) 2011-10-11 2022-09-13 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 双特异性抗体的改进的组装
RU2727012C2 (ru) * 2014-05-06 2020-07-17 Дженентек, Инк. Получение гетеромультимерных белков с использованием клеток млекопитающих

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