WO2020080715A1 - 생산성이 향상된 항체 및 이의 제조방법 - Google Patents

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WO2020080715A1
WO2020080715A1 PCT/KR2019/013008 KR2019013008W WO2020080715A1 WO 2020080715 A1 WO2020080715 A1 WO 2020080715A1 KR 2019013008 W KR2019013008 W KR 2019013008W WO 2020080715 A1 WO2020080715 A1 WO 2020080715A1
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antibody
light chain
rituximab
present
hydroxyamino
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김주영
이진우
김혜연
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연세대학교 산학협력단
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Definitions

  • the CD20 antigen (human B-lymphocyte-restricted differentiation antigen, also called Bp35) is a hydrophobic diaphragm protein located on pre-B and mature B lymphocytes with a molecular weight of approximately 35 kD (Valentine et al. J. Biol. Chem. 264 (19): 11282-11287 (1989); and Einfeld et al. EMBO J. 7 (3): 711-717 (1988)).
  • the antigen is also expressed in more than 90% of B cell non-Hodgkin's lymphomas (NHL) (Anderson et al.
  • CD20 is thought to modulate the initial step (s) in the activation process for cell cycle initiation and differentiation (Tedder et al., Supra) and possibly act as calcium ion channels (Tedder et al. J. Cell Biochem. 14D: 195 (1990)).
  • the antibody may be included without limitation as long as it contains one or more hydroxyamino acids in the light chain, preferably the light chain variable region.
  • the hydroxyamino acid to be glycosylated is an amino acid having a hydroxyl group in the molecule, and may be serine (Tre), threonine (Thr) or tyrosine (Tyr), preferably serine ( Ser) or threonine (Thr) residue.
  • the antibody is at least one of the 7th, 12th, 14th, 26th, 51st, 55th, 62th, 101st, 155th and 181th from the 5 'end of the light chain, preferably the light chain variable region.
  • One may include a hydroxyamino acid residue.
  • the amino acid position numbering may be due to Kabat's EU index, but is not limited thereto.
  • the antibody may be one comprising a hydroxyamino acid residue in at least one of the 7th, 12th and 14th from the 5 'end of the light chain, preferably the light chain variable region.
  • the "anti-CD20 antibody” is an antibody that specifically binds the CD20 antigen.
  • Two types of anti-CD20 antibodies (Type I and Type II anti-CD20 antibodies) according to the binding properties and biological activity of anti-CD20 antibodies to CD20 antigens are described in Craig, MS, et al., Blood 103 (2004). 2738-2743]; And Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052.
  • the anti-CD20 antibody may be a type I anti-CD20 antibody, for example, Rituximab, HI47 IgG3 (ECACC, hybridoma), 2C6 IgG1 (International Patent Application Publication No. 2005/103081 2F2 IgG1 (disclosed in International Patent Application Publication No. 2004/035607 and International Patent Application Publication No. 2005/103081) or 2H7 IgG1 (disclosed in International Patent Application Publication No. 2004/056312) Included, but may preferably be Rituximab.
  • the "Rituximab” antibody in the present invention is a monoclonal antibody containing a genetically engineered chimeric human gamma 1 murine constant region, directed against the human CD20 antigen.
  • the chimeric antibody is a human immunoglobulin gamma 1 heavy chain constant region represented by SEQ ID NO: 1 (human immunoglobulin G1 (IgG1) heavy chain constant region); A human kappa light chain constant region represented by SEQ ID NO: 2; It may include a mouse-derived heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 3 (murine heavy chain variable region) and a mouse-derived light chain variable region represented by SEQ ID NO: 4 (murine light chain variable region), that is, represented by SEQ ID NO: 5 It may consist of two heavy chains and two light chains represented by SEQ ID NO: 6.
  • the nivolumab antibody may include a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 7 and a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 8, or may consist of a heavy chain represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain represented by SEQ ID NO: 10 .
  • the pidilizumab antibody may include a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 15 and a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 16, or may consist of a heavy chain represented by SEQ ID NO: 17 and a light chain represented by SEQ ID NO: 18. have.
  • Antibodies of the invention are hydroxyamino acid residues at least one of the 7th, 12th and 14th, preferably 7th, 12th and 14th from the 5 'end of the light chain, e.g. serine, threonine ( Thr) or tyrosine (Tyr) residues, preferably serine (Ser) or threonine (Thr) residues, more preferably serine (Ser) residues may be glycosylated.
  • serine, threonine ( Thr) or tyrosine (Tyr) residues preferably serine (Ser) or threonine (Thr) residues, more preferably serine (Ser) residues may be glycosylated.
  • the antibody of the present invention is at least one hydroxyamino acid contained in the light chain of Rituximab (Rituximab), preferably at least one hydroxyamino acid contained in the light chain variable region, more preferably at least one serine contained in the light chain variable region
  • the (Ser) or threonine (Thr) residue may be glycosylated.
  • At least one serine (Ser) residue of the 7th, 12th, and 14th from the 5 'end of the light chain variable region may be glycosylated.
  • the antibody of the present invention may be glycosylated with at least one hydroxyamino acid contained in the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 14 in the pembrolizumab, preferably the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 12.
  • At least one serine (Ser) residue of the 7th, 12th, and 14th from the 5 'end of the light chain variable region in the pembrolizumab may be glycosylated.
  • the antibody of the present invention may be glycosylated with at least one hydroxyamino acid contained in the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 18 in the pidilizumab, preferably the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 16.
  • the systemic name of the O-GlcNAc transferase is "UDP-N-acetyl-D-glucosamine: protein-O-beta-N-acetyl-D-glucosaminyl transferase (UDP-N-acetyl- D-glucosamine: protein-O-beta-N-acetyl-D-glucosaminyl transferase).
  • the enzyme is encoded by the OGT gene.
  • it relates to a method for producing an antibody, comprising the step of O-linked glycosylation (O-linked glycosylation) of one or more hydroxyamino acids contained in the light chain of the antibody. .
  • the antibody is at least one of the 7th, 12th, 14th, 26th, 51st, 55th, 62th, 101st, 155th and 181th from the 5 'end of the light chain, preferably the light chain variable region.
  • One may include a hydroxyamino acid residue.
  • the antibody may be one comprising a hydroxyamino acid residue in at least one of the 7th, 12th and 14th from the 5 'end of the light chain, preferably the light chain variable region.
  • the antibody may be an anti-CD20 antibody or an anti-PD-1 antibody, but is not limited thereto.
  • the anti-CD20 antibody is a type I chimeric anti-CD20 antibody, for example, Rituximab, HI47 IgG3 (ECACC, hybridoma), 2C6 IgG1 (International Patent Application Publication No. 2005/103081 2F2 IgG1 (disclosed in International Patent Application Publication No. 2004/035607 and International Patent Application Publication No. 2005/103081) or 2H7 IgG1 (disclosed in International Patent Application Publication No. 2004/056312)
  • it may be preferably Rituximab (Rituximab).
  • a host cell transformed with one or more recombinant nucleic acid molecules encoding the rituximab may be prepared and cultured.
  • the human immunoglobulin gamma 1 heavy chain constant region represented by SEQ ID NO: 1 human immunoglobulin G1 (IgG1) heavy chain constant region); A human kappa light chain constant region represented by SEQ ID NO: 2;
  • a host transformed with one or more recombinant nucleic acid molecules encoding a mouse-derived heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 3 and a mouse-derived light chain variable region represented by SEQ ID NO: 4 Cells can be prepared and cultured.
  • a host cell transformed with one or more recombinant nucleic acid molecules encoding the heavy chain represented by SEQ ID NO: 5 and the light chain represented by SEQ ID NO: 6 may be prepared and cultured.
  • the anti-PD-1 antibody is Nivolumab, Pembrolizumab, Pidilizumab, AMP 514 (Amplimmune), PDR-001 (Novartis), MEDI-0690 (also AMP (Also known as -514) (MedImmune LLC), SHR-1210 (Incyte Corp.), REGN-2810 (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), PF-06801591 (Pfizer), TSR-042 (also known as ANB011) (Tesaro, Inc.), BGB-A317 (BeiGene, Ltd.) or JS001 (Shanghai Junshi Bioscience Co., Ltd.), but may preferably be nivolumab, pembrolizumab or pidilizumab.
  • a host cell transformed with one or more recombinant nucleic acid molecules encoding the nivolumab may be prepared and cultured.
  • host cells transformed with one or more recombinant nucleic acid molecules encoding the heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 7 and the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 8 may be prepared and cultured.
  • a host cell transformed with one or more recombinant nucleic acid molecules encoding the heavy chain represented by SEQ ID NO: 9 and the light chain represented by SEQ ID NO: 10 may be prepared and cultured.
  • host cells transformed with one or more recombinant nucleic acid molecules encoding the pembrolizumab can be prepared and cultured.
  • host cells transformed with one or more recombinant nucleic acid molecules encoding the heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 11 and the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 12 may be prepared and cultured.
  • a host cell transformed with one or more recombinant nucleic acid molecules encoding the heavy chain represented by SEQ ID NO: 13 and the light chain represented by SEQ ID NO: 14 may be prepared and cultured.
  • a host cell transformed with one or more recombinant nucleic acid molecules encoding the pidilizumab may be prepared and cultured.
  • a host cell transformed with one or more recombinant nucleic acid molecules encoding the heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 15 and the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 16 may be prepared and cultured.
  • host cells transformed with one or more recombinant nucleic acid molecules encoding the heavy chain represented by SEQ ID NO: 17 and the light chain represented by SEQ ID NO: 18 may be prepared and cultured.
  • the host cell can be from a rodent, more preferably, the mammalian cell can be a Chinese hamster ovary (CHO) cell, more preferably the cell can be a CHO-K1 cell, most preferably The cells are CHO-K1 cells, and as a culture medium, a serum-free medium suitable for CHO-K1 cell growth can be used, or Sigma # 14360C (EX-CELL® CD CHO Serum-Free Medium for CHO Cells, Chemically Defined) It can be manufactured using a product, but is not limited thereto.
  • CHO Chinese hamster ovary
  • the host cell may be transformed with at least one recombinant nucleic acid molecule such as an expression vector capable of stably producing a recombinant protein, that is, genetically modified.
  • the host cell is one recombinant nucleic acid molecule encoding both the heavy and light chains of the antibody, or two recombinant nucleic acids, one encoding the light chain of the antibody and the other encoding the heavy chain of the antibody It can be transformed by a molecule.
  • a recombinant antibody can be prepared from one recombinant nucleic acid molecule encoding both the heavy and light chains of the antibody.
  • the antibodies of the invention are prepared from one recombinant nucleic acid molecule, and the expression of the heavy and light chains can be controlled by separate promoters, which can be the same or different. In the most preferred embodiment, the antibodies of the invention are prepared from one recombinant nucleic acid molecule, and expression of the heavy and light chains can be controlled by the same separate promoter.
  • the "vector” is a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which a nucleic acid molecule is linked.
  • a vector is a "plasmid” that refers to a circular double-stranded DNA where additional DNA segments can be ligated.
  • a phage vector is another type of vector.
  • a viral vector in which additional DNA segments can be ligated to the viral genome.
  • vectors eg, non-episomal mammalian vectors
  • vectors can be incorporated into the host cell's genome upon entry into the host cell, thereby replicating with the host genome.
  • some vectors are capable of directing the expression of genes to which they are linked in the operational dimension.
  • Such vectors are referred to herein as “recombinant expression vectors” or simply “expression vectors”.
  • expression vectors useful in recombinant DNA techniques are often present in the form of plasmids.
  • plasmid and vector can be used interchangeably, because plasmid is the most commonly used form of vector.
  • the expression vector in the present invention commercially widely used pCDNA vector, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti vector; Cosmid; Phages such as lambda, lambdoid, M13, Mu, p1 P22, Q ⁇ , T-even, T2, T3, T7; It may be selected from the group consisting of plant viruses, but is not limited thereto, and any expression vector known as an expression vector to those skilled in the art can be used in the present invention, and when selecting an expression vector, depends on the properties of the target host cell.
  • the vector Upon introduction of the vector into the host cell, calcium phosphate transfection, viral infection, DEAE-dextran regulatory transfection, lipofectamine transfection, or electroporation may be performed, but is not limited thereto.
  • An introduction method suitable for the expression vector and the host cell can be selected and used.
  • the vector contains one or more selection markers, but is not limited thereto, and selection is possible according to whether a product is produced using a vector not including the selection marker.
  • the selection of the selection marker is selected by the desired host cell, which uses methods already known to those skilled in the art, so the present invention is not limited to this.
  • a tag sequence may be inserted into an expression vector and fused.
  • the tags include, but are not limited to, hexa-histidine tags, hemagglutinin tags, myc tags, or flag tags. Any tag that facilitates purification known to those skilled in the art can be used in the present invention.
  • the culture medium used in the culture of the host cell in the present invention is a solution containing nutrients required for growing mammalian cells, typically essential and non-essential amino acids required by cells for minimal growth and / or survival, It may contain vitamins, energy sources, lipids and trace elements.
  • the medium is chemically characterized in that all components and their concentrations are known.
  • the medium is serum-free, contains no hydrolyzate, and may contain no animal-derived ingredients.
  • the medium is serum-free, contains no hydrolysates, contains no animal-derived ingredients, but may contain some chemicals necessary for the separation process.
  • the serine (Ser), threonine (Thr) or tyrosine (Tyr) residue as one or more hydroxyamino acids contained in the light chain or light chain variable region of the antibody expressed when the host cell is cultured preferably Serine (Ser) or threonine (Thr) residues can be glycosylated.
  • one or more hydroxyamino acids contained in the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 6 or the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 4 of the rituximab antibody expressed when the host cell is cultured can be glycosylated.
  • the 7th, 12th, 14th, 26th, 51st, 55th, 62th, 101st, and 155th from the 5 'end of the light chain.
  • At least one serine (Ser) residue from the 5 'end of the residue, more preferably the 5' end of the light chain variable region of the antibody, can be glycosylated.
  • one or more hydroxyamino acids contained in the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 10 or the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 8 of the nivolumab antibody expressed when the host cell is cultured can be glycosylated.
  • At least one serine (Ser) residue from the 5 'end of the light chain variable region in the nivolumab expressed during the culture of the host cell can be glycosylated.
  • one or more hydroxyamino acids contained in the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 14 or the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 12 of the pembrolizumab antibody expressed when the host cell is cultured can be glycosylated.
  • At least one serine (Ser) residue of the 7th, 12th, and 14th from the 5 'end of the light chain variable region in the pembrolizumab expressed when the host cell is cultured can be glycosylated.
  • the glycosylation is preferably O-linked glycosylation (O-linked glycosylation)
  • the antibody is N-acetyl in one or more hydroxyamino acids contained in the light chain, or light chain variable region Glucosamine (N-acetylglucosamine; GlcNAc) may be bound.
  • an O-GlcNAcase inhibitor (O-GlcNAcase inhibitor; OGA inhibitor) may be added.
  • the OGA inhibitors are Thiamet-G (Thiamet-G), Streptozotocin (STZ), PUGNAc, NAG-thiazoline, NButGT, (2R, 3S) -iminocycly Toll ((2R, 3S) -iminocyclitol), PUGNAc-imidazole hybrid (PUGNAc-imidazole hybrid) and GlcNAc statin C (GlcNAcstatin C) may be one or more selected from the group consisting of, but preferably Tiamet-G have.
  • one or more hydroxyamino acids contained in the light chain or light chain variable region of the antibody through the O-linked glycosylation preferably from the 5 'end of the light chain, 7th, 12th, 14th, 26th , At least one of the 51st, 55th, 62th, 101st, 155th and 181th, preferably at least one of the 7th, 12th, 14th, 26th and 62th, more preferably the 7th, Hydroxyamino acid residues located in at least one of the 12th and 14th may be O-linked glycosylation.
  • the 7th, 12th, 14th, 26th, 51st, 55th, 62th, 101st, 155 from the 5 'end of the light chain of the rituximab antibody At least one of the 7th, 12th, 14th, 26th, and 62th serine residues from the 5 'end of the light chain variable region of the rituximab, at least one of the second and 181th positions is O- Binding glycosylation.
  • At least one of the 7th, 12th and 14th serine (Ser) residues may be O-linked glycosylation.
  • At least one of the 7th, 12th, and 14th serine residues from the terminal can be O-linked glycosylation.
  • At least one of the 7th, 12th, and 14th serine residues from the terminal can be O-linked glycosylation.
  • O-GlcNAc transferase is additionally added during the cultivation of the host cell.
  • N-acetylglucosamine can be bound to the hydroxyamino acid in the light chain or light chain variable region of the anti-CD20 antibody or anti-PD-L1 antibody.
  • a glycosyl linking group of N-acetylglucosamine is additionally added when the host cell is cultured. can do.
  • O-linked glycosylated antibody After preparing the O-linked glycosylated antibody according to the method of the present invention, it can be harvested.
  • O-linked glycosylated antibodies, recombinant proteins expressed from mammalian cells are typically secreted into the cell culture medium during the culturing process, so product harvest at the end of the cultivation process results in cell cultures containing O-linked glycosylated antibodies from the cells. It is done by separating.
  • the method of isolating cells in the present invention should be gentle to minimize cell destruction in order to prevent the increase of cell debris which may affect the quality of the antibody product and the release of proteases and other molecules.
  • harvesting cell cultures containing recombinant proteins such as O-linked glycosylated antibodies involves centrifugation and / or filtration, whereby the recombinant proteins can be present in the supernatant and filtrate, respectively.
  • Expanded bed adsorption chromatography may be an alternative to avoid centrifugation / filtration methods.
  • the O-linked glycosylated antibody may be purified from the cell culture solution.
  • Purification of the O-linked glycosylated antibody by a series of chromatography steps such as anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxyapatite chromatography and size exclusion chromatography. It can generally be done.
  • the purification process may include one or more ultrafiltration, nanofiltration or diafiltration steps. Particularly suitable methods described in PCT / EP2015 / 054862 are anion exchange chromatography in flow-through mode, affinity chromatography on Protein A resin and binding and elution mode (bind-and-elute mode). Cation exchange chromatography.
  • the methods of the present invention can be used to prepare large scale O-linked glycosylated antibodies, meaning a culture volume of at least 500 or 1,000 liters, preferably at least 5,000 or 8,000 liters, most preferably 10,000 or 20,000 liters. have.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the glycosylated antibody provided as an active ingredient.
  • the glycosylated antibody provided by the present invention maintains the titer of the antibody at an equal or higher level by performing O-linked glycosylation on a specific hydroxyamino acid residue of the anti-CD20 antibody or anti-PD-L1 antibody. Since the productivity of the antibody can be significantly increased, it can be used for the prevention or treatment of cancer.
  • the "cancer” refers to or refers to a physiological condition characterized by cell growth that is typically unregulated in mammals.
  • the cancer targeted for prevention or treatment is pancreatic cancer, thyroid cancer, breast cancer, biliary tract cancer, gallbladder cancer, colon cancer, uterine cancer, esophageal cancer, stomach cancer, brain cancer, rectal cancer, lung cancer, bladder cancer, kidney cancer, ovary Cancer, prostate cancer, uterine cancer, head and neck cancer, skin cancer, blood cancer or liver cancer, but may be preferably, blood cancer, melanoma, lung cancer, kidney cancer, head and neck cancer or stomach cancer, but is not limited thereto.
  • prevention may include, without limitation, any action that blocks or suppresses or delays cancer symptoms using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • treatment may include, without limitation, any action that improves or benefits cancer symptoms by examining the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be additionally administered in combination with other anti-cancer agents, thereby further enhancing the growth inhibitory effect on cancer cells.
  • the anticancer agents include nitrogen mustard, imatinib, oxaliplatin, rituximab, erlotinib, neratinib, lapatinib, gefitinib, vandetanib, nilotinib, semasanib, bosutinib, axitinib, cediranib , Restautinib, trastuzumab, gefitinib, bortezomib, sunitinib, carboplatin, bevacizumab, cisplatin, cetuximab, biscumalbum, asparaginase, tretinoin, hydroxycarbamide, da Satinib, Estramustine, gemtuzumab ozogamycin, ibritomomab tucetan, heptaplatin, methylaminolevulinic acid, amsacrine, alemtuzumab, procarbazine, al
  • the pharmaceutical composition may be characterized in that it is in the form of capsules, tablets, granules, injections, ointments, powders or beverages, and the pharmaceutical composition may be characterized for humans.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not limited to these, but may be used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method. You can.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may include binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, fragrances, etc. when administered orally, and buffers, preservatives, and analgesics for injections. Agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, etc.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention can be variously prepared by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, when administered orally, tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc. may be prepared, and in the case of injection, unit dosage ampoules or multiple doses may be prepared. have.
  • Others can be formulated as solutions, suspensions, tablets, capsules, and sustained release preparations.
  • examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives, etc. may be further included.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not limited to these, but oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical , Sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intra-articular, intra-synovial, intrasternal, epidural, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention depends on a number of factors, including the activity, age, weight, general health, sex, diet, administration time, route of administration, release rate, drug combination and severity of the particular disease to be prevented or treated, of the specific compound used. It may vary, and the dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's condition, body weight, disease severity, dosage form, administration route and duration, but can be appropriately selected by those skilled in the art, and 0.0001 to 50 mg / day It can be administered in kg or 0.001 to 50 mg / kg. The administration may be administered once a day, or may be divided into several times. The above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated as pills, dragees, capsules, liquids, gels, syrups, slurries, suspensions.
  • the method comprising the step of administering the glycosylated antibody provided by the present invention to a target individual, the method for preventing or treating cancer.
  • the cancer is pancreatic cancer, thyroid cancer, breast cancer, biliary cancer, gallbladder cancer, colon cancer, uterine cancer, esophageal cancer, stomach cancer, brain cancer, rectal cancer, lung cancer, bladder cancer, kidney cancer, ovarian cancer, prostate cancer, uterine cancer, head and neck cancer, skin cancer, It may be blood cancer or liver cancer, but is preferably blood cancer, melanoma, lung cancer, kidney cancer, head and neck cancer or stomach cancer, but is not limited thereto.
  • the dose, schedule and route of administration of the glycosylated antibody provided by the present invention can be determined according to the size and conditions of the individual and according to standard pharmaceutical practice.
  • Exemplary routes of administration include intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intrapulmonary, intravascular, intramuscular, intratracheal, subcutaneous, intraocular, intrathecal or transdermal.
  • the dose of antibody administered to a subject can vary, for example, depending on the particular type of antibody being administered, the route of administration and the specific type and stage of the cancer being treated.
  • the amount should be sufficient to produce the desired response, such as a therapeutic response to cancer, without severe toxicity or adverse events.
  • the amount of glycosylated antibody to be administered is a therapeutically effective amount.
  • the amount of glycosylated antibody is at least compared to the corresponding tumor size, the number of cancer cells or the rate of tumor growth in the same subject prior to treatment, or compared to the corresponding activity in another subject not receiving treatment.
  • Reduce tumor size by one of about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or 100%, or reduce the number of cancer cells It is an amount sufficient to let or reduce the growth rate of the tumor.
  • the magnitude of the effect can be measured using standard methods such as in vitro assays with purified enzymes, cell-based assays, animal models or human experiments.
  • the administration of the glycosylated antibody alone or other therapies such as surgery, radiation therapy, gene therapy, immunotherapy, bone marrow transplantation, stem cell transplantation, hormone therapy, targeted therapy, cryotherapy, ultrasound therapy, photodynamic Treatment, chemotherapy, and the like.
  • a person at greater risk of developing a proliferative disease may be treated to inhibit and / or delay the onset of the disease.
  • the titer of the antibody is maintained at a level equal to or higher, thereby significantly increasing the productivity of the antibody. You can.
  • FIG. 1 is a graph showing the result of comparing the production yield of rituximab antibody expressed when Tiamet-G (Thiamet G) was added and not added when rituximab was expressed using host cells in Experimental Example 1 It is shown.
  • Figure 2 shows the change in the expression level of the heavy and light chains of the rituximab antibody over time after the addition of Tiamet-G (Thiamet G) upon expression of rituximab using host cells in Experimental Example 2. The results are analyzed through.
  • Figure 3 (a) is a graph of the change in the expression level of the heavy chain of the rituximab antibody over time after the addition of Tiamet-G (Thiamet G) when the expression of rituximab using host cells in Experimental Example 2 It is indicated by.
  • Figure 3 (b) is a graph of changes in the expression level of the light chain of the rituximab antibody over time after the addition of thiamet-G (Thiamet G) upon expression of rituximab using host cells in Experimental Example 2 It is indicated by.
  • Figure 4 shows the results of analyzing the changes in the expression level of heavy and light chains of rituximab antibody over time after the addition of OSMI-1 when expressing rituximab using host cells in Experimental Example 2 through Western blot. It is shown.
  • FIG. 5 is a graph showing the change in the expression level of the heavy chain of the rituximab antibody over time after the addition of OSMI-1 upon expression of rituximab using host cells in Experimental Example 3.
  • FIG. 6 (a) shows the lysate of the host cell (CHO-RTX Lysate) in the case of adding thiamet-G (Thiamet G) and not adding it when expressing rituximab using the host cell in Experimental Example 4.
  • O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) binding degree of the various proteins of the rituximab antibody isolated and purified therefrom was determined by the O-linked N-acetylglucosamine specific antibody ( It shows the results of the analysis through Western blot using RL2).
  • FIG. 6 (b) shows the results of comparing the amounts of rituximab antibodies used in the 3rd and 4th in FIG. 6 (a) through Western blot using human immunoglobulin-specific antibodies.
  • FIG. 7 shows the lysate (Lysate) of the host cell in the case of adding thiamet-G (Thiamet G) when adding rituximab using the host cell in Experimental Example 5 and without adding it, and Reduction conditions of the binding degree of O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) in the isolated and purified rituximab antibody using O-linked N-acetylglucosamine specific antibody (RL2) The results are analyzed through Western blot.
  • O-GlcNAc O-linked N-acetylglucosamine
  • FIG. 7 (b) shows the lysate (Lysate) of the host cell in the case where Tiamet-G (Thiamet G) was added and not added during the expression of Rituximab using the host cell in Experimental Example 5, and The degree of binding of the O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) in the isolated and purified rituximab antibody was determined using a non-O-linked N-acetylglucosamine specific antibody (RL2). It shows the results of the analysis by Western blot under reducing conditions.
  • RL2 non-O-linked N-acetylglucosamine specific antibody
  • FIG. 8 shows the lysate (Lysate) of the host cell and the separation and purification of the host cell in the case of adding Tiamet-G (Thiamet G) when adding rituximab using the host cell in Experimental Example 6 and without adding it.
  • the rituximab antibody shows the results of analyzing the degree of binding of O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) using metabolic labeling.
  • FIG. 9 shows O-GlcNAc in the light chain of the rituximab antibody when Tiamet-G is added when expressing rituximab using host cells through LC-MS / MS analysis in Experimental Example 7. It shows the position of a serine residue.
  • FIG. 10 shows O-GlcNAc in the light chain of the rituximab antibody when Tiamet-G is added upon expression of rituximab using host cells through LC-MS / MS analysis in Experimental Example 7. It shows the position of a serine residue.
  • FIG. 11 shows O-GlcNAc in the light chain of the rituximab antibody when Tiamet-G (Thiamet G) is added during expression of rituximab using a host cell through the Epson Program (OGAP) in Experimental Example 8. It shows the position of the serine residue predicted to be.
  • Tiamet-G Thiamet G
  • OGAP Epson Program
  • FIG. 12 (a) shows site-directed mutagenesis of a 7th, 12th and 14th serine residue to alanine from the 5 'end of the light chain variable region of rituximab using host cells in Experimental Example 9.
  • Tiamet-G Thiamet G
  • FIG. 12 (b) shows site-directed mutagenesis of 26th and 62th serine residues to alanine from the 5 'end of the light chain variable region of rituximab using host cells in Experimental Example 9.
  • thiamet-G Thiamet G
  • FIG. 13 is a ritux in which site-directed mutagenesis is induced by alanine in the 7th, 12th, and 14th serine residues from the 5 'end of the light chain variable region of rituximab in Example 10 using a host cell. It shows the results of analyzing the change in the expression level of the heavy and light chains of the rituximab antibody in the case of adding Thiamet-G (Thiamet G) when expressing the Shimab antibody through Western blot.
  • Thiamet-G Thiamet G
  • FIG. 14 shows the binding affinity of the rituximab antibody to the antigen obtained in the case of adding thiamet-G (Thiamet G) and non-addition when expressing rituximab using host cells in Experimental Example 11. The results are graphed.
  • FIG. 16 is an analysis of antibody-dependent cell-mediated toxicity of rituximab antibody obtained in the case of adding thiamet-G (Thiamet G) and non-addition when expressing rituximab using host cells in Experimental Example 11. The results are graphed.
  • FIG. 17 (b) shows the results of comparing the amounts of the rituximab antibodies used in the first and second in FIG. 17 (a) through Western blot using human immunoglobulin-specific antibodies.
  • FIG. 18 shows the O in the light chain of the rituximab antibody in the case where Tiamet-G (TMG) was added and non-added when expressing rituximab using host cells through LC-MS / MS analysis in Experimental Example 12 -It shows the change in the degree of binding of GalNAc.
  • RTX rituximab
  • NAV nivolumab
  • PEMB pembromab
  • FIG. 21 shows the results of comparing the light chain sequences of Rituximab (RTX), Nivolumab (NIV), and Pembromab (PEMB) in Experimental Example 13.
  • Figure 22 shows the heavy chain and light chain of each antibody after the addition of thiamet-G (Tg) upon expression of rituximab (RTX), nivolumab (NIV) and pembromab (PEMB) using host cells in Experimental Example 14. It shows the results of analyzing the change in expression level through Western blot.
  • one or more hydroxyamino acids contained in a light chain is related to an antibody glycosylated.
  • the hydroxyamino acid to be glycosylated is an amino acid having a hydroxyl group in the molecule, and may be serine (Tre), threonine (Thr) or tyrosine (Tyr), preferably serine ( Ser) or threonine (Thr) residue.
  • the antibody is at least one of the 7th, 12th, 14th, 26th, 51st, 55th, 62th, 101st, 155th and 181th from the 5 'end of the light chain, preferably the light chain variable region.
  • One may include a hydroxyamino acid residue.
  • the amino acid position numbering may be due to Kabat's EU index, but is not limited thereto.
  • the antibody may be one comprising a hydroxyamino acid residue in at least one of the 7th, 12th and 14th from the 5 'end of the light chain, preferably the light chain variable region.
  • the antibody may be an anti-CD20 antibody or an anti-PD-1 antibody, but is not limited thereto.
  • the anti-CD20 antibody may be a type I anti-CD20 antibody, for example, Rituximab, HI47 IgG3 (ECACC, hybridoma), 2C6 IgG1 (International Patent Application Publication No. 2005/103081 2F2 IgG1 (disclosed in International Patent Application Publication No. 2004/035607 and International Patent Application Publication No. 2005/103081) or 2H7 IgG1 (disclosed in International Patent Application Publication No. 2004/056312) Included, but may preferably be Rituximab.
  • the anti-PD-L1 antibody is Nivolumab, Pembrolizumab, Pidilizumab, AMP 514 (Amplimmune), PDR-001 (Novartis), MEDI-0690 (also AMP (Also known as -514) (MedImmune LLC), SHR-1210 (Incyte Corp.), REGN-2810 (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), PF-06801591 (Pfizer), TSR-042 (also known as ANB011) (Tesaro, Inc.), BGB-A317 (BeiGene, Ltd.) or JS001 (Shanghai Junshi Bioscience Co., Ltd.), but may preferably be nivolumab, pembrolizumab or pidilizumab.
  • the antibody of the present invention comprises at least one of the 7th, 12th, 14th, 26th, 51st, 55th, 62th, 101st, 155th and 181th hydrides from the 5 'end of the light chain of rituximab.
  • Roxyamino acid residues more preferably at least one serine (Ser) residue from the 5 'end of the light chain variable region of rituximab from the 5' end, more preferably the At least one serine (Ser) residue of the 7th, 12th, and 14th from the 5 'end of the light chain variable region of the antibody may be glycosylated.
  • At least one serine (Ser) residue of the 7th, 12th, and 14th from the 5 'end of the light chain variable region may be glycosylated.
  • At least one serine (Ser) residue of the 7th, 12th, and 14th from the 5 'end of the light chain variable region in the pembrolizumab may be glycosylated.
  • At least one serine (Ser) residue of the 7th, 12th, and 14th from the 5 'end of the light chain variable region in the pidilizumab may be glycosylated.
  • the sequence of rituximab can be referenced from Drugbank (https://www.drugbank.ca).
  • the heavy chain (SEQ ID NO: 5) and light chain (SEQ ID NO: 6) of Rituximab were prepared through DNA synthesis. However, the constant region of the heavy chain was obtained through PCR from healthy donor DNA.
  • the antibody clone DNA and lentiviral construct DNA prepared in 1. of Example 1 above were cultured in HEK293T cells by co-transfection. After incubation overnight, the cell culture was changed. After 24 hours, the cell culture solution was separated, centrifuged at 4 ° C for 1000 rcf for 3 minutes, and only the supernatant was transferred to a clean tube to remove cells mixed in the cell culture solution. It was stored at -70 ° C.
  • CHO-K1 cells were cultured after inoculation at 1 x 10 5 cells / well in a 12-well plate. The next day, the cells were treated with a culture medium containing lentivirus and fresh culture medium 1: 1 and cultured for 24 hours. After the culture medium was newly replaced, puromycin and blasticidin were treated with 10 ug / ml, respectively, and selected. After 72 hours, sufficient cells were obtained by proliferating the remaining cells. After the culture of the cells thus obtained was replaced with serum-free medium (EX-CELL CD CHO Serum-Free Medium for CHO Cells, Chemicallu Defined, Sigma, 14360C), Thiamet-G (Sigma cat # SML0244) reagent was added to 30 uM. Concentration.
  • serum-free medium EX-CELL CD CHO Serum-Free Medium for CHO Cells, Chemicallu Defined, Sigma, 14360C
  • Thiamet-G Sigma cat # SML0244
  • the protein containing antibody was treated with A protein agarose beads (Protein A agarose bead, Pierce Protein A Agarose, thermos, QE218104) for 4 hours at 4 ° C.
  • the supernatant was removed by centrifugation and washed 5 times with washing buffer (0.1 M NaPO 4 , 0.15 M NaCl, pH 7.4).
  • washing buffer 0.1 M NaPO 4 , 0.15 M NaCl, pH 7.4
  • the beads from which the supernatant was removed were eluted 5 times with a bead volume using an elution buffer (0.2 M glycine, pH 3).
  • the eluted portions were collected in centrifugal filter units (Amicon Ultra-4, Millipore, # UFC800324) and the buffer was changed with PBS three times for 1 hour at 13200 rpm. Then, the total protein was quantified by the Bradford method.
  • Example 1 In order to confirm the change in the production of the antibody during the O-linked glycosylation of rituximab through Thiamet-G in Example 1, 3. Purified antibody with and without the addition of Thiamet-G during the production of the antibody The production of was measured. As shown in FIG. 1, when the rituximab was O-linked and glycosylated by adding Thiamet-G, it was confirmed that the production of the antibody was increased by approximately 2 times compared to the case where no treatment was performed.
  • Example 1 when the O-linked glycosylation of rituximab through Thiamet-G was confirmed to increase the production of the antibody, the following experiment was performed to confirm the change in the production of the antibody over time after the addition of Thiamet-G. was performed. Specifically, in Example 1, 3. When the antibody was prepared, Thiamet-G was added at a concentration of 30 uM, and after 24 hours, 48 hours, and 72 hours, the cell culture solution was recovered. The same amount of the recovered culture was electrophoresed on an acrylamide gel to separate proteins by size, and then subjected to nitrocellulose membrane (NC membrane).
  • N membrane nitrocellulose membrane
  • a portion other than the protein electrically transferred to the nitrocellulose membrane is blocked with TBS-T containing 5% non-fat milk and 0.1% Tween 20 for 1 hour at room temperature, and anti-human- HRP (Anti-human-HRP) and anti-mouse-HRP (Anti-Mouse-HRP) antibodies were incubated at room temperature for 30 minutes, and then washed three times with TBS-T for 10 minutes.
  • the ECL solution was used to photosensitize the X-ray film (FIG. 2), and the production of heavy and light chains according to each time was analyzed (FIG. 3). As a result, when Thiamet-G was treated, it was confirmed that as time passed, the production of heavy and light chains of the antibody significantly increased.
  • the total amount of the separated rituximab was matched and electrophoresed on an acrylamide gel to separate the proteins by size, and then subjected to nitrocellulose membrane.
  • a portion other than the protein electrically transferred to the nitrocellulose membrane was blocked with TBS-T containing 5% skim milk and 0.1% Tween 20 for 1 hour at room temperature, and O-linked N-acetylglucosamine (O-linked) N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) specific antibody (RL2-HRP) was incubated at room temperature for 1 hour, and then washed three times with TBS-T for 10 minutes.
  • the ECL solution was used to photosensitive the X-ray film (Fig. 6 (a)).
  • O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) is more bound as shown in FIG. 6 (a) despite the same amount of rituximab. Indicates. That is, when Thiamet-G was treated, it was confirmed that the binding level of O-GlcNAc was increased in rituximab and thus the expression level was also increased.
  • Rituximab stable cell lines were constructed with a lenti-virus system.
  • the cell line was harvested after 72 hours incubation in serum free RPMI media treated with Thiamet-G (TMG) 50uM, and cell lysates were prepared.
  • TMG Thiamet-G
  • the cell line was incubated in a 30 ° C incubator for 2 weeks in serum-free RPMI medium treated with Thiamet-G 50uM, and then rituximab was isolated with Protein A.
  • 1 ⁇ g of the isolated antibody was subjected to western blot under reducing and non-reducing conditions to perform immunoblotting with anti-O-GlcNAc antibody (RL2-HRP), and SDS gel After running on, coomassie blue staining was performed. The results are shown in Fig.
  • Rituximab stable cell lines were constructed with a lenti-virus system.
  • Thiamet-G 50uM and Ac4GlcNAz (azido sugar) 50uM were treated in the cell line, and after incubation for 4 days, rituximab was isolated with protein A.
  • the separated rituximab was subjected to western blotting after phosphine-biotin and 16-hour click reaction at room temperature, followed by immunoblotting with streptabidin-HRP to obtain rituximab.
  • O-GlcNAc was metabolic labeling.
  • the peptide solution was desalted by passing through a reversed-phase column (Gobom et al., 1999) prior to mass spectrometric to be performed.
  • LC-MS / MS analysis analysis was performed with a Nano ACQUITY UPLC and LTQ-orbitrap-mass spectrometer (Thermo Electron, San Jose, CA) .
  • the column was BEH C18 1.7 ⁇ m, 100 ⁇ m ⁇ 100 mm column (Waters, Milford , MA, USA).
  • SEQUEST software Thermo Quest, San Jose, CA, USA
  • a peak list was made with the MASCOT program (Matrix Science Ltd., London, UK) (Fig.
  • N-acetylglucosamine was added to the serine residues located at the 7th, 12th, 14th and 181th positions from the 5 'end of the light chain of the antibody when treated with Thiamet-G compared to the untreated case. It can be seen that the bond is O-linked glycosylated.
  • Figure 11 is a result of including a signal peptide (signal peptide) consisting of 22 amino acids in the light chain of rituximab.
  • signal peptide signal peptide
  • N-acetylglucosamine binds to the serine residues located at the 26th and 62nd positions from the 5 'end of the light chain of Rituximab and is O-linked glycosylated.
  • Antibodies were prepared in the same manner as in Example 1, but the 7th, 12th and 14th serine residues confirmed by O-binding N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) binding during mass spectrometry in Experimental Example 5 above. After inducing site-directed mutagenesis with alanine, the 26th and 62th serine residues predicted to bind with O-GlcNAc were analyzed for the production of antibodies. In detail, wild type and mutants of rituximab heavy and light chains were transformed 1: 1 in HEK293T cells and cultured, and other conditions were the same as in Example 1.
  • the cell culture was removed and washed 3 times with PBS, followed by lysis buffer (150 mM NaCl, 5 mM NaEDTA, 10% glycerol, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 % Triton X-100, and proteinase inhibitors (Complete, Roche Applied Science) were added, and the cells were collected and transferred to a clean tube. Subsequently, cell lysis using sonication was performed and centrifuged at 4200 ° C for 13200 rpm for 10 minutes to transfer only the supernatant to a clean tube, and then cell lysate was obtained to obtain total protein by the Bradford method. It was quantified.
  • lysis buffer 150 mM NaCl, 5 mM NaEDTA, 10% glycerol, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 % Triton X-100, and proteinase inhibitors (Complete, Roche Applied Science) were added, and the cells were
  • the total amount of protein was adjusted and electrophoresis was performed on an acrylamide gel to separate the proteins by size, and then transferred to a nitrocellulose membrane.
  • a portion other than the protein electrically transferred to the nitrocellulose membrane was blocked with TBS-T containing 5% skim milk and 0.1% Tween 20 for 1 hour at room temperature, and anti-human-HRP and anti-mouse- After incubating at room temperature for 30 minutes using HRP antibody, the cells were washed three times with TBS-T for 10 minutes each.
  • the ECL solution was used to photosensitive the X-ray film (FIG. 12).
  • Example 1 in order to confirm that there is a change in the titer of the antibody by O-linking glycosylation of the light chain of rituximab, Ramos cells were suspended in 50 ul of PBS with 1x10 5 cells per tube and produced by each condition.
  • Obinutuzumab (OBI) which is known to bind to the same target as simap or rituximab, was treated with 0.1, 0.3, 1, 3, 10 ug / ml and incubated at 4 ° C. for 30 minutes.
  • Ramos cells were treated with Calcein-AM 5 uM in Serum free RPMI and then incubated at 37 ° C for 30 minutes. After dispensing the stained Ramos cells in an amount of 1 x 10 5 cells / well, rituximab or obinutuzumab or human IgG produced for each condition is 0.1, 0.3, 1, 3, 10 ug Treatment was performed at an amount of / ml and incubated at 37 ° C for 10 minutes. To this, rabbit complement MA (Cedarlane, cat # CL3221) was added in a 1: 4 ratio and cultured for 2 hours in a 37 ° C., CO 2 incubator.
  • rabbit complement MA (Cedarlane, cat # CL3221) was added in a 1: 4 ratio and cultured for 2 hours in a 37 ° C., CO 2 incubator.
  • the cells were then counted with a FACSVerse (BD Biosciences) machine for a total of 10,000 cells and analyzed with FlowJo software (FIG. 15). As a result, it was confirmed that the rituximab treated with thiamet-G and O-linked glycosylation had no difference in rituximab and complement-dependent cytotoxicity obtained without any treatment.
  • Ramos cells were treated with calcein-AM at 37 ° C. in a CO 2 incubator for 30 minutes, and then the cells were centrifuged.
  • Ramos cells were inoculated with 1 x 10 5 cells per tube, and then treated with rituximab or OBI or human IgG produced for each condition in an amount of 0.1, 0.3, 1, 3, 10 ug / ml. After incubation at 37 °C for 10 minutes. All supernatant was removed and resuspended in 100 ⁇ l of medium.
  • PBMC poly basic mononuclear cell isolated from human blood was added at a ratio of 1:25 and cultured at 37 ° C. in a CO 2 incubator for 4 hours.
  • the cells were then counted with a FACSVerse (BD Biosciences) machine, and a total of 10,000 cells were analyzed with FlowJo software (FIG. 16). As a result, it was confirmed that there was no difference in the rituximab obtained without any treatment in the rituximab treated with Thiamet-G and the antibody-dependent cell hemolysis rate obtained without any treatment.
  • the total amount of rituximab obtained in Example 1 was matched, placed in a non-reducing sample buffer, electrophoresed on an acrylamide gel, and then transferred to a nitrocellulose membrane. After blocking the nitrocellulose membrane with PBS-T (Tween 0.5%) for 1 hour, O-GalNAc binding lectin was added and incubated at room temperature for 1 hour. After washing three times with PBS-T for 10 minutes three times, Streptavidin-HRP was incubated at room temperature for 30 minutes. After washing three times for 10 minutes each with PBS-T, the ECL solution was used to photosensitive the X-ray film.
  • the anti-human-HRP and anti-mouse-HRP antibodies were incubated for 30 minutes at room temperature and then washed three times with TBS-T three times to confirm that the amount of rituximab was the same.
  • the ECL solution was used to photosensitize the X-ray film (FIG. 17).
  • the rituximab without Thiamet-G treatment was O-linked N-acetylgalactosamine (Fig. 17 (a)) despite the same amount of rituximab antibody based on the results of Fig. 17 (b). O-GalNAc).
  • Cell lines expressing rituximab, nivolumab, and pembrolizumab, respectively, were cultured in 60 mm plates with 1 ⁇ 10 6 cell numbers. The next day, Thiamet-G was treated with 50 uM in 3 ml of CHO medium, and cultured at 30 ° C for 2 weeks, followed by harvesting of the medium. After the same amount of medium was subjected to electrophoresis, proteins were separated by size, and then subjected to PVDF membrane.
  • TBS-T containing 5% by weight of non-fat milk and 0.1% by weight of Tween 20 for 1 hour at room temperature
  • anti-human- HRP Anti-human-HRP
  • Anti-mouse-HRP Anti-Mouse-HRP
  • RITUXIMAB is a chimeric antibody combined with human and mouse
  • the ECL solution was used to photosensitivity to the X-ray film (FIG. 19), and the change in production according to Thiamet-G treatment for each antibody was measured (FIG. 20).
  • CHO cell lines expressing each of rituximab, nivolumab, and pembrolizumab were cultured in 60 mm plates with 1 ⁇ 10 6 cell numbers. The next day, 3 ml of CHO medium was treated with 50 uM Thiamet-G and cultured at 30 ° C. for 7 days before harvesting the medium. After the same amount of medium was subjected to electrophoresis, proteins were separated by size, and then subjected to PVDF membrane.
  • a portion other than the protein electrically transferred to the membrane is blocked with TBS-T containing 5% by weight of non-fat milk and 0.1% by weight of Tween 20 for 1 hour at room temperature, and anti-human- HRP (Anti-human-HRP) and anti-mouse-HRP (Anti-Mouse-HRP) (RITUXIMAB is a chimeric antibody combined with human and mouse) antibodies were incubated for 30 minutes at a ratio of 1: 1 or 1: 2. After washing with TBS-T three times for 10 minutes each. The ECL solution was used to photosensitize the X-ray film (FIGS. 22 and 23). As a result, it was confirmed that when Thiamet-G was treated in expressing all of the rituximab, nivolumab, and pembrolizumab antibodies, the production amount was significantly increased.
  • Rituximab antibody was prepared in the same manner as in Example 1, but Thiamet-G was treated with 0, 30 uM or 50 uM for 72 hours. After the same amount of medium was subjected to electrophoresis, proteins were separated by size, and then subjected to PVDF membrane. A portion other than the protein electrically transferred to the membrane is blocked with TBS-T containing 5% by weight of non-fat milk and 0.1% by weight of Tween 20 for 1 hour at room temperature, and anti-human- HRP (Anti-human-HRP) and anti-mouse-HRP (Anti-Mouse-HRP) (RITUXIMAB is a chimeric antibody combined with human and mouse) antibodies were incubated for 30 minutes at a ratio of 1: 1 or 1: 2.
  • the present invention relates to an antibody having improved productivity and a method for manufacturing the same.

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Abstract

본 발명은 생산성이 향상된 항체의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항체의 경쇄에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산을 O-글리코실화(O-linked glycosylation)함으로써 상기 항체의 역가는 유지하되 생산성을 현저히 향상시킬 수 있는 방법에 관한 것입니다.

Description

생산성이 향상된 항체 및 이의 제조방법
본 발명은 생산성이 향상된 항체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
CD20 항원 (인간 B-림프구-제한된 분화 항원, Bp35로도 불림)은 분자량이 대략 35 kD인 프리-B 및 성숙한 B 림프구 상에 위치하는 소수성 횡막 단백질이다 (Valentine et al. J. Biol. Chem. 264 (19): 11282-11287 (1989); 및 Einfeld et al. EMBO J. 7 (3): 711-717 (1988)). 상기 항원은 또한 B 세포 비-호지킨 림프종 (NHL)의 90% 초과에서 발현되나 (Anderson et al. Blood 63 (6): 1424-1433 (1984)), 조혈 줄기 세포, 예비-B 세포, 정상 형질 세포 또는 기타 정상 조직에서는 발견되지 않는다 (Tedder et al. J. Immunol. 135 (2): 973-979 (1985)). CD20은 세포 주기 개시 및 분화를 위한 활성화 과정에서 초기 단계(들)을 조절하고 (Tedder et al., 상기 문헌), 가능하게는 칼슘 이온 채널로서 작용하는 것으로 생각된다 (Tedder et al. J. Cell. Biochem. 14D: 195 (1990)).
B 세포 림프종에서 CD20이 발현되어, 이 항원은 상기 림프종을 치료하는데 유용한 치료적 표적이 되어 왔다. 미국에서 300,000명 이상이 B-세포 NHL을 앓고 있으며, 매년 56,000건 이상의 새로운 경우가 진단된다. 예를 들어, 인간 CD20 항원에 대한 유전자 조작된 키메라 뮤린/인간 모노클로날 항체인 리툭시맵 (리툭산 (RITUXAN)®) 항체 (제넨테크 인크. (Genentech, Inc.)로부터 구입가능함, South San Francisco, California, U.S.)는 재발성 또는 불응성 저등급 또는 난포성 CD20 양성, B 세포 비-호지킨 림프종을 앓고 있는 환자의 치료를 위해 사용된다. 리툭시맵은 1998년 4월 9일에 허여된 미국 특허 제5,736,137호 (Anderson et al.), 및 미국 특허 제5,776,456호에서는 "C2B8"로 언급된 항체이다. 시험관 내에서 메카니즘 연구를 수행한 결과, 리툭산®이 인간 보체와 결합하여 림프구 B 세포주를 보체-의존성 세포 독성 (CDC)을 통해 융해한다는 것을 입증하였다 (Reff at al, Blood 83 (2): 435-445 (1994)). 추가로, 이는 항체-의존성 세포매개 세포독성 (ADCC)에 대한 검정법에서 유의한 활성을 가진다. 생체 전임상 연구는 리툭산®이 아마도 보체 및 세포로 매개된 방법을 통해 시노몰거스 (Cynomolgus) 원숭이의 말초 혈액, 림프절 및 골수로부터 B 세포를 고갈한다는 것을 보여주었다 (Reff et al. Blood 83 (2): 435-445 (1994)).
본 발명의 일 목적은 글리코실화(glycosylation)를 통해 다양한 항체의 생산성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 경쇄에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산(hydroxyamino acid)이 글리코실화된 항체에 관한 것이다.
항체
본 발명에서 상기 항체는 경쇄, 바람직하게는 경쇄 가변 영역에 하나 이상의 하이드록시아미노산(hydroxyamino acid)을 포함하는 것이라면, 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 항체에 있어서 글리코실화되는 하이드록시아미노산은 분자 내에 수산기를 갖는 아미노산으로, 세린(Serine, Ser), 트레오닌(Threonine, Thr) 또는 티로신(Tyrosine, Tyr)일 수 있으나, 바람직하게는 세린(Ser)이나 트레오닌(Thr) 잔기일 수 있다.
본 발명에서 상기 항체는 경쇄, 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째, 51번째, 55번째, 62번째, 101번째, 155번째 및 181번째 중 적어도 하나에 하이드록시아미노산 잔기를 포함하는 것일 수 있다. 이때 상기 아미노산 위치 넘버링(numbering)은 카밧(Kabat)의 EU 인덱스(index)에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 항체는 경쇄, 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나에 하이드록시아미노산 잔기를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 항체는 항-CD20 항체 또는 항-PD-1 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "항-CD20 항체"는 CD20 항원에 특이적으로 결합하는 항체이다. 항-CD20 항체의 CD20 항원으로의 결합 특성 및 생물학적 활성에 따라서 항-CD20 항체의 두 유형(유형 I 및 유형 II 항-CD20 항체)은 문헌[Cragg, M.S., et al., Blood 103 (2004) 2738-2743]; 및 문헌[Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052]에 따라 구분될 수 있다.
본 발명에서 상기 항-CD20 항체는 유형 I 항-CD20 항체일 수 있고, 그 예로는 리툭시맵(Rituximab), HI47 IgG3(ECACC, 하이브리도마), 2C6 IgG1(국제 특허출원공개 제2005/103081호에 개시됨), 2F2 IgG1(국제 특허출원공개 제2004/035607호 및 국제 특허출원공개 제2005/103081호에 개시됨) 또는 2H7 IgG1(국제 특허출원공개 제2004/056312호에 개시됨)을 포함하지만, 바람직하게는 리툭시맵(Rituximab)일 수 있다.
본 발명에서 상기 "리툭시맵(Rituximab)" 항체는 인간 CD20 항원에 대해 유도된, 유전자 조작된 키메라 인간 감마 1 뮤린 불변 영역 함유 단클론성 항체이다. 상기 키메라 항체는 서열번호 1로 표시되는 인간 면역글로불린 감마 1 중쇄 불변 영역(human immunoglobulin G1 (IgG1) heavy chain constant region); 서열번호 2로 표시되는 인간 카파 경쇄 불변 영역(human kappa light chain constant region); 서열번호 3으로 표시되는 생쥐 유래 중쇄 가변 영역(murine heavy chain variable region) 및 서열번호 4로 표시되는 생쥐 유래 경쇄 가변 영역(murine light chain variable region)을 포함할 수 있으며, 즉 서열번호 5로 표시되는 중쇄 2개와 서열번호 6으로 표시되는 경쇄 2개로 이루어질 수 있다. 상기 리툭시맵은 EP2000149B1 호(앤더슨 등, 예를 들면, 도 4 및 5 참조)에서 "C2B8"이란 명칭으로 확인된다. 리툭시맵은 재발 또는 굴절 저등급 또는 여포성, CD20 양성, B 세포 비-호지킨 림프종을 갖는 환자의 치료에 승인된다. 작용 연구의 시험관 내 메카니즘은 리툭시맵이 인간 보체-의존성 세포독성(CDC)을 나타냄을 밝혔다(문헌[Reff et al., Blood 83(2):435-445 (1994)]). 또한, 리툭시맵은 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 측정하는 분석에서 상당한 활성을 나타낸다.
본 발명에서 상기 "항-PD-L1 항체"는 항체가 PD-L1를 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도를 가지고 PD-L1에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. PD-L1 (프로그램된 사멸 리간드 1)은 또한 본 분야에서 "프로그램된 세포 사멸 1 리간드 1", "PDCD1LG1", "CD274", "B7-H" 및 "PDL1" 로 지칭된다. 예시적 인간 PD-L1는 UniProtKB/Swiss-Prot 수탁번호 Q9NZQ7.1에 나타난다.
본 발명에서 상기 항-PD-L1 항체는 니볼루맵(Nivolumab), 펨브롤리주맵(Pembrolizumab), 피딜리주맵(pidilizumab), AMP 514(Amplimmune), PDR-001(Novartis), MEDI-0690(또한 AMP-514로도 공지됨)(MedImmune LLC), SHR-1210(Incyte Corp.), REGN-2810(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), PF-06801591(Pfizer), TSR-042(또한, ANB011으로도 공지됨)(Tesaro, Inc.), BGB-A317(BeiGene, Ltd.) 또는 JS001(Shanghai Junshi Bioscience Co., Ltd.)일 수 있으나, 바람직하게는 니볼루맵, 펨브롤리주맵 또는 피딜리주맵일 수 있다.
본 발명에서 상기 "니볼루맵 (상표명 OPDIVO®; 앞서 표시된 5C4, BMS-936558, MDX-1106, 또는 ONO-4538)"은 PD-1 리간드 (PD-L1 및 PD-L2)와의 상호작용을 선택적으로 방지하며, 그렇게 함으로써 항종양 T-세포 기능의 하향 조절을 차단하는 완전 인간화된 IgG4 (S228P) PD-1 항체이다 (미국 특허 번호 8,008,449; WO2006/121168; 문헌[Wang 등, Cancer Immunol Res. 2:846-56 (2014); Topalian, S.L. 등, N Engl J Med 366:2443-2454 (2012); Topalian, S.L. 등, Current Opinion in Immunology 24:207-212 (2012);Topalian, S.L. 등, J Clin Oncol 31 (suppl):3002(2013)]). 상기 니볼루맵 항체는 서열번호 7로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 또는 서열번호 9로 표시되는 중쇄와 서열번호 10으로 표시되는 경쇄로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 상기 "펨브롤리주맵 (상표명 KEYTRUDA®; 람브롤리주맙 및 MK-3475로도 공지됨)"은 PD-1에 대해 유도된 것으로, S228P Fc 돌연변이를 포함하는 인간화된 단클론성 IgG4 카파 항체이다. 문헌[Hamid, O. 등, N Engl J Med 369:134-144 (2013)]. 상기 펨브롤리주맵 항체는 서열번호 11로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 또는 서열번호 13으로 표시되는 중쇄와 서열번호 14로 표시되는 경쇄로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 상기 "피딜리주맵 (또한 CT-011 및 MDV9300로도 공지됨)"은 PD-1에 결합하는 인간화된 IgG1 카파 단클론성 항체이다. 피딜리주맵은 암 및 감염성 질환의 치료를 위해 메디베이션에 의해 개발 중에 있다. 피딜리주맵은 예를 들어 미국 특허 제8,686,119 B2호, WO 2013/014668 A1, WO2009/101611, 문헌[Berger, R. 등, Clinical Cancer Research 14:3044-3051 (2008), and Armand, P. 등, J Clin Oncol 31:4199-4206 (2013)]에 기재되어 있다. 상기 피딜리주맵 항체는 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16으로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 또는 서열번호 17로 표시되는 중쇄와 서열번호 18로 표시되는 경쇄로 이루어질 수 있다.
글리코실화된 항체
본 발명의 항체는 경쇄, 바람직하게는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 하이드록시아미노산으로 세린(Ser), 트레오닌(Thr) 또는 티로신(Tyr) 잔기가 글리코실화된 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 세린(Ser)이나 트레오닌(Thr) 잔기가 글리코실화된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째, 51번째, 55번째, 62번째, 101번째, 155번째 및 181번째 중 적어도 하나의 하이드록시아미노산 잔기, 바람직하게는 상기 항체의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째 및 62번째 중 적어도 하나의 하이드록시아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 상기 항체의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나의 하이드록시아미노산 잔기가 글리코실화된 것일 수 있다. 이때 상기 아미노산 위치 넘버링(numbering)은 카밧(Kabat)의 EU 인덱스(index)에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항체는 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나, 바람직하게는 7번째, 12번째 및 14번째에 하이드록시아미노산 잔기로 예를 들면 세린(Ser), 트레오닌(Thr) 또는 티로신(Tyr) 잔기, 바람직하게는 세린(Ser)이나 트레오닌(Thr) 잔기, 보다 바람직하게는 세린(Ser) 잔기가 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 항-CD20 항체 또는 항-PD-1 항체의 경쇄에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산, 바람직하게는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 하이드록시아미노산, 보다 바람직하게는 경쇄 가변 영역에 하나 이상의 세린(Ser)이나 트레오닌(Thr) 잔기가 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 리툭시맵(Rituximab)의 경쇄에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산, 바람직하게는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 하이드록시아미노산, 보다 바람직하게는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 세린(Ser)이나 트레오닌(Thr) 잔기가 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 리툭시맵에 있어서 서열번호 6으로 표시되는 경쇄, 바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 하이드록시아미노산(hydroxyamino acid)이 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 리툭시맵의 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째, 51번째, 55번째, 62번째, 101번째, 155번째 및 181번째 중 적어도 하나의 하이드록시아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 상기 리툭시맵의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째 및 62번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기, 보다 바람직하게는 상기 항체의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기가 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 니볼루맵(Nivolumab)의 경쇄에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산, 바람직하게는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 하이드록시아미노산, 보다 바람직하게는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 세린(Ser)이나 트레오닌(Thr) 잔기가 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 니볼루맵에 있어서 서열번호 10으로 표시되는 경쇄, 바람직하게는 서열번호 8로 표시되는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 하이드록시아미노산이 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 니볼루맵에 있어서, 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기가 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 펨브롤리주맵(Pembrolizumab)의 경쇄에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산, 바람직하게는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 하이드록시아미노산, 보다 바람직하게는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 세린(Ser)이나 트레오닌(Thr) 잔기가 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 펨브롤리주맵에 있어서 서열번호 14로 표시되는 경쇄, 바람직하게는 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 하이드록시아미노산이 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 펨브롤리주맵에 있어서 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기가 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 피딜리주맵(Pidilizumab)의 경쇄에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산, 바람직하게는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 하이드록시아미노산, 보다 바람직하게는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 세린(Ser)이나 트레오닌(Thr) 잔기가 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 피딜리주맵에 있어서 서열번호 18로 표시되는 경쇄, 바람직하게는 서열번호 16으로 표시되는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 하이드록시아미노산이 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 피딜리주맵에 있어서 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기가 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 글리코실화(glycosylation)는 O-결합 글리코실화(O-linked glycosylation)인 것이 바람직하고, 본 발명에서 상기 항-CD20 항체 또는 항-PD-L1 항체는 경쇄, 또는 경쇄 가변 영역에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산에 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)이 결합된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 O-결합 글리코실화 시 O-GlcNAc 전이효소(O-GlcNAc transferase; OGT)를 이용하여 상기 항-CD20 항체 또는 항-PD-L1 항체의 경쇄, 또는 경쇄 가변 영역 내 하이드록시아미노산에 N-아세틸글루코사민을 결합시킬 수 있다. 여기서 상기 O-GlcNAc 전이효소의 계통명(systematic name)은 "UDP-N-아세틸-D-글루코사민:프로테인-O-베타-N-아세틸-D-글루코사미닐 전이효소(UDP-N-acetyl-D-glucosamine:protein-O-beta-N-acetyl-D-glucosaminyl transferase)"라고 불리우며, 인간에서 상기 효소는 OGT 유전자에 의해 코딩된다.
본 발명에서 상기 O-결합 글리코실화는 O-GlcNAcase 억제제(O-GlcNAcase inhibitor; OGA inhibitor)를 이용하여 이루어질 수 있는 것이다. 여기서 상기 O-GlcNAcase 억제제는 티아멧-G (Thiamet-G), 스트렙토조토신(streptozotocin; STZ), PUGNAc, NAG-티아졸린(NAG-thiazoline), NButGT, (2R,3S)-이미노시클리톨((2R,3S)-iminocyclitol), PUGNAc-이미다졸 하이브리드(PUGNAc-imidazole hybrid) 및 GlcNAc스타틴 C(GlcNAcstatin C)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있지만, 바람직하게는 티아멧-G일 수 있으며, 보다 바람직하게는 각 항체를 생산하는 숙주세포에 상기 O-GlcNAcase 억제제를 추가하여 얻어질 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 항-CD20 항체 또는 항-PD-L1 항체의 경쇄 O-결합 글리코실화를 위하여, 상기 숙주 세포의 배양 시 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)의 글리코실 연결기를 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 항체의 경쇄에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산(hydroxyamino acid)을 O-결합 글리코실화(O-linked glycosylation)하는 단계를 포함하는, 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에서는 O-결합 글리코실화를 위하여 우선 항체를 준비하는 단계를 수행할 수 있다. 여기서, 상기 항체는 경쇄, 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 분자 내에 수산기를 갖는 아미노산인 하이드록시아미노산으로, 세린(Serine, Ser), 트레오닌(Threonine, Thr) 또는 티로신(Tyrosine, Tyr), 바람직하게는 세린(Ser)이나 트레오닌(Thr) 잔기를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 항체는 경쇄, 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째, 51번째, 55번째, 62번째, 101번째, 155번째 및 181번째 중 적어도 하나에 하이드록시아미노산 잔기를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 항체는 경쇄, 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나에 하이드록시아미노산 잔기를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 항체는 항-CD20 항체 또는 항-PD-1 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 항-CD20 항체는 유형 I 키메라 항-CD20 항체로, 예를 들면, 리툭시맵(Rituximab), HI47 IgG3(ECACC, 하이브리도마), 2C6 IgG1(국제 특허출원공개 제2005/103081호에 개시됨), 2F2 IgG1(국제 특허출원공개 제2004/035607호 및 국제 특허출원공개 제2005/103081호에 개시됨) 또는 2H7 IgG1(국제 특허출원공개 제2004/056312호에 개시됨)일 수 있지만, 바람직하게는 리툭시맵(Rituximab)일 수 있다.
본 발명에서 상기 리툭시맵(Rituximab)을 준비하기 위해서, 상기 리툭시맵을 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질 전환된 숙주 세포를 준비하고 배양할 수 있다. 일 실시형태에서, 서열번호 1로 표시되는 인간 면역글로불린 감마 1 중쇄 불변 영역(human immunoglobulin G1 (IgG1) heavy chain constant region); 서열번호 2로 표시되는 인간 카파 경쇄 불변 영역(human kappa light chain constant region); 서열번호 3으로 표시되는 생쥐 유래 중쇄 가변 영역(murine heavy chain variable region) 및 서열번호 4로 표시되는 생쥐 유래 경쇄 가변 영역(murine light chain variable region)을 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질 전환된 숙주 세포를 준비하고 배양할 수 있다. 다른 실시형태에서, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 및 서열번호 6으로 표시되는 경쇄를 코딩화하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질 전환된 숙주 세포를 준비하고 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기 항-PD-1 항체는 니볼루맵(Nivolumab), 펨브롤리주맵(Pembrolizumab), 피딜리주맵(Pidilizumab), AMP 514 (Amplimmune), PDR-001 (Novartis), MEDI-0690 (또한 AMP-514로도 공지됨) (MedImmune LLC), SHR-1210 (Incyte Corp.), REGN-2810 (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), PF-06801591 (Pfizer), TSR-042 (또한, ANB011으로도 공지됨)(Tesaro, Inc.), BGB-A317 (BeiGene, Ltd.) 또는 JS001 (Shanghai Junshi Bioscience Co., Ltd.)일 수 있으나, 바람직하게는 니볼루맵, 펨브롤리주맵 또는 피딜리주맵일 수 있다.
본 발명에서 상기 니볼루맵을 준비하기 위해서, 상기 니볼루맵을 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질 전환된 숙주 세포를 준비하고 배양할 수 있다. 일 실시형태에서, 서열번호 7로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8로 표시되는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질 전환된 숙주 세포를 준비하고 배양할 수 있다. 다른 실시형태에서, 서열번호 9로 표시되는 중쇄 및 서열번호 10으로 표시되는 경쇄를 코딩화하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질 전환된 숙주 세포를 준비하고 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기 펨브롤리주맵을 준비하기 위해서, 상기 펨브롤리주맵을 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질 전환된 숙주 세포를 준비하고 배양할 수 있다. 일 실시형태에서, 서열번호 11로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질 전환된 숙주 세포를 준비하고 배양할 수 있다. 다른 실시형태에서, 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 및 서열번호 14로 표시되는 경쇄를 코딩화하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질 전환된 숙주 세포를 준비하고 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기 피딜리주맵을 준비하기 위해서, 상기 피딜리주맵을 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질 전환된 숙주 세포를 준비하고 배양할 수 있다. 일 실시형태에서, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16으로 표시되는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질 전환된 숙주 세포를 준비하고 배양할 수 있다. 다른 실시형태에서, 서열번호 17로 표시되는 중쇄 및 서열번호 18로 표시되는 경쇄를 코딩화하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질 전환된 숙주 세포를 준비하고 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기 숙주 세포로는 포유류, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있으나, 바람직하게는 포유류 세포일 수 있다. 본 발명의 항체를 발현하기 위한 적합한 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(DHFR 선별 마커와 함께 사용된 dhfr(-) CHO 세포를 포함), NS0 골수종 세포, COS 세포, SP2 세포, 원숭이 신장 CV1, 인간 배아 신장 세포주 293, 새끼 햄스터 신장 세포(BHK), 생쥐 세르톨리 세포(TM4), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76), 인간 자궁경부암 세포(HELA), 개 신장 세포(MDC), 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3 A), 인간 폐 세포 (W138), 인간 간 세포 (Hep G2), 생쥐 유방암 세포 (MMT 060562), TRI 세포, MRC 5 세포 및 FS4 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 설치류로부터 유래될 수 있고, 보다 바람직하게는, 포유류 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게 세포는 CHO-K1 세포일 수 있고, 가장 바람직하게는 세포는 CHO-K1 세포로, 배양 배지로는 CHO-K1세포 성장에 적합한 무혈청 배지를 사용할 수 있고, 또는 Sigma #14360C (EX-CELL® CD CHO Serum-Free Medium for CHO Cells, Chemically Defined) 제품을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 숙주 세포는 재조합 단백질을 안정하게 제조할 수 있는 발현 벡터와 같은 적어도 하나의 재조합 핵산 분자로 형질 전환, 즉 유전자적으로 변형된 것일 수 있다. 본 발명의 항체의 제조에 있어서, 상기 숙주 세포는 항체의 중쇄 및 경쇄를 모두 코딩하는 하나의 재조합 핵산 분자, 또는 하나는 항체의 경쇄를 코딩하고 다른 하나는 항체의 중쇄를 코딩하는 2개의 재조합 핵산 분자에 의해 형질 전환될 수 있다. 일 실시형태에서, 재조합 항체는 항체의 중쇄 및 경쇄를 모두 코딩하는 하나의 재조합 핵산 분자로부터 제조될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 하나의 재조합 핵산 분자로부터 제조되며, 중쇄 및 경쇄의 발현은 동일하거나 상이할 수 있는 별개의 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 하나의 재조합 핵산 분자로부터 제조되며, 중쇄 및 경쇄의 발현은 동일한 별개의 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
본 발명에서 상기 "벡터"는 어떤 핵산 분자가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 상기 핵산 분자이다. 벡터의 한 가지 유형은, 추가적인 DNA 세그멘트가 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA를 가리키는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터로, 추가적인 DNA 세그멘트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 어떤 벡터들은 그들이 유입된 숙주세포에서 자율적인 복제를 할 수 있다(예컨대, 박테리아성 벡터는 박테리아성 복제 기원을 갖는 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주세포에 유입되면서 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 그럼으로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 어떤 벡터는 이들이 작동차원에서 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이와 같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"라 명명된다. 일반적으로 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는, 플라스미드가 벡터 중 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에, 상호 교환하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 벡터의 구체적인 예시로는 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하고, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주 세포로의 벡터 도입 시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터를 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선별되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명에서는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
본 발명에서 상기 숙주 세포의 배양 시 사용되는 배양 배지는 포유류 세포를 성장시키기 위하여 요구되는 영양분을 함유하는 용액으로, 전형적으로 최소 성장 및/또는 생존을 위하여 세포가 필요로 하는 필수 및 비필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 리피드 및 미량 원소를 포함할 수 있다. 바람직하게, 배지는 모든 성분 및 그 농도가 알려져 있다는 점에서 화학적으로 규명된다. 또한, 바람직한 실시형태에서 상기 배지는 무혈청이고, 가수분해물을 함유하지 않으며, 동물로부터 유래된 성분을 전혀 함유하지 않을 수 있다. 보다 바람직한 실시형태에서, 배지는 무혈청이고, 가수분해물을 함유하지 않고, 동물로부터 유래된 성분을 전혀 함유하지 않으나, 분리 과정에 필요한 일부 화학 물질을 함유할 수 있다.
본 발명에서는 상기 숙주 세포의 배양 시 발현되는 항체의 경쇄 또는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 하이드록시아미노산(hydroxyamino acid)으로 세린(Ser), 트레오닌(Thr) 또는 티로신(Tyr) 잔기, 바람직하게는 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr) 잔기를 글리코실화할 수 있다.
본 발명에서는 상기 숙주 세포의 배양 시 발현되는 리툭시맵 항체의 서열번호 6으로 표시되는 경쇄 또는 서열번호 4로 표시되는 표시되는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 하이드록시아미노산을 글리코실화할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 숙주 세포의 배양 시 발현되는 리툭시맵에 있어서 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째, 51번째, 55번째, 62번째, 101번째, 155번째 및 181번째 중 적어도 하나의 하이드록시아미노산 잔기, 바람직하게는 상기 리툭시맵의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째 및 62번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기, 보다 바람직하게는 상기 항체의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기를 글리코실화할 수 있다.
본 발명에서는 상기 숙주 세포의 배양 시 발현되는 니볼루맵 항체의 서열번호 10으로 표시되는 경쇄 또는 서열번호 8로 표시되는 표시되는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 하이드록시아미노산을 글리코실화할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 숙주 세포의 배양 시 발현되는 니볼루맵에 있어서 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기를 글리코실화할 수 있다.
본 발명에서는 상기 숙주 세포의 배양 시 발현되는 펨브롤리주맵 항체의 서열번호 14로 표시되는 경쇄 또는 서열번호 12로 표시되는 표시되는 경쇄 가변 영역에 포함되는 하나 이상의 하이드록시아미노산을 글리코실화할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 숙주 세포의 배양 시 발현되는 펨브롤리주맵에 있어서 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기를 글리코실화할 수 있다.
본 발명에서 상기 글리코실화(glycosylation)는 O-결합 글리코실화(O-linked glycosylation)인 것이 바람직하고, 본 발명에서 상기 항체는 경쇄, 또는 경쇄 가변 영역에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산에 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine; GlcNAc)이 결합될 수 있다.
본 발명에서 상기 숙주 세포의 배양 시 발현되는 항체로, 항-CD20 항체 또는 항-PD-1 항체의 경쇄에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산을 O-결합 글리코실화 (O-linked glycosylation) 하기 위하여는 상기 숙주 세포의 배양 시 O-GlcNAcase 억제제 (O-GlcNAcase inhibitor; OGA inhibitor)를 첨가할 수 있다.
본 발명에서 상기 OGA 억제제로는 티아멧-G (Thiamet-G), 스트렙토조토신(streptozotocin; STZ), PUGNAc, NAG-티아졸린(NAG-thiazoline), NButGT, (2R,3S)-이미노시클리톨((2R,3S)-iminocyclitol), PUGNAc-이미다졸 하이브리드(PUGNAc-imidazole hybrid) 및 GlcNAc스타틴 C(GlcNAcstatin C)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있지만, 바람직하게는 티아멧-G일 수 있다.
본 발명에서는 상기 O-결합 글리코실화를 통하여 상기 항체의 경쇄, 또는 경쇄 가변 영역에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산, 바람직하게는 상기 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째, 51번째, 55번째, 62번째, 101번째, 155번째 및 181번째 중 적어도 하나, 바람직하게는 7번째, 12번째, 14번째, 26번째 및 62번째 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나에 위치하는 하이드록시아미노산 잔기가 O-결합 글리코실화될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 O-결합 글리코실화를 통하여 상기 리툭시맵 항체의 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째, 51번째, 55번째, 62번째, 101번째, 155번째 및 181번째 중 적어도 하나, 바람직하게는 상기 리툭시맵의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째 및 62번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기가 O-결합 글리코실화될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 O-결합 글리코실화를 통하여 상기 니볼루맵 항체의 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나, 바람직하게는 상기 니볼루맵의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기가 O-결합 글리코실화될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 O-결합 글리코실화를 통하여 상기 펨브롤리주맵 항체의 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나, 바람직하게는 상기 펨브롤리주맵의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기가 O-결합 글리코실화될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 O-결합 글리코실화를 통하여 상기 피딜리주맵 항체의 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나, 바람직하게는 상기 피딜리주맵의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기가 O-결합 글리코실화될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 항-CD20 항체 또는 항-PD-L1 항체의 O-결합 글리코실화를 위하여, 상기 숙주 세포의 배양 시 O-GlcNAc 전이효소(O-GlcNAc transferase; OGT)를 추가로 첨가하여 상기 항-CD20 항체 또는 항-PD-L1 항체의 경쇄 또는 경쇄 가변 영역 내 하이드록시아미노산에 N-아세틸글루코사민을 결합시킬 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 항-CD20 항체 또는 항-PD-L1 항체의 경쇄 O-결합 글리코실화를 위하여, 상기 숙주 세포의 배양 시 N-아세틸글루코사민 (N-acetylglucosamine)의 글리코실 연결기를 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 O-결합 글리코실화된 항체를 제조한 후, 이를 수확할 수 있다. 포유류 세포로부터 발현된 재조합 단백질인 O-결합 글리코실화된 항체는 전형적으로 배양 과정 중에 세포 배양액으로 분비되므로, 배양 과정의 마지막에 생성물 수확은 세포로부터 O-결합 글리코실화된 항체를 포함하는 세포 배양액을 분리함으로써 이루어진다. 본 발명에서 세포를 분리하는 방법은, 상기 항체 생성물의 품질에 영향을 미칠 수 있는 세포 파편의 증가와, 프로테아제 및 다른 분자의 배출을 방지하기 위하여 세포 파괴를 최소화하도록 온화하여야 한다. 일반적으로, O-결합 글리코실화된 항체와 같은 재조합 단백질을 포함하는 세포 배양액의 수확은 원심 분리 및/또는 여과를 포함하며, 이에 의해 재조합 단백질이 상청액 및 여액에 각각 존재할 수 있다. 팽창층 흡착 크로마토그래피(Expanded bed adsorption chromatography)가 원심분리/여과 방법을 피하기 위한 대안이 될 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같이 O-결합 글리코실화된 항체를 포함하는 세포 배양액을 수확한 후에, 세포 배양액으로부터 상기 O-결합 글리코실화된 항체를 정제할 수 있다. 상기 O-결합 글리코실화된 항체의 정제 시 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피와 같은 일련의 크로마토그래피 단계에 의해 일반적으로 이루어질 수 있다. 또한, 정제 과정은 일 이상의 한외여과(ultrafiltration), 나노여과(nanofiltration) 또는 투석여과(diafiltration) 단계를 포함할 수 있다. PCT/EP2015/054862에 기재된 특히 적합한 방법은 플로우-스루 모드(flow-through mode)에서의 음이온 교환 크로마토그래피, 단백질 A 수지 상의 친화성 크로마토그래피 및 결합 및 용리 모드(bind-and-elute mode)에서의 양이온 교환 크로마토그래피의 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 적어도 500 또는 1,000 리터, 바람직하게 적어도 5,000 또는 8,000 리터, 가장 바람직하게 10,000 또는 20,000 리터의 배양 부피(culture volume)를 의미하는 대규모로 O-결합 글리코실화된 항체를 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 글리코실화된 항체를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 글리코실화된 항체는, 그 중에서도 특히 항-CD20 항체 또는 항-PD-L1 항체의 특정 하이드록시아미노산 잔기에 O-결합 글리코실화를 수행함으로써 항체의 역가는 동등 이상의 수준으로 유지하면서 항체의 생산성을 현저히 높일 수 있으므로, 이를 암의 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 상기 예방 또는 치료의 대상이 되는 암은 그 발생 부위에 따라 췌장암, 갑상선암, 유방암, 담도암, 담낭암, 대장암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 혈액암 또는 간암 등 일 수 있으나, 바람직하게는 혈액암, 흑색종, 폐암, 신장암, 두경부암 또는 위암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학적 조성물을 이용하여 암 증상을 차단하거나, 암 증상의 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학적 조성물을 조사하여 암 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 다른 항암제와도 추가로 병용 투여할 수 있으며, 이를 통해서 암 세포에 대한 성장 억제 효과를 더욱 증강시킬 수 있다.
여기서 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 암을 예방 또는 치료하기 위하여, 목적하는 개체에 본 발명에서 제공하는 글리코실화된 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 암은 췌장암, 갑상선암, 유방암, 담도암, 담낭암, 대장암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 혈액암 또는 간암 등 일 수 있으나, 바람직하게는 혈액암, 흑색종, 폐암, 신장암, 두경부암 또는 위암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 글리코실화된 항체의 투여량, 스케줄 및 투여 경로는 개체의 크기 및 조건에 따라, 그리고 표준 약제학적 관행에 따라 결정될 수 있다. 예시적인 투여 경로는 정맥내, 동맥내, 복강내, 폐내, 혈관내, 근육내, 기관내, 피하, 안내, 척수강내 또는 경피를 포함한다.
개체에 투여되는 항체의 용량은, 예를 들어, 투여되는 항체의 특정 유형, 투여 경로 및 치료되는 암의 특정 유형과 병기에 따라 달라질 수 있다. 상기 양은 심한 독성 또는 유해 사례없이, 암에 대한 치료 반응과 같은 원하는 반응을 가져오기 충분해야 한다. 일부 실시 형태에서, 투여될 글리코실화된 항체의 양은 치료적 유효량이다. 일부 실시 형태에서, 글리코실화된 항체의 양은 치료 전의 동일한 개체에서의 상응하는 종양 크기, 암 세포의 수 또는 종양 성장 속도와 비교하여, 또는 치료를 받지 않은 다른 개체에서의 상응하는 활성과 비교하여 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 하나만큼 종양 크기를 감소시키거나, 암 세포의 수를 감소시키거나, 종양의 성장 속도를 감소시키기 충분한 양이다. 정제된 효소를 사용한 시험관내 검정, 세포 기반 검정, 동물 모델 또는 인체 실험과 같은 표준 방법을 사용하여 효과의 규모를 측정할 수 있다.
본 발명에서 상기 글리코실화된 항체의 투여 시 단독으로 또는 다른 요법, 예컨대 수술, 방사선 치료, 유전자 치료, 면역치료, 골수 이식, 줄기세포 이식, 호르몬 요법, 표적 치료, 냉동요법, 초음파 치료, 광역동 치료, 화학요법 등과 함께 수행될 수 있다. 추가로, 증식성 질환이 발병할 위험이 더 큰 사람은 질환의 발병을 억제 및/또는 지연하기 위한 치료를 받을 수 있다.
본 발명에서는 항체, 그 중에서도 특히 항-CD20 항체 또는 항-PD-L1 항체의 특정 하이드록시아미노산 잔기에 O-결합 글리코실화를 수행함으로써 항체의 역가는 동등 이상의 수준으로 유지하면서 항체의 생산성을 현저히 높일 수 있다.
도 1은 실험예 1에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G (Thiamet G)를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우 발현되는 리툭시맵 항체의 생산 수율을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 실험예 2에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)의 첨가 후 시간의 경과에 따른 리툭시맵 항체의 중쇄 및 경쇄의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 (a)는 실험예 2에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)의 첨가 후 시간의 경과에 따른 리툭시맵 항체의 중쇄의 발현 수준의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3의 (b)는 실험예 2에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)의 첨가 후 시간의 경과에 따른 리툭시맵 항체의 경쇄의 발현 수준의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 2에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 OSMI-1의 첨가 후 시간의 경과에 따른 리툭시맵 항체의 중쇄 및 경쇄의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 3에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 OSMI-1의 첨가 후 시간의 경과에 따른 리툭시맵 항체의 중쇄의 발현 수준의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6의 (a)는 실험예 4에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)를 첨가한 경우와 무첨가한 경우에 있어 숙주 세포의 용해물(CHO-RTX Lysate)의 여러가지 단백들과, 그로부터 분리 및 정제한 리툭시맵 항체에서 O-결합 N-아세틸글루코사민(O-linked N-acetylglucosamine; O-GlcNAc)의 결합 정도를 O-결합 N-아세틸글루코사민 특이적 항체 (RL2)를 이용한 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6의 (b)는 도 6의 (a)에서 3번째 및 4번째에 사용된 리툭시맵 항체의 양을 인간 면역글로불린 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블럿을 통해 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 7의 (a)는 실험예 5에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)를 첨가한 경우와 무첨가한 경우에 있어 숙주 세포의 용해물(Lysate)과, 그로부터 분리 및 정제한 리툭시맵 항체에서 O-결합 N-아세틸글루코사민(O-linked N-acetylglucosamine; O-GlcNAc)의 결합 정도를 O-결합 N-아세틸글루코사민 특이적 항체 (RL2)를 이용하여 환원 조건에서 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7의 (b)는 실험예 5에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)를 첨가한 경우와 무첨가한 경우에 있어 숙주 세포의 용해물(Lysate)과, 그로부터 분리 및 정제한 리툭시맵 항체에서 O-결합 N-아세틸글루코사민(O-linked N-acetylglucosamine; O-GlcNAc)의 결합 정도를 O-결합 N-아세틸글루코사민 특이적 항체 (RL2)를 이용하여 비-환원 조건에서 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실험예 6에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)를 첨가한 경우와 무첨가한 경우에 있어 숙주 세포의 용해물(Lysate)과, 그로부터 분리 및 정제한 리툭시맵 항체에서 O-결합 N-아세틸글루코사민(O-linked N-acetylglucosamine; O-GlcNAc)의 결합 정도를 메타볼릭 라벨링(metabolic labeling)을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실험예 7에서 LC-MS/MS 분석을 통해 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)를 첨가한 경우 상기 리툭시맵 항체의 경쇄 내 O-GlcNAc이 결합한 세린 잔기의 위치를 나타낸 것이다.
도 10은 실험예 7에서 LC-MS/MS 분석을 통해 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)를 첨가한 경우 상기 리툭시맵 항체의 경쇄 내 O-GlcNAc이 결합한 세린 잔기의 위치를 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 8에서 엡제공 프로그램 (OGAP)을 통해 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)를 첨가한 경우 상기 리툭시맵 항체의 경쇄 내 O-GlcNAc이 결합하는 것으로 예측되는 세린 잔기의 위치를 나타낸 것이다.
도 12의 (a)는 실험예 9에서 숙주 세포를 이용해 리툭시맵의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 세린 잔기가 알라닌으로 부위 특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)가 유도된 리툭시맵 항체의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)를 첨가한 경우에 있어 리툭시맵 항체의 중쇄 및 경쇄의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12의 (b)는 실험예 9에서 숙주 세포를 이용해 리툭시맵의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 26번째 및 62번째 세린 잔기가 알라닌으로 부위 특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)가 유도된 리툭시맵 항체의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)를 첨가한 경우에 있어 리툭시맵 항체의 중쇄 및 경쇄의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 실험예 10에서 숙주 세포를 이용해 리툭시맵의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 세린 잔기가 알라닌으로 부위 특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)가 유도된 리툭시맵 항체의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)를 첨가한 경우에 있어 리툭시맵 항체의 중쇄 및 경쇄의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 실험예 11에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)를 첨가한 경우와 무첨가한 경우에 있어 얻어진 리툭시맵 항체의 항원에 대한 결합 친화성을 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 실험예 11에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)를 첨가한 경우와 무첨가한 경우에 있어 얻어진 리툭시맵 항체의 보체 의존적 세포 독성을 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 실험예 11에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)를 첨가한 경우와 무첨가한 경우에 있어 얻어진 리툭시맵 항체의 항체-의존적 세포 중재 독성을 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 17의 (a)는 실험예 12에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)를 첨가한 경우와 무첨가한 경우에 있어 리툭시맵 항체 내 O-GalNAc의 결합정도의 차이를 O-GalNAc과 결합하는 렉틴인 (Jacalin-HRP)을 이용한 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 17의 (b)는 도 17의 (a)에서 1번째 및 2번째에 사용된 리툭시맵 항체의 양을 인간 면역글로불린 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블럿을 통해 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 실험예 12에서 LC-MS/MS 분석을 통해 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(TMG)를 첨가한 경우와 무첨가한 경우에서 상기 리툭시맵 항체의 경쇄 내 O-GalNAc의 결합 정도의 변화를 나타낸 것이다.
도 19는 실험예 13에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵(RTX), 니볼루맵(NIV) 및 펨브롤리맵(PEMB)의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)의 첨가 후 각 항체의 중쇄 및 경쇄의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 실험예 13에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵(RTX), 니볼루맵(NIV) 및 펨브롤리맵(PEMB)의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)의 첨가 후 첨가 전에 비하여 각 항체의 경쇄의 발현 수준의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 21은 실험예 13에서 리툭시맵(RTX), 니볼루맵(NIV) 및 펨브롤리맵(PEMB)의 경쇄 서열을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 실험예 14에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵(RTX), 니볼루맵(NIV) 및 펨브롤리맵(PEMB)의 발현 시 티아멧-G(Tg)의 첨가 후 각 항체의 중쇄 및 경쇄의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 실험예 14에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵(RTX), 니볼루맵(NIV) 및 펨브롤리맵(PEMB)의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)의 첨가 후 각 항체의 중쇄 및 경쇄의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 실험예 15에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)의 첨가 농도에 따른 리툭시맵의 중쇄 및 경쇄의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 실험예 15에서 숙주 세포를 이용한 리툭시맵의 발현 시 티아멧-G(Thiamet G)의 첨가 농도에 따른 리툭시맵의 중쇄 및 경쇄의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 경쇄에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산(hydroxyamino acid)이 글리코실화된 항체에 관한 것이다.
본 발명의 항체에 있어서 글리코실화되는 하이드록시아미노산은 분자 내에 수산기를 갖는 아미노산으로, 세린(Serine, Ser), 트레오닌(Threonine, Thr) 또는 티로신(Tyrosine, Tyr)일 수 있으나, 바람직하게는 세린(Ser)이나 트레오닌(Thr) 잔기일 수 있다.
본 발명에서 상기 항체는 경쇄, 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째, 51번째, 55번째, 62번째, 101번째, 155번째 및 181번째 중 적어도 하나에 하이드록시아미노산 잔기를 포함하는 것일 수 있다. 이때 상기 아미노산 위치 넘버링(numbering)은 카밧(Kabat)의 EU 인덱스(index)에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 항체는 경쇄, 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나에 하이드록시아미노산 잔기를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 항체는 항-CD20 항체 또는 항-PD-1 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 항-CD20 항체는 유형 I 항-CD20 항체일 수 있고, 그 예로는 리툭시맵(Rituximab), HI47 IgG3(ECACC, 하이브리도마), 2C6 IgG1(국제 특허출원공개 제2005/103081호에 개시됨), 2F2 IgG1(국제 특허출원공개 제2004/035607호 및 국제 특허출원공개 제2005/103081호에 개시됨) 또는 2H7 IgG1(국제 특허출원공개 제2004/056312호에 개시됨)을 포함하지만, 바람직하게는 리툭시맵(Rituximab)일 수 있다.
본 발명에서 상기 항-PD-L1 항체는 니볼루맵(Nivolumab), 펨브롤리주맵(Pembrolizumab), 피딜리주맵(pidilizumab), AMP 514(Amplimmune), PDR-001(Novartis), MEDI-0690(또한 AMP-514로도 공지됨)(MedImmune LLC), SHR-1210(Incyte Corp.), REGN-2810(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), PF-06801591(Pfizer), TSR-042(또한, ANB011으로도 공지됨)(Tesaro, Inc.), BGB-A317(BeiGene, Ltd.) 또는 JS001(Shanghai Junshi Bioscience Co., Ltd.)일 수 있으나, 바람직하게는 니볼루맵, 펨브롤리주맵 또는 피딜리주맵일 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 리툭시맵의 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째, 51번째, 55번째, 62번째, 101번째, 155번째 및 181번째 중 적어도 하나의 하이드록시아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 상기 리툭시맵의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째 및 62번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기, 보다 바람직하게는 상기 항체의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기가 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 니볼루맵에 있어서, 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기가 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 펨브롤리주맵에 있어서 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기가 글리코실화된 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 피딜리주맵에 있어서 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기가 글리코실화된 것일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[실시예 1] 항체의 생산
1. 항체 및 글리코실화 효소 클로닝
리툭시맵(rituximab)의 서열은 Drugbank (https://www.drugbank.ca)에서 참고할 수 있다. DNA 합성을 통하여 리툭시맵의 중쇄(서열번호 5) 및 경쇄(서열번호 6)를 제작하였다. 단, 중쇄의 불변 영역의 경우는 건강한 기증자의 DNA에서 PCR을 통해 얻었다.
2. 렌티바이러스(lentivirus) 제작
HEK293T 세포에 상기 실시예 1의 1.에서 제작한 항체 클론 DNA 및 렌티바이러스 구성 DNA를 공동-형질전환(co-transfection)하여 배양하였다. 밤새 배양(overnight)한 후, 세포 배양액을 갈아주었다. 24 시간이 경과된 후, 세포 배양액을 분리하여 4 ℃에서 1000 rcf, 3분간 원심 분리하고 상층액만 따로 깨끗한 튜브(tube)로 옮긴 뒤 세포 배양액 내에 섞여있는 세포를 제거하였다. 이를 -70 ℃에 보관하였다.
3. 항체의 제작
CHO-K1 세포를 12 웰 플레이트에 1 x 105 세포/웰로 접종한 후 배양하였다. 다음 날, 세포에 렌티바이러스가 들어있는 배양액과 신선한 배양액을 1:1로 섞어 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 배양 배지를 새로 교체한 뒤 퓨로마이신(puromycin) 및 블라스티시딘(blasticidin)을 각각 10 ug/ml로 처리하여 선별(selection)하였다. 72 시간 경과된 후, 남아있는 세포를 증식시켜 충분한 세포를 확보하였다. 이처럼 확보한 세포의 배양액을 무혈청 배지 (EX-CELL CD CHO Serum-Free Medium for CHO Cells, Chemicallu Defined, Sigma, 14360C)로 갈아준 뒤, Thiamet-G(Sigma cat# SML0244) 시약을 30 uM의 농도로 처리하였다. 세포를 30 ℃, CO2 인큐베이터(incubator)에서 2주간 배양한 후, 배양액을 모아 4 ℃에서 1000 rcf로 3분간 원심 분리하여 상층액만을 따로 깨끗한 튜브로 옮기고, 상기 상층액에 섞여있는 세포를 제거하였다. 이를 4 ℃에서 보관하였다.
4. 항체의 정제
항체가 들어있는 배양액에 A 단백 아가로스 비드(Protein A agarose bead, Pierce Protein A Agarose, thermos, QE218104)를 처리하여 4 ℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 세척 버퍼(washing buffer: 0.1 M NaPO4, 0.15 M NaCl, pH 7.4)로 5번 세척하였다. 다시 상층액을 제거한 비드에 용출 버퍼(elution buffer: 0.2 M glycine, pH 3)로 비드 볼륨으로 5번 용출시켰다. 용출한 부분을 원심 분리용 여과 유닛(Centrifugal filter units)(Amicon Ultra-4, Millipore, #UFC800324)에 모아 13200 rpm으로 1시간씩 3회에 걸쳐 PBS로 버퍼를 바꾸어 주었다. 이후, 브래드포드(Bradford) 방법으로 총 단백을 정량하였다.
[실험예 1] 항체의 생산량 증가 확인(1)
상기 실시예 1에서 Thiamet-G를 통한 리툭시맵의 O-결합 글리코실화 시 항체의 생산량 변화를 확인하기 위하여, 3. 항체의 제작 시 Thiamet-G를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우 정제된 항체의 생산량을 측정하였다. 그 결과를 도 1에서 보는 바와 같이, Thiamet-G를 첨가하여 리툭시맵을 O-결합 글리코실화시킨 경우 아무런 처리를 하지 않은 경우와 비교하여 항체의 생산량이 대략 2배 정도 증가한 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 2] 항체의 생산량 증가 확인(2)-(Thiamet-G 처리에 의한 항체의 중쇄와 경쇄의 단백양의 증가 확인)
상기 실험예 1에서 Thiamet-G를 통한 리툭시맵의 O-결합 글리코실화 시 항체의 생산량이 증가됨을 확인하였고, Thiamet-G의 첨가 후 시간에 따른 항체의 생산량 변화를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로는 상기 실시예 1에서 3. 항체의 제작 시 Thiamet-G를 30 uM의 농도로 첨가한 후 24시간, 48시간, 72시간이 경과한 후 세포 배양액을 회수하였다. 회수된 배양물과 같은 양을 아크릴아마이드 겔(acrylamide gel)에서 전기영동하여 단백을 크기 별로 분리한 후, 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane, NC 막)으로 영동시켰다. 니트로셀룰로오스 막에 전기적으로 전달된 단백질 이외의 부분을 5 % 탈지 우유(non-fat milk)와 0.1 % Tween 20이 함유된 TBS-T로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하고, 항-인간-HRP(Anti-human-HRP)와 항-마우스-HRP(Anti-Mouse-HRP) 항체를 상온에서 30분 배양한 후 TBS-T 로 10분씩 세 번 세척하였다. ECL 용액을 사용하여 X-ray 필름에 감광시키고(도 2), 각 시간에 따른 중쇄 및 경쇄의 생산량을 분석하였다(도 3). 그 결과, Thiamet-G를 처리한 경우 시간이 경과할수록 항체의 중쇄 및 경쇄의 생산량이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 3] 항체의 생산량 증가 확인(3)-(OSMI: Thiamet-G와 반대 작용을 하는 약물에 의한 항체의 중쇄와 경쇄의 단백양의 감소 확인)
상기 실험예 2에서 확인한 바와 같이 항체의 생산량의 증가가 리툭시맵의 O-결합 글리코실화에 의한 것인지를 확인하기 위하여, 대조예로서 상기 실시예 1에서 3. 항체의 제작 시 Thiamet-G 대신에 OGT 억제제에 해당하는 OSMI-1(sigma #SML1621) 시약을 30 uM의 농도로 첨가한 후 상기와 동일한 방법으로 24시간, 48시간, 72시간이 경과한 뒤 세포 배양액을 회수한 후 웨스턴 블럿(Western blot)을 통해 항체 및 그 중쇄의 생산량을 분석하였다(도 4 및 5). 그 결과, OSMI-1를 처리한 경우에도 시간이 경과할수록 항체의 중쇄 및 경쇄의 생산량은 증가하였지만, 무처리한 음성 대조군에 비하여는 생산 증가 폭이 감소한 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 4] 항체의 O-GlcNAc 결합 정도 차이 확인(1)-(O-GlcNAc 검출용 항체를 이용한 O-GlcNAc 결합양 비교)
분리한 리툭시맵의 총 단백량을 맞추어 아크릴아마이드 겔에서 전기영동하여 단백을 크기별로 분리한 후, 니트로셀룰로오스 막으로 영동시켰다. 니트로셀룰로오스 막에 전기적으로 전달된 단백질 이외의 부분을 5 % 탈지유, 0.1 % Tween 20이 함유된 TBS-T로 상온에서 1시간 동안 블러킹(blocking)하고, O-결합 N-아세틸글루코사민(O-linked N-acetylglucosamine; O-GlcNAc) 특이적 항체(RL2-HRP)를 상온에서 1시간 동안 배양한 후, TBS-T로 10분씩 세 번 세척하였다. ECL 용액을 사용하여 X-ray 필름에 감광시켰다(도 6(a)).
리툭시맵의 양이 동량인지 확인하기 위해 니트로셀룰로오스 막에 결합한 O-결합 N-아세틸글루코사민(O-linked N-acetylglucosamine; O-GlcNAc) 특이적 항체(RL2-HRP)를 스트리핑(stripping)으로 제거한 후 항-인간-HRP와 항-마우스-HRP(RITUXIMAB은 human과 mouse가 합쳐진 chimeric 항체) 항체를 상온에서 30분 동안 배양한 후, TBS-T 로 10분씩 세 번 세척하였다. ECL 용액을 사용하여 X-ray 필름에 감광시켰다(도 6(b)). 그 결과, 도 6(b)에서 Thiamet-G를 처리한 경우 리툭시맵이 동일한 양임에도 불구하고 도 6(a)와 같이 O-결합 N-아세틸글루코사민 (O-GlcNAc)이 더 많이 결합하고 있음을 나타낸다. 즉, Thiamet-G를 처리한 경우 리툭시맵에서 O-GlcNAc의 결합이 증가하여 그 발현 수준 또한 증가한 것임을 확인할 수 있었다.
[실험예 5] 항체의 O-GlcNAc 결합 정도 차이 확인(2)-(O-GlcNAc 검출용 항체를 이용한 O-GlcNAc 결합양 비교)
렌티 바이러스 시스템(Lenti-virus system)으로 리툭시맵 안정 세포주를 제작하였다. 상기 세포주를 Thiamet-G(TMG) 50uM을 처리한 무혈청 RPMI 배지(Serum free RPMI media)에서 72시간 배양 후 수확한 뒤 세포 용해물(lysate)을 제작하였다. 또한, 상기 세포주를 Thiamet-G 50uM을 처리한 무혈청 RPMI 배지에서 2주간 30℃ 인큐베이터(incubator)에서 배양한 후 단백질 A(Protein A)로 리툭시맵을 분리하였다. 분리한 항체 1㎍을 환원(reducing)과 비-환원(non-reducing) 조건에서 웨스턴 블럿(western blot)을 수행하여 항-O-GlcNAc 항체(RL2-HRP)로 면역 블럿을 수행하고, SDS 겔에 영동(running)시킨 후 쿠마시 블루 염색(coomassie blue staining)을 하였다. 그 결과는 도 7의 (a) 및 (b)에 나타내었다. 단, 여기서 대조군으로 맙테라주(Mabthera; Mab)(Roche)를 사용하였다. 그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 리툭시맵에 Thiamet-G를 처리한 군에서 O-GlcNAc이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 6] 항체의 O-GlcNAc 결합 정도 차이 확인(3)-(메타볼릭 라벨링을 이용한 O-GlcNAc 결합양 비교)
렌티 바이러스 시스템(Lenti-virus system)으로 리툭시맵 안정 세포주를 제작하였다. 상기 세포주에 Thiamet-G 50uM과 Ac4GlcNAz(azido sugar) 50uM을 처리하고 4일간 배양한 후 단백질 A로 리툭시맵을 분리하였다. 분리한 리툭시맵을 포스핀-비오틴(phosphine-biotin)과 상온에서 16시간 클릭 반응(click reaction) 후 웨스턴 블럿을 수행하여 스트렙타비딘(streptabidin)-HRP로 면역 블럿을 수행하여 리툭시맵의 O-GlcNAc을 메타볼릭 라벨링(metabolic labeling)을 하였다. 또한, 리툭시맵의 양을 알기 위해 상기 실험 결과에서 스트리핑(stripping) 후 항-인간 IgG-HRP와 항-마우스 IgG-HRP로 면역 블럿을 수행하였다. 그 결과 도 8에서 보는 바와 같이 리툭시맵에 Thiamet-G를 처리한 군에서 O-GlcNAc이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 7] 항체의 O-GlcNAc 결합 정도 차이 확인(4)-(항체 내 O-결합 글리코실화 부위의 확인)
리툭시맵의 항체에서 O-결합 글리코실화 부위를 확인하기 위하여, 하기의 실험을 수행하였다. 상기 실험예 2에서 SDS-PAGE 겔에 전기 영동한 단백질의 밴드(band)를 여러조각으로 자른 후 25 mM 암모늄 중탄산 버퍼(ammonium bicarbonate buffer)(pH 7.8, containing 50 % (v/v) acetonitrile (ACN))에서 실온 1시간 동안 세척하였다. 이후, 원심분리 진공 농축기(centrifugal vacuum concentrator)(Biotron, Inc., Incheon, Korea)에서 10분 동안 탈수(dehydration) 과정을 거친 뒤 50 ng의 시퀀싱 그레이드 트립신 용액(grade trypsin solution)(Promega, Madison, WI, USA)에서 재수화(rehydration) 시켰다. 25 mM 암모늄 중탄산 버퍼에 16시간 배양한 후, 포름산(formic acid)으로 펩타이드를 분리하였다. 이후 수행할 질량 분석(mass spectrometric)에 앞서 역상 컬럼(reversed-phase column)(Gobom et al., 1999)을 통과시켜 펩타이드 용액(peptide solution)을 탈염(desalting)시켰다. LC-MS/MS 분석을 위하여 Nano ACQUITY UPLC and LTQ-orbitrap-mass spectrometer (Thermo Electron, San Jose, CA)로 분석을 수행하였고, 컬럼은 BEH C18 1.7 ㎛, 100 ㎛ × 100 mm column (Waters, Milford, MA, USA)을 사용하였다. MS/MS 각각의 스펙트라(spectra)는 SEQUEST software (Thermo Quest, San Jose, CA, USA)로 처리한 후 MASCOT program (Matrix Science Ltd., London, UK)으로 피크 리스트(peak list)를 만들었다(도 9 및 10). 그 결과, 무처리한 경우에 비하여 Thiamet-G를 처리한 경우 항체의 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째 및 181번째에 위치한 세린 잔기에 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)이 결합하여 O-결합 글리코실화된 것을 알 수 있다.
[실험예 8] 항체의 O-GlcNAc 결합 정도 차이 확인(2)-(항체 내 O-결합 글리코실화 부위의 확인)
리툭시맵의 항체에서 O-결합 글리코실화 부위를 예측하기 위하여, 하기의 실험을 수행하였다. 엡제공 프로그램 (OGAP)(http://cbsb.lombardi.georgetown.edu/OGAP.html..)(BMC Bioinformatics. 2011 Apr 6;12:91. doi: 10.1186/1471-2105-12-91.)을 이용하되 프로그램의 역치 값(threshold)을 150으로 정하여 Thiamet-G를 처리한 리툭시맵의 경쇄 내 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)이 결합한 위치를 확인하였다(도 11). 단, 도 11은 리툭시맵의 경쇄에 22개의 아미노산으로 이루어진 시그널 펩타이드(signal peptide)를 포함한 결과이다. 그 결과, 리툭시맵의 경쇄의 5' 말단으로부터 26번째 및 62번째에 위치한 세린 잔기에 N-아세틸글루코사민이 결합하여 O-결합 글리코실화된 것을 알 수 있다.
[실험예 9] 항체 내 O-결합 글리코실화 부위의 확인-(O-GlcNAc 결합부위 돌연변이로 O-GlcNAc 결합 부재 효과 확인)
실시예 1과 동일한 방법으로 항체를 제작하되, 상기 실험예 5에서 질량 분석 시 O-결합 N-아세틸글루코사민(O-GlcNAc)이 결합하는 것으로 확인한 7번째, 12번째 및 14번째 세린(serine) 잔기와 O-GlcNAc이 결합하는 것으로 예측되는 26번째 및 62번째 세린 잔기를 알라닌(alanine)으로 부위 특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 유도한 뒤 항체의 생산량을 분석하였다. 상세하게는 HEK293T 세포에 리툭시맵 중쇄 및 경쇄의 야생형과 돌연변이를 1:1로 형질 전환시킨 뒤 배양하였고, 그 외의 조건은 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 24시간이 경과한 후, 세포의 배양액을 제거하고 PBS로 3번 세척한 뒤 용혈 버퍼(lysis buffer)(150 mM NaCl, 5 mM NaEDTA, 10 % glycerol, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% Triton X-100, and proteinase inhibitors (Complete, Roche Applied Science))를 넣고, 세포를 모아서 깨끗한 튜브로 옮겼다. 이후, 음파 처리(sonication)를 이용한 세포 용해를 수행하고 4 ℃에서 13200 rpm, 10분간 원심 분리하여 상층액만을 따로 깨끗한 튜브에 옮긴 뒤 세포 용해물(cell lysate)를 얻어 브래드포드 방법으로 총 단백을 정량하였다. 총 단백량을 맞추어 아크릴아마이드 겔(acrylamide gel)에서 전기영동하여 단백을 크기 별로 분리한 후, 니트로셀룰로오스 막으로 이동시켰다. 니트로셀룰로오스 막에 전기적으로 전달된 단백질 이외의 부분을 5 % 탈지 우유, 0.1 % Tween 20이 함유된 TBS-T로 상온에서 1시간 동안 블러킹(blocking)하고, 항-인간-HRP와 항-마우스-HRP 항체를 이용하여 상온에서 30분 배양한 후, TBS-T로 10분씩 세 번 세척하였다. ECL 용액을 사용하여 X-ray 필름에 감광시켰다(도 12). 그 결과, 리툭시맵 항체의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 26번째 및 62번째에 위치한 세린 잔기를 알라닌으로 치환시킨 경우, 항체의 중쇄 및 경쇄의 생산량이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 10] 항체 내 O-결합 글리코실화 부위의 확인-(O-GlcNAc 결합부위 돌연변이로 O-GlcNAc 결합 부재 효과 확인)
상기 실험예 9와 동일한 방법으로 리툭시맵 항체에 부위 특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 유도하되, 숙주 세포로 HEK293T 세포 대신에 CHO-K1 세포를 사용하였다. 형질 전환 후 24시간이 경과하였을 때 세포의 배양액을 제거하고 무혈청 RPMI 배지를 넣고 30℃에서 5일간 추가로 배양한 후 배지를 수확하였다. 배지 동량을 전기영동하여 단백을 크기 별로 분리한 후, PVDF 막으로 이동시켰다. 막에 전기적으로 전달된 단백질 이외의 부분을 5 % 탈지유, 0.1 % Tween 20이 함유된 TBS-T로 상온에서 1시간 동안 블러킹(blocking)하고, 항-인간-HRP와 항-마우스-HRP 항체를 상온에서 30분 배양한 후, TBS-T 로 10분씩 세 번 세척하였다. ECL 용액을 사용하여 X-ray 필름에 감광시켰다(도 13). 그 결과, 리툭시맵 항체의 경쇄 가변 영역의 5' 말단으로부터 특히 12번째에 위치한 세린 잔기를 알라닌으로 치환시킨 경우, 항체의 중쇄 및 경쇄의 생산량이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 11] 항체의 역가 유지 확인
1. 결합 친화성 확인
상기 실시예 1에서 리툭시맵의 경쇄를 O-결합 글리코실화함으로써 항체의 역가에 변화가 있는 지 확인하기 위하여, Ramos 세포를 튜브 당 1x105 세포로 PBS 50 ul에 현탁시키고 각 조건 별로 생산한 리툭시맵 또는 리툭시맵과 동일한 타겟에 결합하는 것으로 알려진 오비누투쥬맵(OBI)을 0.1, 0.3, 1, 3, 10 ug/ml의 양으로 처리한 뒤 4 ℃에서 30분 동안 배양하였다. PBS로 1번 세척하는 과정을 거친 후 50 ul PBS에 항-인간 Ig Fc-특이적 FITC-컨쥬게이트된 2차 항체(109-095-008, 1:200 dilution; Jackson Laboratories)를 1:500 희석 처리하여 4 ℃에서 30분 배양하였다. PBS로 1번 세척한 후 유세포 분석기(flow cytometry)(FACS, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)로 총 10,000 개의 세포를 카운팅하여 FlowJo 소프트웨어로 분석하였다(도 14). 그 결과, Thiamet-G를 처리하여 O-결합 글리코실화한 리툭시맵은 아무런 처리를 하지 않고 얻어진 리툭시맵과 결합 친화성에 있어서 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다.
2. 보체-의존적 세포 독성(complementary dependent cell death)
Ramos 세포를 Serum free RPMI에서 Calcein-AM 5 uM로 처리한 후 37 ℃에서 30분 간 배양(incubation)하였다. 염색 한 Ramos 세포를 1 x 105 세포/웰의 양으로 분주 한 후 각 조건별로 생산한 리툭시맵 또는 오비누투주맵, 또는 인간 IgG(human IgG)을 0.1, 0.3, 1, 3, 10 ug/ml의 양으로 처리하여 37 ℃에서 10분 동안 배양하였다. 이에 토끼 보체 MA (Cedarlane, cat#CL3221)를 1:4 비율로 첨가하여 37 ℃, CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하였다. 이후 세포는 FACSVerse (BD Biosciences) 기계로 총 10,000개의 세포를 카운팅하여 FlowJo 소프트웨어로 분석하였다(도 15). 그 결과, Thiamet-G를 처리하여 O-결합 글리코실화한 리툭시맵은 아무런 처리를 하지 않고 얻어진 리툭시맵과 보체-의존적 세포 독성에 있어서 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다.
3. 항체-의존적 세포 중재 독성(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)
Ramos 세포를 칼세인(calcein)-AM 을 37 ℃, CO2 인큐베이터(incubator)에서 30분간 처리한 후, 세포를 원심분리 시켰다. Ramos 세포를 튜브 당 1 x 105 세포로 접종한 뒤 각 조건 별로 생산한 리툭시맵 또는 OBI, 또는 인간 IgG(human IgG)를 0.1, 0.3, 1, 3, 10 ug/ml의 양으로 처리한 뒤 37 ℃에서 10분 동안 배양하였다. 상층액을 모두 제거하고, 100 ㎕의 배지로 재부유 하였다. 이에 사람 혈액에서 분리한 PBMC (poly basic mononuclear cell)를 1:25의 비율로 첨가하여 37 ℃, CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 배양하였다. 이후 세포는 FACSVerse (BD Biosciences) 기계로, 총 10,000개의 세포를 카운팅하여 FlowJo 소프트웨어로 분석하였다(도 16). 그 결과, Thiamet-G를 처리하여 O-결합 글리코실화한 리툭시맵은 아무런 처리를 하지 않고 얻어진 리툭시맵과 항체-의존적 세포 용혈율에 있어서 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 12] Thiamet-G에 의한 당균질화 효과
실시예 1에서 얻어진 리툭시맵의 총 단백량을 맞추어 비-환원 시료 버퍼(Non-reducing sample buffer)에 넣고 아크릴아마이드 겔에서 전기 영동 후, 니트로셀룰로오스 막으로 이동시켰다. 니트로셀룰로오스 막을 PBS-T(Tween 0.5%)로 1시간 블러킹한 후 O-GalNAc 결합 렉틴(Biotinylated-Jacalin)을 첨가하고 상온에서 1시간 배양하였다. PBS-T 로 10분씩 세 번 세척한 후 스트렙타비딘(Streptavidin)-HRP를 상온에서 30분 배양하였다. PBS-T로 10분씩 세 번 세척한 후 ECL 용액을 사용하여 X-ray 필름에 감광시켰다. 리툭시맵의 양이 동량인지 확인하기 위해 스트리핑(stripping) 후 항-인간-HRP와 항-마우스-HRP 항체를 상온에서 30분 동안 배양시킨 후 TBS-T 로 10분씩 세 번 세척하였다. ECL 용액을 사용하여 X-ray 필름에 감광시켰다(도 17). 그 결과, Thiamet-G를 처리하지 않은 리툭시맵은 도 17(b)의 결과에 의거 리툭시맵 항체가 동일한 양임에도 불구하고 도 17(a)와 같이 O-결합 N-아세틸갈락토사민 (O-GalNAc)의 더 적게 결합하고 있는 것을 나타낸다. 즉, Thiamet-G를 처리하여 얻어진 리툭시맵에서는 큰 부피로(bulky) 신장된 형태(extension)인 O-GalNAc이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, Thiamet-G를 처리하여 얻어진 리툭시맵에서 O-GalNAc이 결합된 잔기를 확인하기 위하여 상기 실험예 5와 같이 LC-MS/MS 분석을 수행하였다(도 18). 그 결과, 무처리한 리툭시맵의 경우 경쇄 내에 포함된 7개의 잔기에서 O-GalNAc이 결합된 것을 확인할 수 있었다. 하지만, 본 발명과 같이 Thiamet-G를 처리한 경우 잔기 7개 중 5개에서 O-GalNAc의 결합이 감소한 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 13] 항체의 생산량 증가 확인(4)
리툭시맵, 니볼루맵 및 펨브롤리주맵 각각을 발현하는 세포주를 1x10^6 세포수로 60mm 플레이트에서 배양하였다. 다음 날, CHO 배지 3ml에 Thiamet-G를 50uM로 처리하여 2주간 30 ℃에서 배양한 후 배지를 수확(harvest) 하였다. 배지 동량을 전기영동하여 단백을 크기 별로 분리한 후, PVDF 막으로 영동시켰다. 막에 전기적으로 전달된 단백질 이외의 부분을 5 중량% 탈지 우유(non-fat milk), 0.1 중량% Tween 20이 함유된 TBS-T로 상온에서 1시간 동안 블러킹(blocking)하고, 항-인간-HRP(Anti-human-HRP)와 항-마우스-HRP(Anti-Mouse-HRP)(RITUXIMAB은 human과 mouse가 합쳐진 chimeric 항체) 항체를 상온에서 30분 배양한 후 TBS-T로 10분씩 세 번 세척하였다. ECL 용액을 사용하여 X-ray 필름에 감광시켰고(도 19), 각 항체 별 Thiamet-G 처리에 따른 생산량의 변화를 측정하였다(도 20). 그 결과, 리툭시맵, 니볼루맵 및 펨브롤리주맵 항체 모두를 발현함에 있어서 Thiamet-G를 처리한 경우 경쇄의 생산량이 2배 이상 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이렇게 Thiamet-G의 처리로 생산량이 증가한 리툭시맵, 니볼루맵 및 펨브롤리주맵의 경쇄 서열을 CLUSTAWL로 비교한 결과(도 21), 5' 말단으로부터 3가지 항체 모두 7번째, 12번째 및 14번째에 세린 잔기를 포함하는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 14] 항체의 생산량 증가 확인(5)
리툭시맵, 니볼루맵 및 펨브롤리주맵 각각을 발현하는 CHO 세포주를 1x10^6 세포수로 60mm 플레이트에서 배양하였다. 다음 날, CHO 배지 3ml에 Thiamet-G를 50uM로 처리하여 7일 간 30 ℃에서 배양한 후 배지를 수확(harvest) 하였다. 배지 동량을 전기영동하여 단백을 크기 별로 분리한 후, PVDF 막으로 영동시켰다. 막에 전기적으로 전달된 단백질 이외의 부분을 5 중량% 탈지 우유(non-fat milk), 0.1 중량% Tween 20이 함유된 TBS-T로 상온에서 1시간 동안 블러킹(blocking)하고, 항-인간-HRP(Anti-human-HRP)와 항-마우스-HRP(Anti-Mouse-HRP)(RITUXIMAB은 human과 mouse가 합쳐진 chimeric 항체) 항체를 1:1 또는 1:2의 비율로 상온에서 30분 배양한 후 TBS-T로 10분씩 세 번 세척하였다. ECL 용액을 사용하여 X-ray 필름에 감광시켰다(도 22 및 23). 그 결과, 리툭시맵, 니볼루맵 및 펨브롤리주맵 항체 모두를 발현함에 있어서 Thiamet-G를 처리한 경우 생산량이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 15] Thiamet-G 처리 농도에 따른 항체의 생산량 증가 확인
실시예 1과 동일한 방법으로 리툭시맵 항체를 제작하되, Thiamet-G를 0, 30uM 또는 50uM로 72 시간 동안 처리하였다. 배지 동량을 전기영동하여 단백을 크기 별로 분리한 후, PVDF 막으로 영동시켰다. 막에 전기적으로 전달된 단백질 이외의 부분을 5 중량% 탈지 우유(non-fat milk), 0.1 중량% Tween 20이 함유된 TBS-T로 상온에서 1시간 동안 블러킹(blocking)하고, 항-인간-HRP(Anti-human-HRP)와 항-마우스-HRP(Anti-Mouse-HRP)(RITUXIMAB은 human과 mouse가 합쳐진 chimeric 항체) 항체를 1:1 또는 1:2의 비율로 상온에서 30분 배양한 후 TBS-T로 10분씩 세 번 세척하였다. ECL 용액을 사용하여 X-ray 필름에 감광시켰다(도 24 및 25). 그 결과, Thiamet-G의 처리량이 증가할수록 리툭시맵의 생산량 또한 비례적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명은 생산성이 향상된 항체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Claims (27)

  1. 경쇄에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산(hydroxyamino acid)이 O-결합 글리코실화(O-linked glycosylation)된 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째, 51번째, 55번째, 62번째, 101번째, 155번째 및 181번째 중 적어도 하나에 하이드록시아미노산 잔기를 포함하는 것인, 항체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 항체는 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나에 하이드록시아미노산 잔기를 포함하는 것인, 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 하이드록시아미노산은 세린(Serine), 트레오닌(Threonine, Thr) 또는 티로신(Tyrosine, Tyr) 잔기인, 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 O-결합 글리코실화는 상기 경쇄에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산에 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)이 결합된 것인, 항체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 항-CD20 항체 또는 항-PD-1 항체인, 항체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 리툭시맵(Rituximab)인, 항체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 항체는 리툭시맵의 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째, 51번째, 55번째, 62번째, 101번째, 155번째 및 181번째 중 적어도 하나의 하이드록시아미노산 잔기가 글리코실화된 것인, 항체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 항체는 리툭시맵의 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째, 51번째, 55번째, 62번째, 101번째, 155번째 및 181번째 중 적어도 하나의 세린(Ser) 잔기에 N-아세틸글루코사민이 O-결합된 것인, 항체.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 항-PD-L1 항체는 니볼루맵(Nivolumab), 펨브롤리주맵(Pembrolizumab) 또는 피딜리주맵(Pidilizumab)인, 항체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 항체는 상기 니볼루맵, 펨브롤리주맵 또는 피딜리주맵의 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나의 하이드록시아미노산 잔기가 글리코실화된 것인, 항체.
  12. 항체의 경쇄에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산(hydroxyamino acid)을 O-결합 글리코실화(O-linked glycosylation)하는 단계를 포함하는, 항체를 제조하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 방법은 항체를 준비하는 단계를 더 포함하는, 항체를 제조하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 항체는 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째, 51번째, 55번째, 62번째, 101번째, 155번째 및 181번째 중 적어도 하나에 하이드록시아미노산 잔기를 포함하는 것인, 항체를 제조하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 항체는 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나에 하이드록시아미노산 잔기를 포함하는 것인, 항체를 제조하는 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 항체는 항-CD20 항체 또는 항-PD-1 항체인, 항체를 제조하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 리툭시맵(Rituximab)인, 항체를 제조하는 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 항-PD-L1 항체는 니볼루맵(Nivolumab), 펨브롤리주맵(Pembrolizumab) 또는 피딜리주맵(pidilizumab)인, 항체를 제조하는 방법.
  19. 제13항에 있어서,
    상기 항체를 준비하는 단계는 항체를 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로 형질 전환된 숙주 세포를 준비하고 배양하며 수행되는 것인, 항체를 제조하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 O-결합 글리코실화하는 단계는 상기 숙주 세포의 배양 시 O-GlcNAcase 억제제(O-GlcNAcase inhibitor; OGA inhibitor)를 첨가하는 것인, 항체를 제조하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 O-GlcNAcase 억제제는 티아멧-G (Thiamet-G), 스트렙토조토신(streptozotocin; STZ), PUGNAc, NAG-티아졸린(NAG-thiazoline), NButGT, (2R,3S)-이미노시클리톨((2R,3S)-iminocyclitol), PUGNAc-이미다졸 하이브리드(PUGNAc-imidazole hybrid) 및 GlcNAc스타틴 C(GlcNAcstatin C)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 항체를 제조하는 방법.
  22. 제12항에 있어서,
    상기 하이드록시아미노산은 세린(Serine), 트레오닌(Threonine, Thr) 또는 티로신(Tyrosine, Tyr) 잔기인, 항체를 제조하는 방법.
  23. 제12항에 있어서,
    상기 O-결합 글리코실화하는 단계는 상기 경쇄에 포함된 하나 이상의 하이드록시아미노산에 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine; GlcNAc)이 결합되는 것인, 항체를 제조하는 방법.
  24. 제17항에 있어서,
    상기 O-결합 글리코실화하는 단계는 상기 리툭시맵의 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째, 14번째, 26번째, 51번째, 55번째, 62번째, 101번째, 155번째 및 181번째 중 적어도 하나의 하이드록시아미노산 잔기를 글리코실화하는 것인, 항체를 제조하는 방법.
  25. 제18항에 있어서,
    상기 O-결합 글리코실화하는 단계는 상기 니볼루맵, 펨브롤리주맵 또는 피딜리주맵의 경쇄의 5' 말단으로부터 7번째, 12번째 및 14번째 중 적어도 하나에 하이드록시아미노산 잔기를 글리코실화하는 것인, 항체를 제조하는 방법.
  26. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  27. 암을 예방 또는 치료하기 위하여, 목적하는 개체에 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법.
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