JP2023503258A - 活性化可能サイトカインポリペプチド及びその使用方法 - Google Patents

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ダニエル ヒックリン，
ガルシア， ホセ アンドレス サルメロン
ヘザー ブロドキン，
シンシア サイデル－デュガン，
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ウェアウルフ セラピューティクス， インコーポレイテッド
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Abstract

本開示は、関心対象のサイトカインの条件的活性多様体である融合タンパク質を特徴とする。一態様において、本発明の完全長ポリペプチドは、機能性サイトカインポリペプチドを含有するにもかかわらず、低減されたかまたは最小限に抑えられたサイトカイン受容体賦活作用を有する。サイトカインは、例えば活性サイトカインに阻止部分、例えば立体的阻止ポリペプチドを一続きに結び付けているリンカーの切断によって活性化されると、その受容体に結合し得、シグナル伝達をもたらし得る。典型的には、融合タンパク質は、腫瘍微小環境でサイトカインから切り離され得るものである生体内半減期延長要素をさらに含む。【選択図】図１Ａ

Description

本出願は、２０１９年１１月１４日に出願された米国仮出願第６２／９３５，６０５号の利益を主張するものであり、参照によりその教示内容全体を本明細書に援用する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出された配列表を含有し、これをもって参照によりその全体を援用する。上記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年１１月１２日に作成されたものであり、名前が７６１１４６＿０００１４６＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが２，９７４，２１１バイトである。
専任性が低い前駆体からの成熟免疫正常リンパ系細胞の発達、その後の抗原に起因するそれらの免疫応答、及びこれらの望まれない自己反応性応答の抑制は、共通γ鎖（γｃ）ファミリー内の受容体（Ｒｏｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）を利用するサイトカイン（インターロイキン－２［ＩＬ－２］、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１を含む）、ならびにＩＬ－１２、１８及び２３を含むファミリーメンバーに大きく依存し、かつそれによって調節される。ＩＬ－２は、胸腺でのＴｒｅｇ細胞の発達に必須であり、成熟末梢性Ｔｒｅｇ及び通常の抗原活性化Ｔ細胞のいくつかの肝要な側面を決定的に調節する。ＩＬ－２は、試験管内でのその強力なＴ細胞成長因子作用ゆえに、部分的に大掛かりに研究されてきた、というのも、この作用は、例えばがん及びＡＩＤＳ－ＨＩＶ患者において免疫性を直接増強するための潜在的な手段、または望まれない応答、例えば移植片拒絶反応及び自己免疫疾患に抗するための標的を提示したからである。試験管内でのＩＬ－２に関する試験は、これらの試験に対する強力な理論的解釈を提供するものであったが、生体内でのＩＬ－２の機能は、免疫性の喪失ではなく急速な致死的自己免疫症候群が認められたＩＬ－２欠損マウス（Ｓａｄｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９３，１９９５）で最初に示されたように、よりはるかに複雑であることが明らかである。後に、同様の観察結果が、ＩＬ－２Ｒα（Ｉｌ２ｒａ）及びＩＬ－２Ｒβ（Ｉｌ２ｒｂ）をコードする遺伝子を個別に除去した場合に認められた（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｗｉｌｌｅｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
本発明は、がん、及び免疫の上方または下方制御に依存する他の疾患の治療に使用するための、条件的に活性となる及び／または標的化されるサイトカインに関する。例えば、いくつかのサイトカインの抗腫瘍活性についてはよく知られ、記載がなされており、いくつかのサイトカインはヒトにおいて既に治療的に使用されている。インターロイキン－２（ＩＬ－２）及びインターフェロンα（ＩＦＮα）などのサイトカインは、種々の腫瘍、例えば転移性腎臓癌腫、有毛細胞白血病、カポジ肉腫、メラノーマ、多発性骨髄腫などを有する患者において正の抗腫瘍活性を示した。ＩＦＮβ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＴＮＦβ、ＩＬ－１、４、６、１２、１５及びＣＳＦのような他のサイトカインは、いくつかの類の腫瘍に対して一定の抗腫瘍活性を示しており、それゆえ、さらなる試験の対象物である。
治療用タンパク質、当該タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、ならびに疾患または障害、例えば、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病などの治療のための当該タンパク質及び当該核酸を使用する方法及び組成物を本明細書に提供する。ある実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１９３～２７１のいずれか１つのアミノ酸配列。本明細書に開示される特定の融合タンパク質は、ＡＣＰ２００～２０８、ＡＣＰ２１１、ＡＣＰ２１３～ＡＣＰ２１５、ＡＣＰ２４０～ＡＣＰ２４５、ＡＣＰ２４７、ＡＣＰ２８４～ＡＣＰ２９２、ＡＣＰ２９６～ＡＣＰ３００、ＡＣＰ３０２～ＡＣＰ３０６、ＡＣＰ３０９～ＡＣＰ３１４、ＡＣＰ３３６～ＡＣＰ３５９、ＡＣＰ３７１～ＡＣＰ３７９、ＡＣＰ３８３～ＡＣＰ４３４、ＡＣＰ４３９～ＡＣＰ４４７、またはＡＣＰ４５１～ＡＣＰ４７１と呼称される。本開示はまた、融合タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、融合タンパク質を作る方法、融合タンパク質を含む組成物ならびに、２つ以上の融合タンパク質の組合せ、及び別の治療剤と組み合わせた１つ以上の融合タンパク質を含む、がんを治療するための融合タンパク質の使用方法に関する。
本発明は、関心対象のサイトカインの条件的活性多様体である融合タンパク質を特徴とする。特に興味深いサイトカインとしては、ＩＬ－２、ＩＬ－１２及びＩＦＮが挙げられる。一態様において、本発明の完全長ポリペプチドは、機能性サイトカインポリペプチドを含有するにもかかわらず、低減されたかまたは最小限に抑えられたサイトカイン受容体賦活作用を有する。サイトカイン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、リンホトキシン、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１または上記のいずれかの機能性断片もしくはムテインもしくは機能性多様体もしくはサブユニットは、例えば活性サイトカインに阻止部分、例えば立体的阻止ポリペプチドを一続きに結び付けているリンカーの切断によって活性化されると、その受容体に結合し得、シグナル伝達をもたらし得る。所望により、完全長ポリペプチドは、付加的な有益な特性も提供する阻止ポリペプチド部分を含み得る。例えば、完全長ポリペプチドは、血清中半減期を延長すること及び／または完全長ポリペプチドを所望のサイトカイン作用部位に指向することも行う阻止ポリペプチド部分を含有し得る。あるいは、完全長融合ポリペプチドは、阻止ポリペプチド部分とは別個の、血清中半減期延長要素及び／または標的指向性ドメインを含有し得る。好ましくは、融合タンパク質は、生体内での循環半減期を延ばすことができる少なくとも１つの要素またはドメインを含有する。好ましくは、この要素は、身体の所望の場所において酵素的に除去され（例えば、腫瘍微小環境におけるプロテアーゼ切断）、搭載薬分子（例えば、ＩＬ２、ＩＬ－１２、ＩＦＮｂまたはＩＦＮａ）の薬物動態特性を天然に存在する搭載薬分子と実質的に同程度に回復させる。融合タンパク質は所望の細胞または組織を標的とし得る。
融合ポリペプチドは、典型的には、サイトカインポリペプチド［Ａ］、阻止部分［Ｄ］、任意選択の半減期延長部分［Ｈ］、及びプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーを含む。サイトカインポリペプチドと、阻止部分と、存在する場合の任意選択の半減期延長要素とはプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーによって機能可能に連結されており、融合ポリペプチドは、弱化したサイトカイン受容体賦活作用を有し、例えば、融合ポリペプチドのサイトカイン受容体賦活作用は、プロテアーゼ切断可能リンカーの切断によって生成したサイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体賦活作用に比べて約１０分の１以下である。いくつかの好ましい融合ポリペプチドは、式（Ｉ）～（ＶＩ）：
［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｈ］－［Ｌ２］－［Ｄ］（Ｉ）；
［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｈ］－［Ｌ１］－［Ａ］（ＩＩ）；
［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｈ］（ＩＩＩ）；
［Ｈ］－［Ｌ２］－［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］（ＩＶ）；
［Ｈ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２’］－［Ｄ］（Ｖ）；
［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２’］－［Ｈ］（ＶＩ）；
〔式中、Ａはサイトカインポリペプチドであり、Ｄは阻止部分であり、Ｈは半減期延長部分であり、Ｌ１はプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーであり、Ｌ２は、任意選択的にプロテアーゼ切断可能であるポリペプチドリンカーであり、Ｌ２’はプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーである〕
のうちの１つで表されるものである。Ｌ１及びＬ２、またはＬ１及びＬ２’は、所望により同じまたは異なるアミノ酸配列及びまたはプロテアーゼ切断部位を有し得る（Ｌ２がプロテアーゼ切断可能である場合）。
いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、ＩＬ－１２、ＩＬ－２またはＩＦＮの条件的活性多様体である。実施形態では、融合タンパク質はＩＬ－２ポリペプチドを含有し得る。ＩＬ－２ポリペプチドを含有する融合タンパク質は、配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８及び６３６～６４６のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなる。配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６として開示される融合タンパク質は、本明細書においてＡＣＰ２８９～ＡＣＰ２９２、ＡＣＰ２９６～ＡＣＰ３０２、ＷＷ０３０１、ＡＣＰ３０４～ＡＣＰ３０６、ＡＣＰ３０９～ＡＣＰ３１３、ＷＷ０３５３、ＡＣＰ４１４、ＡＣＰ３３６～ＡＣＰ３９８、ＷＷ０４７２～ＷＷ０４７７、ＡＣＰ４０６～ＡＣＰ４２６、ＡＣＰ４３９～ＡＣＰ４４７、ＡＣＰ４５１～ＡＣＰ４７１、ＷＷ０７２９、ＷＷ０７３４～ＷＷ０７９２、ＡＣＰ１０１、ＡＣＰ２９３～ＡＣＰ２９５、ＡＣＰ３１６～ＡＣＰ３３５、ＡＣＰ４２７～ＡＣＰ４３８及びＡＣＰ４４８～ＡＣＰ４５０と呼称される。例えば、融合タンパク質は配列番号２７２のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号２８６のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号３６２のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号３３６のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号３４８のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号３６３のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号５８０のアミノ酸配列を含み得る。
実施形態では、融合タンパク質はＩＬ－１２を含有し得る。ＩＬ－１２ポリペプチドを含有する融合タンパク質は、配列番号３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９または５２３～５３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。配列番号３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９または５２３～５３８として開示される融合タンパク質は、本明細書においてＡＣＰ２４０～ＡＣＰ２４５、ＡＣＰ２４７、ＡＣＰ２８５～ＡＣＰ２８８、ＷＷ０６４１、ＷＷ０６４９～ＷＷ０６５２、ＷＷ０６６２～ＷＷ０７２５、ＷＷ０７６５～ＷＷ０７７２及びＷＷ０７９６～ＷＷ０８０３と呼称される。例えば、融合タンパク質は配列番号４２４のアミノ酸配列を含み得る。例えば、融合タンパク質は配列番号４２８のアミノ酸配列を含み得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５４１のアミノ酸配列を含み得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５５６のアミノ酸配列を含み得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５６０のアミノ酸配列を含み得る。例えば、融合タンパク質は、配列番号５６８のアミノ酸配列を含み得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５７３のアミノ酸配列を含み得る。
実施形態では、融合タンパク質はＩＦＮを含有する。ＩＦＮポリペプチドを含有する融合タンパク質は、配列番号４２１～４３０及び５３９～５７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。配列番号４２１～４３０及び５３９～５７８として開示される融合タンパク質は、本明細書においてＡＣＰ２００～ＡＣＰ２０９、ＷＷ０６４４～ＷＷ０６４８、ＷＷ０７８１～ＷＷ０７８６、ＷＷ０８１５～ＷＷ０８２２、ＷＷ０８３１～ＷＷ０８３４、ＷＷ０７３７～ＷＷ０７４８及びＷＷ０７８７～ＷＷ０７９０と呼称され得る。
いくつかの態様において、本明細書に開示される融合ポリペプチドは、第２ポリペプチド鎖に共有結合または非共有結合で結合され得る。例えば、融合ポリペプチドが二量体化する（つまり、二量体を形成する）こともあり、または融合ポリペプチドの一部が別のポリペプチドと会合してもよく、その結果、例えば、サイトカインポリペプチドまたは血清アルブミンに対する機能性結合部位が形成され得る。ある実施形態では、第２ポリペプチド鎖と融合ポリペプチド上の阻止部分とが相補的であり、一緒になって、融合ポリペプチド中に含有されるサイトカインポリペプチドに対する特異性を有する機能性結合部位を形成する。融合ポリペプチドの阻止部分と相補的な第２ポリペプチドとによって形成され得る例示的な機能性結合部位としては、抗体の抗原結合部位、例えば、抗体のＦａｂ断片またはその一部が挙げられる。例えば、サイトカインに結合するＦａｂの片方の鎖が融合ポリペプチドの阻止部分、例えばＶＨ－ＣＨ１であり得、相補的なＶＬ－ＣＬが第２ポリペプチドの一部であり得る。そのような場合、融合タンパク質の阻止部分すなわちＶＨ－ＣＨ１と、相補的なＶＬ－ＣＬを含む第２ポリペプチドとが会合して、融合タンパク質中に含有されるサイトカインポリペプチド（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ）に対する特異性を有する機能性結合部位を形成し得、サイトカインポリペプチド活性を弱化させ得る。
実施形態では、ＩＬ－２サイトカインポリペプチドを含有する融合タンパク質は、第２ポリペプチド鎖に共有結合または非共有結合で結合され得る。第２ポリペプチド鎖は、配列番号２６３、２６４または３３３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬを含有し得る。そのような第２ポリペプチドは、融合タンパク質中、例えば配列番号３６２、３６３、３２５、２８６、５７９、５８１または５８２の中に含有される相補的なＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドと結合し得る。配列番号２６３、２６４及び３３３として開示される第２ポリペプチド鎖は、本明細書においてＷＷ０５２３（ＡＣＰ３８１）、ＷＷ０５２４（ＡＣＰ３８２）またはＷＷ０５５６（ＡＣＰ４１４）と呼称され得る。
実施形態では、融合ポリペプチドは配列番号３６２、３６３、３２５、２８６、５７９、５８１または５８２のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６３、２６４または３３３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。配列番号３６２、３６３、３２５、２８６、５７９、５８１または５８２として開示される融合ポリペプチドは、ＷＷ０５２０（ＡＣＰ３７８）、ＷＷ０５２１（ＡＣＰ３７９）、ＷＷ０５４８（ＡＣＰ４０６）、ＷＷ０６２１（ＡＣＰ４５７）、ＷＷ０７２９、ＷＷ０７３５またはＷＷ０７３６と呼称され得、配列番号２６３、２６４及び３３３として開示される第２ポリペプチド鎖は、本明細書においてＷＷ０５２３（ＡＣＰ３８１）、ＷＷ０５２４（ＡＣＰ３８２）またはＷＷ０５５６（ＡＣＰ４１４）と呼称され得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３６２のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３６２のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６４のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３６２のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号３３３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３６３のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３６３のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６４のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３６３のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号３３３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３２５のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６４のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３２５のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号３３３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３２５のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号２８６のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号２８６のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６４のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号２８６のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチドは配列番号３３３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５７９のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５７９のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６４のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５７９のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２３３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５８１を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６３を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５８１を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６４を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５８１を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号３３３を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５８２を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６３を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５８２を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６４を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５８２を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号３３３を含み得るかまたはそれからなり得る。
本明細書に記載されるとおり、標的指向は、所望の標的との結合もする阻止ポリペプチド部分の作用によって、または標的指向性ドメインによって成し遂げられる。好ましい標的に付いている標的抗原（例えば腫瘍特異抗原）を認識するドメインをサイトカインに切断可能または非切断可能リンカーを介して結合させてもよい。非切断可能リンカーによって結合している場合に標的指向性ドメインは、さらに腫瘍内でサイトカインを保持することに役立ち得、それは保持ドメインとみなされ得る。標的指向性ドメインが必ずしも搭載薬分子に直接連結されている必要はなく、それは融合タンパク質の別の要素に直接連結されていてもよい。これは、標的指向性ドメインが切断可能リンカーを介して結合している場合に特に言えることである。
一態様において、サイトカインポリペプチド、または機能性断片、そのムテイン、その機能性多様体もしくはそのサブユニット、及び阻止部分、例えば立体的阻止ドメインを含む、融合ポリペプチドが提供される。阻止部分は、直接またはリンカーを介してサイトカインポリペプチドに融合しており、融合部位もしくはリンカーでの、またはその近傍での、あるいは阻止部分内での融合ポリペプチドの切断（例えばプロテアーゼ媒介切断）によってサイトカインポリペプチドから分離され得る。例えば、サイトカインポリペプチドが、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーを介して阻止部分に融合している場合、リンカーのプロテアーゼ媒介切断を経てサイトカインポリペプチドが阻止部分から遊離し、その受容体に結合し得る。リンカーは、標的外のサイトカイン作用を回避してサイトカイン療法の全体的毒性を低減しつつ、所望のサイトカイン作用部位で、例えば腫瘍微小環境中で切断されるように設計される。
阻止部分は血清中半減期延長要素としても機能し得る。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは別個の血清中半減期延長要素をさらに含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは標的指向性ドメインをさらに含む。様々な実施形態において、血清中半減期延長要素は、水溶性ポリペプチド、例えば、任意選択的に分岐型もしくは多武装型であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、完全長ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、もしくはＦｃＲｎに対する結合性を維持している断片、Ｆｃ断片、またはＦｃＲｎに直接、もしくはヒト血清アルブミンに結合するナノボディである。
血清中半減期延長要素に加えて、本明細書に記載の医薬組成物は、１つ以上の標的抗原に、または単一の標的抗原の上の１つ以上の領域に結合する少なくとも１つ以上の標的指向性ドメインを含むことが好ましい。本発明のポリペプチド構築物が例えば疾患特異的微小環境または対象の血液の中で、プロテアーゼ切断部位において切断されること、及び標的指向性ドメイン（複数可）が標的細胞上の標的抗原に結合するものであることは、本明細書において企図される。少なくとも１つの標的抗原は、疾患、障害または病態に関与及び／または関連する。例示的な標的抗原としては、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病または宿主対移植片病に関連するものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、標的抗原は細胞表面分子、例えば、タンパク質、脂質または多糖である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞上、ウイルス感染細胞上、細菌感染細胞上、損傷赤血球上、動脈プラーク細胞上または線維組織細胞上にある。
標的抗原は、場合によっては、疾患細胞または組織、例えば腫瘍またはがん細胞の表面に発現する。腫瘍のための標的抗原としては、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰａ）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質２（Ｔｒｏｐ２）、フィブロネクチンＥＤＢ（ＥＤＢ－ＦＮ）、フィブロネクチンＥＩＩＩＢドメイン、ＣＧＳ－２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ＦＯＬＲ１、ＦＡＰ及びＣＥＡが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示される医薬組成物は、疾患細胞または組織の上に発現することが知られている２つの異なる標的抗原に結合する２つの抗原結合ドメインを含むタンパク質も含む。抗原結合ドメインの例示的な対としては、ＥＧＦＲ／ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ／ＣＥＡ、及びＨＥＲ－２／ＨＥＲ－３が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは独立して、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、非Ｉｇドメイン、または標的抗原に特異的に結合するリガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは細胞表面分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ及びＦＯＬＲ１のうちの少なくとも１つから選択される腫瘍抗原に特異的に、かつ独立して結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは２つの異なる抗原に特異的に、かつ独立して結合し、当該抗原の少なくとも一方は、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ及びＦＯＬＲ１から選択される腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは保持ドメインとしての役割を果たし、非切断可能リンカーを介してサイトカインに結合している。
本明細書に記載されるとおり、サイトカイン阻止部分は、サイトカインに結合し得、それによってサイトカインの同族受容体の活性化を阻止し得る。
本開示はまた、本明細書に記載の条件的活性タンパク質をコードする核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ならびにそのような核酸を含有するベクター及び宿主細胞にも関する。
本開示はまた、条件的活性タンパク質、条件的活性タンパク質をコードする核酸、ならびにそのような核酸を含有するベクター及び宿主細胞を含有する、医薬組成物にも関する。典型的には、医薬組成物は１つ以上の生理学的に許容される担体及び／または賦形剤を含有する。
本開示はまた、有効量の条件的活性タンパク質、条件的活性タンパク質をコードする核酸、そのような核酸を含有するベクターまたは宿主細胞、及び上記のいずれかの医薬組成物の投与を、それを必要とする対象において行うことを含む、治療方法にも関する。典型的には、対象は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病もしくは宿主対移植片病を有する、またはその発症リスクを有する。
本開示はまた、治療を、それを必要とする対象において行うための、条件的活性タンパク質、条件的活性タンパク質をコードする核酸、そのような核酸を含有するベクターまたは宿主細胞、及び上記のいずれかの医薬組成物の使用にも関する。典型的には、対象は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病もしくは宿主対移植片病を有する、またはその発症リスクを有する。
本開示はまた、疾患、例えば、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病または宿主対移植片病を治療するための医薬品の製造のための、条件的活性タンパク質、条件的活性タンパク質をコードする核酸、そのような核酸を含有するベクターまたは宿主細胞の使用にも関する。
図１Ａ～１Ｅは、ＨＳＡの存在下でのＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－２レポーターアッセイにおけるＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ＩＬ－２の活性を表す。各ＩＬ－１２についてのＥＣ５０。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。図１Ａ～１Ｅはまた、各ＩＬ－２ポリペプチドについてのタンパク質切断アッセイの結果も示す。示される試験構築物には、ＷＷ０４７５（図１Ａ）、ＷＷ０５１７（図１Ｂ）、ＷＷ０５４８／５５６（図１Ｃ）、ＷＷ０７３５／５２３（図１Ｄ）及びＷＷ０６２１／５２３（図１Ｅ）が含まれる。 図１Ａ～１Ｅは、ＨＳＡの存在下でのＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－２レポーターアッセイにおけるＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ＩＬ－２の活性を表す。各ＩＬ－１２についてのＥＣ５０。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。図１Ａ～１Ｅはまた、各ＩＬ－２ポリペプチドについてのタンパク質切断アッセイの結果も示す。示される試験構築物には、ＷＷ０４７５（図１Ａ）、ＷＷ０５１７（図１Ｂ）、ＷＷ０５４８／５５６（図１Ｃ）、ＷＷ０７３５／５２３（図１Ｄ）及びＷＷ０６２１／５２３（図１Ｅ）が含まれる。 図１Ａ～１Ｅは、ＨＳＡの存在下でのＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－２レポーターアッセイにおけるＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ＩＬ－２の活性を表す。各ＩＬ－１２についてのＥＣ５０。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。図１Ａ～１Ｅはまた、各ＩＬ－２ポリペプチドについてのタンパク質切断アッセイの結果も示す。示される試験構築物には、ＷＷ０４７５（図１Ａ）、ＷＷ０５１７（図１Ｂ）、ＷＷ０５４８／５５６（図１Ｃ）、ＷＷ０７３５／５２３（図１Ｄ）及びＷＷ０６２１／５２３（図１Ｅ）が含まれる。 図１Ａ～１Ｅは、ＨＳＡの存在下でのＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－２レポーターアッセイにおけるＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ＩＬ－２の活性を表す。各ＩＬ－１２についてのＥＣ５０。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。図１Ａ～１Ｅはまた、各ＩＬ－２ポリペプチドについてのタンパク質切断アッセイの結果も示す。示される試験構築物には、ＷＷ０４７５（図１Ａ）、ＷＷ０５１７（図１Ｂ）、ＷＷ０５４８／５５６（図１Ｃ）、ＷＷ０７３５／５２３（図１Ｄ）及びＷＷ０６２１／５２３（図１Ｅ）が含まれる。 図１Ａ～１Ｅは、ＨＳＡの存在下でのＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－２レポーターアッセイにおけるＩＬ－２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ＩＬ－２の活性を表す。各ＩＬ－１２についてのＥＣ５０。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。図１Ａ～１Ｅはまた、各ＩＬ－２ポリペプチドについてのタンパク質切断アッセイの結果も示す。示される試験構築物には、ＷＷ０４７５（図１Ａ）、ＷＷ０５１７（図１Ｂ）、ＷＷ０５４８／５５６（図１Ｃ）、ＷＷ０７３５／５２３（図１Ｄ）及びＷＷ０６２１／５２３（図１Ｅ）が含まれる。 非切断可能対照ＷＷ０７２９／５２３の活性を示すグラフである。また、非切断可能対照についてのタンパク質切断アッセイの結果も示す。 図２Ａ～２Ｌは、ＩＬ－２ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。黒四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、白四角は切断されたＩＬ－２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＬ－２）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す（ヒトＩＬ－２）。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５５６（図２Ａ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２４（図２Ｂ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２３（図２Ｃ）、ＷＷ０５２０／ＷＷ０５２４（図２Ｄ）、ＷＷ０５１７（図２Ｅ）、ＷＷ０５１６（図２Ｆ）、ＷＷ０４１７（図２Ｇ）、ＷＷ０３１７（図２Ｈ）、ＷＷ０３１７（図２Ｉ）、及びＷＷ０５２０／ＷＷ０５２３（図２Ｊ）、ＷＷ０６２１／ＷＷ０５２３（図２Ｋ）、ＷＷ００４８（図２Ｌ）が含まれる。 図２Ａ～２Ｌは、ＩＬ－２ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。黒四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、白四角は切断されたＩＬ－２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＬ－２）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す（ヒトＩＬ－２）。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５５６（図２Ａ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２４（図２Ｂ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２３（図２Ｃ）、ＷＷ０５２０／ＷＷ０５２４（図２Ｄ）、ＷＷ０５１７（図２Ｅ）、ＷＷ０５１６（図２Ｆ）、ＷＷ０４１７（図２Ｇ）、ＷＷ０３１７（図２Ｈ）、ＷＷ０３１７（図２Ｉ）、及びＷＷ０５２０／ＷＷ０５２３（図２Ｊ）、ＷＷ０６２１／ＷＷ０５２３（図２Ｋ）、ＷＷ００４８（図２Ｌ）が含まれる。 図２Ａ～２Ｌは、ＩＬ－２ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。黒四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、白四角は切断されたＩＬ－２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＬ－２）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す（ヒトＩＬ－２）。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５５６（図２Ａ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２４（図２Ｂ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２３（図２Ｃ）、ＷＷ０５２０／ＷＷ０５２４（図２Ｄ）、ＷＷ０５１７（図２Ｅ）、ＷＷ０５１６（図２Ｆ）、ＷＷ０４１７（図２Ｇ）、ＷＷ０３１７（図２Ｈ）、ＷＷ０３１７（図２Ｉ）、及びＷＷ０５２０／ＷＷ０５２３（図２Ｊ）、ＷＷ０６２１／ＷＷ０５２３（図２Ｋ）、ＷＷ００４８（図２Ｌ）が含まれる。 図２Ａ～２Ｌは、ＩＬ－２ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。黒四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、白四角は切断されたＩＬ－２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＬ－２）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す（ヒトＩＬ－２）。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５５６（図２Ａ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２４（図２Ｂ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２３（図２Ｃ）、ＷＷ０５２０／ＷＷ０５２４（図２Ｄ）、ＷＷ０５１７（図２Ｅ）、ＷＷ０５１６（図２Ｆ）、ＷＷ０４１７（図２Ｇ）、ＷＷ０３１７（図２Ｈ）、ＷＷ０３１７（図２Ｉ）、及びＷＷ０５２０／ＷＷ０５２３（図２Ｊ）、ＷＷ０６２１／ＷＷ０５２３（図２Ｋ）、ＷＷ００４８（図２Ｌ）が含まれる。 図２Ａ～２Ｌは、ＩＬ－２ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。黒四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、白四角は切断されたＩＬ－２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＬ－２）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す（ヒトＩＬ－２）。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５５６（図２Ａ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２４（図２Ｂ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２３（図２Ｃ）、ＷＷ０５２０／ＷＷ０５２４（図２Ｄ）、ＷＷ０５１７（図２Ｅ）、ＷＷ０５１６（図２Ｆ）、ＷＷ０４１７（図２Ｇ）、ＷＷ０３１７（図２Ｈ）、ＷＷ０３１７（図２Ｉ）、及びＷＷ０５２０／ＷＷ０５２３（図２Ｊ）、ＷＷ０６２１／ＷＷ０５２３（図２Ｋ）、ＷＷ００４８（図２Ｌ）が含まれる。 図２Ａ～２Ｌは、ＩＬ－２ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。黒四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、白四角は切断されたＩＬ－２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＬ－２）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す（ヒトＩＬ－２）。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５５６（図２Ａ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２４（図２Ｂ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２３（図２Ｃ）、ＷＷ０５２０／ＷＷ０５２４（図２Ｄ）、ＷＷ０５１７（図２Ｅ）、ＷＷ０５１６（図２Ｆ）、ＷＷ０４１７（図２Ｇ）、ＷＷ０３１７（図２Ｈ）、ＷＷ０３１７（図２Ｉ）、及びＷＷ０５２０／ＷＷ０５２３（図２Ｊ）、ＷＷ０６２１／ＷＷ０５２３（図２Ｋ）、ＷＷ００４８（図２Ｌ）が含まれる。 図２Ａ～２Ｌは、ＩＬ－２ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。黒四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、白四角は切断されたＩＬ－２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＬ－２）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す（ヒトＩＬ－２）。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５５６（図２Ａ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２４（図２Ｂ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２３（図２Ｃ）、ＷＷ０５２０／ＷＷ０５２４（図２Ｄ）、ＷＷ０５１７（図２Ｅ）、ＷＷ０５１６（図２Ｆ）、ＷＷ０４１７（図２Ｇ）、ＷＷ０３１７（図２Ｈ）、ＷＷ０３１７（図２Ｉ）、及びＷＷ０５２０／ＷＷ０５２３（図２Ｊ）、ＷＷ０６２１／ＷＷ０５２３（図２Ｋ）、ＷＷ００４８（図２Ｌ）が含まれる。 図２Ａ～２Ｌは、ＩＬ－２ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。黒四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、白四角は切断されたＩＬ－２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＬ－２）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す（ヒトＩＬ－２）。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５５６（図２Ａ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２４（図２Ｂ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２３（図２Ｃ）、ＷＷ０５２０／ＷＷ０５２４（図２Ｄ）、ＷＷ０５１７（図２Ｅ）、ＷＷ０５１６（図２Ｆ）、ＷＷ０４１７（図２Ｇ）、ＷＷ０３１７（図２Ｈ）、ＷＷ０３１７（図２Ｉ）、及びＷＷ０５２０／ＷＷ０５２３（図２Ｊ）、ＷＷ０６２１／ＷＷ０５２３（図２Ｋ）、ＷＷ００４８（図２Ｌ）が含まれる。 図２Ａ～２Ｌは、ＩＬ－２ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。黒四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、白四角は切断されたＩＬ－２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＬ－２）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す（ヒトＩＬ－２）。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５５６（図２Ａ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２４（図２Ｂ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２３（図２Ｃ）、ＷＷ０５２０／ＷＷ０５２４（図２Ｄ）、ＷＷ０５１７（図２Ｅ）、ＷＷ０５１６（図２Ｆ）、ＷＷ０４１７（図２Ｇ）、ＷＷ０３１７（図２Ｈ）、ＷＷ０３１７（図２Ｉ）、及びＷＷ０５２０／ＷＷ０５２３（図２Ｊ）、ＷＷ０６２１／ＷＷ０５２３（図２Ｋ）、ＷＷ００４８（図２Ｌ）が含まれる。 図２Ａ～２Ｌは、ＩＬ－２ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。黒四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、白四角は切断されたＩＬ－２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＬ－２）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す（ヒトＩＬ－２）。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５５６（図２Ａ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２４（図２Ｂ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２３（図２Ｃ）、ＷＷ０５２０／ＷＷ０５２４（図２Ｄ）、ＷＷ０５１７（図２Ｅ）、ＷＷ０５１６（図２Ｆ）、ＷＷ０４１７（図２Ｇ）、ＷＷ０３１７（図２Ｈ）、ＷＷ０３１７（図２Ｉ）、及びＷＷ０５２０／ＷＷ０５２３（図２Ｊ）、ＷＷ０６２１／ＷＷ０５２３（図２Ｋ）、ＷＷ００４８（図２Ｌ）が含まれる。 図２Ａ～２Ｌは、ＩＬ－２ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。黒四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、白四角は切断されたＩＬ－２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＬ－２）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す（ヒトＩＬ－２）。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５５６（図２Ａ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２４（図２Ｂ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２３（図２Ｃ）、ＷＷ０５２０／ＷＷ０５２４（図２Ｄ）、ＷＷ０５１７（図２Ｅ）、ＷＷ０５１６（図２Ｆ）、ＷＷ０４１７（図２Ｇ）、ＷＷ０３１７（図２Ｈ）、ＷＷ０３１７（図２Ｉ）、及びＷＷ０５２０／ＷＷ０５２３（図２Ｊ）、ＷＷ０６２１／ＷＷ０５２３（図２Ｋ）、ＷＷ００４８（図２Ｌ）が含まれる。 図２Ａ～２Ｌは、ＩＬ－２ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。黒四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、白四角は切断されたＩＬ－２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＬ－２）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す（ヒトＩＬ－２）。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５５６（図２Ａ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２４（図２Ｂ）、ＷＷ０５２１／ＷＷ０５２３（図２Ｃ）、ＷＷ０５２０／ＷＷ０５２４（図２Ｄ）、ＷＷ０５１７（図２Ｅ）、ＷＷ０５１６（図２Ｆ）、ＷＷ０４１７（図２Ｇ）、ＷＷ０３１７（図２Ｈ）、ＷＷ０３１７（図２Ｉ）、及びＷＷ０５２０／ＷＷ０５２３（図２Ｊ）、ＷＷ０６２１／ＷＷ０５２３（図２Ｋ）、ＷＷ００４８（図２Ｌ）が含まれる。 図３Ａ～３Ｊは、ＩＬ－２ Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ヒトＩＬ－２の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０３１７（図３Ａ）、ＷＷ０５１６（図３Ｂ）、ＷＷ０３５４（図３Ｃ）、ＷＷ０５１７（図３Ｄ）、ＷＷ０６２１／０５２３（図３Ｅ）、ＷＷ０５２１／５２４（図３Ｆ）、ＷＷ０５２０／０５２３（図３Ｇ）、ＷＷ０７２９／５２３（図３Ｈ）、及びＷＷ０７３５／５２３（図３１）、ＷＷ０５２０／５２４（図３Ｊ）が含まれる。 図３Ａ～３Ｊは、ＩＬ－２ Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ヒトＩＬ－２の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０３１７（図３Ａ）、ＷＷ０５１６（図３Ｂ）、ＷＷ０３５４（図３Ｃ）、ＷＷ０５１７（図３Ｄ）、ＷＷ０６２１／０５２３（図３Ｅ）、ＷＷ０５２１／５２４（図３Ｆ）、ＷＷ０５２０／０５２３（図３Ｇ）、ＷＷ０７２９／５２３（図３Ｈ）、及びＷＷ０７３５／５２３（図３１）、ＷＷ０５２０／５２４（図３Ｊ）が含まれる。 図３Ａ～３Ｊは、ＩＬ－２ Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ヒトＩＬ－２の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０３１７（図３Ａ）、ＷＷ０５１６（図３Ｂ）、ＷＷ０３５４（図３Ｃ）、ＷＷ０５１７（図３Ｄ）、ＷＷ０６２１／０５２３（図３Ｅ）、ＷＷ０５２１／５２４（図３Ｆ）、ＷＷ０５２０／０５２３（図３Ｇ）、ＷＷ０７２９／５２３（図３Ｈ）、及びＷＷ０７３５／５２３（図３１）、ＷＷ０５２０／５２４（図３Ｊ）が含まれる。 図３Ａ～３Ｊは、ＩＬ－２ Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ヒトＩＬ－２の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０３１７（図３Ａ）、ＷＷ０５１６（図３Ｂ）、ＷＷ０３５４（図３Ｃ）、ＷＷ０５１７（図３Ｄ）、ＷＷ０６２１／０５２３（図３Ｅ）、ＷＷ０５２１／５２４（図３Ｆ）、ＷＷ０５２０／０５２３（図３Ｇ）、ＷＷ０７２９／５２３（図３Ｈ）、及びＷＷ０７３５／５２３（図３１）、ＷＷ０５２０／５２４（図３Ｊ）が含まれる。 図３Ａ～３Ｊは、ＩＬ－２ Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ヒトＩＬ－２の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０３１７（図３Ａ）、ＷＷ０５１６（図３Ｂ）、ＷＷ０３５４（図３Ｃ）、ＷＷ０５１７（図３Ｄ）、ＷＷ０６２１／０５２３（図３Ｅ）、ＷＷ０５２１／５２４（図３Ｆ）、ＷＷ０５２０／０５２３（図３Ｇ）、ＷＷ０７２９／５２３（図３Ｈ）、及びＷＷ０７３５／５２３（図３１）、ＷＷ０５２０／５２４（図３Ｊ）が含まれる。 図３Ａ～３Ｊは、ＩＬ－２ Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ヒトＩＬ－２の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０３１７（図３Ａ）、ＷＷ０５１６（図３Ｂ）、ＷＷ０３５４（図３Ｃ）、ＷＷ０５１７（図３Ｄ）、ＷＷ０６２１／０５２３（図３Ｅ）、ＷＷ０５２１／５２４（図３Ｆ）、ＷＷ０５２０／０５２３（図３Ｇ）、ＷＷ０７２９／５２３（図３Ｈ）、及びＷＷ０７３５／５２３（図３１）、ＷＷ０５２０／５２４（図３Ｊ）が含まれる。 図３Ａ～３Ｊは、ＩＬ－２ Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ヒトＩＬ－２の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０３１７（図３Ａ）、ＷＷ０５１６（図３Ｂ）、ＷＷ０３５４（図３Ｃ）、ＷＷ０５１７（図３Ｄ）、ＷＷ０６２１／０５２３（図３Ｅ）、ＷＷ０５２１／５２４（図３Ｆ）、ＷＷ０５２０／０５２３（図３Ｇ）、ＷＷ０７２９／５２３（図３Ｈ）、及びＷＷ０７３５／５２３（図３１）、ＷＷ０５２０／５２４（図３Ｊ）が含まれる。 図３Ａ～３Ｊは、ＩＬ－２ Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ヒトＩＬ－２の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０３１７（図３Ａ）、ＷＷ０５１６（図３Ｂ）、ＷＷ０３５４（図３Ｃ）、ＷＷ０５１７（図３Ｄ）、ＷＷ０６２１／０５２３（図３Ｅ）、ＷＷ０５２１／５２４（図３Ｆ）、ＷＷ０５２０／０５２３（図３Ｇ）、ＷＷ０７２９／５２３（図３Ｈ）、及びＷＷ０７３５／５２３（図３１）、ＷＷ０５２０／５２４（図３Ｊ）が含まれる。 図３Ａ～３Ｊは、ＩＬ－２ Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ヒトＩＬ－２の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０３１７（図３Ａ）、ＷＷ０５１６（図３Ｂ）、ＷＷ０３５４（図３Ｃ）、ＷＷ０５１７（図３Ｄ）、ＷＷ０６２１／０５２３（図３Ｅ）、ＷＷ０５２１／５２４（図３Ｆ）、ＷＷ０５２０／０５２３（図３Ｇ）、ＷＷ０７２９／５２３（図３Ｈ）、及びＷＷ０７３５／５２３（図３１）、ＷＷ０５２０／５２４（図３Ｊ）が含まれる。 図３Ａ～３Ｊは、ＩＬ－２ Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。四角は未切断ＩＬ－２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ヒトＩＬ－２の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。示される試験構築物には、ＷＷ０３１７（図３Ａ）、ＷＷ０５１６（図３Ｂ）、ＷＷ０３５４（図３Ｃ）、ＷＷ０５１７（図３Ｄ）、ＷＷ０６２１／０５２３（図３Ｅ）、ＷＷ０５２１／５２４（図３Ｆ）、ＷＷ０５２０／０５２３（図３Ｇ）、ＷＷ０７２９／５２３（図３Ｈ）、及びＷＷ０７３５／５２３（図３１）、ＷＷ０５２０／５２４（図３Ｊ）が含まれる。 図４Ａ～４Ｇは、同系ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおいてＷＷ０４７５、ＷＷ０５２０／０５２３、ＷＷ０５４８／０５２４、ＷＷ０５４８／０５５６、ＷＷ０５１７、ＷＷ０６２１／０５２３、及びＷＷ０６１９ ＩＬ－２融合タンパク質を分析した結果を示すグラフである。各グラフは、示されている異なる用量の各融合タンパク質で処置されたマウスの経時的な平均腫瘍体積（平均＋／－標準誤差）を示す。データは用量依存的に腫瘍体積が経時的に減少することを示している。 図４Ａ～４Ｇは、同系ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおいてＷＷ０４７５、ＷＷ０５２０／０５２３、ＷＷ０５４８／０５２４、ＷＷ０５４８／０５５６、ＷＷ０５１７、ＷＷ０６２１／０５２３、及びＷＷ０６１９ ＩＬ－２融合タンパク質を分析した結果を示すグラフである。各グラフは、示されている異なる用量の各融合タンパク質で処置されたマウスの経時的な平均腫瘍体積（平均＋／－標準誤差）を示す。データは用量依存的に腫瘍体積が経時的に減少することを示している。 図４Ａ～４Ｇは、同系ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおいてＷＷ０４７５、ＷＷ０５２０／０５２３、ＷＷ０５４８／０５２４、ＷＷ０５４８／０５５６、ＷＷ０５１７、ＷＷ０６２１／０５２３、及びＷＷ０６１９ ＩＬ－２融合タンパク質を分析した結果を示すグラフである。各グラフは、示されている異なる用量の各融合タンパク質で処置されたマウスの経時的な平均腫瘍体積（平均＋／－標準誤差）を示す。データは用量依存的に腫瘍体積が経時的に減少することを示している。 図４Ａ～４Ｇは、同系ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおいてＷＷ０４７５、ＷＷ０５２０／０５２３、ＷＷ０５４８／０５２４、ＷＷ０５４８／０５５６、ＷＷ０５１７、ＷＷ０６２１／０５２３、及びＷＷ０６１９ ＩＬ－２融合タンパク質を分析した結果を示すグラフである。各グラフは、示されている異なる用量の各融合タンパク質で処置されたマウスの経時的な平均腫瘍体積（平均＋／－標準誤差）を示す。データは用量依存的に腫瘍体積が経時的に減少することを示している。 図４Ａ～４Ｇは、同系ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおいてＷＷ０４７５、ＷＷ０５２０／０５２３、ＷＷ０５４８／０５２４、ＷＷ０５４８／０５５６、ＷＷ０５１７、ＷＷ０６２１／０５２３、及びＷＷ０６１９ ＩＬ－２融合タンパク質を分析した結果を示すグラフである。各グラフは、示されている異なる用量の各融合タンパク質で処置されたマウスの経時的な平均腫瘍体積（平均＋／－標準誤差）を示す。データは用量依存的に腫瘍体積が経時的に減少することを示している。 図４Ａ～４Ｇは、同系ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおいてＷＷ０４７５、ＷＷ０５２０／０５２３、ＷＷ０５４８／０５２４、ＷＷ０５４８／０５５６、ＷＷ０５１７、ＷＷ０６２１／０５２３、及びＷＷ０６１９ ＩＬ－２融合タンパク質を分析した結果を示すグラフである。各グラフは、示されている異なる用量の各融合タンパク質で処置されたマウスの経時的な平均腫瘍体積（平均＋／－標準誤差）を示す。データは用量依存的に腫瘍体積が経時的に減少することを示している。 図４Ａ～４Ｇは、同系ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおいてＷＷ０４７５、ＷＷ０５２０／０５２３、ＷＷ０５４８／０５２４、ＷＷ０５４８／０５５６、ＷＷ０５１７、ＷＷ０６２１／０５２３、及びＷＷ０６１９ ＩＬ－２融合タンパク質を分析した結果を示すグラフである。各グラフは、示されている異なる用量の各融合タンパク質で処置されたマウスの経時的な平均腫瘍体積（平均＋／－標準誤差）を示す。データは用量依存的に腫瘍体積が経時的に減少することを示している。 図５Ａ～５Ｃは、図４Ａ～４Ｇに示されるデータに対応する、ＭＣ３８マウス同系モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のクモグラフである。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な腫瘍体積である。図５Ａは、ビヒクル処置、ならびに融合タンパク質ＷＷ０５１７及びＷＷ０５２０／５２３に対応するデータを含む。 図５Ａ～５Ｃは、図４Ａ～４Ｇに示されるデータに対応する、ＭＣ３８マウス同系モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のクモグラフである。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な腫瘍体積である。図５Ｂは、融合タンパク質ＷＷ０５４８／０５２４、ＷＷ０５４８／０５５６、及びＷＷ０４７５による処置に対応するデータを含む。 図５Ａ～５Ｃは、図４Ａ～４Ｇに示されるデータに対応する、ＭＣ３８マウス同系モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のクモグラフである。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な腫瘍体積である。図５Ｃは、融合タンパク質ＷＷ０６１９及びＷＷ０６２１／０５２３による処置に対応するデータを含む。 図６Ａ～６Ｃは、図５Ａ～５Ｃに示されるデータに対応する、ＭＣ３８マウス同系モデルにおける体重に対する融合タンパク質の影響を示す一連のクモグラフである。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な体重である。図６Ａは、ビヒクル処置、ならびに融合タンパク質ＷＷ０５１７及びＷＷ０５２０／５２３に対応するデータを含む。 図６Ａ～６Ｃは、図５Ａ～５Ｃに示されるデータに対応する、ＭＣ３８マウス同系モデルにおける体重に対する融合タンパク質の影響を示す一連のクモグラフである。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な体重である。図６Ｂは、融合タンパク質ＷＷ０５４８／０５２４、ＷＷ０５４８／０５５６、及びＷＷ０４７５による処置に対応するデータを含む。 図６Ａ～６Ｃは、図５Ａ～５Ｃに示されるデータに対応する、ＭＣ３８マウス同系モデルにおける体重に対する融合タンパク質の影響を示す一連のクモグラフである。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な体重である。図６Ｃは、融合タンパク質ＷＷ０６１９及びＷＷ０６２１／０５２３による処置に対応するデータを含む。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較したＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較したＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較したＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較したＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較したＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較したＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較したＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較したＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較したＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較したＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較したＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較したＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較したＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較したＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較したＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較したＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図７Ａ～７Ｑは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図７Ａ～７Ｑは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２またはヒトＩＬ－１２融合タンパク質と、キメラＩＬ－１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較されたＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図８Ａ～８Ｄは、ＩＬ１２ Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２またはヒトＩＬ１２融合タンパク質と、対照、キメラＩＬ－１２（ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２）または組換えヒトＩＬ１２とで比較されたＩＬ－１２シグナル伝達の活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照キメラＩＬ－１２または組換えヒトＩＬ－１２の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図８Ａ～８Ｄは、ＩＬ１２ Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２またはヒトＩＬ１２融合タンパク質と、対照、キメラＩＬ－１２（ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２）または組換えヒトＩＬ１２とで比較されたＩＬ－１２シグナル伝達の活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照キメラＩＬ－１２または組換えヒトＩＬ－１２の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図８Ａ～８Ｄは、ＩＬ１２ Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２またはヒトＩＬ１２融合タンパク質と、対照、キメラＩＬ－１２（ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２）または組換えヒトＩＬ１２とで比較されたＩＬ－１２シグナル伝達の活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照キメラＩＬ－１２または組換えヒトＩＬ－１２の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図８Ａ～８Ｄは、ＩＬ１２ Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２またはヒトＩＬ１２融合タンパク質と、対照、キメラＩＬ－１２（ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２）または組換えヒトＩＬ１２とで比較されたＩＬ－１２シグナル伝達の活性化を示す。四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＬ－１２ポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照キメラＩＬ－１２または組換えヒトＩＬ－１２の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図９Ａ～９Ｃは、ＩＬ－１２ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。Ａ～Ｂは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２融合タンパク質と組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較されたＩＬ－１２シグナル伝達の活性化を示す。Ｃは、ヒトＩＬ－１２（ヒトｐ４０／ヒトｐ３５ ＩＬ－１２）融合タンパク質と組換えヒトＩＬ１２とで比較されたＩＬ－１２シグナル伝達の活性化を示す。黒四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、白四角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図９Ａ～９Ｃは、ＩＬ－１２ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。Ａ～Ｂは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２融合タンパク質と組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較されたＩＬ－１２シグナル伝達の活性化を示す。Ｃは、ヒトＩＬ－１２（ヒトｐ４０／ヒトｐ３５ ＩＬ－１２）融合タンパク質と組換えヒトＩＬ１２とで比較されたＩＬ－１２シグナル伝達の活性化を示す。黒四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、白四角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図９Ａ～９Ｃは、ＩＬ－１２ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。Ａ～Ｂは、ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ－１２融合タンパク質と組換えヒトＩＬ－１２（対照）とで比較されたＩＬ－１２シグナル伝達の活性化を示す。Ｃは、ヒトＩＬ－１２（ヒトｐ４０／ヒトｐ３５ ＩＬ－１２）融合タンパク質と組換えヒトＩＬ１２とで比較されたＩＬ－１２シグナル伝達の活性化を示す。黒四角は未切断ＩＬ－１２ポリペプチド（完全型）の活性を表し、白四角は切断されたポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図１０Ａ～１０Ｊは、Ｂ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図１０Ａ～１０Ｊは、マウスＩＮＦα融合タンパク質とマウスＩＮＦα（対照）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＮＦαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＮＦαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（マウスＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。図１０Ａ～１０Ｊはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果も示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図１０Ａ～１０Ｊは、Ｂ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図１０Ａ～１０Ｊは、マウスＩＮＦα融合タンパク質とマウスＩＮＦα（対照）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＮＦαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＮＦαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（マウスＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。図１０Ａ～１０Ｊはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果も示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図１０Ａ～１０Ｊは、Ｂ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図１０Ａ～１０Ｊは、マウスＩＮＦα融合タンパク質とマウスＩＮＦα（対照）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＮＦαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＮＦαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（マウスＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。図１０Ａ～１０Ｊはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果も示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図１０Ａ～１０Ｊは、Ｂ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図１０Ａ～１０Ｊは、マウスＩＮＦα融合タンパク質とマウスＩＮＦα（対照）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＮＦαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＮＦαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（マウスＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。図１０Ａ～１０Ｊはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果も示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図１０Ａ～１０Ｊは、Ｂ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図１０Ａ～１０Ｊは、マウスＩＮＦα融合タンパク質とマウスＩＮＦα（対照）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＮＦαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＮＦαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（マウスＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。図１０Ａ～１０Ｊはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果も示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図１０Ａ～１０Ｊは、Ｂ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図１０Ａ～１０Ｊは、マウスＩＮＦα融合タンパク質とマウスＩＮＦα（対照）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＮＦαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＮＦαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（マウスＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。図１０Ａ～１０Ｊはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果も示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図１０Ａ～１０Ｊは、Ｂ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図１０Ａ～１０Ｊは、マウスＩＮＦα融合タンパク質とマウスＩＮＦα（対照）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＮＦαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＮＦαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（マウスＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。図１０Ａ～１０Ｊはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果も示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図１０Ａ～１０Ｊは、Ｂ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図１０Ａ～１０Ｊは、マウスＩＮＦα融合タンパク質とマウスＩＮＦα（対照）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＮＦαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＮＦαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（マウスＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。図１０Ａ～１０Ｊはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果も示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図１０Ａ～１０Ｊは、Ｂ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図１０Ａ～１０Ｊは、マウスＩＮＦα融合タンパク質とマウスＩＮＦα（対照）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＮＦαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＮＦαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（マウスＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。図１０Ａ～１０Ｊはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果も示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図１０Ａ～１０Ｊは、Ｂ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図１０Ａ～１０Ｊは、マウスＩＮＦα融合タンパク質とマウスＩＮＦα（対照）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＮＦαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＮＦαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（マウスＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。図１０Ａ～１０Ｊはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果も示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図１１Ａ～１１Ｂは、プロテアーゼ切断の前及び後のヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質に対して実施されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイからの結果を示すグラフである。構築物ＡＣＰ３５（Ａ）及びＡＣＰ３４（Ｂ）を試験した。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（登録商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。結果は、ＩＬ１２タンパク質融合タンパク質が活性であることを裏付けている。 図１１Ａ～１１Ｂは、プロテアーゼ切断の前及び後のヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質に対して実施されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイからの結果を示すグラフである。構築物ＡＣＰ３５（Ａ）及びＡＣＰ３４（Ｂ）を試験した。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（登録商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。結果は、ＩＬ１２タンパク質融合タンパク質が活性であることを裏付けている。 図１２Ａ～１２Ｆは、ＭＭＰ９による切断の前及び後の４つのＩＬ－１２融合タンパク質のＨＥＫ－ｂｌｕｅアッセイの結果を示す一連のグラフを示す。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。データは、完全な融合タンパク質よりも切断型ＩＬ１２における方が活性が高いことを示している。試験した構築物は、ＡＣＰ０６（図１２Ａ）、ＡＣＰ０７（図１２Ｃ）、ＡＣＰ０８（図１２Ｂ）、ＡＣＰ０９（図１２Ｄ）、ＡＣＰ１０（図１２Ｅ）、ＡＣＰ１１（図１２Ｆ）であった。 図１２Ａ～１２Ｆは、ＭＭＰ９による切断の前及び後の４つのＩＬ－１２融合タンパク質のＨＥＫ－ｂｌｕｅアッセイの結果を示す一連のグラフを示す。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。データは、完全な融合タンパク質よりも切断型ＩＬ１２における方が活性が高いことを示している。試験した構築物は、ＡＣＰ０６（図１２Ａ）、ＡＣＰ０７（図１２Ｃ）、ＡＣＰ０８（図１２Ｂ）、ＡＣＰ０９（図１２Ｄ）、ＡＣＰ１０（図１２Ｅ）、ＡＣＰ１１（図１２Ｆ）であった。 図１２Ａ～１２Ｆは、ＭＭＰ９による切断の前及び後の４つのＩＬ－１２融合タンパク質のＨＥＫ－ｂｌｕｅアッセイの結果を示す一連のグラフを示す。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。データは、完全な融合タンパク質よりも切断型ＩＬ１２における方が活性が高いことを示している。試験した構築物は、ＡＣＰ０６（図１２Ａ）、ＡＣＰ０７（図１２Ｃ）、ＡＣＰ０８（図１２Ｂ）、ＡＣＰ０９（図１２Ｄ）、ＡＣＰ１０（図１２Ｅ）、ＡＣＰ１１（図１２Ｆ）であった。 図１２Ａ～１２Ｆは、ＭＭＰ９による切断の前及び後の４つのＩＬ－１２融合タンパク質のＨＥＫ－ｂｌｕｅアッセイの結果を示す一連のグラフを示す。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。データは、完全な融合タンパク質よりも切断型ＩＬ１２における方が活性が高いことを示している。試験した構築物は、ＡＣＰ０６（図１２Ａ）、ＡＣＰ０７（図１２Ｃ）、ＡＣＰ０８（図１２Ｂ）、ＡＣＰ０９（図１２Ｄ）、ＡＣＰ１０（図１２Ｅ）、ＡＣＰ１１（図１２Ｆ）であった。 図１２Ａ～１２Ｆは、ＭＭＰ９による切断の前及び後の４つのＩＬ－１２融合タンパク質のＨＥＫ－ｂｌｕｅアッセイの結果を示す一連のグラフを示す。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。データは、完全な融合タンパク質よりも切断型ＩＬ１２における方が活性が高いことを示している。試験した構築物は、ＡＣＰ０６（図１２Ａ）、ＡＣＰ０７（図１２Ｃ）、ＡＣＰ０８（図１２Ｂ）、ＡＣＰ０９（図１２Ｄ）、ＡＣＰ１０（図１２Ｅ）、ＡＣＰ１１（図１２Ｆ）であった。 図１２Ａ～１２Ｆは、ＭＭＰ９による切断の前及び後の４つのＩＬ－１２融合タンパク質のＨＥＫ－ｂｌｕｅアッセイの結果を示す一連のグラフを示す。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。データは、完全な融合タンパク質よりも切断型ＩＬ１２における方が活性が高いことを示している。試験した構築物は、ＡＣＰ０６（図１２Ａ）、ＡＣＰ０７（図１２Ｃ）、ＡＣＰ０８（図１２Ｂ）、ＡＣＰ０９（図１２Ｄ）、ＡＣＰ１０（図１２Ｅ）、ＡＣＰ１１（図１２Ｆ）であった。 タンパク質切断アッセイの結果を示す。切断形態及び非切断形態の両方の融合タンパク質ＡＣＰ１１をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 誘導可能サイトカインタンパク質の非限定的な例を描いた模式図であり、構築物が、サイトカインの２つのサブユニットの間に結合しているリンカーのプロテアーゼ切断によって活性化されている。 図１５Ａ～１５Ｄは、プロテアーゼ切断の前及び後のヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質に対して実施されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイからの結果を示すグラフである。結果は、ＩＬ１２タンパク質融合タンパク質が活性であることを裏付けている。各増殖アッセイは、ＨＳＡを伴って、またはＨＳＡを伴わずに実施した。 図１５Ａ～１５Ｄは、プロテアーゼ切断の前及び後のヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質に対して実施されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイからの結果を示すグラフである。結果は、ＩＬ１２タンパク質融合タンパク質が活性であることを裏付けている。各増殖アッセイは、ＨＳＡを伴って、またはＨＳＡを伴わずに実施した。 図１５Ａ～１５Ｄは、プロテアーゼ切断の前及び後のヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質に対して実施されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイからの結果を示すグラフである。結果は、ＩＬ１２タンパク質融合タンパク質が活性であることを裏付けている。各増殖アッセイは、ＨＳＡを伴って、またはＨＳＡを伴わずに実施した。 図１５Ａ～１５Ｄは、プロテアーゼ切断の前及び後のヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質に対して実施されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイからの結果を示すグラフである。結果は、ＩＬ１２タンパク質融合タンパク質が活性であることを裏付けている。各増殖アッセイは、ＨＳＡを伴って、またはＨＳＡを伴わずに実施した。 図１６Ａ～１６Ｆは、ＷＥＨＩ２７９細胞生存アッセイを用いて例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性をマウスＩＦＮγ対照の活性と比較して示す一連のグラフである。ＨＳＡを含有する（＋ＨＳＡ）またはＨＳＡを含有しない（－ＨＳＡ）培地を使用して各アッセイを実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、非切断形態及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断形態の両方の融合タンパク質を各アッセイに使用した。 図１６Ａ～１６Ｆは、ＷＥＨＩ２７９細胞生存アッセイを用いて例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性をマウスＩＦＮγ対照の活性と比較して示す一連のグラフである。ＨＳＡを含有する（＋ＨＳＡ）またはＨＳＡを含有しない（－ＨＳＡ）培地を使用して各アッセイを実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、非切断形態及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断形態の両方の融合タンパク質を各アッセイに使用した。 図１６Ａ～１６Ｆは、ＷＥＨＩ２７９細胞生存アッセイを用いて例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性をマウスＩＦＮγ対照の活性と比較して示す一連のグラフである。ＨＳＡを含有する（＋ＨＳＡ）またはＨＳＡを含有しない（－ＨＳＡ）培地を使用して各アッセイを実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、非切断形態及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断形態の両方の融合タンパク質を各アッセイに使用した。 図１６Ａ～１６Ｆは、ＷＥＨＩ２７９細胞生存アッセイを用いて例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性をマウスＩＦＮγ対照の活性と比較して示す一連のグラフである。ＨＳＡを含有する（＋ＨＳＡ）またはＨＳＡを含有しない（－ＨＳＡ）培地を使用して各アッセイを実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、非切断形態及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断形態の両方の融合タンパク質を各アッセイに使用した。 図１６Ａ～１６Ｆは、ＷＥＨＩ２７９細胞生存アッセイを用いて例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性をマウスＩＦＮγ対照の活性と比較して示す一連のグラフである。ＨＳＡを含有する（＋ＨＳＡ）またはＨＳＡを含有しない（－ＨＳＡ）培地を使用して各アッセイを実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、非切断形態及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断形態の両方の融合タンパク質を各アッセイに使用した。 図１６Ａ～１６Ｆは、ＷＥＨＩ２７９細胞生存アッセイを用いて例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性をマウスＩＦＮγ対照の活性と比較して示す一連のグラフである。ＨＳＡを含有する（＋ＨＳＡ）またはＨＳＡを含有しない（－ＨＳＡ）培地を使用して各アッセイを実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、非切断形態及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断形態の両方の融合タンパク質を各アッセイに使用した。 図１７Ａ～１７Ｆは、Ｂ１６レポーターアッセイを用いて例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性をマウスＩＦＮγ対照の活性と比較して示す一連のグラフである。ＨＳＡを含有する（＋ＨＳＡ）またはＨＳＡを含有しない（－ＨＳＡ）培地を使用して各アッセイを実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、非切断形態及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断形態の両方の融合タンパク質を各アッセイに使用した。 図１７Ａ～１７Ｆは、Ｂ１６レポーターアッセイを用いて例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性をマウスＩＦＮγ対照の活性と比較して示す一連のグラフである。ＨＳＡを含有する（＋ＨＳＡ）またはＨＳＡを含有しない（－ＨＳＡ）培地を使用して各アッセイを実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、非切断形態及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断形態の両方の融合タンパク質を各アッセイに使用した。 図１７Ａ～１７Ｆは、Ｂ１６レポーターアッセイを用いて例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性をマウスＩＦＮγ対照の活性と比較して示す一連のグラフである。ＨＳＡを含有する（＋ＨＳＡ）またはＨＳＡを含有しない（－ＨＳＡ）培地を使用して各アッセイを実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、非切断形態及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断形態の両方の融合タンパク質を各アッセイに使用した。 図１７Ａ～１７Ｆは、Ｂ１６レポーターアッセイを用いて例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性をマウスＩＦＮγ対照の活性と比較して示す一連のグラフである。ＨＳＡを含有する（＋ＨＳＡ）またはＨＳＡを含有しない（－ＨＳＡ）培地を使用して各アッセイを実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、非切断形態及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断形態の両方の融合タンパク質を各アッセイに使用した。 図１７Ａ～１７Ｆは、Ｂ１６レポーターアッセイを用いて例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性をマウスＩＦＮγ対照の活性と比較して示す一連のグラフである。ＨＳＡを含有する（＋ＨＳＡ）またはＨＳＡを含有しない（－ＨＳＡ）培地を使用して各アッセイを実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、非切断形態及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断形態の両方の融合タンパク質を各アッセイに使用した。 図１７Ａ～１７Ｆは、Ｂ１６レポーターアッセイを用いて例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性をマウスＩＦＮγ対照の活性と比較して示す一連のグラフである。ＨＳＡを含有する（＋ＨＳＡ）またはＨＳＡを含有しない（－ＨＳＡ）培地を使用して各アッセイを実施した。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含み、非切断形態及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断形態の両方の融合タンパク質を各アッセイに使用した。 図１８Ａ～１８Ｂは、実施例２に記載されるタンパク質切断アッセイの結果を示す。切断形態及び非切断形態の両方の２つの構築物ＡＣＰ３１（ＩＦＮ－α融合タンパク質；Ａ）及びＡＣＰ５５（ＩＦＮ－γ融合タンパク質；Ｂ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図１８Ａ～１８Ｂは、実施例２に記載されるタンパク質切断アッセイの結果を示す。切断形態及び非切断形態の両方の２つの構築物ＡＣＰ３１（ＩＦＮ－α融合タンパク質；Ａ）及びＡＣＰ５５（ＩＦＮ－γ融合タンパク質；Ｂ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図１９Ａ～１９Ｂは、Ｂ１６レポーターアッセイを用いてプロテアーゼ切断の前及び後の例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性を示す一連のグラフ（Ａ及びＢ）である。ＨＳＡを含有する培養培地を使用して各アッセイを実施し、各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含む。非切断形態及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断形態の両方の融合タンパク質を各アッセイに使用した。 図１９Ａ～１９Ｂは、Ｂ１６レポーターアッセイを用いてプロテアーゼ切断の前及び後の例示的なＩＦＮγ融合タンパク質の活性を示す一連のグラフ（Ａ及びＢ）である。ＨＳＡを含有する培養培地を使用して各アッセイを実施し、各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含む。非切断形態及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断形態の両方の融合タンパク質を各アッセイに使用した。 図２０Ａ～２０Ｂは、Ｂ１６レポーターアッセイを用いて切断の前及び後の例示的なＩＦＮα融合タンパク質の活性を示す一連のグラフ（Ａ及びＢ）である。ＨＳＡを含有する培地を使用して各アッセイを実施し、各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含む。非切断形態及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断形態の両方の融合タンパク質を各アッセイに使用した。 図２０Ａ～２０Ｂは、Ｂ１６レポーターアッセイを用いて切断の前及び後の例示的なＩＦＮα融合タンパク質の活性を示す一連のグラフ（Ａ及びＢ）である。ＨＳＡを含有する培地を使用して各アッセイを実施し、各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤を含む。非切断形態及びＭＭＰ９プロテアーゼ切断形態の両方の融合タンパク質を各アッセイに使用した。 図２１Ａ～２１Ｄは、ＭＣ３８細胞株を使用する腫瘍成長試験の結果を示す一連のグラフである。Ａ～Ｃは、ＩＦＮγ及びＩＦＮγ融合タンパク質が異なる用量レベル及び計画を用いて腹腔内（ＩＰ）注射された場合に腫瘍成長に及ぼす影響を示す（ｕｇ＝マイクログラム、ＢＩＤ＝１日２回、ＢＩＷ＝週２回、ＱＷ＝毎週）。Ｄは、ＩＦＮγ及びＩＬ－２の腫瘍内（ＩＴ）注射が腫瘍成長に及ぼす影響を示す。 図２１Ａ～２１Ｄは、ＭＣ３８細胞株を使用する腫瘍成長試験の結果を示す一連のグラフである。Ａ～Ｃは、ＩＦＮγ及びＩＦＮγ融合タンパク質が異なる用量レベル及び計画を用いて腹腔内（ＩＰ）注射された場合に腫瘍成長に及ぼす影響を示す（ｕｇ＝マイクログラム、ＢＩＤ＝１日２回、ＢＩＷ＝週２回、ＱＷ＝毎週）。Ｄは、ＩＦＮγ及びＩＬ－２の腫瘍内（ＩＴ）注射が腫瘍成長に及ぼす影響を示す。 図２１Ａ～２１Ｄは、ＭＣ３８細胞株を使用する腫瘍成長試験の結果を示す一連のグラフである。Ａ～Ｃは、ＩＦＮγ及びＩＦＮγ融合タンパク質が異なる用量レベル及び計画を用いて腹腔内（ＩＰ）注射された場合に腫瘍成長に及ぼす影響を示す（ｕｇ＝マイクログラム、ＢＩＤ＝１日２回、ＢＩＷ＝週２回、ＱＷ＝毎週）。Ｄは、ＩＦＮγ及びＩＬ－２の腫瘍内（ＩＴ）注射が腫瘍成長に及ぼす影響を示す。 図２１Ａ～２１Ｄは、ＭＣ３８細胞株を使用する腫瘍成長試験の結果を示す一連のグラフである。Ａ～Ｃは、ＩＦＮγ及びＩＦＮγ融合タンパク質が異なる用量レベル及び計画を用いて腹腔内（ＩＰ）注射された場合に腫瘍成長に及ぼす影響を示す（ｕｇ＝マイクログラム、ＢＩＤ＝１日２回、ＢＩＷ＝週２回、ＱＷ＝毎週）。Ｄは、ＩＦＮγ及びＩＬ－２の腫瘍内（ＩＴ）注射が腫瘍成長に及ぼす影響を示す。 図２２Ａ～２２Ｂは、Ｂ１６レポーターアッセイを用いて、ＭＭＰ９プロテアーゼによって切断された例示的なＩＦＮγ融合タンパク質（ＡＣＰ５１（Ａ）及びＡＣＰ５２（Ｂ））の活性を非切断型融合タンパク質の活性と比較して示す一連のグラフである。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤及び腫瘍指向性ドメインを含む。 図２２Ａ～２２Ｂは、Ｂ１６レポーターアッセイを用いて、ＭＭＰ９プロテアーゼによって切断された例示的なＩＦＮγ融合タンパク質（ＡＣＰ５１（Ａ）及びＡＣＰ５２（Ｂ））の活性を非切断型融合タンパク質の活性と比較して示す一連のグラフである。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合剤及び腫瘍指向性ドメインを含む。 図２３Ａ～２３Ｂは、Ｂ１６レポーターアッセイを用いて、ＭＭＰ９プロテアーゼによって切断された例示的なＩＦＮγ融合タンパク質（ＡＣＰ５３及びＡＣＰ５４）の活性を非切断型融合タンパク質の活性と比較して示す一連のグラフである。各融合タンパク質は、アルブミンに直接融合されたＩＦＮγを含む。 図２３Ａ～２３Ｂは、Ｂ１６レポーターアッセイを用いて、ＭＭＰ９プロテアーゼによって切断された例示的なＩＦＮγ融合タンパク質（ＡＣＰ５３及びＡＣＰ５４）の活性を非切断型融合タンパク質の活性と比較して示す一連のグラフである。各融合タンパク質は、アルブミンに直接融合されたＩＦＮγを含む。 図２４Ａ～２４Ｄは、ＩＬ－２融合ポリペプチド及び組換えヒトＩＬ２（Ｒｅｃ ｈＩＬ－２）に対して実施されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２レポーターアッセイからの結果を示すグラフである。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。図２４Ａは、アルブミンを伴う及び伴わないＩＬ－２構築物ＡＣＰ１３２及びＡＣＰ１３３の結果を示す。 図２４Ａ～２４Ｄは、ＩＬ－２融合ポリペプチド及び組換えヒトＩＬ２（Ｒｅｃ ｈＩＬ－２）に対して実施されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２レポーターアッセイからの結果を示すグラフである。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。図２４Ｂは、切断型及び非切断型のＩＬ－２構築物ＡＣＰ１６の結果を示す。切断形態及び非切断形態のＡＣＰ１６のタンパク質切断アッセイの結果も示す。 図２４Ａ～２４Ｄは、ＩＬ－２融合ポリペプチド及び組換えヒトＩＬ２（Ｒｅｃ ｈＩＬ－２）に対して実施されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２レポーターアッセイからの結果を示すグラフである。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。図２４Ｃは、切断形態及び非切断形態のＩＬ－２構築物ＡＣＰ１５３の結果を示す。タンパク質切断アッセイの結果も示す。 図２４Ａ～２４Ｄは、ＩＬ－２融合ポリペプチド及び組換えヒトＩＬ２（Ｒｅｃ ｈＩＬ－２）に対して実施されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２レポーターアッセイからの結果を示すグラフである。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用した分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。図２４Ｄは、野生型サイトカイン、完全型融合タンパク質、及びプロテアーゼ切断型融合タンパク質を使用したＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２アッセイからの結果を示す。 図２５Ａ及び図２５Ｂは、ＨＳＡの存在下でのＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－２レポーターアッセイにおけるＡＣＰ１６（図２５Ａ）及びＡＣＰ１２４（図２５Ｂ）の分析を示す２つのグラフである。丸は未切断ポリペプチドの活性を表し、四角は切断されたポリペプチドの活性を表す。 図２５Ａ及び図２５Ｂは、ＨＳＡの存在下でのＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－２レポーターアッセイにおけるＡＣＰ１６（図２５Ａ）及びＡＣＰ１２４（図２５Ｂ）の分析を示す２つのグラフである。丸は未切断ポリペプチドの活性を表し、四角は切断されたポリペプチドの活性を表す。 図２５Ｃは、ＣＴＬＬ－２増殖アッセイの結果を示すグラフである。ＣＴＬＬ２細胞（ＡＴＣＣ）を、４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培養培地の中に懸濁させた５００，０００細胞／ウェルの濃度で播種し、活性化可能ｈＩＬ２の希釈系列によって７２時間にわたって３７℃及び５％ＣＯ２で刺激した。非切断型及び切断型活性化可能ＡＣＰ１６の活性を試験した。切断型活性化可能ｈＩＬ２は、活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成された。細胞活性は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）発光ベース細胞生存アッセイを用いて評価した。丸は完全型融合タンパク質を表し、四角はプロテアーゼ切断型融合タンパク質を表す。 図２６Ａ～２６Ｃは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図２６Ａは、ＡＣＰ１１（ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質）とＡＣＰ０４（陰性対照）とで比較されたＩＬ－１２／ＳＴＡＴ４活性化を示す。 図２６Ａ～２６Ｃは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図２６Ｂは、ＡＣＰ９１（キメラＩＬ－１２融合タンパク質）の分析を示すグラフである。四角は未切断ＡＣＰ９１ポリペプチドの活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（ＡＣＰ９１＋ＭＭＰ９）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図２６Ａ～２６Ｃは、ＨＥＫＢｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図２６Ｃは、ＡＣＰ１３６（キメラＩＬ－１２融合タンパク質）の分析を示すグラフである。四角は未切断ＡＣＰ１３６ポリペプチドの活性を表し、三角は切断されたポリペプチド（ＡＣＰ１３６＋ＭＭＰ９）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を挿入表中に示す。 図２７Ａ～２７Ｆは、切断型マウスＩＦＮα１ポリペプチドＡＣＰ３１（図２７Ａ）、ＡＣＰ１２５（図２７Ｂ）、ＡＣＰ１２６（図２７Ｃ）がＢ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおいて活性であることを示す一連のグラフである。 図２７Ａ～２７Ｆは、切断型マウスＩＦＮα１ポリペプチドＡＣＰ３１（図２７Ａ）、ＡＣＰ１２５（図２７Ｂ）、ＡＣＰ１２６（図２７Ｃ）がＢ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおいて活性であることを示す一連のグラフである。 図２７Ａ～２７Ｆは、切断型マウスＩＦＮα１ポリペプチドＡＣＰ３１（図２７Ａ）、ＡＣＰ１２５（図２７Ｂ）、ＡＣＰ１２６（図２７Ｃ）がＢ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおいて活性であることを示す一連のグラフである。 図２７Ａ～２７Ｆは、切断型マウスＩＦＮα１ポリペプチドＡＣＰ３１（図２７Ａ）、ＡＣＰ１２５（図２７Ｂ）、ＡＣＰ１２６（図２７Ｃ）がＢ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおいて活性であることを示す一連のグラフである。 図２７Ａ～２７Ｆは、切断型マウスＩＦＮα１ポリペプチドＡＣＰ３１（図２７Ａ）、ＡＣＰ１２５（図２７Ｂ）、ＡＣＰ１２６（図２７Ｃ）がＢ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおいて活性であることを示す一連のグラフである。 図２７Ａ～２７Ｆは、切断型マウスＩＦＮα１ポリペプチドＡＣＰ３１（図２７Ａ）、ＡＣＰ１２５（図２７Ｂ）、ＡＣＰ１２６（図２７Ｃ）がＢ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおいて活性であることを示す一連のグラフである。 図２８Ａ～２８Ｎは、Ｂ１６ ＩＦＮγレポーターアッセイにおけるＡＣＰ５６（図２８Ａ）、ＡＣＰ５７（図２８Ｂ）、ＡＣＰ５８（図２８Ｃ）、ＡＣＰ５９（図２８Ｄ）、ＡＣＰ６０（図２８Ｅ）、ＡＣＰ６１＋ＨＳＡ（図２８Ｆ）、ＡＣＰ３０＋ＨＳＡ（図２８Ｇ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｈ）、ＡＣＰ７０＋ＨＳＡ（図２８Ｉ）、ＡＣＰ７１（図２８Ｊ）、ＡＣＰ７２（図２８Ｋ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｌ）、ＡＣＰ７４（図２８Ｍ）及びＡＣＰ７５（図２８Ｎ）の活性を示す一連のグラフである。各融合体を、切断されているとき（四角）及び未切断のとき（丸）のその活性について試験した。 図２８Ａ～２８Ｎは、Ｂ１６ ＩＦＮγレポーターアッセイにおけるＡＣＰ５６（図２８Ａ）、ＡＣＰ５７（図２８Ｂ）、ＡＣＰ５８（図２８Ｃ）、ＡＣＰ５９（図２８Ｄ）、ＡＣＰ６０（図２８Ｅ）、ＡＣＰ６１＋ＨＳＡ（図２８Ｆ）、ＡＣＰ３０＋ＨＳＡ（図２８Ｇ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｈ）、ＡＣＰ７０＋ＨＳＡ（図２８Ｉ）、ＡＣＰ７１（図２８Ｊ）、ＡＣＰ７２（図２８Ｋ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｌ）、ＡＣＰ７４（図２８Ｍ）及びＡＣＰ７５（図２８Ｎ）の活性を示す一連のグラフである。各融合体を、切断されているとき（四角）及び未切断のとき（丸）のその活性について試験した。 図２８Ａ～２８Ｎは、Ｂ１６ ＩＦＮγレポーターアッセイにおけるＡＣＰ５６（図２８Ａ）、ＡＣＰ５７（図２８Ｂ）、ＡＣＰ５８（図２８Ｃ）、ＡＣＰ５９（図２８Ｄ）、ＡＣＰ６０（図２８Ｅ）、ＡＣＰ６１＋ＨＳＡ（図２８Ｆ）、ＡＣＰ３０＋ＨＳＡ（図２８Ｇ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｈ）、ＡＣＰ７０＋ＨＳＡ（図２８Ｉ）、ＡＣＰ７１（図２８Ｊ）、ＡＣＰ７２（図２８Ｋ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｌ）、ＡＣＰ７４（図２８Ｍ）及びＡＣＰ７５（図２８Ｎ）の活性を示す一連のグラフである。各融合体を、切断されているとき（四角）及び未切断のとき（丸）のその活性について試験した。 図２８Ａ～２８Ｎは、Ｂ１６ ＩＦＮγレポーターアッセイにおけるＡＣＰ５６（図２８Ａ）、ＡＣＰ５７（図２８Ｂ）、ＡＣＰ５８（図２８Ｃ）、ＡＣＰ５９（図２８Ｄ）、ＡＣＰ６０（図２８Ｅ）、ＡＣＰ６１＋ＨＳＡ（図２８Ｆ）、ＡＣＰ３０＋ＨＳＡ（図２８Ｇ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｈ）、ＡＣＰ７０＋ＨＳＡ（図２８Ｉ）、ＡＣＰ７１（図２８Ｊ）、ＡＣＰ７２（図２８Ｋ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｌ）、ＡＣＰ７４（図２８Ｍ）及びＡＣＰ７５（図２８Ｎ）の活性を示す一連のグラフである。各融合体を、切断されているとき（四角）及び未切断のとき（丸）のその活性について試験した。 図２８Ａ～２８Ｎは、Ｂ１６ ＩＦＮγレポーターアッセイにおけるＡＣＰ５６（図２８Ａ）、ＡＣＰ５７（図２８Ｂ）、ＡＣＰ５８（図２８Ｃ）、ＡＣＰ５９（図２８Ｄ）、ＡＣＰ６０（図２８Ｅ）、ＡＣＰ６１＋ＨＳＡ（図２８Ｆ）、ＡＣＰ３０＋ＨＳＡ（図２８Ｇ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｈ）、ＡＣＰ７０＋ＨＳＡ（図２８Ｉ）、ＡＣＰ７１（図２８Ｊ）、ＡＣＰ７２（図２８Ｋ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｌ）、ＡＣＰ７４（図２８Ｍ）及びＡＣＰ７５（図２８Ｎ）の活性を示す一連のグラフである。各融合体を、切断されているとき（四角）及び未切断のとき（丸）のその活性について試験した。 図２８Ａ～２８Ｎは、Ｂ１６ ＩＦＮγレポーターアッセイにおけるＡＣＰ５６（図２８Ａ）、ＡＣＰ５７（図２８Ｂ）、ＡＣＰ５８（図２８Ｃ）、ＡＣＰ５９（図２８Ｄ）、ＡＣＰ６０（図２８Ｅ）、ＡＣＰ６１＋ＨＳＡ（図２８Ｆ）、ＡＣＰ３０＋ＨＳＡ（図２８Ｇ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｈ）、ＡＣＰ７０＋ＨＳＡ（図２８Ｉ）、ＡＣＰ７１（図２８Ｊ）、ＡＣＰ７２（図２８Ｋ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｌ）、ＡＣＰ７４（図２８Ｍ）及びＡＣＰ７５（図２８Ｎ）の活性を示す一連のグラフである。各融合体を、切断されているとき（四角）及び未切断のとき（丸）のその活性について試験した。 図２８Ａ～２８Ｎは、Ｂ１６ ＩＦＮγレポーターアッセイにおけるＡＣＰ５６（図２８Ａ）、ＡＣＰ５７（図２８Ｂ）、ＡＣＰ５８（図２８Ｃ）、ＡＣＰ５９（図２８Ｄ）、ＡＣＰ６０（図２８Ｅ）、ＡＣＰ６１＋ＨＳＡ（図２８Ｆ）、ＡＣＰ３０＋ＨＳＡ（図２８Ｇ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｈ）、ＡＣＰ７０＋ＨＳＡ（図２８Ｉ）、ＡＣＰ７１（図２８Ｊ）、ＡＣＰ７２（図２８Ｋ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｌ）、ＡＣＰ７４（図２８Ｍ）及びＡＣＰ７５（図２８Ｎ）の活性を示す一連のグラフである。各融合体を、切断されているとき（四角）及び未切断のとき（丸）のその活性について試験した。 図２８Ａ～２８Ｎは、Ｂ１６ ＩＦＮγレポーターアッセイにおけるＡＣＰ５６（図２８Ａ）、ＡＣＰ５７（図２８Ｂ）、ＡＣＰ５８（図２８Ｃ）、ＡＣＰ５９（図２８Ｄ）、ＡＣＰ６０（図２８Ｅ）、ＡＣＰ６１＋ＨＳＡ（図２８Ｆ）、ＡＣＰ３０＋ＨＳＡ（図２８Ｇ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｈ）、ＡＣＰ７０＋ＨＳＡ（図２８Ｉ）、ＡＣＰ７１（図２８Ｊ）、ＡＣＰ７２（図２８Ｋ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｌ）、ＡＣＰ７４（図２８Ｍ）及びＡＣＰ７５（図２８Ｎ）の活性を示す一連のグラフである。各融合体を、切断されているとき（四角）及び未切断のとき（丸）のその活性について試験した。 図２８Ａ～２８Ｎは、Ｂ１６ ＩＦＮγレポーターアッセイにおけるＡＣＰ５６（図２８Ａ）、ＡＣＰ５７（図２８Ｂ）、ＡＣＰ５８（図２８Ｃ）、ＡＣＰ５９（図２８Ｄ）、ＡＣＰ６０（図２８Ｅ）、ＡＣＰ６１＋ＨＳＡ（図２８Ｆ）、ＡＣＰ３０＋ＨＳＡ（図２８Ｇ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｈ）、ＡＣＰ７０＋ＨＳＡ（図２８Ｉ）、ＡＣＰ７１（図２８Ｊ）、ＡＣＰ７２（図２８Ｋ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｌ）、ＡＣＰ７４（図２８Ｍ）及びＡＣＰ７５（図２８Ｎ）の活性を示す一連のグラフである。各融合体を、切断されているとき（四角）及び未切断のとき（丸）のその活性について試験した。 図２８Ａ～２８Ｎは、Ｂ１６ ＩＦＮγレポーターアッセイにおけるＡＣＰ５６（図２８Ａ）、ＡＣＰ５７（図２８Ｂ）、ＡＣＰ５８（図２８Ｃ）、ＡＣＰ５９（図２８Ｄ）、ＡＣＰ６０（図２８Ｅ）、ＡＣＰ６１＋ＨＳＡ（図２８Ｆ）、ＡＣＰ３０＋ＨＳＡ（図２８Ｇ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｈ）、ＡＣＰ７０＋ＨＳＡ（図２８Ｉ）、ＡＣＰ７１（図２８Ｊ）、ＡＣＰ７２（図２８Ｋ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｌ）、ＡＣＰ７４（図２８Ｍ）及びＡＣＰ７５（図２８Ｎ）の活性を示す一連のグラフである。各融合体を、切断されているとき（四角）及び未切断のとき（丸）のその活性について試験した。 図２８Ａ～２８Ｎは、Ｂ１６ ＩＦＮγレポーターアッセイにおけるＡＣＰ５６（図２８Ａ）、ＡＣＰ５７（図２８Ｂ）、ＡＣＰ５８（図２８Ｃ）、ＡＣＰ５９（図２８Ｄ）、ＡＣＰ６０（図２８Ｅ）、ＡＣＰ６１＋ＨＳＡ（図２８Ｆ）、ＡＣＰ３０＋ＨＳＡ（図２８Ｇ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｈ）、ＡＣＰ７０＋ＨＳＡ（図２８Ｉ）、ＡＣＰ７１（図２８Ｊ）、ＡＣＰ７２（図２８Ｋ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｌ）、ＡＣＰ７４（図２８Ｍ）及びＡＣＰ７５（図２８Ｎ）の活性を示す一連のグラフである。各融合体を、切断されているとき（四角）及び未切断のとき（丸）のその活性について試験した。 図２８Ａ～２８Ｎは、Ｂ１６ ＩＦＮγレポーターアッセイにおけるＡＣＰ５６（図２８Ａ）、ＡＣＰ５７（図２８Ｂ）、ＡＣＰ５８（図２８Ｃ）、ＡＣＰ５９（図２８Ｄ）、ＡＣＰ６０（図２８Ｅ）、ＡＣＰ６１＋ＨＳＡ（図２８Ｆ）、ＡＣＰ３０＋ＨＳＡ（図２８Ｇ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｈ）、ＡＣＰ７０＋ＨＳＡ（図２８Ｉ）、ＡＣＰ７１（図２８Ｊ）、ＡＣＰ７２（図２８Ｋ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｌ）、ＡＣＰ７４（図２８Ｍ）及びＡＣＰ７５（図２８Ｎ）の活性を示す一連のグラフである。各融合体を、切断されているとき（四角）及び未切断のとき（丸）のその活性について試験した。 図２８Ａ～２８Ｎは、Ｂ１６ ＩＦＮγレポーターアッセイにおけるＡＣＰ５６（図２８Ａ）、ＡＣＰ５７（図２８Ｂ）、ＡＣＰ５８（図２８Ｃ）、ＡＣＰ５９（図２８Ｄ）、ＡＣＰ６０（図２８Ｅ）、ＡＣＰ６１＋ＨＳＡ（図２８Ｆ）、ＡＣＰ３０＋ＨＳＡ（図２８Ｇ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｈ）、ＡＣＰ７０＋ＨＳＡ（図２８Ｉ）、ＡＣＰ７１（図２８Ｊ）、ＡＣＰ７２（図２８Ｋ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｌ）、ＡＣＰ７４（図２８Ｍ）及びＡＣＰ７５（図２８Ｎ）の活性を示す一連のグラフである。各融合体を、切断されているとき（四角）及び未切断のとき（丸）のその活性について試験した。 図２８Ａ～２８Ｎは、Ｂ１６ ＩＦＮγレポーターアッセイにおけるＡＣＰ５６（図２８Ａ）、ＡＣＰ５７（図２８Ｂ）、ＡＣＰ５８（図２８Ｃ）、ＡＣＰ５９（図２８Ｄ）、ＡＣＰ６０（図２８Ｅ）、ＡＣＰ６１＋ＨＳＡ（図２８Ｆ）、ＡＣＰ３０＋ＨＳＡ（図２８Ｇ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｈ）、ＡＣＰ７０＋ＨＳＡ（図２８Ｉ）、ＡＣＰ７１（図２８Ｊ）、ＡＣＰ７２（図２８Ｋ）、ＡＣＰ７３（図２８Ｌ）、ＡＣＰ７４（図２８Ｍ）及びＡＣＰ７５（図２８Ｎ）の活性を示す一連のグラフである。各融合体を、切断されている場合（四角）及び未切断の場合（丸）のその活性について試験した。 図２９Ａ～２９Ｂは、腫瘍異種移植モデルにおいてＡＣＰ３１（マウスＩＦＮα１融合タンパク質）及びＡＣＰ１１（ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質）を分析した結果を示す２つのグラフである。図２９Ａは、３３μｇのＡＣＰ３１（丸）、１１０μｇのＡＣＰ３１（三角）、３３０μｇのＡＣＰ３１（菱形）、ならびに対照としての１μｇのマウス野生型ＩＦＮα１（破線、四角）及び１０μｇのｍＩＦＮα１（破線、小さい丸）で処置したマウスの経時的な腫瘍体積を示す。ビヒクル単独を大きい白丸で表す。データは、ＡＣＰ３１で処置したマウスにおいて用量依存的に腫瘍体積が経時的に減少することを示している。 図２９Ａ～２９Ｂは、腫瘍異種移植モデルにおいてＡＣＰ３１（マウスＩＦＮα１融合タンパク質）及びＡＣＰ１１（ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質）を分析した結果を示す２つのグラフである。図２９Ｂは、１７．５μｇのＡＣＰ１１（四角）、１７５μｇのＡＣＰ３１（三角）、５２５μｇのＡＣＰ３１（丸）、ならびに対照としての２μｇのＡＣＰ０４（破線、三角）及び１０μｇのＡＣＰ０４（破線、菱形）で処置したマウスの経時的な腫瘍体積を示す。ビヒクル単独を大きい白丸で表す。データは、ＡＣＰ１１及びＡＣＰ０４（ヒトｐ４０／マウスｐ３５ ＩＬ１２融合タンパク質）で処置したマウスの両方において用量依存的に腫瘍体積が経時的に減少することを示している。 図３０Ａ～３０Ｆは、ビヒクル単独（図３０Ａ）、２μｇのＡＣＰ０４（図３０Ｂ）、１０μｇのＡＣＰ０４（図３０Ｃ）、１７．５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｄ）、１７５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｅ）及び５２５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｆ）で各々処置したマウスのマウス異種移植腫瘍モデルの経時的な腫瘍体積を示す一連の折れ線グラフである。各線は単一のマウスを表す。 図３０Ａ～３０Ｆは、ビヒクル単独（図３０Ａ）、２μｇのＡＣＰ０４（図３０Ｂ）、１０μｇのＡＣＰ０４（図３０Ｃ）、１７．５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｄ）、１７５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｅ）及び５２５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｆ）で各々処置したマウスのマウス異種移植腫瘍モデルの経時的な腫瘍体積を示す一連の折れ線グラフである。各線は単一のマウスを表す。 図３０Ａ～３０Ｆは、ビヒクル単独（図３０Ａ）、２μｇのＡＣＰ０４（図３０Ｂ）、１０μｇのＡＣＰ０４（図３０Ｃ）、１７．５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｄ）、１７５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｅ）及び５２５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｆ）で各々処置したマウスのマウス異種移植腫瘍モデルの経時的な腫瘍体積を示す一連の折れ線グラフである。各線は単一のマウスを表す。 図３０Ａ～３０Ｆは、ビヒクル単独（図３０Ａ）、２μｇのＡＣＰ０４（図３０Ｂ）、１０μｇのＡＣＰ０４（図３０Ｃ）、１７．５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｄ）、１７５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｅ）及び５２５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｆ）で各々処置したマウスのマウス異種移植腫瘍モデルの経時的な腫瘍体積を示す一連の折れ線グラフである。各線は単一のマウスを表す。 図３０Ａ～３０Ｆは、ビヒクル単独（図３０Ａ）、２μｇのＡＣＰ０４（図３０Ｂ）、１０μｇのＡＣＰ０４（図３０Ｃ）、１７．５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｄ）、１７５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｅ）及び５２５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｆ）で各々処置したマウスのマウス異種移植腫瘍モデルの経時的な腫瘍体積を示す一連の折れ線グラフである。各線は単一のマウスを表す。 図３０Ａ～３０Ｆは、ビヒクル単独（図３０Ａ）、２μｇのＡＣＰ０４（図３０Ｂ）、１０μｇのＡＣＰ０４（図３０Ｃ）、１７．５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｄ）、１７５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｅ）及び５２５μｇのＡＣＰ１１（図３０Ｆ）で各々処置したマウスのマウス異種移植腫瘍モデルの経時的な腫瘍体積を示す一連の折れ線グラフである。各線は単一のマウスを表す。 図３１Ａ～３１Ｃは、腫瘍異種移植モデルにおいてＡＣＰ１６及びＡＣＰ１２４を分析した結果を示す３つのグラフである。図３１Ａは、４．４μｇのＡＣＰ１６（四角）、１７μｇのＡＣＰ１６（三角）、７０μｇのＡＣＰ１６（逆三角）、２３２μｇのＡＣＰ１６（黒丸）、ならびに対照薬としての１２μｇの野生型ＩＬ－２（破線、三角）及び３６μｇの野生型ＩＬ－２（破線、菱形で処置したマウスの経時的な腫瘍体積を示す。ビヒクル単独を大きい白丸で表す。データは、高い方の濃度のＡＣＰ１６で処置したマウスにおいて用量依存的に腫瘍体積が経時的に減少することを示している。 図３１Ａ～３１Ｃは、腫瘍異種移植モデルにおいてＡＣＰ１６及びＡＣＰ１２４を分析した結果を示す３つのグラフである。図３１Ｂは、１７μｇのＡＣＰ１２４（四角）、７０μｇのＡＣＰ１２４（三角）、２３０μｇのＡＣＰ１２４（逆三角）及び７００μｇのＡＣＰ１２４で処置したマウスの経時的な腫瘍体積を示す。ビヒクル単独を大きい白丸で表す。 図３１Ａ～３１Ｃは、腫瘍異種移植モデルにおいてＡＣＰ１６及びＡＣＰ１２４を分析した結果を示す３つのグラフである。図３１Ｃは、１７μｇのＡＣＰ１６（三角）、７０μｇのＡＣＰ１６（丸）、２３２μｇのＡＣＰ１６（黒丸）、ならびに対照薬としての１７μｇのＡＣＰ１２４（破線、三角）７０μｇのＡＣＰ１２４（破線、菱形）、２３０μｇのＡＣＰ１２４（破線、菱形）で処置したマウスの経時的な腫瘍体積を示す。ビヒクル単独を黒の逆三角で表す。データは、ＡＣＰ１２４ではなくＡＣＰ１６で処置したマウスにおいて用量依存的に腫瘍体積が経時的に減少することを示している。 図３２Ａ～３２Ｂは、図３１に示されるデータに対応する、ＭＣ３８マウス異種移植モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連の折れ線グラフである。グラフ中の各線は単一のマウスである。 図３２Ａ～３２Ｂは、図３１に示されるデータに対応する、ＭＣ３８マウス異種移植モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連の折れ線グラフである。グラフ中の各線は単一のマウスである。 図３３は、対照マウス（白丸）及びＡＰ１６処置マウス（四角）における腫瘍成長を示すマウス異種移植モデルの経時的な腫瘍体積を示すグラフである。 図３４Ａ～３４Ｄは、切断可能融合タンパク質で処置した後のマウスの経時的な生存率を示す一連の生存率グラフである。図３４Ａは、ビヒクル単独（灰色線）、１７μｇのＡＣＰ１６（黒線）及び１７μｇのＡＣＰ１２４（破線）で処置したマウスのデータを示す。 図３４Ａ～３４Ｄは、切断可能融合タンパク質で処置した後のマウスの経時的な生存率を示す一連の生存率グラフである。図３４Ｂは、ビヒクル単独（灰色線）、７０μｇのＡＣＰ１６（黒線）及び７０μｇのＡＣＰ１２４（破線）で処置したマウスのデータを示す。 図３４Ａ～３４Ｄは、切断可能融合タンパク質で処置した後のマウスの経時的な生存率を示す一連の生存率グラフである。図３４Ｃは、ビヒクル単独（灰色線）、２３２μｇのＡＣＰ１６（黒線）及び２３０μｇのＡＣＰ１２４（破線）で処置したマウスのデータを示す。 図３４Ａ～３４Ｄは、切断可能融合タンパク質で処置した後のマウスの経時的な生存率を示す一連の生存率グラフである。図３４Ｄは、ビヒクル単独（灰色線）、２３２μｇのＡＣＰ１６（黒線）及び７００μｇのＡＣＰ１２４（破線）で処置したマウスのデータを示す。 ＭＣ３８マウス異種移植モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連の折れ線グラフ。１週間／２回用量の後に致死的毒性が検出された最高３回用量のＡＰＣ１３２を除けば全てのマウス群に計４回用量が与えられた。示されているのは、ビヒクル単独（上）、１７、５５、７０及び２３０μｇのＡＣＰ１６（上段）、９、２８、３６及び１１９μｇのＡＣＰ１３２（中段）、ならびに１３、４２、５４及び１７７μｇのＡＣＰ２１（下段）である。グラフ中の各線は個々の動物を表す。 図３６Ａ～３６Ｈは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図３６Ａ～３６Ｈは、ヒトＩＦＮα融合タンパク質）と対照（ヒトＩＦＮα）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＦＮαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＦＮαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。結果は、ＩＦＮα融合タンパク質が活性であり誘導可能であることを裏付けている。図３６Ａ～３６Ｈはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果を示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図３６Ａ～３６Ｈは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図３６Ａ～３６Ｈは、ヒトＩＦＮα融合タンパク質）と対照（ヒトＩＦＮα）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＦＮαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＦＮαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。結果は、ＩＦＮα融合タンパク質が活性であり誘導可能であることを裏付けている。図３６Ａ～３６Ｈはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果を示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図３６Ａ～３６Ｈは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図３６Ａ～３６Ｈは、ヒトＩＦＮα融合タンパク質）と対照（ヒトＩＦＮα）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＦＮαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＦＮαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。結果は、ＩＦＮα融合タンパク質が活性であり誘導可能であることを裏付けている。図３６Ａ～３６Ｈはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果を示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図３６Ａ～３６Ｈは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図３６Ａ～３６Ｈは、ヒトＩＦＮα融合タンパク質）と対照（ヒトＩＦＮα）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＦＮαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＦＮαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。結果は、ＩＦＮα融合タンパク質が活性であり誘導可能であることを裏付けている。図３６Ａ～３６Ｈはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果を示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図３６Ａ～３６Ｈは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図３６Ａ～３６Ｈは、ヒトＩＦＮα融合タンパク質）と対照（ヒトＩＦＮα）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＦＮαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＦＮαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。結果は、ＩＦＮα融合タンパク質が活性であり誘導可能であることを裏付けている。図３６Ａ～３６Ｈはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果を示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図３６Ａ～３６Ｈは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図３６Ａ～３６Ｈは、ヒトＩＦＮα融合タンパク質）と対照（ヒトＩＦＮα）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＦＮαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＦＮαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。結果は、ＩＦＮα融合タンパク質が活性であり誘導可能であることを裏付けている。図３６Ａ～３６Ｈはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果を示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図３６Ａ～３６Ｈは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図３６Ａ～３６Ｈは、ヒトＩＦＮα融合タンパク質）と対照（ヒトＩＦＮα）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＦＮαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＦＮαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。結果は、ＩＦＮα融合タンパク質が活性であり誘導可能であることを裏付けている。図３６Ａ～３６Ｈはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果を示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図３６Ａ～３６Ｈは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図３６Ａ～３６Ｈは、ヒトＩＦＮα融合タンパク質）と対照（ヒトＩＦＮα）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＦＮαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＦＮαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（ヒトＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。結果は、ＩＦＮα融合タンパク質が活性であり誘導可能であることを裏付けている。図３６Ａ～３６Ｈはまた、各ＩＮＦα融合タンパク質についてのタンパク質切断アッセイの結果を示す。切断形態及び非切断形態の両方の各ＩＮＦα融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルにみられるように、切断は完全なものであった。 図３７Ａ～３７Ｄは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図３７Ａ～３７Ｂは、マウスＩＮＦβ融合タンパク質と対照（マウスＩＦＮβ）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。図３７Ｃ～３７Ｄは、ヒトＩＮＦβ融合タンパク質と対照（ヒトＩＦＮβ）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＮＦβポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＮＦβポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。結果は、ＩＦＮβ融合タンパク質が活性であり誘導可能であることを裏付けている。 図３７Ａ～３７Ｄは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図３７Ａ～３７Ｂは、マウスＩＮＦβ融合タンパク質と対照（マウスＩＦＮβ）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。図３７Ｃ～３７Ｄは、ヒトＩＮＦβ融合タンパク質と対照（ヒトＩＦＮβ）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＮＦβポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＮＦβポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。結果は、ＩＦＮβ融合タンパク質が活性であり誘導可能であることを裏付けている。 図３７Ａ～３７Ｄは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図３７Ａ～３７Ｂは、マウスＩＮＦβ融合タンパク質と対照（マウスＩＦＮβ）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。図３７Ｃ～３７Ｄは、ヒトＩＮＦβ融合タンパク質と対照（ヒトＩＦＮβ）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＮＦβポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＮＦβポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。結果は、ＩＦＮβ融合タンパク質が活性であり誘導可能であることを裏付けている。 図３７Ａ～３７Ｄは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図３７Ａ～３７Ｂは、マウスＩＮＦβ融合タンパク質と対照（マウスＩＦＮβ）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。図３７Ｃ～３７Ｄは、ヒトＩＮＦβ融合タンパク質と対照（ヒトＩＦＮβ）とで比較されたＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＮＦβポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＮＦβポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。結果は、ＩＦＮβ融合タンパク質が活性であり誘導可能であることを裏付けている。 図３８Ａ～３８Ｃは、ヒトＰＢＭＣアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。Ａ～Ｃは、ヒトＩＦＮα融合タンパク質と対照（ヒトＩＦＮα）とで比較されたＩＦＮα経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＦＮαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＦＮαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ヒトＩＦＮαの活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。分析はＣＸＣＬ－１０（ＩＰ－１０）の定量に基づいて実施した。結果はＩＦＮα融合タンパク質が活性であり誘導可能であることを裏付けている。 図３８Ａ～３８Ｃは、ヒトＰＢＭＣアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。Ａ～Ｃは、ヒトＩＦＮα融合タンパク質と対照（ヒトＩＦＮα）とで比較されたＩＦＮα経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＦＮαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＦＮαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ヒトＩＦＮαの活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。分析はＣＸＣＬ－１０（ＩＰ－１０）の定量に基づいて実施した。結果はＩＦＮα融合タンパク質が活性であり誘導可能であることを裏付けている。 図３８Ａ～３８Ｃは、ヒトＰＢＭＣアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。Ａ～Ｃは、ヒトＩＦＮα融合タンパク質と対照（ヒトＩＦＮα）とで比較されたＩＦＮα経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＦＮαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＦＮαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照ヒトＩＦＮαの活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。分析はＣＸＣＬ－１０（ＩＰ－１０）の定量に基づいて実施した。結果はＩＦＮα融合タンパク質が活性であり誘導可能であることを裏付けている。 図３９Ａ～３９Ｇは、同系ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおいてＩＮＦ融合タンパク質を分析した結果を示す。図３９Ａは、３６９μｇのＷＷ０６１０（四角）、５５３μｇのＷＷ０６１０（下向き三角）、８３０μｇのＷＷ０６１０（上向き三角）及び１，２４５μｇのＷＷ０６１０（丸）で処置したマウスの経時的な平均腫瘍体積を示す。ビヒクル単独を黒丸で表す。 図３９Ａ～３９Ｇは、同系ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおいてＩＮＦ融合タンパク質を分析した結果を示す。図３９Ｂは、１，２３１μｇのＷＷ０８１５（四角）、１，８４５μｇのＷＷ０８１５（下向き三角）、２，７７０μｇのＷＷ０８１５（上向き三角）及び４，１５４μｇのＷＷ０８１５（丸）で処置したマウスの経時的な平均腫瘍体積を示す。ビヒクル単独を黒丸で表す。 図３９Ａ～３９Ｇは、同系ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおいてＩＮＦ融合タンパク質を分析した結果を示す。図３９Ｃは、４．６μｇのＷＷ０６４４（四角）、９．３μｇのＷＷ０６４４（下向き三角）、１９μｇのＷＷ０６４４（上向き三角）及び３７μｇのＷＷ０６４４（丸）で処置したマウスの経時的な平均腫瘍体積を示す。ビヒクル単独を黒丸で表す。 図３９Ａ～３９Ｇは、同系ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおいてＩＮＦ融合タンパク質を分析した結果を示す。図３９Ｄは、３１μｇのＷＷ０８１６（四角）、６２μｇのＷＷ０８１６（下向き三角）、１２３μｇのＷＷ０８１６（上向き三角）及び２４７μｇのＷＷ０８１６（丸）で処置したマウスの経時的な平均腫瘍体積を示す。ビヒクル単独を黒丸で表す。 図３９Ａ～３９Ｇは、同系ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおいてＩＮＦ融合タンパク質を分析した結果を示す。図３９Ｅは、１１０μｇのＷＷ０６０９（四角）、８３０μｇのＷＷ０６０９（下向き三角）及び１，３２０μｇのＷＷ０６０９（上向き三角）で処置したマウスの経時的な平均腫瘍体積を示す。 図３９Ａ～３９Ｇは、同系ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおいてＩＮＦ融合タンパク質を分析した結果を示す。図３９Ｆは、１１０μｇのＷＷ０６１０（四角）、８３０μｇのＷＷ０６１０（下向き三角）及び１，３２０μｇのＷＷ０６１０（上向き三角）で処置したマウスの経時的な平均腫瘍体積を示す。 図３９Ａ～３９Ｇは、同系ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおいてＩＮＦ融合タンパク質を分析した結果を示す。図３９Ｇは、０．３μｇのＷＷ０６４３（四角）、１．５μｇのＷＷ０６４３（下向き三角）、７．５μｇのＷＷ０６４３（上向き三角）及び３７．５μｇのＷＷ０６４３（菱形）で処置したマウスの経時的な平均腫瘍体積を示す。ビヒクル単独を黒丸で表す。 図４０Ａ～４０Ｇは、図３９Ａ～３９Ｇのデータに対応する、ＭＣ３８異種移植モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のクモグラフを示す。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な腫瘍体積である。 図４０Ａ～４０Ｇは、図３９Ａ～３９Ｇのデータに対応する、ＭＣ３８異種移植モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のクモグラフを示す。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な腫瘍体積である。 図４０Ａ～４０Ｇは、図３９Ａ～３９Ｇのデータに対応する、ＭＣ３８異種移植モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のクモグラフを示す。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な腫瘍体積である。 図４０Ａ～４０Ｇは、図３９Ａ～３９Ｇのデータに対応する、ＭＣ３８異種移植モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のクモグラフを示す。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な腫瘍体積である。 図４０Ａ～４０Ｇは、図３９Ａ～３９Ｇのデータに対応する、ＭＣ３８異種移植モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のクモグラフを示す。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な腫瘍体積である。 図４０Ａ～４０Ｇは、図３９Ａ～３９Ｇのデータに対応する、ＭＣ３８異種移植モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のクモグラフを示す。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な腫瘍体積である。 図４０Ａ～４０Ｇは、図３９Ａ～３９Ｇのデータに対応する、ＭＣ３８異種移植モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のクモグラフを示す。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な腫瘍体積である。 図４１Ａ～４１Ｇは、図３９Ａ～３９ＧのＩＮＦ融合タンパク質で処置したマウスの経時的な平均体重パーセントを示す。 図４１Ａ～４１Ｇは、図３９Ａ～３９ＧのＩＮＦ融合タンパク質で処置したマウスの経時的な平均体重パーセントを示す。 図４１Ａ～４１Ｇは、図３９Ａ～３９ＧのＩＮＦ融合タンパク質で処置したマウスの経時的な平均体重パーセントを示す。 図４１Ａ～４１Ｇは、図３９Ａ～３９ＧのＩＮＦ融合タンパク質で処置したマウスの経時的な平均体重パーセントを示す。 図４１Ａ～４１Ｇは、図３９Ａ～３９ＧのＩＮＦ融合タンパク質で処置したマウスの経時的な平均体重パーセントを示す。 図４１Ａ～４１Ｇは、図３９Ａ～３９ＧのＩＮＦ融合タンパク質で処置したマウスの経時的な平均体重パーセントを示す。 図４１Ａ～４１Ｇは、図３９Ａ～３９ＧのＩＮＦ融合タンパク質で処置したマウスの経時的な平均体重パーセントを示す。 図４２Ａ～４２Ｅは、Ｂ１６ ＩＦＮレポーターアッセイの結果を示す。関心対象の誘導可能インターフェロン構築物を切断の前及び後に試験した。関連する野生型ＩＦＮを対照として試験した。 図４２Ａ～４２Ｅは、Ｂ１６ ＩＦＮレポーターアッセイの結果を示す。関心対象の誘導可能インターフェロン構築物を切断の前及び後に試験した。関連する野生型ＩＦＮを対照として試験した。 図４２Ａ～４２Ｅは、Ｂ１６ ＩＦＮレポーターアッセイの結果を示す。関心対象の誘導可能インターフェロン構築物を切断の前及び後に試験した。関連する野生型ＩＦＮを対照として試験した。 図４２Ａ～４２Ｅは、Ｂ１６ ＩＦＮレポーターアッセイの結果を示す。関心対象の誘導可能インターフェロン構築物を切断の前及び後に試験した。関連する野生型ＩＦＮを対照として試験した。 図４２Ａ～４２Ｅは、Ｂ１６ ＩＦＮレポーターアッセイの結果を示す。関心対象の誘導可能インターフェロン構築物を切断の前及び後に試験した。関連する野生型ＩＦＮを対照として試験した。 ＡＣＰ１６、ＡＣＰ１０、ＡＣＰ１１の結合性データを示す。 図４４Ａ～４４Ｄは、サイトカイン融合タンパク質構築物ＡＣＰ２４３、ＡＣＰ２４４、ＡＣＰ２４３、ＡＣＰ２４４及びＡＣＰ２４７の活性を示す。 図４４Ａ～４４Ｄは、サイトカイン融合タンパク質構築物ＡＣＰ２４３、ＡＣＰ２４４、ＡＣＰ２４３、ＡＣＰ２４４及びＡＣＰ２４７の活性を示す。 図４４Ａ～４４Ｄは、サイトカイン融合タンパク質構築物ＡＣＰ２４３、ＡＣＰ２４４、ＡＣＰ２４３、ＡＣＰ２４４及びＡＣＰ２４７の活性を示す。 図４４Ａ～４４Ｄは、サイトカイン融合タンパク質構築物ＡＣＰ２４３、ＡＣＰ２４４、ＡＣＰ２４３、ＡＣＰ２４４及びＡＣＰ２４７の活性を示す。 ビヒクル、ＩＬ－１２、ＡＣＰ１１またはＡＣＰ１０による処置の間の経時的な腫瘍体積を示す一連のクモグラフを示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図４６Ａ～４６Ｄ、４７Ａ～４７Ｄ、４８Ａ、Ａ８Ｂ、Ａ９Ａ～４９Ｉ、５０Ａ、５０Ｂ、及び５１Ａ～５１Ｃは、サイトカイン融合タンパク質構築物で処置したマウスについてのデータ（腫瘍体積及び／または体重）を示す。 図５２Ａ～５２Ｎ、５３Ａ及び５３Ｂは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５２Ａ～５２Ｎ、５３Ａ及び５３Ｂは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５２Ａ～５２Ｎ、５３Ａ及び５３Ｂは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５２Ａ～５２Ｎ、５３Ａ及び５３Ｂは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５２Ａ～５２Ｎ、５３Ａ及び５３Ｂは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５２Ａ～５２Ｎ、５３Ａ及び５３Ｂは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５２Ａ～５２Ｎ、５３Ａ及び５３Ｂは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５２Ａ～５２Ｎ、５３Ａ及び５３Ｂは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５２Ａ～５２Ｎ、５３Ａ及び５３Ｂは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５２Ａ～５２Ｎ、５３Ａ及び５３Ｂは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５２Ａ～５２Ｎ、５３Ａ及び５３Ｂは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５２Ａ～５２Ｎ、５３Ａ及び５３Ｂは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５２Ａ～５２Ｎ、５３Ａ及び５３Ｂは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５２Ａ～５２Ｎ、５３Ａ及び５３Ｂは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５２Ａ～５２Ｎ、５３Ａ及び５３Ｂは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５２Ａ～５２Ｎ、５３Ａ及び５３Ｂは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５４Ａ～５４Ｎは、切断されたタンパク質と、未切断タンパク質と、対照としてのＩＬ２とを比較する増殖アッセイの結果を示す。 図５４Ａ～５４Ｎは、切断されたタンパク質と、未切断タンパク質と、対照としてのＩＬ２とを比較する増殖アッセイの結果を示す。 図５４Ａ～５４Ｎは、切断されたタンパク質と、未切断タンパク質と、対照としてのＩＬ２とを比較する増殖アッセイの結果を示す。 図５４Ａ～５４Ｎは、切断されたタンパク質と、未切断タンパク質と、対照としてのＩＬ２とを比較する増殖アッセイの結果を示す。 図５４Ａ～５４Ｎは、切断されたタンパク質と、未切断タンパク質と、対照としてのＩＬ２とを比較する増殖アッセイの結果を示す。 図５４Ａ～５４Ｎは、切断されたタンパク質と、未切断タンパク質と、対照としてのＩＬ２とを比較する増殖アッセイの結果を示す。 図５４Ａ～５４Ｎは、切断されたタンパク質と、未切断タンパク質と、対照としてのＩＬ２とを比較する増殖アッセイの結果を示す。 図５４Ａ～５４Ｎは、切断されたタンパク質と、未切断タンパク質と、対照としてのＩＬ２とを比較する増殖アッセイの結果を示す。 図５４Ａ～５４Ｎは、切断されたタンパク質と、未切断タンパク質と、対照としてのＩＬ２とを比較する増殖アッセイの結果を示す。 図５４Ａ～５４Ｎは、切断されたタンパク質と、未切断タンパク質と、対照としてのＩＬ２とを比較する増殖アッセイの結果を示す。 図５４Ａ～５４Ｎは、切断されたタンパク質と、未切断タンパク質と、対照としてのＩＬ２とを比較する増殖アッセイの結果を示す。 図５４Ａ～５４Ｎは、切断されたタンパク質と、未切断タンパク質と、対照としてのＩＬ２とを比較する増殖アッセイの結果を示す。 図５４Ａ～５４Ｎは、切断されたタンパク質と、未切断タンパク質と、対照としてのＩＬ２とを比較する増殖アッセイの結果を示す。 図５４Ａ～５４Ｎは、切断されたタンパク質と、未切断タンパク質と、対照としてのＩＬ２とを比較する増殖アッセイの結果を示す。 図５５Ａ～５５Ｎは、プロテアーゼ切断を伴う及び伴わない構築物の活性を比較するＨｅｋＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイの結果を示し、対照としてＩＬ－２を含める。 図５５Ａ～５５Ｎは、プロテアーゼ切断を伴う及び伴わない構築物の活性を比較するＨｅｋＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイの結果を示し、対照としてＩＬ－２を含める。 図５５Ａ～５５Ｎは、プロテアーゼ切断を伴う及び伴わない構築物の活性を比較するＨｅｋＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイの結果を示し、対照としてＩＬ－２を含める。 図５５Ａ～５５Ｎは、プロテアーゼ切断を伴う及び伴わない構築物の活性を比較するＨｅｋＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイの結果を示し、対照としてＩＬ－２を含める。 図５５Ａ～５５Ｎは、プロテアーゼ切断を伴う及び伴わない構築物の活性を比較するＨｅｋＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイの結果を示し、対照としてＩＬ－２を含める。 図５５Ａ～５５Ｎは、プロテアーゼ切断を伴う及び伴わない構築物の活性を比較するＨｅｋＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイの結果を示し、対照としてＩＬ－２を含める。 図５５Ａ～５５Ｎは、プロテアーゼ切断を伴う及び伴わない構築物の活性を比較するＨｅｋＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイの結果を示し、対照としてＩＬ－２を含める。 図５５Ａ～５５Ｎは、プロテアーゼ切断を伴う及び伴わない構築物の活性を比較するＨｅｋＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイの結果を示し、対照としてＩＬ－２を含める。 図５５Ａ～５５Ｎは、プロテアーゼ切断を伴う及び伴わない構築物の活性を比較するＨｅｋＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイの結果を示し、対照としてＩＬ－２を含める。 図５５Ａ～５５Ｎは、プロテアーゼ切断を伴う及び伴わない構築物の活性を比較するＨｅｋＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイの結果を示し、対照としてＩＬ－２を含める。 図５５Ａ～５５Ｎは、プロテアーゼ切断を伴う及び伴わない構築物の活性を比較するＨｅｋＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイの結果を示し、対照としてＩＬ－２を含める。 図５５Ａ～５５Ｎは、プロテアーゼ切断を伴う及び伴わない構築物の活性を比較するＨｅｋＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイの結果を示し、対照としてＩＬ－２を含める。 図５５Ａ～５５Ｎは、プロテアーゼ切断を伴う及び伴わない構築物の活性を比較するＨｅｋＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイの結果を示し、対照としてＩＬ－２を含める。 図５５Ａ～５５Ｎは、プロテアーゼ切断を伴う及び伴わない構築物の活性を比較するＨｅｋＢｌｕｅ ＩＬ２レポーターアッセイの結果を示し、対照としてＩＬ－２を含める。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図５６、５７Ａ～５７Ｄ、５８、５９Ａ～５９Ｚは、サイトカイン融合タンパク質構築物の活性を示す。 図６０Ａ～６０Ｇは、図４１Ａ～４１Ｇに示されるデータに対応する、ＭＣ３８マウス異種移植モデルの体重に対するＩＮＦ融合タンパク質の影響を示す一連のクモグラフを示す。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な体重である。 図６０Ａ～６０Ｇは、図４１Ａ～４１Ｇに示されるデータに対応する、ＭＣ３８マウス異種移植モデルの体重に対するＩＮＦ融合タンパク質の影響を示す一連のクモグラフを示す。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な体重である。 図６０Ａ～６０Ｇは、図４１Ａ～４１Ｇに示されるデータに対応する、ＭＣ３８マウス異種移植モデルの体重に対するＩＮＦ融合タンパク質の影響を示す一連のクモグラフを示す。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な体重である。 図６０Ａ～６０Ｇは、図４１Ａ～４１Ｇに示されるデータに対応する、ＭＣ３８マウス異種移植モデルの体重に対するＩＮＦ融合タンパク質の影響を示す一連のクモグラフを示す。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な体重である。 図６０Ａ～６０Ｇは、図４１Ａ～４１Ｇに示されるデータに対応する、ＭＣ３８マウス異種移植モデルの体重に対するＩＮＦ融合タンパク質の影響を示す一連のクモグラフを示す。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な体重である。 図６０Ａ～６０Ｇは、図４１Ａ～４１Ｇに示されるデータに対応する、ＭＣ３８マウス異種移植モデルの体重に対するＩＮＦ融合タンパク質の影響を示す一連のクモグラフを示す。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な体重である。 図６０Ａ～６０Ｇは、図４１Ａ～４１Ｇに示されるデータに対応する、ＭＣ３８マウス異種移植モデルの体重に対するＩＮＦ融合タンパク質の影響を示す一連のクモグラフを示す。グラフ中の各線は単一のマウスの経時的な体重である。 図６１Ａ～Ｂは、Ｂ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。Ａは、アルブミンの存在下及び非存在下での構築物ＷＷ０６０９についてのＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。Ｂは、アルブミンの存在下及び非存在下での構築物ＷＷ０６４３についてのＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＮＦαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＮＦαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（マウスＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。 図６１Ａ～Ｂは、Ｂ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βレポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。Ａは、アルブミンの存在下及び非存在下での構築物ＷＷ０６０９についてのＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。Ｂは、アルブミンの存在下及び非存在下での構築物ＷＷ０６４３についてのＩＦＮ－α／β経路の活性化を示す。四角は未切断ＩＮＦαポリペプチド（完全型）の活性を表し、三角は切断されたＩＮＦαポリペプチド（切断型）の活性を表す。丸は対照（マウスＩＦＮα）の活性を表す。各々についてのＥＣ５０値を表に示す。
本明細書では、誘導可能サイトカインを含む構築物を設計し使用するための方法及び組成物を開示する。サイトカインは強力な免疫アゴニストであり、このことゆえにそれは腫瘍学のための有望な治療剤としてみなされている。しかしながら、サイトカインは治療窓が非常に狭いことが証明された。サイトカインは血清中半減期が短く、また、非常に強力であると考えられている。結果として、サイトカインの治療的投与は、望ましくない全身作用及び毒性を生じさせた。これらは、意図したサイトカイン作用部位（例えば腫瘍）でのサイトカインの所望のレベルを実現するために大量のサイトカインを投与する必要性によって増悪した。残念なことに、サイトカインの生物学、ならびにその活性の効果的な指向及び制御ができないことに起因して、サイトカインは腫瘍の治療において待望の臨床的利益を実現しなかった。
本明細書では、腫瘍学におけるサイトカインの臨床使用を著しく制限してきた毒性及び短い半減期の課題を克服する融合タンパク質を開示する。融合タンパク質は、受容体アゴニスト作用を有するサイトカインポリペプチドを含有する。しかしながら、融合タンパク質の文脈では、サイトカイン受容体アゴニスト作用が弱化しており循環半減期が延びる。融合タンパク質は、所望のサイトカイン作用部位（例えば腫瘍）に関連付いており典型的には所望の作用部位に豊富にまたは選択的に存在しているプロテアーゼによって切断されるものであるプロテアーゼ切断部位を含む。かくして、融合タンパク質は所望の作用部位において優先的に（または選択的に）かつ効率的に切断されて、サイトカイン作用を実質的に所望の作用部位、例えば腫瘍微小環境に限定する。所望の作用部位、例えば腫瘍微小環境でのプロテアーゼ切断は、サイトカイン受容体アゴニストとして融合タンパク質よりもはるかに活性である（典型的には活性が融合タンパク質よりも少なくとも約１００倍大きい）サイトカインの一形態を、融合タンパク質から遊離させる。融合タンパク質の切断時に遊離するサイトカインの形態は、典型的には短い半減期を有し、これはしばしば、天然に存在するサイトカインの半減期と実質的に同程度であり、その結果、サイトカイン作用がよりいっそう腫瘍微小環境に限局される。融合タンパク質の半減期が延びるにもかかわらず、毒性は、循環する融合タンパク質が弱化されていること及び活性サイトカインが腫瘍微小環境に指向されることゆえに、劇的に低減または排除される。本明細書に記載の融合タンパク質は、サイトカインの作用が実質的に腫瘍微小環境に限定され、サイトカインの望まれない全身作用及び毒性が劇的に低減及び排除される、腫瘍を治療するための有効治療用量のサイトカインの投与を、初めて可能にするものである。
本明細書に開示される融合タンパク質は、典型的には、サイトカインポリペプチド［Ａ］、阻止部分［Ｄ］、任意選択の半減期延長部分［Ｈ］、及びプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーを含む。サイトカインポリペプチドと、阻止部分と、存在する場合の任意選択の半減期延長要素とはプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーによって機能可能に連結されており、融合ポリペプチドは、弱化したサイトカイン受容体賦活作用を有し、例えば、融合ポリペプチドのサイトカイン受容体賦活作用は、プロテアーゼ切断可能リンカーの切断によって生成したサイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体賦活作用に比べて約１０分の１以下である。いくつかの好ましい融合ポリペプチドは、式（Ｉ）～（ＶＩ）：
［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｈ］－［Ｌ２］－［Ｄ］（Ｉ）；
［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｈ］－［Ｌ１］－［Ａ］（ＩＩ）；
［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｈ］（ＩＩＩ）；
［Ｈ］－［Ｌ２］－［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］（ＩＶ）；
［Ｈ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２’］－［Ｄ］（Ｖ）；
［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２’］－［Ｈ］（ＶＩ）；
〔式中、［Ａ］はサイトカインポリペプチドであり、［Ｄ］は阻止部分であり、［Ｈ］は半減期延長部分であり、［Ｌ１］はプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーであり、［Ｌ２］は、任意選択的にプロテアーゼ切断可能であるポリペプチドリンカーであり、［Ｌ２’］はプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーである〕
のうちの１つで表されるものである。［Ｌ１］及び［Ｌ２］、または［Ｌ１］及び［Ｌ２’］は、所望により同じまたは異なるアミノ酸配列及びまたはプロテアーゼ切断部位を有し得る（Ｌ２がプロテアーゼ切断可能である場合）。
本開示はさらに、誘導可能融合タンパク質及び付加的治療剤を含有する医薬組成物、ならびにポリペプチドをコードする核酸、ならびにそのような融合タンパク質を作るための組換え発現ベクター及び宿主細胞（ｓｅｌｌｓ）に関する。また、疾患、病態及び障害の治療において本開示の融合タンパク質を使用する方法も、本明細書に提供される。
特に規定されない限り、本明細書中で使用される技術分野、記号法及び他の科学技術の全ての用語は、本発明が属する分野の当業者に通常理解されている意味を有することを意図したものである。場合によっては、通常理解されている意味を有する用語は、明確さのため及び／または参照を容易にするために本明細書中で定義がなされており、そのような本明細書中での定義の包含は、必ずしも当技術分野で一般的に理解されているものとの差異を表していると解釈されるべきではない。本明細書において記載または言及される技術及び手順は一般的によく理解されており、当業者による従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４ｔｈ ｅｄ．（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されており広く利用されている分子クローニング方法論などを用いて通常採用されるものである。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を伴う手順を、特に記されていない限り概して製造業者の規定のプロトコール及び条件に従って行う。
「サイトカイン」は、とりわけ免疫系の細胞によって分泌され、免疫系の調節物質である免疫調節性タンパク質のクラスのいずれか（例えばインターロイキンまたはインターフェロン）を指すよく知られている専門用語である。本明細書に開示される融合タンパク質に使用され得るサイトカインポリペプチドとしては、形質転換成長因子、例えばＴＧＦ－α及びＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３）；インターフェロン、例えばインターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－γ、インターフェロン－カッパ及びインターフェロン－オメガ；インターロイキン、例えばＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１及びＩＬ－２５；腫瘍壊死因子、例えば腫瘍壊死因子アルファ及びリンホトキシン；ケモカイン（例えば、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳ）、ならびにサイトカインに対する同族受容体を活性化させるそのようなポリペプチドの断片（すなわち上記の機能性断片）が挙げられるが、これらに限定されない。「ケモカイン」は、近傍の応答細胞において指向的な走化性を誘導する能力を有する小さいサイトカインのファミリーのいずれかを指す専門用語である。
サイトカインは、しばしばほんの数分または数時間となる、短い血清中半減期を有することがよく知られている。血清中半減期を延ばすが受容体アゴニスト作用を保持することを意図した改変型アミノ酸配列を有するサイトカインの形態でさえも、短い血清中半減期を有することが典型的である。本明細書中で使用する場合、「短半減期サイトカイン」は、対象の血清において循環するかなり短い時間の半減期、例えば、１０分未満、１５分未満、３０分未満、６０分未満、９０分未満、１２０分未満、２４０分未満または４８０分未満の血清中半減期を有するサイトカインを指す。本明細書中で使用する場合、短半減期サイトカインには、対象の体内での通常より長い半減期をもたらすための、及び血清中半減期を延ばすが受容体アゴニスト作用を保持することを意図した改変型アミノ酸配列を有するポリペプチドをもたらすための配列の改変がなされていないサイトカインが含まれる。この後者は、異種タンパク質ドメイン、例えば真正の半減期延長要素、例えば血清アルブミンの付加を含むことを意味していない。
「ソーターゼ」は、標的タンパク質またはペプチドに埋め込まれているかまたはその末端に結合しているカルボキシル末端選別シグナルを認識及び切断することによってタンパク質を修飾するペプチド転移酵素である。ソーターゼＡは、標的タンパク質上のＬＰＸＴＧモチーフ（配列番号４４２）（Ｘは任意の標準的アミノ酸である）のＴｈｒ残基とＧｌｙ残基との間での切断を触媒するが、これは、酵素上の活性部位Ｃｙｓ残基にＴｈｒ残基が一時的に結合して酵素－チオアシル中間体を形成することを伴う。ペプチド転移を完了させペプチド－単量体結合体を作り出すためには、Ｎ末端求核基、典型的にはオリゴグリシンモチーフを有する生体分子が中間体を攻撃してソーターゼＡを置き換え、２つの分子を結び付ける。
本明細書中で使用する場合、「立体的阻止物質」という用語は、直接的に、またはリンカーなどの他の部分を介して間接的に例えばキメラポリペプチド（融合タンパク質）の形態でサイトカインポリペプチドに共有結合で結合していることもあるが別様であればサイトカインポリペプチドに共有結合で結合していない、ポリペプチドまたはポリペプチド部分を指す。立体的阻止物質はサイトカインポリペプチドに非共有結合で、例えば静電的結合、疎水性結合、イオン結合または水素結合によって結合し得る。立体的阻止物質は典型的には、サイトカイン部分とのその近さ及び相対的大きさゆえにサイトカイン部分の活性を阻害または阻止する。立体的阻止物質は、大きなタンパク質結合相手を採用することによっても阻止を行い得る。この一例が血清アルブミンに結合する抗体であり、抗体自体はそれ自体で活性化または結合を阻止するほど大きなものであってもなくてもよい一方、アルブミンを採用することは十分な立体的阻止を可能にする。
本明細書中で使用され記載される場合、「半減期延長要素」は、例えばその大きさ（例えば腎濾過カットオフを上回るように）、形状、流体力学的径、電荷、または吸収、生体内分布、代謝及び排出のパラメータを変化させることによって血清中半減期を長くしｐＫを改善する、キメラポリペプチドの一部である。
本明細書中で使用する場合、「活性化可能」、「活性化させる」、「誘導する」及び「誘導可能」という用語は、融合タンパク質の一部であるタンパク質、すなわちサイトカインの、融合タンパク質からの付加的要素の切断によってその受容体と結合して作用を起こす能力を意味する。
本明細書中で使用する場合、「プラスミド」または「ウイルスベクター」は、本開示の核酸を分解させずに細胞内に輸送する薬剤であり、それが送達される細胞において細胞核酸分子及び／またはポリペプチドの発現をもたらすプロモーターを含む。
本明細書中で使用する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、広義には、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸を意味して使用される。タンパク質、ペプチド及びポリペプチドはまた、本明細書においてアミノ酸配列を指して互換的に使用される。本明細書においてポリペプチドという用語が、分子を構成する特定の大きさまたはアミノ酸の数を示唆するために使用されていないこと、及び本発明のペプチドが数個以下またはそれより多くのアミノ酸残基を含有し得ることは認識されるべきである。
全体を通して使用されている「対象」は、脊椎動物であり得、より具体的には、哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラット及びモルモット）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類及び他の任意の動物であり得る。当該用語は特定の年齢または性別を表さない。したがって、成体及び新生対象は雄であろうと雌であろうと包含されることを意図する。
本明細書中で使用する場合、「患者」または「対象」は互換的に使用され得、疾患または障害（例えばがん）を有する対象を指し得る。患者または対象という用語は、ヒト及び獣医学的対象を含む。
本明細書中で使用する場合、「治療」、「治療する」または「治療すること」という用語は、疾患もしくは病態、または疾患もしくは病態の症候の影響を軽減する方法を意味する。したがって、本開示の方法において治療は、既存の疾患もしくは病態、または疾患もしくは病態の症候の重症度を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または実質的に完全に低減することを意味し得る。例えば、疾患を治療する方法は、対照と比較して対象における疾患の１つ以上の症候に１０％の低減がある場合に、治療であるとみなされる。したがって、低減は、元のレベルまたは対照レベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０～１００％の間の任意の低減パーセントであり得る。治療が必ずしも疾患、病態、または疾患もしくは病態の症候の治癒または完全な除去を意味していないことは、理解される。
本明細書中で使用する場合、疾患または障害の「予防する」、「予防すること」及び「予防」という用語は、疾患または障害の１つ以上の症候の開始または増悪を抑制するまたは遅らせるものである、対象が疾患または障害の１つ以上の症候を示し始める前またはそれとほぼ同じ時に起こる行為、例えばキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸配列の投与を意味する。
本明細書中で使用する場合、「減少させること」、「低減すること」または「抑制すること」に対する言及は、好適な対照レベルと比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％の、またはそれより大きな変化を含む。そのような用語は、機能または特性、例えばアゴニスト作用の完全な排除を含む場合があるが、必ずしも含むというわけではない。
「弱化したサイトカイン受容体アゴニスト」は、サイトカイン受容体の天然に存在するアゴニストと比較して減少した受容体アゴニスト作用を有するサイトカイン受容体アゴニストである。弱化したサイトカインアゴニストは、受容体の天然に存在するアゴニストと比較して多くとも約１０分の１、多くとも約５０分の１、多くとも約１００分の１、多くとも約２５０分の１、多くとも約５００分の１、多くとも約１０００分の１またはそれ未満のアゴニスト作用を有し得る。本明細書に記載のサイトカインポリペプチドを含有する融合タンパク質が「弱化している」または「弱化した作用」を有すると表現される場合、それは、融合タンパク質が、弱化したサイトカイン受容体アゴニストである、ということを意味している。
「完全型融合タンパク質」は、どのドメインも例えばプロテアーゼ切断によって除去されていない融合タンパク質である。ドメインはプロテアーゼ切断または他の酵素作用によって除去可能であり得るが、融合タンパク質が「完全型」である場合にはこれが起こっていない。
本明細書中で使用する場合、「部分」は、分子の中で別個の機能を有している当該分子の一部を指し、その機能はその部分によって別の分子の文脈において発揮され得る。部分は、特定の機能を有する化学的実体、または特定の機能を有する生体分子の一部であり得る。例えば、融合タンパク質中の「阻止部分」は、融合ポリペプチドの活性の一部または全てを阻止することができる融合タンパク質の一部である。これは、タンパク質ドメイン、例えば血清アルブミンであり得る。阻止は、立体的阻止物質または特異的阻止物質によって成し遂げられ得る。立体的阻止物質は、特異的な結合に基づくのではなく大きさ及び位置によって阻止を行うものであり、一例は血清アルブミンである。特異的阻止物質は、阻止される部分との特異的な相互作用によって阻止を行う。特異的阻止物質は、特定のサイトカインまたは活性ドメインに適合するように作られなければならず、立体的阻止物質は、それが十分に大きい限り、搭載薬とは無関係に使用され得る。所望により、本明細書に記載の融合タンパク質に組み込まれる阻止部分は、別のポリペプチドと会合して特異的な結合ドメインを作り出し得る。例えば、抗体のサイトカイン結合性断片を阻止部分として使用する場合、融合ポリペプチドは、サイトカインに特異的なｓｃＦｖを阻止部分として含み得、または融合ポリペプチドは、Ｆａｂの半分、例えばＶＨ－ＣＨ１もしくはＶＬ－ＣＬを阻止部分として含み得、これがそれぞれ相補鎖ＶＬ－ＣＬもしくはＶＨ－ＣＨ１と会合して、サイトカインに特異的に結合するＦａｂ断片を形成し得る。本明細書にさらに記載されるとおり、阻止部分は、直接的に、または阻止部分が別のポリペプチドと会合しているときに、融合タンパク質の活性を阻止し得る。例えば、抗ＨＳＡ ｓｃＦｖがＨＳＡに結合しているとき、またはＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドが相補的なＶＬ－ＣＬポリペプチドと会合してその後にサイトカインポリペプチドに結合しているときである。
一般に、サイトカインの治療的使用はその全身毒性によって厳しく制限される。例えばＴＮＦは当初、いくつかの腫瘍の出血性壊死を誘導するその能力ゆえに、及び種々の腫瘍性系統に対するその試験管内での細胞傷害作用ゆえに発見されたが、後にそれは、過剰産生条件の場合に人体を危険に曝す可能性がある強い炎症促進作用を有することが証明された。全身毒性はヒトにおける薬理活性量のサイトカインの使用に関する根本的課題であるため、この類の生物学的エフェクターの治療的有効性を保ちながらその毒性作用を軽減することを目的として新規な誘導体及び治療方策が現在評価中である。
ＩＬ－２は、免疫系において刺激機能及び調節機能を両方とも働かせるものであり、共通γ鎖（γｃ）サイトカインファミリーの他のメンバーと一緒に免疫恒常性の中心となっている。ＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）鎖とＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）鎖とＩＬ－２Ｒγ（γｃ、ＣＤ１３２）鎖とで作られた三量体型受容体か、二量体型βγＩＬ－２Ｒ（１，３）かのどちらかからなるＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）に結合することによってその作用を媒介する。どちらのＩＬ－２Ｒ多様体も、ＩＬ－２との結合によってシグナルを伝達することができる。しかしながら、三量体型αβγＩＬ－２Ｒは二量体型βγＩＬ－２Ｒ（３）と比較してＩＬ－２に対するおおよそ１０～１００倍高い親和性を有しており、ＣＤ２５がＩＬ－２とその受容体との高親和性の結合性を与えるがシグナル伝達に必須ではないことを示唆している。三量体型ＩＬ－２Ｒは、試験管内及び生体内でＩＬ－２に対する感受性を有する活性化Ｔ細胞及びＣＤ４＋フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）＋Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）の上に見つかる。反対に、抗原感作（メモリー）ＣＤ８＋、ＣＤ４４高メモリー表現型（ＭＰ）ＣＤ８＋及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は高いレベルの二量体型βγＩＬ－２Ｒを持っており、これらの細胞も試験管内及び生体内でＩＬ－２に激しく応答する。
高親和性ＩＬ－２Ｒの発現は、Ｔ細胞が生体内で一時的に利用可能なＩＬ－２の低濃度に対する応答性を持つ上で極めて重要である。ＩＬ－２Ｒα発現は、天然及びメモリーＴ細胞上には存在していないが、抗原活性化後に誘導される。ＩＬ－２Ｒβは、ＮＫ、ＮＫＴ及びメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞で恒常的に発現しているが、抗原活性化後に天然Ｔ細胞上にも誘導される。γｃは、よりはるかに緩慢に調節されており、全てのリンパ系細胞で恒常的に発現している。ひとたび高親和性のＩＬ－２Ｒが抗原によって誘導されると、ＩＬ－２Ｒシグナル伝達はＩｌ２ｒａ転写のＳｔａｔ５依存的調節によってＩＬ－２Ｒαの発現を部分的に上方制御する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００１）。このプロセスは、高親和性ＩＬ－２Ｒの発現を維持し、ＩＬ－２の供給源が残存している間はＩＬ－２シグナル伝達を持続させる機序を表している。
ＩＬ－２はＩＬ－２Ｒαによって、速い結合－解離速度論を伴う比較的弱い相互作用（Ｋｄ１０～８Ｍ）をもたらす極性辺縁に取り囲まれた広い疎水性結合表面を介して捕捉される。しかしながら、ＩＬ－２Ｒα－ＩＬ－２二元複合体は、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβとの別個な極性相互作用によってＩＬ－２Ｒβとの会合を促進する非常に小さな立体配座変化をＩＬ－２にもたらす。Ｃｉａｒｄｅｌｌｉのデータに示されるように、ＩＬ２／α／β三量体型複合体の偽性高親和性（すなわちＫｄ約３００ｐＭ）は明らかに、α鎖のみに結合したＩＬ２（Ｋｄ＝１０ｎＭ）またはβ鎖のみに結合したＩＬ２（Ｋｄ＝４５０ｎＭ）のどちらと比べても三量体型複合体の方がより安定していることを示している。いずれにせよ、ＩＬ２／α／β三量体は次に、シグナル伝達ができる四元複合体の中にγ鎖を動員するが、これは、γ鎖に対するＩＬ２結合β鎖上の大きな複合結合部位によって容易にされる。
換言すれば、三元ＩＬ－２Ｒα－ＩＬ－２Ｒβ－ＩＬ－２複合体は次に、ＩＬ－２との弱い相互作用、及びＩＬ－２Ｒβとのより強い相互作用によってγｃを動員して、安定した四元高親和性ＩＬ－２Ｒ（Ｋｄ１０～１１Ｍ、すなわち１０ｐＭ）を生成する。高親和性四元ＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒ複合体の形成は、ＩＬ－２Ｒβ及びγｃとそれぞれ会合するものであるチロシンキナーゼＪａｋ１及びＪａｋ３によるシグナル伝達につながる（Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｌｅｒｆｏｒｄ，１９９８）。四元ＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒ複合体は速やかに内在化してＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒβ及びγｃが速やかに分解されるが、ＩＬ－２Ｒαは細胞表面に再利用される（Ｈｅｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｙｕ ａｎｄ Ｍａｌｅｋ，２００１）。したがって、持続的ＩＬ－２Ｒシグナル伝達を必要とする機能的作用は、ＩＬ－２Ｒαに係合してさらなるＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒシグナル伝達複合体を形成するためのＩＬ－２の継続的供給源を必要とする。
サイトカインの４－アルファ－ヘリックスバンドルファミリーの別のメンバーであるインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）も、同じくがんの治療のための免疫調節物質として出現した。ＩＬ－１５は最初に、抗原提示樹状細胞上、単球上及びマクロファージ上に発現するＩＬ－１５Ｒαによって捕捉される。ＩＬ－１５は広範な作用を発揮し、ＩＬ－１５／ＩＬ－２－Ｒ－β（ＣＤ１２２）及び共通γ鎖（ＣＤ１３２）を介したシグナル伝達によってＴ、Ｂ及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の分化及び増殖を誘導する。それはさらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解作用を増強し、長期間持続する抗原感作ＣＤ８＋ＣＤ４４メモリーＴ細胞を誘導する。ＩＬ－１５は、Ｂ細胞による分化及び免疫グロブリン合成を刺激し、樹状細胞の成熟を誘導する。それは、免疫抑制Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）を刺激しない。このため、ＩＬ－１５作用を腫瘍微小環境において選択的に増強することで、自然及び特異的免疫性が増強されて腫瘍と闘うこと可能性がある（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＩＬ－１５は当初、ＩＬ－２に類似する方法で共通受容体成分（ＩＬ－２Ｒ／１５Ｒβ－γｃ）によって、ならびにＪＡＫ１／ＪＡＫ３及びＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ５によるシグナル伝達によってＴ細胞増殖を刺激するその能力のために同定された。ＩＬ－２と同様にＩＬ－１５は、活性化ＣＤ４－ＣＤ８－、ＣＤ４＋ＣＤ８＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激することが示されているとともに、細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導ならびにＮＫ細胞の生成、増殖及び活性化を容易にすることが示されている（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。しかしながら、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）発現ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を維持するため及び末梢におけるこれらの細胞の保持のために必要とされるＩＬ－２とは違って、ＩＬ－１５はＴｒｅｇに対してほとんど影響を及ぼさない（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）。これは重要なことである、というのも、ＦＯＸＰ３発現ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＴｒｅｇはエフェクターＴ細胞を抑制してそれによって、腫瘍を標的とするものを含めた免疫応答を阻害するからである。ＩＬ－２も、自己反応性Ｔ細胞の除去につながるプロセスである活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を開始する上での決定的な役割を有しているが、ＩＬ－１５はＴ細胞に対する抗アポトーシス因子である（Ｍａｒｋｓ－Ｋｏｎｃｚａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＨＩＶペプチドワクチンと共送達されたＩＬ－１５は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の長続きを促進すること及びＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスを阻止することによってＣＤ４＋Ｔ細胞欠損症を克服することが示された（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００８）。さらには、ＩＬ－１５はＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉメモリーＴ細胞の長期維持を促進する（Ｋａｎｅｇａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
Ｔ及びＮＫ細胞発達に対するＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαの重要性は、ＩＬ－１５Ｒα－／－及びＩＬ－１５－／－マウスの表現型によってさらに強調される。ノックアウトマウスはＣＤ８＋Ｔ細胞の総数の減少を示し、メモリー表現型ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、及び腸管上皮細胞間リンパ球のいくつかのサブセットが欠損しており、ＩＬ－５が細胞のこれらのサブセットに必須となる正の恒常性機能を提供することを示している（Ｌｏｄｏｌｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ノックアウトマウスのこれらの２つの株の表現型における類似性は、生理学的に重要なＩＬ－１５シグナルの維持におけるＩＬ－１５Ｒαの重要性を示唆している。
ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５受容体アルファ鎖によって、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面に提示されたＩＬ－１５Ｒβγｃ複合体にトランスで提示される（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＩＬ－１５Ｒα鎖は、シャペロンタンパク質の役割を果たし、ＩＬ－１５活性を安定化させ増大させる（Ｄｅｓｂｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。外来ＩＬ－１５は、がん患者において下方制御されていることが多いＩＬ－１５Ｒαに対するその依存性ゆえに、がんの患者に対しては限られた影響を有し得ることが示された。それゆえ、リンカーを介してＩＬ－１５に連結されたＩＬ１５Ｒａのｓｕｓｈｉ＋ドメインで構成される融合タンパク質ＲＬＩが、ＩＬ１５療法に対する代替手法として提案された（Ｂｅｓｓａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００９）。可溶性ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体の投与は生体内でのＩＬ－１５血清中半減期及び生物学的利用能を大幅に強化したことが見出された（Ｓｔｏｋｌａｓｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
Ｔ及びＮＫ細胞に対する作用に加えてＩＬ－１５は、免疫系の他の成分に対するいくつかの作用も有する。ＩＬ－１５は、好中球をアポトーシスから保護し、食作用を調節し、ＩＬ－８及びＩＬ－１Ｒアンタゴニストの分泌を刺激する。それは、ＪＡＫ２、ｐ３８及びＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫ、Ｓｙｋキナーゼ、ならびにＮＦ－ｋＢ転写因子の活性化によって機能する（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。マスト細胞では、ＩＬ－１５は成長因子及びアポトーシスの阻害物質として作用し得る。これらの細胞においてＩＬ－１５は、γｃ結合を必要とすることなくＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５経路を活性化させる（Ｔａｇａｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。ＩＬ－１５はまた、Ｂリンパ球増殖及び分化を誘導し、免疫グロブリン分泌を増加させる（Ａｒｍｉｔａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。それはまた、Ｆａｓ媒介アポトーシスを防止し、ＣＤ４の援助から部分的に独立した抗体応答の誘導を可能にする（Ｄｅｍｅｒｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。単球、マクロファージ及び樹状細胞はＩＬ－１５を効果的に転写及び翻訳する。それらはまた、ＩＬ－１５刺激に応答する。マクロファージは、食作用を増加させること、ＩＬ－８、ＩＬ－１２及びＭＣＰ－１発現を誘導すること、ならびにＩＬ－６、ＩＬ－８及びＴＮＦαを分泌することによって応答する（Ｂｕｄａｇｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＩＬ－１５とインキュベートされた樹状細胞は、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ４０及びＭＨＣクラスＩＩ発現の増加に伴って成熟を示し、さらにはアポトーシスに対して抵抗性であり、インターフェロン－γ分泌の増強を示す（Ａｎｇｕｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。
ＩＬ－１５は、単球、脂肪細胞、内皮及び神経細胞を含めた非血液細胞に対する作用を有することも示されている。ＩＬ－１５は筋肉に対するタンパク同化作用を有し、筋肉細胞分化を支援し得る（Ｑｕｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。それは筋細胞及び筋線維を刺激して収縮タンパク質を蓄積し、がん関連悪液質を有するラットにおける筋消耗を減速させることができる（Ｆｉｇｕｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＩＬ－１５はまた、血管新生を刺激すること（Ａｎｇｉｏｌｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、ならびに小膠細胞の成長及び生存を誘導すること（Ｈａｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７）が示されている。
同じくＩＬ－２／ＩＬ－１５ファミリーのものであるインターロイキン－７（ＩＬ－７）は、十分に特性評価された多面的なサイトカインであり、間質細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞及び角化細胞によって、ならびに活性化後に樹状細胞で発現する（Ａｌｐｄｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。当初、それは前駆Ｂリンパ球のための成長及び分化因子として記載されたが、後の研究は、Ｔリンパ球の発達及び分化にＩＬ－７が決定的に関与していることを示した。インターロイキン－７シグナル伝達は、最適なＣＤ８Ｔ細胞機能、恒常性及びメモリーの確立に必須であり（Ｓｃｈｌｕｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）、それはほとんどのＴ細胞サブセットに必要とされ、その発現はＴ細胞数の調節のために重要であることが提唱された。
ＩＬ－７は、ＩＬ－７Ｒα及びγｃを含む二量体型受容体に結合して、細胞外マトリックス再構成、Ｔ及びＢ細胞の発達及び恒常性において基礎的役割を果たす三元複合体を形成する（Ｍａｚｚｕｃｃｈｅｌｌｉ ａｎｄ Ｄｕｒｕｍ，２００７）。ＩＬ－７Ｒαも交差反応して胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）及びその受容体（ＴＳＬＰＲ）との三元複合体を形成し、ＴＳＬＰ経路を活性化させてヒトにおけるＴ及び樹状細胞増殖、ならびにさらにはマウスにおけるＢ細胞発達をもたらす（Ｌｅｏｎａｒｄ，２００２）。それゆえ、複合体によって活性化されたシグナル伝達カスケードの緊密な制御は正常な細胞機能にとって極めて重要である。ＩＬ－７Ｒα外部ドメインにおける変異によって引き起こされたＩＬ－７経路の刺激減弱は、Ｔ及びＢ細胞発達を阻害し、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）の一形態を有する患者をもたらす（Ｇｉｌｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｐｕｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
ＩＬ－７は、細胞毒性化学療法の後のがん患者における免疫再構成の強化における潜在的役割を有している。ＩＬ－７療法は免疫再構成を強化し、少数の最近の胸腺移出細胞についてさえも末梢での増殖を容易にすることによって、限られた胸腺機能さえも増強することができる。それゆえ、ＩＬ－７療法は、細胞毒性化学療法によって枯渇した患者の免疫系を修復できる可能性がある（Ｃａｐｉｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）は、２つの別個にコードされるサブユニット（ｐ３５及びｐ４０）のジスルフィド連結ヘテロ二量体であるが、これらのサブユニットは、共有結合で連結されていわゆる生物活性ヘテロ二量体型（ｐ７０）分子を発生させるものである（Ｌｉｅｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｊａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ヘテロ二量体（ＩＬ－１２及びＩＬ－２３）を形成する以外にも、ｐ４０サブユニットは単量体（ｐ４０）及びホモ二量体（ｐ４０２）としても分泌される。ｐ３５をｐ４０サブユニットに繋げるリンカーによるヘテロ二量体の一本鎖としての合成がヘテロ二量体の完全な生物活性を保存することは、当技術分野で知られている。ＩＬ－１２は、感染に対する初期炎症応答、及び細胞媒介免疫性に有利に働くものであるＴｈ１細胞の生成において決定的な役割を果たす。ＩＬ－１２の過剰産生は、複数の自己免疫炎症性疾患（例えば、ＭＳ、関節炎、１型糖尿病）の発病に関与するので宿主に対して危険であり得ることが見出された。
ＩＬ－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）は、活性化Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞の表面に発現したＩＬ－１２Ｒβ１及びＩＬ－１２Ｒβ２鎖からなるヘテロ二量体型複合体である（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＩＬ－１２Ｒβ１鎖がＩＬ－１２ｐ４０サブユニットに結合する一方、ＩＬ－１２Ｒβ２と会合したＩＬ－１２ｐ３５は細胞内シグナル伝達能力を付与する（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＩＬ－１２Ｒによるシグナル伝達は、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４及びＳＴＡＴ５をリン酸化して活性化させるものである、ヤヌスキナーゼ（Ｊａｋ２）及びチロシンキナーゼ（Ｔｙｋ２）のリン酸化を誘発する。ＩＬ－１２の特異的な細胞作用は主に、ＳＴＡＴ４の活性化によるものである。ＩＬ－１２は、ナチュラルキラー及びＴ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ１表現型への分化を含めたＩＬ－１２の炎症促進作用の多くを媒介するものであるサイトカイン、特にインターフェロン（ＩＦＮ）γを産生することを誘発する（Ｍｏｎｔｅｐａｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
制御性Ｔ細胞は、免疫系の活性化を能動的に抑制し、病理学的自己反応性及びその結果としての自己免疫疾患を予防する。自己免疫疾患の治療のための、制御性Ｔ細胞を選択的に活性化させる薬物及び方法を開発することは盛んな研究の対象であり、活性インターロイキンを炎症部位に選択的に送達できるものである本発明が開発されるまでは概して不成功であった。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、他の免疫細胞の活性を抑制するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の部類である。Ｔｒｅｇは免疫系恒常性の中核となるものであり、自己抗原に対する抵抗性を維持する上で、及び外来抗原に対する免疫応答を調節する上で主要な役割を果たす。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含めた複数の自己免疫及び炎症性疾患はＴｒｅｇ細胞数またはＴｒｅｇ機能の欠乏を有することが示された。
結果的に、Ｔｒｅｇ細胞の数及び／または機能を増強する療法の開発に大きな関心が持たれている。自己免疫疾患のための研究されている１つの治療手法は、自家性の生体外増殖されたＴｒｅｇ細胞の移植である（Ｔａｎｇ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ，２００３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．，３：１－１５）。この手法は、疾患の動物モデルの治療、及びいくつかの初期段階ヒト治験において有望性を示したが、それは患者自身のＴ細胞による個別化治療を必要とし、侵襲性であり、技術的に複雑である。別の手法は、低用量インターロイキン－２（ＩＬ－２）による治療である。Ｔｒｅｇ細胞は特徴として、サブユニットＩＬ２Ｒα（ＣＤ２５）、ＩＬ２Ｒβ（ＣＤ１２２）及びＩＬ２Ｒγ（ＣＤ１３２）で構成されるものである高親和性ＩＬ－２受容体ＩＬ２Ｒαβγを高い恒常的レベルで発現させ、Ｔｒｅｇ細胞成長は、ＩＬ－２に依存することが示されている（Ｍａｌｅｋ，Ｔ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３３：１５３－６５）。
反対に、ＩＬ－２を使用して免疫賦活も成し遂げられており、組換えＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））は特定のがんを治療するために承認されている。高用量ＩＬ－２は、全生存率に対する長期的影響を伴って転移メラノーマ及び転移腎細胞癌腫の患者の治療のために使用される。
慢性ＧＶＨＤ患者（Ｋｏｒｅｔｈ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，３６５：２０５５－６６）及びＨＣＶ関連自己免疫性血管炎患者（Ｓａａｄｏｕｎ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，３６５：２０６７－７７）の低用量ＩＬ－２治療の治験は、Ｔｒｅｇレベルの上昇及び臨床有効性の兆候を実証した。他の複数の自己免疫及び炎症性疾患におけるＩＬ－２の有効性を調査する新たな治験が開始された。いわゆる低用量ＩＬ－２を使用することの理論的根拠は、Ｔｒｅｇ上に恒常的に発現する三量体型ＩＬ－２受容体の高いＩＬ－２親和性を採用する一方、高親和性受容体が発現しない他のＴ細胞を不活性状態のままにすることであった。アルデスロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）としてＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡによって市販されている）は、これらの試験に使用された組換え形態のＩＬ－２であるが、高い毒性と関連付いている。アルデスロイキンは高用量では転移メラノーマ及び転移腎臓癌の治療のために承認されているが、その副作用はとても重篤であるため、集中治療が利用可能である病院環境においてのみその使用が推奨されている（ウェブアドレス：ｗｗｗ．ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ．ｃｏｍ／ａｓｓｅｔｓ／ｐｄｆ／ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ．ｐｄｆ）。
自己免疫疾患におけるＩＬ－２の治験は、Ｔｒｅｇ細胞を標的とするためにＩＬ－２の低めの用量を採用するものであった、というのも、Ｔｒｅｇ細胞はそのＩＬ２Ｒアルファの発現ゆえに他の多くの免疫細胞種に比べてより低い濃度のＩＬ－２に応答するからである（Ｋｌａｔｚｍａｎｎ Ｄ，２０１５ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２８３－９４）。しかしながら、これらの低めの用量さえも安全性及び忍容性の問題を生じ、用いられた治療は、長期間か、断続的な５日間治療クールかのどちらかでの毎日の皮下注射を採用していた。したがって、Ｔｒｅｇ細胞数及び機能を増強し、ＩＬ－２よりも特異的にＴｒｅｇ細胞を標的とし、より安全かつより忍容可能であり、より低い頻度で投与される自己免疫疾患療法が必要とされている。
自己免疫疾患のＩＬ－２系療法の治療指数を向上させるために提案されている１つの手法は、Ｔｒｅｇ細胞に対して他の免疫細胞よりも選択的であるＩＬ－２の多様体を使用することである。ＩＬ－２受容体は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、好酸球及び単球を含めた多様な免疫細胞種の上に発現し、この広範な発現様式は、免疫系に対するその多面的な作用、及び高い全身毒性の原因になっている可能性がある。特に、活性化されたＴエフェクター細胞は肺上皮細胞と同様にＩＬ２Ｒαβγを発現させる。しかしながら、Ｔエフェクター細胞を活性化させることは、免疫応答を弱めるように調節し制御するという目標に真っ向から逆行し、肺上皮細胞を活性化させることは、ＩＬ－２の既知の用量制限的副作用、例えば肺浮腫を招く。実際、高用量ＩＬ－２免疫療法の主要な副作用は血管漏出症候群（ＶＬＳ）であるが、これは肺及び肝臓などの臓器における血管内流体蓄積を招き、この後に肺浮腫及び肝細胞損傷を伴う。ＶＬＳの治療はＩＬ－２の中止以外にはない。ＶＬＳを回避するために患者において低用量ＩＬ－２治療計画が試験されたことはあるが、最適未満の治療結果という代償を伴った。
文献によれば、ＶＬＳは、ＩＬ－２活性化ＮＫ細胞からの炎症促進性サイトカインの放出によって引き起こされると考えられている。しかしながら、肺浮腫が、低～中レベルの機能性αβγＩＬ－２Ｒを発現させるものである肺内皮細胞に対するＩＬ－２の直接的な結合に起因している、ということのいくつかの証拠がある。そして、ＣＤ２５欠損宿主マウスにおいて抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用してＣＤ２５に対する結合を阻止することで、またはＣＤ１２２特異的ＩＬ－２／抗ＩＬ－２ｍＡｂ（ＩＬ－２／ｍＡｂ）複合体を使用することで、ＩＬ－２と肺内皮細胞との相互作用に関連する肺浮腫が排除され、かくして、ＶＬＳが予防された。
ＩＬ－２以外のインターロイキンサイトカインによる治療はいっそう制限されてきた。ＩＬ－１５はＩＬ－２と類似した免疫細胞刺激作用を発揮するが、同じ阻害作用は有しておらず、このことからそれは有望な免疫治療薬候補とされる。転移悪性メラノーマまたは腎細胞癌の治療のための組換えヒトＩＬ－１５の治験は、免疫細胞分布、増殖及び活性化におけるかなりの変化を実証し、潜在的な抗腫瘍活性を示唆していた（Ｃｏｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＩＬ－１５は現在、様々な形態のがんを治療するために治験中である。しかしながら、ＩＬ－１５療法は望ましくない有害作用、例えば、増悪性の特定の白血病、移植片対宿主病、低血圧、血小板減少症及び肝損傷と関連付いていることが知られている。（Ｍｉｓｈｒａ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２０１２，２２（５）：６４５－５５、Ａｌｐｄｏｇａｎ Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００５，１０５（２）：８６６－７３、Ｃｏｎｌｏｎ ＫＣ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２０１５，３３（１）：７４－８２）。
ＩＬ－７は、胸腺におけるリンパ球発達を促進し、末梢におけるナイーブ及びメモリーＴ細胞恒常性の存続を維持する。さらには、それはリンパ節（ＬＮ）の器官形成のため及び二次リンパ器官（ＳＬＯ）内に動員される活性化Ｔ細胞の維持のために重要である（Ｇａｏ ｅｔ．ａｌ．，２０１５）。ＩＬ－７の治験では、ＩＬ－７を受けている患者は、ＦｏｘＰ３発現によって追跡評価される制御性Ｔ細胞数の有意な増加を伴わずにＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増加を示した（Ｓｐｏｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）。２００６年、２００８年及び２０１０年に報告された治験では、転移メラノーマまたは肉腫などの種々のがんの患者に異なる用量のＩＬ－７が皮下注射された。毒性は一過性の発熱及び軽度の紅斑以外にはほとんどみられなかった。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の循環レベルは有意に上昇し、Ｔｒｅｇの数は減少した。ＴＣＲレパートリーの多様性はＩＬ－７療法後に増大した。しかしながら、ＩＬ－７の抗腫瘍活性は十分に評価がなされなかった（Ｇａｏ ｅｔ．ａｌ．，２０１５）。結果は、ＩＬ－７療法が免疫応答を増強し拡大する可能性があることを示唆している。
ＩＬ－１２は多面的なサイトカインであり、その作用は自然免疫性と適応免疫性との間の相互連結を作り出す。ＩＬ－１２は、ＰＭＡ誘発性ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株から分泌される因子として最初に記載された。ＩＬ－１２は、その作用に基づいて細胞傷害性リンパ球成熟因子及びナチュラルキラー細胞刺激因子と名付けられている。ＩＬ－１２は、自然免疫性と適応免疫性との間の橋渡しをすること、及び天然の抗がん防御機序を調和させるサイトカインであるＩＦＮγの産生を強力に刺激することから、ヒトにおける腫瘍免疫療法のための理想的な候補であると見受けられた。しかしながら、臨床試験におけるＩＬ－１２の全身投与に関連した重篤な副作用、及びこのサイトカインの非常に幅狭い治療指数は、がん患者におけるこのサイトカインの使用に対する熱意を著しく冷めさせた（Ｌａｓｅｋ ｅｔ．ａｌ．，２０１４）。ＩＬ－１２療法に関する従来の問題のいくつかを軽減し得るものである、腫瘍をサイトカインの送達の標的としたＩＬ－１２療法の手法が、現在がんのために治験中である。
ＩＬ－２Ｒに結合して免疫応答を治療的に調節するアゴニストとしてのＩＬ－２の直接的使用は、文献によって十分に支持された治療的リスク、例えばその短い血清中半減期及び高い毒性ゆえに問題がある。これらのリスクは他のサイトカインの治療薬開発及び使用も制限してきた。これらのリスクを軽減する新しい形態のサイトカインが必要とされている。本明細書では、これらのリスクに対処して必要な免疫調節治療薬を提供するために考案された、ＩＬ－２及びＩＬ－１５、及び他のサイトカイン、サイトカインの機能性断片及びムテイン、サイトカインの多様体及びサブユニット、ならびに条件的活性サイトカインを含む、組成物及び方法を開示する。
本発明は、例えばサイトカイン阻止部分、例えば立体的阻止ポリペプチド、血清中半減期延長ポリペプチド、標的指向性ポリペプチド、連結ポリペプチド、例えばプロテアーゼ切断可能リンカー、及びその組合せを使用して、直接的なＩＬ－２療法及び他のサイトカインを使用する療法の欠点に対処するように設計される。インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１ ＩＬ－２３）、インターフェロン（ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ及びＩＦＮガンマを含めたＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦアルファ、リンホトキシン）、形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１）、及び顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳ）を含めて、サイトカインは、患者に投与されると非常に強力である。本明細書中で使用する場合、「ケモカイン」は、近傍の応答細胞において指向的な走化性を誘導する能力を有する小さいサイトカインのファミリーを意味する。サイトカインは、力強い療法を提供できるが、臨床的制御が難しくサイトカインの臨床使用を制限してきた望ましくない作用を伴う。本開示は、望ましくない作用を軽減または排除して患者に使用することができる新しい形態のサイトカインに関する。特に、本開示は、キメラポリペプチド（融合タンパク質）を含む医薬組成物、融合タンパク質をコードする核酸、及び対応するサイトカインに比べて低減されたサイトカイン受容体賦活作用を有するサイトカインまたはサイトカインの活性断片もしくはムテインを含有する上記の医薬製剤に関する。それにもかかわらず、選択された条件下または選択された生物学的環境では、キメラポリペプチドは、しばしば対応する天然に存在するサイトカインと同じまたはそれよりも高い力価で、その同族受容体を賦活する。本明細書に記載されるとおり、これは、通常の条件下ではサイトカイン、その活性断片またはムテインの受容体賦活機能の阻止または阻害を行うが、選択された条件、例えば所望のサイトカイン作用部位（例えば炎症部位または腫瘍）に存在する条件の下ではそれを行わない、サイトカイン阻止部分を使用して成し遂げられるのが典型的である。
キメラポリペプチド、及びキメラポリペプチドをコードする核酸は、任意の好適な方法を用いて作られ得る。例えば、キメラポリペプチドをコードする核酸は、組換えＤＮＡ技術、合成化学またはこれらの技術の組合せを用いて作られ得、好適な発現システム、例えばＣＨＯ細胞において発現され得る。キメラポリペプチドは同様に、例えば合成または半合成化学技術などを用いた好適な核酸の発現によって作られ得る。いくつかの実施形態では、阻止部分はソーターゼ媒介結合体化によってサイトカインポリペプチドに結合され得る。「ソーターゼ」は、標的タンパク質またはペプチドに埋め込まれているかまたはその末端に結合しているカルボキシル末端選別シグナルを認識及び切断することによってタンパク質を修飾するペプチド転移酵素である。ソーターゼＡは、標的タンパク質上のＬＰＸＴＧモチーフ（配列番号４４２）（Ｘは任意の標準的アミノ酸である）のＴｈｒ残基とＧｌｙ残基との間での切断を触媒するが、これは、酵素上の活性部位Ｃｙｓ残基にＴｈｒ残基が一時的に結合して酵素－チオアシル中間体を形成することを伴う。ペプチド転移を完了させペプチド－単量体結合体を作り出すためには、Ｎ末端求核基、典型的にはオリゴグリシンモチーフを有する生体分子が中間体を攻撃してソーターゼＡを置き換え、２つの分子を結び付ける。
サイトカイン阻止部分融合タンパク質を形成するには、まずサイトカインポリペプチドを、Ｎ末端においてポリグリシン配列で、あるいはＣ末端においてＬＰＸＴＧモチーフ（配列番号４４２）でタグ付けする。阻止部分または他の要素には、タグ付きポリペプチドのための受容体部位としての役割を果たすそれぞれのペプチドが結合している。結合されたＬＰＸＴＧモチーフ（配列番号４４２）受容体ペプチドを保有するドメインに対するそのＮ末端を介した結合体化のためには、ポリペプチドを一続きのＮ末端ポリグリシンでタグ付けすることになる。ポリグリシンペプチドを保有するドメインに対するそのＣ末端を介した結合体化のためには、ポリペプチドをそのＣ末端においてＬＰＸＴＧ（配列番号４４２）ソーターゼ認識配列でタグ付けすることになる。ソーターゼは、ポリグリシン及びＬＰＸＴＧ（配列番号４４２）配列を認識して、ポリマー－ペプチドとタグ付きポリペプチドとの間にペプチド結合を形成することになる。ソーターゼ反応は、中間体としてグリシン残基を切り捨て、また、室温で起こる。
阻止部分によってもたらされる阻害を除去または低減するために様々な機序が採用され得る。例えば、医薬組成物は、プロテアーゼ切断部位を含むプロテアーゼ切断可能リンカーがサイトカインとサイトカイン阻止部分との間またはサイトカイン阻止部分の中に位置する状態で、サイトカイン部分と、阻止部分、例えば立体的阻止部分とを含み得る。プロテアーゼ切断部位が切断されると、阻止部分はサイトカインから解離し得、その後、サイトカインがサイトカイン受容体を賦活し得る。サイトカイン部分は、該当するサイトカインの上にみられるエピトープに結合する抗体などの特異的阻止部分によっても阻止され得る。
任意の好適なリンカーが使用され得る。例えば、リンカーは、グリシン－グリシン、ソーターゼ認識モチーフ、またはソーターゼ認識モチーフ及びペプチド配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号４４３）または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ、（配列番号４４４）を含むものであり得、ここで、ｎは１、２、３、４または５である。典型的には、ソーターゼ認識モチーフはペプチド配列ＬＰＸＴＧ（配列番号４４２）を含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、サイトカインポリペプチドのＣ末端に結合している反応性リジン残基と、阻止物質または他のドメインのＮ末端に結合している反応性アスパラギン酸との間に共有結合リンケージがある。他の実施形態では、サイトカインポリペプチドのＮ末端に結合している反応性アスパラギン酸残基と、上記阻止物質または他のドメインのＣ末端に結合している反応性リジン残基との間に共有結合リンケージがある。
したがって、本明細書に詳しく記載されるとおり、使用されるサイトカイン阻止部分は立体的阻止物質であり得る。本明細書中で使用する場合、「立体的阻止物質」は、直接的に、またはリンカーなどの他の部分を介して間接的に例えばキメラポリペプチド（融合タンパク質）の形態でサイトカインポリペプチドに共有結合で結合していることもあるが別様であればサイトカインポリペプチドに共有結合で結合していない、ポリペプチドまたはポリペプチド部分を指す。立体的阻止物質は、サイトカインポリペプチドに非共有結合で、例えば静電的結合、疎水性結合、イオン結合または水素結合によって結合し得る。立体的阻止物質は典型的には、サイトカイン部分とのその近さ及び相対的大きさゆえにサイトカイン部分の活性を阻害または阻止する。サイトカイン部分の立体的阻害は、例えば立体的阻止物質及びサイトカインペプチドを含有する融合タンパク質を立体的阻止物質とサイトカインポリペプチドとの間の部位にて酵素的に切断することによって、サイトカイン部分を立体的阻止物質から空間的に分離することによって除去され得る。
本明細書にさらに詳しく記載されるとおり、阻止機能は、標的指向性ドメイン、血清中半減期延長要素及びプロテアーゼ切断可能連結ポリペプチドなどの付加的な機能性成分と組み合わされ得るかまたは医薬組成物におけるその存在によるものであり得る。例えば、血清中半減期延長ポリペプチドは、立体的阻止物質でもあり得る。
本発明の全体的展望の簡潔な開示を提示するために、サイトカインＩＬ－２を例示的なサイトカインとして用いて本発明の態様を詳しく記載する。しかしながら、本発明及び本開示はＩＬ－２に限定されない。本開示の方法、ポリペプチド及び核酸を含めて本開示が他のサイトカイン、断片、多様体、サイトカインサブユニット及びムテイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１ ＩＬ－２３、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、リンホトキシン、ＴＧＦ－ベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、及び上記のいずれかの機能性断片またはムテインの使用を十分に記載しておりそれを可能にしていることは、当業者には明らかであろう。本明細書に開示される融合タンパク質に使用するのに好ましいサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、上記のいずれかのムテイン、機能性多様体及び機能性断片またはサブユニットである。例えば、サイトカインＩＬ－１２サイトカインは、ｐ３５サブユニット、ｐ４０サブユニット、ヘテロ二量体であり得る。
様々な要素が、所望のＩＬ－２活性部位でのＩＬ－２の送達及び活性を確かなものにしてインターロイキンに対する全身曝露を、血清中半減期延長方策に優先的に関連付けられた阻止及び／または標的化方策によって厳しく制限する。この血清中半減期延長方策において、阻止された形態のインターロイキンは、延長された時間（好ましくは１～２週間以上）にわたって循環するが、活性化形態はインターロイキンの典型的な血清中半減期を有する。
血清中半減期延長形態と比較して、静脈内投与されたＩＬ－２の血清中半減期は、平均的大きさの成人において約１５Ｌである広い全身細胞外空間への分配ゆえに、たったの約１０分である。その後、ＩＬ－２は腎臓によって約２．５時間の半減期で代謝される（Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．”Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２４０（２００１））。他の測定によれば、ＩＬ－２は、静脈内投与では８５分、皮下投与では３．３時間という非常に短い血漿中半減期を有する（Ｋｉｒｃｈｎｅｒ，Ｇ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：５－１０）。本発明のいくつかの実施形態では、半減期延長要素はリンカーを介してインターロイキンに連結されるが、このリンカーは、作用部位で（例えば炎症特異的または腫瘍特異的なプロテアーゼによって）切断されて、インターロイキンの完全な作用を所望の部位で解除し、さらにはそれを非切断形態の半減期延長から分離させる。そのような実施形態では、完全活性及び遊離インターロイキンは非常に異なった薬物動態（ｐＫ）特性－数週間の代わりに数時間の半減期を有するであろう。加えて、活性サイトカインに対する曝露は所望のサイトカイン作用部位（例えば炎症部位または腫瘍）に限定され、活性サイトカインに対する全身曝露ならびに関連する毒性及び副作用が軽減される。
本発明において考えられる他のサイトカインは、ＩＬ－２と類似した薬理を有し（例えば、Ｂｌｏｏｄ ２０１１ １１７：４７８７－４７９５；ｄｏｉ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１０－１０－３１１４５６によって報告されたＩＬ－１５）、したがって、本発明の設計は、これらの薬剤を直接的に使用することの欠点に対処し、延長された半減期を有し得る及び／または所望の活性部位（例えば炎症または腫瘍の部位）に指向され得るキメラポリペプチドを提供する。
所望によりＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒ複合体に全体的に、または３つのＩＬ－２Ｒサブユニットのうちの１つに特異的に、野生型ＩＬ－２に対応する親和性とは異なる親和性で結合するように、例えば、ＴｒｅｇまたはＴｅｆｆを選択的に活性化させるように操作され得る。例えば、野生型ＩＬ－２と対比してＩＬ－２受容体の二量体ベータ／ガンマ形態に対するよりもＩＬ－２受容体の三量体形態に対する親和性の方が高いと言われているＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ６０５６８－１を有するヒトＩＬ－２のアミノ酸２１～１５３を含む成熟ＩＬ－２タンパク質）に関する以下の変異の組のうちの１つを含むアミノ酸配列を有し得る：（ａ）Ｋ６４Ｒ、Ｖ６９Ａ及びＱ７４Ｐ；（ｂ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ及びＴ１０１Ａ；（ｃ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ及びＩ１２８Ｔ；（ｄ）Ｎ３０Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ及びＦ１０３Ｓ；（ｅ）Ｋ４９Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ａ７３Ｖ及びＫ７６Ｅ；（ｆ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｔ１０１Ａ及びＴ１３３Ｎ；（ｇ）Ｎ３０Ｓ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ及びＩ１２８Ａ；（ｈ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ及びＳ９９Ｐ；（ｉ）Ｎ３０Ｓ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ及びＩ１２８Ｔ；（ｊ）Ｋ９Ｔ、Ｑ１１Ｒ、Ｋ３５Ｒ、Ｖ６９Ａ及びＱ７４Ｐ；（ｋ）Ａ１Ｔ、Ｍ４６Ｌ、Ｋ４９Ｒ、Ｅ６１Ｄ、Ｖ６９Ａ及びＨ７９Ｒ；（ｌ）Ｋ４８Ｅ、Ｅ６８Ｄ、Ｎ７１Ｔ、Ｎ９０Ｈ、Ｆ１０３Ｓ及びＩ１１４Ｖ；（ｍ）Ｓ４Ｐ、Ｔ１０Ａ、Ｑ１１Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ及びＴ１３３Ａ；（ｎ）Ｅ１５Ｋ、Ｎ３０Ｓ Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ及びＩ９２Ｔ；（ｏ）Ｎ３０Ｓ、Ｅ６８Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｓ７５Ｐ、Ｋ７６Ｒ及びＮ９０Ｈ；（ｐ）Ｎ３０Ｓ、Ｙ３１Ｃ、Ｔ３７Ａ、Ｖ６９Ａ、Ａ７３Ｖ、Ｑ７４Ｐ、Ｈ７９Ｒ及びＩ１２８Ｔ；（ｑ）Ｎ２６Ｄ、Ｎ２９Ｓ、Ｎ３０Ｓ、Ｋ５４Ｒ、Ｅ６７Ｇ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ及びＩ９２Ｔ；（ｒ）Ｋ８Ｒ、Ｑ１３Ｒ、Ｎ２６Ｄ、Ｎ３０Ｔ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ及びＩ９２Ｔ；ならびに（ｓ）Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ及びＩ８９Ｖ。この手法は、インターロイキン（例えばＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３）、インターフェロン（ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ及びＩＦＮガンマを含めたＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦアルファ、リンホトキシン）、形質転換成長因子（例えばＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３）及び顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳ）を含めた他のサイトカインのムテインを調製するためにも適用され得る。例えば、同族受容体に対する所望の結合親和性を有するムテインが調製され得る。
上に記したとおり、本明細書に開示される変異ＩＬ－２ポリペプチドのいずれかは、記載されている配列を含み得；それらもまた、記載されている配列及びそれ以外の配列番号１と同一の配列に限定され得る。さらには、本明細書に開示される変異ＩＬ－２ポリペプチドのいずれかは、配列番号１の位置１２５にあるシステイン残基の別の残基（例えばセリン）による置換を任意選択的に含み得、及び／または位置１にあるアラニン残基の欠失を任意選択的に含み得る。
ＩＬ－２系療法の治療指数を向上させるための別の手法は、分子の薬物動態を最適化してＴｒｅｇ細胞を最大限に活性化させることである。初期のＩＬ－２作用の研究は、試験管内でのヒトＴ細胞増殖のＩＬ－２刺激が最低でも５～６時間にわたる有効濃度のＩＬ－２への曝露を必要とすることを実証した（Ｃａｎｔｒｅｌｌ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：１３１２－１３１６）。ヒト患者に投与された場合、ＩＬ－２は、静脈内投与では８５分、及び皮下投与では３．３時間という非常に短い血漿中半減期を有する（Ｋｉｒｃｈｎｅｒ，Ｇ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：５－１０）。その短い半減期ゆえに、循環ＩＬ－２をＴ細胞増殖の刺激に必要とされるレベル以上に所要の持続時間にわたって維持することは、Ｔｒｅｇ細胞に対するＥＣ５０を著しく上回るピークＩＬ－２レベルをもたらす高用量を要するか、または頻回投与を必要とすることになる。これらの高いＩＬ－２ピークレベルは、ＩＬ２Ｒβγ受容体を活性化させ得、他の意図しないまたは有害な作用、例えば上記のようなＶＬＳを有し得る。ＩＬ－２よりも長い循環半減期を有し、ＦｃＲｎ受容体に対する結合を可能にする、ＩＬ－２類縁体、またはドメインにＩＬ－２が結合された多機能性タンパク質は、ＩＬ－２よりも低い用量及びより低いピークレベルで特定期間にわたって目標薬物濃度を実現することができる。したがって、そのようなＩＬ－２類縁体は、Ｔｒｅｇ細胞を効果的に刺激するためにＩＬ－２に比べてより低い用量またはより低い頻度の投与を必要とすることになる。ＩＬ－２薬のより低い頻度での皮下投与は、患者にとってより忍容可能なものにもなる。これらの特徴を有する治療薬は臨床的に、改善された薬理学的有効性、低減された毒性、及び療法に対する改善された患者コンプライアンスにつながるものである。あるいは、ＩＬ－２またはＩＬ－２のムテイン（本明細書中では「ＩＬ－２＊」）は、意図した作用部位（例えば炎症部位または腫瘍）に選択的に指向され得る。この標的指向は、切り捨てられるＩＬ－２（またはムテイン）の阻止物質を含む投与薬に対するドメインの付加を含めたいくつかの方策の１つによって、または標的指向性ドメインによって、または両者の組合せによって成し遂げられ得る。
いくつかの実施形態では、所望の標的に応じてより高いまたはより低い親和性を有するように適合させたＩＬ－２＊部分的アゴニストが作られ得、例えば、ＩＬ－２＊は、増強された親和性で受容体サブユニットの１つに結合するが他のものには結合しないように操作され得る。これらの類の部分的アゴニストは、完全なアゴニストまたは完全アンタゴニストとは違って、所望の機能的特性を引き出しながら望ましくない特性の閾値を満たさない大きさにシグナル伝達特性を調整する能力を提供する。部分的アゴニストの差次的活性を考慮すると、ＩＬ－２多様体のレパートリーを、ほぼ完全～部分的な作動作用から完全拮抗作用にまで及ぶいっそうきめ細かな度合いの独特なシグナル伝達活性を発揮するように操作することもあり得る。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２＊は、ＩＬ－２Ｒαに対する改変された親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２＊は、ＩＬ－２Ｒαに対する親和性が野生型ＩＬ－２よりも高い。他の実施形態では、ＩＬ－２＊は、ＩＬ－２Ｒβに対する親和性が変化している。一実施形態では、ＩＬ－２＊は、ＩＬ－２Ｒβ、例えばＩＬ－２ＲβのＮ末端に対する結合親和性が増強されており、これによってＩＬ－２Ｒαの機能要件は排除される。別の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性が増大しているがＩＬ－２Ｒγに対する低減された結合性を呈し、それによってＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体化及びシグナル伝達が正常に機能しない、ＩＬ－２＊が生成される。
阻止部分は、以下により詳しく記載されるが、１つ以上の受容体に対する結合またはその活性化に有利に働くようにも用いられ得る。一実施形態では、ＩＬ－２Ｒβγの結合または活性化が阻止されるがＩＬ－２Ｒαの結合または活性化に変化がないような、阻止部分を付加する。別の実施形態では、ＩＬ－２Ｒαの結合または活性化が弱められるような阻止部分を付加する。別の実施形態では、３つ全ての受容体に対する結合またはその活性化が阻害されるような阻止部分を付加する。この阻止は、特定環境における阻止部分の除去によって、例えば、１つ以上の阻止部分をサイトカインに連結しているリンカーのタンパク質分解的切断によって解除できるものであり得る。
類似する手法は、特に例えばがんの治療のための免疫刺激剤としての使用のために、他のサイトカインを改善するために適用され得る。例えば、この態様において、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１ ＩＬ－２３、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ及びＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、リンホトキシン、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３ ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ならびにＣＣＬ２１の薬物動態及び／または薬力学は、全身的でないことが好ましいが所望の作用部位、例えば腫瘍内にてエフェクター細胞（例えば、エフェクターＴ細胞、ＮＫ細胞）及び／または細胞傷害性免疫応答促進細胞を最大限に活性化させる（例えば樹状細胞成熟を誘導する）ために調整され得る。
かくして、少なくとも１つのサイトカインポリペプチド、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３）、インターフェロン（ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ及びＩＦＮガンマを含めたＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦアルファ、リンホトキシン）、形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３）、ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１）及び顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳ）、または上記のいずれかの機能性断片もしくはムテインを含む医薬組成物が本明細書に提供される。ポリペプチドは典型的には、少なくとも１つのリンカーアミノ酸配列も含み、当該アミノ酸配列は、ある実施形態では、内在性プロテアーゼによって切断されることができる。一実施形態では、リンカーは、ＨＳＳＫＬＱ（配列番号２５）、ＧＰＬＧＶＲＧ（配列番号４４５）、ＩＰＶＳＬＲＳＧ（配列番号４４６）、ＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号４４７）またはＳＧＥＳＰＡＹＹＴＡ（配列番号４４８）を含むアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、キメラポリペプチドは、インターロイキンポリペプチドの作用を阻止することができる阻止部分、例えば立体的阻止ポリペプチド部分をさらに含有する。阻止部分は、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメイン、または任意選択的に分岐型もしくは多武装型であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み得る。あるいは、医薬組成物は、第１サイトカインポリペプチドまたはその断片、及び阻止部分、例えば立体的阻止ポリペプチド部分を含み、阻止部分は、サイトカイン受容体に対するサイトカインポリペプチドの作用を阻止するものであり、阻止部分は、ある実施形態では、プロテアーゼ切断可能ドメインを含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン作用の阻止及び低減は、単に非常に短いリンカーを有する付加的ドメインをインターロイキンドメインのＮまたはＣ末端に結合させることによって成し遂げられる。そのような実施形態では、阻止部分の、または阻止物質をインターロイキンに繋ぎ止めている短いリンカーのプロテアーゼ消化によって阻止が解除されることが予期される。ひとたびドメインが断ち切られるかまたは遊離すると、それはもはやサイトカイン作用の阻止を成し遂げることができなくなる。
医薬組成物、例えばキメラポリペプチドは、同じサイトカインポリペプチドまたは異なるサイトカインポリペプチドであり得る２つ以上のサイトカインを含み得る。例えば、２つ以上の異なる種類のサイトカインが相補的な機能を有する。いくつかの例では、第１サイトカインはＩＬ－２であり、第２サイトカインはＩＬ－１２である。いくつかの実施形態では、２つ以上の異なる種類のサイトカインポリペプチドの各々は、他のサイトカインポリペプチドの作用を調節する作用を有する。２つのサイトカインポリペプチドを含有するキメラポリペプチドのいくつかの例では、第１サイトカインポリペプチドはＴ細胞賦活性であり、第２サイトカインポリペプチドはＴ細胞非賦活性である。２つのサイトカインポリペプチドを含有するキメラポリペプチドのいくつかの例では、第１サイトカインは化学誘引物質、例えばＣＸＣＬ１０であり、第２サイトカインは免疫細胞賦活物質である。
好ましくは、本明細書に開示される融合タンパク質中に含まれるサイトカインポリペプチド（機能性断片を含む）は、受容体結合親和性及び特異性または血清中半減期を含めた天然に存在するサイトカインの特性を変化させるように変異したかまたは操作されたものではない。しかしながら、例えばクローニングを容易にするため及び所望の発現レベルを実現するための、天然に存在するサイトカイン（野生型を含む）からのアミノ酸配列の変化は、許容可能である。
阻止部分
阻止部分は、サイトカインのその受容体に対する結合及び／または賦活能力を阻害する任意の部分であり得る。阻止部分は、サイトカインを立体的に阻止して、及び／またはそれに非共有結合で結合することによって、サイトカインのその受容体に対する結合及び／または賦活能力を阻害し得る。好適な阻止部分の例としては、サイトカインの同族受容体の完全長またはサイトカイン結合性断片またはムテインが挙げられる。サイトカインに結合する、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ型ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）、ｄＡｂなどを含めた抗体及びその断片も、使用され得る。サイトカインに結合する他の好適な抗原結合ドメインも使用され得、これには、抗体結合性及び／または構造を模倣した非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、ならびに他の操作された足場、例えばＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン及びＣＴＬＡ４足場に基づく結合ドメインが含まれる。好適な阻止ポリペプチドのさらなる例としては、サイトカインのその同族受容体に対する結合を立体的に阻害または阻止するポリペプチドが挙げられる。有益なことに、そのような部分は半減期延長要素としても機能し得る。例えば、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーとの結合体化によって改変されたペプチドは、サイトカインのその受容体に対する結合を立体的に阻害または妨害し得る。長い血清中半減期を有するポリペプチドまたはその断片、例えば、血清アルブミン（ヒト血清アルブミン）、免疫グロブリンＦｃ、トランスフェリンなど、ならびにそのようなポリペプチドの断片及びムテインを使用してもよい。例えば長い血清中半減期を有するＨＳＡ、免疫グロブリンもしくはトランスフェリンなどのタンパク質に結合する、または形質膜に再利用されるＦｃＲｎもしくはトランスフェリン受容体などの受容体に結合する、抗体及び抗原結合ドメインも、詳しくはそれらの抗原に結合しているときに、サイトカインを阻害し得る。そのような抗原結合性ポリペプチドの例としては、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ型ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）、ｄＡｂなどが挙げられる。サイトカインに結合する他の好適な抗原結合ドメインを使用してもよく、これには、抗体の結合性及び／または構造を模倣した非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、ならびに他の操作された足場、例えばＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン及びＣＴＬＡ４足場に基づく結合ドメインが含まれる。
説明のための例において、ＩＬ－２がキメラポリペプチド中のサイトカインである場合、阻止部分は、ＩＬ－２受容体のアルファ鎖（ＩＬ－２Ｒα）またはＩＬ－２受容体のベータ（ＩＬ－２Ｒβ）もしくはガンマ鎖（ＩＬ－２Ｒγ）の完全長または断片またはムテイン、抗ＩＬ－２単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）またはｓｃＦｖ、Ｆａｂ、抗ＣＤ２５抗体またはその断片、及び抗ＨＳＡ ｄＡｂまたはｓｃＦｖなどであり得る。本明細書にさらに記載されるとおり、抗体断片を使用してサイトカインポリペプチドの作用を弱化させる場合、融合タンパク質中の阻止部分は、一本鎖抗体結合性断片、例えばｓｃＦｖであり得る。阻止部分は２本鎖抗原結合性断片の半分であってもよく、例えば、第２ポリペプチド上の相補的なＶＬ－ＣＬと会合して、サイトカインポリペプチドに結合する抗体結合部位を形成する、ＶＨ－ＣＨ１であってもよい。
生体内半減期延長要素
好ましくは、キメラポリペプチドは生体内半減期延長要素を含む。天然に短い半減期を有する治療薬分子の生体内半減期を長くすることは、有効性を犠牲にすることなくより許容可能で管理可能な投薬計画を可能にする。本明細書中で使用する場合、「半減期延長要素」は、例えばその大きさ（腎濾過カットオフを上回るように）、形状、流体力学的径、電荷、または吸収、生体内分布、代謝及び排出のパラメータを変化させることによって生体内半減期を長くしｐＫを改善する、キメラポリペプチドの一部である。ポリペプチドのｐＫを改善するための例示的な方法は、リソソーム中で分解されるのではなく細胞の形質膜に再利用される受容体、例えば内皮細胞上のＦｃＲｎ受容体及びトランスフェリン受容体に結合するポリペプチド鎖中の要素の発現による方法である。３種類のタンパク質、例えば、ヒトＩｇＧ、ＨＳＡ（または断片）及びトランスフェリンは、リソソーム中で分解されるのではなく再利用される受容体に対するそれらの結合能力の関数であるそれらの大きさだけで予測されるよりもはるかに長くヒト血清中に存在し続ける。ＦｃＲｎ結合性を保持するこれらのタンパク質またはそれらの断片は慣例的に他のポリペプチドにその血清中半減期の延長のために連結される。一実施形態では、半減期延長要素はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメインである。ＨＳＡ（配列番号２）は、医薬組成物に直接的に結合していてもよいし、または短いリンカーを介して結合していてもよい。ＨＳＡの断片を使用してもよい。ＨＳＡ及びその断片は、阻止部分及び半減期延長要素の両方として機能し得る。ヒトＩｇＧ及びＦｃ断片も同様の機能を行い得る。
血清中半減期延長要素は、長い血清中半減期を伴ってタンパク質に結合する抗原結合性ポリペプチド、例えば、血清アルブミン、トランスフェリンなどであってもよい。そのようなポリペプチドの例としては、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体 一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ型ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）、ｄＡｂなどを含めた抗体及びその断片が挙げられる。他の好適な抗原結合ドメインとしては、抗体結合性及び／または構造を模倣した非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、ならびに他の操作された足場、例えばＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン及びＣＴＬＡ４足場に基づく結合ドメインが挙げられる。抗原結合性ポリペプチドのさらなる例としては、所望の受容体に対するリガンド、受容体のリガンド結合性部分、レクチン、及び１つ以上の標的抗原との結合または会合をするペプチドが挙げられる。
いくつかの好ましい血清中半減期延長要素は、相補性決定領域（ＣＤＲ）及び任意選択の非ＣＤＲループを含むポリペプチドである。有益なことに、そのような血清中半減期延長要素はサイトカインの血清中半減期を延ばし得、サイトカインの阻害剤として（例えば、立体的阻止、非共有結合的相互作用またはその組合せによって）及び／または標的指向性ドメインとしての機能もし得る。場合によっては、血清中半減期延長要素は、免疫グロブリン分子（Ｉｇ分子）に由来する、または抗体構造及び／または結合活性を模倣した操作されたタンパク質足場に由来するドメインである。Ｉｇは、任意のクラスまたはサブクラスのもの（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭなど）であり得る。Ｉｇ分子のポリペプチド鎖は折りたたまれて、ループによって連結された一連の平行ベータストランドとなる。可変領域では、ループのうちの３つは、分子の抗原結合特異性を決定する「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を構成する。ＩｇＧ分子は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖、またはその抗原結合性断片を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では略してＶＨ）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では略してＶＬ）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、配列が極めて可変性である及び／または抗原認識に関与する及び／または大抵において構造が定まったループを形成する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変性の領域にさらに細分され、この領域には、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼称される領域が散在している。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ酸末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序で整列している３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される；ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本開示のいくつかの実施形態では、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４のアミノ酸配列の少なくともいくらかまたは全ては、本明細書に記載の結合性部分の「非ＣＤＲループ」の一部である。免疫グロブリン分子の可変ドメインは、２枚のシートに整列されたいくつかのベータストランドを有する。免疫グロブリン重軽鎖の両方の可変ドメインは３つの超可変性ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。Ｖドメインの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）は、ベータバレルの片方の端部に密集している。ＣＤＲは、免疫グロブリンフォールドのベータストランドＢ－Ｃ、Ｃ’－Ｃ”、及びＦ－Ｇを連結するループであり、他方、免疫グロブリンフォールドのベータストランドＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”－Ｄ、及びＥ－Ｆを連結する下側ループ、ならびに免疫グロブリンフォールドのＤ－Ｅストランドを連結する上側ループは非ＣＤＲループである。本開示のいくつかの実施形態では、定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３の少なくともいくつかのアミノ酸残基は、本明細書に記載の結合性部分の「非ＣＤＲループ」の一部である。非ＣＤＲループは、いくつかの実施形態では、ＩｇまたはＩｇ様分子のＣ１組ドメインのＡＢ、ＣＤ、ＥＦ及びＤＥループ；ＩｇまたはＩｇ様分子のＣ２組ドメインのＡＢ、ＣＣ’、ＥＦ、ＦＧ、ＢＣ及びＥＣ’ループ；ＩｇまたはＩｇ様分子のＩ（中間）組ドメインのＤＥ、ＢＤ、ＧＦ、Ａ（Ａ１Ａ２）Ｂ及びＥＦループのうちの１つ以上を含む。
可変ドメイン中でＣＤＲは抗原認識及び結合を担っていると考えられている一方、ＦＲ残基はＣＤＲのための足場とみなされている。しかしながら、ある場合にはＦＲ残基のいくつかは抗原認識及び結合において重要な役割を果たす。Ａｇ結合性に影響を及ぼすフレームワーク領域残基は２つのカテゴリーに分けられる。１つ目は、抗原に接触するＦＲ残基であり、したがってこれは結合部位の一部であり、これらの残基のいくつかは配列がＣＤＲの近傍にある。他の残基は、配列がＣＤＲから離れているが分子の三次元構造、例えば重鎖のループにおいてはそのすぐ近くに存在しているものである。
結合性部分は任意の種類のポリペプチドである。例えば、ある場合には結合性部分は天然ペプチド、合成ペプチド、またはフィブロネクチン足場、または操作された巨大血清タンパク質である。巨大血清タンパク質は、例えば、アルブミン、フィブリノーゲンまたはグロブリンを含む。いくつかの実施形態では、結合性部分は、操作された足場である。操作された足場は、例えば、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、（Ｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ １２（７）：５６３－５７１の中で提案されているような）免疫グロブリン様足場、ＤＡＲＰｉｎ、シスチンノットペプチド、リポカリン、３ヘリックスバンドル足場、タンパク質Ｇ関連アルブミン結合性モジュール、またはＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマー足場を含む。
場合によっては、血清中半減期延長要素は巨大血清タンパク質に対する結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは巨大血清タンパク質に対する結合部位を提供する。巨大血清タンパク質は、いくつかの例では、グロブリン、アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＧ３、ＩｇＡ単量体、第ＸＩＩＩ因子、フィブリノーゲン、ＩｇＥまたは五量体型ＩｇＭである。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、免疫グロブリン軽鎖、例えばＩｇκ不含軽鎖またはＩｇλ不含軽鎖のための結合部位を形成する。
血清中半減期延長要素は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含むがこれらに限定されない任意の種類の結合ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、結合性部分は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ由来ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）である。他の実施形態では、結合性部分は非Ｉｇ結合ドメイン、すなわち抗体模倣体、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド及びモノボディである。
他の実施形態では、血清中半減期延長要素は、水溶性ポリマー、または水溶性ポリマーに結合体化されたペプチド、例えばＰＥＧであり得る。本明細書中で使用される「ＰＥＧ」、「ポリエチレングリコール」及び「ポリ（エチレングリコール）」は相互交換可能であり、任意の非ペプチド性水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含する。「ＰＥＧ」という用語はまた、大部分の、つまり５０％超の－ＯＣＨ２ＣＨ２－繰り返しサブユニットを含有するポリマーも意味する。特定の形態に関して、ＰＥＧは、任意の数の様々な分子量、ならびに構造または幾何学配置、例えば以下にさらに詳しく記載される「分岐型」、「直鎖型」、「フォーク型」、「多官能性」などを採り得る。ＰＥＧは、特定の構造に限定されず、直鎖型（例えば末端封止型、例えばアルコキシＰＥＧ、または二官能性ＰＥＧ）、分岐型または多武装型（例えば、フォーク型ＰＥＧ、またはポリオールコアに結合したＰＥＧ）、デンドリマー型（または星型）構造であり得、各々は、１つ以上の分解可能リンケージを有するまたは有しないものであり得る。さらには、ＰＥＧの内部構造は、任意の数の異なる繰り返しパターンで組織化され得、ホモポリマー、交互コポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー及びブロックトリポリマーからなる群から選択され得る。ＰＥＧは、ポリペプチド及びペプチドに任意の好適な方法によって結合体化され得る。典型的には、アミン、スルフヒドリル、カルボン酸またはヒドロキシル官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸、例えばシステイン、リジン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、トリオシン、セリン、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含むペプチドまたはポリペプチドに、反応性ＰＥＧ誘導体、例えばＮ－ヒドロキシスクシンアミジルエステルＰＥＧを反応させる。
標的指向性及び保持ドメイン
ある用途のためには、構築物が体内のその所望の場所に存在する時間の量を最大限にすることが望ましい場合がある。これは、１つのさらなるドメインをキメラポリペプチド（融合タンパク質）中に含ませて体内でのその移動に影響を与えることによって成し遂げられ得る。例えば、キメラ核酸は、ポリペプチドを体内の場所、例えば腫瘍細胞または炎症部位へ導くドメインをコードし得；このドメインは、「標的指向性ドメイン」と呼称され、及び／またはポリペプチドを体内の場所、例えば腫瘍細胞または炎症部位に留めるドメインをコードし；このドメインは「保持ドメイン」と呼称される。いくつかの実施形態では、ドメインは、標的指向性及び保持ドメインの両方として機能し得る。いくつかの実施形態では、標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインは、プロテアーゼに富む環境に対して特異的である。いくつかの実施形態では、コードされる標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対して特異的であり、例えば、ＣＣＲ４またはＣＤ３９受容体を標的とする。他の好適な標的指向性及び／または保持ドメインは、炎症組織に過剰発現する同族リガンド、例えばＩＬ－１受容体またはＩＬ－６受容体を有するものを含む。他の実施形態では、好適な標的指向性及び／または保持ドメインは、腫瘍組織に過剰発現する同族リガンド、例えば、Ｅｐｃａｍ、ＣＥＡまたはメソテリンを有するものを含む。いくつかの実施形態では、標的指向性ドメインは、（例えば炎症またはがん特異的プロテアーゼによって）作用部位で切断されてインターロイキンの完全な作用を所望の部位で解除するリンカーを介して、インターロイキンに連結される。いくつかの実施形態では、標的指向性及び／または保持ドメインは、（例えば炎症またはがん特異的プロテアーゼによって）作用部位で切断されずに所望の部位にサイトカインを留まらせるリンカーを介して、インターロイキンに連結される。
場合によっては、最適な抗原が疾患細胞または組織、例えば腫瘍またはがん細胞の表面に発現する。腫瘍に指向及び保持することのために役立つ抗原としては、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ＦＯＬＲ１及びＣＥＡが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示される医薬組成物には、疾患細胞または組織に発現することが知られている２つの異なる標的抗原に結合する２つの標的指向性及び／または保持ドメインを含むタンパク質も含まれる。例示的な抗原結合ドメインの対としては、ＥＧＦＲ／ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ／ＣＥＡ、及びＨＥＲ－２／ＨＥＲ－３が挙げられるが、これらに限定されない。
好適な標的指向性及び／または保持ドメインとしては、抗原結合ドメイン、例えば、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体 一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ型ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）、ｄＡｂなどを含めた抗体及びその断片が挙げられる。他の好適な抗原結合ドメインとしては、抗体結合性及び／または構造を模倣した非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、ならびに他の操作された足場、例えばＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン及びＣＴＬＡ４足場に基づく結合ドメインが挙げられる。抗原結合性ポリペプチドのさらなる例としては、所望の受容体に対するリガンド、受容体のリガンド結合性部分、レクチン、及び１つ以上の標的抗原との結合または会合をするペプチドが挙げられる。
いくつかの実施形態では、標的指向性及び／または保持ドメインは細胞表面分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性及び／または保持ドメインは腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰａ）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質２（Ｔｒｏｐ２）、フィブロネクチンＥＤＢ（ＥＤＢ－ＦＮ）、フィブロネクチンＥＩＩＩＢドメイン、ＣＧＳ－２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ及びＦＯＬＲ１のうちの少なくとも１つから選択される腫瘍抗原に特異的にかつ独立して結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、２つの異なる抗原に特異的にかつ独立して結合し、抗原の少なくとも一方は、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ及びＦＯＬＲ１から選択される腫瘍抗原である。
標的指向性及び／または保持抗原は、腫瘍細胞に発現する腫瘍抗原であり得る。腫瘍抗原は当技術分野でよく知られており、例えば、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ＦＯＬＲ１、ＰＳＭＡ、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、及びＣＥＡ、５Ｔ４、ＡＦＰ、Ｂ７－Ｈ３、カドヘリン－６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０５、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３５２、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＤＬＬ３、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＧＰＣ３、ｇｐＡ３３、ＦＬＴ－３、ｇｐＮＭＢ、ＨＰＶ－１６ Ｅ６、ＨＰＶ－１６ Ｅ７、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＳＬＣ３９Ａ６、ＭＡＧＥ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｐ－カドヘリン、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＬＲ、ＰＳＣＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＴＲＫ５、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＩＭ１、Ｔｒｏｐ２、ＷＴ１が挙げられる。
標的指向性及び／または保持抗原は、免疫チェックポイントタンパク質であり得る。免疫チェックポイントタンパク質の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ－１、ＯＸ４０、ＤＮＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ４８、ＣＤ７０、Ａ２ＡＲ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３またはＶＩＳＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。
標的指向性及び／または保持抗原は、細胞表面分子、例えば、タンパク質、脂質または多糖であり得る。いくつかの実施形態では、標的指向性及び／または保持抗原は、腫瘍細胞上、ウイルス感染細胞上、細菌感染細胞上、損傷赤血球上、動脈プラーク細胞上、炎症または線維性組織細胞上にある。標的指向性及び／または保持抗原は免疫応答調節物質を含み得る。免疫応答調節物質の例としては、顆粒球－マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３またはＧＩＴＲが挙げられるが、これらに限定されない。
標的指向性及び／または保持抗原は、サイトカイン受容体であり得る。サイトカイン受容体の例としては、Ｉ型サイトカイン受容体、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ受容体、Ｇ－ＣＳＦ受容体、Ｉ型ＩＬ受容体、Ｅｐｏ受容体、ＬＩＦ受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＴＰＯ受容体；ＩＩ型サイトカイン受容体、例えば、ＩＦＮ－アルファ受容体（ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２）、ＩＦＢ－ベータ受容体、ＩＦＮ－ガンマ受容体（ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２）、ＩＩ型ＩＬ受容体；ケモカイン受容体、例えば、ＣＣケモカイン受容体、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体、ＸＣケモカイン受容体；腫瘍壊死受容体スーパーファミリー受容体、例えば、ＴＮＦＲＳＦ５／ＣＤ４０、ＴＮＦＲＳＦ８／ＣＤ３０、ＴＮＦＲＳＦ７／ＣＤ２７、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＴＮＦＲ１／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ／ＴＮＦＲ２／ＣＤ１２０ｂ；ＴＧＦ－ベータ受容体、例えばＴＧＦ－ベータ受容体１、ＴＧＦ－ベータ受容体２；Ｉｇスーパーファミリー受容体、例えばＩＬ－１受容体、ＣＳＦ－１Ｒ、ＰＤＧＦＲ（ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ＳＣＦＲが挙げられるが、これらに限定されない。
リンカー
上に記されるとおり、医薬組成物は１つ以上のリンカー配列を含む。リンカー配列は、例えば阻止部分がサイトカインポリペプチドの作用を阻止できるような柔軟性をポリペプチド間に与えるのに役立つ。リンカー配列は、サイトカインポリペプチド、血清中半減期延長要素及び／または阻止部分のいずれかまたは全ての間に位置し得る。本明細書に記載されるとおり、リンカーの少なくとも１つはプロテアーゼ切断可能であり、（１つ以上の）所望のプロテアーゼのための（１つ以上の）切断部位を含有する。好ましくは、所望のプロテアーゼは所望のサイトカイン作用部位（例えば腫瘍微小環境）に豊富に存在するかまたは選択的に発現する。かくして、融合タンパク質は所望のサイトカイン作用部位において優先的または選択的に切断される。
好適なリンカーは長さが様々であり得、例えば、１アミノ酸（例えばＧｌｙ）～２０アミノ酸、２アミノ酸～１５アミノ酸、３アミノ酸～１２アミノ酸、例えば、４アミノ酸～１０アミノ酸、アミノ酸～９アミノ酸、６アミノ酸～８アミノ酸、または７アミノ酸～８アミノ酸であり得、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０アミノ酸であり得る。
医薬組成物の成分の配向は概して構造選択の問題であり、複数の配向が可能であること及び全てが本開示に包含されることを意図していることは認識される。例えば、阻止部分はサイトカインポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に位置し得る。
疾患細胞または組織に関連いていることが知られているプロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、カテプシン、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カリクレイン、ｈＫ１、ｈＫ１０、ｈＫ１５、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメリシン、第Ｘａ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ－３、Ｍｉｒｌ－ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ－１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１４、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン－１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ－ａ）、ジペプチジルペプチダーゼ、メプリン、グランザイム、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に提供されるキメラ核酸配列にコードされるアミノ酸配列を切断することができるプロテアーゼは、例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ディスインテグリン及びメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ）、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、腫瘍細胞表面プロテアーゼ及びエラスターゼからなる群から選択され得る。ＭＭＰは、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）またはマトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ９）であり得る。
本明細書に開示される方法に有用となるプロテアーゼを表１に示し、例示的なプロテアーゼ及びそれらの切断部位を表１ａに示す：
Figure 2023503258000002
Figure 2023503258000003
Figure 2023503258000004
Figure 2023503258000005
Figure 2023503258000006
Figure 2023503258000007
本明細書では、ポリペプチド配列を含む医薬組成物が提供される。断片を含めたあらゆるペプチド、ポリペプチド及びタンパク質に関して、キメラポリペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸配列多様体）において、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の性質または機能を変化させないさらなる改変が起こり得ることは理解される。そのような改変としては、保存的アミノ酸置換が挙げられ、以下にさらに詳しく記述される。
本明細書に提供される組成物は所望の機能を有する。組成物は、少なくともサイトカインポリペプチド、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＦＮａもしくはＩＦＮγ、またはケモカイン、例えばＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、阻止部分、例えば立体的阻止ポリペプチド、及び任意選択の血清中半減期延長要素、及び任意選択の標的指向性ポリペプチドで構成され、組成物中の各ポリペプチドを１つ以上のリンカーが連結している。第１ポリペプチド、例えばＩＬ－２ムテインは、活性薬剤とするために提供される。阻止部分は、インターロイキンの作用を阻止するために提供される。リンカーポリペプチド、例えばプロテアーゼ切断可能ポリペプチドは、活性薬剤の意図した標的に特異的に発現するプロテアーゼによって切断されるために提供される。任意選択的に、阻止部分はインターロイキンポリペプチドに結合することによって第１ポリペプチドの作用を阻止する。いくつかの実施形態では、阻止部分、例えば立体的阻止ペプチドは、（例えば炎症特異的または腫瘍特異的プロテアーゼによって）作用部位で切断されてサイトカインの完全な作用を所望の部位で解除するプロテアーゼ切断可能リンカーを介してインターロイキンに連結される。
プロテアーゼ切断部位は、天然に存在するプロテアーゼ切断部位、または人工的に操作されたプロテアーゼ切断部位であり得る。人工的に操作されたプロテアーゼ切断部位は、切断が起こることになる所望の環境、例えば腫瘍に特異的な１つよりも多いプロテアーゼによって切断され得る。プロテアーゼ切断部位は、少なくとも１つのプロテアーゼ、少なくとも２つのプロテアーゼ、少なくとも３つのプロテアーゼまたは少なくとも４つのプロテアーゼによる切断が可能なものであり得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン－グリシン、ソーターゼ認識モチーフ、またはソーターゼ認識モチーフとペプチド配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号４４３）もしくは（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（配列番号４４４）を含み、ここで、ｎは１、２、３、４または５である。一実施形態では、ソーターゼ認識モチーフは、ペプチド配列ＬＰＸＴＧ（配列番号４４２）を含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。一実施形態では、サイトカインポリペプチドのＣ末端に結合している反応性リジン残基と、阻止部分または他の部分のＮ末端に結合している反応性アスパラギン酸との間に共有結合リンケージがある。一実施形態では、共有結合リンケージは、サイトカインポリペプチドのＮ末端に結合している反応性アスパラギン酸残基と、阻止部分または他の部分のＣ末端に結合している反応性リジン残基との間にある。
切断及び誘導可能性
本明細書に記載されるとおり、融合タンパク質の文脈でのサイトカインポリペプチドの作用は弱化しており、所望の作用部位、例えば腫瘍微小環境でのプロテアーゼ切断は、サイトカイン受容体アゴニストとして融合タンパク質よりもはるかに活性であるサイトカインの一形態を融合タンパク質から遊離させる。例えば、融合ポリペプチドのサイトカイン受容体賦活（アゴニスト）作用は、別個の分子的実体としてのサイトカインポリペプチドのサイトカイン受容体賦活作用に比べて約１０分の１以下、約５０分の１以下、約１００分の１以下、約２５０分の１以下、約５００分の１以下または約１０００分の１以下であり得る。融合タンパク質の一部であるサイトカインポリペプチドは、それが、サイトカインポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸を含有しており、付加的なアミノ酸を実質的に含んでおらず、他の分子と（共有結合または非共有結合によって）会合していない場合には、別個の分子的実体として存在する。必要に応じて、別個の分子的実体としてのサイトカインポリペプチドは、いくつかの付加的アミノ酸配列、例えば、発現及び／または精製に役立つタグまたは短い配列を含み得る。
他の例では、融合ポリペプチドのサイトカイン受容体賦活（アゴニスト）作用は、融合タンパク質中のプロテアーゼ切断可能リンカーの切断によって生成するサイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体賦活作用に比べて約１０分の１以下、約５０分の１以下、約１００分の１以下、約２５０分の１以下、約５００分の１以下または約１０００分の１以下である。換言すれば、融合タンパク質中のプロテアーゼ切断可能リンカーの切断によって生成するサイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体賦活（アゴニスト）作用は、融合タンパク質のサイトカイン受容体賦活作用よりも少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍または少なくとも約１０００倍大きい。
ポリペプチド多様体及びアミノ酸置換
本明細書に記載のポリペプチドは、対応する天然に存在するタンパク質（例えばＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＨＳＡ）と同じアミノ酸配列を有するかまたは所望の機能が維持される限り天然に存在するタンパク質とは異なるアミノ酸配列を有し得る成分（例えば、サイトカイン、阻止部分）を含み得る。本開示のタンパク質及びそれをコードする核酸の、任意の既知の改変及び誘導体または発生する可能性があるものを規定する１つの方法が、特定の既知の基準配列との同一性に関して配列多様体を規定することによるものであることは、理解される。具体的には、本明細書に提供されるキメラポリペプチドとの少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの同一性を有するポリペプチド及び核酸を開示する。例えば、本明細書に記載の核酸またはポリペプチドのいずれかの配列との少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの同一性を有するポリペプチドまたは核酸が提供される。当業者であれば、２つのポリペプチドまたは２つの核酸の同一性を判定する方法が容易に分かる。例えば、同一性は、２つの配列を同一性がその最高レベルとなるように整列させた後に算出され得る。
同一性を算出する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって実施され得る。比較のための配列の最適なアライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所同一性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の同一性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．の中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって行われ得る。
核酸についての同じ類の同一性は、例えばＺｕｋｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８－５２（１９８９）、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６－７７１０（１９８９）、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１－３０６（１９８９）に開示されているアルゴリズムによって得ることができ、参照によりこれらを、少なくとも核酸アライメントに関する資料について本明細書に援用する。方法のいずれかは典型的に用いられ得るものであり、場合によってこれらの様々な方法の結果が異なることがあるが、これらの方法の少なくとも１つで同一性が見出されるならば配列は指定の同一性を有しており本明細書に開示されていると言えるであろうことを当業者が理解することは、理解される。
タンパク質改変にはアミノ酸配列改変が含まれる。アミノ酸配列における改変は、（例えば遺伝学的多型に起因する）アレル変異として天然に起こることもあり、環境影響に起因して（例えば紫外線曝露によって）起こることもあり、または誘導された点、欠失、挿入及び置換変異などの人間の介入によって（例えばクローンＤＮＡ配列の変異誘発によって）生成することもある。これらの改変は、アミノ酸配列の変化をもたらし得、サイレント変異をもたらし得、制限部位を変化させ得、または他の特異的な変異をもたらし得る。アミノ酸配列改変は、典型的には、３つのクラス：置換、挿入または欠失改変のうちの１つ以上に該当する。挿入は、アミノ及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は、アミノまたはカルボキシル末端融合の場合よりも小さな、例えば１～４残基程度の挿入とするのが通常であろう。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去を特徴とする。典型的には、タンパク質分子中の任意の１つの部位において約２～６残基以下を欠失させる。アミノ酸置換は単一残基の置換であることが典型的であるが、一度に複数の異なる場所において起こることがあり；挿入は約１～１０アミノ酸残基程度とするのが通常であろうし；欠失は約１～３０残基の範囲であろう。欠失または挿入は好ましくは隣接対でなされ、つまり、２残基の欠失または２残基の挿入とする。最終構築物を得るために置換、欠失、挿入またはその任意の組合せが組み合わされ得る。突然変異は配列をリーディングフレームの外側に配置するものであってはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を生む可能性がある相補的な領域を作り出さないものとする。置換改変は、少なくとも１つの残基が除去されてその場所に異なる残基が挿入されるものである。そのような置換は一般に、以下の表２に従ってなされ、保存的置換と呼称される。
Figure 2023503258000008
改変は、具体的に挙げたアミノ酸置換を含めて、既知の方法によってなされる。例えば、改変は、ポリペプチドをコードするＤＮＡの中のヌクレオチドを部位特異的に変異誘発してそれによって改変をコードするＤＮＡを生成し、その後に組換え細胞培養においてＤＮＡを発現させることによってなされる。既知の配列を有するＤＮＡの中の所定の部位において置換変異を行う技術はよく知られており、例えばＭ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発がある。
改変は、結合性を最適化するように選択され得る。例えば、親和性成熟技術を用いて、相補性決定領域（ＣＤＲ）内にランダム変異を導入することによってｓｃＦｖの結合性を変化させることができる。そのようなランダム変異は、放射線、化学的変異原またはエラープローンＰＣＲを含めた様々な技術を用いて導入され得る。複数回の変異及び選択が、例えばファージディスプレイを用いて実施され得る。
本開示はまた、本明細書に記載のキメラポリペプチドをコードする核酸、ならびにキメラポリペプチドを製造するため及び治療目的のためのそのような核酸の使用にも関する。例えば、本発明は、キメラポリペプチドをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、自己複製性ＲＮＡ）、ならびにそのようなＤＮＡ及びＲＮＡ分子の治療的使用を含む。
例示的な組成物
本発明の例示的な融合タンパク質は、上記の要素を様々な配向で組み合わせる。この節で記載される配向は、例として意図したものであり、限定するものとみなされるべきでない。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、サイトカイン、阻止部分及び半減期延長要素を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは半減期延長要素と阻止部分との間に配置される。いくつかの実施形態では、サイトカインは阻止部分及び半減期延長要素のＮ末端側にある。いくつかのそのような実施形態では、サイトカインは阻止部分の近くにあり；いくつかのそのような実施形態では、サイトカインは半減期延長要素の近くにある。サイトカインが切断によって活性となり得るように、どの実施形態においても少なくとも１つのプロテアーゼ切断可能リンカーが含まれていなければならない。いくつかの実施形態では、サイトカインは阻止部分及び半減期延長要素のＣ末端側にある。付加的な要素が切断可能リンカー、非切断可能リンカーまたは直接的な融合によって結合していてもよい。
いくつかの実施形態では、使用される阻止ドメインは半減期を延ばすことができ、サイトカインは２つのそのような阻止ドメインの間に配置される。いくつかの実施形態では、サイトカインは２つの阻止ドメインの間に配置され、そのうちの１つは半減期を延ばすことができる。
いくつかの実施形態では、２つのサイトカインが同じ構築物の中に含まれている。いくつかの実施形態では、サイトカインは２つの阻止ドメインに各々連結され（１分子に合計３つ）、１つの阻止ドメインが２つのサイトカインドメインの間にある。いくつかの実施形態では、薬物動態特性を最適化するために１つ以上の付加的半減期延長ドメインを含ませることがある。場合によっては、二量体化を容易にするために同じサイトカインを２つ含むことが有益である。二量体として働くサイトカインの一例はＩＦＮである。
いくつかの実施形態では、同じ構築物の中に３つのサイトカインを含ませる。いくつかの実施形態では、第３サイトカインはその他２つを、２つのサイトカインの間の阻止ドメインの代わりに阻止するように機能し得る。
融合タンパク質に使用するのに好ましい半減期延長要素は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、血清アルブミンに結合する抗体もしくは抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ）、ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ、または上記のいずれかの断片である。いくつかの好ましい実施形態では、阻止部分は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、または血清アルブミンに結合する抗体もしくは抗体断片、サイトカインに結合してサイトカイン受容体の結合活性化もしくは賦活を妨げる抗体、別のサイトカイン、または上記のいずれかの断片である。付加的な標的指向性ドメインを含む好ましい実施形態では、標的指向性ドメインは、がん細胞の表面に豊富に存在する細胞表面タンパク質、例えばＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１及びフィブロネクチンに結合する抗体である。
実施形態において、融合タンパク質はＩＬ－２ポリペプチドを含有し得る。ＩＬ－２ポリペプチドを含有する融合タンパク質は、配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８及び６３６～６４６のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８及び６３６～６４６として開示される融合タンパク質は、本明細書においてＡＣＰ２８９～ＡＣＰ２９２、ＡＣＰ２９６～ＡＣＰ３０２、ＷＷ０３０１、ＡＣＰ３０４～ＡＣＰ３０６、ＡＣＰ３０９～ＡＣＰ３１３、ＷＷ０３５３、ＡＣＰ４１４、ＡＣＰ３３６～ＡＣＰ３９８、ＷＷ０４７２～ＷＷ０４７７、ＡＣＰ４０６～ＡＣＰ４２６、ＡＣＰ４３９～ＡＣＰ４４７、ＡＣＰ４５１～ＡＣＰ４７１、ＷＷ０７２９、ＷＷ０７３４～ＷＷ０７９２、ＡＣＰ１０１、ＡＣＰ２９３～ＡＣＰ２９５、ＡＣＰ３１６～ＡＣＰ３３５、ＡＣＰ４２７～ＡＣＰ４３８及びＡＣＰ４４８～ＡＣＰ４５０とも呼称される。例えば、融合タンパク質は配列番号２７２のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号２８６のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号３６２のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号３３６のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号３４８のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号３６３のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号５８０のアミノ酸配列を含み得る。
実施形態では、融合タンパク質はＩＬ－１２ポリペプチドを含有し得る。ＩＬ－１２ポリペプチドを含有する融合タンパク質は、配列番号３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９または５２３～５３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。配列番号３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９または５２３～５３８として開示される融合タンパク質は、本明細書においてＡＣＰ２４０～ＡＣＰ２４５、ＡＣＰ２４７、ＡＣＰ２８５～ＡＣＰ２８８、ＷＷ０６４１、ＷＷ０６４９～ＷＷ０６５２、ＷＷ０６６２～ＷＷ０７２５、ＷＷ０７６５～ＷＷ０７７２及びＷＷ０７９６～ＷＷ０８０３と呼称される。例えば、融合タンパク質は配列番号４５９のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号４６６のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号４８４のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号５０６のアミノ酸配列を含み得る。
実施形態では、融合タンパク質はＩＦＮ（例えば、ＩＦＮガンマ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ）ポリペプチドを含有する。いくつかの例では、ＩＦＮポリペプチドはＩＦＮアルファまたはＩＦＮベータである。ＩＦＮポリペプチドを含有する融合タンパク質は、配列番号４２１～４３０及び５３９～５７８のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。配列番号４２１～４３０及び５３９～５７８として開示される融合タンパク質は、本明細書においてＡＣＰ２００～ＡＣＰ２０９、ＷＷ０６４４～ＷＷ０６４８、ＷＷ０７８１～ＷＷ０７８６、ＷＷ０８１５～ＷＷ０８２２、ＷＷ０８３１～ＷＷ０８３４、ＷＷ０７３７～ＷＷ０７４８及びＷＷ０７８７～ＷＷ０７９０と呼称され得る。例えば、融合タンパク質は配列番号４２１のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号４２８のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号５４１のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号５５８のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は配列番号５７７のアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの態様において、本明細書に開示される融合ポリペプチドは、第２ポリペプチド鎖に共有結合または非共有結合で結合され得る。例えば、融合ポリペプチドが二量体化する（つまり、二量体を形成する）こともあり、または融合ポリペプチドの一部が別のポリペプチドと会合してもよく、その結果、例えば、サイトカインポリペプチドまたは血清アルブミンに対する機能性結合部位が形成され得る。ある実施形態では、第２ポリペプチド鎖と融合ポリペプチド上の阻止部分とが相補的であり、一緒になって、融合ポリペプチド中に含有されるサイトカインポリペプチドに対する特異性を有する機能性結合部位を形成する。融合ポリペプチドの阻止部分と相補的な第２ポリペプチドとによって形成され得る例示的な機能性結合部位としては、抗体の抗原結合部位、例えば、抗体のＦａｂ断片またはその一部が挙げられる。例えば、サイトカインに結合するＦａｂの片方の鎖が融合ポリペプチドの阻止部分、例えばＶＨ－ＣＨ１であり得、相補的なＶＬ－ＣＬが第２ポリペプチドの一部であり得る。そのような場合、融合タンパク質の阻止部分すなわちＶＨ－ＣＨ１と、相補的なＶＬ－ＣＬを含む第２ポリペプチドとが会合して、融合タンパク質中に含有されるサイトカインポリペプチド（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ）に対する特異性を有する機能性結合部位を形成し得、サイトカインポリペプチド活性を弱化させる。阻止部分の少なくとも一部は、第２ポリペプチド鎖上にあり得、融合ポリペプチド上の阻止部分に会合する阻止部分の少なくとも一部を含み得る。
実施形態では、ＩＬ－２サイトカインポリペプチドを含有する融合タンパク質は、第２ポリペプチド鎖に共有結合または非共有結合で結合され得る。第２ポリペプチド鎖は、配列番号２６３、２６４または３３３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬを含有し得る。そのような第２ポリペプチドは、融合タンパク質中、例えば配列番号３６２、３６３、３２５、２８６、５７９、５８１または５８２の中に含有される相補的なＶＨ－ＣＨ１ポリペプチドと結合し得る。配列番号２６３、２６４及び３３３として開示される第２ポリペプチド鎖は、本明細書においてＷＷ０５２３（ＡＣＰ３８１）、ＷＷ０５２４（ＡＣＰ３８２）またはＷＷ０５５６（ＡＣＰ４１４）と呼称され得る。
実施形態では、融合ポリペプチドは配列番号３６２、３６３、３２５、２８６、５７９、５８１または５８２のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６３、２６４または３３３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。配列番号３６２、３６３、３２５、２８６、５７９、５８１または５８２として開示される融合ポリペプチドは、ＷＷ０５２０（ＡＣＰ３７８）、ＷＷ０５２１（ＡＣＰ３７９）、ＷＷ０５４８（ＡＣＰ４０６）、ＷＷ０６２１（ＡＣＰ４５７）、ＷＷ０７２９、ＷＷ０７３５またはＷＷ０７３６と呼称され得、配列番号２６３、２６４及び３３３として開示される第２ポリペプチド鎖は、本明細書においてＷＷ０５２３（ＡＣＰ３８１）、ＷＷ０５２４（ＡＣＰ３８２）またはＷＷ０５５６（ＡＣＰ４１４）と呼称され得る。
例えば、融合タンパク質は配列番号３６２のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３６２のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６４のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３６２のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号３３３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３６３のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３６３のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６４のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３６３のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号３３３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３２５のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６４のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３２５のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号３３３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号３２５のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号２８６のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号２８６のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６４のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号２８６のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチドは配列番号３３３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５７９のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５７９のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６４のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５７９のアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２３３のアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５８１を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６３を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５８１を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６４を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５８１を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号３３３を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５８２を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６３を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５８２を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号２６４を含み得るかまたはそれからなり得る。例えば、融合タンパク質は配列番号５８２を含み得、またはそれからなり得、第２ポリペプチド鎖は配列番号３３３を含み得るかまたはそれからなり得る。
治療方法及び医薬組成物
本開示はまた、本明細書に開示される１つ以上の融合タンパク質を任意選択的に別の治療剤、好ましくは免疫調節薬または抗がん剤と組み合わせて含む医薬組成物にも関する。本開示はまた、がんの治療におけるそのような医薬組成物の使用及び１つ以上の融合タンパク質の任意選択的に別の治療剤と組み合わせた使用にも関する。
本明細書に開示される治療薬合剤は、例えば、ＩＬ－２ポリペプチドを含有する融合タンパク質、ＩＬ－１２ポリペプチドを含有する融合タンパク質、またはＩＦＮポリペプチドを含有する融合タンパク質を含み得る。２つ以上の融合タンパク質を使用して療法が提供され得る。例えば、治療薬合剤は、ＩＬ－２ポリペプチドを含有する融合タンパク質とＩＬ－１２ポリペプチドを含有する融合タンパク質、ＩＬ－２ポリペプチドを含有する融合タンパク質とＩＦＮポリペプチドを含有する融合タンパク質、ＩＬ－１２ポリペプチドを含有する融合タンパク質とＩＦＮポリペプチドを含有する融合タンパク質を含み得る。
本明細書に開示される治療薬合剤は、融合ポリペプチド サイトカインポリペプチド［Ａ］、阻止部分［Ｄ］、任意選択の半減期延長部分［Ｈ］、及びプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーを含み得、サイトカインポリペプチドと、阻止部分と、存在する場合の任意選択の半減期延長要素とはプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーによって機能可能に連結されており、融合ポリペプチドは、弱化したサイトカイン受容体賦活作用を有し、融合ポリペプチドのサイトカイン受容体賦活作用は、プロテアーゼ切断可能リンカーの切断によって生成したサイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体賦活作用に比べて約１０分の１以下であり、融合ポリペプチドは、式：
［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｈ］－［Ｌ２］－［Ｄ］（Ｉ）；
［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｈ］－［Ｌ１］－［Ａ］（ＩＩ）；
［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｈ］（ＩＩＩ）；
［Ｈ］－［Ｌ２］－［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］（ＩＶ）；
［Ｈ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２’］－［Ｄ］（Ｖ）；
［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２’］－［Ｈ］（ＶＩ）；
〔式中、［Ａ］はサイトカインポリペプチドであり、［Ｄ］は阻止部分であり、［Ｈ］は半減期延長部分であり、［Ｌ１］はプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーであり、［Ｌ２］は、任意選択的にプロテアーゼ切断可能であるポリペプチドリンカーであり、［Ｌ２’］はプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーである〕
を有する。治療薬組成物は、第２サイトカインポリペプチド［Ａ］、阻止部分［Ｄ］ 任意選択の半減期延長要素［Ｈ］、及びプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカー［Ｌ］の各々を少なくとも１つずつ含む第２融合ポリペプチドを含み得、サイトカインポリペプチドと、サイトカイン阻止部分と、存在する場合の任意選択の半減期延長要素とはプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーによって機能可能に連結されており、融合ポリペプチドは、弱化したサイトカイン受容体賦活作用を有し、融合ポリペプチドのサイトカイン受容体賦活作用は、プロテアーゼ切断可能リンカーの切断によって生成したサイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体賦活作用に比べて約１０分の１以下である。第２融合ポリペプチドは、式：
［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｈ］－［Ｌ２］－［Ｄ］（Ｉ）；
［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｈ］－［Ｌ１］－［Ａ］（ＩＩ）；
［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｈ］（ＩＩＩ）；
［Ｈ］－［Ｌ２］－［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］（ＩＶ）；
［Ｈ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２’］－［Ｄ］（Ｖ）；
［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２’］－［Ｈ］（ＶＩ）；
〔式中、［Ａ］はサイトカインポリペプチドであり、［Ｄ］は阻止部分であり、［Ｈ］は半減期延長部分であり、［Ｌ１］はプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーであり、［Ｌ２］は、任意選択的にプロテアーゼ切断可能であるポリペプチドリンカーであり、［Ｌ２’］はプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーである〕
を有し得る。
本明細書に開示される治療薬合剤は、配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０及び５３９～５７８からなる群から選択されるアミノ酸を含む第１融合タンパク質、ならびに配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０及び５３９～５７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２融合タンパク質を含み得る。第１融合タンパク質と第２融合タンパク質とが異なっていることが好ましい。いくつかの好ましい実施形態では、治療薬合剤は、配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６から選択されるアミノ酸配列を含む第１融合タンパク質、ならびに配列番号３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０及び５３９～５７８から選択されるアミノ酸配列を含む第２融合タンパク質を含む。いくつかの好ましい実施形態では、治療薬合剤は、配列番号３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９または５２３～５３８から選択されるアミノ酸配列を含む第１融合タンパク質、ならびに配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、６３６～６４６、５７９～６０８、４２１～４３０及び５３９～５７８から選択されるアミノ酸配列を含む第２融合タンパク質を含む。いくつかの好ましい実施形態では、治療薬合剤は、配列番号４２１～４３０及び５３９～５７８から選択されるアミノ酸配列を含む第１融合タンパク質、ならびに配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８またはその組合せから選択されるアミノ酸配列を含む第２融合タンパク質を含む。
本明細書に開示される治療薬合剤は、第２ポリペプチド鎖及び治療剤に共有結合または非共有結合で結合している第１融合タンパク質を含み得る。治療薬合剤は、（ｉ）配列番号３６２、３６３、３２５、２８６、５７９、５８１または５８２から選択されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号２６３、２６４または３３３のアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド鎖、ならびに（ｉｉ）第２治療剤を含み得、第２治療剤は、配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０、５３９～５７８またはその組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２融合ポリペプチドである。第１融合タンパク質と第２融合タンパク質とが同じでないことが好ましい。
実施形態において、治療薬合剤は、付加的な治療剤（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれより多い治療剤）を含み得る。実施形態において、治療薬合剤は、２つ以上の融合タンパク質、及び１つ以上の治療剤、好ましくはがんを治療するための薬剤を含み得る。
他の例示的な治療剤としては、化学療法剤（例えば、アドリアマイシン、セルビジン、ブレオマイシン、アルケラン、ベルバン、オンコビン、フルオロウラシル、チオテパ、メトトレキサート、ビサントレン、ノバントロン（Ｎｏａｎｔｒｏｎｅ）、チオグアニン（Ｔｈｉｇｕａｎｉｎｅ）、シタラビン（Ｃｙｔａｒｉｂｉｎｅ）、プロカルバジン（Ｐｒｏｃａｒａｂｉｚｉｎｅ））、免疫腫瘍学薬剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ－１、抗ＣＤ４７、抗ＧＤ２、ＶＥＧＦ阻害剤）、抗体－薬物複合体、細胞療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ、Ｔ細胞療法）、腫瘍溶解性ウイルス、放射線療法及び／または小分子が挙げられるが、これらに限定されない。
使用され得る抗がん剤の非限定的な例としては、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール塩酸塩、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレン塩酸塩、二メシル酸ビスナフィド、ビゼレシン、ブレオマイシン硫酸塩、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシン塩酸塩、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジキオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸塩、ドロロキシフェン、ドロロキシフェンクエン酸塩、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキサート、エフロルニチン塩酸塩、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、エピルビシン塩酸塩、エルブロゾール、エソルビシン塩酸塩、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、ファドロゾール塩酸塩、ファザラビン、フェンレチニド、フロキシウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルオロシタビン、フォスキドン、フォストリエシンナトリウム塩、ゲムシタビン、ゲムシタビン塩酸塩、ヒドロキシ尿素、イダルビシン塩酸塩、イフォスファミド、イルモホシン、インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩまたはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンアルファ－２ａ、インターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロンアルファ－ｎ１ インターフェロンアルファ－ｎ３、インターフェロンベータ－Ｉａ、インターフェロンガンマ－Ｉｂ、イプロプラチン、イリノテカン塩酸塩、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸リュープロリド、リアロゾール塩酸塩、ロメトレキソールナトリウム塩、ロムスチン、ロソキサントロン塩酸塩、マソプロコール、メイタンシン、メクロレタミン塩酸塩、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム塩、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスペル、ミトタン、ミトキサントロン塩酸塩、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペグアスパラガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、ペプロマイシン硫酸塩、ペルフォスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、ピロキサントロン塩酸塩、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン塩酸塩、ピューロマイシン、ピューロマイシン塩酸塩、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、サフィンゴール塩酸塩、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォサートナトリウム塩、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム塩酸塩、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム塩、テガフール、テロキサントロン塩酸塩、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、トレミフェンクエン酸塩、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、ツブロゾール塩酸塩、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、ビンデシン、ビンデスチン硫酸塩、ビネピジン硫酸塩、ビングリシナート硫酸塩、硫酸ビンロイロシン、ビノレルビン酒石酸塩、ビンゾリジン硫酸塩、ビンゾリジン硫酸塩、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、ゾルビシン塩酸塩が挙げられる。
したがって、本開示は、化学療法剤、例えばアドリアマイシン、セルビジン、ブレオマイシン、アルケラン、ベルバン、オンコビン、フルオロウラシル、チオテパ、メトトレキサート、ビサントレン、ノバントロン（Ｎｏａｎｔｒｏｎｅ）、チオグアニン（Ｔｈｉｇｕａｎｉｎｅ）、シタラビン（Ｃｙｔａｒｉｂｉｎｅ）、プロカルバジン（Ｐｒｏｃａｒａｂｉｚｉｎｅ）と組み合わせた本明細書に開示される融合タンパク質のいずれか（例えば、ＩＬ－２ポリペプチド及びＩＬ－１２ポリペプチドまたはＩＦＮポリペプチドを含む融合タンパク質）の治療薬合剤に関する。本開示は、抗体－薬物複合体と組み合わせた本明細書に開示される融合タンパク質のいずれか（例えば、ＩＬ－２ポリペプチド及びＩＬ－１２ポリペプチドまたはＩＦＮポリペプチドを含む融合タンパク質）の治療薬合剤に関する。がん療法に使用するのに適する様々な抗体薬物複合体はよく知られており、典型的には、腫瘍細胞上に優先的に発現するかまたは高レベルで発現する細胞性抗原に結合する抗体、及び細胞毒性薬を含む。本開示は、細胞療法、例えばＣＡＲ－ＴまたはＴ細胞療法と組み合わせた本明細書に開示される融合タンパク質のいずれか（例えば、ＩＬ－２ポリペプチド及びＩＬ－１２ポリペプチドまたはＩＦＮポリペプチドを含む融合タンパク質）の治療薬合剤に関する。本開示は、腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせた本明細書に開示される融合タンパク質（例えば、ＩＬ－２ポリペプチド及びＩＬ－１２ポリペプチドまたはＩＦＮポリペプチドを含む融合タンパク質）の治療薬合剤に関する。例示的な腫瘍溶解性ウイルスとしては、腫瘍溶解性アデノウイルス、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ポリオウイルス、麻疹ウイルス（ＭＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、レオウイルス、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）及びジカウイルスが挙げられる。本開示は、放射線療法、例えば体外照射または体内療法放射線療法と組み合わせた本明細書に開示される融合タンパク質のいずれか（例えば、ＩＬ－２ポリペプチド及びＩＬ－１２ポリペプチドまたはＩＦＮポリペプチドを含む融合タンパク質）の治療薬合剤に関する。
本開示は、サイトカイン（例えばＩＬ－２、ＩＬ－１５）、シグナル誘発阻害剤（例えばＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤）、チェックポイント阻害剤（例えばＰＤＬ－１、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４）、ｃ－ｍｅｔ阻害剤、キナーゼ阻害剤（例えばＶＧＥＦ阻害剤）、プロテアソーム阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、血管新生阻害剤と組み合わせた本明細書に開示される融合タンパク質のいずれか（例えば、ＩＬ－２ポリペプチド及びＩＬ－１２ポリペプチドまたはＩＦＮポリペプチドを含む融合タンパク質）の治療薬合剤に関する。実施形態において、本明細書に開示される融合タンパク質のいずれか１つ（例えば、ＩＬ－２ポリペプチド及びＩＬ－１２ポリペプチドまたはＩＦＮポリペプチドを含む融合タンパク質）は、抗ＰＤ－Ｌ１剤または抗ＰＤ－１剤と組み合わされ得る。例示的なＰＤ－１及び／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤としては、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、シンチリマブ、チスレリズマブ、トリパリマブ、ドスタルリマブ、ＩＮＣＭＧＡ０００１２、ＡＭＰ－２２４及びＡＭＰ－５１４）が挙げられるが、これらに限定されない。実施形態において、配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０及び５３９～５７８から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質は、チェックポイント阻害剤、例えばＰＤＬ－１、ＰＤ－１またはＣＴＬ－４と組み合わされ得る。
さらには、疾患または障害、例えば増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応もしくは移植片対宿主病を有するまたはその発症リスクを有する対象を治療する方法が提供される。本明細書に開示される方法は、好ましくは、がんを有する対象を治療するために使用される。医薬組成物として投与されるのが典型的である有効量の本明細書に開示される融合タンパク質の投与を、それを必要とする対象に対して行う方法。いくつかの実施形態では、方法は、そのような疾患もしくは障害を有するまたはその発症リスクを有する対象を選択することをさらに含む。医薬組成物は、好ましくは、炎症部位または腫瘍において活性化される阻止されたサイトカイン、その断片、多様体、サブユニットまたはムテインを含む。一実施形態では、キメラポリペプチドは、サイトカインポリペプチド、その断片またはムテイン、及び血清中半減期延長要素を含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドは、サイトカインポリペプチド、その多様体、サブユニット、断片またはムテイン、及び阻止部分、例えば立体的阻止ポリペプチドを含み、立体的阻止ポリペプチドは、サイトカインポリペプチド、その断片またはムテインの作用を立体的に阻止することができる。別の実施形態では、キメラポリペプチドは、サイトカインポリペプチド、その断片またはムテイン、阻止部分、及び血清中半減期延長要素を含む。
炎症は、有害な刺激、例えば病原体、損傷細胞または刺激物質に対する身体組織の複雑な生物学的応答の一部であり、免疫細胞、血管及び分子状伝達物質が関与する防御的応答である。炎症の機能は、細胞損傷の初発原因をなくし、最初の傷害及び炎症プロセスから損傷を受けた壊死細胞及び組織を取り除き、組織修復を開始することである。炎症は、感染から、症候または疾患、例えばがん、粥状動脈硬化、アレルギー、ミオパチー、ＨＩＶ、肥満または自己免疫疾患として起こり得る。自己免疫疾患は、自己抗原に対する異常な免疫応答に起因する慢性病態である。本明細書に開示されるポリペプチドによって治療され得る自己免疫疾患としては、狼瘡、セリアック病、１型真性糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ及び全身性紅斑性狼瘡が挙げられるが、これらに限定されない。
医薬組成物は、１つ以上のプロテアーゼ切断可能リンカー配列を含み得る。リンカー配列は、各ポリペプチドが第１ポリペプチドの作用を阻害することができるような柔軟性をポリペプチド間に与えるのに役立つ。リンカー配列は、サイトカインポリペプチド、その断片またはムテイン、阻止部分、及び血清中半減期延長要素のいずれかまたは全ての間に位置し得る。任意選択的に、組成物は２つ、３つ、４つまたは５つのリンカー配列を含む。リンカー配列、２つ、３つまたは４つのリンカー配列は、同じまたは異なるリンカー配列であり得る。一実施形態では、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳ（配列番号４４９）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号４５０）、またはＧ（ＳＧＧＧ）２ＳＧＧＴ（配列番号４５１）を含む。別の実施形態では、リンカーは、ＨＳＳＫＬＱ（配列番号２５）、ＧＰＬＧＶＲＧ（配列番号４４５）、ＩＰＶＳＬＲＳＧ（配列番号４４６）、ＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号４４７）及びＳＧＥＳＰＡＹＹＴＡ（配列番号４４８）からなる群から選択されるプロテアーゼ切断可能配列を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カテプシンＧ、エラスターゼ、ＰＲ－３、グランザイムＭ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、トリプターゼまたは腫瘍細胞表面プロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼによって切断される。
好適なリンカーは長さが様々であり得、例えば、１アミノ酸（例えばＧｌｙ）～２０アミノ酸、２アミノ酸～１５アミノ酸、３アミノ酸～１２アミノ酸、例えば、４アミノ酸～１０アミノ酸、アミノ酸～９アミノ酸、６アミノ酸～８アミノ酸、または７アミノ酸～８アミノ酸であり得、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０アミノ酸であり得る。
さらには、がんを有するまたはその発症リスクを有する対象を治療する方法が提供される。方法は、医薬組成物として投与されるのが典型的である有効量の本明細書に記載のキメラポリペプチド（融合タンパク質）の投与を、それを必要とする対象に対して行うことを含む。いくつかの実施形態では、方法は、がんを有するまたはその発症リスクを有する対象を選択することをさらに含む。医薬組成物は、好ましくは、腫瘍部位において活性化される阻止されたサイトカイン、その断片またはムテインを含む。
本明細書に開示される方法は、造血器悪性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、癌腫、ならびに他の固形及び非固形腫瘍を含めた任意の好適ながんのために治療され得る。例示される好適な癌としては、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌腫、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、基底細胞癌腫、脳腫瘍、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、気管支腫瘍、原発不明の癌腫、心臓腫瘍、子宮頸癌、軟骨腫、結腸癌、大腸癌、頭蓋咽頭腫、乳管癌、胎芽性腫瘍、胎芽性癌、上衣細胞腫、食道癌、嗅神経芽細胞腫、線維性組織球腫、ユーイング肉腫、眼部癌、胚細胞腫瘍、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌、組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内メラノーマ、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、口唇及び口腔癌、肝臓癌、非浸潤性小葉癌腫、肺癌、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮性頚部癌、ＮＵＴ遺伝子が関与する正中線癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成性／骨髄増殖性新生物、鼻孔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、クロム親和性細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、中枢神経原発リンパ腫、前立腺癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管癌、網膜芽細胞腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、脊髄腫瘍、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、奇形腫様腫瘍、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫及び胸腺癌腫、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、膣癌、外陰癌、ならびにウィルムス腫瘍が挙げられる。
好ましくは、腫瘍は固形腫瘍である。結腸癌、肺癌、メラノーマ、肉腫、腎細胞癌腫及び乳癌は特に関心対象である。
方法は、がんを治療するための１つ以上の付加的薬剤、例えば１つ以上の本明細書に記載のサイトカイン融合タンパク質、化学療法剤（例えば、アドリアマイシン、セルビジン、ブレオマイシン、アルケラン、ベルバン、オンコビン、フルオロウラシル、チオテパ、メトトレキサート、ビサントレン、ノバントロン（Ｎｏａｎｔｒｏｎｅ）、チオグアニン（Ｔｈｉｇｕａｎｉｎｅ）、シタラビン（Ｃｙｔａｒｉｂｉｎｅ）、プロカルバジン（Ｐｒｏｃａｒａｂｉｚｉｎｅ））、免疫腫瘍学薬剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ－１、抗ＣＤ４７、抗ＧＤ２、ＶＥＧＦ阻害剤）、細胞療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ、Ｔ細胞療法）、腫瘍溶解性ウイルス、放射線療法などを施与することをさらに含み得る。
実施形態において、本明細書に記載の融合タンパク質は、誘導可能である１つ以上の付加的なサイトカイン融合タンパク質と共に投与され得る。例えば、本明細書に記載されるような、ＩＬ－２ポリペプチドを含有する融合タンパク質は、ＩＬ－１２ポリペプチド、ＩＦＮポリペプチド、異なるＩＬ－２ポリペプチドまたはその組合せを含有する融合タンパク質と共に投与され得る。本明細書に記載されるような、ＩＬ－１２ポリペプチドを含有する融合タンパク質は、ＩＬ－２ポリペプチド、ＩＦＮポリペプチド、異なるＩＬ－１２ポリペプチドまたはその組合せを含有する融合タンパク質と共に投与され得る。本明細書に記載されるような、ＩＦＮポリペプチドを含有する融合タンパク質は、ＩＬ－２ポリペプチド、ＩＬ－１２ポリペプチド、異なるＩＦＮポリペプチドまたはその組合せを含有する融合タンパク質と共に投与され得る。
いくつかの好ましい実施形態では、配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８及び６３６～６４６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１融合タンパク質は、配列番号３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０及び５３９～５７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２の異なる融合タンパク質と共に投与され得る。いくつかの好ましい実施形態では、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９または５２３～５３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１融合タンパク質は、配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、４２１～４３０及び５３９～５７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２の異なる融合タンパク質と共に投与され得る。いくつかの好ましい実施形態では、配列番号４２１～４３０及び５３９～５７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１融合タンパク質は、配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８またはその組合せのいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２の異なる融合タンパク質と共に投与され得る。
本明細書に記載の１つ以上の誘導可能サイトカイン融合タンパク質と組み合わせて投与され得るさらなる例示的な薬剤としては、サイトカイン（例えばＩＬ－２、ＩＬ－１５）、シグナル誘発阻害剤（例えばＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤）、チェックポイント阻害剤（例えばＰＤＬ－１、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４）、ｃ－ｍｅｔ阻害剤、キナーゼ阻害剤（例えばＶＧＥＦ阻害剤）、プロテアソーム阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、血管新生阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい免疫腫瘍学薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１剤または抗ＰＤ－１である。例示的なＰＤ－１及び／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤としては、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、シンチリマブ、チスレリズマブ、トリパリマブ、ドスタルリマブ、ＩＮＣＭＧＡ０００１２、ＡＭＰ－２２４及びＡＭＰ－５１４）が挙げられるが、これらに限定されない。実施形態において、２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０及び５３９～５７８として開示される融合タンパク質は、チェックポイント阻害剤、例えばＰＤＬ－１、ＰＤ－１またはＣＴＬ－４と組み合わせて投与され得る。
本明細書には、キメラポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する医薬製剤または組成物が開示される。本明細書に提供される組成物は、試験管内または生体内での投与に適している。薬学的に許容される担体は、生物学またはその他に関して望ましくないものでない材料を意味し、つまり、当該材料は、望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、またはそれを含有する医薬製剤もしくは組成物の他成分と有害な方法で相互作用することなく対象に投与される。担体は、有効成分の分解を最小限に抑えるように及び対象における有害副作用を最小限に抑えるように選択される。
好適な担体及びその配合組成は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ， Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。典型的には、適切な量の薬学的に許容される塩を製剤に使用して製剤を等張にし、但し、所望により製剤は高張または低張であってもよい。薬学的に許容される担体の例としては、無菌水、生理食塩水、緩衝液、例えばリンガー液、及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは概して約５～約８または約７～７．５である。他の担体としては、持続放出性調製品、例えば、免疫原性ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。マトリックスは、成形品、例えば、膜、リポソームまたは微粒子の形態である。例えば投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて特定の担体がより好ましくなる場合がある。担体は、キメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸配列をヒトまたは他の対象に投与するのに適するものである。
医薬製剤または組成物は、局所または全身のどちらに対する処置が望まれるか、及び処置される領域に応じて、複数の方法で投与される。組成物は、局所、経口、非経口、静脈内、関節内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮、肝内、頭蓋内、噴霧／吸入、または気管支鏡を介した設置によるものを含めたいくつかの投与形態のいずれかによって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、腫瘍内、関節内、クモ膜下腔内などを含めた局所に（非全身的に）投与される。
非経口投与のための製剤は、無菌水性または非水性液剤、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、水、アルコール性／水性液剤、乳剤または懸濁剤を含み、これには生理食塩水及び緩衝培地が含まれる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、デキストロースリンゲル液、デキストロース及び円かナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養素補給剤、電解質補給剤（例えばデキストロースリンゲル液ベースのもの）などが含まれる。保存剤及び他の添加物、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、ならびに不活性ガス及び類似するものなどは、任意選択的に存在する。
局所投与のための製剤には、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、坐剤、スプレー剤、液剤及び散剤が含まれる。従来の医薬担体、水性、粉末状または油性基剤、増粘剤などは、任意選択的に必要であるかまたは望ましい。
経口投与のための組成物には、散剤または顆粒剤、水もしくは非水性媒体で作られた懸濁剤もしくは液剤、カプセル剤、予包剤、または錠剤が含まれる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤は、任意選択的に望ましい。
任意選択的に、キメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸配列はベクターによって投与される。核酸分子及び／またはポリペプチドを細胞に試験管内か生体内かのどちらかで例えば発現ベクターによって送達するために用いられ得る複数の組成物及び方法が存在する。これらの方法及び組成物は概して２つの部類に分けることができる：ウイルス系送達システム、及び非ウイルス系送達システム。そのような方法は当技術分野でよく知られており、本明細書に記載の組成物及び方法と共に用いるために容易に適合させることができる。そのような組成物及び方法は、試験管内または生体内で細胞にトランスフェクトまたは形質導入するため、例えば、コードされるキメラポリペプチドを発現させ好ましくは分泌する細胞株を生産するため、または核酸を対象に治療的に送達するために用いられ得る。本明細書に開示されるキメラ核酸の構成要素は、典型的には、融合タンパク質をコードするようにインフレームで機能可能に連結される。
本明細書中で使用する場合、プラスミドまたはウイルスベクターは、本開示の核酸を分解させずに細胞内に輸送する作用物質であり、その送達を受けた細胞における核酸分子及び／またはポリペプチドの発現をもたらすプロモーターを含む。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルス、ポリオウイルス、シンドビス及び他のＲＮＡウイルス、例えばＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスである。これらのウイルスをベクターとしての使用に好適なものにしているそれらの特性を共有している任意のウイルスファミリーも、好ましい。レトロウイルスベクターは全体的にＣｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）に記載がなされており、参照によりこれをベクター及びそれを作る方法に関して本明細書に援用する。複製能欠損アデノウイルスの構築については記載がなされている（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１２１３－２０（１９８７）、Ｍａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２－８３（１９８６）、Ｈａｊ－Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７－７４（１９８６）、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１２２６－３９（１９８７）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：８６８－７２（１９９３））。これらのウイルスのベクターとしての利点及び用途は、それらが他の細胞種に広がり得る程度が限られていることである、というのも、それらは最初の感染細胞の中では複製できるが新たな感染性ウイルス粒子を形成することができないからである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質及び他の複数の組織部位への直接的な生体内送達の後に高い効率を実現することが示されている。他の有用な系としては、例えば、複製性及び宿主制限非複製性ワクチニアウイルスベクターが挙げられる。
提供されるポリペプチド及び／または核酸分子は、ウイルス様粒子によって送達され得る。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルスの構造タンパク質に由来するウイルスタンパク質（複数可）からなる。ウイルス様粒子を作る及び使用する方法は、例えば、Ｇａｒｃｅａ ａｎｄ Ｇｉｓｓｍａｎｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：５１３－７（２００４）に記載されている。
提供されるポリペプチドは、サブウイルスデンスボディ（ＤＢ）によって送達され得る。ＤＢは膜融合によって標的細胞内にタンパク質を輸送する。ＤＢを作る及び使用する方法は、例えば、Ｐｅｐｐｅｒｌ－Ｋｌｉｎｄｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２７８－８４（２００３）に記載されている。
提供されるポリペプチドは、テグメント凝集体によって送達され得る。テグメント凝集体を作る及び使用する方法は国際公開第ＷＯ２００６／１１０７２８号に記載されている。
非ウイルス系送達方法は、核酸分子及びポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含み得、核酸は発現制御配列に機能可能に連結されている。好適なベクター骨格としては、例えば、当技術分野で慣例的に使用されているもの、例えばプラスミド、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣまたはＰＡＣが挙げられる。多数のベクター及び発現システムが、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｐａｌ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）などの会社から市販されている。ベクターは典型的には１つ以上の調節領域を含有する。調節領域は、限定はしないがプロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導可能エレメント、タンパク質結合性配列、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終止配列、ポリアデニル化配列及びイントロンを含む。そのようなベクターは、好適な宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞における発現によってキメラポリペプチドを作るためにも使用され得る。
哺乳動物宿主細胞においてベクターからの転写を制御している好ましいプロモーターは、様々な供給源、例えば、ポリオーマ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及び最も好ましくはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などのウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えばβアクチンプロモーターもしくはＥＦ１αプロモーターから、またはハイブリッドもしくはキメラプロモーター（例えば、β－アクチンプロモーターに融合されたＣＭＶプロモーター）から得られ得る。もちろん、宿主細胞または関連する種からのプロモーターも本明細書において有用である。
エンハンサーは一般に、転写開始部位からの不定の距離のところで機能するＤＮＡの配列を指し、転写単位の５’側か３’側かのどちらかにあり得る。さらには、エンハンサーはイントロンの中にもコード配列自体の中にもあり得る。それらは、普通は長さが１０～３００塩基対（ｂｐ）であり、それらはシスで機能する。エンハンサーは一般に、近くにあるプロモーターからの転写を増進するように機能する。エンハンサーは、転写の調節を媒介する応答エレメントも含有し得る。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトタンパク質及びインスリン）からの多くのエンハンサー配列が知られているが、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを通常の発現のために使用するのが典型的であろう。好ましい例は、複製起点の後ろ側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側にあるポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーである。
プロモーター及び／またはエンハンサーは誘導可能であり得る（例えば化学的または物理的に調節され得る）。化学的に調節されるプロモーター及び／またはエンハンサーは、例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイドまたは金属の存在によって調節され得る。物理的に調節されるプロモーター及び／またはエンハンサーは、例えば、環境因子、例えば温度及び光によって調節され得る。任意選択的に、プロモーター及び／またはエンハンサー領域は、恒常プロモーター及び／またはエンハンサーとして作用して、転写される転写単位の領域の発現を最大限にし得る。あるベクターでは、プロモーター及び／またはエンハンサー領域は、細胞種特異的に活性となり得る。任意選択的に、あるベクターではプロモーター及び／またはエンハンサー領域は、細胞種とは無関係に全ての真核細胞において活性となり得る。この類の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、ＥＦ１αプロモーター及びレトロウイルス長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）である。
ベクターはまた、例えば、複製起点及び／またはマーカーを含み得る。マーカー遺伝子は、選択可能な表現型、例えば抗生物質耐性を細胞に付与し得る。マーカー産物は、ベクターが細胞に送達されたか否か、及び一旦送達されたものが発現しているか否かを判定するために使用される。哺乳動物細胞のための選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類縁体Ｇ４１８、ヒグロマイシン、ピューロマイシン及びブラスチシジンである。そのような選択マーカーは首尾よく哺乳動物宿主細胞内に移入され、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、淘汰圧下に置かれた場合に生存することができる。他のマーカーの例としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びルシフェラーゼが挙げられる。加えて、発現ベクターは、発現したポリペプチドの取扱いまたは検出（例えば精製または局在化）を容易にすべく設計されたタグ配列を含み得る。タグ配列、例えばＧＦＰ、グルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ－ｍｙｃ、ヘマグルチニンまたはＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．）配列は、コードされるポリペプチドとの融合体として発現するのが典型的である。そのようなタグは、ポリペプチド中のどこにでも、例えば、カルボキシルかアミノ末端かのどちらかに、挿入され得る。
本明細書中で使用する場合、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質という用語は、広義にはペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸を意味して使用される。タンパク質、ペプチド及びポリペプチドはまた、アミノ酸配列も指して本明細書中で互換的に使用される。ポリペプチドという用語が本明細書において特定の大きさまたは分子を構成するアミノ酸の数を示唆するために使用されてはいないこと、及び本発明のペプチドが数個以下またはそれよりも多いアミノ酸残基を含有し得ることは認識されるべきである。対象は、全体を通して使用されているが、脊椎動物、より具体的には哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラット及びモルモット）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類及び他の任意の動物であり得る。当該用語は特定の年齢または性別を表さない。したがって、成体及び新生対象は雄であろうと雌であろうと包含されることを意図する。本明細書中で使用する場合、患者または対象は互換的に使用され得、疾患または障害（例えばがん）を有する対象を指し得る。患者または対象という用語はヒト及び獣医学的対象を含む。
疾患または障害の発症リスクを有する対象は、遺伝学的に疾患または障害にかかる傾向があり得、例えば、家族歴を有し得るか、または遺伝子中に疾患もしくは障害を引き起こす変異を有し得るか、または疾患もしくは障害の初期の兆候もしくは症候を示し得る。疾患または障害を現在有する対象は、疾患または障害の１つまたは１つよりも多い症候を有し、疾患または障害と診断されたことがあり得る。
本明細書に記載の方法及び薬剤は、予防及び治療処置の両方において有用である。予防的使用のためには、治療的有効量の本明細書に記載のキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードするキメラ核酸配列を対象に発症前に（例えば、がんまたは炎症の明らかな兆候が出る前に）、または初期発症中に（例えば、がんまたは炎症の初期兆候及び症候が出たときに）投与する。予防的投与は、がんまたは炎症の症候が顕在化する前に数日間～数年にわたって起こり得る。予防的投与は、例えば、遺伝的にがんにかかりやすいと診断された対象の予防的処置において用いられ得る。治療的処置は、治療的有効量の本明細書に記載のキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸配列を対象にがんまたは炎症（例えば自己免疫疾患）の診断または進展の後に投与することを含む。炎症が予測される治療、例えば化学療法を患者が受けている場合にも予防的使用が適用され得る。
本明細書において教示される方法によれば、対象は、有効量の薬剤（例えばキメラポリペプチド）が投与される。有効量及び有効投薬量という用語は互換的に使用される。有効量という用語は、所望の生理学的応答を生むために必要とされる任意の量として定義される。有効量、及び薬剤を投与のための計画は実験的に決定され得、そのような決定を行うことは当技術分野における技量の範囲内である。投与のための投薬量範囲は、疾患または障害の１つ以上の症候が影響を受ける（例えば軽減されるまたは遅延する）所望の効果を生むのに十分に大きなものである。投薬量は、望まれない交差反応、アナフィラキシー反応などのようなかなりの有害副作用を引き起こすほど多くすべきではない。通常、投薬量は、年齢、病態、性別、疾患の種類、疾患もしくは障害の程度、投与経路、または治療計画中に含められる他の薬物の有無によって様々であり、当業者によって決定され得るものである。投薬量は、何らかの禁忌があった場合に個々の医師によって調整され得る。投薬量は様々であり得、１日または数日間にわたって毎日１回以上の用量投与で投与され得る。所与のクラスの医薬製品のための適切な投薬量についての指針は文献中に見つかり得る。
本明細書中で使用する場合、治療、治療する、または治療することという用語は、疾患もしくは病態、または疾患もしくは病態の症候の影響を軽減する方法を意味する。したがって、本開示の方法において治療は、既存の疾患もしくは病態、または疾患もしくは病態の症候の重症度を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低減することを意味し得る。例えば、疾患を治療する方法は、対照と比較して対象における疾患の１つ以上の症候に１０％の低減がある場合に、治療であるとみなされる。したがって、低減は、元のレベルまたは対照レベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０～１００％の間の任意の低減パーセントであり得る。治療が必ずしも疾患、病態、または疾患もしくは病態の症候の治癒または完全な除去を意味していないことは、理解される。
本明細書中で使用する場合、疾患または障害の予防する、予防すること及び予防という用語は、疾患または障害の１つ以上の症候の開始または増悪を抑制するまたは遅らせるものである、対象が疾患または障害の１つ以上の症候を示し始める前またはそれとほぼ同じ時に起こる行為、例えばキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸配列の投与を意味する。本明細書中で使用する場合、減少させること、低減すること、または阻害することに対する言及は、対照レベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれを上回る変化を含む。そのような用語は完全な除去を含み得るが、必ずしも含むというわけではない。
ＩＬ２Ｒβγと対比したときＩＬ２Ｒαβγに対して選択的であるＩＬ－２多様体が開発されている（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１１９７－２０２、Ｃａｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ． ａｌ．，２００２，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．，８：２１７１－８３）。これらの多様体は、ＩＬ２ＲＢに対するそれらの親和性を低下させるアミノ酸置換を有する。ＩＬ－２はＩＬ２ＲＧに対する検出不可能な親和性を有するため、これらの多様体は結果としてＩＬ２Ｒβγ受容体複合体に対する低下した親和性を有し、ＩＬ２Ｒβγ発現細胞を活性化させる能力が低下しているが、ＩＬ２ＲＡに結合する能力及びＩＬ２Ｒαβγ受容体複合体に結合してそれを活性化させる能力は保持している。
これらの多様体の１つであるＩＬ２／Ｎ８８Ｒ（Ｂａｙ ５０－４７９８）は、ＩＬ２Ｒβγ発現ＮＫ細胞が毒性の主因であるという仮説に基づいて、免疫系刺激剤としてのＩＬ－２の低毒性形態として臨床的に試験された。Ｂａｙ ５０－４７９８は、ＮＫ細胞と対比したとき活性化Ｔ細胞の増殖を選択的に刺激することが示され、がん患者（Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．，２００７，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１３：３３１２－９）及びＨＩＶ患者（Ｄａｖｅｙ，Ｒ．Ｔ．，ｅｔ． ａｌ．，２００８，Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．，２８：８９－１００）における第Ｉ／ＩＩ相治験において評価された。これらの治験は、Ｂａｙ ５０－４７９８がアルデスロイキンよりもかなり安全でありより忍容可能であることを示し、また、それが、Ｔｒｅｇ細胞に富む細胞集団であるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のレベルを上昇させたことも示した。これらの治験の後、当該分野における研究はＴｒｅｇ細胞の同一性をより十分に確立し、Ｔｒｅｇ細胞が選択的にＩＬ２Ｒαβγを発現させることを実証した（Ｍａｌｅｋ，Ｔ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３３：１５３－６５の中で総説されている）。
加えて、天然Ｉｌ－２と対比したときＣＤ２５鎖に対する親和性を選択的に改変する変異体が作られ得る。
ＩＬ－２は、対応する野生型ＩＬ－２または現在入手可能な変異体（位置１２５のシステイン残基がセリン残基に置き換わっているためＣ１２５Ｓと呼称される）とは異なる親和性でＩＬ－２Ｒ複合体に全体的に、またはＩＬ－２Ｒαサブユニットに特異的に結合する変異体を生成するように操作され得る。
したがって、本発明は、野生型ＩＬ－２と少なくとも８０％同一である（例えば、８５、８７、９０、９５、９７、９８または９９％同一である）アミノ酸配列を含み、ＷＴ ＩＬ－２と対比して二量体型ＩＬ－２受容体に対するよりもＩＬ－２三量体型受容体に対する結合性の方が高い、変異インターロイキン－２（ＩＬ－２＊）ポリペプチドを特徴とする。典型的にはムテインも、野生型ＩＬ－２がＩＬ－２Ｒαに結合するときよりも高い親和性でＩＬ－２受容体αサブユニット（ＩＬ－２Ｒα）に結合するであろう。変異ＩＬ－２ポリペプチド中のアミノ酸配列は、保存的または非保存的置換とみなされ得る１つ以上のアミノ酸置換を含有する（またはそれだけを含有する）ことゆえに配列番号１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ６０５６８）とは異なり得る。天然に存在しないアミノ酸を組み込むこともできる。あるいは、またはさらに、アミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸残基を含有することならびにその付加及び／または欠失ゆえに配列番号１（これは「基準」配列ともみなされ得る）とは異なり得る。より具体的には、アミノ酸配列は、配列番号１の以下の位置の少なくとも１つにおける変異ゆえに配列番号１のアミノ酸配列とは異なり得る：１、４、８、９、１０、１１、１３、１５、２６、２９、３０、３１、３５、３７、４６、４８、４９、５４、６１、６４、６７、６８、６９、７１、７３、７４、７５、７６、７９、８８、８９、９０、９２、９９、１０１、１０３、１１４、１２５、１２８または１３３（またはその組合せ）。記されているとおり、これらの位置のうちのたった１つが変化していてもよく、同様にそれは位置の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個または１１個以上（全てに至るまでを含む）であってもよい。例えば、アミノ酸配列は、位置６９及び７４、さらには位置３０、３５及び１２８のうちの１つ以上において配列番号１とは異なり得る。アミノ酸配列は、配列番号２（参照により本明細書に援用されるＵＳ７５６９２１５に開示されているもの）とも以下の位置の組のうちの１つにおいて異なり得る：（ａ）位置６４、６９及び７４、（ｂ）位置６９、７４及び１０１、（ｃ）位置６９、７４及び１２８、（ｄ）位置３０、６９、７４及び１０３、（ｅ）位置４９、６９、７３及び７６、（ｆ）位置６９、７４、１０１及び１３３、（ｇ）位置３０、６９、７４及び１２８、（ｈ）位置６９、７４、８８及び９９、（ｉ）位置３０、６９、７４及び１２８、（ｊ）位置９、１１、３５、６９及び７４、（ｋ）位置１、４６、４９、６１、６９及び７９、（ｌ）位置４８、６８、７１、９０、１０３及び１１４、（ｍ）位置４、１０、１１、６９、７４、８８及び１３３、（ｎ）位置１５、３０ ３１、３５、４８、６９、７４及び９２、（Ｏ）位置３０、６８、６９、７１、７４、７５、７６及び９０、（ｐ）位置３０、３１、３７、６９、７３、７４、７９及び１２８、（ｑ）位置２６、２９、３０、５４、６７、６９、７４及び９２、（ｒ）位置８、１３、２６、３０、３５、３７、６９、７４及び９２、ならびに（ｓ）位置２９、３１、３５、３７、４８、６９、７１、７４、８８及び８９。これらの位置における変異を除けば変異ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸配列はそれ以外は配列番号１と同一であり得る。具体的な置換に関して、アミノ酸配列は、以下の変異のうちの１つ以上を有することゆえに配列番号１とは異なり得る：Ａ１Ｔ、Ｓ４Ｐ、Ｋ８Ｒ、Ｋ９Ｔ、Ｔ１０Ａ、Ｑ１１Ｒ、Ｑ１３Ｒ、Ｅ１５Ｋ、Ｎ２６Ｄ、Ｎ２９Ｓ、Ｎ３０Ｓ、Ｎ３０Ｄ、Ｎ３０Ｔ、Ｙ３１Ｈ、Ｙ３１Ｃ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｔ３７Ｒ、Ｍ４６Ｌ、Ｋ４８Ｅ、Ｋ４９Ｒ、Ｋ４９Ｅ、Ｋ５４Ｒ、Ｅ６１Ｄ、Ｋ６４Ｒ、Ｅ６７Ｇ、Ｅ６８Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｔ、Ｎ７１Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ａ７３Ｖ、Ｑ７４Ｐ、Ｓ７５Ｐ、Ｋ７６Ｅ、Ｋ７６Ｒ、Ｈ７９Ｒ、Ｎ８８Ｄ、Ｉ８９Ｖ、Ｎ９０Ｈ、Ｉ９２Ｔ、Ｓ９９Ｐ、Ｔ１０１Ａ、Ｆ１０３Ｓ、Ｉ１１４Ｖ、Ｉ１２８Ｔ、Ｉ１２８Ａ、Ｔ１３３ＡまたはＴ１３３Ｎ。本発明者らの命名法は、野生型または基準配列の中のアミノ酸の一文字コードに続けて配列内でのその位置を書き、それに続けてそれを置き換えるアミノ酸の一文字コードを書くという科学文献の命名法と合致する。したがって、Ａ１Ｔは、位置１におけるアラニン残基のスレオニンによる置換を表す。本発明の範囲に入る他の変異ポリペプチドとしては、Ｖ６９（例えばＡ）及びＱ７４（例えばＰ）における置換を有する配列番号２の変異体を含むものが挙げられる。例えば、アミノ酸配列は、配列番号２に関する以下の変異の組のうちの１つを含み得る：（ａ）Ｋ６４Ｒ、Ｖ６９Ａ及びＱ７４Ｐ、（ｂ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ及びＴ１０１Ａ、（ｃ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ及びＩ１２８Ｔ、（ｄ）Ｎ３０Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ及びＦ１０３Ｓ、（ｅ）Ｋ４９Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ａ７３Ｖ及びＫ７６Ｅ、（ｆ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｔ１０１Ａ及びＴ１３３Ｎ、（ｇ）Ｎ３０Ｓ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ及びＩ１２８Ａ、（ｈ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ及びＳ９９Ｐ、（ｉ）Ｎ３０Ｓ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ及びＩ１２８Ｔ、（ｊ）Ｋ９Ｔ、Ｑ１１Ｒ、Ｋ３５Ｒ、Ｖ６９Ａ及びＱ７４Ｐ、（ｋ）Ａ１Ｔ、Ｍ４６Ｌ、Ｋ４９Ｒ、Ｅ６１Ｄ、Ｖ６９Ａ及びＨ７９Ｒ、（ｌ）Ｋ４８Ｅ、Ｅ６８Ｄ、Ｎ７１Ｔ、Ｎ９０Ｈ、Ｆ１０３Ｓ及びＩ１１４Ｖ、（ｍ）Ｓ４Ｐ、Ｔ１０Ａ、Ｑ１１Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ及びＴ１３３Ａ、（ｎ）Ｅ１５Ｋ、Ｎ３０Ｓ Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ及びＩ９２Ｔ、（ｏ）Ｎ３０Ｓ、Ｅ６８Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｓ７５Ｐ、Ｋ７６Ｒ及びＮ９０Ｈ、（ｐ）Ｎ３０Ｓ、Ｙ３１Ｃ、Ｔ３７Ａ、Ｖ６９Ａ、Ａ７３Ｖ、Ｑ７４Ｐ、Ｈ７９Ｒ及びＩ１２８Ｔ、（ｑ）Ｎ２６Ｄ、Ｎ２９Ｓ、Ｎ３０Ｓ、Ｋ５４Ｒ、Ｅ６７Ｇ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ及びＩ９２Ｔ、（ｒ）Ｋ８Ｒ、Ｑ１３Ｒ、Ｎ２６Ｄ、Ｎ３０Ｔ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ及びＩ９２Ｔ、ならびに（ｓ）Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ及びＩ８９Ｖ。配列番号２はＵＳ７５６９２１５に開示されており、参照によりこれを、本明細書に使用され得る例示的なＩＬ－２ポリペプチド配列として本明細書に援用する。
上に記したとおり、本明細書に開示される変異ＩＬ－２ポリペプチドのいずれかは、記載されている配列を含み得、それらは、記載されておりそれ以外は配列番号１と同一である配列に限定もされ得る。さらには、本明細書に記載の変異ＩＬ－２ポリペプチドのいずれかは、任意選択的に位置１２５でのシステイン残基の別の残基（例えばセリン）による置換を含み得、及び／または任意選択的に配列番号１の位置１におけるアラニン残基の欠失を含み得る。
本明細書に開示される変異ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒαサブユニットに約２８ｎＭ未満（例えば約２５ｎＭ、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ、約５００ｐＭ未満または約１００ｐＭ未満）のＫｄで結合し得る。より具体的には、変異ＩＬ－２ポリペプチドは、１．０ｎＭ未満（例えば約０．８、０．６、０．４または０．２ｎＭ）の親和性平衡定数を有し得る。親和性は、ＩＬ－２ＲαサブユニットまたはＩＬ－２受容体複合体（例えば、細胞の表面に発現するかあるいは膜に結合している複合体）からの解離の相対速度としても表され得る。例えば、変異ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ポリペプチドまたはＩＬ－２系治療薬、例えばＩＬ－２＊に比べて低下した速度で例えばＩＬ－２Ｒαから解離し得る。あるいは、親和性は、例えばＩＬ－２Ｒが発現している細胞の表面にＩＬ－２＊ポリペプチドが存在し続ける時間または平均時間として特徴付けられ得る。例えば、ＩＬ－２＊ポリペプチドは、少なくとも約２、５、１０、５０、１００または２５０回（またはそれ以上）にわたって受容体上に存在し続け得る。
本開示の方法及び組成物のために使用され得る、それと一緒に使用され得る、その調製に使用され得る、またはその生成物である、材料、組成物及び成分が開示される。これら及び他の材料は本明細書に開示されており、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示されている場合にこれらの構成物の様々な個々の及び集合的な組合せ及び並べ替えの各々について具体的言及が明示的に開示されていないことがあっても各々が本明細書において具体的に企図され記載されていることは理解される。例えば、方法の開示及び記述がなされており、方法を含めて複数の分子に対してなされ得る複数の改変について記述されている場合、方法及び改変のありとあらゆる可能な組合せ及び並べ替えは、相反する具体的指示がない限り具体的に企図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも具体的に企図され開示される。この概念は、本開示の組成物を使用する方法の中のステップを含むがこれらに限定されない本開示の全ての態様に当てはまる。したがって、実施され得る様々な付加的ステップが存在する場合、これらの付加的ステップの各々が本開示の方法の任意の特定の方法ステップまたは方法ステップの組合せと共に実施され得ること、及びそのような組合せまたは組合せのサブセットが具体的に企図され、開示されているとみなされるべきであることが、理解される。
本明細書において引用される刊行物、及びその引用の対象となった材料は、これをもって参照によりそれらの全体が具体的に援用される。
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。本明細書に提供される一般的説明を考慮すれば、他の様々な実施形態が実施され得ることは理解される。
実施例１：ＥＬＩＳＡによる融合タンパク質中のＩＬ－２、ＩＬ－２ムテイン、ＩＬ－２Ｒα及びＩＬ－２Ｒγの検出
ＩＬ－２ムテインは、市販の抗体、例えば抗ＩＬ－２モノクローナル（ＪＥＳ６－１Ａ１２）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）によって検出される。モノクローナル抗体がサイトカインまたはムテインを認識するか否かを示すために陽性対照を使用する。ＩＬ－２Ｒα及びＩＬ－２Ｒγ鎖に対する抗体も使用する。９６ウェルプレートのウェルを、抗体（２．５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳでコーティングする。０．２％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含み５％の脱脂粉乳を含んだＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｍ－Ｔｗ）でウェルを遮断し、３７℃で１～２時間、融合タンパク質を添加する。洗浄後、抗ＩＬ－２ビオチン標識抗体、例えばＪＥＳ５Ｈ４（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加し、ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）を使用して結合を検出する。０．１ＭのシトレートｐＨ４．５及び０．０４％のＨ２Ｏ２の中に含まれたＯ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）５０μｌによってＥＬＩＳＡプレートを呈色させ、５０μｌ／ウェルの２ＮのＨ２ＳＯ４で停止させ、吸光度を４９０ｎｍで読み取った。
実施例２：ＭＭＰ９プロテアーゼによる融合タンパク質のプロテアーゼ切断
当業者であれば、タンパク質切断アッセイを構成する方法に精通しているであろう。１×ＰＢＳ ｐＨ７．４の中の１００ｕｇのタンパク質を１μｇの活性ＭＭＰ９（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＳＡＥ００７８－５０、またはＥｎｚｏカタログＢＭＬ－ＳＥ３６０）によって切断し、室温で最長１６時間にわたってインキュベートした。消化されたタンパク質を次に機能アッセイに使用するかまたは試験に先立って－８０℃で保存する。切断の程度をＳＤＳ ＰＡＧＥによって当技術分野でよく知られている方法を用いて追跡した。図１０、図１３、図１８Ａ、図１８Ｂ、図２４Ｂ、図２４Ｃ及び図２７Ａに示されるように、ＭＭＰ９プロテアーゼによる融合タンパク質の完全な切断がみられる。
実施例３：ＣＴＬＬ－２アッセイ
ＣＴＬＬ２細胞（ＡＴＣＣ）を、４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培養培地で作られた懸濁液にして５００，０００細胞／ウェルの濃度で播種し、７２時間にわたって３７℃及び５％ＣＯ２で組換えｈＩＬ２または活性化可能ｈＩＬ２の希釈系列によって刺激した。非切断型及び切断型活性化可能ｈＩＬ２の活性を試験した。切断型活性化可能ｈＩＬ２は活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成された。細胞活性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）発光ベース細胞生存能アッセイを用いて評価した。
実施例４：ＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒγキメラポリペプチドのプロテアーゼ切断は抗体及び生物活性ＩＬ－２ムテインへの到達可能性を高める
ＩＬ－２ムテイン融合タンパク質をプロテアーゼ、例えばＰＳＡによる切断の前後に生化学的に特性評価する。イムノブロット分析は、融合タンパク質がＰＳＡによって切断され得ること、及びＰＳＡによる試料の処理の後には抗ＩＬ－２抗体との反応性を有するおよそ２０ｋＤａの予測低分子量切断生成物の強度の増大があることを示すことになる。切断の度合いは、ＰＳＡの量及びインキュベーションの時間によって決まる。興味深いことに、融合タンパク質をＰＳＡ処理の前後にＥＬＩＳＡによって分析したところ、ＩＬ－２の見掛けの量がＰＳＡ切断後に増加することが見出された。この実験では、構築物に応じてこのサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検出されるＩＬ－２の見掛けの量におよそ２倍または４倍の増加があり、完全な融合タンパク質では抗体結合が部分的に妨害されることを示唆している。同じ試料のアリコートをＰＳＡ処理の後にも、ＩＬ－２を成長及び生存のために必要とするＣＴＬＬ－２細胞株を使用して分析するが、細胞の生存能は比色ＭＴＴアッセイを用いて確認され得る。このアッセイでは、上清を希釈すればするほどそれが含有する生物活性ＩＬ－２が多くなり、ＰＳＡ切断後に生物活性ＩＬ－２の量の増加がある。ＩＬ－２ムテイン増加の量は、ＰＳＡ切断後には抗ＩＬ－２抗体との反応性を有するおよそ２０ｋＤａの予測低分子量切断断片が増加すること、抗体到達可能性が向上すること、及び最も重要なことに生物活性ＩＬ－２ムテインの量が増加することを示唆することになる。
実施例５：プロテアーゼ活性化融合タンパク質の生体内送達は腫瘍成長の減少をもたらす
キメラポリペプチドを、それが生体内での生物学的作用を有する可能性があるか否かを判定するために試験する。これらの実験のために、腹腔内注射された腫瘍細胞が、網上にみられる一連の組織化された免疫凝集体である乳斑に速やかかつ優先的に結合してそこで最初に成長するシステム（Ｇｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６９：１７３９－５２（２００６））を使用する。このシステムは、融合タンパク質処置が腫瘍成長に与える影響を調べる簡便な方法を提供する、というのも、融合タンパク質は腹腔内に複数回送達され得、腫瘍成長は解離した網細胞を調べることによって分析され得るからである。これらの実験のために、試験管内でＭＭＰ２及びＭＭＰ９を両方とも発現させる急成長する腫瘍細胞株である結腸３８細胞株が使用され得る。網組織には通常、比較的少量のＭＭＰ２及びＭＭＰ９が発現するが、結腸３８腫瘍が網上に存在しているとＭＭＰレベルが上昇する。この腫瘍モデルを使用して、腫瘍成長に影響を与えるＩＬ－２ムテイン融合タンパク質の能力を調べる。結腸３８細胞を腹腔内注射し、１日間にわたって結合及び成長させ、その後、腹腔内に毎日、融合タンパク質によって処置する。７日目に動物を屠殺し、フローサイトメトリーを用いて及びコロニー形成アッセイによって網を腫瘍成長について調べる。
実施例６：ＣＤ２０を標的とする例示的な活性化可能ＩＬ２タンパク質の構築
活性化可能ＩＬ２ドメインの生成
腫瘍内または腫瘍細胞上に存在するＣＤ２０ポリペプチドに結合することができるＩＬ－２ポリペプチドを以下のとおりに生成する。（１）ＩＦＮγポリペプチド配列をコードする及び（２）１つ以上のポリペプチドリンカーをコードする核酸配列を含有する核酸を生成する。活性化可能インターロイキンプラスミド構築物は、任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓまたは他の親和性タグを有し得、ＨＥＫ２９３または他の好適なヒトもしくは哺乳動物細胞株の中に電気穿孔で導入され、精製される。検証アッセイは、プロテアーゼの存在下でＩＦＮγ刺激に対する応答姓を有するＴ細胞を使用するＴ細胞活性化アッセイを含む。
ｓｃＦｖ ＣＤ２０結合ドメインの生成
ＣＤ２０は、Ｂリンパ球上に存在する細胞表面タンパク質の１つである。ＣＤ２０抗原は、正常な及び悪性の前駆Ｂ及び成熟Ｂリンパ球、例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％超に存在するものにみられる。当該抗原は、造血幹細胞、活性化Ｂリンパ球（形質細胞）及び正常組織には存在しない。このため、大半がマウス由来のものであるいくつかの抗体について記載がなされている：１Ｆ５、２Ｂ８／Ｃ２Ｂ８、２Ｈ７及び１Ｈ４。
したがって、ヒトまたはヒト化抗ＣＤ２０抗体を使用して活性化可能インターロイキンタンパク質のＣＤ２０結合ドメインのためのｓｃＦｖを生成する。ヒトまたはヒト化ＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を得、構築物のためのコドンを任意選択的にホモサピエンスからの細胞における発現のために最適化する。ＶＬ及びＶＨドメインがｓｃＦｖ中に出現する順序は様々であり（つまり、ＶＬ－ＶＨ、またはＶＨ－ＶＬの配向）、「Ｇ４Ｓ」（配列番号４４９）または「Ｇ４Ｓ」（配列番号４４９）サブユニットの３つのコピー（Ｇ４Ｓ）３（配列番号４５２）が可変ドメインを連結してｓｃＦｖドメインを作り出す。抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖプラスミド構築物は任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓまたは他の親和性タグを有し得、ＨＥＫ２９３または他の好適なヒトもしくは哺乳動物細胞株の中に電気穿孔で導入され、精製される。検証アッセイは、ＦＡＣＳによる結合性分析、Ｐｒｏｔｅｏｎを使用する速度論解析、及びＣＤ２０発現細胞の染色を含む。
活性化可能ＩＬ２タンパク質をコードするＤＮＡ発現構築物のクローニング
プロテアーゼ切断部位ドメインを有する活性化可能ＩＬ２構築物を抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖドメイン及び血清中半減期延長要素（例えばＨＳＡ結合性ペプチドまたはＶＨドメイン）と組み合わせて使用して活性化可能インターロイキンタンパク質を構築する。ＣＨＯ細胞における活性化可能インターロイキンタンパク質の発現のために、全てのタンパク質ドメインのコード配列を哺乳動物発現ベクターシステムの中にクローニングする。手短に述べると、活性化可能インターロイキンドメイン、血清中半減期延長要素及びＣＤ２０結合性ドメイン、ならびにペプチドリンカーＬ１及びＬ２をコードする遺伝子配列を別々に合成し、サブクローニングする。得られた構築物をその後、ＣＤ２０結合ドメイン－Ｌ１－ＩＬ２サブユニット１－Ｌ２－プロテアーゼ切断ドメイン－Ｌ３－ＩＬ２サブユニット２－Ｌ４－抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ－Ｌ５－血清中半減期延長要素の順で接合して最終構築物を得る。全ての発現構築物は、タンパク質分泌及び精製を容易にするためにそれぞれＮ末端シグナルペプチド及びＣ末端ヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）タグ（配列番号３５４）のコード配列を含有するように設計される。
安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞における活性化可能ＩＬ２タンパク質の発現
ＣＨＯ－Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）（Ｋａｏ ａｎｄ Ｐｕｃｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９６８；６０（４）：１２７５－８１）の派生物であるＣＨＯ細胞発現システム（Ｆｌｐ－Ｉｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する。接着細胞を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって提供される標準的細胞培養プロトコールに従って継代する。
懸濁液中での成長に適合させるために細胞を組織培養フラスコから剥離させ、無血清培地に入れる。１０％のＤＭＳＯを含む培地の中で懸濁液適合型細胞を凍結保存する。
分泌型活性化可能インターロイキンタンパク質が安定的に発現する組換えＣＨＯ細胞株を、懸濁液適合型細胞のトランスフェクションによって生成する。抗生物質ヒグロマイシンＢによる選択の間、生細胞密度を週に２回測定し、細胞を遠心分離し、新鮮な選択培地に０．１×１０６生細胞／ｍＬの最大密度で再懸濁させる。活性化可能インターロイキンタンパク質が安定的に発現する細胞プールを２～３週間の選択の後に回収し、その時点で細胞を振盪フラスコ内の標準培養培地に移す。組換え分泌型タンパク質の発現は、タンパク質ゲル電気泳動またはフローサイトメトリーを実施することによって確認される。安定した細胞プールをＤＭＳＯ含有培地中で凍結保存する。
活性化可能ＩＬ２タンパク質は、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株の１０日間の流加培養において細胞培養物上清中への分泌によって生成される。１０日後、典型的には培養物生存能が７５％超であるときに、細胞培養物上清を採集する。１日おきに生産培養物から試料を回収し、細胞密度及び生存能を評価する。採集の日に細胞培養物上清をさらなる使用の前に遠心分離及び真空濾過によって清澄化する。
細胞培養物上清におけるタンパク質発現力価及び生成物完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析する。
活性化可能ＩＬ２タンパク質の精製
活性化可能ＩＬ２タンパク質をＣＨＯ細胞培養物上清から２ステップの手順で精製する。第１ステップにおいて構築物を親和性クロマトグラフィーに供し、続いて第２ステップにおいてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００での分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供する。試料の緩衝液交換を行い、限外濾過によって濃縮して１ｍｇ／ｍＬ超の典型的な濃度にする。最終試料の純度及び均一性（典型的には９０％超）を、還元及び非還元条件下でのＳＤＳ ＰＡＧＥとそれに続く抗ＨＳＡまたは抗イディオタイプ抗体を使用するイムノブロッティングによって、及び分析的ＳＥＣによってそれぞれ評価する。精製されたタンパク質をアリコートにして使用時まで－８０℃で保存する。
実施例７：フローサイトメトリーによる抗原親和性の決定
実施例６の活性化可能インターロイキンタンパク質を、ヒトＣＤ２０＋細胞及びカニクイザルＣＤ２０＋細胞に対するその結合親和性について試験する。
ＣＤ２０＋細胞を実施例１の活性化可能インターロイキンタンパク質の１００μＬの段階希釈液及び少なくとも１つのプロテアーゼとインキュベートする。ＦＡＣＳ用緩衝液で３回洗浄した後、細胞を氷上で４５分間、１０μｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体を含む同じ緩衝液０．１ｍＬとインキュベートする。２回目の洗浄サイクルの後、先と同じ条件下で細胞を１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体０．１ｍＬとインキュベートする。対照として、細胞を抗Ｈｉｓ ＩｇＧとインキュベートし、続いて、活性化可能ＩＬ２タンパク質なしでＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とインキュベートする。その後、死細胞を除去するために細胞を再び洗浄し、２μｇ／ｍＬのプロピジウムヨージド（ＰＩ）を含有するＦＡＣＳ用緩衝液０．２ｍＬの中に再懸濁させた。ＭＸＰソフトウェアを使用するＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００ ＭＰＬフローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはＩｎｃｙｔｅソフトウェアを使用するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメータ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、１×１０４個の生存細胞の蛍光を測定する。ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、またはＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して細胞試料の平均蛍光強度を算出する。二次及び三次試薬のみで染色した細胞の蛍光強度値を差し引いた後、値を今度はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ウィンドウズ（登録商標）用バージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）の１部位結合のための等式（双曲線）によるＫＤ値の算出のために使用する。
ＣＤ２０結合性及び交差反応性をヒトＣＤ２０＋腫瘍細胞株において評価する。組換えヒトまたは組換えカニクイザル抗原のどちらかが発現するＣＨＯ細胞株について決定されたＫＤ値を使用して交差反応性のＫＤ比を算出する。
実施例８：細胞毒性アッセイ
実施例６の活性化可能インターロイキンタンパク質を、ＣＤ２０＋標的細胞に対する免疫応答のその媒介に関して試験管内で評価する。
蛍光標識ＣＤ２０＋ＲＥＣ－１細胞（マントル細胞リンパ腫細胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３００４）を、実施例５の活性化可能ＩＬ２タンパク質及び少なくとも１つのプロテアーゼの存在下で、エフェクター細胞としての無作為ドナーの単離ＰＢＭＣまたはＣＢ１５ Ｔ細胞（標準的なＴ細胞株）とインキュベートする。加湿インキュベータ内で、３７℃で４時間インキュベートした後、標的細胞から上清中への蛍光色素の遊離を分光蛍光光度計で判定する。実施例１の活性化可能ＩＬ２タンパク質なしでインキュベートした標的細胞、及びインキュベーションの最後にサポニンの添加によって完全に溶解させた標的細胞はそれぞれ陰性及び陽性対照としての役割を果たす。
測定された残存する生存標的細胞を基準として特異的細胞溶解の百分率を以下の式に従って算出する：［１－（生存標的数（試料）／生存標的数（自発的））］×１００％。シグモイド用量応答曲線及びＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用する非線形回帰／４係数ロジスティック近似によって算出する。所与の抗体濃度について得られた溶解値を使用してシグモイド用量応答曲線を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用する４係数ロジスティック近似解析によって算出する。
実施例９：活性化可能インターロイキンタンパク質の薬物動態
実施例６の活性化可能インターロイキンタンパク質を動物試験において消失半減期について評価する。
活性化可能ＩＬ２タンパク質を伏在静脈内への０．５ｍｇ／ｋｇのボーラス注射としてカニクイザルに投与する。別のカニクイザル群には同程度の大きさを有するが血清中半減期延長要素を欠くＩＬ２構築物を与える。第３及び第４群にはそれぞれ、血清中半減期延長要素を有するＩＬ２構築物、ならびにＣＤ２０及び血清中半減期延長要素を有するサイトカインを与えるが、どちらも大きさが活性化可能インターロイキンタンパク質と同程度のものである。各試験群は５匹のサルからなる。示された時間点において血清試料を採取し、段階希釈し、ＣＤ２０に対する結合ＥＬＩＳＡを用いてタンパク質の濃度を決定する。
試験品の血漿中濃度を使用して薬物動態分析を実施する。各試験品についての群平均血漿データは、投薬後時間に対してプロットすると多指数関数的プロファイルに従う。データを、ボーラス投入ならびに分配段階及び消失段階の一次速度定数を有する標準的な二成分モデルで近似する。静脈内投与のためのデータの最良近似のための一般的な等式は、ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔであり、式中、ｃ（ｔ）は時間ｔでの血漿中濃度であり、Ａ及びＢはＹ軸上の切片であり、α及びβはそれぞれ分配段階及び消失段階の見掛けの一次速度定数である。α段階はクリアランスの初期段階であり、動物の細胞外流体中へのタンパク質の分配を反映する一方、減衰曲線の第２またはβ段階部分は真の血漿クリアランスを表す。そのような等式を近似するための方法は当技術分野でよく知られている。例えば、Ｖ＝分配の体積、ｋ１０＝消失速度、ｋ１２＝区画１から区画２までの移行速度、及びｋ２１＝区画２から区画１への移行速度、ならびにＤ＝投与された用量、という推定パラメータを使用して、Ａ＝Ｄ／Ｖ（α－ｋ２１）／（α－β）、Ｂ＝Ｄ／Ｖ（β－ｋ２１）／（α－β）であり、α及びβ（α＞βの場合）は二次方程式ｒ２＋（ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０）ｒ＋ｋ２１ｋ１０＝０の根である。
データ解析：濃度対時間プロファイルのグラフはＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（商標）Ｖ．３．０９ Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９８６－１９９７．Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｐａ．）を使用して作られる。報告可能未満（ＬＴＲ）として報告された値はＰＫ解析に含めず、グラフに表されない。薬物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｖ．３．１ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９８－１９９９．Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）を使用する区画解析によって決定される。薬物動態パラメータは、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ Ｗ Ａ ａｎｄ Ｋｅａｒｎｓ Ｇ Ｌ，１９９９，ＩＮ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に記載されているように計算される。
実施例５の活性化可能インターロイキンタンパク質は、血清中半減期延長要素を欠くタンパク質に比べて改善された薬物動態パラメータ、例えば消失半減期の増加を有することが予期される。
実施例１０：異種移植腫瘍モデル
実施例６の活性化可能ＩＬ２タンパク質を異種移植モデルにおいて評価する。
雌性免疫不全ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスを亜致死的に放射線照射し（２Ｇｙ）、右背側脇腹に４×１０６個のラモスＲＡ１細胞を皮下接種する。腫瘍が１００～２００ｍｍ３に達した時に動物を３つの処置群に割り当てる。群２及び群３（各々８匹の動物）には１．５×１０７個の活性化ヒトＴ細胞を腹腔内注射する。３日後に群３からの動物を今度は合計９回の５０μｇの実施例１の活性化可能インターロイキンタンパク質の静脈内用量で処置する（１日１回×９日間）。群１及び群２をビヒクルのみで処置する。体重及び腫瘍体積の決定を３０日間行う。
実施例５の活性化可能インターロイキンタンパク質で処置した動物は、それぞれのビヒクル処置対照群と比較して腫瘍成長が統計的に有意に遅れることが予期される。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し記載してきたが、そのような実施形態が例として提供されているにすぎないことは当業者には明らかであろう。いまや当業者は本発明から逸脱することなく多数の変形形態、変更及び置換を考え付くであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替形態が本発明の実施に採用され得ることは理解されるべきである。以下の特許請求の範囲によって本発明の範囲を画定すること、ならびにこの特許請求の範囲に入る方法及び構造、ならびにそれらの均等物をそれによって包含することを意図する。
実施例１１：マウスＩＦＮγ ＷＥＨＩ細胞生存アッセイ
１．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培養培地の中に懸濁したＷＥＨＩ２７９細胞（ＡＴＣＣ）を２５，０００細胞／ウェルの濃度で播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で７２時間にわたって組換えｍＩＦＮγまたは誘導可能ｍＩＦＮγの希釈系列で刺激した。非切断型及び切断型誘導可能ｍＩＦＮγの活性を試験した。切断型誘導可能ｍＩＦＮｇは活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成された。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）発光ベース細胞生存能アッセイを用いて細胞生存を評価した。切断型誘導可能ｍＩＦＮｇ分子のＥＣ５０値は非切断型誘導可能ｍＩＦＮｇ分子よりも少なくとも１００倍強力であった。図１６Ａ～図１６Ｆに示すように、培養培地がヒト血清アルブミンを含有していたアッセイではより大きな誘導性がみられた。
実施例１２：マウスＩＦＮγ Ｂ１６レポーター及びマウスＩＦＮα／β Ｂ１６レポーター細胞アッセイ
１．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培養培地の中に含まれたＢ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮγ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を７５，０００細胞／ウェルの濃度で播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間にわたって組換えｍＩＦＮγまたは誘導可能ｍＩＦＮγの希釈系列で刺激した。非切断型及び切断型誘導可能ｍＩＦＮγの活性を試験した。切断型誘導可能ｍＩＦＮγは活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成された。上清を採取し、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）の添加、３７℃で２時間にわたるインキュベーション、及び６２０ｎｍでの吸光度の測定によってＳＥＡＰ活性化を評価した。結果を図１７Ａ～図１７Ｆ、図１９Ａ、図１９Ｂ、図２２Ａ、図２２Ｂ、図２３Ａ、図２３Ｂ、及び図２８Ａ～図２８Ｎに示す。この実験を、Ｂ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮα／β細胞を使用してＩＦＮα融合タンパク質について繰り返した。切断型誘導可能ｍＩＦＮα分子のＥＣ５０値は、非切断型誘導可能ｍＩＦＮα分子よりも少なくとも１００倍強力であった。
１５ｍｇ／ｍｌのマウス血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培養培地の中に懸濁したＢ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／β細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を７５，０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で２０～２４時間にわたって組換えマウスＩＦＮα（またはＩＦＮβ）及び活性化可能マウスＩＦＮα（またはＩＦＮβ）の希釈系列で刺激した。非切断型及び切断型活性化可能ＩＦＮα（またはＩＦＮβ）の活性を試験した。切断型誘導可能ＩＦＮα（またはＩＦＮβ）は活性組換えプロテアーゼとのインキュベーションによって生成された。ＩＦＮα（またはＩＦＮβ）によるＢ１６－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／β細胞の刺激は、ＩＳＲＥ－ＩＳＧ５４－ＳＥＡＰレポーターからの分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現を誘導する。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、比色ベースアッセイを用いてＳＥＡＰ活性の定量によってＩＦＮα（またはＩＦＮβ）活性を評価した。結果を図１０Ａ～１０Ｊに示す。
実施例１３．プロテアーゼ活性化融合タンパク質の生体内送達は腫瘍成長の減少をもたらす
キメラポリペプチドを、それが生体内での生物学的作用を有する可能性があるか否かを判定するために試験する。これらの実験のために、腹腔内注射された腫瘍細胞が、網上にみられる一連の組織化された免疫凝集体である乳斑に速やかかつ優先的に結合してそこで最初に成長するシステム（Ｇｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６９：１７３９－５２（２００６））を使用する。このシステムは、融合タンパク質処置が腫瘍成長に与える影響を調べる簡便な方法を提供する、というのも、融合タンパク質は腹腔内に複数回送達され得、腫瘍成長は解離した網細胞を調べることによって分析され得るからである。これらの実験のために、試験管内でＭＭＰ２及びＭＭＰ９を両方とも発現させる急成長する腫瘍細胞株である結腸３８細胞株が使用され得る。網組織には通常、比較的少量のＭＭＰ２及びＭＭＰ９が発現するが、結腸３８腫瘍が網上に存在しているとＭＭＰレベルが上昇する。この腫瘍モデルを使用して、腫瘍成長に影響を与えるＩＦＮ融合タンパク質の能力を調べる。結腸３８細胞を腹腔内注射し、１日間にわたって結合及び成長させ、その後、腹腔内に毎日、融合タンパク質によって処置する。７日目に動物を屠殺し、フローサイトメトリーを用いて及びコロニー形成アッセイによって網を腫瘍成長について調べる。
実施例１３ｂ：キメラポリペプチドを試験して生体内でのその生物学的影響を判定した。
試験管内でＭＭＰ９を発現させる急成長する結腸腺癌細胞株であるＭＣ３８細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、腫瘍成長に影響を与えるＩＦＮγ融合タンパク質の能力を調べた。ＭＣ３８細胞を腹腔内注射し、１０～１４日間にわたって成長させ、その後、腹腔内に週２回、図２１Ａ～図２１Ｃに示されるレベルで合計４用量にわたって融合タンパク質によって処理した。対照薬として野生型ｍＩＦＮγを示されている用量レベルで２週間にわたって１日２回を５日間／休止を２日間のスケジュールで投与した（合計１０用量）。腫瘍成長及び体重を２週間にわたって週におよそ２回追跡評価した。
実施例１４：ＣＤ２０を標的とする例示的なＩＦＮγタンパク質の構築
活性化可能サイトカインドメインの生成
腫瘍内または腫瘍細胞上に存在するＣＤ２０ポリペプチドに結合することができるＩＦＮγポリペプチドを以下のとおりに生成する。（１）ＩＦＮγポリペプチド配列をコードする及び（２）１つ以上のポリペプチドリンカーをコードする核酸配列を含有する核酸を生成する。活性化可能ＩＦＮγプラスミド構築物は、任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓまたは他の親和性タグを有し得、ＨＥＫ２９３または他の好適なヒトもしくは哺乳動物細胞株の中に電気穿孔で導入され、精製される。検証アッセイは、プロテアーゼの存在下でＩＦＮγ刺激に対する応答姓を有するＴ細胞を使用するＴ細胞活性化アッセイを含む。
ｓｃＦｖ ＣＤ２０結合ドメインの生成
ＣＤ２０は、Ｂリンパ球上に存在する細胞表面タンパク質の１つである。ＣＤ２０抗原は、正常な及び悪性の前駆Ｂ及び成熟Ｂリンパ球、例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％超に存在するものにみられる。当該抗原は、造血幹細胞、活性化Ｂリンパ球（形質細胞）及び正常組織には存在しない。このため、大半がマウス由来のものであるいくつかの抗体について記載がなされている：１Ｆ５、２Ｂ８／Ｃ２Ｂ８、２Ｈ７及び１Ｈ４。
したがって、ヒトまたはヒト化抗ＣＤ２０抗体を使用して活性化可能ＩＦＮγタンパク質のＣＤ２０結合ドメインのためのｓｃＦｖを生成する。ヒトまたはヒト化ＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を得、構築物のためのコドンを任意選択的にホモサピエンスからの細胞における発現のために最適化する。ＶＬ及びＶＨドメインがｓｃＦｖ中に出現する順序は様々であり（つまり、ＶＬ－ＶＨ、またはＶＨ－ＶＬの配向）、「Ｇ４Ｓ」（配列番号４４９）または「Ｇ４Ｓ」（配列番号４４９）サブユニットの３つのコピー（Ｇ４Ｓ）３（配列番号４５２）が可変ドメインを連結してｓｃＦｖドメインを作り出す。抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖプラスミド構築物は任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓまたは他の親和性タグを有し得、ＨＥＫ２９３または他の好適なヒトもしくは哺乳動物細胞株の中に電気穿孔で導入され、精製される。検証アッセイは、ＦＡＣＳによる結合性分析、Ｐｒｏｔｅｏｎを使用する速度論解析、及びＣＤ２０発現細胞の染色を含む。
活性化可能ＩＦＮγタンパク質をコードするＤＮＡ発現構築物のクローニング
プロテアーゼ切断部位ドメインを有する活性化可能ＩＦＮγ構築物を抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖドメイン及び血清中半減期延長要素（例えばＨＳＡ結合性ペプチドまたはＶＨドメイン）と組み合わせて使用して、組織化されたドメインを有する活性化可能ＩＦＮγタンパク質を構築する。ＣＨＯ細胞における活性化可能ＩＦＮγタンパク質の発現のために、全てのタンパク質ドメインのコード配列を哺乳動物発現ベクターシステムの中にクローニングする。手短に述べると、活性化可能ＩＦＮγドメイン、血清中半減期延長要素及びＣＤ２０結合性ドメイン、ならびにペプチドリンカーＬ１及びＬ２をコードする遺伝子配列を別々に合成し、サブクローニングする。得られた構築物をその後、ＣＤ２０結合ドメイン－Ｌ１－ＩＦＮγサブユニット１－Ｌ２－プロテアーゼ切断ドメイン－Ｌ３－ＩＦＮγサブユニット２－Ｌ４－抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ－Ｌ５－血清中半減期延長要素の順で接合して最終構築物を得る。全ての発現構築物は、タンパク質分泌及び精製を容易にするためにそれぞれＮ末端シグナルペプチド及びＣ末端ヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）タグ（配列番号３５４）のコード配列を含有するように設計される。
安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞における活性化可能ＩＦＮγタンパク質の発現
ＣＨＯ－Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）（Ｋａｏ ａｎｄ Ｐｕｃｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９６８；６０（４）：１２７５－８１）の派生物であるＣＨＯ細胞発現システム（Ｆｌｐ－Ｉｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する。接着細胞を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって提供される標準的細胞培養プロトコールに従って継代する。
懸濁液中での成長に適合させるために細胞を組織培養フラスコから剥離させ、無血清培地に入れる。１０％のＤＭＳＯを含む培地の中で懸濁液適合型細胞を凍結保存する。
分泌型活性化可能ＩＦＮγタンパク質が安定的に発現する組換えＣＨＯ細胞株を、懸濁液適合型細胞のトランスフェクションによって生成する。抗生物質ヒグロマイシンＢによる選択の間、生細胞密度を週に２回測定し、細胞を遠心分離し、新鮮な選択培地に０．１×１０６生細胞／ｍＬの最大密度で再懸濁させる。活性化可能ＩＦＮγタンパク質が安定的に発現する細胞プールを２～３週間の選択の後に回収し、その時点で細胞を振盪フラスコ内の標準培養培地に移す。組換え分泌型タンパク質の発現は、タンパク質ゲル電気泳動またはフローサイトメトリーを実施することによって確認される。安定した細胞プールをＤＭＳＯ含有培地中で凍結保存する。
活性化可能ＩＦＮγタンパク質は、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株の１０日間の流加培養において細胞培養物上清中への分泌によって生成される。１０日後、典型的には培養物生存能が７５％超であるときに、細胞培養物上清を採集する。１日おきに生産培養物から試料を回収し、細胞密度及び生存能を評価する。採集の日に細胞培養物上清をさらなる使用の前に遠心分離及び真空濾過によって清澄化する。
細胞培養物上清におけるタンパク質発現力価及び生成物完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析する。
活性化可能ＩＦＮγタンパク質の精製
活性化可能ＩＦＮγタンパク質をＣＨＯ細胞培養物上清から２ステップの手順で精製する。第１ステップにおいて構築物を親和性クロマトグラフィーに供し、続いて第２ステップにおいてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００での分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供する。試料の緩衝液交換を行い、限外濾過によって濃縮して１ｍｇ／ｍＬ超の典型的な濃度にする。最終試料の純度及び均一性（典型的には９０％超）を、還元及び非還元条件下でのＳＤＳ ＰＡＧＥとそれに続く抗ＨＳＡまたは抗イディオタイプ抗体を使用するイムノブロッティングによって、及び分析的ＳＥＣによってそれぞれ評価する。精製されたタンパク質をアリコートにして使用時まで－８０℃で保存する。
実施例１５：フローサイトメトリーによる抗原親和性の決定
実施例１の活性化可能ＩＦＮγタンパク質を、ヒトＣＤ２０＋細胞及びカニクイザルＣＤ２０＋細胞に対するその結合親和性について試験する。
ＣＤ２０＋細胞を実施例１の活性化可能ＩＦＮγタンパク質の１００μＬの段階希釈液及び少なくとも１つのプロテアーゼとインキュベートする。ＦＡＣＳ用緩衝液で３回洗浄した後、細胞を氷上で４５分間、１０μｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体を含む同じ緩衝液０．１ｍＬとインキュベートする。２回目の洗浄サイクルの後、先と同じ条件下で細胞を１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体０．１ｍＬとインキュベートする。対照として、細胞を抗Ｈｉｓ ＩｇＧとインキュベートし、続いて、活性化可能ＩＦＮγタンパク質なしでＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とインキュベートする。その後、死細胞を除去するために細胞を再び洗浄し、２μｇ／ｍＬのプロピジウムヨージド（ＰＩ）を含有するＦＡＣＳ用緩衝液０．２ｍＬの中に再懸濁させた。ＭＸＰソフトウェアを使用するＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００ ＭＰＬフローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはＩｎｃｙｔｅソフトウェアを使用するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメータ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、１×１０４個の生存細胞の蛍光を測定する。ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、またはＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して細胞試料の平均蛍光強度を算出する。二次及び三次試薬のみで染色した細胞の蛍光強度値を差し引いた後、値を今度はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ウィンドウズ（登録商標）用バージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）の１部位結合のための等式（双曲線）によるＫＤ値の算出のために使用する。
ＣＤ２０結合性及び交差反応性をヒトＣＤ２０＋腫瘍細胞株において評価する。組換えヒトまたは組換えカニクイザル抗原かのどちらかが発現するＣＨＯ細胞株について決定されたＫＤ値を使用して交差反応性のＫＤ比を算出する。
実施例１６：細胞毒性アッセイ
実施例５の活性化可能ＩＦＮγタンパク質を、ＣＤ２０＋標的細胞に対する免疫応答のその媒介に関して試験管内で評価する。
蛍光標識ＣＤ２０＋ＲＥＣ－１細胞（マントル細胞リンパ腫細胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３００４）を、実施例５の活性化可能ＩＦＮγタンパク質及び少なくとも１つのプロテアーゼの存在下で、エフェクター細胞としての無作為ドナーの単離ＰＢＭＣまたはＣＢ１５ Ｔ細胞（標準的なＴ細胞株）とインキュベートする。加湿インキュベータ内で、３７℃で４時間インキュベートした後、標的細胞から上清中への蛍光色素の遊離を分光蛍光光度計で判定する。実施例５の活性化可能ＩＦＮγタンパク質なしでインキュベートした標的細胞、及びインキュベーションの最後にサポニンの添加によって完全に溶解させた標的細胞はそれぞれ陰性及び陽性対照としての役割を果たす。
測定された残存する生存標的細胞を基準として特異的細胞溶解の百分率を以下の式に従って算出する：［１－（生存標的数（試料）／生存標的数（自発的））］×１００％。シグモイド用量応答曲線及びＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用する非線形回帰／４係数ロジスティック近似によって算出する。所与の抗体濃度について得られた溶解値を使用してシグモイド用量応答曲線を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用する４係数ロジスティック近似解析によって算出する。
実施例１７：活性化可能ＩＦＮγタンパク質の薬物動態
実施例５の活性化可能ＩＦＮγタンパク質を動物試験において消失半減期について評価する。
活性化可能ＩＦＮγタンパク質を伏在静脈内への０．５ｍｇ／ｋｇのボーラス注射としてカニクイザルに投与する。別のカニクイザル群には同程度の大きさを有するが血清中半減期延長要素を欠くサイトカインを与える。第３及び第４群にはそれぞれ、血清中半減期延長要素を有するサイトカイン、ならびにＣＤ２０及び血清中半減期延長要素を有するサイトカインを与えるが、どちらも大きさが活性化可能ＩＦＮγタンパク質と同程度のものである。各試験群は５匹のサルからなる。示された時間点において血清試料を採取し、段階希釈し、ＣＤ２０に対する結合ＥＬＩＳＡを用いてタンパク質の濃度を決定する。
試験品の血漿中濃度を使用して薬物動態分析を実施する。各試験品についての群平均血漿データは、投薬後時間に対してプロットすると多指数関数的プロファイルに従う。データを、ボーラス投入ならびに分配段階及び消失段階の一次速度定数を有する標準的な二成分モデルで近似する。静脈内投与のためのデータの最良近似のための一般的な等式は、ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔであり、式中、ｃ（ｔ）は時間ｔでの血漿中濃度であり、Ａ及びＢはＹ軸上の切片であり、α及びβはそれぞれ分配段階及び消失段階の見掛けの一次速度定数である。α段階はクリアランスの初期段階であり、動物の細胞外流体中へのタンパク質の分配を反映する一方、減衰曲線の第２またはβ段階部分は真の血漿クリアランスを表す。そのような等式を近似するための方法は当技術分野でよく知られている。例えば、Ｖ＝分配の体積、ｋ１０＝消失速度、ｋ１２＝区画１から区画２までの移行速度、及びｋ２１＝区画２から区画１への移行速度、ならびにＤ＝投与された用量、という推定パラメータを使用して、Ａ＝Ｄ／Ｖ（α－ｋ２１）／（α－β）、Ｂ＝Ｄ／Ｖ（β－ｋ２１）／（α－β）であり、α及びβ（α＞βの場合）は二次方程式ｒ２＋（ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０）ｒ＋ｋ２１ｋ１０＝０の根である。
データ解析：濃度対時間プロファイルのグラフはＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（商標）Ｖ．３．０９ Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９８６－１９９７．Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｐａ．）を使用して作られる。報告可能未満（ＬＴＲ）として報告された値はＰＫ解析に含めず、グラフに表されない。薬物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｖ．３．１ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９８－１９９９．Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）を使用する区画解析によって決定される。薬物動態パラメータは、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ Ｗ Ａ ａｎｄ Ｋｅａｒｎｓ Ｇ Ｌ，１９９９，ＩＮ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に記載されているように計算される。
実施例５の活性化可能ＩＦＮγタンパク質は、血清中半減期延長要素を欠くタンパク質に比べて改善された薬物動態パラメータ、例えば消失半減期の増加を有することが予期される。
実施例１８：異種移植腫瘍モデル
実施例５の活性化可能ＩＦＮγタンパク質を異種移植モデルにおいて評価する。
雌性免疫不全ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスを亜致死的に放射線照射し（２Ｇｙ）、右背側脇腹に４×１０６個のラモスＲＡ１細胞を皮下接種する。腫瘍が１００～２００ｍｍ３に達した時に動物を３つの処置群に割り当てる。群２及び群３（各々８匹の動物）には１．５×１０７個の活性化ヒトＴ細胞を腹腔内注射する。３日後に群３からの動物を今度は合計９回の５０μｇの実施例５の活性化可能ＩＦＮγタンパク質の静脈内用量で処置する（１日１回×９日間）。群１及び群２をビヒクルのみで処置する。体重及び腫瘍体積の決定を３０日間行う。
実施例５の活性化可能ＩＦＮγタンパク質で処置した動物は、それぞれのビヒクル処置対照群と比較して腫瘍成長が統計的に有意に遅れることが予期される。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し記載してきたが、そのような実施形態が例として提供されているにすぎないことは当業者には明らかであろう。いまや当業者は本発明から逸脱することなく多数の変形形態、変更及び置換を考え付くであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替形態が本発明の実施に採用され得ることは理解されるべきである。以下の特許請求の範囲によって本発明の範囲を画定すること、ならびにこの特許請求の範囲に入る方法及び構造、ならびにそれらの均等物をそれによって包含することを意図する。
実施例１９：ＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイ
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ１２細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、１５または４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培養培地の中に懸濁させて５０，０００細胞／ウェルの濃度で播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で２０～２４時間にわたって組換えｈＩＬ１２、キメラＩＬ１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または活性化可能ｈＩＬ１２の希釈系列で刺激した。非切断型及び切断型活性化可能ｈＩＬ１２の活性を試験した。切断型誘導可能ｈＩＬ１２は活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成された。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、比色ベースアッセイを用いた分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量によってＩＬ１２活性を評価した。結果を図７Ａ～図７Ｑ、図１１Ａ～図１１Ｂ、図１２Ａ～図１２Ｆ、図１５Ａ～図１５Ｄ及び図２６Ａ～図２６Ｄに示す。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ２細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、１５～４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培養培地の中に懸濁させて５０，０００細胞／ウェルの濃度で播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間にわたって組換えｈＩＬ１２または活性化可能ｈＩＬ１２の希釈系列で刺激した。非切断型及び切断型活性化可能ｈＩＬ１２の活性を試験した。切断型誘導可能ｈＩＬ１２は活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成された。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、比色ベースアッセイを用いた分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量によってＩＬ１２活性を評価した。結果を図１Ａ～図１Ｆ及び図２４Ａ～図２４Ｄに示す。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－ａ／ｂ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、１５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培養培地の中に懸濁させて５０，０００細胞／ウェルの濃度で播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で２０～２４時間にわたって組換えヒトＩＦＮａ（またはＩＦＮｂ）及び活性化可能ヒトＩＦＮａ（またはＩＦＮｂ）の希釈系列で刺激した。非切断型及び切断型活性化可能ＩＦＮａ（またはＩＦＮｂ）の活性を試験した。切断型誘導可能ＩＦＮａ（またはＩＦＮｂ）は活性組換えプロテアーゼとのインキュベーションによって生成された。ＩＦＮα（またはＩＦＮβ）によるＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／β細胞の刺激はＩＳＧ５４－ＳＥＡＰ受容体からの分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現を誘導する。試薬ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、比色ベースアッセイを用いたＳＥＡＰ活性の定量によってＩＦＮα（またはＩＦＮβ）活性を評価した。結果を図３６Ａ～図３６Ｈに示す。
実施例２０：脾細胞Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイ
マウス脾細胞からＰＨＡとの６日間のインキュベーション及び組換えｈＩＬ１２との２４時間のインキュベーションによってＴ－Ｂｌａｓｔを誘導した。Ｔｂｌａｓｔをその後、４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培養培地の中に懸濁させて２００，０００細胞／ウェルの濃度で播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で７２時間にわたって組換えｈＩＬ１２またはキメラＩＬ１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）またはマウスＩＬ１２の希釈系列で刺激した。非切断型及び切断型ＩＬ１２融合タンパク質の活性を試験した。切断型誘導可能ｈＩＬ１２は活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成された。ｍＩＦＮγアルファＥＬＩＳＡを用いたＩＦＮγ産生の下流定量によってＩＬ１２活性を評価した。
実施例２１：プロテアーゼ活性化融合タンパク質の生体内送達は腫瘍成長の減少をもたらす
キメラポリペプチドを、それが生体内での生物学的作用を有する可能性があるか否かを判定するために試験する。これらの実験のために、腹腔内注射された腫瘍細胞が、網上にみられる一連の組織化された免疫凝集体である乳斑に速やかかつ優先的に結合してそこで最初に成長するシステム（Ｇｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６９：１７３９－５２（２００６））を使用する。このシステムは、融合タンパク質処置が腫瘍成長に与える影響を調べる簡便な方法を提供する、というのも、融合タンパク質は腹腔内に複数回送達され得、腫瘍成長は解離した網細胞を調べることによって分析され得るからである。これらの実験のために、試験管内でＭＭＰ２及びＭＭＰ９を両方とも発現させる急成長する腫瘍細胞株である結腸３８細胞株が使用され得る。網組織には通常、比較的少量のＭＭＰ２及びＭＭＰ９が発現するが、結腸３８腫瘍が網上に存在しているとＭＭＰレベルが上昇する。この腫瘍モデルを使用して、腫瘍成長に影響を与えるＩＬ－２ムテイン融合タンパク質の能力を調べる。結腸３８細胞を腹腔内注射し、１日間にわたって結合及び成長させ、その後、腹腔内に毎日、融合タンパク質によって処置する。７日目に動物を屠殺し、フローサイトメトリーを用いて及びコロニー形成アッセイによって網を腫瘍成長について調べる。
実施例２２：ＣＤ２０を標的とする例示的な活性化可能インターロイキンタンパク質の構築
活性化可能インターロイキンドメインの生成
ヒトＩＬ－１２ｐ３５鎖カノニカル配列はＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２９４５９である。ヒトＩＬ－１２ｐ４０鎖カノニカル配列はＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２９４６０である。ＩＬ－１２ｐ３５及びＩＬ－１２ｐ４０を発現構築物の中にクローニングする。プロテアーゼ切断部位をＩＬ－１２ｐ３５及びＩＬ－１２ｐ４０ドメインの間に含ませる。腫瘍内または腫瘍細胞上に存在するＣＤ２０ポリペプチドに結合することができるＩＬ－１２ポリペプチドを以下のとおりに生成する。（１）ＩＦＮγポリペプチド配列をコードする及び（２）１つ以上のポリペプチドリンカーをコードする核酸配列を含有する核酸を生成する。活性化可能インターロイキンプラスミド構築物は、任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓまたは他の親和性タグを有し得、ＨＥＫ２９３または他の好適なヒトもしくは哺乳動物細胞株の中に電気穿孔で導入され、精製される。検証アッセイは、プロテアーゼの存在下でＩＬ－１２刺激に対する応答姓を有するＴ細胞を使用するＴ細胞活性化アッセイを含む。
ｓｃＦｖ ＣＤ２０結合ドメインの生成
ＣＤ２０は、Ｂリンパ球上に存在する細胞表面タンパク質の１つである。ＣＤ２０抗原は、正常な及び悪性の前駆Ｂ及び成熟Ｂリンパ球、例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％超に存在するものにみられる。当該抗原は、造血幹細胞、活性化Ｂリンパ球（形質細胞）及び正常組織には存在しない。このため、大半がマウス由来のものであるいくつかの抗体について記載がなされている：１Ｆ５、２Ｂ８／Ｃ２Ｂ８、２Ｈ７及び１Ｈ４。
したがって、ヒトまたはヒト化抗ＣＤ２０抗体を使用して活性化可能インターロイキンタンパク質のＣＤ２０結合ドメインのためのｓｃＦｖを生成する。ヒトまたはヒト化ＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を得、構築物のためのコドンを任意選択的にホモサピエンスからの細胞における発現のために最適化する。ＶＬ及びＶＨドメインがｓｃＦｖ中に出現する順序は様々であり（つまり、ＶＬ－ＶＨ、またはＶＨ－ＶＬの配向）、「Ｇ４Ｓ」（配列番号４４９）または「Ｇ４Ｓ」（配列番号４４９）サブユニットの３つのコピー（Ｇ４Ｓ）３（配列番号４５２）が可変ドメインを連結してｓｃＦｖドメインを作り出す。抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖプラスミド構築物は任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓまたは他の親和性タグを有し得、ＨＥＫ２９３または他の好適なヒトもしくは哺乳動物細胞株の中に電気穿孔で導入され、精製される。検証アッセイは、ＦＡＣＳによる結合性分析、Ｐｒｏｔｅｏｎを使用する速度論解析、及びＣＤ２０発現細胞の染色を含む。
活性化可能インターロイキンタンパク質をコードするＤＮＡ発現構築物のクローニング
プロテアーゼ切断部位ドメインを有する活性化可能インターロイキン構築物を抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖドメイン及び血清中半減期延長要素（例えばＨＳＡ結合性ペプチドまたはＶＨドメイン）と組み合わせて使用して活性化可能インターロイキンタンパク質を構築する。ＣＨＯ細胞における活性化可能インターロイキンタンパク質の発現のために、全てのタンパク質ドメインのコード配列を哺乳動物発現ベクターシステムの中にクローニングする。手短に述べると、活性化可能インターロイキンドメイン、血清中半減期延長要素及びＣＤ２０結合性ドメイン、ならびにペプチドリンカーＬ１及びＬ２をコードする遺伝子配列を別々に合成し、サブクローニングする。得られた構築物をその後、ＣＤ２０結合ドメイン－Ｌ１－ＩＬ－１２ｐ３５－Ｌ２－プロテアーゼ切断ドメイン－Ｌ３－ＩＬ－１２ｐ４０－Ｌ４－抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ－Ｌ５－血清中半減期延長要素の順で接合して最終構築物を得る。全ての発現構築物は、タンパク質分泌及び精製を容易にするためにそれぞれＮ末端シグナルペプチド及びＣ末端ヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）タグ（配列番号３５４）のコード配列を含有するように設計される。
安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞における活性化可能インターロイキンタンパク質の発現
ＣＨＯ－Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）（Ｋａｏ ａｎｄ Ｐｕｃｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９６８；６０（４）：１２７５－８１）の派生物であるＣＨＯ細胞発現システム（Ｆｌｐ－Ｉｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する。接着細胞を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって提供される標準的細胞培養プロトコールに従って継代する。
懸濁液中での成長に適合させるために細胞を組織培養フラスコから剥離させ、無血清培地に入れる。１０％のＤＭＳＯを含む培地の中で懸濁液適合型細胞を凍結保存する。
分泌型活性化可能インターロイキンタンパク質が安定的に発現する組換えＣＨＯ細胞株を、懸濁液適合型細胞のトランスフェクションによって生成する。抗生物質ヒグロマイシンＢによる選択の間、生細胞密度を週に２回測定し、細胞を遠心分離し、新鮮な選択培地に０．１×１０６生細胞／ｍＬの最大密度で再懸濁させる。活性化可能インターロイキンタンパク質が安定的に発現する細胞プールを２～３週間の選択の後に回収し、その時点で細胞を振盪フラスコ内の標準培養培地に移す。組換え分泌型タンパク質の発現は、タンパク質ゲル電気泳動またはフローサイトメトリーを実施することによって確認される。安定した細胞プールをＤＭＳＯ含有培地中で凍結保存する。
活性化可能インターロイキンタンパク質は、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株の１０日間の流加培養において細胞培養物上清中への分泌によって生成される。１０日後、典型的には培養物生存能が７５％超であるときに、細胞培養物上清を採集する。１日おきに生産培養物から試料を回収し、細胞密度及び生存能を評価する。採集の日に細胞培養物上清をさらなる使用の前に遠心分離及び真空濾過によって清澄化する。
細胞培養物上清におけるタンパク質発現力価及び生成物完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析する。
活性化可能インターロイキンタンパク質の精製
活性化可能インターロイキンタンパク質をＣＨＯ細胞培養物上清から２ステップの手順で精製する。第１ステップにおいて構築物を親和性クロマトグラフィーに供し、続いて第２ステップにおいてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００での分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供する。試料の緩衝液交換を行い、限外濾過によって濃縮して１ｍｇ／ｍＬ超の典型的な濃度にする。最終試料の純度及び均一性（典型的には９０％超）を、還元及び非還元条件下でのＳＤＳ ＰＡＧＥとそれに続く抗ＨＳＡまたは抗イディオタイプ抗体を使用するイムノブロッティングによって、及び分析的ＳＥＣによってそれぞれ評価する。精製されたタンパク質をアリコートにして使用時まで－８０℃で保存する。
実施例２３：フローサイトメトリーによる抗原親和性の決定
実施例５の活性化可能インターロイキンタンパク質を、ヒトＣＤ２０＋細胞及びカニクイザルＣＤ２０＋細胞に対するその結合親和性について試験する。
ＣＤ２０＋細胞を実施例５の活性化可能インターロイキンタンパク質の１００μＬの段階希釈液及び少なくとも１つのプロテアーゼとインキュベートする。ＦＡＣＳ用緩衝液で３回洗浄した後、細胞を氷上で４５分間、１０μｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体を含む同じ緩衝液０．１ｍＬとインキュベートする。２回目の洗浄サイクルの後、先と同じ条件下で細胞を１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体０．１ｍＬとインキュベートする。対照として、細胞を抗Ｈｉｓ ＩｇＧとインキュベートし、続いて、活性化可能インターロイキンタンパク質なしでＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とインキュベートする。その後、死細胞を除去するために細胞を再び洗浄し、２μｇ／ｍＬのプロピジウムヨージド（ＰＩ）を含有するＦＡＣＳ用緩衝液０．２ｍＬの中に再懸濁させた。ＭＸＰソフトウェアを使用するＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００ ＭＰＬフローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはＩｎｃｙｔｅソフトウェアを使用するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメータ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、１×１０４個の生存細胞の蛍光を測定する。ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、またはＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して細胞試料の平均蛍光強度を算出する。二次及び三次試薬のみで染色した細胞の蛍光強度値を差し引いた後、値を今度はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ウィンドウズ（登録商標）用バージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）の１部位結合のための等式（双曲線）によるＫＤ値の算出のために使用する。
ＣＤ２０結合性及び交差反応性をヒトＣＤ２０＋腫瘍細胞株において評価する。組換えヒトまたは組換えカニクイザル抗原のどちらかが発現するＣＨＯ細胞株について決定されたＫＤ値を使用して交差反応性のＫＤ比を算出する。
実施例２４：細胞毒性アッセイ
実施例５の活性化可能インターロイキンタンパク質を、ＣＤ２０＋標的細胞に対する免疫応答のその媒介に関して試験管内で評価する。
蛍光標識ＣＤ２０＋ＲＥＣ－１細胞（マントル細胞リンパ腫細胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３００４）を、実施例５の活性化可能インターロイキンタンパク質及び少なくとも１つのプロテアーゼの存在下で、エフェクター細胞としての無作為ドナーの単離ＰＢＭＣまたはＣＢ１５ Ｔ細胞（標準的なＴ細胞株）とインキュベートする。加湿インキュベータ内で３７℃で４時間インキュベートした後、標的細胞から上清中への蛍光色素の遊離を分光蛍光光度計で判定する。実施例５の活性化可能インターロイキンタンパク質なしでインキュベートした標的細胞、及びインキュベーションの最後にサポニンの添加によって完全に溶解させた標的細胞はそれぞれ陰性及び陽性対照としての役割を果たす。
測定された残存する生存標的細胞を基準として特異的細胞溶解の百分率を以下の式に従って算出する：［１－（生存標的数（試料）／生存標的数（自発的））］×１００％。シグモイド用量応答曲線及びＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用する非線形回帰／４係数ロジスティック近似によって算出する。所与の抗体濃度について得られた溶解値を使用してシグモイド用量応答曲線を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用する４係数ロジスティック近似解析によって算出する。
実施例２５：活性化可能インターロイキンタンパク質の薬物動態
実施例５の活性化可能インターロイキンタンパク質を動物試験において消失半減期について評価する。
活性化可能インターロイキンタンパク質を伏在静脈内への０．５ｍｇ／ｋｇのボーラス注射としてカニクイザルに投与する。別のカニクイザル群には同程度の大きさを有するが血清中半減期延長要素を欠くサイトカインを与える。第３及び第４群にはそれぞれ、血清中半減期延長要素を有するサイトカイン、ならびにＣＤ２０及び血清中半減期延長要素を有するサイトカインを与えるが、どちらも大きさが活性化可能インターロイキンタンパク質と同程度のものである。各試験群は５匹のサルからなる。示された時間点において血清試料を採取し、段階希釈し、ＣＤ２０に対する結合ＥＬＩＳＡを用いてタンパク質の濃度を決定する。
試験品の血漿中濃度を使用して薬物動態分析を実施する。各試験品についての群平均血漿データは、投薬後時間に対してプロットすると多指数関数的プロファイルに従う。データを、ボーラス投入ならびに分配段階及び消失段階の一次速度定数を有する標準的な二成分モデルで近似する。静脈内投与のためのデータの最良近似のための一般的な等式は、ｃ（ｔ）＝Ａｅ－αｔ＋Ｂｅ－βｔであり、式中、ｃ（ｔ）は時間ｔでの血漿中濃度であり、Ａ及びＢはＹ軸上の切片であり、α及びβはそれぞれ分配段階及び消失段階の見掛けの一次速度定数である。α段階はクリアランスの初期段階であり、動物の細胞外流体中へのタンパク質の分配を反映する一方、減衰曲線の第２またはβ段階部分は真の血漿クリアランスを表す。そのような等式を近似するための方法は当技術分野でよく知られている。例えば、Ｖ＝分配の体積、ｋ１０＝消失速度、ｋ１２＝区画１から区画２までの移行速度、及びｋ２１＝区画２から区画１への移行速度、ならびにＤ＝投与された用量、という推定パラメータを使用して、Ａ＝Ｄ／Ｖ（α－ｋ２１）／（α－β）、Ｂ＝Ｄ／Ｖ（β－ｋ２１）／（α－β）であり、α及びβ（α＞βの場合）は二次方程式ｒ２＋（ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０）ｒ＋ｋ２１ｋ１０＝０の根である。
データ解析：濃度対時間プロファイルのグラフはＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（商標）Ｖ．３．０９ Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９８６－１９９７．Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｐａ．）を使用して作られる。報告可能未満（ＬＴＲ）として報告された値はＰＫ解析に含めず、グラフに表されない。薬物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｖ．３．１ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９８－１９９９．Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）を使用する区画解析によって決定される。薬物動態パラメータは、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ Ｗ Ａ ａｎｄ Ｋｅａｒｎｓ Ｇ Ｌ，１９９９，ＩＮ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に記載されているように計算される。
実施例５の活性化可能インターロイキンタンパク質は、血清中半減期延長要素を欠くタンパク質に比べて改善された薬物動態パラメータ、例えば消失半減期の増加を有することが予期される。
実施例２６：異種移植腫瘍モデル
実施例５の活性化可能インターロイキンタンパク質を異種移植モデルにおいて評価する。
雌性免疫不全ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスを亜致死的に放射線照射し（２Ｇｙ）、右背側脇腹に４×１０６個のラモスＲＡ１細胞を皮下接種する。腫瘍が１００～２００ｍｍ３に達した時に動物を３つの処置群に割り当てる。群２及び群３（各々８匹の動物）には１．５×１０７個の活性化ヒトＴ細胞を腹腔内注射する。３日後に群３からの動物を今度は合計９回の５０μｇの実施例５の活性化可能インターロイキンタンパク質の静脈内用量で処置する（１日１回×９日間）。群１及び群２をビヒクルのみで処置する。体重及び腫瘍体積の決定を３０日間行う。
実施例５の活性化可能インターロイキンタンパク質で処置した動物は、それぞれのビヒクル処置対照群と比較して腫瘍成長が統計的に有意に遅れることが予期される。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し記載してきたが、そのような実施形態が例として提供されているにすぎないことは当業者には明らかであろう。いまや当業者は本発明から逸脱することなく多数の変形形態、変更及び置換を考え付くであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替形態が本発明の実施に採用され得ることは理解されるべきである。以下の特許請求の範囲によって本発明の範囲を画定すること、ならびにこの特許請求の範囲に入る方法及び構造、ならびにそれらの均等物をそれによって包含することを意図する。
実施例２７：ＭＣ３８実験
試験管内でＭＭＰ９を発現させる急成長する結腸腺癌細胞株であるＭＣ３８細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、腫瘍成長に影響を与える融合タンパク質の能力を調べた。
実施例２７ａ：ＭＣ３８ ＩＬ－２ＰＯＣ
Figure 2023503258000009
 手順
潰瘍形成を軽減するための細胞の移植のためにマウスにイソフルランで麻酔を掛けた。３０８ ＣＲ雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹の皮下に、５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を含む０％マトリゲルを設置した。細胞注射体積は０．１ｍＬ／マウスであった。開始日のマウス年齢は８～１２週齢であった。腫瘍が１００～１５０ｍｍ３の平均サイズに達して処置を開始する時に対の釣り合わせを実施した。体重測定を開始時及びその後に最後まで週に２回行った。キャリパー測定を最後まで週に２回行った。有害反応があればすぐに報告することとした。３０％超の体重減少が１回観察されたかまたは２５％超の体重減少が３回連続して測定された個体動物がいればそれを安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超である群があれば投薬を中止し、その群を安楽死させず、回復させる。体重減少が２０％超である群の中で、個々の体重減少終点に達した個体は安楽死させた。群の処置に関係する体重減少が元の体重の１０％以内にまで回復する場合には投薬をより低い用量またはより少ない頻度の投薬計画で再開する。非処置体重％回復の例外は個別基準で許容した。評価項目は腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々に監視した。実験の終点は、１５００ｍｍ３の腫瘍体積か４５日かのどちらかで早く到来した方とした。奏効者をより長く追跡した。終点に達した時に動物を安楽死させることになる。
結果を図３５に示す。
実施例２７ｂ：ＭＣ３８ ＩＬ－２ ＰＯＣ。ＡＣＰ１６、ＡＣＰ１２４及びＡＣＰ１３０による処置
Figure 2023503258000010
 手順：
潰瘍形成を軽減するための細胞の移植のためにマウスにイソフルランで麻酔を掛けた。３０８ ＣＲ雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹の皮下に、５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を含む０％マトリゲルを設置した。細胞注射体積は０．１ｍＬ／マウスであった。開始日のマウス年齢は８～１２週齢であった。腫瘍が１００～１５０ｍｍ３の平均サイズに達して処置を開始する時に対の釣り合わせを実施した。体重測定を開始時及びその後に最後まで週に２回行った。キャリパー測定を最後まで週に２回行った。有害反応があればすぐに報告することとした。３０％超の体重減少が１回観察されたかまたは２５％超の体重減少が３回連続して測定された個体動物がいればそれを安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超である群があれば投薬を中止し、その群を安楽死させず、回復させる。体重減少が２０％超である群の中で、個々の体重減少終点に達した個体は安楽死させた。群の処置に関係する体重減少が元の体重の１０％以内にまで回復する場合には投薬をより低い用量またはより少ない頻度の投薬計画で再開する。非処置体重％回復の例外は個別基準で許容した。評価項目は腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々に監視した。実験の終点は、１５００ｍｍ３の腫瘍体積か４５日かのどちらかで早く到来した方とした。奏効者をより長く追跡した。終点に達した時に動物を安楽死させることになる。
結果を図３１Ａ～３１Ｃ及び図３２Ｂ～３２Ｃに示す。生存率曲線を図３４Ａ～３４Ｄに示す。
実施例２７ｃ：ＭＣ３８ ＩＦＮａ及びＩＬ－１２
Figure 2023503258000011
 手順：
潰瘍形成を軽減するための細胞の移植のためにマウスにイソフルランで麻酔を掛けた。３０８ ＣＲ雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹の皮下に、５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を含む０％マトリゲルを設置した。細胞注射体積は０．１ｍＬ／マウスであった。開始日のマウス年齢は８～１２週齢であった。腫瘍が１００～１５０ｍｍ３の平均サイズに達して処置を開始する時に対の釣り合わせを実施した。体重測定を開始時及びその後に最後まで週に２回行った。キャリパー測定を最後まで週に２回行った。有害反応があればすぐに報告することとした。３０％超の体重減少が１回観察されたかまたは２５％超の体重減少が３回連続して測定された個体動物がいればそれを安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超である群があれば投薬を中止し、その群を安楽死させず、回復させる。体重減少が２０％超である群の中で、個々の体重減少終点に達した個体は安楽死させた。群の処置に関係する体重減少が元の体重の１０％以内にまで回復する場合には投薬をより低い用量またはより少ない頻度の投薬計画で再開する。非処置体重％回復の例外は個別基準で許容した。評価項目は腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々に監視した。実験の終点は、１５００ｍｍ３の腫瘍体積か４５日かのどちらかで早く到来した方とした。奏効者をより長く追跡した。終点に達した時に動物を安楽死させることになる。結果を図２９Ａ～図２９Ｂ及び図３０に示す。
実施例２７ｄ：ＡＣＰ１６、ＡＣＰ１３２及びＡＣＰ２１による処置
Figure 2023503258000012
 手順：
潰瘍形成を軽減するための細胞の移植のためにマウスにイソフルランで麻酔を掛けた。ＣＲ雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹の皮下に、５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を含む０％マトリゲルを設置した。細胞注射体積は０．１ｍＬ／マウスであった。開始日のマウス年齢は８～１２週齢であった。腫瘍が１００～１５０ｍｍ３の平均サイズに達して処置を開始する時に対の釣り合わせを実施した。ＡＣＰ１６は１７、５５、７０または２３０μｇ／動物で投薬し、ＡＣＰ１３２は９、２８、３６または１１９ｕｇ／動物で投薬し、ＡＣＰ２１は１３、４２、５４または１７７μｇ／動物で投薬した。体重測定を開始時及びその後に最後まで週に２回行った。キャリパー測定を最後まで週に２回行った。有害反応があればすぐに報告することとした。３０％超の体重減少が１回観察されたかまたは２５％超の体重減少が３回連続して測定された個体動物がいればそれを安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超である群があれば投薬を中止し、その群を安楽死させず、回復させる。体重減少が２０％超である群の中で、個々の体重減少終点に達した個体は安楽死させた。群の処置に関係する体重減少が元の体重の１０％以内にまで回復する場合には投薬をより低い用量またはより少ない頻度の投薬計画で再開する。非処置体重％回復の例外は個別基準で許容した。評価項目は腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々に監視した。実験の終点は、１５００ｍｍ３の腫瘍体積か４５日かのどちらかで早く到来した方とした。奏効者をより長く追跡した。終点に達した時に動物を安楽死させることになる。結果を図３５に示す。
実施例２７ｅ：ＭＣ３８再攻撃
実施例２７ｂから治癒したマウス（ＡＣＰ１６処置済み）を腫瘍移植によって再攻撃して、初回処置からの抗腫瘍メモリーが確立されているか否かを判定した。
Figure 2023503258000013
手順：
潰瘍形成を軽減するための細胞の移植のためにマウスにイソフルランで麻酔を掛けた。試験のこの部分は移植日（１日目）に開始された。群１は、５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を含む０％マトリゲルを脇腹の皮下に設置された３３ ＣＲ雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスからなっていた。群２～６は、５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を含む０％マトリゲルを左脇腹の皮下に設置された３３ ＣＲ雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスからなっていた。各動物の右脇腹には先のＭＣ３８実験（実施例２７ｂ）からの腫瘍を移植した。細胞注射体積は０．１ｍＬ／マウスであった。開始時の対照マウスの年齢は１４～１７週齢であった。これらのマウスの年齢を先のＭＣ３８実験（実施例２７ｂ）からのマウスと一致させた。再攻撃の間、活性薬剤の投薬は起こらなかった。体重測定を最後まで週に２回行い、キャリパー測定も同様に行った。有害反応または死亡があればすぐに報告することとした。３０％超の体重減少が１回観察されたかまたは２５％超の体重減少が３回連続して測定された個体動物がいればそれを安楽死させた。評価項目は腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々に監視した。実験の終点は、１０００ｍｍ３の腫瘍体積か４５日かのどちらかで早く到来した方とした。可能な場合には奏効者をより長く追跡した。終点に達した時に動物を安楽死させた。結果を図３３に示す。
実施例２７ｆ：ＡＣＰ１０、ＡＣＰ１１による処置
Figure 2023503258000014
 手順：
潰瘍形成を軽減するための細胞の移植のためにマウスにイソフルランで麻酔を掛けた。ＣＲ雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹の皮下に、５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を含む０％マトリゲルを設置した。細胞注射体積は０．１ｍＬ／マウスであった。開始日のマウス年齢は８～１２週齢であった。腫瘍が１００～１５０ｍｍ３の平均サイズに達して処置を開始する時に対の釣り合わせを実施した。ＡＣＰ１１は１７５または３００μｇ／動物で投薬し、ＡＣＰ１０は５、１０、４３または１７２ｕｇ／動物で投薬し、ＩＬ－１２－ＨＭ－ＷＴＩは５または２０ｕｇ／動物で投薬した。体重測定を開始時及びその後に最後まで週に２回行った。キャリパー測定を最後まで週に２回行った。有害反応があればすぐに報告することとした。３０％超の体重減少が１回観察されたかまたは２５％超の体重減少が３回連続して測定された個体動物がいればそれを安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超である群があれば投薬を中止し、その群を安楽死させず、回復させる。体重減少が２０％超である群の中で、個々の体重減少終点に達した個体は安楽死させた。群の処置に関係する体重減少が元の体重の１０％以内にまで回復する場合には投薬をより低い用量またはより少ない頻度の投薬計画で再開する。非処置体重％回復の例外は個別基準で許容した。評価項目は腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々に監視した。実験の終点は、１５００ｍｍ３の腫瘍体積か４５日かのどちらかで早く到来した方とした。奏効者をより長く追跡した。終点に達した時に動物を安楽死させることになる。結果を図４５及び図４６Ａ～図４６Ｄに示す。
実施例２７ｇ：ＡＣＰ１６、ＡＰＣ１５３、ＡＣＰ１５５、ＡＣＰ１５６及びＡＣＰ２９２による処置
Figure 2023503258000015
 手順：
潰瘍形成を軽減するための細胞の移植のためにマウスにイソフルランで麻酔を掛けた。ＣＲ雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹の皮下に、５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を含む０％マトリゲルを設置した。細胞注射体積は０．１ｍＬ／マウスであった。開始日のマウス年齢は８～１２週齢であった。腫瘍が１００～１５０ｍｍ３の平均サイズに達して処置を開始する時に対の釣り合わせを実施した。ＡＣＰ１６は１７、５５または２３０μｇ／動物で投薬し、ＡＣＰ１５３、ＡＣＰ１５５及びＡＣＰ１５６は５５または２３０μｇ／動物で投薬し、ＡＣＰ２９２は４５または１８６μｇ／動物で投薬した。体重測定を開始時及びその後に最後まで週に２回行った。キャリパー測定を最後まで週に２回行った。有害反応があればすぐに報告することとした。３０％超の体重減少が１回観察されたかまたは２５％超の体重減少が３回連続して測定された個体動物がいればそれを安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超である群があれば投薬を中止し、その群を安楽死させず、回復させる。体重減少が２０％超である群の中で、個々の体重減少終点に達した個体は安楽死させた。群の処置に関係する体重減少が元の体重の１０％以内にまで回復する場合には投薬をより低い用量またはより少ない頻度の投薬計画で再開する。非処置体重％回復の例外は個別基準で許容した。評価項目は腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々に監視した。実験の終点は、１５００ｍｍ３の腫瘍体積か４５日かのどちらかで早く到来した方とした。奏効者をより長く追跡した。終点に達した時に動物を安楽死させることになる。結果を図４９Ａ～図４９Ｉに示す。
実施例２７ｈ：ＡＣＰ１６、ＡＰＣ３０２及びＡＣＰ３１４による処置
Figure 2023503258000016
 手順：
潰瘍形成を軽減するための細胞の移植のためにマウスにイソフルランで麻酔を掛けた。ＣＲ雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹の皮下に、５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を含む０％マトリゲルを設置した。細胞注射体積は０．１ｍＬ／マウスであった。開始日のマウス年齢は８～１２週齢であった。腫瘍が１００～１５０ｍｍ３の平均サイズに達して処置を開始する時に対の釣り合わせを実施した。ＡＣＰ１６は５５または２３０μｇ／動物で投薬し、ＡＣＰ３０２は３３、１０６、４４２または１３４４ｕｇ／動物で投薬し、ＡＣＰ３１４は２１、６８、２８３または８６１μｇ／動物で投薬した。体重測定を開始時及びその後に最後まで週に２回行った。キャリパー測定を最後まで週に２回行った。有害反応があればすぐに報告することとした。３０％超の体重減少が１回観察されたかまたは２５％超の体重減少が３回連続して測定された個体動物がいればそれを安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超である群があれば投薬を中止し、その群を安楽死させず、回復させる。体重減少が２０％超である群の中で、個々の体重減少終点に達した個体は安楽死させた。群の処置に関係する体重減少が元の体重の１０％以内にまで回復する場合には投薬をより低い用量またはより少ない頻度の投薬計画で再開する。非処置体重％回復の例外は個別基準で許容した。評価項目は腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々に監視した。実験の終点は、１５００ｍｍ３の腫瘍体積か４５日かのどちらかで早く到来した方とした。奏効者をより長く追跡した。終点に達した時に動物を安楽死させることになる。結果を図５０Ａ～図５０Ｂに示す。
実施例２７ｉ：ＡＣＰ３３９による処置
Figure 2023503258000017
 手順：
潰瘍形成を軽減するための細胞の移植のためにマウスにイソフルランで麻酔を掛けた。ＣＲ雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹の皮下に、５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を含む０％マトリゲルを設置した。細胞注射体積は０．１ｍＬ／マウスであった。開始日のマウス年齢は８～１２週齢であった。腫瘍が１００～１５０ｍｍ３の平均サイズに達して処置を開始する時に対の釣り合わせを実施した。ＡＣＰ３３９は５５、２３０または７００μｇ／動物で投薬した。体重測定を開始時及びその後に最後まで週に２回行った。キャリパー測定を最後まで週に２回行った。有害反応があればすぐに報告することとした。３０％超の体重減少が１回観察されたかまたは２５％超の体重減少が３回連続して測定された個体動物がいればそれを安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超である群があれば投薬を中止し、その群を安楽死させず、回復させる。体重減少が２０％超である群の中で、個々の体重減少終点に達した個体は安楽死させた。群の処置に関係する体重減少が元の体重の１０％以内にまで回復する場合には投薬をより低い用量またはより少ない頻度の投薬計画で再開する。非処置体重％回復の例外は個別基準で許容した。評価項目は腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々に監視した。実験の終点は、１５００ｍｍ３の腫瘍体積か４５日かのどちらかで早く到来した方とした。奏効者をより長く追跡した。終点に達した時に動物を安楽死させることになる。結果を図５１Ａ～図５１Ｃに示す。
実施例２８：ＣＴ２６実験
試験管内でＭＭＰ９を発現させる急成長する結腸腺癌細胞株であるＣＴ２６細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、腫瘍成長に影響を与える融合タンパク質の能力を調べた。
実施例２８ａ：ＡＣＰ１６単独またはそれと抗ＰＤ１抗体薬剤との組合せによる処置
Figure 2023503258000018
 手順：
潰瘍形成を軽減するための細胞の移植のためにマウスにイソフルランで麻酔を掛けた。ＣＲ雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの脇腹の皮下に、３×１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞を含む０％マトリゲルを設置した。細胞注射体積は０．１ｍＬ／マウスであった。開始日のマウス年齢は８～１２週齢であった。腫瘍が１００～１５０ｍｍ３の平均サイズに達して処置を開始する時に対の釣り合わせを実施した。２００μｇ／動物の抗ＰＤ－１抗体（ＲＭＰ１－１４）を伴うかまたは伴わずにＡＣＰ１６を７０、２３０または５００μｇ／動物で投薬した。体重測定を開始時及びその後に最後まで週に２回行った。キャリパー測定を最後まで週に２回行った。有害反応があればすぐに報告することとした。３０％超の体重減少が１回観察されたかまたは２５％超の体重減少が３回連続して測定された個体動物がいればそれを安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超である群があれば投薬を中止し、その群を安楽死させず、回復させる。体重減少が２０％超である群の中で、個々の体重減少終点に達した個体は安楽死させた。群の処置に関係する体重減少が元の体重の１０％以内にまで回復する場合には投薬をより低い用量またはより少ない頻度の投薬計画で再開する。非処置体重％回復の例外は個別基準で許容した。評価項目は腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々に監視した。実験の終点は、１５００ｍｍ３の腫瘍体積か４５日かのどちらかで早く到来した方とした。奏効者をより長く追跡した。終点に達した時に動物を安楽死させることになる。結果を図４７Ａ～図４７Ｄ及び図４８Ａ～図４８Ｂに示す。
実施例２９．ヒトＴｂｌａｓｔアッセイ
ＩＬ－２ Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイ。予備刺激したＴ細胞（Ｔ－ｂｌａｓｔ）を使用して誘導可能ＩＬ－２融合タンパク質の活性を評価した。Ｔ－Ｂｌａｓｔを、３日間のＰＨＡとのインキュベーションによってヒトＰＢＭＣから誘導した。その後、ＴｂｌａｓｔをＸ－ＶＩＶＯ培養培地（ヒト血清アルブミンを含有する）の中に懸濁させて５０，０００または７５，０００細胞／ウェルの濃度で播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で７２時間にわたって組換えＩＬ－２融合タンパク質またはヒトＩＬ－２の希釈系列によって刺激した。非切断型及び切断型ＩＬ－２融合タンパク質の活性を試験した。切断型誘導可能ＩＬ－２は活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成された。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏによる増殖を測定してＩＬ－２活性を評価した。例示的な結果を図３Ａ～図３Ｉに示す。
ＩＬ－１２ Ｔ－Ｂｌａｓｔアッセイ。Ｔ－Ｂｌａｓｔを、７２時間にわたるＰＨＡ刺激によってヒトＰＢＭＣから誘導した。その後、Ｔ－ｂｌａｓｔを洗浄し、使用前に凍結させた。アッセイのためにＴ－Ｂｌａｓｔを解凍し、ヒトアルブミンを含有する培養培地の中に懸濁させて１００，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で７２時間にわたって組換えｈＩＬ１２またはキメラＩＬ１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）ｉｎｄｕｋｉｎｅまたはｈＩＬ１２ｉｎｄｕｋｉｎｅの希釈系列によって刺激した。非切断型及び切断型ＩＬ１２融合タンパク質の活性を試験した。切断型誘導可能ｈＩＬ１２は活性ＭＭＰ９酵素とのインキュベーションによって生成された。ｈＩＦＮγアルファ－ＬＩＳＡキットを使用して上清におけるＩＦＮγ産生を定量することによってＩＬ１２活性を評価した。例示的な結果を図８Ａ～図８Ｄに示す。
実施例３０．ルシフェラーゼレポーターアッセイ
「解凍後使用」形式で製造業者から購入したＩＬ－２ルシフェラーゼレポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示に従って播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で６時間にわたって組換えｈＩＬ－２または活性化可能ｈＩＬ－２の希釈系列によって刺激した。非切断型及び切断型活性化可能ＩＬ－２の活性を試験した。切断型誘導可能ＩＬ－２は活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成された。発光読み値によってルシフェラーゼ活性の測定を可能にするものであるＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してルシフェラーゼ活性を定量することによってＩＬ－２活性を評価した。結果を図２Ａ～図２Ｊに示す。
「解凍後使用」形式で製造業者から購入したＩＬ１２ルシフェラーゼレポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示に従って播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で６時間にわたって組換えｈＩＬ１２または活性化可能ｈＩＬ１２の希釈系列によって刺激した。非切断型及び切断型活性化可能ＩＬ１２の活性を試験した。切断型誘導可能ＩＬ１２は活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成された。発光読み値によってルシフェラーゼ活性の測定を可能にするものであるＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してルシフェラーゼ活性を定量することによってＩＬ１２活性を評価した。結果を図９Ａ～図９Ｃに示す。
実施例３１．ＭＣ３８実験
Figure 2023503258000019
 手順：
潰瘍形成を軽減するための細胞の移植のためにマウスにイソフルランで麻酔を掛けた。３０８ ＣＲ雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹の皮下に、５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を含む０％マトリゲルを設置した。細胞注射体積は０．１ｍＬ／マウスであった。開始日のマウス年齢は８～１２週齢であった。腫瘍が１００～１５０ｍｍ３の平均サイズに達して処置を開始する時に対の釣り合わせを実施した。体重測定を開始時及びその後に最後まで週に２回行った。キャリパー測定を最後まで週に２回行った。有害反応があればすぐに報告することとした。３０％超の体重減少が１回観察されたかまたは２５％超の体重減少が３回連続して測定された個体動物がいればそれを安楽死させた。平均体重減少が２０％超であるかまたは死亡率が１０％超である群があれば投薬を中止し、その群を安楽死させず、回復させる。体重減少が２０％超である群の中で、個々の体重減少終点に達した個体は安楽死させた。群の処置に関係する体重減少が元の体重の１０％以内にまで回復する場合には投薬をより低い用量またはより少ない頻度の投薬計画で再開する。非処置体重％回復の例外は個別基準で許容した。評価項目は腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）であった。動物を個々に監視した。実験の終点は、１５００ｍｍ３の腫瘍体積か４５日かのどちらかで早く到来した方とした。奏効者をより長く追跡した。終点に達した時に動物を安楽死させることになる。結果を図４～図６に示す。
試料融合タンパク質構築物を表３に詳細に示す。表３中、「Ｌ」は「リンカー」の略称であり、「ｃｌｅａｖ．ｌｉｎｋ．」は「切断可能リンカー」の略称である。他の略称「ｍＩＦＮｇ」は、マウスインターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）を表し、「ｈＡｌｂｕｍｉｎ」はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を表し、「ｍＡｌｂｕｍｉｎ」はマウス血清アルブミンを表す。
実施例３２．ヒトインターフェロンＰＢＭＣアッセイ
ヒトＰＢＭＣを、健常ドナーから得た血液から単離した。単離後、アッセイを実施するときまでＰＢＭＣを凍結保存した。アッセイのためにＰＢＭＣを解凍し、１．５％のヒト血清アルブミンが補充されたＸ－Ｖｉｖｏ培養培地の中に懸濁させて１００，０００細胞／ウェルで播種した。９６ウェル丸底プレートをアッセイのために使用した。３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間にわたって細胞をヒトＩＦＮα及び活性化可能ヒトＩＦＮαの希釈系列で刺激した。非切断型及び切断型活性化可能ＩＦＮαの活性を試験した。切断型誘導可能ＩＦＮαは活性組換えプロテアーゼとのインキュベーションによって生成された。ＰＢＭＣ上清を回収し、産生されたＣＸＣＬ－１０（ＩＰ－１０）の量を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡを使用して応答の尺度として定量した。結果を図３８Ａ～図３８Ｃに示す。
Figure 2023503258000020
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Figure 2023503258000044
Figure 2023503258000045
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 配列表
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Figure 2023503258000048
Figure 2023503258000049
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Figure 2023503258000157
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参照による援用
本明細書中で引用される全ての特許及び非特許刊行物の全開示内容の各々の全体を参照によりあらゆる目的のために援用する。
他の実施形態
上に示される本開示は、独立した実用性を有する複数の別個な本発明を包含し得る。これらの本発明の各々はその好ましい形態（複数可）で開示されているが、本明細書において開示され例示されるその具体的な実施形態は限定の意味で解釈されるべきではない、というのも、多数の変形形態が可能であるからである。本発明の主題は、本明細書に開示される様々な要素、特徴、機能及び／または特性のあらゆる新規かつ非自明な組合せ及び部分的組合せを含む。以下の特許請求の範囲は、新規かつ非自明であるとみなされる特定の組合せ及び部分的組合せを詳しく示している。特徴、機能、要素及び／または特性の他の組合せ及び部分的組合せで具現される本発明は、本出願の中、本出願から優先権を主張する出願の中、または関連出願の中で特許請求され得る。そのような請求項は、異なる発明に関するものであろうと同じ発明に関するものであろうと、範囲が元の請求項に比べてより広いかより狭いか等しいかまたは異なるかを問わず、同じく本開示の本発明の主題に含まれるとみなされる。

Claims (68)

  1. 医薬組成物であって、
    （ｉ）サイトカインポリペプチド［Ａ］、阻止部分［Ｄ］、任意選択の半減期延長部分［Ｈ］、及びプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーを含む、融合ポリペプチド；ならびに
    （ｉｉ）第２治療剤
    を含み、前記サイトカインポリペプチドと、前記阻止部分と、存在する場合の前記任意選択の半減期延長要素とが前記プロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーによって機能可能に連結されており、前記融合ポリペプチドが、弱化したサイトカイン受容体賦活作用を有し、前記融合ポリペプチドの前記サイトカイン受容体賦活作用が、
    前記プロテアーゼ切断可能リンカーの切断によって生成した前記サイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体賦活作用
    に比べて約１０分の１以下である、前記医薬組成物。
  2. 前記サイトカインポリペプチドが、
    ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＧＦ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、ＴＮＦ、ＴＧＦベータ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、または上記のいずれかのムテイン、多様体、活性断片もしくはサブユニット
    からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記サイトカインポリペプチドが、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、または上記のいずれかのムテイン、多様体、活性断片もしくはサブユニットである、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 前記融合ポリペプチドが、式：
    ［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｈ］－［Ｌ２］－［Ｄ］
    ［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｈ］－［Ｌ１］－［Ａ］
    ［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｈ］
    ［Ｈ］－［Ｌ２］－［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］
    ［Ｈ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２’］－［Ｄ］
    ［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２’］－［Ｈ］
    〔式中、［Ａ］はサイトカインポリペプチドであり、［Ｄ］は阻止部分であり、［Ｈ］は半減期延長部分であり、［Ｌ１］はプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーであり、［Ｌ２］は、任意選択的にプロテアーゼ切断可能であるポリペプチドリンカーであり、［Ｌ２’］はプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーである〕
    を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 前記第２治療剤が、
    第２サイトカインポリペプチド［Ａ］、阻止部分［Ｄ］、任意選択の半減期延長要素［Ｈ］、及びプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカー［Ｌ］
    の各々を少なくとも１つずつ含む第２融合ポリペプチドであり、前記サイトカインポリペプチドと、前記サイトカイン阻止部分と、存在する場合の前記任意選択の半減期延長要素とが前記プロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーによって機能可能に連結されており、前記融合ポリペプチドが、弱化したサイトカイン受容体賦活作用を有し、前記融合ポリペプチドの前記サイトカイン受容体賦活作用が、
    前記プロテアーゼ切断可能リンカーの切断によって生成した前記サイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体賦活作用
    に比べて約１０分の１以下である、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  6. 前記第２サイトカインポリペプチドが、
    ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＧＦ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、ＴＮＦ、ＴＧＦベータ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、そのムテイン及びその活性断片
    からなる群から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
  7. 前記第２サイトカインポリペプチドが、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、または上記のいずれかのムテインもしくは活性断片である、請求項５に記載の医薬組成物。
  8. 前記第２融合ポリペプチドが、式：
    ［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｈ］－［Ｌ２］－［Ｄ］
    ［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｈ］－［Ｌ１］－［Ａ］
    ［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｈ］
    ［Ｈ］－［Ｌ２］－［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］
    ［Ｈ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２’］－［Ｄ］
    ［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２’］－［Ｈ］
    〔式中、［Ａ］はサイトカインポリペプチドであり、［Ｄ］は阻止部分であり、［Ｈ］は半減期延長部分であり、［Ｌ１］はプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーであり、［Ｌ２］は、任意選択的にプロテアーゼ切断可能であるポリペプチドリンカーであり、［Ｌ２’］はプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーである〕
    を有する、請求項４～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. 前記第１融合ポリペプチドがＩＬ－２ポリペプチドを含み、前記第２融合ポリペプチドが、異なるＩＬ－２ポリペプチド、ＩＬ－１２ポリペプチド、インターフェロンアルファポリペプチド、インターフェロンベータポリペプチド、または上記のいずれかのムテインもしくは活性断片を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  10. 前記第１融合ポリペプチドがＩＬ－１２ポリペプチドを含み、前記第２融合ポリペプチドが、異なるＩＬ－１２ポリペプチド、ＩＬ－２ポリペプチド、インターフェロンアルファポリペプチド、インターフェロンベータポリペプチド、または上記のいずれかのムテインもしくは活性断片を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  11. 前記第１融合ポリペプチドがインターフェロンアルファポリペプチドまたはインターフェロンベータポリペプチドを含み、前記第２融合ポリペプチドが、異なるインターフェロンアルファポリペプチド、異なるインターフェロンベータポリペプチド、ＩＬ－２ポリペプチド、ＩＬ－１２ポリペプチド、または上記のいずれかのムテインもしくは活性断片を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  12. 付加的な第３治療剤をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  13. 前記第２治療剤が、がんを治療するための薬剤である、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  14. 前記第２治療剤が免疫調節剤である、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  15. 前記第２治療剤が、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、Ｔ細胞アゴニストサイトカイン、ＣＡＲ－Ｔ、抗体－薬物複合体、または腫瘍溶解性ウイルス療法である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  16. 各プロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーが独立して、
    カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カテプシンＧ、カテプシンＬ、エラスターゼ、ＰＲ－３、グランザイムＭ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＡＤＡＭ、ＦＡＰ、カテプシンＬ、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、トリプターゼ及び腫瘍細胞表面プロテアーゼ
    からなる群から選択されるプロテアーゼによって切断されることができる配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  17. 前記半減期延長要素が、血清アルブミン結合ドメイン、血清アルブミン、トランスフェリンもしくは免疫グロブリンＦｃ、またはその断片を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  18. 前記阻止要素が、前記サイトカインポリペプチドに結合する抗体または抗体の抗原結合性断片を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  19. 前記融合ポリペプチドが、
    配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０及び５３９～５７８
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  20. 前記第２治療剤が、
    配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０及び５３９～５７８
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２融合タンパク質であり、前記第２融合タンパク質が同じでない、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  21. 前記融合ポリペプチドが第２ポリペプチドに共有結合または非共有結合で結合している、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  22. 前記第２ポリペプチド鎖と前記融合ポリペプチドの前記阻止部分とが相補的であり、一緒になって機能性結合部位を形成する、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 前記機能性結合部位が、前記融合ポリペプチド中に含有される前記サイトカインポリペプチドに対する特異性を有する、請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. 前記機能性結合部位が抗体のＦａｂ断片である、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  25. 前記第１融合ポリペプチドが二量体化する、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  26. 医薬組成物であって、
    （ｉ）配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０及び５３９～５７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第１融合ポリペプチド、ならびに
    （ｉｉ）配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０及び５３９～５７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２融合ポリペプチド
    を含み、前記第１融合ポリペプチドと前記第２融合ポリペプチドとが同じでない、前記医薬組成物。
  27. 医薬組成物であって、
    （ｉ）
    配列番号３６２、３６３、３２５、２８６、５７９、５８１または５８２から選択されるアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド鎖、及び
    配列番号２６３、２６４または３３３のアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド配列
    を含む、第１融合ポリペプチド、ならびに
    （ｉｉ）第２治療剤
    を含み、前記第２治療剤が、
    配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０及び５３９～５７８
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２融合ポリペプチドであり、前記第１融合ポリペプチドと前記第２融合ポリペプチドとが同じでない、前記医薬組成物。
  28. 配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８及び６３６～６４６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または
    配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８及び６３６～６４６との少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、融合ポリペプチド。
  29. 前記融合ポリペプチドが、配列番号２７２、２８６、３６２、３３６、３４８、３６３または５８０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の融合ポリペプチド。
  30. ポリペプチドであって、
    第２ポリペプチドに共有結合または非共有結合で結合している第１ポリペプチド
    を含み、前記第１ポリペプチドが、
    配列番号３６２、３６３、３２５、２８６、５７９、５８１もしくは５８２から選択されるアミノ酸配列、または
    配列番号３６２、３６３、３２５、２８６、５７９、５８１もしくは５８２との少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列
    を含み、前記第２ポリペプチド配列が、
    配列番号２６３、２６４もしくは３３３のアミノ酸配列、または
    配列番号２６３、２６４もしくは３３３との少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、前記ポリペプチド。
  31. 配列番号３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９及び５２３～５３８からなる群から選択されるアミノ酸配列、または
    配列番号３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９及び５２３～５３８との少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、融合ポリペプチド。
  32. 配列番号４２１～４３０及び５３９～５７８からなる群から選択されるアミノ酸配列、または
    配列番号４２１～４３０及び５３９～５７８との少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、融合ポリペプチド。
  33. 前記融合ポリペプチドが、配列番号４２４、４２８、５４１、５５６、５６０、５６８または５７３から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の融合ポリペプチド。
  34. がんまたはがんに関連するウイルス感染症を治療する方法であって、それを必要とする対象に先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物または１つ以上の融合ポリペプチドを投与することを含む、前記方法。
  35. 請求項１～２７または請求項２８～３３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸。
  36. 請求項３５に記載の核酸を含むベクター。
  37. 請求項３６に記載のベクターを含む宿主細胞。
  38. 請求項３７に記載の宿主細胞を前記融合ポリペプチドの発現及び回収に適した条件で培養することを含む、医薬組成物を作る方法。
  39. 合剤であって、がんの治療を、それを必要とする対象において行うことに使用するための、
    （ｉ）サイトカインポリペプチド［Ａ］、阻止部分［Ｄ］、任意選択の半減期延長部分［Ｈ］、及びプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーを含む、治療的有効量の融合ポリペプチド；ならびに
    （ｉｉ）治療的有効量の第２治療剤
    を含み、前記サイトカインポリペプチドと、前記サイトカイン阻止部分と、存在する場合の前記任意選択の半減期延長要素とが前記プロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーによって機能可能に連結されており、前記融合ポリペプチドが、弱化したサイトカイン受容体賦活作用を有し、前記融合ポリペプチドの前記サイトカイン受容体賦活作用が、
    前記プロテアーゼ切断可能リンカーの切断によって生成した前記サイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体賦活作用
    に比べて約１０分の１以下である、前記合剤。
  40. 対象においてがんを治療する方法であって、
    （ｉ）サイトカインポリペプチド［Ａ］、阻止部分［Ｄ］、任意選択の半減期延長部分［Ｈ］、及びプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーを含む、治療的有効量の融合ポリペプチド；ならびに
    （ｉｉ）治療的有効量の第２治療剤
    の投与を、それを必要とする前記対象において行うことを含み、前記サイトカインポリペプチドと、前記サイトカイン阻止部分と、存在する場合の前記任意選択の半減期延長要素とが前記プロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーによって機能可能に連結されており、前記融合ポリペプチドが、弱化したサイトカイン受容体賦活作用を有し、前記融合ポリペプチドの前記サイトカイン受容体賦活作用が、
    前記プロテアーゼ切断可能リンカーの切断によって生成した前記サイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体賦活作用
    に比べて約１０分の１以下である、前記方法。
  41. 前記サイトカインポリペプチドが、
    ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＧＦ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、ＴＮＦ、ＴＧＦベータ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、または上記のいずれかのムテインもしくは活性断片
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の使用、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記サイトカインポリペプチドが、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、または上記のいずれかのムテイン、多様体、活性断片もしくはサブユニットである、請求項４１に記載の使用または方法。
  43. 前記融合ポリペプチドが、式：
    ［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｈ］－［Ｌ２］－［Ｄ］
    ［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｈ］－［Ｌ１］－［Ａ］
    ［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｈ］
    ［Ｈ］－［Ｌ２］－［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］
    ［Ｈ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２’］－［Ｄ］
    ［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２’］－［Ｈ］
    〔式中、Ａはサイトカインポリペプチドであり、Ｄは阻止部分であり、Ｈは半減期延長部分であり、Ｌ１はプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーであり、Ｌ２は、任意選択的にプロテアーゼ切断可能であるポリペプチドリンカーであり、Ｌ２’はプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーである〕
    を有する、請求項３９～４２のいずれか１項に記載の使用または方法。
  44. 前記第２治療剤が、
    サイトカインポリペプチド［Ａ］、阻止部分［Ｄ］、任意選択の半減期延長部分［Ｈ］、及びプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーを含む、第２融合ポリペプチド
    であり、前記サイトカインポリペプチドと、前記サイトカイン阻止部分と、存在する場合の前記任意選択の半減期延長要素とが前記プロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーによって機能可能に連結されており、前記融合ポリペプチドが、弱化したサイトカイン受容体賦活作用を有し、前記融合ポリペプチドの前記サイトカイン受容体賦活作用が、
    前記プロテアーゼ切断可能リンカーの切断によって生成した前記サイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体賦活作用
    に比べて約１０分の１以下である、請求項３９～４３のいずれか１項に記載の使用または方法。
  45. 前記第２サイトカインポリペプチドが、
    ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＧＦ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦ、ＴＧＦベータ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、または上記のいずれかのムテイン、多様体、活性断片もしくはサブユニット
    からなる群から選択される、請求項４４に記載の使用または方法。
  46. 前記サイトカインポリペプチドが、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、または上記のいずれかのムテインもしくは活性断片である、請求項４５に記載の使用または方法。
  47. 前記第２融合ポリペプチドが、式：
    ［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｈ］－［Ｌ２］－［Ｄ］
    ［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｈ］－［Ｌ１］－［Ａ］
    ［Ａ］－［Ｌ１］－［Ｄ］－［Ｌ２］－［Ｈ］
    ［Ｈ］－［Ｌ２］－［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］
    ［Ｈ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２’］－［Ｄ］
    ［Ｄ］－［Ｌ１］－［Ａ］－［Ｌ２’］－［Ｈ］
    〔式中、Ａはサイトカインポリペプチドであり、Ｄは阻止部分であり、Ｈは半減期延長部分であり、Ｌ１はプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーであり、Ｌ２は、任意選択的にプロテアーゼ切断可能であるポリペプチドリンカーであり、Ｌ２’はプロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーである〕
    を有する、請求項３９～４６のいずれか１項に記載の使用または方法。
  48. 前記第１融合ポリペプチドがＩＬ－２ポリペプチドを含み、前記第２融合ポリペプチドが、異なるＩＬ－２ポリペプチド、ＩＬ－１２ポリペプチド、インターフェロンアルファポリペプチド、インターフェロンベータポリペプチド、または上記のいずれかのムテインもしくは活性断片を含む、請求項３９～４７のいずれか１項に記載の使用または方法。
  49. 前記第１融合ポリペプチドがＩＬ－１２ポリペプチドを含み、前記第２融合ポリペプチドが、異なるＩＬ－１２ポリペプチド、ＩＬ－２ポリペプチド、ＩＦＮアルファポリペプチド、インターフェロンベータポリペプチド、または上記のいずれかのムテインもしくは活性断片を含む、請求項３９～４７のいずれか１項に記載の使用または方法。
  50. 前記第１融合ポリペプチドがインターフェロンアルファポリペプチドまたはＩＦＮベータポリペプチドを含み、前記第２融合ポリペプチドが、異なるインターフェロンアルファポリペプチド、異なるインターフェロンベータポリペプチド、ＩＬ－２ポリペプチド、ＩＬ－１２ポリペプチド、または上記のいずれかのムテインもしくは活性断片を含む、請求項３９～５０のいずれか１項に記載の使用または方法。
  51. 付加的な第３治療剤をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の使用または方法。
  52. 前記第２治療剤が、がんを治療するための薬剤である、請求項３９～５１のいずれか１項に記載の使用または方法。
  53. 前記第２治療剤が免疫調節剤である、請求項３９～５２のいずれか１項に記載の使用または方法。
  54. 前記第２治療剤が、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、Ｔ細胞アゴニストサイトカイン、ＣＡＲ－Ｔ、抗体－薬物複合体、または腫瘍溶解性ウイルス療法である、請求項３９～５３のいずれか１項に記載の使用または方法。
  55. 各プロテアーゼ切断可能ポリペプチドリンカーが独立して、
    カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カテプシンＧ、カテプシンＬ、エラスターゼ、ＰＲ－３、グランザイムＭ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＡＤＡＭ、ＦＡＰ、カテプシンＬ、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、トリプターゼ及び腫瘍細胞表面プロテアーゼ
    からなる群から選択されるプロテアーゼによって切断されることができる配列を含む、請求項３９～５４のいずれか１項に記載の使用または方法。
  56. 前記半減期延長要素が、血清アルブミン結合ドメイン、血清アルブミン、トランスフェリンもしくは免疫グロブリンＦｃ、またはその断片を含む、請求項３９～５５のいずれか１項に記載の使用または方法。
  57. 前記サイトカイン阻止部分が、前記サイトカインポリペプチドに結合する抗体または抗体の抗原結合性断片を含む、請求項３９～５６のいずれか１項に記載の使用または方法。
  58. 前記第１融合ポリペプチドが、
    配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０及び５３９～５７８
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３９～５６のいずれか１項に記載の使用または方法。
  59. 前記第２治療剤が、
    配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０及び５３９～５７８
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３９～５７のいずれか１項に記載の使用または方法。
  60. 前記第１融合ポリペプチドが、
    配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０及び５３９～５７８
    からなる群から選択されるアミノ酸を含み、前記第２治療剤が、
    配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、６３６～６４６、５７９～６０８、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０及び５３９～５７８
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記融合ポリペプチドと前記第２治療剤とが異なっている、請求項３９～５７のいずれか１項に記載の使用または方法。
  61. 前記第１融合ポリペプチドが第２ポリペプチド鎖に共有結合または非共有結合で結合している、請求項３９～６０のいずれか１項に記載の使用または方法。
  62. 前記第２ポリペプチド鎖と前記融合ポリペプチドの前記阻止部分とが相補的であり、一緒になって機能性結合部位を形成する、請求項６１に記載の使用または方法。
  63. 前記機能性結合部位が、前記融合ポリペプチド中に含有される前記サイトカインポリペプチドに対する特異性を有する、請求項６２に記載の使用または方法。
  64. 前記機能性結合部位が抗体のＦａｂ断片である、請求項６１～６３のいずれか１項に記載の使用または方法。
  65. 前記第１融合ポリペプチドが二量体化する、請求項６１～６４のいずれか１項に記載の使用または方法。
  66. 前記第１融合ポリペプチドが第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含み、前記第１ポリペプチドが、配列番号３６２、３６３、３２５、２８６、５７９、５８１または５８２から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチド配列が、配列番号２６３、２６４または３３３のアミノ酸配列を含む、請求項３９～６５のいずれか１項に記載の使用または方法。
  67. （ｉ）
    配列番号３６２、３６３、３２５、２８６、５７９、５８１または５８２から選択されるアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド鎖、及び
    配列番号２６３、２６４または３３３のアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド配列
    を含む、第１融合ポリペプチド、ならびに
    （ｉｉ）第２治療剤
    を含み、前記第２治療剤が、
    配列番号２５７～３００、３０２～３１７、３２５～３５３、３５５～３６５、３６６、３７２～３８１、３８３～３８５、３８８～４２０、５７９～６０８、６３６～６４６、３６８～３７１、４３４～４４０、４５３～５１９、５２３～５３８、４２１～４３０及び５３９～５７８
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２融合ポリペプチドであり、前記第１融合ポリペプチドと前記第２融合ポリペプチドとが同じでない、請求項３９～６５のいずれか１項に記載の方法または使用。
  68. 前記がんが、メラノーマ、腎癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、膵臓癌、脳腫瘍、膀胱癌または肺癌である、請求項３９～６７のいずれか１項に記載の使用または方法。
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