KR20240082401A - Il-2 전구약물 - Google Patents

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KR20240082401A
KR20240082401A KR1020247014914A KR20247014914A KR20240082401A KR 20240082401 A KR20240082401 A KR 20240082401A KR 1020247014914 A KR1020247014914 A KR 1020247014914A KR 20247014914 A KR20247014914 A KR 20247014914A KR 20240082401 A KR20240082401 A KR 20240082401A
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호세 안드레 샐머론-가르시아
윌리엄 윈스턴
대니얼 히클린
신디아 사이델-두간
헤더 브로드킨
크리스토퍼 니르쉴
티지아나 카파렐리
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웨어울프 세라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 유도성 IL-2 전구약물을 사용하여 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

IL-2 전구약물
본 출원은 2021년 10월 8일자로 출원된 미국 가출원 제63/253,964호, 2021년 12월 17일자로 출원된 미국 가출원 제63/290,941호 및 2022년 4월 7일자로 출원된 미국 가출원 제63/328,524호의 이익을 주장하며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
암 면역요법은 주로 체크포인트 억제제의 임상적 성공으로 인해 암 치료의 제4 기둥으로서 빠르게 자리매김하였다(1-3). 이러한 새로운 요법을 사용하여 일부 환자에 의해 달성된 지속적인 반응에도 불구하고, 반응자의 비율은 여전히 비교적 낮고 일부 암 유형에만 제한된다. 종양 돌연변이 부담, 종양 내 T 세포 침윤의 존재 또는 부재, 및 종양의 전반적인 면역억제 미세환경은 면역요법에 대한 반응에 크게 영향을 미친다. 면역 체크포인트 차단은 면역 활성화에 대한 반응으로 발생하는 생리적 정지-신호를 방지할 수 있지만, 항-종양 면역 반응을 긍정적으로 자극하기 위해 다른 접근법이 사용될 수 있다. 하나의 접근법은 면역-활성화 사이토카인의 사용을 수반한다. 수많은 전임상 및 임상적 연구는 항-종양 면역을 증가시키기 위한 사이토카인 요법의 가능성을 입증하였다. 사실상, 이는 임상적 사용을 위해 승인된 최초의 암 면역요법들 중 일부였다. 그러나, 전신 독성 및 열악한 약동학적 프로파일은 이들의 임상적 적용을 제한하였다(4).
인터루킨(IL)-2는 암세포의 면역-매개 사멸을 유도하는 중요한 사이토카인이며, 이들 작용 메커니즘은 선천성 및 적응성 면역 세포 모두의 자극을 포함한다. IL-2 수용체(IL-2R)는 3개의 서브유닛으로 구성된다: 분화 클러스터(CD)25(IL-2Rγ), CD122(IL-2Rγ) 및 CD132(IL-2Rγ). 신호 변환은 CD122 및 CD132의 이종이량체를 통해 매개된다. 동시에, 이들 분자는 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 대식세포 및 휴면 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 발현되는 IL-2 중간-친화성 수용체를 형성한다. 삼량체 IL-2 고-친화성 수용체(CD25/CD122/CD132)는 활성화된 T 및 NK 세포에 존재하며, CD4+FoxP3+ 조절 T 세포(Treg) 상에서 구성적으로 발현된다. IL-2는 T 세포 및 NK 세포의 증식 및 활성화를 증가시키고, CD8+ T 세포가 이펙터 및 기억 세포로의 분화를 유도한다(5,6). 재조합 인간 IL-2(프로류킨)는 고-용량 요법으로서 전이성 흑색종 및 신세포암종에 대한 임상적 사용이 승인되었으나, 이 치료는 이의 실용화를 제한하는, 혈관 누출 증후군 및 저혈압을 포함한 중증 부작용과 관련된다(5, 7).
IL-2 고-용량 요법의 한계를 해결하기 위해, 독성을 완화시키고 Treg의 활성화를 감소시킬 가능성으로 중간-친화성 수용체(CD122/CD132)에만 결합하는 차세대 IL-2 분자를 개발하기 위한 여러 접근법이 추구되었다(7-10). 그러나, 이들 분자 중 다수는 여전히 정상 조직에 위치한 비-종양 특이적 면역 세포 상에서 IL-2 수용체를 활성화시키고, 따라서, IL-2 신호전달과 관련된 독성을 최소화하지 못할 수 있다. 종양 미세환경에서 완전히 활성인 천연(native) IL-2를 전달하면서 말초에서 IL-2 신호전달을 차단하는 분자는 최소한의 전신 독성을 가진 IL-2 항-종양 활성의 완전한 잠재력을 달성하기 위한 보다 적절한 접근법일 수 있다.
강력한 항-종양 면역 반응을 자극하기 위해, 상기 종양 내에서 완전히 활성인 천연 IL-2 사이토카인을 방출시키고자 프로테아제 절단을 통해 종양 미세환경에서 조건부로 활성화되는 것인, 유도성 형태의 IL-2는 WO2021097376호에 기술되어 있다. 이러한 IL-2 전구약물은 프로테아제 절단가능한 링커를 통해 반감기 연장 도메인에 부착된 천연 IL-2 분자(예를 들어, VH 도메인과 같은 항-인간 혈청 알부민 항체 결합 단편) 및 말초의 정상 조직 상에서 IL-2β/γ 수용체에 대한 IL-2의 결합을 차단하는 IL-2 차단 요소(예를 들어, Fab과 같은 항-IL-2 항체 결합 단편)를 포함한다. 상기 프로테아제 절단가능한 링커의 절단시, 완전히 활성인 천연 IL-2가 종양 내에서 방출되어 강력한 항-종양 면역 반응을 자극한다.
2. 요약
본 개시내용은 유도성 IL-2 전구약물을 사용하여 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 일반적으로 유효량의 유도성 IL-2 전구약물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 유도성 IL-2 전구약물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 4일 수 있다. 상기 유도성 IL-2 전구약물은 화합물 5 내지 29 중 어느 하나일 수 있다.
유도성 IL-2 전구약물은 조건부 활성이다. 상기 유도성 IL-2 전구약물은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 제1 폴리펩티드 사슬은 아미노부터 카르복시 말단까지 다음을 포함할 수 있다: IL-2 폴리펩티드 - 프로테아제 절단가능한 링커 - 항-인간 혈청 알부민(HSA) 결합 단일 항체 가변 도메인 - 바람직하게는 프로테아제 절단가능한 링커 - IL-2에 결합하는 항체의 VH 및 CH1. 제1 폴리펩티드 사슬은 아미노부터 카르복시 말단까지 다음을 포함할 수 있다: IL-2 폴리펩티드 - 프로테아제 절단가능한 링커 - IL-2에 결합하는 항체의 VH 및 CH1 - 바람직하게는 프로테아제 절단가능한 링커 - 항-인간 혈청 알부민(HSA) 결합 단일 항체 가변 도메인. 제2 폴리펩티드 사슬은 IL-2에 결합하는 항체의 VL 및 CL을 포함하고, 이는 제1 폴리펩티드 사슬의 VH 및 CH1과 함께 IL-2 폴리펩티드에 결합하는 Fab를 형성한다. 유도성 IL-2 전구약물이 관심 부위(예를 들어, 종양 미세환경)에 없는 경우, 전구약물은 전형적으로 온전히 남아있다. 온전한 전구약물은 IL-2 수용체 작용제 활성을 약화시켰다. 유도성 IL-2 전구약물이 관심 부위(예컨대, 종양 미세환경)에 있는 경우, 프로테아제 절단가능한 링커는 관심 부위에서 활성인 프로테아제에 의해 절단되고, 약화되지 않은 형태의 IL-2를 방출한다. 이러한 조건부 활성은 비-유도성 IL-2 요법과 관련된 전신 독성을 제한하면서 IL-2의 면역 자극 효과를 보존한다. 온전한 IL-2 전구약물은 이의 반감기를 연장하는 요소를 함유하지만, 절단 후 약화되지 않은 형태의 IL-2는 그렇지 않다. 결과적으로, IL-2의 짧은 반감기는 관심 부위 외부의 독성을 효과적으로 제한한다.
본원에 추가로 기술되고 예시된 바와 같이, 전신 투여 후 순환(혈장) 내 유도성 IL-2 전구약물의 양은 종양 내 양보다 적어도 약 5배 초과일 수 있으며, 예를 들어 순환 내 양은 종양 내 유도성 IL-2 전구약물의 양보다 약 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 18배, 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 25배 초과일 수 있다. 종양 미세환경에서보다 순환에서 더 많은 전구약물이 발견되는 반면, 전구약물은 종양 미세환경에서 더 많이 처리(절단)되어 활성 IL-2를 방출한다. 전신 투여 후, 순환과 비교하여 종양 미세환경에서 활성 IL-2를 방출하기 위한 전구약물의 적어도 약 40배 이상의 절단일 수 있다. 구현예에서, 순환과 비교하여 종양 미세환경에서 유도성 IL-2 전구약물의 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 55배, 적어도 약 60배, 적어도 약 65배, 적어도 약 70배, 적어도 약 75배, 적어도 약 80배, 적어도 약 85배, 적어도 약 90배, 적어도 약 93배, 적어도 약 95배, 또는 적어도 약 100배 이상의 절단일 수 있다.
본 개시내용은 유효량의 유도성 인터루킨-2(IL-2) 전구약물을 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 유도성 IL-2 전구약물은 전신적으로 투여되며, 이는 다른 위치에서보다 종양 미세환경에서 더 높은 활성을 갖는 프로테아제에 의한 절단에 의해 활성화되고, 순환과 비교하여 종양 미세환경에서 유도성 IL-2 전구약물의 적어도 약 40배 이상의 절단을 초래한다. 상기 방법은 종양 반응성 CD8+/Treg 비율의 유의미한 증가를 초래할 수 있다.
본 개시내용은 종양에 대한 면역학적 기억을 유도하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 유효량의 유도성 인터루킨-2(IL-2) 전구약물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 유도성 IL-2 전구약물은 전신적으로 투여되며, 이는 다른 위치에서보다 종양 미세환경에서 더 높은 활성을 갖는 프로테아제에 의한 절단에 의해 활성화된다. 전신 투여 후 순환(혈장) 내 유도성 IL-2 전구약물의 양은 종양 내 양보다 적어도 약 5배 초과일 수 있으며, 예를 들어 순환 내 양은 종양 내 유도성 IL-2 전구약물의 양보다 약 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 18배, 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 25배 초과일 수 있다. 전신 투여 후, 순환과 비교하여 종양 미세환경에서 활성 IL-2를 방출하기 위한 전구약물의 적어도 약 40배 이상의 절단일 수 있다. 구현예에서, 순환과 비교하여 종양 미세환경에서 유도성 IL-2 전구약물의 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 55배, 적어도 약 60배, 적어도 약 65배, 적어도 약 70배, 적어도 약 75배, 적어도 약 80배, 적어도 약 85배, 적어도 약 90배, 적어도 약 93배, 적어도 약 95배, 또는 적어도 약 100배 이상의 절단일 수 있다. 상기 면역학적 기억은 기억 표현형(예를 들어, CD8+CD44hiCD62low)을 갖는 종양 반응성 CD8+ 세포의 존재에 의해, 재자극시 TNF, IFN감마 및/또는 그랜자임 B를 생성하는 종양 반응성 CD8+ 세포, 또는 재자극시 TNF, IFN감마 및/또는 그랜자임 B를 생성하는 기억 표현형을 갖는 종양 반응성 CD8+ 세포에 의해 특징지어질 수 있다.
본 개시내용은 종양 미세환경에서 이펙터 CD8+ T 세포를 선택적으로 활성화시키기 위한 방법, 및 종양 침윤 림프구를 선택적으로 활성화시키기 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 유효량의 유도성 인터루킨-2(IL-2) 전구약물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 유도성 IL-2 전구약물은 전신적으로 투여되며, 이는 다른 위치에서보다 종양 미세환경에서 더 높은 활성을 갖는 프로테아제에 의한 절단에 의해 활성화되고, 말초 조직에 비해 종양 내에서 TNF 및/또는 IFN감마를 생성하는 CD8+ T 세포의 유의미하게 더 높은 빈도를 초래한다. 다른 위치에서보다 종양 미세환경에서 더 높은 활성을 갖는 프로테아제에 의한 절단. 전신 투여 후 순환(혈장) 내 유도성 IL-2 전구약물의 양은 종양 내 양보다 적어도 약 5배 초과일 수 있으며, 예를 들어 순환 내 양은 종양 내 유도성 IL-2 전구약물의 양보다 약 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 18배, 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 25배 초과일 수 있다. 전신 투여 후, 순환과 비교하여 종양 미세환경에서 활성 IL-2를 방출하기 위한 전구약물의 적어도 약 40배 이상의 절단일 수 있다. 구현예에서, 순환과 비교하여 종양 미세환경에서 유도성 IL-2 전구약물의 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 55배, 적어도 약 60배, 적어도 약 65배, 적어도 약 70배, 적어도 약 75배, 적어도 약 80배, 적어도 약 85배, 적어도 약 90배, 적어도 약 93배, 적어도 약 95배, 또는 적어도 약 100배 이상의 절단일 수 있다. 이러한 방법은 종양 미세환경에서 종양 반응성 CD8+/Treg 비율의 유의미한 증가를 초래할 수 있다.
본 개시내용의 방법의 구현예에서, 상기 유도성 IL-2 전구약물은 약 주 2회 이하 빈도로, 주 1회 이하 빈도로, 또는 약 2주마다 1회 이하 빈도로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 유도성 IL-2 전구약물은 약 2주마다 1회 투여될 수 있다.
본 개시내용의 방법에 사용하기 위한 바람직한 유도성 IL-2 전구약물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 또는 전술한 것 중 임의의 아미노산 서열 변이체이다. 본 개시내용의 방법에 사용하기 위한 다른 바람직한 유도성 IL-2 전구약물은 화합물 5 내지 29이다. 화합물 1은 서열번호:1의 제1 폴리펩티드 사슬 및 서열번호:5의 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 화합물 1의 아미노산 서열 변이체는 서열번호:1과 적어도 약 80% 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있고, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열번호:5와 적어도 약 80% 동일성을 포함할 수 있다. 화합물 2는 서열번호:2의 제1 폴리펩티드 사슬 및 서열번호:5의 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 화합물 2의 아미노산 서열 변이체는 서열번호:2와 적어도 약 80% 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 사슬 및 서열번호:5와 적어도 약 80% 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 화합물 3은 서열번호:3의 제1 폴리펩티드 사슬 및 서열번호:5의 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 화합물 3의 아미노산 서열 변이체는 서열번호:3과 적어도 약 80% 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 사슬 및 서열번호:5와 적어도 약 80% 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 화합물 4는 서열번호:1의 제1 폴리펩티드 사슬 및 서열번호:4의 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 화합물 4의 아미노산 서열 변이체는 서열번호:4와 적어도 약 80% 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 사슬 및 서열번호:5와 적어도 약 80% 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다.
도 1a-1f는 화합물 1로 표시되는 유도성 IL-2 전구약물의 설계 및 개발을 보여준다. 도 1a는 화합물 1의 구성 요소의 도식이다. 도 1b는 온전한 및 프로테아제-절단된 화합물 1(IL-2, 항-HSA 반감기 연장 도메인 및 Fab 비활성화 도메인)을 비교한 비-환원된 SDS-PAGE를 나타낸다. 도 1c는 온전한(사각형) 및 프로테아제-활성화된(절단된) 화합물 1(삼각형)을 rhIL-2(원형)와 비교한 HEK-Blue IL-2 리포터 검정에서 화합물 1의 시험관내 활성을 보여준다. 도 1d는 rhIL-2(원형)와 비교하여 일차 인간 Tblast에서 온전한(사각형) 및 절단된(삼각형) 화합물 1의 시험관내 활성을 보여준다. 도 1e는 rhIL-2(원형)와 비교하여 일차 뮤린 Tblast에서 온전한(사각형) 및 절단된(삼각형) 화합물 1의 시험관내 활성을 보여준다. 도 1f는 rhIL-2(사각형)과 비교하여 일차 인간 Tblast에서 온전한(원형) 및 절단된(삼각형) 화합물 1-NC의 시험관내 활성을 보여준다. 도 1c-1f 곡선은 적어도 이반복(duplicate) 웰을 대표하며 개별 지점에 대한 평균 ± SD를 나타낸다; 데이터는 적어도 2개의 실험을 대표한다.
도 2a-2j는 화합물 1이 절단-의존적 방식으로 종양 퇴행을 유도하였음을 나타낸다. 도 2a는 다양한 용량의 화합물 1, 화합물-NC(비-절단가능한 대조군) 또는 비히클로 처리된 마우스에서 시간 경과에 따른 종양 부피를 보여주는 일련의 그래프이다. 개별 마우스에 대한 스파이더 플롯을 나타내고(점선), 그룹에 대한 평균 종양 부피는 굵은 선으로 나타낸다. 도 2b는 화합물 1 또는 WW0177(비활성화 도메인이 결여된 화합물 1 변이체)로 처리된 것을 보여주는 시간 경과에 따른 개별 마우스로부터의 체중 및 생존을 보여주는 그래프이다. 시간 경과에 따른 개별 마우스로부터의 체중 및 생존율을 보여준다. WW0177의 투약은 과도한 독성으로 인해 2회 투약 후 중단된 반면, 화합물 1을 받은 마우스는 모두 4회 투약이 제공되었다. 도 2c는 야생형 또는 MC38 종양-보유 마우스로부터의 뮤린 혈장에 희석하고 화합물 1 처리 전 37℃에서 24, 48 또는 72시간 동안 인큐베이션한 화합물 1에 대한 웨스턴 블롯을 보여준다. 온전한 및 절단된 대조군은 시험관내에서 제조하였다. 데이터는 n = 3의 마우스를 대표한다. 도 2d는 유효량의 화합물 1(총 5.04 μM) 또는 rhIL-2(총 15.5 μM)로 처리된 마우스에서 시간 경과에 따른 종양 부피를 보여주는 그래프이다. 개별 마우스에 대한 스파이더 플롯을 보여준다. 도 2e는 종양-보유 마우스로부터의 혈장 내 시간 경과에 따른 총 IL-2를 보여주는 그래프이다. 샘플을 다양한 시점에서 채취하고 온전한 화합물 1 뿐만 아니라 유리 IL-2를 모두 검출하는 ELISA를 사용하여 총 유도성 IL-2 단백질의 존재에 대해 분석하였다. 도 2f는 종양-보유 마우스로부터의 종양 샘플에서 시간 경과에 따른 총 IL-2를 보여주는 그래프이다. 샘플을 다양한 시점에서 채취하고 온전한 화합물 1 뿐만 아니라 유리 IL-2를 모두 검출하는 ELISA를 사용하여 총 유도성 IL-2 단백질의 존재에 대해 분석하였다. 도 2g는 종양-보유 마우스로부터의 혈장 내 시간 경과에 따른 총 IL-2를 보여주는 그래프이다. 샘플을 다양한 시점에서 채취하고 차단되지 않은 인간 IL-2에 특이적인 AlphaLISA를 사용하여 유리 인간 IL-2를 검출하는 ELISA를 사용하여 총 유도성 IL-2 단백질의 존재에 대해 분석하였다. 마우스는 단지 2회 용량만을 받았으며, 투약의 시기는 종속(x) 축 상의 화살표로 표시된다. 도 2h는 종양-보유 마우스로부터의 종양 샘플에서 시간 경과에 따른 총 IL-2를 보여주는 그래프이다. 샘플을 다양한 시점에서 채취하고 차단되지 않은 인간 IL-2에 특이적인 AlphaLISA를 사용하여 유리 인간 IL-2를 검출하는 ELISA를 사용하여 총 유도성 IL-2 단백질의 존재에 대해 분석하였다. 마우스는 단지 2회 용량만을 받았으며, 투약의 시기는 종속(x) 축 상의 화살표로 표시된다. 도 2e-2h는 평균 ± SD로 제시되며, 곡선하면적 측정은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 도 2i는 비히클, 25 μg, 50 μg, 100 μg 및 300 μg의 화합물 1 및 300 μg의 화합물 1-NC를 사용한 18일째의 종양 부피(mm3)를 보여주는 그래프이다. 도 2j는 주당 2회 항-CD8 항체 처리에 의해 CD8+ T 세포가 고갈되었을 때 화합물 1의 항-종양 활성이 마우스에서 크게 감소되었음을 보여주는 그래프이다.
도 3a-3i는 화합물 1이 항-종양 기억 반응을 유도하였음을 입증한다. 도 3a-3b는 비장세포에서 사량체-양성 CD8+ T 세포의 빈도를 보여준다. 도 3c-3d는 비장세포에서 사량체-양성 CD8+ T 세포 상의 기억 세포 마커 CD62L 및 CD44의 발현을 보여준다. 도 3e-3f는 TNF 또는 IFNγ를 생성하는 사량체-양성 CD8+ T 세포의 빈도를 보여준다. 도 3g는 IFNγ 및 TNF를 공-발현하는 다기능성 사량체-양성 CD8+ T 세포의 분석을 보여주는 원 그래프이다. 도 3h는 종양 투여 및 재투여 연구의 개략도이다. IL-2 INDUKINE™ 단백질 처리 후 이전에 MC38 종양이 거부된 나이브 마우스 또는 마우스는 초기 이식 60일후 MC38 종양 세포로 재-투여하였다. 재-투여 동안 이들 마우스에 처리가 시행되지 않았다. 도 3i는 시간 경과에 따라 측정된 MC38 CR(n = 15) 또는 나이브(n = 33) 마우스로부터의 종양 부피를 나타내는 그래프를 보여준다. 데이터는 t 테스트로부터 파생된 P 값으로 평균 ± SD로 제시된다(*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001).
도 4a-4m은 화합물 1을 이용한 처리가 면역 세포 활성화 및 MC38 종양의 침윤을 증가시켰음을 보여준다. 도 4a는 두 처리(화합물 1 및 비히클 대조군) 간의 발현에 있어서 통계적으로 유의미한 차이를 갖는 전사체의 히트맵을 나타낸다. 전사체는 이들이 평균 정규화된 수가 50 미만인 경우 히트맵으로부터 제외되었다. 각 레인은 개별 동물을 나타낸다. 도 4b는 화합물 1 및 비히클-처리된 마우스 간에 차등적으로 발현된 전사체의 플롯이다. 도 4c는 화합물 1 또는 비히클-처리된 마우스에 대한 특정 경로 점수를 나타낸다. P 값은 다중 비교를 포함한 이원분산분석(2-way ANOVA)로부터 파생된다(***, P < 0.001; ****, P < 0.0001). 도 4d는 선택된 면역 체크포인트 유전자로부터 정규화된 유전자 수를 보여준다. 도 4e는 비히클- 및 화합물 1-처리된 그룹 간의 배수 변화 정보를 비롯하여, 다양한 면역 집단의 TIL 밀도의 유세포 측정 분석으로부터의 다이어그램을 나타낸다. 도 4f는 비히클- 및 화합물 1-처리된 그룹 간의 배수 변화 정보를 비롯하여, TIL 내의 Treg에 대한 총 CD8+ T 세포 또는 사량체-양성 CD8+ T 세포의 비율을 보여준다. 도 4g-4h는 PMA/이오노마이신으로 재-자극 후 IFNγ를 생성하는 사량체-양성 CD8+ T 세포의 빈도를 보여준다. 도 4i는 PMA/이오노마이신 재자극 후 IFNγ, TNF 및 그랜자임 B의 공-발현을 조사함으로써 다기능성 사량체-양성 CD8+ T 세포 분석의 원 그래프를 보여준다. 도 4j-4k는 비히클(대조군) 및 화합물 1 그룹에서 IFNγ를 생성하는 종양-침윤 FoxP3+ Treg의 빈도를 보여준다. 도 4l-4m은 비히클(대조군) 및 화합물 1 그룹에서 PMA/이오노마이신 재자극 후 TNF를 생성하는 종양-침윤 FoxP3+ Treg의 빈도를 보여준다. 달리 언급되지 않는 한, 데이터는 평균 ± SD로 제시되며, P 값은 t 테스트로부터 파생된다(*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001).
도 5a-5c는 화합물 1을 이용한 전신 치료가 종양-침윤 T 세포를 우선적으로 활성화시켰음을 보여준다. 도 5a는 TIL, 비장세포, DLN 및 말초 혈액에서 비히클(대조군) 및 화합물 1 그룹에서의 사량체-음성 CD8+ T 세포의 빈도를 보여주는 그래프이다. 도 5b는 PMA/이오노마이신으로 재-자극 후 TIL, 비장세포, DLN 및 말초 혈액에서 비히클(대조군) 및 화합물 1 그룹에서의 IFNγ를 생성하는 CD4+ 비-Treg의 빈도를 보여주는 그래프이다. 도 5c는 비히클(n = 10), 화합물 1 단독(n = 10), 또는 매일 FTY720(n = 10) 처리와 함께 화합물 1로 처리된 마우스에서 시간 경과에 따른 종양 부피를 보여주는 그래프이다. FTY720 투약은 화합물 1 처리(25 μg 용량)를 시작하기 24시간 전에 시작하고 실험 전반에 걸쳐 매일 유지하였다(10 μg 용량). 종양 부피(평균 ± SEM)는 시간 경과에 따라 측정하였다. 달리 언급되지 않는 한, 데이터는 평균 ± SD로 제시되며, P 값은 t 테스트로부터 파생된다(*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001).
도 6a-6g는 화합물 1을 이용한 처리가 B16-F10에서 CD8+ T 세포 활성화 및 Treg 취약성을 증가시켰음을 보여준다. 도 6a는 비히클, 100 μg/동물 및 200 μg/동물의 화합물 1, 및 항-PD1 억제제와 조합한 100μg/동물 및 200μg/동물의 화합물 1로 처리된 마우스에서 시간 경과에 따라 측정한 종양 부피를 보여준다. 개별 마우스로부터의 데이터(점선)는 굵은 선으로 제시된 그룹 평균으로 나타낸다. 도 6b는 두 처리(비히클 대조군 및 화합물 1) 간의 발현에 있어서 통계적으로 유의미한 차이를 갖는 전사체의 히트맵을 나타낸다. 전사체는 이들이 평균 정규화된 수가 50 미만인 경우 히트맵으로부터 제외되었다. 각 레인은 개별 동물을 나타낸다. 도 6c-6h는 재-자극된 TIL의 결과를 보여주는 일련의 그래프이고, 이펙터 사이토카인 및 단백질의 생성 및 증식에 대해 조사되었다. 도 6c는 사량체-양성 CD8+ T 세포의 대표적인 플로우 플롯이다. 도 6d는 개별 마우스로부터의 정량적 분석을 보여주는 그래프이다. 도 6e는 NK 세포의 대표적인 플로우 플롯이고, 도 6f는 개별 마우스로부터의 정량적 분석을 보여주는 그래프이다. 도 6g는 FoxP3+ Treg의 대표적인 플로우 플롯이고, 도 6h는 개별 마우스로부터의 정량적 분석을 보여주는 그래프이다. P 값은 t 테스트로부터 파생된다(*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001).
도 7a-7b는 화합물 1이 인간 혈청에서 안정하고 인간 종양 세포에 의해 선택적으로 처리되었음을 보여준다. 도 7a는 웨스턴 블롯 분석으로부터의 결과를 보여주며, 여기서 화합물 1은 n = 3의 공여자로부터의 건강한 인간 혈청으로 희석되었고, 처리한 화합물 1을 IL-2에 대한 웨스턴 블롯 분석으로 측정하기 전에 37℃에서 24 또는 72시간 동안 인큐베이션하였다. 도 7b는 화합물 1을 일차 세포에 노출시키고 생체외 유도성 IL-2 단백질 절단이 일차 인간 종양 샘플(n = 97) 및 일차 인간 건강한 세포(n = 13)에서 측정되었을 때 총 활성화의 그래프를 보여준다.
도 8a-8d는 추가적인 인간 공여자 및 마우스에서의 화합물 1의 활성을 보여준다. 도 8a-8b는 PHA 자극에 반응하여 시간 경과에 따른 Tblast에 의한 CD25 발현을 보여준다. 도 8a에서의 데이터는 개별적인 인간 공여자를 대표한다. 도 8b는 n = 3의 공여자로부터 모은(pooled) 데이터이다. 도 8c-8d는 온전한(원형) 및 프로테아제-활성화된(절단된) WTX-124(하향 삼각형)를 rhIL-2(상향 삼각형)와 비교하여, 추가 공여자로부터 유래된 일차 인간 Tblast(도 8c) 및 뮤린 Tblast(도 8d)에서 화합물 1의 시험관내 활성을 보여주는 그래프이다.
도 9a-9b는 화합물 1이 마우스에서 잘 용인됨을 보여준다. 도 9a는 MC38 종양 세포가 이식된 마우스의 시간 경과에 따른 체중을 보여주는 그래프이며, 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하기 전에 평균 부피 100-150 mm3까지 성장하도록 허용하였다. 범례에서의 라벨은 투여일당 마우스당 용량을 나타낸다. 마우스는 총 4회 용량에 대해 주 2회 IP 투약하고, 체중은 시간 경과에 따라 측정하였다. 그룹당 n = 12의 마우스의 평균 체중을 나타낸다. 도 9b는 MC38 종양-보유 마우스에서 rhIL-2 및 화합물 1의 대표적인 치료적 창(therapeutic window)을 보여주는 그래프이다.
도 10a-10b는 MC38 종양-침윤 사량체-양성 CD8+T 세포의 이펙터 사이토카인 생성을 보여준다. MC38 종양 세포를 이식하고 마우스를 치료 그룹으로 무작위화하기 전에 평균 부피 100 mm3까지 성장하도록 허용하였다. 마우스는 화합물(100 μg) 또는 PBS 비히클로 주 2회 투약하였다. 종양은 제2 투약 후 24시간째 수집하고, 추가 분석을 위해 분리하였다. PMA/이오노마이신으로 재자극 후 TNF(도 10a) 또는 그랜자임 B를 생성하는 사량체-양성 CD8+ T 세포의 빈도(도 10b). P 값은 t 테스트로부터 파생된다(*, P < 0.05).
도 11은 PD-1 단독요법이 B16-F10에서 항-종양 활성을 갖지 않음을 보여주는 그래프이다. B16-F10 종양을 이식하고 마우스를 처리 그룹으로 무작위화하기 전에 평균 부피 100 mm3까지 성장하도록 허용하였다. 마우스는 비히클(빈 원형; 또는 항-PD-1(속이 꽉 찬 원형, 200 μg))을 2주 동안 주 2회 IP 투약하였다. 종양 부피는 시간 경과에 따라 측정하였다. 데이터는 그룹당 n = 10의 마우스를 대표한다.
도 12a-12b는 기준선 종양-침윤 림프구 분석의 결과를 보여준다. MC38 및 B16-F10 종양을 이식하고, TIL 분석을 위해 종양을 수확하기 전에 평균 부피 100 mm3까지 성장하도록 허용하였다. 도 12a는 다양한 면역 세포 집단의 식별을 위한 게이팅 전략을 보여준다. 도 12b는 CD45+ 집단 내의 다양한 면역 집단의 빈도를 보여준다.
도 13a-13g는 마우스에서 화합물 1 처리의 결과를 보여준다. MC38 종양 세포를 이식하고 마우스를 치료 그룹으로 무작위화하기 전에 평균 부피 100-150 mm3까지 성장하도록 허용하였다. 범례에서의 라벨은 투여일당 마우스당 용량을 나타낸다. 마우스는 총 4회 용량에 대해 주 2회 IP 투약하였다. 도 13a는 시간 경과에 따라 측정된 체중을 보여주는 그래프이다. 그룹당 n = 12의 마우스의 평균 체중을 나타낸다. 도 13b는 시간 경과에 따라 측정된 종양 부피를 보여주는 그래프이며, 이는 평균 +/- SEM으로 나타낸다. 도 13c는 MC38 종양 보유 마우스를 무작위화하고, 비히클, 화합물 1, 또는 반감기 연장 요소가 결여된 IL-2 전구약물을 투약한 결과를 보여주는 그래프이다. 종양 부피는 시간 경과에 따라 측정되었고, 이는 평균 +/- SEM으로 나타낸다. 도 13d는 마우스가 에반스 블루(Evan's Blue) 용액으로 정맥내로 주사되기 전에, 등몰량의 재조합 인간 IL-2(3일에 걸쳐 총 5회 용량), WW0177(3일에 걸쳐 2회 용량) 또는 화합물 1(3일에 걸쳐 2회 용량)을 투약한 마우스의 결과를 보여준다. 폐 내로 에반스 블루 일혈(extravasation)은 염료의 정맥 투여 30분 후에 측정되었다. 도 13e는 인간 특이적 IL-2 ELISA에 의한 재조합 인간 IL-2 또는 재조합 마우스 IL-2의 검출을 보여주는 그래프이다. 도 13f는 인간 특이적 IL-2 Alphalisa에 의한 화합물 1 또는 유리 IL-2의 검출을 보여주는 그래프이다. 도 13g는 MC38 종양-보유 마우스에서 rhIL-2, WW0177, 또는 화합물 1을 대표하는 치료적 창을 보여주는 그래프이다. P 값은 t 테스트로부터 파생된다(*, P < 0.05; ***, P<0.001). ELISA, 효소-결합 면역흡착 검정; IL-2, 인터루킨-2; IP, 복강내; MC, 뮤린 결장; rhIL-2, 재조합 인간 IL-2; SEM, 평균의 표준 오차; TW, 치료적 창.
도 14a-14c는 화합물 1이 B16-F10 TIL을 활성화할 시 등몰량의 재조합 인간 IL-2에 비해 우수함을 보여주는 그래프이다. B16-F1 종양을 이식하고 마우스를 치료 그룹으로 무작위화하기 전에 평균 부피 100 mm3까지 성장하도록 허용하였다. 마우스는 비히클(빈 원형; 또는 항-PD-1(속이 꽉 찬 원형, 200 μg))을 2주 동안 주 2회 IP 투약하였다. 도 14a는 시간 경과에 따라 측정된 종양 부피를 보여주는 그래프이다. 데이터는 그룹당 n = 10의 마우스를 대표하며, 평균 +/- SEM으로 나타낸다. 도 14b-14c는 5일째에 수확된 비히클, 화합물 1(200 μg/용량) 또는 등몰량의 재조합 인간 IL-2로 처리된 마우스로부터의 종양 결과를 보여준다. 도 14b는 CD25 발현의 정량적 분석을 보여주고, 도 14c는 다양한 면역 세포 서브세트에 의한 Ki67 발현. P 값은 다중 비교를 포함한 일원분산분석(one way ANOVA)으로부터 파생된다(*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001).
도 15a-15c는 비-알파 IL-2 뮤테인을 함유하는 화합물 1의 변이체(화합물 5)가 동일한 용량의 화합물 1과 비교할 때 항-종양 활성이 없음을 보여주는 그래프이다. 도 15a는 비히클, 화합물 1(천연 IL-2 페이로드 함유, 100 μg/용량), 또는 페이로드 (100 μg/용량) (화합물 5)로서 비-알파 IL-2 뮤테인을 함유하는 화합물 1의 변이체로 처리된 MC38 종양 보유 마우스에서 시간 경과에 따라 측정된 종양 부피를 보여주는 그래프이다. 도 15b는 5일째에 그랜자임 B, IFNγ 또는 TNF를 생성하는 종양 침윤 사량체 +CD8+ T 세포의 빈도를 나타내는 그래프이다. 도 15c는 그랜자임 B 또는 IFNγ를 생성하는 종양 침윤 NK 세포의 빈도를 보여주는 그래프이다.
본 개시내용은 유도성 IL-2 전구약물을 사용하여 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 일반적으로 유효량의 유도성 IL-2 전구약물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 유도성 IL-2 전구약물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 4일 수 있다. 상기 유도성 IL-2 전구약물은 화합물 5 내지 29 중 어느 하나일 수 있다. 상기 유도성 IL-2 전구약물은 종양 미세환경에서 IL-2를 선택적으로 활성화시키고, 암을 가진 환자에서 항-종양 효과를 개선시키면서 IL-2-관련 독성을 감소시킬 수 있다. 본 발명자들은 유도성 IL-2가 종양-관련 프로테아제에 의해 종양 조직에서 우선적으로 활성화되고, 이는 종양 미세환경에서 활성 IL-2를 방출한다는 것을 입증하고 예시한다. 시험관내 검정은 유도성 IL-2 전구약물(화합물 1)의 활성이 단백질 분해 활성화에 의존하고, 유도성 IL-2 전구약물 처리가 절단-의존적 방식으로 확립된 종양의 완전한 거부를 초래함을 확인하였다.
본 발명자들은 유도성 IL-2 전구약물을 포함한 처리가 T 세포 및 자연 살해 세포의 활성화를 촉발하고, 종양 미세환경의 면역 활성화 프로파일을 현저하게 이동시키고, 이는 동계 종양 모델에서 종양 성장의 유의미한 억제를 초래한다. 본 발명자들은 또한 유도성 IL-2 전구약물이 종양 미세환경에서 IL-2의 완전한 약리학을 유지하면서 말초에서 IL-2 처리의 독성을 최소화하고, 이는 신규한 암 면역요법 치료로서 이의 추가 개발을 뒷받침함을 보여주었다.
A. IL-2 전구약물
본 개시내용의 방법 및 조성물에 사용하기 위한 유도성 IL-2 전구약물은 종양학에서 사이토카인의 임상적 사용을 심각하게 제한한 독성 및 짧은 반감기 문제를 극복한다. 유도성 IL-2 전구약물은 IL-2Rα/β/γ 및 IL-2Rβ/γ에 결합하고 이를 통한 신호전달 활성화를 비롯하여, 천연 IL-2의 수용체 작용제 활성을 갖는 IL-2 폴리펩티드를 함유하지만, 유도성 전구약물의 맥락에서 사이토카인 수용체 작용제 활성이 약화되고 순환 반감기가 연장된다. 전구약물은 종양 미세환경과 연관되고 전형적으로 풍부화되거나 선택적으로 존재하는 프로테아제에 의해 절단되는 프로테아제 절단 서열을 포함한다. 따라서, 유도성 IL-2 전구약물은 종양 미세환경에서 우선적으로 (또는 선택적으로) 그리고 효율적으로 절단되어 활성 IL-2를 방출하고, IL-2 활성을 종양 미세환경에 실질적으로 제한한다. 절단시 방출되는 IL-2는 짧은 반감기를 가지며, 이는 자연적으로 발생하는 IL-2의 반감기와 실질적으로 유사하며, IL-2 활성을 종양 미세환경으로 추가로 제한한다. 유도성 IL-2 전구약물의 반감기가 연장되더라도, 순환 전구약물이 IL-2 활성을 약화시키고, 활성 IL-2가 종양 미세환경으로 제한되기 때문에 독성이 극적으로 감소하거나 제거된다.
유도성 IL-2 전구약물은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 제1 폴리펩티드 사슬은 아미노부터 카르복시 말단까지 다음을 포함할 수 있다: IL-2 폴리펩티드 - 프로테아제 절단가능한 링커 - 항-인간 혈청 알부민(HSA) 결합 단일 항체 가변 도메인 - 바람직하게는 프로테아제 절단가능한 링커 - IL-2에 결합하는 항체의 VH 및 CH1. 제1 폴리펩티드 사슬은 아미노부터 카르복시 말단까지 다음을 포함할 수 있다: IL-2 폴리펩티드 - 프로테아제 절단가능한 링커 - IL-2에 결합하는 항체의 VH 및 CH1 - 바람직하게는 프로테아제 절단가능한 링커 - 항-인간 혈청 알부민(HSA) 결합 단일 항체 가변 도메인. 제2 폴리펩티드 사슬은 IL-2에 결합하는 항체의 VL 및 CL을 포함하고, 이는 제1 폴리펩티드 사슬의 VH 및 CH1과 함께 IL-2 폴리펩티드에 결합하는 Fab를 형성한다. 화합물 1, 2, 3 및 4는 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 유도성 IL-2 전구약물의 구체적인 예이다. 화합물 1, 2, 3 및 4, 및 이들의 활성에 관한 추가적인 세부사항은 WO2021/097376호에 개시되어 있다. 화합물 5-29는 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 유도성 IL-2 전구약물의 추가적인 예이다.
표 1. 유도성 IL-2 전구약물
말초에서 약화된 IL-2 활성을 유지하고 종양 미세환경에서 프로테아제 절단시 활성 IL-2를 방출하는, 화합물 1, 2, 3 및 4의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 전구약물은 서열번호:1과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:2와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:3과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:4와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
말초에서 약화된 IL-2 활성을 유지하고 종양 미세환경에서 프로테아제 절단시 활성 IL-2를 방출하는, 화합물 5 내지 29의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다.
전구약물은 서열번호:1과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:8과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:1과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:9와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:1과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:10과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:1과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:11과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:1과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:12와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:13과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:14와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:15와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:16과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:17과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:18과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:19와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:20과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:21과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:22와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:23과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:24와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:25와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:26과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:27과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:28과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:29와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:30과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:31과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
전구약물은 서열번호:32와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호:5와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
모든 아미노산 서열 변이체 전구약물에 대해, 서열 변이체 전구약물이 종양 미세환경에서 절단되고, 상응하는 모(parental) 전구약물과 실질적으로 동일한 정도로 IL-2를 방출하도록, 프로테아제 절단 부위는 아미노산 대체를 함유하지 않거나, 보존적 아미노산 대체만을 함유하는 것이 바람직하다. 유사하게, a) 서열 변이체 전구약물의 혈청 반감기가 상응하는 모 전구약물과 실질적으로 동일하고, b) 서열 변이체 전구약물의 IL-2 작용제 활성의 약화가 상응하는 모 전구약물과 실질적으로 동일하도록, 항-HAS 단일 가변 도메인 및 항-IL2 Fab의 상보성 결정 영역은 아미노산 대체를 함유하지 않거나 보존적 아미노산 대체만을 함유하는 것이 바람직하다.
예시적인 아미노산 치환은 표 2에 제공된다.
표 2. 예시적인 아미노산 치환
B. 치료적 용도 및 약제학적 조성물
본 개시내용은 추가로 선택적으로 하나 이상의 추가적인 치료제, 예컨대 화학요법제, 사이토카인, 종양용해성 바이러스, 면역-종양제 또는 체크포인트 억제제(예를 들어, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체)와 조합하여, 유도성 IL-2 전구약물을 사용하여 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 적합한 화학요법제(예를 들어, 시클로포스파미드, 메클로레타민, 멜팔란, 클로람부실, 이포스파미드, 부설판, N-니트로소-N-메틸우레아(MNU), 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 세무스틴(MeCCNU), 포테무스틴, 스트렙토조토신, 다카르바진, 미토졸로미드, 테모졸로미드, 티오테파, 미토마이신, 디아지쿠온(AZQ), 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 프로카바진, 헥사메틸멜라민, 메토트렉세이트, 페메트렉시드, 플루오로우라실(예를 들어, 5-플루오로우라실), 카페시타빈, 시타라빈, 젬시타빈, 데시타빈, 아자시티딘, 플루다라빈, 넬라라빈, 클라드리빈, 클로파라빈, 펜토스타틴, 티오구아닌, 메르캅토퓨린, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 빈플루닌, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포사이드, 테니포사이드, 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 피라루비신, 아클라루비신, 미톡산트론, 악티노마이신, 블레오마이신, 비산트렌, 젬시타빈, 시타라빈 등), 면역 체크포인트 단백질은 예를 들어, 리간드 PD-L1(B7-H1, CD274) 및 PD-L2(B7-DC, CD273)에 결합하는 PD-1, B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86)에 결합하는 CTLA-4(CD152), 갈렉틴3(Galectin3), LSECtin 및 FGL1에 결합하는 LAG 3(CD223); 리간드 Ceacam1 및 갈렉틴9에 결합하는 TIM3(HAVCR2); CD112 및 CD155에 결합하는 TIGIT(VSTM3, WUCAM); HVEM(TNFRSF14)에 결합하는 BTLA(CD272), HVEM에 결합하는 B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), VISTA(B7-H5), KIR, CD44(2B4), CD160(BY55); CD252(OX-40L)에 결합하는 CD134(TNRFSR4, OX40)를 포함한다. 면역 체크포인트 단백질에 결합하고 이들의 면역억제 활성을 억제하는 항체와 같은 치료제는 항-PD1 항체인 펨브로리주맙(KEYTRUDA), 도스타리맙(JEMPERLI), 세미플리맙-rwlc(LIBATYO), 니볼루맙(OPDIVO), 캄렐리주맙, 티슬렐리주맙, 토리팔리맙 및 신틸리맙(TYVYT); 항-PD-L1 항체인 아벨루맙(BAVENCIO), 더발루맙(IMFINZI) 및 아테졸리주맙(TECENTRIQ); 항-CTLA-4 항체인 이필리무맙(YERVOY)을 포함한다.
유도성 IL-2 전구약물 및 임의의 추가적인 치료제는 전형적으로 예를 들어 정맥내 주사 또는 바람직하게는 정맥내 주입에 의해 전신적으로 투여된다. 다른 유형의 투여는 예컨대 경구로, 비경구로, 정맥내, 정맥내로, 관절내로, 복강내로, 근육내로, 피하로, 공동내, 경피로, 간내로, 두개내로, 분무/흡입, 기관지 내시경을 통한 설치에 의해 또는 종양내로 사용될 수 있다.
본원에 개시된 방법 및 조성물은 임의의 적합한 암, 특히 육종 및 암종과 같은 고형 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 부신피질 암종, 항문암, 충수암, 성상세포종, 기저 세포 암종, 뇌종양, 담관암, 방광암, 골암, 유방암, 기관지 종양, 원발성 기원 불명의 암종, 심장 종양, 자궁경부암, 척색종, 결장암, 대장암, 두개인두종, 유관 암종(ductal carcinoma), 배아 종양, 자궁내막암, 상의세포종(ependymoma), 식도암, 감각신경모세포종, 섬유성 조직구종, 유잉육종, 안구암, 생식세포종양, 담낭암, 위암, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 간질성 종양, 임신성 영양막 질환, 신경교종, 두경부암, 간세포암, 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암, 안구내 흑색종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 구순 및 구강암, 간암, 소엽성 상피내 암종, 폐암, 마크로글로불린혈증, 악성 섬유성 조직구종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 원발성 잠재성을 지닌 전이성 편평 경부암, NUT 유전자와 관련된 정중선 관 암종(midline tract carcinoma), 구강암, 다발성 내분비샘 종양 증후군, 다발성 골수종, 균상 식육종, 골수이형성증후군, 골수이형성/골수증식성 신생물, 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 비-소세포폐암, 구인두암, 골육종, 난소암, 교모세포종, 췌장암, 유두종증, 부신경절종, 부갑상선 암, 음경암, 인두암, 크롬 친화성 세포종, 뇌하수체 종양, 흉막폐아세포종, 원발성 중추신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포암, 신우 및 요관암, 망막모세포종, 횡문근 종양, 침샘암, 세자리 증후군, 피부암, 소세포폐암, 소장암, 연조직 육종, 척수 종양, 위암, T-세포 림프종, 기형종, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 요도암, 자궁암, 질암, 외음부암 및 윌름스 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 비-소세포폐암(NSCLC)은 예를 들어, 선암종 NSCLC, 편평 세포 NSCLC 또는 거대세포 암종 NSCLC일 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 부신피질 암종, 항문암, 충수암, 성상세포종, 기저 세포 암종, 뇌종양, 담관암, 방광암, 골암, 유방암, 기관지 종양, 원발성 기원 불명의 암종, 심장 종양, 자궁경부암, 척색종, 결장암, 대장암, 두개인두종, 유관 암종, 배아 종양, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 섬유성 조직구종, 유잉육종, 안구암, 생식세포종양, 담낭암, 위암, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 간질성 종양, 임신성 영양막 질환, 신경교종, 두경부암, 간세포암, 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암, 안구내 흑색종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 구순 및 구강암, 간암, 소엽성 상피내 암종, 폐암, 악성 섬유성 조직구종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 원발성 잠재성을 지닌 전이성 편평 경부암, NUT 유전자와 관련된 정중선 관 암종, 구강암, 다발성 내분비샘 종양 증후군, 균상 식육종, 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 비-소세포폐암, 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 유두종증, 부신경절종, 부갑상선 암, 음경암, 인두암, 크롬 친화성 세포종, 뇌하수체 종양, 흉막폐아세포종, 원발성 중추신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포암, 신우 및 요관암, 망막모세포종, 횡문근 종양, 침샘암, 세자리 증후군, 피부암, 소세포폐암, 소장암, 연조직 육종, 척수 종양, 위암, T-세포 림프종, 기형종, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 요도암, 자궁암, 질암, 외음부암, 비-호지킨 림프종, 두경부의 편평상피암종, 악성 흉막 중피종 및 윌름스 종양을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 흑색종, 비-소세포폐암(NSCLC), 소세포폐암(SCLC), 두경부의 편평 세포암(HNSCC), 전형적 호지킨 림프종(cHL), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종(PMBCL), 요로상피암종, 고빈도 현미부수체 불안정성(microsatellite instability high) 또는 불일치 복구 결함 암, 고빈도 현미부수체 불안정성 또는 불일치 복구 결함 대장암, 위암, 식도암, 자궁경부암, 간세포암종(HCC), 메르켈 세포 암종(MCC), 신장세포암종(RCC), 자궁내막 암종, 종양 돌연변이 부담 고암, 피부 편평 세포 암종(cSCC), 삼중 음성 유방암(TNBC), 요로상피암종, 대장암 또는 식도 암종을 치료하는데 사용된다. 특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 교모세포종을 치료하는데 사용된다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 메르켈 세포 암종(MCC), 요로상피암종(UC), 신장세포암종(RCC), 비-소세포폐암(NSCLC), 소세포폐암(SCLC), 삼중 음성 유방암(TNBC), 자궁내막암, 피부 편평 세포 암종(CSCC), 기저 세포 암종(BCC), 흑색종, 악성 흉막 중피종, 전형적 호지킨 림프종(cHL), 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN), 간세포 암종(HCC), 식도 편평 세포 암종(ESCC), 비-편평 비-소세포폐암 또는 비인두 암종(NPC)을 치료하는데 사용된다.
바람직하게는, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 결장암, 폐암, 흑색종, 신장세포암종 또는 유방암을 치료하는데 사용된다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 흑색종을 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 절제 불가능하거나 전이성 흑색종을 갖는 대상체에서 흑색종을 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 완전한 절제 후 림프절(들)의 침범이 있는 흑색종을 가진 대상체의 보조 치료에 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 비-소세포폐암(NSCLC)을 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 FDA-승인된 테스트에 의해 결정된 바와 같이, PD-L1을 발현하는 NSCLC(예를 들어, 종양 비율 점수(TPS) ≥1%)를 갖는 대상체에서, EGFR 또는 ALK 게놈 종양 이상이 없는, NSCLC를 치료하는데 사용될 수 있으며, 이는: 대상체가 외과적 절제 또는 확정적 화학방사선요법에 대한 후보자가 아니거나, 전이성인 단계 III이다. 또 다른 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 FDA-승인된 테스트에 의해 결정된 바와 같이, 종양이 PD-L1(TPS ≥1%)을 발현하고 백금-함유 화학요법 도중 또는 이후에 질환이 진행되는 전이성 NSCLC 환자에서 NSCLC를 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 EGFR 또는 ALK 게놈 종양 이상이 없는 전이성 비편평 NSCLC 환자의 제1차 치료로서 페메트렉시드 및 백금 화학요법과 조합하여 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 전이성 편평 NSCLC 환자의 제1차 치료로서 카르보플라틴 및 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 단백질-결합과 조합하여 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 SCLC를 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 백금-기반 화학요법 및 적어도 하나의 다른 이전 회차의 요법 도중 또는 이후에 질환이 진행되는 전이성 SCLC를 갖는 대상체에서 SCLC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 HNSCC를 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 FDA-승인된 테스트에 의해 결정된 바와 같이, PD-L1을 발현하는 종양(예를 들어, 복합 양성 점수(CPS) ≥1)인 전이성 또는 절제 불가능한, 재발성 HNSCC를 갖는 대상체에서 HNSCC를 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 백금-함유 화학요법 도중 또는 이후에 질환이 진행되는 재발성 또는 전이성 HNSCC를 갖는 대상체에서 HNSCC를 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 전이성 또는 절제 불가능한 재발성 HNSCC를 갖는 환자의 제1차 치료를 위한 백금 및 플루오로우라실과 조합하여 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 cHL을 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 재발성 또는 불응성 cHL을 가진 대상체에서 cHL을 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 불응성 cHL, 또는 2개 이상의 회차의 요법 후에 재발된 cHL을 갖는 소아 대상체에서 cHL을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 PMBCL을 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 불응성 PMBCL을 갖는 대상체에서, 또는 2개 이상의 이전 회차의 요법 후에 재발된 대상체에서 PMBCL을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 요로상피암종을 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 시스플라틴-함유 화학요법에 대해 적격하지 않고, FDA-승인된 테스트에 의해 결정된 바와 같이, PD-L1을 발현하는 종양(예를 들어, 복합 양성 점수(CPS) ≥10)인 국소 진행성 또는 전이성 요로상피암종을 갖는 대상체에서, 또는 PD-L1 상태와 관계없이 임의의 백금-함유 화학요법에 대해 적격하지 않은 대상체에서 요로상피암종을 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 백금-함유 화학요법 동안 또는 이후에, 또는 백금-함유 화학요법과 함께 신보조 또는 보조 치료 후 12개월 이내에 질환이 진행되는 국소 진행성 또는 전이성 요로상피암종을 갖는 대상체에서 요로상피암종을 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 방광절제술에 적격하지 않거나 받지 않기로 선택한, 유두종양 유무에 관계없이 상피내암종(CIS)과 더불어 바실러스 칼메트-게랭(BCG)-무반응, 고-위험, 비-근육 침윤성 방광암(NMIBC)을 갖는 대상체에서 요로상피암종을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 고빈도 현미부수체 불안정성(MSI-H) 또는 불일치 복구 결함(dMMR) 암을 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 절제 불가능하거나 전이성인 MSI-H 또는 dMMR 암을 갖는 대상체에서 MSI-H 또는 dMMR 암을 치료하는데 사용될 수 있으며, 여기서 고형 종양은 이전 치료 후에 진행되었고 대상체는 만족스러운 대체 치료 옵션이 없거나, 플루오로피리미딘, 옥살리플라틴 및 이리노테칸으로 치료 후에 대장암이 진행되었다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 고빈도 현미부수체 불안정성(MSI-H) 또는 불일치 복구 결함(dMMR) 대장암을 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 절제 불가능하거나 전이성인 MSI-H 또는 dMMR 대장암을 갖는 대상체에서 MSI-H 또는 dMMR 대장암을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 위암을 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 플루오로피리미딘- 및 백금-함유 화학요법 및 적절한 경우, HER2/neu-표적화된 요법을 포함하는 2개 이상의 이전 회차의 요법 도중 또는 이후에 질환 진행과 더불어, FDA-승인된 테스트에 의해 결정된 바와 같이, PD-L1을 발현하는 종양(예를 들어, 복합 양성 점수(CPS) ≥1)인 재발성 국소 진행성 또는 전이성 위 또는 위식도 접합부 선암종을 갖는 대상체에서 위암을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 식도암을 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 백금- 및 플루오로피리미딘-기반 화학요법과 조합하여, 외과적 절제 또는 확정적 화학방사선요법으로 처리할 수 없는, 국소 진행성 또는 전이성 식도 또는 위식도 접합부(GEJ)(예를 들어, GEJ 위에 1 내지 5 센티미터에 진원지를 갖는 종양) 암종을 갖는 대상체에서 식도암을 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 FDA-승인된 테스트에 의해 결정된 바와 같이, PD-L1(CPS ≥10)을 발현하는 편평 세포 조직 종양을 가진 환자에 대해 1개 이상의 이전 회차의 전신 요법 이후에, 외과적 절제 또는 확정적 화학방사선요법으로 처리할 수 없는, 국소 진행성 또는 전이성 식도 또는 위식도 접합부(GEJ)(예를 들어, GEJ 위에 1 내지 5 센티미터에 진원지를 갖는 종양) 암종을 갖는 대상체에서 식도암을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 자궁경부암을 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 FDA-승인된 테스트에 의해 결정된 바와 같이, PD-L1을 발현하는 종양(예를 들어, 복합 양성 점수(CPS) ≥1)인 화학요법 도중 또는 이후에 질환이 진행되는 재발성 또는 전이성 자궁경부암을 갖는 대상체에서 자궁경부암을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 HCC를 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 이전에 소라페닙으로 치료받은 적이 있는 대상체에서 HCC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 MCC를 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 재발성 국소 진행성 또는 전이성 MCC를 갖는 대상체에서 MCC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 RCC를 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 진행성 RCC를 가진 환자의 제1차 치료를 위해 액시티닙과 조합하여 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 자궁내막 암종을 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 MSI-H 또는 dMMR이 아닌 진행성 자궁내막 암종을 가진 대상체의 치료를 위해 렌바티닙과 조합하여 사용될 수 있으며, 상기 대상체는 이전 전신 요법 이후 질환이 진행되고, 근치적 수술 또는 방사선을 위한 후보자가 아니다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 종양 돌연변이 부담 고암(TMB-H)을 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 절제 불가능하거나 전이성 종양 돌연변이 부담 고암(예를 들어, ≥10 돌연변이/메가베이스(mut/Mb)) 고형 종양을 갖는 대상체에서 TMB-H 암을 치료하는데 사용될 수 있으며, FDA-승인된 테스트에 의해 결정된 바와 같이, 이는 이전 치료 후에 진행되었고 만족스러운 대체 치료 옵션이 없다.
특정 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 피부 편평 세포 암종(cSCC)을 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 수술 또는 방사선에 의해 치료될 수 없는 재발성 또는 전이성 피부 편평 세포 암종을 갖는 대상체에서 cSCC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 삼중-음성 유방암(TNBC)을 치료하는데 사용된다. 예로서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 FDA 승인된 테스트에 의해 결정된 바와 같이, PD-L1을 발현하는 종양(예를 들어, 복합 양성 점수(CPS) ≥10)인 국소 재발성 절제 불가능하거나 전이성 TNBC를 갖는 대상체의 치료를 위해 화학요법과 조합하여 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 메르켈 세포 암종(MCC)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 아벨루맙을 포함하는 조합은 전이성 MCC를 갖는 대상체에서 MCC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 요로상피암종(UC)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 아벨루맙을 포함하는 조합은 백금-함유 화학요법 동안 또는 이후 질환이 진행되는 국소 진행성 또는 전이성 UC를 갖는 대상체에서 UC를 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 아벨루맙을 포함하는 조합은 백금-함유 화학요법과 함께 신보조 또는 보조 치료 후 12개월 이내에 질환이 진행되는 국소 진행성 또는 전이성 UC를 갖는 대상체에서 UC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 신장세포암종(RCC)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 아벨루맙 및 악시티닙을 포함하는 조합은 진행성 RCC를 갖는 대상체에서 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 요로상피암종(UC)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 더발루맙을 포함하는 조합은 백금-함유 화학요법 동안 또는 이후 질환이 진행되는 국소 진행성 또는 전이성 요로상피암종을 갖는 대상체에서 UC를 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 더발루맙을 포함하는 조합은 백금-함유 화학요법과 함께 신보조 또는 보조 치료 후 12개월 이내에 질환이 진행되는 국소 진행성 또는 전이성 요로상피암종을 갖는 대상체에서 UC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 비-소세포폐암(NSCLC)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 더발루맙을 포함하는 조합은 동시 백금-기반 화학요법 및 방사선 요법 이후 질환이 진행되지 않은 절제 불가능한, III기 비-소세포폐암(NSCLC)을 갖는 대상체에서 NSCLC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 소세포폐암(SCLC)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 더발루맙을 포함하는 조합은 확장기 소세포폐암(ES-SCLC) 갖는 성인 대상체의 제1차 치료로서 에토포시드 및 카르보플라틴 또는 시스플라틴과 조합하여 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 요로상피암종(UC)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 아테졸리주맙을 포함하는 조합은 시스플라틴-함유 화학요법에 대해 적격하지 않고, FDA-승인된 테스트에 의해 결정된 바와 같이, 종양이 PD-L1을 발현하거나(예를 들어, PD-L1 염색된 종양-침윤 면역 세포(IC)가 종양 부위의 ≥5%를 포괄함), 또는 PD-L1 상태와 관계없이 임의의 백금-함유 화학요법에 대해 적격하지 않거나, 또는 임의의 백금-함유 화학요법 동안 또는 이후에, 또는 신보조 또는 보조 화학요법 후 12개월 이내에 질환이 진행되는, 국소 진행성 또는 전이성 요로상피암종을 갖는 성인 대상체에서 UC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 NSCLC를 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 아테졸리주맙을 포함하는 조합은 EGFR 또는 ALK 게놈 종양 이상이 없는, FDA-승인된 테스트에 의해 결정된 바와 같이, 높은 PD-L1 발현을 갖는 종양(예를 들어, PD-L1 염색된 ≥ 50%의 종양 세포 [TC ≥ 50%] 또는 PD-L1 염색된 종양-침윤 면역 세포[IC]가 종양 부위의 ≥10%를 포괄함 [IC ≥ 10%])인, 전이성 NSCLC를 갖는 성인 대상체에서 NSCLC를 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 아테졸리주맙을 포함하는 조합은 EGFR 또는 ALK 게놈 종양 이상이 없는 전이성 비-편평 NSCLC를 갖는 성인 대상체의 제1차 치료를 위해, 베바시주맙, 파클리탁셀 및 카르보플라틴과 조합하여 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 아테졸리주맙을 포함하는 조합은 EGFR 또는 ALK 게놈 종양 이상이 없는 전이성 비-편평 NSCLC를 갖는 성인 대상체의 제1차 치료를 위해 파클리탁셀 단백질-결합 및 카르보플라틴과 조합하여 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 아테졸리주맙을 포함하는 조합은 백금-함유 화학요법 동안 또는 이후 질환 진행이 있는 전이성 NSCLC를 갖는 성인 대상체에서 NSCLC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 삼중 음성 유방암(TNBC)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 아테졸리주맙을 포함하는 조합은 FDA 승인된 테스트에 의해 결정된 바와 같이, PD-L1을 발현하는 종양(예를 들어, ≥ 1%의 종양 부위를 포괄하는 임의의 강도의 PD-L1 염색된 종양-침윤 면역 세포[IC])인, 절제 불가능한 국소 진행성 또는 전이성 TNBC를 갖는 성인 대상체의 치료를 위해 단백질-결합 파클리탁셀과 조합하여 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 소세포폐암(SCLC)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 아테졸리주맙을 포함하는 조합은 확장기 소세포폐암(ES-SCLC)을 갖는 성인 대상체의 제1차 치료를 위해, 카르보플라틴 및 에토포시드와 조합하여 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 자궁내막암을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 도스타리맙을 포함하는 조합은 FDA-승인된 테스트에 의해 결정된 바와 같이, 백금-함유 레지멘으로 이전 치료 도중 또는 이후에 진행되는, 불일치 복구 결함(dMMR) 재발성 또는 진행성 자궁내막암을 갖는 성인 대상체에서 자궁내막암을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 피부 편평 세포 암종(CSCC)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 세미플리맙-rwlc를 포함하는 조합은 근치적 수술 또는 근치 방사선을 위한 후보자가 아닌, 전이성 피부 편평 세포 암종(mCSCC) 또는 국소 진행성 CSCC(laCSCC)를 갖는 대상체에서 CSCC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 기저 세포 암종(BCC)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 세미플리맙-rwlc를 포함하는 조합은 이전에 헤지호그 경로 억제제로 처리되었거나 헤지호그 경로 억제제가 적절하지 않은 국소 진행성 BCC(laBCC)를 갖는 대상체에서 BCC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 NSCLC를 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 세미플리맙-rwlc를 포함하는 조합은 EGFR, ALK 또는 ROS1 이상이 없는, FDA-승인된 테스트에 의해 결정된 바와 같이 PD-L1 발현이 높으며(예를 들어, 종양 비율 점수(TPS) ≥ 50%), 대상체가 외과적 절제 또는 확정적 화학방사선요법을 위한 후보자가 아닌, 국소 진행성 또는 전이성 종양을 갖는 대상체에서 NSCLC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 흑색종을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 니볼루맙을 포함하는 조합은 단일 제제로서 또는 이필리무맙과 조합하여, 절제 불가능하거나 전이성 흑색종을 갖는 대상체에서 흑색종을 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 니볼루맙을 포함하는 조합은 보조제 설정에 있어서 완전한 절제를 경험한, 림프절 침범 또는 전이성 질환이 있는 흑색종을 가진 대상체에서 흑색종을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 NSCLC를 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 니볼루맙을 포함하는 조합은 이필리무맙과 조합하여 제1차 치료로서, EGFR 또는 ALK 게놈 종양 이상이 없는, FDA-승인된 테스트에 의해 결정된 바와 같이, PD-L1(≥1%)을 발현하는 전이성 비-소세포폐암을 갖는 성인 대상체에서 NSCLC를 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, NSCLC를 포함하는 조합은 이필리무맙 및 2주기의 백금-이중 화학요법과 조합하여, 제1차 치료로서 EGFR 또는 ALK 게놈 종양 이상이 없는, 전이성 또는 재발성 비-소세포폐암을 갖는 성인 대상체에서 흑색종을 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, NSCLC를 포함하는 조합은 백금-기반 화학요법 도중 또는 이후에 진행되고 전이성인 비-소세포폐암을 갖는 대상체에서 흑색종을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 악성 흉막 중피종을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 니볼루맙을 포함하는 조합은 이필리무맙과 조합하여 제1차 치료로서, 절제 불가능한 악성 흉막 중피종을 갖는 성인 대상체에서 악성 흉막 중피종을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 RCC를 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 니볼루맙을 포함하는 조합은 이필리무맙과 조합하여 제1차 치료로서, 중등도(intermediate) 또는 고위험(poor risk) 진행성 신장세포암종을 갖는 대상체에서 RCC를 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 니볼루맙을 포함하는 조합은 카보잔티닙과 조합하여 제1차 치료로서, 진행성 신장세포암종을 갖는 대상체에서 RCC를 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 니볼루맙을 포함하는 조합은 이전에 항-혈관신생 요법을 받은 진행성 신장세포암종을 갖는 대상체에서 RCC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 전형적 호지킨 림프종(cHL)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 니볼루맙을 포함하는 조합은 자가 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 및 브렌툭시맙 베도틴, 또는 자가 HSCT를 포함하는 3개 이상의 회차의 전신 요법 이후 재발되거나 진행된 cHL을 갖는 성인 대상체에서 cHL을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 니볼루맙을 포함하는 조합은 백금-기반 요법 도중 또는 이후에 질환이 진행되는 재발성 또는 전이성 두경부의 편평 세포 암종을 갖는 대상체에서 SCCHN을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 요로상피암종(UC)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 니볼루맙을 포함하는 조합은 백금-함유 화학요법 동안 또는 이후에 질환이 진행되었거나, 백금-함유 화학요법과 함께 신보조 또는 보조 치료 후 12개월 이내에 질환이 진행되는 국소 진행성 또는 전이성 요로상피암종을 갖는 대상체에서 UC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 대장암을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 니볼루맙을 포함하는 조합은 플루오로피리미딘, 옥살리플라틴, 이리노테칸을 단일 제제로서 또는 이필리무맙과 조합하여 치료한 후 진행된 고빈도 현미부수체 불안정성(MSI-H) 또는 불일치 복구 결함(dMMR) 전이성 대장암을 갖는 대상체에서 대장암을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 간세포 암종(HCC)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 니볼루맙을 포함하는 조합은 이전에 소라페닙을 단일 제제로서 또는 이필리무맙과 조합하여 치료받은 적이 있는 HCC를 갖는 대상체에서 HCC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 식도 편평 세포 암종(ESCC)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예로서, 니볼루맙을 포함하는 조합은 이전에 플루오로피리미딘- 및 백금-기반 화학요법 후 절제 불가능한 진행성, 재발성 또는 전이성 식도 편평 세포 암종을 갖는 대상체에서 ESCC를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 캄렐리주맙을 포함하는 조합은 cHL을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 티슬레리주맙을 포함하는 조합은 비-편평 비-소세포폐암을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정한 바람직한 구현예에서, 티슬레리주맙을 포함하는 조합은 간세포 암종(HCC)을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 토리팔리맙을 포함하는 조합은 요로상피암종을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정한 바람직한 구현예에서, 토리팔리맙을 포함하는 조합은 흑색종을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정한 바람직한 구현예에서, 토리팔리맙을 포함하는 조합은 비인두 암종(NPC)을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정한 바람직한 구현예에서, 신틸리맙을 포함하는 조합은 비-편평 비-소세포 폐암을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정한 바람직한 구현예에서, 신틸리맙을 포함하는 조합은 cHL을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 방법 및 조성물을 사용하여 치료될 암은 전이성 암일 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 전이성 신장 투명 세포 암종 또는 전이성 피부 악성 흑색종을 치료하는데 사용될 수 있다.
원하는 경우, 추가적인 치료제가 대상체에게 투여될 수 있다. 전형적으로 이러한 추가적인 치료제는 본원에 추가로 기술된 바와 같이 화학요법제, 면역 체크포인트 억제제, 기타 사이토카인(예컨대, IL-12, 유도성 IL-12 전구약물, 유도성 IFN, 유도성 IFN 전구약물, IL-2 또는 IL-2 전구약물), 혈관 신생 억제제, 항체-약물 접합체(예를 들어, 트라스투주맙 엠탄신(KADCYLA), 트라스투주맙 데룩스테칸(ENHERTU), 엔포르투맙 베도틴(PADCEV), 사시투주맙 고비테칸(TRODELVY), 세포 요법(예를 들어, CAR-T, TCT-T, T-세포 요법, 예컨대 종양 침윤 림프구(TIL) 요법), 종양 용해성 바이러스, 방사선 요법 및/또는 소분자와 같은 항암제이다.
약제학적 조성물은 다양한 형태, 예를 들어 액체, 동결건조를 취할 수 있고, 전형적으로 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유한다. 약제학적으로 허용가능한 담체 (또는 부형제)는 약제학적 조성물의 비-활성 성분 구성요소이며, 이는 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아니며, 즉, 본 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하거나 그것이 함유된 약제학적 제형 또는 조성물의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용함이 없이 대상체에게 투여된다. 담체는 활성 성분의 분해를 최소화하고 대상체에서 부작용을 최소화하도록 선택된다.
적합한 담체 및 이들의 제형은 Remington: The Science and Practice of Pharmacy,　21st　Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005)에 기술되어 있다. 약제학적으로-허용가능한 담체의 예는 멸균수, 식염수, 링거 용액과 같은 완충 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 담체는 면역원성 폴리펩타이드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스와 같은 지속 방출 제제를 포함한다. 매트릭스는 예를 들어, 필름, 리포솜 또는 마이크로입자와 같은 성형품의 형태로 된다. 예를 들어, 투여 경로 및 투여되는 조성물의 농도에 따라 특정 담체가 더 바람직할 수 있다. 담체는 인간 또는 다른 대상체에게 키메라 폴리펩티드 또는 키메라 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 투여에 적합한 것들이다.
비경구 투여용 제제는 멸균된 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 예컨대 올리브 오일 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르이다. 수성 담체는 식염수 및 완충 배지를 포함한, 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제 (예컨대, 링거 덱스트로스에 기반한 것) 등을 포함한다. 예를 들어, 항균제, 항-산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스 등과 같은 방부제 및 기타 첨가제가 선택적으로 존재한다. 전형적으로, 제형이 원하는 경우 고장성 또는 저장성일 수 있지만, 제형을 등장성으로 만들기 위해 적절한 양의 약제학적으로-허용가능한 염이 제형에 사용된다. 용액의 pH는 일반적으로 약 5 내지 약 8 또는 약 7 내지 7.5이다.
국소 투여용 제형은 연고, 로션, 크림, 젤, 점적제(drops), 좌약, 스프레이, 액체 및 분말을 포함한다. 통상적인 약제학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 염기, 증점제 등이 선택적으로 필요하거나 바람직하다.
경구 투여용 조성물은 분말 또는 과립, 물 또는 비-수성 매질 내 현탁액 또는 용액, 캡슐, 사쉐(sachets) 또는 정제를 포함한다. 증점제, 향료, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 선택적으로 바람직하다.
본 개시내용은 또한 약제학적 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이며, 이는 a) 예를 들어, 적합한 용기(예를 들어, 바이알, 백(bag) 등) 내, 액체 조성물 또는 동결건조된 조성물로서의 유도성 IL-2 전구약물 조성물, 및 b) 예를 들어, 적합한 용기(예를 들어, 바이알, 백 등) 내, 액체 조성물 또는 동결건조된 조성물로서의 펨브롤리주맙 조성물을 함유한다. 키트는 동결건조된 조성물의 재구성을 위한 멸균수 또는 식염수와 같은 다른 구성요소를 추가로 포함할 수 있다.
C. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖도록 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되고, 본원에 이러한 정의의 포함은 반드시 당해 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것 이상의 차이를 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에 기술되거나 참조된 기술 및 절차는 일반적으로 잘 이해되고, 예를 들어 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed. (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY에 기술된 널리 활용되는 분자 클로닝 방법론과 같은 당업계의 숙련된 자에 의해 통상적인 방법론을 사용하여 일반적으로 사용된다. 적절하게, 상업적으로 이용가능한 키트 및 시약의 사용을 포함하는 절차는 달리 명시되지 않는 한 일반적으로 제조사-정의된 프로토콜 및 조건에 따라 수행된다.
"사이토카인"은 특히 면역계의 세포에 의해 분비되고 면역계의 조절자인 면역조절 단백질 (예컨대, 인터루킨 또는 인터페론)의 임의의 부류를 지칭하는 잘 알려진 기술 용어이다. 본원에 개시된 융합 단백질에 사용될 수 있는 사이토카인 폴리펩티드는 이에 제한되지는 않으나, 형질전환 성장 인자, 예컨대 TGF-α 및 TGF-β (예를 들어, TGF베타1, TGF베타2, TGF베타3); 인터페론 예컨대 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터페론-카파 및 인터페론-오메가; 인터루킨, 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21 및 IL-25; 종양 괴사 인자, 예컨대 종양 괴사 인자 알파 및 림프독소; 케모카인 (예를 들어, C-X-C 모티프 케모카인 10 (CXCL10), CCL19, CCL20, CCL21) 및 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CS), 뿐만 아니라 사이토카인에 대한 동족 수용체를 활성화하는 이러한 폴리펩티드의 단편 (즉, 전술한 것의 기능적 단편)을 포함한다. "케모카인"은 근처 반응성 세포에서 지향성 화학주성(chemotaxis)을 유도하는 능력을 가진 임의의 작은 사이토카인의 패밀리를 지칭하는 기술 용어이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유도성"은 전구약물의 일부인 단백질, 즉 IL-2, IL-12 또는 IFN이 이의 수용체에 결합하고, 종양 미세환경에서 전구약물의 절단시 활성을 발생시키는 능력을 지칭한다. 본원에 개시된 유도성 사이토카인 전구약물은 사이토카인 작용제 활성을 약화시키거나 전혀 갖지 않으나, 종양 미세환경에서 절단시 활성 사이토카인을 방출한다.
"약화된" 활성은 생물학적 활성 및 전형적으로 사이토카인(즉, IL-2, IL-12 또는 IFN) 작용제 활성이 천연 사이토카인(즉, IL-2, IL-12 또는 IFN)의 활성과 비교하여 감소됨을 의미한다. 본원에 개시된 유도성 사이토카인 전구약물은 약화된 사이토카인 수용체 작용제 활성, 즉 천연 사이토카인(즉, IL-2, IL-12 또는 IFN)과 비교하여 적어도 약 10X, 적어도 약 50X, 적어도 약 100X, 적어도 약 250X, 적어도 약 500X, 적어도 약 1000X 또는 그 이하의 작용제 활성을 갖는다. 종양 미세환경에서 절단시, 활성인 사이토카인이 방출된다. 전형적으로, 방출되는 사이토카인은 전구약물의 IL-2 수용체 활성화 활성보다 적어도 약 10X, 적어도 약 50X, 적어도 약 100X, 적어도 약 250X, 적어도 약 500X, 또는 적어도 약 1000x 더 큰 사이토카인 수용체 작용제 활성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산을 의미하기 위해 광범위하게 사용된다. 단백질, 펩티드 및 폴리펩티드는 또한 아미노산 서열을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 폴리펩티드는 분자를 포함하는 특정 크기 또는 수의 아미노산을 제안하기 위해 본원에서 사용되지 않는다는 것 및 본 발명의 펩티드는 최대 여러 아미노산 잔기 또는 그 이상을 함유할 수 있다는 것을 인식해야 한다.
전체적으로 사용된 바와 같이, "대상체"는 척추동물, 보다 구체적으로 포유동물 (예를 들어, 인간, 말, 고양이, 개, 소, 돼지, 양, 염소, 마우스, 토끼, 랫트 및 기니피그), 조류, 파충류, 양서류, 어류 및 임의의 기타 동물일 수 있다. 본 용어는 특정 연령 또는 성별을 의미하지 않는다. 따라서, 남성이든 여성이든, 성인 및 신생아 대상체가 포괄되는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같이, "환자" 또는 "대상체"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 질환 또는 장애(예를 들어, 암)를 가진 대상체를 지칭할 수 있다. 용어 환자 또는 대상체는 인간 및 수의학적 대상체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "치료", "치료하다" 또는 "치료하는"은 질환 또는 병태의 영향 또는 질환 또는 병태의 증상을 감소시키는 방법을 지칭한다. 따라서, 개시된 방법에서, 치료는 확립된 질환 또는 병태의 중증도 또는 질환 또는 병태의 증상에서 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 최소 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 실질적으로 완전한 감소, 예컨대 종양 부피의 감소, 종양 부담의 감소, 사망의 감소를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 질환을 치료하기 위한 방법은 대조군과 비교하여 대상체에서 질환의 하나 이상의 증상에서 10% 감소가 있는 경우 치료인 것으로 간주된다. 따라서, 감소는 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 10% 내지 100% 사이의 임의의 감소 퍼센트일 수 있다. 치료가 반드시 질환, 병태, 또는 질환 또는 병태의 증상의 치유 또는 완전한 절제를 지칭하는 것이 아님이 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 질환 또는 장애의 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 발병 또는 악화를 억제하거나 지연시키는 작용, 예를 들어, 대상체가 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 나타내는 것을 시작하기 전 또는 거의 동시에 발생하는, 키메라 폴리펩티드 또는 키메라 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 투여를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "감소하는(decreasing)", "감소시키는(reducing)" 또는 "억제하는"에 대한 언급은 적절한 대조군 수준과 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 그 이상의 변화를 포함한다. 이러한 용어는 작용제 활성과 같은 기능 또는 특성의 완전한 제거를 포함할 수 있지만 반드시 포함되지는 않는다.
용어 "서열 변이체"는 참조 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 갖지만 아미노산 서열이 상이한 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 참조 서열과 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 갖지만 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 실질적으로 유사한 활성을 갖는 단백질을 암호화함)이 상이한 핵산의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 전형적으로 "서열 변이체"의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 참조 서열과 매우 유사(예를 들어, 적어도 약 80% 유사)하다. 당업계의 기술자는 2개의 폴리펩티드 또는 2개의 핵산의 동일성을 결정하는 방법을 쉽게 이해한다. 예를 들어, 동일성은 정의된 수의 뉴클레오티드 또는 아미노산에 걸쳐 최고 수준이 되도록 두 서열을 정렬한 후 계산될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 Smith 및 Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 동일성 알고리즘에 의해, Needleman 및 Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 동일성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson alc Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 검색 방법에 의해, 이러한 알고리즘(위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지(Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)의 전산화된 구현에 의해, 또는 검사에 의해 수행될 수 있다.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 폴리펩티드에서 아미노산을 참조 아미노산과 크기, 전하 및 소수성과 같은 유사한 생화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로의 대체를 지칭하는 기술 용어이다. 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 보존적 아미노산 대체는 빈번하게 폴리펩티드의 전체 구조 또는 기능을 유의미하게 변경하지 않는다는 것이 잘 알려져 있다. 아미노산의 보존적 치환은 당업계의 숙련된 자에게 알려져 있다. 아미노산의 보존적 치환은 다음 그룹 내의 아미노산들 중에서 이루어진 치환을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D. 예를 들어, 당업계의 통상의 기술자는 류신을 이소류신 또는 발린으로, 아스파르테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로의 분리된 대체, 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 대체가 생성된 분자의 생물학적 활성에 주요한 영향을 미치지 않을 것임을 합리적으로 예상한다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 투여 조건하에서 원하는 효과를 달성하기 위해 투여되는 제제(예를 들어, 유도성 IL-2 전구약물)의 양, 예컨대 종양 크기를 감소시키고, 종양 부담을 감소시키며, 무진행 생존율을 연장시키거나 전체 생존율을 연장시키는 양을 지칭한다. 선택된 실제 유효량은 치료되는 특정 암 및 이의 단계, 및 기타 요인, 예컨대 대상체의 연령, 성별, 체중, 인종, 이전 치료 및 해당 치료에 대한 반응 및 기타 요인에 따라 달라질 것이다. 투여될 유도성 사이토카인 전구약물 및 임의의 추가적인 제제의 적합한 양, 및 특정 환자에 대한 투약 일정은 이들 및 기타 고려사항에 기초하여 통상의 숙련의 임상의에 의해 결정될 수 있다.
바람직하게는, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 결장암, 폐암, 흑색종, 신세포암종, 유방암, 두경부의 편평상피암종을 치료하는데 사용된다.
특정한 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 흑색종, 비-소세포폐암(NSCLC), 소세포폐암(SCLC), 두경부의 편평 세포암(HNSCC), 전형적 호지킨 림프종(cHL), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종(PMBCL), 요로상피암종, 고빈도 현미부수체 불안정성 또는 불일치 복구 결함 암, 고빈도 현미부수체 불안정성 또는 불일치 복구 결함 대장암, 위암, 식도암, 자궁경부암, 간세포암종(HCC), 메르켈 세포 암종(MCC), 신장세포암종(RCC), 자궁내막 암종, 종양 돌연변이 부담 고암, 피부 편평 세포 암종(cSCC), 삼중 음성 유방암(TNBC), 요로상피암종, 대장암 또는 식도 암종을 치료하는데 사용된다.
5. 등가물
본원에 기술된 본 발명의 방법의 다른 적합한 변형 및 적응이 명백하고 본 개시내용 또는 구현예의 범위를 벗어나지 않으며 적합한 등가물을 사용하여 이루어질 수 있음이 당업계의 숙련된 자에게 쉽게 명백할 것이다. 이제 특정 화합물 및 방법을 상세히 기술하며, 이는 단지 예시를 위해 도입되고 제한하려는 것으로 의도되지 않는 다음의 실시예를 참조하여 보다 명확하게 이해될 것이다.
6. 서열
7. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 본원에 제공된 일반적인 설명을 고려하면 다양한 다른 구현예가 실시될 수 있음이 이해된다.
1.1 재료 및 방법
세포주
MC38 및 B16-F10 세포주는 ATCC로부터 획득하였고, 병원균 오염에 대해 정례적으로 확인하였다. 모든 세포주는 ATCC 지침에 따라 성장시키고 유지하였으며 2주 이내로 배양하였다. 동결된 MC38 또는 B16-F10 세포를 해동하고, 10% 열-불활성화된 FCS(Gibco) 및 1×페니실린/스트렙토마이신(Gibco)이 보충된 DMEM(ThermoFisher Scientific)에서 1-3회 계대 동안 유지하였다. 종양 이식 전에, 세포를 PBS로 2회 세척하고 계수하였다. 세포를 PBS(효능 연구) 또는 50% 마트리젤(TIL 수확물, Corning)에 접종하였다.
마우스, 종양 이식 및 생체내 투약
모든 마우스 생체내 작업은 미국 농무부(U.S. Department of Agriculture) 및 Charles River Laboratories(Morrisville, NC 및 Worcester, MA)의 NIH의 현행 규정 및 표준에 따라 수행되었다. Charles River Laboratories의 6-8주령 암컷 C57Bl/6 마우스는 종양 세포 이식 1일 전에 이들의 옆구리를 면도하였다. 총 5×105 MC38 또는 1×105 B16-F10 세포를 피하로 주사하고 종양 성장을 모니터링하였다. 무작위화를 위해 충분한 크기의 종양을 갖기 위해 추가 마우스를 이식하였다. 그룹 평균이 100-150 mm3가 될 때까지 종양 부피를 모니터링하고, 0일째에 마우스를 치료 그룹으로 무작위화하였다. 유도성 IL-2 전구약물을 받는 마우스는 주 2회 투약되었다. rhIL-2를 받는 마우스는 2일 휴식(5/2 레지멘)을 받기 전 5일 동안 하루 2회 투약되었다. PD-1 차단을 사용한 연구에서, 마우스는 항-PD-1(200 μg, 클론 RMP1-14, BioXCell)이 주 2회 일정으로 투약되었다. FTY720을 사용한 연구에서, 마우스는 처음에 제1 용량으로 25 μg을 투약한 다음 실험 과정 전반에 걸쳐 용량 당 10 μg을 매일 처리하였다.
일부 연구에서 항종양 활성은 CD8+ 세포가 고갈된 마우스에서 평가되었다. 해당 연구에서 마우스는 복강내 주사를 통해 항-CD8 항체(200 μg/용량, Bio X Cell의 클론 2.43)가 주 2회 투약되었다. 각 그룹에 대한 평균 종양 부피는 평균 +/- SEM으로 표시된다(도 2i). 결과는 CD8+ 세포의 과잉(repletion)이 화합물 1의 항-종양 효과를 감소시켰음을 나타내었다.
일부 연구에서 MC38 보유 마우스는 비히클, 화합물 1(100 μg/용량의 천연 IL-2 페이로드 함유), 또는 절단시 IL-2 수용체 α에 결합하지 않지만 100 μg/용량의 IL-2 수용체 베타-감마 수용체(화합물 5)에는 결합하는 유도성 형태의 IL-2 뮤테인으로 처리하였다. 화합물 5는 서열번호: 6을 갖는 제1 폴리펩티드 및 서열번호: 5를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다(도 15a-15c). 결과는 비-알파 뮤테인이 모델에서 유의미한 항-종양 활성을 갖지 않음을 입증하였다.
모든 치료제는 복강내 주사로 투여하였고, 달리 명시하지 않는 한 마우스는 2주 동안 투약되었다. 체중 및 종양 부피는 모두 연구 기간 동안 매주 2회 측정하였다. 종양은 캘리퍼스를 사용하여 2차원으로 측정하였으며, 부피는 다음 공식을 사용하여 계산되었다: 종양 부피(mm3) = [(w2 x l) / 2] 여기서 w = 종양의 너비 및 l = 종양의 길이(mm). 마우스는 종양이 1500 mm3에 도달할 때까지 또는 연구가 45일째에 종료 지점에 도달할 때까지 계속 연구하였다. 일부 경우에, 완전한 퇴행을 가진 마우스는 추후에 기억 실험을 위해 남겨 두었다.
뮤린 혈관 누출 증후군 모델
뮤린 VLS 실험은 미국 농무부 및 Biomodels LLC(Waltham, MA)의 NIH의 현행 규정 및 표준에 따라 수행되었다. 8-10 주령 암컷 C57Bl/6에는 등몰량의 재조합 인간 IL-2(100 μg/용량, 4일에 걸쳐 7회 제공됨), WW0177(D0 및 D3에 2회 제공됨), 또는 화합물 1(D0 및 D3에 2회 제공됨)이 복강내 주사로 투약되었다. 3일째, 동물은 에반스 블루 염료의 정맥 주사가 제공되었고, 동물은 30분 후에 헤파린이 포함된 50 mL의 식염수를 사용하여 10 mL/분의 속도로 관류시켰다. 폐를 수확하고 37℃에서 24시간 동안 포름아미드에 두었다. 24시간 후, 폐 내로 에반스 블루 일혈은 620nm 및 650nm에서 흡광도를 측정하고, 새로 준비된 에반스 블루 염료의 표준 곡선과 흡광도 값을 비교함으로써, 분광계를 사용하여 측정되었다.
유도성 IL-2 전구약물 생성, 프로테아제 활성화 및 SDS page 분석
화합물 1, 재조합 인간 IL-2 및 화합물 1-NC를 생성하였다. 단백질은 제조사의 프로토콜에 따라 Life Technologies로부터의 Expi293 발현 시스템을 사용하여 발현시켰다. 형질감염 후 4일째, 배양물을 스핀다운시키고, 0.2 μm 보틀(bottle) 상단 필터로 여과하고, MabSelect 수지의 존재하에서 밤새 회전되도록 방치하였다. 다음날, 배양물/수지 혼합물을 중력 컬럼에 적용하고 수지를 PBS(TEKNOVA, 내독소 테스트됨)로 세척하였다. 단백질을 200 mM 아세트산 pH 3.5, 50 mM NaCl로 용출시키고 1M Tris pH 8로 중화시켰다. 용출액을 모으고, 투석하고, 농축하고, 분취하고, 향후 사용을 위해 -80℃에 보관하였다. WTX-124는 20 mM 히스티딘 pH 6, 150 mM NaCl로 투석하였으며, 한편 재조합 인간 IL-2 및 WW0177은 1x PBS에 대해 투석하였다. 이론적으로 SnapGene(v 5.0.7)을 사용하여 각 단백질에 대한 흡광 계수를 결정하였고, 단백질 농도는 A280으로 결정하였다. SDS page 겔의 경우, 3 μg의 단백질을 비-환원 조건하에서 16% 트리스-글리신(Tris-Glycine) 겔(ThermoFisher)에 로딩하였다.
HEK-블루 IL-2 리포터 검정
HEK-블루 IL-2 리포터 세포 검정은 제조사의 프로토콜(Invivogen)에 따라 수행하였다. 검정 1일째, 세포를 헹구고, 1.5% 인간 혈청 알부민을 함유하는 배지에 재현탁시키고, 96-웰 플랫 바닥 플레이트(flat bottom plate)에 웰당 5 x 104개 세포의 농도로 플레이팅하였다. 적정된 양의 온전한 및 프로테아제-활성화된(절단된) 유도성 IL-2 단백질 또는 rhIL-2를 세포에 첨가하여 전체 용량-반응 곡선을 생성하였다. 2일째, SEAP 수준은 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.
인간 및 뮤린 일차 세포 검정
인간 PBMC는 제조사의 프로토콜에 따라 Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)를 사용하여 분리하고, 추후에 사용하기 위해 Recovery Cell Culture Freezing Media(Gibco)에 동결시켰다. 활성화된 T 세포(Tblast)를 생성하기 위해, PBMC를 해동하고, 계수하고, 추후에 사용하기 위해 동결시키기 전에 72시간 동안 5 μg/mL의 PHA(Sigma-Aldrich)로 자극하였다. 온전한 또는 프로테아제-활성화된(절단된) 유도성 IL-2 단백질 활성을 측정하기 위해, Tblast를 96-웰 라운드 바닥 플레이트(round bottom plate)에 플레이팅하고, 적정된 양의 온전한 또는 프로테아제-활성화된(절단된) 유도성 IL-2 단백질 또는 rhIL-2를 세포에 첨가하여 전체 용량-반응 곡선을 생성하였다. 72시간 후, 증식은 제조사의 프로토콜에 따라 Cell Titer glow 시약(Promega)을 사용하여 측정하였다.
뮤린 Tblast 실험을 위해, 비장세포를 해동하고, 세척하고, Recovery Cell Culture Freezing Media(Gibco)에 동결시키기 전에 72시간 동안 2 μg/mL의 콘카나발린 A(Concanavalin A) (Sigma-Aldrich)로 자극하였다. T 세포 활성화는 완전 배지(10% FBS, 100 유닛/mL의 페니실린, 100 μg/mL의 스트렙토마이신 및 0.1% 2-메르캅토에탄올이 보충된 RPMI-1640 배지)에서 수행하였다. 유도성 IL-2 단백질 활성을 측정하기 위해, 뮤린 Tblast를 96-웰 라운드 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 적정된 양의 온전한 또는 프로테아제-활성화된(절단된) 유도성 IL-2 단백질 또는 rhIL-2를 세포에 첨가하여 전체 용량-반응 곡선을 생성하였다. 72시간 후, 증식은 제조사의 프로토콜에 따라 Cell Titer glow 시약(Promega)을 사용하여 측정하였다.
뮤린 혈장 및 인간 혈청 내 유도성 IL-2 안정성
6-8주령 암컷 C57Bl/6 마우스로부터의 전혈을 사용하여 혈장을 생성하였다. 인간 혈청은 BioIVT로부터 구입하였다. 검정 1일째, 샘플을 혼합하고 3개의 분취량(aliquot)으로 나누기 전에 유도성 IL-2를 뮤린 혈장 또는 인간 혈청에 첨가하고, 이는 추후에 분석을 위해 동결시키기 전에 지시된 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 유도성 IL-2의 효소적 처리를 평가하기 위해, 샘플을 해동하고, 인간 IL-2에 대한 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 유도성 IL-2 절단을 평가하였다. 온전한 및 프로테아제-활성화된 유도성 IL-2는 양성 및 음성 대조군으로서 포함되었다.
웨스턴 블롯 분석은 제조사의 프로토콜에 따라 JESS 시스템(Protein Simple)을 사용하여 수행하였다. 일차 항-인간 IL-2 항체는 R&D Systems(AF-202-NA)으로부터 구입하고, 항-염소 2차 항체는 Jackson Labs(AB_2338513)으로부터 구입하였다. 샘플 및 항체를 12-230 kDA Jess 분리 모듈에 로딩하고, 화학발광에 대한 표준 설정으로 설정된 Jess 시스템을 사용하여 실행하였다. 결과적인 웨스턴 블롯의 분석은 심플 웨스턴 소프트웨어(Simple Western Software)용 컴파스(Compass)(v4.1.0)를 사용하여 수행하였다.
약동학적 분석
혈장 및 종양 샘플은 Charles River Laboratories(Morrisville, North Carolina)에 의해 지정된 시점에 수집되었으며, 드라이아이스로 배송되어 -80℃에서 보관되었다. MC38 종양 용해물은 각 종양을 얼음 중 차가운 용해 완충액(1X Tris 완충 식염수, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, diH2O 중 프로테아제 억제제 포함)에서 일회용 프로브(Qiagen)가 포함된 Qiagen TissueRuptor 균질화기로 균질화시켜 생성하였다. 혈장 및 종양 용해물은 제조사의 지침에 따라, 온전한 유도성 IL-2 뿐만 아니라 유리 IL-2를 모두 검출하는 BioLegend IL-2 ELISA(431804)를 사용하여 분석되었다. 온전한 유도성 IL-2를 사용하여 12-포인트 표준 곡선을 생성하였다. 유리 IL-2의 수준을 구체적으로 분석하기 위해, 샘플은 IL-2 AlphaLISA(PerkinElmer, AL221C)를 사용하여 측정하였으며, 이는 유리 인간 IL-2를 검출하지만 비활성화 도메인과의 경쟁으로 인해 온전한 유도성 IL-2는 검출하지 못한다. 모든 AlphaLISA는 제조사의 지침에 따라 수행되었으며, Perkin Elmer Enspire 리더 및 소프트웨어로 분석되었다.
종양 소화 및 나노스트링 분석
MC38 및 B16-F10 종양은 콜라게나제 IV(3 mg/mL, Gibco)로 37℃에서 35분간 진탕하면서 효소적으로 소화시키기 전에 페놀-프리 RPMI-1640(Thermofisher)에서 작은 조각(< 5 mm3)으로 잘게 잘랐다. 소화 후, 종양 샘플을 70 μM 세포 스트레이너를 통해 기계적으로 분리하였다. 이펙터 사이토카인을 포함하는 유세포 분석을 위해, 샘플은 포볼 12-미리스테이트 13-아세트산(phorbol 12-myristate 13-acetate)(50 ng/mL, Sigma-Aldrich), 이오노마이신(1 μg/mL, Sigma-Aldritch) 및 1X 브레펠딘 A(Brefeldin A) (eBioscience)를 포함하는 완전 배지에서 37℃로 4시간 동안 재자극하였다. 나노스트링(NanoString) 분석을 위해, 5 x 105개 세포를 100 μL의 RLT 용해 완충액(Qiagen)에 동결시켰다. RNA 샘플을 LakePharma로 배송하고, nCounter FLEX 분석 시스템과 함께 nCounter Mouse PanCancer 면역 프로파일링 코드세트 패널을 사용하여 분석하였다. 나노스트링 분석은 고급 분석 모듈이 설치된 nSolverTM 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
유세포 분석
모든 세포 염색은 적절한 경우 FACs 완충액(PBS + 0.5% BSA) 또는 1x 투과화 완충액(eBioscience)을 사용하여 96-웰 라운드 바닥 플레이트에서 수행되었다. 세포는 실온에서 20분 동안 사량체 염색을 수행하기 전에 먼저 실온에서 FC 블록(BioLegend)으로 처리하였다. 사량체 염색 후, 세포를 세척하고 이후 세포외 항체의 마스터 믹스로 4℃에서 20분 동안 염색하였다. 세포는 이후 제조사의 프로토콜에 따라 eBioscience™ Foxp3 전사 인자 염색 완충액 세트를 사용하여 세척하고 밤새 고정/투과화하였다. 다음날, 샘플을 Perm 완충액으로 세척하고 4℃에서 20분 동안 세포내 마커로 염색하였다. 세포는 이후 세척하고 Cytek Aurora 시스템 상에서 분석하였다. 형광 마이너스 원(FMO) 및 단일 염색 대조군은 모든 염색에 대해 포함되었다. 일부 경우에, OneComp ebeadsTM(Thermofisher)은 세포와 함께 염색되어 단일 염색 대조군으로서 작용하였다. 개별 세포 집단은 도 12a-12b의 게이팅 전략에 의해 기술된 바와 같이 정의되었다. 이펙터 사이토카인 생성을 평가하기 위해 유세포 분석을 사용한 경우, 세포는 염색 전 37℃의 완전 배지에서 4시간 동안 1x Breldin A(Thermofisher Scientific)의 존재하에서 PMA(50 ng/mL, Sigma Aldrich) 및 이오노마이신(Ionomycin) (1 μg/mL, Sigma Aldrich)으로 재자극하였다. 다음의 단백질에 대한 유세포 분석 형광 염료-컨쥬게이션된 항체는 Biolegend로부터 구입하였다: CD8α APC, 클론 53-67; CD4 BV650, 클론 RM4-5; CD3 AF700, 클론 17A2; CD45 BV605, 클론 30-F11; CD49b APC/Cy7, 클론 DX5; CD25 BV421, 클론 PC61; CD25 APC/Fire 750, 클론 PC61; Ki67 PeCy7, 클론 16A8; Ki67 AF700, 클론 16A8; 그랜자임 B FITC, 클론 GB11; IFNγ PE, 클론 XMG1.2; F4/80 Pe/Dazzle 594, 클론 BM8; CD3 복합체 PeCy7, 클론 17A2; FC 블록, 클론 93. 다음의 단백질에 대한 유세포 분석 형광 염료-컨쥬게이션된 항체는 eBioscience로부터 구입하였다: CD45 BUV395, clon30-F11; CD4 BUV496, 클론 GK1.5; CD8 BUV563, 53.6-7; TNF BV750, 클론 MP6-XT22; CD49B Pe-Cy5, 클론 DX5, FoxP3 AF488, 클론 FJK-16s; FoxP3 eFlour450, 클론 FJK-16s. MulV p15E 펩티드 KSPWFTTL(서열번호: 7)에 대한 형광 염료-컨쥬게이션된 사량체는 ThermoFisher Scientific(50-168-9385)으로부터 구입하였다. 생(Live)/사(Dead) 블루 염료 또한 ThermoFisher Scientific(L23105)으로부터 구입하였다.
생체외 유도성 IL-2 전구약물 처리 검정
일차 인간 건강한 세포는 ATCC, Lonza 또는 Zen-Bio로부터 구입하였으며, 제조사의 프로토콜에 따라 배양하였다. 해리된 인간 종양 샘플은 Discovery Life Sciences로부터 구입하였다. 이러한 샘플은 수술로 제거되고 동결되기 전에 현장에서 효소적으로 소화된 일차 인간 종양 샘플로부터 생성된다. 구입한 모든 샘플은 드라이아이스로 배송되었으며 액체질소 냉동고에 보관되었다.
유도성 IL-2 전구약물 처리를 조사하기 위해, 샘플을 해동하고 세척하고 계수하였다. 이후, 세포를 화합물 1, 화합물 1-NC 또는 사전-절단된 화합물 1을 함유하는 X-Vivo 15 배지에 재현탁시켰다. 유도성 IL-2 전구약물은 세포 배양 상층액을 수집하고 추후 분석을 위해 동결시키기 전에 세포와 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. 해동 후 사용(thaw-and-use)하는 IL-2 리포터 세포를 활용하는 IL-2 생물검정(Promega)을 사용하여 세포 배양 상층액에서 IL-2 활성을 평가하였다(카탈로그 # JA2201/JA2205). 이 생물학적 검정은 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다. 상대적 발광 유닛(RLU) 값은 다음의 수식을 사용하여 전체 활성 퍼센트로 변환되었다:
수식 1(Eq. 1)
데이터 표현 및 통계
뮤린 종양 실험의 경우, 마우스는 각 그룹이 무작위화 및 투약의 개시 시점에 그룹당 적어도 n = 8의 마우스를 갖도록 각각의 종양 세포주가 이식되었다. 종양 크기에 기초하여 적절하게 무작위화할 수 있는 충분한 동물을 갖기 위해, 이식된 총 마우스 수는 연구에 필요한 총 동물 수에 30%를 추가하여 계산하였다. 샘플 크기는 이 모델에 대한 이전 경험에 의해 결정되었으며, 종양 측정은 비맹검된 방식으로 이루어졌다. 유세포 분석 플롯은 FlowJo 소프트웨어로 생성되었으며, 이는 대표적인 샘플이다. 모든 정량적 플롯은 Windows용 GraphPad Prism 8 소프트웨어(64-비트)(San Diego, CA)를 사용하여 생성되었다. 시험관내 활성 검정의 경우, 데이터는 제약 없이 비-선형 S자형, 4PL 곡선 맞춤 모델을 사용하여 분석되었다. 통계 분석은 또한 GraphPad Prism 소프트웨어(San Diego, CA)를 사용하여 수행하였다. 2개의 샘플 비교는 스튜던트 t-테스트(students t-test)를 사용하였고, 한편 2개 이상의 그룹 비교는 다중 비교를 포함한 분산 분석(ANOVA) 테스트를 사용하였다. 시간 경과에 따른 항종양 효과는 혼합-효과 모델을 사용하여 분석된 반면, 특정 시점에 대한 항종양 효과는 독립표본 t 테스트(unpaired　t　test)를 사용하여 분석하였다. 나노스트링(NanoString) 데이터 세트의 경우, 고급 분석 모듈(Advanced Analysis Module)이 설치된 nSolverTM 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다.
1.2 결과
유도성 IL-2 신호전달 및 활성은 단백질 분해 활성화에 따라 달라진다
유도성 IL-2 전구약물인 화합물 1은 덜 빈번한 전신 전달을 촉진하고, 분자의 종양 노출을 증가시키며, 고-용량 IL-2와 관련된 독성을 감소시킴으로써 재조합 인간 IL-2 치료의 임상적 프로파일을 향상시키도록 설계되었다(도 1a). 화합물 1은 IL-2가 중간 친화성 IL-2 수용체(IL-2Rβ/γ)에 결합하는 것을 방지하는 Fab 항체 단편인 천연 인간 IL-2를 포함하며, 이에 따라 비활성화 도메인으로 작용하고, 항-인간 혈청 알부민(αHSA) 단일 도메인 항체가 반감기 연장 도메인으로 작용한다. 이들 두 도메인은 프로테아제-절단가능한 링커 서열을 통해 IL-2 페이로드에 연결된다. 전구약물 상태의 화합물 1은 반감기가 연장되고, IL-2 수용체에 대한 분자의 결합을 차단함으로써 IL-2의 활성이 억제된다. 그러나, 링커가 종양 조직에서 효소적으로 절단되는 경우, 그 결과 반감기 연장 및 비활성화 도메인이 제거되고 천연 IL-2가 방출된다(도 1b).
온전한 및 프로테아제 절단된 화합물 1 간의 활성 차이를 측정하기 위해, HEK-Blue IL-2 리포터 세포를 재조합 인간 IL-2(rhIL-2), 온전한 화합물 1, 또는 프로테아제 활성화된 화합물 1(절단됨)과 함께 인큐베이션하고, 이후 IL-2 신호전달을 측정하였다. 이 검정에서, 온전한 화합물 1은 rhIL-2 또는 절단된 화합물 1보다 대략 100배 더 적은 활성을 가졌다(도 1c). 추가로, 인간 PBMC를 PHA로 자극하여 Tblast를 형성하였으며, 이는 고친화성 IL-2 수용체(CD25/CD122/CD132)를 발현하고(도 8a-8b) 증식에 의해 IL-2 신호전달에 반응한다. 다수의 공여자로부터의 인간 Tblast를 rhIL-2, 온전한 화합물 1, 또는 절단된 화합물 1에 72시간 동안 노출시키고, 이후 Tblast 증식을 측정하였다. 본 시스템에서, 온전한 화합물 1은 다수의 공여자에 걸쳐 절단된 화합물 1 또는 rhIL-2보다 활성이 낮았다(도 1d, 도 8c). 보다 구체적으로, 온전한 화합물 1은 증가된 EC50 측면에서 대략 23배 더 적은 활성을 가졌고, 절단된 화합물 1 또는 rhIL-2에서 확인된 최대 활성의 단지 60%에서만 정체 상태를 유지하였다.
온전한 및 절단된 화합물 1의 활성은 또한 마우스 일차 Tblast 검정에서 특성화하였다. 절단된 화합물 1 및 rhIL-2는 뮤린 Tblast에 의한 유사한 증식을 유도한 반면, 온전한 화합물 1은 여러 마우스로부터 분리된 세포에서 측정가능한 활성을 거의 갖지 않았다(도 1e, 도 8d). 절단된 활성은 화합물 1이 링커 절단에 의존적이며 알려지지 않은 처리 이벤트가 아님을 확인하기 위해, 화합물 1-NC로 명명된 화합물 1의 비-절단가능한 변이체는 링커 서열을 비-절단가능한 글리신/세린 서열로 대체함으로써 생성하였다. 대조군으로서, 화합물 1-NC를 인간 Tblast에서 테스트하기 전에 화합물 1과 동일한 효소적 소화로 처리하였다. 예상되는 바와 같이, 화합물 1-NC의 온전한 및 "절단된" 형태 간에 활성의 차이가 확인되지 않았으며, 이는 화합물 1전구약물로부터 방출된 IL-2의 전체 활성을 회복시키기 위한 링커 절단에 대한 필요성을 입증한다(도 1f).
화합물 1 처리는 절단-의존적 방식으로 종양 성장을 제어하였다
화합물 1 처리가 종양 성장을 억제할 수 있는지를 테스트하기 위해, 마우스에 MC38 종양 세포를 이식하고 종양이 100-150 mm3 사이일 때 처리 그룹으로 무작위화하였다. 이후, 마우스는 총 4회 용량에 대해 비히클(PBS) 또는 적정량의 화합물 1 또는 화합물 1-NC(비-절단가능한 대조군)로 주 2회 처리하였다. 시험관내 고농도로 테스트할 때 온전한 화합물 1로 관찰된 잔류 활성을 고려하면, 화합물 1-NC는 또한 온전한 화합물 1로부터 특이적으로 유도된 생체내 활성 수준에 대한 대조군으로 작용한다(도 1c-1e). 이 모델에서, 화합물 1의 가장 낮은 용량(25 μg)에서도 통계적으로 유의미한 종양 성장 억제가 초래되었다(도 2a, 2i 및 13b). 또한, 100 μg, 150 μg 또는 300 μg의 용량은 모두 매우 효과적이었다. 해당 투약 그룹의 24마리 마우스 중 23마리는 실험 종료시 측정 가능한 종양이 남아 있지 않는 완전한 반응을 보였다(도 2a). 이러한 모든 용량 수준은 체중 손실의 징후 없이 마우스에 의해 잘 용인되었다(도 9a). 대조적으로, 화합물 1-NC가 테스트된 최고량(300 μg)으로 투약된 경우에도, 이는 종양 성장에 무시해도 될 정도의 영향을 미쳤으며, 상기 화합물 1의 항-종양 활성이 이의 링커의 생체내 효소적 절단에 의존적임을 입증하였다. 추가로, CD8+ T 세포가 고갈될 때 화합물 1의 항-종양 활성이 감소하였으며(도 2i), 이는 화합물 1이 숙주 이펙터 세포 항-종양 반응을 지지함을 입증하였다.
재조합 인간 IL-2의 광범위한 임상적 사용에 대한 주요 장애물은 이 사이토카인이 전신적으로 제공될 때 관찰되는 독성이다. 화합물 1은 IL-2 치료의 PK 프로파일을 향상시키도록 설계되었기 때문에, 반감기가 연장된 IL-2를 사용하면 실제로 원래 유리 사이토카인보다 훨씬 더 큰 독성을 초래할 수 있음이 가능하였다. 따라서, 본 발명자들은 화합물 1의 반감기 연장 요소가 항-종양 활성에 필요한지 여부를 테스트하였다. 실제로, 반감기 연장 요소가 결여된 유도성 IL-2 전구약물(WW0057)이 생체내에서 테스트되었을 때, 이 분자는 화합물 1의 완전 효과적인 용량의 10배로 제공된 경우에도 항-종양 면역을 생성하지 못하였으며(도 13c), 이는 IL-2 전구약물로 항-종양 면역을 생성하기 위해 반감기 연장 요소를 포함할 필요성을 입증한다. 본 발명자들은 화합물 1의 차단 요소가 반감기 연장된 IL-2에 대한 노출로 예상되는 독성 증가를 방지할 수 있는지 여부를 조사하였다.
독성 제한시, 비활성화 도메인의 효과를 더 잘 이해하기 위해, 차단 도메인이 없는 화합물 1의 변이체가 생성되었다(WW0177). WW0177은 반감기 연장 도메인과 완전 활성인 IL-2 사이에 비-절단가능한 링커 서열을 함유한다는 점, 및 비활성화 도메인을 갖지 않는다는 점에서 화합물 1과 상이하며, 이에 따라 이는 비활성화 도메인이 제대로 기능하지 않을 경우 예상되는 독성 수준을 나타낸다. MC38 종양-보유 마우스에 WW0177 또는 화합물 1을 투약하고, 이들의 체중을 시간 경과에 따라 모니터링하였다(도 2b). 단지 2회 WW0177의 투약 후, 체중 손실로 인해 투약을 중단해야 했고, 2/7마리의 마우스만이 생존하였다. 대조적으로, 4회 용량의 화합물 1로 처리된 마우스는 WW0177을 받은 그룹에 투여된 IL-2의 대략 26배 몰량이 제공되었음에도 불구하고, 체중 손실의 증거가 없었다.
상기 손실은 면역요법과 관련하여 전체 독성을 모니터링하는 데 유용한 대용이지만, 이는 장기 특이적 독성에 대한 화합물 1의 효과를 조사하는 것 또한 중요하였다. 혈관 누출 증후군(VLS)은 임상에서 고용량 IL-2 처리와 관련된 주요 용량-제한 독성이며, 이는 고용량 IL-2의 임상적 유용성을 제한할 뿐만 아니라 반감기 연장된 IL-2가 실행 가능한 임상적 전략이 되는 것을 방지한다. 마우스에서, VLS는 고용량의 재조합 IL-2에 의해 유도되며, 이는 i.v. 주사 후 폐 내로 누출되는 에반스 블루 염료의 양을 조사하여 측정할 수 있다. 전체 독성 데이터와 일치하게, 재조합 인간 IL-2, WW0177 또는 화합물 1을 등몰량으로 투여한 경우, 재조합 인간 IL-2 및 WW0177만이 검출 가능한 수준의 에반스 블루가 폐 내로 누출되는 결과를 보인 반면, 화합물 1은 그렇지 않았다(도 13d). 이들 데이터는 화합물 1의 차단 도메인이 말초 조직에서 IL-2의 활성을 효과적으로 차단하고, 말초 활성 IL-2 분자와 비교하여 VLS의 유도가 방지됨을 입증한다.
화합물 1의 비활성화 도메인이 매우 효과적이지만, 이 도메인의 활성은 IL-2 분자에 연결된 상태로 남아 있는 차단제에 따라 달라진다(도 1). 말초에서 화합물 1의 안정성을 조사하기 위해, 온전한 화합물 1의 수준을 웨스턴 블롯으로 측정하기 전에, 화합물 1을 나이브 또는 MC38 종양-보유 마우스로부터의 뮤린 혈장에서 24, 48 또는 72시간 동안 인큐베이션하였다. 분자의 내약성과 일치하게, 테스트된 모든 시점에 걸쳐 화합물 1 절단의 증거는 없었다(도 2c).
말초 독성 관리 이외에, 화합물 1은 고용량 IL-2의 효능 및 항-종양 활성을 희생시키지 않고 치료의 덜 빈번한 전신 전달을 촉진하도록 설계되었다. 따라서, 화합물 1의 활성을 천연 IL-2와 직접 비교하는 것이 중요하였다. MC38 종양-보유 마우스를 이전과 같이 적정된 양의 화합물 1(2주 동안 매주 2회) 또는 rhIL-2를 2주 동안 일 2회 투약하여 처리하였다(투약 레지멘: 2주 동안 5일 투약, 2일 휴식 일정). 투약 일정의 차이는 인간(15) 및 마우스(16) 모두에서 rhIL-2의 불량한 생체내 약동학적 특성을 반영하고, 임상에서 고-용량 IL-2를 가진 환자의 투약을 모방한다. 두 처리는 상이한 투약 레지멘으로 전달되므로, 처리 그룹을 비교하는 올바른 방법은 투약 기간 동안 전달된 IL-2의 총량을 비교하는 것이다. MC38 종양-보유 마우스를 총 5.04 μM의 화합물 1로 처리한 경우, 8/8 마우스에서 완전한 종양 거부가 나타났다. 대조적으로, 마우스를 15.5 μM의 천연 IL-2(화합물 1을 투약한 IL-2 총량의 3배)로 처리한 경우에도 5/8 마우스만이 종양을 완전히 거부하였다(도 2d).
앞서 언급한 바와 같이, 프로류킨 치료의 불량한 약동학적 프로파일(t1/2 < 1시간)은 비실용적인 투약 레지멘을 초래하고, 더불어 많은 환자가 최대 15회 용량에 대해 8시간마다 고용량을 투여받게 된다(17). 마찬가지로, 마우스에서, rhIL-2는 순환으로부터 빠르게 제거된다(16). 본 발명자들은 천연 IL-2와 비교하여 화합물 1의 증가된 활성이 이의 연장된 반감기 및 약동학적 프로파일에 기인한다는 가설을 세웠다. 이를 확인하기 위해, 종양-보유 마우스는 0일째 1회, 및 4일째 1회 투약하고, 다양한 시점에서 혈장 및 종양 내에서 약물 노출을 측정하였다. rhIL-2와 대조적으로, 화합물 1 투약은 대략 20시간의 반감기로 혈장 내 연장된 노출을 초래하였고, 노출은 4일의 과정 동안 유지되었다(도 2e). 추가적으로, 화합물 1의 복강내 투약은 종양 자체 내에서 연장된 약물 노출을 초래하였고, 이는 화합물 1에 의한 조직 침투를 입증하였다(도 2f). 총 화합물 1의 수준은 혈장에서 투약 후 6시간째 Cmax에 도달하고, 종양에서는 투약 후 12시간째 최고조에 달하였다.
화합물 1은 절단가능한 링커의 사용을 통해 완전히 활성인 IL-2를 종양에 국소적으로 전달하면서 IL-2의 전신 활성을 제한하도록 설계되었다. 화합물 1의 전신 투약이 종양 내로 rhIL-2의 국소 전달을 초래하는지 여부를 테스트하기 위해, 투약 후 다양한 시점에서 혈장 및 종양 샘플을 수집하고 효소적 처리로 인해 방출된 유리 인간 IL-2(즉, 차단 Fab에 결합되지 않음)의 존재에 대해 분석하였다. 단백질 분해 처리에 의해 IL-2 전구약물로부터 방출된 인간 IL-2를 구체적으로 측정하기 위해, 본 발명자들은 인간 IL-2에 특이적인 ELISA 키트를 확인하였으며(도 13e), 여기서 화합물 1의 차단 도메인은 ELISA 검출 시약의 결합을 방지하였다(도 13f). 이는 화합물 1의 생체내 처리를 통해 뮤린 시스템에만 존재할 수 있는 유리, 인간 IL-2의 수준을 평가하도록 허용하였다. 화합물 1을 이용한 전신 투약은 혈장에서 거의 검출할 수 없는 유리 IL-2를 초래하였다(도 2g). 대조적으로, 화합물 1의 전신 투약은 종양에서 검출가능한 유리 IL-2의 연장된 수준을 초래하였고(도 2h), 이는 종양 의존적 처리가 화합물 1의 전신 전달 이후 종양에서 완전 활성인 IL-2의 증가된 노출을 유도함을 입증한다.
화합물 1 처리 측면에서 혈장과 종양 사이의 차이를 더 잘 정량화하기 위해, 노출 곡선하면적(도 2e-2h)을 측정하고 표 3에 기록하였다. 놀랍게도, 혈장 내 총 화합물 1의 양은 종양에서 검출된 것보다 약 18배 더 많았지만, 종양 내 유리 IL-2의 양은 여전히 혈장에서 검출된 것보다 5배 이상 더 많았으며, 이는 혈장과 비교하여 종양에서 화합물 1 처리가 대략 93배 증가했음을 시사한다.
표 3. MC38 종양-보유 마우스의 혈장 및 종양 내 총 화합물 1 및 유리 IL-2의 곡선하면적 분석.
*AUC 측정값은 프리즘 소프트웨어를 사용하여 도 2e-2h의 플롯으로부터 계산되었다. 이들 값은 종양의 노출과 혈장의 노출을 비교하는 노출 비율을 계산하는데 사용되었다.
*AUC, 곡선하면적; IL-2, 인터루킨-2; MC, 뮤린 결장.
요법의 치료적 창(TW)은 최대 허용 용량 및 최저 유효 용량의 비율로 정의되고, 이에 따라 활성 및 중증 유해 반응 사이의 차이를 식별한다. 임상(clinic)에서, 프로류킨에 대한 TW는 비교적 작다. 유사하게, MC8 종양 보유 마우스에서 rhIL-2의 TW는 본 모델에서 4배 미만인 것으로 계산되었다(도 9b). WW0177의 반감기 연장 요소는 이를 보다 활성인 IL-2 버전으로 만들기 때문에, 재조합 hIL-2에 비해 완전한 효능에 도달하는데 더 적은 WW0177이 필요하다. 그러나, WW0177은 또한 더 낮은 최대 허용 용량을 가지며, 2 미만의 TW를 초래한다. 그러나, 화합물 1은 등몰량의 rhIL-2보다 유의미하게 더 활성이었고, 최대 960 μg/용량의 화합물 1을 투약한 종양 보유 마우스에서는 독성이 확인되지 않았으므로, 화합물 1의 TW는 최소 20보다 크며, 이는 rhIL-2에 비해 적어도 5배 개선을 나타낸다(도 13g). 이러한 데이터는 화합물 1이 단순히 약화된 IL-2 분자가 아닌 대신, 페이로드의 활성을 향상시키면서 이의 전신 활성은 제한하는 독특한, 유동성 IL-2 전구약물임을 입증한다.
MC38 종양-보유 마우스에 대한 화합물 1 처리는 면역학적 기억을 초래한다
종양의 면역학적 거부의 한 특징은 후속적 종양 재-투여에 대한 보호 기억의 발달이다. 화합물 1 처리가 종양 거부 후 종양-특이적 기억을 초래하는지 여부를 테스트하기 위해, 마우스에 MC38 종양 세포를 이식하고 비히클 또는 화합물 1 처리 그룹으로 무작위화하고 종양 성장을 측정하였다. 이전 연구와 마찬가지로, 화합물 1 처리는 종양 거부를 초래한 반면, 대조군 종양은 계속 성장하였다.
화합물 1-처리된 마우스에서 종양 거부가 면역학적 기억을 초래하는지 여부를 조사하기 위해, 초기 MC38 이식 6개월 후에 종양-특이적 기억 CD8+ T 세포의 존재에 대해 마우스로부터의 비장을 조사하였다(MC38 CR 마우스)(도 3a). 이전 연구는 뮤린 백혈병 바이러스 단백질 gp70(KSPWFTTL)(서열번호: 7)로부터 유래된 펩티드가 MC38 종양에 의해 제시되는 항원이며, 이 항원에 특이적인 T 세포는 사량체로 알려진 형광 표지된 MHC 펩티드 복합체를 사용하여 식별할 수 있음을 확인하였다(18). MC38 CR 마우스의 비장은 연령이 일치하는 종양-나이브 마우스보다 사량체-양성 CD8+ T 세포의 전체 빈도가 더 높았다(도 3a-3b). 더욱이, 종양-나이브 마우스로부터의 사량체-양성 세포는 대체로 나이브 표현형을 유지하였지만, MC38 CR 마우스로부터의 세포는 주로 이펙터 기억 표현형(CD44hiCD62Llow)이었다(도 3c-3d). 더욱이, 재-자극시, MC38 CR 마우스로부터의 사량체-양성 세포는 이펙터 사이토카인 TNF 및 IFNγ를 더 많이 분비하였다(도 3e-3f). 2개 이상의 이펙터 사이토카인의 공-발현은 다기능성으로 알려져 있으며, 이는 T 세포에서 더 큰 세포용해 활성과 관련이 있다(19). WTX-124 처리는 또한 재-자극 후 다기능성 T 세포의 빈도를 유의미하게 증가시켰다(도 3g). 이들 데이터는 화합물 1 처리가 면역 매개 종양 거부를 초래하고, 이는 이후 면역학적 기억으로 변환된다는 견해와 일치한다.
이들 비장세포의 표현형이 종양-특이적 기억의 생성을 시사하지만, 기억 반응의 궁극적인 테스트는 재투여에 대한 보호이다. 따라서, 화합물 1-유도 MC38 CR 마우스는 초기 이식 후 60일째 MC38 종양 세포로 재-투여하였다(도 3h). 중요한 것은, 재투여 동안 어떠한 처리도 투여되지 않았다. 종양-나이브 마우스와는 달리, MC38 CR 마우스 중 어느 것도 종양을 발생시키지 않았으며(도 3i), 이는 유도성 IL-2 단백질 처리-유도된 종양 거부가 면역학적 기억 및 후속적 종양 재투여에 대한 보호를 초래함을 입증한다.
화합물 1 처리는 MC38 종양 침윤을 증폭시키고 면역 세포 활성화를 유도하였다
화합물 1 처리가 항-종양 면역을 유도하는 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해, MC38 종양-보유 마우스를 0일째에 처리 그룹으로 무작위화하고 1일째 및 4일째에 비히클 또는 화합물 1로 처리하였다. 이들의 제2 투약 후 24시간째 종양을 수확하였다. 단일-세포 현탁액으로부터 총 RNA를 추출하고, NanoString nCounter® PanCancer 마우스 면역 프로파일링 패널을 사용하여 분석하였다. 화합물 1 처리는 전사적 프로파일에 명확한 이동을 초래하였고, 패널의 437/770개 유전자는 대조군과 비교하여 발현에서 통계적으로 유의미한 차이를 보였다(도 4a-4b). 이 데이터 세트의 NanoString nSolver™ 경로 분석은 화합물 1 처리에 의해 상향조절된 일련의 면역 활성화-관련 경로를 밝혀냈으며, 이는 적응성 면역 및 염증과 같은 광범위한 면역 활성화 시그니처 뿐만 아니라 백혈구 기능, NK 세포 기능 및 T 세포 기능과 같은 보다 구체적인 시그니처를 모두 포함하였다(도 4c). 흥미롭게도, PD-1, TIGIT 및 CTLA-4를 비롯하여, 면역 체크포인트 단백질과 관련된 여러 전사체의 발현도 화합물 1 처리 후에 증가하였다(도 4d). 이는 전형적인 면역 반응 동안 많은 체크포인트 단백질이 상향조절됨에 따라, 종양-침윤 림프구(TIL) 중 면역 세포 활성화의 전반적인 증가를 반영한다.
나노스트링(NanoString) 분석 이외에, 유세포 분석에 의한 면역 세포 프로파일링도 수행하였다. 초기 투약 5일 후부터, 화합물 1 처리는 종양-특이적 사량체-양성 CD8+ T 세포(~19.8배 증가) 및 이보다 적은 정도의 Treg(~2.5배 증가)을 비롯하여, 침윤 면역 세포의 밀도를 크게 증가시켰다(도 4e). Treg에 대한 IL-2-기반 요법의 효과는 과학계에서 주요 논의 주제이며, 이는 IL-2 치료가 역효과적인 Treg 확장을 초래하여 임상에서 면역요법을 방해할 수 있다는 우려가 있기 때문이다. 이는 Treg 결합을 방지하도록 조작된 여러 IL-2 변이체 분자의 개발로 이어졌다. 대조적으로, 화합물 1은 본 발명자들이 세포용해 세포 상에서 완전히 활성화된 IL-2의 활성이 상기 요법과 관련된 임의의 가능한 Treg 활성화를 극복할 것이라는 가설을 가짐으로써, Treg을 피하도록 특별히 조작되지 않는다. 이 가설을 뒷받침에 있어서, 화합물 1 처리 후 사량체-양성 CD8+ T 세포의 증가는 Treg의 증가를 훨씬 초과하여, 화합물 1 처리 후 사량체-양성 CD8+/Treg 비율의 유의미한 증가를 초래하였다(도 4f). 화합물 1에 의해 생성된 극도로 강력한 항-종양 활성과 결합된 이러한 발견은 Treg 활성화가 화합물 1의 효능을 유의미하게 손상시키지 않음을 시사한다.
종양-침윤 T 세포의 활성화 상태를 평가하기 위해, TILS로부터의 샘플을 재-자극하고, IFNγ, TNF 및 그랜자임 B의 생성을 평가하였다. 화합물 1 처리는 IFNγ(도 4g-4h), TNF(도 10a) 및 그랜자임 B(도 10b)를 생성하는 사량체-양성 CD8 T 세포의 빈도를 유의미하게 증가시켰다. 화합물 1 처리는 또한 사량체-양성 CD8+ T 세포의 다기능성을 유의미하게 증가시켰으며, 이와 더불어 대조군과 비교하여 이들 이펙터 사이토카인 중 2개 또는 3개 모두를 생성하는 사량체-양성 CD8+ T 세포의 빈도가 더 높았다(도 4i).
최근 데이터는 특정 상황에서 Treg이 "Treg 취약성"으로 알려진 현상에서 TNF 및 IFNγ와 같은 이펙터 사이토카인을 생성할 수도 있음을 입증하였다(20). 중요한 것은, Treg에 의한 이펙터 사이토카인의 생성이 이들의 억제 활성의 상실과 관련이 있다는 것이다. 흥미롭게도, 대조군 종양으로부터 극소수의 Treg이 IFNγ 또는 TNF를 생성하였지만, 화합물 1-처리된 종양으로부터의 Treg의 하위 집단은 이들 이펙터 사이토카인을 모두 생성하였다(도 4j-4m). 더불어, 이들 데이터는 화합물 1 처리가 종양 침윤을 증가시키고, 종양-특이적 CD8+ T 세포를 활성화시키며, Treg의 표현형 불안정성을 유발함을 입증한다.
종양 거부를 생성하기 위해 화합물 1에 의한 면역 세포의 종양 특이적 활성화
전신 화합물 1 처리의 효과가 종양 미세환경에 대해 선택적인지 확인하기 위해, 종양, 비장, 말초 혈액 및 배액 림프절로부터 유래된 T 세포에 의한 이펙터 사이토카인 생성을 이전에 기술된 것과 동일한 처리 일정을 사용하여 화합물 1 처리 후에 비교하였다. 사량체+ 집단은 종양 내의 CD8+ T 세포 중에서 선택적으로 풍부화되기 때문에, 분석에 이들 세포의 포함은 상이한 부위에 걸쳐 비교가 편향될 수 있다. 따라서, 사량체-음성 CD8+ T 세포를 다양한 조직에 걸쳐 구체적으로 검사되었다. 이전 데이터와 마찬가지로, 화합물 1은 검사된 말초 조직에서 관찰된 상대적으로 작은 수준의 활성과 비교하여, 종양 내에서 IFNγ-생성 CD8+ T 세포 및 CD4+ 비-Treg의 빈도를 유의미하게 더 높게 유도하였다(도 5a-5b). 더 이전의 독성 데이터와 함께, 이러한 데이터는 화합물 1 처리가 광범위한 말초 T 세포 활성화를 초래하지 않음을 입증한다.
화합물 1 처리로 관찰된 말초 CD8+ T 세포 활성화는 제한적이었지만, 이러한 낮은 수준의 말초 활성이 이 모델에서 항-종양 면역을 생성하는데 여전히 역할을 하고 있을 가능성은 남아있었다. 종양-특이적 활성화가 항-종양 면역을 생성하기에 충분한지 여부를 테스트하기 위해, 일부 마우스를 핑골리모드(Fingolimod) 또는 FTY720으로 처리하기 전에 약 100-150 mm3까지 성장하는 MC38 종양을 마우스에 이식하였다. FTY720은 스핑고신-1-포스페이트 수용체를 차단하고, 이로써 흉선 및 2차 림프 조직으로부터 림프구가 빠져나가는 것을 방지하는 소분자이다(21). 따라서, FTY720-처리된 마우스에서 확인된 임의의 항-종양 활성은 치료 시작시 이미 종양에 침윤된 면역 세포로부터 유래하는 것이지, 2차 면역 조직으로부터 추가 림프구의 활성화 및 후속 트래피킹(trafficking)으로부터 유래하는 것이 아니다. 매일 FTY720 처리는 화합물 1의 항-종양 활성에 영향을 미치지 않았으며(도 5c), 이는 TIL 단독의 활성화가 MC38 종양을 거부하는데 충분했음을 입증한다. 더불어, 이들 데이터는 종양-보유 동물에 대한 화합물 1의 전신 투여가 유도성 IL-2 분자의 종양 처리 및 강력한 항-종양 면역을 생성하기에 충분한 종양-침윤 면역 세포의 우선적 활성화를 초래함을 입증한다.
암 환자의 경우, "반응률이 높은(hot)" 종양으로 일컬어진 기존 TIL 집단의 존재는 면역요법에 대한 반응과 상관관계가 있으며, "반응률이 낮은(cold)" 종양으로 알려진 기존 TIL 집단의 결여는 반대 상관관계를 갖는다. 뮤린 동계 종양 모델은 이들의 기준선 면역 침윤 뿐만 아니라 이들의 면역요법에 대한 반응이 다양하다. 예를 들어, MC38 종양에서, TIL의 대략 20%는 CD8+ T 세포인데 비해 B16-F10 종양에서는 단지 2.5%이다(도 12a-12b).
면역원성이 덜한 종양 모델에서 화합물 1의 활성을 테스트하기 위해, 마우스는 B16-F10 흑색종 세포를 피하 주사하였다. 이전과 동일한 투약 일정을 사용하여, PBS 또는 다양한 용량의 WTX-124를 투여받도록 마우스를 무작위화하기 전에 종양을 평균 부피 100 mm3까지 성장하도록 허용하였다. 화합물 1 종양-침윤 사량체-양성 방식(도 6a)인 반면, 항-PD-1 단독 치료는 이 모델에서 비효과적이었다(도 11). 흥미롭게도, 더 낮은 용량의 화합물 1과 PD-1 차단의 조합은 조합 활성을 입증하였다. 그러나, PD-1 차단의 추가적인 이점은 화합물 1의 더 높은 용량으로는 확인되지 않았다.
종양 성장 억제 메커니즘을 추가로 탐구하기 위해, 제2 투약 후 24시간째 화합물 1로 처리된 마우스로부터 총 종양 RNA를 추출하고, NanoString nCounter® PanCancer 마우스 면역 프로파일링 패널을 사용하여 분석하였다. 화합물 1 처리는 화합물 1 처리 후 통계적으로 상이한 184/770의 검사된 전사체와 함께, 큰 전사적 이동을 초래하였다(도 6b). 흥미롭게도, B16-F10 TIL의 유세포 분석에 의한 면역 프로파일링은 화합물 1 처리 후 MC38 종양에서 관찰된 면역 세포의 큰 증가를 나타내지 않았으며, 이는 이러한 용량에서 이들 두 모델 간의 항-종양 효능의 차이를 설명할 수 있다(데이터는 나타내지 않음). 그러나, 화합물 1 처리는 종양-침윤 사량체-양성 CD8+ T 세포(도 6c-6d) 및 NK 세포(도 6e-6f)에 의한 증식 및 그랜자임 B 생성을 유도하였다. 더욱이, 화합물 1은 종양 침윤 NK 세포, CD4+ NonTreg, 총 CD8+ T 세포 및 사량체+ CD8+ T 세포에 의한 CD25 발현 및 증식 유도에 있어서 등몰량의 재조합 hIL-2보다 더 효과적이었는데, 이는 유리 사이토카인과 비교하여 IL-2 전구약물의 강화된 PK 프로파일로 인한 것일 가능성이 높다. 마지막으로, MC38 모델에서와 마찬가지로, B16-F10 종양-보유 마우스에 대한 화합물 1 처리는 TNF 및 IFNγ와 같은 염증성 사이토카인을 생성하는 종양-침윤 FoxP3+ Treg의 작은 서브세트를 초래하였으며(도 6g-6h), 이는 화합물 1 처리가 이 모델에서도 Treg 취약성을 유도함을 시사한다. 더불어, 이들 데이터는 화합물 1 처리가 염증이 덜하고 반응률이 더 낮은(colder) 종양 모델에서 TIL 활성화 및 종양 성장 억제를 유도할 수 있음을 입증한다.
화합물 1은 인간 혈청에서 안정하였고 인간 종양에 의해 처리된다.
인간 종양 샘플은 본질적으로 이질적이며 상이한 정도의 프로테아제 조절장애 및 발현을 나타낸다(15). 따라서, 대부분의 종양 유형에 의한 전신 순환 및 처리의 안정성에 기초하여 잠재적인 INDUKINE™ 분자 링커를 식별하기 위한 스크리닝을 수행하였다. 이 스크리닝의 기준은 특정 표적 프로테아제에 기초하여 링커를 사용하는 대신 일차 인간 종양 샘플에 의해 특이적으로 절단된 링커를 선택하는 프로테아제 불가지론 접근법(agnostic approach)이었다. 이는 화합물 1에 대한 상이한 도메인을 분리하는 링커 서열의 선택을 초래하였다.
화합물 1의 말초 안정성 시험으로서, 단백질을 처리 전 최대 72시간 동안 건강한 공여자(n=3)로부터의 인간 혈청과 인큐베이션하고 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 뮤린 혈장 실험과 일치하게, 화합물 1은 임의의 테스트된 공여자에서 인간 혈청으로 처리되지 않았다(도 7a). 화합물 1이 종양 샘플에 의해 처리되었는지 여부를 테스트하기 위해, 생체외 처리 검정을 개발하였다. 간략하게, 분리된 인간 종양 샘플은 생성된 IL-2 활성을 측정하기 전에 화합물 1 또는 대조군 단백질과 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. 온전한 화합물 1 전구약물의 기준선 활성에 대한 대용물로서 화합물 1-NC, 및 완전히 활성화된 분자의 대표로서 사전-절단된 화합물 1을 사용하여, 해리된 인간 종양 샘플과 화합물 1의 인큐베이션에 의해 유도된 활성을 0-100% 활성화 범위로 정규화하였다. 일부 경우에, 일차 인간 종양 샘플은 또한 사전-절단된 화합물 1 양성 대조군에서 유리 IL-2의 일부를 소비하는 능력을 갖는 생존가능한 TIL을 함유하였다. 이는 특정 샘플에서 인위적으로 억제되는 양성 대조군의 활성을 초래하였으며, 이는 일부 샘플이 양성 대조군에 비해 100% 이상의 활성을 기록할 가능성을 허용한다. 이러한 문제에도 불구하고, 이 검정은 일차 인간 종양 샘플에 의해 화합물 1이 처리되고 있는지 여부에 대한 이원 분석으로서 사용하기에 충분하다.
화합물 1이 다양한 조직 샘플에 의해 얼마나 잘 처리되었는지 조사하기 위해, 화합물 1을 절단하는 능력에 대해 건강한 일차 인간 세포(n = 13) 및 일차 인간 종양 샘플(n = 97)을 조사하였다. 건강한 일차 세포는 다양한 조직으로부터 유래되었으며, 종양 샘플은 광범위한 종양 유형 및 단계를 포괄하였다. 중요하게도, 건강한 일차 세포에 대한 화합물 1의 노출은 절단에 대한 임의의 증거를 나타내지 않았으며, 이는 이 단백질이 환자의 말초에서 안정할 것임을 다시 한번 시사한다(도 7b). 대조적으로, 테스트된 종양 샘플의 대부분은 화합물 1을 처리할 수 있었다. 이러한 데이터는 화합물 1이 인간 혈청 또는 건강한 일차 세포에 노출되었을 때 안정하지만, 대부분의 인간 종양 샘플에 의해 효율적으로 활성화되고, 이는 암을 가진 환자를 위한 새로운 면역요법으로서의 추가 개발을 뒷받침함을 시사한다.
1.3 논의
고-용량 IL-2 요법은 1992년에 전이성 신장세포암종을 가진 환자에 대해 그리고 1998년에 진행성 흑색종을 가진 환자에 대해 최초로 승인되었다(4). 현대 면역-종양학 분야의 출현 전에, 고-용량 IL-2가 비록 소수의 환자들일지라도 완전 반응과 관련된 치료로서 두각을 나타내었다. 그러나, IL-2와 같은 전염증성 사이토카인의 항-종양 잠재력은 이들의 전신 전달 및 종양 미세환경 외부의 표적 세포와의 결합과 연관된 심각한 독성에 의해 저해되었다(4). IL-2의 특정 경우에, 여러 제약 및 생명공학 회사는 IL-2 고-친화성 수용체의 활성화를 피하는 덜 활성인 형태의 IL-2(비-알파 분자로 알려짐)를 생성함으로써 이러한 문제를 최소화하려고 노력하였다(7-10). 불행하게도, 이러한 분자 변이체는 사이토카인의 신호 전달을 담당하는, 중간-친화성 수용체(CD122/CD132 서브유닛)를 운반하는 세포를 여전히 전신적으로 활성화시킬 것이며, 이들은 전임상 모델에서 효능을 확인하는데 필요한 용량으로 완전히 활성인 IL-2 처리와 유사한 독성 문제에 직면한다. 실제로, IL-2 요법에 대한 비-α 접근법은 치료적 창을 개선하기보다는 이를 단순히 이동시킬 수 있다. 또한, 새로 활성화된 CD8+ T 세포는 CD25를 상향조절하여 항원의 존재하에서 이들의 지속적인 확장에 필요한 고-친화성 수용체를 형성한다. 예를 들어, 바이러스 감염 모델을 사용한 간행물에서, CD25가 결여된 CD8+ T 세포는 중간-친화성 수용체의 발현에도 불구하고, 감염된 조직 내에서 확장하지 못하였다(22).
유도성 IL-2의 설계는 rhIL-2 요법과 관련된 과제를 해결한다. 유도성 IL-2는 항-종양 면역을 유도하는 이러한 사이토카인의 완전한 약리학적 잠재력을 실현하기 위한 천연 IL-2를 함유한다. 이 분자는 전신 독성을 최소화하기 위해 전구약물로 조작되었으며, 종양 미세환경에서 IL-2를 선택적으로 방출하기 위해 조건부로 활성화된다. 화합물 1의 활성은 인간 리포터 세포 검정 시스템 뿐만 아니라 인간 및 마우스 일차 세포에서 시험관내 고도로 유도성이었다. 마찬가지로, 화합물 1은 마우스 동계 모델에서 효과적이었으며, 이 효능은 종양-특이적 처리에 따라 달라졌다. 반감기 연장 도메인은 고-용량 IL-2 요법(프로류킨)에 대한 전통적인 투약 일정에 비해 덜 빈번한 투약으로 더 나은 약물 노출을 위한 기회를 제공한다. 예를 들어, MC38 마우스 모델에 주 2회 투약함으로써 완전한 반응이 신뢰성 있게 생성될 수 있지만, 약간 더 많은 양의 전구약물로 매 2주 1회 드물게 투약하여 마우스의 100%에서 완전한 반응이 달성될 수도 있다. 또한, IL-2 비활성화 도메인에 의해 제공된 말초 비활성화는 강력한 효능을 위해 필요하지만 명백한 독성이 없는 용량보다 > 20배 더 높은 용량으로 마우스에 이러한 IL-2 전구약물의 안전한 투여를 위해 허용된다. 증가된 효능 및 감소된 독성 간에, 화합물 1은 고-용량 IL-2에 대해 이전에 기술된 것보다 유의미하게 더 넓은 치료적 창을 갖는다.
본 간행물에 보고된 데이터는 화합물 1 효능이 TNF, 그랜자임 B 및 IFN-γ와 같은 이펙터 사이토카인을 생성할 수 있는, 종양 내 이펙터 세포(T 세포 및 NK 세포 모두)의 확장 및 활성화에 의해 유도됨을 입증한다. 실제로, 종양-침윤 면역 세포의 활성화는 강력한 항-종양 반응을 생성하기에 충분하였다. 추가적으로, 화합물 1 처리는 종양-침윤 다기능성 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시켰으며, 이는 바이러스 모델에서 더 큰 세포용해 활성과 관련되어 있다(18,19). 비-α IL-2 요법의 지지자에 의해 발현된 우려 중 하나는 CD25가 Treg 상에서 높게 발현된다는 것이며, 따라서 Treg 확장은 야생형 IL-2에 반응하여 생성된 항-종양 면역을 억제할 것이다. 비록 화합물 1 처리가 약간의 Treg 확장을 초래하였지만, CD8+ T 세포의 확장은 Treg의 확장을 훨씬 능가하여 처리 후 유리한 CD8/Treg 비율을 초래하였다. 또한, WTX-124 처리는 종양-특이적 방식으로 이펙터 세포에 의한 IFN-γ의 발현을 유의미하게 증가시켰다. IFN-γ는 근본적인 이펙터 사이토카인이며, 이는 반응에 대한 세포 면역 구성요소를 증폭시키고 CD4+ T 세포를 TH1 표현형으로 왜곡시킴으로써 항-종양 효능을 유도한다. 또한, 더 최근에, IFN-γ가 Treg의 기계론적 취약성을 지시하는 것으로 나타났다(20). 이러한 현상은 종양내 Treg이 전통적으로 T 이펙터 세포와 연관된 사이토카인을 생성하기 시작함에 따라 화합물 1로 처리시 관찰되었으며, 이는 화합물 1의 전체적인 효능에 기여할 수 있다.
화합물 1의 중요한 특징은 종양에서 전구약물의 선택적 처리이며, 이는 종양 미세환경에서 전신 전달, 양호한 노출 및 전구약물의 활성화를 허용하여 완전히 활성인 IL-2를 방출하게 한다. 실제로, 화합물 1은 마우스 및 비-인간 영장류(데이터는 나타내지 않음)에서 나타낸 바와 같이 순환 중, 뿐만 아니라 WTX-124가 건강한 일차 인간 세포 또는 혈장에 노출되었을 때 매우 안정하였다. 대조적으로, 화합물 1은 매우 다양한 상이한 암 유형으로부터 분리된 일차 인간 종양 샘플에 의해 신뢰할 수 있게 처리되었으며, 이는 전신적으로 투여된 화합물 1이 질환 부위에 IL-2를 선택적으로 전달하고 효과적인 면역 반응의 발달에 긍정적으로 기여할 수 있는 가능성을 입증한다. 화합물 1 처리의 임상적 이점 및 안전성은 다가오는 1상 임상시험에서 조사될 예정이며, FDA 승인을 받아 화합물 1을 단독으로 또는 항-PD-1 요법인 펨브롤리주맙과 조합하여 테스트한다.
요약하면, 본 연구는 종양-특이적 면역 세포 집단을 활성화시키기 위해 완전 효능 IL-2의 종양-선택적 전달을 제공하는, 조건부로 활성화된 IL-2 전구약물인 신규한 화합물 1의 설계 특징 및 기계론적 특성을 제시한다.
1.4 참고자료
1. Wei SC, Duffy CR, Allison JP. Fundamental mechanisms of immune checkpoint blockade therapy. Cancer Discov 2018;8:1069-86.
2. Ribas A, Wolchok JD. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science 2018;359:1350-5.
3. Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer 2012;12:252-64.
4. Waldmann TA. Cytokines in cancer immunotherapy. Cold Spring Harb Perspect Biol 2018;10.
5. Mitra S, Leonard WJ. Biology of IL-2 and its therapeutic modulation: Mechanisms and strategies. J Leukoc Biol 2018;103:643-55.
6. Malek TR. The biology of interleukin-2. Annu Rev Immunol 2008;26:453-79.
7. Sharma M, Khong H, Fa'ak F, Bentebibel SE, Janssen LME, Chesson BC 등, Bempegaldesleukin selectively depletes intratumoral Tregs and potentiates T cell-mediated cancer therapy. Nat Commun 2020;11:661.
8. Charych DH, Hoch U, Langowski JL, Lee SR, Addepalli MK, Kirk PB 등, NKTR-214, an engineered cytokine with biased IL2 receptor binding, increased tumor exposure, and marked efficacy in mouse tumor models. Clin Cancer Res 2016;22:680-90.
9. Klein C, Waldhauer I, Nicolini VG, Freimoser-Grundschober A, Nayak T, Vugts DJ 등, Cergutuzumab amunaleukin (CEA-IL2v), a CEA-targeted IL-2 variant-based immunocytokine for combination cancer immunotherapy: Overcoming limitations of aldesleukin and conventional IL-2-based immunocytokines. Oncoimmunology 2017;6:e1277306.
10. Lopes JE, Fisher JL, Flick HL, Wang C, Sun L, Ernstoff MS 등, ALKS 4230: a novel engineered IL-2 fusion protein with an improved cellular selectivity profile for cancer immunotherapy. J Immunother Cancer 2020;8:e000673.
11. Mitschke J, Burk UC, Reinheckel T. The role of proteases in epithelial-to-mesenchymal cell transitions in cancer. Cancer Metastasis Rev 2019;38:431-44.
12. Dudani JS, Warren AD, Bhatia SN. Harnessing protease activity to improve cancer care. Annu Rev Cancer Biol 2018;2:353-76.
13. Yost KE, Satpathy AT, Wells DK, Qi Y, Wang C, Kageyama R 등, Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med 2019;25:1251-9.
14. Konrad MW, Hemstreet G, Hersh EM, Mansell PW, Mertelsmann R, Kolitz JE 등, Pharmacokinetics of recombinant interleukin 2 in humans. Cancer Res 1990;50:2009-17.
15. Sands H, Loveless SE. Biodistribution and pharmacokinetics of recombinant, human 125I-interleukin-2 in mice. Int J Immunopharmacol 1989;11:411-6.
16. Atkins MB, Lotze MT, Dutcher JP, Fisher RI, Weiss G, Margolin K 등, High-dose recombinant interleukin 2 therapy for patients with metastatic melanoma: analysis of 270 patients treated between 1985 and 1993. J Clin Oncol 1999;17:2105.
17. Ye X, Waite JC, Dhanik A, Gupta N, Zhong M, Adler C 등, Endogenous retroviral proteins provide an immunodominant but not requisite antigen in a murine immunotherapy tumor model. Oncoimmunology 2020;9:1758602.
18. Wherry EJ, Blattman JN, Murali-Krishna K, Van Der Most R, Ahmed R. Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment. J Virol 2003;77:4911-27.
19. Imai N, Tawara I, Yamane M, Muraoka D, Shiku H, Ikeda H. CD4(+) T cells support polyfunctionality of cytotoxic CD8(+) T cells with memory potential in immunological control of tumor. Cancer Sci 2020;111:1958-68.
20. Overacre-Delgoffe AE, Chikina M, Dadey RE, Yano H, Brunazzi EA, Shayan G 등, Interferon-γ drives Treg fragility to promote anti-tumor immunity. Cell 2017;169:1130-41. e11.
21. Matloubian M, Lo CG, Cinamon G, Lesneski MJ, Xu Y, Brinkmann V 등, Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature 2004;427:355-60.
22. D'Souza WN, Lefrancois L. IL-2 is not required for the initiation of CD8 T cell cycling but sustains expansion. J Immunol 2003;171:5727-35.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (24)

  1. 유효량의 유도성 인터루킨-2(IL-2) 전구약물을 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 유도성 IL-2 전구약물은 전신적으로 투여되며, 이는 다른 위치에서보다 종양 미세환경에서 더 높은 활성을 갖는 프로테아제에 의한 절단에 의해 활성화되고, 순환과 비교하여 종양 미세환경에서 유도성 IL-2 전구약물의 적어도 약 40배 이상의 절단을 초래하는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 순환과 비교하여 종양 미세환경에서 유도성 IL-2 전구약물의 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 55배, 적어도 약 60배, 적어도 약 65배, 적어도 약 70배, 적어도 약 75배, 적어도 약 80배, 적어도 약 85배, 적어도 약 90배, 적어도 약 93배, 적어도 약 95배, 또는 적어도 약 100배 이상의 절단인 것인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 투여는 종양 내 유도성 IL-2 전구약물의 양보다 적어도 약 5배 초과인 혈장 내 유도성 IL-2 전구약물의 양을 초래하는 것인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 혈장 내 유도성 IL-2 전구약물의 양은 종양 내 유도성 IL-2 전구약물의 양보다 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 18배, 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 25배 초과인 것인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 종양 반응성 CD8+/Treg 비율의 유의미한 증가를 초래하는 것인, 방법.
  6. 유효량의 유도성 인터루킨-2(IL-2) 전구약물을 종양에 대한 면역학적 기억의 유도를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양에 대한 면역학적 기억을 유도하기 위한 방법으로서, 상기 유도성 IL-2 전구약물은 전신적으로 투여되며, 이는 다른 위치에서보다 종양 미세환경에서 더 높은 활성을 갖는 프로테아제에 의한 절단에 의해 활성화되는 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 순환과 비교하여 종양 미세환경에서 유도성 IL-2 전구약물의 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 55배, 적어도 약 60배, 적어도 약 65배, 적어도 약 70배, 적어도 약 75배, 적어도 약 80배, 적어도 약 85배, 적어도 약 90배, 적어도 약 93배, 적어도 약 95배, 또는 적어도 약 100배 이상의 절단인 것인, 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 투여는 종양 내 유도성 IL-2 전구약물의 양보다 적어도 약 5배 초과인 혈장 내 유도성 IL-2 전구약물의 양을 초래하는 것인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 혈장 내 유도성 IL-2 전구약물의 양은 종양 내 유도성 IL-2 전구약물의 양보다 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 18배, 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 25배 초과인 것인, 방법.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역학적 기억은 기억 표현형(예를 들어, CD8+CD44hiCD62low)을 갖는 종양 반응성 CD8+ 세포에 의해 특징지어지는 것인, 방법.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역학적 기억은 재자극시 TNF 및/또는 IFN감마를 생성하는 종양 반응성 CD8+ 세포에 의해 특징지어지는 것인, 방법.
  12. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역학적 기억은 재자극시 TNF 및/또는 IFN감마를 생성하는 다기능성 종양 반응성 CD8+ 세포에 의해 특징지어지는 것인, 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 반응성 CD8+ 세포는 재자극시 그랜자임 B를 추가로 생성하는 것인, 방법.
  14. 유효량의 유도성 인터루킨-2(IL-2) 전구약물을 종양 미세환경에서 이펙터 CD8+ T 세포의 선택적 활성화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양 미세환경에서 이펙터 CD8+ T 세포를 선택적으로 활성화시키기 위한 방법으로서, 상기 유도성 IL-2 전구약물은 전신적으로 투여되며, 이는 다른 위치에서보다 종양 미세환경에서 더 높은 활성을 갖는 프로테아제에 의한 절단에 의해 활성화되고, 말초 조직에 비해 종양 내에서 TNF 및/또는 IFN감마를 생성하는 CD8+ T 세포의 유의미하게 더 높은 빈도를 초래하는 것인, 방법.
  15. 유효량의 유도성 인터루킨-2(IL-2) 전구약물을 종양 침윤 림프구의 선택적 활성화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양 침윤 림프구를 선택적으로 활성화시키기 위한 방법으로서, 상기 유도성 IL-2 전구약물은 전신적으로 투여되며, 이는 다른 위치에서보다 종양 미세환경에서 더 높은 활성을 갖는 프로테아제에 의한 절단에 의해 활성화되고, 말초 조직에 비해 종양 내에서 TNF 및/또는 IFN감마를 생성하는 CD8+ T 세포의 유의미하게 더 높은 빈도를 초래하는 것인, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 투여는 순환과 비교하여 종양 미세환경에서 유도성 IL-2 전구약물의 적어도 약 40배 이상의 절단을 초래하는 것인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 순환과 비교하여 종양 미세환경에서 유도성 IL-2 전구약물의 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 55배, 적어도 약 60배, 적어도 약 65배, 적어도 약 70배, 적어도 약 75배, 적어도 약 80배, 적어도 약 85배, 적어도 약 90배, 적어도 약 93배, 적어도 약 95배, 또는 적어도 약 100배 이상의 절단인 것인, 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 종양 내 유도성 IL-2 전구약물의 양보다 적어도 약 5배 초과인 혈장 내 유도성 IL-2 전구약물의 양을 초래하는 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 혈장 내 유도성 IL-2 전구약물의 양은 종양 내 유도성 IL-2 전구약물의 양보다 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 18배, 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 25배 초과인 것인, 방법.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 종양 반응성 CD8+/Treg 비율의 유의미한 증가를 초래하는 것인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도성 IL-2 전구약물은 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 또는 전술한 것 중 임의의 아미노산 서열 변이체인 것인, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도성 IL-2 전구약물은 약 주 2회 이하 빈도로 투여되는 것인, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도성 IL-2 전구약물은 약 주 1회 이하 빈도로 투여되는 것인, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도성 IL-2 전구약물은 약 2주마다 1회 투여되는 것인, 방법.
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