KR20080006002A - 신규 Ｓｔｒａ6 폴리펩티드 - Google Patents

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다이앤 페니카
빅토리아 스미쓰
윌리암 아이. 우드
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 뮤린 레티노산 반응성 단백질 Stra6와의 서열 동일성을 나타내는 신규 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본원에서는 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 이종 폴리펩티드 서열과 연결되어 있는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드 분자, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체, 및 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법도 제공한다.
레티노산, Stra6, 종양

Description

신규 Ｓｔｒａ6 폴리펩티드 {Novel Stra6 Polypeptides}
도 1은 천연 서열 PR010282를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (뉴클레오티드 1-2732)을 포함하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)을 나타내는 것으로, 이 뉴클레오티드 서열 (서열 1)은 본원에서 "DNA148380-2827"로 지칭되는 클론이다. 각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치는 굵고 밑줄친 활자로 나타나 있다.
도 2는 서열 1의 코딩 서열로부터 유래된 것과 같은 천연 서열 PR010282 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 2)를 나타낸다. 다양한 다른 중요 폴리펩티드 도메인의 대략적인 위치도 나타나 있다.
도 3a-d는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 아미노산 서열 동일성% (도 3a-b)과 핵산 서열 동일성% (도 3c-d)를 측정하는 하기한 방법을 이용하기 위한 가설적인 예를 도시하며, 여기서, "PRO"는 관심있는 가상 PRO10282 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 관심있는 "PRO" 폴리펩티드를 비교할 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내며, "PRO-DNA"는 관심있는 가상 PRO10282-코딩 핵산 서열을 나타내며, "비교 DNA"는 관심있는 "PRO-DNA" 핵산 분자를 비교할 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, "X", "Y" 및 "Z"는 각각 상이한 가정의 아미노산 잔기를 나타내며, "N", "L" 및 "V"는 각각 상이한 가정의 뉴클레오티드를 나타낸다.
도 4a-q는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램에 대한 완전한 소스 코드를 제공한다. 이 소스 코드는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 제공하기 위해 UNIX 운영 시스템 상에서의 사용에 일상적으로 적용할 수 있다.
도 5는 본원에서 DNA100038 (서열 3)로 지칭되는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 6은 천연 서열 인간 Stra6 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (뉴클레오티드 1-2778)을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 4)을 나타내는 것으로, 상기 뉴클레오티드 서열 (서열 4)은 본원에서 "DNA148389-2827-1"로 지칭되는 클론이다. 각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치는 굵고 밑줄친 활자로 나타나 있다.
도 7은 서열 4의 코딩 서열로부터 유래된 것과 같은 천연 서열 인간 Stra6 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열 (서열 5)를 나타낸다. 다양한 다른 중요 폴리펩티드 도메인의 대략적인 위치도 나타나 있다.
도 8은 마우스 Stra6, 및 DNA148380-2827에 의해 코딩되는 인간 Stra6 단백질 (천연 인간 PR010282)을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 9는 DNA148380-2827 (천연 인간 PR010282)에 의해 코딩되는 인간 Stra6 단백질의 소수성 구획을 나타낸다.
도 10은 다양한 정상 인간 조직에서 DNA148380-2827에 의해 코딩되는 천연 서열 인간 Stra6 단백질에 대한 상대적인 RNA 발현 프로필을 나타낸다.
도 11은 정량 PCR에 의해 분석된 결장 종양 환자로부터 얻은 정상 점막에서 의 RNA 발현에 비하여, 상기 환자의 인간 결장 종양 조직에서 DNA148380-2827에 의해 코딩되는 천연 서열 인간 Stra6 단백질에 대한 RNA 발현의 증가를 보여준다. 상기 데이타는 한 가지 실험을 3회 반복하여 수행함으로써 얻은 것이다. 상기 실험은 다양한 PCR 프라이머 세트를 사용하여 2회 이상 반복하였다.
도 12a는 대조구로서 하우스킵핑 (housekeeping) 유전자 중 하나인 GAPDH를 사용하여, 결장 종양 환자로부터 얻은 정상 점막에서의 RNA의 발현에 비하여, 상기 환자의 인간 결장 종양 조직에서 DNA148380-2827에 의해 코딩되는 천연 서열 인간 Stra6 단백질에 대한 RNA 발현을 나타낸다.
도 12b는 원위치 혼성화에 의해 결장 선암종에서 Stra6가 상피 종양 세포에 위치함을 나타낸다.
도 13은 인간 유방, 신장, 결장 및 폐의 정상 세포에 비하여, 상응하는 종양 세포주에서 DNA148380-2827에 의해 코딩되는 천연 인간 Stra6 단백질에 대한 RNA 발현을 나타낸다.
도 14는 이. 콜라이 (E. coli)에서 DNA148380-2827에 의해 코딩되는 천연 서열 인간 Stra6 단백질로부터 유래된 펩티드 단편의 발현을 나타낸다.
도 15는 모든 트랜스-레티노산 (ATRA) 및 9-시스-레티노산 (9cRA)의 존재 및 부재 하에 인간 결장 결장암종 세포에서의 Stra6 RNA 발현을 나타낸다.
도 16은 종양 절편에서의 Stra6에 대한 원위치 혼성화이다. 은 입자를 나타내는 암시야상 (darkfield image) (A, C, E, G)은 헤마토실린에오신으로 염색된 상응하는 명시야상 (brightfield image)과 함께 나타낸다. 중간 밀도의 은 입자는 종양 세포 위에 놓여 있고 악성 흑색종의 혈관 위에는 놓여 있지 않는다 (A, B). 자궁내막 선암종에서의 종양성 상피는 중간 정도로 표지되는 반면, 종양 간질은 표지되지 않는다 (C, D). 윌름스 종양에서의 아체 (Blastema) 영역은 고발현도를 나타내지만 종양 간질은 음성 반응을 나타낸다 (E, F). 크롬친화성세포종은 매우 높은 Stra6 mRNA 발현을 나타내지만, 인접한 정상 부신피질은 음성 반응을 나타낸다 (G, H). 스케일 막대 = 100 마이크론.
도 17: (A) C57MG/모세포 및 C57MG/Wnt-1 세포에서 9종의 시스-RA 또는 모든 트랜스-RA에 반응한 Stra6 mRNA 발현의 유도; (B) Wnt-3A 컨디셔닝 배지 및 9종의 시스-RA에 반응한, C57MG/모세포에서의 Stra6 mRNA 발현의 유도; (C) HCT116 및 WiDr 결장 선암종 세포에서의 레티노산 처리 후 Stra6 mRNA 발현의 유도; (D) 레티노산으로의 처리 전 (상부 패널) 및 후 (하부 패널), HCT116 세포에서의 원위치 혼성하에 의해 Stra6 발현을 입증하는 암시야상; (E) 인간 Stra6 펩티드 B에 대해 유도된 모노클로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 가시화되었을 때, 레티노산으로의 처리 전 (-RA) 및 후 (+RA) WiDr 세포에서의 Stra6 단백질의 발현; (F) 레티노산으로 처리되지 않은 WiDr 세포 (좌측 패널) 또는 레티노산으로 처리된 WiDr 세포 (우측 패널)에서의 Stra6의 막 위치. 항-인간 Stra6 펩티드 B 모노클로날 하이브리도마 배양물 상등액 (클론 12F4.2H9.lD5)을 사용하여 면역조직화학법을 수행하였다. A-F에 나타낸 실험의 경우, 세포는 48시간 후 레티노산으로 처리하였다. 정량 PCR 반응 (각각 40 주기)의 완료 후 얻은 Stra6 생성물은 각각 그래프 A-C에 나타나 있다.
도 18: (A) Wnt-1이 RARγ-1의 발현을 유도한다. 0, 24, 48 또는 72 시간 후 테트라시클린의 부재 하에 테트라시클린 억제성 C57MG/Wnt-1 세포로부터 얻은 전체 세포 용해물의 단백질-등량을 SDS-PAGE로 분리하고 RARγ-1 및 ERK2에 대해 면역블롯팅하였다. (B) Wnt-1 형질전환 마우스로부터 얻은 과형성 유선 및 유선 종양에서의 RARγ-1 mRNA의 발현. mRNA의 발현은 정량 RT-PCR로 측정하고, 데이타는 야생형 유선에서의 mRNA의 발현에 비하여 증가된 발현으로서 나타낸다.
본 발명은 일반적으로 신규 DNA의 동정과 단리, 및 뮤린 Stra6 (레티노산 반응 단백질)과 유사한 서열을 갖는 신규 폴리펩티드의 재조합 생산에 관한 것이다. 이들 분자들 중 일부는 "PRO10282"로 이미 지칭되었지만, 지금부터 "Stra6" 폴리펩티드로도 부를 것이다.
막-결합 단백질
막-결합 단백질 및 수용체는 다른 것 중에서 다세포 유기체의 형성, 분화 및 유지에 중요한 역할을 할 수 있다. 많은 개별 세포의 운명, 예를 들어, 증식, 이동, 분화 또는 다른 세포와의 상호작용은 전형적으로 다른 세포 및(또는) 인접한 환경으로부터 받는 정보에 의해 지배된다. 이 정보는 종종 분비 폴리펩티드 (예를 들어, 유사분열촉진 인자, 생존 인자, 세포독성 인자, 분화 인자, 뉴로펩티드 및 호르몬)에 의해 전달되고, 이어서 다양한 세포 수용체 또는 막-결합 단백질이 상기 전달된 정보를 받아 해석한다. 이러한 막-결합 단백질 및 세포 수용체에는 사이토킨 수용체, 수용체 키나제, 수용체 포스파타제, 세포-세포 상호작용에 관여하는 수용체, 및 셀렉틴 및 인테그린과 같은 세포 부착분자가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 세포 생장 및 분화를 조절하는 신호의 전달은 다양한 세포 단백질의 인산화에 의해 부분적으로 조절된다. 이 과정을 촉매하는 효소인 프로테인 티로신 키나제는 생장 인자 수용체로도 작용할 수 있다. 이 예에는 섬유아세포 생장 인자 수용체 및 신경 생장 인자 수용체가 포함된다.
막-결합 단백질 및 수용체 분자는 약제 및 진단제로서의 용도를 비롯한 다양한 산업적 용도를 갖는다. 예를 들어, 수용체 이뮤노어드헤신은 수용체-리간드 상호작용을 차단하기 위한 치료제로 사용할 수 있다. 막-결합 단백질은 관련 수용체/리간드 상호작용을 억제할 수 있는 펩티드 또는 소분자 억제제의 스크리닝에 사용할 수도 있다.
산업계 및 학계는 신규 천연 수용체 또는 막-결합 단백질을 동정하고자 노력하고 있다. 신규 수용체 또는 막-결합 단백질의 코딩 서열을 동정하기 위해 포유동물 재조합 DNA 라이브러리를 스크리닝하는 데 많은 노력이 집중되고 있다.
본 발명의 Stra6 폴리펩티드는 레티노산에 의해 발현이 유도되는 뮤린 단백질 Stra6와의 서열 상동성을 나타낸다 (73% 동일 및 81% 유사) (Bouillet et al., Dev. Biol. 170 : 420-433 [1995]; Bouillet et al., Mech. Dev. 63 : 173-186 [1997]; Chazaud et al., Dev. Genet. 19 : 66-73 [1996]). 레티노산은 척추동물의 발생 과정 동안 중요한 신호전달 분자이기 때문에, 레티노산에 반응하여 유도되 는 유전자는 배아 발생 동안의 생장 및 분화에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 뮤린 Stra6 cDNA는 레티노산 유도성 유전자를 동정하고 단리하기 위해 고안된 서브트랙티브 혼성화 방법 (subtractive hybridization approach)을 이용하여 P19 뮤린 배아 암종 세포로부터 단리하였는데, 상기 cDNA는 이전에 특징규명된 단백질들과는 유사성을 나타내지 않는다. 상기 뮤린 Stra6는 막-삽입 단백질의 특징인 다수의 막횡단 도메인에 상응하는 아미노산 잔기로 구성된 고소수성 스트레치를 함유한다. Stra6의 발현 패턴을 기초로 할 때, Stra6는 배아 발생 동안 초기 배복방향 사지 패터닝 및 후기 연골내 골화의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다 (Chazaud et al., Dev. Genet. 19 : 66-73 [19961).
본원에 개시된 Stra6 폴리펩티드는 Stra6 폴리펩티드가 막 삽입 단백질이라는 것을 나타내는 막횡단 도메인으로 구성되어 있는 다수의 고소수성 영역을 함유한다. 이들은 미지의 리간드에 대한 수용체로 작용할 수 있고, 세포 생장, 발생 또는 분화에 영향을 주는 신호 전달 경로의 일부일 수 있다.
종양 세포에서의 유전자 증폭
악성 종양 (암)은 미국에서 심장 질환 다음에 사망의 두 번째 원인이다 (Boring et al., CA Cancel J. Clin., 43 : 7 [1993]).
암은 증식하여 종양 덩어리를 형성하는, 정상 조직으로부터 유래된 비정상 또는 종양성 세포의 수 증가, 이들 종양성 종양 세포에 의한 인접 조직의 침윤, 및 혈액 또는 림프계를 통해 국부 림프절 및 원거리 부위로 퍼지는 악성 세포의 생성 (전이)을 특징으로 한다. 암 상태에서, 세포는 정상 세포가 증식하지 않는 조건 하에서 증식한다. 암은 본질적으로, 상이한 정도의 침윤력 및 침해력을 특징으로 하는 매우 다양한 형태로 나타난다.
유전자 발현의 변화는 모든 암의 공통된 특징인 조절되지 않는 세포 생장 및 탈-분화와 밀접하게 관련되어 있다. 잘 연구되어 있는 특정 종양의 게놈은 일반적으로 악성 세포 생장을 억제하고(하거나), 악성 세포 생장을 촉진하는 작용을 하는 온코진과 같은 특정 우성 유전자의 과발현을 억제하는 기능을 하는 종양 억제 유전자로 불리는 열성 유전자의 감소된 발현을 나타내는 것으로 밝혀져 있다. 이러한 각각의 유전적 변화는 전체적으로 완전한 종양성 표현형을 나타내는 몇몇 형질을 들여오는 기능을 하는 것으로 보인다 (Hunter, Cell, 64 : 1129 [19911 and Bishop, Cell, 64 : 235-248 [19911).
암세포에서 유전자 (예를 들어, 온코진) 과발현의 잘 공지된 메카니즘은 유전자 증폭이다. 이는 많은 카피의 특정한 유전자를 조상 세포의 염색체 내로 도입하는 과정이다. 이 과정은 상기 유전자를 포함하는 염색체 영역의 비계획적 복제 후, 복제된 단편이 상기 염색체 내로 다시 재조합되는 것을 포함한다 (Alitalo et al., Adv. Cancer Res., 47 : 235-281 [1986]). 상기 특정 유전자의 과발현은 유전자 증폭과 유사한, 즉 만들어진 카피의 수에 비례하는 것으로 생각된다.
생장 인자 및 생장 인자 수용체를 코딩하는 프로토-온코진은 유방암을 비롯한 다양한 인간 악성종양의 발병기전에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되어 있다. 예를 들어, 상피 생장 인자 수용체 (EGFR)와 관련되어 있는 185-kd의 막횡단 당단 백질 수용체 (pl85HER2; HER2)를 코딩하는 인간 ErbB2 유전자 (erbB2, her2 또는 c-erbB-2로도 알려짐)는 인간 유방암의 약 25% 내지 30%에서 과발현되는 것으로 밝혀진 바 있다 (Slamon et al., Science, 235 : 177-182 [1987]; Slamon et al., Science, 244 : 707-712 [1989]).
프로토-온코진의 유전자 증폭은 악성이 보다 강한 형태의 암에 전형적으로 관여하는 이벤트이고, 임상 결과의 예측자로 작용할 수 있다 (Schwab et al., Genes Chromosomes Cancer, 1 : 181-193 [1990]; Alitalo et al., supra). 따라서, erbB2 과발현은 특히 액와 림프절을 수반하는 일차 질환을 앓는 환자에서 약한 예후의 예측자로서 통상 간주되고, CMF (시클로포스프아미드, 메토트렉세이트 및 플루오르우라실) 및 안트라시클린을 비롯한 호르몬 요법 및 화학요법에 대한 민감성 및(또는) 내성과 관련되어 있다 (Baselga et al., Oncolo, 11 (3 Suppl 1) : 43-48 [1997]). 그러나, 예후가 약한 erbB2 과발현의 관련에도 불구하고, 탁산으로의 치료에 임상적으로 반응하는 HER2 양성 환자의 비율은 HER2 음성 환자의 비율보다 3 배 더 높았다. 재조합 인간화 항-ErbB2 (항-HER2) 모노클로날 항체 (뮤린 항-ErbB2 항체 4D5의 인간화 버젼, rhuMAb HER2 또는 Herceptin (상표명)으로 불림)는 이전에 광범위한 항암요법을 받은, ErbB2-과발현 전이성 유방암을 앓는 환자에서 임상적으로 활성 상태이다 (Baselga et al., J. Clin. Oncol., 14 : 737-744 [19961).
상기한 것에 비추어, 유전자 증폭과 관련된 종양을 진단하고 치료하는 데 유용한 신규 분자, 방법 및 조성물을 확인하는 데 관심이 있는 것은 명백하다.
<발명의 요약>
뮤린 레티노산 반응 단백질 Stra6를 코딩하는 핵산과 상동성을 나타내고 본원에서 전장 천연 서열 인간 "PR010282"로 지칭되는 667개 아미노산의 신규 폴리펩티드를 코딩하는 인간 cDNA 클론 (본원에서 DNA148380-2827로 지칭됨)을 동정하였다. 뮤린 Stra6 및 천연 서열 PR010282 둘다와 상당한 서열 상동성을 나타내는, 658개 아미노산의 신규 폴리펩티드 (PR19578)를 코딩하는 다른 인간 cDNA 클론 (본원에서 DNA148389-2827-1로 지칭됨)을 확인하였는데, 이것은 천연 서열 인간 PR010282의 얼터네이티브 스플라이싱 변이체인 것으로 생각된다. 이후에 논의한 바와 같이, 뮤린 Stra6와 본 발명의 PR010282 폴리펩티드의 상동성에 비추여, 본 발명의 PR010282 폴리펩티드 (천연 서열 및 변이체 분자를 포함함)는 "Stra6" 폴리펩티드로도 불릴 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PR010282 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
한 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 도 2 (서열 2)의 아미노산 잔기 약 1 내지 약 667로 구성된 서열을 갖는 PR010282 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, (b) 도 7 (서열 5)의 아미노산 잔기 약 1 내지 약 658로 구성된 서열을 갖는 PRO19578 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b) DNA 분자의 상보체와의 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81% 이상, 보다 바람 직하게는 약 82% 이상, 보다 바람직하게는 약 83% 이상, 보다 바람직하게는 약 84% 이상, 보다 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 86% 이상, 보다 바람직하게는 약 87% 이상, 보다 바람직하게는 약 88% 이상, 보다 바람직하게는 약 89% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 91% 이상, 보다 바람직하게는 약 92% 이상, 보다 바람직하게는 약 93% 이상, 보다 바람직하게는 약 94% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 96% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상, 보다 바람직하게는 약 98% 이상, 보다 바람직하게는 약 99% 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또다른 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 도 2 (서열 2)의 아미노산 잔기 약 1 내지 약 667의 서열을 갖는 PR010282 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, (b) 도 7 (서열 5)의 아미노산 잔기 약 1 내지 약 658의 서열을 갖는 PRO19578 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b) 뉴클레오티드 서열의 상보체를 포함한다.
다른 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 도 1 (서열 1)의 뉴클레오티드 약 49 내지 약 2049로 구성된 서열을 갖는 DNA 분자, 도 6 (서열 4)의 뉴클레오티드 약 186 내지 약 2159로 구성된 서열을 갖는 DNA 분자, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b) DNA 분자의 상보체와의 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81% 이상, 보다 바람직하게는 약 82% 이상, 보다 바람직하게는 약 83% 이상, 보다 바람직하게는 약 84% 이상, 보다 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 86% 이상, 보다 바람직하게는 약 87% 이상, 보다 바람직하게는 약 88% 이상, 보다 바람 직하게는 약 89% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 91% 이상, 보다 바람직하게는 약 92% 이상, 보다 바람직하게는 약 93% 이상, 보다 바람직하게는 약 94% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 96% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상, 보다 바람직하게는 약 98% 이상, 보다 바람직하게는 약 99% 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또다른 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 도 1 (서열 1)의 약 49 내지 약 2049 뉴클레오티드로 구성된 뉴클레오티드 서열, (b) 도 6 (서열 4)의 약 186 내지 약 2159 뉴클레오티드로 구성된 뉴클레오티드 서열, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b) 뉴클레오티드 서열의 상보체를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 (a) 2000년 1월 11일 ATCC에 기탁된 인간 단백질 cDNA (DNA148380-2827; ATCC 기탁번호 PTA-1181)에 의해 코딩되는 것과 동일한 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, b) 2000년 2월 23일 ATCC에 기탁된 인간 단백질 cDNA (DNA148389-2827-1; ATCC 기탁번호 PTA-1405)에 의해 코딩되는 것과 동일한 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b) DNA 분자의 상보체와의 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81% 이상, 보다 바람직하게는 약 82% 이상, 보다 바람직하게는 약 83% 이상, 보다 바람직하게는 약 84% 이상, 보다 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 86% 이상, 보다 바람직하게는 약 87% 이상, 보다 바람직하게는 약 88% 이상, 보다 바람직하게는 약 89% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 91% 이상, 보다 바람직하게는 약 92% 이상, 보다 바람직하게는 약 93% 이상, 보다 바람직하게는 약 94% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 96% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상, 보다 바람직하게는 약 98% 이상, 보다 바람직하게는 약 99% 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 2000년 1월 11일 ATCC에 기탁된 인간 단백질 cDNA (DNA148380-2827; ATCC 기탁번호 PTA-1181)에 의해 코딩되는 것과 동일한 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, b) 2000년 2월 23일 ATCC에 기탁된 인간 단백질 cDNA (DNA148389-2827-1; ATCC 기탁번호 PTA-1405)에 의해 코딩되는 것과 동일한 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b) 뉴클레오티드 서열의 상보체를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 2000년 1월 11일 ATCC에 기탁된 인간 단백질 cDNA (DNA148380-2827; ATCC 기탁번호 PTA-1181)의 전장 폴리펩티드 코딩 서열, (b) 2000년 2월 23일 ATCC에 기탁된 인간 단백질 cDNA (DNA148389-2827-1; ATCC 기탁번호 PTA-1405)의 전장 폴리펩티드 코딩 서열, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b) 뉴클레오티드 서열의 상보체와의 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81% 이상, 보다 바람직하게는 약 82% 이상, 보다 바람직하게는 약 83% 이상, 보다 바람직하게는 약 84% 이상, 보다 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 86% 이상, 보다 바람직하게는 약 87% 이상, 보다 바람직하게는 약 88% 이상, 보다 바람직하게는 약 89% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 91% 이상, 보다 바람직하게는 약 92% 이상, 보다 바람직하게는 약 93% 이상, 보다 바람직하게는 약 94% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 96% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상, 보다 바람직하게는 약 98% 이상, 보다 바람직하게는 약 99% 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 단리된 핵산 분자는 2000년 1월 11일 ATCC에 기탁된 인간 단백질 cDNA (DNA148380-2827; ATCC 기탁번호 PTA-1181)의 전장 폴리펩티드 코딩 서열, (b) 2000년 2월 23일 ATCC에 기탁된 인간 단백질 cDNA (DNA148389-2827-1; ATCC 기탁번호 PTA-1405)의 전장 폴리펩티드 코딩 서열, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b) 뉴클레오티드 서열의 상보체를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 도 2 (서열 2)의 아미노산 1 내지 약 667을 코딩하는 핵산 서열의 상보체, 또는 도 7 (서열 5)의 아미노산 1 내지 약 658을 코딩하는 핵산 서열의 상보체와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 아래에 정의된 활성 PR010282 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것으로, 이 단리된 핵산 분자는 뮤린 Stra6를 코딩하는 DNA가 아니다. 바람직하게는, 혼성화는 고엄격 (엄격한) 조건 및 세척 조건 하에 일어난다.
또다른 측면에서, 본 발명은 도 1 (서열 1)의 뉴클레오티드 약 49 내지 약 2049의 핵산 서열의 상보체, 또는 도 6 (서열 4)의 뉴클레오티드 약 186 내지 약 2159의 핵산 서열의 상보체와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 아래에 정의된 활성 PR010282 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것으로, 이 단리된 핵산 분자는 뮤린 Stra6를 코딩하는 DNA가 아니다. 바람직하게는, 혼성화는 고엄격 (엄격한) 조건 및 세척 조건 하에 일어난다.
추가 측면에서, 본 발명은 (a) 도 2 (서열 2)의 아미노산 잔기 약 1 내지 약 667의 서열을 갖는 PR010282 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, (b) 도 7 (서열 5)의 아미노산 잔기 약 1 내지 약 658의 서열을 갖는 PRO19578 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b) DNA 분자의 상보체와 시험 DNA 분자의 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81% 이상, 보다 바람직하게는 약 82% 이상, 보다 바람직하게는 약 83% 이상, 보다 바람직하게는 약 84% 이상, 보다 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 86% 이상, 보다 바람직하게는 약 87% 이상, 보다 바람직하게는 약 88% 이상, 보다 바람직하게는 약 89% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 91% 이상, 보다 바람직하게는 약 92% 이상, 보다 바람직하게는 약 93% 이상, 보다 바람직하게는 약 94% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 96% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상, 보다 바람직하게는 약 98% 이상, 보다 바람직하게는 약 99% 이상인 경우, 상기 시험 DNA 분자를 엄격한 조건 하에 상기 (a), (b) 또는 (c)와 혼성화시키고 시험 DNA 분자를 단리함으로써 수득된, 약 765개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 도 2 (서열 2)의 잔기 약 1 내지 약 667의 아미노산 서열, (b) 도 7 (서열 5)의 잔기 약 1 내지 약 658의 아미노산 서열, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b) 아미노산 서열의 상보체와 비교할 때 약 80% 이상의 양성, 바람직하게는 약 81% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 양성, 보 다 바람직하게는 약 85% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 양성을 기록하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 막횡단 도메인이 결실되어 있거나 불활성화되어 있는 PR010282 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이러한 코딩 뉴클레오티드 서열에 상보적인 단리된 핵산 분자를 제공하는데, 여기서, 상기 막횡단 도메인은 도 2 (서열 2)의 아미노산 위치 약 54부터 69까지, 약 102부터 약 119까지, 약 148부터 약 166까지, 약 207부터 약 222까지, 약 301부터 약 320까지, 약 364부터 약 380까지, 약 431부터 약 451까지, 약 474부터 약 489까지, 약 512부터 약 531까지, 그리고 도 7 (서열 5)의 아미노산 위치 약 54부터 71까지, 약 93부터 약 11까지, 약 140부터 약 157까지, 약 197부터 약 214까지, 약 291부터 약 312까지, 약 356부터 약 371까지, 약 425부터 약 481까지, 약 505부터 약 522까지 걸쳐있는 것으로 잠정적으로 확인되어 있다. 그러므로, 본원에 기재된 PR010282 폴리펩티드의 가용성 세포외 도메인도 고려된다.
이러한 면에서, 본 발명의 또다른 측면은 (a) 도 2 (서열 2)의 아미노산 1 내지 X를 코딩하는 DNA 분자 (여기서, 상기 X는 도 2 (서열 2)의 49 내지 59의 임의의 아미노산임), 또는 (b) 상기 (a) DNA 분자의 상보체와의 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81% 이상, 보다 바람직하게는 약 82% 이상, 보다 바람직하게는 약 83% 이상, 보다 바람직하게는 약 84% 이상, 보다 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 86% 이상, 보다 바람직하게는 약 87% 이상, 보다 바람직하게는 약 88% 이상, 보다 바람직하게는 약 89% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 91% 이상, 보다 바람직하게는 약 92% 이상, 보다 바람직하게는 약 93% 이상, 보다 바람직하게는 약 94% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 96% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상, 보다 바람직하게는 약 98% 이상, 보다 바람직하게는 약 99% 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 특정한 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 아미노산 1 내지 X를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (여기서, 상기 X는 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 49 내지 59의 임의의 아미노산임), 또는 (b) 상기 (a) 뉴클레오티드 서열의 상보체를 포함한다. 특정한 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 아미노산 1 내지 X를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (여기서, 상기 X는 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 49 내지 59의 임의의 아미노산임), 또는 (b) 상기 (a) 뉴클레오티드 서열의 상보체를 포함한다.
본 발명의 또다른 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 도 2 (서열 2) 또 는 도 7(서열 5)의 잔기 약 1 내지 X의 아미노산 서열 (여기서, 상기 X는 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 49 내지 59의 임의의 아미노산임), 또는 (b) 상기 (a) 아미노산 서열의 상보체와 비교할 때 약 80% 이상의 양성, 바람직하게는 약 81% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 양성을 기록하는 폴리펩티드를 코딩한다.
또다른 실시양태는 예를 들어, 혼성화 프로브로 사용할 수 있거나, 임의로 항-PRO10282 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 PRO10282 폴리펩티드의 단편을 코딩하는 데 사용할 수 있는, PRO10282 폴리펩티드 코딩 서열의 단편에 관한 것이다. 이러한 핵산 단편의 길이는 통상적으로 약 20 뉴클레오티드 이상, 바람직하게는 약 30 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 40 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 50 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 60 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 70 뉴클레오티드 이상, 보 다 바람직하게는 약 80 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 90 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 100 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 110 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 120 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 130 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 140 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 150 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 160 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 170 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 180 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 190 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 200 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 250 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 300 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 350 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 400 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 450 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 500 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 600 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 700 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 800 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 900 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 약 1000 뉴클레오티드 이상이고, 이 내용에서 용어 "약'은 언급된 뉴클레오티드 서열 길이의 플러스 또는 마이너스 10%의 길이를 말한다. 본 발명의 핵산 단편은 마우스 Stra6의 천연 코딩 서열의 단편과는 다르다. 바람직한 실시양태에서 뉴클레오티드 서열 단편은 도 1 (서열 1)에 나타낸 뉴클레오티드 서열 또는 도 6 (서열 4)에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 임의의 코딩 영역으로부터 유래된다. 다수의 잘 공지된 서열 정렬 프로그램을 이용하여 PR010282 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열을 다른 공지된 뉴클레오티드 서열과 정렬시키고, 어떤 PR010282 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열 단편(들)이 신규한지를 결정함으로써 PR010282 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열의 신규 단편을 통상적인 방식으로 확인할 수 있다는 것을 알고 있다. 이러한 모든 PR010282 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열은 본원에 포함되고 과도한 실험 없이 결정할 수 있다. 또한, 이들 뉴클레오티드 분자 단편에 의해 코딩되는 PR010282 폴리펩티드 단편, 바람직하게는 항-PR010282 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 PR010282 폴리펩티드 단편도 본원에 포함된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PR010282 또는 그의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 이 벡터는 위에서 확인된 임의의 단리된 핵산 분자를 포함할 수 있다.
이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공한다. 예컨대, 숙주 세포는 CHO 세포, 이. 콜라이 (E. coli) 또는 효모일 수 있다. 숙주 세포를 PR010282의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하고 세포 배양물로부터 PR010282를 회수하는 것을 포함하는, PR010282 폴리펩티드의 생산 방법도 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 위에서 확인된 임의의 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 단리된 PR010282 폴리펩티드를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 일부 실시양태에서 도 2 (서열 2)의 잔기 약 1 내지 약 667, 또는 도 7 (서열 5)의 잔기 약 1 내지 약 658을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 천연 서열 PR010282 폴리펩티드를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 도 2 (서열 2)의 아미노산 잔기 약 1 내지 약 667의 서열, 또는 도 7 (서열 5)의 아미노산 잔기 약 1 내지 약 658의 서열과의 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81% 이상, 보다 바람직하게는 약 82% 이상, 보다 바람직하게는 약 83% 이상, 보다 바람직하게는 약 84% 이상, 보다 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 86% 이상, 보다 바람직하게는 약 87% 이상, 보다 바람직하게는 약 88% 이상, 보다 바람직하게는 약 89% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 91% 이상, 보다 바람직하게는 약 92% 이상, 보다 바람직하게는 약 93% 이상, 보다 바람직하게는 약 94% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 96% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상, 보다 바람직하게는 약 98% 이상, 보다 바람직하게는 약 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PR010282 폴리펩티드에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 2000년 1월 11일 ATCC에 기탁된 인간 단백질 cDNA (DNA148380-2827; ATCC 기탁번호 PTA-1181)에 의해 코딩되는 아미노산 서열, 또는 2000년 2월 23일 ATCC에 기탁된 인간 단백질 cDNA (DNA148389-2827-1; ATCC 기탁번호 PTA-1405)에 의해 코딩되는 아미노산 서열과의 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81% 이상, 보다 바람직하게는 약 82% 이상, 보다 바람직하게는 약 83% 이상, 보다 바람직하게는 약 84% 이상, 보다 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 86% 이상, 보다 바람직하게는 약 87% 이상, 보다 바람직하게는 약 88% 이상, 보다 바람직하게는 약 89% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 91% 이상, 보다 바람직하게는 약 92% 이상, 보다 바람직하게는 약 93% 이상, 보다 바람직하게는 약 94% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 96% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상, 보다 바람직하게는 약 98% 이상, 보다 바람직하게는 약 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PR010282 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 단리된 PR010282 폴리펩티드는 2000년 1월 11일 ATCC에 기탁된 인간 단백질 cDNA (DNA148380-2827; ATCC 기탁번호 PTA-1181) 또는 2000년 2월 23일 ATCC에 기탁된 인간 단백질 cDNA (DNA148389-2827-1; ATCC 기탁번호 PTA-1405)에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 도 2 (서열 2)의 잔기 약 1 내지 약 667로 구성된 아미노산 서열, 또는 도 7 (서열 5)의 잔기 약 1 내지 약 659로 구성된 아미노산 서열과 비교할 때 약 80% 이상의 양성, 바람직하게는 약 81% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 양성을 기록하는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO10282 폴리펩티드에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 막횡단 도메인이 결실되어 있거나 불활성화되어 있는 단리된 PRO10282 폴리펩티드를 제공한다. 적당한 코딩 핵산 분자를 함유하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 PR010282 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하고, 세포 배양물로부터 PR010282 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, PR010282 폴리펩티드의 제조 방법도 본원에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 아미노산 1 내지 X (여기서, X는 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 49 내지 59의 임의의 아미노산임)와의 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81% 이상, 보다 바람직하게는 약 82% 이상, 보다 바람직하게는 약 83% 이상, 보다 바람직하게는 약 84% 이상, 보다 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 86% 이상, 보다 바람직하게는 약 87% 이상, 보다 바람직하게는 약 88% 이상, 보다 바람직하게는 약 89% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 91% 이상, 보다 바람직하게는 약 92% 이상, 보다 바람직하게는 약 93% 이상, 보다 바람직하게는 약 94% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 96% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상, 보다 바람직하게는 약 98% 이상, 보다 바람직하게는 약 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 가용성 PR010282 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직한 측면에서, 상기 단리된 가용성 PR010282 폴리펩티드는 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 아미노산 1 내지 X (여기서, X는 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 49 내지 59의 임의의 아미노산임)를 포함한다.
본 발명의 또다른 측면에서, 상기 단리된 가용성 PR010282 폴리펩티드는 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 잔기 약 1 내지 X (여기서, X는 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 49 내지 59의 임의의 아미노산임)로 구성된 아미노산 서열과 비교할 때 약 80% 이상의 양성, 바람직하게는 약 81% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 양성을 기록하는 아미노산 서열을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 도 2 (서열 2)의 아미노산 잔기 약 1 내지 약 667로 구성된 서열, 또는 도 7 (서열 5)의 아미노산 잔기 약 1 내지 약 658로 구성된 서열을 포함하는 단리된 PR010282 폴리펩티드, 또는 생물학적으로 활성 상태이거나 항-PR010282 항체에 대한 결합 부위를 제공하기에 충분한, 상기 PR010282 폴리펩티드 단편에 관한 것으로, 여기서, 생물학적으로 활성을 나타내거나 항-PR010282 항체에 대한 결합 부위를 제공하는 PR010282 폴리펩티드 단편은 당분야에 잘 공지된 기술을 이용하여 통상적인 방식으로 확인할 수 있다. 본원의 단편은 마 우스 Stra6 폴리펩티드의 단편이 아니다. 바람직하게는, PR010282 단편은 천연 PR010282 폴리펩티드의 정성적인 생물학적 활성을 보유한다.
추가 측면에서, 본 발명은 시험 DNA 분자가 (a) 도 2 (서열 2)의 아미노산 잔기 약 1 내지 약 667의 서열을 갖는 PR010282 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, (b) 도 7 (서열 5)의 아미노산 잔기 약 1 내지 약 658의 서열을 갖는 PR019578 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b) DNA 분자의 상보체와의 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81% 이상, 보다 바람직하게는 약 82% 이상, 보다 바람직하게는 약 83% 이상, 보다 바람직하게는 약 84% 이상, 보다 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 86% 이상, 보다 바람직하게는 약 87% 이상, 보다 바람직하게는 약 88% 이상, 보다 바람직하게는 약 89% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 91% 이상, 보다 바람직하게는 약 92% 이상, 보다 바람직하게는 약 93% 이상, 보다 바람직하게는 약 94% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 96% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상, 보다 바람직하게는 약 98% 이상, 보다 바람직하게는 약 99% 이상인 경우, i) 시험 DNA 분자를 엄격한 조건 하에서 상기 (a), (b) 또는 (b)와 혼성화시키고, ii) 시험 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 PR010282 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하고, iii) 세포 배양물로부터 PR010282 폴리펩티드를 회수함으로써 수득한 폴리펩티드를 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열과 연결된 PR010282 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 제공하는데, 여기서, PR010282 폴리펩티드는 상기 임의의 PR010282 폴리펩티드, 그의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 이러한 키메라 분자의 예로는 에피토프 태그 서열 또는 이뮤노글로불린의 FC 영역에 연결된 PR010282 폴리펩티드가 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 위에 기재된 바와 같이 PR010282 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 하기 정의된 항체를 제공한다. 임의로, 상기 항체는 모노클로날 항체, 항체 단편 또는 단일쇄 항체이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 아래 정의된 천연 PR010282 폴리펩티드의 아고니스트 및 길항제에 관한 것이다. 구체적인 실시양태에서, 아고니스트 또는 길항제는 항-PR010282 항체 또는 소분자이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 PR010282 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시키고 상기 PR010282 폴리펩티드에 의해 매개되는 생물학적 활성을 관찰하는 것을 포함하는, PR010282 폴리펩티드에 대한 아고니스트 또는 길항제의 확인 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, PR010282 폴리펩티드는 천연 PR010282 폴리펩티드이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 담체와 함께 PR010282 폴리펩티드, 본원에 기재된 PR010282 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PR010282 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 임의로, 상기 담체는 제약학적으로 허용가능한 담체이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 PR010282 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PR010282 항체에 반응하는 증상의 치료에 유용한 약제의 제조를 위한, PR010282 폴리펩티드, 본원에 기재된 그의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PR010282 항체의 용도에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 PR010282 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 항체는 PR010282 폴리펩티드를 발현하는 세포의 사멸을 유도한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 세포는 동일한 조직 유형의 정상 세포와 비교할 때 PR010282 폴리펩티드를 과발현하는 암세포이다. 바람직하게는, 상기 항체는 인간화 또는 인간 항체이고 항체 단편 및 단일쇄 항체를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 PR010282 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 PR010282 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 이 핵산을 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항-PR010282 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 PR010282 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 항-PR010282 항체 (또는 PR010282의 또다른 길항제)에 노출시키고 상기 샘플 중에서 상기 항체 (또는 길항제)와 PR010282 폴리펩티드의 결합을 측정함으로써 상기 샘플에서의 PR010282 폴리펩티드의 존재를 확인하는 방법에 관한 것이다. 특히 중요한 실시양태에서, 상기 샘플은 암세포로부터 유래된 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 포유동물로부터 얻은 조직의 시험 샘플 및 (b) 이것과 동일한 세포 유형의 공지된 정상 조직 세포로 구성된 대조구 샘플에서 PR010282 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현도를 검출하는 것을 포함하는, 포유동물의 종양을 진단하는 방법에 관한 것이다. 대조구 샘플과 비교할 때 상기 시험 샘플에서의 보다 높은 발현도는 시험 조직 세포가 유래된 포유동물 내에 종양이 존재함을 의미한다.
본 발명의 또다른 방법에 따르면, (a) 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플과 항-PR010282 항체를 접촉시키고, (b) 상기 시험 샘플에서 상기 항체와 PR010282 폴리펩티드의 결합체 형성을 검출함으로써 포유동물에서 종양을 진단한다. 결합체의 형성은 포유동물에 종양이 존재한다는 것을 나타낸다.
또다른 측면에서, 본 발명은 항-PR010282 항체 (또는 PR010282의 다른 길항제) 및 담체를 적당한 포장 내에 포함하는 암 진단 키트에 관한 것이다. 임의로, 상기 키트는 샘플에서 PR010282 폴리펩티드의 존재를 검출하는 데 있어서 상기 항체 또는 다른 길항제를 사용하기 위한 설명서도 함유한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 PR010282 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포를, PR010282 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 유효량의 물질에 노출시켜 종양 세포의 생장을 억제함으로써 종양 세포의 생장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 물질은 예를 들어, 항-PR010282 항체 또는 PR010282의 또다른 길항제일 수 있다. 종양 세포는 방사선 치료, 세포독성제 및(또는) 화학요법제로의 치료 등과 같은 통상적인 종양 치료에 추가로 노출시킬 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 PR010282 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포를, 상 기 폴리펩티드의 발현을 억제하는 유효량의 물질에 노출시켜 종양 생장을 억제함으로써 종양 세포의 생장을 억제하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 PR010282 폴리펩티드의 과발현을 특징으로 하는 종양의 발생, 생장 또는 퍼짐을 막거나 늦추는 유사한 방법에 관한 것이다. 이러한 치료는 종양 세포의 증상을 직접 완화시키거나, 종양 세포가 다른 치료제를 사용한 치료, 예를 들어, 방사선 요법 및(또는) 화학요법에 보다 민감해지도록 할 수 있다. 본 발명은 특히, 비정상적 또는 다른 방법으로의 전이, 인접 세포의 정상 기능의 방해, 비정상적 수준의 사이토킨 또는 다른 분비물의 방출, 염증 또는 면역 반응의 억제 또는 악화 등을 조절하는 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 용기, 용기 상의 표지, 및 활성제를 포함하는 조성물을 포함하는 제품에 관한 것으로, 상기 조성물은 종양 생장의 억제에 효과적이고, 상기 용기 상의 표지에는 상기 조성물이 종양 세포에서의 PR010282 폴리펩티드의 과발현을 특징으로 하는 증상의 치료에 효과적이라는 것이 기재되어 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 후보 화합물과 PR010282 폴리펩티드를 이 두 성분이 상호작용하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 상기 접촉시키고 PR010282 폴리펩티드의 생물 활성 또는 면역 활성이 억제되는지를 확인함으로써, PR010282 폴리펩티드의 생물 활성 또는 면역 활성을 억제하는 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이다.
또다른 측면에서, (a) PR010282 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응의 유도에 적합한 조건 하에 PR010282 폴리펩티드의 존재 하에서 세포를 스 크리닝할 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 시험 화합물이 효과적인 길항제인지를 확인하기 위해 상기 세포 반응의 유도를 확인하는 단계를 포함하는, PR010282 폴리펩티드의 활성을 억제하는 화합물의 확인 방법에 관한 것이다. 세포 반응의 유도가 일어나지 않는다는 것은 시험 화합물이 효과적인 길항제임을 의미한다.
또한, 본 발명은 PR010282 폴리펩티드를 발현하는 세포를 후보 화합물과 접촉시키고 PR010282 폴리펩티드의 발현이 억제되는지를 확인함으로써, 상기 세포에서 상기 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 특히, 본원의 스크리닝 방법에 의해 확인된 PR010282 아고니스트 및 PR010282 길항제에 관한 것이다. 이러한 아고니스트 및 길항제에는 항-PR010282 항체, 폴리펩티드, 펩티드 및 아고니스트 또는 길항제의 성질을 갖는 유기 소분자가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "PR010282 폴리펩티드", "PR010282 단백질", "PR010282", "Stra6 폴리펩티드", "Stra6 단백질" 및 "Stra6"는 상호교환하여 사용되고, 천연 서열 PR010282 (Stra6) 및 PR010282 (Stra6) 폴리펩티드 변이체 (본원에 더 정의되어 있음)를 포함한다. PR010282 (Stra6) 폴리펩티드는 인간 조직 유형 또는 또다른 공급원과 같은 다양한 공급원으로부터 단리하거나 재조합 및(또는) 합성 방법으로 제조할 수 있다.
"천연 서열 PR010282" 또는 "천연 서열 Stra6"는 아미노산 서열이 천연 PR010282와 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 PR010282 (Stra6)는 천연 공급원으로부터 단리할 수 있거나 재조합 및(또는) 합성 방법으로 제조할 수 있다. 용어 "천연 서열 PR010282" 또는 "천연 서열 Stra6"는 특히, 자연적으로 발생하는 말단-절단된 형태 또는 분비된 형태 (예컨대, 세포외 도메인 서열), 자연-발생 변이체 형태 (예를 들어, 얼터네이티브-스플라이싱 형태) 및 PR010282의 자연-발생적 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 천연 서열 PR010282는 도 2 (서열 2)의 아미노산 1 내지 667을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 PR010282이다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 천연 서열 PR010282 폴리펩티드는 서열 5의 아미노산 1 내지 658을 포함하는 성숙 또는 전장 PRO19578 폴리펩티드이고, 이 폴리펩티드는 서열 2의 천연 서열 PR010282의 얼터네이티브 스플라이싱 형태인 것으로 생각된다. 도 2 (서열 2) 및 도 7 (서열 5)에 개시된 PR010282 폴리펩티드는 본원에서 아미노산 위치 1이라 지칭한 메티오닌 잔기로 시작되지만, 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)에서 아미노산 위치 1로부터 상류 또는 하류에 위치한 또다른 메티오닌 잔기가 PR010282 폴리펩티드의 개시 아미노산 잔기로 사용될 수 있는 가능성이 있다.
PR010282 (Stra6) 폴리펩티드 "세포외 도메인" 또는 "ECD"란 본질적으로 막횡단 또는 세포질 도메인이 없는 PR010282 (Stra6) 폴리펩티드의 형태를 의미한다. 임의로, PR010282 (Stra6) 폴리펩티드 ECD는 통상 막횡단 및(또는) 세포질 도메인을 1% 미만으로 포함하며, 바람직하게는 상기 도메인들을 0.5% 미만으로 포함한다. 본 발명의 PR010282 폴리펩티드에서 확인된 모든 막횡단 도메인은 당업계에서 소수 성 도메인 유형을 밝히는 데 통상적으로 사용되는 기준에 준거하여 확인된 것임을 이해해야 할 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계선은 다를 수 있지만, 대부분은 본원에서 처음 확인된 도메인의 말단에서 5개 아미노산 범위 내에 존재한다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, PR010282 폴리펩티드의 세포외 도메인은 X가 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 아미노산 49 내지 59 중 임의의 아미노산인 아미노산 1 내지 X를 포함한다.
상호교환가능하게 사용되는 용어 "PR010282 변이체 폴리펩티드" 또는 "Stra6 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 2 (서열 2)에 나타낸 PR010282 폴리펩티드의 잔기 1 내지 667 또는 도 7 (서열 5)의 잔기 1 내지 658, (b) 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 잔기 1 내지 X (여기서, X는 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 아미노산 잔기 49 내지 59 중 어느 하나의 아미노산임), 또는 (c) 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)에 나타낸 아미노산 서열로부터 유래된 또다른 특정 단편의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상인 하기 정의된 활성 PR010282 (Stra6) 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 PR010282 (Stra6) 변이체 폴리펩티드로는 예컨대, 하나 이상의 아미노산 잔기가 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 서열의 N- 및(또는) C-말단 뿐만 아니라 하나 이상의 내부 도메인 내에 부가되거나 결실된 PR010282 (Stra6) 폴리펩티드가 있다. 통상적으로, PR010282 변이체 폴리펩티드는 (a) 도 2 (서열 2)에 나타낸 PR010282 폴리펩티드의 잔기 1 내지 667 또는 도 7 (서열 5)의 잔기 1 내지 658, (b) 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 잔기 1 내지 X (여기서, X는 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 아미노산 잔기 49 내지 59 중 어느 하나의 아미노산임), 또는 (c) 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)에 나타낸 아미노산 서열로부터 유래된 또다른 특정 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81% 이상, 보다 바람직하게는 약 82% 이상, 보다 바람직하게는 약 83% 이상, 보다 바람직하게는 약 84% 이상, 보다 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 86% 이상, 보다 바람직하게는 약 87% 이상, 보다 바람직하게는 약 88% 이상, 보다 바람직하게는 약 89% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 91% 이상, 보다 바람직하게는 약 92% 이상, 보다 바람직하게는 약 93% 이상, 보다 바람직하게는 약 94% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 96% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상, 보다 바람직하게는 약 98% 이상, 보다 바람직하게는 약 99% 이상일 것이다. PR010282 변이체 폴리펩티드는 천연 PR010282 폴리펩티드 서열을 포함하지 않는다. 통상적으로, PR010282 변이체 폴리펩티드의 길이는 약 10개 아미노산 이상, 약 20개 아미노산 이상, 바람직하게는 약 30개 아미노산 이상, 바람직하게는 약 40개 아미노산 이상, 바람직하게는 약 50개 아미노산 이상, 바람직하게는 약 60개 아미노산 이상, 바람직하게는 약 70개 아미노산 이상, 바람직하게는 약 80개 아미노산 이상, 바람직하게는 약 90개 아미노산 이상, 바람직하게는 약 100개 아미노산 이상, 바람직하게는 약 150개 아미노산 이상, 바람직하게는 약 200개 아미노산 이상, 바람직하게는 약 300개 아미노산 이상 또는 그 이상이고 문헌 (Bouillet et al., Mechanisms of Development 63, 173-186 (1997))에 개시된 뮤린 Stra6 서열의 단편과는 다르다.
본원에서 확인된 PR010282 (Stra6) 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성(%)"은 서열을 정렬하고, 필요하다면, 최대 서열 동일성(%)을 얻기 위해 갭 (gap)을 도입한 후 임의의 보존적인 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않은 상태에서 PR010282 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성(%)을 결정하기 위한 정렬은 당분야의 기술에 속하는 다양한 방법, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메갈린 (Megalign; DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 전장 서열의 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬 측정에 적합한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성(%)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2을 이용하여 아래에 기재된 바와 같이 얻는데, 여기서, ALIGN-2 프로그램용 완전 원시 코드는 하기 표 1에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사에 의해 개발되었고, 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (Washington D. C., 20559)에 사용자 문서로 등록되어 있고, 미국 저작권 등록번호는 TXU510087이다. ALIGN-2 프로그램은 제넨텍, 인크사 (South San Francisco, California)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 표 1에 기재된 원시 코드로부터 번역할 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작업 시스템, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D 상에서 번역되어 사용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변하지 않는다.
본원의 목적상, 해당 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 해당 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%)(해당 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 해당 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 아미노산 서열 동일성 계산의 예로서, 하기 표 2 및 3은 "PRO"로 지칭되는 아미노산 서열에 대한 비교 단백질로 지칭되는 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성 (%)을 계산하는 방법을 나타낸다.
달리 명시하지 않는 한, 모든 아미노산 서열 동일성(%)은 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 사용하여 상기와 같이 얻을 수 있다. 그러나, 아미노산 서열 동일성 (%)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 이용하여 계산할 수도 있다 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). 상기 NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정된다.
NCBI-BLAST2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 해당 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 해당 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%)(해당 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 해당 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
X/Y ×100
여기서, X는 NCBI-BLAST2 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
"PR010282 (Stra6) 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PR010282 (Stra6) 변이체 핵산 서열"은 아래 정의된 바와 같은 활성 PR010282 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, (a) 도 2 (서열 2)에 나타낸 PR010282 폴리펩티드의 잔기 1 내지 667 또는 도 7 (서열 5)의 잔기 1 내지 658을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 잔기 1 내지 X (여기서, X는 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 아미노산 잔기 49 내지 59 중 어느 하나의 아미노산임)을 코딩하는 핵산 서열, 또는 (c) 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)에 나타낸 아미노산 서열로부터 유래된 또다른 특정 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상인 핵산 분자이다. 보통, PR010282 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 2 (서열 2)에 나타낸 PR010282 폴리펩티드의 잔기 1 내지 667 또는 도 7 (서열 5)의 잔기 1 내지 658을 코딩하는 핵산 서열, (b) 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 잔기 1 내지 X (여기서, X는 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)의 아미노산 잔기 49 내지 59 중 어느 하나의 아미노산임)을 코딩하는 핵산 서열, 또는 (c) 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)에 나타낸 아미노산 서열로부터 유래된 또다른 특정 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상, 보다 바람직하게는 약 81 % 이상, 보다 바람직하게는 약 82 % 이상, 보다 바람직하게는 약 83 % 이상, 보다 바람직하게는 약 84 % 이상, 보다 바람직하게는 약 85 % 이상, 보다 바람직하게는 약 86 % 이상, 보다 바람직하게는 약 87 % 이상, 보다 바람직하게는 약 88 % 이상, 보다 바람직하게는 약 89 % 이상, 보다 바람직하게는 약 90 % 이상, 보다 바람직하게는 약 91 % 이상, 보다 바람직하게는 약 92 % 이상, 보다 바람직하게는 약 93 % 이상, 보다 바람직하게는 약 94 % 이상, 보다 바람직하게는 약 95 % 이상, 보다 바람직하게는 약 96 % 이상, 보다 바람직하게는 약 97 % 이상, 보다 바람직하게는 약 98 % 이상, 보다 바람직하게는 약 99 % 이상일 것이다. PR010282 폴리뉴클레오티드 변이체들은 천연 PR010282 뉴클레오티드 서열 또는 천연 PRO19578 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
통상적으로, PR010282 (Stra6) 변이체 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 60 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 90 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 120 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 150 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 180 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 210 개 이상의 뉴클레 오티드, 또는 약 240 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 270 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 300 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 450 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 600 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 900 개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 이상이고, 문헌 (Bouillet et al., Mechanisms of Development 63, 173-186 (1997))에 개시된 뮤린 Stra6의 뉴클레오티드 서열에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 제외된다.
본원에서 확인된 PR010282 (Stra6) 폴리펩티드 코딩 핵산 서열과 관련하여 "핵산 서열 동일성 (%)"은 PR010282 폴리펩티드 코딩 핵산 서열과 후보 서열을 정렬시키고, 필요한 경우 서열 동일성의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 PR010282 폴리펩티드 코딩 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열의 뉴클레오티드의 백분율로서 정의된다. 핵산 서열 동일성 (%)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메갈린 (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하는 데 적합한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 핵산 서열 동일성 값 (%)은 하기에 기재된 바와 같이 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2을 이용하여 얻는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 하기 표 1에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사가 개발하였으며, 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱톤 D.C.에 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코 드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨텍, 인크사 (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 쉽게 구할 수 있거나, 표 1에 기재된 원시 코드로부터 번역될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 번역되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정하고 변하지 않는다.
본원의 목적상, 해당 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 해당 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (%)(해당 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 해당 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
W/Z ×100
여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (%)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 핵산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 4 및 5는 "PRO-DNA"로 지칭하는 핵산 서열에 대한 비교 DNA로 지칭하는 핵산 서열의 핵산 서열 동일성 (%)을 계산하는 방법을 나타낸다.
달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 핵산 서열 동일성 (%)은 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기와 같이 얻는다. 그러나, 핵산 서열 동일성 (%)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))을 이용하여 측정할 수도 있다. 상기 NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정된다.
NCBI-BLAST2가 핵산 서열 비교에 사용되는 경우, 해당 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 해당 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (%)(해당 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 해당 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
W/Z ×100
여기서, W는 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (%)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
다른 실시양태에서 PR010282 (Stra6) 변이체 폴리뉴클레오티드는 도 2 (서열 2) 또는 도 7 (서열 5)에 나타낸 전장 PR010282 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 (바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건에서) 혼성화할 수 있는, 활 성 PR010282 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다. PR010282 변이체 폴리펩티드는 PR010282 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
상기한 바와 같이 수행되는 아미노산 서열 동일성 비교와 관련하여 "양성"이란 용어는 동일할 뿐만 아니라 성질이 유사한 비교될 서열의 아미노산 잔기를 의미한다. 관심있는 아미노산 잔기에 대해 양성값을 기록하는 아미노산 잔기는 관심있는 아미노산 잔기와 동일한 잔기이거나 관심있는 아미노산 잔기의 바람직한 치환체 (하기 표 1에 정의되어 있음)인 아미노산 잔기이다.
본원의 목적상, 해당 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 해당 아미노산 서열 A의 양성값 (%)(해당 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 양성값 (%)을 갖거나 포함하는 해당 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 상기에서 정의된 양성값을 기록하는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 양성값 (%)은 A에 대한 B의 양성값 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용된 "단리된"은 폴리펩티드가 확인되고, 그 자연 환경 요소로부터 분리 및(또는) 회수되었음을 의미한다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩티드는 자연적으로 결합되어 있는 모든 성분이 결합되어 있지 않는 상태이다. 폴리펩티드의 자연 환경의 오염 요소는 이 폴리펩티드의 진단 또는 치료적 사용을 일반적으로 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질 등이 있을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝컵 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제될 수 있다. PR010282 (Stra6)의 천연 환경 성분 중 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내에 존재하는 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 얻어질 것이다.
PR010282 (Stra6) 폴리펩티드를 코딩하는 "단리된" 핵산이란 PR010282 코딩 핵산의 천연 출처에서 통상적으로 결합되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자라는 의미이다. 바람직하게는, 단리된 핵산은 자연적으로 결합되어 있는 모든 성분이 결합되어 있지 않는 상태이다. 단리된 PR010282 코딩 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다르게 존재한다. 따라서, 단리된 PR010282 코딩 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 특정 PR010282 코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 예를 들어, 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하며 통상적으로 PR010282를 발현하는 세포에 함유된 폴리펩티드 핵산 분자는 단리된 PR010282 코딩 핵산 분자에 포함된다.
용어 "조절 서열"이란 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열 의 발현에 필요한 DNA 서열이다. 원핵생물에 적절한 조절 서열로는 예컨데 프로모터, 경우에 따라 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 들 수 있다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)의 DNA는 해당 폴리펩티드가 분비되기 전의 형태인 전단백질로서 발현되는 경우 그 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩티드 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 위치할 뿐만 아니라 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 하나의 항-PR010282 폴리펩티드 모노클로날 항체 (아고니스트, 길항제 및 중화 항체 등), 폴리에피토프 특이성이 있는 항-PR010282 항체 조성물, 단쇄 항-PR010282 항체 및 항-PR010282 항체의 단편 (하기 참조) 등을 통칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외한, 한 집단을 이루는 동일 한 개별 항체를 의미한다.
혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도, 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로 보다 긴 프로브일수록 적절한 어닐링에 보다 높은 온도를 필요로하며, 보다 짧은 프로브일수록 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 자신들의 용융 온도보다 낮은 환경에 존재할 때 재어닐링되는 변성된 DNA의 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이의 원하는 상동성의 정도가 높을수록, 사용할 수 있는 상대적인 온도가 높아진다. 따라서, 상대적 온도보다 높아질수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 반면, 상대적 온도가 낮을수록 반응조건은 덜 엄격해진다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련한 더 자세한 정보 및 설명은 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995))을 참조한다.
본원에서 정의되는 "엄격 조건" 또는 "엄격도가 높은 조건"이란 (1) 세척시 이온 세기가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들면 50 ℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1 % 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 조건, 또는 (2) 혼성화시에 포름아미드, 예를 들어 42 ℃, 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)/0.1 % 소혈청 알부민/0.1 % 피콜/0.1 % 폴리비닐피롤리돈으로 제조한 50 % (부피/부피) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, (3) 50 % 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1 % 피로인산 나트륨, 5 x Denhardt's 용 액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1 % SDS, 및 10 % 덱스트란 술페이트를 42 ℃에서 사용하고, 42 ℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 그리고 55 ℃에서 50 % 포름아미드로 세척하며, 55 ℃에서 EDTA가 함유된 0.1 x SSC를 이용한 고엄격 세척을 수행하는 것이다.
"중간정도의 엄격 조건"이란 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press 1989)에 기재된 바와 같고, 상기한 것보다 엄격성이 낮은 혼성화 조건 (예를 들어 온도, 이온 세기 및 %SDS)의 이용을 말한다. 중간정도의 엄격 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x Denhardt 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 잘린 연어 정액 변성 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃로 밤새 인큐베이션한 후 필터를 약 37 내지 50℃에서 1 x SSC로 세척하는 조건이다. 당업계의 숙련가는 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞추기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등을 조절하는 방법을 잘 알 것이다.
본원에 사용된 "에피토프 태그를 붙인"란 용어는 "태그 폴리펩티드"에 융합된 PR010282 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. "태그 폴리펩티드"가 만들어질 수 있을 정도의 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 융합되는 PR010282 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 태그 폴리펩티드는 아주 독특해서 자신에 대한 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 가교반응하지 않는 것이 바람직하다. 적절한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 통상 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기를 갖는다 (바 람직하게는 약 10 내지 20개의 잔기).
용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로 예를 들어, 단일 항-PR010282 (항-Stra6) 모노클로날 항체 (아고니스트, 길항제 및 중화 항체를 포함함), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항-PR010282 항체 조성물, 단일쇄 항-PR010282 항체, 및 항-PR010282 항체의 단편을 포함한다 (아래 참조).
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻은 항체를 말하는데, 다시말해, 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이가 일어날 가능성을 제외하고 동일하다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10):1057-1062 (1995); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 있다.
항체를 파파인 (Papain) 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 쉽게 결정화되는 능력을 반영하여 이름 붙여진 나머지 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비공유결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가 변 도메인으로 이루어진 이량체로 구성된다. 이 구조에서는 각 가변 도메인의 CDR 3개가 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면에 항원 결합 부위를 형성한다. 결론적으로 보면, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 항원에 결합하는 능력을 갖는다.
또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지 (Hinge) 영역으로부터 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 첨가되었다는 점에서 Fab 단편은 Fab' 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 지칭한다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인이 있는 몇쌍의 Fab' 단편으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되었다.
임의의 척추동물종으로부터 유래한 항체(이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 명백하게 상이한 타입 중의 하나로 분류될 수 있다.
이뮤노글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 이뮤노글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개 주요 클래스가 있고, 이들 중 몇 개는 서브클래스(이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 다양한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 , , , ,로 불린다. 다양한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원적 입체구조는 잘 공지되어 있다.
용어 "디아바디 (diabody)"는 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내에 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편을 말한다. 동일한 사슬에 있는 2개의 도메인을 페어링시키기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제로 페어링시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097, WO93/11611 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"단리된" 항체란 자신의 천연 환경의 요소로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 요소는 항체의 진단 또는 치료적 사용을 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백성 또는 비단백성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정시 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 항체로, 또는 (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산의 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드로 정제될 것이다. 단리된 항체는 그 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내의 원위치에서의 항체를 포함한다. 그러나, 단리된 항체는 일반적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 정제될 것이다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정한 부분이 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타내고 그의 특정한 항원에 대한 각 특정 항체의 결합성과 특이성에 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 이러한 가변성이 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포 적용되는 것은 아니다. 이는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 모두에 있어서 초가변 영역으로 불리우는 3가지 세그먼트에 집중되어 있다. 보다 고도로 보존된 가변 도메인 부분이 골격 영역 (FRs)으로 불리운다. 본래의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FRs를 포함하는데, 크게는 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하고, 몇몇 경우에는 상기 β-시트 구조의 형성부인 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 β-시트 형태를 취한다. 각 쇄에서의 초가변 영역은 FRs에 의해 서로 밀접하게 유지되어 있는데, 기타 쇄로부터의 초가변 영역의 경우에는, 항체의 항원-결합성 부위 형성에 도움이 된다 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]. 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데 직접적인 관련은 없지만, 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)에 항체가 참여하는 것과 같은 각종 작용인자 기능을 나타낸다.
본원에 사용된 경우의 용어 "초가변 영역"은 항원-결합에 관여하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 이러한 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 [예: 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 및(또는) "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 [예: 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]를 포함한다. "골격 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
비-인간 (예: 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역의 잔기가 목적하는 항체 특이성, 친화성 및 능력을 가진 마우스, 쥐, 토끼 또는 비-인간 영장류 등의 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에서는, 인간 이뮤노글로불린의 골격 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 더우기, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않은 잔기를 포함할 수도 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더 증진시키도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 임의로, 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 다음 문헌을 참조할 수 있다 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]. 인간화 항체에는 항체의 항원 결합 부위가 마카크 원숭이를 관심있는 항원으로 면역화시켜 얻은 항체로부터 유래된 것인 PRIMATIZED (상표명) 항체가 포함된다.
본원에 사용된 용어 "이뮤노어드헤신"은 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 이종 단백질 (어드헤신)의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로 보면 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌 (즉 "이종성"인), 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신 중 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 임의의 이뮤노글로불린으로부터 얻을 수 있다.
본원에서 사용된 "활성의" 또는 "활성"은 천연 또는 자연발생 PR010282 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유하는 PR010282 폴리펩티드의 형태(들)을 말하는데, 여기서 "생물학적" 활성이란 천연 또는 자연발생 PR010282에 있는 항원성 에피토프에 대한 항체 생성을 유도하는 능력이 아니라, 천연 또는 자연발생 PR010282에 의한 생물학적 기능 (억제 기능 또는 자극 기능)을 말하며, "면 역학적" 활성이란 천연 또는 자연발생 PR010282에 있는 항원성 에피토프에 대한 항체 생성을 유도하는 능력을 말한다. 바람직한 생물 활성에는 예를 들어, 레티노산에 반응한, 생장, 발생 또는 분화에서의 기능이 포함된다. 레티노산에 반응하여 유도된 뮤린 단백질 Stra6과의 상당한 유사성을 기초로, 본원에 개시된 PR010282 폴리펩티드는 예를 들어, 초기 배복방향 사지 패터닝 및 후기 연골내 골화의 조절에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 또다른 생물학적 활성은 종양의 발생 및 생장과의 관련성이다.
"면역학적 활성"은 후보 폴리펩티드가 이러한 활성을 갖는 PR010282 (Stra6) 폴리펩티드의 정성적 생물 활성을, 공지된 활성 PR010282 (Stra6) 폴리펩티드에 대해 유도된 폴리클로날 항혈청과 경쟁하면서 억제할 수 있는 것을 의미하는 데 사용되는 "면역학적 교차-반응"이다. 상기 항혈청은 완전 프로인트 면역보강제 중의 공지된 활성 동족체를 염소 또는 토끼에게 예컨대 피하 주사한 후 불완전 프로인트 면역보강제 중의 상기 동족체를 복강내 또는 피하 주사로 부스팅함으로써 통상적인 방식으로 얻는다. 면역학적 교차-반응은 바람직하게는 상응하는 Stra6 폴리펩티드와 확인된 면역학적 교차-반응 분자 (예를 들어, 항체)의 결합 친화도가 임의의 다른 공지된 천연 폴리펩티드와 상기 분자의 결합 친화도보다 (약 2배 이상, 보다 바람직하게는 약 4배 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 8배 이상, 가장 바람직하게는 약 10배 이상) 훨씬 더 높다는 것을 의미하는 특이성을 나타낸다.
용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 PR010282 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키 는 모든 분자를 통칭한다. 이와 비슷하게 용어 "아고니스트"도 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 PR010282 폴리펩티드의 생물학적 활성을 흉내내는 모든 분자를 통칭한다. 적절한 아고니스트 또는 길항제 분자로는 구체적으로 아고니스트 또는 길항제의 항체 또는 항체의 단편, 천연 PR010282 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 유기분자 등을 들 수 있다. PR010282 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제를 확인하는 방법은 PR010282 폴리펩티드를 후보 아고니스트 분자나 후보 길항제 분자와 접촉시키고, PR010282 폴리펩티드와 정상적으로 관련된 하나 이상의 생물학적 활성에서 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "종양"은 악성이든 양성이든지 관계없이 모든 종양성 세포 생장 및 증식, 및 모든 전구암 세포 및 암세포와 조직을 말한다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 못한 세포 생장을 특징적으로 나타내는 포유류에서의 생리학적 증상을 지칭하거나 이를 기술한 것이다. 암의 예로는 암종, 임파종, 아세포종, 육종 및 백혈병 또는 임파계 악성 종양이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 유방암, 전립선암, 결장암, 소(小)세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위암, 췌장암, 신경교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 결장직장암, 자궁내막암, 타액선 암종, 신장암, 음문암, 갑상선암, 간세포암종 및 다양한 유형의 두경부암이 포함된다.
"치료"는 표적 병리학적 증상 또는 질환을 예방하거나 늦추기 (완화하기) 위한 목적으로 수행되는 치료와 예방 또는 방지 처치를 나타낸다. 치료를 요하는 대 상은 이미 질환을 앓고 있는 대상뿐만 아니라 질환에 걸리기 쉬운 대상 또는 질환을 예방하고자 하는 대상을 포함한다. 종양 (예를 들어, 암)의 치료에 있어서, 치료제는 종양 세포의 증상을 직접 완화시키거나, 종양 세포가 다른 치료제, 예를 들어, 방사선요법 및(또는) 화학요법으로의 치료에 보다 더 민감하도록 할 수 있다.
암의 "증상"은 환자의 복지를 위험하는 모든 현상을 말한다. 이것에는 비정상적 또는 조절되지 않은 세포 생장, 전이, 이웃하는 세포의 정상 기능의 방해, 비정상적 수준의 사이토킨 또는 다른 분비물의 방출, 염증반응 또는 면역반응의 억제 또는 악화 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
"만성" 투여란 급성 방식과 반대로 연속 방식으로 활성제(들)를 투여하여, 초기 치료 효과 (활성)를 장기간 동안 유지하는 것을 말한다. "간헐적" 투여는 중단없이 계속해서 행하는 것이 아니라 성질상 주기적으로 이루어지는 치료를 의미한다.
치료하기 위한 "포유동물"은 인간, 가축과 사육 동물, 및 동물원용, 경기용 또는 애완용 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 포함하는 포유동물로서 분류되는 모든 동물을 말한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
하나 이상의 다른 치료제와 "병행하여" 투여된다는 것은 동시에 (동시다발적으로) 투여하거나 어떤 순서로든 연속하여 투여하는 것을 포괄한다.
본원에서 사용되는 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 생리학상 허용되는 담체는 pH 완충 수용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예는 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 포함한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 TWEEN, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICS를 포함한다.
"표지 (label)"는 이 명세서에 사용될 때, 항체에 직간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체로 (방사성동위원소 표지 또는 형광 표지) 검출될 수 있거나, 효소 표지인 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
"고상 (solid phase)"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 고상의 예는 부분적으로 또는 완전하게 형성된 유리 (예를 들어 세공 조절된 유리), 폴리사카라이드 (예를 들어 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘 등이 있다. 특정 실시양태에서, 내용에 따라 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며, 다른 실시양태에서 고상은 정제 컬럼 (예를 들어 친화 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 별개 입자의 비연속적 고상도 포함한다.
"리포좀"은 약물 (예를 들어 PR010282 폴리펩티드 또는 이에 대한 항체)을 포유동물에게 전달하는 데 유용한 여러 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 작은 베지클 (vesicle)이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생체막의 지질 정렬과 유사하게 이중층 형태로 정렬된다.
"소분자 (작은 분자)"는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 이하인 것으로 정의된다.
어구 "유전자 증폭" 및 "유전자 복제"는 상호교환가능하게 사용되며, 많은 카피의 유전자 또는 유전자 단편이 특정한 세포 또는 세포주에서 형성되는 과정을 말한다. 복제된 영역 (증폭된 DNA의 스트레치)은 종종 "앰플리콘"으로 불린다. 통상적으로, 생성된 메신저 RNA (mRNA)의 양, 즉 유전자 발현도도 발현된 특정 유전자의 카피수에 비례하여 증가한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지시키고 (시키거나) 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 이러한 용어는 방사성 동위원소 (예: At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예를 들면 작은 분자 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소적 활성 독소 (이들의 단편 및(또는) 변이체 포함)를 포괄한다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는 아드리아마이신, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노사 이드 ("아라-C"), 시클로포스프아미드, 티오테파, 부술판, 사이톡신, 탁소이드, 예를 들어, 팩클리탁셀 (탁솔, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) 및 독세탁셀 (탁소테레, Rhne Poulenc Rorer, Antony, Rnace), 탁소테레, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토폭사이드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포사이드, 다우노마이신, 카미노마이신, 아미노프테린, 댁티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 제4,675,187호 참조), 5-FU, 6-티오구아닌, 6-메르캅토퓨린, 악티노마이신 D, VP-16, 클로람부실, 멜팔란 및 기타 관련 질소 머스타드가 포함된다. 또한, 타목시펜 및 오나프리스톤과 같은, 종양에 작용하는 호르몬을 조절하거나 억제하는 호르몬성 물질도 화학요법제의 정의에 포함된다.
본원에 사용된 경우의 "생장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 특정 세포, 특히 본원에 확인된 유전자들 중 임의의 유전자를 발현하는 암세포의 생장을 억제시키는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 이러한 생장 억제제는 S 상에서의 상기 유전자 과발현 세포의 비율을 상당히 감소시키는 것일 수 있다. 생장 억제제의 예로는 (S 기 이외의 위치에서) 세포 주기 진행을 차단시하는 물질, 예를 들면 G1 정지와 M-기 정지를 유도하는 물질이 있다. 전통적인 M-기 차단제에는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포 II 억제제, 예를 들면 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. G1기를 정지시켜 S-기 정지 효과를 나타내는 물질은 예를 들면, DNA 알킬화제, 예를 들면 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C이다. 추가의 정보가 다음 문헌에 제시되어 있다 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p. 13].
"독소루비신"은 안트라시클린 항생제이다. 독소루비신의 전체 화학명은 (8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시--L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-8-(히드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타세네디온이다.
용어 "사이토킨"은 세포간 매개자로서 또다른 세포에 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반명이다. 이러한 사이토킨의 예로는 림포킨, 모노킨 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토킨 중에는 성장 호르몬, 예를 들면 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들면 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α및 -β; 물레리안-억제 물질; 마우스 고난도트로핀 관련 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예를 들면 NGF-β; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자 (TGFs), 예를 들면 TGF-α및 TGF-β; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 인슐린 유사 성장 인자-II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예를 들면 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSFs), 예를 들면 마크로파지-CSF (M-CSF); 과립구-마크로파지-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터류킨 (ILs), 예를 들면 IL-1, IL-1α,IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예를 들면 TNF-α및 TNF-β; 및 LIF 및 키트 리간드 (KL)을 비롯한 기타 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에 사용된 사이토킨은 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양물 및 본래 서열 사이토킨의 생물학적 활성 등가물로부터의 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "전구약물 (prodrug)"은 모약물과 비교해서 종양 세포에 대해 보다 낮은 세포독성을 나타내고 보다 높은 활성을 나타내는 모 형태로 효소적 활성화되거나 전환될 수 있는, 제약학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태이다 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615th Meeting Belfast (1986) and Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]. 본 발명의 전구약물에는 보다 활성인 세포독성 자유 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트 함유 전구약물, 티오포스페이트 함유 전구약물, 설페이트 함유 전구약물, 펩티드 함유 전구약물, D-아미노산-변형된 전구약물, 글리코실화 전구약물, β-락탐 함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드 함유 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세타미드 함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 기타 5-플루오로우리딘 전구약물이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용하기 위 한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예에는 상기 언급된 화학요법제가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
종양성 세포 생장, 종양 생장 또는 암세포 생장의 억제와 관련하여, 본원에 개시된 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 "유효량"은 표적 세포의 생장을 어느 정도 억제할 수 있는 양이다. 이 용어에는 표적 세포의 생장 억제, 세포증식 억제 효과, 세포독성 효과 및(또는) 아폽토시스를 일으킬 수 있는 양이 포함된다. 종양성 세포 생장, 종양 세포 또는 암세포의 생장을 억제하기 위한, (PR019578을 포함하는) PR010282 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 "유효량"은 경험적으로 관례적인 방식으로 결정할 수 있다.
종양의 치료와 관련하여 "치료 유효량"은 (1) 종양 생장을 늦추는 효과과 완전히 정지시키는 효과를 포함하는, 어느 정도까지 종양 생장을 억제하는 효과; (2) 종양 세포의 수를 감소시키는 효과; (3) 종양 크기를 감소시키는 효과; (4) 종양세포가 말초 기관으로 침윤하는 것을 억제하는 효과 (즉, 종양세포가 말초 기관으로 침윤하는 것을 감소시키거나, 늦추거나 완전히 정지시키는 효과); (5) 전이의 억제 효과 (즉, 전이의 감소, 완화 또는 완전한 정지 효과); (6) 반드시는 아니지만 종양을 억제시키거나 거부할 수 있는 항-종양 면역반응의 강화 효과; 및(또는) (7) 종양과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 완화시키는 효과 중에서 하나 이상의 효과를 나타낼 수 있는 양을 말한다. 종양의 치료를 위한 PR010282 폴리펩티드 길항제의 "치료 유효량"은 경험적으로 관례적인 방식으로 결정할 수 있다.
PR010282 길항제의 "생장 억제량"은 시험관내 또는 생체내에서 세포, 특히 종양, 예를 들어, 암세포의 생장을 억제할 수 있는 양이다. 종양성 세포 생장을 억제하기 위한, PR010282 길항제의 "세포독성량"은 경험적으로 관례적인 방식으로 결정할 수 있다.
PR010282 길항제의 "세포독성량"은 시험관내 또는 생체내에서 세포, 특히 종양, 예를 들어, 암세포의 파괴를 유발할 수 있는 양이다. 종양성 세포 생장을 억제하기 위한, PR010282 길항제의 "세포독성량"은 경험적으로 관례적인 방식으로 결정할 수 있다.
(상호교환가능하게 사용되는 용어인) "안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드" 또는 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 서열 특이적 방식으로 표적 유전자의 전사 및(또는) 번역을 억제할 수 있는 핵산 분자로서 정의된다. 용어 "안티센스"는 핵산이 표적 유전자의 코딩 ("센스") 유전자 서열에 상보적이라는 사실을 말한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 와슨-크릭 염기-짝짓기를 통해 생성되는 mRNA에 역평형 방향으로 혼성화한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 mRNA 주형에 결합함으로써 코딩된 단백질의 성공적인 번역을 차단한다. 구체적으로, 이 용어에는 천연 자가-스플라이싱 활성을 나타내는 서열을 첨가함으로써 표적 RNA의 효소 절단을 유도하도록 지정된 "리보자임"으로 불리는 안티센스 물질이 포함된다 (Warzocha and Wotowiec, "Antisense strategy"biological utility and prospects int he treatment of hematological malignancies."Leuk. Lymphom 24 : 267-281 [1997]).
II. 본 발명의 조성물 및 방법
A. 인간 PR010282 및 PRO19578 ( Stra6 ) 폴리펩티드의 전장 천연 서열
본 발명은 본원에서 각각 천연 인간 PR010282 (또는 UNQ3126) 및 PRO19578로 언급된 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 특히, 하기 실시예에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 천연 인간 PR010282 및 PRO19578 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. 별도의 발현 라운드에서 생산된 단백질의 PR0 숫자는 다를 수 있지만 UNQ 수는 임의 주어진 DNA 및 코딩된 단백질 특유의 것이며, 변하지 않을 것이다. 그러나, 본원에서는 간단하게, DNADNA148380-2827에 의해 코딩되는 단백질뿐만 아니라 PR010282의 상기 정의에 포함되는 모든 천연 상동체 및 변이체도 이들의 출처 및 제조 방식과 상관없이 "PR010282"로 언급할 것이다. "PR010282"의 천연 변이체인, DNA148389-2827-1에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 구체적으로 "PR019578"로 언급될 것이다.
하기 실시예에 기재된 바와 같이, 본원에서 DNA148380-2827 및 DNA148389-2827-1로 지칭되는 cDNA 클론은 ATCC에 기탁하였다. 당업자라면 당업계의 일반적인 방법을 이용하여 기탁된 클론의 서열을 분석함으로써 상기 클론의 실제 뉴클레오티드 서열을 쉽게 결정할 수 있다. 일반적인 기술을 사용하여 뉴클레오티드 서열로부터 예상된 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 본원에 기재된 PR010282 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산의 경우, 본 발명자들은 당시 이용할 수 있었던 서열 정보를 사용하여 가장 잘 확인할 수 있는 리딩 프레임으로 여겨지는 것을 확인하였다.
위에 언급되어 있는 ALIGN-2 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 전장 천연 서열 PR010282 (도 2 및 서열 2에 나타냄)가 레티노산 (AF062476)에 반응하여 유도되는 뮤린 단백질 Stra6와 어느 정도의 아미노산 서열 동일성을 갖고 있다는 것을 밝혔다. 따라서, 현재 본원에 개시된 PR010282 폴리펩티드는 Stra6 단백질족의 새로 확인된 구성원이고 상기 단백질족의 전형적인 생물학적 및(또는) 면역학적 활성 또는 성질을 한 가지 이상 가질 수 있는 것으로 생각된다. PR019578은 현재, 천연 인간 PR010282 아미노산 서열의 위치 89-97의 아미노산 9개 (SPVDFLAGD)가 결실되어 있으며 PR010282의 위치 527에 상응하는 위치 518의 Met (M) 대신에 Ile (I)를 함유하는 천연 전장 인간 PR010282의 얼터네이티브 스플라이싱 변이체인 것으로 생각된다. 이는 Stra6이 다형성일 수 있음을 의미한다.
B. PR010282 ( Stra6 ) 변이체
본원에는 두 가지 특정 천연 서열 인간 Stra6 폴리펩티드 (천연 서열 인간 PR010282 및 PR019578)가 개시되어 있다. 위에 기재된 바와 같이, PR019578은 천연 서열 인간 PR010282의 얼터네이티브 스플라이싱 천연 변이체인 것으로 생각되므로, "PR010282 변이체"이다. 본원에 기재되어 있는 전장 천연 서열 PR010282 및 PR019578 폴리펩티드 외에, PR010282 및 PR019578 변이체를 제조할 수 있는 것으로 생각된다. PR010282 및 PR019578 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변화를 PR010282 또는 PR019578 DNA에 도입하고(하거나) 목적 PRO10282 변이체 폴리펩티드를 합성하여 제조할 수 있다. 당업자라면 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변화 또는 멤브레인 앵커링 특성의 변화와 같은 아미노산 변화가 PR010282 또는 PR019578의 번역후 프로세스를 변화시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에 기재되어 있는 전장 천연 서열 PR010282, PR019578 또는 이들의 여러 도메인에서의 변이는 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 개시된 보존적 및 비보존적 돌연변이 기술 및 지침을 사용하여 제조할 수 있다. 변이는 천연 서열 PR010282 또는 PR019578와 비교되는 것으로 PR010282 또는 PR019578의 아미노산 서열이 변화된 PR010282 또는 PR019578를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 하나 이상의 PR010282 또는 PR019578 도메인에서 하나 이상의 아미노산을 임의 다른 아미노산으로 치환함으로써 생성된다. 목적 활성에 유해한 효과를 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기는 PR010282 또는 PR019578의 서열을 공지의 상동 단백질 분자의 서열과 비교하고 상동성이 높은 영역에서 생성된 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환, 예를 들어 루이신의 세린으로의 치환, 즉 아미노산의 보존적 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산에서 발생할 수 있다. 허용되는 변이는 서열 내에 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시키고, 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타나는 생성된 변이체의 활성을 시험함으로써 정할 수 있다.
본원은 PR010282 폴리펩티드 단편들을 제공한다. 예를 들어 전장 천연 단백질과 비교하는 경우, 이 단편들은 N-말단 또는 C-말단이 잘릴 수 있으며 내부 잔기가 결손될 수 있다. 몇몇 단편은 본 발명의 PR010282 또는 PRO19578 폴리펩티드의 목적 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결실되어 있다.
PR010282 또는 PRO19578 단편은 많은 통상의 기술 중 임의의 기술에 의해 제 조할 수 있다. 목적 펩티드 단편은 화학적으로 합성할 수 있다. 다른 방법은 효소적 분해 방법, 예를 들어 이 단백질을 특정 아미노산 잔기에 의해 정해진 부위에서 단백질을 자르는 것으로 알려진 효소로 처리하거나 또는 이 DNA를 적합한 제한 효소로 잘라냄으로써 PR010282 또는 PRO19578 단편을 생성하고 이 목적 단편을 단리하는 것을 포함한다. 그러나, 또다른 적합한 기술은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 목적 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 증폭하는 것을 포함한다. DNA 단편의 목적 말단부를 정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머로 사용된다. 바람직하게는, PR010282 또는 PRO19578 폴리펩티드 단편은 도 2 (서열 2)에 개시된 천연 PR010282 폴리펩티드와 한가지 이상의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 공유한다.
구체적인 실시태양에서, 목적물의 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 표제로 표 1에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우, 하기 표 1에서 치환예로서 명명되거나 아미노산 종류에 대해서 하기에서 보다 상세하게 설명된 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다.
<표 1>
Figure 112007086700136-PAT00001
PR010282 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 백본의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 유지하거나, (b) 표적 부위에서의 분자의 하전 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 그의 효과를 상당히 변경시키는 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:
(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족; trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 상기 한 종류의 구성 성분을 다른 종류의 것으로 교환시킬 것이다. 또한, 이렇게 치환되는 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비보존) 부위에 도입될 수 있다.
*변이는 올리고뉴클레오티드 매개 (위치 지정) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝법 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수있다. 위치 지정 돌연변이 유발법 [Carter et al., Nucl . Acids Res ., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl . Acids Res ., 10:6487 (1987)], 카세트 돌연변이 유발법 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], 제한 선택 돌연변이 유발법 [Wells et al., Philos . Trans . R. Soc . London SerA, 317:415 (1986)] 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 실시하여 본 발명의 PR010282 폴리펩티드 변이체 DNA를 제조할 수 있다.
또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 사용하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 통상적으로, 알라닌은 베타-탄소 밖의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 배열을 변경시킬 가능성이 적기 때문에 바람직한 스캐닝 아미노산이다[Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. 또한, 알라닌은 통상적으로 가장 흔한 아미노 산이기 때문에 바람직하다. 또한, 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서 빈번하게 발견된다 [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol . Biol ., 150:1 (1976)]. 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체(isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.
C. 천연 및 변이체 PR010282 ( Stra6 )의 변형
PR019578을 비롯하여 PR010282 및 PR010282 변이체의 공유결합 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 변형의 한 형태는 PR010282의 선택된 측쇄 또는 N 말단 또는 C 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 PR010282 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제를 사용한 유도체화는 예를 들어 항-PR010282 폴리펩티드 항체 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 PR010282를 가교결합시키거나 그 반대로 가교결합시키는데 유용하다. 통상 사용되는 가교결합제는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질을 포함한다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노 기의 메틸화[T.E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)], N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 PR010282 폴리펩티드의 공유결합 변형의 다른 유형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. 천연 서열 PR010282 및 PRO19578 폴리펩티드는 그들의 아미노산 서열의 위치 8-12에 N-결합 글리코실화 부위를 함유한다. 본원의 목적을 위한 "천연 글리코실화 패턴의 변화"는 천연 서열 PR010282 또는 PRO19578에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실(잠재적인 글리코실화 부위를 제거하거나 화학적 및(또는) 효소적 방법에 의해 글리코실화를 결실시킴으로써) 및(또는) 천연 서열 PR010282 또는 PRO19578에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다. 또한, 이 용어는 존재하는 다양한 탄수화물 잔기의 특성 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어 질적 변화를 포함한다.
천연 또는 변이체 PR010282 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열의 변화에 의해 달성될 수 있다. 변화는 예를 들어 천연 서열 PR010282에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우). PR010282 아미노산 서열은 특히 목적 아미노산으로 번역되는 코돈을 생성시키도록 PR010282 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이시킴으로써 DNA 수준에서의 변화를 통하여 임의로 변화시킬 수 있다.
*PR010282 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit . Rev . Biochem ., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
PR010282 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 또는 글리코실화 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch . Biochem . Biophys., 259:52(1987) 및 Edge et al., Anal . Biochem ., 118:131(1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 효소에 의한 절단은 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다 [Thotakura et al., Meth. Enzymol ., 138:350(1987)].
PR010282의 공유결합 변형의 다른 종류는 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 기재된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 PR010282 폴리펩티드를 연결시키는 것을 포함한다.
*또한, 본 발명의 PR010282는 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 PRO10282를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 PRO10282의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 PRO10282의 아미노 또는 카르복실 말단에 위치한다. 상기 에피토프 태그를 갖는 형태의 PRO10282의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 종류의 친화성 매트릭스를 사용한 친화성 정제에 의해 PRO10282를 용이하게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘(poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 태그, flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [Field et al., Mol . Cell . Biol ., 8:2159-2165 (1988)], c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3636 (1985)], 및 단순포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]를 들 수 있다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)], KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)], 알파-튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al., J. Biol. Chem ., 266:15163-15166 (1991)] 및 T7 유전자 10 단백질 태그 [Lutz-Freyermuth et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87:6393-6397 (1990)]를 포함한다.
다른 한 실시태양에서, 키메라 분자는 PRO10282와 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정 영역의 융합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태("면역어드헤신"으로 언급하기도 함)의 경우, 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역일 수 있다. 이 Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자내 1개 이상의 가변성 영역의 부위를 PR010282 폴리펩티드의 가용성(결실 또는 실활화된 막횡단 도메인) 형태로 치환한 것을 포함한다. 특히 바람직한 한 실시태양에서, 이뮤노글로불린 융합체는 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 융합체를 생산하는 방법으로는, 1995년 6월 27일 간행된 미국 특허 제5,428,130호를 참조한다.
D. 천연 또는 변이체 PR010282 ( Stra6 ) 폴리펩티드의 제조
하기 설명은 주로 PR010282 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 (특히, PR019578을 비롯한) 천연 서열 및 변이체 PR010282 (Stra6) 폴리펩티드를 제조하는 것에 관한 것이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 PR010282 (Stra6)를 제조할 수 있다. 예를 들어, PR010282 서열 또는 그의 단편은 고상 기술을 사용하는 직접적인 펩티드 합성법에 의해 제조할 수 있다 [문헌 (Stewart et al., Solid - Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am . Chem . Soc ., 85:2149-2154 (1963))을 참조한다]. 시험관 내 단백질 합성은 수동 방법 또는 자동 방법에 의해 수행될 수 있다. 자동 합성법은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 펩티드 합성기( Applied Biosystems Peptide Synthesizer)(미국 캘리포니아주 포스터시티 소재)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. PR010282의 다양한 단편을 별도로 화학적으로 합성하고 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합함으로써 전장 PR010282 (Stra6)를 제조할 수 있다.
1. PR010282 ( Stra6 )를 코딩하는 DNA 의 단리
PR010282를 코딩하는 DNA는 PR010282 mRNA를 보유하여 그를 검출가능한 수준으로 발현할 것으로 생각되는 조직으로부터 제조한 cDNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 따라서, 인간 PR010282 DNA는 실시예에서 설명되는 바와 같이 인체 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득할 수 있다. PR010282 코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 수득하거나 또는 공지된 합성 방법(예를 들어, 자동 핵산 합성 방법)에 의해 수득할 수 있다.
라이브러리는 목적 유전자 또는 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 고안된 프로브 (예를 들어, 목적하는 PRO에 대한 항체 또는 약 20 내지 80개 이상의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. PRO를 코딩하는 유전자를 단리하는 다른 수단은 PCR 방법을 사용하는 것이다 [Sambrook et al., 상기 문헌; Dieffenbach et al., PCR Primer : A Laboratory Manual (Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995)].
하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 프로브로 서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가양성 결과를 최소화하기 위해서 충분한 길이를 갖고 충분히 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리에서 DNA에 혼성화시에 검출될 수 있도록 표지되는 것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고, 32P-표지 ATP와 같은 방사성 표지, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중간정도 엄격성 및 높은 엄격성을 포함하는 혼성화 조건은 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에서 제공된다.
상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 GenBank와 같은 공용 데이타베이스 또는 다른 독점 서열 데이타베이스에 기탁되고 입수될 수 있는 다른 공지의 서열과 비교하여 정렬시킬 수 있다. 분자의 한정된 영역 내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 선행 기술 공지된 방법 및 본원에서 설명된 방법을 이용하여 결정할 수 있다.
단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 먼저 본원에 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하고 필요하다면 전구체를 검출하기 위해 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에 기재된 통상의 프라이머 신장 방법을 사용하여, 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, cDNA로 역전사되지 않은 mRNA의 중간체를 프로세싱함으로써 수득할 수 있다.
2. 숙주세포의 선택 및 형질전환
숙주세포는 PRO10282 생성을 위해 본원에서 설명한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환되고, 프로모터 유도, 형질전환체 선별 또는 목적 서열의 코딩 유전자 증폭에 적합하게끔 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양된다. 당업자라면 불필요한 실험을 수행하지 않고서도 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건을 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실시되는 기술은 문헌(Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al., 상기 문헌)에서 찾을 수 있다.
진핵세포 형질감염 방법 및 원핵세포 형질전환 방법, 예를 들어 CaCl2, CaPO4, 리포좀-매개 방법 및 전기천공법(electroporation)은 당업자에게 공지되어 있다. 사용되는 숙주세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 문헌(상기 Sambrook et al.)에 기재된 염화칼슘법을 이용하는 칼슘 처리, 또는 전기천공법은 일반적으로 원핵세포에 대해 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 문헌(Shaw et al., Gene, 23:315(1983) 및 1989년 6월 29일 공개된 국제 공개 제89/05859호)에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 문헌(Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978))의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 특징은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 문헌(Van Solingen et al., J. Bact., 130:949(1977) 및 Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 76:3829(1979))의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 세포 내로 DNA를 도입하는 다른 방법, 예를 들어 핵내 미세주입, 전기천공법, 원형 세포와 세균 원형질체 융합, 또는 다가양이온, 예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴도 사용할 수 있다. 포유동물 세포의 형질전환을 위한 여러 기술에 대해서는 문헌(Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 및 Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988))을 참조한다.
본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주세포에는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포가 포함된다. 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae), 예를 들어 이. 콜라이(E. coli)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예를 들어 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 X1776(ATCC 31,537), 이. 콜라이 균주 W3110(ATCC 27,325) 및 이. 콜라이 균주 K5 772(ATCC 53,635)는 용이하게 입수할 수 있다. 다른 적합한 원핵생물 숙주세포는 에셔리키아(Eshcerichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella) 등의 장내세균과(Enterobacteriaceae), 및 바실러스(Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리체니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710호에 기재된 비. 리체니포르미스(B. licheniformis) 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예는 단지 예시적인 것으로서 이에 제한되는 것은 아니다. 균주 W3110은 재조합 DNA 산물 발효에 공통적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주의 내생 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 초래하도록 변형될 수 있고, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2, 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4, 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT kan r 를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7(ATCC 55,244), 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT rbs7 ilvG kan r 를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6, 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4 및 1990년 8월 7일자로 허여된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 페리플라즘 프로테아제 변이체를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 중합효소 반응이 적합하다.
원핵세포 외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 PRO10282 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 일반적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 미생물에는 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985년 5월 2일 공개된 EP 139,383); 클루이베로 마이세스(Kluyveromyces) 숙주(미국 특허 제4,943,529호; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를 들어 케이. 락티스(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983]), 케이. 프라길리스 (K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135(1990)), 케이. 써모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia)(유럽 특허 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (유럽 특허 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia)(유럽 특허 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa; Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); 시와니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis)(1990년 10월 31일 공개된 유럽 특허 394,538); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공개된 국제 공개 제91/00357호) 및 아스퍼길러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A. nidulans)(Ballance et al,, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) 및 에이. 니게르 (A. niger) (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])가 포함된다. 메틸 영양 요구성 효모가 적합하고, 한세눌라(Hansenula), 칸디다(Candida), 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 이루어지는 속으로부터 선택된, 메탄올 상에서 생장할 수 있는 효모를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 종류의 효모의 예인 구체적인 종의 목록은 문헌(C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982))에 기재되어 있다.
글리코실화 PRO10282의 발현에 적합한 숙주세포는 다세포 생물로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예에는 드로소필라 S2 및 스포도프테라 Sf9와 같은 곤충 세포 및 식물 세포가 포함된다. 유용한 포유동물 숙주세포주의 예에는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 COS 세포가 포함된다. 보다 구체적인 예에는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통(COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 계통 (293 세포 또는 현탁 배양액 중의 생장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59(1997)), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)), 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251(1980)), 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포(Hep G2, HB 8065) 및 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51)이 포함된다. 당업자라면 적합한 숙주세포를 선택할 수 있다.
3. 복제가능 벡터의 선택 및 사용
PRO10282를 코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터에 삽입할 수 있다. 다양한 벡터를 용이하게 구할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 DNA를 적합한 제한효소 부위(들) 내에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 성분을 하나 이상 포함하는 적합한 벡터의 제조는 당업자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 이용한다.
PRO10282는 직접 재조합 방법에 의해 생산될 수 있을 뿐만 아니라 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 또는 벡터 내로 삽입된 PRO10282 코딩 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모에서의 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더(사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더(미국 특허 제5,010,182호)를 포함함) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더(1990년 4월 4일 공개된 유럽 특허 362,179) 또는 1990년 11월 15일 공개된 국제 공개 제90/13646호에 기재된 신호 서열일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열, 예를 들어 동일하거나 관련된 종의 분비 폴리펩티드로부터의 신호 서열 및 바이러스 분비 리더를 사용하여 단백질의 분비를 유도할 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터가 선택된 1 종 이상의 숙주세포에서 복제할 수 있도록 만드는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 복제 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 복제 기점(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 선별가능한 마커로도 불리우는 선별 유전자를 함유할 것이다. 대표적인 선별 유전자, 예를 들어 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린테트라시클린하는 단백질, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩한다.
포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 예에는 PRO10282 코딩 핵산을 수용할 수 있는 세포를 확인할 수 있게 하는 것, 예를 들어 DHFR 또는 티미딘 키나아제가 있다. 야생형 DHFR이 이용될 경우, 적합한 숙주세포는 DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이고, 문헌(Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980))에 기재된 바와 같이 제조 및 증식된다. 효모에 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다(Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979); Kingsman et al., Gene, 7:141(1979); Tschemper et al., Gene, 10:157(1980)). trp1 유전자는 트립토판으로의 생장능이 결여된 효모의 변이주(예를 들어, ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선별 마커를 제공한다(Jones, Genetics, 85: 12 (1977)).
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 mRNA 합성을 유도하는 PRO10282 코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적 숙주세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터에는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템(Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)), 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템(Goeddel, Nucleic acid Res., 8:4057 (1980); EP 제36,776호), 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터(deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983))를 포함한다. 또한, 세균 시스템에서 사용되는 프로모터는 PRO10282를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(S.D.) 서열을 함유할 것이다.
효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나아제(Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) 또는 다른 당분해 효소(Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149(1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나아제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프럭토키나아제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제, 피루베이트 키나아제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나아제에 대한 프로모터가 포함된다.
생장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터로는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이 있다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 EP 제73,657호에 기재되어 있다.
포유동물 숙주세포내의 벡터로부터의 PRO10282 전사는 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 포울폭스 바이러스 (1989년 7월 5일 공개된 UK 제2,211,504호), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 싸이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 얻어진 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터 및 열-충격 프로모터로부터 얻어진, 숙주세포 시스템에 적합한 프로모터에 의해 조절된다.
고등 진핵세포에 의한 PRO10282를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 일반적으로 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 대해 작용하는, 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-액팅 성분이다. 많은 인핸서 서열은 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 유래하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 통상적으로 진핵세포 바이러 스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예에는 복제 기점의 뒷부분 상의 SV40 인핸서(bp 100-270), 싸이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 뒷부분 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 인핸서는 PRO10282 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.
또한, 진핵생물 숙주세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터 유래한 다핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 수 있을 것이다. 그러한 서열은 통상적으로 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비번역 영역으로부터 입수한다. 이들 영역은 PRO10282를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 단편을 포함한다.
재조합 척추동물 세포 배양에서 PRO10282의 합성에 적용하는 데 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주세포는 문헌(Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); 유럽 특허 제117,060호 및 동 제117,058호)에 기재되어 있다.
4. 유전자 증폭 및 발현의 검출
유전자 증폭 및(또는) 발현은 예를 들어 통상의 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블롯팅(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), 도트 블롯팅(DNA 분석) 또는 본원에서 제공된 서열을 기초로 하여 적절하게 표지된 프로브를 사용한 원위치(in situ) 혼성화에 의해 샘플에서 직접 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중체(duplex), RNA 이중체 및 DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 비롯한 특정 이중체를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 바꾸어 말하면, 항체를 표지하고, 상기 이중체를 표면에 결합시켜, 표면 상에 결합체가 형성될 때 이중체에 결합한 항체의 존재를 검출할 수 있는 분석을 수행할 수 있다.
별법으로, 유전자 발현은 세포 또는 조직 단면의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 생성물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양액 또는 체액의 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 샘플 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 이들은 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연 서열 PRO10282 폴리펩티드, 본원에서 제공되는 DNA 서열 기재의 합성 펩티드 또는 PRO10282 DNA에 융합되어 있으며 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외부 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.
5. 폴리펩티드의 정제
PRO10282의 형태는 배양 배지 또는 숙주세포 용해액으로부터 회수될 수 있다. 세포막에 결합하는 경우, 적합한 세제 용액 (예를 들어, Triton-X 100)을 사용하거나 효소의 절단에 의해 세포막으로부터 방출될 수 있다. PRO10282의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 싸이클, 초음파 처리, 기계적 분쇄 또는 세포 용해제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 분쇄시킬 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 PRO10282를 정제하는 것이 바람 직할 수 있다. 적합한 정제 방법의 예로는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지, 예를 들어 DEAE 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 세파덱스 (Sephadex) G-75를 사용한 겔 여과, IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼, 및 PRO10282의 에피토프 태그 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이팅 컬럼이 있다. 다양한 단백질 정제 방법을 사용할 수 있고, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌(Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982))에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어 사용되는 생산 방법 및 생산되는 특정 PRO10282의 특성에 따라 결정될 것이다.
E. 종양 조직 및 세포주에서 PRO10282 ( Stra6 ) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 증폭
한 측면에서, 본 발명은 특정 암 세포에서 증폭된 유전자의 확인 및 특징규명을 기초로 한 것이다.
원핵생물 및 진핵생물의 게놈은 표면상 모순되는 두 요구조건하에 놓인다. 하나는 여러 세대를 거치면서 안정한 유전성이 보존되도록 유전 정보인 DNA를 원형대로 보존 및 증식시켜야 한다는 것이며, 다른 하나는 세포 또는 유기체가 환경 변화에 적응할 수 있어야 한다는 것이다. 적응 메카니즘으로는 유전 물질의 정성 또는 정량적 변화가 있다. 정성적 변화로는 코딩 서열이 변형되어 구조적 및(또는) 기능적으로 상이한 단백질을 생성시키는 DNA 돌연변이가 있다. 유전자 증폭은 완 전한 코딩 서열, 예를 들어 유전자의 실질적인 수가 증가하여 전사에 이용될 수 있는 주형의 수가 증가하고, 변역가능한 전사물 수의 증가 및 결국에는 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 풍부해진다.
유전자 증폭의 현상 및 그의 기저 메카니즘은 다수 원핵생물 및 진핵생물 배양 시스템에서 시험관내 연구하였다. 유전자의 증폭의 가장 전형적인 예로는 세포독성 약물인 메토트렉세이트(MTX)의 농도를 달리하여 함유하는 배지 중의 진핵세포 배양액을 포함한다. MTX는 폴산 유사체이며, 효소 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 블록킹하여 DNA 합성을 방해하는 물질이다. 낮은 농도의 MTX에 초기 노출되는 동안, 대부분의 세포(99.9%를 넘음)가 사멸된다. 소수의 세포만이 살아남고, 이들은 다량의 DFHR-RNA 및 단백질을 생성하여 증가되는 MTX 농도에서 생장할 수 있다. 이러한 과생성은 단일 DHFR 유전자의 증폭을 기초로 한다. 추가의 유전자 카피는 작은 형태의 세포외염색체 카피, 과잉 염색체(이중 음성 가닥) 또는 통합된 염색체 카피로 밝혀졌다.
유전자 증폭은 거의 대부분 세포독성 약물(세균의 경우에는 항생제이고, 원핵세포의 경우에는 화학요법제)에 대한 내성의 발현 및 종양성 형질전환 중에 일어난다. 자발적인 사건으로서 또는 바이러스 또는 화학 및 환경적 손상으로 인한 원핵세포의 형질전환은 통상 그 세포의 유전 물질의 변화와 관련되어 있다. 인간 악성질환에서 관찰되는 가장 통상적인 유전적 변화 중 하나는 p53 단백질의 돌연변이이다. p53은 세포가 정지기(G1)에서 복제기(S)로 전이되는 것을 조절하며, DNA가 손상된 상태에서는 이러한 전이가 저해된다. 즉, p53 돌연변이를 무력하게한 결과 로 주요한 것은 DNA 손상의 축적 및 증가, 즉 유전적 변화이다. 점 돌연변이외에, 종양성 세포에서 유전적 변화의 통상적인 유형은 증폭 및 전체적 구조 변형, 예를 들어 전좌이다.
DNA 서열의 증폭은 DHFR 실험계에서 예시된 바와 같이 특정 기능적 요구조건을 나타낼 수 있다. 따라서, 악성인 특정 종양유전자의 증폭은 악성 형질전환 및 형질전환된 표현형의 유지 과정에서 원인이 되는 상기 유전자의 역할에 대한 것이다. 이 가설은 최근 연구에 의해 지지되고 있다. 예를 들어, bcl -2 단백질은 특정 유형의 비-호지킨 림프종에서 증폭되는 것으로 밝혀졌다. 이 단백질은 아팝토시스를 억제하고, 종양성 세포를 점차적으로 축적시킨다. 생장 인자 수용체의 유전자 족에 속하는 부류는 각종 유형의 암에서 증폭되는 것으로 밝혀졌는데, 이는 상기 수용체의 과다 발현이 이용가능한 생장 인자의 양을 제한하는 것에 대해 종양성 세포를 덜 민감게 하는 것임을 시사하는 것이다. 예로 들 수 있는 것으로는 안드로겐 제거 요법 도중 재발된 전립선암에서 안드로겐의 증폭, 및 유방암에서 ERB2와 유사한 생장 인자 수용체의 증폭이 있다. 최근, 세포 주기 진행의 세포내 신호 및 조절에 관련된 유전자가 악성 형질전환 도중 증폭될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 것은 각종 상피 및 림프성 종양에서의 bcl -1 및 ras 유전자에 의해 예시된다.
초기 연구에서는 그러한 연구를 통해 악성 형질전환에 중요한 유전자를 확인할 수 있기 때문에 종양에서 증폭된 DNA 서열의 확인 가능성을 예시하였다. ERB2의 경우에는 형질전환 단백질이 신규하며 종양 치료 요법에 대한 특이적 표적이기 때문에 치료요법 견지에서의 실행가능성도 보여준다.
증폭된 게놈 서열을 증명하는 데 다수의 다양한 기술을 이용할 수 있다. 암 세포로부터 제조된 염색체 스프레드의 고전적인 세포유전적 분석은 전체적 구조 변형, 예를 들어, 전좌, 결실 및 역위를 확인하는 데 적합하다. 증폭된 게놈 영역은 많은 카피 수를 가지거나 염색체외 물질로 존재하는 경우에만 가시화될 수 있다. 세포유전학은 특정 종양과 특이적 염색체 변화가 일정한 관계에 있음을 보여준 최초의 기술이지만, 취급이 용이한 DNA 서열의 확인 및 단리에 부적합하다. 비교 게놈 혼성화(CGH)라는 보다 근래 개발된 기술은 종양에서 게놈 증폭의 만연된 현상을 예시하고 있다. 종양 및 정상 DNA는 분열 중기의 정상 세포에 동시에 혼성화되고, 전체 게놈은 종양에 높은 빈도수로 존재하는 DNA 서열을 영상 분석하여 스크리닝할 수 있다(국제 공개 93/18,186호; Gray et al., Radiation Res., 137:275-289[1994]). 스크리닝 방법으로서, 이러한 유형의 분석은 각종 인간 종양에 존재하는 많은 수의 재발생 앰플리콘(복제된 DNA 스트레치)을 밝혀낸다. CGH는 증폭된 DNA 스트레치를 확인하는 데 있어서 전형적인 세포유전적 분석보다 더 민감하지만, 표준 분자 유전적 분석으로 앰플리콘 내의 코딩 서열을 신속하게 확인 및 단리할 수는 없다.
유전자 앰플리콘을 검출하는 가장 민감한 방법은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR) 분석이다. 이 분석법은 매우 소량의 종양 DNA를 출발 물질로 사용하며, 매우 민감하고, 서열분석 등 추가로 분석할 수 있는 DNA를 제공하며, 고-처리량 분석에 적합하다.
상술한 분석법은 상호 배타적이지만, 종종 신생물내 증폭을 확인하는 데 조합하여 사용하기도 한다. 세포유전적 분석 및 CGH는 증폭된 영역을 위해 전체 게놈을 조사하는 방법을 대표하지만, PCR을 기초한 분석은 증폭된 영역내 코딩 서열, 즉 유전자의 최종 확인을 위해서는 가장 적합하다.
본 발명에 따라, 상기 유전자는 유방암, 폐암, 결장암, 전립선암, 뇌암, 간암, 신장암, 췌장암, 비장암, 흉선암, 정소암, 난소암, 자궁암 등을 비롯한 원발성 암, 종양 또는 종양 세포주로부터의 DNA와 건강한 공여자로부터 모아진 DNA를 비교하여 정량적 PCR(S. Gelmini et al., Clin. Chem., 43:752[1997])로 확인하였다. 정량적 PCR은 TaqMan 장치(ABI)를 이용하여 수행하였다. 유전자 특이적 프라이머 및 형광 프로브는 DNA의 코딩 서열을 기초로 설계하였다.
인간 폐 암종 세포주로는 모두 ARCC로 부터 입수할 수 있는 A549(SRCC768), Calu-1(SRCC769), Calu-6(SRCC770), H157(SRCC771), H441(SRCC772), H460(SRCC773), SKMES-1(SRC774), SW900(SRCC775), H522(SRCC832) 및 H810(SRCC833)이 있다. 원발성 인간 폐 종양 세포는 통상 선암종, 편평세포 암종, 대세포 암종, 비-소세포 암종, 소세포 암종 및 기관지 폐포 암종으로부터 유래되며, 그의 예로는 SRCC724(선암종, 약어 "AdenoCa")(LT1), SRCC725(편평세포 암종, 약어 "SqCCa")(LT1a), SRCC726(선암종)(LT2), SRCC727(선암종)(LT3), SRCC728(선암종)(LT4), SRCC729(편평세포 암종)(LT6), SRCC730(선암종/편평세포 암종)(LT7), SRCC731(선암종)(LT9), SRCC732(편평세포 암종(LT10), SRCC733(편평세포 암종)(LT11), SRCC734(선암종)(LT12), SRCC735(선암종/편평세포 암종)(LT13), SRCC736( 편평세포 암종)(LT15), SRCC737(편평세포 암종)(LT16), SRCC738(편평세포 암종)(LT17), SRCC739(편평세포 암종)(LT-18), SRCC740(편평세포 암종)(LT19), SRCC741(폐세포 암종, 약어 "LCCa")(LT21), SRCC811(선암종)(LT22), SRCC825(선암종)(LT8), SRCC886(선암종)(LT25), SRCC887(편평세포 암종)(LT26), SRCC888(선-BAC 암종)(LT27), SRCC889(편평세포 암종)(LT28), SRCC890(편평세포 암종)(LT29), SRCC891(선암종)(LT30), SRCC892(편평세포 암종((LT31), SRCC894(선암종)(LT33)이 있다. 또한, SRCC1125 [HF-000631], SRCC1127 [HF-000641], SRCC1129 [HF-000643], SRCC1133 [HF-000840], SRCC1135 [HF-000842], SRCC 1227 [HF-001291], SRCC 1229 [HF-001293], SRCC 1230 [HF-001294], SRCC 1231 [HF-001295], SRCC1232 [HF-001296], SRCC1233 [HF-001297], SRCC1235 [HF-001299] 및 SRCC1236 [HF-001300]로 표시되는 인간 폐 종양도 있다.
결장 암 세포주로는 예를 들어, ATCC 세포주 SW480(선암종, SRCC776), SW620(결장 선암종의 림프절 전이, SRCC777), Colo320(암종, SRCC778), HT29(선암종, SRCC779), HM7(UCSF 로버트 워렌 박사에게서 얻은 ATCC 결장 선암종 세포주의 뮤신 다생성 변이체, SRCC780), CaWiDr(선암종, SRCC781), HCT116(선암종, SRCC782), SKCO1(선암종, SRCC783), SW403(선암종, SRCC 784), LS174T(선암종, SRCC785), Colo205(선암종, SRCC828), HCT15(선암종, SRCC829), HCC2998(선암종, SRCC830) 및 KM12(선암종, SRCC831)가 있다. 원발성 결장 종양으로는 CT2(SRCC742), CT3(SRCC743), CT8(SRCC744), CT10(SRCC745), CT12(SRCC746), CT14(SRCC747), CT15(SRCC748), CT16(SRCC749), CT17(SRCC750), CT1(SRCC751), CT4(SRCC752), CT5(SRCC753), CT6(SRCC754), CT7(SRCC755), CT9(SRCC756), CT11(SRCC757), CT18(SRCC758), CT19(선암종, SRCC906), CT20(선암종, SRCC907), CT21(선암종, SRCC908), CT22(선암종, SRCC909), CT23(선암종, SRCC910), CT24(선암종, SRCC911), CT25(선암종, SRCC912), CT26(선암종, SRCC913), CT27(선암종, SRCC914), CT28(선암종, SRCC915), CT29(선암종, SRCC916), CT30(선암종, SRCC917), CT31(선암종, SRCC918), CT32(선암종, SRCC919), CT33(선암종, SRCC920), CT35(선암종, SRCC921) 및 CT36 (선암종, SRCC922)로 표시되는 결장 선암종이 있다. 또한, SRCC1051 [HF-000499], SRCC1052 [HF-000539], SRCC1053 [HF-000575], SRCC1054 [HF-000698], SRCC1142 [HF-000762], SRCC1144 [HF-000789], SRCC1146 [HF-000795] 및 SRCC1148 [HF-000811]로 표시되는 인간 결장암 중심부가 있다.
인간 유방암 암종 세포주로는 예를 들어, HBL100(SRCC759), MB435s(SRCC760), T47D(SRC761), MB468(SRCC763), MB175(SRCC763), MB361(SRCC764), BT20(SRCC765), MCF7(SRCC766) 및 SKBR3(SRCC767) 및 SRCC1057[HF-000545]로 표시되는 인간 유방 종양 중심부도 있다. 또한, SRCC1094, SRCC1095, SRCC1096, SRCC1097, SRCC1098, SRCC1099, SRCC1100 및 SRCC1101로 표시되는 인간 유방 종양, 및 SRCC893[LT32]으로 표시되는 인간 유방-전이-폐-NS 종양이 있다.
인간 신장 종양 중심부로는 SRCC989[HF-000611] 및 SRCC1014[HF-000613]이 있다.
인간 정소 종양 중심부로는 SRCC1001[HF-000733], 정소 종양 주변부로는 SRCC999[HF-000716]이 있다.
인간 부갑상선 종양으로는 SRCC1002[HF-00831] 및 SRCC1003[HF-000832]가 있다.
F. 조직 분포
본원의 유전자 증폭 분석 결과는 추가의 연구, 예를 들어, 각종 인간 조직에서의 mRNA 발현을 측정하여 입증할 수 있다.
상기한 바와 같이, 각종 조직에서의 유전자 증폭 및(또는) 유전자 발현은 본원에 제공된 서열을 기초로 하여 적절히 표지된 프로브를 사용하여 통상의 서던 블롯팅, 노던 블롯팅(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77:5201-5205[1980]), 도트 블롯팅(DNA 분석), 또는 원위치 혼성화로 측정하여 mRNA의 전사를 정량적으로 측정할 수 있다. 또한, DNA 이중체, RNA 이중체 및 DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 비롯한 특정 이중체를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다.
별법으로, 각종 조직에서의 유전자 발현은 세포 또는 조직 단면의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 생성물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양액 또는 체액의 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 샘플액의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 이들은 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연 서열 PRO10282 (Stra6) 폴리펩티드, 본원에서 제공되는 DNA 서열 기재의 합성 펩티드 또 는 PRO10282 DNA에 융합된 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외부 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다. 항체를 제조하는 일반 기술 및 노던 블롯팅 및 원위치 혼성화에 대한 특정 프로토콜은 하기에 제시하였다.
G. 염색체 맵핑
소정의 유전자의 증폭이 기능적으로 관련되어 있는 경우, 그 유전자는 종양 생존에 중요하지 않은 인접 게놈 영역보다 더 증폭된다. 이를 시험하기 위해, 유전자는 예를 들어, 방사선-하이브리드 분석으로 특정 염색체에 맵핑할 수 있다. 이어서, 증폭 정도는 확인된 지역 및 인접 게놈 영역에서 측정한다. 유전자가 맵핑된 게놈 영역에서의 선택적 또는 우선적 증폭은 관찰된 유전자 증폭이 종양 생장 또는 생존을 촉진시킬 수 있다는 가능성과 일치한다. 염색체 맵핑으로는 골격 및 에피센터 맵핑이 있다. 추가의 상세한 설명은 예를 들어, 문헌(Stewart et al., Genome Research, 7:422-433 (1997))을 참조한다.
H. 항체 결합 연구
유전자 증폭 연구 결과는 종양(암) 세포상의 Stra6 폴리펩티드의 발현을 항-PRO10282 항체가 억제하는 능력을 시험하는 항체 결합 연구로 더 입증할 수 있다. 항체의 예로는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종접합 항체가 있으며, 그 제조 방법은 아래에 기재될 것이다.
항체 결합 연구는 임의의 공지된 분석 방법, 예를 들어, 경쟁 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석 및 면역침전 분석으로 수행할 수 있다(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.. 147-158(CRS Press, Inc., 1987)).
경쟁 결합 분석은 제한된 양의 항체와 결합하는 데 있어서 시험 샘플 분석물과과 경쟁하는 표지된 표준 물질의 능력에 좌우된다. 시험 샘플 중 표적 단백질(종양 세포에서 증폭된 유전자에 의해 코딩됨)의 양은 항체에 결합하게 되는 표준 물질의 양에 반비례한다. 결합하게 되는 표준 물질의 양 측정을 용이하게 하기 위해, 항체를 경쟁 전 또는 후에 불용화시켜, 항체에 결합하는 표준 물질 및 분석물이 결합되지 않은 채로 남아있는 표준 물질 및 분석물로부터 쉽게 분리될 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
샌드위치 분석은 각각 검출할 단백질의 상이한 면역원 부분 또는 에피토프에 결합할 수 있는 두 항체를 사용하는 방법을 포함한다. 샌드위치 분석에서, 시험 샘플 분석물은 고상 지지체 상에 고정되는 제1 항체에 의해 결합되고, 그후 분석물에 제2 항체가 결합됨에 따라, 불용성 3부 결합체를 형성한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,376,110호를 참조한다. 제2 항체는 그 자체로 검출가능한 잔기로 표지(직접 샌드위치 분석)할 수 있거나, 또는 검출가능한 부분에 의해 표지된 항-이뮤노글로불린 항체를 사용하여 (간접 샌드위치 분석) 측정할 수 있다. 예를 들어, 샌드위치 분석의 한 유형은 ELISA 분석이며, 이 경우 검출가능한 잔기는 효소이다.
면역조직화학에서, 종양 샘플은 신선한 상태이거나 또는 냉동시킬 수 있으며, 또는 파라핀에 매몰시키거나 포르말린과 같은 방부제로 고정시킬 수 있다.
I. 세포 기재의 종양 분석
종양에 대한 세포 기재 분석 및 동물 모델은 유전자 증폭 분석에서 발견된 사항을 입증하며, 본원에서 확인된 유전자와 종양 세포 생장의 발달 및 발병기전 사이의 관계를 더 잘 이해하는 데 이용할 수 있다. 종양 세포 또는 암의 발생 및 발병기전에 있어서 본원에서 확인된 유전자 생성물의 역할은 본원에서 유전자를 증폭하기 위해 확인된 원발성 종양 세포 또는 세포를 사용하여 시험할 수 있다. 그러한 세포로는 예를 들어, 유방, 결장 및 폐 암세포주 및 상기 열거된 세포주가 있다.
또다른 연구에서, 특정 종양에 관련된 것으로 공지된 세포 유형의 세포는 본원에서의 cDNA로 형질감염시키고, cDNA가 과도한 생장을 유도해내는 능력을 분석한다. 적합한 세포로는 예를 들어, B104-1 세포주(neu 원시 종양유전자로 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주) 및 ras로 형질감염된 NIH-3T3 세포가 있으며, 이들은 목적하는 유전자로 형질감염될 수 있고, 종양원성 생장을 모니터링할 수 있다. 이어서, 상기 형질감염된 세포주는 형질전환된 세포의 생장에 세포정지 또는 세포독성 활성을 발휘하거나, 또는 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)을 발휘하는 폴리- 또는 모노클로날 항체 또는 항체 조성물의 능력을 시험하는 데 사용할 수 있다. 본원에서 확인된 코딩 서열로 형질감염된 세포는 추가로 암 치료를 위한 후보 약물을 확인하는 데 사용할 수 있다.
또한, 형질전환 동물(transgenic animal, 하기 기재된 바와 같음)의 종양으로부터 유래된 1차 배양액이 세포 기재의 분석에서 사용될 수 있지만, 안정한 세포주가 바람직하다. 형질전환 동물로부터 연속성 세포주를 유도해내는 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 (Small et al., Mol. Cell. Biol., 5:642-648 (1985)) 참조).
J. 동물 모델
잘 공지되어 있는 각종 동물 모델은 종양의 발생 및 발병기전에 있어서 본원에서 확인된 유전자의 역할을 더 이해하고, 항체를 비롯한 후보 치료제 및 소분자 길항제를 비롯한 천연 폴리펩티드의 다른 길항제의 효능을 시험하는 데 사용할 수 있다. 상기 모델의 생체내 특성으로 인해 특히 인간 환자에서의 반응을 예측할 수 있다. 종양 및 암(예를 들어, 유방암, 결장암, 전립선암, 폐암 등)의 동물 모델로는 비-재조합 및 재조합 (트랜스제닉) 동물이 있다. 비-재조합 동물로는 설치류 모델, 예를 들어 래트 모델이 있다. 상기 모델은 표준 기술, 예를 들어 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 신장 캡슐의 이식, 또는 오르토핀(orhtopin) 이식, 예를 들어, 결장 조직에 이식된 결장 암 세포를 사용하여 종양 세포를 동계 마우스에 도입하여 제조한다(예를 들어, 1997년 9월 18일에 공개된 PCT 국제 출원 공개 제97/33551호 참조).
종양유전자 연구에 가장 흔하게 연구되는 동물은 면역결핍된 마우스, 특히 누드 마우스(nude mouse)일 것이다. 과다증 및 결여증이 있는 누드 마우스가 인간 종양 이종이식에 대한 숙주로 성공적으로 작용한다는 관찰 결과로부터 누드 마우스가 본 발명의 목적을 위해 광범위하게 사용될 수 있음을 알 수 있다. 상동염색체 열성 nu 유전자는 많은 수의 누드 마우스의 각종 유사유전자형 종(예를 들어, ASW, A/He, AKB, BALB/c, B10, LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NAC, NZW, P, RIII 및 SJL)으로 도입하였다. 또한, 누드 마우스 이외에 유전적으로 면역 결함이 있는 광범한 범위의 다른 동물을 번식시켜 타가 이 식의 수용체로 사용하였다. 더 상세한 사항은 예를 들어, 문헌(The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven and B. Winograd, eds., CRC Press, Inc. 1991)을 참조한다.
상기 동물로 도입된 세포는 공지된 종양 또는 암 세포, 예를 들어 상기 열거된 종양 세포주라면 어떠한 것이든지, 예를 들어, B104-1 세포주(neu 원시 종양유전자로 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주); ras로 형질감염된 NIH-3T3 세포; Caco-2(ATCC HTB-37); 적당히 잘 분화된 등급 II 인간 결장 선암종 세포주, HT-29(ATCCHTB-38), 또는 종양 및 암으로부터 유래될 수 있다 . 종양 또는 암 세포의 샘플은 수술중인 환자로부터 얻고, 이를 냉동시켜 액체 질소중에 저장하는 방법을 포함하는 표준 조건으로 얻을 수 있다(Karmali et al, Br. J. Cancer, 48:689-696[1983]).
종양 세포는 각종 방법을 이용하여 동물, 예를 들어 누드 마우스로 도입할 수 있다. 마우스에서의 피하(s.c.) 공간은 종양 이식에 매우 적합한다. 종양은 고체 덩어리로서, 투관침을 사용한 침상 생체검사 또는 세포 현탁액으로서 이식할 수 있다. 고체 덩어리 또는 투관침 이식의 경우, 적합한 크기의 종양 조직 단편을 피하 공간으로 도입한다. 세포 현탁액은 원발성 종양 또는 안정한 종양 세포주로부터 새로 제조하고, 피하 주사한다. 종양 세포는 또한 경피하 이식체로서 주사할 수 있다. 이 영역에서, 접종물은 경피 연결 조직과 피하 조직의 하부 사이에 침착된다. 상기 문헌(Boven and Winograd(1991))을 참조한다.
유방암의 동물 모델은 근복적으로는 문헌(Drebin et al., PNAS USA, 83:9129-9133 (1986))에 기재된 바와 같이, 예를 들어 (neu 종양유전자가 최초로 단리된) 래트 신경모세포종 세포 또는 neu로 형질전환된 NIH-3T3 세포를 누드 마우스로 이식하여 제조할 수 있다.
이와 유사하게, 결장 암의 동물 모델은 결장 암 세포를 동물, 예를 들어 누드 마우스에 도입시켜 동물에 종양을 일으킨다. 누드 마우스내 인간 결장암의 동소이식 이식체 모델은, 예를 들어 문헌(Wang et al., Cancer Research, 54:4726-4728(1994) 및 Too et al., Cabcer Research, 55:681-684(1995))에 기재되어 있다. 이 모델은 AntiCancer Inc.(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 제품의 소위 메타마우스(METAMOUSE)를 기초로 한 것이다.
동물 모델에서 유도된 종양은 제거할 수 있으며 시험관내 배양할 수 있다. 이어서, 시험관내 배양액으로부터의 세포는 동물로 전달시킨다. 상기 종양은 추가의 시험 또는 약물 스크리닝을 위한 표적으로 이용될 수 있다. 또한, 그와 같은 전달로부터 유도된 종양은 단리할 수 있고, 전달 전 세포 및 1회 이상의 전달 후에 단리된 세포의 RNA는 관심있는 유전자의 차등적 발현에 대해 분석한다. 상기 전달 기술은 공지된 어떠한 종양 또는 암 세포에서든지 수행할 수 있다.
예를 들어, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 및 WEHI-164는 BALB/c 암컷 마우스(DeLeo et al., J. Exp. Med., 146:720[1997])의 화학적으로 유도된 섬유육종이며, 이는 각종 물질의 항-종양 활성을 연구하는 데 고도로 조절가능한 모델 시스템을 제공한다(Palladino et al., J. Immunol., 138L4023-4032 [1987]). 간단히, 종양 세포는 세포 배양액에서 시험관내 증식한다. 동물로 주사하기 전에 세포주를 세척 하고, 완충액에 약 10x106 내지 10x107 세포/㎖의 세포 밀도로 현탁시킨다. 이어서, 동물 모델은 세포 현탁액 10 내지 100 ㎕로 피하 주사하여 종양이 1 내지 3 주 후에 나타나도록 한다.
또한, 가장 완전한 수준으로 연구된 것 중 하나인 마우스의 루이스 폐(3 LL) 암종을 연구용 종양 모델로 사용할 수 있다. 종양 모델에서의 효능은 폐의 소세포 암종(SCCL)인 것으로 진단된 인간 환자의 치료에 있어서의 유익한 효과와 상관관계가 있다. 이 종양은 병에 걸린 마우스로부터의 종양 단편, 또는 배양액 중에 유지된 세포를 주사할 때 정상 마우스에 도입(Zupi et al., Br. J. Cancer, 41:suppl. 4:309 [1980])할 수 있고, 그와 같은 사실은 종양이 단일 세포를 주사하는 것으로부터도 시작할 수 있으며, 상당한 높은 비율의 감염 종양 세포가 생존할 수 있음을 입증하는 것이다. 이 종양 모델에 관한 추가의 정보는 문헌(Zacharski, Haemostasis, 16:300-320 [1986])을 참조한다.
종양이 이식된 동물 모델에서 시험 화합물의 효능을 평가하는 한 방식은 치료 전 및 후의 종양의 크기를 측정하는 것이다. 전형적으로, 이식된 종양의 크기는 슬라이드 캘리퍼스를 사용하여 2 내지 3 차원으로 측정하였다. 2 차원으로 제한된 측정값은 종양의 크기를 정확히 반영하지 않기 때문에, 통상 수학식을 이용하여 상응하는 체적으로 환산한다. 그러나, 종양 크기의 측정값은 매우 부정확하다. 후보 약물의 치료 효과는 치료로 유도된 생장의 지연 및 특이적 생장의 지연으로 더 양호하게 설명할 수 있다. 종양 생장의 설명에 있어서의 중요한 다른 변수는 종양이 2 배 체적으로 되기까지 소요되는 시간이다. 종양 생장의 계산 및 설명을 위해 문헌(Rygaard and Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds.,개 염기l, 1989, 301)에 보고된 바와 같이 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 그러나, 치료 후의 괴사 및 염증 반응은 적어도 초기에 실제적으로 종양 크기를 증가시킬 수 있음을 주의해야 한다. 따라서, 이러한 변화는 형태측정법 및 유동 세포계수법으로 조심스럽게 모니터링할 필요가 있다.
재조합(형질전환) 동물 모델은 형질전환 동물을 제조하기 위한 표준 기술을 이용하여 본원에서 확인된 유전자의 코딩부를 관심있는 동물의 게놈으로 유전공학적으로 도입할 수 있다. 형질전환 조작을 위한 표적으로 이용될 수 있는 동물로는 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 인간을 제외한 영장류, 예를 들어, 비비, 침팬지, 원숭이가 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 형질전이유전자(transgene)를 상기와 같은 동물로 도입하는 당업계에 공지된 기술로는 전핵 미세주입(microinjection)(Hoppe 및 Wanger, 미국 특허 제4,873,191호); 생식세포주로의 레트로바이러스 매개 유전자 전달(예를 들어, Van Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6148-615[1985]); 간세포를 사용한 배아의 유전자 표적화(Thompson et al., Cell, 56:313-321[1989]); 배아의 전기천공법(Lo, Mol. Cell Biol., 3:1803-1814[1983]); 정자 매개 유전자 전달(Lavitrano et al., Cell, 57:717-73[1989])이 있다. 자세한 검토를 위해서는, 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호를 참조한다
본 발명의 목적상, 형질전환 동물은 형질전이유전자를 그의 일부 세포에만 갖는 동물("모자이크 동물")이 포함된다. 형질전이유전자는 단일 형질전이유전자로서 또는 연쇄체(concatamer)로, 예를 들어 헤드-투-헤드(head-to-head) 또는 헤드-투-테일(head-to-tail) 텐덤으로 삽입될 수 있다. 특정 세포 유형으로의 형질전이유전자의 선택적 도입은 또한, 예를 들어 문헌(Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6232-6236[1992])의 기술로 수행할 수 있다.
형질전환 동물에서의 형질전이유전자의 발현은 표준 기술로 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 서던 블롯 분석 또는 PCR 증폭은 형질전이유전자를 입증하는 데 사용할 수 있다. 이어서, mRNA 발현 정도는 원위치 혼성화, 노던 블롯 분석, PCR 또는 면역세포화학 등의 기술을 이용하여 분석할 수 있다. 이 동물에 대해 종양 또는 암 발생의 징후를 더 조사할 수 있다.
또한, 본원에서 확인된 PRO10282 (Stra6) 폴리펩티드를 코딩하는 내생성 유전자와 동물의 배세포로 도입된 상기 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA 사이의 동형 재조합 결과 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 결함이 있거나 변형된 "넉 아웃(knock out)" 동물을 만들 수 있다. 예를 들어, PRO10282 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA는 확립된 기술에 따라 상기 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝하는 데 사용할 수 있다. 특정 PRO10282를 코딩하는 게놈 DNA의 일부를 결실시키거나 다른 유전자, 예를 들어 통합을 모니터링하는 데 사용될 수 있는 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자로 치환할 수 있다. 전형적으로, 수 킬로베이스(kb)의 비변형된 플랭킹(flanking) DNA(5' 및 3' 말단 모두에서)가 벡터에 포함되어 있다(동형 재조합 벡터에 대한 설명의 경우, 예를 들어 문헌(Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)) 참조). 벡터를 배아 줄기세포주로 (예를 들어, 전기천공법에 의해) 도입하고, 도입된 DNA가 내재 DNA와 함께 동형 재조합된 세포를 선별한다(예를 들어, 문헌(Li et al., Cell, 69:915(1992)). 이어서, 선별된 세포는 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트)의 배아세포로 주사하여 응집 키메라를 형성한다(예를 들어, 문헌(Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed.(IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152) 참조). 이어서, 키메라 배는 적합한 가임신 암컷 대리모 동물 및 배로 이식하여 "넉 아웃" 동물을 유도하였다. 생식 세포에 동형 재조합 DNA를 함유하는 자손은 표준 기술로 확인할 수 있고, 동물의 모든 세포가 동형 재조합 DNA를 함유하는 동물을 번식시키는 데 사용할 수 있다. 넉 아웃 동물은, 예를 들어 특정 병리학적 증상을 방어하는 능력 및 PRO10282 폴리펩티드의 부재로 인한 병리학적 증상의 발생을 특징으로 한다.
본원에서 확인된 폴리펩티드 및 다른 후보 약물에 특이적으로 결합하는 항체의 효능은 특발성 동물 종양의 치료에서도 시험할 수 있다. 그러한 연구에 적합한 표적은 고양이과 경구 편평세포 암종(SCC)이다. 고양이과 경구 SCC는 고양이종에서 보고된 경구 종양의 60% 이상을 차지하는 것으로서 가장 흔한 고양이 경구 악성인, 매우 침입성이 강한 악성 종양이다. 원발 부위로 거의 전이되지 않지만, 이러한 전이의 낮은 발생률은 상기 종양이 있는 고양이의 생존 시간이 짧다는 것을 반영한다. 이 종양은 통상 수술받지 못하는데, 그 주된 이유는 고양이과 구강의 해 부학적 구조 때문이다. 현재 이 종양에 대한 효과적인 치료는 없다. 연구에 들어가지 전에 각 고양이를 완전히 임상 조사(생체검사)하고, 컴퓨터 X선 단층 촬영(computed tomography, CT)으로 검사한다. 설하 경구 평판세포 종양이 있는 것으로 진단된 고양이는 이 연구에서 제외한다. 이러한 종양의 결과 혀가 마비될 수 있고, 치료를 하여 종양을 사멸시킬지라도, 동물은 음식을 섭취할 수 없다. 각 고양이를 장시간에 걸쳐 반복 치료한다. 치료 기간 동안 종양을 촬영하고, 각 수반 현상을 다시 점검한다. 치료 후, 각 고양이는 추가로 CT 촬영을 한다. CT 촬영 및 흉부 방사선 투과 사진으로 매 8 주 마다 평가한다. 그 데이타는 대조군과 비교한 생존율, 반응 및 독성의 차이를 평가한 것이다. 양성 반응은 종양 퇴행과, 바람직하게는 삶의 질 개선 및(또는) 수명의 연장을 요한다.
또한, 다른 특발성 동물 종양, 예를 들어 개, 고양이 및 비비의 섬유육종, 선암종, 림프종, 연골종, 평활근육종도 시험할 수 있다. 이들 포유동물 중 개 및 고양이의 선암종은 그 외양 및 행동이 인간과 매우 유사하기 때문에 연구 모델로 바람직하다. 그러나, 동물에서 상기 유형의 종양이 드물게 발생하기 때문에 그 모델을 사용하는 것이 제한을 받는다.
K. 후보 약물의 스크리닝 분석
후보 약물에 대한 스크리닝 분석은 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 결합하거나 그와 결합체를 이루거나, 또는 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포 단백질의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하도록 고안되었다. 그러한 스크리닝 분석은 화합물 라이브러리를 고처리량으로 스크리닝하여 특히 소분자 후보 약물을 확인하는 데 적합할 수 있는 분석을 포함한다. 예상되는 소분자로는 펩티드, 바람직하게는 가용성 펩티드, (폴리)펩티드-이뮤노글로불린 융합체와, 특히 폴리- 및 모노클로날 항체를 비롯한 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-유전형 항체 및 상기 항체 또는 항체 단편의 키메라 또는 인간화 형태와, 또한 인간 항체 및 항체 단편을 비롯한 항체를 포함하는 합성의 유기 또는 무기 화합물이 있다. 분석은 당업계에 그 특징이 잘 규명되어 있는 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역 분석 및 세포 기재의 분석을 비롯한 각종 방식으로 수행할 수 있다.
모든 분석법은 본원에서 확인된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 후보 약물이 이들 두 성분이 상호작용할 수 있는 충분한 시간 및 조건하에 접촉시키는 것을 필요로한다는 점에서 공통적이다.
결합 분석에서, 상호작용은 결합하는 것이며, 형성된 결합체는 반응 혼합물에서 단리 또는 검출할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 후보 약물은 고상 지지체, 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트상에 비공유결합적 부착으로 고정시킨다. 비공유결합적 부착은 일반적으로 고상 표면을 폴리펩티드의 용액으로 코딩하고 건조시켜 달성한다. 또한, 고정될 폴리펩티드에 특이적인 고정화 항체, 예를 들어 모노클로날 항체는 고상 표면에 폴리펩티드를 고정시키는 데 사용할 수 있다. 이 분석은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 고정되지 않은 성분을 고정된 성분, 예를 들어 고정된 성분을 갖는 코팅 표면에 가하여 수행한다. 반응이 완료되면, 비반응성 성분은 예를 들어, 세 척하여 제거하고, 고상 지지체 상에 고정된 결합체를 검출한다. 원래 고정되지 않은 성분은 검출가능한 표지를 갖기 때문에, 표면상에 고정된 표지가 검출되면 이는 결합체가 형성되었음을 가리키는 것이다. 원래 고정되지 않은 성분은 표지를 갖지 않기 때문에, 예를 들어 고정된 결합체에 특이적으로 결합하는 고정화 항체를 사용하여 결합체 형성을 검출할 수는 없다.
후보 화합물이 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 특정 PRO10282 폴리펩티드와 상호작용하거나 그에 결합하는 경우, 그 폴리펩티드와의 결합은 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 데 있어서 잘 공지된 방법으로 분석할 수 있다. 그러한 분석법으로는, 전통적인 연구법, 예를 들어 가교결합, 동시-면역침전, 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 동시 정제법이 있다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌(Chevary and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-95828(1991))에 개시된 바와 같은 필드(Field)와 그의 공동 연구자의 문헌(Fields and Song, Nature, 340:245-246(1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:9578-9582(1991))에 기재된 효모 기재의 유전자 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다. 많은 전사 활성화 인자, 예를 들어 효모 GAL4는 두 개의 물질적으로 독특한 조절 도메인으로 이루어져 있는데, 그 중 하나는 DNA 결합 도메인으로 작용하고, 다른 하나는 전사 활성 도메인으로 작용한다. 상기 문헌에 기재된 효모 발현 시스템(일반적으로, "투-하이브리드 시스템 (two-hybrid system)"으로 불림)은 그러한 특성을 이용하며, 2 종의 하이브리드 단백질, 즉 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA 결합 도메인에 융합되어 있는 단백질, 다른 하나는 후보 활성화 단백질이 활성 도메인에 융합되어 있는 단백질을 사용한다. GAL4-활성화 프로모터에 의한 조절하에 있는 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재생에 좌우된다. 상호작용하는 폴리펩티드를 함유하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 발색 기질로 검출할 수 있다. 투 하이브리드 기술을 이용하여 두 특이적 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 완전 키트(매치마커(MATCHMAKER), 상표명)는 Clontech로부터 구입할 수 있다. 이 시스템은 또한 특이적 단백질 상호작용에 관련된 단백질 도메인을 맵핑하는 것은 물론 그러한 상호작용에 결정적으로 중요한 아미노산 잔기를 정확하게 나타내는 데까지 확장하여 사용할 수 있다.
본원에서 확인된 PRO10282 코딩 유전자와 다른 세포내- 및 세포외 성분사이의 상호작용을 방해하는 화합물은 다음과 같이 시험할 수 있다. 통상, 반응 혼합물은 증폭된 유전자의 생성물 및 세포간- 또는 세포외 성분을 이들 생성물이 상호작용하고 결합할 수 있는 충분한 시간 및 조건하에 접촉시켜 제조한다. 결합을 억제하는 시험 화합물의 능력을 시험하기 위해, 반응을 시험 화합물의 존재 및 부재하에 실행한다. 또한, 제3 반응 혼합물에 위약을 가하여 양성 대조군으로 이용한다. 혼합물중에 존재하는 시험 화합물과 세포간- 또는 세포외 성분 사이의 결합(결합체 형성)은 상기한 바와 같이 모니터링한다. 시험 화합물을 함유하지 않는 반응 혼합물이 아닌 대조 반응물(들)에서 결합체가 형성되면, 이는 시험 화합물과 그의 반응 파트너 사이의 상호작용을 방해하는 것을 가리키는 것이다.
길항제를 시험하기 위해, 화합물의 특정 활성 및 화합물이 PRO10282 폴리펩 티드에 대한 길항제임을 가리키는 PRO10282 폴리펩티드 존재하에 관심있는 활성을 억제하는 화합물의 능력에 대해 스크리닝할 화합물과 함께 세포에 가할 수 있다. 또한, 길항제는 PRO10282 폴리펩티드 및 잠재적 길항제를 막 결합된 PRO10282 폴리펩티드 수용체와 경쟁적 억제 분석 조건하에 병용하여 검출할 수 있다. PRO10282 폴리펩티드는 방사능 등으로 표지하여 수용체에 결합된 상기 PRO10282 폴리펩티드 분자의 수로 잠재적 길항제의 효능을 측정하는 데 사용할 수 있다. 수용체를 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 많은 방법, 예를 들어 리간드 패닝 및 FACS 소팅(Coligan et al., Current Protocols in Immune., 1(2); Chapter 5(1991))으로 입증할 수 있다. 바람직하게는, 발현 클로닝은 PRO10282 폴리펩티드로부터 폴리아데닐화 RNA를 제조하고, 이 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리를 풀로 나누고, PRO10282 폴리펩티드에 반응하지 않은 COS 세포 또는 다른 세포를 형질감염시키는 데 사용하는 경우에 이용한다. 유리 슬라이드상에서 생장한 형질감염된 세포를 표지된 PRO10282 폴리펩티드에 노출시킨다. PRO10282 폴리펩티드는 요오드화 또는 부위 특이적 단백질 키나아제에 대한 인식 부위를 포함시키는 등 각종 수단으로 표지시킬 수 있다. 고정화 및 배양 후, 슬라이드는 방사능자동사진 분석을 한다. 양성 풀을 확인하여 서브풀을 제조한 후, 상호작용성 서브풀 제조 및 재스크리닝 방법을 이용하여 재형질감염시킴으로써 결국에는 추정 수용체를 코딩하는 단일 클론을 수득한다.
수용체 확인을 위한 또다른 연구법으로서, 표지된 PRO10282 폴리펩티드는 수용체 분자를 발현하는 세포막 또는 추출물 제제와 광친화적으로 결합될 수 있다. 가교결합된 물질은 PAGE로 해상하고, X-선 필름에 노출시킨다. 수용체를 함유하는 표지된 결합체는 절단하여 펩티드 단편으로 분해할 수 있고, 단백질 마이크로-시퀀싱(micro-sequencing)을 할 수 있다. 마이크로시퀀싱으로부터 얻은 아미노산 서열은 추정 수용체를 코딩하는 유전자를 입증하기 위한 cDNA 라이브러리의 스크리닝용 축퇴성(degenerate) 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 설계하는 데 사용할 수 있다.
길항제에 대한 다른 분석법에서, 수용체를 발현하는 포유동물 세포 또는 막 제제를 표지된 PRO10282 폴리펩티드와 후보 화합물 존재하에 인큐베이션시킨다. 이이서, 이러한 상호작용을 증진시키거나 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있다.
잠재적 길항제의 보다 구체적인 예로는 이뮤노글로불린과 PRO10282 폴리펩티드의 융합체에 결합하는 올리고뉴클레오티드와, 구체적으로는 폴리- 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-유전형 항체를 비롯한 항체, 또는 그러한 항체의 키메라 형태 또는 인간화 형태 또는 단편은 물론 인간 항체 및 항체 단편이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 잠재적 길항제는 단백질, 예를 들어 수용체를 인식하지만 효과를 부여하지 않아 PRO10282 폴리펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제하는 PRO10282 폴리펩티드의 돌연변이형과 밀접하게 관련되어 있다.
잠재적 다른 PRO10282 폴리펩티드 길항제는 안티센스 기술을 이용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 제작물이며, 여기서 안티센스 RNA 또는 DNA는 표적화된 mRNA에 혼성화됨으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하고, 단백질 번역을 억제한다. 안티센스 기술은 삼중 나선 형성 또는 안티센스 RNA 또는 DNA를 통한 유전자 발현을 억제하는 데 사용할 수 있으며, 이들 두 방법은 폴리뉴클레오티드의 DNA 또는 RNA에 대한 결합을 기초로 한다. 예를 들어, 본원에서의 성숙 PRO10282 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩부는 길이가 약 10 내지 40 bp인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계하는 데 사용된다. 이 DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관련된 유전자 영역에 상보적이도록 설계(삼중 나선에 대해서는 문헌[Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073(1979); Cooney et al., Science, 241:456(1988); Dervan et al., Science, 251:1360(1991))하여, 전사 및 PRO10282 폴리펩티드 생성을 억제시킨다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA에 혼성화되고, mRNA 분자가 PRO10282 폴리펩티드로 번역되는 것을 억제한다(안티센에 대해서는 문헌[Ojano, Neuochem., 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)] 참조). 상기된 올리고뉴클레오티드는 또한 세포로 전달되어 안티센스 RNA 또는 DNA가 PRO10282 폴리펩티드의 생성을 억제하도록 생체내 발현될 수 있게 된다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우, 번역 개시 부위로부터 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10에서 +10 위치 사이가 바람직하다.
안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 일반적으로 길이가 약 5개 염기 이상, 약 10개 염기 이상, 약 15개 염기 이상, 약 20개 염기 이상, 약 25개 염기 이상, 약 30개 염기 이상, 약 35개 염기 이상, 약 40개 염기 이상, 약 45개 염기 이상, 약 50 개 염기 이상, 약 55개 염기 이상, 약 60개 염기 이상, 약 65개 염기 이상, 약 70개 염기 이상, 약 75개 염기 이상, 약 80개 염기 이상, 약 85개 염기 이상, 약 90개 염기 이상, 약 95개 염기 이상, 약 100개 염기 이상, 또는 그 이상이다.
잠재적 길항제로는 PRO10282 폴리펩티드의 활성 부위, 수용체 결합 부위, 또는 생장 인자 또는 관련 결합 부위에 결합하여 PRO10282 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 소분자가 포함된다. 소분자의 예로는 작은 펩티드 또는 펩티드 유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드 및 합성 비-펩티딜 유기 또는 무기 화합물이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매화할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 그와 상보적인 표적 RNA와 서열-특이적 혼성화한 다음, 엔도뉴클레아제에 의해 절단함으로써 작용한다. 공지된 기술로 잠재적 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있었다. 보다 자세한 사항은, 예를 들어 문헌 (Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) 및 1997년 9월에 공개된 국제 공개 제97/33551호)을 참조한다.
전사를 억제하는 데 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일 가닥이어야하며, 데옥시뉴클레오티드로 이루어져야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 그가 호그스틴(Hoogsteen) 염기-짝짓기 룰을 통해 삼중나선 형성을 촉진하게끔 설계되어 있는데, 삼중나선 형성에는 일반적으로 이중쇄 중 한 가닥에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 있어야 한다. 보다 자세한 사항은, 예를 들어 문헌(상기 국제 공개 제97/33551호)을 참조한다.
상기 소분자들은 상기 기재된 임의의 한 가지 이상의 스크리닝 분석법 및(또는) 당업자에게 잘 알려진 임의의 다른 스크리닝 기술에 의해 확인할 수 있다.
L. PRO10282 ( Stra6 )의 용도
PRO10282 (Stra6) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (또는 그의 상보체)는 혼성화 프로브로서의 용도를 비롯한 분자생물학 분야, 염색체 및 유전자 맵핑 및 안티센스 RNA 및 DNA의 제조에서 다양한 용도를 갖는다. 또한, PRO10282 핵산은 본원에서 설명되는 재조합 기술에 의한 PRO10282 폴리펩티드의 제조에도 유용할 것이다.
전장 천연 서열 PRO10282 유전자 (서열 1) 또는 PRO19578 유전자 (서열 4), 또는 그의 단편은 도 1 (서열 1)에 개시된 PRO10282 코딩 서열 또는 도 6 (서열 4)에 개시된 PRO09578 코팅 서열과 목적하는 서열 동일성을 갖는 전장 PRO10282 또는 PRO19578 cDNA 또는 다른 cDNA (예를 들어 PRO10282의 자연 발생 변이체 또는 다른 종으로부터의 PRO10282를 코딩하는 유전자)를 단리하기 위한 cDNA 라이브러리에 대한 혼성화 프로브로서 사용할 수 있다. 임의로, 프로브의 길이는 약 20 내지 약 50개의 염기일 것이다. 혼성화 프로브는 서열 1의 천연 뉴클레오티드 서열의 새로운 영역(여기서, 이 영역은 불필요한 실험 없이도 결정할 수 있음)의 적어도 일부 또는 천연 PRO10282 또는 PRO19578 유전자의 프로모터, 인핸서 성분 및 인트론을 포함하는 게놈 서열로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 스크리닝 방법은 약 40 염기의 선택된 프로브를 합성하기 위해서 공지의 DNA 서열을 사용하여 PRO10282 또는 PRO19578 유전자의 코딩 영역을 단리하는 것을 포함할 것이다. 혼성화 프로브는 32P 또는 35S와 같은 방사성 뉴클레오티드 또는 아비딘/비오틴 커플링 시스템을 통하여 프로브에 커플링된 알칼리성 포스파타제와 같은 효소 표지를 비롯한 다양한 표지에 의해 표지할 수 있다. 본 발명의 PRO10282 또는 PRO19578 유전자와 상보적인 서열을 갖는 표지된 프로브를 사용하여 인간 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝함으로써 프로브가 혼성화하는 상기 라이브러리의 구성원을 결정할 수 있다. 혼성화 기술은 하기 실시예에서 보다 상세하게 설명된다.
본원에 개시된 임의의 EST 서열은 본원에서 설명된 방법을 사용하여 프로브로서 유사하게 사용될 수 있다.
다른 유용한 PRO10282 (Stra6) 핵산의 단편에는 표적 PRO10282 (Stra6) mRNA(센스) 또는 PRO10282 (Stra6) DNA(안티센스) 서열과 결합할 수 있는 단일-가닥 핵산 서열(RNA 또는 DNA)을 포함하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에 따른 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 PRO10282 (Stra6) DNA의 코딩 영역의 단편을 포함한다. 이 단편은 일반적으로 약 14개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 14개 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 해당 단백질을 코딩하는 cDNA 서열을 기초로 한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 유도하는 능력은 예를 들어 문헌 [Stein and Cohen(Cancer Res . 48:2659, 1988) 및 van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988)]에 기재되어 있다.
안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 서열의 결합은 이중쇄의 강화된 분해, 전사 또는 번역의 조기 종결을 비롯한 여러 방법 또는 다른 방법 중 하나에 의해 표적 서열의 전사 또는 번역을 차단하는 이중쇄를 형성시킨다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PRO10282 (Stra6) 단백질의 발현을 차단할 수 있다. 또한, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 당-포스포디에스테르 주쇄 (또는 다른 당결합, 예를 들어 WO 91/06629에 개시된 당결합)을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 이러한 당결합은 내부 뉴클레아제에 대한 내성이 있다. 내성이 있는 당결합을 갖는 이러한 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 안정(즉, 효소 분해에 대해 내성이 있음)하지만, 표적 뉴클레오티드 서열과 결합할 수 있는 서열 특이성을 보유한다.
센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 다른 예에는 유기 잔기, 예를 들어 WO 90/10048에 개시된 잔기 및 표적 핵산 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증가시키는 다른 잔기, 예를 들어 폴리-(L-라이신)과 공유적으로 연결되는 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 또한, 엘립티신과 같은 삽입제, 및 알킬화제 또는 금속 착물을 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 연결하여 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 결합 특이성을 변화시킬 수 있다.
예를 들어, CaPO4-매개 DNA 형질감염법, 전기천공법을 비롯한 임의의 유전자 전달 방법을 이용하거나 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스와 같은 유전자 전달 벡터를 사용함으로써 표적 핵산 서열을 포함하는 세포에 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 바람직한 한 방법으로는, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 적합한 레트로바이러스 벡터에 삽입한다. 표적 핵산 서열을 포함하는 세포는 생체내 또는 생체외에서 재조합 레트로바이러스 벡터와 접촉한다. 적합한 레트로바이러스 벡터에는 뮤린 레트로바이러스 M-MuLV, N2(M-MuLV로부터 유도된 레트로바이러스), 또는 DCT5A, DCT5B 및 DCT5C(WO 90/13641을 참조함)로 지칭되는 이중 카피 벡터로부터 유도된 벡터가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
또한, WO 91/04753에 개시된 바와 같이, 리간드 결합 분자와 결합체를 형성함으로써 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 적합한 리간드 결합 분자에는 세포 표면 수용체, 생장 인자, 다른 사이토킨, 또는 세포 표면 수용체와 결합하는 다른 리간드가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 리간드 결합 분자의 결합은, 리간드 결합 분자가 그의 상응하는 분자 또는 수용체와 결합하는 능력을 실제적으로 방해하지 않거나, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 결합체 형태의 세포내 진입을 차단하지 않는다.
별법으로, WO 90/10448에 개시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드-지질 결합체를 형성함으로써 표적 핵산 서열을 포함하는 세포내에 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 이러한 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드-지질 결합체는 바람직하게는 세포내에서 내재 리파제에 의해 분해된다.
또한, 상기 프로브를 PCR 기술에서 사용하여 밀접하게 관련된 PRO10282 코딩 서열의 확인을 위한 서열군을 생성시킬 수 있다.
또한, 천연 서열 PRO10282 (Stra6) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서 열을 사용하여 천연 서열 PRO10282 (Stra6)를 코딩하는 유전자의 맵핑 및 유전 질환이 있는 개체의 유전자 분석을 위한 혼성화 프로브를 제조할 수 있다. 본원에서 제공되는 뉴클레오티드 서열은 원위치 혼성화, 공지의 염색체 마커에 대한 연관성 분석 및 라이브러리를 사용한 혼성화 스크리닝과 같은 공지의 기술을 사용하여 염색체 및 염색체의 특정 영역에 맵핑시킬 수 있다.
PRO10282에 관한 코딩 서열이 다른 단백질(예를 들어, 여기서 PRO10282는 수용체임)과 결합하는 단백질을 코딩하는 경우, PRO10282는 이러한 결합 상호작용에 관여하는 다른 단백질 또는 분자를 확인하기 위한 분석에 사용될 수 있다. 이 방법에 의해, 수용체/리간드 결합 상호작용의 억제제도 확인할 수 있다. 또한, 상기 결합 상호작용에 관여하는 단백질을 사용하여 결합 상호작용의 펩티드 또는 소분자 억제제 또는 아고니스트를 스크리닝할 수 있다. 또한, 수용체 PRO10282 (Stra6)를 사용하여 유사한 리간드를 단리할 수 있다. 스크리닝 분석을 설계하여 천연 PRO10282 (Stra6) 또는 PRO10282에 결합하는 천연 폴리펩티드 ("PRO10282 결합 단백질")에 대한 수용체의 생물학적 활성을 모방하는 리드 화합물을 발견할 수 있다. 이러한 스크리닝 분석은 화학 물질 라이브러리에 대한 고처리 스크리닝 분석을 포함하며, 특히 소분자의 약물 후보물질을 확인하는 데 적합할 것이다. 고려되는 소분자는 합성 유기 또는 무기 화합물을 포함한다. 분석은 당업계에 특성화된 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역분석 및 세포 기재 분석을 비롯한 다양한 포맷으로 수행될 수 있다.
또한, PRO10282 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산을 사용하여 유용한 치료 제의 개발 및 스크리닝에 유용한 형질전환 동물 또는 "넉 아웃(knock out)" 동물을 생성시킬 수 있다. 형질전환(transgenic) 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)은 형질전이유전자(transgene)를 포함하는 세포를 갖는 동물인데, 형질전이유전자는 태아기 예를 들어 배아 단계에서 동물 또는 그 동물의 조상에 도입된다. 형질전이유전자는 세포의 게놈내에 삽입되는 DNA이며, 이 세포로부터 형질전환 동물이 발생한다. 한 실시양태에서, PRO10282를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 PRO10282를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있고, 이 게놈 서열을 사용하여 PRO10282를 코딩하는 DNA를 발현하는 세포를 포함하는 형질전환 동물을 생성시킬 수 있다. 특히, 마우스 또는 래트와 같은 형질전환 동물을 생성시키는 방법은 당업계에서 통상적인 방법이며, 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호 및 동 제4,870,009호에 기재되어 있다. 통상적으로, 조직 특이적 인핸서를 갖춘 PRO10282 형질전이유전자의 도입에는 특정 세포가 표적이 된다. 배아 단계에서 동물의 생식세포주에 도입된 PRO10282를 코딩하는 한 카피의 형질전이유전자를 포함하는 형질전환 동물을 사용하여 PRO10282를 코딩하는 DNA의 발현 증가 효과를 조사할 수 있다. 이러한 동물은 예를 들어 PRO10282 폴리펩티드의 과발현과 관련된 병리학적 증상으로부터 보호할 것으로 생각되는 시약에 대한 시험 동물로서 사용할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따라, 상기 시약으로 동물을 처리하면, 형질전이유전자를 보유하는 미처리 동물에 비해 병리학적 증상의 발생은 저하되며, 이는 상기 병리학적 증상에 대한 잠재적인 치료적 개입을 나타낸다.
별법으로, PRO10282의 비-인간 동족체를 사용하여 PRO10282를 코딩하는 내재 유전자와 이 동물의 배아 줄기세포에 도입된 PRO10282를 코딩하는 변형된 게놈 DNA 사이의 상동 재조합의 결과로서 PRO10282를 코딩하는 결함 또는 변형 유전자를 갖는 PRO10282 "넉 아웃" 동물을 만드는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, PRO10282를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 PRO10282를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. PRO10282를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실되거나, 삽입을 모니터하기 위해 사용될 수 있는 선택적 마커를 코딩하는 유전자와 같은 다른 유전자로 치환될 수 있다. 일반적으로, 수천개의 염기의 비변형된 플랭킹 DNA (5' 및 3' 말단 모두에서)가 벡터내에 포함된다 (예를 들어, 상동성 재조합 벡터에 대해서는 문헌 (Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987))을 참조함). 이 벡터는 (예를 들어, 전기천공법에 의해) 배아 줄기세포주에 도입되고, 도입된 DNA와 내재 DNA가 상동 재조합된 세포가 선택된다 (예를 들어, 문헌 (Li et al., Cell, 69:915 (1992))을 참조함). 선택된 세포는 이어서 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)의 배반포에 주입되어 응집 키메라를 형성한다 (예를 들어, 문헌(Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152)을 참조함). 이어서, 키메라 배를 적합한 가임신 대리모 동물에 이식하여 "넉 아웃" 동물을 발생시켰다. 생식 세포 내에 상동 재조합 DNA를 보유하는 자손을 표준 기술로 확인하고 그를 사용하여 동물의 모든 세포가 상동성 재조합 DNA를 함유하는 동물을 육종할 수 있다. 넉 아웃 동물은 예를 들어 특정 병리학적 증상에 대한 방어 능력 및 PRO10282 폴리펩티드의 부재로 인한 병리학적 증상의 발생을 특징으로 한다.
PRO10282 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 유전자요법에도 사용될 수 있다. 유전자요법에 사용될 경우, 유전자는 치료적으로 유효한 유전자 산물의 생체내 합성을 달성하기 위해, 예를 들면 결함있는 유전자를 대체하기 위해 세포내로 도입된다. "유전자요법"은 단일 치료에 의해 효과가 지속되는 전통적인 유전자요법 및 치료적으로 유효한 DNA 또는 mRNA의 단회 또는 반복 투여를 포함하는 유전자 치료제의 투여를 모두 포함한다. 안티센스 RNA 및 DNA는 생체내에서 특정 유전자의 발현을 차단하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 세포막을 통한 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 흡수는 한계가 있으므로, 이런 올리고뉴클레오티드의 세포내 농도가 낮음에도 불구하고, 이들이 세포내로 도입되면 억제제로 작용할 수 있음이 이미 밝혀져 있다 (Zamecnik et al., Proc . Natl . Acad ., Sci . USA 83, 4143-4146 (1986)). 이러한 올리고뉴클레오티드는 변형, 예를 들어 이들의 음으로 대전된 포스포디에스테르기를 비대전 기로 치환함으로써 올리고뉴클레오티드의 흡수를 증대시킬 수 있다.
핵산을 살아있는 세포로 도입하는 데 사용될 수 있는 다양한 기술이 있다. 이 기술은 핵산이 시험관내에서 배양된 세포로 전달되는가 또는 생체내에서 목적하는 숙주의 세포로 전달되는가에 따라 달라진다. 시험관내 포유동물 세포로 핵산을 전달하는 데 적합한 기술은 리포좀, 전기천공법, 미세주입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등을 포함한다. 생체내 유전자 전이 기술로 현재 바람직한 것으로는 바이러스 (통상적으로, 레트로바이러스) 벡터를 사용한 형질감염 및 바이러스 코트 단백질-리포좀 매개 형질감염 등이 있다 (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). 어떤 경우에는, 표적 세포를 표적화하는 활성제, 예컨대 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용되는 경우에는, 세포내이입에 관련된 세포 표면 막 단백질과 결합하는 단백질을 표적화에 사용하고(하거나) 흡수를 촉진시킬 수 있는데, 그러한 단백질의 예로는, 특정 세포 유형에 대한 친화성을 나타내는 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내부화를 경험하는 단백질에 대한 항체, 세포내 위치를 표적화하고 세포내 반감기를 증대시키는 단백질 등이 있다. 수용체 매개 세포내이입 기술은 예를 들면 문헌 (Wu et al., J. Biol . Chem . 262, 4429-4432 (1987), 및 Wagner et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 87, 3410-3414 (1990))에 기재되어 있다. 유전자 마킹 및 유전자요법 프로토콜의 검토를 위해서는, 문헌 (Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992))을 참조한다.
본원에 개시된 PRO10282 폴리펩티드는 단백질 전기영동을 위한 분자량 마커로 사용할 수도 있다.
본원에 개시된 PRO10282 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 그의 단편은 염색체의 확인에 유용하다. 이러한 면에서, 계속해서 새로운 염색체 마커를 확인할 필요가 있는데, 이는 실제 서열 데이타를 기초로 한 사용가능한 염색체 마킹 시약이 현재로서는 비교적 적기 때문이다. 본 발명의 PRO10282 핵산 분자 각각은 염색체 마커로 사용할 수 있다.
본 발명의 PRO10282 폴리펩티드 및 핵산 분자는 조직 타이핑(tissue typing) 에 사용할 수도 있으며, 여기서 본 발명의 PRO10282 폴리펩티드는 다른 조직에 비해 한 조직에서 특이하게 발현될 수 있다. PRO10282 핵산 분자는 PCR, 노던 분석, 서던 분석 및 웨스턴 분석용 프로브를 생성하는 데 사용될 것이다.
본원에 개시된 PRO10282 폴리펩티드를 치료제로 사용할 수도 있다. 공지된 방법에 따라 본 발명의 PRO10282 폴리펩티드를 제제화하여 제약학적으로 유용한 조성물을 제조할 수 있는데, 여기서 이 PRO10282 생성물은 제약학적으로 허용되는 담체 비이클과 배합된다. 치료 제형은 바람직한 순도를 갖는 활성 성분을 임의의 생리적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 동결건조 제형 또는 수용액 형태의 보관용으로 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량과 농도에서 환자에게 무독성이며, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산, 아스코르브산 등의 항산화제, 저분자량 (약 10 개 잔기 미만의) 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린 등의 단백질, 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 중합체, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신 등의 아미노산, 단당류, 이당류, 및 그밖에 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 탄수화물, EDTA 등의 킬레이트제, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당 알콜, 나트륨 등의 염-형성 반대이온, 및(또는) 트윈 (Tween, 등록상표), 플루로닉스 (Pluronics, 등록상표) 또는 PEG 등의 비이온성 계면활성제 등이 있다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이는 동결건조 및 재용해 (reconstitution) 전 또는 후에 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달 성된다.
본원의 치료 조성물은 일반적으로 멸균 출입구가 있는 용기, 예를 들면 정맥내 용액제 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알에 담을 수 있다.
투여 경로는 공지된 방법, 예를 들면 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내 또는 병소내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 또는 서방 시스템에 의한 방법이 있다.
본 발명의 제약 조성물의 투여량 및 목적하는 약물 농도는 계획된 특정 용도에 따라 변할 수 있다. 적합한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 당업자라면 잘 아는 것이다. 동물 실험 결과는 인간 치료에 효과적인 투여량을 결정하는 데 믿을만한 지침을 제공한다. 종간의 효과적인 투여량의 척도화는 문헌 (Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96)의 원리에 따라 수행될 수 있다.
PRO10282 폴리펩티드 또는 아고니스트 또는 그의 길항제가 생체내에서 사용되는 경우, 일반적인 투여량은 투여 경로에 따라 좌우되며, 포유동물의 체중 1 kg당 약 10 ng/일 내지 100 mg/일, 또는 바람직하게는 약 1 ㎍/일 내지 10 mg/일일 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌, 예를 들어 미국 특허 제4,657,760호, 동 제5,206,344호 또는 동 제5,225,212호에 제시되어 있다. 다른 치료 화합물 및 다른 질환에 대해서는 다른 제제가 효과적일 수 있으며, 한가지 기관 또는 조직을 표적으로 하는 투여는 예를 들어 또다른 기관 또는 조직에 대한 투여와는 다른 방식으로의 전달을 필요로할 것으로 예상된다.
PRO10282 폴리펩티드의 서방성 투여가 PRO10282 폴리펩티드의 투여를 필요로 하는 특정 질환 또는 질환의 치료에 적합한 방출 특성을 갖는 제제에 요구되는 경우, PRO10282 폴리펩티드의 마이크로캡슐화가 고려된다. 지연 방출을 위한 재조합 단백질의 마이크로캡슐화는 인간 성장 호르몬 (rhGH), 인터페론 (rhIFN), 인터루킨-2 및 MN rgp120을 사용하여 성공적으로 수행되었다 (Johnson et al., Nat . Med ., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed . Ther ., 27:1221-1223(1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758(1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design : The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462: WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399 및 미국 특허 제5,654,010호).
상기 단백질의 서방성 제제는 그의 생체적합성 및 광범위한 생분해성 특성으로 인해, 폴리-락트산-공-글리콜산 (PLGA) 중합체를 사용하여 개발되었다. PLGA의 분해 산물인 락트산 및 글리콜산은 인체내에서 신속하게 소실될 수 있다. 또한, 상기 중합체의 분해능은 그의 분자량 및 조성에 따라 수개월 내지 수년으로 조정될 수 있다 (문헌 [Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1- 41]).
본 발명은 PRO10282 폴리펩티드를 모방한 화합물(아고니스트)을 확인하고 PRO10282 폴리펩티드의 영향을 방해하기 위한 화합물(길항제)을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 길항제 약물 후보에 관한 스크리닝 분석법을 설계하여 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 PRO10282 폴리펩티드와 결합하거나 결합체를 이루거나, 또는 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포내 단백질의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하였다. 이러한 스크리닝 분석법은 화학 물질 라이브러리에 대해 고처리 스크리닝할 수 있는 분석법을 포함하며, 이는 소분자 약물 후보를 확인하는 데 특히 적합할 것이다.
상기 분석법은 당업계에서 특성화된 단백질-단백질 결합 분석법, 생화학적 스크리닝 분석법, 면역분석법 및 세포-기재 분석법을 비롯한 다양한 포맷으로 수행할 수 있다.
길항제에 관한 모든 분석법의 공통점은 상호작용하기에 충분한 조건 및 시간 동안 약물 후보와 본원에서 확인된 핵산에 의해 코딩된 PRO10282 폴리펩티드의 접촉을 요구한다는 점이다.
결합 분석법에서, 상호작용은 결합하는 것이며, 형성된 결합체는 단리하거나 반응 혼합물에서 검출할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 PRO10282 폴리펩티드 또는 약물 후보는 공유적 부착 또는 비공유적 부착에 의해 고상, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트에 고정된다. 비공유적 부착은 일반적으로 고체 표면을 PRO10282 폴리펩티드 용액으로 코팅하고 건조함으로써 달성된다. 별법으로, 고정화 항체, 예를 들어 고정된 PRO10282 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 그를 고체 표면에 앵커링할 수 있다. 이 분석은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 비고정 성분을 고정 성분, 예를 들어 앵커링된 성분을 포함하는 코딩 표면에 부가함으로써 수행된다. 반응이 종결되었을 때, 반응하지 않은 성분은 예를 들어 세척에 의해 제거되며, 고체 표면에 앵커링된 결합체는 검출된다. 본래 고정되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 운반하는 경우, 표면에 고정된 표지의 검출은 결합체 형성반응이 일어났음을 나타낸다. 본래 고정되지 않은 성분이 표지를 운반하지 않는 경우, 예를 들어 고정된 결합체와 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 결합체 형성반응을 검출할 수 있다.
후보 화합물이 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 특정 PRO10282 폴리펩티드와 상호작용하지만 결합하지 않는 경우, 후보 화합물과 이 폴리펩티드의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 잘 알려진 방법에 의해 분석할 수 있다. 이러한 분석법에는 통상의 방법, 예를 들어 가교형성법, 공동면역침전법, 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 공동정제법이 포함된다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 [Fields and co-workers(Fields and Song, Nature ( London ), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 88:9578-9582 (1991)) as disclosed by Chevray and Nathans, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:5789-5793 (1991)]에 기재된 효모-기재 유전자 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다. 많은 전사 활성자, 예를 들어 효모 GAL4는 물리적으로 구별되는 2개의 모듈형 도메인으로 이루어져 있는데, 한 도메인은 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 나머지 한 도메인은 전사-활성 도메인으로 작용한다. 상기 간행물에 기재된 효모 발현 시스템(일반적으로, "2-하이브리드 시스템"으로 불림)는 이러한 특성을 이용하며, 2-하이브리드 단백질을 사용하는데, 이 중 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인과 융합된 것이며, 다른 하나는 후보 활성 단백질이 활성 도메인과 융합된 것이다. GAL4-활성 프로모터의 조절하에 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재생에 따라 좌우된다. 상호작용 폴리펩티드를 포함하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 발색 기질을 사용하여 검출한다. 2-하이브리드 기술을 사용하여 2종의 특이적인 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 완성형 키트(MATCHMAKER, 등록상표)는 클론테크사에서 구입할 수 있다. 또한, 이 시스템을 확대 적용하여 특이적 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인을 맵핑할 수 있을뿐 아니라, 이러한 상호작용에 결정적인 아미노산 잔기의 위치를 정확하게 나타낼 수 있다.
*하기의 방법으로, 본원에서 확인된 PRO10282 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 방해하는 화합물을 시험할 수 있다. PRO10282 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 산물과 세포내 또는 세포외 성분을 포함하는 반응 혼합물을 두 생성물의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건 및 시간하에 제조하였다. 결합을 억제하는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해, 시험 화합물의 존재 및 부재 하에 반응을 수행하였다. 또한, 양성 대조구 역할을 하는 제3의 반응 혼합물에 위약을 첨가할 수 있다. 혼합물에 존재하는 시험 화합물과 세포 내 또는 세포외 성분사이의 결합(결합체 형성)을 상기 기재된 바와 같이 모니터링하였다. 대조 반응물에서는 결합체가 형성되었으나 시험 화합물을 포함하는 반응 혼합물에서 결합체가 형성되지 않은 것은 시험 화합물이 시험 화합물과 그의 반응 대응물의 상호작용을 방해한다는 사실을 나타낸다.
길항제를 분석하기 위해, PRO10282 폴리펩티드를 화합물과 함께 세포에 첨가하여 특정 활성을 스크리닝할 수 있었으며, PRO10282 폴리펩티드의 존재하에 목적 활성을 억제하는 화합물의 능력은 이 화합물이 PRO10282 폴리펩티드에 대한 길항제임을 나타내었다. 별법으로, 경쟁 억제 분석을 위해 적절한 조건하에 PRO10282 폴리펩티드 및 잠재적인 길항제를 막-결합 PRO10282 폴리펩티드 수용체 또는 재조합 수용체와 함께 결합시킴으로써 길항제를 검출할 수 있었다. PRO10282 폴리펩티드를 예를 들어 방사 활성 동위원소로 표지하여, 수용체와 결합하는 PRO10282 폴리펩티드 분자의 수를 이용하여 잠재적인 길항제의 효과를 측정할 수 있었다. 당업자에게 공지된 여러 방법, 예를 들어 리간드 패닝법 및 FACS 분류법 (Coligan et al., Current Protocols in Immun ., 1(2): Chapter 5 (1991))에 의해 수용체를 코딩하는 유전자를 확인할 수 있었다. 바람직하게는, 발현 클로닝법이 사용되는데, 여기서 폴리아데닐화 RNA는 PRO10282 폴리펩티드에 대해 반응성을 나타내는 세포로부터 제조되며, 이 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리는 풀로 나누어지고 PRO10282 폴리펩티드에 대해 비반응성인 COS 세포 또는 다른 세포를 형질감염시키는 데 사용된다. 유리 슬라이드에서 증식하는 형질감염된 세포는 표지된 PRO10282 폴리펩티드에 노출된다. 요오드화 또는 부위-특이적 단백질 키나제에 관한 인식 부위의 도 입을 비롯한 여러 방법에 의해 PRO10282 폴리펩티드를 표지할 수 있었다. 고정하고 인큐베이션한 다음, 슬라이드를 방사선자동사진법으로 분석하였다. 양성 풀을 확인하여 서브-풀을 제조하고, 상호작용 서브-풀링 및 재스크리닝 방법을 이용하여 재형질감염시킴으로써, 결국 추정 수용체를 코딩하는 단일 클론을 얻었다.
수용체를 확인하는 다른 방법으로, 표지된 PRO10282 폴리펩티드를 세포막 또는 수용체 분자를 발현시키는 추출물 시료와 함께 광친화적으로 연결할 수 있었다. PAGE에 의해 가교 물질을 분석하고 X-선 필름에 노출시켰다. 수용체를 포함하는 표지 결합체를 절단하고 펩티드 단편으로 분해하여 단백질 마이크로-시퀀싱처리할 수 있었다. 마이크로-시퀀싱으로부터 얻어진 아미노산 서열을 사용하여 축퇴 올리고뉴클레오티드 프로브 한 셋트를 설계함으로써 cDNA 라이브러리를 스크리닝하고 추정 수용체를 코딩하는 유전자를 확인할 수 있었다.
다른 길항제 분석 방법으로, 후보 화합물의 존재하에 수용체를 발현하는 포유동물의 세포 또는 막 시료를 표지된 PRO10282 폴리펩티드와 함께 인큐베이션하였다. 그 후에, 상기 상호작용을 강화 또는 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있었다.
잠재적인 길항제의 보다 구체적인 예에는 이뮤노글로불린과 PRO10282 폴리펩티드의 융합체와 결합하는 올리고뉴클레오티드, 및 특히 폴리- 및 모노클로날 항체, 및 항체 단편, 측쇄 항체, 항-유전자형 항체, 및 이러한 항체 또는 그의 단편의 키메라 형태 또는 인간화 형태, 및 인간 항체 및 항체 단편을 비롯한 항체가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 또는, 잠재적인 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어 수용체를 인식하지만 영향을 주지는 않으며, 따라서 PRO10282 폴리펩티드의 작용을 경쟁적으로 억제하는 PRO10282 폴리펩티드의 변이된 형태일 수 있다.
또다른 잠재적인 PRO10282 폴리펩티드 길항제는 안티센스 기술을 사용하여 제조한 안티센스 RNA 또는 DNA 제작물인데, 여기서 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적 mRNA와 혼성화하여 단백질 번역을 방해함으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술을 사용하여 삼중나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통한 유전자 발현을 조절할 수 있는데, 이 방법들은 모두 폴리뉴클레오티드와 DNA 또는 RNA의 결합을 기초로 한다. 예를 들어, 본원에서 성숙 PRO10282 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5'코딩 부분을 사용하여 염기쌍 약 10 내지 40개 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계한다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관여하는 유전자 영역에 대해 상보적이게끔 설계하여(삼중나선-문헌(Lee et al., Nucl . Acids Res ., 6:3073 (1979); Cooney et al,, Science, 241:456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991))을 참조함) 전사 및 PRO10282 폴리펩티드의 생산을 방해하였다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 그의 mRNA와 혼성화하여 mRNA 분자의 PRO10282 폴리펩티드로의 번역을 차단하였다 (antisense - Okano, Neurochem ., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)). 또한, 상기 기재된 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하여 안티센스 RNA 또는 DNA를 생체내에서 발현시킴으로써 PRO10282 폴리펩티드의 생산을 억제할 수 있었다. 안티센스 DNA가 사용되는 경우, 전사-개시 부위, 예를 들 어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 위치와 +10 위치 사이로부터 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하였다.
잠재적인 길항제에는 활성 부위, 수용체 결합 부위, 또는 PRO10282 폴리펩티드의 생장 인자 또는 다른 관련 결합 부위와 결합하여 PRO10282 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 소분자가 포함된다. 소분자의 예에는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성 비펩티딜 유기 또는 무기 화합물이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
리보자임은 RNA의 특이적인 절단을 촉매할 수 있는 효소 RNA 분자이다. 리보자임은 그와 상보적인 표적 RNA와 서열-특이적 혼성화한 다음, 엔도뉴클레아제에 의해 절단됨으로써 작용한다. 공지된 기술로 잠재적인 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있었다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌 (Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) 및 PCT publication No. WO 97/33551(published September 18, 1997))을 참조한다.
전사를 억제하는 데 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일-가닥이어야하며, 데옥시뉴클레오티드로 이루어져야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 그가 Hoogsteen 염기-짝짓기 룰을 통해 삼중나선 형성을 촉진하게끔 설계되어 있는데, 삼중나선 형성에는 일반적으로 이중쇄 중 한 쇄에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 있어야 한다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌 (PCT publication No. WO 97/33551, supra.)을 참조한다.
상기 소분자들은 상기 기재된 임의의 한가지 이상의 스크리닝 분석법 및(또 는) 당업자에게 잘 알려진 임의의 다른 스크리닝 기술에 의해 확인할 수 있다.
뮤린 레티노산 유도 유전자인 Stra6는 고환내 세르톨리 세포 (Sertoli cell)에서 정자생성 주기-의존성 발현을 나타낸다. Stra6과의 서열 상동성을 기초로, 본원에 개시된 PRO10282 폴리펩티드는 정자생성에서 중요한 역할을 할 수 있으므로 생식능 치료에서 잠재적인 용도를 갖는다. 현재 PRO10282 폴리펩티드의 발현은 그의 뮤린 상동체 (homolog)의 발현과 유사하게 레티노산에 대한 반응으로 유도된다고 생각된다. 따라서, 혼성화에 의한 mRNA 수준에서 또는 면역학적 분석에 의한 단백질 수준에서 PRO10282의 발현은 시험 화합물이 다양한 레티노이드 반응 질환의 치료에 대한 잠재력을 가지고 있는가를 확인하는 데 사용될 수 있다. 치료 표적으로 예상되는 질환의 유형들은 건선, 여드름, 부전증 (dysplasias), 암 및 자가면역 질환들을 포함한다. 예상되는 부전증의 종류는 상피 조직의 전암성 병변, 예를 들어 구강 백반, 경부, 후두 및 기관지의 부전증을 포함한다. 예상되는 암의 종류는 결장 (선암), 폐 (암종 선암), 피부, 두경부, 자궁, 유방 및 전립선의 암종을 포함한다. 예상되는 자가면역 질환의 종류는 류마티스성 관절염, 골관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 심상성 천포창 및 낙엽성 천포창을 포함한다. 이러한 질환 및 증상을 치료하기 위한 잠재적인 치료법은 PRO10282의 항체 및 길항제 (소분자들을 포함)이다.
M. 종양의 치료용 조성물 및 치료 방법
본원에서 확인된 유전자의 증폭과 관련된 종양의 치료에 유용한 조성물로는 표적 유전자 생성물의 발현 및(또는) 활성을 억제하는 항체, 유기 및 무기 소분자, 펩티드, 포스포펩티드, 안티센스 및 리보자임 분자, 삼중나선 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적 mRNA에 혼성화되어 mRNA의 번역을 직접 차단하고, 단백질로의 번역을 억제한다. 안티센스 DNA가 사용되는 경우, 번역 개시 부위, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 위치와 +10 위치 사이로부터 유래된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.
리보자임은 RNA의 특이적인 절단을 촉매할 수 있는 효소 RNA 분자이다. 리보자임은 그와 상보적인 표적 RNA와 서열-특이적 혼성화한 다음, 엔도뉴클레아제에 의해 절단됨으로써 작용한다. 공지된 기술로 잠재적인 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있었다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌 (Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) 및 PCT publication No. WO 97/33551(published September 18, 1997))을 참조한다.
전사를 억제하는 데 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일-가닥이어야하며, 데옥시뉴클레오티드로 이루어져야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 그가 Hoogsteen 염기-짝짓기 룰을 통해 삼중나선 형성을 촉진하게끔 설계되어 있는데, 삼중나선 형성에는 일반적으로 이중쇄 중 한 쇄에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 있어야 한다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌 (PCT publication No. WO 97/33551, supra.)을 참조한다.
상기 소분자들은 상기 기재된 임의의 한가지 이상의 스크리닝 분석법 및(또는) 당업자에게 잘 알려진 임의의 다른 스크리닝 기술에 의해 확인할 수 있다.
N. 항- PRO10282 (항- Stra6 ) 항체
본 발명은 추가로 항-PRO10282 (항-Stra6) 항체를 제공한다. 항체의 예는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 헤테로컨쥬게이트 (heteroconjugate) 항체를 포함한다.
1. 폴리클로날 항체
항-PRO10282 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 예를 들어 면역화제 및 필요한 경우 보조제를 1회 이상 주사함으로써 포유동물에서 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 면역화제 및(또는) 보조제는 피하 또는 복강내 수회 주사하는 방법으로 포유동물에 주사될 것이다. 면역화제는 PRO10282 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역처리되는 포유동물에서 면역원성인 것으로 알려진 단백질에 면역화제를 결합시키는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예에는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 보조제의 예는 프로인트 완전 면역보강제 및 MPL-TDM 면역보강제 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역처리 방법은 불필요한 실험 없이도 당업계의 숙련가에 의해 선택될 수 있다.
2. 모노클로날 항체
항-PRO10282 항체는 별법으로 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기재되 바와 같은 하이 브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 통상적으로 면역화제로 면역처리하여 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역처리할 수 있다.
면역화제는 일반적으로 PRO10282 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인체 기원의 세포를 원하는 경우 말초 혈액 림프구 ("PBL")가 사용되나, 인간 이외의 포유동물 공급원을 원하는 경우에는 비장 세포 또는 임프절 세포가 사용된다. 이어서, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 림프구와 불멸화된 세포주를 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [Goding, Monoclonal Antibodies : Principle and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. 불멸화된 세포주는 대체로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인체 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화된 세포의 증식 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양시킬 수 있다. 예를 들면, 모세포가 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배양 배지 ("HAT 배지")는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 증식을 억제시킨다.
바람직한 불멸화된 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 생산을 높은 수준으로 안정하게 유지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감 수성이 있는 것이다. 보다 바람직한 불멸화된 세포주는 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 마나사스)으로부터 입수가능한 뮤린 골수종 세포주이다. 또한, 인간 골수종 세포주 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기술되었다 [Kozbor, J. Immunol ., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].
하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지를 PRO10282에 대해 유도된 모노클로날 항체의 존재에 대해 분석할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전법에 의해, 또는 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡수 분석법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석에 의해 측정하였다. 이러한 기술 및 분석은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 스카트카르트(Scatchard) 분석 (Munson and Pollard, Anal . Biochem ., 107:220 (1980))에 의해 측정할 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석법에 의해 클론을 서브클로닝시키고 표준 방법 [Goding, 상기문헌]에 의해 배양시켰다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지에는 예를 들면, 둘베코스 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또는, 하이브리도마 세포는 포유동물에서 복수종양으로서 생체내 배양시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상의 이뮤노글로불린 정제 방법에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 및 정제시킬 수 있다.
또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법을 이용하여 (예를 들면, 뮤린 동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 쉽게 단리하여 시퀀싱할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로서의 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 백터 내로 넣은 다음, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 다른 방법으로는 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 발현 벡터를 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 생성시킬 수 있다. 또한, DNA는 예를 들어 상동성을 나타내는 뮤린 동물 서열 부위를 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환하거나 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., 상기 문헌), 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다. 그러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드로 본 발명의 항체의 불변 도메인을 치환하거나, 본 발명의 항체의 한 항체-결합 부위의 가변 도메인을 치환하여 키메라 2가 항체를 생성시킬 수 있다.
항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 한 방법은 이뮤노글로불린 경쇄 및 변형 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄 가교결합을 방해하기 위해서 중쇄는 일반적으로 Fc 영역의 임의의 지점에서 말단이 절단된다. 또는, 관련 시스테인 잔기는 가교결합을 방해하기 위해서 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실된다.
또한, 시험관내 방법도 1가 항체의 제조에 적합하다. 항체 단편, 특히 Fab 단편을 제조하기 위한 항체의 분해는 당업계에 통상적으로 알려진 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
3. 인간 항체 및 인간화 항체
또한, 본 발명의 항-PRO10282 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 비-인간(예를 들어, 뮤린 동물) 항체의 인간화 형태는 키메라 이뮤노글로불린, 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 이뮤노글로불린쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 소서열)이다. 인간화 항체는, 수용체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종 (공여 항체)의 CDR로부터의 잔기로 치환시킨 인간 이뮤노글로불린 (수용 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 골격 잔기는 대응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체에서도 또는 도입되는 CDR 또는 골격 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인 간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 영역에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 이뮤노글로불린 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr . Op . Struct . Biol . 2:593-596 (1992)].
비인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 흔히 "임포트(import)" 잔기로 언급되며, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)]에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 실질적으로 보다 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비-인간 종 유래의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.
인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯한 당업계에 공지된 여러 기술을 사용하여 제조할 수도 있다 [Hoogenboom and Winter., J. Mol . Biol ., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol . Bio ., 222: 581 (1991)]. 또한, 코울 등 및 보에르너 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용할 수 있다 (Cole et al., Monoclonal 항체 and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol ., 147(1):86-95 (1991)]. 마찬가지로, 유전자도입 동물, 예를 들어 마우스에 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 도입함으로써 인간 항체를 제조할 수 있는데, 여기서 내재 이뮤노글로불린 유전자는 부분적으로 또는 완전히 불활성화된다. 항원투여 후에, 인간 항체 생산이 관찰되었는데, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레파토리를 비롯한 모든 점에서 인간에서 관찰되는 항체와 매우 유사하였다. 상기 사항은 예를 들어 문헌 (미국 특허 제5,545,807호, 동 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 5,661,016호) 및 과학 간행물 (Marks et al., Bio / Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856-859 (1994), Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern . Rev . Immunol. 13 65-93 (1995))에 기재되어 있다.
4. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 2종 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 이 경우, 결합 특이성 중의 하 나는 PRO10282에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 바람직하게는 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중 특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄/경쇄-중쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기에서, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [Millstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10가지 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행된다. 유사한 방법이 WO 제93/08829호(1993년 5월 13일에 공개됨) 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.
원하는 결합 특이성을 갖는 항체의 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 연결시킬 수 있다. 이 연결은 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인과의 연결이 바람직하다. 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체, 및 원한다면 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별도의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체에 동시 형질감염시킨다. 이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은 예를 들면, 문헌[Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121: 210(1986)]을 참조한다.
WO 96/27011에 개시된 다른 방법에 따르면, 한쌍의 항체 분자 사이의 공유영역을 조작하여 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 바람직한 공유영역은 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 공유영역으로부터 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체하였다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보충의 "공동(cavity)"을 제2 항체 분자의 공유영역에 생성시켰다. 이는 이종이량체의 수율을 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물의 수율 이상으로 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조할 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 (Brennan et al., Science 229:81 (1985))에는 무손상 항체를 단백질 가수분해로 잘라서 F(ab')2 단편을 생성하는 방법이 기재되어 있다. 이러한 단편은 디티올 착화제인 소듐 아르세니트의 존재하에 환원되어 인접한 디티올을 안정화하고 분자내 디술피드 형성을 방해한다. 그 후에, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환시켰다. 그 후에, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민을 사용하여 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시켰다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로 사용할 수 있다.
이. 콜라이로부터 Fab' 단편을 직접 회수하여 화학적으로 연결시킴으로써 이중특이적 항체를 형성시켰다. 문헌 (Shalaby et al., J. Exp . Med . 175:217-225 (1992))에는 완전한 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자가 개시되어 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 별도로 분비되었으며 지시된 시험관내의 화학적 방법으로 연결하여 이중특이적 항체를 형성시켰다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현시키는 세포 및 정상적인 인간 T 세포와 결합할 수 있을뿐 아니라, 인간 유방암 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 개시할 수 있었다.
또한, 재조합 세포 배양으로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 만들고 단리하는 여러 기술이 개시되어 있다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중 특이적 항체를 제조하였다(Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)). 유전자 융합에 의해, Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 2종의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결하였다. 항체 동종이량체의 힌지 영역을 환원시켜 단량체를 형성한 다음, 재산화시켜 항체 이종이량체를 형성시켰다. 또한, 이 방법은 항체 동종이량체를 생산하기 위한 방법으로 이용할 수도 있다. 문헌 (Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:6444-6448 (1993))에 기재된 "디아바디(diabody)" 기술은 이중특이적 항체 단편을 만드는 다른 메카니즘을 제공한다. 이 단편은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하 는데, 이 링커는 너무 짧아서 상기 두 도메인을 동일 쇄로 짝지을 수 없다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보적인 VH 및 VL 도메인과 쌍을 이루게 되며, 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 만드는 또다른 방법이 보고되었다(문헌 (Gruber et al., J. Immunol . 152:5368 (1994))을 참조함). 2가 이상의 결합가를 갖는 항체도 고려 대상이다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 만들 수 있다(Tutt et al., J. Immunol . 147:60 (1991)).
전형적인 이중특이적 항체는 본원에서 제공된 PRO10282 폴리펩티드의 2종의 상이한 에피토프과 결합할 수 있다. 또는, 특정 PRO10282 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 대한 세포내 방어 메카니즘에 초점을 맞추기 위해, 항-PRO10282 폴리펩티드 아암 (arm)을 백혈구 상 촉발 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자(예를 들어, CD2, CD3, CD28 또는 B7), 또는 IgG의 Fc 수용체(FcR), 예를 들어 FcRI(CD64), FcRII(CD32) 및 FcRIII(CD16)와 결합하는 아암과 연결할 수 있다. 또한, 이중특이적 항체를 사용하여 특정 PRO10282 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 세포독성 물질을 국소화할 수 있다. 이러한 항체에는 PRO10282-결합 아암과 세포독성 물질 또는 방사성핵종 킬레이트제, 예를 들어 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA와 결합하는 아암이 있다. 목적하는 또다른 이중특이적 항체는 PRO10282 폴리펩티드와 결합하며 추가로 조직 인자(TF)와 결합한다.
5. 헤테로컨쥬게이트 항체
헤테로컨쥬게이트 항체도 본 발명의 범위에 포함된다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 2개의 공유결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어 면역시스템 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 제91/00360호, 동 제92/200373호, 및 EP 제03089호) 제안되었다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 가교결합제를 사용하는 방법을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 시험관내에서 제조할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 제조할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약은 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트 및 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 시약을 포함한다.
6. 이펙터 기능 조작
이펙터 기능에 대해 본 발명의 항체를 변형하여 예를 들어 암치료에 있어서의 항체의 효과를 증대하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 Fc 영역에 도입하여 이 영역내 쇄간 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이와 같이 생성된 동종이량체 항체는 내부화 능력을 향상시키고(시키거나) 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포내 세포독성(ADCC)을 증대시킨다 (문헌 (Caron et al., J. Exp Med ., 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, J. Immunol ., 148:2918-2922 (1992))을 참조함). 또한, 문헌 (Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993))에 기재된 이종이관능성 가교를 사용하여 증대된 항종양 활성을 지닌 동종이량체 항체를 제조할 수 있다. 또는, 이중의 Fc 영역을 갖는 항체를 조작하여 보체 세포용해능 및 ADCC 능력을 증대시킬 수 있다 (문헌 (Stevenson et al., Anti - Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989))을 참조함).
7. 이뮤노컨쥬게이트
또한, 본 발명은 세포독성 물질, 예를 들어 화학요법제, 독소(예를 들어, 효소적으로 활성인 박테리아, 진균, 식물 또는 동물성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사활성 동위원소(즉, 방사성결합체)와 결합된 항체를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트에 관한 것이다.
상기 이뮤노컨쥬의 생성에 유용한 화학요법제는 위에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 쓴 멜론(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테세네스가 포함된다. 여러 방사성핵종을 방사결합체 항체의 제조에 이용할 수 있다. 예에는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re가 포함된다.
다양한 이관능성 단백질-커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체(예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미 딜 수베레이트), 알데히드(예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성 물질의 결합체를 만들 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987))에 기재된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아셋트산(MX-DTPA)은 방사성핵종과 항체를 연결하는 전형적인 킬레이트제이다(WO 94/11026을 참조함).
또다른 실시양태으로, 항체와 종양 예비표적화에 이용되는 "수용체"(예를 들어, 스트렙타비딘)를 연결할 수 있는데, 여기서 항체-수용체 결합체를 투여 대상에게 투여한 다음, 킬레이트제를 사용하여 순환계로부터 결합하지 않은 결합체를 제거하고 세포독성 물질(예를 들어, 방사성핵종)에 연결된 "리간드"(예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
8. 이뮤노리포좀
본원에서 개시된 항체를 이뮤노리포좀으로 제제화할 수도 있다. 이 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 (Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호)에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 순환 시간이 증대된 리포좀은 문헌 (미국 특허 제 5,013,556호)에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 함유하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법에 의해 생성할 수 있다. 정해진 공극 크기의 필터를 통해 리포좀을 밀어내어 소정의 직경을 갖는 리포좀을 수득하였다. 문헌 (Martin et al., J. Biol . Chem ., 257:286-288 (1982))에 기재된 바와 같이 디술피드-상호교환 반응을 통해 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 연결할 수 있다. 화학요법제(예를 들어, 독소루비신(Doxorubicin))은 임의로 리포좀내에 포함된다(문헌 (Gabizon et al., J. National Cancer Inst ., 81(19):1484 (1989))을 참조함).
9. 항체 의존성 효소 매개 전구약물 요법 ( ADEPT )
전구약물 (예를 들면, 펩티딜 화학요법제, 국제 공개 제81/01145호 참조)을 활성 항암제로 전환시키는 전구약물-활성화 효소에 이 항체를 결합시킴으로써 본 발명의 항체를 ADEPT에 사용할 수도 있다 (국제 공개 제88/07378호 및 미국 특허 제4,975,278호 참조).
ADEPT에 유용한 이뮤노컨쥬게이트의 효소 성분에는 전구약물을 더 활성적이고 세포독성인 형태로 전환시키는 방식으로 전구약물에 작용할 수 있는 임의의 효소가 포함된다.
본 발명의 방법에 유용한 효소에는 글리코시다제, 글루코스 옥시다제, 인간 리소자임, 인간 글루큐로니다제, 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시 키는 데 유용한 알칼리성 포스파타제; 술페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 아릴술파타제; 무독성 5-플루오로시토신을 항암제 5-플루오로우라실로 전환시키는 데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 세라티아 프로테아제, 써모리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제(예를 들어, 카르복시펩티다제 G2 및 카르복시펩티다제 A) 및 카텝신(예를 들어, 카텝신 B 및 L)과 같은 프로테아제; D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약의 전환에 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제와 같은 탄수화물-절단 효소; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소 위치에서 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 방법으로, 당업계에 "아브자임(abzyme)"이라 공지된, 효소 활성이 있는 항체는 본 발명의 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시키는데 사용될 수 있다 (Massey, Nature, 328:457-458 (1987)). 종양 세포 덩어리로 아브자임을 전달하기 위한 항체-아브자임 결합체는 본원에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
본 발명의 효소는 상기 논의된 이종이관능성 가교결합제의 사용과 같이 당업계에 공지된 기술에 의해 항-PRO10282 (항-Stra6)에 공유결합될 수 있다. 다른 방법으로, 본 발명 효소의 적어도 기능적 활성 부분에 연결된, 본 발명 항체의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질은 당업계에 잘 공지된 재조합 DNA 기술 을 이용하여 제조할 수 있다 (Neuberger et al., Nature, 312:604-608(1984)).
10. 항체 제약 조성물
각종 질환을 치료하기 위해, 본원에서 확인된 PRO10282 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 기재된 스크리닝 분석에 의해 확인된 다른 분자를 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다.
PRO10282 폴리펩티드가 세포내에 있고 항체 전부가 억제제로 사용되는 경우, 내부화 항체가 바람직하다. 그러나, 또한 리포펙션 또는 리포좀을 사용하여 항체 또는 항체 단편을 세포내에 전달할 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 저해성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열을 기초로, 표적 단백질 서열과 결합하는 능력을 지닌 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성하고(하거나) 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다(예를 들어, 문헌 (Marasco et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 90:7889-7893 (1993))을 참조함). 또한, 본원의 제형은 치료할 특정 증상에 따라 필요한 경우 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 상보적인 활성을 지닌 화합물을 포함할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 이 조성물은 그의 기능을 증대시키는 물질, 예를 들어 세포독성 물질, 사이토킨, 화학요법제, 또는 생장-억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 배합된다.
활성 성분은 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로 에멀젼 중에서 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 문헌)에 개시되어 있다.
체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.
서방성 제제도 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT(등록상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주입가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 있다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출시키지만, 어떤 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 오랫 동안 체내에 남아있는 경우, 그는 37 ℃에서 습기에 노출된 결과, 변성 또는 응집되어 생물 활성을 감소시키고 면역원성을 변화시킬 수 있다. 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 방법을 설계할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자내 S-S 결합 형성인 것으 로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화를 달성할 수 있다.
O. 항- PRO10282 (항- Stra6 ) 항체의 용도
본 발명의 항-PRO10282 항체는 다양한 유용성을 갖는다. 예를 들어, 항-PRO10282 항체는 PRO10282에 대한 진단 분석, 예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서의 그의 발현의 검출에 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 진단 분석 기술, 예를 들어 이종상 또는 동종상에서 수행되는 경쟁 결합 분석, 직접 또는 간접 샌드위치 분석 및 면역침전 분석[Zola, Monoclonal 항체: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]을 사용할 수 있다. 진단 분석에 사용되는 항체는 검출가능한 잔기로 표지될 수 있다. 검출가능한 잔기는 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있어야 한다. 예를 들어, 검출가능한 잔기는 방사성 동위 원소, 예를 들어 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125I, 형광 또는 화학발광 화합물, 예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린, 또는 효소, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 양고추냉이 퍼록시다제일 수 있다. 문헌 [Hunter et al, Nature, 144:945(1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol . Meth ., 40:219 (1981); 및 Nygren, J. Histochem . and Cytochem ., 30:407 (1982)]에 기재된 방법을 비롯하여 항체를 검출가능한 잔기에 결합시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다.
또한, 항-PRO10282 항체는 재조합 세포 배양액 또는 천연 공급원으로부터 PRO10282의 친화성 정제에도 유용하다. 이 과정에서, PRO10282에 대한 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세파덱스 수지 또는 여과지에 적합한 지지체에 고정된다. 그 후에, 고정된 항체는 정제될 PRO10282를 함유하는 시료와 접촉시킨 후, 고정된 항체에 결합한 PRO10282 폴리펩티드를 제외하고 시료 내의 모든 물질을 실질적으로 제거하기 위해 적합한 용매로 세척한다. 최종적으로, 지지체는 다른 적합한 용매로 세척하여 항체로부터 PRO10282를 방출시킨다.
항-PR010282 항체를 사용하여, 다양한 레티노이드 반응 질환에 대해 치료적으로 유용한 화합물을 스크리닝하는 민감한 방법으로서 잠재적인 용도를 갖는 PR010282 폴리펩티드의 발현을 모니터링할 수 있다. 치료 표적으로 예상되는 질환의 유형은 건선, 여드름, 부전증, 암 및 자가면역 질환들을 포함한다. 예상되는 부전증의 종류는 상피 조직의 전암성 병변, 예를 들어 구강 백반, 경부, 후두 및 기관지의 부전증을 포함한다. 예상되는 암의 종류는 결장 (선암), 폐 (암종 선암), 피부, 두경부, 자궁, 유방 및 전립선의 암종을 포함한다. 예상되는 자가면역 질환의 종류는 류마티스성 관절염, 골관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 심상성 천포창 및 낙엽성 천포창을 포함한다. 항-PR010282 항체는 이러한 질환 및 증상의 치료에 잠재적인 치료 용도를 갖는다.
P. 항- PR010282 ( Stra6 ) 항체 및 다른 Stra6 길항제를 사용한 치료 방법
본 발명의 항체 및 다른 항종양 화합물은 본원에 확인된 증폭된 유전자의 과 발현 및(또는) 활성화를 특징으로 하는 증상을 포함하는 다양한 증상을 치료하는 데 사용할 수 있다는 것으로 생각된다. 이러한 항체 및 다른 화합물 (이에 제한되지는 않지만 유기 및 무기 소분자, 펩티드, 안티센스 분자 등을 포함함)로 치료하고자 하는 예시적인 증상 또는 질환은 양성 또는 악성 종양 (예, 신장부, 간장, 신장, 방광, 유방, 위, 난소, 결장직장, 전립선, 췌장, 폐, 음문, 갑상선, 간세포 암종; 육종 ; 교아세포종 및 다양한 머리 및 목 종양); 백혈병 및 림프구 악성종양; 다른 장애들, 예를 들어 신경원, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 다른 선상, 대식세포, 상피, 간질 및 배강 질환; 및 염증성, 맥관형성성 및 면역질환을 포함한다. 본 발명의 항-Stra6 항체 및 다른 길항제를 사용한 치료에 대해 특히 바람직한 표적은 Wnt-1 경로에 유전자적 결함 (예, 3-카테닌 시그날링의 비정상 발현을 야기함) 및(또는) 과발현 Stra6을 포함하는 종양이다. Wnt-1 경로에 유전자적 결함을 포함하는 인간의 암은 전형적으로 Stra6의 과발현도 나타내는 것으로 밝혀졌지만, 모든 Stra6 과발현 종양이 Wnt-1 경로에서의 돌연변이와 관련되는 것은 아닌 것으로 알려졌다. 본 발명의 Stra6 길항제는 Stra6 과발현 종양의 치료에 큰 가능성을 갖는다. 이러한 종양의 바람직한 군은 결장직장 종양, 난소, 자궁내막 및 윌름스 (Wilm's) 신장 종양, 흑색종 및 갈색세포종 (부신 피질로부터 유래된 종양)을 포함한다.
본 발명의 항종양제 (예, 항체)는 볼루스, 또는 일정 기간에 걸친 연속 관주에 의한 정맥내 투여, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액낭내, 포막내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의한 것과 같은 공지된 방법에 따라 포유동물, 바람직하게 인간에게 투여된다. 상기 항체의 정맥내 투여가 바람직하다.
*기타 치료 방법을 항암제, 예를 들어 본 발명의 항체의 투여와 병행할 수 있다. 예를 들어, 이러한 항암제를 사용하여 치료하고자 하는 환자는 또한 방사선 요법을 받을 수 있다. 또한, 화학요법제를 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투여 스케쥴은 제조업자의 지시에 따르거나 당분야의 숙련인에 의해 실험적으로 결정된 바에 따라서 이용될 수 있다. 이러한 화학요법에 대한 제조 및 투여 스케쥴은 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M.C.Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기재되어 있다. 화학요법제는 항종양제 (예, 항체)의 투여 전 또는 후에, 또는 항종양제와 동시에 투여될 수 있다. 항체는 타목시펜과 같은 항-에스트로겐 화합물 또는 오나프리스톤 등의 항-프로게스테론 (EP 616 812 참조)과 함께 이러한 분자에 대해 공지된 투여량으로 사용될 수 있다.
또한, 다른 종양 관련 항원에 대한 항체, 예를 들어 ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4에 결합하는 항체 또는 맥관 내피 인자 (VEGF)를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 동일한 또는 2종 이상의 상이한 항원에 결합한 2종 이상의 항체를 환자에게 동시 투여할 수 있다. 때때로, 1종 이상의 사이토킨을 환자에게 투여하는 것이 이로울 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원의 항체는 생장 억제제와 함께 동시 투여된다. 예를 들어 생장 억제제를 먼저 투여한 후 본 발명의 항체를 투여할 수 있다. 그러나, 동시 투여 또는 본 발명의 항체를 먼저 투 여하는 것도 예상된다. 생장 억제제의 적합한 투여량은 현재 사용되는 것과 같고 생장 억제제와 본원의 항체의 조합작용 (상승작용)으로 인해 더 적을 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 항종양제, 예를 들어 항체의 적당한 투여량은 상기 정의된 바와 같은 치료받고자 하는 질환의 유형, 약제를 예방 목적으로 투여하든 치료 목적으로 투여하든지 간에 해당 질환의 중증도와 경과, 선행 치료 요법, 환자의 임상 병력 및 약제에 대한 반응도, 및 담당의의 재량에 따라서 결정될 것이다. 약품은 환자에게 1회 투여하거나 일련의 치료 전반에 걸쳐 투여하는 것이 적합하다.
예를 들면, 질환의 유형 및 심각성에 따라, 항체 약 1 g/kg 내지 15 mg/kg (예를 들면, 0.1 내지 20 mg/kg)이 예를 들면, 1 회 이상의 별도의 투여 또는 연속 관주에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1 일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라, 약 1 g/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 증상에 따라 수일 이상에 걸친 반복 투여기간 동안, 질환의 증상이 원하는 정도로 저해될 때까지 처치를 지속한다. 그러나, 다른 투여 섭생이 유용할 수 있다. 이러한 치료법의 진행상태는 통상적인 기술 및 분석법으로 쉽게 모니터링된다.
Q. 제조 용품
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 기재한 장애의 진단 또는 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 용품이 제공된다. 제조 용품은 용기 및 표지를 포함한다. 적합한 용기의 예로는 병, 바이알, 주사기 및 시험관 등이 있다. 용기는 유리 또 는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 용기에는 증상의 진단 또는 치료에 효과적인 조성물이 들어 있으며, 멸균 입구 (access port)가 있을 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 (bag) 또는 피하 주사기의 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 달린 바이알일 수 있음). 조성물 중의 활성 제제는 통상적으로 본원에서 확인한 유전자 산물의 활성을 방해할 수 있는 항-종양제, 예를 들어 항체이다. 용기 위에 있거나 용기에 부착되어 있는 표지는 이 조성물이 선택된 증상의 진단 또는 치료에 사용됨을 지시한다. 제조 용품은 인산염완충염수, 링거액 및 덱스트로스 용액 등의 제약학적으로 허용되는 완충액를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 용품은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 사용 지침서가 들어있는 팩키지 삽입물을 포함하는, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다.
R. 종양의 진단 및 예후
특정 종양에서 과발현된 생장 수용체와 같은 세포 표면 단백질은 약물 후보 또는 종양 (예를 들어, 암) 치료에 대한 훌륭한 표적인 반면, 상기 단백질은 종양 세포에서 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 분비 단백질과 함께 종양의 진단 및 예후에 추가의 용도가 있다. 예를 들어, 종양 세포에서 증폭된 유전자의 단백질 생성물에 대한 항체는 종양 진단제 또는 예후제로서 사용할 수 있다.
예를 들어, 항체 단편을 포함하는 항체를 사용하여 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 단백질 ("마커 유전자 생성물")의 발현을 정성적 또는 정량적으로 검출할 수 있다. 항체에는 형광 표지 등과 같은 검출가능한 표지를 부착하는 것이 바람직 하고, 항체의 결합은 광학현미경법, 유동세포측정법, 형광측정법 또는 당업계에 공지된 기타의 기술을 통해 모니터링할 수 있다. 이들 기술은 증폭된 유전자가 생장 인자와 같은 세포 표면 단백질을 코딩하는 경우에 특히 적합하다. 이러한 결합 분석은 본질적으로 상기 기술된 바대로 수행된다.
마커 유전자 생성물에 대한 항체의 원위치 검출은 예를 들어 면역형광법 또는 면역전자현미경법으로 수행할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 환자로부터 조직학적 표본을 취하고, 바람직하게는 상기 생물학적 시료 상에 항체를 올려놓음으로써 표지된 항체를 적용시킨다. 또한, 이 방법을 이용하면, 조사되는 조직에서의 마커 유전자 생성물의 분포를 결정할 수 있다. 당업자에게는 원위치 검출에 광범위한 조직학적 방법을 쉽게 이용할 수 있음이 명백할 것이다.
하기 실시예는 오직 예시를 위한 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떤 방식으로도 제한하고자 함이 아니다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고 문헌은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 도입된다.
<실시예>
실시예에서 언급한 시판 시약들은 달리 명시하지 않는 한 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 명세서 전반에서 ATCC 기탁번호로 확인되는 세포들의 입수원은 미국 버지니아주 마나사스에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)이다. 하기 실시에서 별도의 언급이 없는 경우, "Sra6"은 천연 서열 PR010282 폴리펩티드를 지칭한다.
실시예 1:인간 PR010282 및 PR019578 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
1차 cDNA 클론의 5' 말단을 우선적으로 나타내는 인간 태아의 뇌 cDNA 라이브러리에서 효모 스크리닝법을 사용하여 천연 인간 PR010282 및 PR019578 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 클론 (DNA148380-2827 및 DNA148389-2827-1)을 확인했다.
클론 DNA148380-2827은 뉴클레오티드 위치 49 내지 51에 명백한 번역 개시 부위를 갖고 뉴클레오티드 위치 2050 내지 2052에 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 1). 예측되는 폴리펩티드 전구체는 667 개 아미노산 길이이다 (도 2). 도 2에 나타낸 전장 PRO10282 단백질의 추정 분자량은 약 73502 달톤이고 pI는 약 9.26이다. 도 2 (서열 2)에 나타낸 전장 PR010282 서열의 분석은 도 2에 나타낸 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 도 2에서 상기 중요 폴리펩티드 도메인의 위치는 상기 기재한 바와 유사하다. 클론 DNA148380-2827을 2000년 1월 11일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 PTA-1181를 배정받았다.
클론 DNA148389-2827-1은 뉴클레오티드 위치 186 내지 188에 명백한 번역 개시 부위를 갖고 뉴클레오티드 위치 2160 내지 2162에 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 6, 서열 4). 예측되는 폴리펩티드 전구체는 658 개 아미노산 길이이다 (도 7, 서열 5). 도 7에 나타낸 전장 PR019578 단백질의 추정 분자량은 약 72583 달톤이고 pI는 약 9.36이다. 도 7 (서열 5)에 나타낸 전장 PR019578 서열의 분석은 도 7에 나타낸 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 도 7에서 상기 중요 폴리펩티드 도메인의 위치는 상기 기재한 바와 유사하다. 인간 및 상응하는 마우스 서열 사이에 보존된 9 개의 잠재적인 막횡단 도메인 및 14 개의 시스테인 잔기가 존재한다는 점은 주목할 만하다. 마우스 Stra6에는 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위가 3군데 있으나, 인간 PR019578 (천연 인간 Stra6) 폴리펩티드에는 1군데 있다. 클론 148389-2827-1을 2000년 2월 23일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 PTA-1405를 배정받았다.
데이호프 (Dayhoff) 데이타베이스 (버전 35.45 스위스-프롯 (SwissProt) 35) 분석법을 이용한 도 2 (서열 2)에 나타낸 전장 서열 및 도 7 (서열 5)에 나타낸 전장 서열의 ALIGN 2 서열 정렬 분석은 PR010282 아미노산 서열과 하기의 데이호프 서열 사이의 서열 동일성을 입증했다: AF062476, P_W88559 및 HGS_RE259.
도 8에 나타낸 바와 같이, 전장 인간 PR010282과 PRO19578 폴리펩티드와의 비교는 PR019578이 PR010282 아미노산 서열의 위치 89 내지 97에서 9 개 아미노산 (SPVDFLAGD; 서열 13)이 결실되어 있음을 나타낸다. 또한, PR019578은 PR010282의 위치 527에 있는 메티오닌 (M) 대신 상응하는 위치 (아미노산 위치 518)에 이소루이신 (I)을 포함하여, 이 위치에서의 G/A 다형성을 생성한다. PR010282 및 천연 서열 PR019578 폴리펩티드 둘다 마우스 Stra6 폴리펩티드의 인간 동족체라고 여겨지기 때문에 "Stra6"으로 지칭되기도 한다. DNA148340-2827에 의해 코딩되는 천연 서열 인간 전장 PR010282 폴리펩티드 및 마우스 Stra6은 약 74％의 아미노산 서열 동일성을 나타낸다.
도 9는 간략하게 "인간 Stra6"로 지칭되는, DNA148380-2827에 의해 코딩되는 천연 서열 인간 전장 PR010282 폴리펩티드의 소수성 구획을 나타낸다. 도 9에 나 타낸 바와 같이, 이러한 667 개 아미노산 길이 중 약 50％의 아미노산 잔기가 소수성이다.
인간 Stra6 유전자는 UNIGENE에 의해 결정된 바와 같이 염색체 15q23에 위치한다. 예비 상세 맵핑은 Stra6이 STS 인터벌 (interval) D15S124-D15S160에 위치하며 GeneMap'98 위치는 G3 맵의 244.52에 상응한다는 것을 지시한다.
실시예 2: 혼성화 프로브로서 PR010282 및 PR019578 의 용도
다음 방법은 PR010282 및 PR019578을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 혼성화 프로브로서의 용도를 기술한다.
인간 조직 cDNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리에서 상동성 DNA (예를 들면, PR010282 또는 PR019578의 자연 발생 변이체를 코딩하는 것)를 스크리닝하기 위한 프로브로서 전장 또는 성숙 PR010282 또는 PR019578의 코딩 서열을 포함하는 DNA를 이용하였다.
이들 라이브러리 DNA를 포함하는 필터의 혼성화 및 세척을 다음 고엄격 조건 하에 수행하였다: 방사선 표지된 PR010282 유도 프로브를 50％ 포름아미드, 5 ×SSC, 0.1％ SDS, 0.1％ 피로인산나트륨, 50 mM 인산나트륨, pH 6.8, 2 ×덴하르트 (Denhardt's) 용액 및 10％ 덱스트란 황산염의 용액 중에서 42℃에서 20 시간 동안 혼성화를 수행하였다. 필터를 42℃의 0.1 ×SSC 및 0.1％ SDS의 수용액 중에서 세척하였다.
이어서, 전장 천연 서열 PR010282 또는 PR019578을 코딩하는 DNA와 원하는 서열 동일성을 갖는 DNA를 당업계에 공지된 표준 방법으로 확인할 수 있다.
실시예 3: 이. 콜라이에서 PR010282 및 PR019578 의 발현
본 실시예는 이. 콜라이 내의 재조합 발현으로 PR010282 또는 PR019578의 비글리코실화 형태를 제조하는 방법을 나타낸다.
먼저, PR010282 또는 PR019578을 코딩하는 DNA 서열을 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한효소 부위에 해당하는 제한효소 부위를 포함해야만 한다. 여러 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예로는 앰피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 포함하는 pBR322 [이. 콜라이에서 유래; Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)]가 있다. 벡터를 제한효소로 절단하고 탈인산화시켰다. 이어서, PCR 증폭된 서열을 벡터에 라이게이션하였다. 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리-His 리더 (처음 6 개의 STII 코돈, 폴리-His 서열 및 엔테로키나제 절단 부위를 포함), PR010282 또는 PR019578 코딩 영역, 람다 전사 터미네이터 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 것이다.
이어서, 상기 문헌 [Sambrook et al.]에 기재된 방법을 이용하여, 라이게이션 혼합물을 사용하여 선택된 이. 콜라이 균주를 형질전환시켰다. LB 플레이트에서 생장할 수 있는 형질전환체를 확인한 후에 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선별하였다. 플라스미드 DNA를 제한 분석법 및 DNA 서열 분석을 이용하여 단리 및 확인하였다.
선별된 클론을 항생제가 보충된 LB 브로스와 같은 액체 배양 배지에서 밤새 생장시킬 수 있다. 그 후, 이 철야 배양액은 더 큰 규모의 배양 접종에 사용할 수 있다. 이어서, 세포를 발현 프로모터가 작동되는 동안 원하는 광학 밀도까지 생장시킨다.
수시간 이상 동안 세포를 배양한 후에 원심분리로 세포를 회수할 수 있다. 원심분리로 얻어진 세포 펠렛을 당업계에 공지된 여러가지 시약을 이용하여 용해시킨 후에, 단백질이 강하게 결합하는 조건 하에서 금속 킬레이팅 컬럼을 이용하여 용해된 PR010282 단백질을 정제할 수 있다.
PR010282 또는 PR019578은 다음 과정을 이용하여 이. 콜라이에서 폴리-His 태그가 부가된 형태로 발현될 수 있다. PR010282 또는 PR019578을 코딩하는 DNA는 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 초기에 증폭된다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한효소 부위에 해당하는 제한효소 부위 및 효율적이고 신뢰할 만한 번역 개시, 금속 킬레이트 컬럼에서의 신속한 정제, 엔테로키나제를 사용한 단백질 분해 제거를 제공하는 다른 유용한 서열을 포함한다. 이어서 PCR 증폭된, 폴리-His 태그가 부가된 서열을 발현 벡터에 라이게이션시켜 이. 콜라이 숙주[균주 52 (W3110fuhA (tonA) lon galE rpoHts (htpRts) clpP (lacIq)]를 형질전환시키는 데 사용하였다. 우선 형질전환체를 50 ㎎/mL의 카르베니실린을 포함하는 LB 배지에서 O.D.600이 3 내지 5에 도달할 때까지 30℃에서 진탕 배양하였다. 이어서, 배양액을 CRAP 배지 (물 500 mL 중의 3.57 g (NH4)2SO4, 0.71 g 시트르산나트륨·2H2O, 1.07 g KCl, 5.36 g Difco 효모 추출물, 5.36 g 쉐필드 하이카제 (Sheffield hycase) SF, 또한 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55％ (w/v) 글루코스 및 7 mM MgSO4를 혼 합하여 준비)로 50 내지 100 배 희석하고 약 20 내지 30 시간 동안 30℃에서 진탕 배양시켰다. 시료를 취해 SDS-PAGE 분석법으로 발현을 확인하고 대량 배양액을 원심분리하여 세포를 펠렛으로 만들었다. 세포 펠렛을 정제와 리폴딩시킬 때까지 동결시켰다.
0.5 내지 1 L 발효액으로부터 얻은 이. 콜라이 페이스트 (6 내지 10 g 펠렛)를 10 배 부피 (w/v)의 7 M 구아니딘, 20 mM 트리스 (pH 8) 완충액에 재현탁시켰다. 고체 아황산나트륨 및 사티온산나트륨을 각각 최종 농도 0.1 M과 0.02 M이 되도록 첨가하고 용액을 4℃에서 밤새 교반하였다. 이 단계에서 아황산염화에 의해 모든 시스테인 잔기가 블록킹된 변성 단백질이 생성되었다. 이 용액을 벡크만 (Beckman) 초원심 분리기에서 40,000 rpm으로 30 분간 원심분리하였다. 상등액을 3 내지 5 배 부피의 금속 킬레이트 컬럼 완충액 (6 M 구아니딘, 20 mM 트리스, pH 7.4)으로 희석하고 0.22 마이크론 필터로 여과시켜 정화하였다. 정화된 추출물을 금속 킬레이트 컬럼 완충액으로 평형화된 5 mL 퀴아젠 (Qiagen) Ni-NTA 금속 킬레이트 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 50 mM 이미다졸 (Calbiochem, Utrol grade)을 포함하는 추가의 완충액 (pH 7.4)으로 세척하였다. 단백질을 250 mM 이미다졸을 포함하는 완충액으로 용출시켰다. 원하는 단백질을 포함하는 분획을 모아 4℃에 보관하였다. 아미노산 서열에 따라 계산된 흡광 계수를 이용하여 280 nm 흡광도로 단백질 농도를 측정하였다.
시료를 20 mM 트리스, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mM 시스테인, 20 mM 글리신 및 1 mM EDTA로 구성된 새롭게 준비한 리폴딩 완충액으로 천천히 희 석하여 단백질을 리폴딩시켰다. 리폴딩 부피는 최종 단백질 농도가 50 내지 100 ㎍/mL가 되도록 선택하였다. 리폴딩 용액을 4℃에서 12 내지 36 시간 가량 완만하게 교반하였다. 최종 농도가 0.4％ (약 pH 3)가 되도록 TFA를 첨가하여 리폴딩 반응을 정지시켰다. 추가로 단백질을 정제하기 전에, 용액을 0.22 마이크론 필터로 여과시키고 아세토니트릴을 최종 농도 2 내지 10％가 되도록 첨가하였다. 리폴딩된 단백질을 10 내지 80％의 아세토니트릴 농도 구배로 용출시키면서 0.1％ TFA의 이동 완충액을 이용하는 포로스 (Poros) R1/H 역상 컬럼 크로마토그래피시켰다. A280 흡광도를 보이는 분획의 분액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하여 균질하게 리폴딩된 단백질을 포함하는 분획을 회수하였다. 일반적으로, 리폴딩된 단백질은 역상 수지와의 상호작용으로부터 보호되는 소수성의 내부 부분과 가장 밀착되기 때문에, 대부분의 단백질에서 적절하게 리폴딩된 단백질 형태는 아세토니트릴의 가장 낮은 농도에서 용출된다. 응집된 단백질은 대개 높은 아세토니트릴 농도에서 용출된다. 역상 단계는 바람직한 형태의 단백질로부터 잘못 폴딩된 형태의 단백질을 분리할 뿐 아니라, 시료로부터 내독소를 제거한다.
폴딩된 PR010282 또는 PRO19578 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모아 용액에 대해 질소 기류를 완만하게 적용하여 아세토니트릴을 제거하였다. 투석법 또는 제제화 완충액으로 평형화되고 멸균 여과된 G25 수퍼파인 (Superfine) (Pharmacia) 수지를 이용한 겔 여과법으로 0.14 M 염화나트륨 및 4％ 만니톨을 포함하는 20 mM 헤르페스, pH 6.8으로 단백질을 제제화하였다.
구체적으로, 천연 인간 Stra6 단백질 PR010282의 2 개의 세포외 도메인 (ECD)인 페페티드 (Pepetide) A (아미노산 229 내지 295) 및 페페티드 B (아미노산 532 내지 667)는 이. 콜라이 원형질에서 아미노산 서열이 MKHQHQHQHQHQHQMHQ (서열 12)인 N-말단 폴리히스티딘 리더를 갖는 별개의 펩티드로 발현된다. 상기 리더는 최적의 번역 개시를 제공하며, 니켈 킬레이팅 컬럼에서 정제하고 필요에 따라 TAGZyme 시스템 (Unizyme Laboratories)을 사용하여 효과적으로 제거된다. 전사는 이. 콜라이 알칼리성 포스파타제 프로모터 (Kikuchi et al., Nucleic Acids Res. 9: 5671-5678 [1981]) 및 번역을 위한 trp 오페론 리보좀 결합 부위 (Yanofsky et al., Nucleic Acids Res. 9: 6647-6668 [1981])에 의해 조절된다. 번역 종결 코돈의 하류는 λ전사 터미네이터 (Scholtissek and Grosse, Nucleic Acids Res. 15 : 3185 [1987])이며 드문 코돈인 tRNA 유전자 pro2, argU 및 glyT이 뒤따른다 (Komine et al., J. Mol. Biol. 212: 579-598 [1990] ; Fournier and Ozeki, Microbiol. Rev. 49: 379397 [1985]).
서열 DNA 단편을 코딩하는 2 개의 Stra6 ECD를 전장 cDNA 클론으로부터의 PCR을 통해 제조하고, 상기 기재한 pST239이라 지칭하는 발현 벡터에 삽입했다. DNA 서열을 밝힌 후에, PE148380A 및 PE148380B이라 지칭하는 새로운 Stra6 발현 플라스미드로 이. 콜라이 균주 58F3 ((fhuA△(tonA△)lon△galE rpoHts (htpRts) △clpP laclq△ompT△ (nmpc-fepE)△slyD)를 형질전환시켰다. 이러한 형질전환체의 루리아 (Luria) 브로스 배양물을 우선 30℃에서 밤새 생장시킨 후에 포스페이트 제한 배지로 100 배 희석하여 알칼리성 포스파타제 프로모터를 유도했다. 30℃에서 24 시간 동안 진탕한 후에, 상기 배양물을 원심분리하고 펩티드 정제를 시작할 때까지 세포 페이스트를 동결시켰다.
정제를 위해, 이. 콜라이 페이스트 (6 내지 10 gm 펠렛)를 10 배 부피의 (w/v)의 7 M 구아니딘 HCl, 20 mM 트리스 (pH 8) 완충액 중에 재현탁했다. 고체 아황산나트륨 및 테트라티온산나트륨을 첨가하여 최종 농도를 각각 0.1 M 및 0.02 M로 만들고 상기 용액을 4℃에서 반새 교반했다. 상기 용액을 원심분리하여 세정하고 6 M 구아니딘, HCl, 20 mM 트리스 (pH 7.4)로 평형화시킨 퀴아젠 Ni-NTA 금속 킬레이트 컬럼에 로딩했다. 상기 컬럼을 50 mM 이미다졸 (Calbiochem, Utrol grade)을 함유하는 추가의 완충액으로 세척했다. 상기 단백질은 250 mM 이미다졸을 함유하는 완충액을 사용하여 용출시켰다. 원하는 단백질을 포함하는 분획들을 모아 1 mM HCl에 대해 투석하고 4℃에 보관했다.
실시예 4: 포유동물 세포에서 PR010282 및 PR019578 의 발현
본 실시예는 포유동물 세포내의 재조합 발현으로 PR010282 및 PR019578의 잠재적인 글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 예시한다.
벡터 pRK5 (1989년 3월 15일자로 공개된 EP 307,247 참조)를 발현 벡터로 사용하였다. 임의로, 상기 문헌 [Sambrook et al.]에 기재된 라이게이션 방법을 이용하여 PR010282 또는 PR019578 DNA를 선택된 제한효소를 사용하여 pRK5에 라이게이션시켜, PR010282 DNA를 삽입하였다. 생성 벡터를 각각 pRK5-PR010282 및 pRK5-PR019578 폴리펩티드로 지칭하였다.
한 실시양태에서, 숙주 세포로서 293 세포를 선택할 수 있다. 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573)를 태아 송아지 혈청 및 임의로 영양소 및(또는) 항생제가 보충 된 DMEM와 같은 배지에서 조직 배양 플레이트에 융합 (confluent)되도록 배양하였다. 약 10 ㎍ pRK5-PR010282 또는 pRK5-PR019578 DNA를 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA [Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982)] 약 1 g과 혼합하여, 500 L의 1 mM 트리스-HCl, 0.1 mM EDTA 및 0.227 M CaCl2에 용해시켰다. 이 혼합물에 500 L의 50 mM 헤르페스 (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO4를 적가하여 25℃에서 10 분간 침전물을 형성시켰다. 침전물을 현탁시키고 293 세포에 첨가하여 37℃에서 4 시간 가량을 정치시켰다. 배양 배지를 흡인 제거하고 PBS 중의 20％ 글리세롤 2 mL를 30 초 동안 첨가하였다. 이어서, 293세포를 무혈청 배지로 세척하고 새로운 배지를 첨가하고 약 5 일 동안 세포를 인큐베이션하였다.
형질감염 약 24 시간 후에 배양 배지를 제거하고 배지(만으로) 또는 200 Ci/mL 35S-시스테인 및 200 Ci/mL 35S-메티오닌을 포함하는 배지로 교체하였다. 12 시간 인큐베이션 후, 컨디셔닝 배지를 모아 회전 필터에서 농축시켜 15％ SDS 겔에 로딩하였다. 처리된 겔을 건조시키고 선택된 기간동안 필름에 노출시켜 PR010282 폴리펩티드의 존재를 확인할 수 있다. 형질감염된 세포를 포함하는 배양액을 추가로 인큐베이션시키고 (무혈청 배지에서), 배지를 선택된 생물분석법으로 시험하였다.
별법의 기술로서 문헌 [Somparyrac et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 12:7575 (1981)]에 기재된 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 PR010282 또는 PR019578을 293 세포에 일시적으로 도입시킬 수 있었다. 293 세포는 스피너 플라 스크에서 최고 밀도가 되도록 배양하고 700 g pRK5-PR010282 또는 pRK5-PR019578 DNA를 첨가하였다. 세포를 우선 원심분리하여 스피너 플라스크로부터 농축하고 PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물을 4 시간 동안 세포 펠렛 상에서 인큐베이션하였다. 세포를 20％ 글리세롤로 90 초간 처리하고 조직 배양 배지로 세척한 후 다시 조직 배양 배지, 5 g/mL 소의 인슐린 및 0.1 g/mL 소의 트랜스페린을 포함하는 스피너 플라스크에 다시 넣었다. 약 4 일 후에 컨디셔닝 배지를 원심분리하고 여과시켜 세포와 파쇄물을 제거하였다. 이어서, 발현된 PR010282 또는 PR019578을 포함하는 시료를 농축시키고 선택된 임의의 방법, 예를 들어 투석 및(또는) 컬럼 크로마토그래피로 정제할 수 있다.
다른 실시양태에서, PR010282 또는 PR019578을 CHO 세포에 발현시킬 수 있다. pRK5-PR010282 또는 pRK5PR019578을 공지된 시약, 예를 들어 CaPO4 또는 DEAE 덱스트란을 이용하여 CHO 세포에 형질감염시킬 수 있다. 상기에서 언급한 것과 같이, 세포 배양물을 인큐베이션하고, 배지(만으로) 또는 35S-메티오닌과 같은 방사선 표지를 포함하는 배지로 배양액을 교체할 수 있다. PRO10282 또는 PRO19578 폴리펩티드의 존재를 확인하고 나서, 배양 배지를 무혈청 배지로 교체할 수 있다. 바람직하게는, 약 6 일 가량 배양물을 인큐베이션하고 컨디셔닝 배지를 회수한다. 이어서, 발현된 PR010282 또는 PR019578을 포함하는 배지를 농축하여 임의의 선택된 방법으로 정제할 수 있다.
또한, 에피토프 태그가 부가된 PR010282 또는 PR019578은 CHO 숙주세포에서 발현될 수 있다. PR010282 또는 PR019578은 pRK5 벡터로부터 서브클로닝될 수 있다. 서브클론 삽입체는 PCR을 통해 폴리-His 태그와 같은 선택된 에피토프 태그를 갖는 형태로 바큘로바이러스 발현 벡터에 융합될 수 있다. 폴리-His 태그가 부가된 PR010282 또는 PR019578 삽입체는 안정한 클론을 선택하기 위해 DHFR과 같은 선택 마커를 포함하는 SV40 유도 벡터로 서브클로닝될 수 있다. 최종적으로, CHO 세포는 (상기에서와 같이) SV40 유도 벡터로 형질감염될 수 있다. 발현을 확인하기 위해서 상기와 같은 방법으로 표지될 수 있다. 이어서, 발현된 폴리-His 태그된 PR010282 또는 PR019578을 포함하는 배양 배지를 농축하여 Ni2 +-킬레이트 친화성 크로로마토그래피와 같이 임의의 선택된 방법으로 정제할 수 있다.
PR010282 또는 PR019578은 또한 일시적인 발현 과정에 의해 CHO 및(또는) COS 세포에서 또는 다른 안정된 발현 방법에 의해서 CHO 세포 내에서 발현될 수 있다.
다음의 실험 방법을 이용하여 CHO 세포 내에서 안정하게 발현되었다. 단백질은 각 단백질의 가용성 형태 (예를 들면, 세포의 도메인)의 코딩 서열이 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열에 융합된 IgG 구조체 (이뮤노어드헤신)로서 발현 및(또는) 폴리-His 태그가 부가된 형태로 발현되었다.
PCR 증폭에 이어 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, Johnn Wiley and Sons (1997)]에 기재된 표준 방법을 이용하여 각 DNA를 CHO 발현 벡터에 서브클로닝 하였다. CHO 발현 벡터는 관심있는 DNA 의 5' 및 3'에 적합한 제한 부위를 갖도록 제작되어 cDNA의 제한 위치가 편리하게 셔틀링될 수 있게 된다. CHO 세포에서 발현에 사용되는 벡터는 문헌 [Lucas et al., Nucl . Acids Res . 24:9 (1774-1779 (1996)]에 의해 기재된 바와 같으며, 관심있는 cDNA와 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 발현시키기 위해 SV40 초기 프로모터/인핸서를 사용하였다. DHFR 발현으로 형질감염된 플라스미드의 안정적 유지를 선별할 수 있다.
원하는 플라스미드 DNA 12 ㎍을 시판되는 형질감염 시약 Superfect (등록상표) (Qiagen), Dosper (등록상표) 또는 Fugene (등록상표) (Boehringer Mannheim)을 이용하여 약 1000만 개의 CHO 세포에 도입하였다. 상기의 문헌 (Lucas et al.)에 기재된 방법에 따라 세포를 생장시켰다. 약 3 ×10-7 세포를 추후의 배양 및 생산을 위해 하기에 기재된 방법에 따라 앰플에 동결시켰다.
플라스미드 DNA를 포함하는 앰플을 수조에 넣어 녹인 후 볼텍싱하여 혼합하였다. 내용물을 배지 10 mL를 포함하는 원심분리 튜브에 피펫으로 넣고 1000 rpm에서 5 분간 원심분리하였다. 상등액을 흡입해 내고 세포를 10 mL 선별 배지 (0.2 ㎛ 투석 여과된 5％ 소 태아 혈청을 포함하는 0.2 ㎛ 여과된 PS20)에 재현탁시켰다. 세포를 90 mL 선별 배지를 포함하는 100 mL 스피너에 분주하였다. 1 내지 2 일 후 세포를 150 mL 선별 배지로 채워진 250 mL 스피너로 옮겨 37℃에서 인큐베이션하였다. 2 내지 3 일 후에 250 mL, 500 mL 및 2000 mL 스피너에 3 ×105 세포/mL를 접종하였다. 세포 배양액을 원심 분리하여 신선한 배지로 교환하고 생산 배지 에 재현탁하였다. 임의의 적합한 CHO 배지를 이용할 수 있으나, 미국 특허 제5,122,469호 (1992년 6월 16일자로 허여됨)에 기재된 생산 배지를 실제로 이용할 수 있다. 3 L 생산 스피너에 1.2 ×106 세포/mL가 되도록 접종하였다. 제0 일에 세포 수와 pH를 측정하였다. 제1 일에 스피너에서 시료를 취해 여과된 공기의 살포를 개시하였다. 제2 일에 스피너에서 시료를 취해 온도를 33℃로 바꾸고 500 g/L-글루코스 30 mL 및 10％ 소포제 0.6 mL (예를 들면, 35％ 폴리디메틸 실록산 유액, Dow Corning 365 의약 등급 유액)를 첨가하였다. 전체 생산기 동안, pH가 약 7.2 정도가 되도록 조정할 필요가 있다. 10 일 후 또는 생존률이 70％ 미만으로 떨어질 즈음 세포 배양액을 원심분리로 회수하고 0.22 ㎛ 필터에 여과시켰다. 여과액을 정제 컬럼에 로딩하기 전까지 4℃에 보관하였다.
폴리-His 태그된 제작물의 경우, Ni-NTA 컬럼 (Qiagen)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 컨디셔닝 배지에 첨가하였다. 컨디셔닝 배지를 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM 헤르페스, pH 7.4 완충액으로 평형화된 6 mL Ni-NTA 컬럼에 4℃에서 4 내지 5 mL/분의 유속으로 주입하였다. 로딩 후에 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고 단백질을 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 용출하였다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 25 mL의 G25 수퍼파인 (Pharmacia) 컬럼으로 10 mM 헤르페스, 0.14 M NaCl 및 4％ 만니톨을 함유하는 저장 완충액 (pH 6.8)에서 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.
이뮤노어드헤신 (Fc 포함) 제작물은 컨디셔닝 배지로부터 다음과 같이 정제되었다. 컨디셔닝 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액 (pH 6.8)으로 평형화된 5 mL 프로테인 (Protein) A 컬럼 (Pharmacia)에 주입하였다. 로딩후, 컬럼을 평형화 완충용액으로 철저하게 세척한 후, 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎕의 1 M 트리스 완충액 (pH 9)을 포함하는 튜브에 1 mL 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 폴리-His 태그된 단백질의 경우에 상기에 기재된 방법으로 저장 완충액으로 염을 제거하였다. SDS-폴리아크릴 아미드 겔 및 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 상동성을 확인하였다.
실시예 5: 효모에서 PR010282 및 PR019578 의 발현
다음 방법은 효모에서 PR010282 및 PR019578의 재조합 발현을 기재하고 있다.
우선, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 PR010282 폴리펩티드의 세포내 생산 또는 분비를 위한 효모 발현 벡터를 제조하였다. PR010282 폴리펩티드 (PR019578 포함)를 코딩하는 DNA를 PR010282의 세포내 발현을 위해 선택된 플라스미드의 적합한 제한효소 부위에 삽입하였다. 분비의 경우, PR010282 발현을 위해 PR010282를 코딩하는 DNA를 ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 PR010282 신호 펩티드 또는 다른 포유동물의 신호 펩티드 또는 예를 들어 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 신호/리더 서열 및 링커 서열 (필요한 경우)을 코딩하는 DNA와 함께 선택된 플라스미드에 클로닝할 수 있다.
이어서, 효모 세포, 예를 들어 효모 균주 AB110을 상기에서 기재된 발현 플라스미드로 형질전환시키고 선택된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질전환된 효모 상등액을 10％ 트리클로로아셋트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리한 후 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 분석할 수 있다.
이어서, 원심분리로 발효 배지로부터 효모 세포를 제거하고 선택된 카트리지 필터를 사용하여 배지를 농축시켜 재조합 PR010282 (PR019578 포함)를 단리하고 정제할 수 있다. PR010282 (예를 들면, PR019578)를 포함하는 농축액을 선택된 컬럼 크로마토그래피 수지를 사용해서 더 정제할 수 있다.
실시예 6: 바큘로바이러스로 감염된 곤충 세포 내에서 PR010282 및 PR01957 의 발현
다음 방법은 바큘로바이러스로 감염된 곤충 세포 내에서 PR010282 및 PR019578의 재조합 발현에 대하여 기재하고 있다.
PR010282 또는 PR019578의 코딩 서열을 바큘로바이러스 발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 상류에 융합시켰다. 상기의 에피토프 태그는 폴리-His 태그 및 이뮤노글로블린 태그 (IgG의 Fc 영역과 같이)를 포함하고 있다. 시판되는 플라스미드, 예를 들어 pVL1393 (Novagen)에서 유도된 플라스미드를 포함하여 여러 플라스미드를 사용할 수 있다. 간략하게, PR010282 또는 PR019578의 코딩 서열 또는 PR010282 또는 PR019578의 코딩 서열의 원하는 부분, 예를 들어 상기 단백질이 세포외에 존재하는 경우, 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열 또는 성숙 단백질 코딩하는 서열을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 플랭킹 (선택된) 제한효소 부위를 포함할 수 있다. 이 어서, 생산물을 선택된 제한효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다.
재조합 바큘로바이러스는 리포펙틴 (GIBCO-BRL로부터 구입)을 이용하여 상기의 플라스미드 및 BaculoGold (등록상표) 바이러스 DNA (Pharmingen)를 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)에 동시에 형질감염시켜 생성되었다. 28℃에서 4 내지 5 일 배양 후에, 방출된 바이러스를 회수하여 이후의 증폭에 사용했다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌 [O'Reilley et al., Baculovirus Expresstion vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 따라 수행된다.
이어서, 발현된 폴리-His 태그된 PR010282 또는 PR019578은 예를 들어 Ni2 +-킬레이트 친화성 크로로마토그래피로 다음과 같이 정제될 수 있다. 추출액을 문헌 [Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993)]에 따라 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 제조했다. 간략하게, Sf9 세포를 세척하여 초음파 처리 완충액 (25 mL 헤르페스, pH 7.9; 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; 10％ 글리세롤; 0.1％ NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고 빙상에서 20 초간 2 회 초음파 처리하였다. 초음파 처리물을 원심분리로 제거하고 상등액을 로딩 완충액 (50 mM 인산, 300 mM NaCl, 10％ 글리세롤, pH 7.8)에 50 배 희석하여 0.45 ㎛ 필터로 여과시켰다. 5 mL 충진 부피를 사용하여 Ni2 +-NTA 아가로스 컬럼 (Quiagen으로부터 구입)을 물 25 mL로 세척하고 로딩 완충액 25 mL로 평형화시켰다. 여과시킨 세포 추출물을 1 분 당 0.5 mL로 컬럼에 로딩하였다. 점 분획 회수를 개시할 때 컬럼을 로딩 완충액으 로 A280 기준선까지 세척하였다. 다음으로, 2차 세척 완충액 (50 mM 인산; 300 mM NaCl, 10％ 글리세롤, pH 6.0)으로 컬럼을 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시켰다. A280이 기준선에 다시 도달하면, 컬럼을 2차 세척 완충액에 0 내지 500 mM 이미다졸로 구배로 전개시켰다. 1 mL 분획을 회수하여 SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알칼리 포스파타제에 결합된 Ni2 +-NTA (Qiagen)를 사용한 웨스턴 블롯팅을 통해 분석하였다. 용출된 His10 태그된 PR010282 또는 PR019578을 포함하는 분획을 모아 로딩 완충액에 대해 투석하였다.
별법으로, IgG 태그된 (또는 Fc 태그된) PR010282 또는 PR019578의 정제는 공지된 크로마토그래피 기술, 예를 들어 프로테인 A 또는 프로테인 G 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있다.
*실시예 7: PR010282 또는 PR019578 에 결합하는 항체의 제조
본 실시예는 PR010282 또는 PR019578에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 제조 방법을 설명한다.
모노클로날 항체를 생산하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어 상기의 문헌 (Goding)에 기재되어 있다. 이용될 수 있는 면역원에는 정제된 PR010282 및 PR019578, PR010282 또는 PR019578을 포함하는 융합 단백질 및 세포 표면에 재조합 PR010282 또는 PR019578을 발현하는 세포를 포함한다. 당업자는 과도한 시행착오없이도 면역원을 선택할 수 있다.
마우스, 예를 들어 Balb/c를 프로인트 완전 면역보강제에 유화된 PR010282 또는 PR019578 면역원 1 내지 100 ㎍을 피하 또는 복강내 주사하여 면역화했다. 별법으로, 면역원을 MPL-TDM 면역보강제 (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT)에 유화시켜 동물의 뒷발바닥에 주사하였다. 이어서, 면역화된 마우스를 10 내지 12 일 후에 선택된 보조제 중에 유화된 추가의 면역원으로 부스팅하였다. 그 이후, 수주 동안 마우스를 추가 면역화 주사로 부스팅할 수도 있다. 역회전 출혈법으로 마우스로부터 혈청 시료를 주기적으로 채취하여, ELISA 분석법을 시험하여 항-PR010282 항체 또는 항-PR019578 항체를 검출하였다.
적합한 항체 역가가 검출되면, 항체에 대해 "양성"인 동물에게 PR010282 또는 PR019578을 최종 정맥주사할 수 있다. 3 내지 4 일 후에 마우스를 희생시켜 비장 세포를 회수했다. 이어서, 비장 세포를 선택된 쥐과 골수종 세포주, 예를 들어 ATCC 번호 CRL 1597로부터 이용 가능한 P3X63AgU.1와 융합시켰다 (35％ 폴리에틸렌 글리콜 이용). 융합체는 비-융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장세포 하이브리드의 증식을 억제하는 HAT (하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 포함하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅될 수 있는 하이브리도마 세포를 생성하였다.
하이브리도마 세포를 PRO10282 또는 PR019578와의 반응성에 대해 ELISA로 스크리닝한다. PRO10282 또는 PR019578에 대한 원하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
양성 하이브리도마 세포는 동계의 Balb/c 마우스가 항-PR010282 모노클로날 항체 또는 항-PRO19578 모노클로날 항체를 포함하는 복수를 생산하도록 복강 내에 주사될 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 조직 배양 플라스크 또는 롤러병에서 배양될 수 있다. 복수 내에서 생성된 모노클로날 항체는 황산암모늄 침전법 및 이후의 겔 배제 크로마토그래피를 통해 정제될 수 있다. 별법으로, 항체의 프로테인 A 또는 프로테인 G 결합을 기초로 하는 친화성 크로로마토그래피를 이용할 수도 있다.
구체적으로, 리비 (Ribi) 면역보강제 (Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, MO) 중의 정제된 유니자임 (Unizyme) 결합된 아미노산 펩티드 (인간 Stra6의 아미노산 532 내지 667에 해당)를 사용하여 5마리의 Balb/c 마우스 (Charles River Laboratories, Wilmington, DE)를 과면역화하였다. 상기 기재한 바와 같이 (Hongo et al., Hybridoma 14: 253-260 [1995]), 슬와 림프절로부터의 B-세포를 마우스 골수종 세포 (X63.Ag8.653; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, Rockville, MD)와 융합시켰다. 10 내지 14 일 후에, 상등액을 회수하여 직접적인 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA)을 통해 항체 생성을 스크리닝했다. 제한 희석에 의한 2 회의 서브클로닝 후에 직접적인 ELISA법 및 면역조직화학 분석법을 통해 가장 강한 면역결합을 하는 것으로 나타난 8 개의 양성 클론을 mAb의 생체내 생산을 위해 프리스틴 (Pristine) 프라이밍된 마우스에 주사했다 (Freud and Blair, J. lmmunol. 129: 2826-2830 [1982]). 상기 기재한 바와 같이 (Hongo et al., 상기 문헌), 프로테인 A 친화성 크로로마토그래피를 통해 복수를 모아 정제했다 (Pharmacia FPLC (fast protein liquid chromatography); Pharmacia, Uppsala, Sweden). 정제된 항체 제제를 멸균 여과 (공극 크기: 0.2 ㎛; Nalgene, Rochester, NY)하고 인산염완충염수 (PBS) 중에서 4℃에 보관했다.
실시예 8: 특이적 항체를 사용한 PRO10282 및 PRO19578 폴리펩티드의 정제
천연 또는 재조합 PRO10282 및 PRO19578 폴리펩티드를 단백질 정제 분야의 다양한 표준 기술을 통해 정제할 수 있다. 예를 들면, 프로-PR010282 또는 PRO-PR019578 폴리펩티드, 성숙 PRO10282 또는 PRO19578 폴리펩티드 또는 프리 (pre)-PR010282 또는 프리-PR019578 폴리펩티드를 목적 PRO10282 폴리펩티드에 특이적인 항체를 이용하는 면역친화성 크로로마토그래피로 정제한다. 일반적으로, 면역친화성 컬럼은 항-PRO10282 또는 항-PR019578 폴리펩티드 항체를 활성화된 크로마토그래피 수지에 공유 결합적으로 커플링시킴으로써 제작된다.
폴리클로날 이뮤노글로불린은 면역 혈청으로부터 황산암모늄 침전법 또는 고정화 프로테인 A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) 상에서의 정제법을 통해 제조하였다. 유사하게, 모노클로날 항체는 마우스 복수액으로부터 황산암모늄 침전법 또는 고정화 프로테인 A 상의 크로마토그래피에 의해 제조하였다. 부분적으로 정제된 이뮤노글로불린을 CnBr-활성화 세파로스 (SEPHAROSE)™ (Pharmacia LKB Biotechnology)와 같은 크로마토그래피 수지에 공유적으로 부착시켰다. 항체를 수지에 커플링시키고, 수지를 블록킹시키고, 유도된 수지를 제조업자의 지시에 따라 세척하였다.
이러한 면역친화성 컬럼은 PRO10282 또는 PRO19578 폴리펩티드를 가용성 형태로 포함하는 세포로부터 분획을 제조함으로써 PR010282 또는 PR019578 폴리펩티드의 정제에 이용된다. 이 제제는 세정제 첨가에 의해 또는 당업계에 공지되어 있 는 다른 방법에 의한 온전한 세포의 가용화 또는 차등 원심분리를 통해 수득한 세포하 분획의 가용화에 의해 유도된다. 별법으로, 신호 서열을 포함하는 가용성 PRO10282 또는 PRO19578 폴리펩티드는 세포가 생장하는 배지 내로 유용한 양으로 분비될 수 있다.
가용성 PR010282 또는 PR019578 폴리펩티드 함유 제제를 면역친화성 컬럼에 통과시키고, 컬럼을 PR010282 또는 PRO19578 폴리펩티드의 우선적인 흡광도를 허용하는 조건 (예를 들면, 세정제의 존재 하에 고이온 강도 완충액) 하에 세척하였다. 이어서, 컬럼을 항체/PR010282 또는 PR019578 폴리펩티드 결합을 파괴시키는 조건 (예를 들면, 약 pH 2 내지 3과 같은 저 pH 완충액 또는 고농도의 카오트로프 (chaotrope), 예를 들어 요소 또는 티오시아네이트 이온) 하에 용출시키고, PR010282 또는 PR019578 폴리펩티드를 회수하였다.
실시예 9: 약물 스크리닝
본 발명은 PR010282 (Stra6) 폴리펩티드 (PR019578 포함) 또는 그의 결합 단편을 사용하여 임의의 여러가지 약물 스크리닝 기술으로 화합물을 스크리닝하는 데 특히 유용하다. 이러한 시험에 사용된 PR010282 폴리펩티드 또는 단편은 용액 중에 유리되어 있거나, 고상 지지체에 고착되거나, 세포 표면에서 유지되거나, 세포 내에 위치할 수 있다. 약물 스크리닝의 한 방법에서는 PRO10282 폴리펩티드 또는 단편을 발현하는 재조합 핵산을 사용하여 안정하게 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 이용한다. 경쟁 결합 분석법을 통해 상기 형질전환된 세포에 대한 약물을 스크리닝하였다. 생존형 또는 고정형의 상기 세포는 표준 결합 분석을 위해 사 용할 수 있다. 예를 들면, PR010282 폴리펩티드 또는 단편과 시험되는 활성제 사이의 결합체 형성을 측정할 수 있다. 별법으로, 시험되는 활성제의 의해 유발된 PR010282 폴리펩티드와 그의 표적 세포 또는 표적 수용체 사이의 결합체 형성의 감소를 조사할 수 있다.
따라서, 본 발명은 PR010282 (Stra6) 폴리펩티드-관련 질환 또는 장애에 영향을 끼칠 수 있는 약물 또는 임의의 다른 활성제를 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다. 이들 방법은 상기 활성제를 Stra6 폴리펩티드 또는 그의 단편과 접촉시키고, 당업계에 공지된 방법으로 (i) 활성제와 Stra6 폴리펩티드 또는 단편 사이의 결합체의 존재 또는 (ii) Stra6 폴리펩티드 또는 단편과 세포 사이의 결합체의 존재에 대해 분석하는 것을 포함한다. 이러한 경쟁 결합 분석법에서, Stra6 폴리펩티드 또는 단편은 대개 표지화시킨다. 적합한 인큐베이션 후, 유리 Stra6 폴리펩티드 또는 단편을 결합형으로 존재하는 것과 분리시키며, 유리 또는 비복합된 표지의 양은 특정 활성제의 Stra6 폴리펩티드에 결합하는 능력 또는 Stra6 폴리펩티드/세포 결합체를 방해하는 능력의 척도이다.
또다른 약물 스크리닝법은 폴리펩티드에 적합한 결합 친화성을 갖는 화합물에 대한 고처리량 스크리닝을 제공하고, WO84/03564 (1984년 9월 13일자 공개)에 상세히 기재되어 있다. 간단히 서술하면, 다수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물을 플라스틱 핀 또는 몇몇 다른 표면과 같은 고상 기질 상에 합성한다. PR010282 (Stra6) 폴리펩티드에 적용시켜, 펩티드 시험 화합물을 Stra6 폴리펩티드와 반응시키고 세척한다. 결합된 Stra6 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법으로 검출할 수 있다. 정제된 Stra6 폴리펩티드는 또한 상기 언급한 약물 스크리닝 기술에 사용하기 위해 플레이트 상에 직접 코팅될 수 있다. 또한, 비-중화 항체를 사용하여 펩티드를 포획하여 이를 고상 지지체 상에 고정시킬 수 있다.
본 발명은 또한 Stra6 폴리펩티드에 결합할 수 있는 중화 항체가 Stra6 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합하는 데 있어서 시험 화합물과 특이적으로 경쟁하는 경쟁 약물 스크리닝 분석의 이용을 고려한다. 이러한 방식으로, 항체를 Stra6 폴리펩티드와 하나 이상의 항원 결정자를 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 검출하는 데 사용할 수 있다.
실시예 10: 합리적인 ( Rational ) 약물 디자인
합리적 약물 디자인의 목표는 관심있는 생물 활성 폴리펩티드 (즉, PR010282 (Stra6) 폴리펩티드) 또는 이들이 상호작용하는 소분자, 예를 들면, 아고니스트, 길항제 또는 억제제의 구조적 동족체를 생산하는 것이다. 이들 예 중 임의의 것들을 천연 서열 PR010282 폴리펩티드 또는 PRO19578 폴리펩티드의 보다 활성적이거나 보다 안정한 형태인 약물, 또는 생체 내 천연 서열 PR010282 또는 PRO19578 폴리펩티드의 기능을 증진시키거나 방해하는 약물을 형성하기 위해 이용할 수 있다 (문헌 [Hodgson, Bio / Technology, 9: 19-21 (1991)] 참조).
한 접근법에서, 천연 서열 PR010282 또는 PRO19578 폴리펩티드 또는 PR010282 또는 PR019578 폴리펩티드-억제제 결합체의 3차원 구조를 X-선 결정법, 컴퓨터 모델링 또는 가장 전형적으로 상기 두가지 접근법의 조합에 의해 결정한다. 분자의 구조를 밝히고 활성 부위(들)을 결정하기 위해 천연 PRO10282 또는 PRO19578 폴리펩티드의 형태와 전하량 모두를 확인해야 한다. 더 적은 빈도이지만, PR010282 또는 PR019578 폴리펩티드의 구조에 관한 유용한 정보는 상동성 단백질의 구조를 기준으로 모델링함으로써 얻을 수 있다. 두 경우 모두, 관련 구조 정보를 동족 PR010282 폴리펩티드 유사 분자를 디자인하거나 유효한 억제제를 확인하기 위해 사용한다. 합리적 약물 디자인의 유용한 예는 문헌 [Braxton and Wells, Biochemistry, 31:7796-7801 (1992)]에 나타낸 바와 같이 활성 또는 안정성을 개선시킨 분자 또는 문헌 [Athauda et al., J. Biochem ., 113:742-746 (1993)]에 나타낸 바와 같이 천연 펩티드의 억제제, 아고니스트 또는 길항제로서 작용하는 분자를 포함할 수 있다.
기능 분석에 의해 선택된 표적-특이적 항체를 상기한 바와 같이 단리한 후 그의 결정 구조를 해석하는 것도 가능하다. 이러한 접근법은 원칙적으로 후속적인 약물 디자인이 기준이 될 수 있는 파마코어 (pharmacore)를 제공한다. 기능성 약리 활성 항체에 대한 항-이디오타입 항체 (항-id)를 생산함으로써 단백질 결정법을 생략하는 것도 가능하다. 거울상의 거울상으로서, 항-id의 결합 부위는 원래 수용체의 동족체일 것으로 예측된다. 이어서, 항-id를 사용하여 화학적 또는 생물학적으로 생산된 펩티드 뱅크로부터 펩티드를 확인하고 단리할 수 있을 것이다. 이어서, 단리된 펩티드는 파마코어로서 작용할 것이다.
본 발명에 의해, X-선 결정법과 같은 분석적 연구를 수행하기 위해 충분한 양의 PR010282 폴리펩티드 (PRO19578 포함)를 이용가능하게 할 수 있다. 또한, 본원에 제공된 PR010282 폴리펩티드 아미노산 서열 정보는 X-선 결정법 대신 또는 그 에 덧붙여 컴퓨터 모델링 기술 이용하는 데 지침을 제공할 것이다.
실시예 11: 조직 발현 분포
올리고뉴클레오티드 프로브를 정량적 PCR 증폭 반응에 사용하기 위해, 첨부한 도면에서 보인 바와 같이 PRO10282 폴리펩티드 코딩 뉴클레오티드 서열로부터 제작하였다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 표준 PCR 반응에서 관련 주형의 3' 말단으로부터 대략 200 내지 600 염기쌍의 단편이 증폭되도록 선택되었다. 이들 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 상이한 성인 조직 공급원으로부터 단리한 클론테크 (Clontech) RNA를 사용한 표준 정량적 PCR 증폭 반응을 수행하고, 아가로스 겔 전기영동을 통해 분석하여 시험한 여러 조직에서의 PRO10282 폴리펩티드 코딩 핵산의 발현 정도를 정량적으로 측정하였다. 여러 상이한 인간 조직 유형에서의 PRO10282 폴리펩티드 코딩 핵산 발현 패턴 또는 차등 발현에 대해 알 수 있다면 전이 종양의 원발 조직원 등을 결정하는 데 있어서, 다른 조직 특이적 마커와 함께 또는 그러한 마커 없이도 조직 타이핑에 유용한 진단 마커를 제공할 수 있다. 이런 분석 결과 (도 10 참조)는 DNA148380-2827 분자가 성인의 신장, 고환 및 자궁에서는 고도로 발현되고; 유방, 전립선 및 기관지에서는 상당히 발현되고; 뇌, 심장, 폐 및 흉선에서는 약하게 발현되며; 간, 골수, 결장, 골격근, 소장, 비장 및 위에서는 발현되지 않는다는 것을 증명한다.
모든 RNA는 클론테크 (Palo Alto, California)에서 구입하였으며, 하기의 하기의 프라이머/프로브 셋트를 사용한 PCR 증폭을 통해 분석하였다:
h.Stra6.tmf3: 5'-CACACTCGAGAGCCAGATATTTT (서열 6)
h.Stra5.tmr4: 5'-AACAAGTTTATTGCAGGGAACAC (서열 7)
h.Stra6.tmp4: 5'-TGTAGTTTTTATGCCTTTGGCTATTATGAAAGAGGT (서열 8)
tmf = 전방향 프라이머
tmr = 역방향 프라이머
tmp = 프로브
하기 실시예 12에 기재한 바와 같이 수행한 원위치 혼성화를 통해, 세뇨관 상피 세포, 자궁근층 및 유관 및 유엽 주변의 간질 세포에서는 Stra6가 발현된다는 것을 확인하였으나, 뇌, 간, 비장, 췌장, 심장, 폐, 위, 소장, 결장, 전립선, 비장 및 부신 피질의 절편에서는 거의 발현되지 않거나 전혀 발현되지 않는 것으로 검출되었다 (데이타는 나타내지 않음). 원위치 혼성화로 시험한 정상적인 조직 중 최고의 발현 수준은 태반 및 부신 수질에서 나타났는데, 이는 PCR 분석법에서는 포함하지 않았던 부분이었다.
실시예 12: 인간 종양에서 천연 인간 PRO10282 ( Stra6 ) 전사체의 과발현
본 실시예는 천연 인간 전장 PRO10282 (Stra6)를 코딩하는 유전자가 특정 인간 결장 종양 및 또한 결장, 폐, 신장 및 유방 등을 비롯한 여러가지 인간 종양에서 유도된 세포주에서 상당히 과발현된다는 것을 나타낸다.
스크리닝을 위한 출발 물질은 인간 결장 종양 또는 여러 인간 결장, 신장, 유방 또는 폐 종양 세포주로부터 단리된 전체 RNA였다. 결장 종양 조직에서, Stra6 RNA 발현량을 동일 환자의 정상적인 결장 조직 (점막)으로부터의 RNA에 대해 측정했다. 여러가지 종양 세포주에서의 Stra6 RNA 발현량을 여러가지 정상 세포주 (즉, 정상적인 결장, 신장 및 폐 세포주)에서의 경우와 비교하여 측정했다.
실시간 정량적 PCR (RT-PCR, 예를 들어, TAQMAN ABI PRIZM 7700 (등록상표) 시퀀스 검출 시스템 (Sequence Detection System) (등록상표) [Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, California])을 이용하고 Taqman 분석 시약을 사용하여 정상적인 세포 및 특정 암 또는 암 세포주의 세포에서 유전자 (DNA148380-2827에 해당)를 코딩하는 PRO10292 (Stra6)의 발현 수준 차이를 정량적으로 모니터링했다. RT-PCR 반응물 50 ㎕은 10 ×Taqman 완충액 A 5 ㎕, 300 mM 각 dNTF, 5 mM MgCl2, RNAse 억제제 10 유닛, MuLV 역전사효소 12.5 유닛, AmpliTaq Gold DNA 중합효소 1.25 유닛, 200 nM 프로브, 500 nM 프라이머 및 100 ng RNA로 구성되었다. 반응 조건은 48℃에서 30 분 동안의 역전사, 95℃에서 25 초 동안의 변성 및 65℃에서 1 분 동안의 변성으로 구성되었다. 반응 생성물을 4 내지 20％ 폴리아크릴아미드 겔 (Novex) 상에서 분석했다.
표준 곡선을 사용하여 각 관심 유전자 및 분석된 각 시료에서의 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH) 하우스킵핑 (housekeeping) 유전자의 상대적인 발현 수준을 측정하였다. 관심 mRNA의 유전자를 GAPDH mRNA 수준으로 나눔으로써 비교적 표준화된 유닛을 얻었다. 상기 비교적 표준화된 유닛을 실험 시료와 대조구 사이에서 비교하여 유도량을 측정했다.
이 결과를 사용하여 PRO10282를 코딩하는 mRNA가 스크리닝한 원발성 결장암 또는 결장암, 신장암, 유방암 또는 폐암 세포주 중 임의의 것에서 과발현되는지 여 부를 결정하였다. 분석에 사용한 인간의 정상적인 시료 및 이에 상응하는 결장 종양 시료 몇 개의 조직조사 결과는 다음과 같다 (도 11 및 도 12 참조):
번호 조직조사 결과
850 침습성 선암종; 괴사가 일어나지 않음; 보존상태 양호.
851 침습성 선암종; 괴사가 최소로 일어남; 상태 양호.
892 침습성 선암종; 괴사가 최소로 일어남; 상태 양호.
869 침습성 선암종; 괴사가 최소로 일어남; 상태 양호.
893 정상적인 점막 - 형성이상 - 침습성 선암종; 약간의 괴사가 일어남; 상태 양호.
870 선암종 - 심각한 형성이상; 괴사가 최소로 일어남; 상태 양호
871 선암종 - 형성이상 - 정상적인 점막; 괴사가 일어나지 않음; 상태 양호.
848 선암종 - 융모성 선종에서 발생하는 것으로 여겨짐; 정상적인 점막/점막하; 괴사가 일어나지 않음, 상태 양호.
*872 침습성 선암종; 약 70％의 종양이 괴사성임; 전반적인 보존상태 양호.
778 선암종 - 특이한 유두 모양; 정상/증식성 점막; 괴사가 최소로 일어남; 보존상태가 허용가능함.
17 선암종이 중간정도로 잘 분화됨.
18 선암종이 잘 분화됨.
64 선암종이 중간정도로 잘 분화됨.
76 선암종이 중간정도로 잘 분화됨.
인간 폐 세포주로는 정상적인 인간 폐 섬유아세포 세포주 MRC5 (CCL-171) 및 IMR90 (CCL-186), 인간 폐 암종 상피성 세포주 A549 (SRCC768, CCL-185), 인간 표피양 폐 암종 세포주 Calu-1 (SRCC769; HTB-54), 인간 퇴행성 암종 세포주 Calu-6 (SRCC770, HTB-56 - 아마도 폐일 것임), 폐에 유두상 선암종이 있는 환자의 심막액에서 유도한 인간 상피성 세포주 NCI-H441 (SRCC772; HTB-174) 및 인간 폐 편평 세포 암종 세포주 SW900 (SRCC775; HTB-59) 등이 있으며, 이들 모두 ATCC로부터 이용가능하다.
결장 세포주의 예로는 정상적인 결장 섬유아세포 세포주 CCD112Co (CRL-1541), 인간 직장결장의 선암종 세포주 CaCo-2 (HTB-37), 인간 직장결장의 선암종 세포주 WiDr- (CCL-218), 인간 직장결장의 암종 세포주 HCT116 (CCL-247), 인간 직장결장의 선암종 세포주 SK-Co1 (HTB-39), 인간 직장결장의 선암종 세포주 COLO320 (SRCC778; CCL-220), 인간 직장결장의 선암종 세포주 HT29 (SRCC779; HTB-38), 인간 직장결장의 선암종 세포주 SW403 (CCL-230), 인간 결장암 세포주 NCI/HCC2998 및 인간 직장결장의 선암종 세포주 Colo320DM (CCL-220) 등이 있으며, 이들 모두 ATCC 또는 기타의 공공 공급원으로부터 이용가능하다.
인간 유방 암종 세포주로는 인간 유방 선암종 세포주 MCF7 (SRCC766; HTB-22) 및 인간 유방암 세포주 NCI/ADR-RES 등이 있으며, 두가지 모두 공개적으로 입 수가능하다.
신장 세포주로는 아데노바이러스 5 DNA로 형질전환시킨 293 세포주 (CRL-1573)가 있다. 윌름스 종양 세포주인 G401 (CRL-1441) 및 SK-NEP-1 (CRL-1573) 두가지 역시 이 분석에 포함시켰다.
RNA 프렙 :
상기에서 배양한 세포주로부터 RNA를 프렙하였다. 정제 키트, 완충액 셋트 및 프로테아제 (Qiagen)를 사용하여 하기 기재한 제조업자의 지시에 따라 단리하였다. 더욱 구체적으로, 배양물 내 세포로부터의 전체 RNA는 퀴아젠 RNeasy 미디-컬럼을 사용하여 단리했다. 조직 시료로부터의 전체 RNA는 RNA Stat-60 (Tel-Test)을 사용하여 단리했다. 종양으로부터 프렙한 RNA는 염화세슘 밀도 구배 원심분리를 통해 단리했다.
인간 충실성 종양 시료 제조 및 세포용해:
종양 시료의 무게를 달아 50 mL 원뿔형 튜브에 넣고 빙상에 방치하였다. 1 회 제조시 조직 250 mg 이하로 제한하여 처리하였다 (1 팁/1 회 제조). 프로테아제 용액을 차가운 ddH2O 6.25 mL 중에 희석시켜 최종 농도 20 mg/mL로 새로 제조한 후 4℃에 보관하였다. DNAse A의 최종 농도가 200 ㎍/mL가 되도록 희석 (100 mg/mL 스톡을 사용하여 희석)시킨 G2 완충액 (20 mL)을 제조하였다. 에어로졸의 흡입을 방지하기 위해서 라미나-플로우 TC 후드 중에서 폴리트론의 큰 팁을 사용하여, 종양 조직을 G2 완충액 10 mL 중에서 60 초 동안 균질화하고 실온에 두었다. 시료와 시료 사이마다 폴리트론을 ddH2O 2 L 중에서 30 초씩 2 회 회전시켜 세정한 후 G2 완충액 (50 mL)으로 세정하였다. 생성기 팁 상에 조직이 남아있던 경우에는 기기를 분해하여 세정하였다.
퀴아젠 프로테아제 (상기한 바와 같이 제조됨, 1.0 mL)를 첨가한 후 볼텍싱하고 3 시간 동안 50℃에서 인큐베이션하였다. 용해물이 투명해질 때까지 인큐베이션 및 원심분리를 반복하였다 (예를 들어 30 내지 60 분을 더 인큐베이션하고 4℃에서 10 분 동안 3000 ×g로 펠렛화함).
정량:
먼저, RNA의 실시간 PCR 분석으로 얻은 결과를 델타 (Δ) CT 유닛으로 나타냈다. 1 유닛은 PCR 1 사이클에 상응하거나 또는 정상에 비해 약 2 배 증폭에 상응하며, 2 유닛은 4 배, 3 유닛은 8 배 증폭 등에 상응한다. 이러한 데이타는 배수 차이로 전환시켜 나타낸다. 우선, 프라이머로서 올리고 (dT)를 사용하여 폴리A + RNA 또는 RNA 총 100 ng로부터 역전사효소를 사용하여 cDNA를 합성했다. 이어서, 생성된 cDNA를 PCR의 주형으로 사용했다. 정량은 PRO10282 코딩 서열의 3' 비번역 영역으로부터 유도한 프라이머 및 각 삽입 서열에 해당하는 TAQMAN (등록상표) 형광 프로브를 사용하여 수행했다. 3' 영역의 사용으로 게놈 DNA에서 인트론-엑손 경계의 교차를 피할 수 있으며, 이 방법에서 RNA 발현을 정확하게 평가하기 위한 필수적인 필요조건이다. PRO10282 코딩 유전자 증폭에 사용한 프라이머 및 프로브 (전방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브) 서열은 다음과 같았다:
한 셋트에는 실시예 11에 기재한 전방향 및 역방향 프라이머 및 프로브가 포함되었으며, 각각 서열 6, 7 및 8과 같았다.
다른 셋트는 다음과 같았다:
hStra6.tmfl1: 5'-AGACCAGGTCCCACACTGA (서열 9)
hStra6.tmr1: 5'-TTCATAATAGCCAAAGGCATAAAA (서열 10), 및
h.Stra6.tmp1: 5'-CTGCCCACACTCGAGAGCCAGAT-3' (서열 11)
인간 GAPDH:
전방향 프라이머: 5'- GAAGATGGTGATGGGATTTC-3' (서열 14)
역방향 프라이머 ; 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3' (서열 15)
프로브: 5'-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3' (서열 16)
5' 뉴클레아제 분석 반응은 Taq DNA 중합효소의 5' 엑소뉴클레아제 활성을 이용하여 증폭을 실시간으로 모니터링하는 형광 PCR-기재 기술이다. 2 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR 반응에 통상적인 앰플리콘을 생성한다. 제3 올리고뉴클레오티드 또는 프로브는 2 개의 PCR 프라이머 사이에 위치한 뉴클레오티드 서열을 검출하도록 디자인된다. 프로브는 Taq DNA소 중합효소에 의해 신장될 수 없으며 리포터 형광 염료 및 켄쳐 (quencher) 형광 염료로 표지된다. 리포터 염료로부터의 레이저 유도 방출은 2 개의 염료가 프로브 상에 함께 가까이 위치할 때 켄칭 염료에 의해 켄칭된다. 증폭 반응 동안, Taq DNA 중합효소는 주형 의존적 방식으로 프로브를 절단한다. 이렇게 생성된 프로브 단편을 용액 중에서 해리시키고, 방출된 리포터 염료의 신호를 2차 형광단의 켄칭 영향을 받지 않게 한 다. 합성된 새로운 분자 각각에 대해 리포터 염료 분자가 하나씩 방출되며, 비켄칭 리포터 염료의 검출은 데이타의 정량적 해석의 기초를 제공한다.
상기 기재한 바와 같이, 5' 뉴클레아제 방법은 실시간 정량 PCR 장비, 예를 들어 ABI PRIZM 7700 (등록상표) 시퀀스 검출 시스템 (등록상표)에서 실시된다. 이 시스템은 주기적 가열기, 레이저, 하전-커플 장비 (CCD), 카메라 및 컴퓨터로 구성된다. 본 시스템은 주기적 가열기에서 96 웰 포맷으로 시료를 증폭시킨다. 증폭시키는 동안 레이저로 유도된 형광 신호가 광섬유 케이블을 통해 96 웰에 실시간으로 모아져 CCD에서 검출된다. 본 시스템은 장치를 작동하고 데이타를 분석하기 위한 소프트웨어를 포함한다.
5' 뉴클레아제 분석 데이타는 초기에는 Ct 또는 임계 사이클 (threshold cycle)로 표현된다. 이것은 리포터 신호가 형광의 기본 수준 이상으로 축적될 때의 사이클로 정의된다. Ct 값은 암 세포의 RNA 발현량을 정상적인 세포의 것과 비교할 때 핵산 시료 내 특정 표적 서열의 출발 카피의 상대적 수치의 정량적 측정치로서 이용된다.
결과:
인간 Stra6 RNA (DNA148380-2827에 해당)는 인간 결장 종양 조직에서 해당하는 정상적인 인간 결장 조직에 비해 강한 과발현을 나타냈다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 인간 Stra6 RNA (DNA148380-2827에 해당)는 시험한 모든 14 개 인간 종양 결장 조직에서 동일 환자의 매치되는 정상적인 직장결장의 점막으로부터의 RNA에 비해 과발현되는 것으로 밝혀졌다. 과발현 정도는 2 내지 170 배 사이였으며, 14 개 종양 조직 시료 중 7 개에서는 약 10 배였다. 정량적 PCR에 의해 얻어진 사이클 임계값은 Stra6 mRNA 수준이 정상적인 점막 시료 중 많은 시료에서 매우 낮거나 가능하다면 없음을 지시했다.
제2의 검출 방법으로, 정량적 PCR 반응의 완결 후 (각 40 회의 사이클)에 수득된 생성물을 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동시키고 브롬화에티듐 염색하여 가시화했다. 도 12a에 나타낸 바와 같이, 하우스킵핑 유전자인 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH)의 발현을 표준으로 이용한 실험에서, 정상적인 대응 시료에 비해 종양 시료의 Stra6 mRNA로부터 상당히 더 많은 양의 PCR 산물을 생성했다. 반대로, 모든 시료에서 내부 대조구 GAPDH mRNA로부터의 생성물은 비슷한 수준이었다.
결장 선암종에서의 Stra6 발현은 다음과 같이 수행한 원위치 혼성화 (ISH)를 통해 상피성 종양 세포에서 발생함을 알아냈다. 32P-표지된 센스 및 안티센스 리보프로브를 DNA148380-2827에 의해 코딩되는 인간 Stra6 폴리펩티드 코딩 서열의 뉴클레오티드 432 내지 1247에 해당하는 874 bp PCR 산물로부터 전사시켰다. 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 묻은 조직 절편을 상기 기재한 바와 같이 처리하였다 (Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:14717-22 [1998]). 이 결과를 도 12b에 나타냈다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 인간 Stra6 RNA (DNA148380-2827에 해당) 역시 여러가지 유방, 신장, 결장 및 폐 종양 세포주에서 상당히 과발현된다. "상대적인 RNA 발현"이란, 정상 조직 및 종양 조직에서의 RNA 발현량이 임의로 선택된 표준 세포주 SW480에서의 발현량과 차이가 있음을 의미한다.
또한, 여러가지 종양 절편에서 얻어진 원위치 혼성화 결과도 도 16에 나타냈다. 결장 선암종이 아닌 몇가지 종양 유형에서도 Stra6 발현이 높은 수준인 것으로 나타났다. 이러한 종양 유형에는 3 가지의 흑색종 중 3 가지 (도 16A 및 B), 4 가지의 자궁내막 선암종 중 3 가지 (도 16C 및 D), 3 가지의 난소 선암종 중 2 가지 및 신장의 윌름스 종양 (도 16E 및 F)이 포함된다. 이러한 여러가지 종양에서의 Stra6 원위치 혼성화 신호는 결장 선암종에서의 신호보다 꽤 높으며, 이는 정상적인 신장 및 자궁에서 발현 수준이 비교적 높고 정상적인 결장에서 비교적 낮다는 데이타와 일치한다. Stra6이 정상적인 부신 수질에서 검출되기 때문에, 이 조직에서 유도한 종양인 2 개의 크롬친화세포종에 대해서도 시험했다. 이러한 종양에서, Stra6 발현량은 이 연구에서 시험한 임의의 다른 종양 또는 조직에서의 발현량보다 높았다 (도 16G 및 H). Stra6은 정상적인 신장에서는 검출되지 않았고 윌름스 종양에서는 강하게 발현되었으나, 신장 세포 암종에서는 검출되지 않았다. 신장에서의 이행성 세포 암종에서는, 종양 상피 세포가 아닌 종양-관련 간질 세포가 Stra6을 발현했다 (데이타는 나타내지 않음).
PRO10282를 코딩하는 DNA148380-2827 mRNA는 여러가지 종양 및 세포주로부터 유래한 수많은 종양에서 과발현되기 때문에, 종양 형성 및(또는) 생장과 관련이 있는 것으로 여겨진다. 결과적으로, DNA148380-2827에 의해 코딩되는 단백질 (PRO10282) 또는 상기 단백질의 기타의 자연 발생 변이체, 예를 들어 DNA148389- 2827-1에 의해 코딩되는 PRO19578에 대해 유도된 길항제 (예를 들면, 항체, 유기 및 무기 소분자, 펩티드 및 폴리펩티드, 예를 들어 Stra6 변이체, 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 암, 특히 결장, 폐, 유방 및(또는) 신장암의 진단, 예방 및(또는) 치료에 유용할 것이라 예측되나, 이에 제한되지 않는다.
DNA148380-2827에 의해 코딩되는 단백질 (PRO10282)에 대해 유도된 치유성 항체 등과 같은 길항제의 효능은 PRO10282를 코딩하는 유전자 발현을 자극하는 활성제에 의해 증진될 수 있었다. 예를 들면, 9-시스-레티노산 또는 모든 트랜스-레티노산을 사용한 인간 직장결장암 세포주의 치료법은 Stra6 mRNA 발현을 크게 증진시켰다 (도 15). 따라서, PRO10282에 대해 지시된 치유성 항체를 적당한 레티노이드와 병용하는 암 환자의 치료법은 항체에 의한 종양 사멸을 증진시킬 것이라 예측된다. 여러가지 종양에서 과발현되는 다른 천연 Stra6 폴리펩티드, 예를 들어 DNA148389-2827-1에 의해 코딩되는 인간 스플라이싱 변이체에 대해 유도된 항체의 경우에도 동일할 것이다.
실시예 13: Wnt -1 및 레티노이드에 의한, Stra6 의 상승작용적 유도
물질 및 방법
세포 배양
C57MG 및 C57MG/Wnt-1 세포를 10％ 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민 및 2.5 ㎍/mL 퓨로마이신으로 보충된 듈베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle medium) (Edge Biosystems) 중에서 생장시켰다. 테트라사이클린에 내성이 있으며 Wnt-1를 발현하는 C57MG 세포를 퓨로마이신이 없고, 400 ㎍/mL G418 (Gibco BRL), 100 ㎍/mL 하이그로마이신 B (Gibco BRL) 및 50 ng/mL 테트라사이클린으로 보충된 완전 배지에서 생장시켰다 (Korinek et al., Mol. Cell Biol. 18:1248-56 [1998]). Wnt-1 유도를 연구하기 위해, 세포를 인산염완충염수로 세척하고, 테트라사이클린이 없는 배지에서 10, 24, 48, 72 및 96 시간 동안 배양한 후에 회수했다. 제0 시간의 대조구 디쉬 (dish)는 전체를 테트라사이클린을 포함하는 배지 중에 유지시켰다. 모든 디쉬들을 동시에 회수하고 각 시간 별로 전체 RNA를 추출했다. 각 시료로부터의 총 100 ng RNA에 대해 Wnt-1, Stra6 및 GAPDH 특이적 프라이머 및 프로브를 사용하여 RT-PCR을 수행했다.
인간 결장 선암종 세포주 HCT116 및 WiDr 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에서 얻었다. HCT116 세포를 10％ 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충된 맥코이 (McCoy) 5A 배지에서 유지했다. WiDr 세포를 10％ FBS로 보충된 듈베코 최소 필수 배지 (DMEM)에서 유지했다. 레티노산 유도를 연구하기 위해, 세포를 배지 2.5 mL을 포함하는 60 mm 디쉬 당 105 세포로 플레이팅하고 24 시간 동안 배양했다. 세포에 비타민 D3, 모든 트랜스-RA (Spectrum Laboratory Products) 또는 9-시스-RA (Toronto Research Chemicals Inc.) (DMSO 중에서의 최종 농도: 1 μM)를 지정된 시간 동안 처리했다. 대조구 세포에는 동일한 부피의 DMSO를 처리했다.
C57MG/모세포를 Wnt-3a 컨디셔닝 배지로 처리하기 위해, 상기 세포를 통상의 배지 또는 L-세포 또는 L-W3A 세포로부터의 컨디셔닝 배지에서 1 μM 9-시스-RA의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션시켰다. 컨디셔닝 배지는 상기 기재한 바와 같이 제조했다 (Willert et al.,Genes Dev. 13:1768-73 [1999]). 제48 시간에, 세포를 플루오르화나트륨 및 바나듐산염을 포함하는 PBS 중으로 긁어내어 회수하고 액체 질소 중에 신속하게 동결시켰다. 제조업자의 지시에 따라 컬럼에 DNaseI을 추가로 처리한 RNAeasy 키트 (Qiagen)를 사용하여 RNA를 프렙했다.
웨스턴 블롯팅
C57MG/Wnt-1 TET 세포주를 테트라사이클린 없이 0, 24, 48 또는 72 시간 동안 배양하여 이 세포주에서 Wnt-1 발현을 유도했다. 세포를 트리톤 X-100 용해 완충액 [20 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 1％ 트리톤 X-100, 1 mM EGTA, 10％ 글리세롤, 1.5 mM MgCl2, 1 mM 디티오트레이톨, 1 mM 바나듐산나트륨, 50 mM 플루오르화나트륨 및 완전 프로테아제 억제제 칵테일 (Boehringer Mannheim)] 중에서 용해시키고 단백질-등가물을 사용하여 SDS-PAGE 및 면역블롯팅을 수행했다. 블롯을 β-카테닌에 대한 0.2 ㎍/mL 친화성 정제 토끼 폴리클로날 항체 (Rubinfeld et al., Science 262:1731-1734 [1993]), 0.1 ㎍/mL 항-ERK2 모노클로날 항체 (Transduction Laboratories) 또는 RARγ-1에 대한 1 : 2000 토끼 폴리클로날 항혈청 (Affinity Bioreagents)와 함께 인큐베이션했다. WiDr 세포주의 경우, 세포에 1 μM의 모든 트랜스-RA를 48 시간 동안 처리한 후, 트리톤 X-100 용해 완충액 중에서 용해시키고 상기 기재한 바와 같이 처리했다. 블롯을 1 : 50 항-Stra6 펩티드 B 모노클로날 하이브리도마 배양 상등액 (클론 12F4.2H9.1D5)과 함께 인큐베이션시켰다.
면역조직화학 분석
WiDr 세포에 9-시스-레티노산 또는 DMSO를 처리한 후에 떼어내고 저속 원심분리를 통해 펠렛화했다. 세포 펠렛을 10％ 중성 포르말린 완충액 중에 밤새 고정시키고 탈수시켜 파라핀에 묻었다. 상기 기재한 바와 같이 (Eberhard et al., Am. J. Pathol. 145:640-9 [1994]), 일차 항체로서 항-Stra6 펩티드 B 모노클로날 하이브리도마 배양 상등액 (클론 12F4.2H9.1D5) 또는 비특이적 마우스 이소타입 IgG2A을 사용하여 면역조직화학 분석을 수행한 후, 크로모겐으로서 디아미노벤지딘을 사용하는 아비딘-바이오틴 결합체를 사용한 검출을 수행했다 (Vectastain Elite Kit, Vector Laboratories). 헤마톡실린을 사용하여 절편들을 대조염색했다.
Wnt -1 형질전환 마우스
유선에서 Wnt-1 프로토-온코진을 발현하는 형질전환 마우스는 통상적으로 증식성 병변을 나타내고 이 조직에서 신생물을 발달시킨다 (Tsukamoto et al., Cell 55:619-625 [1988]). 이러한 마우스를 하기 실험에 사용했다.
결과
이스와란 (Easwaran) 등은 MCF-7 세포를 β-카테닌 돌연변이체로 동시에 형질감염시키고 레티노이드를 처리하는 경우, 합성 레티노산에 반응성인 리포터 유전자의 활성이 증진된다고 보고한 바 있다 (Easwaran et al., Curr. Biol. 9:1415-1418 [1999]). 이를 고려할 때, Stra6이 레티노산 유도가능한 유전자로서 확인되었다 (Bouillet et al., Mech Dev. 63:173-186 [1997])는 점과 함께 레티노산이 C57MG 세포주에서 Wnt-1과 상승작용을 일으켜 Stra6 수준을 증가시킬 수 있는지 여 부에 관해 관심을 가졌다. C57MG 모세포에 9-시스-RA 또는 모든 트랜스-RA (ATRA)를 48 시간 동안 처리하였을 때, Stra6 mRNA 수준은 상당히 증가했으나 DMSO 및 비타민 D3는 아무 효과가 없었다 (도 17A). 예측한 바와 같이, DMSO 또는 비타민 D3로 처리한 C57MG/Wnt-1 세포의 Stra6 mRNA 수준은 모 세포주에 비해 증진되었다. Wnt-1에 의한 Stra6 유도 수준은 C57MG 모세포를 9-시스-RA로 자극했을 때 관찰된 경우와 비슷했다. 그러나, C57MG/Wnt-1 세포주에 대한 9-시스-RA 처리는 Stra6 mRNA 수준을 미처리 C57MG/Wnt-1 또는 9-시스-RA 처리한 C57MG 모세포에 비해 10 배 더 증가시켰다. 모든 트랜스-RA에 대해 유사한 결과를 얻었다.
C57MG/Wnt-1 세포주에서는 Wnt-1 발현과 관련없는 잠재적인 클론 변이가 가능하여 레티노산에 대한 반응에서 대조구 모세포와 차이가 나는 것일 수 있다. 이를 밝히기 위해, 9-시스-RA의 존재 또는 부재 하에 가용성 Wnt-3a 자극에 대한 C57MG 모세포의 반응을 시험하였다. Wnt-3a는 Wnt-1과 유사한 형질전환 특성을 나타내는 Wnt-1 상동체로서, 이는 마우스 L-세포에서 가용성 리간드로 생산될 수 있다. Wnt-3a를 발현하는 L-세포 배양물로부터의 컨디셔닝 배지는 C57MG 세포에서 Stra6의 발현을 유도했지만 대조구 L-세포 배양물로부터의 것은 그렇지 않았다 (도 17B). C57MG 세포에 9-시스-RA를 처리한 경우에는 유도 수준이 다소 더 높은 것으로 관찰되었다. 그러나, 9-시스-RA와 Wnt-3a를 병용한 경우에는 Stra6 전사체 수준이 상기 활성제 중 어느 하나를 처리한 경우에 비해 훨씬 증가했다.
레티노산 처리한 C57MG/Wnt-1세포에서의 Stra6 유도가 β-카테닌 수준 증가에 의해 상승작용을 받는다면, β-카테닌 또는 APC에서 돌연변이가 있는 인간 결장 암종 세포에서는 레티노산에 의한 Stra6 유도 반응이 유사할 것임은 누구나 예측할 수 있다. 이러한 예측을 확인하기 위해서, β-카테닌에 활성화 돌연변이가 있는 HCT116 세포 및 야생형 APC의 2 카피가 모두 없는 WiDr 세포에서 레티노산 처리 이전 및 이후의 Stra6 mRNA 수준을 측정했다. 두 세포주 모두에서, ATRA 또는 9-시스-RA를 처리한 후의 Stra6 mRNA 수준이 DMSO 또는 비타민 D3를 처리한 경우에 비해 상당히 증가한 것으로 나타났다 (도 17C). HCT116 세포주에서 ATRA에 의한 Stra6 유전자의 활성화를 원위치 혼성화를 통해 확인하였다 (도 17D). ATRA로 처리한 WiDr 세포에서 예상되는 73 kDa의 Stra6 단백질 밴드의 유도가 Stra6 특이적 모노클로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅 분석을 통해 검출되었다 (도 17E). WiDr 세포의 면역조직화학적 분석을 통해 레티노산에 대한 반응으로 증가한 Stra6 단백질이 원형질막에 위치함을 알아냈다 (도 17F).
RARγ 유전자는 제노푸스 배에서 Wnt 신호전달에 관한 표적으로 제안된 바 있고, 레티노이드에 의한 Stra6 유도는 이러한 레티노산 수용체 서브타입의 존재에 따라 달라지는 것으로 나타났다 (McGrew et al., Mech. Dev. 87:21-32 [1999]; Taneja et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7854-8 [1995]). 이와 더불어, 이러한 관찰 결과들은 Wnt 및 레티노이드에 의한 Stra6의 상승적인 활성화가 Wnt 신호전달에 의한 RARγ 발현의 활성화에 기인할 수 있음을 암시한다. Wnt-1 신호전달이 포유동물 세포에서 RARγ의 수준에 미치는 영향을 측정하기 위해서, 조건에 따라 Wnt-1를 발현하는 C57MG 세포로부터 얻은 세포용해물에 있는 수용체에 관한 웨스턴 블롯팅을 수행했다. Wnt-1 발현 후에, RARγ-1에 특이적인 항체와 반응성 을 나타내고 분자량이 명백하게 64 kDa인 단백질이 제24 시간에 유도되었고, 이의 발현은 제48 시간에 증가했다 (도 18A). 또한, Wnt-1 형질전환 마우스로부터의 증식성 유선 및 유선 종양을 분석하여, 이들 조직에서 정상적인 유선에 대한 RARγ mRNA의 상승 수준을 검출했다. 19 가지 선암종에서 단리한 동량의 RNA에 존재하는 RARγ 전사체의 수준을 정량적 PCR로 평가했다. 주목할 만한 것은, RARγ mRNA 발현이 시험된 인간 결장 종양 19 가지 중 14 가지 (74％)에서 정상적인 인간 결장 조직에 비해 약 2 내지 4 배 증가했다는 점이다 (도 18C). 이러한 결과는 Wnt-1 신호전달이 RARγ의 발현을 촉진하여 마우스 및 인간 종양에서 수용체가 Wnt-1 경로에 의해 상승된다는 것을 증명한다.
실험적 발견들에 관한 고찰
유전자 발현의 프로파일 접근법은 mRNA 전사체의 공정한 검출을 바탕으로 하므로, 유전자 활성화가 발행하는 메카니즘에 관한 예기치못한 통찰로 이끌 수 있다. 이는 Wnt-1이 레티노산 반응성 유전자 Stra6의 유도를 촉진한다는 것을 나타내며, Wnt 및 레티노산에 의해 유도된 신호전달 경로들간의 관련성을 암시한다. 이러한 관련성은 Wnt와 레티노산의 병용에 의한 Stra6의 상승적 유도를 증명함으로써 더욱 뒷받침되었다. 이러한 상승작용을 설명할 수 있는 대안이 적어도 3 가지 있다: i) Wnt에 직접적으로 반응하는 전사 인자, 예를 들어 TCF/LEF가 Stra6 유전자 내의 프로모터 요소에 결합하여 활성화시킬 수 있음; ii) Wnt 경로 중의 신호전달 성분들이 적당한 레티노산 수용체 (RAR)와 직접 상호작용하여 RAR에 의해 매개되는 유전자 활성화를 상승시킬 수 있음; 또는 iii) Wnt-1에 의한 신호전달이 적당 한 RAR의 발현을 활성화시켜서, 세포를 레티노산에 감수성 있게 할 수 있음. 본원에 제시된 데이타는 Wnt-1 신호전달이 RARγ 수용체의 발현을 신속하게 유도한다는 것을 나타내기 때문에 이 마지막 제안이 유력하지만, 본 발명은 어떠한 특정 이론 또는 메카니즘에 제한되지 않는다.
기존의 작업들은 RARγ 유전자의 특이적인 분포가 레티노이드에 의한 Stra6 유전자 유도를 크게 감소시키며, 이것은 상기 수용체의 재발현을 통해 구제된다는 것을 나타냈다 (Taneja et al., 상기 문헌). 그러나, 상기 메카니즘이 RARγ의 Wnt-1-유도된 발현 뿐 아니라 상기 관찰된 상승작용에 기여할 수도 있다. β-카테닌이 레티노산 수용체에 결합한다는 제안이 그럴듯 하지만, 본 발명의 실험에 사용한 세포주 내에서는 내인성 RARγ과 β-카테닌의 임의의 특정 결합을 관찰하지 못했다. 그러나, RARγ에 대한 β-카테닌의 결합은 시험관내에서 나타난 바와 같이 (Easwaran et al., 1999, 상기 문헌), Wnt-1에 의한 Stra6의 활성화와 관련있을 수 있다. RARγ에 대한 널 (null) 형질전환 동물에서의 Stra6의 발현 패턴은 야생형 새끼에서 관찰되는 것보다 더욱 보편적이며, 레티노산에 의한 Stra6 유도는 널 동물의 세포에서 대조구에 비해 상승되었다 (Bouillet et al., 1997, 상기 문헌; Taneja et al., 1995, 상기 문헌). 따라서, RARγ는 Stra6 발현을 억제할 수 있고, β-카테닌이 RARγ 기능을 억제하는 경우, Wnt-1에 의한 β-카테닌 활성화는 이러한 억제를 잠재적으로 경감시킬 수 있다.
Wnt-1 신호전달에 의한 레티노산 반응성 유전자의 상승적 유도는 Wnt-1 경로에 유전적 결함이 있는 인간 암이 Stra6을 과발현한다는 것을 암시한다. 직장결장 종양의 대다수가 APC 종양 억제제 또는 β-카테닌을 코딩하는 유전자에 돌연변이가 있으므로 (Polakis, Curr. Opin. Genet. Dev. 9:15-21 [1999]), 14 가지 직장결장 종양 중 14 가지에서 상응하는 정상 조직에 비해 Stra6 전사체가 과발현됨을 검출했다 (실시예 12 참조). β-카테닌에서의 활성화 돌연변이는 난소 및 자궁내막의 암, 신장의 윌름스 종양 및 흑색종에서도 확인된 바 있으며, 이는 Wnt-1 신호전달에서의 결함이 이러한 암의 진행에 기여한다는 것을 증명한다 (Kobayashi et al. Jpn. J. Cancer Res. 90:55-9 [1999]; Koesters et al., Cencer Res. 59:3880-2 [1999]; Palacios and Hamallo, Cancer Res. 58:1344-7 [1998]; Rimm et al. Am. J. Pathol.154:325-9 [1999]; Rubinfeld et al. Science 262:1731-1734 [1993]; Wright et al. Int. J. Cancer 82:625-9 [1999]). 이러한 4 가지 인간 암 모두가 Stra6 mRNA을 과발현하며, 이는 원위치 혼성화에 의해 측정되는 바와 같다 (실시예 12 참조). 부신 수질에서 유도된 종양인 크롬친화세포종은 매우 높은 수준의 Stra6 mRNA를 나타내지만, 이러한 종양이 Wnt-1 신호전달 경로에 돌연변이가 있는 상태로 보고된 적은 없다. 흥미롭게도, 흑색종 및 크롬친화세포종을 일으키는 유형의 세포는 공통적으로 발생학적 기원이 신경능선이다. 주목할 만한 것은, 신장의 윌름스 종양, 크롬친화세포종 및 자궁내막 암종 모두가 Stra6이 정상적으로 발현되는 기관에서 일어난다는 점이다. 이는 종양발생성 신호전달, 예를 들어 Wnt-1 경로에 의한 신호전달이 분화에 관한 신호와 상호작용함으로써 Stra6 발현을 과다 활성화할 수 있음을 암시한다.
인간 Stra6 단백질은 세포 표면에 위치하며, 이는 인간 Stra6 단백질에 특 이적인 모노클로날 항체를 사용한 직장결장암 세포의 염색을 통해 확인된 바와 같다. 또한, 세포막에서 관찰된 염색 강도는 세포에 레티노산을 처리한 이후에 증가했다. 따라서, Stra6은 유사하게 세포 표면에 위치한 다횡단의 막횡단 단백질을 코딩한다.
물질의 기탁
다음 물질들은 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러버드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었다:
물질 ATCC 기탁번호 기탁일
DNA148380-2827 PTA-1181 2000년 1월 11일
DNA148389-2827-1 PTA-1405 2000년 2월 23일
이들 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙 (부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정 하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30 년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크와 ATCC 사이의 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시 (이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙 (37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.
본 출원의 양수인은 적합한 조건 하에 배양할 때 기탁 물질의 배양물이 사멸 하거나 손실되거나 파손된 경우, 그 통지시 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
앞서 기술한 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 본 발명은 기탁된 실시양태는 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되는 것이므로 기탁된 제작물의 범위에 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의 제작물은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 임의의 측면을 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명에 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업자에게는 명백하고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위 내에 있을 것이다.
본 발명을 통해 뮤린 레티노산 반응성 단백질 Stra6와의 서열 동일성을 나타내는 신규 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제공할 수 있으며, 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 이종 폴리펩티드 서열과 연결되어 있는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드 분자, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체, 및 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법도 제공할 수 있다.
<110> Genentech, Inc. Pennica, Diane Smith, Victoria Wood, William I. <120> Novel STRA6 Polypeptides <130> GENENT.2827VPC <150> 60/197089 <151> 2000-04-14 <150> 60/175849 <151> 2000-01-13 <160> 5 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2732 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221> CDS <222> (49)...(2052) <400> 1 agtcccagac gggcttttcc cagagagcta aaagagaagg gccagaga atg tcg tcc 57 Met Ser Ser 1 cag cca gca ggg aac cag acc tcc ccc ggg gcc aca gag gac tac tcc 105 Gln Pro Ala Gly Asn Gln Thr Ser Pro Gly Ala Thr Glu Asp Tyr Ser 5 10 15 tat ggc agc tgg tac atc gat gag ccc cag ggg ggc gag gag ctc cag 153 Tyr Gly Ser Trp Tyr Ile Asp Glu Pro Gln Gly Gly Glu Glu Leu Gln 20 25 30 35 cca gag ggg gaa gtg ccc tcc tgc cac acc agc ata cca ccc ggc ctg 201 Pro Glu Gly Glu Val Pro Ser Cys His Thr Ser Ile Pro Pro Gly Leu 40 45 50 tac cac gcc tgc ctg gcc tcg ctg tca atc ctt gtg ctg ctg ctc ctg 249 Tyr His Ala Cys Leu Ala Ser Leu Ser Ile Leu Val Leu Leu Leu Leu 55 60 65 gcc atg ctg gtg agg cgc cgc cag ctc tgg cct gac 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2552 ggtcccacac tgagctgccc acactcgaga gccagatatt tttgtagttt ttatgccttt 2612 ggctattatg aaagaggtta gtgtgttccc tgcaataaac ttgttcctga gaaaaaaaaa 2672 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2732 <210> 2 <211> 667 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Ser Ser Gln Pro Ala Gly Asn Gln Thr Ser Pro Gly Ala Thr Glu 1 5 10 15 Asp Tyr Ser Tyr Gly Ser Trp Tyr Ile Asp Glu Pro Gln Gly Gly Glu 20 25 30 Glu Leu Gln Pro Glu Gly Glu Val Pro Ser Cys His Thr Ser Ile Pro 35 40 45 Pro Gly Leu Tyr His Ala Cys Leu Ala Ser Leu Ser Ile Leu Val Leu 50 55 60 Leu Leu Leu Ala Met Leu Val Arg Arg Arg Gln Leu Trp Pro Asp Cys 65 70 75 80 Val Arg Gly Arg Pro Gly Leu Pro Ser Pro Val Asp Phe Leu Ala Gly 85 90 95 Asp Arg Pro Arg Ala Val Pro Ala Ala Val Phe Met Val Leu Leu Ser 100 105 110 Ser Leu Cys Leu Leu Leu Pro Asp Glu Asp Ala Leu Pro Phe Leu Thr 115 120 125 Leu Ala Ser Ala Pro Ser Gln Asp Gly Lys Thr Glu Ala Pro Arg Gly 130 135 140 Ala Trp Lys Ile Leu Gly Leu Phe Tyr Tyr Ala Ala Leu Tyr Tyr Pro 145 150 155 160 Leu Ala Ala Cys Ala Thr Ala Gly His Thr Ala Ala His Leu Leu Gly 165 170 175 Ser Thr Leu Ser Trp Ala His Leu Gly Val Gln Val Trp Gln Arg Ala 180 185 190 Glu Cys Pro Gln Val Pro Lys Ile Tyr Lys Tyr Tyr Ser Leu Leu Ala 195 200 205 Ser Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Gly Phe Leu Ser Leu Trp Tyr Pro 210 215 220 Val Gln Leu Val Arg Ser Phe Ser Arg Arg Thr Gly Ala Gly Ser Lys 225 230 235 240 Gly Leu Gln Ser Ser Tyr Ser Glu Glu Tyr Leu Arg Asn Leu Leu Cys 245 250 255 Arg Lys Lys Leu Gly Ser Ser Tyr His Thr Ser Lys His Gly Phe Leu 260 265 270 Ser Trp Ala Arg Val Cys Leu Arg His Cys Ile Tyr Thr Pro Gln Pro 275 280 285 Gly Phe His Leu Pro Leu Lys Leu Val Leu Ser Ala Thr Leu Thr Gly 290 295 300 Thr Ala Ile Tyr Gln Val Ala Leu Leu Leu Leu Val Gly Val Val Pro 305 310 315 320 Thr Ile Gln Lys Val Arg Ala Gly Val Thr Thr Asp Val Ser Tyr Leu 325 330 335 Leu Ala Gly Phe Gly Ile Val Leu Ser Glu Asp Lys Gln Glu Val Val 340 345 350 Glu Leu Val Lys His His Leu Trp Ala Leu Glu Val Cys Tyr Ile Ser 355 360 365 Ala Leu Val Leu Ser Cys Leu Leu Thr Phe Leu Val Leu Met Arg Ser 370 375 380 Leu Val Thr His Arg Thr Asn Leu Arg Ala Leu His Arg Gly Ala Ala 385 390 395 400 Leu Asp Leu Ser Pro Leu His Arg Ser Pro His Pro Ser Arg Gln Ala 405 410 415 Ile Phe Cys Trp Met Ser Phe Ser Ala Tyr Gln Thr Ala Phe Ile Cys 420 425 430 Leu Gly Leu Leu Val Gln Gln Ile Ile Phe Phe Leu Gly Thr Thr Ala 435 440 445 Leu Ala Phe Leu Val Leu Met Pro Val Leu His Gly Arg Asn Leu Leu 450 455 460 Leu Phe Arg Ser Leu Glu Ser Ser Trp Pro Phe Trp Leu Thr Leu Ala 465 470 475 480 Leu Ala Val Ile Leu Gln Asn Met Ala Ala His Trp Val Phe Leu Glu 485 490 495 Thr His Asp Gly His Pro Gln Leu Thr Asn Arg Arg Val Leu Tyr Ala 500 505 510 Ala Thr Phe Leu Leu Phe Pro Leu Asn Val Leu Val Gly Ala Met Val 515 520 525 Ala Thr Trp Arg Val Leu Leu Ser Ala Leu Tyr Asn Ala Ile His Leu 530 535 540 Gly Gln Met Asp Leu Ser Leu Leu Pro Pro Arg Ala Ala Thr Leu Asp 545 550 555 560 Pro Gly Tyr Tyr Thr Tyr Arg Asn Phe Leu Lys Ile Glu Val 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ctcctgctct tccgttccct ggagtcctcg tggcccttct ggctgacttt ggccctggct 420 gtgatcctgc agaacatggc agcccattgg gtcttcctgg agactcatga tggacaccca 480 cagctgacca accggcgagt gctctatgca gccacctttc ttctcttccc cctcaatgtg 540 ctggtgggtg ccatggtggc cacctggcga gtgctcctct ctgccctcta caacgccatc 600 caccttggcc agatggacct cagcctgctg ccaccgagag ccgccactct cgaccccggc 660 tactacacgt accgaa 676 <210> 4 <211> 2777 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (186)...(2160) <400> 4 cacaaccagc cacccctcta ggatcccagc ccagctggtg ctgggctcag aggagaaggc 60 cccgtgttgg gagcaccctg cttgcctgga gggacaagtt tccgggagag atcaataaag 120 gaaaggaaag agacaaggaa gggagaggtc aggagagcgc ttgattggag gagaagggcc 180 agaga atg tcg tcc cag cca gca ggg aac cag acc tcc ccc ggg gcc aca 230 Met Ser Ser Gln Pro Ala Gly Asn Gln Thr Ser Pro Gly Ala Thr 1 5 10 15 gag gac tac tcc tat ggc agc tgg tac atc gat gag ccc cag ggg ggc 278 Glu Asp Tyr Ser Tyr Gly Ser Trp Tyr Ile Asp Glu Pro Gln Gly Gly 20 25 30 gag gag ctc cag cca gag ggg gaa gtg ccc tcc tgc cac acc agc ata 326 Glu Glu Leu Gln Pro Glu Gly Glu Val Pro Ser Cys His Thr Ser Ile 35 40 45 cca ccc ggc ctg tac cac gcc tgc ctg gcc tcg ctg tca atc ctt gtg 374 Pro Pro Gly Leu Tyr His Ala Cys Leu Ala Ser Leu Ser Ile Leu Val 50 55 60 ctg ctg ctc ctg gcc atg ctg gtg agg cgc cgc cag ctc tgg cct gac 422 Leu Leu Leu Leu Ala Met Leu Val Arg Arg Arg Gln Leu Trp Pro Asp 65 70 75 tgt gtg cgt ggc agg ccc ggc ctg ccc agg ccc cgg gca gtg cct gct 470 Cys Val Arg Gly Arg Pro Gly Leu Pro Arg Pro Arg Ala Val Pro Ala 80 85 90 95 gct gtt ttc atg gtc ctc ctg agc tcc ctg tgt ttg ctg ctc ccc gac 518 Ala Val Phe Met Val Leu Leu Ser Ser Leu Cys Leu Leu Leu Pro Asp 100 105 110 gag gac gca ttg ccc ttc ctg act ctc gcc tca gca ccc agc caa gat 566 Glu Asp Ala Leu Pro Phe Leu Thr Leu Ala Ser Ala Pro Ser Gln Asp 115 120 125 ggg aaa act gag gct cca aga ggg gcc tgg aag ata ctg gga ctg ttc 614 Gly Lys Thr Glu Ala Pro Arg Gly Ala Trp Lys Ile Leu Gly Leu Phe 130 135 140 tat tat gct gcc ctc tac tac cct ctg gct gcc tgt gcc acg gct ggc 662 Tyr Tyr Ala Ala Leu Tyr Tyr Pro Leu Ala Ala Cys Ala Thr Ala Gly 145 150 155 cac aca gct gca cac ctg ctc ggc agc acg ctg tcc tgg gcc cac ctt 710 His Thr Ala Ala His Leu Leu Gly Ser Thr Leu Ser Trp Ala His Leu 160 165 170 175 ggg gtc cag gtc tgg cag agg gca gag tgt ccc cag gtg ccc aag atc 758 Gly Val Gln Val Trp Gln Arg Ala Glu Cys Pro Gln Val Pro Lys Ile 180 185 190 tac aag tac tac tcc ctg ctg gcc tcc ctg cct ctc ctg ctg ggc ctc 806 Tyr Lys Tyr Tyr Ser Leu Leu Ala Ser Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu 195 200 205 gga ttc ctg agc ctt tgg tac cct gtg cag ctg gtg aga agc ttc agc 854 Gly Phe Leu Ser Leu Trp Tyr Pro Val Gln Leu Val Arg Ser Phe Ser 210 215 220 cgt agg aca gga gca ggc tcc aag ggg ctg cag agc agc tac tct gag 902 Arg Arg Thr Gly Ala Gly Ser Lys Gly Leu Gln Ser Ser Tyr Ser Glu 225 230 235 gaa tat ctg agg aac ctc ctt tgc agg aag aag ctg gga agc agc tac 950 Glu Tyr Leu Arg Asn Leu Leu Cys Arg Lys Lys Leu Gly Ser Ser Tyr 240 245 250 255 cac acc tcc aag cat ggc ttc ctg tcc tgg gcc cgc gtc tgc ttg aga 998 His Thr Ser Lys His Gly Phe Leu Ser Trp Ala Arg Val Cys Leu Arg 260 265 270 cac tgc atc tac act cca cag cca gga ttc cat ctc ccg ctg aag ctg 1046 His Cys Ile Tyr Thr Pro Gln Pro Gly Phe His Leu Pro Leu Lys Leu 275 280 285 gtg ctt tca gct aca ctg aca ggg acg gcc att tac cag gtg gcc ctg 1094 Val Leu Ser Ala Thr Leu Thr Gly Thr Ala Ile Tyr Gln Val Ala Leu 290 295 300 ctg ctg ctg gtg ggc gtg gta ccc act atc cag aag gtg agg gca ggg 1142 Leu Leu Leu Val Gly Val Val Pro Thr Ile Gln Lys Val Arg Ala Gly 305 310 315 gtc acc acg gat gtc tcc tac ctg ctg gcc ggc ttt gga atc gtg ctc 1190 Val Thr Thr Asp Val Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Phe Gly Ile Val Leu 320 325 330 335 tcc gag gac aag cag gag gtg gtg gag ctg gtg aag cac cat ctg tgg 1238 Ser Glu Asp Lys Gln Glu Val Val Glu Leu Val Lys His His Leu Trp 340 345 350 gct ctg gaa gtg tgc tac atc tca gcc ttg gtc ttg tcc tgc tta ctc 1286 Ala Leu Glu Val Cys Tyr Ile Ser Ala Leu Val Leu Ser Cys Leu Leu 355 360 365 acc ttc ctg gtc ctg atg cgc tca ctg gtg aca cac agg acc aac ctt 1334 Thr Phe Leu Val Leu Met Arg Ser Leu Val Thr His Arg Thr Asn Leu 370 375 380 cga gct ctg cac cga gga gct gcc ctg gac ttg agt ccc ttg cat cgg 1382 Arg Ala Leu His Arg Gly Ala Ala Leu Asp Leu Ser Pro Leu His Arg 385 390 395 agt ccc cat ccc tcc cgc caa gcc ata ttc tgt tgg atg agc ttc agt 1430 Ser Pro His Pro Ser Arg Gln Ala Ile Phe Cys Trp Met Ser Phe Ser 400 405 410 415 gcc tac cag aca gcc ttt atc tgc ctt ggg ctc ctg gtg cag cag atc 1478 Ala Tyr Gln Thr Ala Phe Ile Cys Leu Gly Leu Leu Val Gln Gln Ile 420 425 430 atc ttc ttc ctg gga acc acg gcc ctg gcc ttc ctg gtg ctc atg cct 1526 Ile Phe Phe Leu Gly Thr Thr Ala Leu Ala Phe Leu Val Leu Met Pro 435 440 445 gtg ctc cat ggc agg aac ctc ctg ctc ttc cgt tcc ctg gag tcc tcg 1574 Val Leu His Gly Arg Asn Leu Leu Leu Phe Arg Ser Leu Glu Ser Ser 450 455 460 tgg ccc ttc tgg ctg act ttg gcc ctg gct gtg atc ctg cag aac atg 1622 Trp Pro Phe Trp Leu Thr Leu Ala Leu Ala Val Ile Leu Gln Asn Met 465 470 475 gca gcc cat tgg gtc ttc ctg gag act cat gat gga cac cca cag ctg 1670 Ala Ala His Trp Val Phe Leu Glu Thr His Asp Gly His Pro Gln Leu 480 485 490 495 acc aac cgg cga gtg ctc tat gca gcc acc ttt ctt ctc ttc ccc ctc 1718 Thr Asn Arg Arg Val Leu Tyr Ala Ala Thr Phe Leu Leu Phe Pro Leu 500 505 510 aat gtg ctg gtg ggt gcc ata gtg gcc acc tgg cga gtg ctc ctc tct 1766 Asn Val Leu Val Gly Ala Ile Val Ala Thr Trp Arg Val Leu Leu Ser 515 520 525 gcc ctc tac aac gcc atc cac ctt ggc cag atg gac ctc agc ctg ctg 1814 Ala Leu Tyr Asn Ala Ile His Leu Gly Gln Met Asp Leu Ser Leu Leu 530 535 540 cca ccg aga gcc gcc act ctc gac ccc ggc tac tac acg tac cga aac 1862 Pro Pro Arg Ala Ala Thr Leu Asp Pro Gly Tyr Tyr Thr Tyr Arg Asn 545 550 555 ttc ttg aag att gaa gtc agc cag tcg cat cca gcc atg aca gcc ttc 1910 Phe Leu Lys Ile Glu Val Ser Gln Ser His Pro Ala Met Thr Ala Phe 560 565 570 575 tgc tcc ctg ctc ctg caa gcg cag agc ctc cta ccc agg acc atg gca 1958 Cys Ser Leu Leu Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Arg Thr Met Ala 580 585 590 gcc ccc cag gac agc ctc aga cca ggg gag gaa gac gaa ggg atg cag 2006 Ala Pro Gln Asp Ser Leu Arg Pro Gly Glu Glu Asp Glu Gly Met Gln 595 600 605 ctg cta cag aca aag gac tcc atg gcc aag gga gct agg ccc ggg gcc 2054 Leu Leu Gln Thr Lys Asp Ser Met Ala Lys Gly Ala Arg Pro Gly Ala 610 615 620 agc cgc ggc agg gct cgc tgg ggt ctg gcc tac acg ctg ctg cac aac 2102 Ser Arg Gly Arg Ala Arg Trp Gly Leu Ala Tyr Thr Leu Leu His Asn 625 630 635 cca acc ctg cag gtc ttc cgc aag acg gcc ctg ttg ggt gcc aat ggt 2150 Pro Thr Leu Gln Val Phe Arg Lys Thr Ala Leu Leu Gly Ala Asn Gly 640 645 650 655 gcc cag ccc t gagggcaggg aaggtcaacc cacctgccca tctgtgctga 2200 Ala Gln Pro ggcatgttcc tgcctaccac ctcctccctc cccggctctc ctcccagcat cacaccagcc 2260 atgcagccag caggtcctcc ggatcactgt ggttgggtgg aggtctgtct gcactgggag 2320 cctcaggagg gctctgctcc acccacttgg ctatgggaga gccagcaggg gttctggaga 2380 aagaaactgg tgggttaggg ccttggtcca ggagccagtt gagccagggc agccacatcc 2440 aggcgtctcc ctaccctggc tctgccatca gccttgaagg gcctcgatga agccttctct 2500 ggaaccactc cagcccagct ccacctcagc cttggccttc acgctgtgga agcagccaag 2560 gcacttcctc accccctcag cgccacggac ctctctgggg agtggccgga aagctcccgg 2620 gcctctggcc tgcagggcag cccaagtcat gactcagacc aggtcccaca ctgagctgcc 2680 cacactcgag agccagatat ttttgtagtt tttatgcctt tggctattat gaaagaggtt 2740 agtgtgttcc ctgcaataaa cttgttcctg agaaaaa 2777 <210> 5 <211> 658 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ser Ser Gln Pro Ala Gly Asn Gln Thr Ser Pro Gly Ala Thr Glu 1 5 10 15 Asp Tyr Ser Tyr Gly Ser Trp Tyr Ile Asp Glu Pro Gln Gly Gly Glu 20 25 30 Glu Leu Gln Pro Glu Gly Glu Val Pro Ser Cys His Thr Ser Ile Pro 35 40 45 Pro Gly Leu Tyr His Ala Cys Leu Ala Ser Leu Ser Ile Leu Val Leu 50 55 60 Leu Leu Leu Ala Met Leu Val Arg Arg Arg Gln Leu Trp Pro Asp Cys 65 70 75 80 Val Arg Gly Arg Pro Gly Leu Pro Arg Pro Arg Ala Val Pro Ala Ala 85 90 95 Val Phe Met Val Leu Leu Ser Ser Leu Cys Leu Leu Leu Pro Asp Glu 100 105 110 Asp Ala Leu Pro Phe Leu Thr Leu Ala Ser Ala Pro Ser Gln Asp Gly 115 120 125 Lys Thr Glu Ala Pro Arg Gly Ala Trp Lys Ile Leu Gly Leu Phe Tyr 130 135 140 Tyr Ala Ala Leu Tyr Tyr Pro Leu Ala Ala Cys Ala Thr Ala Gly His 145 150 155 160 Thr Ala Ala His Leu Leu Gly Ser Thr Leu Ser Trp Ala His Leu Gly 165 170 175 Val Gln Val Trp Gln Arg Ala Glu Cys Pro Gln Val Pro Lys Ile Tyr 180 185 190 Lys Tyr Tyr Ser Leu Leu Ala Ser Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Gly 195 200 205 Phe Leu Ser Leu Trp Tyr Pro Val Gln Leu Val Arg Ser Phe Ser Arg 210 215 220 Arg Thr Gly Ala Gly Ser Lys Gly Leu Gln Ser Ser Tyr Ser Glu Glu 225 230 235 240 Tyr Leu Arg Asn Leu Leu Cys Arg Lys Lys Leu Gly Ser Ser Tyr His 245 250 255 Thr Ser Lys His Gly Phe Leu Ser Trp Ala Arg Val Cys Leu Arg His 260 265 270 Cys Ile Tyr Thr Pro Gln Pro Gly Phe His Leu Pro Leu Lys Leu Val 275 280 285 Leu Ser Ala Thr Leu Thr Gly Thr Ala Ile Tyr Gln Val Ala Leu Leu 290 295 300 Leu Leu Val Gly Val Val Pro Thr Ile Gln Lys Val Arg Ala Gly Val 305 310 315 320 Thr Thr Asp Val Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Phe Gly Ile Val Leu Ser 325 330 335 Glu Asp Lys Gln Glu Val Val Glu Leu Val Lys His His Leu Trp Ala 340 345 350 Leu Glu Val Cys Tyr Ile Ser Ala Leu Val Leu Ser Cys Leu Leu Thr 355 360 365 Phe Leu Val Leu Met Arg Ser Leu Val Thr His Arg Thr Asn Leu Arg 370 375 380 Ala Leu His Arg Gly Ala Ala Leu Asp Leu Ser Pro Leu His Arg Ser 385 390 395 400 Pro His Pro Ser Arg Gln Ala Ile Phe Cys Trp Met Ser Phe Ser Ala 405 410 415 Tyr Gln Thr Ala Phe Ile Cys Leu Gly Leu Leu Val Gln Gln Ile Ile 420 425 430 Phe Phe Leu Gly Thr Thr Ala Leu Ala Phe Leu Val Leu Met Pro Val 435 440 445 Leu His Gly Arg Asn Leu Leu Leu Phe Arg Ser Leu Glu Ser Ser Trp 450 455 460 Pro Phe Trp Leu Thr Leu Ala Leu Ala Val Ile Leu Gln Asn Met Ala 465 470 475 480 Ala His Trp Val Phe Leu Glu Thr His Asp Gly His Pro Gln Leu Thr 485 490 495 Asn Arg Arg Val Leu Tyr Ala Ala Thr Phe Leu Leu Phe Pro Leu Asn 500 505 510 Val Leu Val Gly Ala Ile Val Ala Thr Trp Arg Val Leu Leu Ser Ala 515 520 525 Leu Tyr Asn Ala Ile His Leu Gly Gln Met Asp Leu Ser Leu Leu Pro 530 535 540 Pro Arg Ala Ala Thr Leu Asp Pro Gly Tyr Tyr Thr Tyr Arg Asn Phe 545 550 555 560 Leu Lys Ile Glu Val Ser Gln Ser His Pro Ala Met Thr Ala Phe Cys 565 570 575 Ser Leu Leu Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Arg Thr Met Ala Ala 580 585 590 Pro Gln Asp Ser Leu Arg Pro Gly Glu Glu Asp Glu Gly Met Gln Leu 595 600 605 Leu Gln Thr Lys Asp Ser Met Ala Lys Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser 610 615 620 Arg Gly Arg Ala Arg Trp Gly Leu Ala Tyr Thr Leu Leu His Asn Pro 625 630 635 640 Thr Leu Gln Val Phe Arg Lys Thr Ala Leu Leu Gly Ala Asn Gly Ala 645 650 655 Gln Pro 1 11

Claims (3)

  1. (i) (a) 도 2 (서열 2)의 아미노산 잔기 1 내지 667의 서열 또는 그의 보존적 아미노산 치환체, 또는 (b) 도 7 (서열 5)의 아미노산 잔기 1 내지 658의 서열 또는 그의 보존적 아미노산 치환체를 갖는 아미노산 서열을 갖는 단리된 Stra6 폴리펩티드;
    (ii) (a) ATCC 기탁 번호 PTA-1181(DNA148380-2827) 하에 2000년 1월 11일 ATCC에 기탁된 벡터의 cDNA(서열 1) 인서트, 또는 (b) ATCC 기탁 번호 PTA-1405(DNA148389-2827-1) 하에 2000년 2월 23일 ATCC에 기탁된 벡터의 cDNA(서열 4) 인서트에 의해 코딩되는 단리된 Stra6 폴리펩티드; 또는
    (iii) (a) 도 2 (서열 2)의 아미노산 잔기 1 내지 667, (b) 도 7 (서열 5)의 아미노산 잔기 1 내지 658, 또는 (c) 항-Stra6 항체에 대한 결합 부위를 제공하기에 충분하고, 서열 2의 아미노산 잔기 532 내지 667에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 (a) 또는 (b)의 단편의 서열을 갖는 단리된 Stra6 폴리펩티드
    에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  2. 제1항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  3. 제2항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
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