BR112019020224A2 - Composições e métodos para o tratamento do câncer de pulmão - Google Patents

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Abstract

a presente invenção refere-se a composições e métodos para a prevenção ou o tratamento de câncer de pulmão, em que as referidas composições compreendem um anticorpo que se liga à progastrina e os referidos métodos compreendem o uso de um anticorpo que se liga à progastrina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DO CÂNCER DE PULMÃO
INTRODUÇÃO
[001] A presente invenção se refere à prevenção e ao tratamento de câncer, mais particularmente a métodos e composições para a prevenção ou o tratamento de câncer de pulmão. As composições de acordo com a invenção compreendem uma molécula de ligação à progastrina, particularmente um anticorpo anti-hPG, enquanto os métodos de acordo com a invenção compreendem o uso de uma molécula de ligação à progastrina e particularmente a um anticorpo anti-hPG.
[002] O câncer de pulmão continua sendo a neoplasia mais letal do mundo. Apesar das melhorias no tratamento cirúrgico, terapia sistêmica e radioterapia, a taxa de sobrevida em 5 anos para todos os pacientes diagnosticados com câncer de pulmão permanece entre 15 e 20%.
[003] O câncer de pulmão compreende dois tipos principais de tumores, a saber, câncer de pulmão de células pequenas (SCLC) e câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) . O SCLC representa 15-18% de todos os cânceres de pulmão, enquanto o NSCLC compõe cerca de 80% a 85% dos cânceres de pulmão. Outros tipos de câncer de pulmão, tais como carcinomas adenóides cisticos, linfomas e sarcomas, além de tumores benignos de pulmão, como hamartomas, são raros.
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[004] Câncer de pulmão de células pequenas e células não pequenas são tratados de maneira diferente. Em particular, o SCLC é mais responsive à quimioterapia e radioterapia do que outros tipos celulares de câncer de pulmão. No entanto, é difícil alcançar uma cura porque o SCLC tem uma tendência maior a ser amplamente disseminada no momento do diagnóstico. Até o momento, não existem biomarcadores moleculares que foram traduzidos para a prática clínica generalizada de câncer de pulmão. Os tratamentos dependem do desenvolvimento do câncer e geralmente incluem cirurgia para tumores pequenos localizados ou quimioterapia, possivelmente em combinação com terapia de radiação.
[005] Portanto, ainda há necessidade de novas composições e métodos para a prevenção ou o tratamento do câncer de pulmão.
[006] Este é o objetivo da presente invenção.
DESCRIÇÃO
[007] A presente invenção fornece agora um anticorpo que se liga especificamente à progastrina para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de pulmão. A presente invenção também fornece uma composição para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de pulmão, em que a referida composição compreende uma ligação de anticorpo à progastrina, e métodos para a prevenção ou o tratamento de
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3/79 câncer de pulmão, compreendendo o uso de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à progastrina, isoladamente ou em combinação com qualquer outro método conhecido de prevenção ou terapêutico contra o câncer de pulmão.
[008] Os anticorpos anti-hPG aqui descritos, particularmente os anticorpos anti-hPG neutralizantes, inibem a proliferação dependente de PG de células tumorais do pulmão, tornando-os agentes terapêuticos úteis para o tratamento de câncer de pulmão. Por conseguinte, também são fornecidas composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo anti-hPG e métodos para usar os anticorpos antihPG e/ou as composições farmacêuticas para tratar o câncer de pulmão. As composições farmacêuticas podem ser formuladas para qualquer via de administração conveniente, incluindo, por exemplo, injeção parentérica, subcutânea ou intravenosa, e incluirão tipicamente um anticorpo anti-hPG e um ou mais carreadores, excipientes e/ou diluentes aceitáveis adequados para o modo de administração desejado e pode incluir outros componentes opcionais, como será descrito mais adiante. Para usos terapêuticos, as composições podem ser embaladas na forma de dosagem unitária para facilitar o uso.
[009] Os métodos de tratamento geralmente compreendem a administração a um indivíduo necessitado de tratamento, por exemplo, um indivíduo diagnosticado com
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[010] Também são fornecidos métodos para inibir o crescimento de uma célula-tronco de câncer de pulmão em um paciente, administrando a um paciente com necessidade de inibição de crescimento de uma célula-tronco de câncer de
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5/79 pulmão um anticorpo anti-PG e/ou uma composição farmacêutica do mesmo em uma quantidade eficaz para inibir a referida célula-tronco do câncer de pulmão.
[011] Em várias modalidades, os anticorpos anti-PG são eficazes para reduzir a proliferação ou aumentar a diferenciação ou taxa de morte celular de células-tronco de câncer de pulmão ou reduzir a concentração sanguínea de progastrina nos pacientes tratados. Em outras modalidades, os anticorpos anti-PG e/ou composição farmacêutica dos mesmos podem ser administrados concomitantemente com ou após um segundo agente terapêutico eficaz para inibir o crescimento de células-tronco de câncer colorretal, por exemplo, um anticorpo com especificidade diferente de progastrina.
[012] O tratamento com anticorpos anti-hPG, como aqui descrito, pode ser combinado com, ou em complemento a outra terapia. Exemplos não limitativos de outras terapias para câncer de pulmão incluem tratamento quimioterápico, radioterapia, ressecção cirúrgica e terapia com anticorpos, como aqui descrito. Em um exemplo específico, os anticorpos anti-hPG são administrados em combinação com agentes quimioterápicos. Em outro exemplo específico, os anticorpos anti-hPG são administrados em adjunção à ressecção cirúrgica.
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[013] A presente invenção também se refere a composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos antiPG, de preferência com um carreador farmaceuticamente aceitável e/ou um excipiente. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um segundo agente terapêutico. Em alguma modalidade, o segundo agente terapêutico é um agente biológico ou quimioterápico. Exemplos de agentes biológicos incluem anticorpos monoclonais anti-EGFR e anticorpos monoclonais anti-VEGF, enquanto agentes quimioterápicos compreendem compostos tais como, por exemplo, agentes alquilantes, anti-metabólitos, antibióticos antitumorais, inibidores mitóticos, inibidores da função da cromatina, agentes anti-angiogênese, antiestrogênios, anti- andrógenos e imunomoduladores.
[014] A pré-progastrina humana, um peptideo de 101 aminoácidos (referência da sequência de aminoácidos: AAB19304.1), é o principal produto de tradução do gene da gastrina. A progastrina é formada pela divagem dos primeiros 21 aminoácidos (o peptideo sinal) da pré-progastrina. A cadeia de 80 aminoácidos da progastrina é processada ainda mais por divagem e modificação de enzimas em várias formas de hormônios da gastrina biologicamente ativos: gastrina 34 (G34) e gastrina 34 estendida com glicina (G34-Gly), compreendendo os aminoácidos 38-71 da progastrina, gastrina
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7/79 (G17) e gastrina 17 estendida com glicina (G17-Gly), compreendendo os aminoácidos 55 a 71 da progastrina.
[015] Anticorpos monoclonais anti-progastrina humana (anti-hPG) e seu uso para diagnóstico ou terapia foram descritos nos seguintes documentos: WO 2011/083 088 para câncer colorretal, WO 2011/083 090 para câncer de mama, WO 2011/083 091 para câncer de pâncreas, WO 2011/116 954 para câncer colorretal e gastrointestinal e WO 2012/013 609 e WO 2011/083089 para patologias hepáticas.
[016] A presente invenção será mais completamente compreendida a partir da descrição detalhada dada aqui e dos desenhos anexos, que são dados apenas como ilustração e não limitam o escopo pretendido da invenção.
[017] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a uma molécula de ligação à progastrina para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de pulmão. A presente divulgação também fornece uma composição para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de próstata, em que a referida composição compreende um anticorpo de ligação à progastrina ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[018] Por molécula de ligação à progastrina, se refere aqui a qualquer molécula que se liga à progastrina, mas não se liga à gastrina 17 (G17), gastrina 34 (G34), gastrina 17 estendida com glicina (G17-Gly) ou gastrina 34 estendida com glicina (G34-Gly). A molécula de ligação à
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8/79 progastrina da presente invenção pode ser qualquer molécula de ligação à progastrina, tal como, por exemplo, uma molécula de anticorpo ou uma molécula receptora. De preferência, a molécula de ligação à progastrina é um anticorpo antiprogastrina (um anticorpo anti-PG) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[019] O termo progastrina designa o peptídeo de progastrina de mamífero, e particularmente a progastrina humana. Para evitar dúvidas, sem nenhuma especificação, a expressão progastrina humana ou hPG se refere à PG humana da sequência de SEQ ID N° 1. A progastrina humana compreende notavelmente um domínio N-terminal e C-terminal que não são presentes nas formas hormonais da gastrina biologicamente ativas mencionadas acima. De preferência, a sequência do referido domínio N-terminal é representada pela SEQ ID NO. 2. Em outra modalidade preferida, a sequência do referido domínio C-terminal é representada pela SEQ ID NO. 3.
[020] Assim, em uma primeira modalidade, a invenção se refere a um anticorpo que se liga à progastrina, mas não a qualquer outro produto derivado do gene da gastrina, para uso no tratamento de câncer de pulmão.
[021] Por ligação, se liga ou similar, pretende-se que o anticorpo, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, forme um complexo com um antígeno que, sob condições fisiológicas, seja relativamente estável. Os
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9/79 métodos para determinar se duas moléculas se ligam são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, diálise de equilíbrio, ressonância plasmônica de superfície e similares. Em uma modalidade específica, o referido anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, se liga à progastrina com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior que a sua afinidade para a ligação a uma molécula não específica, tal como BSA ou caseína. Em uma modalidade mais particular, o referido anticorpo, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga apenas à progastrina.
[022] A expressão câncer de pulmão designa um câncer que se origina nos tecidos do pulmão, geralmente nas células que revestem as passagens de ar. Um câncer de pulmão, como aqui utilizado, abrange, em particular, câncer de pulmão de células pequenas (SCLC), incluindo carcinoma de células pequenas e carcinoma de células pequenas combinado, e cânceres de pulmão de células não pequenas (NSCLC), incluindo carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes e adenocarcinoma. Outros tipos de câncer de pulmão, tais como carcinomas adenoides císticos, linfomas e sarcomas, bem como tumores benignos de pulmão, como hamartomas, também são incluídos nos cânceres de pulmão, como aqui utilizado.
[023] Em uma modalidade específica, a invenção fornece um anticorpo anti-PG para uso na prevenção ou no
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10/79 tratamento de câncer de pulmão, o referido anticorpo reconhecendo um epitopo incluindo uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência de aminoácidos da progastrina.
[024] Em uma modalidade mais especifica, o referido anticorpo anti-PG para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de pulmão reconhece um epitopo de progastrina, em que o referido epitopo inclui uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência de aminoácidos da parte Nterminal da progastrina, em que a referida sequência de aminoácidos pode incluir os resíduos 10 a 14 de hPG, os resíduos 9 a 14 de hPG, os resíduos 4 a 10 de hPG, os resíduos 2 a 10 de hPG ou os resíduos 2 a 14 de hPG, em que a sequência de aminoácidos de hPG é a SEQ ID N° 1.
[025] Em uma modalidade mais específica, o anticorpo anti-PG para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de pulmão reconhece um epitopo de progastrina, em que o referido epitopo inclui uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência de aminoácidos da parte Cterminal da progastrina, em que a referida sequência de aminoácidos pode incluir os resíduos 71 a 74 de hPG, os resíduos 69 a 73 de hPG, os resíduos 71 a 80 de hPG (SEQ ID N° 40), os resíduos 76 a 80 de hPG ou os resíduos 67 a 74 de hPG, em que a sequência de aminoácidos de hPG é a SEQ ID N° 1.
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[026] Em uma modalidade mais especifica, ο anticorpo anti-PG para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de pulmão tem uma afinidade pela progastrina de pelo menos 5000 nM, pelo menos 500 nM, 100 nM, 80 nM, 60 nM, 50 nM, 4 0 nM, 3 0 nM, 2 0 nM, 10 nM, 7 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,lnM, 50 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM ou em pelo menos 0,1 pM, conforme determinado por um método tal como o descrito acima.
[027] De preferência, o anticorpo anti-PG para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de pulmão é um anticorpo anti-PG neutralizante.
[028] A expressão anticorpo anti-PG neutralizante
designa um anticorpo que se liga a PG e bloqueia a
sinalização dependente de PG, resultando na inibição de
respostas induzidas por PG em células tumorais, e
particularmente em células tumorais pulmonares. A inibição de respostas induzidas por PG de células de câncer de pulmão pode ser mediada pela repressão da diferenciação celular, repressão da morte celular e/ou estimulação da proliferação celular.
[029] O termo anticorpo, conforme usado aqui, pretende incluir anticorpos policlonais e monoclonais. Um anticorpo (ou imunoglobulina) consiste em uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto.
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Cada cadeia pesada compreende uma região variável (ou domínio) de cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada compreende três domínios, CHI, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como LCVR ou VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve compreende um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR) ou regiões hipervariáveis, responsáveis principalmente pela ligação de um epítopo de um antígeno e intercaladas com regiões mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). 0 método para identificar as CDRs dentro de cadeias leves e pesadas de um anticorpo e determinar sua sequência são bem conhecidos do especialista. Para evitar dúvidas, na ausência de qualquer indicação no texto, a expressão CDRs significa as regiões hipervariáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo, conforme definido pelo IMGT, em que a numeração exclusiva do IMGT fornece uma delimitação padronizada das regiões estruturais e das regiões determinantes de complementaridade, CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2.
[030] A numeração exclusiva do IMGT foi definida para comparar os domínios variáveis, qualquer que seja o receptor de antígeno, o tipo de cadeia ou a espécie [Lefranc
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Μ. -Ρ., Immunology Today 18, 509 (1997)/Lefranc Μ. -P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)/Letranc, M. -P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. e Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 5577 (2003)]. Na numeração exclusiva do IMGT, os aminoácidos conservados sempre têm a mesma posição, por exemplo, cisteína 23 (la-CYS), triptofano 41 (CONSERVED-TRP), aminoácido hidrofóbico 89, cisteína 104 (2a-CYS), fenilalanina ou triptofano 118 (J-PHE ou J-TRP). A numeração exclusiva do IMGT fornece uma delimitação padronizada das regiões de estrutura (FR1-IMGT: posições 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 e FR4-IMGT: 118 a 128) e das regiões determinantes de complementaridade: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 e CDR3-IMGT: 105 a 117. Como as lacunas representam posições desocupadas, os comprimentos de CDRIMGT (mostrados entre colchetes e separados por pontos, por exemplo, [8.8.13]) tornam-se informações cruciais. A numeração exclusiva do IMGT é usada em representações gráficas 2D, designadas como IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. e Lefranc, Μ. -P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002)/Kaas, Q. e Lefranc, M. -P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], e em estruturas 3D em IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q. , Ruiz, M. e Lefranc, M. -P., receptor de células T e dados estruturais do MHC. Nucl. Acids. Res. 32, D208D210 (2004)].
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[031] Cada VH e VL é composto por três CDRs e quatro FRs, dispostos do terminal amino ao terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. Os anticorpos podem ser de diferentes isotipos (nomeadamente IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM).
[032] Em uma modalidade específica, o referido anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é selecionado do grupo que consiste em: anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia única, anticorpos camelizados, anticorpos IgAl, anticorpos IgA2, anticorpos IgD, anticorpos IgE, anticorpos IgGl, anticorpos IgG2, anticorpos IgG3, anticorpos IgG4 e anticorpos IgM.
[033] Um anticorpo policlonal é um anticorpo que foi produzido entre ou na presença de um ou mais outros anticorpos não idênticos. Em geral, os anticorpos policlonais são produzidos a partir de um linfócito B na presença de vários outros linfócitos B que produzem
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15/79 anticorpos não idênticos. Geralmente, os anticorpos policlonais são obtidos diretamente de um animal imunizado.
[034] O termo anticorpo monoclonal designa um anticorpo que surge de uma população de anticorpos quase homogênea, em que a população compreende anticorpos idênticos, exceto por algumas possíveis mutações de ocorrência natural que podem ser encontradas em proporções mínimas. Um anticorpo monoclonal surge do crescimento de um clone de célula única, tal como um hibridoma, e é caracterizado por cadeias pesadas de uma classe e subclasse e cadeias leves de um tipo.
[035] Pela expressão fragmento de ligação ao antigeno de um anticorpo, pretende-se indicar qualquer peptídeo, polipeptídeo ou proteína que retenha a capacidade de se ligar ao alvo (também geralmente referido como antigeno) do referido anticorpo, geralmente o mesmo epítopo, e compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 5 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 10 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 25 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 40 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 50 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 60 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 70 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 80 resíduos de aminoácidos
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16/79 contíguos, pelo menos 90 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 100 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 125 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 150 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 175 resíduos de aminoácidos contíguos ou pelo menos 200 resíduos de aminoácidos contíguos, da sequência de aminoácidos do anticorpo.
[036] Em uma modalidade particular, o referido fragmento de ligação ao antígeno compreende pelo menos uma CDR do anticorpo do qual é derivado. Ainda em uma modalidade preferida, o referido fragmento de ligação ao antígeno compreende 2, 3, 4 ou 5 CDRs, mais preferencialmente as 6 CDRs do anticorpo do qual é derivado.
[037] Os fragmentos de ligação ao antígeno podem ser selecionados, sem limitação, no grupo constituído por Fv, scFv (sc para cadeia única), Fab, F(ab')2, Fab' , fragmentos ou diacorpos scFv-Fc ou proteínas de fusão com peptídeos desordenados, como motivos XTEN (polipeptídeo recombinante estendido) ou PAS, ou qualquer fragmento cujo tempo de meia- vida seria aumentado por modificação química, tal como a adição de poli (alquileno) glicol, tal como poli(etileno) glicol (PEGilação) (fragmentos pegilados chamados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab’)2-PEG ou Fab’-PEG) (PEG para Poli (Etileno) Glicol) ou por incorporação em um lipossoma, os referidos fragmentos possuindo pelo menos uma
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17/79 das CDRs características do anticorpo de acordo com a invenção. De preferência, os referidos fragmentos de ligação ao antígeno serão constituídos ou compreenderão uma
sequência parcial da cadeia variável pesada ou leve do
anticorpo a partir do qual eles são derivados, sendo a
referida sequência parcial suficiente para manter a mesma
especificidade de ligação que o anticorpo de que é
descendente e uma afinidade suficiente, preferencialmente pelo menos igual a 1/100, de uma maneira mais preferida a pelo menos 1/10, da afinidade do anticorpo do qual é descendente, em relação ao alvo.
[038] Em outra modalidade específica, em um método para o diagnóstico de câncer de pulmão de acordo com a invenção, uma amostra biológica de um indivíduo é contatada com um anticorpo que se liga à progastrina, em que o referido anticorpo foi obtido por um método de imunização conhecido por um especialista na técnica, em que a utilização como imunógeno de um peptídeo cuja sequência de aminoácidos compreende a totalidade ou uma parte da sequência de aminoácidos da progastrina. Mais particularmente, o referido imunógeno compreende um peptídeo escolhido entre:
• um peptídeo cuja sequência de aminoácidos compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de progastrina de comprimento total e, em particular, da progastrina humana de comprimento total da SEQ ID N° 1,
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18/79 • um peptideo cuja sequência de aminoácidos corresponde a uma parte da sequência de aminoácidos da progastrina, e particularmente à progastrina humana de comprimento total da SEQ ID N° 1, • um peptideo cuja sequência de aminoácidos corresponde a uma parte ou a toda a sequência de aminoácidos da parte Nterminal da progastrina e, em particular, os peptideos que compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: SWKPRSQQPDAPLG (SEQ ID N° 2) e • um peptideo cuja sequência de aminoácidos corresponde a uma parte ou a toda a sequência de aminoácidos da parte Cterminal da progastrina e, em particular, os peptideos que compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (SEQ ID N° 3), • um peptideo cuja sequência de aminoácidos corresponde a uma parte da sequência de aminoácidos da parte C-terminal da progastrina e, em particular, os peptideos que compreendem a sequência de aminoácidos FGRRSAEDEN (SEQ ID N° 40) correspondente aos aminoácidos 71 a 80 da progastrina.
[039] O técnico no assunto perceberá que essa imunização pode ser usada para gerar anticorpos policlonais ou monoclonais, conforme desejado. Os métodos para obter cada um desses tipos de anticorpos são bem conhecidos na técnica. O perito na técnica irá assim selecionar e
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19/79 implementar facilmente um método para gerar anticorpos policlonais e/ou monoclonais contra qualquer antígeno.
[040] Exemplos de anticorpos monoclonais que foram gerados usando um imunógeno que compreende a sequência de aminoácidos SWKPRSQQPDAPLG, correspondente à sequência de aminoácidos 1-14 da progastrina humana (extremidade Nterminal) incluem, mas não estão restritos a, anticorpos monoclonais designados como: mAb3, mAb4, mAbl6 e mAbl9 e mAb20, conforme descrito na Tabela 1 a Tabela 4. Outros anticorpos monoclonais foram descritos, embora não esteja claro se esses anticorpos realmente se ligam à progastrina (WO 2006/032980). Os resultados experimentais do mapeamento de epítopos mostram que mAb3, mAb4, mAbl6 e mAbl9 e mAb20 se ligam especificamente a um epítopo dentro da referida sequência de aminoácidos N-terminal hPG. Os anticorpos policlonais que reconhecem especificamente um epítopo no Nterminal da progastrina representado pela SEQ ID NO. 2, foram descritos na técnica (ver, por exemplo, WO 2011/083088) .
Tabela 1
Depósito de hibridoma mAb Sequências de aminoácidos SEQ ID N°
6B5B11C10 mAb3 VH CDR 1 GYIFTSYW SEQ ID N° 4
VH CDR 2 FYPGNSDS SEQ ID N° 5
VH CDR 3 TRRDSPQY SEQ ID N° 6
VL CDR 1 QSIVHSNGNTY SEQ ID N° 7
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VL CDR2 KVS SEQ ID N° 8
VL CDR 3 FQGSHVPFT SEQ ID N° 9
mVH 3 EVQLQQSGTVLARPGASVKMSCK ASGYIFTSYWVHWVKQRPGQGL EWIGGFYPGNSDSRYNQKFKGKA TLTAVTSASTAYMDLSSLTNEDSA VYFCTRRDSPQYWGQGTTLTVSS SEQ ID N° 41
mVL 3 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCR SSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQ SPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQ GSHVPFTFGGGTKLEIK SEQ ID N° 42
huVH 3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCK ASGYIFTSYWVH WVRQAP GQRL EWMGGFYPGNSDSRYSQKFQGR VTITRDTSASTAYMELSSLRSEDT AVYYCTRRDSPQYWGQGTLVTV SS SEQ ID N° 53
huVL 3 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCR SSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQ SPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHVPFTFGGGTKVEIK SEQ ID N° 54
Tabela 2
Depósito de hibridoma mAb Sequências de aminoácidos SEQ ID N°
20D2C3G2 mAb4 VH CDR 1 GYTFSSW SEQ ID N° 10
VH CDR 2 FLPGSGST SEQ ID N° 11
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VH CDR 3 ATDGNYDWFAY SEQ ID N° 12
VL CDR 1 QSLVHSSGVTY SEQ ID N° 13
VL CDR2 KVS SEQ ID N° 14
VL CDR 3 SQSTHVPPT SEQ ID N° 15
mVH 4 QVQLQQSGAELMKPGASVKISCK ATGYTFSSSWIEWLKQRPGHGLE WIGEFLPGSGSTDYNEKFKGKAT FTADTSSDTAYMLLSSLTSEDSAV YYCATDGNYDWFAYWGQGTLV TVSA SEQ ID N° 43
mVL 4 DLVMTQTPLSLPVSLGDQASISCR SSQSLVHSSGVTYLHWYLQKPGQ SPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQ STHVPPTFGSGTKLEIK SEQ ID N° 44
huVH 4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCK ASGYTFSSSWMH WVRQAPG QG L EWMGIFLPGSGSTDYAQKFQGRV TMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTA VYYC ATDG N YDW FAYWG QGTL VTVSS SEQ ID N° 55
huVL 4 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCK SSQSLVHSSGVTYLYWYLQKPGQ SPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQ STHVPPTFGQGTKLEIK SEQ ID N° 56
Tabela 3
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Depósito de hibridoma mAb Sequências de aminoácidos SEQID N°
1E9D9B6 mAb1 6 VH CDR 1 GYTFTSYY SEQ ID N° 16
VH CDR 2 INPSNGGT SEQ ID N° 17
VH CDR 3 TRGGYYPFDY SEQ ID N° 18
VL CDR 1 QSLLDSDGKTY SEQ ID N° 19
VL CDR2 LVS SEQ ID N° 20
VL CDR 3 WQGTHSPYT SEQ ID N° 21
mVH 16 QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCK ASGYTFTSYYMYWVKQRPGQGL EWIGEINPSNGGTNFNEKFKSKAT LTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAV YYCTRGGYYPFDYWGQGTTLTV SS SEQ ID N° 45
mVL 16 DWMTQTPLTLSVTIGRPASISCK SSQSLLDSDGKTYLYWLLQRPGQ SPKRLIYLVSELDSGVPDRITGSGS GTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQ GTHSPYTFGGGTKLEIK SEQ ID N° 46
huVH 16a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCK ASGYTFTSYYMYWVRQAPGQG L EWMGIINPSNGGTSYAQKFQGRV TMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTA VYYCTRG GYYP FDYWGQGTTVT vss SEQ ID N° 57
huVH 16b QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCK ASGYTFTSYYMH WVRQAP GQG L EWMGIINPSNGGTSYAQKFQGRV SEQ ID N° 58
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TMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTA VYYCTRG GYYP FDYWGQGTTVT VSS
huVH 16c QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCK ASGYTFTSYYMYWVRQAPGQG L EWMGEINPSNGGTNYAQKFQGR VTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDT AVYYCTRGGYYPFDYWGQGTTV TVSS SEQ ID N° 59
huVL 16a DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCR SSQSLLDSDGKTYLYWFQQRPGQ SPRRLIYLVSNRDSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCW QGTHSPYTFGQGTKLEIK SEQ ID N° 60
huVL 16b DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCR SSQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQ SPRRLIYLVSNRDSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCW QGTHSPYTFGQGTKLEIK SEQ ID N° 61
huVL 16c DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCR SSQSLLDSDGKTYLYWFQQRPGQ SPRRLIYLVSERDSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCW QGTHSPYTFGQGTKLEIK SEQ ID N° 62
Tabela 4
Depósito de mAb Sequências de SEQ ID N°
hibridoma aminoácidos
1B3B4F11 mAb19 VH CDR 1 GYSITSDYA SEQ ID N° 22
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VH CDR 2 ISFSGYT SEQ ID N° 23
VH CDR 3 AREVNYGDSYHFDY SEQ ID N° 24
VL CDR 1 SQHRTYT SEQ ID N° 25
VL CDR2 VKKDGSH SEQ ID N° 26
VL CDR 3 GVGDAIKGQSVFV SEQ ID N° 27
mVH 19 DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCT VTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKL EWMGYISFSGYTSYNPSLKSRISV TRDTSRNQFFLQLTSVTTEDTAT YYCAREVNYGDSYHFDYWGQGT IVTVSS SEQ ID N° 47
mVL 19 QLALTQSSSASFSLGASAKLTCTL SSQH RTYTIEWYQQQSLKP P KYV MEVKKDGSHSTGHGIPDRFSGSSS GADRYLSISNIQPEDEAIYICGVGD AIKGQSVFVFGGGTKVTVL SEQ ID N° 48
huVH 19a QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCT VSGYSITSDYAWNWIRQHPGKGL EWIGYISFSGYTYYNPSLKSRVTIS VDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYY CAREVNYGDSYHFDYWGQGTLV TVSS SEQ ID N° 63
huVH 19b QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCT VSGYSITSDYAWSWIRQHPGKGL EWIGYISFSGYTYYNPSLKSRVTIS VDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYY CAREVNYGDSYHFDYWGQGTLV TVSS SEQ ID N° 64
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huVH 19c QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCT VSGYSITSDYAWNWIRQHPGKGL EWIGYISFSGYTSYNPSLKSRVTIS VDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYY CAREVNYGDSYHFDYWGQGTLV TVSS SEQ ID N° 65
huVL 19a QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTL SSQHRTYTIEWHQQQPEKGPRYL MKVKKDGSHSKGDGIPDRFSGSSS GAERYLTISSLQSEDEADYYCGVG DAIKGQSVFVFGGGTKVEIK SEQ ID N° 66
huVL 19b QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTL SSQHRTYTIAWHQQQPEKGPRYL MKVKKDGSHSKGDGIPDRFSGSSS GAERYLTISSLQSEDEADYYCGVG DAIKGQSVFVFGGGTKVEIK SEQ ID N° 67
huVL 19c QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTL SSQHRTYTIEWHQQQPEKGPRYL MEVKKDGSHSKGDGIPDRFSGSSS GAERYLTISSLQSEDEADYYCGVG DAIKGQSVFVFGGGTKVEIK SEQ ID N° 68
[041] Exemplos de anticorpos monoclonais que podem ser gerados usando um imunógeno compreendendo a sequência de aminoácidos QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN, (parte C-terminal da progastrina) correspondente à sequência de aminoácidos 55-80 da progastrina humana incluem, mas não estão restritos
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26/79 a anticorpos designados como: mAb8 e mAbl3 nas seguintes Tabelas 5 e 6. Os resultados experimentais do mapeamento de epitopos mostram que o mAbl3 se liga especificamente a um epitopo dentro da referida sequência de aminoácidos Cterminais de hPG.
Tabela 5
Depósito de hibridoma mAb Sequências de aminoácidos SEQ ID N°
1C10D3B9 mAb8 VH CDR 1 GFIFIIYA SEQ ID N° 28
VH CDR 2 ISSGGTYT SEQ ID N° 29
VH CDR 3 ATQGNYSLDF SEQ ID N° 30
VL CDR 1 KSLRHTKGITF SEQ ID N° 31
VL CDR2 QMS SEQ ID N° 32
VL CDR 3 AQNLELPLT SEQ ID N° 33
mVH 8 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA ASGF I F I I YAMSWVRQAPGKGL EWVATISSGGTYTYYADSVKGRF TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCATQG NYSLDFWG QGTTVT VSS SEQ ID N° 49
mVL 8 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRS SKSLRHTKGITFLYWYLQKPGQS PQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQ NLELPLTFGGGTKVEIK SEQ ID N° 50
VH hZ8CV1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA ASGF I F I I YAMSWVRQAPGKGL SEQ ID N° 69
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EWVSSISSGGTYTYYADSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAV YYCATQG NYSLDFWGQGTTVTV SS
VL hZ8CV1 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRS SKSLRHTKGITFLYWYLQKPGQS PQLLIYQMSNRASGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQ NLELPLTFGGGTKVEIK SEQ ID N° 70
VH hZ8CV2 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA ASGF IH I YAMSWVRQAPGKGL EWVATISSGGTYTYYADSVKGRF TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCATQG NYSLDFWG QGTTVT vss SEQ ID N° 71
VL hZ8CV2 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRS SKSLRHTKGITFLYWYLQKPGQS PQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQ NLELPLTFGGGTKVEIK SEQ ID N° 72
CH hZ8CV2 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA ASGF I F I I YAMSWVRQAPGKGL EWVATISSGGTYTYYADSVKGRF TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCATQG NYSLDFWG QGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV SEQ ID N° 73
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VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK
CL hZ8CV2 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRS SKSLRHTKGITFLYWYLQKPGQS PQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQ NLELPLTFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYP REAKVQWKVDN ALQSG NSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC SEQ ID N° 74
Tabela 6
Depósito mAb Sequências SEQ ID N°
de de
hibridoma aminoácidos
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2C6C3C7 mAb!3 VH CDR 1 GFIFSSYG SEQ ID N° 34
VH CDR 2 INTFGDRT SEQ ID N° 35
VH CDR 3 ARGTGTY SEQ ID N° 36
VL CDR 1 QSLLDSDGKTY SEQ ID N° 37
VL CDR 2 LVS SEQ ID N° 38
VL CDR 3 WQGTHFPQT SEQ ID N° 39
mVH 13 EVQLVESGGGLVQPGGSLKL SCAASGFIFSSYGMSWVRQS PDRRLELVASINTFGDRTYY PDSVKGRFTISRDNAKNTLY LQMTSLKSEDTAIYYCARGT GTYWGQGTTLTVSS SEQ ID N° 51
mVL 13 DVVLTQTPLTLSVTIGQPAS ISCKSSQSLLDSDGKTYLNW LLQRPGQSPKRLIYLVSKLD SGVPDRFTGSGSGTDFTLKI SRVEAEDLGVYYCWQGTHFP QTFGGGTKLEIK SEQ ID N° 52
huVH 13a EVQLVESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFIFSSYGMSWVRQA SEQ ID N° 75
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PGKGLEWVANINT FGDRTYY VDSVKGRFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARGT GTYWGQGTLVTVSS
huVH 13b EVQLVESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFIFSSYGMSWVRQA PGKGLEWVASINTFGDRTYY VDSVKGRFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARGT GTYWGQGTLVTVSS SEQ ID N° 76
huVL 13a DVVMTQSPLSLPVTLGQPAS ISCRSSQSLLDSDGKTYLNW FQQRPGQSPRRLIYLVSNRD SGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCWQGTHFP QTFGGGTKVEIK SEQ ID N° 77
huVL 13b DVVMTQSPLSLPVTLGQPAS ISCRSSQSLLDSDGKTYLNW FQQRPGQSPRRLIYLVSKRD SGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCWQGTHFP QTFGGGTKVEIK SEQ ID N° 78
[042] Outros exemplos incluem anticorpos monoclonais e/ou policlonais anti-hPG gerados usando um
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31/79 imunógeno compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 40.
[043] Os termos anticorpos anti-hPG N-terminais e anticorpos anti-hPG C-terminais designam anticorpos que se ligam a um epitopo compreendendo aminoácidos localizados na parte N-terminal do hPG ou a um epitopo compreendendo aminoácidos localizados na parte C-terminal do hPG, respectivamente. De preferência, o termo anticorpos antihPG N-terminais se refere a anticorpos que se ligam a um epitopo localizado em um domínio de progastrina cuja sequência é representada pela SEQ ID NO. 2. Em outra modalidade preferida, o termo anticorpos anti-hPG Cterminais se refere a anticorpos que se ligam a um epitopo localizado em um domínio de progastrina cuja sequência é representada pela SEQ ID NO. 3.
[044] O termo epitopo se refere a uma região de um antígeno que é ligado por um anticorpo. Epítopos podem ser definidos como estruturais ou funcionais. Os epítopos funcionais são geralmente um subconjunto dos epítopos estruturais e possuem os aminoácidos que contribuem diretamente para a afinidade da interação. Os epítopos também podem ser conformacionais. Em certas modalidades, os epítopos podem incluir determinantes que são agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforil ou
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32/79 grupos sulfonil e, em certas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características específicas de carga. A determinação do epítopo ligado por um anticorpo pode ser realizada por qualquer técnica de mapeamento de epítopos, conhecida por um especialista na técnica. Um epítopo pode compreender diferentes aminoácidos que se localizam sequencialmente dentro da sequência de aminoácidos de uma proteína. Um epítopo também pode compreender aminoácidos que não estão localizados sequencialmente dentro da sequência de aminoácidos de uma proteína.
[045] Em uma modalidade específica, o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal selecionado no grupo que consiste em:
• Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 4, 5 e 6, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 4, 5 e 6, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 7, 8 e 9, respectivamente, ou
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33/79 sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 7, 8 e 9, respectivamente, • um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 10, 11 e 12, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente identidade de 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 10, 11 e 12, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 13, 14 e 15, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 13, 14 e 15, respectivamente, • Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 16, 17 e 18, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 16, 17 e
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18, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das
sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 19 , 20 e 21,
respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%,
preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o
alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 19 , 20 e
21, respectivamente,
• Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia
pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 22, 23 e 24, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 22, 23 e 24, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 25, 26 e 27, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 25, 26 e 27, respectivamente, • Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo
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35/79 menos dois, preferencialmente pelo menos três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 28, 29 e 30, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 28, 29 e 30, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente em pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 31, 32 e 33, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95 % e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 31, 32 e 33, respectivamente, e • Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 34, 35 e 36, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 34, 35 e 36, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 37, 38 e 39, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%,
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36/79 preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 37, 38 e 39, respectivamente.
[046] No sentido da presente invenção, a identidade percentual ou % de identidade entre duas sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos significa a porcentagem de nucleotideos idênticos ou resíduos de aminoácidos entre as duas sequências a serem comparadas, obtidas após o alinhamento ideal, essa porcentagem é puramente estatística e as diferenças entre as duas sequências são distribuídas aleatoriamente ao longo de seu comprimento. A comparação de duas sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos é tradicionalmente realizada comparando-se as sequências após alinhadas de maneira ideal, sendo a referida comparação capaz de ser conduzida por segmento ou usando uma janela de alinhamento. O alinhamento ideal das sequências para comparação pode ser realizado, além da comparação manual, por meio de métodos conhecidos por um especialista na técnica.
[047] Para a sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com uma sequência de aminoácidos de referência, exemplos preferidos incluem aqueles que contêm a sequência de referência, certas modificações, principalmente uma deleção, adição ou substituição de pelo menos um aminoácido,
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37/79 truncamento ou extensão. No caso de substituição de um ou mais aminoácidos consecutivos ou não consecutivos, são preferidas substituições nas quais os aminoácidos substituídos são substituídos por aminoácidos equivalentes. Aqui, a expressão aminoácidos equivalentes pretende indicar quaisquer aminoácidos que possam ser substituídos por um dos aminoácidos estruturais sem, no entanto, modificar as atividades biológicas dos anticorpos correspondentes e dos exemplos específicos definidos abaixo.
[048] Os aminoácidos equivalentes podem ser determinados em sua homologia estrutural com os aminoácidos pelos quais são substituídos ou nos resultados de testes comparativos de atividade biológica entre os vários anticorpos que provavelmente serão gerados.
[049] Em uma modalidade mais particular, o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal selecionado no grupo que consiste em:
• Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 41 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 42;
• Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 43 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 44;
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38/79 • Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 45 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 46;
• Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 47 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 48;
• Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 49 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 50; e • Um anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 51 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 52.
[050] Em outra modalidade particular, o anticorpo utilizado no método da invenção é um anticorpo humanizado.
[051] Como aqui utilizada, a expressão anticorpo humanizado significa um anticorpo que contém regiões CDR derivadas de um anticorpo de origem não humana, sendo as outras partes da molécula de anticorpo derivadas de um ou vários anticorpos humanos. Além disso, alguns dos resíduos do segmento esquelético (chamados FR para estrutura) podem ser modificados para preservar a afinidade de ligação, de acordo com técnicas conhecidas por um especialista na técnica (Jones et al. , Nature, 321: 522-525, 1986) . O objetivo da humanização é uma redução na imunogenicidade de um anticorpo xenogênico, tal como um anticorpo murino, para introdução em
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39/79 humanos, mantendo a afinidade e a especificidade completas de ligação ao antígeno.
[052] Os anticorpos humanizados da invenção ou fragmentos dos mesmos podem ser preparados por técnicas conhecidas por um especialista na técnica (tais como, por exemplo, as descritas nos documentos Singer et al., J. Immun., 150: 2844-2857 1992). Tais anticorpos humanizados são preferidos para uso em métodos que envolvem diagnóstico in vitro ou tratamento preventivo e/ou terapêutico ín vivo. Outras técnicas de humanização também são conhecidas do especialista na técnica. De fato, os anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de técnicas, incluindo enxerto de CDR (EP 0 451 261; EP 0 682 040; EP 0 939 127; EP 0 566 647; US 5.530.101; US 6.180.370; US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.639.641 ; US 6.054.297; US 5.886.152; e US 5.877.293), revestimento ou recapeamento (EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E. A., 1991, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498; Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7 (6): 805-814; Roguska M. A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. ScL USA, 91: 969-973), e embaralhamento de cadeias (Patente US 5.565.332). Os anticorpos humanos podem ser produzidos por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo métodos de exibição de fagos. Ver também as Pat. U.S. Nos. 4.444.887, 4.716.111, 5.545.806 e 5.814.318; e números de publicação de pedidos de patente internacional WO 98/46645,
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WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741.
[053] Em uma modalidade mais especifica, o referido anticorpo é um anticorpo humanizado selecionado no grupo que consiste em:
• Um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 4, 5 e 6, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 4, 5 e 6, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 7, 8 e 9, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 7, 8 e 9, respectivamente, • Um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 10, 11 e 12, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente identidade de 85%, 90%, 95% e 98% após o
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41/79 alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 10, 11 e 12, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 13, 14 e 15,
respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%,
preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o
alinhamento ideal com as sequênci as das SEQ ID N° 13 , 14 e
15, respectivamente,
• Um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia
pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 16, 17 e 18, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 16, 17 e 18, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 19, 20 e 21, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 19, 20 e 21, respectivamente,
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42/79 • Um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 22, 23 e 24, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 22, 23 e 24, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 25, 26 e 27, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 25, 26 e 27, respectivamente, • Um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 28, 29 e 30, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 28, 29 e 30, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das
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43/79 sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 31, 32 e 33,
respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%,
preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o
alinhamento ideal com as sequênci as das SEQ ID N° 31 , 32 e
33, respectivamente, e
• Um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia
pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 34, 35 e 36, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 34, 35 e 36, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 37, 38 e 39, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 37, 38 e 39, respectivamente, em que o referido anticorpo também compreende regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada derivadas de um anticorpo humano.
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[054] Em outra modalidade mais especifica, o referido anticorpo é um anticorpo humanizado selecionado no grupo que consiste em:
• Um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 53, e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 54;
• Um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 55 e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 56;
• Um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID N° 57, 58 e 59 e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID N° 60, 61 e 62;
• Um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID N° 63, 64 e 65 e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID N° 66, 67 e 68;
• Um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID N° 69 e 71 e uma região variável
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45/79 da cadeia leve da sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID N° 70 e 72; e • Um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID N° 75 e 76 e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID N° 77 e 78;
em que o referido anticorpo também compreende regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada derivadas de um anticorpo humano.
[055] Mais preferencialmente, o referido anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 71 e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 72, o referido anticorpo também compreende regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada cadeia derivada de um anticorpo humano.
[056] Ainda mais preferencialmente, o referido anticorpo compreende uma cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 73 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 74.
[057] Em outro aspecto, a invenção também fornece imunoconjugados (intercambiavelmente referidos como conjugados anticorpo-fármaco ou ADCs) compreendendo um anticorpo de ligação à progastrina, conforme descrito aqui,
Petição 870190122851, de 25/11/2019, pág. 50/86 sendo ο referido anticorpo conjugado com um ou mais agentes citotóxicos, tal como um agente quimioterápico, um medicamento, um agente inibidor do crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina proteica, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal ou fragmentos das mesmas) ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).
[058] Os imunoconjugados têm sido utilizados para a entrega local de agentes citotóxicos, isto é, fármacos que matam ou inibem o crescimento ou a proliferação de células, no tratamento de câncer (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5: 543-549; Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23 (9): 1137-1146; Payne, G. (2003) i 3: 207-212; Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; NiculescuDuvaz e Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26: 151-172; Patente US No. 4.975.278). Os imunoconjugados permitem a entrega direcionada de uma porção de fármaco a um tumor e o acúmulo intracelular, onde a administração sistêmica de fármacos não conjugadas pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para células normais, bem como as células tumorais que procuram ser eliminadas (Baldwin et al. , Lancet (15 de março de 1986), pp. 603-05; Thorpe (1985) Carreadores de anticorpos de agentes citotóxicos na terapia do câncer: uma revisão, em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp. 475-506.
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Tanto os anticorpos policlonais quanto os anticorpos monoclonais foram relatados como úteis nessas estratégias (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21: 18387) . Os fármacos utilizados nesses métodos incluem daunomicina, doxorrubicina, metotrexato e vindesina (Rowland et al., (1986) supra) . As toxinas usadas em conjugados anticorpo-toxina incluem toxinas bacterianas tais como a toxina da difteria, toxinas vegetais tal como a ricina, toxinas de pequenas moléculas tal como a geldanamicina (Handler et al. (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92 (19) : 15731581; Handler et al. (2000) Bioorganic & Hed. Chem. Letters 10: 1025-1028; Handler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791), maitansinóides (EP 1391213; Liu et al. , (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 8618-8623) e caliqueamicina (Lode et al (1998) Cancer Res. 58: 2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342). As toxinas podem exercer seus efeitos citotóxicos por mecanismos que incluem a ligação à tubulina, a ligação ao DNA ou a inibição da topoisomerase. Alguns medicamentos citotóxicos tendem a ser inativos ou menos ativos quando conjugados a anticorpos grandes ou ligantes de receptores de proteínas.
[059] Em certas modalidades, um imunoconjugado compreende um anticorpo e um agente quimioterápico ou outra toxina. Os agentes quimioterápicos úteis na geração de imunoconjugados são aqui descritos (por exemplo, acima). As
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48/79 toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser usados incluem a cadeia da difteria A, fragmentos ativos não vinculativos da toxina da difteria, cadeia da exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia da ricina A, cadeia da abrina A, cadeia da modecina A, alfa-sarcino, proteínas de Aleurites fordii, proteínas da diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor da momordica charantia, curcina, crotina, inibidor da sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrinocina, fenomicina, enomicina e tricotecenos. Ver, por exemplo, WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993. Está disponível uma variedade de radionuclídeos para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem 212Bi, 131I, 131In, 90Y e 186Re. Os conjugados do anticorpo e do agente citotóxico são feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais, tais como propionato de Nsuccinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como dimetil adipimidato HC1), ésteres ativos (tal como suberato de disuccinimidil), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos de bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(pdiazônio benzoil))-etilenodiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno) . Por exemplo, uma
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49/79 imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987) . O ácido 1isotiocianatobenzil-3-metiIdletileno triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação de radionucleotideo no anticorpo. Ver WO 94/11026.
[060] Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de moléculas pequenas, tais como uma caliqueamicina, maitansinóides, dolastatinas, aurostatinas, um tricoteceno e CC 1065, e os derivados dessas toxinas que possuem atividade de toxinas, também são contemplados aqui.
[061] O imunoconjugado da invenção pode ainda compreender um ligante.
[062] Ligante, Unidade Ligante ou ligação significa uma fração química que compreende uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que liga covalentemente uma proteína de ligação a pelo menos um agente citotóxico.
[063] Os ligantes podem ser feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais, tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-l-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como dimetil adipimidato HC1), ésteres ativos (tal como suberato de disuccinimidil), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos de bis-azido
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50/79 (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), bis-diazônio derivados (tal como bis-(p-diazônio-benzoil)etilenodiamina), di- isocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tal como 1,5difluoro-2,4- dinitrobenzeno) . O ácido 1isotiocianatobenzil-3- metildietileno triaminapentaacético marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação de agentes citotóxicos no sistema de endereçamento. Outros reagentes de reticulação podem ser BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo- EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS,
sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo- SMCC e sulfo-SMPB e SVSB
(benzoato de succinimidil-(4- vinilsulfona) ) que estão
disponíveis comercialmente (por exemplo, na Pierce
Biotechnolo gy. Inc ., Rockford, Ill. , EUA) .
[064] 0 ligante pode ser um não clivável ou
clivável.
[065] Em outro aspecto, a invenção fornece uma
composição para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de pulmão, compreendendo a referida composição um anticorpo que reconhece um epitopo incluindo uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência de aminoácidos da progastrina.
[066] Em uma modalidade mais especifica, a referida composição para uso na prevenção ou no tratamento de câncer
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51/79 de pulmão compreende um anticorpo que reconhece um epitopo de progastrina, em que o referido epitopo inclui uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência de aminoácidos da parte N-terminal da progastrina, em que a referida sequência de aminoácidos pode incluir os resíduos 10 a 14 de hPG, os resíduos 9 a 14 de hPG, os resíduos 4 a 10 de hPG, os resíduos 2 a 10 de hPG ou os resíduos 2 a 14 de hPG, em que a sequência de aminoácidos de hPG é a SEQ ID N° 1.
[067] Em uma modalidade mais específica, a composição para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de pulmão compreende um anticorpo que reconhece um epitopo de progastrina, em que o referido epitopo inclui uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência de aminoácidos da parte C-terminal da progastrina, em que a referida sequência de aminoácidos pode incluir os resíduos 71 a 74 de hPG, os resíduos 69 a 73 de hPG, os resíduos 71 a 80 de hPG (SEQ ID N° 40), os resíduos 76 a 80 de hPG ou os resíduos 67 a 74 de hPG, em que a sequência de aminoácidos de hPG é a SEQ ID N° 1.
[068] Em uma modalidade mais particular, a composição para uso na prevenção ou no tratamento do câncer de pulmão compreende um anticorpo de ligação à progastrina ou um fragmento de ligação ao antígeno que tem uma afinidade pela progastrina de pelo menos 5000 nM, pelo menos 500 nM,
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100 nM, 80 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 7 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 nM, 50 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM ou pelo menos 0,1 pM, conforme determinado por um método como o descrito acima.
[069] Em uma modalidade ainda mais particular, a composição para uso na prevenção ou no tratamento do câncer de pulmão compreende um anticorpo de ligação à progastrina, em que a referida molécula de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno, é um anticorpo neutralizante.
[070] Em outra modalidade particular, uma composição para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de pulmão compreende um anticorpo de ligação à progastrina, em que a referida molécula de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno, é um anticorpo humanizado.
[071] Em uma modalidade específica, uma composição para uso na prevenção ou no tratamento do câncer de pulmão compreende um anticorpo de ligação à progastrina, em que a referida molécula de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno, é conjugada a um ou mais agentes citotóxicos, tal como um agente quimioterápico, um medicamento, um agente inibidor do crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina proteica, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal
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53/79 ou animal ou seus fragmentos) ou um isótopo radioativo (ou seja, um radioconjugado), como descrito acima.
[072] Em outra modalidade particular, uma composição para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de pulmão para um paciente compreende um anticorpo de ligação à progastrina, em que o referido paciente foi diagnosticado com câncer de pulmão, em que uma concentração de progastrina é maior em uma amostra biológica de paciente do que em uma amostra de referência. De preferência, o referido paciente foi diagnosticado com câncer de pulmão ao entrar em contato com um anticorpo anti-PG com uma amostra biológica do referido paciente.
[073] Uma amostra biológica, como aqui utilizada, é uma amostra de tecido ou fluido biológico que contém ácidos nucleicos ou polipeptideos, por exemplo, de uma proteína, polinucleotídeo ou transcrito de câncer de pulmão. Essa amostra deve permitir a determinação dos níveis de expressão de progastrina. Sabe-se que a progastrina é uma proteína secretada. As amostras biológicas preferidas para a determinação do nível da proteína progastrina incluem assim fluidos biológicos. Um fluido biológico, como aqui utilizado, significa qualquer fluido que inclui material de origem biológica. Fluidos biológicos preferidos para uso na presente invenção incluem fluidos corporais de um animal, por exemplo, um mamífero, de preferência um indivíduo humano.
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54/79 fluido corporal pode ser qualquer fluido corporal, incluindo, sem limitação, sangue, plasma, soro, linfa, líquido cefalorraquidiano (LCR), saliva, suor e urina. De preferência, as referidas amostras biológicas líquidas preferidas incluem amostras como uma amostra de sangue, uma amostra de plasma ou uma amostra de soro. Mais preferencialmente, a amostra biológica é uma amostra de sangue. De fato, essa amostra de sangue pode ser obtida por uma coleta de sangue completamente inofensiva do paciente e, portanto, permite uma avaliação não invasiva dos riscos de o indivíduo desenvolver um tumor.
[074] Uma amostra biológica, como aqui utilizada, também inclui uma amostra de câncer sólido do paciente a ser testado, quando o câncer é um câncer sólido. Essa amostra de câncer sólido permite que o especialista realize qualquer tipo de medição do nível do biomarcador da invenção. Em alguns casos, os métodos de acordo com a invenção podem compreender ainda uma etapa preliminar de coleta de uma amostra de câncer sólido do paciente. Por uma amostra de câncer sólido, é referida uma amostra de tecido tumoral. Mesmo em um paciente com câncer, o tecido que é o local do tumor ainda compreende tecido não tumoral saudável. A amostra de câncer deve, portanto, ser limitada ao tecido tumoral retirado do paciente. A referida amostra de câncer
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55/79 pode ser uma amostra de biópsia ou uma amostra retirada de uma terapia de ressecção cirúrgica.
[075] Uma amostra biológica é tipicamente obtida de um organismo eucariótico, mais preferencialmente um mamífero, ou um pássaro, réptil ou peixe. De fato, um indivíduo que pode ser submetido ao método aqui descrito pode ser qualquer um de animais mamíferos, incluindo humanos, cães, gatos, gado, cabras, porcos, suínos, ovelhas e macacos; ou um pássaro; réptil; ou peixe. De preferência, um indivíduo é um ser humano; um indivíduo humano pode ser conhecido como um paciente.
[076] Por obter uma amostra biológica, pretendese aqui obter uma amostra biológica para uso nos métodos descritos nesta invenção. Na maioria das vezes, isso será feito removendo uma amostra de células de um animal, mas também pode ser realizado usando células previamente isoladas (por exemplo, isoladas por outra pessoa, em outro momento e/ou para outra finalidade) ou executando os métodos da invenção in vivo. Os tecidos de arquivo, com tratamento ou histórico de resultados, serão particularmente úteis.
[077] Esta amostra pode ser obtida e, se necessário, preparada de acordo com métodos conhecidos de um especialista na técnica. Em particular, é bem conhecido na técnica que a amostra deve ser retirada de um indivíduo em jejum.
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[078] Em um aspecto mais particular, a presente invenção se refere a uma composição para uso na prevenção ou tratamento de câncer de pulmão de acordo com a invenção, em que o referido anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antigeno, é selecionado entre os anticorpos anti-progastrina N-terminais e os anticorpos anti-progastrina C-terminais.
[079] As composições de anticorpos para uso nos métodos da invenção podem ser preparadas como formulações diferentes, incluindo, mas não se limitando a, uma suspensão aquosa, para administração por uma variedade de vias, incluindo, mas não se limitando a, administração parenteral, intratecal, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, de infusão ou bolus. Em algumas modalidades, a composição é formulada para administração parenteral e, em algumas modalidades especificas, injeção intravenosa por infusão.
[080] Em uma modalidade particular, uma composição para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de pulmão, de acordo com a invenção, compreende uma dose eficaz que, nos anticorpos antiprogastrina da invenção, variam de 0,001 mg/kg a cerca de 250 mg/kg, o que pode ser administrado em uma administração ou em várias administrações espaçadas.
[081] Em uma modalidade particular, uma composição para uso na prevenção ou tratamento de câncer de pulmão, de
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57/79 acordo com a invenção, compreende um anticorpo de ligação à progastrina ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo selecionado entre anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia única, anticorpos camelizados, anticorpos IgAl, anticorpos IgA2, anticorpos IgD, anticorpos IgE, anticorpos IgGl, anticorpos IgG2, anticorpos IgG3, anticorpos IgG4 e anticorpos IgM. Preferencialmente, os referidos anticorpos são os descritos acima. Mais preferencialmente, os referidos anticorpos são anticorpos humanizados.
[082] De preferência, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo uma composição para uso na prevenção ou tratamento de câncer de pulmão de acordo com a invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável. Mais especificamente, a composição farmacêutica para uso na prevenção ou tratamento de câncer de pulmão de acordo com a invenção, compreende um anticorpo como descrito acima e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[083] Em um aspecto mais particular, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo uma composição para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de pulmão de acordo com a invenção e um
carreador farmaceuticamente aceitável, em que o referido
anticorpo anti-progastrina é administrado em uma dose de
0,001 mg/kg a 250 mg/kg e, de preferência, a uma dose de
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58/79 pelo menos 0,005 mg/kg, pelo menos 0,01 mg/kg, pelo menos 0,05 mg/kg, pelo menos 0,1 mg/kg, pelo menos 0,5 mg/kg, pelo menos 1 mg/kg, pelo menos 5 mg/kg, pelo menos 10 mg/kg, pelo menos 50 mg/kg ou pelo menos 100 mg/kg. Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um kit de partes compreendendo uma composição para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de pulmão, de acordo com a invenção, e uma molécula terapêutica anticâncer.
[084] De fato, o tratamento com anticorpos monoclonais anti-PG, como aqui descrito, pode ser combinado com, ou em complemento a outra terapia. Exemplos não limitativos de outras terapias incluem tratamento quimioterápico, radioterapia, ressecção cirúrgica e terapia com anticorpos.
[085] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um kit de partes que compreende uma composição para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de pulmão, de acordo com a invenção, e uma molécula terapêutica anticâncer escolhida entre: uma molécula quimioterápica, uma molécula de terapia direcionada.
[086] Em uma modalidade particular, a presente invenção se refere a kits de partes que compreendem, para a administração simultânea, sequencial ou separada, uma composição para o tratamento de câncer de pulmão de acordo com a invenção e uma molécula quimioterápica. Moléculas
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59/79 quimioterápicas úteis para esse fim incluem, entre outras, antagonistas de folato, antagonistas de purina, antagonistas de pirimidina, moléculas alquilantes de DNA, fármacos de reticulação de DNA, antibióticos, complexos de platina, inibidores de proteassoma, venenos do fuso mitótico, inibidores da topoisomerase, inibidores de tirosina quinase e outros.
[087] Em outra modalidade particular, a presente invenção se refere a kits de partes compreendendo, para a administração simultânea, sequencial ou separada, uma composição de acordo com a invenção e uma composição compreendendo outra molécula de terapia direcionada. Essa molécula de terapia direcionada inclui, mas não se limita a, anticorpos direcionados ao EGFR, tal como cetuximabe ou panitumumabe, anticorpos direcionados ao VEGF, tal como bevacizumabe, anticorpos direcionados ao HER2, tal como trastuzumabe ou pertuzumabe, anticorpos direcionados ao PD1 e ao PDL-1, tal como o pembrolizumabe, anticorpos que têm como alvo CTLA-4, tal como ipilimumabe, medicamentos de moléculas pequenas que têm como alvo o EGFR, tal como erlotinibe, medicamentos de moléculas pequenas que têm como alvo BRAF, tal como vemurafenibe ou dabrafenibe, uma proteína de fusão recombinante que tem como alvo o VEGF, tal como o Af libercept.
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[088] Em outro aspecto particular, a presente invenção se refere ao uso de um anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para o diagnóstico de câncer de pulmão.
[089] Em outro aspecto particular, a presente invenção se refere ao uso de um anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para a prevenção ou o tratamento do câncer de pulmão.
[090] Em um aspecto mais particular, a presente invenção se refere ao uso de um anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para a prevenção ou o tratamento de câncer de pulmão para um paciente, em que a concentração de progastrina em uma amostra biológica do referido paciente foi determinada e é superior à concentração de progastrina de uma amostra biológica de referência.
[091] Em outro aspecto particular, a invenção se refere à utilização de uma composição farmacêutica da invenção para evitar a recorrência de câncer de pulmão. Por
conseguinte, a presente divulgação fornece métodos e
composições úteis para o tratamento de câncer de pulmão e
prevenção da recorrência de câncer de pulmão em animais,
incluindo se res humanos. Os métodos de tratamento envolvem
a administração a um indivíduo diagnosticado com câncer de pulmão de uma quantidade de um anticorpo que se liga
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61/79 especificamente à progastrina eficaz para proporcionar um beneficio terapêutico. 0 anticorpo anti-PG pode ser administrado isoladamente, em monoterapia, ou em conjunto com, ou em complemento a outras modalidades de tratamento, tais como ressecção de tumor, radioterapia, quimioterapia, terapia com outro anticorpo, etc.
[092] Os tumores sólidos não são necessariamente tecidos homogêneos. Em vez disso, alguns tumores compreendem uma pluralidade de tipos de células aberrantes com propriedades fenotipicas e funcionais distintas. A este respeito, esses tumores são análogos a órgãos anormais. As células compreendendo tumores sólidos diferem no que diz respeito à extensão em que são capazes de iniciar a formação de um novo tumor quando transplantadas para um novo local no mesmo hospedeiro ou para um novo hospedeiro da mesma ou de diferentes espécies. As células que possuem essa propriedade são conhecidas como células iniciadoras de tumor ou de câncer ou, alternativamente, células-tronco tumorais ou de câncer. Ver, por exemplo, Hardavella et al., 2016, Células-tronco de câncer de pulmão - características, fenótipo, Transi Lung Cancer Res. 2016, 5 (3) : 272-279. Tais células são altamente tumorigênicas.
[093] Geralmente, as células-tronco cancerígenas são definidas por duas propriedades: a capacidade de se autorenovar e a capacidade de gerar células filhas que se
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62/79 diferenciam em células não-tronco. A auto-renovação é a capacidade de sofrer divisão celular, pela qual uma ou ambas as células filhas permanecem indiferenciadas, mantendo a capacidade de gerar mais uma célula-tronco cancerígena com capacidade semelhante de proliferar como a célula de origem. Essa propriedade permite que as células-tronco cancerígenas deem origem ao grande número de células que compõem o tumor em crescimento. As células-tronco cancerígenas também têm a capacidade de produzir células-filhas que se diferenciam, dando origem a um espectro de células tumorais não-tronco ou em massa mais diferenciadas, encontradas em muitos tumores sólidos. Assim, quando transplantadas, as células-tronco cancerígenas podem reconstituir o tipo de tumor do qual se originaram, mesmo após múltiplos transplantes seriados. Além disso, pensa-se que as células-tronco cancerígenas abrigam mutações genéticas e/ou alterações epigenéticas que resultam em padrões de proliferação alterados e/ou em baixas taxas de apoptose.
[094] As células-tronco cancerígenas podem ser identificadas de acordo com várias características fenotípicas que as distinguem das células tumorais em massa. Os métodos úteis para avaliar se um tumor ou linhagem celular contêm células-tronco cancerígenas são familiares aos especialistas na técnica. Tais métodos são descritos, por exemplo, em Hardavella et al., 2016, Células-tronco de
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63/79 câncer de pulmão - características, fenótipo, Transi Lung Cancer Res. 2016, 5 (3) : 272-279, bem como no documento WO 2012/013609. Instâncias particulares desses métodos também são descritas nos exemplos do presente pedido.
[095] Em um aspecto mais particular, a presente invenção se refere ao uso de um anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para a prevenção ou o tratamento de câncer de pulmão para um paciente, em que o referido paciente apresenta metástase.
[096] Em um aspecto ainda mais particular, a presente invenção se refere ao uso de um anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para a prevenção ou o tratamento de câncer de pulmão para um paciente, em que o referido paciente apresenta metástase e em que a concentração de progastrina em uma amostra biológica do referido paciente foi determinada e é superior à concentração de progastrina de uma amostra biológica de referência.
[097] Os constituintes dos quais a combinação é composta podem ser administrados simultaneamente, separadamente ou sequencialmente, de modo a obter a máxima eficácia da combinação; sendo possível para cada administração variar em sua duração, de uma administração rápida a uma perfusão contínua.
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[098] Como aqui utilizado, administração simultânea se refere à administração dos dois compostos da composição de acordo com uma forma farmacêutica individual e única. Como usado aqui, administração separada se refere à administração, ao mesmo tempo, dos dois compostos da composição de acordo com a invenção em formas farmacêuticas distintas. Como aqui utilizado, administração sequencial se refere à administração sucessiva dos dois compostos da composição de acordo com a invenção, cada um em uma forma farmacêutica distinta.
[099] Uma quantidade terapeuticamente eficaz, como aqui utilizada, se refere à concentração ou quantidade mínima de um composto (ou de compostos) que é eficaz para prevenir, aliviar, reduzir ou melhorar os sintomas da doença ou prolongar a sobrevivência do paciente sendo tratado.
[100] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um método para prevenir a recorrência do câncer de próstata, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-PG a um indivíduo com necessidade de prevenção. Os métodos para prevenir a recorrência do câncer de fígado de acordo com a presente divulgação são realizados pela administração de um ou mais anticorpos antiPG capazes de neutralizar a PG, descritos acima, a indivíduos em risco de recorrência de câncer de pulmão.
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[101] Os indivíduos que necessitam de prevenção da recorrência do câncer de próstata são indivíduos previamente tratados para câncer de pulmão, que correm o risco de, mas não foram diagnosticados com, câncer de pulmão novamente. Os indivíduos adequados incluem indivíduos previamente tratados para câncer de pulmão por qualquer meio, incluindo ressecção cirúrgica, quimioterapia ou qualquer outra terapia.
[102] A prevenção eficaz da recorrência do câncer de pulmão inclui, mas não se limita a, uma ausência completa e contínua de recorrência do câncer de pulmão. Em algumas modalidades, a prevenção eficaz é medida pela ausência de tumores de câncer de pulmão ou células-tronco de câncer de pulmão obtidas de um indivíduo em risco de recorrência de câncer de pulmão. Em algumas modalidades, a prevenção eficaz é determinada pela falta de aumento na concentração sanguínea de PG em um indivíduo em risco de recorrência de câncer de pulmão.
[103] O tratamento anti-PG pode ser administrado isoladamente, em monoterapia, ou em combinação com ou em adjuvante em um ou mais outros tratamentos. Outros tratamentos incluem, sem limitação, ressecção cirúrgica e tratamento com um segundo agente terapêutico, tal como um agente quimioterápico ou um anticorpo, como descrito acima. O tratamento combinado, conforme aqui fornecido, envolve a administração de pelo menos dois tratamentos a um paciente,
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66/79 um dos quais é tratamento anti-PG com pelo menos um anticorpo anti-PG e o outro é o tratamento com um agente terapêutico ou procedimento.
[104] O anticorpo anti-PG e um segundo agente podem ser administrados simultaneamente, sucessivamente ou separadamente. Como aqui utilizado, o anticorpo anti-PG e o segundo agente são ditos como sendo administrados sucessivamente se forem administrados ao paciente no mesmo dia, por exemplo, durante a mesma visita ao paciente. A administração sucessiva pode ocorrer com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 horas de intervalo. Em contraste, o anticorpo antiPG e o segundo agente são administrados separadamente se forem administrados ao paciente em dias diferentes, por exemplo, o anticorpo anti- PG e o segundo agente terapêutico podem ser administrados em intervalos de um dia, 2 dias ou 3 dias, uma semana, 2 semanas ou mensais. Nos métodos da presente divulgação, a administração do anticorpo anti-PG da divulgação pode preceder ou seguir a administração do segundo agente. Como um exemplo não limitativo, o anticorpo anti-PG e o segundo agente podem ser administrados simultaneamente por um periodo de tempo, seguido por um segundo periodo de tempo no qual a administração do anticorpo anti-PG e o segundo agente são alternados.
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[105] As características das modalidades da invenção se tornarão mais evidentes a partir da descrição detalhada a seguir dos exemplos abaixo.
LEGENDAS DE FIGURAS
[106] Figura 1:
Ensaio de proliferação celular: as células NCI- H358 foram tratadas com um anticorpo de controle ou com o antihPG Hz 8CV2 (PG Hz), um anticorpo humanizado com anti- hPG C-terminal.
EXEMPLOS
[107] Exemplo 1: Atividade neutralizante de anticorpos anti-hPG em linhagens celulares de câncer
1.1 Atividade neutralizante de anticorpos monoclonais anti-hPG
[108] Os anticorpos monoclonais ao PG são testados quanto à sua capacidade de inibir a proliferação de várias linhagens celulares comumente usadas para estudar câncer de pulmão, que produzem e secretam progastrina. A sobrevivência das células de cada uma destas linhagens celulares é testada usando diferentes anticorpos monoclonais anti-hPG.
[109] Para cada experimento, 50.000 células são semeadas em placas de 6 cavidades em meio contendo soro fetal de bezerro e incubadas por 8 horas. As células são privadas de soro durante a noite e, começando 24 horas após a semeadura (tempo TO), as células são tratadas em duplicadas
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68/79 sexuais a cada 12 horas por 48 horas, na ausência de soro fetal de bezerro, com 1 a 20 pg/ml de anticorpos monoclonal de controle (anticorpo monoclonal anti-puromicina) (mAb CT) , ou com 1 a 20 pg/ml mAb anti-hPG, em que o referido mAb é um anticorpo monoclonal anti-hPG C-terminal ou um anticorpo monoclonal anti-hPG N-terminal.
[110] O referido mAb é um anticorpo anti-hPG Cterminal, selecionado entre:
Um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 28, 29 e 30, e uma cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 31, 32 e 33,
Um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 34, 35 e 36, e uma cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 37, 38 e 39.
ou um anticorpo anti-hPG N-terminal selecionado entre:
Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 4, 5 e 6, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 7, 8 e 9,
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Um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 10, 11 e 12, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 13, 14 e 15, respectivamente,
Um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 16, 17 e 18, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 19, 20 e 21, respectivamente,
Um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 22, 23 e 24, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 25, 26 e 27, respectivamente,
[111] O número de células em TO é contado em uma cavidade de controle, para cada experimento.
[112] Especificamente, o número de células vivas nas cavidades de controle e tratadas com mAb anti-hPG é contado em 48 horas, depois é calculada a diferença entre cada contagem de células e a contagem de células determinada em TO. O número resultante de células tratadas com mAb anti
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70/79 hPG é então expresso como uma porcentagem do número de células tratadas com mAb de controle.
[113] O tratamento com anticorpos monoclonais antihPG reduz o número de células em comparação com o tratamento com anticorpo de controle. A significância estatística é determinada usando uma ANOVA unidirecional com um teste posthoc de Tukey: * = p < 0,05, ** = p < 0,01 e *** = p < 0,001. Em cada linhagem celular, os anticorpos anti-hPG reduzem a sobrevivência celular.
1.2 Atividade neutralizante de anticorpos humanizados anti-hPG na sobrevivência celular
[114] Os anticorpos humanizados para PG são testados quanto à sua capacidade de inibir a proliferação de várias linhagens celulares comumente usadas para estudar câncer de pulmão, que produzem e secretam progastrina. A sobrevivência das células de cada uma destas linhagens celulares é testada usando diferentes anticorpos monoclonais anti-hPG.
[115] Para cada experimento, 50.000 células são semeadas em placas de 6 cavidades em meio contendo soro fetal de bezerro e incubadas por 8 horas. As células são privadas de soro durante a noite e, começando 24 horas após a semeadura (tempo TO), as células são tratadas em duplicadas sexuais a cada 12 horas por 48 horas, na ausência de soro fetal de bezerro, com 1 a 20 pg/ml de anticorpos humanizados
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71/79 de controle (FcGl anti-humano, da BioXCell) (CT Hz) ou com 1 a 20 pg/ml de anti-hPG Hz, em que o referido Hz é um anticorpo humanizado anti-hPG C-terminal ou um anticorpo humanizado anti-hPG N-terminal. O número de células em TO é contado em uma cavidade de controle, para cada experimento.
[116] Especificamente, o número de células vivas em cavidades de controle e tratadas com anti-hPG Hz é contado em 48 horas, depois é calculada a diferença entre cada contagem de células e a contagem de células determinada em TO. O número resultante de células tratadas com anti-hPG Hz é então expresso como uma porcentagem do número de células tratadas com mAb de controle.
[117] O tratamento com anticorpos anti-hPG Hz reduz o número de células em comparação com o tratamento com anticorpo de controle. A significância estatística é determinada usando uma ANOVA unidirecional com um teste posthoc de Tukey: * = p < 0,05, ** = p < 0,01 e *** = p < 0,001. Em cada linhagem celular, os anticorpos anti-hPG reduzem a sobrevivência celular.
1.3 Atividade neutralizante de anticorpos monoclonais anti-hPG na frequência de células-tronco cancerígenas
[118] Os anticorpos monoclonais ao PG são testados quanto à sua capacidade de reduzir a frequência de célulastronco do câncer (CSC) usando o Extreme Limiting Dilution Assay (ELDA), em várias linhagens de células comumente usadas
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72/79 para estudar o câncer de pulmão, que produzem e secretam progastrina. A frequência de CSC de cada uma dessas linhagens celulares é testada usando diferentes anticorpos monoclonais anti-hPG.
[119] Para cada experimento, as células são semeadas em ligação ultra baixa U96 (ULA) (placas de 96 cavidades) em concentrações celulares fixas por cavidade usando um citômetro de fluxo FACS Aria, e uma faixa de concentrações é usada de uma a 500 células por cavidade. As células são cultivadas por até 11 dias em placas de ULA com meio Mil (Macari et al, Oncogene, 2015) e tratadas a cada 3 ou 4 dias com 1 a 20 pg/ml de anticorpos monoclonais de controle (monoclonal anticorpo anti-puromicina) (mAb CT) , ou com 1 a 20 pg/ml de mAb anti-hPG, em que o referido mAb é um anticorpo monoclonal anti-hPG C-terminal ou um anticorpo monoclonal anti-hPG N-terminal.
[120] Especificamente, no final da fase de incubação, as placas são observadas com um microscópio de contraste de fase e o número de cavidades positivas por concentração celular é avaliado. Por fim, a ferramenta da web ELDA (http://www.bioinf.wehi.edu.au/software/elda/) é usada para calcular as frequências do CSC de cada grupo de tratamento e testar a diferença estatística entre os grupos (teste Qui- quadrado modificado).
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[121] 0 tratamento com anticorpos monoclonais antihPG reduz a frequência do CSC em comparação com o tratamento com anticorpo de controle.
1.4 Atividade neutralizante de anticorpos humanizados anti-hPG na frequência de células-tronco cancerígenas • Ensaio de formação de esferas
[122] Os anticorpos humanizados para PG são testados quanto à sua capacidade de reduzir a frequência de células-tronco cancerígenas (CSC) usando o ensaio de formação de esferas em várias linhagens celulares comumente usadas para estudar câncer de pulmão, que produzem e secretam progastrina.
[123] Para cada experimento, 700 células são semeadas em 24 cavidades de ligação ultra baixa (ULA). As células são cultivadas por até 7 dias em placas ULA com meio Mil (Macari et al, Oncogene, 2015) e tratadas a cada 3 ou 4 dias com 20 pg/ml de anticorpos de controle humanizados (FcGl anti- humano, da BioXCell) (CT Hz), ou com 20 pg/ml de antihPG Hz (PG Hz) , em que o referido Hz é um anticorpo humanizado anti- hPG C-terminal ou um anticorpo humanizado anti-hPG Nterminal.
[124] Especificamente, no final da fase de incubação, as cavidades são fotografadas por microscopia de campo claro, as imagens são analisadas e as esferas com diâmetro médio acima de 25 pm são contadas.
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[125] Ο tratamento com anticorpos humanizados antihPG reduz a frequência do CSC em comparação com o tratamento com anticorpo de controle.
• Ensaio de Diluição com Limitação Extrema
[126] Os anticorpos humanizados para PG são testados quanto à sua capacidade de reduzir a frequência de células-tronco do câncer (CSC) usando o Extreme Limiting Dilution Assay (ELDA) em várias linhagens celulares comumente usadas para estudar o câncer de pulmão, que produzem e secretam progastrina. A frequência de CSC de cada uma dessas linhagens celulares é testada usando diferentes anticorpos humanizados anti-hPG.
[127] Para cada experiência, as células são semeadas em ligação ultra-baixa (ULA) P96 (placas de 96 cavidades) em concentrações celulares fixas por cavidade usando um citômetro de fluxo FACS Aria, e é usada uma faixa de concentrações de uma a 500 células por cavidade. As células são cultivadas por até 11 dias em placas ULA com meio Mil (Macari et al, Oncogene, 2015) e tratadas a cada 3 ou 4 dias com 1 a 20 pg/ml de anticorpos controle humanizados (FcGl anti-humano, da BioXCell) (CT Hz) ou com 1 a 20 pg/ml de anti-hPG Hz, em que o referido Hz é um anticorpo humanizado anti-hPG C-terminal ou um anticorpo humanizado anti-hPG N- terminal.
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[128] Especificamente, no final da fase de incubação, as placas são observadas com um microscópio de contraste de fase e o número de cavidades positivas por concentração celular é avaliado. Por fim, a ferramenta da web ELDA (http://www.bioinf.wehi.edu.au/software/elda/) é usada para calcular as frequências do CSC de cada grupo de tratamento e testar a diferença estatística entre os grupos (teste Qui- quadrado modificado).
[129] 0 tratamento com anticorpos humanizados antihPG reduz a frequência do CSC em comparação com o tratamento com anticorpo de controle.
1.5 Atividade neutralizante de anticorpos monoclonais anti-hPG na via de WNT/B-catenina
[130] Os anticorpos monoclonais ao PG são testados quanto à sua capacidade de inibir a via de WNT/B-catenina em várias linhagens celulares comumente usadas para estudar câncer de pulmão, que produzem e secretam progastrina, usando a expressão da proteína survivina, um gene alvo bem conhecido da via da WNT/B-catenina, conforme leitura. A expressão de survivina de cada uma dessas linhagens celulares é testada usando diferentes anticorpos monoclonais anti-hPG.
[131] Para cada experimento, 50.000 células são semeadas em placas de 6 cavidades em meio contendo soro fetal de bezerro e incubadas por 8 horas. As células foram privadas no soro durante a noite e, 24 horas após a semeadura, as
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células são tratadas em quadruplicado a cada 12 horas por 72 horas, na ausência de soro fetal de bezerro, com 1 a 20 pg/ml de anticorpos monoclonais de controle (anticorpo monoclonal anti-puromicina) (CT mAb), ou com 1 a 20 pg/ml de mAb antihPG, em que o referido mAb é um anticorpo monoclonal antihPG C-terminal ou um anticorpo monoclonal anti-hPG Nterminal.
[132] Especificamente, após 72 horas de tratamento, as células são colhidas e as proteínas totais são extraídas usando tampão RIPA. Uma quantidade igual de proteína das células tratadas com mAb CT ou mAb anti-hPG é então submetida a uma western blot usando anticorpo anti-survivina (anticorpo monoclonal, # 2802 da Cell Signaling) e anticorpo anti-actina como controle de carregamento (anticorpo monoclonal, # A4700 da SIGMA). A quantificação é realizada usando o sistema químico GBOX da Syngene.
[133] O tratamento com anticorpos monoclonais antihPG reduz a expressão de survivina em comparação com o tratamento com o anticorpo de controle. A significância estatística é determinada usando um teste T de Student não pareado: * = p < 0,05, ** = p < 0,01 e *** = p < 0,001.
1.6 Atividade neutralizante de anticorpos humanizados anti-hPG na via da WNT/B-catenina
[134] Os anticorpos humanizados para PG são testados quanto à sua capacidade de inibir a via da WNT/β-
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77/79 catenina em várias linhagens celulares comumente usadas para estudar câncer de pulmão, que produzem e secretam progastrina, usando a expressão da proteína survivina, um gene alvo bem conhecido da via da WNT/B-catenina, conforme leitura. A expressão de survivina de cada uma dessas linhagens celulares é testada usando diferentes anticorpos humanizados anti-hPG.
[135] Para cada experimento, 50.000 células são semeadas em placas de 6 cavidades em meio contendo soro fetal de bezerro e incubadas por 8 horas. As células foram privadas no soro durante a noite e, 24 horas após a semeadura, as células são tratadas em quadruplicado a cada 12 horas por 72 horas, na ausência de soro fetal de bezerro, com 1 a 20 pg/ml de anticorpos de controle humanizados (FcGl anti-humano, de BioXCell) (CT Hz), ou com 1 a 20 pg/ml de anti-hPG Hz, em que o referido Hz é um anticorpo humanizado anti-hPG Cterminal ou um anticorpo humanizado anti-hPG N-terminal.
[136] Especificamente, após 72 horas de tratamento, as células são colhidas e as proteínas totais são extraídas usando tampão RIPA. Uma quantidade igual de proteína das células tratadas com CT Hz ou anti-hPG Hz é então submetida a uma Western blot usando anticorpo anti-survivina (anticorpo monoclonal, # 2802 da Cell Signaling) e anticorpo anti-actina como controle de carga (anticorpo monoclonal, #
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A4700 da SIGMA). A quantificação é realizada usando o sistema químico GBOX da Syngene.
[137] 0 tratamento com anticorpos humanizados antihPG reduz a expressão de survivina em comparação com o tratamento com anticorpo de controle. A significância estatística é determinada usando um teste T de Student não pareado: * = p < 0,05, ** = p < 0,01 e *** = p < 0,001.
[138] Exemplo 2: Atividade neutralizante de anticorpos anti-hPG em linhagens celulares de câncer
Atividade neutralizante de anticorpos humanizados antihPG na sobrevivência celular
[139] Os anticorpos humanizados para PG foram testados quanto à sua capacidade de inibir a proliferação de várias linhagens celulares comumente usadas para estudar câncer de pulmão (isto é, NCI-H358, A549 ou NCI-H460), que produzem e secretam progastrina. A sobrevivência das células de cada uma destas linhagens celulares foi testada usando diferentes anticorpos monoclonais anti-hPG.
[140] 200.000 células NCI-H358 foram semeadas em placas de 6 cavidades em meio contendo soro fetal de bezerro e incubadas por 8 horas. As células foram privadas de soro durante a noite. 24 horas após a semeadura (tempo TO), as células foram tratadas a cada 12 horas por 48 horas, na ausência de soro fetal de bezerro, com 20 pg/ml de anticorpos controle humanizados (FcGl anti-humano, da BioXCell) (CT
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Hz), ou com 20 pg/ml de anti-hPG Hz 8CV2 (PG Hz), em que o referido Hz é um anticorpo humanizado anti-hPG C-terminal. O número de células em TO foi contado em uma cavidade de controle, para cada experimento.
[141] Especificamente, o número de células vivas em cavidades de controle e tratadas com anti-hPG Hz foi contado em 48 horas. A diferença entre cada contagem de células e a contagem de células determinada em TO foi então calculada.
[142] O tratamento com anticorpos anti-hPG Hz reduziu o número de células em comparação ao tratamento com anticorpo de controle. A significância estatística foi determinada usando um teste t: ** = p < 0,01. Em cada linhagem celular, os anticorpos anti-hPG reduziram a sobrevivência celular (ver Fig. 1).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Yanaoka et al, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,
2008, 17(4)
Pepe et al, J Natl Cancer Inst, 2008, Oct., 100(20)
Leja et al, Best Practice & Research Clinical
Gastroenterology, 2014, Dec., 28(6)

Claims (8)

1. Anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para uso na prevenção ou no tratamento de câncer de pulmão.
2. Anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é selecionado a partir de anticorpos de cadeia única, anticorpos camelizados, anticorpos IgAl, Anticorpos IgA2, anticorpos IgD, anticorpos IgE, anticorpos IgGl, anticorpos IgG2, anticorpos IgG3, anticorpos IgG4 e anticorpos IgM.
3. Anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é selecionado entre anticorpos anti-progastrina Nterminal e anticorpos anti-progastrina C-terminal.
4. Anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo de
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2/8 ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é um anticorpo neutralizante.
5. Anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é selecionado do grupo que consiste em:
um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 das sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 4, 5 e 6, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 7, 8 e 9, respectivamente, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 das sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 10, 11 e 12, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 13, 14 e 15, respectivamente, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos
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3/8 dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 das sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 16, 17 e 18, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 19, 20 e 21, respectivamente, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 das sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 22, 23 e 24, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 25, 26 e 27, respectivamente, um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 das sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 28, 29 e 30, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 31, 32 e 33, respectivamente, e um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 das
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4/8 sequências de aminoácidos de SEQ ID N° 34, 35 e 36, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de
aminoácidos de SEQ ID N° 37, 38 e 39, respectivamente. 6. Anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo í ^ato de que o referido anticorpo é selecionado do grupo que consiste em: • um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia
pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 41 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 42;
• um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 43 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 44;
• um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 45 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 46;
• um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 47 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 48;
• um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 49 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 50; e
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5/8 • um anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 51 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 52.
7 . Anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo humanizado. 8 . Anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para uso, de
acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é selecionado do grupo que consiste em:
• um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 53, e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 54;
• um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 55 e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 56;
• um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID N° 57, 58 e 59 e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID N° 60, 61 e 62;
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6/8 • um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID N° 63, 64 e 65 e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID N° 66, 67 e 68;
• um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID N° 69 e 71 e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID N° 70 e 72; e • um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID N° 75 e 76 e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID N° 77 e 78;
em que o referido anticorpo também compreende regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada derivadas de um anticorpo humano.
9. Anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 71 e uma região variável de cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 72, o
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7/8 referido anticorpo também compreendendo regiões constantes de cadeia leve e de cadeia pesada derivadas de um anticorpo humano.
10. Anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno, para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 73 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 74.
11. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo de ligação à progastrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, e um carreador farmaceuticamente aceitável e/ou um excipiente, para a prevenção ou o tratamento de câncer de pulmão.
12. Composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de ainda compreender um segundo agente terapêutico.
13. Composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o referido agente é um agente biológico ou um agente quimioterápico.
14. Composição farmacêutica para o uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o referido agente biológico é um anticorpo monoclonal anti-EGFR ou um anticorpo monoclonal anti-VEGF.
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15. Composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o referido agente quimioterápico é selecionado do grupo de agentes alquilantes, anti-metabólitos, antibióticos antitumorais, inibidores mitóticos, inibidores da função de cromatina, agentes antiangiogênese, anti-estrogênios, anti-andrógenos e imunomoduladores.
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