TWI850203B - 抗體、可活化之抗體、雙特異性抗體、和雙特異性可活化之抗體、及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本文提供抗體、可活化抗體(AA)、雙特異性抗體、及雙特異性可活化抗體(BAA)。亦提供該些抗體、AA、雙特異性抗體、及BAA之製造方法及使用方法。

Description

抗體、可活化之抗體、雙特異性抗體、和雙特異性可活化之抗體、及其使用方法 相關申請的交叉引用

本申請案主張2017年10月14日申請之美國臨時專利申請案62/572,468號之權利；2017年10月25日申請之美國臨時專利申請案62/577,140號之權利；2018年1月3日申請之美國臨時專利申請案62/613,358號之權利；2018年5月2日申請之美國臨時專利申請案62/666,065號之權利；2018年9月14日申請之美國臨時專利申請案62/731,622號之權利，其內容以全文引用的方式併入本文中。

本文提供抗體、可活化之抗體(AA)、雙特異性抗體、以及雙特異性可活化之抗體(BAA)。本文亦提供該些抗體、AA、雙特異性抗體以及BAA的製造方法及使用方法。

參照序列表

「序列表」與37 C.F.R §1.821.同時以電子方式提交，電腦可讀形式(CRF)，經由EFS-Web，文件名為CYTX-045-US SEQ LIST 10-08-18_ST25.txt，在此引用作為參考。序列表的電子副本創建於10-04-18，檔案大小為438kilobytes。

基於抗體的療法已被證明對幾種疾病有效治療，但在一些情況下，由於廣泛的標靶表現引起的毒性而限制它們的治療效果。另外，基於抗體的治療劑已經表現出其他限制，例如在投予後從循環中快速清除。

在小分子治療領域，已經開發了策略以提供活性化學實體的前藥。這些前藥以相對無活性(或顯著較低活性)的形式投予。一旦投予，前藥在活體內代謝成活性化合物。這種前藥策略可以提高藥物對其預期標靶的選擇性和減少不良反應。

因此，在基於抗體的抗體治療領域中仍然需要模擬小分子前藥的所需特徵。

本文提供抗體、雙特異性抗體、可活化之抗體、以及雙特異性可活化之抗體、其製造方法、及使用方 法。該方法係在治療及診斷的用途。本發明之可活化之抗體及雙特異性抗體可用於減少通常由抗體結合其在健康組織以及患者組織上的標靶所引起的對健康組織的損害。

因此在一態樣中，本文提供雙特異性可活化之抗體(BAA)，其中該BAA，當活化時特異性結合至兩個標靶且包含以下結構：a)特異性結合至第一標靶的IgG抗體(AB1)，其中AB1包含：a. 兩個重鏈(AB1 HC)及兩個輕鏈(AB1 LC)；以及b. 連接至第一可切割基團(CM1)的第一掩蔽基團(MM1)以形成MM1-CM1建構體，其中MM1-CM1建構體的羧基末端係連接至該AB1的每條輕鏈的每個胺基末端，其中c. 該MM1抑制該AB1結合至其標靶；以及d. 該CM1係作用為第一蛋白酶受質的多肽，b)每個特異性結合至第二標靶的兩個scFv(AB2)，其中每個AB2包含：a. 連接至重鏈可變區的輕鏈可變區，其中每個AB2的羧基末端係連接至每個AB1重鏈的胺基末端；以及b. 連接至第二可切割基團(CM2)的第二掩蔽基團(MM2)以形成MM2-CM2建構體，其中MM2-CM2建構體的羧基末端係連接至每個AB2的胺基末端，其中c. 該MM2抑制該AB2結合至其標靶；以及d. 該CM2係作用為第二蛋白酶受質的多肽， c)且其中該BAA具有至少一種以下特徵：a. MM2包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列；b. MM1包含選自於表7所列之序列所組成群組之胺基酸序列；c. AB2包含如列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之重鏈可變域或如列於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之輕鏈可變域；以及d. AB1包含含有在L234、L235、N297、以及P331至少一個胺基酸位置的胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應(effector)功能。

在一些實施例中，本文提供的該BAA包含：雙特異性可活化之抗體(BAA)，其中該BAA，當活化時，特異性結合至兩個標靶且包含以下結構：a. 特異性結合至第一標靶的IgG抗體(AB1)，其中AB1包含兩個重鏈(AB1 HC)及兩個輕鏈(AB1 LC)；以及其中AB1係連接至第一可切割基團(CM1)的第一掩蔽基團(MM1)以形成MM1-CM1建構體，其中MM1-CM1建構體的羧基末端係連接至該AB1的每條輕鏈的每個胺基末端，其中該MM1抑制該AB1結合至其標靶；以及該CM1係作用為第一蛋白酶受質的多肽，b. 每個特異性結合至第二標靶的兩個scFv(AB2)，其中每個AB2包含連接至重鏈可變區的輕鏈可變區，其中每 個AB2的羧基末端係連接至每個AB1重鏈的胺基末端；以及其中每個AB2連接至連接至第二可切割基團(CM2)的第二掩蔽基團(MM2)以形成MM2-CM2建構體，其中每個MM2-CM2建構體的羧基末端係連接至每個AB2的胺基末端，其中該MM2抑制該AB2結合至其標靶；以及該CM2係作用為第二蛋白酶受質的多肽，且其中該BAA具有至少一種以下特徵：i. MM2包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列；ii. MM1包含選自於表7所列之序列所組成群組之胺基酸序列；iii. AB2包含如列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之重鏈可變域或如列於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之輕鏈可變域；以及iv. AB1包含含有在L234、L235、N297、以及P331至少一個胺基酸位置的胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應(effector)功能。

在一些實施例中，該BAA包含如列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之重鏈可變域或如列於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。在一些實施例中，該AB1結合腫瘤標靶以及該AB2結合免疫效應(effector)標靶。在一些實施例中，該係T細胞-銜接(T cell-engaging)雙特異性(TCB)AA(TCBAA)。在一些實施例中，該AB1結合EGFR以 及AB2結合CD3。在一實施例中，該MM1包含選自於表7所列之序列所組成群組之胺基酸序列。在一些實施例中，該MM1包含選自於SEQ ID NO：85以及SEQ ID NO：78所組成群組的胺基酸序列。在一些實施例中，該MM1包含SEQ ID NO：78。在一些實施例中，該MM2包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。在一些實施例中，該CM包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列。在一些實施例中，該CM包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列。在一些實施例中，該CM該CM包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列。在一些實施例中，該CM1包含選自於SEQ ID NO：14以及SEQ ID NO：16所組成群組的胺基酸序列。在一些實施例中，該CM2包含選自於SEQ ID NO14以及SEQ ID NO：17所組成群組的胺基酸序列。在一些實施例中，本文提供BAA CI106，包含如在表11及範例1的排列及序列。在一些實施例中，本文提供BAA CI107，包含如在表11及範例1的排列及序列。在一些實施例中，本文提供BAA CI079，包含如在表11及範例1的排列及序列。在一些實施例中，本文提供BAA CI090，包含如在表11及範例1的排列及序列。在一些實施例中，本文提供BAA CI135，包含如在表11及範例1的排列及序列。在一些實施例中，本文提供BAA CI136，包含如在表11及範例1的排列及序列。在一些實施例中，該AB1包含在L234、L235、以及P331胺基酸位置至少兩個胺基酸取代。在一些實施例中，該AB1包含在L234、L235、以及P331胺基酸位置的胺基酸取代。在一些實施例中，該AB1 包含L234F、L235E、以及P331S的胺基酸取代。在一些實施例中，該AB1包含含有在N297的胺基酸取代的Fc域。在一些實施例中，該AB1包含L234F、L235E、P331S、以及N297Q的胺基酸取代。在一些實施例中，AB1的重鏈包含表6所列的SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75以及SEQ ID NO：76。

在另一態樣中，本文提供雙特異性可活化之抗體(BAA)，包含：a)特異性結合第一標靶的IgG抗體(AB1)，其中AB1包含：i. 兩個重鏈(AB1 HC)及兩個輕鏈(AB1 LC)；以及ii. 連接至第一可切割基團(CM1)的第一掩蔽基團(MM1)以形成MM1-CM1建構體，其中MM1-CM1建構體的羧基末端係連接至該AB1的每條輕鏈的每個胺基末端，其中該MM1抑制該AB1結合至其標靶；以及該CM1係作用為第一蛋白酶受質的多肽，b)每個特異性結合至第二標靶的兩個scFv(AB2)，其中每個AB2包含：i. 連接至重鏈可變區的輕鏈可變區，其中每個AB2的羧基末端係連接至每個AB1重鏈的胺基末端；以及ii. 連接至第二可切割基團(CM2)的第二掩蔽基團(MM2)以形成MM2-CM2建構體，其中MM2-CM2建構體的 羧基末端係連接至每個AB2的胺基末端，其中該MM2抑制該AB2結合至其標靶；以及該CM2係作用為第二蛋白酶受質的多肽，且其中AB1包含含有在L234、L235、N297、以及P331至少一個胺基酸位置之胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應。在一些實施例中，含有在L234、L235、N297、以及P331至少一個胺基酸位置之胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應。在一些實施例中，含有在L234、L235、以及P331至少一個胺基酸位置之胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應。在一些實施例中，該第一標靶係選自於表9所列標靶組成的群組以及該第二標靶係選自於表9所列標靶組成的群組。

在一些實施例中，本文提供的該BAA，包含：a)雙特異性可活化之抗體(BAA)，包含：i)特異性結合至第一標靶的IgG抗體(AB1)，其中AB1包含兩個重鏈(AB1 HC)及兩個輕鏈(AB1 LC)；以及其中AB1係連接至第一可切割基團(CM1)的第一掩蔽基團(MM1)以形成MM1-CM1建構體，其中MM1-CM1建構體的羧基末端係連接至該AB1的每條輕鏈的每個胺基末端，其中該MM1抑制該AB1結合至其標靶；以及 該CM1係作用為第一蛋白酶受質的多肽，ii)每個特異性結合至第二標靶的兩個scFv(AB2)，其中每個AB2包含連接至重鏈可變區的輕鏈可變區，其中每個AB2的羧基末端係連接至每個AB1重鏈的胺基末端；以及其中每個AB2連接至連接至第二可切割基團(CM2)的第二掩蔽基團(MM2)以形成MM2-CM2建構體，其中每個MM2-CM2建構體的羧基末端係連接至每個AB2的胺基末端，其中該MM2抑制該AB2結合至其標靶；以及該CM2係作用為第二蛋白酶受質的多肽，且其中該AB1包含含有在L234、L235、N297、以及P331至少一個胺基酸位置的胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應(effector)功能。在一些實施例中，在至少L234、L235、N297、以及P331胺基酸位置的胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應(effector)功能。在一些實施例中，在至少L234、L235、以及P331胺基酸位置，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應(effector)作用。在一些實施例中，該第一標靶係選自於表9所列標靶組成的群組以及該第二標靶係選自於表9所列標靶組成的群組。

在另一態樣中，本文提供可活化抗體(AA)，包含：(a)特異性結合至表皮生長因子受體(表皮生長因子受體，EGFR)的抗體(AB)，其中該AB為IgG1抗體，且其中 該AB的Fc域包含在L234、L235、以及P331至少一個胺基酸位置的胺基酸取代，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該AA具有減少效應(effector)功能；(b)與AB耦合的掩蔽基團(MM)，其中當AA是未切割的狀態時該MM會減少或抑制該AB結合至EGFR；以及(c)與AB耦合的可切割基團(CM)，其中該CM係作用為蛋白酶受質的多肽之功能。在一些實施例中，該胺基酸取代係L234F、L235E、以及P331S的任何一個或多個。在一些實施例中，該AB包含在L234、L235、以及P331至少兩個胺基酸位置的胺基酸取代。在一些實施例中，該AB包含在L234、L235、以及P331胺基酸位置的胺基酸取代。在一些實施例中，該AB包含L234F、L235E、以及P331S的胺基酸取代。在一些實施例中，該AB包含在N297胺基酸取代的Fc域。在一些實施例中，該Fc域包含N297Q突變。在一些實施例中，該AB包含L234F、L235E、P331S、以及N297Q的胺基酸取代。在一些實施例中，該MM包含選自於表7所列序列組成群組之胺基酸序列。在一些實施例中，該MM包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列。在一些實施例中，該MM包含SEQ ID NO：85的胺基酸序列。在一些實施例中，該CM包含選自於表4所列序列組成群組之胺基酸序列。在一些實施例中，該CM包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列。在一些實施例中，該CM包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列。在一些實施例中，該AA係BAA的部份。

在另一態樣中，本文提供可活化抗體(AA)包 含：(a)特異性結合至表皮生長因子受體(EGFR)的抗體或其抗原結合片段(AB)；(b)與AB耦合的掩蔽基團(MM)，其中當AA是未切割的狀態時MM會減少或抑制該AB結合至EGFR，以及該MM包含選自於表7所列序列組成群組之胺基酸序列；以及(c)與AB耦合的可切割的基團(CM)，其中該CM係作用為蛋白酶受質的多肽之功能。在一些實施例中，該MM包含SEQ ID NO：78的胺基酸序列。在一些實施例中，該CM包含經由絲胺酸蛋白酶或MMP的可切割的受質。在一些實施例中，該CM包含選自於SEQ ID NO：18-56群組的胺基酸序列。在一些實施例中，該CM包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列。在一些實施例中，該CM包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列。在一些實施例中，該AA係BAA的部份。

在另一態樣中，本文提供係可活化抗體(AA)，包含：(a)特異性結合至CD3的ε鏈的抗體或其抗原結合片段(AB)，其中該抗體包含如列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之重鏈可變域或如列於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之輕鏈可變域；(b)與AB耦合至掩蔽基團(MM)，其中當AA是未切割的狀態時MM會減少或抑制該AB結合至CD3；以及(c)與AB耦合的可切割基團(CM)，其中該CM係作用為蛋白酶受質的多肽之功能。在一些實施例中，該AB包含如列於SEQ ID NO：2之重鏈可變域。在一些實施例中，該AB包含如列於SEQ ID NO：3之重鏈可變域。在一些 實施例中，該AB包含如列於SEQ ID NO：1之輕鏈可變域。在一些實施例中，該AB包含如列於SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。在一些實施例中，該AB包含如列於SEQ ID NO：2之重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：1之輕鏈可變域。在一些實施例中，該AB包含如列於SEQ ID NO：3之重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：1之輕鏈可變域。在一些實施例中，該AB包含如列於SEQ ID NO：2之重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。在一些實施例中，該AB包含如列於SEQ ID NO：3之重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。在一些實施例中，該MM包含選自於表所列之任一序列。在一些實施例中，該CM包含表4所列之任一序列。在一些實施例中，該AA係BAA的部份。

在另一態樣中，本文提供可活化抗體(AA)包含：(a)特異性結合至CD3的epsilon鏈(CD3ε)的抗體或其抗原片段(AB)；(b)與AB耦合的掩蔽基團(MM)，其中當AA是未切割的狀態時MM會減少或抑制該AB結合至CD3；其中MM包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列；以及(b)與AB耦合的可切割基團(CM)，其中該CM係作用為蛋白酶受質的多肽之功能。在一些實施例中，該CM包含表4所列任一序列。在一些實施例中，該CM包經由絲胺酸蛋白酶或MMP的可切割的受質。在一些實施例中，該CM包含選自於SEQ ID NO：18-56群組的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白酶為MMP.在一些實施例中，蛋白酶為絲胺酸蛋白酶。在一些實施例中，該AA係BAA的部份。

在另一實施例中，本文提供可活化抗體(AA)，包含：(a)特異性結合標靶的抗體(AB)，其中該抗體係為IgG1抗體，且該抗體的Fc域包含在L234、L235、以及P331至少一個胺基酸位置的胺基酸取代，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該AA具有減少效應；(b)與AB耦合的掩蔽基團(MM)，其中當AA是未切割的狀態時MM會減少或抑制該AB結合至標靶；以及(c)與AB耦合的可切割基團(CM)，其中該CM係作用為蛋白酶受質的多肽之功能。在一些實施例中，該Fc域包含在在至少L234、L235、N297以及P331胺基酸位置，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該AA具有減少效應(effector)功能；在一些實施例中，該標靶選自於表9所列標靶組成之群組。在一些實施例中，該AA係BAA的部份。

在另一態樣中，本文提供特異性結合至CD3的ε(epsilon)鏈的抗體或其抗原結合片段(AB)，其中該抗體包含如列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之重鏈可變域或如列於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。在一些實施例中該抗體包含如列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之重鏈可變域或如列於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。在一些實施例中該抗體包含如列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。在一些實施例中該AB包含如列於SEQ ID NO：2之重鏈可變域。在一些實施例中該AB包含如列於SEQ ID NO：3之重鏈可變域。在一些實施例 中該AB包含如列於SEQ ID NO：1之輕鏈可變域。在一些實施例中該AB包含如列於SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。在一些實施例中該AB包含如列於SEQ ID NO：2之重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：1之輕鏈可變域。在一些實施例中該AB包含如列於SEQ ID NO：3之重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：1之輕鏈可變域。在一些實施例中該AB包含如列於SEQ ID NO：3之重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。在一些實施例中該AB包含如列於SEQ ID NO：2之重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。在一些實施例中，該抗體為雙特異性AB。在一些實施例中該抗體係scFv。在一些實施例中該抗體係IgG1抗體。在一些實施例中，該抗體係AA係BAA的部份。

在另一態樣中，本文提供特異性結合至EGFR或CD3的抗體(AB)，其中該抗體係連接至Fc域的IgG1抗體或scFv，其中該抗體包含含有在L234、L235、以及P331至少一個胺基酸位置的胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該抗體具有減少效應(effector)功能。在一些實施例中，任一個或多個L234F、L235E、以及P331S的胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體包含在L234、L235、以及P331的至少兩個胺基酸位置的胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體包含在L234、L235、以及P331胺基酸位置的胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體包含L234F、L235E、以及P331S的胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體包含含有在N297胺基酸取代 的Fc域。在一些實施例中，該Fc包含N297Q突變。在一些實施例中，該抗體包含L234F、L235E、P331S、以及N297Q胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體的重鏈包含表6所列SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75以及SEQ ID NO：76之任一個。在一些實施例中，該抗體的重鏈可變域包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之任一個或其中該AB的輕鏈可變域SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之任一個。在一些實施例中，該抗體係AA或BAA的部份。

在另一態樣中，本文亦提供含有BAA、AA以及上述抗體之任一個以及任一載劑之醫藥組成物。在另一態樣中，本文以提供含有BAA、AA以及上述抗體之任一個以及載劑之醫藥組成物。在一些實施例中，該組成物包含另外的藥劑，例如該另外的藥劑可為治療藥劑。

在另一態樣中，本文亦提供編碼BAA、AA以及上述抗體之任一個的單離核酸分子。本文亦提供含有所提供的核酸之載體。在一些實施例中，該載體包含pLW289核酸序列。在一些實施例中，該載體包含pLW246核酸序列。在一些實施例中，該載體包含pLW307核酸序列。在一些實施例中，該載體包含pLW291核酸序列。在一些實施例中，該載體包含pLW352核酸序列。在一些實施例中，該載體包含pLW246核酸序列。在一些實施例中，該載體包含pLW353核酸序列。

在另一態樣中，本文亦提供含有上述任一載體的細胞。在一些實施例中，本文提供含有pLW289以及pLW246的細胞。在一些實施例中，本文提供含有pLW307以及pLW291的細胞。在一些實施例中，本文提供含有pLW352以及pLW246的細胞。在一些實施例中，本文提供含有pLW353以及pLW246的細胞。

在另一態樣中，本文提供經由在可誘導抗體、AA、或BAA表現的條件下培養細胞來製造上述提供的抗體、AA、或BAA的方法，其中該細胞包含相關的核酸或本文提供的載體。

在另一態樣中，本文提供治療、減緩病症或疾病的症狀、或延遲病症或疾病的進展之方法，包含投予所需個體治療有效劑量的上述抗體/AA/BAA/醫藥組成物。在一些實施例中，該病症或疾病包含表現EGFR的疾病細胞。在一些實施例中，該病症或疾病為癌症。在一些實施例中，該癌症為肛門癌、基底細胞癌、腦癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、子宮頸癌、膽管癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、膽囊癌、胃癌、膠質母細胞瘤、頭頸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、肉瘤、小腸癌、皮膚癌、睪丸癌、甲狀腺癌或子宮癌。在一些實施例中，該病症為淋巴瘤，如：艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus；EBV)淋巴瘤、B-細胞淋巴瘤、T-細胞霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkins)以及非霍奇金氏淋巴瘤。在一些實施例中，該癌症為鱗狀細胞癌。在一些實施例中，該 癌症為頭部及頸部鱗狀細胞癌。在一些實施例中，該癌症為皮膚鱗狀細胞癌。在一些實施例中，該癌症為食道鱗狀細胞癌。在一些實施例中，該癌症為頭部及頸部鱗狀細胞癌。在一些實施例中，該癌症為肺鱗狀細胞癌。

在另一態樣中，本文提供抑制個體血管新生的方法，包含投予所需個體治療有效劑量的上述抗體/AA/BAA/醫藥組成物。在一些實施例中，該方法包含投予另外的藥劑。在一些實施例中，該另外的藥劑為治療藥劑。

在另一態樣中，本文提供減少經由抗體與在健康組織以及疾病組織(如癌症組織)上的標靶結合所造成的損傷，該方法包含投予所需個體治療有效劑量的AA或BAA或含有AA或BAA的醫藥組成物。該方法包含投予所需個體AA或BAA或含有AA或BAA的醫藥組成物，其中該AA或BAA為本文提供任一實施例的AA或BAA。

在另一態樣中，本文提供改善抗體治療的耐受性(tolerability)，包含投予所需個體(如：患有癌症的個體)AA或BAA或含有AA或BAA的醫藥組成物，其中該AA或BAA為本文提供任一實施例的AA或BAA。

在另一態樣中，本文提供募集T細胞至癌組織的方法，包含投予所需個體AA或BAA或含有AA或BAA的醫藥組成物，其中該AA或BAA為本文提供任一實施例的AA或BAA。

在另一態樣中，本文提供任一實施例的抗 體、AA、BAA、或醫藥組成物作用為藥物之用途。該藥物可用於減少經由抗體與在健康組織以及疾病組織(如癌症組織)上的標靶結合所造成的損傷之方法之用途。該藥物可用於改善抗體治療的耐受性之用途。

在另一態樣中，本文提供任一實施例的抗體、AA、BAA、或醫藥組成物用於治療、減緩病症或疾病的症狀、或延遲病症或疾病的進展之方法之用途，其中該病症或疾病包含表現EGFR的疾病細胞。

在另一態樣中，本文提供任一實施例的抗體、AA、BAA、或醫藥組成物用於治療癌症的方法之用途；其中該癌症任意為肛門癌、基底細胞癌、腦癌、膀胱癌、乳癌、骨癌、子宮頸癌、膽管癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、膽囊癌、胃癌、膠質母細胞瘤、頭頸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、肉瘤、小腸癌、鱗性細胞癌、皮膚癌、睪丸癌、甲狀腺癌或子宮癌。該用途可包含將T細胞募集到腫瘤組織。

在另一態樣中，本文提供任一實施例的抗體、AA、BAA、或醫藥組成物用於抑制血管新生的方法之用途。

本文提供任一實施例的抗體、AA、BAA、或醫藥組成物可用於治療的方法之用途，包含投予另外的藥劑；其中該另外藥劑為任意治療藥劑。

圖1A表示相較於CI011，將h20GG CD3ε掩蔽胜肽併入至EGFR掩蔽BAA CI106和CI107中顯著降低對Jurkat細胞的結合。相較於CI011，結合至EGFR+HT29-luc2細胞的減少亦在CI106和CI107證實(圖1B)。

圖2A證明相較於CI011和CI040，CI106和CI106進一步減少EGFR+HT29-luc2細胞的殺傷力。圖2B顯示當以CI127和CI128處理細胞時未觀察到細胞毒性，證明EGFR靶向對細胞殺傷的依賴性。另外，圖2B描繪相較於蛋白酶活化的雙特異性抗體(如：經由蛋白酶處理活化BAA)act-104(可互換地稱為CI104)，雙重掩蔽的雙特異性抗體CI106和CI107(如：在EGFR及CD13標靶結合區域BAA掩蔽)超過300,000倍EC50偏移。圖2C描繪包含HT29的一組細胞株的EGFR受體數目。HT29細胞上的近似EGFR受體數量為75,000，表示測試抗體的強效細胞毒性不需要高抗原密度。

圖3A表示相較於CI011及CI040，經由CI106及CI10是初代CD8+T細胞的活性減弱。圖3B表示相較於蛋白酶活化的雙特異性抗體act-104，雙重掩蔽的抗體顯示T細胞活化的移位劑量反應曲線，表示掩蔽減弱T細胞活化。

圖4繪製腫瘤體積與初始治療劑量後天數的關係，表示CI106和CI107雙重遮蔽、雙、AA對HT29-luc2異種移植腫瘤的生長具有劑量依賴性作用。

圖5繪製腫瘤體積與初始治療劑量後天數的 關係，表示CI106和CI107雙重遮蔽、雙、AA對HCT116異種移植腫瘤的生長具有劑量依賴性作用。

圖6A-6B證實當使用人類(6A)或獼猴(6B)反應細胞時，細胞毒性測定中測試的雙重掩蔽和蛋白酶活化的雙特異性抗體的EC50是相似的。圖6C和圖6D表示蛋白酶活化的和雙重掩蔽的抗體對人類(6C)和食蟹獼猴(6D)T細胞的結合是相似的。

圖7A-7C繪製在以CI106或CI107處理的食蟹獼猴中投予前，投予劑量後(post-dose)48小時和7天的ALT(7A)、AST(7B)和總膽紅素(7C)的血清濃度。

圖8A-8C描繪在以CI106或CI107處理的食蟹獼猴中IL-2(8A)、IL-6(8B)、以及IFN-g(8C)的血清細胞因子含量的增加。

圖9A-9C繪製在以CI106或CI107處理的食蟹獼猴中經由在CD4+T細胞CD69(9A)、Ki67(9B)、以及PD-1(9B)的表現測量T細胞活性。

圖10A-E繪製在以CI106或CI107處理的食蟹獼猴中投予劑量後48小時AST(10A)、投予劑量後48小時ALT(10B)、投予劑量後8小時IL-6(10C)、投予劑量後8小時IFNg(10D)和投予劑量後72小時Ki67(10E)的劑量依賴性增加。對於雙重掩蔽的抗體，所有參數的劑量反應曲線發生偏移，表示相較於蛋白酶活化的雙特異性抗體，改善的耐受性和降低的藥效學效應。在一些實施例中，IL-6劑量反應曲線偏移60多倍。

圖11A-11C相較於EGFR結合CI107以及非EGFR結合CI128(RSVxCD3)在總膽色素(11A)、IL-6(11B)、以及CD4+T細胞表現PD-1(11C)的影響增加。

圖12A描繪相較於hSP34v12、v16以及v19相對於hSP34的親和力測量。圖12B描繪在HT29-luc2活化的或雙重掩蔽的雙特異性抗體對HT29-luc2細胞的細胞毒性。

圖13描繪相對於蛋白酶活化分子act-104的雙重掩蔽分子CI107的延長的PK。

圖14A描繪PBMC移植的NSG小鼠中HT29-luc2腫瘤干預模型的功效。該範例中的抗腫瘤效力與測試物的蛋白酶敏感性和受質可切割性相關，最有效的測試物是完全蛋白酶活化的CI048。圖14B描繪CD3的腫瘤切片染色(深色染色)，作為T細胞浸潤到腫瘤中的程度的測量。腫瘤T細胞浸潤與測試物的蛋白酶敏感性和受質可切割性相關。

圖15及圖16為本發明的可活化的抗EGFR C225v5抗體用於上述可活化的抗EGFR抗體3954-2001-C225v5以及用於抗EGFR抗體C225v5的結合等溫線圖。

圖17-19表示本文所提供的示例性的BAA。

圖20繪製以600、2000、或4000μg/kg單一劑量投予後雙重遮蔽BAA CI107的PK。

圖21表示在HT29-luc2細胞中相對於CI011、CI090和CI091的細胞毒性減弱。

圖22表示相較於CI011、CI090和CI091進一步減弱原代CD8+T細胞的活性。

圖23繪製在PBMC異種移植NSG小鼠HT29-luc2腫瘤干預模型中的功效。顯示CI091、CI090以及CI011的抗腫瘤能力。

圖24繪製在給藥後8小時，食蟹獼猴活體內的IL-6含量進行研究。

本文提供的抗體、可活化抗體(AA)、雙特異性抗體、以及雙特異性可活化抗體(BAA)。

在一些實施例中，本文提供特異性結合至CD3的epsilon鏈(CD3ε；表示本文可互換為CD3)的人源化抗體。

在一些實施例中，本文提供係特異性結合至表皮生長因子受體(EGFR)的IgG1抗體，其中包含在Fc域的點突變，以使抗體具有減少效應(effector)功能。

在一些實施例中，本文提供係AA，例如特異性結合至EGFR或CD3的AA。該些AA係優化的親和力、效應功能、掩蔽、以及可切割性。

在一些實施例中，本文提供BAA，例如特異性結合至標靶抗原以及第二抗原(e.g.在免疫效應細胞的免疫效應抗原)的BAA(如：腫瘤抗原、例如陳列於表9的標靶)。在一些實施例中，該免疫效應細胞係白血球細胞。 在一些實施例中，該免疫效應細胞係T細胞。在一些實施例中，該免疫效應細胞係自然殺手(NK)細胞。在一些實施例中，該免疫效應細胞係巨嗜細胞。在一些實施例中，該免疫效應細胞係單核細胞，例如髓系單核細胞。在一些實施例中，該BAA為免疫效應細胞參與(engaging)BAA。在一些實施例中，該BAA係白血球細胞參與BAA。在一些實施例中，該BAA係T細胞參與雙特異性(TCB)AA，此處亦表示為TCBAAs。在一些實施例中，該BAA為NK細胞參與BAA。在一些實施例中，該BAA係巨噬細胞參與BAA。在一些實施例中，該BAA係單核細胞參與BAA，例如髓系單核細胞參與BAA。在一些實施例中，該雙特異性抗體結合EGFR及CD3。該BAA係優化的親和力、效應功能、掩蔽、以及可切割性。

在本文中所亦提供者係該些抗體、AA及BAA的製造方法及使用方法。AA，包含其一般製造及掩蔽基團(MM)的鑑定且可切割基團(CM)係在2009年2月26日Daugherty等人的國際專利公開號WO 2009/025846以及在2010年7月15日Stagliano等人的國際專利公開號WO 2010/081173，兩者內容以引用的方式併入本文中。BAA，包含其一般製造及掩蔽基團(MM)的鑑定且可切割基團(CM)係在2009年1月29日Lowman等人的國際專利公開號WO2015/013671以及在2016年1月28日Irving等人的國際專利公開號WO2016/014974，兩者內容以引用的方式併入本文中。亦併入2016年1月28日Irving等人的國際專利公開號 WO2016/118629以及在2016年7月28日Moore等人的國際專利公開號提供的AA、一般製造、MM、以及CM。

除非另有說明，否則本文使用的用語「抗體」包括特異性結合其標靶的抗體或其抗原結合片段，並且是單株抗體、結構域抗體、單鏈、Fab片段、F(ab’)₂片段、scFv、scAb、dAb、單結構域重鏈抗體、以及單結構域輕鏈抗體。在一些實施例中，該抗體係IgG抗體。在一些實施例中，該抗體係IgG1抗體。在一些實施例中，該抗體係IgG4抗體。在一些實施例中，該抗體係scFv抗體。在一些實施例中，該抗體或結合至其標靶的免疫活性片段係老鼠、嵌合抗體、人源化抗體或完全人單株(monoclonal)抗體。

1. CD3抗體

本文提供特異性結合至CD3的epsilon鏈(CD3ε，此處統稱為CD3)的抗體或其抗原片段(AB)。

表1中提供本發明的CD3結合抗體(可變結構域)的示例性胺基酸序列。(預測的CDR序列加下底線)。如下所述，在示例性CD3結合抗體中，L3是連接輕鏈和重鏈可變結構區域的連接子。

表1-1提供式例性的scFv連接子(此處表示「L3」連接VH及VL)。

在表2提供示例性CD3結合抗體的CDR序列。

此處提供，該CD3抗體包含至少一個表2提供的CDR序列。

在一些實施例中，該CD3抗體包含列於SEQ ID NO：2之重鏈可變域。

在一些實施例中，該CD3抗體包含列於SEQ ID NO：3之重鏈可變域。

在一些實施例中，該CD3抗體包含列於SEQ ID NO：1之輕鏈可變域。

在一些實施例中，該CD3抗體包含列於SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。

在一些實施例中，該CD3抗體包含列於SEQ ID NO：2之重鏈可變域以及列於SEQ ID NO：1之輕鏈可變域。

在一些實施例中，該CD3抗體包含列於SEQ ID NO：3之重鏈可變域以及列於SEQ ID NO：1之輕鏈可變域。

在一些實施例中，該CD3抗體包含列於SEQ ID NO：3之重鏈可變域以及列於SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。

在一些實施例中，該CD3抗體包含列於SEQ ID NO：2之重鏈可變域以及列於SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。

在一些實施例中，該CD3抗體包含列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之重鏈可變域或列於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。

在一些實施例中，該CD3抗體包含列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之重鏈可變域以及列於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。

在一些實施例中，該CD3抗體為scFv抗體。在一些實施例中，該可變區域包含從以下N末端至C末端之結構：LV-HV。在一些實施例中，該可變域包含從以下N末端至C末端之結構：HV-LV。

在一些實施例中，該CD3抗體為scFv抗體包含連接至輕鏈可變區(VL)的重鏈可變區(VH)，其中該VH係經由含有胺基酸序列SEQ ID NO：98的連接子連接至該VL。具有連接子示例性的序列例如是表1所提供。

在一些示例性的實施例中，本文提供特異性結合至CD3的抗體(AB)，其中該抗體為IgG1抗體或連接至Fc域的scFv，其中該抗體包含含有在L234、L235以及P331至少一個胺基酸位置的胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應(effector)功能。在一些實施例中，該胺基酸取代為任何一個或多個L234F、L235E及P331S之胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體包含在L234、L235、以及P331至少兩個胺基位置之胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體包含在L234、L235、以及P331胺基位置之胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體包含L234F、L235E、以及P331S之胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體包含含有在N297的胺基酸取代的Fc域。在一些實施例中，該Fc域包含N297Q突變。在一些實施例中，該抗體包L234F、L235E、P331S、以及N297Q胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體的重鏈可變域包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的任一個或其中AB的 該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的任一個。

2.可活化CD3抗體

在一些實施例中，本文提供CD3抗體的任一各為在可活化抗體(AA)型式(format)。

如本文一般性地提供，本文之AA包含MM-CM建構體，本文表示為前域(prodomain)。因此，如本文所使用，「前域」表示含有掩蔽基團(MM)的多胜肽以及可切割部分(CM)。在一些實施例中，經由連接子將該MM及該CM分開，本文表示為L1。在一些實施例中，該前域包含在CM的羧基末端的連接子；該連接子，本文表示為L2，連接前域的CM至AB。在一些實施例中，該前域包含在MM及CM之間的連接子且連接子在CM之後。在一些實施例中，該MM及該CM不會被連接子分開。在一些實施例中，前域包含下式之一(其中該下式代表N-至C-末端方向或C-至N-末端方向任一個的胺基酸序列)：(MM)-L1-(CM)、(MM)-(CM)-L2、(MM)-L1-(CM)-L2、或(MM)-(CM)。在示例性的實施例中，前域包含EGFR MM以及經由第二型跨膜絲胺酸蛋白酶(matriptase)或MMP的可切割CM；或CD3ε MM以及經由第二型跨膜絲胺酸蛋白酶或MMP的可切割CM。在一些實施例中，前域包含EGFR MM以及經由第二型跨膜絲胺酸蛋白酶或MMP的可切割CM。在一些實施例中，前域包含CD3ε MM以及經由第二型跨膜 絲胺酸蛋白酶或MMP的可切割CM。本文所提供為包含前域的可活化抗體(AA)。本文亦提供編碼本發明之前域的核苷酸。

因此，本文提供CD3 AA包含：(a)特異性結合至CD3的ε鏈(CD3ε)的抗體或其抗原結合片段(AB)，其中該抗體包含列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的重鏈區域或包含列於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的輕鏈區域；(b)與AB耦合的掩蔽基團(MM)，其中當AA是未切割的狀態時MM會減少或抑制該AB結合至CD3ε；以及(c)與AB耦合的可切割的基團(CM)，其中該CM係作用為蛋白酶受質的多肽之功能。如前文所述，(b)以及(c)一起為前域的部分。

在一些實施例中，該CDAA的AB為前述一節的任何一個CD3抗體。

在一些實施例中，該CD3 AA的AB包含列於SEQ ID NO：2的重鏈可變域。

在一些實施例中，該CD3 AA的AB包含列於SEQ ID NO：3的重鏈可變域。

在一些實施例中，該CD3 AA的AB包含列於SEQ ID NO：1的輕鏈可變域。

在一些實施例中，該CD3 AA的AB包含列於SEQ ID NO：4的輕鏈可變域。

在一些實施例中，該CD3 AA的AB包含列於SEQ ID NO：2之重鏈可變域以及列於SEQ ID NO：1之輕鏈 可變域。

在一些實施例中，該CD3 AA的AB包含列於SEQ ID NO：3之重鏈可變域以及列於SEQ ID NO：1之輕鏈可變域。

在一些實施例中，該CD3 AA的AB包含列於SEQ ID NO：3之重鏈可變域以及列於SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。

在一些實施例中，該AB為含有連接至輕鏈可變區(VL)的重鏈可變區(VH)的scFv，其中VH係經由含有SEQ ID NO：98的胺基酸序列連接子L3連接至VL具有連接子示例性的序列例如是表1所提供。

在一些實施例中，該CD3 AA的MM包含列於表3的任一序列。

示例性的本發明CD3掩蔽基團(MM)如表3提供。

在一些實施例中，該CD3 AA的MM包含列於SEQ ID NO：12的序列。在一些實施例中，該CD3 AA的MM包含列於SEQ ID NO：10的序列。在一些實施例中，該CD3 AA的MM包含列於SEQ ID NO：11的序列。

在一些實施例中，該CD3 AA的CM包含列於 表4的序列。本發明示例性的可切割基團(CM)如表4所提供。

在一些實施例中，本發明的AA的CM包含例如表4-1的任一序列。

3. 具有Fc突變的抗體

本文所提供為具有Fc突變或含有連接至Fc域域的抗原結合區域(如scFv、Fab、F(ab’)₂)的抗體片段之 IgG1抗體，其中Fc表現具有減少效應(effector)功能(本文為Fc變異體)。本文所述BAA、AA、以及抗體可包含本文揭露任何Fc變異體。

包含該些Fc突變的抗體會導致減少效應功能，以維持標靶結合的親和力。因此，本文提供與目標標靶結合的抗體，其中該抗體為IgG1抗體或連接至Fc的抗體片段，其中連接至Fc的抗體或抗體片段，其中該Fc域包含在L234、L235、以及P331至少一個胺基酸位置的胺基酸取代，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應(effector)功能。在一些實施例中，該胺基酸取代為L234F、L235E、以及P331S之任一或多個。在一些實施例中，在N297有其他的突變。在一些實施例中，該胺基酸取代為N297Q或N297A。

在一些實施例中，該Fc為選自於陳列表4-2的Fc序列。在一些實施例中，該Fc為選自於SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：SEQ ID NO：158、以及SEQ ID NO：160，其中該X為選自於任何天然存在的胺基酸(例如：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、穀胺醯胺、谷胺酸、甘胺酸、組胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、吡咯離胺酸、硒代半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸)或任何非天然存在的胺基酸(例如反式-3-甲基脯胺酸、2,4-甲基脯胺酸、順式-4-羥基脯胺酸、反式-4-羥基脯胺酸、N-甲基甘胺酸、異丙蘇胺酸、甲基蘇胺酸、羥乙基 半胱胺酸、羥乙基高半胱胺酸、硝基穀胺醯胺、高穀胺醯胺、呱啶酸、叔亮胺酸、正纈胺酸、2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸和4-氟苯丙胺酸)所組成之群組。

本文提供含有該些Fc突變的抗體、AA、雙特異性抗體、以及BAA。

在一些實施例中，該些含有AA及BAA的Fc變異體可結合免疫效應細胞。在一些實施例中，其可結合選擇性位於免疫效應細胞上的標靶。在一些實施例中，其可結合CD3。在一些實施例中，其可結合列於表9的任何標靶。在一些實施例中，其可結合EGFR。

因此，在一些實施例中，本文提供為可活化抗體(AA)，包含： a)特異性結合標靶的抗體(AB)，其中該抗體為IgG1抗體，且其中該抗體的Fc域包含在L234、L235、以及P331至少一個胺基酸位置的胺基酸取代，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該AA具有減少效應(effector)功能；b)與AB耦合的掩蔽基團(MM)，其中當AA是未切割的狀態時該MM會減少或抑制該AB結合至該標靶；以及c)與AB耦合的可切割基團(CM)，其中該CM係作用為蛋白酶受質的多肽之功能。

在一些實施例中，該Fc域包含在L234、L235、N297、以及P331至少胺基酸位置的胺基酸取代，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該AA具有減少效應(effector)功能。在一些實施例中，該標靶選自於表9陳列的標靶所組成的群組。

在一些實施例中，本文提供為雙特異性可活化之抗體(BAA)，包含：a)特異性結合第一標靶的IgG抗體(AB1)，其中該AB1包含：i. 兩個重鏈(AB1 HC)及兩個輕鏈(AB1 LC)；以及ii. 連接至第一可切割基團(CM1)的第一掩蔽基團(MM1)以形成MM1-CM1建構體，其中MM1-CM1建構體的羧基末端係連接至該AB1的每條輕鏈的每個胺基末端，其中該MM1抑制該AB1結合至其標靶；以及 該CM1係作用為第一蛋白酶受質的多肽，b)每個特異性結合至第二標靶的兩個scFv(AB2)，其中每個AB2包含：i. 連接至輕鏈可變區的重鏈可變區，其中每個AB2的羧基末端係連接至每個AB1重鏈的胺基末端；以及ii. 連接至第二可切割基團(CM2)的第二掩蔽基團(MM2)以形成MM2-CM2建構體，其中每個MM2-CM2建構體的羧基末端係連接至每個AB2的胺基末端，其中該MM2抑制該AB2結合至其標靶；以及該CM2係作用為第二蛋白酶受質的多肽，且其中該AB1的Fc域包含在L234、L235、N297、以及P331至少一個胺基酸位置的胺基酸取代，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該AA具有減少效應(effector)功能。

在一些實施例中，本文提供該AA包含：a)雙特異性可活化之抗體(BAA)，包含：i)特異性結合第一標靶的IgG抗體(AB1)，其中該AB1包含兩個重鏈(AB1 HC)及兩個輕鏈(AB1 LC)；以及其中該AB1係連接至兩個重鏈(AB1 HC)及兩個輕鏈(AB1 LC)；以及其中MM1-CM1建構體的羧基末端係連接至該AB1的每條輕鏈的每個胺基末端，其中該MM1抑制該AB1結合至其標靶；以及該CM1係作用為第一蛋白酶受質的多肽，ii)每個特異性結合至第二標靶的兩個scFv(AB2)，其 中每個AB2包含連接至輕鏈可變區的重鏈可變區，其中每個AB2的羧基末端係連接至每個AB1重鏈的胺基末端；以及其中每個AB2係連接至連接至第二可切割基團(CM2)的第二掩蔽基團(MM2)以形成MM2-CM2建構體，其中每個MM2-CM2建構體的羧基末端係連接至每個AB2的胺基末端，其中該MM2抑制該AB2結合至其標靶；以及該CM2係作用為第二蛋白酶受質的多肽，且其中該AB1包含含有在L234、L235、N297、以及P331至少一個胺基酸位置的胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應(effector)功能。

4. EGFR抗體

本文提供為特異性結合至EGFR的抗體或其抗原結合片段(AB)。示例性的EGFR結合抗體的CDR序列提供於表5。

本文提供為EGFR抗體、具有一臂(arm)雙特異抗體標靶於EGFR，於活化時能夠結合EGFR之AA以及BAA(能在活化時結合EGFR)。在一些實施例中，該EGFR抗體包含表5的CDRs。

在一些實施例中，如：在BAA型式(format)中，本文提供為結合至表皮生長因子受體(EGFR)的IgG1抗體及賦與減少效應功能的能力。該抗體包含會導致減少 效應功能的Fc突變，而維持EGFR結合親和力。因此，本文所提供為結合至EGFR的抗體，其中該抗體為IgG1抗體，其中該抗體包含含有L234、L235、以及P331至少一個胺基酸位置之胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應(effector)功能。在一些實施例中，該胺基酸取代為L234F、L235E、以及P331S之任一個或多個。

在一些實施例中，該抗體包含在L234、L235、以及P331至少兩個胺基酸位置之胺基酸取代。

在一些實施例中，該抗體包含在L234、L235、以及P331的胺基酸位置的胺基酸取代。

在一些實施例中，該抗體包含L234F、L235E、以及P331S之胺基酸取代。

在一些實施例中，該抗體包含含有在N297的胺基酸取代並伴隨有在L234、L235、及/或P331至少一個胺基酸位置的胺基酸取代的Fc域。在一些實施例中，該Fc包含N297Q突變。在一些實施例中，該Fc域包含N297A突變。

在一些實施例中，該抗體包含L234F、L235E、P331S以及N297Q取代。在一些實施例中，該抗體包含L234F、L235E、P331S以及N297A取代。

示例性的EGFR結合抗體的CDR序列為提供於表5，陳列在Kabat。

示例性的EGFR結合抗體的胺基酸序列為提供於表6。(VL及VH分別表示可變輕鏈及可變重鏈；LC及HC分別表示輕鏈及重鏈)。

在一些實施例中，EGFR抗體包含在表6中提供的任一序列。

在一些實施例中，該EGFR抗體的重鏈包含列於表6的SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75以及SEQ ID NO：76之任一序列。在一些實施例中，該EGFR抗體的重鏈包含列於SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、以及SEQ ID NO：73之任一序列，其中X為選自於任何天然存在的胺基酸(例如：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、穀胺醯胺、谷胺酸、甘胺酸、組胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、吡咯離胺酸、硒代半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸)或任何非天然存在的胺基酸(例如反式-3-甲基脯胺酸、2,4-甲基脯胺酸、順式-4-羥基脯胺酸、 反式-4-羥基脯胺酸、N-甲基甘胺酸、異丙蘇胺酸、甲基蘇胺酸、羥乙基半胱胺酸、羥乙基高半胱胺酸、硝基穀胺醯胺、高穀胺醯胺、呱啶酸、叔亮胺酸、正纈胺酸、2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸以及4-氟苯丙胺酸)所組成之群組。代號Fcmt3包含三個點突變，其中EGFR抗體的重鏈的Fc域包含以下三個點突變：L234F、L235E、以及P331S。因此，在一些實施例中，該EGFR抗體包含具有列於SEQ ID NO：C225v5Fcmt3 HC序列的重鏈。在一些實施例中，EGFR抗體的重鏈的Fc域包含第四個點突變N297Q。代號Fcmt4包含Fcmt3三個點突變及四個點突變N297Q。因此，在該實施例中，該EGFR抗體包含具有列於SEQ ID NO：76之胺基酸序列的重鏈。

5.可活化EGFR抗體

在一些實施例中，本文提供的EGFR抗體任一個為AA型式(EGFR AA)，如上述CD3 AAs，該EGFR AA亦包含前域。

因此本文提供AA，其包含特異性結合至EGFR的抗體或其抗原結合片段(AB)。示例性EGFR結合抗 體的CDR序列提供於表5。

在一些實施例中，該AA包含：(a)特異性結合至表皮生長因子受體(EGFR)的任何抗體或其抗原結合片段(AB)；(b)以及前域，其中該前預包含(i)與AB耦合的掩蔽基團(MM)，其中當AA是未切割的狀態時該MM會減少或抑制AB結合至EGFR，且其中該MM包含選自於表7所列之序列所組成群組之胺基酸序列；以及(ii)與AB耦合的可切割基團(CM)，其中該CM係作用為第一蛋白酶受質的多肽。

本發明之示例性的EGFR掩蔽基團(MM)為表7及8所提供。

在一些實施例中，EGFR AA的MM包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列。在一些實施例中，EGFR AA的MM包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列。

在一些實施例中，EGFR AA的CM包含選自於表4所列之序列所組成群組之胺基酸序列。在一些實施例中，該CM包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列。在一些實施例中，該CM包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列。

在一些實施例中，本文所提供為可活化抗體(AA)包含：(a)特異性結合至表皮生長因子受體(EGFR)的抗體，其中該抗體為IgG1抗體，且其中該抗體的Fc域包含在L234、L235、以及P331至少一胺基酸序列之胺基酸取代，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該AA具有減少效應(effector)功能；(b)與AB耦合的掩蔽基團(MM)，其中當AA是未切割的狀態時該MM會減少或抑制AB結合至EGFR；以及(c)與AB耦合的可切割基團(CM)，其中該CM係作用為第一蛋白酶受質的多肽。該EGFR IgG1抗體可為前述所描述任何的IgG1抗體。在一些實施例中，該MM包含選自於表7所列序列組成之群組的胺基酸序列。

在示例性的實施例中，本文所提供為可活化抗體(AA)，包含：(a)特異性結合至表皮生長因子受體(EGFR)的抗體或其抗原結合片段，其中AB為IgG1抗體，且其中AB的Fc域包含在L234、L235、以及P331至少一個胺基酸之胺基酸取代，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該AA具有減少效應(effector)功能；(b)與AB耦合的掩蔽基(MM)，其中當AA是未切割的狀態時該MM會減少或抑制AB結合至EGFR；以及(c)與AB耦合的可切割基團(CM)，其中該CM係作用為第一蛋白酶受質的多肽。在一 些實施例中，該胺基酸取代為L234F、L235E、以及P331S的任一個或多個。在一些實施例中，該AB包含在L234、L235、以及P331至少兩個胺基酸位置之胺基酸取代。在一些實施例中，該AB包含在L234、L235、以及P331胺基酸位置之胺基酸取代。在一些實施例中，該AB包含L234F、L235E、以及P331S之胺基酸取代。在一些實施例中，該AB包含在N297胺基酸取代的Fc域。在一些實施例中，該Fc域包含N297Q突變。在一些實施例中，該AB包含L234F、L235E、P331S、以及N297Q之胺基酸取代。在一些實施例中，該MM包含選自於表7或表8所列序列組成之群組的胺基酸序列。在一些實施例中，該MM包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列。在一些實施例中，該MM包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列。在一些實施例中，該CM包含選自於表4所列序列組成之群組的胺基酸序列。在一些實施例中，該CM包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列。在一些實施例中，該CM包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列。在一些實施例中，該AA係BAA的部份。

6. 雙特異性可活化之抗體(BAA)

本文所提供為BAA(雙特異性AA、BAA)，其中該BAA，當活化時，特異性結合至兩個標靶(如：結合至兩個不同標靶、或結合至相同標靶上的兩個不同的表位(epitopes))且可包含且可包含提供於圖17-19所提供之結構之一。

在一些實施例中，該第一標靶係選自於表9所列之標靶所組成群組且第二標靶選自於表9所列之序列所組成群組之胺基酸序列。

如本文一般性的提供，且如前述部分描述本發明的AA、BAA包含MM-CM建構體，亦即本文表示前域(prodomain)。因此，如本文所述，用語「前域」表示含有掩蔽基團(MM)的多胜肽以及可切割部分(CM)。在一些實施例中，經由連接子將該MM及該CM分開，本文表示為L1。在一些實施例中，該前域包含在CM的羧基末端的連接子；該連接子，本文表示為L2，連接前域的CM至AB。在一些實施例中，該前域包含在MM及CM之間的連接子且連接子在CM之後。在一些實施例中，該MM及該CM不會被連接子分開。在一些實施例中，前域包含下式之一(其中該下式代表N-至C-末端方向或C-至N-末端方向任一個的胺基酸序列)：(MM)-L1-(CM)、(MM)-(CM)-L2、(MM)-L1-(CM)-L2、或(MM)-(CM)。在示例性的實施例中，前域包含EGFR MM以及經由第二型跨膜絲胺酸蛋白酶(matriptase)或MMP的可切割CM；或CD3ε MM以及經由第二型跨膜絲胺酸蛋白酶或MMP的可切割CM。在一些實施例中，前域包含EGFR MM以及經由第二型跨膜絲胺酸蛋白酶或MMP的可切割CM。在一些實施例中，前域包含CD3ε MM以及經由第二型跨膜絲胺酸蛋白酶或MMP的可切割CM。本文所提供為包含前域的雙特異性可活化抗體(BAA)。本文亦提供編碼本發明之前域的核苷酸。

在一些實施例中，本文所提供為BAA，當該BAA，當活化時，特異性結合至兩個標靶(如：結合至兩個不同標靶、或結合至相同標靶上的兩個不同的表位(epitopes))，以及其中該BAA，當不活化時，包含以下結構；a)特異性結合至第一標靶的IgG抗體(AB1)，其中該AB1包含：i. 兩個重鏈(AB1 HC)及兩個輕鏈(AB1 LC)；以及ii. 連接至第一可切割基團(CM1)的第一掩蔽基團(MM1)以形成MM1-CM1建構體，其中MM1-CM1建構體的羧基末端係連接至該AB1的每條輕鏈的每個胺基末端，其中1. 該MM1抑制該AB1結合至其標靶；以及2. 該CM1係作用為第一蛋白酶受質的多肽，b)每個特異性結合至第二標靶的兩個scFv(AB2)，其中每個AB2包含：i. 連接至輕鏈可變區的重鏈可變區，其中每個AB2的羧基末端係連接至每個AB1重鏈的胺基末端；以及ii. 連接至第二可切割基團(CM2)的第二掩蔽基團(MM2)以形成MM2-CM2建構體，其中每個MM2-CM2建構體的羧基末端係連接至每個AB2的胺基末端，其中該MM2抑制該AB2結合至其標靶；以及該CM2係作用為第二蛋白酶受質的多肽，且其中該BAA具有至少一個下特性： i. MM2包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列；ii. MM1包含選自於表7所列之序列所組成群組之胺基酸序列；iii. AB2包含列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的重鏈可變域或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的輕鏈可變域；以及iv. AB1包含含有L234、L235、N297、以及P331或L234、L235以及P331至少一個胺基酸位置之胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應(effector)功能。

在一些實施例中，本文所述之BAA包含：1. 雙特異性可活化之抗體(BAA)，其中該BAA，當活化時，特異性結合至兩個標靶且包含以下結構：a. 特異性結合至第一標靶的IgG抗體(AB1)，其中該AB1包含兩個重鏈(AB1 HC)及兩個輕鏈(AB1 LC)；以及其中該AB1係連接至連接至第一可切割基團(CM1)的第一掩蔽基團(MM1)以形成MM1-CM1建構體，其中MM1-CM1建構體的羧基末端係連接至該AB1的每條輕鏈的每個胺基末端，其中該MM1抑制該AB1結合至其標靶；以及該CM1係作用為第一蛋白酶受質的多肽，b. 每個特異性結合至第二標靶的兩個scFv(AB2)，其中每個AB2包含連接至重鏈可變區的輕鏈可變區，其中每個AB2的羧基末端係連接至每個AB1重鏈的胺基末端；以 及其中每個AB2連接至連接至第二可切割基團(CM2)的第二掩蔽基團(MM2)以形成MM2-CM2建構體，其中每個MM2-CM2建構體的羧基末端係連接至每個AB2的胺基末端，其中該MM2抑制該AB2結合至其標靶；以及該CM2係作用為第二蛋白酶受質的多肽，且其中該BAA具有至少一個下特性：i. MM2包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列；ii. MM1包含選自於表7所列之序列所組成群組之胺基酸序列；iii. AB2包含列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的重鏈可變域或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的輕鏈可變域；以及iv. AB1包含含有L234、L235、N297、以及P331至少一個胺基酸位置之胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應(effector)功能。

在一些實施例中，本文所述之BAA包含：a)特異性結合至第一標靶的IgG抗體(AB1)，其中該AB1包含：a. 兩個重鏈(AB1 HC)及兩個輕鏈(AB1 LC)；以及b. 連接至第一可切割基團(CM1)的第一掩蔽基團(MM1)以形成MM1-CM1建構體，其中MM1-CM1建構體的羧基末端係連接至該AB1的每條輕鏈的每個胺基末端，其 中1. 該MM1抑制該AB1結合至其標靶；以及2. 該CM1係作用為第一蛋白酶受質的多肽，b)每個特異性結合至第二標靶的兩個scFv(AB2)，其中每個AB2包含：a. 連接至輕鏈可變區的重鏈可變區，其中每個AB2的羧基末端係連接至每個AB1重鏈的胺基末端；以及b. 連接至第二可切割基團(CM2)的第二掩蔽基團(MM2)以形成MM2-CM2建構體，其中每個MM2-CM2建構體的羧基末端係連接至每個AB2的胺基末端，其中1. 該MM2抑制該AB2結合至其標靶；以及2. 該CM2係作用為第二蛋白酶受質的多肽，且其中AB1包含含有L234、L235、N297、以及P331至少一個胺基酸位置之胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應(effector)功能。在一些實施例中，該Fc域包含在L234、L235、N297以及P331至少胺基酸位置之胺基酸取代，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應(effector)功能。

在一些實施例中，本文所提供的BAA包含：(2)特異性可活化之抗體(BAA)，包含：(a)特異性結合至第一標靶的IgG抗體(AB1)，其中該AB1包含兩個重鏈(AB1 HC)及兩個輕鏈(AB1 LC)；以及其中該AB1係連接至連接至第一可切割基團(CM1)的第一掩 蔽基團(MM1)以形成MM1-CM1建構體，其中MM1-CM1建構體的羧基末端係連接至該AB1的每條輕鏈的每個胺基末端，其中1. 該MM1抑制該AB1結合至其標靶；以及2. 該CM1係作用為第一蛋白酶受質的多肽，(b)每個特異性結合至第二標靶的兩個scFv(AB2)，其中每個AB2包含連接至輕鏈可變區的重鏈可變區，其中每個AB2的羧基末端係連接至每個AB1重鏈的胺基末；以及其中每個AB2係連接至連接至第二可切割基團(CM2)的第二掩蔽基團(MM2)以形成MM2-CM2建構體，其中每個MM2-CM2建構體的羧基末端係連接至每個AB2的胺基末端，其中該MM2抑制該AB2結合至其標靶；以及該CM2係作用為第二蛋白酶受質的多肽，且其中AB1包含含有L234、L235、N297、以及P331至少一個胺基酸位置之胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應(effector)功能。

如上述所提供，本發明之BAA包含每個特異性結合至第二標靶的兩個scFv(AB2)。該scFv的VL及VH可為任何順序，VL-VH或VH-VL任一種。

在一些實施例中，該AB1的Fc域包含在L234、L235、以及P331至少胺基酸位置的胺基酸取代，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效 應(effector)功能。在一些實施例中，該第一標靶係選自於表9陳列的標靶所組成的群組且該第二標靶係選自於表9陳列的標靶所組成的群組。

在一些實施例中，AB1結合標靶抗原，如：腫瘤抗原，以及AB2結合免疫效應標靶。

在一些實施例中，AB2結合標靶抗原，如：腫瘤抗原，以及AB1結合免疫效應標靶。

在一些實施例中，AB1結合EGFR以及AB2結合CD3。

在一些實施例中，MM1包含SEQ ID NO：78。

在一些實施例中，MM2包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。

在一些實施例中，雙特異性AA為CI106，如表11之範例1所提供。

在一些實施例中，BAA為CI107，如表11之範例1所提供。

在一些實施例中，BAA為CI011，如表11之範例1所提供。

在一些實施例中，BAA為CI020，如表11之範例1所提供。

在一些實施例中，BAA為CI040，如表11之範例1所提供。

在一些實施例中，BAA為CI079，如表11之 範例1所提供。

在一些實施例中，BAA為CI090，如表11之範例1所提供。

再示例性的實施例中，AB1包含C225v5Fcmt3 HC或C225v5Fcmt4 HC之胺基酸序列。

在一些實施例中，該第一及第二蛋白酶為相同之蛋白酶。在一些實施例中，在該第一及第二蛋白酶為不同的蛋白酶。在一些實施例中，CM1及CM2包含相胺基酸序列。在一些實施例中，CM1及CM2包含不同的胺基酸序列。在一些實施例中，CM1及CM2包含經由相同蛋白酶或蛋白酶可切割的不同胺基酸序列。在一些實施例中，CM1及CM2經由超過一個蛋白酶為可切割的。在一些實施例中，CM1及/或CM2經由絲胺酸蛋白酶為可切割的。在一些實施例中，CM1及/或CM2經由基質金屬蛋白酶(MMP)為可切割的。在一些實施例中，CM1及/或CM2經由絲胺酸蛋白酶及MMP為可切割的。

本發明的示例性BAA包含，例如，本文所提供的範例所示，及其變異體。

在一些未限制的實施例中，在BAA中至少一個AB為對CD3特異性以及至少一另一AB為列於表9的任一標靶之結合配偶體(binding partner)。

在一示例性的實施例中，該BAA的AB2為對CD3特異性且AB1為列於表9的任一標靶之結合配偶體。

在一些實施例中，未掩蔽的EGFR-CD3雙特異性抗體表現出對EGFR依賴性腫瘤細胞的殺傷力，而雙重掩蔽的EGFR-CD3 BAA會減少標靶依賴性細胞毒性超過100,000倍。在已建立的腫瘤模型中，預期腫瘤駐留蛋白酶(tumor-resident proteases)為有活性的，顯示BAA有效誘導腫瘤消退。在非人靈長類動物中，EGFR-CD3 BAA的最大耐受劑量(MTD)比未掩蔽的雙特異性抗體的MTD高60倍以上，並且耐受性暴露(AUC)高出10,000倍以上。儘管MTD的劑量差異為60倍，但在用BAA處理的非人靈長類動物中觀察到的短暫性血清細胞因子以及AST/ALT增加仍然是低於由雙特異性抗體誘導的那些。經由將活性定位於腫瘤微環境，BAA具有擴大T細胞參與雙特異性療法的臨床機會的潛力，所述雙特異性療法是受到標靶毒性的限制， 尤其是在實體瘤中。此外，EGFR-CD3 BAA具有解決表現EGFR的腫瘤的潛力，這些腫瘤對現有的EGFR定向治療反應差。

7. 可切割基團(CM)

單特異性AA及本發明之BAA兩者包含至少一個CM，當掩蔽時不活化。

在一些實施例中，AA或BAA的可切割基團(CM)會誘導能作為至少一個蛋白酶受質的胺基酸序列，通常細胞外蛋白酶。在BAA的情況下，CM可基於在組織中與BAA或AA的至少一個AB所需標靶共定位的蛋白酶。CM可作為多種蛋白質酶的受質，如：作為絲胺酸蛋白酶及第二不同蛋白酶的受質，如：MMP。在一些實施例中，CM可作為多於一個絲胺酸蛋白酶的受質，如：第二型跨膜絲胺酸蛋白酶(matriptase)以及uPA。在一些實施例中，CM第二型跨膜絲胺酸蛋白酶(matriptase)MMP的受質，如：MMP9及MMP14。

已知多種不同的條件，其中目標標靶與蛋白酶共定位，其中蛋白酶的受質是本發明技術領域已知的。在癌症的範例中，標靶組織可以是癌組織，特別是實體腫瘤的癌組織。文獻中有報導稱許多癌症中的蛋白酶含量增加，例如液體腫瘤或實體腫瘤。參閱，例如，La Rocca等，(2004)British J.of Cancer 90(7)：1414-1421。疾病的非限制範例包括：所有類型的癌症(例如但不限於 乳癌、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、膠質母細胞瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、腎癌、肉瘤、皮膚癌、宮頸癌、肝癌、膀胱癌、膽管癌、前列腺癌、黑色素瘤、頭頸癌(如頭頸部鱗狀細胞癌、胰腺癌等)、類風濕性關節炎、克羅恩病(Crohn’s disease)、SLE、心血管損傷、缺血等。例如，適應症包括包含T細胞急性淋巴細胞白血病(T-ALL)的白血病、包括多發性骨髓瘤在內的淋巴細胞性疾病、以及包括肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、胰腺癌和乳癌(包括三陰性乳癌)的實體腫瘤。例如，適應症包括骨疾病或癌症轉移、無論原發性腫瘤起源；乳腺癌(包括作為非限的範例ER/PR+乳癌、Her2+乳癌、三陰性乳癌)；結腸直腸癌；子宮內膜癌；胃癌；膠質母細胞瘤；頭頸癌(如頭頸部鱗狀細胞癌)；食道癌；肺癌(例如作為非限制的範例非小細胞肺癌)；多發性骨髓瘤卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；肉瘤(如骨肉瘤)；腎癌(例如作為非限制的範例腎細胞癌)；以及/或皮膚癌(例如作為非限制的範例鱗狀細胞癌、基底細胞癌或黑素瘤)。在一些實施例中，該癌症是一種鱗狀細胞癌。在一些實施例中，該癌症係一種皮膚鱗狀細胞癌。在一些實施例中，該癌症係一種食道鱗狀細胞癌。在一些實施例中，該癌症係一種頭頸鱗狀細胞癌。在一些實施例中，該癌症係一種肺鱗狀細胞癌。

CM係經由酵素在約0.001-1500×10⁴ M^-1S^-1或至少0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、 250、500、750、1000、1250、或1500×10⁴ M^-1S^-1的速度下特異性切割。

關於經由酵素特異性切割，製造酶及CM之間的接觸。當AA或BAA包含至少與MM及CM耦合時，如AA包含經由CM與MM耦合的AB，為標靶存在且足夠的酵素活性，CM被切割。足夠的酵素活型能賦與酵素與CM接觸的能力且影響切割。可容易地設想到酶可以在CM附近，但因為酵素的其他細胞因子或蛋白質修飾而不能切割。

本發明的CM範例為在上述表4所提供。在一些實施例中，CM具有高達15個胺基酸的長度、高達20個胺基酸的長度、高達25個胺基酸的長度、高達30個胺基酸的長度、高達35個胺基酸的長度、高達40個胺基酸的長度、高達45個胺基酸的長度、高達50個胺基酸的長度、高達60個胺基酸的長度、在10-60個胺基酸範圍的長度、在15-60個胺基酸範圍的長度、在20-60個胺基酸範圍的長度、在25-60個胺基酸範圍的長度、在30-60個胺基酸範圍的長度、在35-60個胺基酸範圍的長度、在40-50個胺基酸範圍的長度、在45-50個胺基酸範圍的長度、在10-40個胺基酸範圍的長度、在15-40個胺基酸範圍的長度、在20-40個胺基酸範圍的長度、在25-40個胺基酸範圍的長度、在35-40個胺基酸範圍的長度、在10-30個胺基酸範圍的長度、在15-30個胺基酸範圍的長度、在20-30個胺基酸範圍的長度、在25-30個胺基酸範圍的長度、在10-20個胺基酸 範圍的長度、或在10-15個胺基酸範圍的長度。

8. 掩蔽基團(MM)

在上述可活化的單抗體特異性CD3及EGFR AA及BAA之兩者，AA/BAA包含MM。如本文所描述，本發明之AA及BAA包含前域，其包含MM。

在一些實施例中，MM係選用於特異性抗體或抗體片段。

在一些實施例中，MM非為AB的天然結合配偶體。在一些實施例中，MM未包含或實質上不予任何AB的天然結合配偶體同源。在其他實施例中，MM未超過類似於任何AB天然結合配偶體的5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或80%。在一些實施例中，MM為不超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或80%相同於任何AB的天然結合配偶體。在一些實施例中，MM為不超過50%相同於任何AB的天然結合配偶體。在一些實施例中，MM係不超過25%相同於任何AB的天然結合配偶體。在一些實施例中，MM係不超過20%相同於任何AB的天然結合配偶體。在一些實施例中，MM係不超過10%相同於任何AB的天然結合配偶體。

本文的的MM範例可為具有高達15個胺基酸的長度、高達20個胺基酸的長度、高達25個胺基酸的長 度、高達30個胺基酸的長度、高達35個胺基酸的長度、高達40個胺基酸的長度、高達45個胺基酸的長度、高達50個胺基酸的長、高達60個胺基酸的長度、在10-60個胺基酸範圍的長度、在15-60個胺基酸範圍的長度、在20-60個胺基酸範圍的長度、在25-60個胺基酸範圍的長度、在30-60個胺基酸範圍的長度、在35-60個胺基酸範圍的長度、在40-50個胺基酸範圍的長度、在40-50個胺基酸範圍的長度、在10-40個胺基酸範圍的長度、在15-40個胺基酸範圍的長度、在20-40個胺基酸範圍的長度、在25-40個胺基酸範圍的長度、在30-40個胺基酸範圍的長度、在35-40個胺基酸範圍的長度、在10-30個胺基酸範圍的長度、在15-30個胺基酸範圍的長度、在20-30個胺基酸範圍的長度、在1025-30個胺基酸範圍的長度、在10-20個胺基酸範圍的長度、在10-15個胺基酸範圍的長度、或10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個胺基酸長度。

如本文所提供，MM抑制AB結合至標靶。MM結合AB的抗原結合區域且抑制AB結合至標靶。MM可空間上抑制AB結合至標靶。MM可變構性地抑制AB結合至其標靶。在該些實施例中，當AB經由MM修飾或與MM耦合並有標靶存在時，AB未有結合至或實質上未結合至標靶，或未超過0.001%、0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、或50%AB結合至標靶，相較於AB未經由MM修飾或與MM耦合，親本(parental)AB、或 AB未與MM耦合至標靶，至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84、或96小時，或5、10、15、30、45、60、90、120、150、或180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12個月或更長，當在活體內或試管內分析測量時。

當AB係與MM耦合或以MM修飾時，MM「掩蔽」或減少或以其他方式抑制AB特異性結合至標靶。當AB係與MM耦合或以MM修飾時，該耦合或修飾可減少或抑制AB特異性至其標靶的能力之結構上改變。

本發明示例性之MM如上述表3、7、及8所提供。

9. 連接子

在很多實施例中，其可需要插入一個或多個連接子(如：彈性連接子)至AA/BAA建構體以提供一個或多個MM-CM結合、該CM-AB/CM-scFv結合、或兩者處提供彈性。例如AB、MM、及/或CM可包含足夠的基團數目(如：Gly、Ser、Asp、Asn、尤其是Gly以及Ser)以提供所需的彈性。因此，該BAA建構體以如本文所揭露維持完整(未活化)或活化的能力可有利於引入一個或多個胺基酸來提供彈性連接子。

例如，在一些實施例中，AA包含下式之一(其中下式表示N-至C-末端方向或C-至N-末端方向的胺基酸序列)： (MM1)-L1-(CM1)-(AB1) (MM1)-(CM1)-L2-(AB1) (MM1)-L1-(CM1)-L2-(AB1) (MM2)-L1-(CM2)-(AB2) (MM2)-(CM2)-L2-(AB2) (MM2)-L1-(CM2)-L2-(AB2)

其中MM、CM、以及AB為上述定義；其中L1及L2為各自獨立地且任一存在或不存在，在相同或不相同的包含至少1彈性胺基酸(如Gly,Ser)的彈性連接子。

在一些實施例中，BAA包含2重鏈(各自包含從N-末端至C-末端的MM2-CM2-AB2-AB1 HC從N-末端至C-末端的結構排列)以及2輕鏈(各自包含從N-末端至C-末端的MM1-CM1-AB1 LC的結構排列)。

在一些實施例中，包含連接子的結構在圖17提供。

在一些實施例中，(MM2)-L1-(CM2)-L2-(AB2)係連接至AB1的重鏈且AB2為scFv。

適用於本文所述組合物連接子為通常能提供經修飾AB或AA的彈性的連接子以易於抑制AB結合至標靶。該些連接子通常係指彈性連接子。合適的連接子能易於選擇且能為任何合適的不同長度，例如1個胺基酸(如Gly)至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、3個胺基酸至12個胺基酸、包含4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸或、7個胺基酸至8個胺基酸、且可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸長度。在一些實施例中，合適的連接子可為4個至25個胺基酸長度。在一些實施例中，合適的連接子可為5個至25個胺基酸長度。在一些實施例中，合適的連接子可為4個至20個胺基酸長度。在一些實施例中，合適的連接子可為5個至20個胺基酸長度。

示例性的連接子包含甘胺酸聚合物(G)n，甘胺酸-絲胺酸聚合物(包含，例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：88)以及(GGGS)n(SEQ ID NO：89)，其n為至少一個整數)，甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物、及如本發明技術領中已知的其他彈性連接子。在一些實施例中，n為約1至約10、或約1至約9、或約1至約8、或約1至約7、或約1至約6或約1至約5、或約1至約4、或約1至約3、或約1至約。甘胺酸以及甘胺酸-絲胺酸聚合物為較非結構化，且因此能夠做為成份之間的中性系鏈(neutral tether)。甘胺酸比甚至丙胺酸獲得顯著更多的phi-psi空間，並且比具有更長側鏈的基團更少限制(參閱Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。式例性的連接子可在表9-1提供。

熟悉技藝人士將理解到AA的設計可以包含全部或部分彈性的連接子，使得該連接子可包含彈性連接子亦能提供一個或多個部分給較少彈性結構的所需AA結構。

10. 共軛(Conjugation)

在一些實施例中，本文揭露的任何抗體、或AA的AB、及BAA可共軛至藥劑。在一些實施例中，該藥劑為治療藥劑。在一些實施例中，該藥劑為可偵測基團。在一些實施例中，該藥劑為抗腫瘤藥劑。在一些實施例中，該藥劑為毒素或其片段。在一些實施例中，該藥劑為經由連接子與AB共軛。在一些實施例中，該連接子為非 可切割連接子。在一些實施例中，該藥劑為微管抑制劑。在一些實施例中，該藥劑為核酸破壞藥劑，例如DNA烷化劑或DNA嵌入劑、或其他DNA破壞藥劑。在一些實施例中，該連接子為可切割連接子。在一些實施例中，該藥劑細選自列於表10所組成群組之藥劑。

熟悉技藝人士將理解到多種可能的基團可與本發明之相關抗體、AA及BAA耦合。(See,for example,“Conjugate Vaccines”,Contributions to Microbiology and Immunology,J.M.Cruse and R.E.Lewis,Jr(eds),Carger Press,New York,(1989)，在此其全文引用作為參考)。

在一些實施例中，抗體、AA或BAA包含可偵測基團。在一些實施例中，該可偵測基團為診斷藥劑。

在一些實施例中，抗體、AA或BAA包含一個或多個二硫鍵。在一些實施例中，抗體、AA或BAA包含一個或多個離胺酸。在一些實施例中，AA或BAA可工程化為包括一個或多個二硫鍵，或者可以以其他工程化方式以實現位點特異性共軛。

11. 製造

本發明還提供編碼本文所述的抗體、AA或BAA的單離的核酸分子，以及包括這些單離的核酸序列的載體。本發明提供經由在導致該抗體、AA或BAA表現的條件下培養細胞來產生抗體、AA或BAA的方法，其中該細胞包含所述核酸分子。

在一些實施例中，該細胞包含所述載體。在一些實施例中，該載體為pLW289。在一些實施例中，該載體為pLW246。在一些實施例中該載體為pLW307。在一些實施例中，該載體為pLW291。在一些實施例中，該載體為pLW352。在一些實施例中，該載體為pLW353。(該些載體及所描述的及序列在下面範例1提供)

12. 抗體、AA、雙特異性抗體及BAA的用途

在一些實施例中，抗體/雙特異性抗體/AA/BAA可用作治療劑。這些藥劑通常用於治療、減輕及/或預防個體的疾病或病理。經由使用標準方法鑑定個體，例如患有病症的人類患者或其他哺乳動物(或有發展成疾病的風險者)來進行治療方案。

其抗體/雙特異性抗體/AA/BAA的投予消除或抑制或干擾一個或多個標靶的訊號傳遞功能。

應當理解，根據本發明的治療整體將與合適的載劑、賦形劑及其他藥劑摻入製劑中一起施用，以提供改善的轉移、遞送、耐受性等。在所有藥物化學家已知的藥典中可以找到許多合適的製劑：Remington’s Pharmaceutical Sciences(第15版，Mack Publishing Company,Easton,PA(1975))，其中特別是Blaug,Seymour的87章。這些製劑包含粉末、糊劑、軟膏、凝膠、蠟、油、脂質，含有囊泡的脂質(陽離子或陰離子)(例如Lipofectin TM)、DNA共軛物、無水吸收糊劑、水包油以及油包水乳化物、乳化物carbowax(各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠、以及含有carbowax的半固混合物。任何前述混合物可適用於根據本發明的治療(treatment)和治療(therapy)，先決條件是在製劑中的活性成分不因製劑失活，並且製劑與投予途徑在生理上是相容的且可以耐受的。亦參閱Baldrick P.“Pharmaceutical excipient development：the need for preclinical guidance.”Regul.Toxicol Pharmacol.32(2)：210-8(2000),Wang W.“Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.”Int.J.Pharm.203(1-2)：1-60(2000),Charman WN“Lipids,lipophilic drugs,and oral drug delivery-some emerging concepts.”J Pharm Sci.89(8)：967-78(2000),Powell等人“Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA J Pharm Sci Technol.52：238-311(1998)其中的引用已得到更多為藥學化學家所熟知和配方、賦形劑以及載劑相關之資訊。

通常，疾病或病症的緩解或治療會涉及減輕與疾病或病症相關的一種或多種症狀或醫學問題。例如，在癌症的情況下，治療有效劑量的藥物可以實現以下一種或組合：減少癌細胞的數目；減少腫瘤的大小；抑制(如：減少到一定程度或停止)癌細胞浸潤到外周器官中；抑制腫瘤轉移；抑制到一定程度的腫瘤生長；及/或相對於與癌症有關一個或多個症狀。在一些實施例中，本發明的組合物可用於預防在個體中(如人類或例如是非人類靈長類動物、伴侶動物(如貓、狗、馬)、農場動物、工作動物或動物園動物的其他哺乳類)疾病或病症的發作或再發生。該用語個體及患者在本文中可互換使用。

本發明抗體/雙特異性抗體/AA/BAA的治療有效劑量通常關於達到治療目的的所需量。

本發明之抗體/雙特異性抗體用於治療有效劑量的一般範圍，作為非限制範例，為約0.1mg/kg體重至約50mg/kg體重。常見的投予頻率可以是例如每天兩次至每週一次。

與用於診斷或治療特定病症的任何已知方法相關聯地確定治療的有效性。用於篩選具有所需特異性的抗體/雙特異性抗體/AA/BAA的方法包括但不限於酵素結合免疫吸附測定(ELISA)和本發明技術領域已知的其他免疫介導技術。

其他預期用途涉及診斷、成像、預測和偵測之用途。在一些實施例中，抗體/雙特異性抗體/AA/BAA係用於本發明技術領域已知與標靶定位及/或定量的有關的方法中(例如，用於測量適當生理樣本中一種或多種標靶的含量、用於診斷方法、用於成像蛋白質等)。

在一些實施例中，使用抗體/雙特異性抗體/AA/BAA經由標準技術(例如免疫親和、層析或免疫沉澱)分離一個或多個標靶。抗體、AA、雙特異性抗體或BAA可在診斷上用於監測組織中蛋白質含量作為臨床偵測程序的一部分，例如：確定投予治療方案的效果。經由將抗體與可偵測物質耦合(即物理連接)可以促進偵測。可偵測物質的範例包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料、生物發光材料和放射性材料。合適的酶的範例包括辣根過氧化物酶(hoerseradish peroxidas)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙醯膽鹼酯酶；合適的輔基複合物的範例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的螢光材料的實例包括繖形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光材料的範例包括魯米諾(luminol)；生物發光材料的範例包括 螢光素酶、螢光素和水母發光蛋白，合適的放射性材料的範例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

在另一實施例中，可使用針對兩種或多種的抗體、雙特異性抗體、AA、BAA作為在一樣本中用於偵測一或多個標靶的藥劑(或其片段)。在一些實施例中，該抗體包含可偵測的標記(label)。抗體為多株的(polyclonal)，或在一些實施例中，為單株的(monoclonal)。使用整個抗體或其片段(如：Fab、scFv、或F(ab’)₂)。用語「標記(labeled)」，關於探針或抗體，試圖包含經由可偵測物質與該探針或抗體耦合(即物理連接)的探針或抗體之直接標記，以及經由與另一直接標記的試劑反應性的探針或抗體之間接標記。間接標記的範例包括使用螢光標記的第二抗體偵測第一抗體和用生物素末端標記抗體，使得其可以用螢光標記的抗生蛋白鏈菌素偵測。用語「生物性樣本」指在包括從受試者分離的組織、細胞和生物流體，以及受試者體內存在的組織、細胞和流體。因此，用語「生物性樣本」的使用包括血液和血液的一部分或組分，包括血清、血漿或淋巴。也就是說，本發明的偵測方法可用於在試管內以及活體內偵測生物樣本中的蛋白質。例如，用於偵測分析物蛋白的試管內技術包括酵素結合免疫吸附測定(ELISA)、西方墨點法、免疫沈澱法、免疫化學染色和免疫螢光法。進行免疫測定的程序描述於例如“ELISA：Theory and Practice：Methods in Molecular Biology”,Vol.42,J.R.Crowther(Ed.)Human Press,Totowa,NJ,1995；“Immunoassay”, E.Diamandis and T.Christopoulus,Academic Press,Inc.,San Diego,CA,1996；以及“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”,P.Tijssen,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,1985。此外，用來偵測被分析物蛋白質的活體內技術包含將標記的抗被分析物蛋白質抗體導入個體中。例如，可以用放射性標記抗體，其在個體的存在和定位可透過標準成像技術來偵測。

本發明的抗體、雙特異性抗體、AA、及雙特異性抗體異亦可用於各種診斷及預防製劑中。在一實施例中，將抗體、AA、雙特異性抗體、BAA投予有發展一種或多種上述疾病風險的患者。可使用基因型、血清學或生物化學標記物確定患者或器官對一種或多種疾病的易感性。

在本發明的另一個實施例中，將抗體、AA、雙特異性抗體、BAA投予被診斷患有與一種或多種上述病症相關的臨床適應症的人類個體。在診斷時，抗體、AA、雙特異性抗體、BAA以減輕或逆轉臨床適應症的作用。

抗體、雙特異性抗體、AA以及雙特異性抗體也亦可用於偵測患者樣本中的一種或多種標靶，因此可用作診斷劑。例如，本發明的抗體、雙特異性抗體、AA以及雙特異性抗體用於體外測定，例如ELISA，以偵測患者樣本中的一種或多種標靶的含量。

在一實施例中，抗體、AA、雙特異性抗 體、BAA固定在固體支撐物(如微量滴定板的孔)上。該固定的抗體及/或AA作為任何可以存在於測試樣本中的任何標靶的捕獲抗體。在將固定的抗體/AA與患者樣本接觸之前，固體支撐物係經沖洗以及用阻斷劑如牛奶蛋白或白蛋白處理來防止被分析物非特異性的吸收。

隨後將孔以懷疑帶有抗原的測試樣本或以包含標準量之抗原的溶液處理。該樣本係，如，來自懷疑具有被認為是病理診斷性循環抗原含量之對象的血清樣本。測試樣本或標準品經過沖洗後，將固體支撐物以可偵測地標記之二級抗體處理。標記的二級抗體係作為偵測抗體。測量可偵測標記的值，並且測量樣本中標靶抗原的濃度，透過與來自標準品的標準曲線進行比較來確定。

應該理解的是，在試管內診斷性偵測中基於利用抗體、AA、雙特異性抗體、BAA獲得的結果，可能基於標靶抗原在個體中表現的值來對疾病分級。對投予的疾病，從診斷為在疾病進展之不同階段和/或在疾病治療性處理不同點的個體採取血液樣本。使用對進展或治療的每個階段提供統計學顯著結果的樣本群，可指定考量每個階段特徵的一定範圍的抗原濃度。

抗體、雙特異性抗體、AA和BAA也可用於診斷和/或成像方法。在一些實施例中，這些方法是試管內方法。在一些實施例中，這些方法是活體內方法。在一些實施例中，這種方法是原位方法。在一些實施例中，這些方法是活體外方法。例如，AA和酵素性可切割CM的雙 特異性抗體可用於偵測是否存在能夠切割CM的酶。此類AA和雙特異性抗體可用於診斷，其可包括酶活性的體內偵測(例如：定性或定量)(或者，在一些實施例中，增加的還原電位之環境，譬如可提供雙硫鍵還原的環境)經由在提供的宿主生物所提供的細胞或組織中測量的活化雙特異性活化抗體的累積(如：由AA或BAA切割產生的抗體或雙特異性抗體)。活化的雙特異性抗體的這種積累不僅表示組織表現酶活性(或取決於CM的性質的增加的還原電位)，而且表示組織表現活化的雙特異性抗體結合至少一個標靶。

例如，可以選擇CM為在腫瘤部位、在生物學限制的位置之細菌或病毒感染部位(例如，諸如在膿瘡、在器官中等)等發現的蛋白酶之受質。AB的至少一個可以是結合至標靶抗原的AB。使用本發明領域技術人員熟悉的方法，可偵測的標記(例如：螢光標記或放射性標記或放射物追蹤劑)可以與抗體、AA、雙特異性抗體、BAA或其他區域共軛。在上述篩選方法的前提下討論合適的可偵測標記，並且在下文中提供另外的具體實例。使用對疾病狀態的蛋白質或胜肽特異性的AB，以及至少其活性在有興趣之患病組織中活性提升的蛋白酶，可活化之抗體將顯示相對其中不存在可偵測之值的CM特異性酶或以比患者組織更低的值存在或無活性(例如，以酶原(zymogen)型式或和抑制劑複合)，AA將表現出與疾病組織增加的結合速率。因此小蛋白質和胜肽係快速透過腎臟過 濾系統從血液中迅速被清除，並且由於對CM酶特異性不存在可偵測的值(或在非患病組織以更低的值存在，或以無活性構型存在)，在患者組織中活化的抗體之累績相對於非患病組織係被增強的

在另一個實施例中，本發明的抗體、抗體/雙特異性抗體/AA/BAA可用於偵測樣本中切割劑的存在或不存在。例如，當抗體/雙特異性抗體/AA/BAA包含易被酶切割之CM時，可活化之抗體可用來偵測樣本中酶的存在(定性或定量)。在其他範例中，當抗體/雙特異性抗體/AA/BAA包含易被還原劑切割之CM時，抗體/雙特異性抗體/AA/BAA可用來偵測樣本中還原劑的存在(定性或定量)。為了利於分析彼等方法，可活化之抗體可被偵測性標記，且可被結合至支撐物上(如固體支撐物，如玻片或珠子)。可偵測標記可被定位在不會被下列所切割的可活化之抗體部分，例如，可偵測標記可為消滅(quenched)之螢光標記或其他需等切割發生才可被偵測的標記。該測定方法可透過例如在對切割具足夠時間將發生下，將固定的、可偵測標記的抗體/雙特異性抗體/AA/BAA與懷疑含有酶和/或還原劑接觸來進行，之後清洗以移除多餘的樣本和污染物。在樣本中切割劑(如酶或還原劑)的存在或不存在係隨後以抗體/雙特異性抗體/AA/BAA內可偵測訊號在與樣本接觸之前的改變來判定，例如在樣本中因為抗體/雙特異性抗體/AA/BAA被切割劑切割造成之可偵測訊號的存在和/或增加。

彼等偵測方法可改變以同時提供偵測能夠結合當受切割時抗體/雙特異性抗體/AA/BAA之至少一AB的標靶。因此，偵測法亦能改變以評估切割劑的存在或不存在以及有目的之標靶的存在或不存在。切割劑的存在與否可利用前述之抗體/雙特異性抗體/AA/BAA的存在和/或可偵測之值的增加來偵測，且標靶的存在或不存在可透過偵測標靶-AB複合物來偵測，如，利用可偵測標記的抗標靶抗體。

本發明之AA/BAA亦對用於確認可活化之抗體之活化的原位成像法為有用的，如透過蛋白酶切割，和與特定標靶結合。原位成像法係為能夠定位蛋白水解活性和生物性樣本中的標靶諸如細胞培養或組織部分的技術。利用此技術，與投予標靶之結合和根據可偵測標記存在的蛋白水解活性事是可能被確認的(如螢光標記)。

彼等技術係對從疾病位置衍生之冷凍細胞或組織(如癌症組織)或其他健康組織為有用的。彼等技術亦對新鮮細胞或組織樣本為有用的。

在彼等技術中，AA/BAA係以可偵測標記來標記。可偵測標記本含螢光染料(如螢光基團、螢光異硫氰酸鹽(FITC)、異硫氰酸羅丹明(TRITC)、Alexa Fluor®標記)、近紅外線(NIR)染料(如Qdot®奈米晶體)、膠體金屬、半抗原、放射性標記、生物素和擴增劑例如蛋白鏈菌素、或酶(例如，辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶)。

偵測與標記的可活化之抗體共同培養之樣品 的標記指示樣本中含標記且包含AA或BAA之CM具特異性的蛋白酶。在一些實施例中，蛋白酶的存在可使用廣效性蛋白酶抑制劑例如本文所描述那些和/或透過對蛋白酶具有特異性的藥劑(例如抗體如A11，其係對絲胺酸蛋白酶具特異性且抑制絲胺酸蛋白酶的蛋白質水解活性，參見如國際公開號WO 2010/129609，公開於2010年11月11日)來確認。利用廣效性蛋白酶抑制劑如本文所述者和/或利用更具選擇性的抑制劑可用來鑑定對CM具特異性的可活化之抗體。在一些實施例中，標靶的存在可使用對標靶具有特異性的藥劑來證實，如其他抗體，或者可偵測標記可與未標記標的競爭。在一些實施態樣中，未標記的可活化之抗體可用在透過標記的二級抗體或更複雜的檢測系統進行的檢測。

類似的技術對活體內成像亦為有用的，其中在個體中(如哺乳類，包含人類)偵測螢光訊號，指示疾病位置包含標靶且包含對本發明之AA或BAA的CM具特異性的蛋白酶。

彼等技術還可用於套組和/或基於AA或BAA中蛋白酶-特異性CM用作偵測、鑑定或表徵在不同細胞、組織或器官中蛋白酶活性的藥劑。

13. 治療投予

本發明之治療實體的投予係將以嵌入配方中以提供改進的轉移、傳遞、耐受性和其他等之合適的 載劑、賦形劑和其他劑一起投予。大多數合適的配方可在所有製藥化學家熟知的藥典中找到：Remington’s Pharmaceutical Sciences(第15版，Mack Publishing Company,Easton,PA(1975))，尤其是其中的Blaug,Seymour的第87章。這些製劑包含粉末、糊劑、軟膏、凝膠、蠟、油、脂質，含有囊泡的脂質(陽離子或陰離子)(例如LipofectinTM)、DNA共軛物、無水吸收糊劑、水包油和油包水乳化物、乳化物carbowax(各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠、以及含有carbowax的半固混合物。任何前述混合物可適用於根據本發明的治療(treatment)和治療(therapy)，先決條件是在製劑中的活性成分不被製劑失活，並且製劑與投予途徑在生理上是相容的且可以耐受的。亦可參見Baldrick P.之“Pharmaceutical excipient development：the need for preclinical guidance.”Regul.Toxicol Pharmacol.32(2)：210-8(2000)、Wang W.之“Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.”Int.J.Pharm.203(1-2)：1-60(2000)、Charman WN之“Lipids,lipophilic drugs,and oral drug delivery-some emerging concepts.”J Pharm Sci.89(8)：967-78(2000)、Powell等人之“Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA J Pharm Sci Technol.52：238-311(1998)和其中的引用已得到更多為藥學化學家所熟知和配方、賦形劑以及載劑相關之資訊。

在一些實施例中，抗體、雙特異性抗體、AA、或BAA(或其共軛組合物)與一種或多種另外的藥劑一 起投予，或與另外的藥劑一起投予。合適的另外的藥劑包括用於預期應用的當前藥物和/或手術療法。例如，它們可以與另外的化學治療劑或抗腫瘤劑一起使用。

在一些實施例中，本發明之抗體、雙特異性抗體、AA、或BAA(或其共軛組合物)與選自於由下列所組成之群組：抗體、共軛抗體、AA、共軛AA、雙特異性抗體、共軛雙特異性抗體、或共軛BAA。在一些實施例中，任合上述參考的任何上述另外的藥劑的抗體部分針對標靶，例如表9中揭露的一種或多種標靶。應當理解，在一些實施例中，本發明之抗體、雙特異性抗體、AA或BAA的抗體部分(或其共軛的組合物)及另外的藥劑的抗體部分針對相同的標靶(例如，兩者都可以靶向EGFR)。在一些實施例中，它們針對相同的標靶，但標向不同表位(epitopes)。在一些實施例中，他們完全把向不同標靶(如：本發明之會靶向EGFR的可活化抗體)與靶向不同標靶的AA一起投予；同時，如靶向EGFR及CD3的本發明之BAA可與靶向不同標靶的AA一起投予。

在一些實施例中，本發明的抗體、雙特異性抗體、AA、或BAA(或其共軛的組合物)與免疫治療劑一起投予。在一些實施例中，本發明的抗體，雙特異性抗體，AA或BAA(或其共軛的組合物)與化學治療劑一起投予。在一些實施例中，本發明的抗體、雙特異性抗體、AA、或BAA(或其共軛的組合物)與免疫治療劑和化學治療劑一起投予。在一些實施例中，一種或多種另外的藥劑與這些組 合實施例中的任一種一起投予。

在一些實施例中，他們配製成單一治療組合物，以及其抗體/雙特異性抗體/AA/BAA及另外的藥劑一起投予。或者，其抗體/雙特異性抗體/AA/BAA互相分開投予，如：每個配製成分別的治療組成物，以及其抗體/雙特異性抗體/AA/BAA以及另外的藥劑為同時投予，或其抗體/雙特異性抗體/AA/BAA以及另外的藥劑為在治療方案內不同時間投予。其抗體/雙特異性抗體/AA/BAA以及另外的藥劑為多重劑量投予。

其抗體/雙特異性抗體/AA/BAA可以藥學組合物形式來投予。準備彼等組合物之原則和考量，以及選擇組分的指導係於下列例子提供：in Remington：The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed.(Alfonso R.Gennaro,et al.,editors)Mack Pub.Co.,Easton,Pa.：1995；Drug Absorption Enhancement：Concepts,Possibilities,Limitations,And Trends,Harwood Academic Publishers,Langhorne,Pa.,1994；和Peptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences,Vol.4),1991,M.Dekker,New York。

該組合物通常包含其抗體/雙特異性抗體/AA/BAA及藥學上可接受的載劑。

本文使用「藥學上可接受的載劑」為試圖包含與投予藥物相容的任何及所有藥劑、分散介質、包衣、抗細菌劑以及抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。合適的載體描述於最新版本的Remington’s Pharmaceutical Sciences， 該領域的標準參考文獻，其經由引用併入本文。此類載劑或稀釋劑的合適實例包括但不限於水、鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5%人血清白蛋白。也可以使用脂質體和非水性載體如固定油。這些介質和試劑用於藥物活性物質的用途是本發明技術領域熟知的。除非任何常規介質或藥劑與活性化合物不相容，否則考慮在組合物中使用它們。

用於活體內投予的製劑必須是無菌的。通過無菌過濾膜過濾很容易完成。

本發明之要學組合物係被配製成與預期投予途徑相容。投予途徑的範例包括腸胃外投予，例如靜脈內、皮膚內、皮下的、口服(如吸入)、皮膚滲透(如局部的)、黏膜和直腸投予。用於腸胃外的皮膚內或皮下應用溶液或懸浮液可以包含以下組分：無菌稀釋劑例如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑例如苯醇或羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用於調節張力的劑例如氯化鈉或右旋糖。pH可用酸或鹼，例如鹽酸或氫氧化鈉。腸胃外的製備可封裝在安瓶、一次性注射器或玻璃或塑膠製成的多劑量小瓶中。

適合於注射使用的藥學組合物包含無菌水溶液(其中水為可溶的)或分散體和用於無菌注射溶液或分散體臨時製備的無菌粉末。對於靜脈內投予，合適的載 劑包括生理食鹽水、抑菌性用水、Cremophor EL^TM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物必須是無菌的，並且應該達到存在易於注射之程度的流體。在製造和儲存的條件下，彼等需要是穩定的，並且保存在免於諸如細菌和真菌的微生物污染作用。載劑可為溶劑或分散介質，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體乙二醇等)，以及其合適的混合物。可以透過例如包覆如卵磷脂的使用、透過在分散體的情況下維持所要求的粒子尺寸和透過表面活性劑的使用來維持適當的流動性。防止微生物的作用可透過各種抗菌劑和抗真菌劑來達成，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在一些實施例中，組合物中係期望包含等滲劑，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)、氯化鈉。注射組合物的延長吸收可透過在組合物中包含延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠來達成。

可以利用將所需量的活性化合物在適當的劑中摻入以上列舉之一種成分或多種成分的組合，如需要，可隨後過濾滅菌來製備無菌注射液。一般來說，透過將活性化合物摻入包含基本分散介質和來自上述列舉所需之其他成分的無菌媒介來製備分散體。在用於無菌注射液之製備的無菌粉末的情況下，製備方法係為真空乾燥和冷凍乾燥，以獲得來自其先前無菌過濾的溶液的活性成分加上任何另外所需成分的粉末。

口服組成物通常包含惰性稀釋劑或可食用的 載劑。他們可被封入明膠膠囊或壓成片劑。對於口服治療的投予目的，活性化合物可以和賦形劑混合並以片劑、錠劑或膠囊形式使用。口服組合物亦可使用流體載劑製備，做為漱口水，其中流體載劑中的化合物係口服使用，並涮洗和吐出或吞下。藥學上相容的結合劑和/或佐劑材料可被包含作為組合物的一部份。所述片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可包含下列成分或類似性質的化合物：黏合劑如微晶纖維素、黄蓍膠或明膠；賦形劑例如澱粉或乳糖；崩解劑例如藻酸、Primogel、或玉米澱粉；潤滑劑例如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑例如膠體二氧化矽；甜味劑例如蔗糖或糖精；或調味劑例如薄荷、水楊酸甲酯、或橙調味劑。

對於吸入投予，化合物係以氣溶膠噴射形式從加壓容器或包含合適推進器，如氣體，諸如二氧化碳的分配器、或噴霧器中傳遞。

全身性投予可透過黏膜或經皮膚方法。對於黏膜或經皮膚投予，適用於待滲透屏障的滲透劑係用於組分中。彼等滲透劑係為本技術領域所熟知者，且包括，例如，對於經黏膜投予，去垢劑、膽鹽和夫西地酸衍生物。經黏膜投予可透過使用鼻噴霧劑或栓劑來達成。用於經皮膚投予，活性化合物係為配製成軟膏劑、油膏劑、凝膠劑或本發明技術領域通常以熟知的。

所述化合物亦可以栓劑(例如以常規栓劑基質諸如可可脂和其他甘油酯)或用於直腸傳遞的保留灌腸形式製備。

在一個實施例中，活性化合物係與載體一起製備，所述載劑可保護化合物免於從身體內快速被清除，例如控釋制劑，包含植入物和為囊化傳遞系統。可使用可生物降解的、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用於製備彼等配方之方法係對本發明技術領域人員為顯而易見的。

活性成分可被包覆在準備的微膠囊中，例如，利用凝聚(coacervation)技術或界面具合作用，例如羥丙甲纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，分別在膠體藥物投遞系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子以及奈米膠囊)或在粗乳液(macroemulsions)中。

緩釋製備係可達成。緩釋製備的合適實例包含含有固體疏水性聚合物的半穿透性基質，其中基質係為成形製品的形式，例如，薄膜或微膠囊。緩釋基質實例包含聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)、聚乳酸(美國專利案號3,773,919)、L-穀胺酸和γ乙基-L-麩胺酸共聚合物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸和柳菩林組成的可注射的微球)、以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能使分子的釋放超過100天，但是某些水凝膠釋放蛋白質的時間為較短的期間。

材料亦可從Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals,Inc.購得，質體的懸浮液(包含用單株抗體對病毒抗原標靶受感染細胞的脂質體)亦可做為藥學可接受載體。這些可根據本發明技術領域已知的方法製備，例如美國專利案號4,522,811中所述。

特別有利的係以劑量單位形式配製口服或腸胃外組合物以利於投予和劑量均勻。本文所使用劑量單位形式係指適合在待治療對象中作用為單一劑量的物理上離散單位；每個單位含有經計算產生所需的藥物載體組合物所需要達到預期治療效果的活性化合物的預定量。對於本發明的劑量單位形式說明是由活性化合物的獨特性質和要達成的特定治療效果，以及在配製彼等活性化合物用於個體治療的領域中固有的限制所決定且直接根據於此的。

藥學組合物可包還在容器、包裝或分配器中，連同投予的說明書。

製劑還可以含有一種以上的活性化合物，這是所治療的具體適應症所必需的，例如那些具有互補活性而不會相互產生不利影響的活性化合物。或者/另外，組合物可包含增強其功能的藥劑，例如細胞毒劑、細胞因子、化學治療劑或生長抑制劑。這些分子合適地以對預期目的有效的量組合存在。

在一個實施例中，活性化合物與治療組合投予，例如：與其他藥劑(如治療劑)組合，其可用於治療病理狀況或病症，例如自身免疫病症和炎性疾病。在該上下文中，用語「組合」是指基本上同時或同時投予試劑。如 果依次投予，在第二種化合物投予開始時，兩種化合物中的第一種仍然可以在治療部位以有效濃度檢測到。

例如，如下文更詳細描述的，組合治療可包括本發明的一種或多種抗體/雙特異性抗體/AA/BAA與一種或多種另外的治療劑(例如，一種或多種細胞因子和生長劑、免疫抑制劑、抗炎劑、代謝抑制劑、酶抑制劑、和/或細胞毒性劑或細胞抑制劑)共同配製和/或共同投予。此外，本文所述的一種或多種抗體/雙特異性抗體/AA/BAA可以與兩種或更多種本文所述的治療劑組合使用(例如，一個BAA與本發明的另一種BAA或AA一起投予等等)。這種組合療法可以有利地使用較低劑量的所投予的治療劑，從而避免與各種單一療法相關的可能的毒性或併發症。

在其他實施例中，本發明的一種或多種抗體可與一種或多種抗炎藥、免疫抑制劑或代謝或酶抑制劑共同配製和/或共同投予。可與本文所述抗體組合使用的藥物或抑制劑的非限制性範例包括但不限於以下一種或多種：非類固醇抗發炎藥物(NSAID)，例如布洛芬、替尼達普(tenidap)、萘普生、美洛昔康、吡羅昔康、雙氯芬酸和吲哚美辛；柳氮磺胺吡啶；皮質激素，例如為潑尼松龍；細胞因子抑制性抗炎藥(CSAIDs)；核苷酸生物合成的抑制劑，例如嘌呤生物合成的抑制劑、葉酸拮抗劑(例如甲氨蝶呤(N-[4-[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲基氨基]苯甲酰基]-L-谷胺酸)；與嘧啶生物合成的抑制劑，例如二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)抑制劑。與本發明的抗體組合使用的合 適治療劑包括NSAID、CSAID、(DHODH)抑制劑(例如，來氟米特)、以及葉酸拮抗劑(例如甲氨蝶呤)。

另外的抑制劑的實例包括以下一種或多種：皮質類固醇(口服、吸入和局部注射)；免疫抑制劑，例如環孢菌素，他克莫司(FK-506)；和mTOR抑制劑，例如西羅莫司(雷帕黴素-RAPAMUNE^TM或雷帕黴素衍生物，例如可溶性雷帕黴素衍生物(例如酯雷帕黴素衍生物，例如CCI-779)；干擾促炎細胞因子如TNFα或IL-1信號傳導的藥劑(例如，IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)；COX2抑制劑，例如塞來昔布，羅非考昔及其變體；磷酸二酯酶抑制劑，例如R973401(磷酸二酯酶IV型抑制劑)；磷脂酶抑制劑，例如胞質磷脂酶抑制劑2(cPLA2)(例如，三氟甲基酮類似物)；血管內皮細胞生長因子或生長因子受體的抑制劑，例如VEGF抑制劑和/或VEGF-R抑制劑；和血管生成抑制劑。與抗體組合使用的合適治療劑本發明涉及免疫抑制劑，例如環孢菌素，他克莫司(FK-506)；mTOR抑制劑，例如西羅莫司(雷帕黴素)或雷帕黴素衍生物，例如可溶性雷帕黴素衍生物(例如，酯雷帕黴素衍生物，例如CCI-779)；COX2抑制劑，例如塞來昔布及其變體；和磷脂酶抑制劑，例如胞質磷脂酶2(cPLA2)的抑制劑，例如三氟甲基酮類似物。

可以與本發明之抗體組合的治療劑的其他實例包括以下一種或多種：6-巰基嘌呤(6-MP)；硫唑嘌呤磺胺嘧啶；美沙拉嗪；奧沙拉嗪；氯喹/羥氯喹 (PLAQUENIL^®)；青黴胺(pencillamine)；aurothiornalate(肌肉注射和口服)；硫唑嘌呤；coichicine；β-2腎上腺素受體激動劑(沙丁胺醇，特布他林、salmeteral)；黃嘌呤(茶鹼、氨茶鹼)；色甘酸鈉；奈多羅米；酮替芬；異丙托銨和氧托銨；mycophenolate mofetil；腺苷激動劑；抗血栓藥；補體抑制劑；和腎上腺素能藥物。

在一些實施例中，本發明的抗體/雙特異性抗體/AA/BAA可與一個或多個抗體/雙特異性抗體/AA/BAA組合。

14. 套組及製品

本發明提供包含本文提供的抗體、AA、雙特異性抗體和BAA中的任何一種或多種的套組和製品。

套組和製品以適於儲存或運輸的形式可包含本文提供的抗體、AA、雙特異性抗體和BAA中的任何一種或多種。

套組和製品可包含至少第二組分。

套組和製品可包括容器、稀釋劑、溶劑、第二組合物、或用於將組合物以儲存形式轉化成適合用於本發明的方法的組合物的任何組分，如果需要這樣的轉換。該方法可以是，例如，本文公開的治療方法。套組可包含使用說明書。

套組和製品可包含本發明的試劑，例如細胞毒性劑或可偵測標記，其形式適於與本文提供的抗體、 AA、雙特異性抗體和BAA共軛。

為達詳細說明之目的，本發明將在下列範例中進一步描述，所述範例不限制請本發明之範圍

實施例舉例

可以經由參考以下列舉的說明性實施例來定義本發明

1. 一種雙特異性可活化之抗體(BAA)，其中該BAA，當活化時特異性結合兩個標靶且包含以下結構：a. 特異性結合第一標靶的IgG抗體(AB1)，其中該AB1包含兩個重鏈(AB1 HC)及兩個輕鏈(AB1 LC)；以及其中該AB1係連接至第一可切割基團(CM1)的第一掩蔽基團(MM1)以形成MM1-CM1建構體以及其中MM1-CM1建構體的羧基末端係連接至該AB1的每條輕鏈的每個胺基末端，其中該MM1抑制該AB1結合至其標靶；以及該CM1係作用為第一蛋白酶受質的多肽，b. 每個特異性結合至第二標靶的兩個scFv(AB2)，其中每個AB2包含連接至重鏈可變區的輕鏈可變區，其中每個AB2的羧基末端係連接至每個AB1重鏈的胺基末端；且其中每個AB2係連接至連接至第二可切割基團(CM2)的第二掩蔽基團(MM2)以形成MM2-CM2建構體，其中MM2-CM2建構體的羧基末端係連接至每個AB2的胺基末端，其中 該MM2抑制該AB2結合至其標靶；以及該CM2係作用為第二蛋白酶受質的多肽，且其中該BAA具有至少一種以下特徵：i. MM2包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列；ii. MM1包含選自於表7所列之序列所組成群組之胺基酸序列；iii. AB2包含如列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之重鏈可變域或如列於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之輕鏈可變域；以及iv. AB1包含含有在L234、L235、N297、以及P331至少一個胺基酸位置的胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應(effector)功能。

2. 如實施例1所述之BAA，其中AB2包含如列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之重鏈可變域或如列於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。

3. 如實施例1所述之BAA，其中該AB1結合腫瘤標靶以及該AB2結合免疫效應(effector)標靶。

4. 如實施例1至3任一項所述之BAA，其中該BAA係為T細胞-銜接雙特異性(TCB)AA(TCBAA)。

5. 如實施例1至4任一項所述之BAA，其中該AB1結合EGFR以及AB2結合CD3ε。

6. 如實施例1至5任一項所述之BAA，其中該MM1包含選自於表7所列之序列所組成群組之胺基酸序 列。

7. 如實施例1至5任一項所述之BAA，其中該MM1包含選自於SEQ ID NO：85以及SEQ ID NO：78所組成群組的胺基酸序列。

8. 如實施例1至5任一項所述之BAA，其中該MM1包含SEQ ID NO：78。

9. 如實施例1至8任一項所述之BAA，其中該MM2包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。

10. 如實施例1至9任一項所述之BAA，其中該CM包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列。

11. 如實施例1至9任一項所述之BAA，其中該CM包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列。

12. 如實施例1至9任一項所述之BAA，其中該CM該CM包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列。

13. 如實施例1至9任一項所述之BAA，其中該CM1包含選自於SEQ ID NO：14以及SEQ ID NO：16所組成群組的胺基酸序列。

14. 如實施例1至9任一項所述之BAA，其中該CM2包含選自於SEQ ID NO14以及SEQ ID NO：17所組成群組的胺基酸序列。

15. 如實施例1至14任一項所述之BAA，其中該AB1包含在L234、L235、以及P331至少兩個胺基酸位置的胺基酸取代。

16. 如實施例15所述之BAA，其中AB1包含 在L234、L235、以及P331胺基酸位置之胺基酸取代。

17. 如實施例15所述之BAA，其中AB1包含L234F、L235E、以及P331S胺基酸取代。

18. 如實施例15所述之BAA，其中該AB1包含含有在N297胺基酸取代的Fc域。

19. 如實施例1至14任一項所述之BAA，其中AB1包含在L234F、L235E、P331S、以及N297Q胺基酸位置之胺基酸取代。

20. 如實施例1所述之BAA，其中該AB1的重鏈包含表6所列之SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75以及SEQ ID NO：76的任一個。

21. BAA CI106，包含如在表11及範例1的排列及序列。

22. BAA CI107，包含如在表11及範例1的排列及序列。

23. BAA CI079，包含如在表11及範例1的排列及序列。

24. BAA CI090，包含如在表11及範例1的排列及序列。

25. 一種可活化的抗體(AA)，包含：a)提供特異性結合至CD3的epsilon鏈(CD3ε)的抗體或其抗原結合片段；b)與AB耦合的掩蔽基團(MM)，其中當AA是未切割 的狀態時MM會減少或抑制該AB結合至CD3ε；其中MM包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列；以及c)與AB耦合至可切割基團(CM)，其中該CM係作用為蛋白酶受質的多肽之功能。

26. 如實施例25的AA，其中該CM包含表4所列的任一序列。

27. 如實施例25的AA，其中該CM包含經由絲胺酸蛋白酶或MMP的可切割的受質。

28. 如實施例25的AA，其中該CM包含選自於SEQ ID NO：18-56群組的胺基酸序列。

29. 如實施例25的AA，其中該蛋白酶係MMP。

30. 如實施例25的AA，其中該蛋白酶係絲胺酸蛋白酶。

31. 如實施例25的AA，其中該特異性結合至CD3的AB係為實施例38-47之抗體。

32. 一種可活化抗體(AA)，包含：a. 特異性結合至表皮生長因子受體(EGFR)的抗體或其抗原結合片段(AB)；b. 與AB耦合的掩蔽基團(MM)，其中當AA是未切割的狀態時該MM會減少或抑制該AB結合至EGFR且其中該MM包含選自於表7所列序列組成之群組的胺基酸序列；以及c. 與AB耦合的可切割基團(CM)，其中該CM係作用 為蛋白酶受質的多肽之功能。

33. 如實施例32的AA，其中MM包含SEQ ID NO：78的胺基酸序列。

34. 如實施例32至33的AA，其中該CM包含經由絲胺酸蛋白酶或MMP的可切割的受質。

35. 如實施例32至33的AA，其中該CM包含選自於SEQ ID NO：18-56所組成群組之胺基酸序列。

36. 如實施例32的AA，其中該CM包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列。

37. 如實施例32的AA，其中該CM包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列。

38. 一種特異性結合至CD3的ε鏈(CD3ε)的抗體或其抗原結合片段(AB)，其中包含如列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之重鏈可變域或如列於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。

39. 如實施例38的AB，其中該抗體包含如列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之重鏈可變域或如列於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。

40. 如實施例38的AB，包含如列於SEQ ID NO：2之重鏈可變域。

41. 如實施例38的AB，包含如列於SEQ ID NO：3之重鏈可變域。

42. 如實施例38的AB，其中該抗體包含如列於SEQ ID NO：1之輕鏈可變域。

43. 如實施例38的AB，包含如列於SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。

44. 如實施例38的AB，包含如列於SEQ ID NO：2之重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：1之輕鏈可變域。

45. 如實施例38的AB，包含如列於SEQ ID NO：3之重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：1之輕鏈可變域。

46. 如實施例38的AB，包含如列於SEQ ID NO：3之重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。

47. 如實施例38的AB，包含如列於SEQ ID NO2之重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。

48. 如實施例32至47的AB，其中該AB為雙特異性。

49. 如實施例32至47的AB，其中該抗體為scFv。

50. 如實施例32至47的AB，其中該抗體為IgG1抗體。

51. 一種可活化抗體(AA)，包含：a)特異性結合至CD3的ε鏈(CD3ε)的抗體或其抗原結合片段(AB)，其中該抗體包含如列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之重鏈可變域或如列於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之輕鏈可變域；b)與AB耦合的掩蔽基團(MM)，其中當AA是未切割的狀態時MM會減少或抑制該AB結合至CD3ε；以及c)與AB耦合的可切割的基團(CM)，其中該CM係作用為蛋白酶受質的多肽之功能。

52. 如實施例51所述之AA，其中該AB包含如列於SEQ ID NO：2的重鏈可變域。

53. 如實施例51所述之AA，其中該AB包含如列於SEQ ID NO：3的重鏈可變域。

54. 如實施例51所述之AA，其中該AB包含如列於SEQ ID NO：1的輕鏈可變域。

55. 如實施例51所述之AA，其中該AB包含如列於SEQ ID NO：4的輕鏈可變域。

56. 如實施例51所述之AA，其中AB包含如列於SEQ ID NO：2的重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：1的輕鏈可變域。

57. 如實施例51所述之AA，其中AB包含如列於SEQ ID NO：3的重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：1的輕鏈可變域。

58. 如實施例51所述之AA，其中AB包含如列於SEQ ID NO：2的重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：4的輕鏈可變域。

59. 如實施例51所述之AA，其中AB包含如列於SEQ ID NO：3的重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：4 的輕鏈可變域。

60. 如實施例51至59所述之AA，其中該MM包含表3所列序列之任一個。

61. 如實施例55至59所述之AA，其中該CM包含如表4所列序列之任一個。

62. 一種雙特異性可活化抗體(BAA)包含如實施例51至61任一項所述之AA。

63. 一種可活化抗體(AA)，包含：a. 特異性結合標靶的抗體(AB)，其中該抗體係為IgG1抗體，且該抗體的Fc域包含在L234、L235、以及P331至少一個胺基酸位置的胺基酸取代，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該AA具有減少效應；b. 與AB耦合的掩蔽基團(MM)，其中當AA是未切割的狀態時MM會減少或抑制該AB結合至標靶；以及c. 與AB耦合的可切割基團(CM)，其中該CM係作用為蛋白酶受質的多肽之功能。

64. 如實施例63所述之AA，其中含有在L234、L235、以及P331至少一個胺基酸位置的胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該AA具有減少效應(effector)功能。

65. 如實施例63或64所述之AA，其中該標靶係選自於表9所列之標靶所組成的群組。

66. 一種雙特異性可活化之抗體(BAA)，包含： a. 特異性結合至第一標靶的IgG抗體(AB1)，其中該AB1包含兩個重鏈(AB1 HC)及兩個輕鏈(AB1 LC)；其中該AB1連接至連接至第一可切割基團(CM1)的第一掩蔽基團(MM1)以形成MM1-CM1建構體，其中MM1-CM1建構體的羧基末端係連接至該AB1的每條輕鏈的每個胺基末端，其中該MM1抑制該AB1結合至其標靶；以及該CM1係作用為第一蛋白酶受質的多肽，b. 每個特異性結合至第二標靶的兩個scFv(每個AB2)，其中每個AB2包含連接至重鏈可變區的輕鏈可變區，其中每個AB2的羧基末端係連接至每個AB1重鏈的胺基末端；以及每個AB2連接至連接至第二可切割基團(CM2)的第二掩蔽基團(MM2)以形成MM2-CM2建構體，其中MM2-CM2建構體的羧基末端係連接至每個AB2的胺基末端，其中該MM2抑制該AB2結合至其標靶；以及該CM2係作用為第二蛋白酶受質的多肽，且其中AB1包含含有在L234、L235、N297、以及P331至少一個胺基酸位置之胺基酸取代的Fc域，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應。

67. 如實施例63所述之BAA，其中Fc域包含在L234、L235、N297、以及P331至少胺基酸位置之胺基酸取代，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應。

68. 如實施例66所述之BAA，其中Fc域包含在L234、L235、以及P331至少胺基酸位置之胺基酸取代，如經由列於Kabat的EU索引編號，使得該BAA具有減少效應。

69. 如實施例66至68之BAA，其中該第一標靶選自於表9所列之標靶組成之群組以及第二標靶選自於表9所列之標靶組成之群組。

70. 如上述實施例的任一項的AA或BAA，其中該其抗原結合片段係選自於Fab片段、F(ab’)₂片段、scFv、scAb、dAb、單一區域重鏈抗體、以及單一區域輕鏈抗體所組成之群組。

71. 如上述實施例的任一項的AA或BAA，其中該抗體囓齒動物抗體、嵌合抗體、人源化抗體或完全人單株(monoclonal)抗體。

72. 如上述實施例的32-37及51-71任一項的AA，其中AA係BAA。

73. 一種醫藥組成物包含實施例1-72任一項的抗體、AA、或BAA以及任一之載劑。

74. 如實施例73的醫藥組成物，其包含另外的藥劑。

75. 如實施例74的醫藥組成物，其中該另外的藥劑係治療藥劑。

76. 一種編碼如實施例1至72任一項所述之單離核酸分子。

77. 一種包含如實施例76所述之單離核酸分子的載體。

78. 一種包含如pLW289核酸序列的載體。

79. 一種包含如pLW246核酸序列的載體。

80. 一種包含如pLW307核酸序列的載體。

81. 一種包含如pLW291核酸序列的載體。

82. 一種包含實施例77-81的載體任一個的細胞。

83. 一種包含pLW289及pLW246的細胞。

84. 一種包含pLW307及pLW291的細胞。

85. 一種經由在可誘導如實施例1至72任一項所述之抗體、AA、或BAA表現的條件下培養細胞來製造上述提供的抗體的方法，其中該細胞包含如實施例76之核酸分子或如實施例78至81任一項所述之載體。

86. 一種治療有效劑量之如實施例1至72任一項所述之抗體、AA、BAA、或實施例73至75任一項之醫藥組成物用於製備治療、減緩病症或疾病的症狀、或延遲病症或疾病的進展之藥物的用途。

87. 如實施例86的方法，其中該病症或疾病包含表現EGFR的疾病細胞。

88. 如實施例86或87的方法，其中該病症或疾病係癌症。

89. 如實施例88的方法，其中該癌症係肛門癌、基底細胞癌、腦癌、膀胱癌、乳癌、骨癌、子宮頸 癌、膽管癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、膽囊癌、胃癌、膠質母細胞瘤、頭頸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、肉瘤、小腸癌、鱗狀細胞癌、皮膚癌、睪丸癌、甲狀腺癌或子宮癌。

90. 一種治療有效劑量之如實施例1至72任一項所述之抗體、AA、或BAA、或如實施例73至75任一項所述之醫藥組成物用於製備抑制所需個體血管新生之藥物的用途。

91. 如實施例86至90任一項所述之方法，其中該方法包含投予另外的藥劑。

92. 如實施例91之方法，其中該另外的藥劑為治療藥劑。

93. 一種AA或BAA或含有AA或BAA的醫藥組成物用於製備減少經由抗體與在健康組織以及疾病組織上的標靶結合所造成健康組織的損傷之藥物的用途，其中該AA或BAA係如本文提供實施例任一所述之AA或BAA。

94. 一種AA或BAA或含有AA或BAA的醫藥組成物用於製備改善所需個體抗體治療的耐受性(tolerability)之藥物的用途，其中該AA或BAA係如本文提供實施例任一所述之AA或BAA。

95. 一種募集T細胞至癌組織之方法，包含投予AA或BAA或含有AA或BAA的醫藥組成物至所需個體，其中該AA或BAA係如本文提供實施例任一所述之AA或BAA。

96. 一種用於藥物之如本文提供實施例任一所述之抗體、AA、或BAA、或如本文提供實施例任一所述之醫藥組成物。

97. 一種用於治療、減緩病症或疾病的症狀、或延遲病症或疾病的進展之方法的如實施例1至72任一項所述之抗體、AA、或BAA、或如實施例73至75任一項所述之醫藥組成物，其中該病症或疾病包含表現EGFR的疾病細胞。

98. 一種用於治療肛門癌、基底細胞癌、腦癌、膀胱癌、乳癌、骨癌、子宮頸癌、膽管癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、膽囊癌、胃癌、膠質母細胞瘤、頭頸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、肉瘤、小腸癌、鱗狀細胞癌、皮膚癌、睪丸癌、甲狀腺癌或子宮癌之方法的如實施例1至72任一項之抗體、AA、或BAA、或如實施例73至75任一項所述之醫藥組成物。

99. 一種用於治療方法之如實施例1至72任一項之抗體、AA、或BAA、或實施例73至75任一項所述之醫藥組成物，其中該方法包含抑制血管新生。

100. 如實施例96至99任一項之抗體、AA、或BAA之用途，其中該用途包含投予另外藥劑，其中該另外藥劑係任一治療藥劑。

範例

範例1. 序列、載體建構及抗體、BAA及經活化BAA的表現

有目的目的的抗體

在下表11提供的分子建構並測試。如所指出的，活化分子以掩蔽的方式產生並且蛋白水解切割以產生活化形式。

以下提供分子和載體的序列。括號表示所呈現分子的一些組成部分。在一些序列中，提供連接子。畫底線的胺基酸表示預測的CDR序列。

CI011：3954-0001-C225v5N297Q-JF15865-0001-CD3LvHv-H-N

pLW023：HC JF15865-0001-CD3LvHv-C225v5N297Q(H-N)

核苷酸序列

[間隔SEQ ID NO：176][pLW023無間隔SEQ ID NO：177]

(SEQ ID NO：105)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][pLW023無間隔SEQ ID NO：179]

(SEQ ID NO：106)

OPP022：LC 3954-0001-C225v5

核苷酸序列

[間隔SEQ ID NO：180][OPP022無間隔SEQ ID NO：181]

(SEQ ID NO：107)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][OPP022無間隔SEQ ID NO：182]

(SEQ ID NO：108)

CI020：3954-Nsub-C225v5N297Q-JF15865-Nsub-hSP34LvHv-H-N

pLW073：HC C225v5N297Q-JF15865-Nsub-hSP34LvHv(H-N)

核苷酸序列

[間隔SEQ ID NO：176][pLW073無間隔SEQ ID NO：183]

(SEQ ID NO：109)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][pLW073無間隔SEQ ID NO：184]

(SEQ ID NO：110)

pLW071：LC 3954-Nsub-C225v5

核苷酸序列

[間隔SEQ ID NO：180][pLW071無間隔SEQ ID NO：185]

(SEQ ID NO：111)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][pLW071無間隔SEQ ID NO：186]

(SEQ ID NO：112)

CI040：3954-2001-C225v5N297Q-JF15865-2001-hSP34LvHv-H-N

pLW101：HC JF15865-2001-CD3LvHv-C225v5N297Q(H-N)

核苷酸序列

[間隔SEQ ID NO：176][pLW101無間隔SEQ ID NO：187]

(SEQ ID NO：113)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][pLW101無間隔SEQ ID NO：188]

(SEQ ID NO：114)

CTX122：LC 3954-2001-C225v5

核苷酸序列

[間隔SEQ ID NO：180][CTX122無間隔SEQ ID NO：189]

(SEQ ID NO：115)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][CTX122無間隔SEQ ID NO：190]

(SEQ ID NO：116)

CI048：活化的CI011：3954-0001-C225v5N297Q-JF15865-0001-CD3LvHv-H-N

pLW023以及OPP022序列編碼相對應遮蔽的本文提供的遮蔽的抗體成份分別為在表11概述的「pLW023」以及「OPP022」。

活化的pLW023：HC JF15865-0001-CD3LvHv-C225v5N297Q(H-N)

核苷酸 序列

(SEQ ID NO：117)

胺基酸序列

(SEQ ID NO：118)

活化的OPP022：LC 3954-0001-C225v5

核苷酸 序列

(SEQ ID NO：119)

胺基酸序列

(SEQ ID NO：120)

CI079：3954-0001-C225v5Fcmt3-h20GG-0001-v16sc-H-N

pLW225：HC h20GG-0001-v16sc-C225v5Fcmt3(H-N)

核苷酸序列

[間隔SEQ ID NO：191][pLW225無間隔SEQ ID NO：192]

(SEQ ID NO：121)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][pLW225無間隔SEQ ID NO：193]

(SEQ ID NO：122)

OPP022：LC 3954-0001-C225v5

上述提供序列

CI090：3954-0001-C225v5Fcmt4-h20GG-0001-v16sc-H-N

pLW233：HC h20GG-0001-v16sc-C225v5Fcmt4(H-N)

核苷酸序列

[間隔SEQ ID NO：191][pLW233無間隔SEQ ID NO：194]

(SEQ ID NO：123)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][pLW233無間隔SEQ ID NO：195]

(SEQ ID NO：124)

OPP022：LC 3954-0001-C225v5

上述提供序列

活化的CI090：活化的-3954-0001-C225v5Fcmt4-h20GG--0001-v16sc-H-N

活化的pLW233：HC C225v5Fcmt4-h20GG-0001-v16sc(H-N)

核酸序列

(SEQ ID NO：164

胺基酸序列

(SEQ ID NO：165)

活化的OPP022：3954-0001-C225v5

核酸序列

(SEQ ID NO：166)

胺基酸序列

(SEQ ID NO：167)

CI104：3954-0011-C225v5Fcmt4-h20GG-0011-v16sc-H-N

pLW289以及pLW291序列編碼相對應遮蔽的本文提供的遮蔽的抗體成份分別為在表11概述的「pLW289」以及「pLW291」。

活化的CI104：3954-0011-C225v5Fcmt4-h20GG-0011-v16sc-H-N

活化的pLW289：HC h20GG-0011-v16sc-C225v5Fcmt4(H-N)

核苷酸序列

(SEQ ID NO：125)

胺基酸序列

(SEQ ID NO：126)

活化的pLW291：LC 3954-0011-C225v5

核苷酸序列

(SEQ ID NO：127)

胺基酸序列

(SEQ ID NO：128)

CI106：CF41-2008-C225v5Fcmt4-h20GG-0011-v16sc-H-N

pLW289：HC h20GG-0011-v16sc-C225v5Fcmt4(H-N)

核苷酸序列

[間隔SEQ ID NO：191][pLW289無間隔SEQ ID NO：196]

(SEQ ID NO：129)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][pLW289無間隔SEQ ID NO：197]

(SEQ ID NO：130)

pLW246：LC CF41-2008-C225v5

核苷酸序列

[間隔SEQ ID NO：176][pLW246無間隔SEQ ID NO：198]

(SEQ ID NO：131)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][pLW246無間隔SEQ ID NO：199]

(SEQ ID NO：132)

CI107：3954-0011-C225v5Fcmt4-h20GG-2006-v16sc-H-N

pLW307：HC h20GG-2006-v16sc-C225v5Fcmt4(H-N)

核苷酸序列

[間隔SEQ ID NO：191][pLW307無間隔SEQ ID NO：200]

(SEQ ID NO：133)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][pLW307無間隔SEQ ID NO：201]

(SEQ ID NO：134)

pLW291：LC 3954-0011-C225v5

核苷酸序列

[間隔SEQ ID NO：180][pLW291無間隔SEQ ID NO：202]

(SEQ ID NO：135)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][pLW291無間隔SEQ ID NO：203]

(SEQ ID NO：136)

CI127：SynFcmt4-h20GG-0011-v16sc-H-N

pLW334：HC h20GG-0011-v16sc-Synagis ^® Fcmt4(H-N)

核苷酸序列

[間隔SEQ ID NO：191][pLW334無間隔SEQ ID NO：204]

(SEQ ID NO：137)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][pLW334無間隔SEQ ID NO：205]

(SEQ ID NO：138)

pLW139：LC Synagis ^®

核苷酸序列

(SEQ ID NO：139)

胺基酸 序列

(SEQ ID NO：140)

CI128：SynFcmt4-h20GG-2006-v16sc-H-N

pLW335：HC h20GG-2006-v16sc-Synagis ^® Fcmt4(H-N)

核苷酸序列

[間隔SEQ ID NO：191][pLW335無間隔SEQ ID NO：206]

(SEQ ID NO：141)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][pLW335無間隔SEQ ID NO：207]

(SEQ ID NO：142)

pLW139：LC Synagis ^®

上述提供序列

CI135：CF41-2008-C225v5Fcmt4-h20GG-0011-v12sc-H-N

pLW352：HC h20GG-0011-v12sc-C225v5Fcmt4(H-N)

核苷酸序列

[間隔SEQ ID NO：208][pLW352無間隔SEQ ID NO：209]

(SEQ ID NO：151)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：176][pLW352無間隔SEQ ID NO：210]

(SEQ ID NO：146)

pLW246：LC CF41-2008-C225v5

核苷酸序列

上述提供序列

胺基酸序列

上述提供序列

CI136：CF41-2008-C225v5Fcmt4-h20GG-0011-v19sc-H-N

pLW353：HC h20GG-0011-v19sc-C225v5Fcmt4(H-N)

核苷酸序列

[間隔SEQ ID NO：191][pLW353無間隔SEQ ID NO：211]

(SEQ ID NO：152)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][pLW353無間隔SEQ ID NO：212]

(SEQ ID NO：148)

pLW246：LC CF41-2008-C225v5

上述提供序列

CI091：3954-1490DQH-C225v5Fcmt4-h20GG-2008-v16sc-H-N

pLW242：HC C225v5Fcmt4-h20GG-2008-v16sc(H-N)

核酸序列

[間隔SEQ ID NO：191][pLW242無間隔SEQ ID NO：213]

(SEQ ID NO：168)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][pLW242無間隔SEQ ID NO：214]

(SEQ ID NO：169)

CX320：3954-C225v5-2008

核酸序列

[間隔SEQ ID NO：180][CX320無間隔SEQ ID NO：215]

(SEQ ID NO：170)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][CX320無間隔SEQ ID NO：216]

(SEQ ID NO：171)

CI064：SynN297Q-JF15865-0001-hSP34LvHv-H-N

pLW138：HC SynN297Q-JF15865-0001-hSP34LvHv-H-N

核酸序列

[間隔SEQ ID NO：176][pLW138無間隔SEQ ID NO：147]

(SEQ ID NO：172)

胺基酸序列

[間隔SEQ ID NO：178][pLW138無間隔SEQ ID NO：153]

(SEQ ID NO：173)

pLW139：LC Syn kappa

核酸序列

(SEQ ID NO：174)

胺基酸序列

(SEQ ID NO：175)

抗CD3 scFv變異體v12

輕鏈LV12

重鏈HV12

上述提供序列

抗CD3 scFv變異體v16

輕鏈LV12

重鏈HV20

上述提供序列

抗CD3 scFv變異體v19

輕鏈LV19

重鏈HV20

上述提供序列

抗CD3 scFv變異體v26

輕鏈LV19

重鏈HV12

上述提供序列

載體建構

使用標準分子生物學技術將重鏈和輕鏈分別選殖到哺乳動物表現載體中。簡言之，利用引子結合末端的擴增編碼目的區域的DNA片段。需要將重疊的片段合併利用且側翼引物(flanking primer)擴增以構建整個所需區域。隨後使用市售的同源重組套組(MCLabs,South San Francisco,CA)將DNA片段選殖到表現載體中。哺乳動物表現載體是來自Invitrogen的cDNA^TM3.1(+)的修飾版本，具有G418或潮黴素(hygromycin)的選擇標記。使用QuikChange套組(Agilent,Santa Clara，CA)引入突變。

AA的表現及雙重掩蔽的BAA(BAA)

使用標準轉染套組(Life Technologies,Grand Island,NY)在哺乳動物細胞中表現AA和BAA。簡言之，依照製造商推薦的程序，使用以脂質為基礎的系統用核酸轉染293細胞。使用蛋白A珠(GE,Piscataway,NJ)從無細胞上清液中純化並使用標準緩衝液交換管柱(Millipore,Temecula,CA)濃縮AA和雙重掩蔽的BAA。

範例2. 雙重掩蔽、雙特異性、AA結合至EGFR+ HT-29細胞及CD3ε+Jurkat細胞

為確認是否所述EGFR及CD3ε遮蔽胜肽及蛋白酶受質是否可以在雙重遮蔽、雙特異性、AA的情況下抑制結合，進行基於流式細胞術的結合測定。

根據製造商手冊，將HT-29-luc2(Caliper)和Jurkat(Clone E6-1,ATCC,TIB-152)細胞在RPMI-1640+ glutamax(Life Technologies,Catalog 72400-047)、10%熱失活胎兒牛血清(HI-FBS,Life Technologies,Catalog 10438-026)、100U/ml青黴素、以及100μg/ml鏈黴素(Life Technologies,Catalog 15140-122)培養。測試以下雙特異性活化抗體CI048和CI104(act-104)和雙重遮蔽、雙特異性、AAs CI011、CI106以及CI107。使用兩種版本的SP34 scFv，即CI011和CI048中的scFv對比CI104，CI106和CI107中的scFv。使用兩種版本(version)的EGFR掩蔽，即CI011和CI107中的 EGFR掩蔽與CI106中的EGFR掩蔽。使用兩種版本的CD3掩蔽，即CI011中的CD3掩蔽與CI106和CI107中的CD3掩蔽。

用Versene^TM(Life Technologies,Catalog 15040-066)分離HT29-luc2細胞、洗滌、以150,000個細胞術/孔接種在96孔盤中，並再懸浮於50μL初級抗體中。滴定開始於圖1A至1B中所示的濃度，接著在FACS染色緩衝液+2%FBS(BD Pharmingen,Catalog 554656)中3倍連續稀釋。將細胞在4℃下振盪培育約1小時、收穫細胞，並用2×200μL的FACS染色緩衝液洗滌。將細胞再懸浮於50μL的Alexa Fluor 647共軛至抗人類IgG Fc(10μg/ml，Jackson ImmunoResearch，product 109-606-008)中，並在4℃下振盪培育約1小時。收穫HT29-luc2，洗滌並再懸浮於含有2.5μg/ml 7-AAD(BD Biosciences,Catalog 559925)最後體積為60μL的FACS染色緩衝液中。單獨二級抗體染色的細胞用作陰性對照。在MACSQuant^®分析儀10(Miltenyi)上獲得數據，並使用FlowJo^®V10(Treestar)計算活細胞的中間值螢光強度(MFI)。使用曲線擬合分析在GraphPad Prism 6中繪製背景減去的MFI數據。

收穫生長在懸浮液中的Jurkats、洗滌、以150000個細胞數/孔接種在96孔盤中，並再懸浮於50μl初級抗體中。如上文針對HT29-luc2細胞所述進行染色和數據採集。

圖1A表示相較於CI011，將h20GG CD3ε掩蔽肽併入至EGFR掩蔽BAAs CI106和CI107中顯著降低對 Jurkat細胞的結合。在一些實施例中，與Jurkat細胞的結合減少超過5,000倍。在一些實施例中，本發明的scFv也導致結合度降低。相較於CI011，CI106和CI107對EGFR+ HT29-luc2細胞的結合減少也是明顯的(圖1B)。在一些實施例中，與EGFR+HT29-luc2細胞的結合減少超過1,000倍。在圖1A和圖1B中，相較於活化的雙特異性抗體，雙重掩蔽BAA表現出結合減少。

範例3. 雙重遮蔽BAA的EGFR依賴細胞毒性

為確定是否CD3ε確定CI106和CI107中的CD3+和EGFR掩蔽及蛋白酶受質是否可以進一步減少相對於CI011和CI040的細胞殺傷力，進行細胞毒性測定。購買以冷凍等分試樣的人類PBMC(HemaCare)，並在以10：1的比例添加有5%熱失活的人類血清(Sigma,Catalog H3667)的RPMI-1640+glutamax中與表現EGFR的HT29-luc2細胞共培養。測試以下雙特異性活化抗體和雙重掩蔽的BAA的滴定：CI011、CI040、活化的CI104、CI106和CI107。此外，非EGFR結合、掩蔽的雙特異性、AAs CI127和CI128用於證明EGFR對細胞毒性的依賴性。48小時後，使用ONE-GloTM螢光素酶測定係統(Promega,Catalog E6130)評估細胞毒性。在Infinite M200 Pro(Tecan)上測量發光。計算細胞毒性百分比並用GraphPad PRISM繪製曲線擬合分析。使用QIFIKIT(Dako)經由流式細胞術定量一組細胞株的EGFR受體數目。

圖2A證明相較於CI011和CI040，CI106和CI106進一步減少EGFR+HT29-luc2細胞的殺傷力。圖2B顯示當以CI127和CI128處理細胞時未觀察到細胞毒性，證明EGFR靶向對細胞殺傷的依賴性。另外，圖2B描繪相較於蛋白酶活化的雙特異性抗體act-104，雙重掩蔽的雙特異性抗體CI106和CI107超過300,000倍EC50偏移。圖2C描繪包含HT29的一組細胞株的EGFR受體數目。HT29細胞上的近似EGFR受體數量為75,000，表示測試抗體的強效細胞毒性不需要高抗原密度。

範例4. 經由雙遮蔽BAA原代T細胞活化

為確定CI106和CI107中的CD3+和EGFR掩蔽是否可以相較於CI011和CI040減少原代T細胞活化，進行流式細胞術測定。根據實施例3中描述的條件，共培養人類PBMC和U266細胞。培育48小時後、沉澱細胞、除去培養基，並將細胞重在懸浮於50μl在含有抗CD45VioBlue^®(Miltenyi,Catalog 130-002-880)、抗CD8APC-Vio770(Miltenyi,Catalog 130-096-561)以及抗CD69 PE(BD Pharmingen,Catalog 555531)的FACS染色緩衝液+2%FBS之混合物中。將細胞在4℃下振盪染色1小時，收穫、洗滌、並再懸浮於最終體積為60μL的FACS緩衝液中。在MACSQuant^®分析儀10(Miltenyi)上獲得數據，並在FlowJo^® V10(Treestar)中定量活化，作為在PE同型(isotype)對照組之上表現CD69的CD8+T細胞的百分比。用GraphPad PRISM 6繪製數據並進 行曲線擬合分析。

圖3A表示相較於CI011及CI040，經由CI106 and CI10是初代CD8+T細胞的活性減弱。圖3B表示相較於蛋白酶活化的雙特異性抗體act-104，雙重掩蔽的抗體顯示T細胞活化的移位劑量反應曲線，表示掩蔽減弱T細胞活化。

範例5. 實施例的雙重遮蔽、雙特異性、AA會誘導在小鼠中建立的HT29-luc2腫瘤消退

在範例中，在人類T細胞移植的NSG小鼠中分析標靶EGFR和CD3+的雙重掩蔽的BAAs CI106和CI107會誘導已建立的HT-29-Luc2異種移植腫瘤生長的消退或減少。

人類結腸癌細胞株HT29-luc2從Perkin Elmer,Inc.,Waltham,MA(先前稱為Caliper Life Sciences,Inc.)獲得並根據已建立的程序培養。純化的冷凍人類PBMC從Hemacare,Inc.,Van Nuys,CA.N^SG^TM(NOD.Cg-Prkdcscid Il2 ^rgtm1Wjl /SzJ)獲得，小鼠從Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME獲得。

在第0天時，每個小鼠在右側皮下接種2×10⁶個在100μL RPMI+ Glutamax無血清培養基中的HT29-luc2細胞。在第3天，以CD3+T細胞與腫瘤細胞的比例1：1投予來自單一捐獻者的先前冷凍PBMC(i.p.)。當腫瘤體積達到200mm³(大約第12天)時，將小鼠隨機分配到治療組並 靜脈內(i.v.)投予。根據表12，每週兩次測量腫瘤體積和體重。

圖4繪製腫瘤體積與初始治療劑量後天數的關係，表示CI106和CI107雙重遮蔽、雙特異性、AA對HT29-luc2異種移植腫瘤的生長具有劑量依賴性作用。測試的最有效劑量是1.5mg/kg，其會導致腫瘤消退。在GraphPad PRISM進行統計分析(RMANOVA與Dunnett’s對PBS對照組)。*=p<0.05、**=p<0.01、****=p<0.0001。

範例6. 實施例的雙重遮蔽、雙特異性、AA會誘導在小鼠中建立的HCT116腫瘤消退

在範例中，在人類T細胞移植的NSG小鼠中分析標靶EGFR和CD3ε的雙特異性抗體、活化的CI104、和雙重遮蔽CI107會誘導已建立的HCT116異種移植腫瘤生長的消退或減少。人類結腸癌細胞株HCT116從ATCC獲得，且根據已建立的程序培養於RPMI+Glutamax+10%FBS。腫瘤模型如範例5所述之方式進行。依據表13投予小鼠劑 量。

圖5繪製腫瘤體積與初始治療劑量後天數的關係，表示CI106和CI107雙重遮蔽雙特異性、AA對HCT116異種移植腫瘤的生長具有劑量依賴性作用。測試的最有效劑量是1.0mg/kg，其會導致腫瘤停滯。以0.3mg/kg投予的Act-104也會導致腫瘤停滯，證明雙重掩蔽和蛋白酶活化的雙特異性抗體之間的功效差異為3倍。在GraphPad PRISM進行統計分析(RMANOVA與Dunnett’s對PBS對照組)。*=p<0.05、**=p<0.01、****=p<0.0001。

範例7. 雙遮蔽雙特異性、AA對食蟹獼猴T細胞的交叉反應性

為確認食蟹獼猴是相關的毒性物種，將蛋白酶活化的CI104、CI106和CI107用於基於流式細胞術的細胞結合測定和使用食蟹獼猴pan T細胞(BioreclamationIVT)的HT29-luc2細胞毒性測定，且該能力為相較於人類PBMC。 程序如範例2及3中所述。

圖6A及圖6B證實當使用人類(6A)或獼猴(6B)反應細胞時，細胞毒性測定中測試的雙重掩蔽和蛋白酶活化的雙特異性抗體的EC50是相似的。圖6C和圖6D表示蛋白酶活化的和雙重掩蔽的抗體對人類(6C)和食蟹獼猴(6D)T細胞的結合是相似的。

因此，確定食蟹獼猴是耐受性研究的相關物種。

範圍8. Fc域的突變影響食蟹獼猴中雙重掩蔽、雙特異性、AA的耐受性

在該範例中，在年幼的食蟹獼猴(n=1)中以600μg/kg劑量投予CI079和CI090以評估耐受性。基於先前建立的CI011的MTD選擇600μg/kg的起始劑量。這些猴子來自中國，體重2.5至4公斤。監測每隻研究動物至少7天。根據臨床症狀、體重和食物消耗評估耐受性。該研究符合SNBL USA,Ltd.(Everett,WA)的標準操作程序。

表14描述投予僅在其Fc域不同的CI079和CI090雙重遮蔽的雙特異性AA(BAA)後的臨床觀察結果(表15)。CI079含有Fc突變L234F、L235E和P331S。CI090含有那些Fc突變和N297Q突變。在以600μg/kg劑量投予CI090後沒有觀察到臨床觀察結果，而在劑量投予CI079後的最初24小時內注意到嘔吐，證明Fc域中的突變有助於這些分子的耐受性。

範例9. 食蟹獼猴中雙重掩蔽BAA的耐受性

在該範例中，CI106以及CI107以600、2000、4000μg/kg(僅CI107)或6000μg/kg(僅CI107)劑量投予以建立單次IV推注投予年幼的食蟹獼猴(n=1)後的最大耐受劑量(MTD)。基於先前建立的CI011的MTD選擇600μg/kg為起始劑量。這些猴子來自中國，體重2.5至4公斤。監測每隻研究動物至少7天。基於臨床體徵、體重、食物消耗和實驗室分析評估耐受性，所述實驗室分析包括血清化學、血液學、細胞因子分析和流式細胞術以評估T細胞活性。收集血液用於標準血清化學和血液學分析，一次在適應期間和藥劑投予前、48小時、72小時(僅血液學)和投予後7天。在投予前和投予後1小時、4小時、8小時和24小時收集血液用於細胞因子分析。在投予後72小時和7天對投予前外周血進行流式細胞術。該研究符合SNBL USA,Ltd.(Everett,WA)的標準操作程序。

以6000μg/kg劑量投予CI107在投予後24小時 內是致命的。在其他組中，在用2000μg/kg及以上劑量的CI106和CI107處理的短尾猴中觀察到包括嘔吐和食物攝入減少的異常臨床體徵。當存在時，這些發現是短暫的並且通常局限於投予後48小時。這些劑量的血清化學發現包括48小時丙胺酸轉氨酶(ALT)和天冬胺酸氨基轉移酶(AST)的輕度升高，但不超過正常範圍。在2000和4000μg/kg的CI107處理的動物中，總膽紅素在48小時時增加到正常範圍之外並且在第8天完全逆轉。在CI106和CI107處理的動物中，血清細胞因子IL-2、IL-6以及IFNg的瞬時增加在投予後觀察，並在投予後24小時消退。在投予後72小時觀察到表達CD69、Ki67和PD-1的T細胞百分比的增加，並且通常，CI107處理的動物的陽性細胞百分比更高。

圖7A-7C描繪先行劑量(pre-dose)，投予劑量後(post-dose)48小時和7天的ALT(7A)、AST(7B)和總膽紅素(7C)的血清濃度。除2000和4000μg/kg的總膽紅素外，所有值在建立的食蟹獼猴的正常範圍內。CI107僅有6000μg/kg的先行劑量數據，不包括在內。

圖8A-8C描繪IL-2(8A)、IL-6(8B)、以及IFN-g(8C)的血清細胞因子含量的增加。

圖9A-9C描繪經由在CD4+T細胞CD69(9A)、Ki67(9B)、以及PD-1(9B)的表現測量T細胞活性。

範例10. 在食蟹獼猴中與活化的雙特異性抗體相比，雙重遮蔽、雙特異性、AA更安全。

在該實施例中，在食蟹獼猴中蛋白酶活化的CI104和雙重掩蔽的CI106和CI107以60、180(僅活化CI104)、600、2000、4000μg/kg(僅CI107)劑量投予、或6000μg/kg(僅CI107)，用於比較單次靜脈推注後掩蔽和未掩蔽抗體的耐受性。耐受性評估和血液收集如實施例9中所述。雙重掩蔽、BAAs CI106和CI107的耐受劑量含量比蛋白酶活化的雙特異性抗體高30-60倍。

圖10A-E繪製在投予劑量後48小時AST(10A)、投予劑量後48小時ALT(10B)、投予劑量後8小時IL-6(10C)、投予劑量後8小時IFNg(10D)和投予劑量後72小時Ki67(10E)的劑量依賴性增加。對於雙重掩蔽的抗體，所有參數的劑量反應曲線發生偏移，表示相較於蛋白酶活化的雙特異性抗體，改善的耐受性和降低的藥學效應。在一些實施例中，IL-6劑量反應曲線偏移60多倍。

範例11. EGFR結合、雙重掩蔽、雙特異性、AA的耐受性取決於EGFR

在範例中，在食蟹獼猴(n=1)中靶向RSR和靶向RSV和CD3ε和CI128的雙重掩蔽、雙特異性抗體、CI107以2000μg/kg劑量投予。耐受性評估和血液收集如上文實施例9中所述。CI128對急性器官毒性(總膽紅素)和T細胞活化(IL-6、PD-1)的測量沒有影響，證實在食蟹獼猴中觀察到的毒性依賴於EGFR結合。這些數據還表示單獨的CD3ε結合不足以誘導毒性。

圖11A-11C相較於EGFR結合CI107以及非EGFR結合CI128在總膽色素(11A)、IL-6(11B)、以及CD4+ T細胞表現PD-1(11C)的影響增加。

範例12. 具有不同親和力及能力的抗CD3變異體v12、v16、以及v19之人源化(humanization)

該範例描述抗CD3抗體變異體v12、v16、以及v19。該三個變異點衍生自親代抗體hSP34。

經由選擇性突變框架進行抗人類CD3單鏈可變片段(scFv)的人源化。簡言之，將CDR移植到一系列輕鏈(LC)和重鏈(HC)人IgG支架中，並選擇性突變可變區框架中的許多胺基酸。免疫球蛋白在LC和HC的所有可能組合中表現，然後使用ELISA和細胞與Jurkat細胞的結合評估表現量、單體百分比和CD3親和力。所需組合的可變區以雙特異性抗體(TCB)形式表示為scFv，然後評估細胞細胞毒性測定中的表現量、單體百分比、CD3親和力和功能。

使用表面等離振子共振(SPR)測量v12、v16和v19變異體的親和力。表面為HC200m、基於線性合成聚羧酸鹽的羧基化水凝膠。以標準EDC/NHS胺耦合程序活化表面通道。通道1和2是空白組，通道3和4是各種抗人類CD3抗體。經由將v12、v16、v19以及MM194抗體在1.0mL 10mM乙酸鈉pH 4.5中稀釋至5μg/ml來產生表面。

在20℃下在PBST(10mM磷酸鈉、pH 7.4、 150mM氯化鈉、0.05%Tween-20)中進行動力學分析。再生是一連串三次注射；單次5μl注射20mM氫氧化鈉，然後注射兩次5μL新鮮製備的10mM氫氧化鈉。

使用與緩衝液空白組交替的逆3倍連續稀釋進行配製。人類CD3egFc來自Sino Biological Inc.(中國北京，Catalog#CT041-H0305H)之基於PBS和穩定劑的凍乾製劑的使用無菌水重建。用溶液中的分析物從300nM或100nM人類CD3開始連續稀釋。使用Scrubber軟件完成處理。

亦使用所述方法將這些變異體工程化為靶向EGFR和CD3的雙重遮蔽的雙特異性AA，並用於如實施例3中所述的體外細胞毒性測定該些變異體。

圖12A描繪v12、v16以及v19相對於hSP34的親和力測量。V12是在12nM時的最高親和力，而v16是在70nM時的最低親和力。

圖12B描繪活化的或雙重掩蔽的雙特異性抗體對HT29-luc2細胞的細胞毒性。對於雙重掩蔽的分子，活化分子的細胞殺傷之效力略有差異，v16是最有效的。對於雙重遮蔽分子對細胞殺傷的保護亦略有差異。

範例13. 在食蟹獼猴中雙重掩蔽BAA有延長的PK之能力

在該些範例中，蛋白酶活化的雙特異性抗體act-104和雙重掩蔽的雙特異性抗體CI107以60μg/kg、180μg/kg(act-104)或2000μg/kg(CI107)在食蟹獼猴中給藥。在 5分鐘(act-104)、30分鐘、4小時(act-104)、24小時、48小時(act-104)、96小時以及168小時收集血漿樣品。經由ELISA使用抗獨特型(anti-idiotype)抗體以捕獲血漿濃度來測量用於檢測的辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗人類IgG(Fc)，並使用3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB)顯現。從標準曲線內插血漿濃度值，並使用GraphPad PRISM繪圖。還進行曲線下面積(AUC)分析。

圖13描繪相對於蛋白酶活化分子act-104的雙重掩蔽分子CI107的延長的PK。CI107的暴露(AUC)為448天*nM且act-104(60μg/kg)為0.04天*nM，表示血漿暴露的差異大於10,000倍。

範例14. 對雙重遮蔽、雙特異性的AA蛋白酶切割的敏感性與腫瘤功效和腫瘤T細胞浸潤相關

該範例描述HT29-luc2異種移植模型中的抗腫瘤功效和腫瘤T細胞浸潤。如範例5中所述進行該模型。在腫瘤T細胞浸潤研究中，小鼠接受單劑量的測試物，並在劑量投予後7天收穫腫瘤。建立福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)塊於組織學使用。使用的測試物是CI011，CI020(不含可切割受質的雙重掩蔽的雙特異性抗體)、CI040以及CI048。測試物品的蛋白酶敏感性和受質可切割性如下：CI040>CI011>CI020。根據表16劑量投予小鼠。

圖14A描繪PBMC移植的NSG小鼠中HT29-luc2腫瘤干預模型的功效。該範例中的抗腫瘤效力與測試物的蛋白酶敏感性及受質可切割性相關，最有效的測試物是完全蛋白酶活化的CI048。

圖14B描繪CD3的腫瘤切片染色(深色染色)，作為T細胞浸潤到腫瘤中的程度的測量。腫瘤T細胞浸潤與測試物的蛋白酶敏感性及受質可切割性相關。

範例15. 在食蟹獼猴中與第一代分子相比第二代雙重遮蔽、雙特異性、AA更安全

在該範例中，比較食蟹獼猴的耐受性數據為CI011、CI040、CI048(第一代分子)、act-104、CI106、以及CI107(第二代分子)。在範例中提供的數據來自兩項食 蟹獼猴耐受性研究。在食蟹獼猴中蛋白酶活化的CI104以及CI048以20(僅CI048)、60或180μg/kg(僅-act-104)劑量投予。雙重掩蔽的CI011、CI040、CI106以及CI107以600、2000、4000(僅CI107)、或6000(僅CI107)μg/kg劑量投予，以比較單次IV推注後雙重掩蔽和活化的雙特異性抗體的耐受性。耐受性評價如範例8中所述。

表17總結單劑量測試物品後的臨床觀察結果。第二代、蛋白酶活化的雙特異性抗體act-104以比第一代蛋白酶活化的雙特異性抗體CI048高2倍的劑量耐受力。CI106和CI107的耐受劑量比第一代抗體CI011和CI040高30-60倍。

範例16. 評估可活化抗EGFR抗體的遮蔽效率

掩蔽抗體結合至其抗原的能力是抑制結合的範例，並且在本文中列舉為掩蔽效率(ME)。掩蔽效率可以計算為AA結合的K_D除以在相同條件下測量的抗體結合的K_D。抑制程度取決於抗體對其抗原的親和力、抑制劑(即掩蔽部分)對抗體的親和力和所有反應物的濃度。栓系(tethered)掩蔽部分胜肽(抑制劑)的局部濃度在AA背景(context)中非常高，在約10mM的順序下，中等親和胜肽因此將會有效地掩蔽AA抗原結合。

該測定的一般概述如下：將Nunc,Maxisorp^TM 盤在4℃下以100μl/孔的1μg/mL在PBS pH 7.4中人類EGFR(R和D Systems)的溶液塗覆過夜。將該盤以3X PBST(PBS，pH 7.4，0.05%Tween-20)洗滌，並將孔使用200μl/孔、10mg/mL BSA的PBST在室溫下封閉2小時。該盤以PBST(PBS，pH 7.4，0.05%Tween-20)洗滌。可以在PBST中以10mg/mL BSA製備稀釋曲線，如下表18中所示。在該範例中，親本抗體的最高濃度為10nM，且對於AA為400nM，然而，最高濃度可以增加或減少以給出具有更強或更弱掩蔽的AA的完全飽和結合曲線。

將結合溶液加入盤中，然後將其在室溫下培育1小時，然後洗滌3X PBST(PBS，pH 7.4，0.05%Tween-20)。加入在PBST中10mg/mL BSA中的100μl/孔之1：4000稀釋的山羊抗人類IgG(Fab特異性，Sigma cat#A0293)，並將樣本盤在室溫下培育1小時。該樣本盤以TMB以及1N HCL反應。圖15和圖16中顯示本發明的可活化的抗EGFR C225v5抗體用於上述可活化的抗EGFR抗體3954-2001-C225v5以及用於抗EGFR抗體C225v5的結合等溫線圖。在GraphPad PRISM中生成繪圖，並將數據擬合到單點飽和度 的模型並確定K_D。表19中提供K_D和ME值。

範例17. 在食蟹獼猴中雙重掩蔽的藥物代謝動力學(pharmacokinetics)

在該範例中，在食蟹獼猴中雙重遮蔽的雙特異性抗體CI107以600μg/kg、2000μg/kg、或4000μg/kg劑量投予。在第30分鐘、4h(僅600μg/kg)、24h、48h(僅600以及4000μg/kg)、96h、以及168h收集血漿樣本。經由範例13中的ELISA測量血漿濃度。

圖20繪製以600、2000、或4000μg/kg單一i.v.劑量投予後雙重遮蔽BAA CI107的PK。

範例18. EGFR-依賴性雙重遮蔽、雙特異性、可活化抗體的細胞毒性

為確定相對於CI011、CI090及CI091中抗CD3ε、CD3遮蔽、及蛋白酶受質是否可以進一步減弱對細胞殺傷力，使用實施例3中描述的方法進行細胞毒性測 定。以下雙特異性的滴定，測試活化的抗體和雙重掩蔽的雙特異性可活化抗體：CI011、CI090、CI091、活化的CI090、以及CI048。此外，非EGFR結合、雙特異性、可活化的抗體CI064用於證明EGFR對細胞毒性的依賴性。

圖21表示相對於CI011，CI090和CI091進一步減弱對EGFR+HT29-luc2細胞的殺傷力，但活化的CI090的效力等同於CI048。相對於活化的雙特異性抗體，CI090和CI091的EC50偏移增加，表示這些分子相對於CI011的掩蔽效率增加。當用CI064處理細胞時未觀察到細胞毒性，證明EGFR靶向對細胞殺傷力的依賴性。

範例19. 經由雙重遮蔽、雙特異性、可活化抗體的原代T細胞活性

為確定相對於CI011，CI090及CI091中抗CD3ε、CD3遮蔽、及蛋白酶受質是否可以進一步減弱原代T細胞活化，如範例4中所述進行流式細胞術測定。

圖22表示相較於CI011，CI090和CI091進一步減弱原代CD8+ T細胞的活性。

範例20. 實施例中的雙重遮蔽、雙特異性、可活化抗體誘導小鼠建立HT29-luc2腫瘤消退

在該範例中，分析雙特異性可激活抗體CI011、CI090和CI091在人PBMC移植的NSG小鼠中誘導消退或減少已建立的HT-29-Luc2異種移植腫瘤生長的能力。 該方法如範例5中所述。

圖23繪製腫瘤體積與初始治療劑量後的天數的關係，表示對於所有測試的雙特異性可活化抗體，以1mg/kg，每週劑量誘導腫瘤消退。

範例21. 在食蟹獼猴中雙重遮蔽、雙特異性、可活化的抗體引發更少的細胞因子的釋放

在該範例中，在食蟹獼猴(n=1)中蛋白酶活化的CI104以及雙重掩蔽的CI011、CI090及CI091以0.06、0.18(活化的CI104)、或600mg/kg(CI011、CI090、CI091)劑量投予。在給藥前和給藥後1小時、4小時、8小時以及24小時收集血液用於細胞因子分析。使用Life Technologies Monkey Magnetic 29-Plex Panel套組(Product No.LCP0005M)分析樣品。數據在BioRad BioPlex 200儀器上獲得。該分析符合SNBL USA,Ltd(Everett,WA)的標準操作程序。

圖24繪製劑量投予後8小時的IL-6含量。即使以較高劑量傳遞，雙重掩蔽雙特異性可活化抗體CI011也比可活化的CI104誘導顯著更少的細胞因子釋放，證明 掩蔽對T細胞活化的影響。在CI090和CI091處理的動物中IL-6甚至進一步降低，反映這些分子相對於CI011的掩蔽效率增加。

其他實施例

雖然本發明已結合該發明之詳細說明來描述，但前述說明係意欲為描繪且並非限制本發明之範圍，本發明之範圍係由後附之申請專利範圍所界定。其他態樣、優點、及修飾係在後列之申請專利範圍內。

Claims (25)

1. 一種可活化抗體(AA)，其中，當經活化時，該AA特異性結合至CD3的ε鏈(CD3ε)，該AA包含：a)特異性結合至CD3ε的抗體或其抗原結合片段(AB2)，其中該AB2包含VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、及VH CDR3之胺基酸序列，該VL CDR1胺基酸序列包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：149)；該VL CDR2胺基酸序列包含GTNKRAP(SEQ ID NO：5)；該VL CDR3胺基酸序列包含ALWYSNLWV(SEQ ID NO：6)；該VH CDR1胺基酸序列包含TYAMN(SEQ ID NO：7)；該VH CDR2胺基酸序列包含RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO：8)；且該VH CDR3胺基酸序列包含HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO：9)；b)與該AB2耦合的掩蔽基團(masking moiety)(MM2)，其中，當該AA是未切割的狀態時，該MM2會減少或抑制該AB2結合至CD3ε；其中該MM2包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列；以及c)與該AB2耦合的可切割基團(cleavable moiety)(CM2)，其中該CM2係作用為蛋白酶受質的多肽。
2. 如申請專利範圍第1項所述之AA，其中：a.該CM2包含可藉由絲胺酸蛋白酶或基質金屬蛋白酶(MMP)切割的受質；及/或 b. 該CM2包含選自於SEQ ID NO：18-56所組成群組的胺基酸序列；及/或c. 該CM2包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；及/或d. 該CM2包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；及/或e. 該CM2包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列；及/或f. 該CM2包含選自由SEQ ID NO：13至17所組成之群組之胺基酸序列之任一者。
3. 如申請專利範圍第1項所述之可活化抗體，其中該可活化抗體係雙特異性可活化抗體(BAA)。
4. 如申請專利範圍第3項所述之可活化抗體(AA)，其中，當經活化時，該BAA特異性結合至表皮生長因子受體(EGFR)，其中該BAA進一步包含：a. 特異性結合至EGFR的抗體或其抗原結合片段(AB1)；b. 與該AB1耦合的掩蔽基團(MM1)，其中，當該BAA是未切割的狀態時，該MM1會減少或抑制該AB1結合至EGFR，且其中該MM1包含選自由SEQ ID NO：78-84所組成之群組的胺基酸序列；以及c. 與該AB1耦合的可切割基團(CM1)，其中該CM1係作用為蛋白酶受質的多肽。
5. 如申請專利範圍第3項所述之AA，其中該MM1包含 SEQ ID NO：78的胺基酸序列。
6. 如申請專利範圍第1項所述之可活化抗體，其中該AB2包含如列於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之重鏈可變域及如列於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之輕鏈可變域。
7. 如申請專利範圍第6項所述之AA，其中該AB2包含如列於SEQ ID NO：2的重鏈可變域。
8. 如申請專利範圍第6項所述之AA，其中該AB2包含如列於SEQ ID NO：3的重鏈可變域。
9. 如申請專利範圍第6項所述之AA，其中該AB2包含如列於SEQ ID NO：1的輕鏈可變域。
10. 如申請專利範圍第6項所述之AA，其中該AB2包含如列於SEQ ID NO：4的輕鏈可變域。
11. 如申請專利範圍第6項所述之AA，其中該AB2包含如列於SEQ ID NO：2的重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：1的輕鏈可變域。
12. 如申請專利範圍第6項所述之AA，其中該AB2包含如列於SEQ ID NO：3的重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：1 的輕鏈可變域。
13. 如申請專利範圍第6項所述之AA，其中該AB2包含如列於SEQ ID NO：2的重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：4的輕鏈可變域。
14. 如申請專利範圍第6項所述之AA，其中該AB2包含如列於SEQ ID NO：3的重鏈可變域以及如列於SEQ ID NO：4的輕鏈可變域。
15. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至14項中任一項所述之AA以及載劑。
16. 一種編碼如申請專利範圍第1至14項中任一項所述之AA之單離核酸分子。
17. 一種載體，其包含如申請專利範圍第16項所述之單離核酸分子。
18. 一種包含如申請專利範圍第16項所述之單離核酸分子或如申請專利範圍第17項所述之載體之細胞。
19. 一種製造AA之方法，其包含將如申請專利範圍第18項所述之細胞在使該AA表現的條件下培養。
20. 一種如申請專利範圍第1至14項中任一項所述之AA、或如申請專利範圍第15項所述之醫藥組成物之用途，其用於製造供治療癌症的藥物。
21. 一種掩蔽基團，其包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
22. 一種單離核酸分子，其編碼如申請專利範圍第21項所述之掩蔽基團。
23. 一種載體，其包含如申請專利範圍第22項所述之單離核酸分子。
24. 一種包含如申請專利範圍第22項所述之單離核酸分子或如申請專利範圍第23項所述之載體之細胞。
25. 一種製造如申請專利範圍第21項所述之掩蔽基團之方法，該方法包含將如申請專利範圍第24項所述之細胞在使該掩蔽基團表現的條件下培養。

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