JPH08503468A - Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのヒトｂリンパ球限定分化抗原に対するキメラ抗体と放射能標識抗体の療法利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｂ細胞リンパ腫の治療のために考案された治療処置プロトコールが開示される。それらのプロトコールは、免疫学的に活性なマウス／ヒトキメラ抗CD20抗体または放射能標識抗CD20抗体の投与の使用を含む治療方法、並びにキメラ抗CD20抗体と放射能標識抗CD20抗体の使用を含んで成る協同的治療方法に基づいている。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのヒトＢリンパ球限定分化 抗原に対するキメラ抗体と放射能標識抗体の療法利用 37 C.F.R．§1.74(d)／(e)著作権告知 本特許明細書の開示の一部は著作権保護を受けるものを含んでいる。著作権所 有者は、特許および商標庁の特許ファイルまたは記録に出る時は特許文書または 特許開示の複製に異議を唱えることはないが、その他はどんな場合でも著作権を 有する。 関連出願 本出願は1992年11月13日出願の係属中の米国特許出願第07/978,891号の一部継 続出願である。この特許文書は、発明の名称が“IMPAIRED DOMINANT SELECTABLE MARKER SEQUENCE FOR ENHANCEMENT OF EXPRESSION OF CO-LINKED GENE PRODUCT AND EXPRESSION VECTORSYSTEMS COMPRISING SAME”である米国特許出願第07/97 7,691号（係属中：1992年11月13日出願）と、“IMPAIRED DOMINANT SELECTABLE MARKER SEQUENCE AND INTRONIC INSERTION STRATEGIES FOR ENHANCEMENT OF EXP RESSION OF GENE PRODUCT AND EXPRESSION VECTOR SYSTEMS COMPRISING SAME” である米国特許出願第 号（本出願と同日出願）に関連する。関連特許文 書は参考として本明細書中に組み込まれる。 内容の一覧表 Ａ．発明の分野 Ｂ．発明の背景 Ｃ．発明の要約 Ｄ．図面の簡単な説明 Ｅ．好ましい態様の詳細な説明 Ｆ．実施例 Ｉ．放射能標識抗CD20抗体2B8 Ａ．抗CD20モノクローナル抗体（ネズミ）産生（“2B8”） Ｂ．2B8-MX-DTPA接合体の調製 ｉ．MX-DTPA ii．2B8の調製 iii．2B8とMX-DTPAの接合 iv．MX-DTPA取り込みの測定 ｖ．2B8-MX-DTPAの免疫反応性 vi．インジウム［111］標識2B8-MX-DTPA（“I2B8”）の調製 viｉ．イットリウム［90］標識2B8-MX-DTPA（“Y2B8”）の調製 Ｃ．非ヒト動物実験 ｉ．放射能標識2B8-MX-DTPAの分布 ii．I2B8の腫瘍局在化 iii．放射能標識2B8-MX-DTPAを使った生体分布および腫瘍局在化 Ｄ．ヒト実験 ｉ．2B8と2B8-MX-DTPA ：ヒト組織を使った免疫組織学的研究 ii．I2B8（画像診断）とY2B8（治療）の臨床分析 ａ．第Ｉ／II相臨床実験：単一線量療法研究 ｂ．第Ｉ／II相臨床実験階：複数線量療法研究 II．キメラ抗CD20産生 Ａ．キメラ抗CD20免疫グロブリンＤＮＡ発現ベクターの作製 Ｂ．キメラ抗CD20産生CHOおよびSP2/0 トランスフェクトーマの作製 Ｃ．キメラ抗CD20抗体の免疫学的活性の測定 ｉ．ヒトClq分析 ii．補体依存性細胞溶解 iii．抗体依存性細胞障害エフェクターアッセイ III．キメラ抗CD20を使った生体内Ｂ細胞の涸渇 Ａ．非ヒト霊長類実験 Ｂ．C2B8の臨床分析 ｉ．C2B8の第Ｉ／II相臨床実験：単一用量療法研究 ii．C2B8の第Ｉ／II相臨床実験：複数用量療法研究 IV．組合せ療法：C2B8とY2B8 Ａ．Y2B8の調製 Ｂ．C2B8の調製 Ｃ．結果 Ｖ．別の治療方法 VI．寄託物情報 Ｇ．配列表 Ｈ．請求の範囲 Ａ．発明の分野 この文書を通して言及される参考文献は、単にこの文書の出願日より前にその 中に記載された情報について説明するのであって、該参考文献が「先行技術」で あるということや、前に提出された出願に基づいた優先権または先行発明者によ って本発明者らがそのような記載よりも日時が先行する権利を与えられないとい うことの明白なまたは暗黙の認可であると解釈してはならない。 本発明は、Ｂ細胞表面抗原Bp35（“CD20”）に対する放射能標識抗体およびキ メラ抗体を使ったＢ細胞リンパ腫の治療に向けられる。 Ｂ．発明の背景 脊椎動物（例えば霊長類、例えはヒト、類人猿、サル等を含む）の免疫系は多 数の器官および細胞種から成り、これは脊椎動物宿主を侵略する外来微生物（「 抗原」）を正確且つ特異的に認識するもの；そのような外来微生物に特異的に結 合するもの；およびそのような外来微生物を排除／破壊するものへと発展してい った。中でもリンパ球は免疫系にとって重要である。リンパ球は胸腺、脾臓およ び骨髄（成人）中で生産され、そしてヒト（成人）の循環系中に存在する全白血 球の約30％を占める。リンパ球には２つの主な小集団、即ちＴ細胞とＢ細胞があ る。Ｔ細胞は細胞性免疫の原因であり、一方Ｂ細胞は抗体産生（体液性免疫）を 引き起こす。しかしながら、Ｔ細胞とＢ細胞は相互依存であると見なすことがで きる。典型的免疫応答では、抗原提示細胞の表面上の主要組織適合複合体（「Ｍ ＨＣ」）糖タンパク質に結合している抗原の断片にＴ細胞レセプターが結合する とＴ細胞が活性化される。そのような活性化が生物学的媒介物質（「インターロ イキン」）の放出を引き起こし、これが本質的にＢ細胞を剌激して分化させそし て該抗原に対する抗体（「免 疫グロブリン」）を生産させる。 宿主中の各Ｂ細胞はその表面上に異なる抗体を発現する。よって、或るＢ細胞 は或る抗原に特異的な抗体を発現し、別のＢ細胞は別の抗原に特異的な抗体を発 現するだろう。従って、Ｂ細胞は非常に多様であり、この多様性が免疫系にとっ て重要である。ヒトでは、各Ｂ細胞が無数の抗体分子（即ち約10⁷〜10⁸）を生産 することができる。そのような抗体産生は、最も典型的には外来抗原が中和され た時に停止する（または実質的に減少する）。しかし、時に、特定のＢ細胞の増 殖が衰えずに続くことがある。そのような増殖は「Ｂ細胞リンパ腫」と呼ばれる 癌を引き起こし得る。 Ｔ細胞とＢ細胞は共に、識別と同定のための「マーカー」として利用すること ができる細胞表面タンパク質を含んで成る。１つのそのようなヒトＢ細胞マーカ ーは、「CD20」と呼ばれるヒトＢリンパ球限定分化抗原Bp35である。CD20は初期 プレＢ細胞発達の間に発現され、形質細胞分化まで残存する。特に、CD20分子は 細胞周期開始と分化に必要とされる賦活過程の中の一段階を調節すると思われ、 通常、新生物性（「腫瘍」）Ｂ細胞上に非常に高レベルで発現される。CD20は、 定義上、「正常」Ｂ細胞と「悪性」Ｂ細胞（即ち衰えない増殖がＢ細胞リンパ腫 を引き起こし得るＢ細胞）の両方の上に存在する。よって、CD20表面抗原はＢ細 胞リンパ腫の「ターゲティング（標的指向）」の候補者として働く可能性を有す る。 本質的には、そのようなターゲティングは次のようにして発生させることがで きる：Ｂ細胞のCD20表面抗原に特異的な抗体を例えば患者に注射する。それらの CD20抗体は正常Ｂ細胞と悪性Ｂ細胞の両方（表向きは）のCD20表面抗原に特異的 に結合する。CD20表面抗原に結合した抗CD20抗体は新生物性Ｂ細胞の破壊と涸渇 を引き起こすことができる。その上、腫瘍を破壊する可能性を有する化学物質ま たは放射能標識が例えば新生物性Ｂ細胞に特異的に送達されるように、そのよう な物質を抗CD20抗体に接合することができる。アプローチにかかわりなく、主目 標は腫瘍を破壊することである。特定のアプローチは使用する特定の抗CD20抗体 により決定され得るので、従ってCD20抗原をターゲティングするための利用可能 なアプローチは異なり得る。 例えば、CD20表面抗原のターゲティングの試みが報告されている。報告によれ ばネズミ（マウス）モノクローナル抗体1F5（抗CD20抗体）を連続点滴静注によ りＢ細胞リンパ腫患者に投与した。報告によれば循環している腫瘍細胞を涸渇さ せるのに非常に高レベル（＞２グラム）の1F5が必要であり、結果は「一時的」 であると記載された。Pressら、“Monoclonal Antibody 1F5（Anti-CD20）Sero- therapy of Human B-Ce11 Lymphomas．”Blood 69/2:584-591(1987)。このアプ ローチに伴う潜在的問題は、非ヒトモノクローナル抗体（例えばマウスモノクロ ーナル抗体）が典型的にはヒトエフェクター機能を欠くこと、即ちそれらが特に 補体依存性細胞溶解を媒介したり抗体依存性細胞障害もしくはＦｃレセプター媒 介性食作用を通してヒト標的細胞を溶解したりできないことである。更に、非ヒ トモノクローナル抗体はヒト宿主により外来タンパク質として認識され得る。従 って、そのような外来抗原の反復注入は、有害な過敏性反応となる免疫応答を誘 導し得る。マウス由来のモノクローナル抗体については、これはヒト抗マウス抗 体応答または“HAMA”と呼ばれている。その上、それらの「外来」抗体は宿主の 免疫系によって攻撃され、その結果それらが標的部位に到達する前に事実上中和 されてしまうことがある。 リンパ球およびリンパ腫細胞は、幾つかの理由で放射線療法に対して本質的に 感受性である。放射能標識抗体のイオン化放射線の局 所放出は、抗原に結合した抗体の極めて近位に標的抗原（例えばCD20）を有する または有しない細胞を殺すことができ；透過性放射線は嵩張ったまたは血管形成 の乏しい腫瘍中の抗体への接近の制限という問題を除去することができ；そして 、必要とされる抗体の総量を減らすことができる。放射性核種は、細胞修復機構 が細胞を生存させておくことができない箇所に環状ＤＮＡに損傷を与えることが できる放射性粒子を発生する。従って、標的が腫瘍ならば、放射能標識は腫瘍細 胞を有利に殺傷する。放射能標識抗体は、定義によれば、患者（即ち可能な骨髄 移植）と健全な提供者（即ち放射能で処理する時に高度の注意を払う必要性）の 両方に対して用心する必要性がある放射性物質の使用を含む。 従って、Ｂ細胞障害の治療に効果的であるマウスモノクローナル抗体の能力を 改善するアプローチは、放射能標識または毒素が腫瘍部位に局在化されるように 標識または毒素を抗体に接合させることであった。例えば、上述のIF5抗体はヨ ウ素131（「¹³¹Ｉ」）で「標識」され、そして伝えられるところによれば２人の 患者で生体内分布について評価された。Eary，J.F.ら、“Imaging and Treatmen t of B-Cell Lymphoma”J．Nuc．Med．31/8:1257-1268（1990）を参照のこと。 またPress，O．W．ら、“Treatment of Refractory Non-Hodgkin's Lymphoma wi th Radiolabeled MB-1（Anti-CD37）Antibody”J．Clin．Onc．7/8:1027-1038(1 989)（¹³¹Ｉ標識IF-5で治療した１人の患者が「部分応答」を達成したことを指 摘している）；Goldenberg，D．M．ら、“Targeting，Dosi-metry and Radioimm unotherapy of B-Cell Lymphomas with Iodine-131-Labeled LL2 MonoClonal An tibody”J．Clin．Onc．9/4:548-564(1991)（複数回注射を受けた８人の患者の うちの３人がHAMA応答を発生したことを報告している）；Appelbaum，F．R． “Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin's L ymphoma”Hem./Onc．Clinics of N．A．5/5:1013-1025(1991)（総説文献）：Pre ss，O．W．ら、“Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Au tologous Bone Marrow Support．”New England Journal of Medicine 329/17:1 219-12223(1993)（ヨウ素131-標識抗CD20抗体IF5およびB1）およびKaminski，M ．G．ら“Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with ［¹³¹Ｉ］Anti-B1（An ti-CD20）Antibody”NEJM 329/7(1993)（ヨウ素¹³¹-標識抗CD20抗体B1；以後“K aminski”と称する）も参照のこと。 毒素（即ち、ドキソルビシンやミトマイシンＣのような化学療法剤）も抗体に 接合されている。例えば、ＰＣＴ出願公開WO 92/07466（1992年5月14日公開）を 参照のこと。 「接合」抗体の代わりとして、「キメラ」抗体、即ち２以上の異なる種（例え ばマウスとヒト）からの部分を含んで成る抗体が開発されている。例えば、Liu ，A．Y．ら、“Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody t o CD20 with PotentFc-Dependent Biologic Activity”J．Immun．139/10:3521- 3526(1987)は、CD20抗原に対して向けられたマウス／ヒトキメラ抗体を記載して いる。ＰＣＴ公報第WO 88/04936号も参照のこと。しかしながら、Ｂ細胞障害の 治療のためのそのようなキメラ抗体の能力、効力または実用性に関する情報は該 文献中に全く与えられていない。試験管内機能分析〔例えば補体依存性細胞溶解 （“CDC”）；抗体依存性細胞障害（“ADCC”）等〕は、特異抗原を発現してい る標的細胞を破壊または涸渇させるキメラ抗体の生体内能力を本質的に予測する ことはできないと言及されている。例えば、Robinsoｎ，R．D．ら、“Chimeric mouse-human anti-carcinoma antibodies that mediatedifferent anti-tumor c ell biological activities”，Hum．Anti- bod.Hybridomas 2.84-93(1991)（検出不可能なADCC活性を有するキメラマウス− ヒト抗体）を参照のこと。従って、キメラ抗体の治療効力は生体内実験によって のみ正しく評価することができる。 必要とされ且つ大きな技術進歩になると思われるものは、霊長類（ヒトを含む がそれに限定されない）におけるＢ細胞リンパ腫の治療のためにCD20抗原をター ゲティングする治療法である。 Ｃ．発明の要約 Ｂ細胞障害、特にＢ細胞リンパ腫の治療用に考案された治療法が本明細書中に 開示される。それらのプロトコールは、リンパ腫に関係するＢ細胞を含む末梢血 Ｂ細胞の涸渇のための免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体の投与；局在化されそ して末梢Ｂ細胞に関係づけられた腫瘍をターゲティングするための放射能標識抗 CD20抗体の投与；および協同的療法（組合せ療法）におけるキメラ抗CD20抗体と 放射能標識抗CD20抗体の投与に基づく。 Ｄ．図面の簡単な説明 図１は、免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体の生産に有用な縦列式キメラ抗体 発現ベクター（“TCAB 8”）の略図である。 図２Ａ〜２Ｅは、図１のベクターの核酸配列である。 図３Ａ〜３Ｆは、マウス軽鎖および重鎖可変領域を更に含んで成る図１のベク ター（“TCAE 8中の抗CD20”）の核酸配列である。 図４は、マウス抗CD20モノクローナル抗体2B8由来のマウス可変領域軽鎖の核 酸配列とアミノ酸配列（CDRとフレームワーク領域を含む）である。 図５は、マウス抗CD20モノクローナル抗体2B8由来のマウス可変領域重鎖の核 酸配列とアミノ酸配列（CDRとフレームワーク領域を 含む）である。 図６は、対照として標識Clq；標識Clqとマウス抗CD20モノクローナル抗体2B8 ；および標識ClqとヒトIgGl,kを含む、キメラ抗CD20抗体への蛍光標識ヒトClqの 結合を証明するフローサイトメトリー結果である。 図７は、キメラ抗CD20抗体とマウス抗CD20モノクローナル抗体2B8を比較する 補体依存性連細胞溶解の結果を示す。 図８は、キメラ抗CD20抗体と2B8を比較する生体内ヒトエフェクター細胞によ る抗体媒介性細胞障害の結果を示す。 図９Ａ．９Ｂおよび９Ｃは、0.4mg／kg（Ａ）：1.6mg／kg（Ｂ）；および6.4m g／kg（Ｃ）の免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体の点滴注入後の非ヒト霊長類 末梢血Ｂリンパ球涸渇の結果を与える。 図10は、特に、0.01mg／kgの免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体の点滴注入後 の非ヒト霊長類末梢血Ｂリンパ球涸渇の結果を与える。 図11は、Ｂ細胞リンパ芽球腫を使ったマウス異種移植モデルにおけるY2B8の殺 腫瘍性攻撃の結果を与える。 図12は、Ｂ細胞リンパ芽球腫を使ったマウス異種移植モデルにおけるC2B8の殺 腫瘍性攻撃の結果を与える。 図13は、Ｂ細胞リンパ芽球腫を使ったマウス異種移植モデルにおけるY2B8とC2 B8の組合せの殺腫瘍性攻撃の結果を与える。 図14Ａと14Ｂは、病気の部分緩解（14Ａ）および病気の微緩解（14Ｂ）を証明 する患者について或る期間に渡るＢ細胞集団涸渇の証拠となるC2B8の第Ｉ／II相 臨床分析からの結果を与える。 Ｅ．好ましい態様の詳細な説明 一般的に、抗体は２つの軽鎖分子と２つの重鎖分子から構成される。それらの 鎖は通常「Ｙ」字形を形成し、軽鎖と重鎖の両方がＹ のアーム部分を形成し、重鎖がＹのつけ根部分を形成している。軽鎖と重鎖は構 造的および機能的相同性の領域（ドメイン）に分けられる。軽鎖の可変領域（「 Ｖ_L」）と重鎖の可変領域（「Ｖ_H」）は認識と特異性を決定する。軽鎖の定常領 域（（「Ｃ_L」）と重鎖の定常領域（「Ｃ_H」）は重要な生物学的性質、例えば抗 体鎖会合、分泌、経胎盤移動性、Fcレセプター結合補体結合等を付与する。抗体 産生細胞における免疫グロブリン遺伝子発現をもたらす一連の現象は複雑である 。可変領域遺伝子配列は、「Ｖ_H」，「Ｄ」および「Ｊ_H」、または「Ｖ_L」およ び「Ｊ_L」と呼ばれる別々の生殖細胞系列遺伝子セグメントの中に位置している 。それらの遺伝子セグメントがＤＮＡ再配列により連結して、それぞれ重鎖およ び軽鎖中に現れる完全なＶ領域を形成する。次いで、再配列され連結されたＶセ グメント（Ｖ_L−Ｊ_LおよびＶ_H−Ｄ−Ｊ_H）が、それぞれ軽鎖および重鎖の完全な 可変領域または抗原結合領域をコードする。 抗CD20マウスモノクローナル抗体（1F5）を使ったヒトＢ細胞リンパ腫の血清 療法はPressらにより記載されている（69 Blood 584,1987，前掲）。この報告さ れた療法応答は不運にも一時的であった。更に、報告によれば、試験した患者の 25％が該血清療法に対してヒト抗マウス抗体（HAMA）応答を発生した。Pressら は、毒素または放射性同位体に接合したそれらの抗体が未接合抗体よりも長く持 続する臨床的利益を付与するかもしれないことを示唆している。 Ｂ細胞リンパ腫の消耗性作用と、この病気に実行可能な治療法を提供するごく 現実的な必要性のために、我々はアプローチ間を共通に結び付けるものとして特 定の抗体2B8を有する様々なアプローチに着手した。１つのそのようなアプロー チは、末梢血Ｂ細胞を容易に且つ効率的に再生させる哺乳動物系の能力を有利に 活用する。このアプローチを使って、我々は本質的にＢ細胞リンパ腫を除去する 手段として末梢血およびリンパ系組織中のＢ細胞を追放または涸渇させようと試 みる。特に免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体の使用によりこれを達成する。別 のアプローチでは、放射性標識による破壊のため腫瘍細胞をターゲティング（標 的指向）しようと試みる。 本明細書中で使用する時、用語「抗CD20抗体」は、典型的にはヒトＢリンパ球 限定分化抗原Bp35と命名された、一般的にCD20と呼ばれる35,000ダルトンの細胞 表面非グリコシル化リンタンパク質を特異的に認識する抗体である。本明細書中 で使用する時、抗CD20抗体に関して使用する時の用語「キメラ」は、最も好まし くは組換えデオキシリボ核酸技術を使って誘導され、ヒト（免疫学的「親類」種 、例えばチンパンジーを含む）成分と非ヒト成分の両方を含んで成る抗体を包含 する。キメラ抗体の定常領域は、最も好ましくは天然ヒト抗体の定常領域と実質 的に同じであり；キメラ抗体の可変領域は、最も好ましくは非ヒト源に由来し、 CD20細胞表面抗原に対する所望の抗原性と特異性を有する。非ヒト源は、ヒトCD 20細胞表面抗原またはヒトCD20細胞表面抗原を含んで成る物質に対する抗体を産 生させるのに使うことができる任意の脊椎動物源であることができる。そのよう な非ヒト源としては、齧歯類（例えばウサギ、ラット、マウス等）および非ヒト 霊長類（例えば類人猿、サル等）が挙げられるがそれらに限定されない。最も好 ましくは、非ヒト成分（可変領域）はマウス源に由来する。本明細書中で使用す る時、キメラ抗CD20抗体に関して使用する時の「免疫学的に活性な」という語は 、ヒトClqを結合し、ヒトＢリンパ系細胞系の補体依存性細胞溶解（“CDC”）を 媒介し、且つ抗体依存性細胞障害（“ADCC”）を通してヒト標的細胞を溶解する キメラ抗体を意味する。本明細書中で使用する時、「間接標識」および「間接標 識アプローチ」という用語は共に、キレート化剤が抗体に共有結合的に取り付け られ、そして該キレー ト化剤中に少なくとも１つの放射性核種が挿入されることを意味する。好ましい キレート化剤および放射性核種はSrivagtava，S．C．およびMease，R．C.，“Pr ogress in Research on Ligands，Nuclides and Techniques for Labeling Mono clonal Antibodies，”Nucl．Med．Bio．18/6: 589-603(1991)（“Srivagtava” ）中に記載されている。これは参考として本明細書中に組み込まれる。特に好ま しいキレート化剤は１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレント リアミンペンタ酢酸（“MX-DTPA”）であり：間接標識に特に好ましい放射性核 種としてはインジウム［111］とイットリウム［90］が挙げられる。本明細書中 で使用する時、「直接標識」および「直接標識アプローチ」という用語は、放射 性各種が抗体に共有結合的に直接取り付けられる（典型的にはアミノ酸残基によ って）ことを意味する。好ましい放射性核種は“Srivagtava”中に与えられてい る。直接標識に特に好ましい放射性核種は、チロシン残基によって共有結合的に 取り付けられるヨウ素［131］である。間接標識アプローチが特に好ましい。 本明細書中に開示される治療方法は、末梢血Ｂ細胞を迅速に回復または再生さ せる霊長類の免疫系の能力に基づいている。その上、霊長類の主要な免疫応答は Ｔ細胞により誘発されるので、免疫系が末梢血Ｂ細胞欠損を有する時は、「特別 な」用心（例えば患者の隔離など）の必要はない。霊長類の免疫系のそれらおよ び他の繊細さの結果として、我々のＢ細胞障害の治療方法は、免疫学的に活性な キメラ抗CD20抗体を使った末梢血Ｂ細胞の浄化（purging）を考慮に入れている 。 末梢血Ｂ細胞障害は、定義上、治療目的で血液に接近する必要性があることを 示し得るので、免疫学的に活性な抗CD20抗体と放射能標識抗CD20抗体の投与経路 は好ましくは非経口である。本明細書中 で使用する時、「非経口」なる用語は静脈内、筋内、皮下、直腸、膣内または腹 腔内投与を包含する。それらのうち静脈内投与が最も好ましい。 免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体と放射能標識抗CD20抗体は、典型的には、 標準技術により、医薬上許容される緩衝液、例えば無菌塩類溶液、無菌緩衝化水 、プロピレングリコール、前記のものの組合せ、等の中に提供されるだろう。非 経口投与可能な薬剤の調製方法はPharmaceutical Carriers & Formulations，Ma rtin，Remington's Pharmaceutical Sciences，第１５版（Mack Pub．Co.，Bast on，PA 1975）に記載されている。これは参考として本明細書中に組み込まれる 。任意の与えられた患者において独特の治療効果を生じさせるのに有用である免 疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体の特定の治療的有効量は、当業者に公知の標準 技術により決定することができる。 免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体の有効量（即ち治療的有効量）は、約0.00 1〜約30mg／kg体重、より好ましくは約0.0１〜約25mg／kg体重、最も好ましくは 約0.4〜約20.0mg／kg体重の範囲である。他の用量も実行できる。用量に影響を 及ぼす因子としては、病気の重度；前の治療方法；患者の全体的健康；存在する 他の病気等が挙げられるがそれらに限定されない。当業者は、特定の患者を評価 しそして前記範囲内に入る適当な用量、または必要ならば範囲の外側の用量を容 易に決定することができると思う。 それらの用量範囲での免疫学的に活性な抗CD20抗体の導入は、１回治療または 一連の治療として行うことができる。キメラ抗体に関しては、そのような導入が 一連の治療として実施されるのが好ましい。この好ましいアプローチは、この病 気に関係する治療方法論の上に基づいている。何ら特定の理論に結び付けようと しなくても、 免疫学的に活性な抗CD20抗体は免疫学的に活性であり且つCD20に結合するため、 個体への免疫学的に活性な抗CD20抗体の初回導入と同時に、末梢血Ｂ細胞涸渇が 始まるだろう。我々は、点滴注入治療後約24時間以内にほぼ完全なＢ細胞涸渇を 観察した。このため、患者への免疫学的に活性な抗CD20抗体（または放射能標識 抗CD20抗体）のその後の導入は、ａ）残っている末梢血Ｂ細胞を浄化する；ｂ） リンパ節からのＢ細胞涸渇を開始する；ｃ）他の組織源、例えば骨髄、腫瘍等か らのＢ細胞涸渇を開始すると推定される。繰り返し言うと、免疫学的に活性な抗 CD20抗体の反復導入を使うことにより、一連の現象が起こる。我々は、これらの 各現象を病気の有効治療に重要と見なした。第一の「現象」は、主に患者の末梢 血Ｂ細胞を実質的に涸渇させることを指令するものとして見なすことができ；次 の現象は主に、同時にもしくは連続的に系から残りのＢ細胞を浄化し、リンパ節 Ｂ細胞を浄化しまたは他の組織Ｂ細胞を浄化することを指令するものとして見な すことができる。 実際には、１回投薬は有利であって病気治療／管理に効果的に利用することが できるけれども、好ましい治療過程は数段階に渡り起こり、約2〜10週間に渡り 、最も好ましくは約４週間に渡り、１週間に１回、約0.4〜約20mg／kg体重の免 疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体が患者に投与される。 放射能標識抗CD20抗体に関しては、該抗体は非キメラであるのが好ましい。こ の好ましさは、マウス抗体と比較するとキメラ抗体の循環半減期が有意に長いこ とに基づいている（即ち、循環半減期が長ければ、放射性核種が長期間に渡り患 者内に存在する）。しかしながら、マウス抗体と比べてより低いミリキューリー （“mCi”）線量でキメラ抗体と組み合わせて使用することにより、放射性キメ ラ抗体を有利に使用することができる。この筋書きは、治療的効用を 維持しながら、許容できるレベルへの骨髄毒性の減少を考慮に入れている。 本発明には様々な放射性核種が適用でき、当業者は様々な状況下でどの放射性 核種が最も適当であるかを容易に決定する能力を有すると思われる。例えば、ヨ ウ素［131］は標的免疫療法に使われる公知の放射性核種である。しかしながら 、ヨウ素［131］の臨床的有用性は次に挙げる幾つかの因子により制限され得る ：８日の物理的半減期；血液中と腫瘍部位の両方におけるヨウ素化抗体の脱ハロ ゲン化；および腫瘍中への局在化された用量沈着にとって次善となり得る発光性 質（例えば多量のγ成分）。優れたキレート化剤の出現により、金属キレート化 基をタンパク質に取り付ける機会が、インジウム［131］やイットリウム［90］ といった他の放射性核種を利用する機会を増加させた。イットリウム［90］は、 放射性免疫療法応用への利用に幾つかの利点を提供する。イットリウム［90］の 64時間という半減期は腫瘍による抗体蓄積を可能にするのに十分長く、そして例 えばヨウ素［131］と異なり、イットリウム［90］は100〜1000細胞直径の組織の 範囲で、それの崩壊の間に全く付随のγ放射を伴わない高エネルギーの純粋なβ 発射体である。更に、透過する放射線の最小線量はイットリウム［90］標識抗体 の外来患者投与を考慮に入れる。また、細胞致死に標識抗体の介在を必要とせず 、そしてイオン化放射線の局所放出が標的抗原を欠く近隣の腫瘍細胞にも致死的 であるだろう。 イットリウム［90］に対する１つの非療法的制限は、それを使った画像診断を 難しくする有意なγ線の欠如に基づく。この問題を回避するために、イットリウ ム［90］標識抗CD20の治療線量の投与前に腫瘍の位置と相対的大きさを決定する のに「画像診断用」放射性核種、例えばインジウム［111］を使うことができる 。インジウム［111］は 診断用放射性核種として特に好ましい。何故なら、約1〜約10mCiの間は検出可能 な毒性を伴わずに安全に投与することができ；そして画像診断データは一般にそ の後のイットリウム［90］標識抗体の分布を予測する。大部分の画像診断研究は ５mCiインジウム［111］標識抗体を利用する。というのは、この線量は安全であ り且つ低線量に比較して増大された画像診断効率を有するからである。この場合 、最適な画像診断は抗体投与後３〜６日目に行う。例えば、Murray，J．L.，26 J．Nuc．Med．3328(1985)およびCarraguillo，J．A．ら，26 J．Nuc．Med．67(1 985)を参照のこと。 イットリウム［90］標識抗C20抗体の１回治療有効量（即ち治療的有効量）は 約5〜約75mCi、より好ましくは約10〜約40mCiの範囲である。ヨウ素［131］標識 抗C20抗体の非骨髄剥離的１回治療有効量は約5〜約70mCi、より好ましくは約5〜 約40mCiの範囲である。ヨウ素［131］標識抗C20抗体の剥離的１回治療有効量（ 即ち、自系骨髄移植を必要とし得る）は約30〜約600mCi、より好ましくは約50〜 約500mCi未満の範囲である。キメラ抗C20抗体と組み合わせた場合、マウス抗体 に比較してより長い循環半減期のため、ヨウ素［131］標識キメラ抗C20抗体の非 骨髄剥離的１回治療有効量は、約5〜約40mCi、より好ましくは約30mCi未満の範 囲である。例えばインジウム［111］標識の画像診断基準は、典型的には約５mCi 未満である。 放射能標識抗C20抗体に関しては、それを使った療法は１回療法処置または複 数回処置を利用して行うことができる。放射性核種成分のため、治療前に、放射 線から生じる潜在的に致死的な骨髄毒性を経験している患者については末梢幹細 胞（“PSC”）または骨髄（“BM”）を「収穫」することが好ましい。標準技術 を使ってBMおよび／またはPSCを収穫し、次いでパージし、そして可能な再注入 のために凍 結しておく。また、治療前に診断用標識抗体（例えばインジウム［111］を使っ たもの）を使って患者に診断的線量計測研究を行うことが最も好ましい。その目 的は、治療用標識抗体（例えばイットリウム［90］を使ったもの）がいずれかの 正常な器官または組織において不必要に「濃縮」されたりしないことを保証する ことである。 キメラマウス／ヒト抗体は記載されている。例えば、Morrison，S．L．ら、PN AS 11:6851-6854（1984年11月）；欧州特許公開第173494号；Boulianne，G.L． ら、Nature 312:642（1984年12月）；Neubeiger，M.S．ら、Nature 314:268（19 85年3月）；欧州特許公開第125023号：Tanら、J．Immunol．135:8564（1985年11 月）；Sun，L.K．ら、Hybridoma 5/1:517(1986)：Sahaganら、J．Immunol.137:1 066-1074(1986)を参照のこと。一般的には、Muron，Nature312:597 （1984年12 月）；Dickson，Genetic Engineering News5/3 （1985年3月）；Marx，Science 229，445（1985年8月）；およびMorrisoｎ，Science 229:1202-1207（1985年9月 ）を参照のこと。Robinsonらは、ＰＣＴ公開番号第WO 88/04936号において、ヒト 定常領域とマウス可変領域を有し、CD20のエピトープに対して特異性を有するキ メラ抗体を記載している。Robinson参考文献のキメラ抗体のマウス部分は2H7マ ウスモノクローナル抗体に由来する（γ2b，κ）。この参考文献は記載のキメラ 抗体がＢ細胞障害の治療に向けての「第一候補者」であることを記載しているが 、特にこの参考文献は治療効能の断定を支持するデータを欠いており、また重要 なことに、霊長類またはヒトといったより高等の哺乳動物を使ったデータも欠い ているため、この記述は、この提言がこの特定抗体に的確であるかどうかを決定 するための当業者への提言に過ぎないと見なすことができる。 キメラ抗体を作製する方法論は当業者に利用可能である。例えば、 別々のプラスミド中の免疫グロブリン軽鎖と免疫グロブリン重鎖を使って、軽鎖 と重鎖を別々に発現させることができる。次いでそれらを精製し、試験管内で完 全な抗体に構築することができる。そのような構築を達成するための方法論は記 載されている。例えば、Scharff，M.，Harvey Lectures 69:125(1974)を参照の こと。還元され単離された軽鎖と重鎖からIgG抗体を形成させるための試験管内 反応パラメーターも記載されている。例えば、Beychok，S.，Cells of Immunogl oblin Synthesis，Academic Press，New York，p．69，1979を参照のこと。完全 なH₂L₂ IgG抗体への重鎖と軽鎖の細胞内会合および連鎖を達成するために同一細 胞中での軽鎖と重鎖の同時発現も可能である。そのような同時発現は、同一宿主 細胞中で同一プラスミドまたは異なるプラスミドのいずれかを使って達成するこ とができる。 別のアプローチ、即ちキメラ非ヒト／ヒト抗CD20抗体を作製するための我々の 最も好ましいアプローチであるものは、ヒト起源の重鎖および軽鎖定常領域をコ ードするＤＮＡを最初から含有する発現ベクターの利用に基づく。そのようなベ クターは、様々な非ヒト抗CD20抗体を生成し、分泌しそして種々の特性（例えば 結合特異性の型、エピトープ結合領域等）について分析することができるように 、非ヒト可変領域をコードするＤＮＡの挿入を考慮に入れる。その後で、好まし いかまたは所望の抗CD20抗体からの軽鎖および重鎖可変領域をコードするｃＤＮ Ａを該ベクター中に組み込むことができる。本発明者らはそれらの型のベクター を縦列式キメラ抗体発現（“TCAE”）ベクターと呼ぶ。リンパ腫の治療処置のた めの免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体を生産するのに使用した最も好ましいTC AEベクターはTCAE 8である。TCAE 8は、本特許文書の譲渡人が所有するベクター （TCAE 5.2と命名）の誘導体であり、TCAE 5.2では 優性選択可能マーカー（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、“NEO”）の 翻訳開始部位が共通Kozak配列であり、TCAE 8ではこの領域が部分的に損傷され た共通Kozak配列であるという点が異なる。タンパク質発現に対するTCAEベクタ ー（“ANEXベクター”とも呼称される）の優性選択可能マーカーの開始部位の影 響に関する詳細は、本出願と一緒に出願された同時係属出願の中に詳細に開示さ れている。 TCAE 8は４つの転写カセットを含んで成り、それらは縦列に置かれ、即ち可変 領域を欠くヒト免疫グロブリン軽鎖；可変領域を欠くヒト免疫グロブリン重鎖； DHFR；およびNEOの順に置かれる。各転写カセットはそれ自身の真核プロモータ ーとポリアデニル化領域を含有する（TCAE 8ベクターの略図である図１を参照の こと）。詳しくは、 １）免疫グロブリン重鎖の前のＣＭＶプロモーター／エンハンサーは、−350 位のNheI部位から−16位のSstI部位まで、軽鎖の前のプロモーター／エンハンサ ーの先端が切り取られた変形である（41 Cell，521，1985を参照のこと）。 ２）ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域は、ＰＣＲ反応によるｃＤＮＡの増幅に よって誘導された。TCAE 8では、これはヒト免疫グロブリン軽鎖κ定常領域〔Ka bat番号付け法でアミノ酸108-214、アロタイプKm３（Kabat，E.A．“Sequences of proteins of immunological interest，”NIH Publication，第５版，No.91- 3242,1991を参照のこと）〕およびヒト免疫グロブリン重鎖γ１定常領域〔Kabat 番号付け法でアミノ酸114-478、アロタイプGmla，Gmlz〕であった。軽鎖は正常 ヒト血液（IDEC Pharmaceuticals Corpora-tion，La Jolla，CA）から単離され ；そこから得たＲＮＡを使ってｃＤＮＡを合成し、次いでＰＣＲ技術を使ってｃ ＤＮＡを増幅させ た（Kabatからの共通配列に関してプライマーを誘導した）。ヒトIgG1ベクター （３ Prot．Eng．531，1990；ベクター pNγ_I62）によりトランスフェクトされ た細胞から誘導されたＲＮＡから調製したｃＤＮＡから重鎖を単離した（ＰＣＲ 技術を使って）。Kabatからの共通アミノ酸配列と一致させるために、単離され たヒトIgG1中の２つのアミノ酸が変更され、即ち、アミノ酸225がバリンからア ラニンに（GTTからGCAに）変更され、そしてアミノ酸287がメチオニンからリジ ンに（ATGからAAGに）変更された。 ３）ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖カセットは、免疫グロブリン鎖の分泌 のために合成シグナル配列を含有する。 ４）ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖カセットは、転写解読枠を維持し且つ 免疫グロブリン鎖の中に通常見つかるアミノ酸を変更しないような軽鎖および重 鎖免疫グロブリン可変領域の挿入を考慮した特定のＤＮＡ制限部位を含有する。 ５）DHFRカセットは、それ自身の真核プロモーター（マウスβ−グロビン主要 プロモーター、“BETA”）とポリアデニル化領域（ウシ成長ホルモンポリアデニ ル化領域、“BGH）を含んだ。 ６）NBOカセットは、それ自身の真核プロモーター（BBTA）とポリアデニル化 領域（SV40初期ポリアデニル化領域、“SV”）を含んだ。 TCAE 8ベクターとNEOカセットに関しては、Kozak領域は部分的に損傷された共 通Kozak配列（上流のClaI部位を含む）であった： （TCAE 5.2ベクターでは、ClaIとATG領域の間に変更がある、即ちccAcc）。 TCAE 8の完全な配列表（４つの転写カセットの特定成分を含む）は図２に与え られる（配列番号１）。 当業者により認識されるように、TCAEベクターは、免疫学的に活性なキメラ抗 C20抗体を生産させる上で実質的に時間を削減することを考慮に入れる。非ヒト 軽鎖および重鎖可変領域の調製と単離、次いでそれらをヒト軽鎖定常転写カセッ トとヒト重鎖定常転写カセット中に組み込むことは、免疫学的に活性なキメラ抗 C20抗体の生産に備える。 本発明者らは、マウス源とハイブリドーマ技術を使って、CD20抗原に対する特 異性を有する最も好ましい非ヒト可変領域を誘導した。ポリメラーゼ連鎖反応（ 「ＰＣＲ」）技術を使って、マウス軽鎖および重鎖可変領域を直接TCAE 8ベクタ ー中にクローニングした。これはTCAEベクター中への非ヒト可変領域の組み込み のための最も好ましいルートである。この好ましさは主として、ＰＣＲ反応の効 率と挿入の精度に基づいている。しかしながら、この作業を達成する他の同等の 手順も利用可能である。例えば、TCAE 8（または同等のベクター）を使って、非 ヒト抗CD20抗体の可変領域の配列を得、次いで該配列の一部分、または適当なら ば全配列のオリゴヌクレオチド合成を行い、その後で、該部分または全合成配列 をベクター中の適当な位置に挿入することができる。当業者はこの作業を達成す る能力を有すると思う。 我々の最も好ましい免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体は、CD20に対するモノ クローナル抗体から誘導したマウス可変領域を含むTCAE 8ベクターの使用により 誘導した。この抗体（下記に詳細に記載する）は“2B8”と称する。TCAE 8中の2 B8から得られた可変領域の完全配列（“TCAE 8中の抗CD20”）は図３に記載され る（配列番号２）。 タンパク質発現に使う宿主細胞系は、最も好ましくは哺乳動物起源のものであ る。当業者はその中で発現させようとする所望の遺伝 子産物に最も適する特定の宿主細胞系を優先的に決定する能力を有すると思われ る。典型的な宿主細胞系としては、DG44とDUXBII（チャイニーズハムスター卵巣 細胞系、DHFR^-）、HELA（ヒト頸部癌）、CVI（サル腎臓系）、COS（SV40T抗原を 有するCVIの誘導体）、R1610（チャイニーズハムスター繊維芽細胞）、BALBC/3T 3（マウス繊維芽細胞）、HAK（ハムスター腎臓系）、SP2/0（マウスミエローマ ）、P3x63-Ag3.653（マウスミエローマ）、BFA-1c1BPT（ウシ内皮細胞）、RAJI （ヒトリンパ球）および293（ヒト腎臓）が挙げられるがそれらに限定されない 。宿主細胞系は典型的には商業施設から、the American Tissue Culture Collec tionからまたは発表された文献から入手することができる。 好ましくは、宿主細胞系はDG44（“CHO”）かSP2/0のいずれかである。Urland ，G．ら、“Effect of gamma rays and the dihydroforatereductase locus: de letions and inversions．”Som.Cell& Mol.Gen.12/6:555-566(1986)およびSchu lman，M．ら、“A better cellIine for making hybridomas secreting specifi c antibodies.”Nature 276:269(1987)をそれぞれ参照のこと。最も好ましくは 、宿主細胞系はDG44である。宿主細胞中へのプラスミドのトランスフェクション は、当業界で利用可能な任意の技術を使って達成することができる。それらとし ては、トランスフェクション（電気泳動およびエレクトロポレーションを含む） 、エンベロープＤＮＡを使った細胞融合、マイクロインジェクション、およびそ のままのウイルスによる感染が挙げられるがそれに限定されない。Ridgway，A.A .G.，“Mammalian Expression Vectors.” 第24.2章，470-472頁，Vectors，Ro driguesおよびDenhardt編（Butterworths，Boston，MA1988）を参照のこと。最 も好ましいのは、エレクトロポレーションによる宿主中へのプラスミド導入であ る。 Ｆ．実施例 次の実施例は、本発明を限定するつもりではなく、また本発明を限定すると解 釈してはならない。それらの実施例は、放射能標識抗CD20抗体（“I2B8”）；放 射能標識抗CD20抗体（“Y2B8”）；および特定ベクター（“TCAE 8”）とマウス 抗CD20モノクローナル抗体（“2B8”）由来の可変領域を使って誘導された免疫 学的に活性なキメラ抗CD20抗体（“C2B8”）、を使った用量イメージングを証明 するつもりである。 Ｉ．放射能標識抗CD20抗体2B8 Ａ．抗CD20モノクローナル抗体（マウス）産生（“2B8”） BALB/Cマウスを３〜４カ月の期間に渡る毎週の注射によりヒトリンパ芽球様 細胞系SB（Adams，R.A．ら、“Direct implantation and serial transplantati on of human acute IymphoblasticIeukemia in hamsters，SB-2.”Can．Res．28 :1121-1125(1968)を参照のこと；この細胞系はATCC受入れ番号ATCC CCL 120のも とにthe American Tissue Culture Collection，Rockville，MD．から入手可能 である）で繰り返し免疫処置した。既知のCD20特異抗体の阻害により測定した時 に抗CD20抗体（使用した抗CD20抗体は、Leu 16，Beckton Dickinson，San Jose ，CA，カタログNo.7670；およびB1，Coulter Corp.，Hialeah，FL，カタログNo. 6602201であった）の高血清力価を証明するマウスを同定した。次いでそのよう なマウスの牌臓を切除した。Einfeld，D.A．ら（1988）EMBO 7:711に記載された プロトコールに従って脾臓細胞をマウスミエローマSP2/0と融合させた（SP2/0は ATCC受入れ番号ATCC CRL 8006を有する）。 CD20特異性についてのアッセイはラジオイムノアッセイにより行われた。簡単 に言えば、Valentine，M.A．ら（1989）J．Biol．Chem． 264:11282に記載されたようなヨードビーズ法により、精製した抗CD20 B1を¹²⁵ Ｉで放射能標識した。（¹²⁵Ｉ−ヨウ化ナトリウム，ICN，Irvine，CA，カタログ No.28665H）。各々の融合ウエルからの培地0.05mlを、１％BSA，PBS（pH 7.4） 中の¹²⁵Ｉ標識抗CD20 B1（10 ng）0.05mlおよび100,000個のSB細胞を含む同緩衝 液0.05mlと一緒にインキュベーションすることにより、ハイブリドーマをスクリ ーニングした。室温で１時間インキュベーションした後、96ウエルのタイタープ レート（V＆P Scientific，San Diego，CA）に移すことにより細胞を収集し、徹 底的に洗浄した。未標識抗CD20 B1を含有する複製ウエルと阻害抗体を全く含ま ないウエルを、それぞれ正の対照と負の対照として使用した。50％阻害以上を含 有するウエルを増殖させ、クローニングした。クローニングした細胞系から最大 阻害を示す抗体が誘導され、これを“2B8”と命名した。 Ｂ．MX-DTPA接合体の調製 ｉ．MX-DTPA ¹⁴Ｃで標識された１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレント リアミンペンタ酢酸（“¹⁴Ｃ標識MX-DTPA”）を2B8への放射能標識の接合のため のキレート化剤として使用した。無金属条件を維持するためにMX-DTPAの操作を 行った。即ち、無金属試薬を使用し、そして可能な時には、Alconoxで洗浄しMil li-Q水で濯いだポリプロピレン製プラスチック容器（フラスコ、ビーカー、メス シリンダー、ピペットチップ）を同様に使用した。MX-DTPAをOtto Gansow博士（ National Institute of Health，Bethesda，MD）から乾燥固体形態として入手し 、４℃で乾燥保存した（遮光下で）。Milli-Q水中に２〜５mMの濃度の原液を調 製し、−70℃で保存した。MX-DTPAは水中の二ナトリウム塩としてCoulter lmmun ology（Hialeah，Florida）からも得られ、これを−70℃で保存した。 ii．2B8の調製 CENTRICON 30^TMスピンフィルター（30,000D，MWCO；Amicon）を使った繰り返 し緩衝液交換を利用して、150mM NaClを含む無金属の50mMバイシン−NaOH，pH 8 .6中に2B8抗体を移すことにより、MX-DTPAとの接合用の精製2B8を調製した。一 般に、該フィルター装置に50〜200μｌのタンパク質（10mg/nl）を加え、次いで ２mlのバイシン緩衝液を加えた。Sorval SS-34ローター中で４℃で該フィルター を遠心した（6,000 rpm，45分）。滞留液容量は約50〜100μｌであった。同フィ ルターを使ってこの工程を２回繰り返した。滞留液をポリプロピレン製1.5mlス クリューキャップ付試験管に移し、タンパク質について分析し、10.0mg/mlに希 釈し、使用まで４℃で保存した。上述のプロトコールを使って同様に該タンパク 質を150mM NaClと0.05％アジ化ナトリウムを含む50mMクエン酸ナトリウム，pH 5 .5中に移した。 iii．2B8とMX-DTPAの接合 2B8とMX-DTPAの接合は、周囲温度でポリプロピレン試験管中で実施した。凍結 したMX-DTPA原液を使用直前に解凍した。10mg/mlのタンパク質50〜200mlを、４ ：１のMX-DTPA：2B8のモル比においてMX-DTPAと反応させた。MX-DTPA原液を添加 しそして穏やかに混合することにより反応を開始した。接合は周囲温度で一晩（ 14〜20時間）進行させておいた。実施例Ｉ．Ｂ．ii．において上述したような0. 05％アジ化ナトリウムを含む無金属生理的食塩水（0.9％w/v）中への透析または 反復限外濾過により、接合体から未反応のMX-DTPAを除去した。タンパク質濃度 を10mg／mlに調整し、放射能標識するまでポリプロピレン試験管中に４℃で保存 した。 iv．MX-DTPA取り込みの測定 シンチレーションカウンティングしそして精製接合体を使って得 られた値を炭素［14］標識MX-DTPAの比活性と比較することにより、MX-DTPAの取 り込みを測定した。非放射性MX-DTPA（Coulter Immunology）を使用した幾つか の研究には、該接合体を既知濃度と既知比活性のイットリウム［90］の過剰の放 射性担体溶液と共にインキュベートすることにより、MX-DTPA取り込みを評価し た。 既知濃度の塩化イットリウムの原液を無金属の0.05 N HCl中に調製し、そこに 無担体のイットリウム［90］（塩化物塩）を加えた。この溶液のアリコートを液 体シンチレーションカウンティングにより分析し、この試薬の正確な比活性を決 定した。抗体に結合させようとするキレートのモル数の３倍に等しい塩化イット リウム試薬の量（典型的には２モル／モル抗体）をポリプロピレン試験管に加え 、２Ｍ酢酸ナトリウムでpHを4.0-4.5に調整した。次いで接合抗体を加え、混合 物を周囲温度で15〜30分間インキュベートした。20mM EDTAを１mMの最終濃度に 加えることにより反応を失活させ、そして２Ｍ酢酸ナトリウムを使って溶液のpH を約pH 6に調整した。 ５分間のインキュベーション後、全容量を高性能サイズ排除クロマトグラフィ ー（後述）により精製した。溶出されたタンパク質含有画分を合わせ、タンパク 質濃度を測定し、そしてアリコートを放射能についてアッセイした。塩化イット リウム［90］調製物の比活性とタンパク質濃度を使ってキレートの取り込みを算 出した。 ｖ．2B8-MX-DTPAの免疫反応性 全細胞ELISAを使って接合2B8の免疫反応性を評価した。対数期中期のSB細胞を 遠心により培養物から収得し、１×HBSSで２回洗浄した。細胞をHBSS中1〜2×10⁶ 細胞／mlに希釈し、50,000〜100,000細胞／ウエルになるように96ウエルのポリ スチレンマイクロタイタープレート中にアリコートに分けた。プレートを40〜45 ℃にて２時間真空乾燥して細胞をプラスチックに固定させた。使用す るまで該プレートを−20℃で保存した。アッセイ用に、使用直前にプレートを周 囲温度に温め、次いで１％BSAを含有する１×PBS，pH7.2-7.4でブロックした（ ２時間）。アッセイ用試料を１×PBS／１％BSA中に希釈し、プレートに添加し、 同緩衝液中に系列希釈（１：２）した。プレートを周囲温度で１時間インキュベ ートした後、１×PBSで３回プレートを洗浄した。二次抗体（ヤギ抗マウスIgGl 特異的HRP接合体、50μｌ）をウエルに添加し（１×PBS／１％BSA中１：1500希 釈液）、そして周囲温度で１時間インキュベートした。プレートを１×PBSで４ 回洗浄した後、ABTS基質溶液（0.01％ATBSと0.001％H₂O₂を含有する50mMクエン酸 ナトリウム、pH 4.5）を加えた。15〜30分間インキュベーション後、プレートを 405nmで読んだ。非特異的結合をモニタリングするために抗原陰性HSB細胞をアッ セイに含めた。吸光度値を各希釈率に対してプロットし、そして同一プレート上 で試験した未変性抗体から得られた値（100％免疫反応性を意味する）と比較す ることにより、該接合体の免疫反応性を計算した。滴定プロフィールの直線部分 上にある数個の値を比較し、平均値を決定した。 vi．インジウム［111］標識2B8-MX-DTPA（“I2B8”）の調製 無担体インジウム［111］を使って接合体を放射能標識した。0.05M HCl中の同 位体のアリコート（0.1〜2mCi／mg抗体）をポリプロピレン試験管に移し、約1／ 10容の無金属2M HClを加えた。５分間インキュベーション後、無金属２Ｍ酢酸ナ トリウムを加え、該溶液をpH 4.0-4.4に調整した。生理的食塩水中、または0.05 ％アジ化ナトリウムを含む50mMクエン酸ナトリウム／150mM NaCl中の10.0mg／ml DTPA原液から約0.5mgの2B8-MX-DTPAを加え、次いで該溶液を即座に穏やかに混 合した。pH試験紙で溶液のpHを調べ、4.0〜4.5の値であることを確認し、該混合 物を周囲温度で15〜30分間インキ ュベートした。次いで、20mM EDTAを１mMの最終濃度になるように加えることに より反応を失活させ、２Ｍ酢酸ナトリウムを使って反応混合物を約pH 6.0に調整 した。 5〜10分間のインキュベーション後、結合しなかった放射性同位体をサイズ排 除クロマトグラフィーにより除去した。HPLC装置は、それぞれWaters U6Kまたは Rheodyne 700注入弁を備えたWaters Model 6000またはTosoHaas Model TSK-6110 溶媒供給システムから成った。クロマトグラフィー分離は、ゲル浸透カラム（Bi oRad SEC-250；7.5×300mmまたは同等のTosoHaasカラム）とSEC-250ガードカラ ム（7.5×100mm）を使って実施した。このシステムに、フラクションコレクター （Pharmacia Frac200)および280nmフィルターを取り付けたＵＶモニター（Pharm acia model UV-1）を装備した。試料を適用し、１×PBS，pH 7.4を使って1.0ml ／分の流速で溶離させた。1/2ml画分をガラス試験管中に収集し、それらのアリ コートをγカウンター中でカウントした。上下の窓をそれぞれ100と500 KeVに設 定した。 溶出したタンパク質ピークに関連する放射能を加算し、そしてこの数をカラム から溶出された全放射能で割ることにより、放射能取り込みを算出した。次いで この値を百分率（％）として表した（データは示してない）。或る場合には、即 席薄層クロマトグラフィー（“ITLC”）を使って放射能取り込みを測定した。放 射能標識接合体を１×PBS中または１×PBS／１mM DTPA中に1：10または1：20希 釈し、次いで１μｌをITLC SG紙の１×５cm片の一端から1.5cmのところにスポッ トした。この紙をメタノール：水（1:1，v/v）中の10％酢酸アンモニウムを使っ た上昇クロマトグラフィーにより展開した。紙片を乾燥し、横に半分に切り、γ カウンティングにより各部分に結合した放射能を測定した。紙片の下半分に結合 した放射能（タン パク質結合放射能）を、上半分と下半分の両方の値を加算することにより決定さ れた全放射能の百分率として表した（データは示してない）。 放射能標識接合体の適当なアリコートの放射能を測定することにより、比活性 を決定した。この値をカウンター効率（典型的には75％）について補正し、280 nmでの吸光度により前に決定された該接合体のタンパク質濃度と関連させ、得ら れた値をmCi／mgタンパク質として表した。 ある実験では、上述のものと同様であるがHPLCによる精製を実施しないプロト コールに従って、2B8-MX-DTPAをインジウム［111］で放射能標識した。これを「 ミックス＆シュート」プロトコールと名付けた。 Vii．イットリウム［90］標識2B8-MX-DTPA（“Y2B8”）の調製 2 ng HClを使用しないこと以外、I2B8の調製について記載したのと同じプロト コールに従ってイットリウム［90］標識2B8-MX-DTPA（“Y2B8”）を調製した。 イットリウム標識接合体の全調製物は上述のものと同じサイズ排除クロマトグラ フィーにより精製した。 Ｃ．非ヒト動物実験 ｉ．放射能標識2B8-MX-DTPAの生体内分布 I2B８を６〜８週齢のBALB/cマウスにおいて組織分布について評価した。上述 の「ミックス＆シュート」プロトコールに従って臨床用2B8-MX-DTPAを使って放 射能標識接合体を調製した。該接合体の比活性は2.3mCi／mgであり、該接合体を 50mg／ml HSAを含むPBS，pH 7.4中に配合した。マウスに100μｌのI2B8（約21μ Ci）を静注し、３匹のマウスのグループを0，24，48および72時間目に頸部脱臼 により犠牲にした。犠牲後、尾、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉および大腿 を取り出し、洗浄し、重さを量った。分析のため血 液試料も採取した。各標本に結合した放射能をガンマカウンティングにより測定 し、次いで組織１ｇあたりの％注入線量を決定した。個々の器官に付随する血液 により与えられる活性寄与を割り引く試みは行わなかった。 別のプロトコールでは、４℃と30℃で10週間インキュベートした2B8-MX-DTPA のアリコートを両調製物について2.1mCi／mgの比活性になるようにインジウム［ 111］で放射能標識した。次いでそれらの接合体を上述と同じマウスでの生体内 分布実験に使用した。 線量計測のため、2B8-MX-DTPAを2.3mCi／mgの比活性になるようにインジウム ［111］で放射能標識し、そして約1.1μCiを20匹のBALB/cマウスの各々に注射し た。次いで、各々５匹のマウスから成るグループを1，24，48および72時間目に 犠牲にし、それらの器官を取り出し、分析用に調製した。加えて、皮膚、筋肉お よび骨の一部分を取り出し、分析用に処理し、尿と糞便も収集し、24〜74時間の 時点で分析した。 同様のアプローチを使って2B8-MX-DTPAをイットリウム［90］でも放射能標識 し、その生体内分布を72時間に渡りBALB/cマウスにおいて評価した。HPLCサイズ 排除クロマトグラフィーによる精製の後、各々５匹のマウスから成るグループに 臨床用に配合した約１μCiの接合体（比活性：12.2mCi／mg）を静注し、次いで1 ，24，48および72時間目にマウスを犠牲にし、それらの器官と組織を上述の如く 分析した。γシンチレーションカウンターを使って制動放射エネルギーを測定す ることにより、各組織標本に結合した放射能を決定した。次いで活性値を％注入 線量／ｇ組織としてまたは％注入線量／器官として表した。器官または他の組織 を繰り返しすすいで血液を除去したが、器官に灌流は行わなかった。よって、内 部に付随した血液により与えられる活性寄与について器官活性値を割り引かなか った。 ii．I2B8の腫瘍局在化 放射能標識2B8-MX-DTPAの局在化は、ラモスＢ細胞腫を有する無胸腺症マウス において測定した。６〜８週齢の無胸腺症マウスに、無胸腺症マウス中での増殖 用に前に順応させておいた1.2×10⁷個のラモスＢ細胞腫を含む0.1mlのRPMI-1640 を皮下注射（左後方側腹部）した。腫瘍は２週間以内に出現し、0.07〜1.1グラ ムの重さに及んだ。マウスに100μｌのインジウム［111］標識2B8-MX-DTPA（16. 7μCi）を静注し、0，24，48および72時間目に頸部脱臼により３匹のマウスのグ ループを犠牲にした。犠牲後、尾、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、大腿お よび腫瘍を取り出し、洗浄し、重さを量った。分析用に血液試料も採取した。各 標本に結合した放射能をγカウンティングにより測定し、％注入線量／ｇ組織を 測定した。 iii．放射能標識2B8-MX-DTPAを使った生体内分布 および腫瘍局在化実験 上述した予備的生体内分布実験（実施例Ｉ．Ｂ．viii．ａ．）に従って、接合 2B8をインジウム［111］で2.3mCi／mgの比活性に放射能標識し、およそ1.1μCi を20匹のBALB/cマウスの各々に注射して放射能標識物質の生体内分布を調べた。 続いて、各々５匹から成るグループを1，24，48および72時間目に犠牲にし、そ れらの器官と皮膚、筋肉および骨の一部分を取り出し、分析用に処理した。加え て、尿と糞便も収集し、24〜72時間の時点に渡り分析した。血液中の放射能レベ ルは、１時間目の40.3％の注入線量／ｇから72時間目には18.9％へと低下した（ データは示してない）。心臓、腎臓、筋肉および脾臓の値は実験の間中0.7〜9.8 ％の範囲にとどまった。肺に検出される放射能のレベルは、１時間目の14.2％か ら72時間目に 7.6％に減少し：同様に、それぞれの肺の注入線量／ｇの値は10.3％と9.9％であ った。それらのデータは、後述するI2B8の放射線吸収線量推定値を決定する際に 使用した。 12.2mCi／mg抗体の比活性を有するイットリウム［90］標識抗体の生体内分布 をBALB/cマウスにおいて評価した。＞90％の放射能取り込みが得られ、放射能標 識抗体をHPLCにより精製した。放射能の組織沈着を主要器官並びに皮膚、骨およ び尿と糞便において72時間に渡り評価し、そして％注入線量／ｇ組織として表し た。結果（示してない）は、血液に関係する放射能レベルが１時間目の約39.2％ 注入線量／ｇから72時間後はほぼ15.4％に低下し、一方で尾、心臓、肝臓、筋肉 および脾臓に関係する放射能は実験の間中10.2％またはそれ未満でまったく一定 のままであった。重要なことには、骨に関係する放射能は１時間目の4.4％の注 入線量／ｇ骨から72時間目の3.2％までに及んだ。それらの結果を合わせると、 該接合体に結合した遊離のイットリウムがほとんどなかったこと、そして遊離の 放射性金属がほとんど実験の間に放出されなかったことを示唆する。それらのデ ータは、後述するY2B8の放射線吸収線量推定値を決定する際に使用した。 腫瘍局在化実験のため、2B8-MX-DTPAを調製し、インジウム［111］で2.7mCi/m gの比活性に放射能標識した。100μｌの標識接合体（約24μCi）を、ラモスＢ細 胞腫を有する12匹の無胸腺症マウスの各々に注射した。腫瘍は0.1〜1.0グラムの 範囲であった。注射後0，24，48および72時間目の時点で眼窩後方穿刺により50 μｌの血液を採取し、そして尾、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、大腿およ び腫瘍を取り出した。組織を処理して重さを量った後、各組織標本に結合した放 射能をγカウンターにより測定し、ｇあたりの％注入線量として表した。 結果（示してない）は、¹¹¹In-2B8-MX-DTPAの腫瘍濃度が実験の進行の間中一 様に増加することを証明した。注入線量の13％が72時間後に腫瘍に蓄積された。 対比して、血液レベルは、０時での30％から72時間目の13％へと実験の間に低下 した。他の全ての組織（筋肉を除く）は、実験の終了までに1.3〜6.0％注入線量 ／ｇ組織を含んだ。筋肉組織は約13％注入線量／ｇを含んだ。 Ｄ．ヒト実験 ｉ．2B8と2B8-MX-DTPA ：ヒト組織を使った免疫組織学的研究 アセトンで固定した32の異なるヒト組織のパネルを使ってマウスモノクローナ ル抗体2B8の組織反応性を評価した。抗体2B8は、非常に限定された組織分布パタ ーンを有した抗CD20抗原と反応する。該抗原は、造血起源のものを含むリンパ系 組織中の細胞のサブセットにおいてのみ観察される。 リンパ節では、免疫反応性は皮質性成熟Ｂリンパ球集団と、胚中心の増殖細胞 において観察された。末梢血、扁桃のＢ細胞領域、脾臓の白色脾髄、および胸腺 中に見つかる髄質リンパ球の40〜70％で陽性の反応性が観察された。陽性の反応 性は大腸の粘膜固有層のリンパ小節（パイアー斑）においても認められた。最後 に、膀胱、乳房、頸、食道、肺、耳下腺、前立腺、小腸および胃を含む種々の器 官の支質中の集合または散在リンパ系細胞も、抗体2B8に陽性であった（データ は示してない）。 全ての単純な上皮細胞、並びに種々の器官の重層上皮および上皮は、非反応性 であることがわかった。同様に、大脳、脊髄および末梢神経中のものを含む神経 外胚葉細胞では全く反応性が観察されなかった。間葉要素、例えば骨格筋および 平滑筋細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、並びに多形核炎症細胞も陰性であることが わかった（データは示してない）。 アセトンで固定されている16のヒト組織のパネルを使って2B8-MX-DTPA接合体 の組織反応性を評価した。未接合抗体を使って前に証明されたように（データは 示してない）、2B8-MX-DTPA接合体は、高度に限定された分布パターンを示しリ ンパ系起源の細胞のサブセットの上にのみ見つかるCD20抗原を認識する。リンパ 節では、Ｂ細胞集団に免疫反応性が観察された。脾臓の白色脾髄と胸腺の髄質リ ンパ球において強い反応性が観察された。膀胱、心臓、大腸、肝臓、肺および子 宮中の散在リンパ球においても免疫反応性が観察され、これはそれらの組織中に ある炎症細胞の存在に起因するものであった。未接合抗体と同様に、神経外胚葉 細胞または間葉要素では全く反応性が観察されなかった（データは示してない） 。 ii．I2B8（画像診断）およびY2B8（治療）の臨床分析 ａ．第Ｉ／II相臨床実験：単一線量療法研究 I2B8（画像診断）の第Ｉ／II相臨床分析に続くY2B8の単一治療線量での処置を 目下実施している。単一線量研究では、次のスキームに従う： １．灌流による末梢幹細胞（PSC）または骨髄（BM）の収得； ２．I2B8画像診断； ３．Y2B8治療（３つの線量レベル）；および ４．PSCまたは自己BM移植（必要なら、連続３日間の500／mm³以下の絶体好中 球数または20,000／mm³以下の血小板数に基づいて、骨髄検査に関する骨髄回収 の証拠なしで） Y2B8の線量レベルは次の通りである： 線量レベル 線量（mCi） １ 20 ２ 30 ３ 40 最大耐容線量（“MTD”）の決定のため上記線量レベルの各々で３人の患者を 処置する。 画像診断（線量計測）実験を次の通り実施する：各患者を、２通りのI2B8を使 った生体内分布実験に含める。第一の実験では、２mgのI2B8（５mCi）を１時間 に渡り点滴静注（i.v.）として投与し、１週間後に2B8（即ち未接合抗体）を250 mg／時間を越えない速度でi.v.により投与し、その後すぐに２mgのI2B8（５mCi ）を１時間に渡りi.v.により投与した。両実験とも、I2B8点滴静注後すぐに、各 患者を画像診断し、画像診断をｔ＝14〜18時間（指摘した場合）；ｔ＝24時間； ｔ＝72時間；およびｔ＝92時間（指摘した場合）の時点で繰り返した。インジウ ム［111］標識についての全身平均保持時間を測定した。そのような測定を識別 可能な器官または腫瘍病巣（「着目領域」）についてもおこなった。 着目領域を該標識の全身濃度と比較する；この比較に基づいて、標準プロトコ ールを使ってY2B8の局在化と濃度の推定値を決定することができる。Y2B8の推定 蓄積線量が推定全身線量の８倍より大きければ、または肝臓の推定蓄積線量が15 00cGyを越えるならば、Y2B8を使った治療は行うべきでない。 画像診断実験が許容できれば、0.0または1.0mg／kg患者体重の2B8を点滴静注 により250mg／時間を越えない速度で投与する。この後、Y2B8（10，20または40m Ci）を20mCi／時間の点滴静注速度で投与する。 ｂ．第Ｉ／II相臨床実験：複数線量療法実験 Y2B8の第Ｉ／II相臨床分析を現在実施している。複数線量研究の場合、次のス キームに従っている： １．PSCまたはBMの収得； ２．I2B8画像診断 ３．４線量または80mCiの全蓄積線量でのY2B8治療（３線量レベル）；および ４．PSCまたは自己BM移植（臨床医の決定に基づく） Y2B8の線量レベルは次の通りである： 線量レベル 線量（mCi） １ 10 ２ 15 ３ 20 MTDの決定のため３人の患者を上記線量レベルの各々で処置する。 画像診断（線量計測）実験を次の通り実施する：最初の２人の患者を使って未 標識抗体（即ち2B8）の好ましい画像診断線量を決定する。最初の２人の患者に2 50ccの生理的食塩水中の100mgの未標識2B8を４時間に渡り投与し、次いで0.5mCi のI2B8を投与する--ｔ＝０、ｔ＝10分、ｔ＝120分、ｔ＝24時間およびｔ＝48時 間の時点で生体内分布データ用に血液をサンプリングする。ｔ＝２時間、ｔ＝24 時間およびｔ＝48時間の時点で患者を多領域γカメラ画像でスキャンする。ｔ＝ 48時間でスキャンした後、患者に上述と同様に250mgの2B8に次いで4.5mCiのI2B8 を投与する---次いで上述と同様に採血とスキャンニングを行う。100mgの2B8が 良好な画像を生成したら、次の２人の患者に上述と同様に50mgの2B8を投与し、 その後で0.5mCiのIB28、その48時間後に100mgの2B8、次いで4.5mCiのI2B8を投与 する。250mgの2B8が良好な画像を生成したら、次の２人の患者に上述と同様に25 0mgの2B8を投与し、その後で0.5mCiのIB28、その48時間後に500mgの2B8、次いで 4.5mCiのI2B8を投与する。その次の患者は最適な画像を生成する2B8の最小量で 処理する。最適な画像化は(1)抗体が最も遅く消失する最も効率的な画像化；(2) 単一器官中の区画化を最小にする最良分布；およ び(3)病変の最良の対象分解能（腫瘍／バックグラウンド対比）により定義され るだろう。 最初の４人の患者には、最終線量のI2B8の14日後に、第一の治療線量のY2B8を 開始する。その後の患者には、I2B8の２〜７日後に第一の治療線量のY2B8を開始 する。 Y2B8での処置の前に、最初の４人を除く患者には、上述と同様に2B8を投与し 、次いで5〜10分間に渡りY2B8を点滴静注により投与する。ｔ＝０、ｔ＝10分、 ｔ＝120分、ｔ＝24時間およびｔ＝48時間の時点で生体内分布用に血液をサンプ リングする。患者にほぼ６〜８週間毎にそれぞれの線量のYB28（第一の線量の場 合と同じ線量を投与する）を４線量の最大値または80mCiの全蓄積線量になるよ うに投与する。患者のWBCが3,000以上であり且つAGCが1000,000以上となるまで 、患者に次の線量のY2B8を投与しないことが最も好ましい。 ３線量レベル実験の完了の後、MTDの範囲を限定する。次いで追加の患者を実 験に登録し、MTDを投与する。 II．キメラ抗CD20抗体の産生（“C2B8”） Ａ．キメラ抗CD20免疫グロブリンＤＮＡ発現ベクターの作製 2B8マウスハイブリドーマ細胞からＲＮＡを単離し（Chomczynki，P．ら、“Si ngle step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol -chloroform extraction.’Anal.Biochem．162:156-159(1987)に記載された通り に）、そしてそれからｃＤＮＡを調製した。５′末端においてマウス軽鎖シグナ ル配列と相同性を有するＤＮＡプライマーと３′末端においてマウス軽鎖Ｊ領域 と相同性を有するＤＮＡプライマーのセットを使ったポリメラーゼ連鎖反応によ り、該ｃＤＮＡからマウス免疫グロブリン軽 鎖可変領域ＤＮΛを単離した。プライマー配列は次の通りであった： １． Ｖ_Lセンス（配列番号３） （下線を引いた部分はBgl II部位であり、上に線を引いた部分は開始コド ンである） ２． Ｖ_Lアンチセンス（配列番号４） ５’ TGC AGC ATC CGTACG TTT GAT TTC CAG CTT ３’ （下線を引いた部分はBsi WI部位である） TCAE 8中の対応するBgl II部位とBsi WI部位については図１と２を、そしてTCAE 8中の抗CD20中の対応する部位については図３を参照のこと。 生成したそれらのＤＮＡ断片を、TCAE 8ベクター中にヒトκ軽鎖定常領域の前 のところに直接クローニングし、配列決定した。マウス可変領域軽鎖について決 定されたＤＮＡ配列を図４（配列番号５）に示す。図３のヌクレオチド978〜136 2も参照のこと。図４は更に、このマウス可変領域、ＣＤＲおよびフレームワー ク領域のアミノ酸配列も提供する。2B8からのマウス軽鎖可変領域はマウスκVI ファミリーに属する。Kabat（前掲）を参照のこと。 同様にマウス重鎖可変領域を単離し、ヒトIgGl定常領域の前にクローニングし た。プライマーは次の通りであった： １． Ｖ_Hセンス（配列番号６） ５’GCG GCT CCC ACGCGT GTC CTG TCC CAG ３’ （下線を引いた部分はMlu I部位である） ２． Ｖ_Hアンチセンス（配列番号７） ５’GG(G/C)TGT TGT GCTAGC TG(A/C)(A/G)GA GAC (G/A)GT GA ３’ （下線を引いた部分はNhe I部位である） TCAE 8中の対応するMlu I部位とNhe I部位については図１と２を、そしてTCAB 8 中の抗CD20中の対応する部位については図３を参照のこと。 このマウス重鎖配列は図５（配列番号８）に示される。図３のヌクレオチド24 01〜2820も参照のこと。図５はこのマウス可変領域、ＣＤＲおよびフレームワー ク領域のアミノ酸配列も提供する。2B8からのマウス重鎖可変領域はマウスVH 2B ファミリーに属する。Kabat（前掲）を参照のこと。 Ｂ．キメラ抗CD20産生CHOおよびSP2/0トランスフェクトーマの作製 チャイニーズハムスター卵巣（“CHO”）細胞DG44はヒポキサンチンとチミジ ンを欠くSSFM II培地（Gibco，Grand Island，NY，FormNo.91-0456PK）中で増殖 させ；SP2/0マウスミエローマ細胞は５％ウシ胎児血清と20ml／lのグルタミンが 補足されたダルベッコ改良イーグル培地（“DMEM”）（Irvine Scientific，San ta Ana，Ca.，カタログNo.9024）中で増殖させた。0.4mlの使い捨てキュベット 中でBTX 600エレクトロポレーション装置（BTX，San Diego，CA）を使って、Not Iで制限された25μｇのCHOまたは50μｇのSP2/0プラスミドＤＮＡを用いて400 万個の細胞をエレクトロポレーションした。条件は、CHOの場合は210ボルトまた はSP2/0の場合は180ボルト、400マイクロファラデー、13オームであった。各エ レクトロポレーション物を６枚の96ウエルプレート中に置いた（約7,000細胞／ ウエル）。エレクトロポレーションの２日後とコロニーが形成するまでそれから ２または３日後に、CHOの場合は400μｇ/ml活性化合物またはSP2/0の場合は800 μｇ/mlにおいてG418（GENETICIN，Gibco，カタログNo.860-1811）を含有する培 地（培地は更に50μMヒポキサンチンと８μMチミジンを含有する）をプレートに 供給し た。コロニーからの上清を、ヒト抗体に特異的なBLISAによりキメラ免疫グロブ リンの存在についてアッセイした。最大量の免疫グロブリンを生産するコロニー を増殖させ、メトトレキセート（SP2/0の場合は25nM、CHOの場合は５nM）を含む 培地を入れた96ウエルプレート中で平板培養し、２または３日毎に栄養補給した 。上述の通り上清をアッセイし、最大量の免疫グロブリンを生産するコロニーを 増殖させた。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使って上清から キメラ抗CD20抗体を精製した。 精製したキメラ抗CD20抗体をポリアクリルアミドゲル中での電気泳動により分 析し、約95％より高い純度であると見積もった。2B8を基準にしてキメラ抗体の 親和性と特異性を測定した。直接および競合結合アッセイにおいて試験したキメ ラ抗CD20抗体は、マウス抗CD20モノクローナル抗体2B8と比較すると、多数のCD2 0陽性Ｂ細胞系に対して同等の親和性と特異性を証明した（データは示してない ）。¹²⁵Ｉ放射能標識キメラ抗CD20の直接結合により該キメラ抗体の見かけの親 和定数（“Kap”）を決定し、Scatchard プロットにより放射能標識2B8と比較し た。推定KapはCHOで生産されたキメラ抗CD20抗体については5.2×10^-9Ｍであり 、SP2/0で生産された抗体については7.4×10^-9Ｍであった。2B8についての推定K apは3.5×10^-9Ｍであった。ラジオイムノアッセイによる直接競合分析を使って 、2B8と効率的に競争する能力を比較することにより、該キメラ抗体の特異性と 免疫反応性の保持の両方を確かめた。Ｂ細胞上のCD20抗原への結合を50％阻害す るのに実質的に当量のキメラ抗CD20抗体と2B8抗体が必要であった（データは示 してない）。即ち、おそらくキメラ化によるのであろう抗CD20抗体の阻害活性の 損失は最少であった。 実施例II．Ｂ．の結果は、特に、キメラ抗CD20抗体がTCAB 8ベクタ ーを使ってCHOおよびSP2/0 トランスフェクトーマから生産され、そしてそれら のキメラ抗体がマウス抗CD20モノクローナル抗体2B8と実質的に同じ特異性と結 合力を有したことを指摘している。 Ｃ．キメラ抗CD20抗体の免疫学的活性の測定 ｉ．ヒトClq分析 CHOとSP2/0の両細胞系により生産されたキメラ抗CD20抗体を、フルオレセイン 標識Clq（ClqはQuidel，Mira Mesa，CA，Prod．No.A400から得られ、そしてFITC 標識はSigma，St．Louis MO，Prod．No．F-7250から得られた）を使ったフロー サイトメトリーアッセイにおいてヒトClq結合について評価した。ClqのFITC標識 は、Selected Methods In Cellular Immunology，Michell & Shiigi編（W.H．Fr eeman & Co.，San Francisco，CA，1980，p.292）に記載されたプロトコールに 従って行った。Becton Dickinson FACScan^TMフローサイトメーターを使って分析 結果を誘導した（515〜545nmの領域に渡ってフルオレセインを測定した）。当量 のキメラ抗CD20抗体、ヒトIgGl、κミエローマタンパク質（Binding Site，San Diego，Ca，Prod．No．BP078）および2B8を当量数のCD20陽性SB細胞と共にイン キュベートし、次いでFACS緩衝液（PBS中0.2％BSA，pH 7.4，0.02%アジ化ナトリ ウム）での洗浄段階により未結合抗体を除去し、次いでFITC標識Clqと共にイン キュベートした。30〜60分間のインキュベーション後、細胞を再び洗浄した。対 照としてFITC標識Clqを含む３条件を、製造業者の取扱説明書に従ってFACScan ^{T M} 上で分析した。結果を図６に与える。 図６の結果として、キメラ抗CD20抗体条件についてのみ蛍光の有意な増加が観 察された。即ち、付着性キメラ抗CD20抗体を有するSB細胞のみがClq陽性であり 、一方他の条件は対照と同じパターンを生じた。 ii．補体依存性細胞溶解 キメラ抗CD20抗体をヒト血清（補体源）の存在下でリンパ腫細胞系を溶解する 能力について分析した。100μCiの⁵¹Crと1×10⁶個のSB細胞を37℃で１時間混合 することにより、CD20陽性SB細胞を⁵¹Crで標識した。次いで標識SB細胞を、当量 のヒト補体と当量（0〜50μｇ/ml）のキメラ抗CD20抗体または2B8のいずれかの 存在下で37℃にて４時間インキュベートした（Brunner，K.T．ら、“Quantitati ve assay of the Iytic action of immune Iymphoid cells on ⁵¹Cr-Iabeled al logeneic target cells in vitro.”Immunology 14:181-189(1968)を参照のこと ）。結果を図７に与える。 図７の結果は、特に、キメラ抗CD20抗体がそれらの条件下で有意な溶解（49％ ）をもたらすことを示す。 iii．抗体依存性細胞障害エフェクターアッセイ このアッセイには、CD20陽性細胞（SB）とCD20陰性細胞〔Ｔ細胞白血病系HSB ； Adams，Richard，“Formal Discussion，”Can．Res．27:2479-2482(1967)を 参照のこと；ATCC寄託番号ATCC CCL 120.1〕を使用した。両者を⁵¹Crで標識した 。Brunner，K.T．ら、“Quantitative assay of the Iytic action of immune I ymphoid cells on ⁵¹Cr-Iabeled allogeneic target cells in vitro；inhibiti on by isoantibody and drugs．”Immunology 14:181-189(1968)中に記載された プロトコールに従って分析を行った。37℃で４時間のインキュベーションの終わ りにCD20陽性SB標的細胞（⁵¹Cr標識したもの）の実質的なキメラ抗CD20抗体依存 性細胞媒介性溶解を観察し、そしてこの作用をCHOとSP2/0により生産された抗体 の両方について観察した（エフェクター細胞はヒト末梢リンパ球であり；エフェ クター細胞：標的の比は100：1であった）。標的細胞 の効率的溶解は3.9μｇ/mlにおいて観察された。これに対して、同一条件下で、 マウス抗CD20モノクローナル抗体2B8は統計上有意でない作用を有し、そしてCD2 0陰性HSB細胞は溶解されなかった。結果を図８に与える。 実施例IIの結果は、特に、実施例Ｉのキメラ抗CD20抗体が免疫学的に活性であ ったことを示す。 III．キメラ抗CD20を使った生体内Ｂ細胞の涸渇 Ａ．非ヒト霊長類実験 ３種類の別々の非ヒト霊長類実験を実施した。便宜上、それらを「キメラ抗CD 20：CHO&SP2/0」、「キメラ抗CD20：CHO」および「高用量キメラ抗CD20」と名付 ける。条件は次の通りであった。キメラ抗CD20：CHO&SP2/0 4.5〜7kgの体重を有する６匹のマカクザル（White Sands Research Center，A lamogordo，NM）を各々２匹のサルの３グループに分けた。各グループの両方の サルに同用量の免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体を投与した。各グループの一 方のサルにはCHOトランスフェクトーマにより生産された精製抗体を投与し、他 方のサルにはSP2/0により生産された抗体を投与した。３つのグループには、連 続４日間に渡りそれぞれ0.1mg／kg、0.4mg／kgおよび1.6mg／kgに相当する抗体 量を毎日投与した。免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体は、生理的食塩水と混合 して点滴静注により投与した。各点滴静注の前に血液試料を採取した。最後の注 入の24時間後（Ｔ＝０）に始まり、その後第１，３，７，14および28日にも追加 の血液試料を採取した。血液試料はその後、第90日に実験が終了するまで二週間 間隔で採取した。 各動物からの約５mlの全血を2000 RPMで５分間遠心分離した。可 溶性キメラ抗CD20抗体レベルのアッセイ用に血漿を除去した。ペレット（末梢血 白血球と赤血球を含有する）は蛍光標識抗体分析用にウシ胎児血清中に再懸濁し た（下記の「リンパ系細胞集団の蛍光抗体標識」を参照のこと）。 キメラ抗CD20：CHO 4.5〜6kgの体重を有する６匹のマカクザル（White Sands）を各々２匹のサル の３グループに分けた。全動物にCHOトランスフェクトーマにより生産された免 疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体（無菌の食塩水中）を投与した。３つのグルー プを次の通りに分けた：サブクループ１には４日間に渡り0.01mg／kgの抗体を毎 日静注し；サブクループ２には４日間に渡り0.04mg／kgの抗体を毎日静注し；サ ブクループ３には6.4mg／kgの抗体を１回静注した。３つのサブグループ全てに ついて、処置の開始前に血液試料を得、更に、上述のような最後の注射後のＴ＝ ０，１，３，７，14および28日目においても血液試料を採取した。それらの試料 を蛍光標識抗体分析用に処理した（下記の「蛍光抗体標識」を参照のこと）。末 梢血Ｂ細胞の定量に加えて、最後の注射後７，14および28日目にリンパ節生検試 料を取り、そして単細胞集団をフローサイトメトリーによるリンパ球集団の定量 用に染色した。 高用量キメラ抗CD20 ２匹のマカクザル（White Sands）に、CHO トランスフェクトーマから生産さ れた16.8mg／kgの免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体（無菌の食塩水中）を連続 ４週間の期間に渡り毎週点滴注入した。処置の終わりに、骨髄切除のために両動 物を麻酔した。リンパ節生検試料も取った。両方の組織セットを、Ling，N.R． ら、“B-cell and plasma cell antigens.’Leucocyte Typing III White Cell Differentiation Antigens，A.J．McMichael編（Oxford University Press，Oxford UK，1987），p.302に記載されたプロトコールに従って、Ｂリン パ球の存在下でフローサイトメトリーによりLeu 16で染色した。 リンパ系細胞集団の蛍光抗体標識 血漿の除去後、白血球をハンクス平衡塩類溶液（“HBSS”）で２回洗浄し、血 漿と同容量のウシ胎児血清（56℃で30分間熱不活性化したもの）中に再懸濁する 。この細胞調製物の0.1ml容量を６本の15ml遠心管の各々に分配した。Ｔおよび Ｂリンパ球集団を同定するために、ヒトリンパ球表面マーカーCD2（AMAC，Westb rook，MB）、CD20（Becton Dickinson）およびヒトIgM（Binding Site，SanDieg o，CA）に対して特異性を有する蛍光標識モノクローナル抗体を３本の試験管に 加えた。全ての試薬は対応するサルリンパ球抗原に陽性であることを前に試験し ておいた。４本目の試験管において、フィコエリスリンと接合させたポリクロー ナルヤギ抗ヒトIgG（AMAC）を使って、サルＢ細胞表面CD20に結合したキメラ抗C D20抗体を測定した。この試薬は、サルIgに対する交差反応性を除去するために サルIg−セファロースカラム上に予備吸着させてあり、よって細胞に結合したキ メラ抗CD20抗体の特異的検出および定量が可能である。５本目の試験管は、二重 染色Ｂ細胞集団のために抗IgMと抗ヒトIgG試薬の両方を含んだ。６本目の試験管 は自己蛍光の測定のために全く試薬を含まなかった。細胞を蛍光抗体と共に30分 間インキュベートし、洗浄し、そして0.5mlの固定緩衝液（0.15M NaCl，１％パ ラホルムアルデヒド，pH 7.4）で固定し、そしてBecton DicKinson FACScan^TM装 置上で分析した。未標識の白血球を使ったドットプロットビット地図において前 方対直角光散乱器により最初にリンパ球集団が同定された。次いで他の全ての現 象をゲート制御することにより、全リンパ球集団が単離された。その後の蛍光測 定 は、ゲート制御されたリンパ球特異的現象のみを反映した。 末梢血Ｂリンパ球の涸渇 生体内のＢ細胞を涸渇させることにおいてCHOとSP2/0により生産された抗体の 効力の間には何ら観察できる差は確認できなかったが、CHO トランスフェクトー マから誘導されたキメラ抗CD20抗体を1.6mg／kgと6.4mg／kgの用量レベルで注射 したサルと、SP2/0により生産された抗体を0.4mg／kgの用量レベルで注射したサ ルについては、第７日後に始まるＢ細胞再生のわずかな増加が観察された。図９ Ａ，ＢおよびＣはキメラ抗CD20：CHO&SP2/0実験から得られた結果を与え；図９ Ａは0.4mg／kg用量レベルに向けられ；図９Ｂは1.6mg／kg用量レベルに向けられ ；そして図９Ｃは6.4mg／kg用量レベルに向けられる。 図９から明らかなように、全ての試験用量範囲に渡って治療処置後に末梢血Ｂ 細胞レベルの大幅な減少（＞95％）が認められ、それらのレベルが注入後７日間 まで維持された。この期間の後でＢ細胞再生が始まり、そして再生開始の時期は 用量レベルに無関係であった。 キメラ抗C20：CHO実験では、４回の毎日の注射（合計0.04mg／kg）に渡り1/10 の抗体用量濃度（0.01mg／kg）を使用した。図10はこの実験の結果を与える。こ の用量は、抗表面IgMまたはLeu 16抗体のいずれかを使って推定される正常レベ ルの約50％へ末梢血Ｂ細胞集団を涸渇させた。この結果は、免疫学的に活性なキ メラ抗CD20を使って非ヒト霊長類に対してこの期間に渡りこの用量濃度でＢリン パ球集団上のCD20抗原の飽和が達成されなかったことも示す。治療処置後最初の ３日間の間は血液試料中に該抗体で覆われたＢリンパ球が検出された。しかしな がら、７日目までには、抗体で覆われた細胞は検出できなくなった。 表Ｉは、末梢血集団に対する免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体の単一用量お よび複数用量の結果を要約する。単一用量条件は6.4mg／kgであり；複数用量条 件は連続４日間に渡る0.4mg／kgであった（それらの結果は上述のサルから誘導 された）。 表Ｉに要約したデータは、抗体過剰の条件下での末梢血中のＢ細胞の涸渇が単 一または複数用量レベルにかかわらず迅速且つ効率的に起こったことを示す。更 に、最後の注射後少なくとも７日間は涸渇が観察され、21日目までに部分的なＢ 細胞再生が観察された。 表IIは、表Ｉの治療方法を使ったリンパ節の細胞集団に対する免疫学的に活性 なキメラ抗CD20抗体の効果を要約する（0.4mg／kgの４日分量；6.4mg／kgの１回 量）；正常リンパ節（対照サル、腋窩およびそ径部）および正常骨髄（２匹のサ ル）についての比較値も提供する。 表IIの結果は、両治療方法についてＢリンパ球の効率的涸渇を証明する。表II は更に、非ヒト霊長類について免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体によるリンパ 系組織中のＢ細胞の完全な飽和が達成されなかったことも示す。その上、抗体で 覆われた細胞が処置後７日目に観察され、次いで14日目にはリンパ節Ｂ細胞の著 しい涸渇が観察された。 このデータに基づき、主に薬物学／毒物学測定の方に目を向けながら、上記に 言及した単一高用量キメラ抗CD20実験を実施した。即ち、この実験はキメラ抗体 の投与に関連する何らかの毒性、並びに末梢血リンパ節と骨髄からのＢ細胞涸渇 の効力を評価するために実施した。更に、表IIのデータは、その実験で、処置後 7〜14日目にリンパ節Ｂ細胞の大部分が涸渇され、毎週投薬法がより有効な結果 を示すかもしれないことを指摘する。表IIIは高用量キメラ抗CD20実験の結果を 要約する。 ^aLeu 16で染色された集団を示す。^b 表面IgM細胞とキメラ抗体で覆われた細胞に陽性である、二重染色集団を示す。^c 二重染色する表面IgM陽性細胞と単一染色する（表面IgM陰性）細胞を含む、キ メラ抗体に染色する全集団を示す。^d 最後の16.8mg／kg用量の注射後の日数。 両動物とも、対照リンパ節の場合の40％（上記表II参照）に比べて、治療停止 後22日目に５％未満のＢ細胞を含むことを証明した。同様に、キメラ抗CD20抗体 で治療した動物の骨髄では、正常動物の 場合の11〜15％（上記表II参照）に比べて、CD20陽性細胞のレベルが３％未満で あった。治療停止後36日目に評価した動物では、そのうちの１匹（Ｈ）はリンパ 節中に約12％のＢ細胞と骨髄中に4.4％のＢ細胞を有しており、別の動物（Ｈ） はリンパ節中に約５％のＢ細胞と骨髄中に0.8％のＢ細胞を有していた。このデ ータは有意なＢ細胞涸渇を示している。 実施例III．Ａ．の結果は、特に、免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体が霊長 類において長期の末梢血Ｂ細胞涸渇を引き起こすことを指摘する。該データはま た、該抗体の高用量を反復投与した時、末梢リンパ節と骨髄においてＢ細胞集団 の有意な涸渇が達成されたことも示す。試験動物に対して継続して行った追跡調 査は、治療の第一週の間にそのような末梢Ｂリンパ球の著しい涸渇があってさえ も、何ら健康に悪影響が観察されなかったことも示した。更に、Ｂ細胞集団の再 生が観察されたため、この治療によってそれらの霊長類の多能性幹細胞に悪影響 はなかったという結論が引き出される。 Ｂ．C2B8の臨床分析 ｉ．C2B8の第Ｉ／II相臨床実験：単一用量療法研究 組織学的に実証されたＢ細胞リンパ腫を有する15人の患者を第Ｉ／II相臨床実 験においてC2B8で処置した。用量増加実験において各患者に単一用量のC2B8を投 与した；次の用量：10mg／m²；50mg／m²；100mg／m²；250mg／m²および500mg／m² につき３人の患者を使用した。処置は、生理的食塩水中250ccの最終容量または 1mg／mlの最大濃度に希釈されたC2B8を、0.22ミクロンの並列フィルターを通し て点滴静注することにより行った。初期速度は最初の１時間の間50cc／時であっ た。全く毒性が観察されなければ、投与速度を最大200cc／時まで上げることが 可能であった。 毒性（臨床医により指摘される）は「無し」、「軽度」、「中程 度」（２人の患者）そして「重度」（１人の患者）に渡った。全患者が治療処置 を完了した。特にＴ細胞とＢ細胞に対するC2B8の効果を測定するために、末梢血 リンパ球を分析した。全患者に一貫して、C2B8の点滴注入後に末梢血Ｂリンパ球 が涸渇され、そしてそのような涸渇は二週間を越えて維持された。 １人の患者(100mg／m²のC2B8を投与）は、C2B8処置に対して部分的応答（ＰＲ ）（全ての測定可能な指標病巣の垂直直径の積の和に、４週間以上持続する50％ 以上の減少が観察され、その期間の間は全く新たな病巣が出現せず、現存する病 巣はいずれも拡大しないであろう）を証明した。また、少なくとも１人の患者（ 500mg／m²を投与）はC2B8処置に対してわずかな応答（ＭＲ）（全ての測定可能 な指標病巣の２つの最長垂直直径の積の和に、少なくとも25％で且つ50％未満の 減少が観察される）を証明した。表示効率について、PBLの結果を図14に与える ；ＰＲを示す患者のデータを図14Ａに与え；ＭＲを示す患者のデータを図14Ｂに 与える。図14において次の 上の期間に渡りＢ細胞マーカーCD20とCD19、カッパおよびラムダが涸渇された。 Ｔ細胞数のわずかな初期減少があったが、それらは比較的速い時間枠においてほ ぼ基準線レベルに戻った。 ii．C2B8の第Ｉ／II相臨床実験：複数用量療法研究 測定可能な進行性疾患を伴う組織学的に確証されたＢ細胞リンパ腫を有する患 者は、２部に分けられるこの実験に適格である。第Ｉ相は、用量制限する毒性を 特徴づけるための用量増加と生物学的に活性な耐容量レベルの決定から成り、こ の段階では３人の患者から成るグループに合計４回の点滴静注による毎週の点滴 静注を行う。 ３レベルの各々における蓄積量は次の通りである：500mg／m²（125mg／m²／点滴 注入）；1000mg／m²（250mg／m²／点滴注入）；1500mg／m²（375mg／m²／点滴注 入）。生物学的に活性な耐容用量は、耐容できる毒性と適度の活性の両方を有す る最低用量として定義され、決定されるだろう。第II相では、C2B8の４回量の活 性を決定することに重点をおいて、追加の患者に生物学的に活性な耐容用量を投 与する。 VI．組合せ療法：C2B8とY2B8 Ｂ細胞リンパ芽球腫（ラモス腫瘍細胞）を使用するマウス異種移植モデル（nu /nuマウス、雌、約10週齢）において、C2B8とY2B8を使った組合せ療法アプロー チを研究した。比較目的で、別のマウスもC2B8とY2B8で処置した。 ラモス腫瘍細胞（ATCC，CRL 1596）を、10％ウシ胎児血清とグルタミンが補足 されたRPMI-1640を使って37℃および５%CO₂にて培養することにより維持した。2 5ｇの針が付けられた１ccの注射器を使って0.10mlの容量（HBSS）で1.7×10⁶個 のラモス細胞を皮下注射することにより、7〜10週齢の９匹の雌ヌードマウス中 に腫瘍を発生させた。全ての動物は層状フローフードの中で処理し、そして籠、 寝床、餌および水は全てオートクレーブ処理した。腫瘍を切除しそして40メッシ ュ網を通すことにより腫瘍細胞を濾過し、細胞を遠心分離（1300 RPM）により１ ×HBSS（50ml）で洗浄し、１×HBSS中に10×10⁶細胞／mlに再懸濁し、そして使 用まで−70℃で凍結保存した。 実験条件に向けて、幾つかの凍結ロットからの細胞を解凍し、遠心分離（1300 RPM）によりペレット化し、そして１×HBSSで２回洗浄した。次いで細胞を約2. 0×10⁶細胞／mlに再懸濁した。約9〜 12匹のマウスに、25ｇの針が付けられた１ccの注射器を使って該細胞懸濁液0.1m lを注射（s.c.）した。注射は動物の左側のほぼ中央領域に行った。腫瘍は約２ 週間で発達した。腫瘍を切除し、上述の通り処理した。実験用マウスには上述と 同様にして0.10mlのHBSS中の1.67×10⁶細胞を注射した。 予備的用量決定実験に基づいて、200mgのC2B8と100μCiのY2B8を実験に使用す ることを決定した。90匹の雌nu/nuマウス（約10週齢）に腫瘍細胞を注射した。 約10日後、各グループにおいて同等の腫瘍サイズ分布（腫瘍の長さと幅の積とし て表される平均腫瘍サイズは約80mm²であった）を維持することを試みながら、2 4匹のマウスを４つの実験グループ（６匹のマウス／グループ）に割り当てた。2 5ｇの針が付けられた100μｌハミルトン注射器を使った尾静脈注射により、次の グループを指示の通り処置した： Ａ．生理的食塩水 Ｂ．Y2B8（100μCi） Ｃ．C2B8（200μｇ）および Ｄ．Y2B8（100μCi）＋C2B8（200μｇ） C2B8により試験したグループには、１回目の注射の７日後に２回目のC2B8注射 （200μｇ/マウス）を与えた。腫瘍測定はキャリパーを使って２または３日毎に 行った。 処置材料の調製は次のプロトコールに従った： Ａ．Y2B8の調製 塩化イットリウム［90］（60mCi）をポリプロピレン試験管に移し、無金属２ Ｍ酢酸ナトリウムを使ってpH4.1-4.4に調整した。 2B8-MX-DTPA（生理的食塩水中0.3mg；2B8-MX-DTPAの調製については上記を参照 のこと）を加え、渦動攪拌により穏やかに混合した。15分間のインキュベーショ ン後、0.05×容の20mM EDTAと0.05×容 の２Ｍ酢酸ナトリウムを加えることにより反応を失活させた。この反応混合物5. 0μｌを、75mg／ml HSAと１mM DTPAを含む2.5mlの１×PBS（「配合緩衝液」）中 に希釈することにより放射能濃度を測定した。計測は10.0μｌを20mlのEcolume^{T M} シンチレーションカクテルに添加することによって行った。反応混合物の残り を3.0mlの配合緩衝液に加え、滅菌濾過し、使用まで２〜８℃で保存した。反応 混合物に添加した抗体の量に基づいて算出されたタンパク質濃度と放射能濃度と を使って比活性（注射の時点で14mCi／mg）を算出した。タンパク質に関係する 放射能は即席薄層クロマトグラフィーを使って測定した。放射能取り込みは95％ であった。Y2B8は使用直前に配合緩衝液中に希釈し、滅菌濾過した（最終放射能 濃度は1.0mCi／mlであった）。 Ｂ．C2B8の調製 上記と同様にしてC2B8を調製した。C2B8は生理的食塩水中の無菌試薬として5. 0mg／mlで供給した。注射前に生理的食塩水中に2.0mg／mlに希釈し、次いで滅菌 濾過した。 Ｃ．結果 処置後、腫瘍サイズを長さと幅の積として表し、そして図11（Y2B8対食塩水） ；図12（C2B8対食塩水）および図13（Y2B8＋C2B8対食塩水）に指摘した日に測定 値をとった。標準誤差も決定した。 図13に示されるように、Y2B8とC2B8の組合せは、Y2B8またはC2B8のいずれかに より得られる効果と同等の殺腫瘍性効果を示した。 Ｖ．別の治療方法 前の実施例を考慮して認められる別の治療方法は明らかである。１つのそのよ うな方策は、C2B8の治療用量の後で約一週間以内に2B8と放射能標識2B8（例えば Y2B8）；または2B8，C2B8および Y2B8；またはC2B8と例えばY2B8のいずれかの組合せを使用する。他の方策は放射 能標識C2B8の使用である---そのような方策はC2B8の免疫学的活性部分の利益に 加えて放射能標識に関係する利益の利用を考慮したものである。好ましい放射能 標識としては、マウス抗体2B8に比較して大きなC2B8の循環半減期を仮定すれば イットリウム90が挙げられる。Ｂ細胞を涸渇させるC2B8の能力と、放射能標識の 使用から誘導されるであろう利益のため、好ましい別の方策は、全部ではないに しても大部分のＢ細胞が涸渇されてしまうように患者をC2B8で治療することであ る（単一用量または複数用量のいずれかで）。次いでこの後で放射能標識2B8を 使用する。末梢Ｂ細胞の涸渇のため、放射能標識2B8が腫瘍細胞をターゲッティ ングする見込みがかなりある。この標識に関して文献中に報告された結果の型（ KaminsKi参照）を仮定すれば、ヨウ素［131］標識2B8が好ましく使用される。別 の選択は、腫瘍の透過性を増加させようとして最初に放射能標識2B8（またはC2B 8）を使用し、次いでC2B8による１回または複数回処置を行うことを含む。この 方策の意図は、腫瘍塊の内側と外側の両方に届くC2B8の機会を増加させることで ある。他の方策はC2B8と組み合わせた化学療法剤の使用を含む。それらの方策と しては、いわゆる「互い違い」処置、即ち化学療法剤での処置の後でC2B8での処 置、次いでこのプロトコールの反復、が挙げられる。あるいは、単一用量または 複数用量のC2B8での最初の処置、その後で化学療法処置が有効である。好ましい 化学療法剤としては、シクロホスファミド；ドキソルビシン；ビンクリスチン； およびプレドニソンが挙げられるがそれらに限定されない。Armitage，J.O．ら 、Cancer 50:1695(1982)を参照のこと。これは本明細書中に参考として組み込ま れる。 上記の別の治療方法は限定のつもりでなくむしろ例示として与えられる。 VI．寄託物情報 特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約（「ブタペ スト条約」）の規定のもとに、TCAE 8中の抗CD20（寄託の目的でＥ．コリ中に形 質転換せしめたもの）をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC ），12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland，20852に寄託した。該微生物 は1992年11月9日にATCCにより試験され、そしてその日に生存可能であると決定 された。ATCCはこの微生物に次のATCC寄託番号を付与した：ATCC69119（TCAE 8 中の抗CD20）。ブタペスト条約の規定のもとに1993年6月22日にハイブリドーマ2 B8をATCCに寄託した。該培養物の生存可能性は1993年6月25日に決定され、ATCC はこのハイブリドーマに次のATCC寄託番号を付与した：HB 11388。 Ｇ．配列表 （１） 一般情報 （ｉ）出願人：Darrell Anderson，Nabil Hanna，John Leonard，Roland Newm an，Mitchell ReffおよびWilliam H.Rastetter （ii）発明の名称：Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのヒトＢリンパ球限定分化抗 原に対する放射能標識抗体とキメラ抗体の療法利用 （iii）配列の数：８ （iv）連絡先： （ａ）受信人：IDEC Pharmaceutical Corporation （ｂ）通り：11011 トレヤナロード （ｃ）市：サンディエゴ （ｄ）州：カリフォルニア （ｅ）国：アメリカ合衆国 （ｆ）ジップコード：92121 （ｖ）コンピューター読み取り形式： （ａ）媒体型：Diskette，3.5インチ，1.44 Mb （ｂ）コンピューター：Macintosh （ｃ）駆動システム：MS.DOS （ｄ）ソフトウエア：Microsoft Word 5.0 （vi）本願データ： （ａ）出願番号： （ｂ）出願日： （ｃ）分類： （viii）代理人情報 （ａ）名称：Burgoon，Richard P．Jr. （ｂ）登録番号：34,787 （ｃ）識別番号： （ix）電気通信情報： （ａ）電話：（619）550-8500 （ｂ）テレックス：（619）550-8750 （２）配列番号１： （ｉ）配列の特徴： （ａ）配列の長さ：8540塩基 （ｂ）配列の型：核酸 （ｃ）鎖の数：一本鎖 （ｄ）トポロジー：環状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （iii）ハイポセティカル：Yes （iv）アンチセンス：No （ix）配列の記載：配列番号１： （３）配列番号２： （ｉ）配列の特徴： （ａ）配列の長さ：9209塩基 （ｂ）配列の型：核酸 （ｃ）鎖の数：一本鎖 （ｄ）トポロジー：環状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （iii）ハイポセティカル：Yes （iv）アンチセンス：No （ix）配列の記載：配列番号２： （４）配列番号３： （ｉ）配列の特徴： （ａ）配列の長さ：54塩基 （ｂ）配列の型：核酸 （ｃ）鎖の数：一本鎖 （ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （iii）ハイポセティカル：Yes （iv）アンチセンス：No （ix）配列の記載：配列番号３： （５）配列番号４： （ｉ）配列の特徴： （ａ）配列の長さ:30塩基 （ｂ）配列の型：核酸 （ｃ）鎖の数：一本鎖 （ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （iii）ハイポセティカル：Yes （iv）アンチセンス：Yes （ix）配列の記載：配列番号４： （６）配列番号５： （ｉ）配列の特徴： （ａ）配列の長さ：384塩基 （ｂ）配列の型：核酸 （ｃ）鎖の数：一本鎖 （ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （iii）ハイポセティカル：Yes （iv）アンチセンス：No （ix）配列の記載：配列番号５： （７）配列番号６： （ｉ）配列の特徴： （ａ）配列の長さ：27塩基 （ｂ）配列の型：核酸 （ｃ）鎖の数：一本鎖 （ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （iii）ハイポセティカル：Yes （iv）アンチセンス：Ｎｏ （ix）配列の記載：配列番号６： （８）配列番号７： （ｉ）配列の特徴： （ａ）配列の長さ：29塩基 （ｂ）配列の型：核酸 （ｃ）鎖の数：一本鎖 （ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （iii）ハイポセティカル：Yes （iv）アンチセンス：Yes （ix）配列の記載：配列番号７： （９）配列番号８： （ｉ）配列の特徴： （ａ）配列の長さ：420塩基 （ｂ）配列の型：核酸 （ｃ）鎖の数：一本鎖 （ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：Genomic DNA （iii）ハイポセティカル：Yes （iv）アンチセンス：No （ix）配列の記載：配列番号８：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/46 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/02 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 9281−4Ｂ ＺＮＡ Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ラステッター，ウィリアム エイチ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92067, ランチョ サンタ フェ，ピュエルタ デ ル ソル，16067 (72)発明者 ハンナ，ネイビル アメリカ合衆国，カリフォルニア 92024, オリベンハイン，フォーチュナ ランチ ロード 3255 (72)発明者 レナード，ジョン イー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92024, エンシニタス，アベニダ ジョアキン 1960 (72)発明者 ニューマン，ローランド エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92122, サンディエゴ，ロビンス ストリート 43111 (72)発明者 レフ，ミッチェル イー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92122, サンディエゴ，コーム ウェイ 4166

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． Ｂ細胞リンパ腫の治療方法であって、少なくとも１つの免疫学的に活性 なキメラ抗CD20抗体の治療的有効量をヒトに投与する段階を含んで成る方法。 ２． 前記ヒトに投与される前記抗体の量が、前記ヒトの体重１kgあたり抗体 約0.001〜約30mgである（“mg／kg”）、請求項１の方法。 ３． 前記抗体が、ATCC寄託番号69119の一部としてATCC（American Type Cul ture Collection）に寄託されたTCAE 8中の抗CD20を含んで成るトランスフェク トーマから誘導される、請求項１の方法。 ４． 少なくとも１つの免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体の第二の治療的有 効量を投与する段階を更に含んで成る、請求項１の方法。 ５． 前記ヒトへの前記抗体の前記追加の投与が、前記ヒトへの前記抗体の最 初の投与後約７日以内に行われる、請求項４の方法。 ６． Ｂ細胞リンパ腫の治療方法であって、次の段階： （１）第一の投与期において、免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体の第一の治 療的有効量をヒトに投与し； （２）その後の第二の投与期において、前記抗体の第二の治療的有効量を投与 し；そして （３）その後の第三の投与期において、前記抗体の第三の治療的有効量を投与 する を含んで成る方法。 ７． 前記抗体の第一、第二および第三の治療的有効量が約0.001mg／kg〜約3 0mg／kgである、請求項６の方法。 ８． 前記第二の投与期が前記第一の投与期から約７日以内である、請求項６ の方法。 ９． 前記第二の投与期が前記第一の投与期から約14日以内である、請求項６ の方法。 10． 前記抗体がTCAE 8中の抗CD20を含んで成るトランスフェクトーマから誘 導される、請求項６の方法。 11． TCAE 8中の抗CD20を含んで成るトランスフェクトーマから生産される免 疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体。 12． 抗CD20抗体を分泌するハイブリドーマであって、ATCC寄託番号HB 11388 により同定されるハイブリドーマ。 13． 請求項12のハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体。 14． 放射能標識された請求項12に記載の抗体。 15． 前記放射能標識がイットリウム［90］、インジウム［111］およびヨウ 素［131］から成る群より選択される、請求項14の放射能標識抗体。 16． Ｂ細胞リンパ腫の治療方法であって、請求項14の抗体の治療的有効量を ヒトに投与する段階を含んで成る方法。 17． 前記抗体の放射能標識がイットリウム［90］である、請求項16の方法。 18． Ｂ細胞リンパ腫の治療方法であって、次の段階： （１）第一の投与期において、免疫学的に活性なキメラ抗CD20抗体をヒトに投 与し；そして （２）第二の投与期において、放射能標識抗CD20抗体を前記ヒトに投与する を含んで成る方法。 19． 前記キメラ抗CD20抗体が、ATCC寄託番号69119の一部としてATCCに寄託 されたTCAB 8中の抗CD20を含んで成るトランスフェクトーマから誘導される、請 求項18の方法。 20． 前記放射能標識抗体が、ATCC寄託番号HB 11388により同定されるハイブ リドーマから分泌されたモノクローナル抗体を含んで成る、請求項18の方法。