CN116171324A - 用于治疗和预防冠状病毒感染的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明部分地涉及用于治疗或预防冠状病毒感染的组合物和方法。
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本申请要求于2020年7月20日提交的美国临时申请序列号63/053,817和于2021年2月18日提交的美国临时申请序列号63/150,686的优先权的权益;每个申请的全部内容通过全文引用的方式并入本文。
背景技术
由新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的COVID-19在全球大流行期间已导致数十万人患病或死亡。疫苗正在开发,但离临床转化还有至少18个月的时间,并且面临着在大型临床研究中证明安全性和功效的挑战。根据疫苗的功效和可用性,感染和死亡可能会在此后一段时间持续。
现有抗病毒小分子和疾病修饰免疫调节剂的临床试验正在进行,但其安全性、功效和潜在功效的大小仍不确定。中和抗体也在开发,并且有望大规模提供被动免疫疗法。尽管这是一种很有前途的方法,但中和抗体的功效取决于其结合SARS-CoV-2刺突蛋白上的离散表位并防止刺突蛋白与其细胞表面受体血管紧张素转化酶2(ACE2)结合的能力。抗体与离散刺突蛋白表位结合的依赖性意味着刺突蛋白序列中抑制抗体结合同时保持ACE2结合的改变可以使病毒逃脱中和。因此,中和抗体可能对SARS-CoV-2突变变体无效,所述突变变体可能在大量感染个体中出现,特别是如果广泛使用中和抗体治疗对病毒产生进化压力。类似地,中和抗体可能对未来的ACE2导向的新型冠状病毒无效,所述新型冠状病毒已经受到遗传漂变的影响。
此外,肺部并发症是COVID-19发病率和死亡率的主要原因。尽管包含急性呼吸窘迫综合征(ARDS)在内的肺部并发症的病因复杂且多因素,但一种称为抗体依赖性增强(ADE)的免疫病理现象被认为是COVID-19患者ARDS的促发机制。ADE是一些病毒综合征中出现的现象,其中中和抗体实际上可以通过促进病毒感染或过度刺激表达Fcγ受体的免疫细胞而恶化感染和炎症(Iwasaki等人,(2020)《自然综述免疫学(Nat.Rev.Immunol.)》20:339-42;Taylor等人,(2015)《免疫学评论(Immunol.Rev.)》268:340-364)。
因此,治疗和预防COVID-19仍然非常需要SARS-CoV2的药物抑制剂。
发明内容
本发明至少部分基于以下发现:非活性的可溶性ACE2蛋白竞争性地抑制SARS-CoV-2病毒与内源性ACE2结合,由此阻止病毒进入细胞。
本发明的一方面提供了一种ACE2-Fc融合多肽,其包括ACE2胞外结构域多肽或其片段、铰链多肽和片段可结晶(Fc)结构域或其片段,其中所述ACE2胞外结构域是酶失活的,并且其中所述Fc结构域或其片段对Fcγ受体的结合亲和力减弱。
进一步提供了可以应用于本发明的任何方面和/或与本文所描述的任何其它实施例相结合的许多实施例。例如,在一个实施例中,所述ACE2胞外结构域多肽包括与以下中的任一个的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:1-4。在另一个实施例中,所述ACE2胞外结构域多肽包括在选自由以下组成的组的残基位置处的至少一个氨基酸取代:H374、H378、R273、H345、H345,H505、H505、R169、W271和K481。在仍另一个实施例中,相对于野生型ACE2多肽,所述ACE2胞外结构域多肽包括至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代:H374N、H378N、R273Q、H345A、H345L、H505A、H505L、R169Q、W271Q和K481Q。在又另一个实施例中,所述至少一个氨基酸取代是相对于野生型ACE2多肽的H374N或H378N取代。在另一个实施例中,所述至少一个氨基酸取代是相对于野生型ACE2多肽的H374N和H378N取代。在仍另一个实施例中,所述至少一个氨基酸取代是R273Q、H345A、H345L、H505A、H505L氨基酸取代。在又另一个实施例中,所述至少一个氨基酸取代是R169Q、W271Q和K481Q氨基酸取代。在另一个实施例中,所述ACE2胞外结构域对冠状病毒有亲和力。在仍另一个实施例中,所述冠状病毒选自由SARS-CoV-1和SARS-CoV-2组成的组。在另一个实施例中,所述Fc结构域包括氨基酸序列,所述氨基酸序列包括相对于野生型Fc结构域的至少一个氨基酸取代,所述氨基酸取代减少或消除所述Fc结构域与Fc受体的结合。在仍另一个实施例中,所述Fc受体是FcγIIa受体。在另一个实施例中,所述Fc结构域包括来自表5的氨基酸序列。在仍实施例中,所述Fc结构域源自IgG4抗体。在又另一个实施例中,所述Fc结构域包括在选自由L235和P329组成的组的残基位置处的至少一个氨基酸取代。在另一个实施例中,所述ACE2-Fc融合多肽包括S228P或L235E氨基酸取代。在仍另一个实施例中,所述ACE2-Fc融合多肽包括S228P和L235E氨基酸取代。在又另一个实施例中,所述Fc结构域包括以下中的任一个的氨基酸序列:SEQ IDNO:33-36。在另一个实施例中,所述Fc结构域源自IgG1抗体。在仍另一个实施例中,所述Fc结构域包括至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代:L234A、L235A、N297A、N297D和P329G。在又另一个实施例中,所述Fc结构域包括与以下中的任一个具有至少90%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:37-42或SEQ ID NO:55。在另一个实施例中,所述Fc结构域源自IgG2抗体。在仍另一个实施例中,所述Fc结构域包括SEQ IDNO:42的氨基酸序列。在又另一个实施例中,所述铰链区包括来自表2、3或4的氨基酸序列。在另一个实施例中,所述铰链区由脯氨酸或半胱氨酸-脯氨酸二肽组成。
本发明的另一方面提供ACE2-Fc融合多肽,其包括与以下具有至少90%同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:48、49、56或57。
本发明的又另一方面提供了编码上述任一方面的所述ACE2-Fc融合多肽的核酸分子。
另一方面,提供了一种核酸分子,所述核酸分子包括与以下具有至少90%同一性的核苷酸序列:SEQ ID NO:50、51、58或59。进一步提供了可以应用于本发明的任何方面和/或与本文所描述的任何其它实施例相结合的许多实施例。例如,一个实施例提供了一种载体,所述载体包括前述方面中任一个的核酸分子。在另一个实施例中,所述载体是表达载体。在仍另一个实施例中,提供了一种细胞,所述细胞包括前述实施例中任一个的载体。另一个实施例提供了一种细胞,其包括前述实施例中任一个的载体。在仍另一个实施例中,所述细胞是哺乳动物细胞。
本发明的另一方面提供了一种隔离冠状病毒的方法,所述方法包括使包括冠状病毒的流体与上述方面中的任一个的所述ACE2-Fc融合多肽接触,其中所述ACE2-Fc融合多肽与所述冠状病毒结合,由此隔离所述冠状病毒。
进一步提供了可以应用于本发明的任何方面和/或与本文所描述的任何其它实施例相结合的许多实施例。例如,在一个实施例中,所述经隔离的冠状病毒不能与全长ACE2多肽结合。在一个实施例中,所述流体是间质液、血液、血浆、血清、粘液、脑脊液或淋巴。在本文所描述的方法的另一个实施例中,所述冠状病毒选自由SARS-CoV-1和SARS-CoV-2组成的组。
本发明的仍另一方面提供了一种抑制冠状病毒与细胞表达的内源性ACE2多肽结合的方法,所述方法包括使与所述细胞连通的流体与上述方面中的任一项的所述ACE2-Fc融合多肽接触,其中所述ACE2-Fc融合多肽与所述冠状病毒结合,由此抑制所述冠状病毒与内源性表达的ACE2多肽结合。在一个实施例中,所述流体是间质液、血液、血浆、血清、粘液、脑脊液或淋巴。在另一个实施例中,所述冠状病毒选自由SARS-CoV-1和SARS-CoV-2组成的组。在另一个实施例中,所述细胞是哺乳动物细胞。在仍另一个实施例中,所述哺乳动物细胞是人细胞。
另一方面提供了一种用于治疗患有或疑似患有冠状病毒感染的受试者的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物,所述药物组合物包括上述方面中任一项的所述ACE2-Fc融合多肽。在一个实施例中,所述冠状病毒选自由SARS-CoV-1和SARS-CoV-2组成的组。在另一个实施例中,所述受试者是哺乳动物。在另一个实施例中,所述受试者是人。在仍另一个实施例中,所述施用选自由以下组成的组:皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、鞘内、口服、吸入、雾化和经皮。
在仍另一方面,提供了一种用于预防有感染风险的受试者的冠状病毒感染的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的药物组合物,所述药物组合物包括上述方面中任一项的所述ACE2-Fc融合多肽。在一个实施例中,所述冠状病毒选自由SARS-CoV-1和SARS-CoV-2组成的组。在另一个实施例中,所述受试者是哺乳动物。在另一个实施例中,所述受试者是人。在仍另一个实施例中,所述施用选自由以下组成的组:皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、鞘内、口服、吸入、雾化和经皮。
本发明的另一方面提供了治疗或预防受试者的冠状病毒感染的抗体依赖性增强的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物,所述药物组合物包括上述方面中任一项的所述ACE2-Fc融合多肽。
进一步提供了可以应用于本发明的任何方面和/或与本文所描述的任何其它实施例相结合的许多实施例。例如,在一个实施例中,所述冠状病毒感染选自由SARS-CoV-1感染和SARS-CoV-2感染组成的组。在一个实施例中,所述受试者是哺乳动物。在另一个实施例中,所述受试者是人。在仍另一个实施例中,所述施用选自由以下组成的组:皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、鞘内、口服、吸入、雾化和经皮。
提供了可以应用于本发明的任何方面和/或与本文所描述的任何其它实施例相结合的许多另外的实施例。例如,在一个实施例中,所述冠状病毒:对能够中和其它冠状病毒的单克隆抗体的中和具有抗性;是SARS-CoV-2的变体,所述变体对能够中和SARS-CoV-2的单克隆抗体的中和具有抗性;对冠状病毒疫苗赋予的免疫具有抗性;是SARS-CoV-2的变体,所述变体对SARS-CoV-2疫苗赋予的免疫具有抗性;对先前冠状病毒感染赋予的自然免疫具有抗性;是SARS-CoV-2的变体,所述变体对由先前SARS-CoV-2感染赋予的自然免疫具有抗性;携带S蛋白中的E484取代;携带S蛋白中的N501取代;携带S蛋白中的K417取代;携带S蛋白中的E484和N501取代;携带S蛋白中的E484K取代;携带S蛋白中的E484Q取代;携带S蛋白中的N501Y取代;携带S蛋白中的K417N取代;携带S蛋白中的E484K和N501Y取代;携带S蛋白中的E484、N501和K417取代;携带S蛋白中的E484K、N501Y和K417N取代;携带S蛋白中的L452取代;携带S蛋白中的L452R取代;携带S蛋白中的T478取代;携带S蛋白中的T478K取代;携带S蛋白中的L452和T478取代;携带S蛋白中的L452R和T478K取代;源自B.1.1.7谱系,也称为20I/501Y.V1,“英国变体”或α变体;是B.1.1.7谱系,也称为20I/501Y.V1,“英国变体”或α变体;源自B.1.351谱系,也称为20H/501Y.V2,“南非COVID-19变体”或β变体(除了S蛋白受体结合结构域外部的其它取代外,还携带E484K、N501Y和K417N取代);是B.1.351谱系,也称为20H/501Y.V2,“南非COVID-19变体”或β变体(除了S蛋白受体结合结构域外部的其它取代外,还携带E484K、N501Y和K417N取代);源自B.1.1.248谱系,也称为“巴西COVID-19变体”,谱系P.1或γ变体(除了S蛋白受体结合结构域外部的其它取代外,还携带E484K和N501Y取代);是B.1.1.248谱系,也称为“巴西COVID-19变体”,谱系P.1或γ变体(除了S蛋白受体结合结构域外部的其它取代外,还携带E484K和N501Y取代);源自B.1.617谱系;源自B.1.617.1谱系(携带E484Q取代);是B.1.617.1谱系(携带E484Q取代);源自B.1.617.2谱系,也称为δ变体(除了其它S蛋白突变外,还携带L452R和T478K取代);是B.1.617.2谱系,也称为δ变体(除了其它S蛋白突变外,还携带L452R和T478K取代);源自B.1.617.3谱系(携带E484Q取代);和/或是B.1.617.3谱系(携带E484Q取代)。
附图说明
图1是ACE2-Fc融合多肽的三维图示。
图2A和图2B表征了两种ACE2-Fc融合多肽结合SARS-CoV-2的能力。图2A是示出DF-COV-01和DF-COV-02亲和结合SARS-CoV-2的结合曲线。DF-COV-01和DF-COV-02的浓度以μg/ml为单位测量。图2B是图2A中所示的相同结合曲线,但DF-COV-01和DF-COV-02的浓度是以摩尔浓度测量的。
图3包括表征两种ACE2-Fc融合多肽中和假型化SARS-CoV-2病毒颗粒的能力的图。DF-COV-01和DF-COV-02抑制病毒进入表达ACE2的293T细胞。
图4A和图4B比较了两种ACE2-Fc融合多肽对固定的重组人FcγRIIa的亲和力与纯化的多克隆人IgG对固定的重组人FcγRIIa的亲和力。图4A是示出DF-COV-01和DF-COV-02与人IgG相比具有显著减弱的FcγRIIa结合的结合曲线。DF-COV-01和DF-COV-02的浓度以μg/ml为单位测量。图4B是图4A中所示的相同结合曲线,但DF-COV-01和DF-COV-02的浓度是以摩尔浓度测量的。
图5将DF-COV-01和DF-COV-02的ACE2酶活性与含有野生型ACE2胞外结构域的两种ACE2-Fc融合的酶活性进行了比较。DF-COV-01和DF-COV-02不显示酶活性,而匹配的野生型ACE2-Fc融合确实显示酶活性。
图6A和图6B表征了DF-COV-01和DF-COV-02中和含有荧光素酶和GFP报告基因的假型化SARS-CoV-2病毒颗粒的能力。表达ACE2的293T细胞用作靶标。在图6A中,通过检测荧光素酶表达的发光测定来测量感染。在图6B中,通过荧光显微镜检测GFP表达来可视化293T细胞的感染。DF-COV-01和DF-COV-02两者都抑制病毒进入表达ACE2的293T细胞,其中DF-COV-01比DF-COV-02更有效地中和。
图7表征了DF-COV-01和DF-COV-02中和野生型SARS-CoV-2病毒并防止源自人诱导的多能干细胞的人肺泡2型细胞(iAT2)感染的能力。通过针对SARS-CoV-02N蛋白的荧光标记抗体检测SARS-CoV-2对iAT2细胞的感染,并且通过流式细胞术测量。DF-COV-01和DF-COV-02两者均抑制感染,但阴性对照Fc融合(PD-L1-Fc)不抑制感染。
图8是示出当通过腹膜内注射施用时DF-COV-01和DF-COV-02在仓鼠中的药代动力学(PK)曲线的图。DF-COV-01的血清半衰期(t1/2)比DF-COV-02长。DF-COV-02的分布体积(Vd)大于DF-COV-01。DF-COV-02被认为比DF-COV-01在更大程度上穿透周围组织。
图9A至图9E表征了DF-COV-01、DF-COV-02、DF-COV-03和DF-COV-04在体内针对SARS-CoV-2病毒的活性。用SARS-CoV-2鼻内攻击叙利亚仓鼠(Syrian hamster),并且用40mg/kg的DF-COV-01每天一次或20mg/kg的DF-COV-02、DF-COV-03、DF-COV-04或媒剂对照(PBS)每天两次共治疗3天。图9A比较了第3天的口咽病毒滴度,图9B比较了第3天的鼻甲病毒滴度,图9C比较了第3天的肺滴度,图9D比较了第3天每组仓鼠的体重(相对于第0天每只个体的体重),并且图9E比较了用DF-COV-01治疗的仓鼠与用媒剂对照(PBS)治疗的仓鼠的体重随时间的变化。与媒剂对照(PBS)相比,DF-COV-01降低了口咽滴度、鼻甲滴度和肺滴度。体重减轻是仓鼠SARS-CoV-2感染的表现。与用媒剂对照(PBS)治疗的仓鼠相比,用DF-COV-01治疗的仓鼠在第3天的平均体重更高。用DF-COV-01治疗的若干只仓鼠在第3天开始恢复损失的体重,此时所有仓鼠都被处死。
图10A和图10B包括DF-COV-01和DF-COV-02的示意图和三维图示。图10A描绘了DF-COV-01,一种ACE2-Fc融合,其具有酶失活的全长ACE2胞外结构域ACE2-NN(18-740),融合到沉默IgG4-SPLE Fc结构域。图10B描绘了DF-COV-02,一种ACE2-Fc融合,其具有酶失活的ACE2金属肽酶结构域ACE2-NN(18-612),融合到沉默IgG4-SPLE Fc结构域。可以理解,ACE2胞外结构域的膜近端茎可以增强DF-COV-01的柔韧性。还可以理解,DF-COV-02更小,并且其外周组织穿透可以通过这种更小的分子量和更小的流体动力学半径来增强。
图11包括DF-COV-03的示意图,其为ACE2-Fc融合,具有酶失活的ACE2金属蛋白酶结构域ACE2-NN(18-615),融合到沉默IgG1-LALA Fc结构域。IgG1 Fc结构域的铰链区比IgG4 Fc结构域的铰链区更灵活,并且还包含灵活的G4AG4人工接头序列。
图12A和图12B包括比较与SARS-CoV-2S蛋白结合的两个ACE2金属蛋白酶结构域的氨基末端和羧基末端之间的距离的三维图示,以及基于此比较设计的ACE2-Fc融合的示意图示。在图12A中,与SARS-CoV-2S蛋白RBD(PDB:6M0J)结合的ACE2金属蛋白酶结构域的两个晶体结构的RBD与全长SARS-CoV-2S蛋白结构(PDB:6X2B)中“向上”构象的两个RBD重叠。ACE2金属蛋白酶结构域的氨基末端之间的距离测量为ACE2金属蛋白酶结构域的羧基末端之间的距离测量为图12B是DF-COV-04的示意图,其为ACE2-Fc融合,具有酶失活的ACE2金属蛋白酶结构域ACE2-NN(18-615),融合到沉默IgG1-LALA Fc结构域。此多肽的ACE2和Fc结构域的方向相反,其中Fc结构域是ACE2结构域的氨基末端。当DF-COV-04的两个ACE2金属蛋白酶结构域同时结合同一病毒S蛋白上的两个RBD时,接头可能需要跨越更短的距离,这在能量上更有利。因此,ACE2-Fc与位于Fc结构域羧基末端的ACE2金属蛋白酶结构域的融合可以提高病毒中和的效力。
图13A和图13B表征了DF-COV-01、DF-COV-02、DF-COV-03和DF-COV-04中和假型化SARS-CoV-2病毒颗粒的能力。将表达ACE2的293T细胞用作靶标,并且通过检测荧光素酶报告表达的发光测定来测量感染。图13A包括浓度以μg/mL为单位的中和曲线。图13B包括浓度以纳摩尔单位为单位的中和曲线。DF-COV-01最有效中和病毒(IC50 1.8nM)并且DF-COV-04也有效中和病毒(IC50 4.4nM)。DF-COV-02和DF-COV-03中和病毒的能力较弱(IC50分别为10nM和15nM)。
图14A和图14B表征了DF-COV-01、DF-COV-02、DF-COV-03和DF-COV-04与SARS-CoV-2S蛋白结合的能力。图14A包括浓度以μg/mL为单位的结合曲线,并且图14B包括浓度以纳摩尔单位为单位的结合曲线。DF-COV-01和DF-COV-02与S蛋白具有等同的结合。DF-COV-03对S蛋白的亲合力略高于DF-COV-01和DF-COV-02。令人惊讶地,尽管DF-COV-04显示出比DF-COV-02和DF-COV-03更有效的小瓶中和,但如通过此测定测量的,其对S蛋白的亲合力更低。
图15A和图15B测量DF-COV-01、DF-COV-02、DF-COV-03和DF-COV-04与SARS-CoV-2S蛋白的结合亲和力。用固定的DF-COV化合物和溶液中的SARS-CoV-2S蛋白通过生物层干涉法(Octet)测定亲和力。DF-COV-01和DF-COV-02对SARS-CoV-2S蛋白的亲和力高于DF-COV-03和DF-COV-04。
图16A至图16D表征了雾化后DF-COV-01、DF-COV-02、DF-COV-03和DF-COV-04的稳定性。每种化合物用振动筛网喷雾器雾化,并且然后收集在微离心管中。将雾化的化合物与固定的SARS-CoV-2S蛋白的结合与雾化前采集的样品的结合进行比较(基线)。通过抗人IgGHRP二级抗体检测结合。对于所有四种DF-COV化合物,雾化的样品和非雾化的样品(基线)之间的S蛋白结合亲合力没有显著差异。
图17比较了DF-COV-01、DF-COV-02、DF-COV-03和DF-COV-04在叙利亚仓鼠中的血清半衰期。在时间零时通过腹膜内注射将8mg/kg的DF-COV化合物中的每一种向三只仓鼠的单独组施用。在4小时、8小时、24小时、48小时和72小时进行静脉抽血,并且通过ELISA确定每个样品的DF-COV化合物的血清浓度。DF-COV-01的血清半衰期最长,为52小时。其它三种ACE2-Fc设计排列的半衰期更短,分别为约16小时、13小时和7小时。
图18比较了用SARS-CoV-2鼻内攻击并用DF-COV-01、DF-COV-02、DF-COV-03、DF-COV-04或媒剂对照(PBS)治疗的叙利亚仓鼠的每日体重趋势。
图19A和图19B显示了DF-COV-01在SARS-CoV-2感染的治疗模型中治疗仓鼠的能力,其中仓鼠在用1×104PFU SARS-CoV-2攻击十二小时后进行治疗。图19A提供了治疗的示意图,并且图19B提供了结果。
图20A和图20B显示了DF-COV化合物与SARS-CoV-2变体的结合特性。图20A提供数值数据并且图20B提供了滴定曲线。
具体实施方式
本发明至少部分基于以下发现:非活性的可溶性ACE2蛋白竞争性地抑制SARS-CoV-2病毒与内源性ACE2结合,由此阻止病毒进入细胞。本发明涵盖的ACE2-Fc融合多肽有效抑制SARS-CoV和SARS-CoV-2,并且具有有利的药代动力学。
表面受体胞外结构域与Fc结构域的融合是延长表面受体半衰期并允许其用作药物的常用方法。受体Fc融合的实例包含依那西普(etanercept)、阿巴西普(abatacept)、贝拉西普(belatacept)、阿法西普(alefacept)和利纳西普(rilonacept)等。这些药物的半衰期介于3天与15天之间。融合到Fc结构域具有增加受体对其结合配偶体亲合力的另外的益处,因为Fc结构形成二聚体,因此药物的每个分子上都会存在两个受体结构域,增加其结合亲合力。Fc融合很容易穿过脉管系统,因为其被Fc新生受体陪伴穿过内皮细胞,因此通常表现出较高的外周组织浓度。
ACE2是一种单程膜蛋白,并且其胞外结构域可以与IgG的Fc结构域融合以形成Fc融合。利用ACE2-Fc融合蛋白抑制冠状病毒感染细胞的概念已经被证实。2004年,Moore等人在哈佛医学院(Harvard Medical School)的研究表明,ACE2-Fc融合可以以约2nM的IC50在体外有效抑制SARS-CoV假病毒对靶细胞的感染((2004)《病毒学杂志(J.Virol.)》,78(19):10628-35)。最近,在2020年2月,Lei等人在中国上海(Shanghai,China)第二军医大学(Second Military Medical University)证实了这些发现,并且证明ACE2-Fc融合更有效地抑制SARS-CoV-2,IC50小于0.1μg/mL,或小于0.5nM((2020)《自然通讯(Nat.Commun.)》11(1):2070)。这些临床前研究表明,可溶性ACE2-Fc可以成功地与细胞表面ACE2竞争,以防止靶细胞感染。低至亚毫摩尔范围内的IC50表明ACE2与SARS-CoV-2的刺突蛋白之间存在高度密切的相互作用。ACE2-Fc的IC50与中和单克隆抗体的相似。例如,Wang等人最近报道了SARS-CoV-2中和抗体,其具有约0.5nM的IC50(Wang等人,(2020)《自然通讯》11:225)。本发明所涵盖的融合蛋白更进一步,使用酶促死亡的ACE2胞外结构域与对Fcγ受体亲和力降低的Fc结构域片段融合。
如本文进一步描述的,本发明涵盖的ACE2-Fc融合蛋白具有许多优点,包含1)由于药代动力学允许有效施用(例如,皮下给药),允许门诊治疗和预防,2)避免血流动力学副作用,因为非活性ACE2可避免RAAS通路抑制引起的低血压,3)降低抗体依赖性增强(ADE)风险,因为沉默Fc结构域降低了先天免疫细胞感染和自然发生ADE中断的风险;以及4)有效靶向ACE2导向的新型冠状病毒,因为与中和抗体和疫苗不同,不依赖定义的表位。
I.定义
本文使用的冠词“一个”和“一种”(“a”和“an”)是指冠词的语法对象中的一个或多于一个(即,至少一个)。举例来说,“一个要素”是指一个要素或多于一个要素。
术语“施用”旨在包含允许代理执行其预期功能的施用途径。可以用于治疗身体的施用途径的实例包含注射(皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、鞘内等)、口服、吸入、雾化和经皮途径。注射可以是团注,或可以是连续输注。取决于施用途径,可以用选定的材料涂覆或处理药剂,以保护其免受可能对其执行预期功能的能力产生不利影响的自然条件的影响。所述药剂可以单独施用,或与药学上可接受的载体联合施用。所述药剂也可以作为前药施用,所述前药在体内转化为其活性形式。
除非本文另有说明,否则术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”广泛涵盖天然存在形式的抗体(例如IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体如单链抗体、嵌合抗体和人源化抗体和多特异性抗体以及所有上述的片段和衍生物,所述片段和衍生物至少具有抗原结合位点。抗体衍生物可以包括与抗体缀合的蛋白质或化学部分。
如本文所使用的术语“抗体”还包含抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)。如本文所使用的,术语“抗原结合部分”是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段(例如,本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽)。已经证明,抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包含(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab')2片段,包括在铰链区处由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段;(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)《自然(Nature)》341:544-546);以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外,虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码,但是这两个结构域可以使用重组方法通过使这两个结构域能够成为单个蛋白链的合成接头来连接,在所述单个蛋白链中,VL区和VH区配对以形成单价多肽(被称为单链Fv(scFv));参见例如Bird等人,(1988)《科学(Science)》242:423-426;和Huston等人,(1988)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85:5879-5883;以及Osbourn等人,1998,《自然生物技术(Nature Biotechnology)》16:778)。此类单链抗体还旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。可以将特定scFv的任何VH和VL序列与人免疫球蛋白恒定区cDNA或基因组序列连接,以生成编码完整IgG多肽或其它同种型的表达载体。VH和VL也可以用于使用蛋白质化学或重组DNA技术生成Fab、Fv或其它免疫球蛋白片段。还涵盖了其它形式的单链抗体,如双抗体。双抗体是双价双特异性抗体,其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达,但使用的接头短得无法使同一条链上的两个结构域之间配对,由此迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger等人,(1993)《美国国家科学院刊》90:6444-6448;Poljak等人,(1994)《结构(Structure)》2:1121-1123)。
仍进一步地,抗体或其抗原结合部分可以是较大免疫粘附多肽的一部分,其通过抗体或抗体部分与一种或多种其它蛋白质或肽的共价或非共价结合形成。此类免疫粘附多肽的实例包含使用链霉亲和素核心区来制备四聚体scFv多肽(Kipriyanov等人,(1995)《人抗体和杂交瘤(Human Antibodies and Hybridomas)6:93-101)和使用半胱氨酸残基、蛋白质亚基肽和C端多组氨酸标签来制备二价和生物素化的scFv多肽(Kipriyanov等人,(1994)《分子免疫学(Mol.Immunol.)》31:1047-1058)。抗体部分,如Fc片段可以使用常规技术从完整抗体制备,如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分别消化完整抗体。此外,如本文所描述的,可以使用标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附多肽。
如本文所使用的,术语“抗体依赖性增强(ADE)”是指由抗体辅助病毒进入细胞引起的疾病或病状(即冠状病毒感染)的恶化。例如,特异性结合SARS-CoV-2抗原的中和抗体的Fc结构域可以被Fcγ受体(例如,FcγIIa受体)识别。当Fcγ受体与Fc结构域结合时,所述受体介导抗体和结合的病毒进入细胞。病毒进入导致细胞感染和炎症的增加,而不是病毒在细胞内被破坏。通常,ADE由FcγIIa受体介导。
如本文所使用的,术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类(例如,IgM、IgG1、IgG2C等)。
术语“防止(prevent)”、“防止(preventing)”、“防止(prevention)”、“预防性治疗(prophylactic treatment)”等是指降低未患有疾病、病症或病状但有患病症或病状的风险或易于患疾病、病症或病状的受试者患病症或病状的可能性。
术语“编码区”是指核苷酸序列的包括翻译成氨基酸残基的密码子的区域,而术语“非编码区”是指核苷酸序列的不翻译成氨基酸的区域(例如,5'和3'非翻译区)。
术语“互补”是指两条核酸链的区域之间或同一核酸链的两个区域之间的序列互补性的广义概念。已知如果残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶,则第一核酸区的腺嘌呤残基能够与和第一区反平行的第二核酸区的残基形成特定的氢键(“碱基配对”)。类似地,已知如果残基是鸟嘌呤,则第一核酸链的胞嘧啶残基能够与和第一链反平行的第二核酸链的残基进行碱基配对。如果当两个区域以反平行方式布置时,第一区的至少一个核苷酸残基能够与第二区的残基进行碱基配对,则核酸的第一区与相同或不同核酸的第二区互补。在一些实施例中,第一区包括第一部分并且第二区包括第二部分,由此,当第一部分和第二部分以反平行方式布置时,第一部分的至少约50%,至少约75%、至少约90%或至少约95%的核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基进行碱基配对。在一些实施例中,第一部分的所有核苷酸残基都能够与第二部分中的核苷酸残基进行碱基配对。
如本文所使用的,术语“抑制”和其语法等同物是指减少、限制和/或阻止特定动作、功能或相互作用。给定输出或参数水平的降低不一定(尽管可能)意指输出或参数的绝对缺失。本发明不需要并且不限于完全消除输出或参数的方法。可以使用本领域众所周知的方法来确定给定输出或参数,包含但不限于如本文和实例中所讨论的免疫组织化学、分子生物学、细胞生物学、临床和生化测定。相反的术语“促进”、“增加”和其语法等同物是指给定输出或参数水平的增加,与针对抑制或减少所描述的相反。
如本文所使用的,术语“相互作用(interacting)”或“相互作用(interaction)”是指两个分子(例如,蛋白质、核酸)或其片段彼此表现出足够的物理亲和力,从而使两个相互作用的分子或其片段物理上彼此接近。相互作用的极端情况是化学键的形成,导致两个实体持续且稳定地接近。仅基于物理亲和性的相互作用,虽然通常比化学键合的相互作用更为动态,但在共定位两个分子方面同样有效。物理亲和性和化学键的实例包含但不限于由电荷差、疏水性、氢键、范德华力(Van der Waals force)、离子力、共价键以及其组合引起的力。相互作用结构域、片段、蛋白质或实体之间的接近状态可以是暂时的,或可以是永久的、可逆的或不可逆的。在任何情况下,其都与由两个实体的自然随机移动引起的接触形成对比,并且与之区别开来。通常,尽管不一定,但通过相互作用结构域、片段、蛋白质或实体之间的结合表现出“相互作用”。相互作用的实例包含抗原与抗体、配体与受体、酶与底物等之间的特异性相互作用。
通常,此类相互作用导致所述分子中的一个或两个的活性(产生生物学效应)。所述活性可以是分子中的一个或两个的直接活性(例如,信号转导)。可替代地,可以防止相互作用中的一个或两个分子与它们的配体结合,因此就配体结合活性而言保持无活性(例如,与其配体结合并触发或抑制免疫应答)。抑制此类相互作用会破坏一个或多个参与相互作用的分子的活性。增强此类相互作用是为了延长或增加所述物理接触的可能性和延长或增加所述活性的可能性。
两个分子或其片段之间的“相互作用”可以通过多种方法确定。例如,可以通过功能测定来确定相互作用。如双杂交系统。蛋白质-蛋白质相互作用也可以通过基于两个相互作用配偶体之间的亲和力结合的各种生物物理和生物化学方法来确定。本领域中通常已知的此类生物化学方法包含但不限于蛋白质亲和色谱法、亲和印迹、免疫沉淀等。两种相互作用蛋白质的结合常数反映了相互作用的强度或质量,也可以使用本领域已知的方法来确定。参见Phizicky和Fields,(1995)《微生物学评论(Microbiol.Rev.)》,59:94-123。
如本文所使用的,“试剂盒”是包括至少一种试剂,例如探针的任何制品(例如包装或容器),用于特异性检测或调节本发明所涵盖的人或人源化ACE2-Fc融合多肽的表达。试剂盒可以作为用于执行本发明所涵盖的方法的单元进行推广、分发或销售。
如本文所使用的,术语“调节”包含上调和下调,例如增强或抑制本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽的表达和/或活性。
“分离的蛋白质”是指当从细胞分离或通过重组DNA技术产生时基本上不含其它蛋白质、细胞物质、分离介质和培养基或当以化学方式合成时基本上不含化学前体或其它化学品的蛋白质。“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含来自细胞或组织来源的细胞物质或其它污染蛋白质或当以化学方式合成时基本上不含化学前体或其它化学品,从所述细胞或组织来源衍生抗体、多肽、肽或融合蛋白。术语“基本上不含细胞物质”包含多肽或其片段的制剂,其中蛋白质与分离或重组产生蛋白质的细胞的细胞组分分离。在一个实施例中,语言“基本上不含细胞材料”包含ACE2-Fc融合多肽或其片段的制剂,其具有小于约30%(干重)的非ACE2-Fc融合蛋白(本文也称为“污染蛋白”),小于约20%、小于约10%或小于5%。当重组产生融合蛋白或其片段,例如其生物活性片段时,其还基本上不含培养基,即培养基占蛋白质制剂体积的小于约20%,小于约10%或小于约5%。
如本文所使用的,术语“核酸分子”旨在包含DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链DNA。如本文所使用的,术语“分离的核酸分子”旨在指其中核苷酸序列不含其它核苷酸序列的核酸分子,其中其它序列可以自然地侧接人基因组DNA中的核酸。
当核酸被放置成与另一核酸序列处于功能关系中时,所述核酸是“可操作地连接的”。例如,如果启动子或增强子影响序列的转录,则其与编码序列可操作地连接。关于转录调节序列,可操作地连接意味着被连接的DNA序列是连续的,并且在需要连接两个蛋白质编码区时是连续的并且在阅读框中。对于开关序列,可操作地连接表示序列能够实现开关重组。
对于核酸,术语“实质同源性”表示当最佳比对和比较时,两个核酸或其指定序列在至少约80%的核苷酸中具有适当的核苷酸插入或缺失,通常至少约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%,99%或更多的核苷酸。可替代地,当片段在选择性杂交条件下与链的补体杂交时,存在实质同源性。
两个序列之间的同一性百分比是由所述序列所共有的相同位置的数量的函数(即,同一性%=相同位置的#/位置的总#×100),所述函数考虑了需要针对两个序列的最佳比对而引入的空位的数量和每个空位的长度。两个序列之间的序列的比较和同一性百分比的确定可以使用如以下非限制性实例中所描述的数学算法来完成。
两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用GCG软件包中的GAP程序(可在GCG公司网站的万维网上获得),使用NWSgapdna来确定。CMP矩阵,并且间隙权重为40、50、60、70或80,并且长度权重为1、2、3、4、5或6。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比还可以使用E.Meyers和W.Miller(《计算机在生物科学中的应用(CABIOS)》,4:1117,1989)的已并入到ALIGN程序(版本2.0)的算法,使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分以及4的空位罚分来确定。另外,两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已经合并到GCG软件包中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》(48):444 453(1970))算法(可在GCG公司网站的万维网上获得),使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵以及空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6确定的。
本发明所涵盖的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索,以例如标识相关序列。此类检索可以使用以下的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0):Altschul等人,(1990)《分子生物学杂志》215:403 10。可以用NBLAST程序(评分=100,字长=12)进行BLAST核苷酸检索,以获得与本发明所涵盖的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序(评分=50,字长=3)进行BLAST蛋白质检索,以获得与本发明所涵盖的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有空位的比对,可以利用带空位的BLAST,如在以下中所描述的:Altschul等人,(1997),《核酸研究(Nucleic AcidsRes.)》25(17):3389 3402。当利用BLAST程序和带空位的BLAST程序时,可以使用相应程序(例如,XBLAST和NBLAST)的默认参数(可在NCBI网站的万维网上获得)。
核酸可以存在于全细胞中、细胞溶解产物中或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术而与其它细胞组分或其它污染物(例如,其它细胞核酸或蛋白)纯化分开时,核酸是“纯化的”或使得基本上纯的,所述标准技术包含碱/SDS处理、CsCl条带、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳以及其它本领域熟知的技术(参见F.Ausubel等人,编辑《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,纽约格林出版公司和威利国际科学平台(Greene Publishing and Wiley Interscience,New York)(1987))。
“转录的多核苷酸”或“核苷酸转录物”是与全部或部分成熟mRNA互补或同源的多核苷酸(例如,mRNA、hnRNA、cDNA或此类RNA或cDNA的类似物),所述成熟mRNA通过ACE2-Fc融合核酸的转录和RNA转录物的正常转录后加工(例如,剪接)(如果有的话)和RNA转录物的逆转录来制备。
术语“小分子”是本领域的术语并且包含小于约1000分子量或小于约500分子量的分子。在一个实施例中,小分子不排他地包括肽键。在另一个实施例中,小分子不是寡聚的。可以筛选活性的示例性小分子化合物包含但不限于肽、肽模拟物、核酸、碳水化合物、有机小分子(例如,聚酮化合物)(Cane等人,(1998)《科学》282:63)和天然产物提取物文库。在另一个实施例中,化合物是小的有机非肽化合物。在另外的实施例中,小分子不是生物合成的。
术语“特异性结合”是指抗体与预定抗原结合。通常,当使用所关注的抗原作为分析物和抗体作为配体,在测定仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时,抗体以大约小于10-7M如大约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的亲和力(KD)结合,并且以以下亲和力与预定的抗原结合,所述亲和力是其用于与预定的抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如,BSA、酪蛋白)结合的亲和力的至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍或10.0倍或更多。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换地使用。选择性结合是一个相对术语,指抗体区分一种抗原与另一种抗原结合的能力。
如本文所使用的,术语“结构域”意指蛋白质或多肽的功能部分、片段或区域。“相互作用结构域”特指蛋白质、多肽或蛋白质片段的一部分、片段或区域,所述部分、片段和区域负责该蛋白质、蛋白质片段或分离结构域与另一种蛋白质、蛋白质片段或分离结构域的物理亲和力。
如果未另行说明,如本文所使用的,术语“化合物”包含但不限于肽、核酸、碳水化合物、天然产物提取物库、有机分子(如小有机分子)、无机分子(包含但不局限于化学品、金属和有机金属分子)。
本文中使用的,术语“衍生物”、“类似物”或“变体”包含但不限于包括与ACE2多肽基本同源的区域的多肽,在各种实施例中,在相同大小的氨基酸序列上或与通过本领域已知的计算机同源性程序进行比对的比对序列相比,其具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的同一性,或其编码核酸能够在严格、中等严格或非严格条件下与编码组分蛋白的序列杂交。其意指分别通过氨基酸取代、缺失和添加对天然存在的蛋白质进行修饰的结果的蛋白质,所述衍生物仍然表现出天然存在的蛋白的生物学功能,但不一定达到相同的程度。此类蛋白质的生物学功能可以例如通过本发明提供的合适的可用体外测定来检查。
如本文所使用的,术语“功能活性”是指多肽,即片段或衍生物,其具有根据此多肽,即片段或衍生物所涉及的实施例的蛋白质的结构、调节或生化功能。
“功能保守变体”是其中蛋白质或酶中的给定氨基酸残基已经被改变而不更改多肽的整体构象和功能的包含但不限于用具有类似特性(例如,极性、氢键电势、酸性、碱性、疏水性、芳香族等)的氨基酸替换氨基酸。除了那些被指示为保守的氨基酸之外的氨基酸在蛋白质中可以不同,使得类似功能的任何两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似度百分比可以变化并且可以是如根据比对方案,如通过聚类方法确定的例如70%到99%,其中相似度是基于MEGALIGN算法。“功能保守变体”还包含如通过BLAST或FASTA算法测定的具有至少60%氨基酸同一性,或至少75%、至少85%、至少90%或甚至至少95%,并且具有与其所比较的天然或亲本蛋白相同或基本上类似的特性或功能的多肽。
当关于参考多肽使用时,术语“多肽片段”或“片段”是指与参考氨基酸自身相比,其中缺失氨基酸残基、但其中剩余氨基酸序列通常与参考多肽中对应位置相同的多肽。此类缺失可以发生在参考多肽的氨基端处、内部或羧基端处或可代替地两者兼而有之。片段通常为至少5、6、8或10个氨基酸长、至少14个氨基酸长、至少20、30、40或50个氨基酸长、至少75个氨基酸长或至少100、150、200、300、500或更多个氨基酸长。所述片段可以是例如至少和/或包含10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720、740、760、780、800、820、840、860、880、900、920、940、960、980、1000、1020、1040、1060、1080、1100、1120、1140、1160、1180、1200、1220、1240、1260、1280、1300、1320、1340或更长,只要片段小于全长多肽的长度。可替代地,片段可以不超过和/或不包含此类范围,只要片段小于全长多肽的长度。
如本文所使用的,“同源”是指相同核酸链的两个区域之间或两个不同核酸链的区域之间的核苷酸序列相似性。当两个区域中的核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据时,则所述区域在所述位置是同源的。如果每个区域的至少一个核苷酸残基位置被相同的残基占据,则第一区与第二区是同源的。两个区域之间的同源性以被相同的核苷酸残基占据的两个区域的核苷酸残基位置的比例表示。例如,具有核苷酸序列5'-ATTGCC-3'的区域和具有核苷酸序列5'-TATGGC-3'的区域具有50%的同源性。在一些实施例中,第一区包括第一部分并且第二区包括第二部分,由此,所述部分中的每个部分的至少约50%,并且在一些实施例中,至少约75%、至少约90%或至少约95%的核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据。在一些实施例中,所述部分中的每个部分的所有核苷酸残基位置都被相同的核苷酸残基占据。
如本文所使用的,术语“宿主细胞”旨在指其中已引入本发明开所涵盖的核酸,如本发明所涵盖的重组表达载体的细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应当理解此类术语不仅涉及具体受试者细胞,而且涉及这种细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后续世代中发生,所以此类后代实际上可能不与亲本细胞相同,但仍包含在如本文中所使用的术语的范围内。
如本文所使用的,术语“载体”是指能够转运其已经连接的另一个核酸的核酸。一种类型的载体是“质粒”,是指另外的DNA区段可以连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体,其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在其被引入到其中的宿主细胞中进行自主复制(例如,具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如,非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中时被整合到所述宿主细胞的基因组中,并且由此与宿主基因组一起复制。此外,某些载体能够指导与其操作性地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”或简单地,“表达载体”。通常,可用于重组DNA技术的表达载体通常呈质粒形式。在本说明书中,“质粒”和“载体”可以互换使用,因为质粒是最常用的载体形式。然而,本发明旨在包含提供同等功能的此类其它形式的表达载体,如病毒载体(例如,复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“基本上不含化学前体或其它化学品”包含抗体、多肽、肽或融合蛋白的制剂,其中蛋白质与参与蛋白质合成的化学前体或其它化学品分离。在一个实施例中,语言“基本上不含化学前体或其它化学品”包含具有少于约30%、少于约20%、少于约10%或少于约5%(以干重计)的化学前体或非抗体、多肽、肽或融合蛋白化学品的抗体、多肽或融合蛋白的制剂。
当与蛋白质结合使用时,术语“活性”意指由特定蛋白质显示或与特定蛋白质相关的任何生理或生物化学活性,包含但不限于在生物过程和细胞功能中表现出的活性、与另一分子或其部分相互作用或结合的能力、对某些分子的结合亲和力或特异性、体外或体内稳定性(例如,蛋白质降解率)、抗原性和免疫原性、酶活性等。如熟练的技术人员显而易见的,可以通过各种合适的方法中的任何一种来检测或分析此类活性。
在适用的情况下,术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。其可以进行化学修饰,例如翻译后修饰。例如,其可以是糖基化的或包括修饰的氨基酸残基。其也可以通过添加信号序列来修饰,以促进其从其中多肽不天然含有此类序列的细胞中分泌。其可以用标签标记。用于本发明的多肽/蛋白质可以是基本上分离的形式。应当理解,多肽/蛋白质可以与不会干扰多肽的预期目的的载体或稀释剂混合,并且仍然被认为是基本上分离的。用于本发明的多肽/蛋白质也可以是基本上纯化的形式,在这种情况下,其通常包括制剂中的多肽,其中所述制剂中超过50%,例如超过80%、90%、95%或99%(以重量计)的多肽是本发明多肽。
术语“杂交蛋白质”、“杂交多肽”、“杂交肽”、“融合蛋白”、“融合多肽”和“融合肽”在本文中可互换地用于意指具有与一个或多个不与特定多肽天然连接的多肽分子共价连接的特定多肽分子的非天然存在的蛋白质。因此,“杂交蛋白”可以是通过共价键连接在一起的两种天然存在的蛋白质或其片段。“杂交蛋白”也可以是通过将两种人工多肽共价连接在一起而形成的蛋白质。通常但不一定,两个或更多个多肽分子通过肽键连接或融合在一起,形成单个非支链多肽链。
本文中使用的术语“标签”意指在其最广义上理解,并且包含但不限于任何合适的酶、荧光或放射性标签和合适的表位,包含但不限于HA-标签、Myc-标签、T7、His-标签、FLAG-标签、钙调蛋白结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、strep-标签、KT3-表位、EEF-表位、绿色荧光蛋白以及其变体。
术语“ACE2”,也称为“血管紧张素I转化酶2”,是指与血管紧张素Ⅰ转化酶具有显著同源性的二肽基羧基二肽酶。所述蛋白将血管紧张素I转化为血管紧张素1-9,并且将血管紧张肽II转化为血管紧素1-7(Donoghue等人,(2000)《循环研究(Circ Res)》,87(5):E1-9,Tipnis等人,(2000)《生物化学杂志(J Biol Chem.)》,275(43):33238-43,Vickers等人,(2002)《生物化学杂志》,277(17):14838-43)。ACE2蛋白还高效水解apelin-13和强啡肽-13(Vickers等人,(2002))。ACE2有效地结合冠状病毒的刺突(S)蛋白,包含导致严重急性呼吸综合征(SARS)的病毒(SARS CoV-1)(Li等人,(2003)《自然(Nature)》426:450-454和导致COVID-19的SARS CoV-2(Hoffman等人,(2020)《细胞(Cell)》,4月16日;181(2):271-280.e8。
术语“全长ACE2多肽”或“野生型ACE2多肽”是指与以下具有至少85%序列同一性的多肽:
术语“ACE2”旨在包含其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性的人ACE2 cDNA和人ACE2蛋白质序列是本领域众所周知的,并且可从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)公开获得。人ACE2亚型包含由转录物NM_001371415.1编码的蛋白质NP_001358344.1、由转录物NM_021804.3编码的蛋白质NP_068576.1和由转录物AY358714.1编码的蛋白质AAQ89076.1。人以外的生物体中ACE2同源物的核酸和多肽序列是众所周知的,并且包含例如黑猩猩(XM_016942979.1-XP_016798468.1;以及XM_016942980.1-XP_016798469.1)、恒河猴(NM_001135696.1-NP_001129168.1;XM_028841825.1-XP_028697658.1;以及XM_015126958.2-XP_014982444.2)、狗(NM_001165260.1-NP_001158732.1;XM_014111329.2-XP_013966804.1;XM_022415506.1-XP_022271214.1;以及XM_005640992.2-XP_005641049.1)、牛(NM_001024502.4-NP_001019673.2;XM_005228428.4-XP_005228485.1;XM_015461785.2-XP_015317271.1;XM_005228429.4-XP_005228486.1;以及XM_024987850.1-XP_024843618.1)、小鼠(NM_001130513.1-NP_001123985.1;以及NM_027286.4-NP_081562.2)、大鼠(NM_001012006.1-NP_001012006.1)、鸡(XM_416822.5-XP_416822.2)、青蛙(XM_002938247.4-XP_002938293.2)、斑马鱼(NM_001007297.1-NP_001007298.1;XM_005169359.4-XP_005169416.1;以及XM_005169360.4-XP_005169417.13.2)和秀丽隐杆线虫(C.elegans)(NM_001029282.6-NP_001024453.1)。
术语“片段可结晶结构域”或“Fc结构域”是指IgG抗体的片段可结晶区域。此结构域与Fcγ受体(例如,FcγIIa受体,其允许抗体的细胞内化)结合。
如本文所使用的,术语“ACE-2定向冠状病毒”是指使用ACE2蛋白进入细胞的冠状病毒的子集。已知至少有七种冠状病毒利用ACE2,包含三种具有全球重要性的病毒:NL63、SARS-CoV(导致2004年严重急性呼吸综合征暴发的病毒)和SARS-CoV-2(导致COVID-19大流行的病毒)(Li等人,(2003)《自然》,426(6965):450-54;Hoffman等人,(2020)《细胞》,181(2):271-80e8。
术语“诊断冠状病毒感染”包含使用本发明的方法、系统和代码来确定是否存在冠状病毒或其亚型、编码所述冠状病毒多肽的冠状病毒多肽或核酸分子或特异性结合个体中冠状病毒抗原的抗体。所述术语还包含用于评估个人疾病活动水平的方法、系统和代码。
特定蛋白质的氨基酸序列与可以编码蛋白质的核苷酸序列之间存在已知且明确的对应关系,如基因密码所定义(如下所示)。同样,特定核酸的核苷酸序列与由所述核酸编码的氨基酸序列之间存在已知且明确的对应关系,如基因密码所定义的。
基因密码
基因密码的重要且众所周知的特征是其冗余性,因此,对于用于制造蛋白质的大多数氨基酸,可以采用超过一个编码核苷酸三联体(如上文所示)。因此,许多不同的核苷酸序列可以编码给定的氨基酸序列。此类核苷酸序列被认为在功能上是等效的,因为所述核苷酸序列导致在所有生物体中产生相同的氨基酸序列(尽管某些生物体可能比其它生物体更有效地翻译一些序列)。此外,有时在给定核苷酸序列中可能会发现嘌呤或嘧啶的甲基化变体。此类甲基化不影响三核苷酸密码子与对应氨基酸之间的编码关系。
鉴于前述,编码ACE2-Fc融合多肽核酸(或其任何部分)的DNA或RNA的核苷酸序列可以用于衍生ACE2-Fc融合多肽氨基酸序列,使用基因密码将DNA或RNA翻译成氨基酸序列。同样,对于多肽氨基酸序列,可以从基因密码(由于基因密码的冗余性,基因密码将针对任何给定氨基酸序列产生多个核酸序列)中推断出可以编码多肽的对应核苷酸序列。因此,本文对编码多肽的核苷酸序列的描述和/或公开内容应当被认为还包含对由核苷酸序列编码的氨基酸序列的描述和/或公开内容。类似地,本文对多肽氨基酸序列的描述和/或公开内容应当被认为还包含对可以编码氨基酸序列的所有可能的核苷酸序列的描述和/或公开内容。
最后,本发明所涵盖的ACE2融合多肽以及其片段的核酸和氨基酸序列信息是本领域已知的,并且容易在公开可用的数据库(如国家生物技术信息中心(NCBI))上获得。表1-8中提供了示例性核酸和氨基酸序列。
表1SEQ ID NO:1具有H374N H378N取代的ACE2胞外结构域的氨基酸序列(残基18- 740)
SEQ ID NO:2具有H374N H378N取代的ACE2胞外结构域的子集(残基18-708)
SEQ ID NO:3具有H374N H378N取代的ACE2胞外结构域的子集(残基18-615)
SEQ ID NO:4具有H374N H374N取代的ACE2胞外结构域的子集(残基18-612)
表2:源自IgG4的铰链,具有S228P取代和其它接头
SEQ ID NO:5
VESKYGPPCPPCP
SEQ ID NO:6
ESKYGPPCPPCP
SEQ ID NO:7
SKYGPPCPPCP
SEQ ID NO:8
KYGPPCPPCP
SEQ ID NO:9
YGPPCPPCP
SEQ ID NO:10
GPPCPPCP
SEQ ID NO:11
PPCPPCP
SEQ ID NO:12
PCPPCP
SEQ ID NO:13
CPPCP
SEQ ID NO:14
PPCP
SEQ ID NO:15
PCP
SEQ ID NO:52(与SEQ ID NO:5类似,除了第一残基是G)
GESKYGPPCPPCP
SEQ ID NO:53(G4AG4接头)
GGGGAGGGG
SEQ ID NO:54(G4AG4AG4接头)
GGGGAGGGGAGGGG
表3:源自IgG1的铰链
SEQ ID NO:16
EPKSCDKTHTCP
SEQ ID NO:17
PKSCDKTHTCP
SEQ ID NO:18
KSCDKTHTCP
SEQ ID NO:19
SCDKTHTCP
SEQ ID NO:20
CDKTHTCP
SEQ ID NO:21
DKTHTCP
SEQ ID NO:22
KTHTCP
SEQ ID NO:23
THTCP
SEQ ID NO:24
HTCP
SEQ ID NO:25
TCP
表4:源自IgG2的铰链
SEQ ID NO:26
ERKCCVECPPCP
SEQ ID NO:27
RKCCVECPPCP
SEQ ID NO:28
KCCVECPPCP
SEQ ID NO:29
CCVECPPCP
SEQ ID NO:30
CVECPPCP
SEQ ID NO:31
VECPPCP
SEQ ID NO:32
ECPPCP
表5:Fc结构域
SEQ ID NO:33具有L235E取代的IgG4Fc结构域
SEQ ID NO:34具有L235E和P329G取代的IgG4 Fc结构域
SEQ ID NO:35具有IgG1P329G取代的IgG4 Fc结构域
SEQ ID NO:36具有IgG1P329A取代的IgG4Fc结构域
SEQ ID NO:37具有L234A和L235A取代的IgG1
SEQ ID NO:38具有L234A、L235A和P329G取代的IgG1
SEQ ID NO:39具有N297A取代的IgG1
SEQ ID NO:40具有N297D取代的IgG1
SEQ ID NO:41具有P329G取代的IgG1
SEQ ID NO:42具有P329A取代的IgG1
SEQ ID NO:55具有L234A和L235A取代的IgG1(与SEQ ID NO:37类似,除了具有
“DEL”而不是“EEM”)
表6参考IgG Fc和恒定结构域
SEQ ID NO:43IgG4Fc结构域
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:44IgG2Fc结构域
APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGMEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:45人IgG1恒定区(Eu编号)
SEQ ID NO:46人IgG2恒定区(Eu编号)
SEQ ID NO:47人IgG4恒定区(Eu编号)
||=这些IgG4铰链残基(Y和G)没有Eu编号
表7SEQ ID NO:48DF-COV-01氨基酸序列
*SEQ ID NO:60ACE2氨基酸序列
*ACE2的代表性序列如以下中所提供的:SEQ ID NO:60。氨基末端前导为斜体,ACE2肽酶结构域(PD)(氨基酸18至615)被加粗。ACE2羧基末端至氨基酸615(616至768)的部分被称为集合蛋白样结构域(CLD)(Yan等人,(2020)《科学》367:1444-1448)。此术语涉及这样一个事实,即此区域(包含ACE2的近膜、跨膜和细胞质结构域)与肾跨膜蛋白集合蛋白具有相似性(Hamming等人,(2007)《病理学杂志(J.Pathol.)》212:1–11)。具体地,序列比对表明,通过ACE2羧基端的氨基酸614与集合蛋白的氨基酸21至241具有47.8%的同一性(Zhang等人,(2001)《生物化学杂志》276:17132-17139)。在代表性SEQ ID NO:60中,集合蛋白样结构域(CLD)未被加粗。CLD的近膜(胞外)部分,氨基酸616至740加下划线,而CLD的跨膜和细胞质部分不加下划线。
SEQ ID NO:49DF-COV-02氨基酸序列
SEQ ID NO:56DF-COV-03氨基酸序列([ACE2(18-615)-NN]-[G4AG4]-[IgG1铰链]-[hIgG1(LALA)Fc])[IgG1铰链为粗体且为斜体]
SEQ ID NO:57DF-COV-04氨基酸序列([IgG1铰链]-[hIgG1(LALA)Fc]-[G4AG4AG4]-[ACE2(18-612)-NN])[IgG1铰链为粗体且为斜体]
表8——DF-COV核酸序列
SEQ ID NO:50完整DF-COV-01核苷酸序列
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCCAGTCAACAATCGAGGAGCAGGCAAAGACCTTCCTGGACAAGTTTAACCACGAAGCGGAGGACCTGTTCTACCAGAGCAGCCTGGCGAGCTGGAATTACAACACCAACATCACCGAGGAGAACGTGCAGAACATGAATAACGCTGGCGACAAGTGGAGCGCCTTCTTGAAGGAGCAATCCACCCTGGCCCAGATGTACCCGCTGCAAGAGATACAGAACCTGACTGTGAAGCTGCAACTGCAGGCCCTGCAGCAGAACGGCTCCAGCGTGCTGAGCGAAGACAAGAGCAAAAGGCTGAATACCATATTGAACACGATGAGCACCATCTACAGCACCGGCAAAGTATGCAACCCCGACAACCCCCAAGAGTGTCTGTTGTTGGAACCCGGCCTGAACGAGATTATGGCGAACTCCCTGGACTACAACGAACGCCTGTGGGCATGGGAGTCTTGGAGGTCAGAGGTTGGCAAGCAACTGAGGCCGTTGTACGAAGAGTACGTGGTGCTGAAGAACGAAATGGCACGGGCCAATCATTATGAGGACTACGGTGATTATTGGAGGGGCGACTACGAGGTGAACGGCGTGGACGGCTACGACTATAGCAGGGGCCAACTTATAGAGGACGTAGAGCACACTTTTGAGGAAATCAAACCCCTGTACGAGCACTTGCATGCCTACGTACGCGCCAAACTGATGAATGCGTACCCCAGCTACATCAGCCCCATCGGCTGCCTGCCCGCACACCTGCTCGGCGACATGTGGGGCCGATTCTGGACCAATCTGTATAGCCTCACCGTGCCCTTTGGCCAGAAGCCGAACATAGATGTGACGGATGCTATGGTAGACCAGGCGTGGGATGCACAGCGCATCTTCAAGGAGGCCGAGAAGTTCTTCGTGAGCGTCGGCTTGCCCAACATGACCCAGGGTTTCTGGGAGAACTCAATGCTGACTGACCCCGGCAACGTACAGAAAGCCGTATGCCACCCAACTGCTTGGGACCTGGGTAAGGGAGACTTCCGGATCCTCATGTGTACCAAGGTGACCATGGATGACTTTCTCACCGCCCACAATGAAATGGGCAACATCCAGTACGATATGGCCTACGCAGCGCAGCCATTCCTTCTGAGGAACGGTGCCAACGAGGGCTTCCATGAGGCAGTCGGAGAGATCATGAGCCTGTCAGCGGCGACCCCTAAACATCTGAAGAGCATCGGGCTGCTGTCTCCGGACTTTCAAGAGGACAATGAGACTGAGATCAACTTC
CTCCTGAAACAGGCGCTGACCATTGTAGGCACCTTGCCCTTCACCTACATGCTGGAGAAGTGGCGA
TGGATGGTGTTTAAGGGCGAGATCCCGAAGGACCAGTGGATGAAAAAGTGGTGGGAGATGAAGAGG
GAGATCGTCGGCGTAGTTGAGCCGGTCCCCCACGACGAAACCTACTGCGATCCTGCCAGCCTGTTC
CACGTGAGCAACGATTACAGTTTTATCAGGTACTACACCAGGACCCTTTACCAATTTCAGTTCCAG
GAGGCACTGTGCCAGGCCGCCAAGCACGAAGGCCCCCTGCACAAGTGCGACATCAGCAACAGCACC
GAGGCGGGTCAAAAGCTGTTTAACATGCTGAGGCTGGGCAAGAGCGAGCCGTGGACCCTGGCCCTG
GAAAACGTTGTGGGCGCAAAAAACATGAACGTGAGGCCCCTGCTGAACTACTTCGAGCCCCTGTTC
ACCTGGCTGAAGGACCAGAACAAGAACAGTTTCGTGGGCTGGAGTACCGATTGGAGTCCCTATGCC
GACCAGAGCATCAAGGTGAGGATTAGCCTCAAGAGCGCCCTGGGCGACAAGGCCTATGAATGGAAC
GACAACGAGATGTACCTGTTCAGGTCAAGCGTGGCCTACGCCATGAGGCAGTACTTCCTGAAAGTG
AAGAACCAGATGATACTGTTCGGCGAGGAGGACGTGAGGGTGGCCAACCTGAAGCCCAGGATATCA
TTCAATTTCTTCGTGACCGCTCCCAAGAACGTGAGCGACATCATCCCCAGGACCGAGGTGGAGAAG
GCCATCAGGATGAGCCGCAGCAGGATTAACGACGCCTTCAGGCTGAACGATAACAGCCTGGAGTTC
CTTGGCATCCAGCCAACCCTGGGACCACCCAACCAGCCTCCCGTTAGCGGACCCCCCTGTCCTCCT
TGCCCTGCTCCTGAATTTGAGGGAGGCCCCTCCGTCTTCCTGTTTCCCCCCAAGCCCAAGGACACC
CTGATGATCTCCCGGACACCCGAAGTCACCTGCGTCGTGGTGGATGTCAGCCAGGAAGATCCCGAG
GTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGAGTGGAGGTGCATAACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAAGAG
CAGTTCAACAGCACCTATCGGGTCGTGTCCGTGCTCACCGTCCTGCATCAGGATTGGCTCAACGGC
AAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAG
GCTAAGGGCCAACCTCGGGAGCCCCAAGTGTATACCCTCCCTCCCAGCCAGGAGGAGATGACCAAG
AATCAAGTGAGCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGATTTTACCCCTCCGACATCGCTGTGGAATGGGAA
AGCAATGGCCAACCTGAGAACAACTACAAGACCACACCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGCTCCTTC
TTCCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAATCCCGGTGGCAAGAGGGAAACGTGTTCAGCTGCTCC
GTGATGCACGAGGCTCTCCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGAGCCTCGGCAAGTAA
SEQ ID NO:51完整DF-COV-02核苷酸序列
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCCAGTCAACA
ATCGAGGAGCAGGCAAAGACCTTCCTGGACAAGTTTAACCACGAAGCGGAGGACCTGTTCTACCAG
AGCAGCCTGGCGAGCTGGAATTACAACACCAACATCACCGAGGAGAACGTGCAGAACATGAATAAC
GCTGGCGACAAGTGGAGCGCCTTCTTGAAGGAGCAATCCACCCTGGCCCAGATGTACCCGCTGCAA
GAGATACAGAACCTGACTGTGAAGCTGCAACTGCAGGCCCTGCAGCAGAACGGCTCCAGCGTGCTG
AGCGAAGACAAGAGCAAAAGGCTGAATACCATATTGAACACGATGAGCACCATCTACAGCACCGGC
AAAGTATGCAACCCCGACAACCCCCAAGAGTGTCTGTTGTTGGAACCCGGCCTGAACGAGATTATG
GCGAACTCCCTGGACTACAACGAACGCCTGTGGGCATGGGAGTCTTGGAGGTCAGAGGTTGGCAAG
CAACTGAGGCCGTTGTACGAAGAGTACGTGGTGCTGAAGAACGAAATGGCACGGGCCAATCATTAT
GAGGACTACGGTGATTATTGGAGGGGCGACTACGAGGTGAACGGCGTGGACGGCTACGACTATAGC
AGGGGCCAACTTATAGAGGACGTAGAGCACACTTTTGAGGAAATCAAACCCCTGTACGAGCACTTG
CATGCCTACGTACGCGCCAAACTGATGAATGCGTACCCCAGCTACATCAGCCCCATCGGCTGCCTG
CCCGCACACCTGCTCGGCGACATGTGGGGCCGATTCTGGACCAATCTGTATAGCCTCACCGTGCCC
TTTGGCCAGAAGCCGAACATAGATGTGACGGATGCTATGGTAGACCAGGCGTGGGATGCACAGCGC
ATCTTCAAGGAGGCCGAGAAGTTCTTCGTGAGCGTCGGCTTGCCCAACATGACCCAGGGTTTCTGG
GAGAACTCAATGCTGACTGACCCCGGCAACGTACAGAAAGCCGTATGCCACCCAACTGCTTGGGAC
CTGGGTAAGGGAGACTTCCGGATCCTCATGTGTACCAAGGTGACCATGGATGACTTTCTCACCGCC
CACAATGAAATGGGCAACATCCAGTACGATATGGCCTACGCAGCGCAGCCATTCCTTCTGAGGAAC
GGTGCCAACGAGGGCTTCCATGAGGCAGTCGGAGAGATCATGAGCCTGTCAGCGGCGACCCCTAAA
CATCTGAAGAGCATCGGGCTGCTGTCTCCGGACTTTCAAGAGGACAATGAGACTGAGATCAACTTC
CTCCTGAAACAGGCGCTGACCATTGTAGGCACCTTGCCCTTCACCTACATGCTGGAGAAGTGGCGA
TGGATGGTGTTTAAGGGCGAGATCCCGAAGGACCAGTGGATGAAAAAGTGGTGGGAGATGAAGAGG
GAGATCGTCGGCGTAGTTGAGCCGGTCCCCCACGACGAAACCTACTGCGATCCTGCCAGCCTGTTC
CACGTGAGCAACGATTACAGTTTTATCAGGTACTACACCAGGACCCTTTACCAATTTCAGTTCCAG
GAGGCACTGTGCCAGGCCGCCAAGCACGAAGGCCCCCTGCACAAGTGCGACATCAGCAACAGCACC
GAGGCGGGTCAAAAGCTGTTTAACATGCTGAGGCTGGGCAAGAGCGAGCCGTGGACCCTGGCCCTG
GAAAACGTTGTGGGCGCAAAAAACATGAACGTGAGGCCCCTGCTGAACTACTTCGAGCCCCTGTTC
ACCTGGCTGAAGGACCAGAACAAGAACAGTTTCGTGGGCTGGAGTACCGATTGGAGTCCCGGTGAA
TCCAAGTATGGACCCCCCTGTCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAATTTGAGGGAGGCCCCTCCGTCTTC
CTGTTTCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACACCCGAAGTCACCTGCGTCGTG
GTGGATGTCAGCCAGGAAGATCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGAGTGGAGGTGCAT
AACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAAGAGCAGTTCAACAGCACCTATCGGGTCGTGTCCGTGCTCACC
GTCCTGCATCAGGATTGGCTCAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCC
TCCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCTAAGGGCCAACCTCGGGAGCCCCAAGTGTATACCCTC
CCTCCCAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAATCAAGTGAGCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGATTTTAC
CCCTCCGACATCGCTGTGGAATGGGAAAGCAATGGCCAACCTGAGAACAACTACAAGACCACACCC
CCCGTGCTGGACTCCGATGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAATCCCGGTGG
CAAGAGGGAAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTCCACAACCACTACACCCAGAAG
AGCCTCTCCCTGAGCCTCGGCAAGTAA
SEQ ID NO:58完整DF-COV-03核苷酸序列
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCCAGTCAACA
ATCGAGGAGCAGGCAAAGACCTTCCTGGACAAGTTTAACCACGAAGCGGAGGACCTGTTCTACCAG
AGCAGCCTGGCGAGCTGGAATTACAACACCAACATCACCGAGGAGAACGTGCAGAACATGAATAAC
GCTGGCGACAAGTGGAGCGCCTTCTTGAAGGAGCAATCCACCCTGGCCCAGATGTACCCGCTGCAA
GAGATACAGAACCTGACTGTGAAGCTGCAACTGCAGGCCCTGCAGCAGAACGGCTCCAGCGTGCTG
AGCGAAGACAAGAGCAAAAGGCTGAATACCATATTGAACACGATGAGCACCATCTACAGCACCGGC
AAAGTATGCAACCCCGACAACCCCCAAGAGTGTCTGTTGTTGGAACCCGGCCTGAACGAGATTATG
GCGAACTCCCTGGACTACAACGAACGCCTGTGGGCATGGGAGTCTTGGAGGTCAGAGGTTGGCAAG
CAACTGAGGCCGTTGTACGAAGAGTACGTGGTGCTGAAGAACGAAATGGCACGGGCCAATCATTAT
GAGGACTACGGTGATTATTGGAGGGGCGACTACGAGGTGAACGGCGTGGACGGCTACGACTATAGC
AGGGGCCAACTTATAGAGGACGTAGAGCACACTTTTGAGGAAATCAAACCCCTGTACGAGCACTTG
CATGCCTACGTACGCGCCAAACTGATGAATGCGTACCCCAGCTACATCAGCCCCATCGGCTGCCTG
CCCGCACACCTGCTCGGCGACATGTGGGGCCGATTCTGGACCAATCTGTATAGCCTCACCGTGCCC
TTTGGCCAGAAGCCGAACATAGATGTGACGGATGCTATGGTAGACCAGGCGTGGGATGCACAGCGC
ATCTTCAAGGAGGCCGAGAAGTTCTTCGTGAGCGTCGGCTTGCCCAACATGACCCAGGGTTTCTGG
GAGAACTCAATGCTGACTGACCCCGGCAACGTACAGAAAGCCGTATGCCACCCAACTGCTTGGGAC
CTGGGTAAGGGAGACTTCCGGATCCTCATGTGTACCAAGGTGACCATGGATGACTTTCTCACCGCC
CACAATGAAATGGGCAACATCCAGTACGATATGGCCTACGCAGCGCAGCCATTCCTTCTGAGGAAC
GGTGCCAACGAGGGCTTCCATGAGGCAGTCGGAGAGATCATGAGCCTGTCAGCGGCGACCCCTAAA
CATCTGAAGAGCATCGGGCTGCTGTCTCCGGACTTTCAAGAGGACAATGAGACTGAGATCAACTTC
CTCCTGAAACAGGCGCTGACCATTGTAGGCACCTTGCCCTTCACCTACATGCTGGAGAAGTGGCGA
TGGATGGTGTTTAAGGGCGAGATCCCGAAGGACCAGTGGATGAAAAAGTGGTGGGAGATGAAGAGG
GAGATCGTCGGCGTAGTTGAGCCGGTCCCCCACGACGAAACCTACTGCGATCCTGCCAGCCTGTTC
CACGTGAGCAACGATTACAGTTTTATCAGGTACTACACCAGGACCCTTTACCAATTTCAGTTCCAG
GAGGCACTGTGCCAGGCCGCCAAGCACGAAGGCCCCCTGCACAAGTGCGACATCAGCAACAGCACC
GAGGCGGGTCAAAAGCTGTTTAACATGCTGAGGCTGGGCAAGAGCGAGCCGTGGACCCTGGCCCTG
GAAAACGTTGTGGGCGCAAAAAACATGAACGTGAGGCCCCTGCTGAACTACTTCGAGCCCCTGTTC
ACCTGGCTGAAGGACCAGAACAAGAACAGTTTCGTGGGCTGGAGTACCGATTGGAGTCCCTATGCC
GACGGCGGAGGTGGTGCAGGAGGCGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCT
GAAGCCGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC
CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAAC
TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGC
ACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAG
TGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAG
CCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGC
CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAG
CCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGC
AAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAG
GCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO:59完整DF-COV-04核苷酸序列
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGCGGAGGTGGTGCAGGAGGCGGTGGAGCCGGTGGCGGAGGACAGTCAACAATCGAGGAGCAGGCAAAGACCTTCCTGGACAAGTTTAACCACGAAGCGGAGGACCTGTTCTACCAGAGCAGCCTGGCGAGCTGGAATTACAACACCAACATCACCGAGGAGAACGTGCAGAACATGAATAACGCTGGCGACAAGTGGAGCGCCTTCTTGAAGGAGCAATCCACCCTGGCCCAGATGTACCCGCTGCAAGAGATACAGAACCTGACTGTGAAGCTGCAACTGCAGGCCCTGCAGCAGAACGGCTCCAGCGTGCTGAGCGAAGACAAGAGCAAAAGGCTGAATACCATATTGAACACGATGAGCACCATCTACAGCACCGGCAAAGTATGCAACCCCGACAACCCCCAAGAGTGTCTGTTGTTGGAACCCGGCCTGAACGAGATTATGGCGAACTCCCTGGACTACAACGAACGCCTGTGGGCATGGGAGTCTTGGAGGTCAGAGGTTGGCAAGCAACTGAGGCCGTTGTACGAAGAGTACGTGGTGCTGAAGAACGAAATGGCACGGGCCAATCATTATGAGGACTACGGTGATTATTGGAGGGGCGACTACGAGGTGAACGGCGTGGACGGCTACGACTATAGCAGGGGCCAACTTATAGAGGACGTAGAGCACACTTTTGAGGAAATCAAACCCCTGTACGAGCACTTGCATGCCTACGTACGCGCCAAACTGATGAATGCGTACCCCAGCTACATCAGCCCCATCGGCTGCCTGCCCGCACACCTGCTCGGCGACATGTGGGGCCGATTCTGGACCAATCTGTATAGCCTCACCGTGCCCTTTGGCCAGAAGCCGAACATAGATGTGACGGATGCTATGGTAGACCAGGCGTGGGATGCACAGCGCATCTTCAAGGAGGCCGAGAAGTTCTTCGTGAGCGTCGGCTTGCCCAACATGACCCAGGGTTTCTGGGAGAACTCAATGCTGACTGACCCCGGCAACGTACAGAAAGCCGTATGCCACCCAACTGCTTGGGACCTGGGTAAGGGAGACTTCCGGATCCTCATGTGTACCAAGGTGACCATGGATGACTTTCTCACCGCCCACAATGAAATGGGCAACATCCAGTACGATATGGCCTACGCAGCGCAGCCATTCCTTCTGAGGAACGGTGCCAACGAGGGCTTCCATGAGGCAGTCGGAGAGATCATGAGCCTGTCAGCGGCGACCCCTAAACATCTGAAGAGCATCGGGCTGCTGTCTCCGGACTTTCAAGAGGACAATGAGACTGAGATCAACTTCCTCCTGAAACAGGCGCTGACCATTGTAGGCACCTTGCCCTTCACCTACATGCTGGAGAAGTGGCGATGGATGGTGTTTAAGGGCGAGATCCCGAAGGACCAGTGGATGAAAAAGTGGTGGGAGATGAAGAGGGAGATCGTCGGCGTAGTTGAGCCGGTCCCCCACGACGAAACCTACTGCGATCCTGCCAGCCTGTTCCACGTGAGCAACGATTACAGTTTTATCAGGTACTACACCAGGACCCTTTACCAATTTCAGTTCCAGGAGGCACTGTGCCAGGCCGCCAAGCACGAAGGCCCCCTGCACAAGTGCGACATCAGCAACAGCACCGAGGCGGGTCAAAAGCTGTTTAACATGCTGAGGCTGGGCAAGAGCGAGCCGTGGACCCTGGCCCTGGAAAACGTTGTGGGCGCAAAAAACATGAACGTGAGGCCCCTGCTGAACTACTTCGAGCCCCTGTTCACCTGGCTGAAGGACCAGAACAAGAACAGTTTCGTGGGCTGGAGTACCGATTGGAGTCCCTGA
*表1-7中包含蛋白质的直系同源物,以及包括氨基酸序列的多肽分子,所述氨基酸序列表1或5-7中列出的任何SEQ ID NO的氨基酸序列或其一部分在其全长上具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更多同一性。此类多肽可以具有如本文进一步描述的全长多肽的功能。
*表8中包含RNA核酸分子(例如,用尿苷代替的胸腺嘧啶)、编码经编码的蛋白质的直系同源物的核酸分子,以及包括核酸序列的DNA或RNA核酸序列,所述核酸序列与表8中列出的任何SEQ ID NO的核酸序列或其一部分在其全长上具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更多同一性。此类核酸分子可以具有如本文进一步描述的全长核酸的功能。
*表6中包含的SEQ ID NO:45-47是使用“Eu”编号系统编号的全长IgG1、IgG2和IgG4序列,其也用于本文所描述的Fc结构域取代。IgG1、IgG2和IgG4的CH1结构域的编号相同。但是,因为铰链区的长度不同,所以在IgG1、IgG2和IgG4中铰链、CH2和CH3结构域内的编号不同。Eu编号系统可以用于代替IMGT和Kabat系统(参见www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html和Edelman等人,(1969)《美国国家科学院院刊》63:78-85)。
II.试剂和组合物
a.核酸
本发明涵盖的一方面涉及编码结合冠状病毒(例如,SARS-CoV-2)的ACE2-Fc融合多肽的核酸分子。在一个实施例中,本发明的核酸编码结合冠状病毒(例如,SARS-CoV-2)的ACE2-Fc融合多肽,由此竞争性地抑制病毒结合细胞表面表达的内源性ACE2,其中所述多肽包括1)与以下中任一个的ACE2胞外结构域或其片段、氨基酸序列具有至少70%、80%、90%或更大同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:1-4;2)与以下中任一个的Fc结构域或其片段、氨基酸序列具有至少70%、80%、90%或更大同一性的氨基酸序列的Fc结构域或其片段、多肽:SEQ ID NO:33-42或55;以及3)ACE2胞外结构域或其片段与Fc结构域或片段之间的中间铰链多肽,其中所述铰链多肽具有以下中的任一个的氨基酸序列:SEQ ID NO:5-32或52。
如本文所使用的,术语“核酸分子”旨在包含DNA分子(即cDNA或基因组DNA)和RNA分子(即mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链DNA。
本发明所涵盖的核酸分子编码本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽,其中所述ACE2-Fc融合多肽包括ACE2胞外结构域或其片段、铰链多肽和Fc结构域或其片段。由核酸编码的ACE2胞外结构域或其片段具有表1中所示的氨基酸序列,或与表1中示出的氨基酸序列或其一部分(即,100个、200个、300个、400个、450个、500个或更多个氨基酸残基)至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或至少约95%或更多(例如,约98%)同源的氨基酸序列,并且其中所述核酸其中所述核酸分子编码的多肽在对应于H374N和H378N的位置进一步包括氨基酸取代。在一些实施例中,其中由核酸分子编码的多肽的核酸在对应于R273Q、H345A、H345L、H505A和H505L的位置处进一步包括一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中,核酸分子在对应于R169Q、W271Q和K481Q的位置处进一步包括氨基酸取代。上述氨基酸取代与全长ACE2多肽有关。在一些实施例中,所述核酸编码ACE2胞外结构域,所述胞外结构域包括全长ACE2多肽的氨基酸18-600、18-615、18-708或18-740。
由本发明所涵盖的核酸分子编码的Fc结构域或其片段具有表5中所示的氨基酸序列,或与表5中示出的氨基酸序列或其一部分(即,100个、200个、300个、400个、450个、500个或更多个氨基酸残基)至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或至少约95%或更多(例如,约98%)同源的氨基酸序列。Fc结构域或其片段可以在其核酸序列中包括导致Fc多肽与减弱的Fc受体(即FcγIIaR)结合的变体。例如,包括S228P和/或L235E点取代的人IgG4 Fc结构域或其片段可以减弱Fc与FcγR(例如,FcγIIa受体)的结合。在一个实施例中,Fc结构域片段包括S228或L235E氨基酸取代。在一些实施例中,Fc结构域片段包括S228P和L235E氨基酸取代。可以减弱或消除Fc结构域或其片段与FcγR(例如,FcγIIa受体)结合的其它取代包含IgG1Fc结构或其片段中的L234A、L235A、N297X和/或P329G突变体。因此,在一些实施例中,Fc结构域片段包括L234A和L235A氨基酸取代。在一些实施例中,Fc结构域片段包括L234A、L235A、N297A、N297D和/或P329G氨基酸取代。在仍其它实施例中,Fc结构域片段包括L234A和N297A或N297D氨基酸取代。在仍其它实施例中,Fc结构域片段包括L235A和N297A或N297D氨基酸取代。在一些实施例中,Fc结构域片段包括L234A、L235A和P329G氨基酸取代。氨基酸取代与全长IgG Fc结构域有关。在一些实施例中,铰链多肽可以包括减弱Fab臂交换的突变。例如,在一些实施例中,铰链区包括来自表2的氨基酸序列,其中每个包括S228P取代。通常,S228P取代抑制Fab臂交换,这在IgG4抗体中自然发生,并且S228P对Fcγ受体结合没有影响。IgG4 Fc结构域对Fcγ受体的亲和力低于IgG1,并且L235E取代进一步降低这种亲和力。Fc结构域或其片段可以进一步包括另外的取代(例如,L235E取代)以减弱或消除Fc结构域或其片段与Fc受体的结合。
编码其它ACE2-Fc融合多肽并因此具有不同于编码表1-7中所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段的核酸序列的核酸分子包含在本发明中。此外,编码来自不同物种(如来自人科动物)的ACE2-Fc融合多肽的核酸分子,并且因此具有与编码表1-7中所示的氨基酸序列的核苷酸序列不同的核苷酸序列,也旨在位于在本发明所涵盖的范围内。例如,编码ACE2-Fc融合多肽的黑猩猩核酸序列可以基于人ACE2-Fc融合多肽的核苷酸序列来鉴定。
在一个实施例中,本发明的核酸分子编码包含与表1和5-7中所示的氨基酸序列充分同源的氨基酸序列的蛋白质或其部分,使得融合蛋白或其部分能够与冠状病毒(例如,SARS-CoV-2)结合并且对Fc受体(例如,FcγIIa受体)的结合亲和力降低或没有结合亲和力。用于测量每种此类生物特性的方法和测定是本领域众所周知的,并且在下文的实例和上文的定义中描述了代表性的非限制性实施例。
如本文所使用的,语言“充分同源”是指具有包含与表1-7所示的氨基酸序列或其片段相同或等同的氨基酸残基的最少数量的氨基酸序列的蛋白质或其部分(例如,与表1-7所示的氨基酸序列中的氨基酸残基或其片段具有类似侧链的氨基酸残基),使得蛋白质或其部分(即ACE2胞外结构域或其片段)与冠状病毒(例如,SARS-CoV-2)结合。
在另一个实施例中,所述蛋白质与表1-7中所示的氨基酸序列的整个氨基酸序列或其片段具有至少约50%、或至少约60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的同源性。
在一些实施例中,由本发明所涵盖的ACE2-Fc融合核酸分子编码的蛋白质的部分是ACE2-Fc融合多肽的生物活性部分。如本文所使用的,术语“ACE2-Fc融合多肽的生物活性部分”旨在包含与冠状病毒(例如,SARS-CoV2病毒)结合的ACE2-Fc融合多肽的一部分,即ACE2胞外结构域或其片段。在一些实施例中,ACE2-Fc融合多肽不具有全长ACE2多肽的其它活性。
可以进行标准结合测定,例如本文所描述的免疫沉淀和酵母双杂交测定或功能测定,例如RNAi或过表达实验,以确定ACE2-Fc融合多肽或其生物活性片段维持全长ACE2多肽的冠状病毒结合活性的能力。
本发明进一步涵盖与编码表1-7中所示氨基酸序列或其片段的核苷酸序列不同的核酸分子,所述核苷酸序列由于遗传密码的退化而编码相同的多肽或其片段。在另一个实施例中,本发明的核酸分子具有编码具有表1-7中所示氨基酸序列或其片段的蛋白质的核苷酸序列,或具有与表1-7中所示氨基酸序列或其片段具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同源性的氨基酸序列的蛋白质,或与表1-7所示的氨基酸序列相差至少1个、2个、3个、5个或10个氨基酸但不超过30个、20个、15个氨基酸。在另一个实施例中,编码ACE2-Fc融合多肽的核酸由编码长度小于195个、190个、185个、180个、175个、170个、165个、160个、155个、150个、145个、140个、135个、130个、125个、120个、115个、110个、105个、100个、95个、90个、85个、80个、75个或70个氨基酸的全长ACE2-Fc融合多肽的一部分的核酸序列组成。
本领域技术人员将认识到,可以通过突变将改变引入编码具有表1-7中所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列或其片段,由此导致编码的ACE2-Fc融合多肽的氨基酸序列的改变,而不改变修饰的多肽的功能能力。例如,可以在序列中进行导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸取代的核苷酸取代。“非必需”氨基酸残基是可以从ACE2-Fc融合多肽的序列(例如,表1-7中所示的序列或其片段)改变而不显著改变ACE2-Fc融合多肽的活性的残基,而ACE2-Fc融合多肽活性(即与冠状病毒(例如,SARS-CoV-2)结合)需要“必需”氨基酸残基。然而,其它氨基酸残基(例如,在小鼠和人之间不保守或仅半保守的那些氨基酸残基)可能不是活性所必需的,并且因此可能在不改变ACE2-Fc融合多肽活性的情况下易于改变。
因此,本发明所涵盖的另一方面涉及编码ACE2-Fc融合多肽的核酸分子,其含有对ACE2-Fc融合多肽活性不是必需的氨基酸残基的变化。此类ACE2-Fc融合多肽的氨基酸序列不同于表1-7中所示的氨基酸序列或其片段,但保留了本文所描述的ACE2-Fc融合多肽的冠状病毒结合活性。在一个实施例中,所述核酸分子包括编码蛋白质的核苷酸序列,其中所述蛋白质缺少一个或多个经修饰的ACE2-Fc融合多肽结构域(例如,铰链或Fc结构域可能缺失,但ACE2胞外结构域必须存在,因为其负责结合冠状病毒)。如定义部分所述,ACE2-Fc融合多肽的结构-功能关系是已知的,使得普通技术人员容易理解在保持ACE2结构域的冠状病毒结合活性的同时可能发生突变或以其它方式改变的区域。
如本文所使用的,“序列同一性或同源性”是指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性。当所述两个比较序列中的一个位置被同一碱基或氨基酸单体亚基占据时,例如如果两个DNA分子中的每个分子中的一个位置被腺嘌呤占据,则所述分子在那个位置处是同源的或序列同一的。两个序列之间同源性或序列同一性的百分比是两个序列共享的匹配或同源相同位置的数量除以比较位置的数量×100的函数。例如,如果两个序列中的10个位置中的6个相同,则两个序列60%同源或具有60%的序列同一性。例如,DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50%的同源性或序列同一性。通常,当两个序列被比对以给出最大同源性时进行比较。除非另有规定,否则“环出区域”,例如,由其中一个序列中的缺失或插入引起的区域被算作不匹配。
序列的比较和两个序列之间的同源性百分比的确定可以使用数学算法实现。可以使用Clustal方法进行比对。多个比对参数包含GAP罚分=10,Gap长度罚分=10。对于DNA比对,成对比对参数可以是Htuple=2,Gap罚分=5,窗口=4,并且保存的对角线=4。对于蛋白质比对,成对比对参数可以是Ktuple=1,Gap罚分=3,窗口=5,并且保存的对角线=5。
在一个实施例中,两个氨基酸序列之间的同一性百分比是使用已经合并到GCG软件包(可在线获得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch,(《分子生物学杂志》(48):444-453(1970))算法,使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵和以及空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6确定的。在又另一个实施例中,两个核苷酸序列之间的同一性百分比是使用GCG软件包(可在线获得)中的GAP程序,使用NWSgapdna.CMP矩阵以及空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6确定的。在另一个实施例中,使用已合并在ALIGN程序(版本2.0)(可在线获得)中的E.Meyers和W.Miller(《计算机在生物科学中的应用》,4:11-17(1989))的算法,使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12以及空位罚分4来测定两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性。
编码ACE2-Fc融合多肽的核酸分子包括与表1-7所示的蛋白质结构域同源的结构域或其片段,可以通过向编码多肽结构域或其片段的核苷酸序列或同源核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失来产生,使得一个或更多个氨基酸取代、添加和缺失被引入编码的蛋白质中。突变可通过标准技术(如定点诱变和PCR介导突变)引入编码表1-7中所示的多肽结构域的核苷酸序列或其片段或同源核苷酸序列。在一些实施例中,在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的取代。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包含具有碱性侧链的氨基酸(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如,天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有支链侧链的氨基酸(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此,ACE2-Fc融合多肽中预测的非必需氨基酸残基被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。可替代地,在另一个实施例中,突变可以沿着ACE2-Fc融合多肽编码序列的全部或部分随机引入,如通过饱和诱变,并且可以针对本文所描述的ACE2-Fc融合多肽活性筛选所得突变体,以鉴定保留ACE2-Fc融合多肽活性的突变体。在对编码表1-7中所示的一个或多个多肽结构域的核苷酸序列或其片段进行诱变之后,可以重组表达编码的蛋白质(如本文所描述的),并且可以使用例如本文所描述的测定来确定蛋白质的活性。
可以通过用于检测转录分子或蛋白质表达的多种众所周知的方法中的任何方法来评估ACE2-Fc融合多肽的水平。此类方法的非限制性实例包含用于检测蛋白质的免疫学方法、蛋白质纯化方法、蛋白质功能或活性测定、核酸杂交方法、核酸逆转录方法和核酸扩增方法。
在一些实施例中,ACE2-Fc融合多肽的水平通过测量基因转录物(例如,mRNA)、通过测量翻译蛋白质的量或通过测量基因产物活性来确定。可以通过多种方式监测表达水平,所述方式包含通过检测mRNA水平、蛋白质水平或蛋白质活性,其中任何一种都可以使用标准技术进行测量。检测可以涉及基因表达水平的定量(例如,基因组DNA、cDNA、mRNA、蛋白质或酶活性),或者可替代地可以是基因表达水平的定性评估,特别是与对照水平相比。检测到的级别的类型从上下文将显而易见。
在特定的实施例中,ACE2-Fc融合多肽mRNA表达水平可以使用本领域已知的方法通过生物样品中的原位和体外形式来测定。术语“生物样品”旨在包含从受试者分离的组织、细胞、生物流体以及其分离物,以及受试者体内存在的组织、细胞和流体。许多表达检测方法使用分离的RNA。对于体外方法,任何不选择分离mRNA的RNA分离技术都可以用于从细胞中纯化RNA(参见例如,Ausubel等人,编辑,《当代分子生物学实验指南》,纽约约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons,New York)1987-1999)。另外,可以使用本领域技术人员熟知的技术,例如Chomczynski的单步RNA分离过程(1989,美国专利第4,843,155号)容易地处理大量组织样品。
分离的mRNA可以用于杂交或扩增测定,包含但不限于Southern分析或Northern分析、聚合酶链式反应分析和探针阵列。
在一种形式中,mRNA被固定在固体表面上并与探针接触,例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移到膜,如硝酸纤维素。在替代形式中,探针固定在固体表面上,并且mRNA与探针接触,例如,在基因芯片阵列中,例如,AffymetrixTM基因芯片阵列。本领域技术人员可以容易地调整已知的mRNA检测方法以用于检测ACE2-Fc融合mRNA表达水平的水平。
测定样品中ACE2-Fc融合mRNA表达水平的替代方法涉及核酸扩增过程,例如,通过rtPCR(Mullis,1987,美国专利第4,683,202号中所阐述的实验实施例)、连接酶链式反应(Barany,1991,《美国国家科学院院刊》,88:189-193)、自持序列复制(Guatelli等人,1990,《美国国家科学院院刊》87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等人,1989,《美国国家科学院院刊》86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等人,1988,《生物/技术(Bio/Technology)》6:1197)、滚环复制(Lizardi等人,美国专利第5,854,033号)或任何其它核酸扩增方法,然后使用本领域技术人员众所周知的技术检测扩增的分子。如果此类核酸分子以非常低的数量存在,则这些检测方案对于检测核酸分子特别有用。如本文所使用的,扩增引物被定义为一对核酸分子,其可以退火到基因的5'或3'区域(分别为正链和负链,反之亦然),并且在其间含有短区域。通常,扩增引物的长度约为10个至30个核苷酸,并且侧接长度约为50个至200个核苷酸的区域。在合适的条件下并且使用合适的试剂,此类引物允许扩增包括引物侧接的核苷酸序列的核酸分子。
对于原位方法,在检测之前不需要从细胞中分离mRNA。在此类方法中,使用已知的组织学方法制备/处理细胞或组织样品。然后将样品固定在载体上,通常是载玻片,然后与可以与ACE2-Fc融合多肽mRNA杂交的探针接触。
作为基于ACE2-Fc融合多肽表达水平的绝对值进行测定的替代方案,可以基于归一化的ACE2-Fc融合多肽表达水平进行确定。通过将其表达与非ACE2-Fc融合多肽基因(例如,组成性表达的管家基因)的表达进行比较来校正绝对ACE2-Fc融合多肽表达水平,从而使表达水平归一化。用于归一化的合适基因包含管家基因,如肌动蛋白基因或上皮细胞特异性基因。这种归一化允许将一个样品(例如,受试者样品)中的表达水平与另一个样品(例如,正常样品)或来自不同来源的样品之间的表达水平进行比较。
ACE2-Fc融合多肽的水平或活性也可以通过检测或定量表达的多肽来检测和/或定量。可以通过本领域技术人员众所周知的多种方法中的任何方法来检测和定量ACE2-Fc融合多肽。这些可以包含分析生物化学方法,如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、超扩散色谱法等,或各种免疫学方法,如流体或凝胶沉淀反应、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、蛋白质印迹等。本领域技术人员可以容易地调整已知的蛋白质/抗体检测方法,用于确定细胞是否表达ACE2-Fc融合多肽。
b.重组表达载体和宿主细胞
本发明的另一方面涉及含有编码ACE2-Fc融合多肽(或其一部分)的核酸的载体(例如,表达载体)的用途。如本文所使用的,术语“载体”是指能够转运其已经连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”,其是指可以将另外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体,其中可以将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其被引入到其中的宿主细胞中进行自主复制(例如,具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如,非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中时被整合到所述宿主细胞的基因组中,并且由此与宿主基因组一起复制。此外,某些载体能够指导与其操作性地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。通常,可用于重组DNA技术的表达载体通常呈质粒形式。在本说明书中,“质粒”和“载体”可以互换使用,因为质粒是最常用的载体形式。然而,本发明旨在包含提供同等功能的此类其它形式的表达载体,如病毒载体(例如,复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。在一个实施例中,使用包括ACE2-Fc融合核酸分子的腺病毒载体。
本发明所涵盖的重组表达载体包括呈适合在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明的核酸,这意味着重组表达载体包含一个或多个调控序列,所述调控序列基于用于表达的宿主细胞而选择,其与待表达的核酸序列操作性地连接。在重组表达载体中,“可操作地连接”旨在意指所关注的核苷酸序列(例如,在体外转录/翻译系统中或在将载体引入宿主细胞时在宿主细胞中)以允许表达核苷酸序列的方式与调节序列连接。术语“调节序列”旨在包含启动子、增强子和其它表达控制元件(例如,多腺苷酸化信号)。此类调控序列在例如以下中进行了描述:Goeddel;《基因表达技术:酶学方法(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology)》185,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(Academic Press,San Diego,CA)(1990)。调节序列包含指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如,组织特异性调节序列)。本领域技术人员应了解,表达载体的设计可以取决于如要转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等因素。本发明的表达载体可以引入宿主细胞中,由此产生如由如本文所描述的核酸编码的包含融合蛋白或肽的蛋白或肽。
本发明的重组表达载体可以设计用于在原核或真核细胞中表达ACE2-Fc融合多肽。例如,ACE2-Fc融合多肽可以在细菌细胞(如大肠杆菌(E.coli))、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在以下中进行了进一步讨论:Goeddel,《基因表达技术:酶学方法》185,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(1990)。可替代地,重组表达载体可以在体外例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶来转录和翻译。
蛋白质在原核生物中的表达最经常在大肠杆菌中用含有引导融合或非融合蛋白的表达的组成性或诱导型启动子的载体来进行。融合载体将许多氨基酸添加到其中所编码的蛋白质,通常添加到重组蛋白的氨基端。此类融合载体通常有三个目的:1)增加重组蛋白的表达;2)增加重组蛋白的溶解度;以及3)通过在亲和纯化中作为配体来帮助纯化重组蛋白。通常,在融合表达载体中,将蛋白剪切位点引入到融合部分与重组蛋白的接合处以使得能够在纯化融合蛋白之后将重组蛋白与融合部分分离。此类酶和其同源识别序列包含因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包含pGEX(法玛西亚生物技术公司(PharmaciaBiotech Inc);Smith,D.B.和Johnson,K.S.(1988)《基因(Gene)》67:31-40)、pMAL(马萨诸塞州贝弗利的新英格兰实验室(New England Biolabs,Beverly,MA))以及pRIT5(新泽西州皮斯卡塔韦的法玛西亚公司(Pharmacia,Piscataway,NJ)),它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白质A融合到靶向重组蛋白。在一个实施例中,将ACE2-Fc融合多肽的编码序列克隆到pGEX表达载体中,以产生编码融合蛋白的载体,所述融合蛋白从N末端到C末端包括GST凝血酶切割位点-ACE2-Fc融合多肽。融合蛋白可以通过使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂的亲和色谱法纯化。未融合到GST的重组ACE2-Fc融合多肽可以通过用凝血酶切割融合蛋白来回收。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包含pTrc(Amann等人,1988,《基因》69:301-315)和pET 11d(Studier等人,《基因表达技术:酶学方法》185,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(1990)60-89)。pTrc载体的靶基因表达依赖于宿主RNA聚合酶从杂合trp-lac融合启动子的转录。pET 11d载体的靶基因表达依赖于由共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介导的T7 gn10-lac融合启动子的转录。在lacUV 5启动子的转录控制下,此病毒聚合酶由来自具有T7 gn1基因的常驻λ原噬菌体的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供。
将大肠杆菌中的重组蛋白表达最大化的一种策略是在蛋白裂解重组蛋白的能力被削弱的细菌宿主中表达所述蛋白(Gottesman,《基因表达技术:酶学方法》185,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(1990)119-128)。另一种策略是改变待插入表达载体中的核酸的核酸序列以使得每个氨基酸的单独密码子是在例如大肠杆菌中使用的那些密码子(Wada等人,(1992)《核酸研究》20:2111–2118)。本发明的核酸序列的此类改变可以通过标准DNA合成技术来进行。
在另一个实施例中,ACE2-Fc融合多肽表达载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母(S.cerivisae)中表达的载体的实例包含pYepSec1(Baldari等人,(1987),《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)》6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,(1982),《细胞》30:933-943)、pJRY88(Schultz等人,(1987),《基因》54:113-123)和pYES2(加利福尼亚州圣地亚哥的英杰公司(Invitrogen Corporation,San Diego,CA))。
可替代地,ACE2-Fc融合多肽可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如,Sf 9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包含pAc系列(Smith等人,(1983)《分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)》3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers,(1989),《病毒学(Virology)》170:31-39)。
在又另一个实施例中,使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本发明的核酸。哺乳动物表达载体的实例包含pCDM8(Seed,B.(1987)《自然》329:840)和pMT2PC(Kaufman等人,(1987)《欧洲分子生物学学会杂志》6:187-195)。当用于哺乳动物细胞中时,表达载体的对照功能经常由病毒调控元件来提供。例如,常用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于原核和真核细胞的其它合适的表达系统,参见以下中的第16章和第17章:Sambrook,J.,Fritsh,E.F.和Maniatis,T.《分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.)》第2版,冷泉港实验室(Cold SpringHarbor Laboratory),纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY),1989。
在另一个实施例中,重组哺乳动物表达载体能够引导核酸在特定细胞类型中表达(例如,使用组织特异性调控元件来表达核酸)。组织特异性调控元件在本领域中是已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包含白蛋白启动子(肝脏特异性;Pinkert等人,(1987)《基因与发育(Genes Dev.)》1:268-277)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton,(1988),《免疫学进展(Adv.Immunol.)》43:235-275),特别是T细胞受体(Winoto和Baltimore,(1989),《欧洲分子生物学学会杂志》8:729-733)和免疫球蛋白(Banerji等人,(1983)《细胞》33:729-740;Queen和Baltimore,(1983),《细胞》33:741-748)的启动子、神经元特异性启动子(例如,神经丝启动子;Byrne和Ruddle(1989)《美国国家科学院院刊》86:5473-5477)、胰腺特异性启动子(Edlund等人,(1985)《科学》230:912-916)和乳腺特异性启动子(例如,乳清启动子;美国专利第4,873,316号和欧洲申请公开第264,166号)。还涵盖发育性调控启动子,例如,鼠科动物同源框蛋白(hox)启动子(Kessel和Gruss,(1990),《科学》249:374-379)和α-胎蛋白启动子(Campes和Tilghman,(1989),《基因与发育》3:537–546)。
本发明所涵盖的另一方面涉及其中已引入本发明所涵盖的重组表达载体或核酸的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应理解此类术语不仅涉及具体受试者细胞,而且涉及这种细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后续世代中发生,所以此类后代实际上可能不与亲本细胞相同,但仍包含在如本文中所使用的术语的范围内。
宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如,ACE2-Fc融合多肽可以在如大肠杆菌等细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞(如Fao肝癌细胞、原代肝细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。其它合适的宿主细胞是本领域的技术人员已知的。
载体DNA可以通过常规转化或转染技术而引入原核或真核细胞中。如本文所使用的,术语“转化”和“转染”旨在指用于向宿主细胞中引入外源核酸(例如,DNA)的多种领域公认的技术,包含磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖介导的转染法、脂质转染法或电穿孔法。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook等人,《分子克隆:实验室手册》第2版,冷泉港实验室,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社,1989,以及其它实验室手册。
细胞培养物包含宿主细胞、培养基和其它副产物。用于细胞培养的合适培养基是本领域众所周知的。ACE2-Fc融合多肽或其片段可以从细胞和含有所述多肽的培养基的混合物中分泌和分离。可替代地,ACE2-Fc融合多肽或其片段可以以细胞质方式保留,并且采集、裂解细胞并分离融合蛋白。ACE2-Fc融合多肽或其片段可以使用本领域已知的用于纯化蛋白质的技术(包含离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、超滤、电泳)从细胞培养基、宿主细胞或两者中分离,以及用对ACE2-Fc融合多肽或其片段的特定表位具有特异性的抗体进行免疫亲和性纯化。
在一些实施例中,ACE2-Fc融合多肽或其生物活性片段可以与异源多肽融合。在某些实施例中,融合的多肽的半衰期大于对应的未融合ACE2多肽。在其它实施例中,根据本领域已知的标准方法,异源标签可以用于纯化目的(例如,表位标签)。
因此,编码ACE2-Fc融合多肽的全部或选定部分的核苷酸序列可以用于通过微生物或真核细胞过程产生重组形式的蛋白质。将序列连接到多核苷酸构建体(如表达载体)中,并且转化或转染到真核(酵母、鸟类、昆虫或哺乳动物)或原核(细菌细胞)宿主中是标准程序。根据主题发明,通过微生物手段或组织培养技术,可以采用类似的程序或其修改来制备重组ACE2-Fc融合多肽或其片段。
在另一种变化中,可以使用体外翻译系统实现蛋白质生产。体外翻译系统通常是一种翻译系统,其是一种游离提取物,至少含有将RNA分子翻译成蛋白质所需的最少元件。体外翻译系统通常至少包括核糖体、tRNA、引发剂甲硫氨酰基-tRNAMet、参与翻译的蛋白质或复合物,例如,eIF2、eIF3、包括帽结合蛋白(CBP)的帽结合(CB)复合物和真核起始因子4F(eIF4F)。各种体外翻译系统在本领域中是众所周知的,并且包含可商购获得的试剂盒。体外翻译系统的实例包含真核裂解物,如兔网织红细胞裂解物、兔卵母细胞裂解物,人细胞裂解物、昆虫细胞裂解物和小麦胚芽提取物。裂解物可从制造商商购获得,如威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega Corp.,Madison,Wis.);加利福尼亚州拉荷亚的Stratagene公司(Stratagene,La Jolla,Calif.);伊利诺伊州阿灵顿高地的安玛西亚公司(Amersham,Arlington Heights,Ill.);以及纽约州格兰德岛的GIBCO/BRL公司(GIBCO/BRL,GrandIsland,N.Y)。体外翻译系统通常包括大分子,如酶、翻译、起始和延伸因子、化学试剂和核糖体。另外,可以使用体外转录系统。此类系统通常至少包括RNA聚合酶全酶、核糖核苷酸和任何必要的转录起始、延伸和终止因子。体外转录和翻译可以在一锅式反应中耦接,以从一个或多个分离的DNA产生蛋白质。
在某些实施例中,ACE2-Fc融合多肽或其片段可以化学合成,在游离系统中以核糖体方式合成,或在细胞内以核糖体方式合成。可以使用各种现有技术公认的方法进行化学合成,包含逐步固相合成、通过构象辅助的肽片段再连接的半合成、克隆或合成肽片段的酶连接和化学连接。天然化学连接使用两个未保护的肽片段的化学选择性反应来产生瞬时硫酯连接的中间体。然后瞬时硫酯连接的中间体自发地进行重排,以提供在连接位点处具有天然肽键的全长连接产物。全长连接产物在化学上与游离合成产生的蛋白质相同。如果允许,全长连接产物可以被重折叠和/或氧化,以形成天然的含二硫的蛋白质分子。(参见例如,美国专利第6,184,344号和第6,174,530号;以及T.W.Muir等人,(1993)《当代生物技术观点(Curr.Opin.Biotech.)》,第4卷,第420页;M.Miller等人,(1989)《科学》:第246卷,第1149页;A.Wlodawer等人,(1989)《科学》:第245卷,第616页;L.H.Huang等人,(1991)《生物化学(Biochemistry)》:第30卷,第7402页;M.Sclmolzer等人,(1992)《国际肽和蛋白质研究杂志(Int.J.Pept.Prot.Res.)》:第40卷,第180-193页;K.Rajarathnam等人,(1994)《科学》:第264卷,第90页;R.E.Offord,“蛋白质工程化的化学方法(Chemical Approaches toProtein Engineering)”,《蛋白质设计与新治疗和疫苗的开发(Protein Design and theDevelopment of New therapeutics and Vaccines)》,J.B.Hook,G.Poste,编辑,(纽约普莱南出版社(Plenum Press,New York),1990)第253-282页;C.J.A.Wallace等人,(1992)《生物化学杂志》:第267卷,第3852页;L.Abrahmsen等人,(1991)《生物化学》:第30卷,第4151页;T.K.Chang等人,(1994)《美国国家科学院院刊》91:12544-12548;M.Schnlzer等人,(1992),《科学》:第3256卷,第221页;以及K.Akaji等人,(1985)《化学与药学通报(Chem.Pharm.Bull.)》(东京(Tokyo))33:184)。
为了稳定转染哺乳动物细胞,已知取决于所使用的表达载体和转染技术,只有小部分的细胞可以将外源DNA并入其基因组中。为了鉴定并且选择这些整合体,通常将编码可选择标志物(例如,抗生素抗性)的基因与所关注的基因一起引入宿主细胞中。可选择的标志物包含但不限于对药物产生耐药性的标记,如G418、潮霉素(hygromycin)和甲氨蝶呤。编码可选择标志物的核酸可以在与编码ACE2-Fc融合多肽的载体相同的载体上引入宿主细胞中,或可以在单独的载体上引入。用所引入的核酸稳定转染的细胞可以通过药物选择来鉴定(例如,并入可选择标志基因的细胞将存活,而其它细胞将死亡)。
本发明所涵盖的宿主细胞,如培养物中的原核或真核宿主细胞,可以用于产生(即表达)ACE2-Fc融合多肽。因此,本发明进一步提供了使用本发明的宿主细胞产生ACE2-Fc融合多肽的方法。在一个实施例中,所述方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已引入编码ACE2-Fc融合多肽的重组表达载体),直到产生ACE2-Fc融合多肽。在另一个实施例中,所述方法进一步包括从培养基或宿主细胞分离ACE2-Fc融合多肽。
c.ACE2-Fc融合多肽
本发明还提供了可溶性、纯化的和/或分离形式的ACE2-Fc融合多肽,其结合冠状病毒(例如,SARS-CoV-2,COVID-19的致病媒介,以及SARS-CoV-1,SARS的致病媒介),并且竞争性地抑制病毒与细胞表面内生表达的ACE2结合。ACE2-Fc融合蛋白可以包括ACE2多肽的胞外结构域或其一部分和免疫球蛋白多肽(例如,IgG1、IgG2或IgG4多肽)的Fc结构域或其片段。ACE2胞外结构域或其片段和Fc结构域通过铰链多肽分离。在一些实施例中,ACE2胞外结构域或其片段和Fc结构域被单个脯氨酸或半胱氨酸-脯氨酸二肽分离。在一些实施例中,编码ACE2-Fc融合多肽的核酸包括与人ACE2胞外结构域或其片段具有至少70%、80%、90%或更大同一性的氨基酸序列、以下中的任一个的氨基酸序列:SEQ ID NO:1-4、铰链的氨基酸序列,所述铰链包括以下中的任一个的氨基酸序列:SEQ ID NO:5-32或52,以及与以下中的任一个的Fc结构域或其片段、氨基酸序列具有至少70%、80%、90%或更大同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:33-42或55。ACE2-Fc融合多肽可以根据本文所描述的方法使用。
一方面,ACE2-Fc融合多肽包括人ACE2胞外结构域或其片段,其具有以下中的任一个的氨基酸序列:SEQ ID NO:1-4,其包括类似于野生型ACE2多肽或人ACE2胞外结构域或其片段中H374N和H378N氨基酸取代的氨基酸取代,其具有以下中的任一个的氨基酸序列:SEQID NO:1-4,其包括H374N和H378N氨基酸取代以及1个至约20个另外的保守氨基酸取代。在一些实施例中,ACE2胞外结构域在对应于H374N和H378N的位置处包括氨基酸取代。在一些实施例中,ACE2胞外结构域在对应于R273Q、H345A、H345L、H505A和H505L的位置处包括一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中,ACE2胞外结构域在对应于R169Q、W271Q和K481Q的位置处包括氨基酸取代。上述氨基酸取代与全长ACE2多肽有关。在一些实施例中,所述核酸编码ACE2胞外结构域,所述胞外结构域包括全长ACE2多肽的氨基酸18-600、18-615、18-708或18-740。
本文设想了降低ACE2胞外结构域的酶活性的点取代。在一些实施例中,点取代导致ACE2活性的更大降低,而其它降低了ACE2对SARS-CoV-2或SARS-CoV刺突蛋白(S蛋白)的结合亲合力。需要保持与S蛋白的紧密结合。
为了清楚起见,SEQ ID NO:1-4在氨基酸残基位置357和361处包括天冬酰胺残基。所述残基降低或消除ACE2多肽的酶活性,而不抑制与冠状病毒的结合。本文所描述的任何ACE2胞外结构域或其片段、多肽的氨基酸序列也可以与人ACE2胞外结构域或其片段、氨基酸序列或其片段至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%相同。
本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽还包括Fc结构域片段。完整IgG抗体的Fc结构域通过与其Fcγ受体(例如,FcγIIa受体)结合,负责抗体效应子功能,如抗体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞吞噬作用(Kand和Jung(2019)《实验与分子医学(Exp.&Mol.Med.)》,51:138-46;Moi等人,(2010)《通用病毒学杂志(J.Gen.Virol.)》,91:103-11;Jiang等人,(2011)《自然评论药物发现(Nat.Reviews Drug Discovery)》,10:101-10)。重组Fc结构域可以被工程化,使得Fc结构域不与Fcγ受体(例如,FcγIIa受体)结合,或至少具有减弱的Fcγ受体(例如,FcγIIa受体)的结合活性(Saunders(2019)《免疫学前沿(FrontiersImmunology)》,10:第1296章;Shotlothauer等人,(2016)《蛋白质工程设计与选择(Prot.Eng.,Design&Selection)》,29(10):457-66)。另外,Fc结构域或其片段在并入治疗多肽(即ACE2-Fc融合多肽)时提供了另外的益处,如但不限于增加循环寿命(Saunders(2019))。
在一些实施例中,Fc结构域包括以下中的任一个的氨基酸序列:SEQ ID NO:33-42或55。在一些实施例中,Fc结构域片段源自IgG1、IgG2或IgG4 Fc结构域。在一些实施例中,Fc结构域片段对Fcγ受体(例如,FcγIIa受体)的结合亲和力降低。Fc结构域中的氨基酸取代可以降低Fcγ受体(例如,FcγIIa受体)的结合亲和力;因此,在一些实施例中,本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽包括源自IgG1 Fc结构域的Fc结构域片段,其具有L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G或其组合的氨基酸取代。在一些实施例中,本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽包括源自具有L234A、L235A和P329G氨基酸取代的IgG1 Fc结构域的Fc结构域片段。在一个实施例中,Fc结构域片段源自IgG4 Fc结构域并具有L235E和P329G氨基酸取代。在一个实施例中,Fc结构域片段源自IgG1 Fc结构域并具有P329G氨基酸取代。在一个实施例中,Fc结构域片段源自IgG4 Fc结构域并具有L235E氨基酸取代。在一些实施例中,Fc结构域片段源自IgG1Fc结构域并具有L234A和L235A氨基酸取代。在一个实施例中,Fc结构域片段源自野生型IgG4 Fc结构域。在一个实施例中,Fc结构域片段源自IgG1 Fc结构域并具有N297D氨基酸取代。在一个实施例中,Fc结构域片段源自IgG1 Fc结构域并具有N297A氨基酸取代。在一些实施例中,Fc结构域片段源自IgG1 Fc结构域并具有N297Q氨基酸取代。在一个实施例中,Fc结构域片段源自野生型IgG2 Fc结构域。整个氨基酸残基编号相对于全长蛋白质或结构域(即,全长ACE2多肽或全长IgG Fc结构域)。本文所描述的任何Fc结构域片段多肽的氨基酸序列也可以与人Fc结构域氨基酸序列或其片段至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%相同。
本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽的ACE2胞外结构域和Fc结构域片段可以融合到分离胞外和Fc结构域的另外的多肽上。术语“铰链”、“铰链区”或“铰链多肽”可互换地用于指代此类中间多肽。在一些实施例中,与所使用的Fc结构域的同种型相对应的铰链区。例如,如果使用IgG4铰链序列,S228P取代可以最小化Fab臂交换。在一些实施例中,铰链区可以包括表2-4中任何SEQ ID NO的氨基酸序列。在一些实施例中,铰链区将包括类似于Fc结构域中的氨基酸取代的氨基酸残基,其降低Fc片段对Fcγ受体(例如,FcγIIa受体)的结合亲和力。例如,在一些实施例中,ACE2-Fc融合多肽包括铰链区,所述铰链区包括与IgG4 Fc结构域中的S228P氨基酸取代类似的氨基酸,所述氨基酸取代与Fab臂交换减少相关。在一些实施例中,本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽包括铰链区,所述铰链区包括S228P氨基酸取代,以及包括L235E氨基酸取代的Fc片段,并且所述多肽具有IgG4-SPLE Fc结构域。在一些实施例中,L235E取代使得IgG4 Fc结构域对Fcγ受体(例如,FcγIIa受体)的亲和力降低。
在一个实施例中,ACE2-Fc融合多肽包括具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的ACE2胞外结构域,其包含H374N和H378N取代;包括以下的氨基酸序列的铰链区:SEQ IDNO:10;以及具有以下的氨基酸序列的Fc结构域片段:SEQ ID NO:33。在另一个实施例中,ACE2-Fc融合多肽包括具有以下的氨基酸序列的ACE2胞外结构域:SEQ ID NO:4,其包含H374N和H378N取代;包括以下的氨基酸序列的铰链区:SEQ ID NO:6;以及具有以下的氨基酸序列的Fc结构域片段:SEQ ID NO:33。在一些实施例中,ACE2-Fc融合多肽包括以下的氨基酸序列:SEQ IDNO:48、49、56或57。在一些实施例中,ACE2-Fc融合多肽包括与以下的氨基酸序列具有至少70%、80%或90%或更大同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:48、49、56或57。在一些实施例中,本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽由包括与以下的核苷酸序列具有至少70%、80%或90%或更大同一性的核苷酸序列的核酸分子编码:SEQ ID NO:50、51、58或59。
本文所描述的任何ACE2-Fc融合多肽或其片段对冠状病毒(例如,SARS-CoV-1、SARS-CoV-2等)具有结合亲和力,降低或消除ACE2酶活性,并且降低或消除Fc结构域或其片段与Fc受体(例如,FcγIIa受体)的结合。尽管单克隆抗体有时可以在相关病毒之间表现出交叉反应性,但其通常对所产生的病毒表现出更高的亲合力,并且通常只能部分中和新型相关病毒,除非经过重新工程化和优化。相比之下,本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽是ACE2依赖性冠状病毒所结合的实际受体的优化的可溶性形式,并且因此应作为任何未来利用ACE2作为细胞表面受体的新型冠状病毒的竞争性抑制剂。
在某些实施例中,相对于全长ACE2多肽或野生型Fc结构域或其片段,降低或消除的ACE2酶活性和Fc结构域或其片段与Fc受体的结合降低了至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍,至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3.0倍、至少3.1倍、至少3.2倍、至少3.3倍、至少3.4倍、至少3.5倍、至少3.6倍、至少3.7倍、至少3.8倍、至少3.9倍、至少4.0倍、至少4.1倍、至少4.2倍,至少4.3倍、至少4.4倍、至少4.5倍、至少4.6倍、至少4.7倍、至少4.8倍、至少4.9倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍,至少20倍、至少21倍、至少22倍、至少23倍、至少24倍、至少25倍、至少26倍、至少27倍、至少28倍、至少29倍、至少30倍、至少31倍、至少32倍、至少33倍、至少34倍、至少35倍、至少36倍、至少37倍、至少38倍、至少39倍、至少40倍、至少41倍,至少42倍、至少43倍、至少44倍、至少45倍、至少46倍、至少47倍、至少48倍、至少49倍、至少50倍、至少51倍、至少52倍、至少53倍、至少54倍、至少55倍、至少56倍、至少57倍、至少58倍、至少59倍、至少60倍、至少61倍、至少62倍、至少63倍,至少64倍、至少65倍、至少66倍、至少67倍、至少68倍、至少69倍、至少70倍、至少71倍、至少72倍、至少73倍、至少74倍、至少75倍、至少76倍、至少77倍、至少78倍、至少79倍、至少80倍、至少81倍、至少82倍、至少83倍、至少84倍、至少85倍,至少86倍、至少87倍、至少88倍、至少89倍、至少90倍、至少91倍、至少92倍、至少93倍、至少94倍、至少95倍、至少96倍、至少97倍、至少98倍、至少99倍、至少100倍或所包含的任何范围,如5倍至20倍。
另一方面,本发明设想了一种组合物,其包括本文所描述的ACE2-Fc融合多肽和小于约25%、或可替代地15%、或可替代地5%的污染生物大分子或多肽。
本发明进一步提供与产生、检测或表征ACE2-Fc融合多肽或其片段(如核酸、载体、宿主细胞等)相关的组合物。此类组合物可以用作调节ACE2-Fc融合多肽的表达和/或活性的化合物。
本发明的ACE2-Fc融合多肽是含有Fc结构域或其片段的融合蛋白,其增加其溶解度和生物利用度和/或促进其纯化、鉴定、检测和/或结构表征。在一些实施例中,表达ACE2-Fc融合多肽可能是有用的,其中融合配偶体增强血浆中的融合蛋白稳定性和/或增强全身生物利用度。可以并入本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽的示例性另外的结构域包含,例如谷胱甘肽S-转移酶(GST)、蛋白质A、蛋白质G、钙调蛋白结合肽、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、HA、myc、聚精氨酸、聚His、聚His-Asp或FLAG融合蛋白和标签。另外的示例性结构域包含改变体内蛋白质定位的结构域,如信号肽、2I型分泌系统靶向肽、转运结构域、核定位信号等。在各种实施例中,本发明的ACE2-Fc融合多肽可以包括一种或多种异源融合。多肽可以含有同一融合结构域的多个拷贝,或可以含有两个或更多个不同结构域的融合。融合可以发生在多肽的N末端处、多肽的C末端处或多肽的N末端和C末端两者处。在本发明的多肽与融合结构域之间包含接头序列,以便促进融合蛋白的构建或优化融合蛋白的蛋白表达或结构约束也在本发明范围内。在另一个实施例中,所述多肽可以被构建为在融合多肽与本发明的多肽之间含有蛋白酶切割位点,以便在蛋白质表达之后或其后去除标签。合适的内蛋白酶的实例包含例如因子Xa和TEV蛋白酶。
在仍另一个实施例中,ACE2-Fc融合多肽可以用荧光标签标记,以促进其检测、纯化或结构表征。在示例性实施例中,本发明的ACE2-Fc融合多肽可以与产生可检测荧光信号的异源多肽序列融合,所述可检测荧光信号包含例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、海肾(Renilla Reniformis)绿色荧光蛋白、GFPmut2、GFPuv4、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、来自增强型青色荧光蛋白(ECFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、来自香菇珊瑚的柠檬黄和红色荧光蛋白(dsRED)。
在一些实施例中,ACE2-Fc融合多肽或其部分包括与表1、5或7中所示的氨基酸序列充分同源的氨基酸序列,使得ACE2-Fc融合多肽或其部分被酶促死亡或具有降低的酶活性但可以结合冠状病毒和不被Fcγ受体(例如,FcγIIa受体)识别的Fc片段。在一个实施例中,ACE2-Fc融合多肽或其部分包括与表1中所示的氨基酸序列充分同源的氨基酸序列,使得ACE2-Fc融合多肽或其部分被酶促死亡或具有降低的酶活性但可以结合冠状病毒。在一个实施例中,ACE2-Fc融合多肽或其部分包括与表5中所示的氨基酸序列充分同源的氨基酸序列,使得ACE2-Fc融合多肽或其部分相对于Fc多肽的野生型序列具有增加的稳定性和/或不与Fcγ受体(例如,FcγIIa受体)结合。在一个实施例中,ACE2-Fc融合多肽包括表1所示的氨基酸序列或其片段,其中每一个包括类似于野生型ACE2多肽中H374N和H378N氨基酸取代的氨基酸取代,或与表1中所示的氨基酸序列或其片段至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源的氨基酸序列,其中每一个包括H374N和H378N氨基酸取代。为了清楚起见,表1中所示的氨基酸序列包括氨基酸残基位置357和361处的天冬酰胺残基。这些残基降低或消除ACE2酶活性,但不抑制冠状病毒的ACE2结合。ACE2-Fc融合多肽还包括Fc结构域或其片段、具有表5中所示的氨基酸序列的多肽或其片段,或与表1中所示的氨基酸序列或其片段至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源的氨基酸序列。ACE2-Fc融合多肽的ACE2结构域和Fc结构域或其片段可以通过铰链区分离。在一些实施例中,铰链区具有表2、3或4所示的氨基酸序列。在一些实施例中,Fc结构域或其片段、多肽将包括至少一个氨基酸取代,其减弱片段与Fc受体(例如,FcγIIa受体)结合的能力。在一些实施例中,铰链区将包括至少一个氨基酸取代,其减弱片段与Fc受体(例如,FcγIIa受体)结合的能力。
本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽可以被设计成减少或消除冠状病毒感染的抗体依赖性增强(ADE)。例如,Fc结构域或其片段与ACE2-Fc融合蛋白结合,可以优化Fc结构或其片段的氨基酸序列以减少片段与Fc受体(例如,FcγIIa受体)的结合。铰链区可以包括减弱Fc结构域或其片段与Fc受体的结合能力的氨基酸序列。例如,ACE2-Fc融合多肽可以在其铰链(例如,S228P)中包括减少Fab臂交换的氨基酸取代。在一些实施例中,ACE2-Fc受体在铰链区或在Fc结构域或其片段(例如,L235E)中包括氨基酸取代,其降低或消除Fc结构域或其片段与Fc受体结合的能力。
本发明的ACE2-Fc融合多肽可以通过标准重组DNA技术产生。例如,根据常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段在框内连接在一起,例如采用平端或交错端末端进行连接,限制酶消化以提供合适的末端,将粘性端填充为适当的碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接和酶促连接。在另一个实施例中,融合基因可以通过包含自动化DNA合成仪的常规技术合成。可替代地,可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增,所述锚定引物在两个连续的基因片段之间产生互补突出端,随后使其退火并再扩增以生成嵌合基因序列(参见例如《当代分子生物学实验指南》,编辑Ausubel等人,约翰威利父子出版公司:1992)。此外,许多已经编码融合部分(例如,GST多肽)的表达载体可商购获得。编码核酸的ACE2-Fc融合多肽可以克隆到此类表达载体中,使得融合部分在框架中连接。
本发明还涉及包括ACE2胞外结构域和Fc结构域的氨基酸序列同源物的融合蛋白。人ACE2胞外结构域和Fc结构域的同源物可以通过诱变产生,例如,分别对人ACE2胞外结构域或Fc结构域的离散点突变或截短。如本文所使用的,术语“同源物”是指人ACE2胞外结构域和/或Fc结构域多肽的变体形式。在一个实施例中,相对于用天然存在的ACE2胞外结构域和/或Fc结构域或其片段治疗相比,用具有天然存在的蛋白质形式的生物活性子集的同源物治疗受试者在受试者体内具有较少的副作用。
在替代性实施例中,人ACE2胞外结构域或Fc结构域或其片段的同源物可以通过筛选ACE2胞外结构域或Fc结构域或其片段的突变体(例如,截短突变体)的组合文库来鉴定。在一个实施例中,ACE2胞外结构域或Fc结构域变体的多样化文库通过核酸水平的组合诱变产生并且由多样化基因文库编码。修饰的ACE2胞外结构域或Fc结构域变体的多样化文库可以通过例如将合成寡核苷酸的混合物酶促连接到基因序列中以使潜在ACE2胞外结构域或Fc结构域序列的简并集合可作为单独的多肽表达,或可替代地,作为其中含有ACE2胞外结构域或Fc结构域或其片段序列的一组较大融合蛋白(例如,用于噬菌体展示)。有多种方法可以用于从简并寡核苷酸序列产生潜在ACE2胞外结构域或Fc结构域或其片段、同源物的文库。简并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行,然后将合成基因连接到适当的表达载体中。使用一组简并基因允许在一种混合物中提供编码期望的一组潜在ACE2胞外结构域或Fc结构域或其片段、序列的所有序列。用于合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(参见例如,Narang,S.A.(1983)《四面体(Tetrahedron)》39:3;Itakura等人,(1984)《生物化学年鉴(Annu.Rev.Biochem.)》53:323;Itakura等人,(1984)《科学》198:1056;Ike等人,(1983)《核酸研究》11:477)。
III.药物组合物
另一方面,本发明提供了包括ACE2-Fc融合多肽的药学上可接受的组合物,所述融合多肽包括与表1所示的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或更大同一性的氨基酸序列以及与表5所示的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或更大同一性的氨基酸序列,与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起调配。在一个实施例中,药学上可接受的组合物包括ACE2-Fc融合多肽,其包括与表7中所示的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或更大同一性的氨基酸序列。
如下面详细描述的,本发明所涵盖的药物组合物可以被专门调配成用于以固体或液体形式施用,包含适于以下的药物组合物:(1)口服施用,例如,浸液(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂、大丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂;(2)肠胃外施用,例如通过皮下、肌肉内或静脉注射,例如,无菌溶液或悬浮液;(3)局部应用,例如,作为应用于皮肤的霜剂、软膏或喷雾剂;(4)阴道内或直肠内,例如,作为子宫托、乳膏或泡沫;或(5)气雾剂,例如,作为水性气雾剂、脂质体制剂或含有所述化合物的固体颗粒。
术语“治疗作用”是指由药理活性物质在动物,特别地哺乳动物,并且更特别地人中引起的局部或全身性作用。因此,所述术语意指旨在用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病或增强动物或人的期望身体或精神发育和状况的任何物质。术语“治疗有效量”意指以适用于任何治疗的合理益处/风险比产生某些期望的局部或全身效果的此类物质的量。在某些实施例中,化合物的治疗有效量将取决于其治疗指数、溶解度等。例如,通过本发明的方法发现的某些化合物可以以足够的量施用,以产生适用于此类治疗的合理益处/风险比。
如本文所使用的,短语“治疗有效量”意指以合理的益处/风险比有效产生治疗效果的ACE2-Fc融合多肽的量,例如,减少或减轻冠状病毒感染的症状(例如,发热、咳嗽、喉咙痛、疲劳、呼吸短促、呼吸困难、呼吸急促、缺氧等)。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在正确医学判断的范围内适合于与人类和动物的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏应答或其它问题或并发症的、与合理的益处/风险比相称的那些药剂、材料、组合物和/或剂型。
如本文所使用的,短语“药学上可接受的载体”是指如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料等涉及将主题化学品从身体的一个器官或部分承载或输送到身体的另一个器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或媒剂。在与调配物的其它成分相容并且对受试者无害的意义上来讲,每种载体必须是“可接受的”。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包含:(1)糖,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;(2)淀粉,如玉米淀粉和马铃薯淀粉;(3)纤维素以及其衍生物,如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素;(4)粉状黄蓍胶;(5)麦芽;(6)明胶;(7)滑石粉;(8)赋形剂,如可可脂和栓剂蜡类;(9)油,如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油;(10)二醇,如丙二醇;(11)多元醇,如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇;(12)酯,如油酸乙酯和月桂酸乙酯;(13)琼脂;(14)缓冲剂,如氢氧化镁和氢氧化铝;(15)藻酸;(16)无热原的水;(17)等渗盐水;(18)林格氏溶液;(19)乙醇;(20)磷酸盐缓冲溶液;以及(21)药物调配物中所用的其它无毒可相容物质。
润湿剂、乳化剂和润滑剂(如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和香味剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包含:(1)水溶性抗氧化剂,如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等;(2)油溶性抗氧化剂,如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等;以及(3)金属螯合剂,如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本发明所涵盖的方法中有用的调配物包含适合于口服、鼻腔、局部(包含颊和舌下)、直肠、阴道、气雾剂和/或肠胃外施用的调配物。这些调配物可以方便地以单位剂型呈现并且可以通过制药业领域熟知的任何方法来制备。可以与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据正在被治疗的宿主、具体施用模式而变化。可以与载体材料组合以产生单个剂型的活性成分的量将通常是化合物产生治疗效果的量。通常,在百分之百中,此量的范围将是活性成分的约1%至约百分之九十九,如约5%至约70%,或约10%至约30%。
制备这些调配物或组合物的方法包含使本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽与载体和任选地一种或多种辅助成分缔合的步骤。通常,通过使呼吸解偶联剂与液体载体或精细分散的固体载体或两者均匀且紧密地缔合并且然后如果需要的话使产品成形来制备调配物。
适于口服施用的调配物可以呈胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质,通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、粉末、颗粒剂的形式;或作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液;或作为水包油或油包水液体乳剂;或作为酏剂或糖浆;或作为软锭剂(使用惰性基质,如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶);和/或作为漱口剂等,各自含有预定量的呼吸解偶联剂作为活性成分。化合物也可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂施用。
在用于口服施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉末、颗粒剂等)中,将活性成分与一种或多种药学上可接受的载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下中的任何一个混合:(1)填充剂或增充剂,如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸;(2)粘合剂,如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶;(3)保湿剂,如甘油;(4)崩解剂,如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠;(5)溶液阻滞剂,如石蜡;(6)吸收促进剂,如季铵化合物;(7)润湿剂,例如乙酰醇和甘油单硬脂酸酯;(8)吸附剂,如高岭土和膨润土;(9)润滑剂,如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和其混合物;以及(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下,药物组合物还可以包括缓冲剂。类似类型的固体组合物也可以使用如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂作为软填充明胶胶囊和硬填充明胶胶囊中的填充剂。
片剂可以通过任选地与一种或多种辅助成分压缩或模制来制备。经压缩的片剂可以使用粘合剂(例如,明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如,乙醇酸淀粉钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。模制的片剂可以通过在适合的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状肽或拟肽的混合物来制造。
片剂和其它固体剂型,如糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂,可以任选地用包衣和外壳(如药物调配领域熟知的肠溶衣和其它包衣)来包叠或制备。所述剂型还可以被调配成使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素使活性成分在其中缓释或控释以提供期望的释放曲线、其它聚合物基质、脂质体和/或微球。所述剂型可以例如在即将使用之前通过细菌截留过滤器进行过滤或者通过并入可以溶于无菌水或一些其它无菌可注射介质中的呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌。这些组合物还可以任选地含有乳浊剂并且所述组合物的组成可以使得其仅或在胃肠道的某一部分中任选地以延迟的方式释放一种或多种活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包含聚合物质和蜡。活性成分还可以呈微囊化形式,如果适当,具有上述赋形剂中的一种或多种。
用于口服施用的液体剂型包含药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性成分之外,液体剂型可以含有本领域中常用的惰性稀释剂,例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂,如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(具体地,棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和山梨醇酐的脂肪酸酯和其混合物。
除惰性稀释剂之外,口服组合物还可以包含佐剂,例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、香味剂和防腐剂。
除活性药剂之外,悬浮液可以含有悬浮剂,例如像乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶、及其混合物。
用于直肠或阴道施用的调配物可以作为栓剂存在,所述栓剂可以通过将一种或多种呼吸解偶联剂与一种或多种合适的无刺激性赋形剂或载体(包括例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐)混合来制备并且其在室温下为固体但在体温下为液体并且因此会在直肠或阴道腔内融化并释放出活性药剂的。
适于阴道施用的调配物还包含子宫托、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾调配物,其含有本领域已知是适当的载体。
用于局部、雾化或经皮施用本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽的剂型包含粉末、喷雾、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。活性组分可以在无菌条件下与药学上可接受的载体和可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
除了呼吸解偶联剂之外,所述软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂还可以含有赋形剂,如动物和植物脂肪、油类、蜡类、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。
除ACE2-Fc融合多肽之外,粉剂和喷雾剂还可以含有赋形剂,如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾可以另外含有常规推进剂,如氯氟烃和挥发性未经取代的烃,如丁烷和丙烷。
ACE2-Fc融合多肽可以可替代地通过气雾剂施用。这通过制备含有所述化合物的水性气雾剂、脂质体制剂或固体颗粒来实现。可以使用非水(例如,氟碳化合物推进剂)悬浮液。声波喷雾器最小化了药剂在剪切下的暴露,这可能导致化合物的降解。
通常,水性气雾剂通过将药剂的水溶液或悬浮液与常规药学上可接受的载体和稳定剂一起调配来制备。载体和稳定剂随具体化合物的要求而变化,但通常包含非离子型表面活性剂(吐温(Tween)、普朗尼克(Pluronic)或聚乙二醇)、无害蛋白质类血清白蛋白、脱水山梨醇酯、油酸、卵磷脂、如甘氨酸等氨基酸、缓冲剂、盐、糖或糖醇。气雾剂通常由等渗溶液制备。
透皮贴剂具有额外的优点,即提供呼吸解偶联剂到身体的受控递送。此类剂型可以通过将试剂溶解或分散于适当介质中来制备。还可以使用吸收增强剂来增加拟肽穿过皮肤的通量。此类通量的速率可以通过提供速率控制膜或将拟肽分散于聚合物基质或凝胶中来控制。
眼科调配物、眼药膏、粉末、溶液等也被设想为处于本发明的范围内。
适于肠胃外施用的本发明的药物组合物包括一种或多种呼吸解偶联剂组合一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳剂、或仅在使用之前可重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末,其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使调配物与预期接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。
本发明的药物组合物中可以采用的适合的水性和非水性载体的实例包含水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、以及其适合的混合物、植物油,如橄榄油和可注射的有机酯,如油酸乙酯。可以例如通过使用如卵磷脂等包衣材料,通过在分散液的情况下维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
这些组合物还可以含有佐剂,如防腐剂、润湿剂、乳化剂以及分散剂。可以通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂,例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。还可能期望将等渗剂,如糖、氯化钠等包含于这些组合物中。另外,通过包含延迟吸收的药剂(如单硬脂酸铝以及明胶)可以实现可注射药物形式的延长的吸收。
在一些情况下,为了延长药物的作用,期望的是减缓皮下注射或肌肉内注射的药物的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。然后,药物的吸收速率取决于其溶解速率,溶解速率进而可以取决于晶体大小和晶形。可替代地,肠胃外施用的药物形式的延迟吸收通过将药物溶解或悬浮在油性媒剂中来实现。
通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成ACE2-Fc融合多肽的微囊基质来制备可注射储库型(depot)形式。取决于药物与聚合物的比率以及所采用的特定聚合物的性质,可以对药物释放速率进行控制。其它可生物降解的聚合物的实例包含聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库型可注射调配物还通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。
当将本发明所涵盖的呼吸解偶联剂作为药物施用给人和动物时,其可以本身进行给予或者作为含有,例如0.1%至99.5%(如0.5%至90%)的活性成分与药学上可接受的载体组合的药物组合物进行给予。
可以改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以通过本发明所涵盖的方法来确定,以获得对于特定受试者、组合物和施用模式有效实现期望治疗应答,而对受试者无毒性的活性成分的量。
本发明的核酸分子可以插入载体并且用作基因疗法载体。基因疗法载体可以通过例如以下方式递送给受试者:静脉注射、局部施用(参见美国专利第5,328,470号)或立体定向注射(参见例如,Chen等人,(1994)《美国国家科学院院刊》91:3054 3057)。基因疗法载体的药物制剂可以包含在可接受的稀释剂中的基因疗法载体,或者可以包括嵌入基因递送媒剂的缓释基质。可替代地,在完全的基因递送载体可以从例如逆转录病毒载体的重组细胞完整地产生的情况下,药物制品可以包含产生基因递送系统的一个或多个细胞。
本发明通过以下实例进一步说明,所述实例不应被解释为限制性的。在本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及附图通过引用并入本文。
IV.本发明的另外的用途和方法
本文所描述的组合物可以用于各种诊断、预后和治疗应用。在本文所描述的任何方法(如诊断方法、预后方法、治疗方法或其组合)中,所述方法的所有步骤都可以由单个行动者或可替代地由多于一个行动者执行。例如,可以由提供治疗性治疗的行动者直接进行诊断。可替代地,提供治疗剂的人可以请求进行诊断测定。诊断医生和/或治疗干预者可以解释诊断测定结果以确定治疗策略。类似地,此类替代性过程可以应用于其它测定,如预后测定。
a.筛选方法
本发明的一方面涉及筛选测定,包含基于细胞和非细胞的测定。在一个实施例中,所述测定提供了一种确定冠状病毒是否可能对单独使用ACE2-Fc融合多肽或与其它病毒疗法组合的治疗有应答的方法,如在人体内,通过使用非细胞测定确定ACE2-Fc融合多肽与冠状病毒的结合亲和力,或使用细胞培养测定确定ACE2-Fc融合多肽对感染和/或ADE的抑制作用。
例如,在直接结合测定中,ACE2融合多肽(或它们相应的靶多肽或分子)可以与放射性同位素或酶标记物偶联,从而可以通过检测复合物中的标记蛋白质或分子来确定结合。例如,可以直接或间接地用125I、35S、14C或3H标记靶标,并且通过辐射发射的直接计数或闪烁计数来检测放射性同位素。可替代地,可以用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶对靶标进行酶标记,并且通过确定合适的底物向产物的转化来检测酶标记。还可以使用标准结合或酶分析测定来确定生物标志物与底物之间的相互作用。在上文所描述的测定方法的一个或多个实施例中,可能期望固定多肽或分子以促进复合形式与未复合形式的蛋白质或分子中的一个或两个的分离,并且适应测定的自动化。
可以在任何适用于容纳反应物的容器中完成ACE2-Fc与靶标的结合。此类容器的非限制性实例包含微量滴定板、试管和微量离心管。本文所描述的固定的形式的抗体还可以包含与固相结合的抗体,如多孔、微孔(平均孔径小于约一微米)或大孔(平均孔径大于约10微米)材料,如膜、纤维素、硝化纤维素或玻璃纤维;珠粒,如由琼脂糖或聚丙烯酰胺或乳胶制成的珠粒;或盘子、板或孔的表面,如由聚苯乙烯制成的表面。
在替代性实施例中,确定试剂调节冠状病毒与全长ACE2多肽之间相互作用的能力可以通过确定本发明所涵盖的ACE2融合多肽调节冠状病毒感染性的能力来完成。
本发明进一步涉及通过上文所描述的筛选测定鉴定的ACE2-Fc。因此,进一步使用如本文所描述的鉴定的ACE2-Fc融合多肽在本发明的范围内,如在适当的动物模型中。例如,如本文所描述的鉴定的药剂可以用于动物模型以确定用此类药剂治疗的功效、毒性或副作用。可替代地,如本文所描述的鉴定的抗体可以用于动物模型以确定此类药剂的作用机制。
b.预测医学
本发明还涉及预测医学领域,其中诊断测定、预后测定和监测临床试验用于预后(预测)目的,由此预防性地治疗个体。因此,本发明的一方面涉及用于在生物样品(例如,血液、血清、细胞或组织)的背景下确定冠状病毒的量和/或活性水平的诊断测定,由此确定感染病毒的个体是否可能对本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽的治疗有应答。此类测定可以单独用于预后或预测目的,或可以与治疗干预相结合,由此在与冠状病毒感染相关的症状发生之前或之后对个体进行预防性治疗。本领域技术人员将理解,任何方法都可以使用本文所描述的ACE2-Fc融合多肽的一种或多种(例如,组合),如表、图、实例中的那些以及本说明书中其它地方所描述的那些。
本发明的另一方面涉及监测药剂(即,本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽)对本文所描述的生物标志物的表达或活性的影响。在下面的部分中进一步详细地描述了这些和其它药剂。
本领域技术人员还将理解,在某些实施例中,本发明的方法实现计算机程序和计算机系统。例如,计算机程序可以用于执行本文所描述的算法。计算机系统还可以存储和操作由本发明所涵盖的方法产生的数据,所述数据包括多个生物标志物信号变化/分布,计算机系统可以在实施本发明的方法时使用所述变化/分布。在某些实施例中,计算机系统接收生物标志物表达数据;(ii)储存数据;并且(iii)以本文所描述的任何数量的方式(例如,相对于适当对照的分析)比较数据以确定来自癌性或癌前组织的信息性生物标志物的状态。在其它实施例中,计算机系统(i)将所确定的表达生物标志物水平与阈值进行比较;并且(ii)基于指示输出所述生物标志物水平是否显著调节(例如,高于或低于)阈值或表型的所述指示。
在某些实施例中,此类计算机系统也被认为是本发明的一部分。根据生物信息学和/或计算机领域技术人员所掌握的知识,可以使用多种类型的计算机系统来实现本发明的分析方法。在此类计算机系统的操作期间,可以将若干个软件组件加载到存储器中。软件组件可以包括为本领域标准的软件组件和为本发明专用的组件(例如,dCHIP软件,在以下中进行了描述:Lin等人,(2004)《生物信息学(Bioinformatics)》20,1233-1240;本领域已知的径向基机器学习算法(RBM))。
本发明的方法还可以在数学软件包中编程或建模,所述数学软件包允许方程的符号输入和处理的高级规范,包含要使用的特定算法,由此使用户无需在程序上编程各个方程和算法。此类包包含例如,来自Mathworks公司(Mathworks)(马萨诸塞州纳蒂克(Natick,Mass.))的Matlab、来自沃尔夫勒姆研究公司(Wolfram Research)(伊利诺伊州香槟市(Champaign,Ill.))的Mathematica或来自MathSoft公司(MathSoft)(华盛顿州西雅图(Seattle,Wash.))的S-Plus。
在某些实施例中,计算机包括用于存储生物标志物数据的数据库。此类存储的配置文件可以被访问并用于在稍后的时间点执行所关注的比较。例如,可以存储源自受试者的未感染组织的样品的生物标志物表达谱和/或产生自同一物种的相关群体中所关注的信息基因座的基于群体的分布的谱,并且稍后将其与源自受试者的感染的组织或疑似受试者感染的组织的样品进行比较。
除了本文所描述的示例性程序结构和计算机系统之外,本领域技术人员将容易地明白其它替代性程序结构和计算机系统。因此,在精神上或范围上不脱离上述计算机系统和程序结构的此类替代性系统旨在被理解在所附权利要求内。
c.诊断测定
本发明部分地提供了用于准确分类生物样品是否感染冠状病毒的方法、系统和代码,所述冠状病毒可能对本发明所涵盖的一种或多种ACE2-Fc融合多肽的治疗产生应答。在一些实施例中,本发明可用于使用统计算法和/或经验数据将样品(例如,来自受试者)分类为与冠状病毒感染相关或具有冠状病毒感染风险(例如,本文所描述的生物标志物的量或活性,如在说明书中所描述的表格、图、实例和其它方面),所述样品将或不会对用本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽进行的治疗产生应答。
用于检测本文所描述的冠状病毒的量或活性的示例性方法,并且因此可用于分类样品是否可能或不可能对用本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽进行的治疗产生应答,涉及从测试受试者获得生物样品,并且使生物样品与能够检测所述生物样品中生物标志物的量或活性的试剂接触,如蛋白质结合剂(如抗体或其抗原结合片段),或核酸结合剂(如寡核苷酸)。在一些实施例中,使用至少一种抗体或其抗原结合片段,其中两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多此类抗体或抗体片段可以组合使用(例如,在夹心ELISA中)或串联使用。在某些情况下,统计算法是单个学习统计分类器系统。例如,单个学习统计分类器系统可以用于基于预测或概率值以及生物标志物的存在或水平将样品分类。单个学习统计分类器系统的使用通常将样品分类为例如具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或总体准确度的可能免疫疗法应答者或进展者样品。
其它合适的统计算法是本领域技术人员众所周知的。例如,学习统计分类器系统包含机器学习算法技术,所述技术能够适应复杂的数据集(例如,所关注的标志物面板)并基于此类数据集做出决策。在一些实施例中,使用如分类树(例如,随机森林)的单个学习统计分类器系统。在其它实施例中,优选地串联使用2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个学习统计分类器系统的组合。学习统计分类器系统的实例包含但不限于使用归纳学习的那些(例如,决策/分类树,如随机森林、分类和回归树(C&RT)、增强树等)、可能近似正确(PAC)学习、链结式学习(例如,神经网络(NN)、人工神经网络(ANN)、神经模糊网络(NFN)、网络结构、如多层感知器的感知器、多层前馈网络、神经网络的应用、信念网络中的贝叶斯学习(Bayesian learning)等)、强化学习(例如,在已知环境中的被动学习,如朴素学习、自适应动态学习和时间差学习、在未知环境中的被动学习、在未知环境中的主动学习、学习动作值函数、强化学习的应用等),以及遗传算法和进化编程。其它学习统计分类器系统包含支持向量机(例如,核方法)、多元自适应回归样条(MARS)、列文伯格-马夸尔特算法(Levenberg-Marquardt algorithm)、高斯-牛顿算法(Gauss-Newton algorithm)、高斯混合算法(mixtures of Gaussians)、梯度下降算法和学习向量量化(LVQ)。在某些实施例中,本发明的方法进一步包括将样品分类结果发送给临床医生,例如肿瘤学家。
在另一个实施例中,受试者的诊断之后,基于所述诊断向个体施用治疗有效量的ACE2-Fc融合多肽。
在一个实施例中,所述方法进一步涉及获得对照生物样品(例如,来自不具有冠状病毒感染或其感染易受ACE2-Fc融合多肽病毒隔离的受试者的生物样品、治疗期间之前来自受试者的生物样品、或治疗期间或之后来自受试者的生物样品)。
d.预后测定
此外,本文所描述的诊断方法可以用于识别具有冠状病毒感染或有冠状病毒感染风险的受试者,所述冠状病毒感染可能或不可能对ACE2-Fc融合多肽产生应答。本文所描述的测定,如前述的诊断测定或下面的测定,可以用于识别被冠状病毒感染或具有被冠状病毒感染的风险的受试者。可替代地,可以利用预后测定来识别患有或有发展为与冠状病毒感染相关的病症(如肺炎)的风险受试者。此外,本文所描述的预后测定可以用于确定受试者是否可以施用ACE2-Fc融合多肽以治疗与本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽相关的疾病或病症。
e.治疗方法
本发明提供了治疗有冠状病毒感染风险(或易感)的受试者的预防和治疗方法,包含SARS-CoV-2感染,所述感染是COVID-19的致病媒介。在一些实施例中,向感染冠状病毒或有感染冠状病毒风险的受试者施用本发明所涵盖的ACE2-Fc融合蛋白。施用的ACE2-Fc融合蛋白是SARS-CoV-2冠状病毒的细胞表面受体ACE2的药理学优化的可溶性形式,并且通过与SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)结合而作为病毒感染的竞争性抑制剂,防止其附着于细胞表面ACE2。ACE2-Fc融合蛋白包括Fc片段,所述片段阻断抗体依赖性增强(ADE),所述抗体依赖性增强可以导致或加重COVID-19患者的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的严重程度。
酶活性ACE2对SARS-CoV-2治疗用途的一个缺点是潜在的血流动力学副作用和电解质异常,无论其是否为Fc融合形式。野生型ACE2是一种降解血管紧张素II(肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)途径的组分)的胞外酶,因此是一种天然的RAAS抑制剂,可调节体内的血压、流体和电解质平衡(主要是钠)。利用野生型ACE2的治疗预期会产生副作用,所述副作用反映RAAS抑制的生理效应,特别是在较高剂量下,或在急性疾病、处于相对容量耗竭状态或患有导致RAAS依赖性的慢性疾病(如肾血管狭窄或心力衰竭)的患者中。RAAS抑制的副作用可以包含低血压、低血容量、肾损伤、血压降低,并且可能导致低钠血症或电解质变化。因此,对COVID-19患者(可能是危重症群体)进行ACE2治疗可能会导致剂量限制性副作用,这引起了对在治疗和预防环境中使用活性ACE2的担忧。
酶活性重组ACE2胞外结构域(非Fc融合形式)已被开发用于治疗病理性RAAS激活引起的高血压。在一项针对健康志愿者的1期随机剂量递增研究中,其对血压或心率没有影响,并且在研究剂量下耐受性良好(Haschke等人,(2013)《临床药代动力学(ClinPharmacokinet.)》,52(9):783-92)。但其对COVID-19患者(其中许多患者是危重症)的生理影响可能与对健康志愿者的影响不一致。此外,竞争性抑制病毒所需的剂量可能高于前述RAAS介导的高血压1期试验中研究的剂量,因此产生了即使是非危重症COVID-19患者也可能出现不利的血流动力学影响和低钠血症的担忧。
当RAAS系统活动时,酶活性ACE2药物的副作用最明显。这可以在两种情况中发生:1)血管内容积耗竭状态,如脱水或败血症;或2)RAAS激活的慢性状态,如肾动脉狭窄、心力衰竭或肝硬化(肝衰竭)(Atlas,S.A.,(2007)《管理护理与专业药学杂志(J.Manag.CarePharm.)》,13(8增刊B):9-20;Hricik等人,(1983)《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》,308(7):373-6;Brown等人,(1998)《循环(Circulation)》,97(14):1411-20;Arroyo等人,(2011)《自然综述:神经病学(Nat Rev Nephrol.)》,7(9):517-261)。这些慢性病状在老年群体中很常见,包含退伍军人,他们更有可能患上严重的COVID-19(Krishnamurthi等人,(2018)《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》,13(3):e0193996;Eibner等人,(2016)《兰德健康季刊(Rand Health Q.)》,5(4):13。由于这些共病病状通常在临床上是无症状的,因此在暴露于活性ACE2之前,可能不清楚个体是否存在这些诱发病状之一,并且药物可能会导致低血压或危险的电解质异常,如高钾血症。因此,这些担忧与在治疗和预防环境两者中使用活性ACE2有关。
事实上,酶活性重组ACE2胞外结构域(非Fc融合形式)已被开发作为治疗RAAS病理过度激活导致的高血压(Haschke等人,(2013)《临床药代动力学》,52(9):783-92。但如前所述,RAAS抑制的生理效应在RAAS系统激活时最为明显,而不是在受控环境中的健康志愿者中。此外,竞争性抑制病毒所需的剂量可能高于此试验中研究的剂量。因此,此试验并不能缓解对酶活性ACE2用于COVID-19治疗或预防的安全性的担忧。
IgG Fc结构域赋予的延长半衰期允许皮下给药。每次注射可以施用若干百毫克,剂量足以抑制SARS-CoV-2。与静脉给药相比,皮下给药的生物制品达到峰值浓度的时间更长,但这通常是通过施用较大的初始负荷剂量,然后施用较小的维持剂量来考虑的。如果需要重复给药,通常在半衰期内进行,因此需要的注射频率不超过每三天。关于产品部署,FDA批准的用于皮下注射的Fc融合蛋白通常可在预填充注射器中获得,以备注射。用于皮下注射蛋白质药物的预填充注射器在冷藏条件下通常稳定12个月至24个月,并且不需要冷藏运输。
本发明包括酶失活的ACE2胞外结构域。已知ACE2(H374N和H378N)中包含两点突变会显著降低其酶活性(Imai等人,(2005)《自然》,436(7047):112-6)。关键的是,这些点突变不影响其与SARS-CoV或SARS-CoV-2刺突蛋白的结合。包含这些点突变的ACE2-NN-Fc融合蛋白仍然有效地抑制SARS-CoV和SARS-CoV-2假病毒对靶细胞的感染(Imai等人,Lei等人,(2020)《自然通讯》11(1):2070)。iACE2-Fc对SARS-CoV-2的IC50小于0.1μg/mL,或小于0.5纳摩尔。
通过施用本发明所涵盖的ACE2-Fc融合物,存在与治疗或预防冠状病毒感染相关的若干个优点。本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽不会引发这些副作用,因为其使用了酶失活的ACE2结构域,其不是RAAS抑制剂。因此,ACE2-Fc融合多肽可以安全地向医院的急性病患者和无监测社区环境中的慢性病状患者施用。这使得其能够用作除治疗剂之外的预防剂。因为副作用的风险很低,所以使用酶失活的ACE2允许耐受更高的血清峰值浓度。更高剂量的ACE2-Fc融合多肽提高了对冠状病毒(例如,SARS-CoV-2)感染的竞争性抑制和对ACE2的竞争性抑制剂,同时也允许较少频繁的给药(即,增加给药间隔),从而提高了在非医院环境中部署的实用性。
另外,已知感染人OC43、HKU1、229E、NL63、MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2的七种冠状病毒中,有三种已知利用ACE2(SARS-CoV、SARS-CoV-2和NL63),包含两种具有全球重要性的病毒:SARS-CoV(导致2004年严重急性呼吸综合征暴发的病毒)和SARS-CoV-2(导致COVID-19大流行的病毒)(Li等人,(2003)《自然》,426(6965):450-54;Hoffman等人,(2020)《细胞》,181(2):271-80e8。因此,由于ACE2是SARS-CoV-2感染细胞的主要表面受体,本发明所涵盖的ACE2-Fc融合蛋白将结合任何利用ACE2作为受体的冠状病毒,包含未来的新型冠状病毒。相比之下,针对SARS-CoV-2的中和单克隆抗体以及疫苗可能对未来新型冠状病毒或人群中出现的SARS-CoV-2突变体变体无效,特别是如果广泛治疗和疫苗接种对病毒产生进化压力。这是因为治疗中和抗体和疫苗接种诱导的抗体结合刺突蛋白受体结合结构域(RBD)上的确定的表位,所述表位可能发生突变,以避免抗体结合,同时保持ACE2结合。由于要向有需要的受试者施用的ACE2-Fc融合蛋白是ACE2自身的药理学优化形式,具有突变RBD的病毒表现出与ACE2-Fc融合蛋白的结合减弱,也将表现出与靶细胞的结合减弱和传染性降低。
重要的是要强调ACE2-Fc融合蛋白的惰性ACE2胞外结构域不会中断或影响肺内的内源性ACE2的活性。可溶性ACE2-Fc融合蛋白不影响ARDS的严重程度,ACE2可能会针对其进行保护(Imai等人,(2005))。
本发明所涵盖的融合蛋白避免了与包括向需要中和抗体的受试者施用中和抗体的治疗相关的并发症。例如,抗体依赖性增强(ADE)是一种现象,在病毒综合征中,中和抗体反常地恶化了感染和炎症。ADE在登革热中表征得最好,其中在第一次感染中产生的内源性中和抗体会使第二次感染中的病毒综合征恶化,通常当第二次感染的是不同血清型的病毒,而抗体对其有部分的中和作用时(Tirado等人,(2003)《病毒免疫学(ViralImmunol.)》,16(1):69-86;Takada等人,(2003)《医学病毒学综述(Rev Med Virol.)》,13(6):387-98;Khandia等人,(2018)《免疫学前沿(Front Immunol.)》,9:597。这种现象是Fcγ受体依赖性的。抗体首先结合病毒,然后结合免疫细胞上的Fcγ受体,介导病毒进入并激活免疫细胞(Wan等人,(2020)《病毒学杂志》,94(5)。这导致病毒在免疫细胞中复制,并且释放促炎细胞因子,如TNF-α和IL-6(Boonnak等人,(2008)《病毒学杂志》,82(8):3939-51。这些细胞因子也与组织损伤、休克、肺病理学和ARDS相关。
有证据表明HIV和埃博拉病毒(Ebola virus)以及冠状病毒中存在ADE(Wan等人,(2020);Beck等人,(2008)《疫苗(Vaccine)》,26(24):3078-85;Takada等人,(2001)《病毒学杂志》,75(5):2324-30;Takada等人,(2003)《病毒学杂志》,77(13):7539-44;Corapi等人,(1992)《病毒学杂志》,66(11):6695-705;Hohdatsu等人,J(1998)《兽医医学杂志(J.Vet.Med.Sci.)》,60(1):49-55;Vennema等人,(1990)《病毒学杂志》,64(3):1407-9;Wang等人,(2014)《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem Biophys Res Commun.)》,451(2):208-14;Kam等人,(2007)《疫苗》,25(4):729-40;Jaume等人,(2011)《病毒学杂志》,85(20):10582-97。结合刺突蛋白RBD的冠状病毒中和抗体可以通过Fcγ受体结合介导ADE,并且触发促进膜融合和感染的刺突蛋白构象变化(Corapi等人,(1992);Hohdatsu等人,(1998);Vennema等人,(1990);Wang等人,(2014);Kam等人,(2007);Jaume等人,(2011);(Wan等人,(2020)《病毒学杂志》,94(5):e02015-19);Walls等人,(2019)《细胞》,176(5):1026-39e15)。
相关临床数据支持ADE恶化严重急性呼吸综合征(SARS)和COVID-19两者的作用(Jaume等人,(2011);Cao(2020)《自然综述免疫学》,20(5):269-70;Tetro(2020)《微生物与感染(Microbes Infect.)》,22(2):72-73;Yuan等人,(2005)《组织抗原(TissueAntigens)》,66(4):291-96;Bicheng Zhang等人,(2020)《medRxiv》;Zhao等人,(2020)《临床传染病杂志(Clin.Infect.Dis.)》,doi:10.1093/cid/ciaa344);Yuan等人,(2005)。FcγRIIa等位基因与IgG2等效结合(H131),并且因此可能被内源性IgG2部分阻断,具有保护性。IgG1是由病毒感染引发的主要IgG同种型。换言之,R131 FcγRIIa等位基因纯合的患者,因此更有可能结合抗病毒IgG抗体,结果最差。这和FcγRIIa受体而不是FcγRI或FcγRIIIa的发现足以用于体外SARS-CoV的ADE,表明IgG1抗体通过ADE恶化了易感患者的SARS病程(Juame等人,(2011)。
最近,武汉大学(Wuhan University)对超过200名COVID-19患者进行的研究发现,SARS-CoV-2反应性IgG水平较高的患者比IgG水平较低的患者更有可能患上严重疾病(Bicheng Zhang等人,(2020)。相反,此研究中SARS-CoV-2反应性IgM水平较高的患者比IgM水平较低的患者更可能患有非严重疾病。IgG可以结合Fcγ受体,但IgM不能。研究还发现,嗜中性粒细胞与淋巴细胞的比率较高与严重疾病相关,尤其是在IgG水平较高的患者中。已知嗜中性粒细胞表达高水平的FcγRIIa。包含超过170名患者的第二项研究证实了较高的SARS-CoV-2IgG水平与更严重疾病之间的关联(Zhao等人,(2020))。总结这些发现,具有较高水平的能够激活Fcγ受体的SARS-CoV-2抗体与较严重的COVD-19疾病相关,并且相反,具有较高水平的不能激活Fcγ受体的SARS-CoV-2抗体与较轻的COVID-19相关。表达FcγRIIa的嗜中性粒细胞比例越高,与COVID-19病情越严重相关,尤其是在那些SARS-CoV-2抗体水平较高且嗜中性粒细胞比例较高的患者中。总之,这些临床相关性表明,ADE可能导致COVID-19的严重程度,其特征一贯是肺部炎症,并且通常是ARDS。
ACE2-Fc融合多肽利用Fcγ受体结合显著减弱的Fc结构域,以减轻ADE的风险。在一些实施例中,已知表现出Fcγ受体结合量最少的两个工程化Fc结构域包括IgG1L234AL235A取代(IgG1-LALA)和IgG4 S228P L235E取代(IgG4-SPLE)。例如,IgG4-SPLE几乎不与FcγRIIa结合,而IgG1-LALA在高浓度下表现出最小的FcγRIIa结合(Schlothauer等人,(2016)《蛋白质工程设计与选择》,29(10):457-66)。在一些实施例中,Fc结构域片段包括IgG4-SPLE取代以最小化FcγRIIa结合,因为如上所述,这是与ADE最相关的Fcγ受体。在一些实施例中,使用FcγR结合显著减弱的工程化IgG Fc结构域。例如,可以使用携带S228P和L235E点取代的人IgG4 Fc结构域,其中L235E取代减弱FcγR结合。FcγRI结合减少了若干个数量级,并且与FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIII的结合可忽略不计。保留了与Fc新生受体的结合,这有利于药代动力学。因此,ACE2-Fc融合多肽对Fcγ受体具有低亲和力,降低了ADE的风险。
在一些实施例中,IgG4-SPLE的使用不仅将减轻ACE2-Fc融合多肽自身的ADE风险,而且还将允许ACE2-Fc融合多肽中断内源性免疫病理学IgG抗体介导的持续ADE。在一些实施例中,IgG1 Fc结构域可以选自具有L234A、L235A和P329G取代的IgG1 Fc结构域片段;具有P329G取代的IgG1 Fc结构域片段;具有L234A和L235A取代的IgG1Fc结构域片段;具有N297D取代的IgG1 Fc结构域片段;具有N297A取代的IgG1 Fc结构域片段;以及具有N297Q取代的IgG1 Fc结构域片段。IgG1 Fc结构域可以用于减轻ADE的风险,并且允许ACE2-Fc融合多肽中断内源性免疫病理学IgG抗体介导的持续ADE。在足够的外周组织浓度下,ACE2-Fc融合多肽成功地与这些结合SARS-CoV-2刺突蛋白RBD的内源性抗体竞争并阻断它们。这减少了与抗体结合的病毒粒子的数量,所述抗体可以通过结合Fcγ受体促进ADE。
本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽通过阻断ADE的病理生理机制并通过直接竞争性抑制病毒感染来减少肺部的病毒粒子的数量,从而预防、减轻严重程度和/或治疗COVID-19患者的ARDS。
本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽可以使用多种双功能蛋白质偶联剂与异源药剂缀合,包含但不限于N-(2-吡啶基二硫代)丙酸琥珀酰亚胺酯(SPDP)、(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯HCL)、活性酯类(如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如,碳标记的1-异硫氰基苄基甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂(WO 94/11026)。
另一方面,本发明的特征在于与治疗部分(如抗病毒药物)缀合的ACE2-Fc融合多肽。缀合的ACE2-Fc融合多肽除了治疗效用外,还可以用于诊断或预测监测样品中的多肽水平,作为临床测试程序的一部分,例如,确定给定治疗方案的功效。可以通过将ACE2-Fc融合多肽与可检测物质偶联(即物理连接)来促进检测。可检测物质的实例包含各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶;合适的辅基复合物的实例包含flag标签、myc标签、血凝素(HA)标签、链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素;合适的荧光材料的实例包含伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白(PE);发光材料的实例包含鲁米诺(luminol);生物发光材料的实例包含荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白,并且合适的放射性材料的实例包含125I、131I、35S或3H。如本文所使用的,关于ACE2-Fc融合多肽的术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测物质如放射性药剂或荧光团(例如,异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)或吲哚菁(Cy5))与ACE2-Fc融合多肽偶联(即物理连接)直接标记ACE2-Fc融合多肽,以及通过与可检测物质的反应性间接标记ACE2-Fc融合多肽。
本发明的ACE2-Fc融合多肽缀合物可以用于修饰给定的生物应答。治疗部分不应被解释为限于典型的化学治疗剂。例如,药物部分可以是具有期望的生物活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可以包含例如酶活性毒素或其活性片段,如相思子毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素或白喉毒素;如肿瘤坏死因子或干扰素-γ的蛋白质;或生物反应调节剂,例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它细胞因子或生长因子。
1.预防方法
一方面,本发明提供了一种通过向受试者施用与冠状病毒结合的ACE2-Fc融合蛋白,由此抑制病毒与ACE2结合并进入细胞而在受试者中预防冠状病毒感染的方法。预防剂的施用可以在表现出冠状病毒感染的症状特征之前发生,从而预防感染,或可替代地,减少或消除感染症状。由于包括Fc片段的融合蛋白的半衰期延长,ACE2-Fc融合多肽可以在流动环境中通过皮下注射施用。这使得能够在野外或社区环境中对患有COVID-19的军人、退伍军人或平民进行治疗,降低了传染病传播率,减少了住院治疗,并且允许对暴露或风险个体进行预防。
另外,如果接受预防剂的受试者暴露于冠状病毒并产生针对冠状病毒的适应性免疫应答,则施用ACE2-Fc融合多肽可以减少或消除抗体依赖性增强(ADE)。
2.治疗方法
本发明的另一方面涉及通过施用本发明所涵盖的ACE2-Fc融合多肽来治疗感染冠状病毒的受试者的方法。融合多肽竞争性地抑制冠状病毒与内源性ACE2的结合,由此阻止病毒进一步感染细胞。
如本文所使用的,术语“药剂”和“治疗剂”被广义地定义为包括ACE2-Fc融合多肽的任何化合物或组合物,其可向受试者施用或应用于细胞培养物以抑制冠状病毒与内源性ACE2多肽的结合和/或减少或消除冠状病毒感染的抗体依赖性增强。
本发明的治疗方法涉及使冠状病毒(例如,SARS-CoV-2)与本发明的ACE2-Fc融合多肽接触,包含包括具有表1中所示的氨基酸序列的ACE2胞外结构域、具有表2、3或4中的氨基酸序列的铰链多肽、或半胱氨酸-脯氨酸或脯氨酸氨基酸铰链,以及具有表5所示的氨基酸的Fc结构域片段。
本发明的ACE2-Fc融合多肽竞争性地抑制冠状病毒与内源性ACE2的结合,并且由于ACE2-Fc融合多肽调节病毒进入细胞的量的事实,其还调节细胞中冠状病毒活性的总量(即病毒复制)。另外,在治疗浓度下使用ACE2-Fc融合多肽将超过内源性表达的抗冠状病毒抗体与病毒结合,由此减少或消除受试者的ADE。
在一个实施例中,所述药剂抑制或增强冠状病毒与内源性ACE2或其它结合配偶体的相互作用。在另一个实施例中,所述药剂隔离冠状病毒,由此防止内源性抗体与病毒结合。通过减少或消除内源性抗体与冠状病毒的结合,减少或消除了感染的抗体依赖性增强。
在一些实施例中,DF-COV化合物被用作对抗体和/或疫苗具有抗性的冠状病毒变体的治疗。此类变体现在正在出现。在公开可用的数据中,“南非变体”显示出对疫苗的一些抗性,以及对若干种临床相关单克隆抗体的显著抗性,包含对礼来公司(Eli Lilly)的巴尼韦单抗(bamlanivimab)的完全抗性。另外的数据表明,这是由于病毒S蛋白受体结合结构域中的E484K取代,其也存在于“巴西变体”中。
这些方法可以在体外进行(例如,通过使细胞培养物与药剂接触,其中所述细胞培养物在接触时被冠状病毒感染或将暴露于冠状病毒),或可替代地,通过在体内使体液与药剂接触(例如,通过向受试者施用药剂)。因此,本发明提供了治疗感染冠状病毒或有感染冠状病毒风险的个体的方法,所述方法将受益于抑制病毒进入细胞的药剂。在一个实施例中,所述方法涉及施用ACE2-Fc融合多肽,其抑制或减少冠状病毒感染的抗体依赖性增强。
通过比较从接受治疗的受试者获得的两个或多个样品,可以监测任何特定治疗剂治疗冠状病毒感染的有效性。通常,在开始疗法之前从受试者获得第一样品,并且在治疗期间获得一个或多个样品。在此类用途中,在疗法前确定冠状病毒感染(例如,COVID-19)的受试者细胞表达的基线,并且然后在疗法过程期间监测冠状病毒感染的受试者细胞表达基线状态的变化。可替代地,可以使用治疗期间获得的两个或多个连续样品,而无需预处理基线样品。在此类用途中,从受试者获得的第一样品用作确定受试者中病毒载量是增加还是减少的基线。
另外,ACE2-Fc融合多肽还可以与其它疗法(例如,抗病毒剂、抗疟药、抗炎药、止痛药(例如,对乙酰氨基酚、布洛芬(ibuprofen)等)和小分子治疗(包含但不限于瑞德西韦(remdesivir)))组合施用。
V.试剂盒
本发明还涵盖用于治疗冠状病毒感染的试剂盒。本发明所涵盖的试剂盒还包含说明材料,所述说明材料公开或描述了所公开的发明的试剂盒或ACE2-Fc融合多肽在如本文提供的所公开的发明的方法中的用途。试剂盒还可以包含用于促进试剂盒设计的特定应用的另外组件。例如,试剂盒可以另外含有施用ACE2-Fc融合多肽的手段(例如,注射器、灭菌小瓶和/或灭菌试剂)。试剂盒可以另外包含缓冲液和其它公认用于所公开的发明方法的试剂。非限制性实例包含用于减少非特异性结合的药剂,如载体蛋白或去污剂。
实例
实例1:材料和方法
DF-COV构建体的设计和生产
DF-COV-01和DF-COV-02的设计如下。人血管紧张素转化酶2(ACE2)的氨基酸序列从通用蛋白质数据库(UniProt)获得。对于DF-COV-01,使用完整的ACE2胞外结构域、氨基酸18-730。对于DF-COV-02,使用ACE2胞外结构域的子集、氨基酸18-615。对于DF-COV-01和DF-COV-02两者,催化组氨酸374和378都发生突变(H374N和H378N),使ACE2胞外结构域酶失活。这些ACE2胞外结构域的序列被附加到从UniProt获得的人IgG4铰链区和Fc结构域的氨基酸序列的氨基末端。在DF-COV-01和DF-COV-02两者中,IgG4铰链区和Fc结构域包含已知可减少FAB臂交换、Fcγ受体结合和C1q结合的点取代:S228P和L234E(以下称为IgG4-SPLE)。用于DF-COV-01和DF-COV-02的确切铰链区和Fc结构域序列分别列出如下。为了构建DF-COV-01,将下面列出的适当ACE2胞外结构域直接附加到下面列出的适当铰链区的氨基末端。为了构建DF-COV-02,将下面列出的适当ACE2胞外结构域附加到下面列出的适当铰链区的氨基末端,并且在ACE2胞外结构域与铰链区之间插入单个甘氨酸残基。通过计算逆转录和密码子优化获得编码DF-COV-01和DF-COV-02的核苷酸序列。编码信号肽MEWSWVFLFFLSVTTGVHS的核苷酸序列立即被5'附加到重链和轻链核苷酸序列两者上。
合成核苷酸序列并将其克隆到pLEV123表达载体(LakePharma公司(LakePharma,Inc.))中,并且所述序列经PCR扩增和桑格测序(Sanger sequencing)证实。然后通过PCR扩增载体,并且将扩增的DNA在琼脂糖凝胶上进行质量评估,并且在进行转染前通过桑格测序再次证实其序列。蛋白质生产和纯化按照LakePharma公司的标准操作程序进行。简而言之,将中国仓鼠卵巢(CHO)细胞悬浮接种在摇瓶中,并且使用无血清化学定义的培养基进行扩增。在转染当天,将扩增的细胞接种到具有新鲜培养基的新烧瓶中。将表达载体瞬时转染到CHO细胞中。将细胞作为分批进料培养物维持十四天。采集来自瞬时生产运行的条件培养基,并且通过离心和过滤使所述条件培养基澄清。将上清液上样到用结合缓冲剂预平衡的蛋白A柱上。洗涤缓冲剂通过柱,直到OD280值(NanoDrop,赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific))测量为零。用低pH缓冲剂洗脱靶蛋白,收集级分,并且记录每个级分的OD280值。汇集含有目标蛋白的级分,并且通过0.2μm膜过滤器过滤。由OD280值和计算的消光系数计算蛋白质浓度。使用LabChip GXII(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))进行靶蛋白的毛细管电泳(CE-SDS)分析。为了确认低内毒素水平,使用显色鲎属变形细胞裂解物方法(Endosafe-MCS,查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))对纯化的产物的重复样品进行定量。
SARS-CoV-02刺突蛋白结合测定
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)评估DF-COV-01和DF-COV-02与SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的结合。在pH 9.5的碳酸盐缓冲剂(15mM Na2CO3和35mM NaHCO3)中,在4℃下用5μg/mL重组三聚稳定、预融合稳定的SARS-CoV-2S蛋白(LakePharma公司,参考#46328)涂覆Corning Costar 96孔ELISA板过夜。使用BioTek 405TS微孔板洗涤器在PBS-吐温(购自吉博科公司(Gibco)的磷酸盐缓冲盐水pH 7.4,并且补充有购自西格玛公司(Sigma)的0.05%吐温20)中将板洗涤三次。然后通过在PBS中的5%重量/体积的牛奶中温育来封闭平板。然后使用BioTek 405TS微孔板洗涤器在PBS-吐温中将板洗涤三次。将DF-COV-01或DF-COV-02在PBS-BSA(含0.5%牛血清白蛋白的PBS)中的连续两倍稀释液添加到ELISA板的适当孔中,一式三份,并且在室温下温育30分钟。然后使用BioTek 405TS微孔板洗涤器在PBS-吐温中将板洗涤三次。将在PBS-BSA中稀释1:5000的辣根过氧化物酶缀合的抗人IgG二级抗体(南方生物技术公司(Southern Biotech),2014-05)添加到所有孔中,并且在室温下温育15分钟。然后使用BioTek 405TS微孔板洗涤器在PBS-吐温中将板洗涤三次。添加过氧化物酶底物(TMB微孔过氧化物酶底物系统,KPL公司(KPL Inc.)),然后添加50%体积的1M磷酸终止溶液。使用Molecular Devices SpectraMax M3读板仪确定每个孔在450nm处的光密度,表示DF-COV与SARS-CoV-2S蛋白的结合程度。
FcγRIIa结合测定
通过ELISA评估DF-COV-01和DF-COV-02与重组人FcγRIIa的结合。在pH 9.5的碳酸盐缓冲剂中,在4℃下用1μg/mL的重组人FcγRIIA/CD32a(H167)蛋白(R&D系统公司(R&DSystems),9595-CD-050)涂覆Corning Costar 96孔ELISA板过夜。使用BioTek 405TS微孔板洗涤器在PBS-吐温中将板洗涤三次。然后通过在PBS中的5%重量/体积的牛奶中温育来封闭平板。然后使用BioTek 405TS微孔板洗涤器在PBS-吐温中将板洗涤三次。将DF-COV-01、DF-COV-02或人ACE2-IgG1 Fc(LakePharma公司,参考#46672和#46673)在PBS-BSA中的连续两倍稀释液添加到ELISA板的适当孔中,一式三份,并且在室温下温育30分钟。然后使用BioTek 405TS微孔板洗涤器在PBS-吐温中将板洗涤三次。将在PBS-BSA中稀释1:5000的辣根过氧化物酶缀合的抗人IgG F(ab')2二级抗体(南方生物技术公司(SouthernBiotech),2042-05)添加到所有孔中,并且在室温下温育15分钟。然后使用BioTek 405TS微孔板洗涤器在PBS-吐温中将板洗涤三次。添加过氧化物酶底物(TMB微孔过氧化物酶底物系统,KPL公司),然后添加50%体积的1M磷酸终止溶液。使用Molecular Devices SpectraMaxM3读板仪确定每个孔在450nm处的光密度,表示构建体与FcγRIIa的结合程度。
ACE2酶活性测定
通过荧光酶活性测定评估ACE2酶活性。将DF-COV-01、DF-COV-02或人ACE2-IgG1Fc(LakePharma公司,参考#46672和#46673)的两倍系列稀释液稀释在100μL的反应缓冲剂中,所述反应缓冲剂含有0.1% BSA、1M NaCl、75mM Tris、0.5mM ZnCl2、pH 7.5在96孔Corning Costar板中。以50μM的浓度添加Mca-YVADAPK(Dnp)-OH荧光肽底物(R&D系统公司,ES007)。使用维持在37℃的Molecular Devices SpectraMax M3读板仪通过荧光(激发322nm,发射381nm)监测反应进展。荧光的变化用于计算反应速度。使用反应速度比较DF-COV-01和DF-COV-02与野生型ACE2-IgG1 Fc的ACE2酶活性。
假型化病毒中和研究
假型化SARS-CoV和SARS-CoV-2是使用复制缺陷型HIV-1主链产生的,所述主链含有突变以阻止HIV包膜糖蛋白表达,以及荧光素酶基因以指导靶细胞中的荧光素酶表达。HEK293-T细胞用两种质粒共转染:一种是SARS-CoV或SARS-CoV-2刺突蛋白的表达载体,并且另一种携带Env缺陷的HIV-1基因组。转染后48小时采集含有病毒颗粒的上清液,使用Centricon 70浓缩器浓缩,并且在-80℃下冷冻储存。通过用人ACE2表达载体(pcDNA-hACE2)瞬时转染293T细胞产生靶细胞。ACE2转染的293T细胞在转染后24小时用作靶细胞。在用人ACE2受体瞬时转染的293T细胞上进行假病毒滴定,以确定感染测定中每秒产生50,000计数(cps)所需的病毒体积。将适当体积的假病毒与DF-COV-01、DF-COV-02或不相关的Fc融合的系列稀释液在室温下预温育1小时,然后添加表达人ACE2的293T细胞。24小时后,用新鲜的完整培养基替换含有假病毒的培养基。在另外24小时后,用BrightGlo荧光素酶测定(普洛麦格公司)通过荧光素酶检测对感染进行定量,并且在Victor3读板仪(珀金埃尔默公司)中读取。
药代动力学研究
对叙利亚仓鼠进行称重,然后皮下注射8mg/kg的DF-COV-01或DF-COV-02。随后在注射后4小时、8小时、24小时、48小时和72小时从隐静脉获得介于50μL与100μL之间的静脉血。将来自这些隐静脉血样的血清冷冻,以供稍后分析。通过ELISA确定血清样品中DF-COV-01和DF-COV-02的浓度。在pH 9.5的碳酸盐缓冲剂中,在4℃下用5μg/mL重组三聚稳定、预融合稳定的SARS-CoV-2S蛋白(LakePharma公司,参考#46328)涂覆Corning Costar 96孔ELISA板过夜。使用BioTek 405TS微孔板洗涤器在PBS-吐温中将板洗涤三次。然后通过在PBS中的5%重量/体积的牛奶中温育来封闭平板。然后使用BioTek 405TS微孔板洗涤器在PBS-吐温中将板洗涤三次。将血清样品在PBS-BSA(含0.5%牛血清白蛋白的PBS)中的连续两倍稀释液添加到ELISA板的适当孔中,一式三份,并且在室温下温育30分钟。这与已知浓度的DF-COV-01或DF-COV-02样品平行进行,以定义标准曲线。然后使用BioTek 405TS微孔板洗涤器在PBS-吐温中将板洗涤三次。将在PBS-BSA中稀释1:5000的辣根过氧化物酶缀合的抗人IgG二级抗体(南方生物技术公司,2014-05)添加到所有孔中,并且在室温下温育15分钟。然后使用BioTek 405TS微孔板洗涤器在PBS-吐温中将板洗涤三次。添加过氧化物酶底物(TMB微孔过氧化物酶底物系统,KPL公司),然后添加50%体积的1M磷酸终止溶液。使用Molecular Devices SpectraMax M3读板仪确定每个孔在450nm处的光密度,表示DF-COV与SARS-CoV-2S蛋白的结合程度。在考虑了适当的稀释因子后,使用落在标准曲线线性范围内的血清稀释液的OD 405来计算每个时间点的DF-COV-01或DF-COV-02的血清浓度。
抗体依赖性增强测定
试剂促进表达FcγRIIa但不表达ACE2的靶细胞感染的能力可以用作其促进抗体依赖性增强(ADE)能力的模型。如上所述制备并纯化假型化SARS-CoV-2病毒,不同之处在于复制缺陷型HIV-1载体含有绿色荧光蛋白(GFP)的基因而不是荧光素酶作为报告。为了评估试剂促进ADE的能力,将假型化病毒与以下适当试剂的系列稀释液在室温下一起温育1小时:SARS-CoV-02受体结合结构域(RBD)特异性中和抗体(义翘神州公司(SinoBiological),#40592-MM57或金斯瑞公司(Genscript),A02038)、不相关的同种型对照抗体、DF-COV-01、DF-COV-02或不相关的Fc融合。然后将其添加到转化为表达人FcγRIIa的Jurkat细胞的培养物中,并且通过流式细胞术证明其不表达ACE2(普洛麦格公司)。在37℃下5% CO2气氛中温育24小时后,将含有假病毒的培养基替换为新鲜的完整培养基。在相同条件下温育另外24小时后,通过使用Celigo成像细胞仪使用定量免疫荧光显微镜确定GFP表达来定量感染。如通过GFP表达测量的感染表明抗体依赖性增强(病毒进入由抗病毒抗体介导的表达Fc受体的靶细胞)。
为了评估DF-COV-01和DF-COV-02抑制SARS-CoV-2RBD特异性抗体促进的ADE的能力,如上所述产生和纯化假型化病毒,并且在室温下与SARS-CoV-02RBD特异抗体和DF-COV-01、DF-COV-02或无关Fc融合以不同摩尔比一起温育1小时。如上所述,将其添加到转化为表达人FcγRIIa的Jurkat细胞的培养物中,并且通过流式细胞术证明其不表达ACE2。在37℃下5% CO2气氛中温育24小时后,将含有假病毒的培养基替换为新鲜的完整培养基。在相同条件下温育另外24小时后,通过使用Celigo成像细胞仪使用定量免疫荧光显微镜确定GFP表达来定量感染。如通过GFP表达测量的感染表明ADE,并且当与包含不相关Fc融合的条件相比时,包含DF-COV-01或DF-COV-02的条件下的感染减少程度作为ADE抑制的指标。
除了评估病毒进入作为ADE的指标外,还可以评估SARS-CoV-02RBD特异性抗体、同种型对照抗体、DF-COV-01、DF-COV-02或不相关Fc融合蛋白调理的假型化SARS-CoV-2的免疫复合物对FcγRIIa的激活。还可以评估DF-COV-01和DF-COV-02阻断SARS-CoV-02RBD特异性抗体对假型化病毒的调理作用并介导FcγRIIa激活的能力。如上所述产生表达GFP报告的SARS-CoV-2假病毒,并且在室温下与SARS-CoV-02RBD特异性抗体、同种型对照抗体、DF-COV-01、DF-COV-02或不相关的Fc融合蛋白的系列稀释液一起温育1小时。对于评估DF-COV-01或DF-COV-02阻断病毒调理和由此产生的FcγRIIa激活的能力的实验,将假病毒与不同摩尔比的SARS-CoV-02RBD特异性抗体和DF-COV-01、DF-COV-02或不相关Fc融合在室温下一起温育1小时。使用Promega FcγRIIa-H ADCP生物测定(G9901)评估这些实验条件下的FcγRIIa激活,所述生物测定根据试剂盒的推荐方案进行。使用Molecular DevicesSpectraMax M3读板仪确定每个孔的发光,作为FcγRIIa激活的指标。
体内功效研究
介于6周与8周龄之间的雄性和雌性仓鼠在氯胺酮-甲苯噻嗪麻醉下通过鼻内滴注,在100μL的条件培养基(USA-WA01-2020菌株的Vero传代3,BEI资源公司(BEIResources))中感染每毫升103个至105个斑形成单位(pfu/mL)的SARS-CoV-2。在同一天,对仓鼠进行称重并皮下注射8mg/kg的DF-COV-01、DF-COV-02或同等体积的PBS作为媒剂对照。将口咽拭子收集到病毒运输介质中,每天一次,在攻击前立即开始,并且延长3天。在攻击后第3天和第7天分别对一半的动物进行安乐死和尸检,这两天的病毒滴度最高,并且肺病理学最严重。在这些时间点收集包含肺在内的多个组织进行病毒滴定和组织病理学。病毒滴度通过Vero细胞单层斑测定确定。Vero细胞单层在六孔Costar组织培养处理的板中的1mL伊格尔(Eagle)MEM培养基中生长到80%融合,所述培养基补充有10%胎牛血清。在96孔板中制备一系列10倍稀释的病毒运输培养基中的样品,并且将100μL的每种样品添加到含有Vero细胞单层的单独的适当孔中。摇动每个板以均匀分布接种物后,将这些培养物在37℃下5% CO2气氛中温育60分钟至90分钟。然后去除含有接种物的培养基,并且用PBS洗涤单层。将含有等量伊格尔MEM介导(补充有10%胎牛血清和预冷却到42℃的煮沸的1%琼脂糖溶液)的琼脂糖覆盖层添加到每个洗涤的Vero单层上,冷却15分钟,并且然后在37℃下5%CO2气氛中温育4天。然后用1:10,000稀释的中性红在类似制备的完整MEM培养基/琼脂糖覆盖层中对板进行染色。在37℃下5% CO2气氛中温育过夜后,对斑进行计数。接种物的稀释用于将斑计数转化为每毫升初始接种物样品的斑形成单位数量(pfu/mL)。
实例2:体外评估ACE2-Fc融合多肽与SARS-CoV-2的结合
体外评估ACE2-Fc融合多肽结合重组SARS-CoV-2刺突蛋白(由LakePharma公司生产)的能力。简而言之,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测DF-COV-01和DF-COV-02与重组SARS-CoV-2刺突蛋白的结合。SARS-CoV-2刺突蛋白固定在96孔板上。然后用牛奶蛋白封闭板,洗涤,并且将DF-COV-01或DF-COV-02的连续两倍稀释液添加到适当的孔中。再次洗涤板,并且通过过氧化物酶标记的抗人IgG二级抗体检测DF-COV-01或DF-COV-02的结合。在添加比色过氧化物酶底物后,使用光学密度读板仪测量结合。将结合(光学密度)绘制为DF-COV-01或DF-COV-02浓度的函数以产生结合曲线(图2A和2B)。结合可以与先前产生的野生型ACE2-Fc融合的结合进行比较。非特异性Fc融合(人PD-L1-Fc)可作为阴性对照。
实例3:体外评估ACE2-Fc融合多肽的酶活性
DF-COV-01和DF-COV-02的ACE2酶活性的评估通过使用可商购获得的荧光ACE2底物(Mca-YVADAPK(Dnp)-OH)的荧光酶活性测定进行。所述测定如前所述进行(Imai等人,(2005)《自然》,436(7047):112-6)。简而言之,反应在37℃下在pH 7.5缓冲剂中进行,所述缓冲剂有助于ACE2酶活性,含有0.1% BSA、1M NaCl、75mM Tris、0.5mM ZnCl2。荧光的变化指示酶活性,并且使用荧光读板仪监测。DF-COV-01和DF-COV-02的ACE2酶活性与先前产生的野生型酶活性ACE2-Fc融合的酶活性进行了比较。非特异性Fc融合用作阴性对照。
对于酶活性,比较DF-COV-01或DF-COV-02或对照的不同浓度的反应速度(荧光变化的导数)。
实例4:DF-COV-01和DF-COV-02在体外抑制天然SARS-CoV-2病毒和SARS-CoV-2假病毒对源自iPSC(iAT2细胞)的人肺泡2型细胞的感染
人2型肺泡细胞感染天然SARS-CoV-2病毒的模型利用iAT2细胞,其是从诱导多能干细胞(iPSC)分化的肺泡2型细胞(AT2)。如前所述制备这些细胞和气液界面2D培养物(Kristine等人,(2020)《生物预印本期刊(bioRxiv)》,biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.03.132639v1)。
实例5:SARS-CoV-2感染的iAT2细胞的体外预防和治疗。
进行了两项研究:(1)预防研究,其中与SARS-CoV-2感染同时施用DF-COV-01或DF-COV-02,并且此后也维持在iAT2培养物中;以及(2)治疗研究,其中在SARS-CoV-2感染后一天向iAT2培养物施用DF-COV-01或DF-COV-02,并且此后维持在iAT2培养物中。对于两个实验,病毒滴度在感染后第4天通过定量RT-PCR定量。在没有治疗的情况下,病毒滴度从第1天至第4天显著增加。这两项研究中每一项中的治疗包含DF-COV-01或DF-COV-02的两倍连续稀释液或用作阴性对照的非特异性Fc融合。
通过定量RT-PCR测量培养物中的病毒滴度,通过病毒N蛋白的定量免疫荧光显微镜评估iAT2肺细胞的感染。基于病毒滴度数据产生两条单独的中和曲线,并且通过免疫荧光定量N蛋白表达。由这些曲线中的每个计算的关键数据如下:(1)此系统中DF-COV病毒中和的IC50以及(2)DF-COV完全或几乎完全中和病毒的浓度。
实例6:DF COV介导的对ACE2转导的293细胞的SARS-CoV-2假病毒感染的抑制作用
如下详细描述的进行标准假病毒中和研究,以比较包括非活性ACE2结构域和不结合Fcγ受体(例如,FcγIIa受体)的Fc结构域片段的ACE2-Fc融合多肽与RBD抗体和PDL-1Fc多肽之间的病毒中和。
使用表达SARS-CoV-2的全长刺突蛋白的假病毒,以便在生物安全水平(BSL)-2条件下评估DF-COV-01或DF-COV-02的中和。所述假病毒是使用表达萤火虫荧光素酶的复制缺陷型HIV-1主链产生的。产生缺乏SARS-CoV-2刺突蛋白的病毒作为对照。使用假病毒感染用人ACE2(293A/ACE2)转染的HEK293A细胞。用不同浓度的DF-COV-01或DF-COV-02或非特异性Fc融合作为对照与假病毒的两倍系列稀释液一起温育。感染后,培养细胞并对采集的细胞的裂解物进行荧光素酶测定,以定量病毒感染。
作为假病毒感染的替代物,发光被绘制为DF-COV-01或DF-COV-02或相关对照的浓度的函数,以产生病毒中和曲线(图3)。使用此曲线计算了此系统中DF-COV-01或DF-COV-02病毒中和的IC50以及DF-COV-01或DF-COV-02完全或几乎完全中和病毒的浓度。
实例7:DF-COV与FcγRIIa结合和ACE2-Fc与IgG1 Fc结合的比较
使用如前所述的表面等离子体共振,将ACE2-Fc融合多肽的FcγRIIa结合与先前制备的具有人IgG1 Fc结构域的ACE2-Fc的结合进行比较(Schlothauer等人,(2016)《蛋白质工程设计与选择》,29(10):457-66)。简而言之,将可商购获得的重组His标记的FcγRIIa胞外结构域(R&D系统公司)固定在CM5 Biacore芯片上,所述芯片使用已确立的试剂盒方案预先涂覆有抗His捕获抗体。在Biacore分析期间,将浓度为100nM的His标记的FcγRIIa施加于HBS-P+运行缓冲剂中。随后,以100nM的浓度将具有IgG1Fc的DF-COV-01或DF-COV-02或ACE2-Fc施加到髋。通过标准方案监测缔合和解离阶段,并且通过Biacore评估软件计算结合常数,并且利用其来比较FcγRIIa对DF-COV和具有IgG Fc结构域的ACE2-Fc的结合的相对亲和力。此方案可以修改为使用ELISA分析代替表面等离子体共振。
实例8:DF-COV与FcγRIIa的结合和ACE2-Fc与多克隆人IgG的结合的比较
通过ELISA将ACE2-Fc融合多肽的FcγRIIa结合与多克隆人IgG的结合进行比较。简而言之,将重组人FcγRIIa(R&D系统公司)固定在ELISA板上。在封闭ELSIA板并使用BioTek 405TS微孔板洗涤器在PBS-吐温中洗涤3次后,将DF-COV-01、DF-COV-02或PBS-BSA中的多克隆人IgG(BioXCell)的系列稀释液一式三份施加到适当的孔中,并且在室温下温育30分钟。在使用BioTek 405TS微孔板洗涤器在PBS-吐温中洗涤ELISA板3次后,在室温下将所有孔与PBS-BSA中1:5000稀释的辣根或过氧化物酶缀合的抗人IgG F(ab')2二级抗体(南方生物技术公司)一起温育15分钟。然后使用BioTek 405TS微孔板洗涤器在PBS-吐温中将板洗涤三次。添加过氧化物酶底物(TMB微孔过氧化物酶底物系统,KPL公司),然后添加50%体积的1M磷酸终止溶液。使用Molecular Devices SpectraMax M3读板仪确定每个孔在450nm处的光密度,表示DF-COV或人IgG与FcγRIIa的结合程度(图4A和图4B)。
实例9:DF-COV-01和DF-COV-02在体外阻断ADE
为了评估DF-COV-01和DF-COV-02阻断ADE的能力,采用了模型系统,所述模型系统与先前描述的一种模型系统相似,其在体外证明了由MERS-CoV中和抗体诱导的ADE(Wan等人,(2020))。首先确定针对SARS-CoV-2RBD的中和抗体是否可以在体外促进ADE。为了实现这一点,将表达FcγRIIa(普洛麦格公司)的可商购获得的Jurkat细胞用作靶细胞。基于使用人类蛋白质图谱(Human Protein Atlas)(www.proteinatlas.org/ENSG00000130234-ACE2/tissue/T-cells)搜索T细胞RNAseq数据,Jurkat不表达ACE2,因此这些细胞不应易受SARS-CoV-2假病毒感染,除非感染由ADE介导。这些细胞在含有绿色荧光蛋白(GFP)报告的SARS-CoV-2假病毒存在下培养。Jurkat细胞中的GFP表达表明病毒进入。向这些共培养物中添加不同浓度的SARS-CoV-2中和抗体,已知其结合SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD。现在有若干种SARS-CoV-2RBD特异性中和抗体可商购获得(www.genscript.com/antibody/A02038-SARS_CoV_2_Spike_S1_Antibody_HC2001_Human_Chimeric.html;www.sinobiological.com/antibodies/cov-spike-40592-mm57),包含一些具有人IgG1 Fc结构域的抗体。通过使用流式细胞术测量Jurkat靶细胞中的GFP荧光来评估这些抗体通过FcγRIIa介导的病毒进入诱导ADE的能力。可以在此系统中测定各种可商购获得的抗体。将单独与FcγRIIa Jurkat细胞或与假病毒而非抗体一起温育的FcγRIIa Jurkat细胞的对照样品进行比较。
使用这些可商购获得的FcγRIIa Jurkat细胞具有另外的益处,因为其已被工程化为作为FcγRIIa激活的报告。通过免疫复合物的FcγRIIa聚类触发这些细胞中荧光素酶报告的表达。因此,除了通过测量GFP表达来评估病毒进入外,还可以测量SARS-CoV-2假病毒与中和抗体的免疫复合物对FcγRIIa的激活。可以将单独与FcγRIIa Jurkat细胞或与假病毒而非抗体一起温育的FcγRIIa Jurkat细胞对照样品进行比较。可以可靠地测量FcγRIIa依赖性病毒进入、免疫复合物对FcγRIIa的激活或两者。此系统用于表明,与具有IgG1 Fc结构域的类似预制ACE2-Fc相比,用DF-COV-01和DF-COV-02治疗可以导致较少的ADE(通过病毒进入和/或FcγRIIa激活来测量),并且可以阻断SARS-CoV-2刺突蛋白RBD特异性中和抗体诱导的ADE。
使用流式细胞术通过靶细胞中GFP的表达来测量假病毒进入。FcγRIIa的激活通过这些靶细胞的发光使用读板仪来测量,所述靶细胞被工程化为FcγRIIa报告。
实例10:在SARS-CoV-2感染的体内模型中确定DF-COV-01和DF-COV-02在降低病毒滴度和改善肺病理学方面的功效
在显示人类疾病的许多特征的仓鼠感染攻击模型中评估了DF-COV-01和DF-COV-02减少SARS-CoV-2病毒感染的能力。为了验证此模型,在BSL-3动物设施中,用SARS-CoV-2对大约50只仓鼠进行鼻内攻击。临床疾病轻微,伴有短暂发烧和嗜睡,但无严重表现。攻击后第3天,口腔拭子始终含有感染性病毒,这提供了一种定量病毒脱落的方法。在第3天,呼吸道中病毒的器官负荷很高,但在攻击后第7天或第21天未检测到。表9提供了攻击后第3天来自10只仓鼠的组织和口咽拭子的滴度。
表9:滴度
PFU/克或拭子 | 肺 | 鼻甲 | 口腔拭子 |
平均值 | 4.13E+06 | 4.32E+07 | 8.56E+02 |
最小值 | 5.70E+05 | 2.30E+07 | 3.10E+02 |
最大值 | 6.90E+06 | 5.50E+07 | 1.50E+03 |
组织病理学评估显示,攻击后第3天出现中度严重急性支气管间质性肺炎,尽管缺乏感染性病毒,但第7天更严重。这些病变高度一致,并且正在进行实验以更好地表征肺部病变(例如肺纤维化)的消退。
介于6周与8周龄之间的雄性和雌性仓鼠通过在氯胺酮-甲苯噻嗪麻醉下鼻内滴注100μl体积中介于103pfu与105pfu之间的病毒感染SARS-CoV-2(源自BEI资源公司的USA-WA01-2020菌株的Vero传代3)。从病毒攻击前一天开始,对动物进行密切的临床监测,每天记录体重,每天两次由皮下植入的生命芯片(Destron-Fearing公司(Destron-Fearing))记录体温,并且每天两次临床评估和评分(4分量表)。此监测和生理数据用于评估毒性。SARS-CoV-2感染在仓鼠中是亚临床的,因此预期在临床评估和单独感染评分中不会偏离正常值。
为了收集研究结果的数据,将口咽拭子收集到病毒运输介质中,每天一次,在攻击前立即开始,并且延长3天。在攻击后第3天和第7天在单独的实验中分别进行安乐死和尸检,这两天的病毒滴度最高,并且肺病理学最严重。在这些时间点收集包含肺在内的多个组织进行病毒滴定和组织病理学。
DF-COV-01或DF-COV-02与病毒攻击同时皮下施用,并且分为三个治疗组,每个治疗组的DF-COV-01或DF-COV-02的剂量不断增加。根据其它受体Fc融合和抗体,假设60%的血管外分布和40%的血管内分布,计算剂量以实现动物的细胞外液中药物的特定浓度。靶向治疗组的特定浓度为(1)相当于体外中和假病毒的DF-COV-01and DF-COV-02的IC50,(2)相当于在体外实现完全或接近完全中和假病毒所需的浓度,以及(3)实现体外完全或接近完全中和假病毒所需的浓度一些倍数(例如,介于2X与10X之间)。每个治疗组由六只动物组成。在每个实验中都包含由六只用盐水治疗的动物组成的对照组,作为媒剂对照。在第3天和第7天终点时重复实验。第3天的终点实验用于评估DF-COV-01和DF-COV-02对病毒滴度的影响。第7天的终点实验评估DF-COV-01和DF-COV-02对肺病理学的影响。在第3天比较治疗组与对照组之间的鼻甲、口咽和肺病毒滴度。治疗组和对照组的第3天和第7天肺组织病理学由委员会认证的兽医病理学家进行评估。
数据经过log10变换以控制可变性。对于每个实验,将6只动物随机分配到如上所述的每个治疗组(四个组:低DF-COV-01或DF-COV-02剂量、中等DF-COV-01或DF-COV-02剂量、高DF-COV-01或DF-COV-02剂量,以及媒剂对照),并且假设每组中的方差相等。进行单向方差分析(ANOVA),在0.10双侧显著性水平上进行测试,并且使用邓尼特方法(Dunnett'sapproach)将每种活性药剂与媒剂对照进行比较,以有效调整测试多重性的p值。此研究有90%以上的能力确定至少一个与对照组不同的治疗组。
每天两次临床评估评分可以评估毒性。通过阈值将评分转换为二进制变量。每组6只小鼠,与对照的12%相比,88%的治疗的动物有83%的能力检测毒性。此类比较基于飞世尔精确测试(Fisher exact test),在0.10双侧显著性水平上进行。
实例11:DF-COV-01和DF-COV-02在非人灵长类动物中的毒性评估
标准14天毒性研究设计如表10所概述,血液取样以测量循环药物水平。皮下给药和静脉施用途径在单独的组中使用,以提供安全性数据,以保留在临床试验中除了皮下施用臂之外还包含静脉施用臂的选择。
表10
实例12:DF-COV-02比DF-COV-01具有更好的组织暴露
将DF-COV-01和DF-COV-02的酶活性与含有野生型ACE2胞外结构域的对应的ACE2-Fc融合的酶活性进行比较。结果表明,尽管匹配的野生型ACE2-Fc融合显示出酶活性,但DF-COV-01和DF-COV-02不显示ACE2酶活性(图5)。
使用含有荧光素酶和GFP报告基因的病毒颗粒以及使用表达ACE2的293T细胞作为靶标,来表征DF-COV-01和DF-COV-02中和假型化SARS-CoV-2病毒颗粒的能力。荧光素酶表达(图6A)和GFP表达(图6B)两者的结果表明DF-COV-01和DF-COV-02两者都抑制病毒进入表达ACE2的293T细胞,其中DF-COV-01比DF-COV-02更有效地中和。
尽管如上所述,DF-COV-01具有比DF-COV-02更好的体外病毒中和活性,但令人惊讶地,在某些实验中,DF-COV-02比DF-COV-01具有更好的体内针对SARS-CoV-2的活性(图7)。这被认为是由于DF-COV-02的更好的外周组织渗透,如从图8中的药代动力学曲线计算的更大的分布体积所证明的。因此,在一些实验中,利用完整ACE2胞外结构域的大型ACE2-Fc融合,如DF-COV-01,不如具有更好的外周组织渗透性并因此在需要病毒中和的组织中有更好的药物暴露的较小ACE2-Fc融合。此类组织穿透在一些情况下可能是有用的。
在体内进一步表征了DF-COV-01、DF-COV-02、DF-COV-03和DF-COV-04针对SARS-CoV-2病毒的活性。与此相关,图9A比较了口咽病毒滴度,图9B比较了鼻甲病毒滴度,图9C比较了肺滴度,图9D比较了特定天的体重,并且图9E比较了随时间推移的体重。DF-COV-01降低了口咽滴度、鼻甲滴度和肺滴度,并且还可以防止体重减轻,这是仓鼠SARS-CoV-2感染的表现。根据这些实验结果,在一些实施例中,DF-COV-01是优选的构建体。
实例13:另外的构建体、DF-COV-03和DF-COV-04以及其特性
作为另外的构建体,设计并表达了DF-COV-03和DF-COV-04。表7中提供了其序列。作为各种构建体的示例性描述,提供了图10A至图12B,其中图10A描绘了DF-COV-01,图10B描绘了DF-COV-02,图11描绘了DF-COV-03,图12A描绘了全长SARS-CoV-2S蛋白结构与ACE2金属蛋白酶结构域的重叠,所述金属蛋白酶结构域与SARS-CoV-2S蛋白RBD结合,并且图12B描绘了DF-COV-04。
令人惊讶地,结果显示如在DF-COV-04中一样,逆转ACE2和Fc结构域的朝向改善了中和(图13)。再次令人惊讶地,结果显示图13(和图6)中的体外病毒中和的相对效力与其与病毒S蛋白的结合亲合力无关(图14)。DF-COV-01和DF-COV-02对病毒S蛋白具有相同的亲合力,但在体外,DF-COV-01比DF-COV-02更有效地中和病毒。与DF-COV-01相比,DF-COV-03对病毒S蛋白具有更高的结合亲合力,但中和能力较弱。相反,DF-COV-04比DF-COV-02和DF-COV-03更有效地中和,但具有更低的结合亲合力。
实例14:构建体的结合亲和力、稳定性和功能
DF-COV-01、DF-COV-02、DF-COV-03和DF-COV-04与SARS-CoV-2S蛋白的结合亲和力通过生物层干涉法(Octet)确定,其中DF-COV化合物固定,并且SARS-CoV-2S蛋白在溶液中。DF-COV-01和DF-COV-02对SARS-CoV-2S蛋白的亲和力高于DF-COV-03和DF-COV-04。(图15A和图15B)。
基于这些结果,在一些实施例中,DF-COV-01是优选的化合物,至少由于出乎意料的发现,即其(1)对病毒S蛋白的亲合力高于化合物2和3(如图15A和图15B中测量的),(2)在假病毒中和研究中的IC50低于其它化合物,(3)在仓鼠中的血清半衰期比其它化合物长,以及(4)在仓鼠模型中,其比其它化合物更能降低口咽、鼻甲和肺病毒滴度,并且比其它化合物能更有效地防止体重减轻。
另外,将DF-COV-01、DF-COV-02、DF-COV-03和DF-COV-04中的每一个用振动筛网喷雾器喷雾,并且然后收集在微离心管中。将雾化的化合物与固定的SARS-CoV-2S蛋白的结合与雾化前采集的样品的结合进行比较。通过抗人IgG HRP二级抗体检测结合。对于所有四种DF-COV化合物,雾化的样品和非雾化的样品之间的S蛋白结合亲合力没有显著差异。(图16A至图16D)。
基于结果,在一些实施例中,施用途径是IV或通过吸入(雾化)。图16A至图16D证明化合物在雾化时是稳定的(雾化后病毒S蛋白的亲合力没有降低)。还认为,这些化合物在雾化后能够中和假病毒。
图17证明了出乎意料的发现,即DF-COV-01(含有ACE2的肽酶结构域(PD)和集合蛋白样结构域(CLD)的ACE2-Fc融合)具有比DF-COV-02(其它部分相同的ACE2-Fc融合物,其中省略了CLD)更长的半衰期。DF-COV-03含有将ACE2 PD与Fc结构域分离的人工柔性接头,代替CLD,其半衰期也比含有CLD的DF-COV-01短。DF-COV-04,其中ACE2 PD被附加到Fc结构域的C末端,并且由人工柔性接头分离(并且不包含ACE2 CLD)也具有短半衰期。
DF-COV-01是ACE2-Fc融合,其包含ACE2 CLD的近膜(胞外)部分(ACE2的氨基酸616至740)。出乎意料地确定了DF-COV-01的血清半衰期比DF-COV-02(其是其它部分相同的ACE2-Fc融合,其中省略了CLD)长得多。DF-COV-01的血清半衰期也比DF-COV-03(一种ACE2-Fc融合,其中用人工柔性接头代替CLD)和DF-COV-04(一种ACE2-Fc融合,其中ACE2和Fc结构域的朝向相反,并且其中CLD也被省略)长得多(参见下方的工作实例)。另外,在DF-COV-01、-02、-03和-04的头对头比较中,DF-COV-01是唯一的ACE2-Fc融合,通过降低肺病毒滴度和减轻感染导致的体重减轻,证明了其对SARS-CoV-2感染的体内功效。
如上文所指出的,DF-COV化合物的血清半衰期之间的差异是出乎意料的。在不受理论束缚的情况下,据信CLD的存在促进DF-COV-01中两个ACE2结构域的二聚化,并且ACE2结构相互缔合使其与Fc结构域隔开,由此减少其与Fc新生受体(FcRn)结合的空间位阻。FcRn通过与内皮细胞和体内其它细胞中的溶酶体结合并陪伴其远离溶酶体,延长了含有Fc结构域的分子的半衰期,其中胞饮细胞的蛋白质被水解。这种陪伴活性也被认为能够使含有FcRn的化合物有效地跨内皮和上皮细胞层转运。
通过低温电子显微镜获得的全长ACE2的公开结构(例如,PDB结构6M18和6M1D)表明,全长ACE2作为二聚体存在(Yan等人,(2020)《科学》367:1444-1448)。相比之下,仅ACE2肽酶结构域(PD)的先前结构没有检测到二聚化(例如,PDB结构1R42、1R4L和2AJF,每个都缺少CLD,Towler等人,(2004)《生物化学杂志》279:17996-18007)。发现全长ACE2的二聚化由一部分近膜CLD介导,其在研究中称为“颈部”结构域(氨基酸616-726)。在分子种类的子集中,也发现一部分PD介导直接二聚化,但在纯化的ACE2 PD的研究中没有二聚化将表明CLD的存在对于二聚化是必要的。
全长ACE2的这种结构表明,DF-COV-01的两个ACE2结构域(其可以被认为是柔性臂)被认为在某种程度上彼此缔合,并且形成“二聚体”,使得DF-COV-01的两个ACE2结构域彼此缔合可以限制其与DF-COV-01Fc结构域的接近,并且从而限制其的空间位阻。这种空间位阻的缺失被认为促进FcRn结合。
一致的是,DF-COV-02是一种缺乏CLD的在其它部分相同的ACE2-Fc,被发现比DF-COV-01的血清半衰期短得多。由于DF-COV-02的ACE2结构域缺乏CLD,因此预期其不会彼此缔合,并且将自由地与DF-COV-02的Fc结构域弱缔合或占据其附近的空间,这被认为在空间上阻碍FcRn结合。
此外,DF-COV-03的血清半衰期也比DF-COV-01短得多。与DF-COV-02一样,DF-COV-03中省略了CLD。然而,与DF-COV-02不同的是,在ACE2 PD与Fc结构域的铰链结构域之间插入了人工柔性接头。DF-COV-03中还使用了更灵活的IgG1铰链结构域。总之,这导致了长而灵活的氨基酸序列,将ACE2 PD与Fc结构域分离。将PD与Fc结构域分离的长而灵活的序列不足以赋予DF-COV-01(其在此位置含有CLD)表现的更长半衰期,所述事实强调了CLD的序列同一性在控制ACE2-Fc的血清半衰期中的重要性,这被认为是由于含有CLD的ACE2结构域彼此缔合的倾向,限制了其与Fc结构域的接近和空间位阻。尽管DF-COV-03的ACE2结构域被允许相对于Fc结构域灵活定向,但其仍然可以自由地与Fc结构区弱缔合或占据其附近的空间,从而在空间上阻碍FcRn结合。
DF-COV-04,其中ACE2 PD被附加到Fc结构域的C末端,并且由人工柔性接头分离(并且不包含ACE2 CLD)也具有短半衰期。
图18表明,DF-COV-01是限制体重减轻的唯一化合物,这是疾病严重程度的指标,如每日体重趋势所展现的,所述趋势与媒剂对照组不同,并且展现出体重恢复。在Prism v9软件包中,使用了具有Geisser-Greenhouse校正和多重比较测试的混合效应模型。对来自图9中所呈现和以上至少在实例12中所讨论的实验的数据的这种另外的分析进一步证明,DF-COV-01(含有ACE2的CLD的ACE2-Fc融合)是能够改善SARS-CoV-2治疗的仓鼠疾病严重程度的唯一ACE2-Fc融合。DF-COV-02(其它部分相同的ACE2-Fc融合体,其中省略了CLD)不能减轻疾病的严重程度。DF-COV-03(其含有将ACE2肽酶结构域(PD)与Fc结构域分离以代替CLD的人工柔性接头)也不能减轻疾病的严重程度。DF-COV-04(其中ACE2 PD附加到Fc结构域的C末端并通过人工柔性接头分离(并且不包含ACE2 CLD))尽管与DF-COV-01对SARS-CoV-2S-蛋白三聚体具有相同的结合亲和力,但也不能减轻疾病严重程度(参见图15A)。此数据表明,当全身施用时,与其它DF-COV化合物相比,DF-COV-01具有更好的抗病毒活性。如果通过不同途径(例如,通过吸入)或以更高剂量全身施用,其它DF-COV化合物可能表现出抗病毒活性。
图19A和图19B显示了DF-COV-01在SARS-CoV-2感染的治疗模型中治疗仓鼠的能力,其中仓鼠在用1×104PFU SARS-CoV-2攻击十二小时后进行治疗。一半的仓鼠(20)通过腹膜内注射施用单剂量的150mg/kg的DF-COV-01治疗,并且另一半(20)通过腹膜内注射安慰剂(PBS)治疗。记录每天体重。与安慰剂相比,用DF-COV-01治疗导致体重下降的统计学显著降低,表明其改善了疾病的严重程度。使用了具有Geisser-Greenhouse校正和多重比较测试的混合效应模型(Prism v9软件包)。因此,DF-COV-01被证明可以治疗疾病而不是预防感染。DF-COV-01减少了SARS-CoV-2感染导致的体重减轻,表明其改善了疾病的严重程度。
在实验中,DF-COV-01是唯一显示体内针对SARS-CoV-2活性的化合物,在所述实验中,单独的仓鼠组每天接受等效质量剂量的DF-COV-01、DF-COV-02、DF-COV-03或DF-COV-04,持续三天。尽管DF-COV-04与SARS-CoV-2S蛋白具有与DF-COV-01相似的高结合亲和力,并且在中和研究中具有相似但略高的IC50,但其在此模型中没有表现出活性,表明DF-COV-01优于其它DF-COV化合物被认为是由于除其高结合亲和力和中和效力之外的其它因素,可能是由于其较高半衰期的药物暴露,或其它一些因素。
实例15:评估与病毒变体的结合
假病毒是使用复制缺陷型HIV-1主链产生的,所述主链含有突变以阻止HIV包膜糖蛋白表达,以及荧光素酶基因以指导靶细胞中的荧光素酶表达。HEK293-T细胞用两种质粒共转染:一种是假病毒刺突蛋白(来自病毒变体)的表达载体,并且另一种携带Env缺陷的HIV-1基因组。转染后48小时采集含有病毒颗粒的上清液,使用Centricon 70浓缩器浓缩,并且在-80℃下冷冻储存。通过用人ACE2表达载体(pcDNA-hACE2)瞬时转染293T细胞产生靶细胞。ACE2转染的293T细胞在转染后24小时用作靶细胞。在用人ACE2受体瞬时转染的293T细胞上进行假病毒滴定,以确定感染测定中每秒产生50,000计数(cps)所需的病毒体积。将适当体积的假病毒与DF-COV-01、DF-COV-02或不相关的Fc融合的系列稀释液在室温下预温育1小时,然后添加表达人ACE2的293T细胞。24小时后,用新鲜的完整培养基替换含有假病毒的培养基。在另外24小时后,用BrightGlo荧光素酶测定(普洛麦格公司)通过荧光素酶检测对感染进行定量,并且在Victor3读板仪(珀金埃尔默公司)中读取。
对于本文进行和描述的结合实验,使用RED384生物层干涉法系统评估与来自SARS-CoV-02变体的重组S1蛋白的结合。按照制造商推荐的方案,将DF-COV-01、DF-COV-02、DF-COV-03或DF-COV-04固定在抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器(赛多利斯公司(Sartorius))上。使用运行缓冲剂(PBS,0.02%吐温20,2mg/ml BSA)将S1蛋白(义翘神州公司)稀释到1.23nM至100nM,并且转移到96孔板。将DF-COV ACE2-Fc化合物固定的传感器浸入含有稀释的S1蛋白的孔中5分钟以测量缔合,然后浸入运行缓冲剂10分钟以测量解离。来自没有DF-COV化合物浸入S1蛋白或运行缓冲剂的传感器的信号用作参考。使用数据分析HT 12.0版软件进行动力学分析,并且使用1:1结合模式拟合曲线。
已经证明,SARS-CoV-02变体从接种疫苗的患者的单克隆抗体和血清中和中逃逸是由于RBD内的突变导致这些抗体与病毒的受体结合结构域(RBD)的结合减少或丧失(Planas等人,(2021)《自然》doi.org/10.1038/s41586-021-03777-9)。因此,评估与重组S1蛋白的结合,包含RBD突变和单个SARS-CoV-2变体中S蛋白内的其它突变,可以用于确定DF-COV化合物是否结合,并且预期中和该SARS-CoV-2变体。使用此类方法,评估代表性病毒变体的结合,包含使用来自α(B.1.1.7)和β(B.1.351)冠状病毒的重组S1蛋白。类似的结合评估可以应用于多种其它病毒变体,包含但不限于例如以下中的一种:对能够中和其它冠状病毒的单克隆抗体的中和具有抗性;是SARS-CoV-2的变体,所述变体对能够中和SARS-CoV-2的单克隆抗体的中和具有抗性;对冠状病毒疫苗赋予的免疫具有抗性;是SARS-CoV-2的变体,所述变体对SARS-CoV-2疫苗赋予的免疫具有抗性;对先前冠状病毒感染赋予的自然免疫具有抗性;是SARS-CoV-2的变体,所述变体对由先前SARS-CoV-2感染赋予的自然免疫具有抗性;携带S蛋白中的E484取代;携带S蛋白中的N501取代;携带S蛋白中的K417取代;携带S蛋白中的E484和N501取代;携带S蛋白中的E484K取代;携带S蛋白中的E484Q取代;携带S蛋白中的N501Y取代;冠状病毒携带S蛋白中的K417N取代;携带S蛋白中的E484K和N501Y取代;携带S蛋白中的E484、N501和K417取代;携带S蛋白中的E484K、N501Y和K417N取代;携带S蛋白中的L452取代;携带S蛋白中的L452R取代;携带S蛋中的T478取代;携带S蛋白中的T478K取代;携带S蛋白中的L452和T478取代;携带S蛋白中的L452R和T478K取代;源自B.1.1.7谱系,也称为20I/501Y.V1,“英国变体”或α变体;是B.1.1.7谱系,也称为20I/501Y.V1或“英国变体”或α变体;源自B.1.351谱系,也称为20H/501Y.V2,“南非COVID-19变体”或β变体(除了S蛋白受体结合结构域外部的其它取代外,还携带E484K、N501Y和K417N取代);是B.1.351谱系,也称为20H/501Y.V2,“南非COVID-19变体”或β变体(除了S蛋白受体结合结构域外部的其它取代外,还携带E484K、N501Y和K417N取代);源自B.1.1.248谱系,也称为谱系P.1,“巴西COVID-19变体”或γ变体(除了S蛋白受体结合结构域外部的其它取代外,还携带E484K和N501Y取代);是B.1.1.248谱系,也称为谱系P.1,“巴西COVID-19变体”或γ变体(除了S蛋白受体结合结构域外部的其它取代外,还携带E484K和N501Y取代);源自B.1.617谱系;源自B.1.617.1谱系(携带E484Q取代);是B.1.617.1谱系(携带E484Q取代);源自B.1.617.2谱系,也称为δ变体(除了受体结合域内外部的其它S蛋白突变外,还携带L452R和T478K取代);是B.1.617.2谱系,也称为δ变体(除了受体结合域内外部的其它S蛋白突变外,还携带L452R和T478K取代);源自B.1.617.3谱系(携带E484Q取代);和/或是B.1.617.3谱系(携带E484Q取代)。
图20A和图20B显示了DF-COV化合物与SARS-CoV-2变体的结合特性。通过生物层干涉法(BLI)评估了固定的DF-COV-01、DF-COV-02、DF-COV-03和DF-COV-04与来自B.1.1.7(α)、B.1.351(β)和亲本B.1谱系(D614G)的可溶性重组S1蛋白的结合。B.1.351谱系含有E484K取代,在已公开的研究中,已知所述取代可以抑制若干种治疗性单克隆抗体的结合,包含无法在体外中和此变体的巴尼韦单抗(Ly-CoV555)。类似地,已知REGN-COV2混合物中的两种抗体之一REGN10933在已公开的研究中显示出针对B.1.351的中和效力显著降低。B.1.351谱系也已知显示出疫苗抗性。所有四种DF-COV化合物都与B.1.1.7和B.1.351谱系的S1蛋白紧密结合。事实上,对于每种DF-COV化合物,变体S1蛋白的结合亲和力高于亲本B.1S1蛋白。这些结果很重要,因为已知β变体(B.1.351)对若干种单克隆抗体具有抗性,并且对若干种疫苗具有抗性,这是由病毒S蛋白受体结合结构域中E484和K417位置处的氨基酸取代所驱动的(Wang等人,(2021)《自然》593:130-135描述了B.1.351单克隆抗体抗性;Zhou等人,(2021)《细胞》184:2348-2361描述了B.1.351疫苗抗性)。其它表现出对单克隆抗体和来自接种疫苗的患者的血清有抗性的相关变体,如P.1变体,在这些位置处也有氨基酸取代(Wang等人,(2021)《细胞宿主微生物(Cell Host Microbe)》29:747-751)。
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等效形式
本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等效形式。此类等效形式旨在由以下权利要求书涵盖。
Claims (46)
1.一种ACE2-Fc融合多肽,其包括ACE2胞外结构域多肽或其片段、铰链多肽和片段可结晶(Fc)结构域或其片段,其中所述ACE2胞外结构域是酶失活的,并且其中所述Fc结构域或其片段对Fcγ受体的结合亲和力减弱。
2.根据权利要求1所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述ACE2胞外结构域多肽包括与以下中的任一个的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:1-4。
3.根据权利要求1或2所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述ACE2胞外结构域多肽包括在选自由以下组成的组的残基位置处的至少一个氨基酸取代:H374、H378、R273、H345、H345,H505、H505、R169、W271和K481。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的ACE2-Fc融合多肽,其中相对于野生型ACE2多肽,所述ACE2胞外结构域多肽包括至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代:H374N、H378N、R273Q、H345A、H345L、H505A、H505L、R169Q、W271Q和K481Q。
5.根据权利要求3或4所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述至少一个氨基酸取代是相对于野生型ACE2多肽的H374N或H378N取代。
6.根据权利要求3或4所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述至少一个氨基酸取代是相对于野生型ACE2多肽的H374N和H378N取代。
7.根据权利要求3或4所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述至少一个氨基酸取代是R273Q、H345A、H345L、H505A、H505L氨基酸取代。
8.根据权利要求3或4所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述至少一个氨基酸取代是R169Q、W271Q和K481Q氨基酸取代。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述ACE2胞外结构域对冠状病毒有亲和力。
10.根据权利要求9所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述冠状病毒选自由SARS-CoV-1和SARS-CoV-2组成的组。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述Fc结构域包括氨基酸序列,所述氨基酸序列包括相对于野生型Fc结构域的至少一个氨基酸取代,所述氨基酸取代减少或消除所述Fc结构域与Fc受体的结合。
12.根据权利要求11所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述Fc受体是FcγIIa受体。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述Fc结构域包括来自表5的氨基酸序列。
14.根据权利要求11所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述Fc结构域源自IgG4抗体。
15.根据权利要求11所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述Fc结构域包括在选自由L235和P329组成的组的残基位置处的至少一个氨基酸取代。
16.根据权利要求14所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述ACE2-Fc融合多肽包括S228P或L235E氨基酸取代。
17.根据权利要求14所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述ACE2-Fc融合多肽包括S228P和L235E氨基酸取代。
18.根据权利要求14所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述Fc结构域包括以下中的任一个的氨基酸序列:SEQ ID NO:33-36。
19.根据权利要求11所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述Fc结构域源自IgG1抗体。
20.根据权利要求19所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述Fc结构域包括至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代:L234A、L235A、N297A、N297D和P329G。
21.根据权利要求19所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述Fc结构域包括与以下中的任一个具有至少90%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:37-42或SEQ ID NO:55。
22.根据权利要求11所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述Fc结构域源自IgG2抗体。
23.根据权利要求22所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述Fc结构域包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的ACE2-Fc融合多肽,其中铰链区包括来自表2、表3或表4的氨基酸序列。
25.根据权利要求1至23中任一项所述的ACE2-Fc融合多肽,其中所述铰链区由脯氨酸或半胱氨酸-脯氨酸二肽组成。
26.一种ACE2-Fc融合多肽,其包括与以下具有至少90%同一性的氨基酸序列:SEQ IDNO:48、49、56或57。
27.一种编码根据权利要求1至26中任一项所述的ACE2-Fc融合多肽的核酸分子。
28.一种核酸,其包括与以下具有至少90%同一性的核苷酸序列:SEQ ID NO:50、51、58或59。
29.一种载体,其包括根据权利要求27或28所述的核酸分子。
30.根据权利要求29所述的载体,其中所述载体为表达载体。
31.一种细胞,其包括根据权利要求29或30所述的载体。
32.根据权利要求31所述的细胞,其中所述细胞是哺乳动物细胞。
33.一种隔离冠状病毒的方法,所述方法包括使包括冠状病毒的流体与根据权利要求1至26中任一项所述的ACE2-Fc融合多肽接触,其中所述ACE2-Fc融合多肽与所述冠状病毒结合,由此隔离所述冠状病毒。
34.根据权利要求33所述的方法,其中经隔离的冠状病毒不能与全长ACE2多肽结合。
35.一种抑制冠状病毒与由细胞表达的内源性ACE2多肽结合的方法,所述方法包括使与所述细胞连通的流体与根据权利要求1至26中任一项所述的ACE2-Fc融合多肽接触,其中所述ACE2-Fc融合多肽与所述冠状病毒结合,由此抑制所述冠状病毒与内源性表达的ACE2多肽结合。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法,其中所述流体是间质液、血液、血浆、血清、粘液、脑脊液或淋巴。
37.一种用于治疗患有或疑似患有冠状病毒感染的受试者的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物,所述药物组合物包括根据权利要求1至26中任一项所述的ACE2-Fc融合多肽。
38.一种用于预防有感染风险的受试者的冠状病毒感染的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的药物组合物,所述药物组合物包括根据权利要求1至26中任一项所述的ACE2-Fc融合多肽。
39.一种治疗或预防受试者的冠状病毒感染的抗体依赖性增强的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物,所述药物组合物包括根据权利要求1至26中任一项所述的ACE2-Fc融合多肽。
40.根据权利要求33至39中任一项所述的方法,其中所述冠状病毒选自由SARS-CoV-1和SARS-CoV-2组成的组。
41.根据权利要求33至36中任一项所述的方法,其中所述细胞是哺乳动物细胞。
42.根据权利要求41所述的方法,其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
43.根据权利要求37至39中任一项所述的方法,其中所述受试者是哺乳动物。
44.根据权利要求43所述的方法,其中所述受试者是人。
45.根据权利要求37至39中任一项所述的方法,其中所述施用选自由以下组成的组:皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、鞘内、口服、吸入、雾化和经皮。
46.根据权利要求33至39中任一项所述的方法,其中所述
a.冠状病毒对能够中和其它冠状病毒的单克隆抗体的中和具有抗性;
b.冠状病毒是SARS-CoV-2的变体,所述变体对能够中和SARS-CoV-2的单克隆抗体的中和具有抗性;
c.冠状病毒对冠状病毒疫苗赋予的免疫具有抗性;
d.冠状病毒是SARS-CoV-2的变体,所述变体对SARS-CoV-2疫苗赋予的免疫具有抗性;
e.冠状病毒对先前冠状病毒感染赋予的自然免疫具有抗性;
f.冠状病毒是SARS-CoV-2的变体,所述变体对由先前SARS-CoV-2感染赋予的自然免疫具有抗性;
g.冠状病毒携带S蛋白中的E484取代;
h.冠状病毒携带S蛋白中的N501取代;
i.冠状病毒携带S蛋白中的K417取代;
j.冠状病毒携带S蛋白中的E484和N501取代;
k.冠状病毒携带S蛋白中的E484K取代;
l.冠状病毒携带S蛋白中的E484Q取代;
m.冠状病毒携带S蛋白中的N501Y取代;
n.冠状病毒携带S蛋白中的K417N取代;
o.冠状病毒携带S蛋白中的E484K和N501Y取代;
p.冠状病毒携带S蛋白中的E484、N501和K417取代;
q.冠状病毒携带S蛋白中的E484K、N501Y和K417N取代;
r.冠状病毒携带S蛋白中的L452取代;
s.冠状病毒携带S蛋白中的L452R取代;
t.冠状病毒携带S蛋白中的T478取代;
u.冠状病毒携带S蛋白中的T478K取代;
v.冠状病毒携带S蛋白中的L452和T478取代;
w.冠状病毒携带S蛋白中的L452R和T478K取代;
x.冠状病毒源自B.1.1.7谱系,也称为20I/501Y.V1,“英国变体”或α变体;
y.冠状病毒是B.1.1.7谱系,也称为20I/501Y.V1,“英国变体”或α变体;
z.冠状病毒源自B.1.351谱系,也称为20H/501Y.V2,“南非COVID-19变体”或β变体(除了S蛋白受体结合结构域外部的其它取代外,还携带E484K、N501Y和K417N取代);
aa.冠状病毒是B.1.351谱系,也称为20H/501Y.V2,“南非COVID-19变体”或β变体(除了S蛋白受体结合结构域外部的其它取代外,还携带E484K、N501Y和K417N取代);
bb.冠状病毒源自B.1.1.248谱系,也称为“巴西COVID-19变体”,谱系P.1或γ变体(除了S蛋白受体结合结构域外部的其它取代外,还携带E484K和N501Y取代);
cc.冠状病毒是B.1.1.248谱系,也称为“巴西COVID-19变体”,谱系P.1或γ变体(除了S蛋白受体结合结构域外部的其它取代外,还携带E484K和N501Y取代);
dd.冠状病毒源自B.1.617谱系;
ee.冠状病毒源自B.1.617.1谱系(携带E484Q取代);
ff.冠状病毒是B.1.617.1谱系(携带E484Q取代);
gg.冠状病毒源自B.1.617.2谱系,也称为δ变体(除了其它S蛋白突变外,还携带L452R和T478K取代);
hh.冠状病毒是B.1.617.2谱系,也称为δ变体(除了其它S蛋白突变外,还携带L452R和T478K取代);
ii.冠状病毒源自B.1.617.3谱系(携带E484Q取代);和/或
jj.冠状病毒是B.1.617.3谱系(携带E484Q取代)。
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