JP2003535908A - 二重特異性融合タンパク及び標的細胞を殺傷するエフェクター細胞を増強するための使用方法 - Google Patents

二重特異性融合タンパク及び標的細胞を殺傷するエフェクター細胞を増強するための使用方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明はIFN-α融合タンパクをコードする核酸を提供する。明細書には該核酸によりコードされるタンパク、IFN-α融合タンパクの製法及び癌の治療にその化合物を使用する方法も記述されている。一つの特異的IFN-α融合タンパクはエフェクター細胞の障害作用を増強することができるIFN-αまたはその部分及び例えば、B細胞リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）を標的とすることができるRITUXANTMのような抗CD20抗体を含んでいる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、悪性細胞によって発現される細胞表面タンパクを認識する免疫グロ
ブリンパンタクまたはそのポリペプチドフラグメントと結合したインターフェロ
ンアルファ（IFN-α）の全部または生物学的に活性な部分を含む融合タンパクに
関するものである。悪性細胞または標的細胞に結合した融合タンパクは、エフェ
クター細胞（例えば、ナチュラルキラー（NK）細胞、多形核（PMNs）細胞及びマ
クロファージ/単球）上に発現するIFN-α受容体にIFN-αを介して結合する。エ
フェクター細胞上の受容体にIFN-α融合タンパクが結合すると、結合した標的細
胞に対する細胞外（例えば、抗体依存性細胞仲介細胞障害すなわちADCC型）、細
胞内（食作用）及び/または直接障害作用を増強する。
【０００２】 発明の背景 サイトカイン、インターロイキン-2（IL-2）及びIFN-αは、ナチュラルキラー
（NK）細胞及びその他の抗腫瘍エフェクター細胞を強力に活性化するが、これら
のサイトカインを使用した臨床試験における成績は多種の癌において期待に反す
るものであった。IL-2及びIFN-αが無効であった原因は、腫瘍内単球/マクロフ
ァージ（MO）がNK細胞のような細胞傷害性エフェクター細胞のサイトカイン誘導
活性化を腫瘍増殖部位において阻害するからであろう（Hellstrand et al., Act
a Oncol. 37: 347-53(1998)）。しかし、IFN-αはNK細胞及びリンホカイン活性
化キラー（LAK）細胞を調節することができるし、またIL-2と共同してNK活性を
増大することができる（Chikkala et al., Cancer Res. 50: 1176-82 (1990)）
。例えば、全身的に投与したIFN-αはリンパ腫、白血病、カポジ肉腫、腎細胞癌
、黒色腫、多発性黒色腫、グリア芽細胞腫及び卵巣癌においては限られた抗腫瘍
効果しか示さない。Sell et al., IMMUNOLOGY, IMMUNOPATHOLOGY & IMMUNITY 95
1-2 (1996)を参照。しかし、IFN-αとIL-2をそれぞれ単独または併用すると、有
効性を制約して治療に使用することを妨げている高用量における激しい致命的な
毒性を弱めることができる（Meseri-Delwail et al., Biotechnol. Ther. 5: 47
-57(1994); and Sosman et al., Semin. Oncol. 17: 22-30, 38-41 (1990)）。
さらにIFN-αの使用は、部分的には異なる結合親和性により説明される著しく活
性が相違する多種類のIFN-αが存在するので複雑である（Webb et al., Cell Im
munol. 124: 158-7(1989); and U.S. Patent 4,780,530 (1988)）。さらに、NK
細胞及び単球の全身的活性化は、活性化された細胞が腫瘍に到達できないために
、腫瘍部位における活性化よりは有効性に劣る。このことは特に癌を含む固形腫
瘍に当てはまる。
【０００３】 抗体依存性細胞障害（ADCC）は、生体内においてモノクロナール抗体（mAb）
が抗腫瘍効果を示す機序として見られている。ADCCはサイトカインIL-2及びIFN-
αによって増強することができる（Vuist et al., Cancer Immunol, Immunother
. 36: 163-70 (1993)）。
【０００４】 モノクロナール抗体は特別な細胞または抗原を指向するようにデザインされて
きた。したがって、モノクロナール抗体は細胞に対する外来性の抗原を指向する
ベクターまたは搬送担体として働くようにデザインされている。一般的な記述は
EP Patent No. 553,244 (1993)を参照。
【０００５】 抗-CD19抗体。B-細胞系に限定されたシグナル伝達分子であるCD19を認識する
抗体として作られた。モノクロナール抗-CD19抗体の例としては抗-B4（Goulet e
t al., Blood 90: 2364-75 (1997)）、B43及びB43単鎖Fv（FVS191； Li et al.,
Cancer Immunol. Immunother. 47: 121-130 (1998)）がある。Myeres et al. (
Leuk. Lymphoma 29: 329-38 (1998)はネズミモノクロナールB43をチロシンキナ
ーゼ阻害剤、ゲニステイン（U.S. Patent No. 5,872,459も参照）に結合して血
液癌で陽性になるCD19抗原に対するイムノコンジュゲートを作製したことを報告
した。Treon et al., Semin. Oncol 26/5 Supp: 97-106 (1999)は多発性骨髄腫
の患者に有意な活性を持たない保護リシンにB4を結合したことを報告した。
【０００６】 リツキシマブ（Rituximab）及びその他の抗-CD20抗体。FDAは抗-CD20抗体であ
るリツキシマブ（IDEC C2B8; RITUXANO; ATCC No. HB 11388）をヒトの治療に使
用することを承認した。イブリツモマブ、はネズミにおけるリツキシマブの同族
体である（Wiseman et al., Clin. Cancer Res. 5: 3281s-6s (1999)）。その他
に抗ヒトCD20 mAb 1F5(Shan et al., J. Immunol. 162: 6589-95 (1999))、単鎖
Fv抗-CD20マウスmAb 1H4(Haisma et al., Blood 92:184-90 (1998))及び抗-B1抗
体（Liu et al., J. Clin. Oncol. 16: 3270-8(1998)）を含む抗-CD20抗体が報
告されている。1H4の場合には、腫瘍部位においてプロドラッグN-[4-ドキソルビ
シン-N-カルボニル(-オキシメチル)フェニル] O-β-グルクロニルカルバメート
からドキソルビシンへ活性化するためにヒトβ-グルクロニダーゼと融合した1H4
を作製したことが報告されている（Haisma et al., 1998）。
【０００７】 抗-CD22抗体。CD22は正常ヒトB細胞及び一部の新生B細胞上に発現する細胞表
面抗原である。HD6, RFB4, UV22-2, To15, 4KB128, ヒト化抗-CD22抗体（hLL2）
,サポリンに結合した二重特異性F(ab')2抗体を含め、いくつかのモノクロナール
抗-CD22抗体が作製されている（Li et al., Cell. Immunol. 111: 85-99 (1989)
; Mason et al., Blood 69: 836-40 (1987); Behr et al., Clin. Cancer Res.
5:3304s-14s (1999); 及びBonardi et al., Cancer Res. 53:3015-21 (1993)）
。リシンA鎖に結合した抗-CD22を含むイムノトキシンも作製され、マウスにおい
て抗腫瘍効果を有することが報告されている（Sausville et al., Blood 85:345
7-65 (1995); 及びGhetie et al., Cancer Res. 51: 5876-80 (1991)）。
【０００８】 抗-CD33抗体。CD33は初期骨髄先駆細胞及び骨髄性白血病（例えば、急性骨髄
性白血病、AML）細胞上に発現する糖タンパクであり、幹細胞上には発現しない
。IgG1モノクロナール抗体はマウスにおいて（M195）調製されそしてヒト型にも
（HuM195）調製され、抗体依存細胞障害性を持つことが報告されている（Kossma
n et al., Clin. Cancer Res. 5: 2748-55 (1999)）。しかし、Caron et al., C
lin. Cancer Res. 1: 63-70 (1995)は、HuM195がHL60細胞に対して中等度のADCC
能力を有するのみであることを報告した。抗腫瘍性抗生物質カリケアミシンに結
合したヒト化抗-CD33を含む抗-CD33イムノコンジュゲート（CMA-676）は一部のA
ML患者において悪性造血を選択的に消失することを示すと報告されている（Siev
ers et al., Blood 93: 3678-84 (1999)）。Pagliaro et al., Clin. Cancer Re
s. 4: 1971-6 (1998)は、単鎖植物トキシンであるゲロニンに結合した抗-CD33 m
Abを含むHuM195-ゲロニンイムノコンジュゲートを記述している。
【０００９】 抗-CD38抗体。CD38は正常細胞及び骨髄腫細胞を含む白血病骨髄細胞において
分化の初期段階の間に発現する抗原である。Ellis et al., J. Immunol. 155: 9
25-37 (1995)はCD38に対する高親和性mAb（AT13/5）を報告しており、これはCD3
8+細胞系に対して抗体依存細胞障害性（ADCC）を効率よく指令するが、補体の活
性化は乏しいのでCD38発現を下方調節しないと報告している。Flavell et al.,
Hematol. Oncol. 13: 185-200 (1995)は、リボソーム不活化タンパク（rip）を
白血病細胞（HSB-2細胞）に送り込むといわれている抗-CD38/抗サポリン（OKT10
-Sap）イムノトキシンを記述している。抗-CD38抗体、HB7、は修飾リシン分子と
化学的に結合されており、抗原を持つ腫瘍細胞を殺すと考えられている（Goldma
cher et al., 84: 3017-25 (1994)）。
【００１０】 抗-EGF-R抗体。上皮増殖因子受容体（EGF-R）は分裂促進ペプチドであるEGFに
結合する。抗-EGF-R抗体及びその調製方法はU.S. Patent No. 5,844,093; 5,558
,864の記述に従って実施できる。ヨーロッパ特許No. 706,799AはC-X-Cケモカイ
ン、特にIL-8と融合した抗-EGF-R mAbを含むイムノコンジュゲート記述している
。U.S. 5,824,782は、IL-8の少なくとも最初のアミノ酸を欠失したIL-8と融合し
た抗-EGF-R抗体を含むイムノコンジュゲートを記述している。
【００１１】 抗-HM1.24抗体。HM1.24は、多発性骨髄腫（MM）及びワルデンストレームマク
ログロブリン血症において過剰発現するII型膜糖タンパクである（Ohtomo et al
., Biochem. Biophys. Res. Commun. 258: 583-91 (1999); and Goto et al., B
lood 84: 1922-30 (1994)）。マウスモノクロナール抗-HM1.24 IgG2a/κ抗体はM
M細胞上のHM1.24に結合することが示されており、そしてADCCを誘導することが
報告されている（Ono et al., Mol. Immuno. 36: 387-95 (1999)）。ヒト化抗-H
M1.24 IgG１/κ抗体はやはりヒト骨髄腫KPMM2及びARH77に対してADCCを誘発する
ことが示されている（Ono et al., Mol. Immuno. 36: 387-95 (1999)）。
【００１２】 抗-Her-2抗体。（Her-2/neu）として一般的に知られているergB 2遺伝子は膜
貫通受容体をコードするがん遺伝子である。トラスツズマブ（例えば、HERCEPTI
NTM；Fornier et al., Oncology (Huntingt) 13: 647-58 (1999)）, TAB-250 (R
osenblum et al., Clin. Cancer Res. 5: 865-74 (1999)), BACH-250 (同前)、T
AI（Maier et al., Cancer Res. 51: 5361-9 (1991)）、及びU.S. Patent No. 5
,772,997; 5,770,195(mAb 4D5; ATCC CRL 10463); and 5,677,171に記述されて
いるmAbを含めていくつかの抗体がHer-2/neuに対して開発されている。抗-Her-2
抗体の一部は、緑膿菌外毒素の部分と結合したerbB-2に特異的な単鎖抗体ドメイ
ンのようなトキシンと結合している（Skrepnik et al., Clin. Cancer Res. 2:
1851-7 (1996)）。U.S. Patent No. 5,855,866はサイトカインと結合した抗-p18
5Her-2抗体を使用して固形腫瘍の脈管系を処置する方法を報告している。
【００１３】 抗-MUC-1抗体。MUC-1は癌関連ムチンである。抗-MUC-1抗体、Mc5、は移植乳が
んを持つマウスに投与したところ、腫瘍増殖を抑制したと報告されている（Pete
rson et al., Cancer Res. 57: 1103-8 (1997)）。Mc5を切断できない形で天然
のIFN-α（nIFN-α）と化学的に結合し、そしてマウスに注入した腫瘍の増殖を
抑制したと報告されている（Ozzello et al., Breast Cancer Res. Treat. 25:
265-76 (1993)）。IgG4抗-MUC-1 mAb, hCTMO1,は卵巣癌における細胞障害物質を
運ぶ担体として適していることが示唆されている（Van Hof et al., Cancer Res
. 56: 5179-85）。
【００１４】 抗-ホスファチジル-セリン抗原抗体。ホスファチジル-セリンはリン脂質であ
る。ホスファチジル-セリン及びその他のリン脂質に結合する抗体が報告されて
いる（例えば、Yron et al., Clin. Exp. Immol. 97: 187-92 (1994)）。しかし
、抗-リン脂質抗体は癌の治療及び診断に使用されるよりも、典型的に抗-リン脂
質抗体症候群及びその診断に関係しているようである。
【００１５】 抗-TAG-72抗体。TAG-72は腫瘍関連抗原（TAG）である。モノクロナールCC49の
二量体単鎖Fv抗体構造はTAG-72抗原決定基を認識する（Pavlinkova et al., Cli
n. Cancer Res. 5: 2613-9 (1999)）。その他の抗-TAG-72抗体としてはB72.3（D
ivgi et al., Nucl. Med. Biol. 21: 9-15 (1994)）があり、そしてこれらはU.S
. Patent No. 5,976,531に開示されている。組換えIFN-αの投与は腫瘍上に発現
するTAG-72の量を増加すると報告されている（Macey et al., Clin. Cancer Res
. 3: 1547-55 (1997)）。CC49抗体もまたドキシルビシンと（Johnson et al., A
nticancer Res. 15: 1387-93 (1995)及びストレプトアビジン（Ngai et al., Nu
cl. Med. Biol. 22: 77-86 (1995)）と化学的に結合したことが報告されている
。TAG-72は又ヒトインターロイキン-2（IL-2）と化学的に結合されている（LeBe
rthon et al., Cancer Res. 51: 2694-8 (1991)）。U.S. Patent No. 5,976,531
にはインターフェロンと結合したヒト抗-TAG-72抗体を請求しているが、哺乳動
物における有効性を含めてその証拠が示されていない。
【００１６】 インターフェロン-αイムノコンジュゲート。腫瘍細胞系に対するモノクロナ
ール抗体は精製ヒトリンパ芽球IFN-αと共有結合で結合されている。この結合型
IFN-αの投与により末梢血NK細胞による腫瘍細胞及びその他の腫瘍標的に対する
障害作用を増強したと報告されている（Flannery et al., Eur. J. Cancer Clin
. Oncol. 20: 791-8 (1984)）。
【００１７】 異なる資源からの免疫グロブリンの領域を組合わせたキメラ抗体を作製する技
術も開発されている（Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81: 6851-
5 (1984)）。この技術を使用して、免疫グロブリン及び非免疫グロブリン領域を
含むキメラ分子が創り出されている。抗体のDNA配列及び細胞表面抗原をコード
するDNA配列を含む融合タンパクを発現するベクターが提案されており、その適
当な抗原の一部はCD分子（例えば、CD19, CD20, CD22, CD33, CD38及びCD40）を
含んでいる。例えば、U.S. Patent No. 5,637,481 (1997)及びEP Patent No. 6,
610,046 (1994)を参照。サイトカインIL-15及び抗-CD20を含む融合タンパク（In
ternational PCT Application 98/16254）、及びその他のリンホカイン（例えば
、IL-2及びIL-3）及び腫瘍抗原に結合し得る免疫グロブリンフラグメントを含む
融合タンパクが記述されている（U.S. Patent No. 5,645,835 (1997) 及び 5,31
4,995 (1994); Lode et al., Blood 91: 1706-1715 (1998); Hassan et al., Le
uk. Lymphoma 20: 1-15 (1995)）。Chang et al., U.S. Patent 5,723,125は、
サイトカインの血中半減期を増加するために、カルボキシ末端にペプチドを介し
て免疫グロブリンFcフラグメントのアミノ末端に結合しているインターフェロン
、望ましくはIFN-α-2aまたはIFN-α-2bを含むハイブリッド分子を報告している
。サイトカイン（例えば、IL-2、腫瘍壊死因子など）及びウイルス感染及び癌を
治療するための抗体の重鎖を含むキメラ免疫グロブリンは、IFN-γ/M-CSFと共に
International PCT Application 92/08495に記述されている。RM4/IFN-τの融合
タンパクはマウスにおいて抗腫瘍活性を示した（Qi et al., Hum. Antibodies H
ybridomas 7: 21- 6 (1996);及び Xiang et al., Hum. Antibodies Hybridomas
7: 2-10 (1996)）。
【００１８】 その他に、IFN-αが異起源膜接着ドメインと作動的に融合した非抗体免疫調節
分子を含む融合タンパクの作製が提案されている（U.S. Patent No. 5,891,432
(1999)）。IFN-α-2bはME31.3及び抗-がん胎児性抗原（CEA）と結合して、さら
に研究する価値のあるモノクロナール抗体による診断及び治療を改善すると報告
されている（Thakur et al., J. Immunother. 20: 194-201 (1997)）。
【００１９】 したがって、文献に既に報告されているにもかかわらず、癌の治療のために組
成物及びその組成物の使用方法の改良に対するニーズが存在する。ADCC及び食作
用を増強した、低毒性の、そして血清半減期を増大した改良型イムノコンジュゲ
ートは、今でも癌治療で求められている新しい治療手段を提供するであろう。
【００２０】 発明の要約 本発明の一つの目的は、排除すべき標的細胞により発現する抗原に結合する抗
体またはその免疫原性フラグメントを含むイムノコンジュゲートを含む新規そし
て改良組成物を提供することであり、該抗体またはその免疫原性フラグメントは
ヒトエフェクター機能を有し、その抗体またはその免疫原性フラグメントはその
カルボキシ末端においてナチュラルキラー細胞及び/またはマクロファージの表
面に発現した受容体と結合するサイトカインと融合しており、それによって該イ
ムノコンジュゲートが宿主に投与された時に、イムノコンジュゲートが細胞外（
ADCC型）及び細胞内（食作用）の標的細胞殺作用を増強する。望ましくは、サイ
トカインはインターフェロンである。最も望ましいのは、インターフェロンがα
-インターフェロン、特にFDA承認を得ているもの（例えば、IFN-α-2a, IFN-α-
2b, IFN-α-n1）。
【００２１】 本発明のさらに特殊な目的は、標的細胞が発現するCD19, CD20, CD22, CD33,
CD38, EGF-R, HM1.24, ホスファチジルセリン抗原、HER-2, TAG-72及びMUC1と結
合する新規イムノコンジュゲートを提供することである。
【００２２】 本発明のその他の目的は、これらのイムノコンジュゲートの治療有効量を患者
に投与してアポトーシスを増強し、癌を治療する新しい方法を提供することであ
る。これらのイムノコンジュゲートが指向する標的細胞は、乳癌細胞、前立腺癌
細胞、肺癌細胞、白血病T-細胞、白血病B-細胞、多発性骨髄腫細胞及びB-細胞リ
ンパ腫細胞からなる群から選択される悪性細胞を含むことができる。
【００２３】 本発明のその他の目的は、患者における癌を治療するために上記イムノコンジ
ュゲート及び少なくとも一つの化学療法剤または化学療法カクテルを含む併用療
法を提供することである。
【００２４】 本発明のさらに他の目的は、ここに記述したイムノコンジュゲートをコードす
る核酸を提供することである。
【００２５】 発明の詳細な説明 本発明は、IFN-α融合タンパク、特にイムノコンジュゲート、及び悪性細胞を
標的とする能力を有し、そしてエフェクター細胞上の受容体にIFN-αが結合する
ことによりエフェクター細胞の殺細胞活性を増強し、そしてそれに伴うIFN-αの
全身投与とそれに関連した毒性がなく治療剤としてそれらを使用することに関す
るものである。これ等のイムノコンジュゲートは増進したADCCと食細胞活性を有
する。
【００２６】 I. 定義 「インターフェロン-α」または「IFN-α」はIFN-α受容体を認識しそして結
合することができるタンパクまたはそのフラグメントを意味する。これはIFN-α
-2a（ホフマン・ラロッシュのロフェロン）、IFN-α-2b（シェリング社のINTRONTM A）及びIFN-α-n1（Wellferonと呼ばれそしてウエルカム社‐ウエルカム研究
所により製造されたリンパ芽球インターフェロン）のようなFDAの承認を得た型
のIFN-α、並びにその他のIFN-αの型（例えば、IFN-α-2a及び共通IFN）を含ん
でいる。
【００２７】 ここに使用されている用語「融合タンパク」は、合成または異起源のアミノ酸
配列を含む組換えで作製されたハイブリッドタンパクを意味する。融合タンパク
は作動的に結合した異起源遺伝子配列を含むハイブリッド遺伝子から創ることも
できる。
【００２８】 「二重特異性融合タンパク」は、異なる時点または同時に二つの異なる標的を
特異的に認識し、結合する免疫学的反応性分子を意味し、IFNが抗体、望ましく
は抗-腫瘍抗体と抗体のカルボキシ末端において結合したIFN-α融合タンパクの
ことである。望ましい態様において、抗体部分は標的細胞上に発現する標的抗原
を認識し、結合することができる。より望ましい態様において、抗原結合、Fc受
容体結合、Clq及びC'活性化、及びインターフェロン受容体に結合してエフェク
ター細胞を活性化する能力がイムノコンジュゲートの活性を実質的に維持してい
る。このことはインターフェロンが直接的にまたは間接的に抗体ヒンジ、CH1、C
H2またはCH3ドメインカルボキシ末端に結合することにより行われることが望ま
しい。
【００２９】 ここに使用されている用語「エフェクター細胞」及び「エフェクター機能」は
IFN-α受容体を発現し、そしてそれによってIFN-α融合タンパクと結合すること
ができる細胞のことである。エフェクター細胞にはナチュラルキラー（NK）細胞
、LAK細胞、単球、マクロファージ及び多形核（PMN）細胞が含まれる。望ましい
エフェクター細胞はNK細胞及びマクロファージである。
【００３０】 「発現ベクター」は、(1)プロモーター及び望ましい遺伝子またはDNA配列の発
現を指令するその他の配列（例えば、リーダー配列）、及び(2)望ましい遺伝子
またはDNA配列、を含む核酸分子を意味する。さらに、核酸分子は遺伝子転写の
安定性を増強し及び/または遺伝子転写及び発現を増加するためのポリAシグナル
配列を含むことができる。
【００３１】 「結合ドメイン」、「結合領域」は標的の全体又はその部分を認識してそれと
結合する結合部位を意味する。抗体または免疫グロブリンフラグメントの例とし
ては：(1)抗体の一つの可変領域VLまたはVH；(2)複数の可変領域（例えば、VL及
びVH 、VL及びVL；またはVH 及びVH）またはその相補性決定領域（CDR）；(3)Fa
b1，Fab2, SFVのような抗体フラグメント、単鎖抗体、ドメイン欠失抗体及びミ
ニボディー；または(4)エフェクター細胞上のIFN-α受容体に結合するIFN-αま
たはIFN-αの部分、がある。
【００３２】 「ミニボディー」は免疫グロブリンのヒンジ領域及びCH3ドメインに融合した
天然抗体のVL及びVHドメインを含むかまたは全抗体の必須配列を含む単鎖にコー
ドしている抗原結合タンパクを意味する。単鎖は抗原結合領域、二価分子に組込
むことが出来るCH3ドメイン、及びジスルフィド結合により二量化するのに適し
た抗体ヒンジを含む。ミニボディーの調製方法については、例えば、U.S. Paten
t No. 5,837,821を参照。
【００３３】 「抗体」は、IgG（IgG1, IgG2, IgG3, 及びIgG4）、IgM, IgA, IgD, IgE並び
に抗体フラグメントを広くいうことを意図している。最も広い意味における抗体
は、完全なモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、並びに既に述べたように
そのような抗体の生物学的に活性なフラグメントを包含している。特に、CH2ド
メイン欠失抗体のようなドメイン欠失抗体は本発明の範囲に含まれる。
【００３４】 「モノクロナール抗体」は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、わずかに
存在し得る自然発生的な突然変異を除いて集団を構成する個々の抗体が同一であ
る、から得られた抗体を意味する。モノクロナール抗体は高度に特異的であり、
一つの抗原を指向する。さらに、異なる決定基（抗原決定基）を指向する種々の
抗体を含む通常の（ポリクロナール）抗体調製品とは異なり、各モノクロナール
抗体は抗原上の一つの決定基を指向する。その特異性に加えて、モノクロナール
抗体は他の免疫グロブリンの混入を避けて、ハイブリドーマ培養により調製され
るので優れている。修飾語「モノクロナール」は実質的に均一な抗体の集団から
得られる抗体の性質を示し、特別な抗体の調製を必要としないと考えられている
。例えば、本発明に従って使用されるモノクロナール抗体はKohler et al., Nat
ure 256: 495 (1975)により最初に記述されたハイブリドーマ法、または組換えD
NA法（例えば、U.S. Patent No. 4,816,567を参照）により作ることができる。
例えば、「モノクロナール抗体」は、Clackson et al., Nature 352: 624-628 (
1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記述されてい
る技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離することも出来る。
【００３５】 この中のモノクロナール抗体は特に「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含ん
でおり、その中の重鎖及び/または軽鎖は特別な種から由来したかまたは特別な
群または亜群に属する抗体の配列と同一かまたは相同であり、一方鎖の残部は他
種から由来したかまたは他の群または亜群に属する抗体、並びに、望む治療効果
を示す限り、その抗体のフラグメントと同一かまたは相同である（U.S. Pat. No
. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-5 (19
84)）。
【００３６】 非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから
由来する小さな配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその
フラグメント（例えば、Fv，Fab, Fab', F(ab')2または抗体のその他の抗原結合
配列）である。ヒト化抗体は大部分ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）で
あり、その中でレシピエントの相補性決定領域（CDR）の残基が、求める特異性
、親和性及び容量を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト動物種（
ドナー抗体）のCDRの残基と置換されている。一部の例では、ヒト免疫グロブリ
ンのFv骨格領域（FR）残基が対応する非ヒト残基によって置換されている。さら
に、ヒト化抗体はレシピエント抗体にも導入したCDRにもまた骨格配列にも見ら
れない残基を含むことができる。このような修飾は抗体の効果を改良し、最適化
するために行なわれる。一般的に、ヒト化抗体は実質的に全て少なくとも一つの
、そして典型的には二つの可変領域を含み、その中のCDR領域の全てまたは実質
的にすべては非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に相当し、又FR領域の全てまたは
実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列である。ヒト化抗体は少なくとも免疫グ
ロブリン定常領域（Fc）の部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含むこ
とが最も望ましい。さらに詳細は、Jones et al., Nature, 321: 522-5 (1986);
Reichmann et al., Nature, 332: 323-9 (1988); 及び Presta, Curr. Op. Str
uct. Biol., 2: 593-6 (1992)を参照。
【００３７】 「標的抗原」はイムノコンジュゲートの抗体または免疫グロブリンフラグメン
ト部分によって認識される抗原を意味する。望ましい標的抗原としては次のよう
なものがある：5E10，CD1, CD2, CD3, CD5, CD7, CD13, CD14, CD15，CD
19，CD20，CD21，CD23，CD25, CD33, CD34, CD38, CEA, EGFR, HER-2、
HLA-DR, HM1.24, HMB45, Ia，Leu-M1，MUC1, ホスファチジルセリン抗原、P
MSA及びTAG-72.
【００３８】 「核酸」は、1本鎖または2本鎖である、ゲノムまたは合成由来のオリゴヌクレ
オチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド及びそれらのフラグメント及び部分、
及びDNAまたはRNAを含んでいることを意味する。
【００３９】 「インターフェロンα」または「IFN-α」は、望ましくはインターフェロン-
αファミリータンパクの全構成員を含むことを意味する。IFN-αのフラグメント
も、フラグメントがIFN-α受容体を認識して結合し、エフェクター細胞を活性化
する限り、含まれる。IFN-αの望ましい型はIFN-α-2a, IFN-α-2b及びIFN-α-1
nのようなFDAの承認を得ているIFN-αの型である。
【００４０】 「精製した」または「単離した」とは、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列
に関する場合は、同じタイプの他の生物学的高分子は実質的に存在せずに示した
分子が存在することを意味する。ここに使用した用語「精製した」とは、望まし
くは少なくとも75重量%、より望ましくは少なくとも85重量%、さらに望ましくは
95重量%、そして最も望ましいのは98重量%の同じタイプの生物学的高分子が存在
することを意味する。「個別のポリペプチドをコードする単離核酸分子」とは、
主題のポリペプチドをコードしていない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分
子のことをいう；しかし、分子が組成物の基本的性質に悪影響を及ぼさない塩基
または基を含むことは出来る。したがって、例えば、個別のCDRポリペプチドを
コードする単離核酸分子は本質的に主題の分子を認識するユニットからなる。
【００４１】 「治療上有効」とは、該標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を適当な培地で培養し
、標的細胞をイムノコンジュゲートに曝露した後約4、5、6、7、8、9または10日
後に該増殖抑制を測定した時に、イムノコンジュゲートの約0.1から約3.0μg/ml
の濃度において、インビトロにおいて約20%以上の標的細胞の増殖を抑制するイ
ムノコンジュゲートの能力を意味する。
【００４２】 「患者」とは病気、特に癌になりやすい生きている動物またはヒトを意味する
。望ましい態様において、患者はヒト及び非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物である
。非ヒト哺乳動物にはイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット及
びマウスが含まれる。
【００４３】 II. IFN-α融合タンパクの作成方法 目的とする融合タンパクをコードする核酸を発現するための発現ベクターに挿
入することができる。本発明に使用し得る発現ベクターには原核及び真核発現ベ
クターが含まれる。プラスミド、コスミド、及びバクテリオファージ、バキュロ
ウイルス、レトロウイルス及びDNAウイルスベクターのようなウイルスベクター
を含む発現ベクターは、当業者にはよく知られている（例えば、Meth. Enzymol.
, Vol. 185, D.V. Goeddel, ed. (Academic Press, Inc., 1990),及び Kaplitt
and Loewy (Ed.), VIRAL VECTORS: GENE THERAPY AND NEUROSCIENCE APPLICATIO
NS (Academic Press, Inc., 1995), を参照、両者を参考文献として取り入れた
）。発現ベクターはIFN-αタンパクをコードする核酸分子の構成的または誘導的
転写を行なうために必要な配列を含んでいる。IFN-αの一つの形がPitha et al.
, J. Immunol. 141: 3611-6 (1988) に記述されている。本発明の望ましい態様
はFDAにより承認されたIFN-αを使用することである。
【００４４】 IFN-α融合タンパク、免疫グロブリンポリペプチド、または特定のIFN-α種、
またはそれらのフラグメントをコードする組換え核酸分子は当業者に既知の方法
のいずれかにより得ることができる（例えば、Maniatis et al., Molecular Clo
ning: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Ha
rbor, New York, 1982 and 1989) を参照、または、pGL2BIFN (ATCC No. 53371)
及びpALCA1SIFN (ATCC No. 53369)のような公的に入手し得るクローンから得る
ことができる）。あるいは、IFN-αまたは腫瘍関連抗原（TAA）を認識する抗体
をコードする核酸を次のようにして得ることができる。IFN-αまたは特異的な抗
体を活発に発現することが知られている細胞の集団を得ることができ、そしてそ
れから全細胞RNAを採取する。適当なオリゴヌクレオチドプライマーを設計する
ための核酸の部分配列はIFN-αまたは抗体のアミノ酸配列から推定することがで
きる；または、オリゴヌクレオチドプライマーは抗体またはIFN-αをコードする
既知核酸配列から得ることができる。次いで、免疫グロブリン及び/またはIFN-
αをコードする核酸配列に相当するcDNAを作製するために、オリゴヌクレオチド
フラグメントは逆転写酵素と共に使用される（Okayama et al., Methods Enzymo
l. 154: 3-29 (1987)）。cDNAは次いでクローン化することができ、そして/また
は抗体またはIFN-αコード領域の部分はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）及び適当
なプライマーを使用してこのcDNAから増幅することができる（Saiki et al., Sc
ience 239: 487-491 (1988)）。
【００４５】 本発明の望ましい態様において、組換えベクターシステムはIFN-αをコードす
る配列を収容するために創ることができ、その中でIFN-α配列は主要関連抗原を
認識する抗体または免疫原性フラグメントのC末端をコードする配列に結合して
いる。生成した融合タンパクはエフェクター細胞上の受容体に結合してエフェク
ター細胞の障害性を増強するIFN-α分子の能力を保持しているであろう。イムノ
コンジュゲートは抗体分子の抗原結合Fc受容体結合、C1q結合及びC'活性化領域
を保持しているであろう。
【００４６】 本発明のIFN-αに基づく融合タンパクの種々の成分をコードする核酸配列は、
制限酵素法及び合成リンカー配列の使用を含む当業者に既知の技術と共に使用す
ることができる。
【００４７】 本発明の組換え構築の適切な転写を行なうために、適当なプロモーター/エン
ハンサー配列を組換えベクターの中に取り込むことができる。抗体に基づく融合
タンパクの発現を調節するために使用されるプロモーターに含まれるのは、これ
に限定するものではないが、SV40初期プロモーター領域（Bernoist et al., Nat
ure 290: 304-310 (1981)）、Rous肉腫ウイルスの3'の長い末端反復配列に含ま
れるプロモーター（Yamamoto et al., Cell 22: 787-797 (1980)）、ヘルペスチ
ミジンキナーゼ（tk）プロモーター（Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 78: 144-1445 (1981)）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et
al., Nature 296: 39-42 (1982)）; LACまたはβ-ラクタマーゼプロモーターの
ような原核発現系（Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:
3727-3731 (1978)）、またはtacラムダファージプロモーター（DeBoer et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983)）。その他の適当なプロモータ
ーは当業者には明らかであろう。
【００４８】 さらに、組換えベクターの部分として、免疫グロブリンの3'フランキング領域
に対応する、RNA切断/ポリアデニル化部位及び下流配列を含む、核酸を含むこと
は望ましいであろう。さらに、組換えベクターで形質転換した細胞から融合分子
の分泌を促進するように、IFN-α融合タンパクコード配列の上流にある配列を操
作することが望ましい。
【００４９】 IFN-α含有融合タンパクの創製にIFN-α配列における保存的アミノ酸置換、並
びに融合タンパクの抗体または免疫グロブリン領域における置換をコードする配
列を利用することもできる。そのような置換に含まれるのは、他の疎水性アミノ
酸のどれかの代わりにイソロイシン、バリン及びロイシン；グルタミン酸の代わ
りにアスパラギン酸及びその逆；アスパラギンの代わりにグルタミン及びその逆
；及びスレオニンの代わりにセリン及びその逆。その他の置換も、タンパクの3
次元構造における個別のアミノ酸の環境及びその役割によって、保存的と考えら
れる。例えば、グリシンとアラニン並びにアラニンとバリンは構造及び電荷の類
似性のためにはしばしば相互に交換することができる。
【００５０】 IFN-αに基づく融合遺伝子構造構築の導入に成功したことは3つの一般的方法
により確認することができる：（a）DNA-DNAハイブリダイゼーション、（b）「
マーカー」遺伝子機能の存否、及び(c)挿入配列の発現。最初の方法では、発現
ベクターに挿入された外来遺伝子の存在は、挿入された抗体IFN-α融合タンパク
DNAに相同である配列を含むプローブを使用したDNA-DNAハイブリダイゼーション
により検出することができる。第2の方法では、組換えベクター/宿主系はベクタ
ーに外来遺伝子を挿入したことにより生じる「マーカー」遺伝子機能（例えば、
チミジンキナーゼ活性、G418のような抗生物質に対する耐性、導入表現型、バキ
ュロウイルスにおけるオクルージョンボディー形成、など）の存否に基づいて確
認及び選択することができる。例えば、IFN-α融合遺伝子がベクターのマーカー
遺伝子を切断して挿入されているならば、マーカー遺伝子機能が認められないこ
とにより確認することができる。第3の方法では、組換え発現ベクターは組換え
によって発現する外来遺伝子生産物を検定して確認することができる。例えば、
その検定は生物検定におけるIFN-α融合遺伝子生産物の物理的または機能的性質
に基づいている。
【００５１】 サイトカインはエフェクター細胞を活性化するものであればいずれのサイトカ
インまたは同族体またはそれらのフラグメントであってもよい。望ましいサイト
カインは、インターフェロンであり、特にFDAの承認を得た型のIFN-αが望まし
い。サイトカインをコードする遺伝子は新規にクローン化することができ、利用
し得る資源から入手することができ、または上述のように既知ヌクレオチド配列
から標準的DNA合成により合成することができる。
【００５２】 コンジュゲートのための重鎖定常領域は5つのアイソタイプ：アルファ（IgA）
、デルタ（IgD）、イプシロン（IgE）、ガンマ（IgG）またはミュー（IgM）のい
ずれかから選択することができる。重鎖または種々のサブクラス（例えば、IgG
サブクラス1-4）を使用することができる。軽鎖はカッパまたはラムダ定常鎖の
いずれかを持つことができる。これらの免疫グロブリン領域に対するDNA配列は
当業者にはよく知られている（例えば、Gillies et al., J. Immunol. Meth. 12
5: 191 (1989)）。
【００５３】 望ましい態様において、可変領域は標的抗原に特異的抗体から誘導され、そし
て定常領域はCH1、CH2及びCH3ドメインを含んでいる。サイトカインをコードす
る遺伝子は定常領域（例えば、求めるドメイン欠失型によってCH1、CH2またはCH
3エクソン）をコードする遺伝子の3'端の読み枠内に結合するか、または直接ま
たは遺伝子間領域を介して結合している。
【００５４】 核酸構築はキメラ免疫グロブリンの発現を調節するために可変領域をコードす
る遺伝子に対する内在性プロモーター及びエンハンサーを含むことができる。例
えば、可変領域をコードする遺伝子はリーダーペプチド、軽鎖に対するVJ遺伝子
（機能的に再編成した結合（J）部分を有する可変（V）領域）、または重鎖に対
するVDJ遺伝子、及びこれらの遺伝子に対する内在性プロモーター及びエンハン
サーからなるDNAフラグメントとして得られる。そうでなければ、可変領域をコ
ードする遺伝子は内在性調節配列とは別に得ることができ、そしてこれらの配列
を提供する発現ベクターの中に使用することができる。
【００５５】 可変領域遺伝子は目的とする抗体を生産する細胞から標準的DNAクローニング
方法により得ることができる。特異的機能を再編成した可変領域をゲノムライブ
ラリーからスクリーニングするには、J領域DNA配列及び下流配列を含むDNA部分
のような適当なDNAプローブを使用して行なうことができる。正しいクローンの
同定及び確認はクローン化遺伝子のDNA配列分析及び適切にスプライスされた全
長mRNAの対応する配列と比較して行われる。
【００５６】 標的抗原は腫瘍の細胞表面抗原であることが望ましいが、ウイルス抗原または
その他の細胞表面に発現される疾患関連抗原も含まれる。適した可変領域をコー
ドする遺伝子は一般的に免疫グロブリンを生産するリンパ系細胞から得ることが
できる。例えば、腫瘍関連抗原またはウイルス抗原に対する特異的免疫グロブリ
ンを生産するハイブリドーマ細胞系は標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術
により作ることができる（例えば、U.S. Pat. No. 4,96,265を参照）。これらの
免疫グロブリンを生産する細胞系は機能的に再編成された形の可変領域の資源を
提供する。可変領域遺伝子は典型的にはネズミ起源であろう、なぜならネズミの
系は極めて広範囲の望む特異性をもつ免疫グロブリンを生産させ得るからである
。
【００５７】 機能的に再編成した可変領域を含むDNAフラグメントは望む定常領域（または
その部分）をコードする遺伝子を含むDNAフラグメントに結合する。免疫グロブ
リン定常領域（重鎖及び軽鎖）は抗体生産細胞から標準的遺伝子クローニング技
術により得ることができる。ヒト軽鎖の2クラス及びヒト重鎖の5クラスの遺伝子
がクローン化されており、したがってヒト起源の定常領域は公的に利用し得るク
ローンから容易に入手することができる。
【００５８】 ハイブリッド免疫グロブリン重鎖をコードする融合遺伝子はレシピエント細胞
導入するために発現ベクターの中に組込むまたは挿入される。プラスミドベクタ
ーの中に遺伝子構築を導入するのは標準的遺伝子スプライシング方法により行な
うことができる。
【００５９】 レシピエント細胞は一般的にリンパ系細胞である。望ましいレシピエント細胞
は骨髄腫（またはハイブリドーマ）である。骨髄腫細胞は導入遺伝子によりコー
ドされた免疫グロブリンを合成し、組み立て、そして分泌し、そして翻訳後にタ
ンパクを修飾する。特に望ましいレシピエント細胞はSp2/0骨髄腫であり、これ
は通常内在性免疫グロブリンを生産しない。形質転換されると、細胞は導入され
た遺伝子構築によりコードされた免疫グロブリンのみを生産するであろう。形質
転換骨髄腫細胞は培地中かまたはマウスの腹腔内で増殖し、分泌したイムノコン
ジュゲートは腹水から回収することができる。Bリンパ球のようなその他のリン
パ系細胞もレシピエント細胞として使用することができる。
【００６０】 キメラIg鎖をコードする核酸構築を含むベクターでリンパ系細胞を形質転換す
る方法はいくつかある。リンパ系細胞にベクターを導入する望ましい方法はスフ
ェロブラスト融合によるものであり、Gillies et al., Biotechnol. 7: 798-804
(1989)により記述されている。その他の方法としては電気穿孔またはリン酸カ
ルシウム沈殿法などがある。Maniatis, et al. (1989)中の方法も参照。
【００６１】 宿主細胞によって生産されたIFN-αに基づく融合タンパクは、これに限定しな
いが、標的抗原または融合タンパクのいずれかの部分に対して特異的な抗体を使
用するアフィニティークロマトグラフィー、を含め当業者に既知の技術のいずれ
かを使用して取出すことができる。融合したIFN-αまたは抗体（例えば、抗-CD2
0）の活性は、リンホカインまたは細胞性因子の活性を検出または測定する生物
学的検定を使用して確認することができる。例えば、限定するものでないが、IF
N-α活性の存在は受容体結合、ウイルス中和及びエフェクター細胞の傷害性増強
の検定によって確認することができる。
【００６２】 増強したエフェクター細胞機能を検出する望ましい方法は受容体結合検定及び
ウイルス中和検定を利用することである。これらの検定について以下に一般的に
記述する。
【００６３】 受容体結合検定 後に示すような受容体結合検定はイムノコンジュゲートが標的抗原またはIFN-
α受容体と結合するか否かを測定するために使用される。
【００６４】 ウイルス中和検定 ウイルス中和検定は受容体結合検定の1形態であり、抗体が細胞表面に発現し
たウイルス抗原を標的とする場合に、ウイルス感染細胞を中和するイムノコンジ
ュゲート有効性を測定することを利用したものである。例えば、p24検定を使用
するHIV-1中和に関しては、ウイルス中和はHo et al., J. Virol 65: 489-93 (1
991)により記述されている方法を使用して測定される。中和は培養上清に放出さ
れた標的抗原量またはイムノコンジュゲートで処理していない対照ウエルと比較
してイムノコンジュゲートで処理したウエルの細胞中に検出される抗原量の減少
%として示される。
【００６５】 ADCC検定 ADCCを誘導する融合タンパクの能力はクロミウム放出検定を使用して評価する
ことができる。一般的に、IgG2a及びIgG3サブクラス及びしばしばIgG1サブクラ
スの抗体はADCCを仲介する。IgG2a、IgG3及びIgMサブクラスの抗体は血清補体に
結合しそして活性化する。ここに記述したイムノコンジュゲートのADCCを仲介す
る能力を評価するために、51Cr放出検定を使用することができる。簡単に説明す
ると、エフェクター細胞による破壊の標的である抗原を発現する細胞系を100μC
iの51Crで標識し、その約1時間後にU底マイクロタイタープレート中でエフェク
ター細胞と抗体を反応させる。約5時間37℃でインキュベーション後、上清を採
取し、放射活性を測定する。細胞傷害性は次式により計算することができる：%
細胞分解=[((実験CPM)−(標的漏出CPM)) / ((界面活性剤分解CPM)−(標的漏出CP
M))] X 100%。特異的分解は次式を使用して計算する：特異的分解=（抗体存在
下分解％）−（抗体非存在下分解％）。
【００６６】 補体結合検定 補体に結合するイムノコンジュゲートの能力を評価するために、次のような検
定を使用することができる。イムノコンジュゲートにより認識される標的抗原を
発現する細胞を10μg/ml濃度のイムノコンジュゲートとインキュベートする。細
胞及びイムノコンジュゲートを含むプレートを室温で15分間インキュベートした
後、プレートを3回洗う。3回洗った後、細胞を1/10希釈の補体（例えば、ICNか
ら得たモルモット補体）の50μlに懸濁し、種々の時間37℃でインキュベートす
る。次いで、50μlの0.25％（w/v）トリパンブルーを加えて、細胞数及び細胞の
プラズマ統合性を評価する。
【００６７】 食作用検定 個々のイムノコンジュゲートの食作用増強を評価するために、次のような検定
を使用することができる。標的抗原を発現する細胞を親油性赤色蛍光色素PKH26
で標識する。エフェクター細胞を含むヘパリン加全血から精製したバフィーコー
ト細胞を、イムノコンジュゲートの非存在下及び存在下に、37℃約6時間標識タ
ーゲットとインキュベートする。次いでエフェクター細胞を０℃でエフェクター
細胞に結合するFITC（フルオレッセインイソチオシアネート）標識抗体で染色す
る。細胞を洗い、そしてFACScanによる二色蛍光を使用するかまたはその他のス
キャン方法により分析する。食作用％は、細胞と結合したPFH26を有するエフェ
クター細胞（NK細胞、単球、好中球またはマクロファージ）のパーセントとして
示される。
【００６８】 III. INF-α融合タンパクの投与方法 本発明の融合タンパクは、インビボで薬物投与に適した生物学的に適合する形
で患者に投与される。「インビボで薬物投与に適した生物学的に適合する形」と
はタンパクの治療効果が副作用を凌駕するように投与されるイムノコンジュゲー
トの形のことを意味する。イムノコンジュゲートはいずれの薬理学的形態におい
ても、さらに薬学的に許容し得る担体と共に投与することができる。イムノコン
ジュゲートの治療有効量の投与は、有効量、投与量及び求める結果（例えば、治
療中の疾患の進行または増殖を抑制）を達成するために必要な期間として定義さ
れる。例えば、イムノコンジュゲートの治療有効量は病期（例えば、ステージI
とステージIV）、年齢、性、合併症、体重、そして求める応答を引き出すイムノ
コンジュゲートの能力のような因子により変化し得る。投与方法は最適の治療効
果を提供するために調節されるであろう。例えば、分割した量を毎日投与するこ
とができるし、あるいは治療状況の必要性の応じて投与量を減らすこともできる
。
【００６９】 活性化合物、イムノコンジュゲート、はそれ自体または化学療法抗癌薬のよう
な他の活性薬物と併用して投与することができる。イムノコンジュゲートは、単
独または他の薬物と併用して、注射（皮下、筋肉内、静脈内、など）、吸入、経
皮投与または直腸投与のような通常の方法により投与することができる。投与経
路によっては、化合物を不活化する酵素、酸及びその他の天然に存在する条件か
ら活性化合物を保護するための物質でコートすることもできる。望ましい投与経
路は静脈内（I.V.）注射である。
【００７０】 非経口投与以外によるイムノコンジュゲートの投与には、不活化を防ぐための
物質によるIFN-α融合タンパクのコート、またはそれとIFN-α融合タンパクの併
用が必要であろう。例えば、IFN-α融合タンパクを適当な担体または希釈剤に入
れて酵素阻害剤と共に投与するかまたはリポソームのような適当な担体またはベ
クターに入れて投与することができる。医薬として受容し得る希釈剤としては生
理食塩液及び緩衝液がある。リポソームは水‐油‐水乳液、並びに通常のリポソ
ーム（Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7: 27 (1984)）を含む。その他の医
薬として受容し得る担体及び賦形剤はREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (1
8 th ed. 1990)に記述されているように当業者には既知である。
【００７１】 活性化合物は非経口的にまたは腹腔内にも投与することもできる。活性化合物
のグリセロール、液状ポリエチレンクリコール、及びそれらの混合物及び油中の
分散体を調製することもできる。通常の保存及び使用の条件下では、これらの製
剤は1以上の保存剤を含み、微生物の増殖を防ぐことができる。
【００７２】 注射用に適した医薬組成物には滅菌水溶液（水溶性であれば）または即時調製
滅菌注射液または分散体用の分散体及び滅菌粉末が含まれる。全ての場合に、組
成物は滅菌されており、シリンジに容易に出し入れできる流動性がなければなら
ない。製造及び貯蔵の条件において安定でなければならず、また細菌及び菌類の
ような微生物の混入から保護されていなければならない。担体は、例えば、水、
エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレンフリコール、及び
液状ポリエチレングリコール、など）及びそれらの適当な混合物を含む溶媒また
は分散媒体がある。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの
使用により、分散の場合には必要な粒子サイズの維持により、そして表面活性剤
の使用により保持される。微生物の影響の防止は、例えば、パラベン類、クロロ
ブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどのような種々の抗
細菌剤及び抗菌剤により行なうことができる。多くの場合に、等張剤、例えば、
砂糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、または塩化ナトリ
ウム、を組成物の中に含むことが望ましい。注射用組成物の持続的吸収は、例え
ば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅延させる薬物
を組成物の中に含有させることによりもたらすことができる。
【００７３】 滅菌注射用溶液は、活性化合物（例えば、IFN-α融合タンパク）の必要量を必
要に応じて上に列挙した添加物の一つまたは組合せの適当な溶液に溶かし、次い
で滅菌濾過することにより調製することができる。一般的に、分散剤は、分散基
剤及び上に列挙した中の必要な添加物を含む滅菌担体に取り込むことにより調製
される。滅菌注射液調製用の滅菌粉末の場合は、望ましい調製法は真空乾燥及び
凍結乾燥法であり、これにより予め滅菌濾過した追加の必要な添加物を加えた活
性成分の粉末を得る。
【００７４】 上述のように、活性化合物が適切に保護されている場合には、タンパクを、例
えば、不活性希釈剤または適切な食用担体と共に、経口投与することができる。
ここに使用した「医薬として受容し得る担体」には、全ての溶媒、分散媒体、コ
ーティング、抗細菌及び抗菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、などが含まれる。医薬
活性物質にそのような媒体及び薬剤を使用することは当業者にはよく知られてい
る。活性物質に適合しない通常の媒体または薬剤以外は、治療用組成物への使用
が考慮されている。IFN-α融合タンパクを使用するための上記組成物はすべてそ
の組成物の中に追加の活性化合物を含有することもできる。
【００７５】 投与を容易にしそして投与量を一定にするための単位投与量の形態に非経口投
与組成物を製剤化することは特に有用である。ここに使用した「単位投与量形態
」とは、哺乳類患者を治療するための単回投与量として適した物理的に分離した
単位のことである；各単位は求める治療効果を生じるように計算された活性化合
物の予め定めた量を必要な医薬担体と共に含む。本発明の単位用量形態の詳細は
下記により決められる：(A)活性化合物の特性及び達成すべき個別の治療効果；
及び（B）個別の感受性を処理するためには活性化合物を作製する技術に内在す
る限界。
【００７６】 IV. 癌治療の方法 個々に記述したイムノコンジュゲートは、細胞の表面に腫瘍関連抗原（TAA）
を発現する種々の悪性細胞を標的とすることができる。B及びT細胞白血病及びリ
ンパ腫、多発性骨髄腫、及び固形腫瘍（例えば、前立腺癌、直腸癌、肺癌、乳癌
、及び卵巣癌）を認識する抗体を含むIFN-α融合タンパクを作製することができ
る。望ましい態様において、IFN-α融合タンパクの免疫グロブリン部分はB細胞
マーカー（例えば、CD19, CD20、CD22）、多発性骨髄腫抗原（例えば、CD38，H
M1.24）、白血病マーカー（例えば、CD33）及びホスファチジル-セリン抗原を認
識することができる。悪性腫瘍に関連し、そして融合タンパクの免疫グロブリン
部分が関係するその他のマーカーは、これに限定するものではないが、下記が含
まれる： David A. Scheinberg et al., "The Leukemias" in HARRISON'S PRINCIPLES OF
INTERNAL MEDICINE 1764-1774 (Kurt J. Isselbacher et al., eds., 13th ed.
1994).
【００７７】 V. 融合タンパクと併用して使用する薬物 上述のイムノコンジュゲートは、放射線療法、免疫療法、化学療法、及び外科
手術と併用して使用することができる。個別の患者に適用する併用治療は、癌の
タイプ、病期、家族歴、年齢、性、体重、患者の状態によって変わるであろう。
望ましくは、イムノコンジュゲートはもう一つの化学療法剤と併用して投与され
る。望ましくは、化学療法剤または化学療法カクテル及び下記表に示したものを
含めて、ここに記述したインターフェロンイムノコンジュゲートと併用して投与
する： これらの化学療法剤及び薬物カクテル（例えば、複数の化学療法剤）は、CANSER
: PRINCIPLES ＆ PRACTICE OF ONCOLOGY (Vincent T. DeVita, Jr. et al. eds.
, 5th ed. 1997)の記述又は当業者に既知の方法に従って投与することができる
。
【００７８】 化学療法剤カクテルの略称及び化学療法頭字語は以下のとおり： AC ドキソルビシン、シクロホスファミド ABDIC ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダカルバジン、ロムス チン、プレドニゾン AVBD ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ダカ ルバジン Ara-C シタラビン AVD ドキソルビシン、ビンブラスチン、ダカルバジン CAF シクロホスファミド、ドキソルビシン、5-フルオロウラ シル CAMP ロムスチン、マイトキサントロン、シタラビン、プレド ニソン CAP シクロホスファミド、ドキソルビシン、プレドニゾン CAP-BOP シクロホスファミド、ドキソルビシン、プロカルバジン、 ブレオマイシン、ビンクリスチン、プレドニゾン CAVP ロムスチン、メルファラン、エトポシド、プレドニゾン CEVD ロムスチン、エトポシド、ビンデシン、デキサメタゾン CDDP+VP-16 シスプラチン、エトポシド、マイトマイシンＣ＋ビンブ ラスチン CEF シクロホスファミド、エピルビシン、5-フルオロウラ シル CEM ロムスチン、エトポシド、メトトレキサート CEP ロムスチン、エトポシド、プレドニムスチン CEPP(B) シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレ ドニゾン、ブレオマイシン CEVD ロムスチン、エトポシド、ビンデシン、デキサメタゾン ChlVPP クロランブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン、プレ ドニゾン CHOP シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、 プレドニゾン CHOP-B CHOP+ブレオマイシン CMF シクロホスファミド、メトトレキサート、5-フルオロウラ シル CMP シクロホスファミド、メルファラン、プレドニゾン CMVP シクロホスファミド、メトトレキサート、5-フルオロウラ シル、ビンクリスチン、プレドニゾン CVP シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン DHAP デキサメタゾン、高用量Ara-C、シスプラチン ESHAP エトポシド、メチルプレドニゾロン、高用量シタラビン、シ スプラチン EPOCH エトポシド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、シクロホス ファミド、プレドニゾン EVA エトポシド、ビンブラスチン、ドキソルビシン EVAP エトポシド、ビンブラスチン、シタラビン、シスプラチン IFN-α インターフェロンα IMVP-16 イフォスファミド、メトトレキサート、エトポシド MACOP-B メトテレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、 ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシン、ロイコボリン m-BACOD メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロ ホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾン、ロイコボリン MIME メチル-gag、イフォスファミド、メトトレキサート、エトポ シド MINE マイトクアゾン、イフォスファミド、ビノレルビン、エトポ シド MOPLACE シクロホスファミド、エトポシド、プレドニゾン、メトト レキサート、シタラビン、ビンクリスチン MOPP ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、プロカルバ ジン、プレドニゾン MOPP+ABV MOPP+ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン MOPP+ABVD MOPP及びABVDを月毎交互に MVPP ナイトロジェンマスタード、ビンブラスチン、プロカルバ ジン、プレドニゾン MTX-CHOP メトトレキサート＋CHOP PCVP ビンブラスチン、プロカルバジン、シクロホスファミド、プ レドニソン ProMACE-CytaBOM プレドニゾン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、 エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリ スチン、メトトレキサート、ロイコボリン ProMACE-MOPP プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、 シクロホスファミド、エトポシド、ロイコボリン＋標 準的MOPP Tam タモキシフェン VABCD ビンブラスチン、ドキソルビシン、ダカルバジン、ロムス チン、ブレオマイシン VAT ビンブラスチン、ドキソルビシン、チオテパ VATH ビンブラスチン、ドキソルビシン、チオテパ、フルオキシ メステロン
【００７９】 例 以下に示す例は本発明の特別な態様を説明するのに役立つのみであり、本発明
を限定する意味はない。
【００８０】 例1 IFN-α及びリツキシマブを含むイムノコンジュゲート IFN-α（例えば、IFN-α-2a, IFN-α-2bまたは IFN-α-n1）をコードする核酸
を、翻訳された時にIFN-αが融合タンパクのカルボキシ末端を形成するように、
リツキシマブをコードする核酸と作動的に結合する。抗原結合Fc受容体結合、Cl
q結合及び補体（C'）活性化、並びにNK細胞及びマクロファージに結合するIFN-
αの能力は薬剤が有する特性である。リツキシマブをコードする核酸に加えて、
抗CD20抗体をコードする他の核酸をIFN-αをコードする核酸に作動的に結合する
ことができる。その他の抗CD20抗体にはイブリツモマブ、IF5、B1、及び1H4が含
まれる。
【００８１】 例2 イムノコンジュゲートのインビトロ試験 Her2/neu（例えば、ヒト乳癌細胞、SKBR-3）を発現する細胞系（標的抗原を発
現する細胞）をここに記述したイムノコンジュゲートを使用した細胞障害を測定
するために選択する。エフェクター細胞試料はヘパリン加全血を使用して得るか
、または他の機関から入手する。エフェクター細胞として使用するために、単球
を2％ヒト血清を含むマクロファージ除去培地（Gibco/BRL）を入れたテフロン（
登録商標）容器中で24から48時間培養する。標的細胞を100μCiの51Crで標識し
、1時間後にエフェクター細胞及びイムノコンジュゲートとU底マイクロタイター
プレート中でインキュベートする。37℃で16から18時間インキュベション後、各
ウエルの上清を採取し、放射活性を分析する。細胞傷害性及び特異的分解を前記
のように算出する。
【００８２】 例3 イムノコンジュゲートのインビボ試験 イムノコンジュゲートの抗腫瘍活性を評価するために、マウスモデルを使用す
ることができる。固形腫瘍の場合には、培地中の約1x107細胞をBALB/c, nu/nuま
たはSCIDマウスの側腹前部皮下に注射する。約14日後、または腫瘍が0.8から1.2
cm径に増殖した時、マウスを5-10匹ずつの群に分けそして1μgから10mgの濃度で
イムノコンジュゲートの200μlを静脈内注射する。腫瘍の直交径を定期的に測定
することにより腫瘍容積を計算することができる。あるいは、動物を安楽死させ
て、腫瘍の切片を作製し、対照動物（無処置）と比較してイムノコンジュゲート
による腫瘍増殖に対する影響を測定することができる。
【００８３】 本発明を上記例を参考に詳細に記述したが、本発明の精神から離れることなく
種々の修飾を加えることが可能であることは明らかである。本申請に引用した特
許及び出版物はその全体を参考文献として取り入れた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 排除すべき標的細胞により発現される抗原に結合する抗体ま
    たはその免疫原性フラグメントを含む、イムノコンジュゲートであって、該抗体
    またはその免疫原性フラグメントがヒトエフェクター機能を有し、その抗体また
    はその免疫原性フラグメントがそのカルボキシ末端においてナチュラルキラー細
    胞及び/またはマクロファージの表面に発現する受容体と結合するサイトカイン
    と融合し、それにより、該イムノコンジュゲートが宿主に投与された時に、標的
    細胞に対する細胞外（ADCCタイプ）及び/または細胞内（食作用）殺傷作用を増
    強するイムノコンジュゲート。
  2. 【請求項２】 サイトカインがインターフェロンである請求項１に記載のイ
    ムノコンジュゲート。
  3. 【請求項３】 インターフェロンがアルファインターフェロン（IFN-α）で
    ある請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
  4. 【請求項４】 インターフェロンがIFN-α及びIFN-α-2a, IFN-α-2bまたは
    IFN-α-2n1である請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
  5. 【請求項５】 標的細胞が、乳癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細
    胞、白血病T細胞、白血病B細胞、多発性骨髄腫細胞及びB細胞リンパ腫細胞から
    なる群から選択されている請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
  6. 【請求項６】 抗原がCD19, CD20, CD22, CD33, CD38, EGF-R, HM1.24, ホ
    スファチジル-セリン抗原、HER-2, TAG-72及びMUC-1からなる群から選択されて
    いる請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
  7. 【請求項７】 抗原CD20を認識する抗体がリツキサン（RITUXAN），IF5，B1
    またはIH4である請求項６に記載のイムノコンジュゲート。
  8. 【請求項８】 CD19を認識する抗体がB4，B43またはFVS191である請求項６
    に記載のイムノコンジュゲート。
  9. 【請求項９】 CD22を認識する抗体がhLL2, LL2またはRFB4である請求項６
    に記載のイムノコンジュゲート。
  10. 【請求項１０】 CD33を認識する抗体がM195またはHuM195である請求項６に
    記載のイムノコンジュゲート。
  11. 【請求項１１】 CD38を認識する抗体がAT13/5である請求項６に記載のイム
    ノコンジュゲート。
  12. 【請求項１２】 HER-2を認識する抗体がHERCEPTIN（登録商標）または4D5
    である請求項６に記載のイムノコンジュゲート。
  13. 【請求項１３】 TAG-72を認識する抗体がHuCC49，HuCC39ΔCH2またはB72.3
    である請求項６に記載のイムノコンジュゲート。
  14. 【請求項１４】 MUC-1を認識する抗体が12C10，IG5，H23，BM-2(2E11)，BM
    -7，12H12，MAM-6またはHMFG-1である請求項６に記載のイムノコンジュゲート。
  15. 【請求項１５】 免疫原性フラグメントがドメイン欠失抗体、Fab，Fab1，F
    ab2，SFV，単鎖抗体、ドメイン欠失抗体及びミニボディーからなるリストから選
    択されている請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
  16. 【請求項１６】 請求項１に記載のイムノコンジュゲートの治療有効量を患
    者に投与することにより標的細胞のアポトーシスを増強する方法。
  17. 【請求項１７】 標的細胞が乳癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細
    胞、白血病T細胞、白血病B細胞、多発性骨髄腫細胞及びB細胞リンパ腫細胞から
    なる群から選択された悪性細胞である請求項16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１に記載のイムノコンジュゲートをコードする核酸
    。
  19. 【請求項１９】 排除すべき標的細胞により発現される抗原に結合する抗体
    またはその免疫原性フラグメントを含むイムノコンジュゲートをコードする核酸
    であって、該抗体またはその免疫原性フラグメントがヒトエフェクター機能を有
    し、その抗体またはその免疫原性フラグメントがそのカルボキシ末端においてナ
    チュラルキラー細胞及び/またはマクロファージの表面に発現する受容体と結合
    するサイトカインまたはサイトカインに融合するペプチドと融合し、それにより
    、該イムノコンジュゲートが宿主に投与された時に、標的細胞に対する細胞外（
    ADCCタイプ）及び/または細胞内（食作用）殺傷作用を増強するイムノコンジュ
    ゲートをコードする核酸。
  20. 【請求項２０】 請求項１のイムノコンジュゲート及び少なくとも一つの化
    学療法剤または化学療法カクテルを含む悪性腫瘍患者を治療する併用療法。
  21. 【請求項２１】 化学療法剤が ara-C、ドキソルビシン、イダルビシン、
    マイトキサントロン、クロランブシル、メルファラン、6-メルカプトプリン、6-
    チオグアニン、ジブロモマンニトール、IFN-α、2-クロロデオキシアデノシン、
    デオキシコフォルマイシン、ダカルバジン、シスプラチン、カルムスチン、ロム
    スチン、タウロムスチン、フォテムスチン、カルボプラチン、ビンクリスチン、
    ビンブラスチン、ビンデシン、タキソール、ヂブロモズルシトール、デトルビシ
    ン、ピリトレキシン、エストラムスチン、パクリタキセル、ネバルビンまたはプ
    レニゾロンからなるリストから選択されている請求項19に記載の併用療法。
  22. 【請求項２２】 化学療法カクテルがAC, ABDIC, ABVD, Ara-C, AVD, CAF,
    CAMP, CAP, CAP-BOP, CAVP, CEVD, CDDP+VP-16, CEF, CEM, CEP, CEPP(B), CEVD
    , ChlVPP, CHOP, CHOP-B, CMF, CMP, CMVP, CVP, DHAP, ESHAP, EPOCH, EVA, EV
    AP, IFN-α, IMVP-16, MACOP-B, m-BACOD, MIME, MINE, MOPLACE, MOPP, MOPP+A
    BV, MOPP+ABVD, MVPP, MTX-CHOP, PCVP, ProMACE-CytaBOM, ProMACE-MOPP, VABC
    D, VATまたはVATHからなるリストから選択されている請求項19に記載の併用療法
    。
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