JP2021514625A - 抗ｍｕｃ１抗体およびｉｌ−１５を含む融合タンパク質構築物 - Google Patents

抗ｍｕｃ１抗体およびｉｌ−１５を含む融合タンパク質構築物 Download PDF

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Abstract

本発明は、がん抗原ＭＵＣ１およびＩＬ−１５に対する抗体を含む融合タンパク質構築物に関する。特に、融合タンパク質構築物は、ＮＫ細胞およびＴ細胞をがん部位において活性化するである。したがって、第１の態様では、本発明は、（ｉ）ＭＵＣ１に特異的に結合する抗体モジュールと、（ｉｉ）ＩＬ−１５モジュールとを含む融合タンパク質構築物に関する。第２の態様では、本発明は、本発明による融合タンパク質構築物をコードする核酸を提供する。

Description

本発明は、抗体の分野に関する。がん抗原に対する抗体とサイトカインの融合タンパク質が提供される。特に、融合タンパク質は、がん部位において、ＩＬ−１５部分を介してがん抗原ＭＵＣ１に結合することによってＴ細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化するものである。融合タンパク質構築物の設計により、提供される特定の状況において別個の利点、特に、強力な抗原結合および高度な免疫細胞活性化を伴う、高度に特異的な腫瘍部位の標的化が示される。特定の実施形態では、本発明は、これらの融合タンパク質構築物の治療および診断への使用に関する。
サイトカインは、免疫応答をモジュレートするので、抗がん処置のための有望な薬物である。サイトカインは、免疫系の細胞が互いと情報伝達して標的抗原に対して調和された応答を生じさせることを可能にする分子メッセンジャーである。直接細胞間相互作用を通じて多くの形態の免疫系の情報伝達が生じるが、サイトカインの分泌により、多面的かつ効率的な様式での免疫シグナル伝達の迅速な伝播が可能になる。
サイトカインは、腫瘍部位において免疫エフェクター細胞および間質細胞を直接刺激し、細胞傷害エフェクター細胞による腫瘍細胞の認識を増強する。多数の動物腫瘍モデル試験により、サイトカインが広範な抗腫瘍活性を有することが実証されており、これは、がん治療のためのサイトカインに基づくいくつもの手法に変換されている。近年、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１を含めたいくつものサイトカインが進行がんを有する患者に対する臨床試験に入っている。抗腫瘍免疫の促進におけるＩＬ−１０およびＴＧＦ−βなどの抑制性サイトカインの中和を支持する前臨床的研究が進行中である。
特に、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）は、がん治療に関して魅力的なサイトカインである。ＩＬ−１５は、エフェクター免疫応答を刺激するサイトカインである。ＩＬ−１５により、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の発生、活性化および増殖が誘導される。ＩＬ−１５およびそのＩＬ−１５受容体α鎖は、単球、マクロファージおよび樹状細胞上に発現され、エフェクター免疫細胞上のＩＬ−２受容体β−共通γ鎖（ＩＬ２Ｒβγｃ）複合体に結合する。ＩＬ−１５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、一般的な腫瘍標的化抗体と組み合わせて使用した場合に、高レベルの抗腫瘍細胞傷害を誘導する。それにもかかわらず、サイトカインの投与は、多くの場合、サイトカインの有効なモジュレーターとしての使用を妨げる用量制限毒性によって妨害される。
これを考慮して、ＩＬ−１５などのサイトカインの腫瘍部位への有効な標的化が当技術分野において必要とされている。安全かつ有効な免疫サイトカインによる治療の必要条件として、高度に特異的な腫瘍標的化が必要である。
本発明者らは、インターロイキン１５を、抗ＭＵＣ１抗体と組み合わせることによって腫瘍部位に有効かつ特異的に標的化することができることを見いだした。ＴＡ−ＭＵＣ１は、新規の、腫瘍マーカーＭＵＣ１上の炭水化物／タンパク質混合エピトープであり、これは、正常な細胞には事実上存在しない。ＴＡ−ＭＵＣ１は、起源が異なる上皮がんの中で広範な分布を示し、また、転移およびがん幹細胞にも存在し、これにより、ＴＡ−ＭＵＣ１の広範な治療的潜在性が補強される。抗がん抗原ＭＵＣ１およびＩＬ２Ｒβγｃの同時結合により、腫瘍部位において直接ＮＫ細胞およびＴ細胞を活性化および増殖させることが可能になる。本発明者らはここで、ＭＵＣ１に特異的な抗体とＩＬ−１５とを含む融合タンパク質により、がん細胞が有効に標的化され、前記がん細胞に対するＮＫ細胞およびＴ細胞応答が誘導されることを証明することができる。
したがって、第１の態様では、本発明は、
（ｉ）ＭＵＣ１に特異的に結合する抗体モジュールと、
（ｉｉ）ＩＬ−１５モジュールと
を含む融合タンパク質構築物に関する。
第２の態様では、本発明は、本発明による融合タンパク質構築物をコードする核酸を提供する。さらに、第３の態様では、本発明による核酸および前記核酸と作用的に接続したプロモーターを含む発現カセットまたはベクターが提供され、第４の態様では、本発明による核酸または発現カセットもしくはベクターを含む宿主細胞が提供される。
第５の態様では、本発明は、本発明による融合タンパク質構築物を含む医薬組成物に関する。
第６の態様によると、本発明は、医療、特に、がんまたは感染症の処置において使用するための、本発明による融合タンパク質構築物または医薬組成物を提供する。
以下の説明および添付の特許請求の範囲から、本発明の他の目的、特徴、利点および態様が当業者には明らかになる。しかし、以下の説明、添付の特許請求の範囲、および適用の好ましい実施形態を示す特定の実施例は単に例示として示されていることが理解されるべきである。以下を読むことにより、開示されている発明の主旨および範囲内の種々の変化および改変が当業者には容易に明らかになる。
定義
本明細書で使用される場合、以下の表現は、一般に、それらが使用されている文脈からそうでないことが示される場合を除き、好ましくは下記の意味を有するものとする。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という表現は、本明細書で使用される場合、その文字通りの意味に加えて、「から本質的になる」および「からなる」という表現も含み、具体的に指す。したがって、「含む」という表現は、具体的に列挙された要素を「含む」主題がさらなる要素を含まない実施形態、ならびに具体的に列挙された要素を「含む」主題がさらなる要素を包含し得るおよび／または実際に包含する実施形態を指す。同様に、「有する（ｈａｖｅ）」という表現は、「含む」という表現として理解されるべきであり、「から本質的になる」および「からなる」という表現も含み、具体的に指す。「から本質的になる」という用語は、可能であれば、特に、主題が、主題が本質的にそれからなる具体的に列挙された要素に加えて、２０％もしくはそれ未満、特に、１５％もしくはそれ未満、１０％もしくはそれ未満、または特に、５％もしくはそれ未満のさらなる要素を含む実施形態を指す。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド、または２つもしくはそれよりも多くのポリペプチドの組合せ、または１つもしくは複数のポリペプチドと１つもしくは複数の他の分子もしくはイオンとを含む複合体を指す。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸ならびに人工的なアミノ酸のいずれを含有するものであってもよく、生物学的起源のものであっても合成起源のものであってもよい。タンパク質のポリペプチド（複数可）は、天然に修飾（翻訳後修飾）されたものであってもよく、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化、ヒドロキシル化および／またはリン酸化によって合成的に修飾されたものであってもよい。ポリペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含むが、いかなる特定の長さである必要はない；この用語は、いかなるサイズ制限も含まない。ポリペプチドは、少なくとも５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１００アミノ酸、最も好ましくは少なくとも１５０アミノ酸を含むことが好ましい。
「融合タンパク質構築物」という用語は、異なる天然に存在するタンパク質に由来する２つまたはそれよりも多くのポリペプチドを人工的に組み合わせて１つのタンパク質を形成する場合のタンパク質を指す。異なるポリペプチドを、特に、前記異なるポリペプチドを含む１つのポリペプチド鎖が形成されるように互いと融合することができる。
「タンパク質」および「タンパク質構築物」という用語は、本明細書で使用される場合、ある特定の実施形態では、それぞれ同じ種類のタンパク質またはタンパク質構築物の集団を指す。特に、集団の全てのタンパク質またはタンパク質構築物は、そのタンパク質またはタンパク質構築物を定義するために使用される特徴を示す。ある特定の実施形態では、集団内の全てのタンパク質またはタンパク質構築物が同じアミノ酸配列を有する。
「抗体」という用語は、特に、ジスルフィド結合によって接続された少なくとも２つの重鎖と２つの軽鎖を含むタンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。重鎖定常領域は、３つ、またはＩｇＭ型もしくはＩｇＥ型の抗体の場合では４つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含み、第１の定常ドメインＣＨ１は可変領域に隣接しており、第２の定常ドメインＣＨ２とヒンジ領域によって接続し得る。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメインのみからなる。可変領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができ、各可変領域は３つのＣＤＲと４つのＦＲを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。重鎖定常領域は、γ型重鎖、δ型重鎖、α型重鎖、μ型重鎖またはε型重鎖などの任意の型の重鎖であってよい。抗体の重鎖はγ鎖であることが好ましい。さらに、軽鎖定常領域も、κ型軽鎖またはλ型軽鎖などの任意の型の軽鎖であってよい。抗体の軽鎖はκ鎖であることが好ましい。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、種々の免疫系の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含めた、宿主組織または因子への結合を媒介し得る。抗体は、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体またはキメラ抗体であり得る。
抗体の抗原結合部分とは、通常、全長抗体、または抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つもしくは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。抗体の結合断片の例としては、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片；ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結した、それぞれが同じ抗原に結合する２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一の腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ならびに、ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片が挙げられる。
抗体の「Ｆａｂ部分」は、特に、重鎖可変領域および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）ならびに重鎖定常領域および軽鎖定常領域の第１のドメイン（ＣＨ１およびＣＬ）を含む抗体の一部分を指す。抗体がこれらの領域の全てを含まない場合には、「Ｆａｂ部分」という用語は、領域ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１およびＣＬのうち抗体内に存在するものだけを指す。「Ｆａｂ部分」は、抗体の抗原結合活性を含有する、天然の抗体をパパインで消化することによって得られる断片に対応する抗体のその部分を指すことが好ましい。特に、抗体のＦａｂ部分は、抗原結合部位またはその抗原結合能を包含する。Ｆａｂ部分は、少なくとも抗体のＶＨ領域を含むことが好ましい。
抗体の「Ｆｃ部分」は、特に、重鎖定常領域２、３および適用可能な場合には４（ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含む抗体の一部分を指す。特にＦｃ部分は、これらの領域のそれぞれを２つ含む。抗体がこれらの領域の全てを含まない場合には、「Ｆｃ部分」という用語は、領域ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４の抗体内に存在するものだけを指す。Ｆｃ部分は、少なくとも抗体のＣＨ２領域を含むことが好ましい。「Ｆｃ部分」は、抗体の抗原結合活性を含有しない、天然の抗体をパパインで消化することによって得られる断片に対応する抗体のその部分を指すことが好ましい。特に、抗体のＦｃ部分は、Ｆｃ受容体に結合することができ、したがって、例えば、Ｆｃ受容体結合部位またはＦｃ受容体結合能を含む。
「抗体」および「抗体構築物」という用語は、本明細書で使用される場合、ある特定の実施形態では、それぞれ同じ種類の抗体または抗体構築物の集団を指す。特に、集団の全ての抗体または抗体構築物が、その抗体または抗体構築物を定義するために使用される特徴を示す。ある特定の実施形態では、集団内の全ての抗体または抗体構築物が同じアミノ酸配列を有する。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、前記抗体の断片および誘導体も含む。抗体の「断片または誘導体」とは、特に、前記抗体に由来し、その抗体と同じ抗原、特に同じエピトープに結合することができるタンパク質または糖タンパク質である。したがって、抗体の断片または誘導体は、本明細書では、一般に、機能性断片または誘導体を指す。特に好ましい実施形態では、抗体の断片または誘導体は、重鎖可変領域を含む。抗体の抗原結合機能は全長抗体またはその誘導体の断片によって果たされ得ることが示されている。抗体の断片の例としては、（ｉ）各重鎖および軽鎖の可変領域および第１の定常ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ）２断片；（ｉｉｉ）重鎖の可変領域および第１の定常ドメインＣＨ１からなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一の腕の重鎖および軽鎖可変領域からなるＦｖ断片；（ｖ）単一のポリペプチド鎖からなるＦｖ断片であるｓｃＦｖ断片；（ｖｉ）共有結合により連結した２つのＦｖ断片からなる（Ｆｖ）２断片；（ｖｉｉ）重鎖可変ドメイン；ならびに（ｖｉｉｉ）重鎖可変領域と軽鎖可変領域の結合が分子間でのみ生じ得、分子内では生じないように共有結合により連結した重鎖可変領域と軽鎖可変領域からなるマルチボディ（ｍｕｌｔｉｂｏｄｙ）が挙げられる。抗体の誘導体は、特に、それが由来する親抗体と同じ抗原に結合するが、親抗体とは異なるアミノ酸配列を有する抗体を含む。これらの抗体断片および誘導体は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られる。
標的アミノ酸配列がその全長にわたり、参照アミノ酸配列の対応する部分と、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性または同一性を共有する場合、標的アミノ酸配列は、参照アミノ酸配列に「由来する」または「対応する」。「対応する部分」は、例えば、標的抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域１（ＦＲＨ１）が、参照抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域１に対応することを意味する。特定の実施形態では、参照アミノ酸配列に「由来する」または「対応する」標的アミノ酸配列は、その全長にわたり、参照アミノ酸配列の対応する部分と１００％相同である、または、特に１００％同一である。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「相同性」または「同一性」は、本発明に従って、参照配列の全長にわたって、または、相同性もしくは同一性が規定される配列に対応する参照配列の対応する部分の全長にわたって決定することが好ましい。特定のＣＤＲ配列または特定の可変領域配列などの１つまたは複数のアミノ酸配列によって定義される、親抗体に由来する抗体は、特に、親抗体のそれぞれのアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％相同または同一である、特に同一である、ＣＤＲ配列または可変領域配列などのアミノ酸配列を有する抗体である。ある特定の実施形態では、親抗体に由来する抗体（すなわち、その誘導体）は、親抗体と同じＣＤＲ配列を含むが、可変領域の残りの配列が異なる。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、多価および多重特異性抗体、すなわち、それぞれが同じエピトープに結合する２つよりも多くの結合部位を有する抗体構築物、ならびに、第１のエピトープに結合する１つまたは複数の結合部位および第２のエピトープに結合する１つまたは複数の結合部位を有し、必要に応じてさらなるエピトープに結合するさらなる結合部位をも有する抗体構築物も指す。
「特異的結合」は、抗体などの作用物質が、それに対して特異的であるエピトープなどの標的に、別の標的への結合と比較してより強力に結合することを意味することが好ましい。作用物質が、第１の標的に、第２の標的に対する解離定数よりも低い解離定数（Ｋｄ）で結合する場合、作用物質は、第１の標的に、第２の標的と比較してより強力に結合する。作用物質が特異的に結合する標的に対する解離定数は、作用物質が特異的に結合しない標的に対する解離定数の１００分の１よりも低い、２００分の１よりも低い、５００分の１よりも低いまたは１０００分の１よりも低いことが好ましい。さらに、「特異的結合」という用語は、特に、親和定数Ｋａが少なくとも１０６Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０７Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１である、結合パートナー間の結合親和性を示す。ある特定の抗原に特異的な抗体は、特に、前記抗原に、少なくとも１０６Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０７Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１のＫａの親和性で結合することができる抗体を指す。例えば、「抗ＭＵＣ１抗体」という用語は、特に、ＭＵＣ１に特異的に結合し、好ましくはＭＵＣ１に少なくとも１０６Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０７Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１のＫａの親和性で結合することができる抗体を指す。
「抗体モジュール」は、本明細書で言及される場合、抗体に由来し、抗原に特異的に結合することができるポリペプチド構築物を指す。特に、抗体モジュールは、少なくとも１つ、特に２つの抗体重鎖、および必要に応じて少なくとも１つ、特に２つの抗体軽鎖を含む。
「抗原結合断片」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体に由来し、抗原に特異的に結合することができるが、天然の抗体の全ての要素は含まないポリペプチド構築物を指す。特に、抗原結合断片は、抗体の定常ドメインの一部または全部を含まず、また、抗原結合部位を２つではなく１つしか含まない場合がある。
「抗原結合部位」は、特に、少なくとも１つの抗体可変領域、例えば、抗体重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む。抗原結合部位の抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域は、抗原足場、特にＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインを使用して互いに配置することができ、かつ／または、ペプチドリンカーを介して互いと融合することができる。ある特定の実施形態では、抗原結合部位は、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）である。
「ＩＬ−１５」は、サイトカインであるインターロイキン１５、特に、ヒトインターロイキン１５を指す。ＩＬ−１５は、Ｎ末端シグナルペプチドと共に発現される４α−ヘリックスバンドルタンパク質である。成熟ＩＬ−１５では、シグナルペプチドが切断され、タンパク質がグリコシル化され、質量は約１４〜１５ｋＤａである。ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５受容体α鎖、特にそのｓｕｓｈｉドメイン、およびＩＬ−２受容体β鎖と共通インターロイキン受容体γ鎖（共通γ鎖）の複合体に結合する。
「ＭＵＣ１」という用語は、ムチン−１、多型上皮ムチン（ＰＥＭ）またはがん抗原１５−３としても公知のタンパク質であるＭＵＣ１、特にヒトＭＵＣ１を指す。ＭＵＣ１は、ムチンファミリーのメンバーであり、膜結合グリコシル化リン酸化タンパク質をコードする。ＭＵＣ１のコアタンパク質の質量は１２０〜２２５ｋＤａであり、これは、グリコシル化で２５０〜５００ｋＤａまで増加する。ＭＵＣ１は細胞の表面を越えて２００〜５００ｎｍ伸長する。当該タンパク質は、多くの上皮細胞の頂端表面に膜貫通ドメインによって係留される。細胞外ドメインは、２０アミノ酸の可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）ドメインを含み、リピートの数は異なる個体において２０から１２０まで様々である。これらのリピートは、セリン残基、トレオニン残基およびプロリン残基に富み、これにより重度のＯ−グリコシル化が可能になる。ある特定の実施形態では、「ＭＵＣ１」という用語は、腫瘍関連ＭＵＣ１（「ＴＡ−ＭＵＣ１」）を指す。ＴＡ−ＭＵＣ１は、がん細胞に存在するＭＵＣ１である。このＭＵＣ１は、非がん細胞に存在するＭＵＣ１とは、そのはるかに高い発現レベル、その局在化およびそのグリコシル化によって異なる。特に、ＴＡ−ＭＵＣ１は、がん細胞の細胞表面全体にわたって無極性に存在するが、非がん細胞では、ＭＵＣ１は厳密に頂端発現を有し、したがって、全身投与された抗体は接近できない。さらに、ＴＡ−ＭＵＣ１は異常なＯ−グリコシル化を有し、これにより、ＭＵＣ１タンパク質骨格上に新しいペプチドエピトープおよびトムゼン・フリーデンライヒ抗原アルファ（ＴＦα）などの新しい炭水化物腫瘍抗原が露出する。
「ＴＦα」は、トムゼン・フリーデンライヒ抗原アルファまたはコア−１とも称され、癌細胞においてタンパク質のヒドロキシアミノ酸セリンまたはトレオニンにアルファ−アノマー立体配置でＯ−グリコシド連結した二糖Ｇａｌ−β１，３−ＧａｌＮＡｃを指す。
「グリカンの相対量」は、本発明によると、それぞれ抗体調製物の抗体または抗体を含む組成物中の抗体に結合したグリカンの特定のパーセンテージまたはパーセンテージ範囲を指す。特に、グリカンの相対量は、抗体に含まれ、したがって抗体調製物中のまたは抗体を含む組成物中の抗体のポリペプチド鎖に結合した全てのグリカンの特定のパーセンテージまたはパーセンテージ範囲を指す。１００％のグリカンは、それぞれ抗体調製物の抗体または抗体を含む組成物中の抗体に結合した全てのグリカンを指す。例えば、１０％のフコースを有するグリカンの相対量は、抗体を含む組成物であって、抗体に含まれ、したがって前記組成物中の抗体ポリペプチド鎖に結合した全てのグリカンのうち１０％はフコース残基を含むが、抗体に含まれ、したがって前記組成物中の抗体ポリペプチド鎖に結合した全てのグリカンのうち９０％はフコース残基を含まない、組成物を指す。１００％を表す対応するグリカンの参照量は、組成物中の抗体に結合した全てのグリカン構造、または全てのＮ−グリカン、すなわち、組成物中の抗体のアスパラギン残基に結合した全てのグリカン構造、または全ての複合体型グリカンのいずれかであり得る。グリカン構造の参照群は、一般に、当業者により明確に示されるまたはその環境から直接導き出せる。
「Ｎ−グリコシル化」という用語は、タンパク質のポリペプチド鎖のアスパラギン残基に結合した全てのグリカンを指す。これらのアスパラギン残基は、一般に、アミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（配列中、Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸であってよい）を有するＮ−グリコシル化部位の一部である。同様に、「Ｎ−グリカン」は、ポリペプチド鎖のアスパラギン残基に結合したグリカンである。「グリカン」、「グリカン構造」、「炭水化物」、「炭水化物鎖」および「炭水化物構造」という用語は、一般に、本明細書では同義に使用される。Ｎ−グリカンは、一般に、２つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基および３つのマンノース残基からなる共通のコア構造を有し、構造Ｍａｎα１，６−（Ｍａｎα１，３−）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎを有し、Ａｓｎはポリペプチド鎖のアスパラギン残基である。Ｎ−グリカンは、３つの異なる型、すなわち、複合体型グリカン、ハイブリッド型グリカンおよび高マンノース型グリカンに細分される。
本明細書において示される数、特に、特異的なグリコシル化特性の相対量は、おおよその数と理解されることが好ましい。特に、数は、最大１０％高いおよび／または低い、特に、最大９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％高いおよび／または低いことが好ましい場合がある。
「核酸」という用語は、一本鎖および二本鎖の核酸およびリボ核酸ならびにデオキシリボ核酸を含む。核酸は、天然に存在するヌクレオチドならびに合成ヌクレオチドを含んでよく、また、例えば、メチル化、５’および／または３’キャップ形成によって天然にまたは合成的に修飾されていてよい。
「発現カセット」という用語は、特に、その中に導入されるコード核酸配列の発現を可能にし、制御することができる核酸構築物を指す。発現カセットは、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサーおよび遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳を制御する他の調節エレメントを含み得る。発現カセットの正確な構造は、種または細胞型に応じて変動し得るが、一般に、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写配列ならびに５’非翻訳配列および３’非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャップ形成配列、ＣＡＡＴ配列などを含む。より詳細には、５’非転写発現調節配列は、作用的に接続した核酸の転写調節のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。発現カセットはまた、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列も含み得る。
本発明によると、「プロモーター」という用語は、発現される核酸配列の（５’）側上流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼの認識および結合部位を提供することによって当該配列の発現を調節する核酸配列を指す。「プロモーター」は、遺伝子の転写の制御に関与するさらなる因子のためのさらなる認識および結合部位を含み得る。プロモーターは、原核生物または真核生物の遺伝子の転写を調節し得る。さらに、プロモーターは、「誘導性」、すなわち、誘導性作用物質に応答して転写を開始するものであり得る、または、転写が誘導性作用物質によって調節されない場合には「構成的」であり得る。誘導性プロモーターの調節下にある遺伝子は、誘導性作用物質が存在しなければ、発現されないまたは小さな程度にしか発現されない。誘導性作用物質の存在下では、遺伝子のスイッチがオンになるまたは転写のレベルが上昇する。これは、一般に、特定の転写因子の結合によって媒介される。
「ベクター」という用語は、本明細書では、その最も一般的な意味で使用され、核酸を、例えば、原核細胞および／または真核細胞に導入し、適切な場合には、ゲノム内に組み込むことを可能にする、前記核酸に対する任意の中間ビヒクルを含む。この種類のベクターは、細胞において複製および／または発現されることが好ましい。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスゲノムを含む。「プラスミド」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、染色体外遺伝子材料の構築物、通常、染色体ＤＮＡとは独立して複製可能な環状ＤＮＡ二重鎖に関する。
本発明によると、「宿主細胞」という用語は、外因性核酸を用いて形質転換またはトランスフェクトすることができる任意の細胞に関する。「宿主細胞」という用語は、本発明によると、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、特に、ヒト細胞、酵母細胞および昆虫細胞）を含む。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、または霊長類に由来する細胞などの哺乳動物細胞が特に好まれる。細胞は、多様な組織型に由来し得、初代細胞および細胞株を含む。核酸は、宿主細胞中に、単一コピーの形態または２つもしくはそれよりも多くのコピーの形態で存在し得、一実施形態では、宿主細胞において発現される。
「患者」という用語は、本発明によると、人間、非ヒト霊長類または別の動物、特に、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコもしくはマウスおよびラットなどの齧歯類などの哺乳動物を意味する。特に好ましい実施形態では、患者は、人間である。
「がん」という用語は、本発明によると、特に、白血病、セミノーマ、黒色腫、癌、奇形腫、リンパ腫、肉腫、中皮腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、子宮体がん、腎がん、副腎がん、甲状腺がん、血液がん、皮膚がん、脳がん、子宮頸がん、腸がん、肝がん、結腸がん、胃がん、腸管がん、頭頸部がん、胃腸がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、膵がん、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がんおよび肺がんならびにその転移を含む。がんという用語は、本発明によると、がん転移も含む。
「腫瘍」とは、制御されない細胞増殖によって形成される細胞または組織の群を意味する。腫瘍は、構造的な組織化および正常な組織との機能的な協調の部分的なまたは完全な欠如を示し、通常、別個の組織塊を形成し、これは、良性または悪性であり得る。
「転移」とは、がん細胞が元の部位から体の別の部分に拡散することを意味する。転移の形成は、非常に複雑なプロセスであり、通常、原発腫瘍からのがん細胞の脱離、体内循環への侵入および体内の他の場所の正常組織内で定着して成長することを伴う。腫瘍細胞が転移すると、新しい腫瘍は二次腫瘍または転移性腫瘍と称され、その細胞は、通常、元の腫瘍における細胞と似ている。これは、例えば、乳がんが肺に転移した場合、二次腫瘍は異常な肺細胞ではなく異常な乳房細胞で構成されることを意味する。そして、肺の腫瘍は肺がんではなく転移性乳がんと称される。
「医薬組成物」という用語は、特に、ヒトまたは動物への投与に適した組成物、すなわち、薬学的に許容される構成成分を含有する組成物を指す。医薬組成物は、活性化合物またはその塩もしくはプロドラッグを緩衝剤、保存剤および張度調整剤などの担体、希釈剤または医薬賦形剤と共に含むことが好ましい。
本明細書に記載の数値範囲は、範囲を規定する数を含めたものである。本明細書で提示される表題は、本明細書全体を参照することにより読み取ることができる本発明の種々の態様または実施形態を限定するものではない。一実施形態によると、方法の場合ではある特定のステップを含む、または組成物の場合ではある特定の成分を含むと本明細書に記載される主題は、主題がそれぞれのステップまたは成分からなることを指す。本明細書に記載の好ましい態様および実施形態を選択し、組み合わせることが好ましく、好ましい実施形態のそれぞれの組合せから生じる特定の主題も本開示に属する。
発明の詳細な説明
本発明は、ＩＬ−１５またはそのバリアントとＭＵＣ１を標的とする抗がん抗体とが融合した融合タンパク質構築物の開発に基づく。確立された抗ＭＵＣ１抗体は、腫瘍関連ＭＵＣ１に結合し、細胞傷害免疫細胞を動員し活性化することによってその抗がん活性を発揮する。免疫細胞、特にナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の結合および活性化は、抗体Ｆｃ部分と免疫細胞上のＦｃγ受容体、特にＦｃγＲＩＩＩａの相互作用によって実現される。活性化されると、抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）が開始される。これを考慮して、本発明者らは、確立された抗ＭＵＣ１抗体の有効性を、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５とＩＬ−１５受容体α鎖のｓｕｓｈｉドメインの組合せをこれらの抗体に結合させることによってさらに改善した。ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞およびＴ細胞の発生、活性化および増殖を誘導するサイトカインである。
本発明者らは、抗ＭＵＣ１抗体ＰａｎｋｏＭａｂとＩＬ−１５の融合構築物により、免疫細胞が有効に活性化および動員され、腫瘍細胞の溶解が誘導されることを実証することができた。天然のグリコシル化を有し、Ｆｃ受容体と相互作用することができるか、またはグリコシル化部位の欠失によって不活化される活性または不活性な抗体のＦｃ部分を使用することにより、活性の微調整を実現することができる。さらに、ＩＬ−１５の活性も、ネイティブなＩＬ−１５またはその受容体に対する結合親和性が低下した変異バージョンを使用することによって、ならびにＩＬ−１５受容体αサブユニットのｓｕｓｈｉドメインと組み合わせることによって、調節することができる。一般に、ｓｕｓｈｉドメインを伴わないネイティブなＩＬ−１５と融合した機能性Ｆｃ部分を有する抗ＭＵＣ１抗体により、標的結合親和性、頑強な機能性および安全性と、高い抗腫瘍活性、低いオフターゲット活性および長い循環半減期を伴う好都合な薬物動態学的挙動との最良のバランスがもたらされた。
さらに、本発明者らは、ＩＬ−１５を抗ＭＵＣ１抗体と異なる位置で、例えば、重鎖Ｃ末端、軽鎖Ｃ末端および軽鎖Ｎ末端で融合することができ、これらの全てにより機能性融合構築物がもたらされることを示した。驚いたことに、ＩＬ−１５を抗体重鎖のＣ末端と融合した場合に、最良の活性ならびに薬物動態および薬力学的パラメーターが得られた。
このことを考慮して、本発明は、
（ｉ）ＭＵＣ１に特異的に結合する抗体モジュールと、
（ｉｉ）ＩＬ−１５モジュールと
を含む融合タンパク質構築物を提供する。
抗ＭＵＣ１抗体モジュール
ＭＵＣ１に特異的に結合する抗体モジュール（抗ＭＵＣ１抗体モジュール）は、ＭＵＣ１のエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位を含む。ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、ＭＵＣ１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を少なくとも２つ、特に、正確に２つ含む。これらの抗原結合部位は、異なっても同一であってもよいが、特に、同じアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、抗体モジュールの抗原結合部位は、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む。
ある特定の実施形態では、抗ＭＵＣ１抗体モジュールは、少なくとも１つの抗体重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、２つの抗体重鎖を含む。抗体重鎖は、特に、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。ある特定の他の実施形態では、抗体重鎖は、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むが、ＣＨ１ドメインは含まない。さらなる実施形態では、重鎖の１つまたは複数の定常ドメインを他のドメイン、特に、例えばアルブミンなどの同様のドメインで置き換えることができる。抗体重鎖は、γ鎖、α鎖、ε鎖、δ鎖およびμ鎖を含めた任意の型のものであってよく、γ１鎖、γ２鎖、γ３鎖およびγ４鎖を含めたγ鎖、特にγ１鎖が好ましい。したがって、抗体モジュールは、ＩｇＧ型抗体モジュール、特に、ＩｇＧ１型抗体モジュールであることが好ましい。
好ましい実施形態では、抗体モジュールは、Ｆｃ領域を含む。抗体モジュールは、特に、それぞれがドメインＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３を含む２つの重鎖と、それぞれがドメインＶＬおよびＣＬを含む２つの軽鎖とを含む全抗体であり得る。抗体モジュールは、特に、１つまたは複数のヒトＦｃγ受容体、特に、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩＡに結合することができるものである。ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、ヒトＦｃγ受容体に結合しないまたは有意には結合しない。これらの実施形態では、抗体モジュールは、特に、ＣＨ２ドメイン内にグリコシル化部位を含まない。ある特定の実施形態では、抗体モジュールの重鎖は、γ１抗体重鎖のヒト遺伝子によってコードされるＣ末端リシン残基、例えば、Ｃ末端リシンを含まない。さらに、一部の実施形態では、重鎖のＣ末端の最後の３つのアミノ酸残基の１つまたは複数が欠失および／または置換されていてよい。例えば、最後の２つまたは最後の３つのアミノ酸が欠失していてもよく、Ｃ末端の配列ＰＧＫが、例えば、リシンがアラニンで置換される、グリシンがアラニンもしくはセリンで置換されるまたはプロリンがロイシンで置換される、あるいはこれらの組合せによって変異していてもよい。「重鎖」および「ＣＨ３」という用語は、本明細書で使用される場合、そのような欠失および／または変異を含むバージョンを含む。
特に、抗体モジュールは、少なくとも１つの抗体軽鎖、特に、２つの抗体軽鎖をさらに含む。抗体軽鎖は、特に、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む。抗体軽鎖はκ鎖であってもλ鎖であってもよく、特に、κ鎖である。ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖を含む。
代替の実施形態では、抗体モジュールは、抗体軽鎖を含まない。これらの実施形態では、抗体モジュールの抗体重鎖は、軽鎖可変領域をさらに含み得る。特に、軽鎖可変領域は重鎖のＮ末端と融合しているまたは重鎖可変領域に対してＣ末端が挿入されている。軽鎖可変領域と重鎖の残りの部分を接続するためにペプチドリンカーが存在してよい。
特定の実施形態では、抗体モジュールは、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む。これらの可変領域は、互いと、例えばペプチドリンカーによって共有結合により付着していてよい。ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、特に、Ｎ末端からＣ末端までの方向に、抗体重鎖可変領域、ペプチドリンカーおよび抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチド鎖を含む。特に、抗体モジュールは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であってよい。
抗ＭＵＣ１抗体モジュールは、ＭＵＣ１のエピトープに特異的に結合する。エピトープは、ＭＵＣ１に特異的なもの、すなわち、他の分子には存在しないものであり得る、または、他の分子でも見いだされるエピトープであり得る。
ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、ＭＵＣ１にグリコシル化依存的に結合する。特に、抗体モジュールは、ＭＵＣ１に、ＭＵＣ１がグリコシル化されている場合、特に、細胞外タンデムリピートにおいてグリコシル化されている場合に、より強力に結合する。特定の実施形態では、抗体モジュールは、ＭＵＣ１に、ＭＵＣ１がＮ−アセチルガラクトサミン（Ｔｎ）、シアリルα２−６Ｎ−アセチルガラクトサミン（ｓＴｎ）、ガラクトースβ１−３Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＴＦ）またはガラクトースβ１−３（シアリルα２−６）Ｎ−アセチルガラクトサミン（ｓＴＦ）で、好ましくはＴｎまたはＴＦでＯ−グリコシル化されている場合に、より強力に結合する。
ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、ＭＵＣ１の細胞外タンデムリピート内のエピトープに特異的に結合する。特に、抗体モジュールは、前記タンデムリピートがトレオニン残基においてＮ−アセチルガラクトサミン（Ｔｎ）、シアリルα２−６Ｎ−アセチルガラクトサミン（ｓＴｎ）、ガラクトースβ１−３Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＴＦ）またはガラクトースβ１−３（シアリルα２−６）Ｎ−アセチルガラクトサミン（ｓＴＦ）で、好ましくはＴｎまたはＴＦでグリコシル化されている場合に、より強力に結合する。炭水化物部分がトレオニン残基にα−Ｏ−グリコシド結合によって結合していることが好ましい。
特定の実施形態では、抗体モジュールは、アミノ酸配列ＰＤＴＲ（配列番号１９）またはＰＤＴＲＰ（配列番号２０）を含むＭＵＣ１のタンデムリピートドメイン内のエピトープに特異的に結合することができる。このエピトープへの結合は、上記の通りグリコシル化依存的であることが好ましく、特に、上記の炭水化物部分がそれぞれ配列ＰＤＴＲまたはＰＤＴＲＰ（配列番号１９および２０）のトレオニン残基に結合している場合、結合が増加する。
ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、腫瘍関連ＭＵＣ１エピトープ（ＴＡ−ＭＵＣ１）に特異的に結合する。ＴＡ−ＭＵＣ１エピトープは、特に、腫瘍細胞には存在するが正常な細胞には存在しない、かつ／または腫瘍細胞に存在する場合にのみ宿主の循環中の抗体が接近できるが、正常な細胞に存在する場合には宿主の循環中の抗体が接近できないＭＵＣ１のエピトープを指す。上記のエピトープ、特にＭＵＣ１のタンデムリピートドメイン内に存在するエピトープは、腫瘍関連ＭＵＣ１エピトープであり得る。ある特定の実施形態では、抗体モジュールの、ＴＡ−ＭＵＣ１エピトープを発現する細胞への結合は、正常な非腫瘍ＭＵＣ１を発現する細胞への結合よりも強力である。前記結合は、少なくとも１．５倍強力である、好ましくは少なくとも２倍強力である、少なくとも５倍強力である、少なくとも１０倍強力であるまたは少なくとも１００倍強力であることが好ましい。特に、ＴＡ−ＭＵＣ１は、細胞外タンデムリピート領域内で少なくとも１つのＮ−アセチルガラクトサミン（Ｔｎ）またはガラクトースβ１−３Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＴＦ）でグリコシル化されている。ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、このエピトープに、Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｔｎ）またはガラクトースβ１−３Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＴＦ）を含むＴＡ−ＭＵＣ１の細胞外タンデムリピート領域内で特異的に結合する。特に、前記エピトープは、ＭＵＣ１タンデムリピートの少なくとも１つのＰＤＴＲまたはＰＤＴＲＰ（配列番号１９または２０）配列を含み、ＰＤＴＲまたはＰＤＴＲＰ（配列番号１９または２０）配列のトレオニンにおいてＮ−アセチルガラクトサミン（Ｔｎ）またはガラクトースβ１−３Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＴＦ）で、好ましくはα−Ｏ−グリコシド結合を介してグリコシル化されている。ＴＡ−ＭＵＣ１結合に関しては、抗体モジュールは、グリコシル化されたＭＵＣ１腫瘍エピトープに特異的に結合し、したがって、長さが同一であり、ペプチド配列が同一である、グリコシル化されていないペプチドへの結合と比較して結合の強度が少なくとも２倍、好ましくは４倍または１０倍、最も好ましくは２０倍に増加することが好ましい。
以下に、ＴＡ−ＭＵＣ１に特異的に結合する抗体モジュールの特定の実施形態を記載する。
ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３である相補性決定領域を含む、または配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３である相補性決定領域を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含む。一実施形態によると、抗体モジュール内に存在する重鎖可変領域（複数可）は、配列番号７、８もしくは９のアミノ酸配列または前記配列の１つと少なくとも７５％、特に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、抗体モジュールの重鎖可変領域は、（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号３のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号５のアミノ酸配列を有する、またはＣＤＲ−Ｈ１が配列番号２のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号６のアミノ酸配列を有する一群のＣＤＲを含み、かつ、（ｉｉ）配列番号７、８および９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
抗体モジュールは、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３である相補性決定領域を含む、または配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３である相補性決定領域を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域をさらに含み得る。一実施形態によると、抗体モジュール内に存在する軽鎖可変領域（複数可）は、配列番号１６、１７もしくは１８のアミノ酸配列または前記配列の１つと少なくとも７５％、特に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、抗体モジュールの軽鎖可変領域は、（ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号１０のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号１２のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号１４のアミノ酸配列を有する、またはＣＤＲ−Ｌ１が配列番号１１のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号１３のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号１５のアミノ酸配列を有する一群のＣＤＲを含み、かつ、（ｉｉ）配列番号１６、１７および１８のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の好ましい実施形態では、抗体モジュールは、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を少なくとも１つ、特に２つ、および、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を少なくとも１つ、特に２つ含む。さらなる実施形態では、抗体モジュールは、上記の配列の１つまたは複数を含む抗体、特に、例えば、ＷＯ２００４／０６５４２３およびＷＯ２０１１／０１２３０９に記載されている抗体ＰａｎｋｏＭａｂのキメラもしくはヒト化バージョン、または抗体ガチポツズマブに由来する。
ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号３のアミノ酸配列を有する、かつ／または重鎖可変領域が配列番号８もしくは９のアミノ酸配列を有する抗体モジュールは、重鎖可変領域内にＮ−グリコシル化部位を有する。ある特定の実施形態では、抗体分子は、重鎖可変領域内のこのＮ−グリコシル化部位が除去される変異を含む。特に、配列番号３の８位および／または配列番号９の５７位のアミノ酸残基が、それぞれ、Ａｓｎ以外の任意の他のアミノ酸残基、特にＧｌｎまたはＡｌａによって置換されている。したがって、ある特定の実施形態では、抗体モジュール内に存在する重鎖可変領域（複数可）は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３である相補性決定領域を含む。特に、抗体モジュール内に存在する重鎖可変領域（複数可）は、配列番号３４のアミノ酸配列または前記配列の１つと少なくとも７５％、特に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、抗体モジュールの重鎖可変領域（複数可）は、（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号３３のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号５のアミノ酸配列を有する一群のＣＤＲを含み、かつ、（ｉｉ）配列番号３４のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態では、配列番号３３の８位および配列番号３４の５７位のアミノ酸残基は、特に、アスパラギン以外の任意のアミノ酸残基、特に、グルタミンまたはアラニンである。さらに、これらの実施形態では、抗体モジュール内に存在する軽鎖可変領域（複数可）は、特に、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３である相補性決定領域を含む。特に、抗体モジュール内に存在する軽鎖可変領域（複数可）は、配列番号１８のアミノ酸配列または前記配列の１つと少なくとも７５％、特に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態では、抗体モジュールの軽鎖可変領域（複数可）は、特に、（ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号１０のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号１２のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号１４のアミノ酸配列を有する一群のＣＤＲを含み、かつ、（ｉｉ）配列番号１８のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
ＩＬ−１５モジュール
融合タンパク質構築物のＩＬ−１５モジュールは、ＩＬ−１５の活性の１つまたは複数を含む。特に、ＩＬ−１５モジュールは、ＩＬ−２受容体β−共通γ鎖複合体および／またはＩＬ−１５受容体α鎖に特異的に結合することができる。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１５モジュールは、ＩＬ−１５またはその断片、特に、ヒトＩＬ−１５またはその断片を含む。特定の実施形態では、ＩＬ−１５モジュールは、ヒトＩＬ−１５を含む、特にそれからなる。
特定の実施形態では、ＩＬ−１５モジュールは、配列番号２１の配列またはそれに由来する配列を含む。特に、ＩＬ−１５モジュールは、配列番号２１の配列と少なくとも７５％、特に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１５モジュールは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、特にそれからなる。さらなる実施形態では、ＩＬ−１５モジュールは、前記配列の断片、特に、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも９０アミノ酸または少なくとも１００アミノ酸の長さの断片を含む。断片は、特に、ＩＬ−２受容体β−共通γ鎖複合体および／またはＩＬ−１５受容体α鎖に特異的に結合する能力を保持する。
ＩＬ−１５モジュールは、受容体結合を増加させる変異を含み得る。例えば、ＩＬ−１５モジュールは、配列番号２１のＡｓｎ７２に対応するアミノ酸位におけるアスパラギンのアスパラギン酸への置換を含み得る。ＩＬ−１５モジュールが配列番号２１の配列またはそれに由来する配列を含む実施形態では、受容体結合を増加させる変異は、Ｎ７２Ｄである。代替の実施形態では、ＩＬ−１５モジュールは、受容体結合を低下させる変異を含み得る。例えば、ＩＬ−１５モジュールは、配列番号２１のＩｌｅ６７に対応するアミノ酸位におけるイソロイシンのグルタミン酸への置換を含み得る。ＩＬ−１５モジュールが配列番号２１の配列またはそれに由来する配列を含む実施形態では、受容体結合を低下させる変異は、Ｉ６７Ｅである。ＩＬ−１５モジュールは、Ａｓｎ７９に対応するアミノ酸および／または配列番号２１のＡｓｎ１１２に対応するアミノ酸においてグリコシル化されていてよい。
特定の実施形態では、ＩＬ−１５モジュールは、ＩＬ−１５受容体α鎖またはその断片をさらに含む。ＩＬ−１５受容体α鎖は、特に、ヒトＩＬ−１５受容体α鎖である。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１５受容体α鎖またはその断片は、ＩＬ−１５、特にヒトＩＬ−１５に特異的に結合する。特定の実施形態では、ＩＬ−１５モジュールは、ＩＬ−１５受容体α鎖、特にヒトＩＬ−１５受容体α鎖の細胞外ドメインまたはその一部のみを含む、またはそれからなるＩＬ−１５受容体α鎖の断片を含む。特に、ＩＬ−１５受容体α鎖の断片は、ＩＬ−１５受容体α鎖、特にヒトＩＬ−１５受容体α鎖のｓｕｓｈｉドメインのみを含む、またはそれからなる。
特定の実施形態では、ＩＬ−１５モジュールは、配列番号２２の配列またはそれに由来する配列を含む、ＩＬ−１５受容体α鎖の断片を含む。特に、ＩＬ−１５受容体α鎖の断片は、配列番号２２の配列と少なくとも７５％、特に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＩＬ−１５受容体α鎖の断片は、前記配列の断片、特に、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも５５アミノ酸または少なくとも６０アミノ酸の長さの断片を含む。断片は、特に、ＩＬ−２受容体β−共通γ鎖複合体および／またはＩＬ−１５に特異的に結合する能力を保持する。
ＩＬ−１５受容体α鎖もしくはその断片は、ＩＬ−１５もしくはその断片と同じポリペプチド鎖の一部であり得る、またはＩＬ−１５受容体α鎖もしくはその断片とＩＬ−１５もしくはその断片は異なるポリペプチド鎖の一部であり得る。好ましい実施形態では、ＩＬ−１５受容体α鎖またはその断片とＩＬ−１５またはその断片は同じポリペプチド鎖の一部である。これらの実施形態では、ＩＬ−１５受容体α鎖またはその断片をＩＬ−１５またはその断片のＮ末端またはＣ末端、特にそのＮ末端と融合することができる。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１５受容体α鎖またはその断片をＩＬ−１５またはその断片とペプチドリンカー、特に本明細書に記載のペプチドリンカーを介して融合する。
特定の実施形態では、ＩＬ−１５モジュールならびに融合タンパク質構築物全体は、ＩＬ−１５に結合することができるＩＬ−１５受容体α鎖もその断片も含まない。
ある特定の具体的な実施形態では、ＩＬ−１５モジュールは、配列番号２１のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ−１５を含む、特にそれからなる。代替の実施形態では、ＩＬ−１５モジュールは、配列番号２１のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ−１５を含む、特にそれからなり、６７位のイソロイシン残基がグルタミン酸で置換されている。別の実施形態では、ＩＬ−１５モジュールは、配列番号２１のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ−１５のＮ末端とペプチドリンカーを介して融合した、配列番号２２のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ−１５受容体α鎖断片を含む、特にそれからなる。別の実施形態では、ＩＬ−１５モジュールは、ヒトＩＬ−１５が、参照配列の全長にわたって、配列番号２１と少なくとも９０％、特に、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ／または、ヒトＩＬ−１５受容体α鎖断片が、参照配列の全長にわたって、配列番号２２と少なくとも９０％、特に、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有することを除いて、これらの設計のいずれかを有し、また、ＩＬ−１５モジュールは、ＩＬ−２受容体β−共通γ鎖複合体に特異的に結合する。
融合タンパク質構築物
融合タンパク質構築物は、少なくとも１つの抗ＭＵＣ１抗体モジュールおよび少なくとも１つのＩＬ−１５モジュールを含む。ある特定の実施形態では、融合タンパク質構築物は、少なくとも２つ、特に、正確に２つのＩＬ−１５モジュールを含む。ＩＬ−１５モジュールは同一であっても異なってもよいが、特に、同じアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＩＬ−１５モジュールが抗体モジュールの重鎖のＣ末端と融合している。さらにまたはこれの代わりに、少なくとも１つのＩＬ−１５モジュールが抗体モジュールの軽鎖のＣ末端と融合している。
融合タンパク質構築物が２つのＩＬ−１５モジュールを含む特定の実施形態では、抗体モジュールは、重鎖も２つ含み、ＩＬ−１５モジュールのそれぞれが、抗体モジュールの異なる重鎖のＣ末端と融合している。融合タンパク質構築物が２つのＩＬ−１５モジュールを含む代替の実施形態では、抗体モジュールは、軽鎖も２つ含み、ＩＬ−１５モジュールのそれぞれが、抗体モジュールの異なる軽鎖のＣ末端と融合している。融合タンパク質構築物が２つのＩＬ−１５モジュールを含むさらなる代替的な実施形態では、抗体モジュールは、軽鎖も２つ含み、ＩＬ−１５モジュールのそれぞれが、抗体モジュールの異なる軽鎖のＮ末端と融合している。
ＩＬ−１５モジュールは、抗体モジュールと、ペプチド結合を介して直接融合していてもよく、ペプチドリンカーを介して間接的に融合していてもよい。直接融合は、ＩＬ−１５モジュールの配列が、これらの２つの配列間にいかなる中間のアミノ酸も伴わずに、抗体モジュールの配列に直接続く実施形態を指す。ペプチドリンカーを介した融合は、抗体モジュールの配列とＩＬ−１５モジュールの配列との間に１つまたは複数のアミノ酸が存在する実施形態を指す。これらの１つまたは複数のアミノ酸が抗体モジュールとＩＬ−１５モジュールの間のペプチドリンカーを形成する。
ペプチドリンカーは、原理上は、抗体モジュールとＩＬ−１５モジュールの連結に適した任意の数のアミノ酸および任意のアミノ酸配列を有してよい。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも３アミノ酸、好ましくは少なくとも５アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸または少なくとも２０アミノ酸を含む。さらなる実施形態では、ペプチドリンカーは、５０アミノ酸もしくはそれ未満、好ましくは４５アミノ酸もしくはそれ未満、４０アミノ酸もしくはそれ未満、３５アミノ酸もしくはそれ未満、３０アミノ酸もしくはそれ未満、２５アミノ酸もしくはそれ未満または２０アミノ酸もしくはそれ未満を含む。特に、ペプチドリンカーは、１０アミノ酸から３０アミノ酸まで、特に、２０アミノ酸または３０アミノ酸を含む。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシン残基およびセリン残基からなる。グリシンおよびセリンは、ペプチドリンカー内に、２対１、３対１、４対１または５対１の比で存在し得る（グリシン残基の数対セリン残基の数）。例えば、ペプチドリンカーは、４つのグリシン残基の後に１つのセリン残基という配列、特に、この配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのリピートを含み得る。特定の例は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の２つのリピート、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の３つのリピート、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の４つのリピートおよびアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の６つのリピートを含む、またはそれからなるペプチドリンカーである。特に、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の２つ、３つまたは４つのリピートからなるペプチドリンカーを使用することができる。特定の実施形態では、融合タンパク質構築物は、抗体モジュールのＣ末端とＩＬ−１５モジュールのＮ末端との間にアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の２つ、３つもしくは４つのリピートを含むペプチドリンカー、および／または、ＩＬ−１５もしくはその断片とＩＬ−１５モジュールのＩＬ−１５受容体α鎖もしくはその断片との間にアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の４つもしくは６つのリピートを含むペプチドリンカーを含む。さらなる実施形態では、ペプチドリンカーは、配列ＰＡＰＡＰ（配列番号３２）、特に、この配列の３つまたは６つのリピートを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質構築物は、抗体モジュールのＣ末端とＩＬ−１５モジュールのＮ末端との間にアミノ酸配列ＰＡＰＡＰ（配列番号３２）の３つまたは６つのリピートを含むペプチドリンカーを含む。
他の実施形態では、ペプチドリンカーは、ヒトにおいて免疫原性の可能性を示さないまたは軽微にしか示さない配列、好ましくは、ヒト配列または天然に存在する配列である配列を含む。さらに好ましい実施形態では、ペプチドリンカーおよび隣接するアミノ酸は、免疫原性の可能性を示さないまたは軽微にしか示さない。上記のペプチドリンカーは、１つの抗原結合断片内に存在する重鎖可変領域および軽鎖可変領域などの融合タンパク質構築物の他のエレメントを連結するために使用することもできる。
ある特定の実施形態では、ＩＬ−１５モジュールは、抗体モジュールの重鎖のＣ末端とペプチドリンカーを介して融合している。これらの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｎ末端に追加的なアミノ酸残基、特に、プロリン残基、アスパラギン酸残基またはアラニン残基を含み得る。それに加えて、またはその代わりに、抗体重鎖の最後の１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基が欠失および／または変異していてよい。特定の例としては、ペプチドリンカーがＮ末端に追加的なプロリン残基またはアスパラギン酸残基を含む融合タンパク質構築物；ペプチドリンカーがＮ末端に追加的なアラニン残基を含み、抗体重鎖の最後のアミノ酸残基が欠失している融合タンパク質構築物；および抗体重鎖の最後の２つのアミノ酸残基が欠失している融合タンパク質構築物が挙げられる。これらの実施形態では、ペプチドリンカーは、特に、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の２つ、３つもしくは４つのリピートまたはアミノ酸配列ＰＡＰＡＰ（配列番号３２）の３つもしくは６つのリピートを含む。
融合タンパク質構築物は、特に、抗体構築物である。抗体構築物は、ＭＵＣ１のエピトープに特異的に結合するが、別の抗原に特異的に結合するさらなる抗原結合部位は全く含まない。代替の実施形態では、融合タンパク質構築物は、他の抗原に特異的に結合する１つまたは複数の追加的な抗原結合部位を含む。これらの追加的な抗原結合部位は、融合タンパク質構築物のどこに存在していてもよい。ある特定の実施形態では、追加的な抗原結合部位は、抗体モジュールの抗体軽鎖または重鎖のＣ末端またはＮ末端と融合した抗原結合断片内に存在する。特に、抗体モジュールが２つの抗体軽鎖を含む場合、１つまたは複数の抗原結合断片、特に、１つの追加的な抗原結合断片が抗体モジュールの抗体軽鎖のそれぞれのＣ末端またはＮ末端、特にＣ末端と融合していてよい。これらの追加的な抗原結合断片は同一であっても異なってもよいが、特に、同じアミノ酸配列を有する。これらの実施形態では、ＩＬ−１５モジュールは、抗体モジュールの抗体重鎖（複数可）のＣ末端と融合していることが好ましい。さらに、抗体モジュールが２つの抗体重鎖を含む場合、１つまたは複数の追加的な抗原結合断片、特に、１つの追加的な抗原結合断片が抗体モジュールの抗体重鎖のそれぞれのＣ末端と融合していてよい。これらの追加的な抗原結合断片は同一であっても異なってもよいが、特に、同じアミノ酸配列を有する。これらの実施形態では、ＩＬ−１５モジュールは、抗体モジュールの抗体軽鎖（複数可）のＣ末端と融合していることが好ましい。
特定の実施形態では、追加的な抗原結合断片は、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む。これらの可変領域は、互いに、例えばペプチドリンカーによって共有結合により付着していてよい。ある特定の実施形態では、追加的な抗原結合断片は、特に、Ｎ末端からＣ末端までの方向に、抗体重鎖可変領域、ペプチドリンカーおよび抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチド鎖を含む。特に、追加的な抗原結合断片は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であってよい。
追加的な抗原結合部位は、任意の抗原、特に、腫瘍関連抗原または免疫細胞のチェックポイント抗原に特異的に結合し得る。そのような抗原の適切な例は、ＣＤ３、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ４０、ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ７、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＴＬＡ−４、ＴＦａ、ＬｅＹ、ＣＤ１６０、ガレクチン−３、およびガレクチン−１からなる群から選択することができる。
特定の実施形態では、追加的な抗原結合断片は、ＣＤ３に特異的に結合する。特に、追加的な抗原結合断片は、ＣＤ３に特異的に結合する単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）である。追加的な抗原結合断片は、ＣＤ３のエピトープに特異的に結合する。特に、追加的な抗原結合断片は、ＣＤ３εに特異的に結合する。特定の実施形態では、追加的な抗原結合断片は、ＣＤ３εにコンフォメーション依存的に、特に、ＣＤ３δと複合体を形成した場合にのみ特異的に結合する。
ある特定の実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する追加的な抗原結合断片は、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３である相補性決定領域を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含む。一実施形態によると、追加的な抗原結合断片内に存在する重鎖可変領域（複数可）は、配列番号２６のアミノ酸配列または前記配列の１つと少なくとも７５％、特に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、追加的な抗原結合断片の重鎖可変領域は、（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号２３のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号２４のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号２５のアミノ酸配列を有する一群のＣＤＲを含み、かつ、（ｉｉ）配列番号２６のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
ＣＤ３に特異的に結合する追加的な抗原結合断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３である相補性決定領域を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域をさらに含み得る。一実施形態によると、追加的な抗原結合断片内に存在する軽鎖可変領域（複数可）は、配列番号３０のアミノ酸配列または前記配列の１つと少なくとも７５％、特に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、追加的な抗原結合断片の軽鎖可変領域は、（ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号２７のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号２８のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号２９のアミノ酸配列を有する一群のＣＤＲを含み、かつ（ｉｉ）配列番号３０のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の好ましい実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する追加的な抗原結合断片は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を少なくとも１つ、特に、１つ、および、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を少なくとも１つ、特に、１つ含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質構築物は、それとコンジュゲートした１つまたは複数のさらなる作用物質を含む。さらなる作用物質は、融合タンパク質構築物とのコンジュゲーションに適した任意の作用物質であってよい。融合タンパク質構築物中に１つよりも多くのさらなる作用物質が存在する場合、これらのさらなる作用物質は、同一であっても異なってもよいが、特に、全て同一である。さらなる作用物質と融合タンパク質構築物のコンジュゲーションは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して実現することができる。さらなる作用物質を融合タンパク質構築物に、共有結合により、特に、融合または化学的カップリングによって付着させることもでき、非共有結合により付着させることもできる。ある特定の実施形態では、さらなる作用物質を融合タンパク質構築物に共有結合により、特にリンカー部分を介して付着させる。リンカー部分は、さらなる作用物質を融合タンパク質構築物に結合させるために適した任意の化学的実体であってよい。
ある特定の実施形態では、さらなる作用物質は、タンパク質のポリペプチドである。このポリペプチドまたはタンパク質は、特に、抗体モジュールのポリペプチド鎖またはＩＬ−１５モジュールのポリペプチド鎖と融合することができる。ある特定の実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用物質を抗体モジュールの抗体軽鎖または抗体重鎖のＣ末端またはＮ末端と融合することができる。抗体モジュールが２つの抗体軽鎖を含む実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用物質を２つの抗体軽鎖のそれぞれのＣ末端またはＮ末端、特にＣ末端と融合することができる。抗体モジュールが２つの抗体重鎖を含む実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用物質を２つの抗体重鎖のそれぞれのＣ末端と融合することができる。ポリペプチドまたはタンパク質は同一であっても異なってもよいが、特に、同じアミノ酸配列を有する。そのようなポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用物質の適切な例は、サイトカイン、ケモカイン、抗体モジュール、抗原結合断片、酵素、および相互作用ドメインからなる群から選択することができる。
さらなる作用物質は、疾患、特にがんの治療、診断、予後判定および／またはモニタリングにおいて有用であることが好ましい。例えば、さらなる作用物質は、放射性核種、化学療法剤、検出可能な標識、毒素、細胞溶解性構成成分、免疫モジュレーター、免疫エフェクター、およびリポソームからなる群から選択することができる。
融合タンパク質構築物のグリコシル化
抗ＭＵＣ１抗体モジュールは、１つまたは複数の抗体重鎖内にＣＨ２ドメインを含み得る。ＩｇＧ型の天然ヒト抗体は、ＣＨ２ドメイン内にＮ−グリコシル化部位を含む。抗体モジュール内に存在するＣＨ２ドメインは、Ｎ−グリコシル化部位を含んでもよく含まなくてもよい。
ある特定の実施形態では、抗体モジュール内に存在するＣＨ２ドメインは、Ｎ−グリコシル化部位を含まない。特に、抗体モジュールは、ＩＭＧＴ／Ｅｕ番号付け系に従って２９７位に対応する重鎖内の位置にアスパラギン残基を含まない。例えば、抗体モジュールは、重鎖内にＡｌａ２９７変異を含み得る。これらの実施形態では、融合タンパク質構築物は、Ｆｃγ受容体への結合を介して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導する能力が強力に低下しているかまたはその能力を完全に欠くことが好ましい。能力の強力な低下は、この点においては、特に、ＣＨ２ドメイン内にＮ−グリコシル化部位を含み、かつ、ヒト細胞株におけるまたはＣＨＯ細胞株もしくはＳＰ２／０細胞株における産生によって入手可能なもの、例えば、本明細書に記載のグリコシル化パターンなどの共通の哺乳動物グリコシル化パターンを有する、同じ融合タンパク質構築物と比較して１０％もしくはそれ未満、特に、３％もしくはそれ未満、１％もしくはそれ未満または０．１％もしくはそれ未満までの活性の低下を指す。
ＣＨ２ドメインにおけるＮ−グリコシル化の存在または非存在およびグリコシル化パターンを介して、融合タンパク質構築物によるＴ細胞およびＮＫ細胞の活性化ならびに融合タンパク質構築物の細胞傷害を調節することができる。ＣＨ２ドメインにグリコシル化を伴わない場合であっても、融合タンパク質構築物のＩＬ−１５モジュールによって免疫細胞が腫瘍部位において活性化される。ＣＨ２グリコシル化を伴うと、免疫細胞活性化が増加し、また、フコシル化が低減したグリコシル化パターンにより、免疫細胞活性化がさらにいっそう顕著なものになる。
代替の実施形態では、抗体モジュール内に存在するＣＨ２ドメインは、Ｎ−グリコシル化部位を含む。このグリコシル化部位は、特に、ＩＭＧＴ／Ｅｕ番号付け系に従って重鎖のアミノ酸位２９７に対応するアミノ酸位にあり、アミノ酸配列モチーフＡｓｎ Ｘａａ Ｓｅｒ／Ｔｈｒを有し、Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸であってよい。Ａｓｎ２９７におけるＮ結合グリコシル化は哺乳動物ＩｇＧにおいてならびに他の抗体のアイソタイプの相同領域において保存されている。必要に応じて追加的なアミノ酸が可変領域または他の配列修飾に存在し得るので、抗体のアミノ酸配列におけるこの保存されたグリコシル化部位の実際の位置は変動し得る。抗体モジュールに結合したグリカンは、二分岐の複合体型Ｎ結合炭水化物構造であることが好ましく、少なくとも以下の構造を含むことが好ましい：
Ａｓｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ−（Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ）２
（式中、Ａｓｎは抗体モジュールのポリペプチド部分のアスパラギン残基であり、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｍａｎはマンノースである）。末端ＧｌｃＮＡｃ残基はさらにガラクトース残基を有し得、これは必要に応じてシアル酸残基を有し得る。さらなるＧｌｃＮＡｃ残基（バイセクト型ＧｌｃＮＡｃと称される）をポリペプチドに最も近いＭａｎに結合させることができる。Ａｓｎに結合したＧｌｃＮＡｃにフコースを結合させることができる。
融合タンパク質構築物は、抗体モジュールのＣＨ２ドメインにおいて大量のコアフコースまたは少量のコアフコースを有するグリコシル化パターンを有し得る。ＣＨ２ドメインのフコシル化の量の減少により、融合タンパク質構築物のＡＤＣＣを誘導する能力が増加する。ある特定の実施形態では、コアフコース残基を有するグリカンの相対量は、組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の４０％もしくはそれ未満、特に、３０％もしくはそれ未満または２０％もしくはそれ未満である。代替の実施形態では、コアフコース残基を有するグリカンの相対量は、組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも６０％、特に、少なくとも６５％または少なくとも７０％である。
抗ＭＵＣ１抗体モジュールのＣＨ２ドメイン内のグリコシル化部位の存在または非存在、および前記グリコシル化部位におけるグリカン構造内のフコースの存在または非存在を介して、融合タンパク質構築物の抗体モジュールのＦｃ部分を介してＡＤＣＣを誘導する能力および前記ＡＤＣＣ誘導の強度を調節することができる。Ｔ細胞およびＮＫ細胞によって媒介される細胞傷害は腫瘍部位における前記免疫細胞の増殖および活性化によってすでに開始されている。これは、腫瘍細胞に結合し、融合タンパク質構築物を腫瘍部位に位置付ける抗ＭＵＣ１抗体モジュール、ならびにＴ細胞およびＮＫ細胞の増殖および活性化を誘導するＩＬ−１５モジュールによって実現される。Ｔ細胞およびＮＫ細胞によって媒介される全体的な細胞傷害活性は、抗体モジュールのＦｃ部分のグリコシル化によって増加させることができ、前記グリコシル化におけるフコシル化の量を減少させることによってさらに増加させることができる。特に、低フコシル化を伴うＦｃグリコシル化により、ＮＫ細胞によって媒介されるＡＤＣＣがさらに増強される。ある特定の適用では、ＡＤＣＣ活性の微調整が重要である。したがって、ある特定の状況では、抗体モジュールのＣＨ２ドメイン内にグリコシル化部位を有さない融合タンパク質構築物、抗体モジュールのＣＨ２ドメイン内にグリコシル化部位を有し、フコシル化の量が多い融合タンパク質構築物、または抗体モジュールのＣＨ２ドメイン内にグリコシル化部位を有し、フコシル化の量が少ない融合タンパク質構築物が最も有利であり得る。
ある特定の実施形態では、ＩＬ−１５モジュールがグリコシル化されている。特に、ＩＬ−１５モジュールは、配列番号２１のＡｓｎ７９および／またはＡｓｎ１１２に対応するアミノ酸においてグリコシル化されていてよい。
融合タンパク質構築物は、宿主細胞において組換えによって産生させることが好ましい。融合タンパク質構築物の産生のために使用される宿主細胞は、抗体産生のために使用することができる任意の宿主細胞であってよい。適切な宿主細胞は、特に、真核生物宿主細胞、特に、哺乳動物宿主細胞である。例示的な宿主細胞としては、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞株などの酵母細胞、ＳＦ９細胞株およびＳＦ２１細胞株などの昆虫細胞、植物細胞、ＥＢ６６アヒル細胞株などの鳥類細胞、ＣＨＯ細胞株、ＮＳ０細胞株、ＳＰ２／０細胞株およびＹＢ２／０細胞株などの齧歯類細胞、ならびにＨＥＫ２９３細胞株、ＰＥＲ．Ｃ６細胞株、ＣＡＰ細胞株、ＣＡＰ−Ｔ細胞株、ＡＧＥ１．ＨＮ細胞株、Ｍｕｔｚ−３細胞株およびＫＧ１細胞株などのヒト細胞が挙げられる。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質構築物を、ヒト血液細胞株、特に、ヒト骨髄性白血病細胞株において組換えによって産生させる。融合タンパク質構築物の産生のために使用することができる好ましいヒト細胞株ならびに適切な産生手順は、ＷＯ２００８／０２８６８６ Ａ２に記載されている。特定の実施形態では、融合タンパク質構築物を、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６およびＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２からなる群から選択されるヒト骨髄性白血病細胞株において発現させることによって得る。これらの細胞株は、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｒｏｅｓｓｌｅ−Ｓｔｒ．１０、１３１２５ Ｂｅｒｌｉｎ（ＤＥ）によって、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ、３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ＤＥ）においてブタペスト条約の要件に従った受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８０６（ＮＭ−Ｈ９Ｄ８；２００６年９月１５日に寄託）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８０７（ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６；２００６年１０月５日に寄託）およびＤＳＭ ＡＣＣ２８５６（ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２；２００７年８月８日に寄託）の下で寄託された。ＮＭ−Ｈ９Ｄ８細胞では、高度のシアリル化、高度のバイセクト型ＧｌｙｃＮＡｃ、高度のガラクトシル化および高度のフコシル化を有するグリコシル化パターンがもたらされる。ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６細胞およびＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２細胞では、フコシル化の度合いが非常に低い以外はＮＭ−Ｈ９Ｄ８細胞のものと同様のグリコシル化パターンがもたらされる。他の適切な細胞株としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに存在するヒト骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）、ならびに上述のものに由来する細胞株が挙げられる。
さらなる実施形態では、融合タンパク質構築物を、ＣＨＯ細胞株、特に、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−９０９６の細胞株などのＣＨＯ ｄｈｆｒ−細胞株において組換えによって産生させる。
核酸、発現カセット、ベクター、細胞株および組成物
さらなる態様では、本発明は、融合タンパク質構築物をコードする核酸を提供する。前記核酸の核酸配列は、融合タンパク質構築物をコードするのに適した任意のヌクレオチド配列を有し得る。しかし、核酸配列は、核酸を発現させる宿主細胞または生物体の特定のコドン使用、特に、ヒトコドン使用に少なくとも部分的に適合させたものであることが好ましい。核酸は、二本鎖または一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはｃＤＮＡなどの二本鎖ＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡであってよい。核酸は、１つの連続した核酸分子であってもよく、それぞれが融合タンパク質構築物の異なる部分をコードするいくつかの核酸分子で構成されていてもよい。
融合タンパク質構築物が抗体モジュールの軽鎖および重鎖などの１つよりも多くの異なるアミノ酸の鎖で構成される場合、核酸は、例えば、別々のアミノ酸の鎖を生じさせるためにＩＲＥＳエレメントなどの制御エレメントによって分離されていることが好ましい、それぞれが融合タンパク質構築物のアミノ酸の鎖の１つをコードするいくつかのコード領域を含有する単一の核酸分子であってもよく、または、核酸は、それぞれが融合タンパク質構築物のアミノ酸の鎖の１つをコードする１つまたは複数のコード領域を各核酸分子が含むいくつかの核酸分子で構成されていてもよい。融合タンパク質構築物をコードするコード領域に加えて、核酸は、例えば、他のタンパク質をコードし得る、コード領域（複数可）の転写および／または翻訳に影響を及ぼし得る、核酸の安定性または他の物理的もしくは化学的性質に影響を及ぼし得る、あるいは全く機能を有し得ない、さらなる核酸配列または他の改変も含み得る。
さらなる態様では、本発明は、本発明による核酸および前記核酸と作用的に接続したプロモーターを含む発現カセットまたはベクターを提供する。さらに、発現カセットまたはベクターは、さらなるエレメント、特に、核酸の転写および／もしくは翻訳、発現カセットもしくはベクターの増幅および／もしくは再生、宿主細胞のゲノムへの発現カセットもしくはベクターの組込み、ならびに／または宿主細胞における発現カセットもしくはベクターのコピー数に影響を及ぼし、かつ／またはそれを制御することができるエレメントを含み得る。抗体を発現させるための適切な発現カセットおよびそれぞれの発現カセットを含むベクターは先行技術において周知であり、したがって、本明細書においてさらなる説明は必要ない。
さらに、本発明は、本発明による核酸または本発明による発現カセットもしくはベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は任意の宿主細胞であってよい。宿主細胞は、単離された細胞であっても組織内に含まれる細胞であってもよい。宿主細胞は、培養細胞、特に、初代細胞または樹立細胞系の細胞、好ましくは腫瘍由来細胞であることが好ましい。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞、特に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母細胞、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、または哺乳動物細胞、特に、腫瘍由来ヒト細胞などのヒト細胞、ＣＨＯなどのハムスター細胞、もしくは霊長類細胞であることが好ましい。本発明の好ましい実施形態では、宿主細胞は、ヒト骨髄性白血病細胞に由来する。宿主細胞は、以下の細胞もしくは細胞株：Ｋ５６２、ＫＧ１、ＭＵＴＺ−３またはそれらに由来する細胞もしくは細胞株、あるいは上述の細胞の少なくとも１つを含む細胞または細胞株の混合物から選択されることが好ましい。宿主細胞は、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６、ＮＭ Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２、および前記宿主細胞のいずれか１つに由来する細胞もしくは細胞株、または上述の細胞の少なくとも１つを含む細胞もしくは細胞株の混合物からなる群から選択されることが好ましい。これらの細胞株およびそれらの性質は、ＰＣＴ出願ＷＯ２００８／０２８６８６ Ａ２に詳しく記載されている。好ましい実施形態では、宿主細胞を、糖タンパク質、特に、特定のグリコシル化パターンを有する抗体の発現のために最適化する。本発明による核酸のコード領域のコドン使用ならびに／またはプロモーターおよび発現カセットもしくはベクターのさらなるエレメントは、使用される宿主細胞の型に適合する、より好ましくは、それに対して最適化されたものであることが好ましい。上記の宿主細胞または細胞株によって融合タンパク質構築物が産生されることが好ましい。
別の態様では、本発明は、融合タンパク質構築物、核酸、発現カセットもしくはベクター、または宿主細胞を含む組成物を提供する。組成物は、これらの構成成分の１つよりも多くも含有し得る。さらに、組成物は、溶媒、希釈剤、および賦形剤からなる群から選択される１つまたは複数のさらなる構成成分を含み得る。組成物は、医薬組成物であることが好ましい。この実施形態では、組成物の構成成分は、全てが薬学的に許容されるものであることが好ましい。組成物は固体または流体組成物、特に、好ましくは水性の溶液、エマルションもしくは懸濁液または凍結乾燥粉末であり得る。
医療における使用
融合タンパク質構築物は、特に、医療、特に、疾患、特に、本明細書に記載の疾患、好ましくはがん、感染症および免疫不全の治療、診断、予後判定および／またはモニタリングにおいて有用である。
したがって、さらなる態様では、本発明は、医療に使用するための融合タンパク質構築物、核酸、発現カセットもしくはベクター、宿主細胞、または組成物を提供する。医療における使用は、例えば、がんなどの、異常な細胞成長に関連する疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症または寄生虫感染症などの感染症、および、免疫不全などの、免疫活性の低下に関連する疾患などの疾患の処置、予後判定、診断および／またはモニタリングにおける使用であることが好ましい。好ましい実施形態では、疾患は、がんである。がんは、卵巣がん、トリプルネガティブ乳がんなどの乳がん、肺がんおよび膵がんからなる群から選択されることが好ましい。がんは、さらに、特に結腸がん、胃がん、肝がん、腎がん、膀胱がん、皮膚がん、子宮頸部がん、前立腺がん、胃腸がん、子宮体がん、甲状腺がんおよび血液がんから選択され得る。
ある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスによって引き起こされるものである。ある特定の実施形態では、疾患は、ＭＵＣ１を発現する細胞を含むまたはそれに関連する。例えば、処置されるがんは、ＭＵＣ１陽性である、すなわち、ＭＵＣ１を発現するがん細胞を含む。
特定の実施形態では、融合タンパク質構築物を、別の治療剤、特に、別の抗がん剤と組み合わせて使用する。前記さらなる治療剤は、任意の公知の抗がん薬であってよい。融合タンパク質構築物と組み合わせることができる適切な抗がん治療剤は、化学療法剤、抗体、免疫賦活性剤、サイトカイン、ケモカイン、およびワクチンであり得る。さらに、融合タンパク質構築物を用いた治療を放射線療法、外科手術および／または漢方薬と組み合わせることができる。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質構築物は、がんの処置において以下の１つまたは複数と組み合わせて使用するためのものである：
（ｉ）細胞療法、例えば、ＣＡＲ−Ｔ、ＴＣＲ、ＮＫ、またはＣＤに基づく細胞療法；
（ｉｉ）免疫活性化抗体、例えば、二重特異性ＴまたはＮＫ細胞エンゲージャーまたは他の免疫サイトカイン；
（ｉｉｉ）チェックポイント抗体、例えば、アンタゴニストまたはアゴニストチェックポイント抗体、例えば、ＣＤ３に対する抗体、ＰＤ−１に対する抗体、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体、ＣＤ４０に対する抗体、ＣＤ７に対する抗体、ＣＤ２８に対する抗体、ＧＩＴＲに対する抗体、ＩＣＯＳに対する抗体、ＯＸ４０に対する抗体、４−１ＢＢに対する抗体、ＣＴＬＡ−４に対する抗体、ＣＤ１６０に対する抗体、ガレクチン−３に対する抗体、およびガレクチン−１に対する抗体；
（ｉｖ）ワクチン接種治療；
（ｖ）化学療法；
（ｖｉ）これだけに限定されないが、ＥＧＦＲに対する抗体、ＨＥＲ２に対する抗体、ＴＦαに対する抗体、ＬｅＹに対する抗体、ＣＥＡに対する抗体およびＥｐＣＡＭに対する抗体などのＡＤＣＣ媒介性モノクローナル抗体を含めた、腫瘍を標的とする抗体；
（ｖｉｉ）がん細胞の表面上のＴＡ−ＭＵＣ１を、例えばＥＧＦＲを阻害することによって上方制御する治療。
特定の実施形態では、融合タンパク質構築物は、がんの処置においてＭＵＣ１およびＣＤ３を標的とする二重特異性抗体、特に、ＭＵＣ１に特異的に結合する抗体モジュールとＣＤ３に特異的に結合する抗原結合断片とを含む二重特異性抗体と組み合わせて使用するためのものである。二重特異性抗体のＭＵＣ１に特異的に結合する抗体モジュールは、特に、融合タンパク質構築物に関して本明細書に記載されている通りであり、二重特異性抗体のＣＤ３に特異的に結合する抗原結合断片は、特に、ＣＤ３に特異的に結合する追加的な抗原結合断片に関して本明細書に記載されている通りである。適切な二重特異性抗体は、例えば、ＷＯ２０１８／１７８０４７（ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０５７７２１）に記載されている。
さらなる実施形態では、融合タンパク質構築物は、がんの処置においてＰＤ−Ｌ１に対する抗体と組み合わせて使用するためのものである。特に、融合タンパク質構築物とＰＤ−Ｌ１に対する抗体の組合せは腫瘍細胞殺滅および／または免疫細胞活性化、特に、Ｔ細胞活性化において相乗効果を示す。例示的なＰＤ−Ｌ１に対する抗体は、例えば、ＷＯ２０１８／１７８１２２（ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０５７８４４）に記載されている。
さらなる実施形態では、融合タンパク質構築物は、がんの処置においてＥＧＦＲに対する抗体と組み合わせて使用するためのものである。特に、融合タンパク質構築物とＥＧＦＲに対する抗体の組合せは、腫瘍細胞殺滅において相乗効果を示す。例示的なＥＧＦＲに対する抗体は、トムゾツキシマブおよびセツキシマブである。
さらなる実施形態では、融合タンパク質構築物は、がんの処置においてＣＤ４０に対する抗体と組み合わせて使用するためのものである。抗ＣＤ４０抗体を用いた処置により、患者の免疫細胞におけるＩＬ−１５受容体サブユニットの発現が上方制御される。それにより、抗ＣＤ４０抗体を用いて処置された患者における融合タンパク質構築物を用いた免疫細胞活性化および腫瘍処置が増強される。例示的なＣＤ４０に対する抗体は、例えば、ＷＯ２０１８／１７８０４６（ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０５７７１７）に記載されている。
特定の実施形態
以下に、本発明の特定の実施形態を記載する。
実施形態１．
（ｉ）ＭＵＣ１に特異的に結合する抗体モジュール（抗ＭＵＣ１抗体モジュール）と、
（ｉｉ）ＩＬ−１５モジュールと
を含む融合タンパク質構築物。
実施形態２．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、それぞれがＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖を含む、実施形態１に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態３．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、それぞれがＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む２つの軽鎖を含む、実施形態１または２に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態４．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、ＩｇＧ型抗体モジュール、特に、ＩｇＧ１型抗体モジュールである、実施形態１から３までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態５．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、κ鎖を有する、実施形態１から４までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態６．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、ＴＡ−ＭＵＣ１エピトープに特異的に結合する、実施形態１から５までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態７．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、または配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を有する一群の重鎖ＣＤＲ配列を含む、実施形態１から６までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態８．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、配列番号７、８および９のいずれか１つと少なくとも８０％同一である抗体重鎖可変領域配列を含む、実施形態１から７までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態９．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を有する一群の重鎖ＣＤＲ配列を含む、実施形態１から６までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１０．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、配列番号９と少なくとも８０％同一である抗体重鎖可変領域配列を含む、実施形態１から６までおよび９のいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１１．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を有する一群の重鎖ＣＤＲ配列を含む、実施形態１から６までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１２．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、配列番号３４と少なくとも８０％同一である抗体重鎖可変領域配列を含む、実施形態１から６までおよび１１のいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１３．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を有する一群の軽鎖ＣＤＲ配列を含む、実施形態１から１２までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１４．抗ＭＵＣ１抗体モジュールが、配列番号１８と少なくとも８０％同一である抗体軽鎖可変領域配列を含む、実施形態１から１３までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１５．ＩＬ−１５モジュールが、ＩＬ−１５またはその断片、特に、ヒトＩＬ−１５またはその断片を含む、実施形態１から１４までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１６．ＩＬ−１５モジュールが、全長ヒトＩＬ−１５を含む、実施形態１５に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１７．ヒトＩＬ−１５が、配列番号２１のアミノ酸配列を有する、実施形態１５または１６に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１８．ＩＬ−１５モジュールが、受容体結合を低下させる変異を含む、実施形態１から１７までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１９．受容体結合を低下させる変異が、配列番号２１のＩｌｅ６７に対応する位置におけるイソロイシンのグルタミン酸への置換である、実施形態１８に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態２０．ＩＬ−１５モジュールが、ＩＬ−２受容体β鎖、共通γ鎖およびＩＬ−１５受容体α鎖を含むインターロイキン受容体に特異的に結合する、実施形態１から１９までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態２１．ＩＬ−１５モジュールが、ヒトＩＬ−２受容体β鎖、ヒト共通γ鎖およびヒトＩＬ−１５受容体α鎖を含むインターロイキン受容体に特異的に結合する、実施形態１から２０までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態２２．ＩＬ−１５モジュールが、ＩＬ−１５受容体α鎖またはその断片、特に、ヒトＩＬ−１５受容体α鎖またはその断片をさらに含む、実施形態１５から２１までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態２３．ＩＬ−１５受容体α鎖の断片が、ヒトＩＬ−１５受容体α鎖の細胞外ドメインまたはその一部である、実施形態２２に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態２４．ＩＬ−１５受容体α鎖の断片が、ヒトＩＬ−１５受容体α鎖のｓｕｓｈｉドメインまたはその一部である、実施形態２２に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態２５．ＩＬ−１５受容体α鎖またはその断片が、配列番号２２の配列を含む、実施形態２２から２４までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態２６．ＩＬ−１５受容体α鎖またはその断片が、ヒトＩＬ−１５に特異的に結合する、実施形態２２から２５までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態２７．ＩＬ−１５受容体α鎖またはその断片が、ヒトＩＬ−１５またはその断片のＮ末端と融合している、実施形態２２から２６までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態２８．ＩＬ−１５受容体α鎖またはその断片が、ヒトＩＬ−１５またはその断片とペプチドリンカーを介して融合している、実施形態２２から２７までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態２９．ペプチドリンカーが、配列番号３１のアミノ酸配列、特に、配列番号３１のアミノ酸配列の２つまたはそれよりも多く、特に、３つまたは４つのリピートを含む、実施形態２８に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態３０．ペプチドリンカーが、配列番号３１のアミノ酸配列の２つ、３つまたは４つのリピートからなる、実施形態２９に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態３１．ＩＬ−１５モジュールが、配列番号２１のアミノ酸配列を有する、実施形態１から１４までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態３２．ＩＬ−１５モジュールが、配列番号２２のアミノ酸配列および配列番号２１のアミノ酸配列を含む、実施形態１から１４までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態３３．配列番号２２のアミノ酸配列が、配列番号２１のアミノ酸配列のＮ末端である、実施形態３２に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態３４．ＩＬ−１５モジュールが、Ｎ末端からＣ末端まで、配列番号２２のアミノ酸配列、その後、配列番号３１のアミノ酸配列の２つ、３つまたは４つのリピート、その後、配列番号２１のアミノ酸配列を有する、実施形態１から１４までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態３５．ＩＬ−１５モジュールが、変異Ｉｌｅ６７Ｇｌｕを含む配列番号２１のアミノ酸配列を有する、実施形態１から１４までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態３６．ＩＬ−１５モジュールが、抗体モジュールのＣ末端と融合している、実施形態１から３５までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態３７．ＩＬ−１５モジュールが、ＩＬ−１５に結合することができるＩＬ−１５受容体α鎖およびその断片、特に、ＩＬ−１５受容体α鎖の細胞外ドメインおよびＩＬ−１５受容体α鎖のｓｕｓｈｉドメインおよびその断片を含まない、実施形態１から２１までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態３８．融合タンパク質構築物が、それぞれが抗体モジュールの異なる重鎖のＣ末端と融合した２つのＩＬ−１５モジュール含む、実施形態１から３７までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態３９．抗体モジュールの重鎖が、Ｃ末端リシン残基を含まない、実施形態３８に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態４０．抗体モジュールの重鎖が、２つのＣ末端残基、グリシンおよびリシンを含まない、実施形態３８に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態４１．抗体モジュールの重鎖が、３つのＣ末端残基、プロリン、グリシンおよびリシンを含まない、実施形態３８に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態４２．存在する場合、抗体モジュールの重鎖の３つのＣ末端残基、プロリン、グリシンおよびリシンの１つまたは複数が、特に、ロイシンまたはアラニンまたはセリンによって置換されている、実施形態３８から４１までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態４３．融合タンパク質構築物が、それぞれが抗体モジュールの異なる軽鎖のＣ末端と融合した２つのＩＬ−１５モジュールを含む、実施形態１から４２までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態４４．融合タンパク質構築物が、それぞれが抗体モジュールの異なる軽鎖のＮ末端と融合した２つのＩＬ−１５モジュールを含む、実施形態１から４２までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態４５．融合タンパク質構築物が、抗体モジュールとＩＬ−１５モジュールとの間にペプチドリンカーを含む、実施形態１から４４までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態４６．ペプチドリンカーが、配列番号３１のアミノ酸配列、特に、配列番号３１のアミノ酸配列の２つまたはそれよりも多く、特に、２つ、３つまたは４つのリピートを含む、実施形態４５に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態４７．ペプチドリンカーが、配列番号３１のアミノ酸配列の２つ、３つまたは４つのリピートからなる、実施形態４６に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態４８．ペプチドリンカーが、配列番号３２のアミノ酸配列、特に、配列番号３２のアミノ酸配列の２つまたはそれよりも多く、特に、３つまたは６つのリピートを含む、実施形態４５に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態４９．ペプチドリンカーが、配列番号３２のアミノ酸配列の３つまたは６つのリピートからなる、実施形態４８に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態５０．ペプチドリンカーが、追加的なＮ末端プロリン、アスパラギン酸またはアラニン残基をさらに含む、実施形態４５から４９までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態５１．融合タンパク質構築物が、抗体モジュールとＩＬ−１５モジュールとの間にペプチドリンカーを含まない、実施形態１から４４までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態５２．抗体モジュールが、ＣＨ２ドメイン内にＮ−グリコシル化部位を含まない、実施形態１から５１までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態５３．抗体モジュールが、抗体重鎖のＣＨ２ドメイン内にＮ−グリコシル化部位を含む、実施形態１から５１までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態５４．抗体モジュールが、抗体重鎖のＣＨ２ドメインにおいて、コアフコース残基を有するグリカンの相対量が組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも６０％であるグリコシル化パターンを有する、実施形態５３に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態５５．抗体モジュールが、抗体重鎖のＣＨ２ドメインにおいて、コアフコース残基を有するグリカンの相対量が組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の４０％またはそれ未満であるグリコシル化パターンを有する、実施形態５３に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態５６．それとコンジュゲートしたさらなる作用物質を含む、実施形態１から５５までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態５７．さらなる作用物質が、抗体モジュールのポリペプチド鎖またはＩＬ−１５モジュールのポリペプチド鎖と融合したポリペプチドまたはタンパク質である、実施形態５６に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態５８．抗体モジュールが、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖を含み、ＩＬ−１５モジュールが各抗体軽鎖のＣ末端と融合しており、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用物質が各抗体重鎖のＣ末端と融合している、実施形態５７に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態５９．抗体モジュールが、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖を含み、ＩＬ−１５モジュールが各抗体重鎖のＣ末端と融合しており、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用物質が、各抗体軽鎖のＣ末端と融合している、実施形態５７に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態６０．さらなる作用物質が、サイトカイン、ケモカイン、抗体モジュール、抗原結合断片、酵素および結合ドメインからなる群から選択される、実施形態５６から５９までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態６１．実施形態１から６０までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物をコードする核酸。
実施形態６２．実施形態６１に記載の核酸および前記核酸と作用的に接続したプロモーターを含む発現カセットまたはベクター。
実施形態６３．実施形態６１に記載の核酸または実施形態６２に記載の発現カセットもしくはベクターを含む宿主細胞。
実施形態６４．実施形態１から６０までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物ならびに溶媒、希釈剤、および賦形剤からなる群から選択される１つまたは複数のさらなる構成成分を含む医薬組成物。
実施形態６５．医療に使用するための、実施形態１から６０までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物または実施形態６４に記載の医薬組成物。
実施形態６６．がんなどの、異常な細胞成長に関連する疾患；細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症または寄生虫感染症などの感染症；および、免疫不全などの、免疫活性の低下に関連する疾患の処置、予後判定、診断および／またはモニタリングにおいて使用するための、実施形態１から６０までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物または実施形態５８に記載の医薬組成物。
実施形態６７．がんの処置において使用するための、実施形態６６に記載の融合タンパク質構築物または医薬組成物であって、がんが、乳がん、結腸がん、胃がん、肝がん、膵がん、腎がん、血液がん、肺がん、子宮内膜がん、甲状腺がんおよび卵巣がんからなる群から選択される、実施形態６６に記載の融合タンパク質構築物または医薬組成物。
実施形態６８．感染症の処置において使用するための、実施形態６６に記載の融合タンパク質構築物または医薬組成物であって、感染症が、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症および寄生虫感染症からなる群から選択される、実施形態６６に記載の融合タンパク質構築物または医薬組成物。
実施形態６９．
（ｉ）抗ＭＵＣ１抗体モジュールであって、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖を含み、各重鎖がＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、各軽鎖がＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む、抗体モジュールと、
（ｉｉ）それぞれがヒトＩＬ−１５を含む２つのＩＬ−１５モジュールと
を含む融合タンパク質構築物。
実施形態７０．抗体重鎖がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を有する一群の重鎖ＣＤＲ配列を含む、実施形態６９に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態７１．抗ＭＵＣ１抗体モジュールの各ＶＨドメインが、配列番号３４と少なくとも８０％同一である、特に、１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態７０に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態７２．配列番号３３の８位および配列番号３４の５７位のアミノ酸残基が、アスパラギン以外の任意のアミノ酸残基、特に、グルタミンまたはアラニンである、実施形態７０または７１に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態７３．抗体重鎖がそれぞれ、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を有する一群の重鎖ＣＤＲ配列を含む、実施形態６９に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態７４．抗ＭＵＣ１抗体モジュールの各ＶＨドメインが、配列番号８または９と少なくとも８０％同一である、特に、１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態７３に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態７５．抗体軽鎖がそれぞれ、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を有する一群の軽鎖ＣＤＲ配列を含む、実施形態７０から７４までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態７６．抗ＭＵＣ１抗体モジュールの各ＶＬドメインが、配列番号１７または１８、特に、１８と少なくとも８０％同一である、特に、１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態７５に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態７７．抗体重鎖がそれぞれ、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を有する一群の重鎖ＣＤＲ配列を含む、実施形態６９に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態７８．抗ＭＵＣ１抗体モジュールの各ＶＨドメインが、配列番号７と少なくとも８０％同一である、特に、１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態７７に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態７９．抗体軽鎖がそれぞれ、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を有する一群の軽鎖ＣＤＲ配列を含む、実施形態７７または７８に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態８０．抗ＭＵＣ１抗体モジュールの各ＶＬドメインが、配列番号１６と少なくとも８０％同一である、特に、１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態７９に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態８１．抗ＭＵＣ１抗体モジュールの各ＶＨドメインが、配列番号９と少なくとも８０％同一である、特に、１００％同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を有する一群の重鎖ＣＤＲ配列を含む、実施形態６９に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態８２．抗ＭＵＣ１抗体モジュールの各ＶＨドメインが、配列番号９と少なくとも８０％同一である、特に、１００％同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を有する一群の重鎖ＣＤＲ配列を含み、抗体分子が、配列番号９の５７位のアミノ酸残基に対応する配列番号３の８位のアミノ酸残基がＡｓｎ以外の任意の他のアミノ酸残基、特にＧｌｎまたはＡｌａ、特にＧｌｎによって置換されているという変異を含む、実施形態６９に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態８３．抗ＭＵＣ１抗体モジュールの各ＶＬドメインが、配列番号１８と少なくとも８０％同一である、特に、１００％同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を有する一群の軽鎖ＣＤＲ配列を含む、実施形態８１または８２に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態８４．ＩＬ−１５モジュールが、配列番号２１と少なくとも８０％同一である、特に、１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態６９から８３までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態８５．ＩＬ−１５モジュールが、配列番号２２と少なくとも８０％同一である、特に、１００％同一であるアミノ酸配列をさらに含む、実施形態８４に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態８６．配列番号２２と少なくとも８０％同一である、特に、１００％同一であるアミノ酸配列のＣ末端と、配列番号２１と少なくとも８０％同一である、特に、１００％同一であるアミノ酸配列のＮ末端との間に、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の２つ、３つまたは４つのリピートを含むペプチドリンカーを含む、実施形態８５に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態８７．ＩＬ−１５モジュールが、ＩＬ−１５に結合することができるＩＬ−１５受容体α鎖およびその断片、特に、ＩＬ−１５受容体α鎖の細胞外ドメインおよびＩＬ−１５受容体α鎖のｓｕｓｈｉドメインおよびその断片を含まない、実施形態６９から８４までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態８８．ＩＬ−１５モジュールと抗体モジュールとの間にペプチドリンカーが存在する、実施形態６９から８７までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態８９．ＩＬ−１５モジュールが、抗体モジュールの重鎖のＣ末端と融合している、実施形態６９から８８までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態９０．抗体モジュールの重鎖のＣ末端とＩＬ−１５モジュールのＮ末端との間にアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の４つのリピートを含むペプチドリンカーを含む、実施形態８９に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態９１．抗体モジュールの重鎖のＣ末端とＩＬ−１５モジュールのＮ末端との間にアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の３つのリピートを含むペプチドリンカーを含む、実施形態８９に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態９２．抗体モジュールの重鎖のＣ末端とＩＬ−１５モジュールのＮ末端との間にアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の２つのリピートを含むペプチドリンカーを含む、実施形態８９に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態９３．抗体モジュールの重鎖のＣ末端とＩＬ−１５モジュールのＮ末端との間にアミノ酸配列ＰＡＰＡＰ（配列番号３２）の３つのリピートを含むペプチドリンカーを含む、実施形態８９に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態９４．抗体モジュールの重鎖のＣ末端とＩＬ−１５モジュールのＮ末端との間にアミノ酸配列ＰＡＰＡＰ（配列番号３２）の６つのリピートを含むペプチドリンカーを含む、実施形態８９に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態９５．ペプチドリンカーが、追加的なＮ末端プロリン、アスパラギン酸またはアラニン残基をさらに含む、実施形態９０から９４までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態９６．抗体モジュールの重鎖が、Ｃ末端リシン残基を含まない、実施形態８９から９５までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態９７．抗体モジュールの重鎖が、２つのＣ末端残基、グリシンおよびリシンを含まない、実施形態８９から９５までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態９８．抗体モジュールの重鎖が、３つのＣ末端残基、プロリン、グリシンおよびリシンを含まない、実施形態８９から９５までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態９９．存在する場合、抗体モジュールの重鎖の３つのＣ末端残基、プロリン、グリシンおよびリシンの１つまたは複数が別のアミノ酸残基、特に、アラニンまたはロイシンで置換されている、実施形態８９から９８までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１００．ＩＬ−１５モジュールが抗体モジュールの軽鎖のＣ末端と融合している、実施形態６９から８８までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１０１．抗体モジュールの軽鎖のＣ末端とＩＬ−１５モジュールのＮ末端との間にアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の２つ、３つまたは４つのリピートを含むペプチドリンカーを含む、実施形態１００に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１０２．抗体モジュールの軽鎖のＣ末端とＩＬ−１５モジュールのＮ末端との間にアミノ酸配列ＰＡＰＡＰ（配列番号３２）の３つまたは６つのリピートを含むペプチドリンカーを含む、実施形態１００に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１０３．ＩＬ−１５モジュールが抗体モジュールの軽鎖のＮ末端と融合している、実施形態６９から８８までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１０４．抗体モジュールの軽鎖のＮ末端とＩＬ−１５モジュールのＣ末端との間にアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の２つ、３つまたは４つのリピートを含むペプチドリンカーを含む、実施形態１０３に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１０５．各ＩＬ−１５モジュールが、ヒトＩＬ−１５を含み、Ｎ末端がペプチドリンカーを介して異なる重鎖のＣ末端と融合している、実施形態６９から９９までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１０６．各ＩＬ−１５モジュールが、ヒトＩＬ−１５を含み、Ｎ末端がペプチドリンカーを介して異なる軽鎖のＣ末端と融合している、実施形態６９から８８までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１０７．各ＩＬ−１５モジュールが、ヒトＩＬ−１５を含み、Ｃ末端がペプチドリンカーを介して異なる軽鎖のＮ末端と融合している、実施形態６９から８８までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１０８．各ＩＬ−１５モジュールが、ヒトＩＬ−１５を含み、Ｎ末端がペプチドリンカーを介して異なる重鎖のＣ末端と融合しており、重鎖が、Ｃ末端リシン残基を含まない、実施形態６９から９９までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１０９．各ＩＬ−１５モジュールが、ヒトＩＬ−１５を含み、Ｎ末端が異なる重鎖のＣ末端と直接融合しており、重鎖が、Ｃ末端リシン残基を含まない、実施形態６９から８７までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１１０．ＩＬ−１５モジュールが、ヒトＩＬ−１５からなる、実施形態６９から８４までおよび８７から１０９までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１１１．ヒトＩＬ−１５が、配列番号２１のアミノ酸配列を有する、実施形態１１０に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１１２．抗体モジュールが、各抗体重鎖のＣＨ２ドメイン内にＮ−グリコシル化部位を含まない、実施形態６９から１１１までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１１３．抗体モジュールが、ＩＭＧＴ／Ｅｕ番号付け系に従って２９７位に対応する重鎖内の位置にアスパラギン残基を含まない、特に、重鎖にＡｌａ２９７変異を含む、実施形態１１２に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１１４．抗体モジュールが、各抗体重鎖のＣＨ２ドメイン内にＮ−グリコシル化部位を含む、実施形態６９から１１１までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１１５．抗体モジュールが、抗体重鎖のＣＨ２ドメインにおいて、グリコシル化パターンを有し、コアフコース残基を有するグリカンの相対量が、融合タンパク質構築物の組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも６０％、特に、少なくとも６５％または少なくとも７０％である、実施形態１１４に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１１６．抗体モジュールが、抗体重鎖のＣＨ２ドメインにおいて、グリコシル化パターンを有し、コアフコース残基を有するグリカンの相対量が、融合タンパク質構築物の組成物中の抗体モジュールのＣＨ２ドメインに結合したグリカンの総量の４０％もしくはそれ未満、特に、３０％もしくはそれ未満または２０％もしくはそれ未満である、実施形態１１４に記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１１７．がんなどの、異常な細胞成長に関連する疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症または寄生虫感染症などの感染症および免疫不全の処置における使用のための、実施形態６９から１１６までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１１８．卵巣がん、トリプルネガティブ乳がんなどの乳がん、肺がんまたは膵がんの処置における使用のための、実施形態６９から１１６までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１１９．がんの処置においてＭＵＣ１およびＣＤ３を標的とする二重特異性抗体と組み合わせて使用するための、実施形態１から６０までおよび６９から１１６までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１２０．がんの処置においてＰＤ−Ｌ１に対する抗体と組み合わせて使用するための、実施形態１から６０までおよび６９から１１６までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１２１．がんの処置においてトムゾツキシマブまたはセツキシマブなどのＥＧＦＲに対する抗体と組み合わせて使用するための、実施形態１から６０までおよび６９から１１６までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
実施形態１２２．がんの処置においてＣＤ４０に対する抗体と組み合わせて使用するための、実施形態１から６０までおよび６９から１１６までのいずれか１つに記載の融合タンパク質構築物。
図１は、抗ＭＵＣ１抗体（αＭＵＣ１）の重鎖のＣ末端または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合させた、野生型ＩＬ−１５（ＩＬ−１５ｗｔ）、受容体結合を低下させる変異を有するＩＬ−１５（ＩＬ−１５ｍｕｔ）またはＩＬ−１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインとＩＬ−１５の組合せ（ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉ）を含む、種々の融合タンパク質構築物を示す図である。
図２は、ＥＬＩＳＡによって分析される腫瘍特異性の評価基準として、グリコシル化されたＭＵＣ１ペプチドおよびグリコシル化されていないＭＵＣ１ペプチドへのＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔの抗原結合特性を例示するグラフである。ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１（ＰａｎｋｏＭａｂ）を対照として使用した。
図３は、フローサイトメトリーによって分析された、ＴＡ−ＭＵＣ１を発現する腫瘍細胞株Ｔ−４７ＤへのＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインの結合を示すグラフである。αＭＵＣ１−ＩＬ−１５構築物を、標的細胞に結合しない抗体を伴う同様の融合構築物（ＭＯＰＣ−ＩＬ−１５ｗｔ／ｓｕｓｈｉ）と比較した。ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１（ＰａｎｋｏＭａｂ）を参照として使用した。
図４は、フローサイトメトリーによって分析された、ＰＡＮＣ−１における腫瘍細胞により発現されたＴＡ−ＭＵＣ１へのＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔの結合を示すグラフである。ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１（ＰａｎｋｏＭａｂ）および無関係のヒトＩｇＧ１をそれぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。
図５は、ＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインのＩＬ−１５受容体ドメインＩＬ−１５Ｒα（Ａ）およびＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβ（Ｂ）への結合を示すグラフである。結合をＥＬＩＳＡによって分析した。ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１（ＰａｎｋｏＭａｂ）を対照として使用した。
図６は、ＥＬＩＳＡによって分析された、ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔのＩＬ１５受容体サブユニットＩＬ１５ＲαおよびＩＬ１５Ｒβへの結合を示すグラフである。ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１（ＰａｎｋｏＭａｂ）を対照として使用した。
図７は、競合Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイによって分析された、機能性Ｆｃ部分を有する、および有さないＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインのＦｃガンマ受容体ＩＩＩａへの結合を示すグラフである。ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１（ＰａｎｋｏＭａｂ）を対照として使用した。
図８は、ＰＢＭＣの存在下でのＴＡ−ＭＵＣ１陰性ジャーカット細胞株に対するＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインによる天然の細胞傷害の誘導を示すグラフである。５時間後に細胞傷害をユウロピウム放出アッセイによって分析した。ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１（ＰａｎｋｏＭａｂ）を対照として使用した。
図９は、融合タンパク質構築物によって開始された標的細胞に対する免疫細胞媒介性抗体媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示すグラフである。ＮＫ細胞およびＴ細胞を含有するＰＢＭＣを、ＭＵＣ１＋Ｔ４７Ｄ標的細胞の存在下で、異なるαＭＵＣ１−ＩＬ−１５構築物と一緒にインキュベートした。融合タンパク質構築物の濃度に応じた標的細胞の特異的溶解を決定した。ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１を対照として使用した。
図１０は、融合タンパク質構築物によって開始された標的細胞に対する免疫細胞媒介性ＡＤＣＣを示すグラフである。ＮＫ細胞およびＴ細胞を含有するＰＢＭＣを、ＭＵＣ１＋Ｏｖｃａｒ−３標的細胞の存在下で、異なるαＭＵＣ１−ＩＬ−１５構築物と一緒にインキュベートした。融合タンパク質構築物の濃度に応じた標的細胞の特異的溶解を決定した。αＭＵＣ１−ＩＬ−１５構築物を、等価の標的とされない対照構築物（ＭＯＰＣ−ＩＬ−１５ｗｔ／ｓｕｓｈｉ）と比較した。ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１を対照として使用した。
図１１は、ＰＢＭＣの存在下での、ＴＡ−ＭＵＣ１陽性ＭＣＦ−７乳がん細胞に対するＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインによるＡＤＣＣの誘導を示すグラフである。細胞傷害を２４時間後にＬＤＨ放出アッセイによって分析した。ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１（ＰａｎｋｏＭａｂ）を対照として使用した。
図１２は、ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔによるＴＡ−ＭＵＣ１を発現するＣａＯＶ−３腫瘍細胞に対する細胞傷害の誘導を示すグラフである。異なるドナー由来のＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した。殺滅をＬＤＨ放出アッセイによって決定した。
図１３は、ＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインにより、免疫抑制性腫瘍環境を模倣する、ＴＡ−ＭＵＣ１を発現する３Ｄ腫瘍スフェロイドへの免疫細胞の浸潤が誘導されることを示すグラフである。ＰＢＭＣおよび免疫サイトカインまたは緩衝液対照としてＰＢＳと２日間共培養したスフェロイドを免疫組織化学的検査によって分析して、処置後の腫瘍内のＣＤ４５またはＣＤ３陽性免疫細胞の数を決定した。
図１４は、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５−ｗｔ ＮＡによるＴＡ−ＭＵＣ１を発現する３Ｄ腫瘍スフェロイドへの免疫細胞の浸潤の誘導を例示するグラフである。ＰＢＭＣおよび免疫サイトカイン、ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１（ＰａｎｋｏＭａｂ）または緩衝液対照としてＰＢＳと２日間共培養したスフェロイドを免疫組織化学的検査によって分析して、処置後の腫瘍内のＣＤ４５またはＣＤ８陽性免疫細胞の数を決定した。
図１５は、融合タンパク質構築物によるＮＫ細胞（Ａ）およびＮＫＴ細胞（Ｂ）の活性化を示すグラフである。ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を含有するＰＢＭＣを、αＭＵＣ１−ＩＬ−１５構築物の存在下でインキュベートした。ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の活性化をＣＤ６９発現によって決定した。ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１（ＰａｎｋｏＭａｂ）を対照として使用した。
図１６は、融合タンパク質構築物によるＮＫ細胞（Ａ）、ＮＫＴ細胞（Ｂ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｃ）の増殖を示すグラフである。ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含有するＰＢＭＣを、αＭＵＣ１−ＩＬ−１５構築物の存在下でインキュベートした。免疫細胞の増殖を、分裂した細胞のパーセンテージによって決定した。ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１（ＰａｎｋｏＭａｂ）を対照として使用した。 同上。
図１７は、異なる免疫細胞集団に対するＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔの刺激特性を実証するグラフである。ＮＫ細胞およびＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞における活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９をフローサイトメトリーによって分析した。ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１（ＰａｎｋｏＭａｂ）および抗体を添加していない培地を対照として使用した。
図１８は、フローサイトメトリーにより活性化マーカー発現を検出することによって分析された、ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔによるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含むメモリーＴ細胞サブセットおよびエフェクターＴ細胞サブセットの活性化を示すグラフである。ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１（ＰａｎｋｏＭａｂ）および抗体を添加していない培地を対照として使用した。
図１９は、フローサイトメトリーによって分析された、ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔによるＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖の誘導を示すグラフである。ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１（ＰａｎｋｏＭａｂ）および抗体を添加していない培地を対照として使用した。
図２０は、健康ドナーのＰＢＭＣによる、ＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインと一緒にインキュベートした後のサイトカイン放出の誘導を示すグラフである。培地、ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１（ＰａｎｋｏＭａｂ）およびＯＫＴ３は、サイトカイン放出なし、ほんの中程度のサイトカイン放出または高いサイトカイン放出についての対照としての機能を果たした。ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦの分泌を電気化学発光によって分析した。
図２１は、腫瘍微小環境における免疫抑制状態を模倣するためにＮＫ細胞およびＴ細胞をサイトカインＴＧＦ−βで予め処理した後の、ＰＭ ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔによるこれらの免疫細胞の再活性化を示すグラフである。免疫サイトカインまたは培地対照を用いた処理後のＮＫ細胞およびＴ細胞の再活性化を、フローサイトメトリーにより活性化マーカーを分析することによって決定した。
図２２は、トランスウェルに基づく走化性アッセイで分析された、免疫細胞サブセットにおけるＰＭ ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔの走化特性を示すグラフである。上側チャンバーから刺激性免疫サイトカインまたは標的とされないＩＬ−１５を含有する下側チャンバーに遊走するＮＫ細胞（Ａ）、ＮＫＴ細胞（Ｂ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｃ）の数をフローサイトメトリーによって決定した。結果は無処理の対照に関連する走化性指数として表される。 同上。
図２３は、種々の融合タンパク質構築物の循環半減期を示すグラフである。αＭＵＣ１−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡおよびαＭＵＣ１−ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉ ＮＡをマウスに注射し、これらの構築物の血漿中濃度を８日間モニタリングした。構築物の算出された循環半減期が示されている。
図２４は、マウスモデルにおけるＴ細胞の数に対する種々の融合タンパク質構築物の効果を示すグラフである。αＭＵＣ１−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡおよびαＭＵＣ１−ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉ ＮＡをマウスに注射し、血液試料を投与前および注射の８日後に分析した。マウスの血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞の数を、ＰＢＭＣをＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８について染色することによって決定した。
図２５は、ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔの、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの単回用量ｉ．ｖ．注射後のｉｎ ｖｉｖｏにおける薬物動態（ＰＫ）挙動を示すグラフである。マウス３匹の群からの、異なる時点でＥＬＩＳＡによって決定された血清中濃度（Ａ）、ならびに、算出されたＰＫパラメーターである終末血清中半減期（ｔ１／２）および曲線下面積（ＡＵＣ）（Ｂ）がプロットされている。
図２６は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、免疫サイトカインＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔまたは緩衝液対照としてＰＢＳを単回用量ｉ．ｖ．投与した後のｉｎ ｖｉｖｏにおける薬力学的（ＰＤ）効果を示すグラフである。リンパ器官である脾臓および鼠径リンパ節（ｉｎｇＬＮ）における、処置により誘導されたＰＤ効果をフローサイトメトリーによって分析した。これらの器官における総細胞の増加はＡ＋Ｄで示され、異なる免疫細胞集団の相対的な割合はＢ＋Ｅで示され、一方、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の最終的な選択的増加はＣ＋Ｆで示される。 同上。
図２７（Ａ）は、図２６について記載されているものと同じモデルにおいてフローサイトメトリーによって分析された、ＰＢＳ対照と比較した、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔを用いた単回投与処置によるＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ比の増加を示すグラフである。（Ｂ）は、ＣＤ８＋集団における異なるＴ細胞サブセットの相対的な割合に対する処置の影響を示すグラフである。脾臓におけるＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｃ）およびＮＫ細胞（Ｄ）におけるＩＣＯＳ、ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１２２（ＩＬ−２／１５Ｒβ）の発現を処置後にフローサイトメトリーによって決定した。
図２８は、免疫サイトカインまたは緩衝液対照としてＰＢＳを用いた処置後のこれらのマウスの血清試料中のＥＬＩＳＡによって決定されたサイトカインＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの濃度を示すグラフである。
図２９は、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡを用いた処置の、末梢血中の免疫細胞に対する長期のＰＤ効果を示すグラフである。ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、顆粒球および単球の相対的な割合を、免疫サイトカインを用いた処置前（０日目）および免疫サイトカインを用いた処置後（１１日目）にフローサイトメトリーによって決定した。
図３０は、フローサイトメトリーによって分析された、種々のＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ構築物のＺＲ−７５−１において腫瘍細胞により発現されたＴＡ−ＭＵＣ１への結合を示すグラフである。ＩＬ−１５を伴わないαＭＵＣ１（ＰａｎｋｏＭａｂ）を陽性対照として使用した。
図３１は、ＥＬＩＳＡによって分析された、種々のＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ構築物のＩＬ−１５Ｒαサブユニット（ＣＤ２１５）への結合を示すグラフである。
図３２は、組換えＩＬ−１５と比較した、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳおよび−Ｃκ４ＧＳに応答したＣＴＬＬ−２およびＫＨｙＧ−１ ｍＣＤ１６の増殖を示すグラフである。
図３３は、組換えＩＬ−１５と比較した、異なる免疫細胞集団に対するＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳおよび−Ｃｋ４ＧＳの刺激特性を実証するグラフである。活性化マーカーＣＤ２５をＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞においてフローサイトメトリーによって分析した。抗体を添加していない培地を対照として使用した。
図３４は、組換えＩＬ−１５と比較した、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳおよびＣκ４ＧＳによるＴＡ−ＭＵＣ１を発現するＣａＯＶ−３腫瘍細胞に対する細胞傷害の誘導を示すグラフである。腫瘍細胞殺滅をＬＤＨ放出アッセイによって決定した。
図３５は、Ｃ５７ＢＬ／６への単回用量ｉ．ｖ．注射後のＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳおよび−Ｃκ４ＧＳのｉｎ ｖｉｖｏにおける薬物動態（ＰＫ）挙動を示すグラフである。マウス３匹の群から算出されたＰＫパラメーターが示されている（終末血清中半減期（ｔ１／２）および曲線下面積（ＡＵＣ））。
図３６は、免疫サイトカインＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳおよびＰＭ−ＩＬ−１５−Ｃκ４ＧＳの単回用量ｉ．ｖ．投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏにおける薬力学的（ＰＤ）効果を示すグラフである。免疫サイトカインを用いた処置前（０日目）および免疫サイトカインを用いた処置後（１１日目）に、血液中のＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の相対的な割合ならびに両方の細胞サブセットにおけるＣＤ１２２（ＩＬ１５Ｒβサブユニット）発現の相対的な割合をフローサイトメトリーによって決定した。
図３７は、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳおよび−Ｃκ４ＧＳをｉ．ｖ．およびｓ．ｃ．で用いた処置の、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ４＋Ｔ細胞集団およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団における異なるエフェクターおよびメモリーＴ細胞サブセットの相対的な割合に対する影響を示すグラフである。
図３８は、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳの、腫瘍体積およびＴＡ−ＭＵＣ１陽性４Ｔ１マウス腫瘍細胞を生着させたマウスの生存に対する治療効果を示すグラフである。
図３９は、ＣａＯＶ−３標的細胞の存在下で免疫サイトカインＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳと、ＴＡ−ＭＵＣ１を標的とするＴ細胞誘導二重特異性（ＰＭ−ＣＤ３）とを組み合わせた場合に、免疫細胞活性化に対して見いだされた相乗効果を示すグラフである。ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）における活性化マーカーＣＤ２５の処置により誘導された発現を２日後にフローサイトメトリーによって決定した。
図４０は、ＣａＯＶ−３標的細胞の存在下で免疫サイトカインＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔと、ＴＡ−ＭＵＣ１を標的とするＴ細胞誘導二重特異性（ＰＭ−ＣＤ３）とを組み合わせた場合に、Ｔ細胞増殖に対して見いだされた相乗効果を示すグラフである。ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）の処置により誘導された増殖を５日後にフローサイトメトリーによって決定した。
図４１は、免疫サイトカインＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡまたはＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔと、ＴＡ−ＭＵＣ１を標的とするＴ細胞誘導二重特異性（ＰＭ−ＣＤ３）とを組み合わせた処置後に、ＣａＯＶ−３腫瘍細胞に対するＰＢＭＣ媒介性細胞傷害に対して見いだされた相乗効果を示すグラフである。細胞傷害を２４時間後にＬＤＨ放出アッセイによって決定した。（Ａ）は、絶対的な特異的溶解を示し、（Ｂ）は、免疫サイトカイン自体によって誘導される溶解を差し引いた後の相乗作用をさらに強調するものであり、（Ｃ）は、１μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬの免疫サイトカインを組み合わせた処置後の効果を示す。 同上。
図４２は、２０ｎＭのＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳと一緒に２日間インキュベートした後の、対照と比較したＨＳＣ−４腫瘍細胞および単球におけるＰＤ−Ｌ１の発現を示すグラフである。
図４３は、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳと、ＰＤ−Ｌ１を標的とする抗体Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標）とを組み合わせた処置後に、ＨＳＣ−４腫瘍細胞に対するＰＢＭＣ媒介性細胞傷害に対して見いだされた相乗効果を示すグラフである。細胞傷害を２４時間後にＬＤＨ放出アッセイによって決定した。
図４４は、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳと、ＰＤ−Ｌ１を標的とする抗体Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標）とを組み合わせた処置後に、混合リンパ球反応におけるＴ細胞活性化に対して見いだされた相乗効果を示すグラフである。
図４５は、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳと、ＥＧＦＲを標的とする抗体Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）およびＣｅｔｕＧＥＸ（登録商標）とを組み合わせた処置後の、ＨＳＣ−４腫瘍細胞に対するＰＢＭＣ媒介性細胞傷害に対して見いだされた相乗効果を示すグラフである。細胞傷害を２４時間後にＬＤＨ放出アッセイによって決定した。
図４６は、糖最適化（ｇｌｙｃｏ−ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）抗ＣＤ４０ ｈＩｇＧ１抗体を用いた処置後のＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２１５の発現を示すグラフである。
（実施例１）
ＭＵＣ１およびＩＬ−１５に特異的に結合する融合タンパク質構築物の産生。
ＭＵＣ１特異的結合部分およびＩＬ−１５機能部分からなる融合タンパク質構築物を創製した。ＭＵＣ１結合部分は、典型的な抗体Ｙ形状を有するヒト化全長ＩｇＧ１抗体分子ＰａｎｋｏＭａｂ（ガチポツズマブ）である。抗ＭＵＣ１抗体は、ＣＨ２ドメイン内に天然のグリコシル化部位（ＰＭ）を含むか、または、重鎖内に、グリコシル化を消滅させるＮ２９７Ａ変異を有する（ＰＭ ＮＡ）。ＣＨ２ドメイン内にグリコシル化がないと、抗体は、Ｆｃγ受容体に結合せず、ＡＤＣＣを誘導することができない（Ｆｃサイレンシングバリアント）。ＩＬ−１５機能は、野生型配列（ＩＬ−１５ｗｔ）または受容体結合を低下させる変異Ｉ６７Ｅ（ＩＬ−１５ｍｕｔ）を有する全長ヒトＩＬ−１５を融合することによって実現される。１つの構築物では、ＩＬ−１５ｗｔにはＩＬ−１５受容体α鎖のｓｕｓｈｉドメインが付随する（ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉ）。構築物の一般構造を図１に示す。
Figure 2021514625
これらの構築物では、各抗体重鎖のＣ末端に１つのＩＬ−１５が（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーを介して融合している。ＩＬ−１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインが存在する場合、これは、抗体重鎖のＣ末端とＩＬ−１５のＮ末端との間に、融合パートナー間の（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーで融合している。
Figure 2021514625
これらの構築物では、各抗体軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に１つのＩＬ−１５ｗｔが（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４もしくは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１リンカーを介して融合している；または各抗体重鎖のＣ末端に１つのＩＬ−１５が（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーを介して融合している、もしくはいかなるリンカーもなしに直接融合しており、重鎖の末端リシン残基は欠失していた。ＰａｎｋｏＭａｂはＣＨ２ドメインにおいてグリコシル化されている。ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳは表１のＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔに対応する。
構築物をヒト骨髄性白血病由来細胞株ＮＭ−Ｈ９Ｄ８（ＤＳＭ ＡＣＣ２８０６）において発現させ、それにより、ＰａｎｋｏＭａｂ ＣＨ２ドメイン内に約９０％フコシル化グリカンを有するヒトグリコシル化パターンを有する構築物を産生させた。さらに、構築物を関連する細胞株ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２（ＤＳＭ ＡＣＣ２８５６）において産生させ、それにより、ｗｔ構築物のＰａｎｋｏＭａｂ ＣＨ２ドメイン内に約１０％というフコシル化の量が少ないグリコシル化された構築物をもたらすこともできる。
Figure 2021514625
Figure 2021514625
構築物をヒト骨髄性白血病由来細胞株ＮＭ−Ｈ９Ｄ８（ＤＳＭ ＡＣＣ２８０６）および酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ／ｄｈＦｒ−において発現させた。さらに、構築物を、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８関連細胞株ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２（ＤＳＭ ＡＣＣ２８５６）において産生させ、それにより、ｗｔ構築物のＰａｎｋｏＭａｂ ＣＨ２ドメイン内に約１０％というフコシル化の量が少ないグリコシル化された構築物をもたらすこともできる。
異なるＰａｎｋｏＭａｂおよびＩＬ−１５バリアントの分析
（実施例２）
抗原結合
グリコシル化されたＭＵＣ１ペプチドおよびグリコシル化されていないＭＵＣ１ペプチドへのＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔの抗原結合特性を、ＥＬＩＳＡを使用してＰａｎｋｏＭａｂと比較した。ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔはどちらもグリコシル化されたＭＵＣ１ペプチドにＰａｎｋｏＭａｂと同程度に結合するが、グリコシル化されていないＭＵＣ１ペプチドへの有意な結合はない（図２）。これにより、両方のＰＭ−ＩＬ１５構築物の十分な腫瘍特異性が示される。
ＰＭ−ＩＬ１５免疫サイトカインの種々のバリアントの細胞表面ＴＡ−ＭＵＣ１への結合特性を、ＴＡ−ＭＵＣ１を強力に発現する乳がん細胞株Ｔ−４７Ｄを使用して分析した。腫瘍細胞を、示されている抗体の段階希釈物と一緒にインキュベートし、結合した抗体を、フィコエリトリンとコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（重鎖および軽鎖）抗体を使用して検出した。結合をフローサイトメトリーによって分析した。全てのＰＭ−ＩＬ１５免疫サイトカインが、ＩＬ１５バリアントの結合またはＦｃドメインのグリコシル化（図３ＡのＦｃ機能的バリアント、図３ＢのＦｃサイレンシングバリアント）とは関係なく、Ｔ−４７Ｄ細胞への強力な結合を示す。結合特性（ＥＣ５０、％最大結合）はＰａｎｋｏＭａｂと同一であった。さらに、ＴＡ−ＭＵＣ１に対して、対照構築物ＭＯＰＣ−ＩＬ１５（無関係のＦａｂドメイン）の結合は検出されなかったので、ＰＭ−ＩＬ１５免疫サイトカインの結合は高度に特異的であった。
ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔの細胞表面ＴＡ−ＭＵＣ１への結合を、ＴＡ−ＭＵＣ１を強力に発現する腫瘍細胞株Ｐａｎｃ−１を使用したフローサイトメトリーによってさらに評価した。Ｐａｎｃ−１細胞を、異なる濃度のＰＭ−ＩＬ１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡと一緒にインキュベートし、ＰａｎｋｏＭａｂと比較した。ヒトＩｇＧ対照を、バックグラウンド染色に対する対照のために含めた。結合した抗体を、フィコエリトリンとコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（重鎖および軽鎖）抗体を使用して検出した。ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔの両方がＴＡ−ＭＵＣ１を発現するＰａｎｃ−１細胞への強力かつ特異的な結合を示し、結合特性（ＥＣ５０、％最大）はＰａｎｋｏＭａｂと完全に同一であった（図４）。
（実施例３）
ＩＬ−１５受容体結合
ＩＬ−１５受容体への結合特性を、具体例としてＦｃサイレンシングＮＡバリアントを用いてＥＬＩＳＡによって分析した。ＩＬ−１５ＲαまたはＩＬ−１５Ｒβ（ＩＬ−２ｒβ、ＣＤ１２２）のいずれかを９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートにコーティングした。段階希釈したＰＭ−ＩＬ１５免疫サイトカインをインキュベートし、結合した免疫サイトカインを、ペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片特異的抗体と一緒にインキュベートすることによって検出した。ＰＭ−ＩＬ１５ｓｕｓｈｉ ＮＡに関してはＩＬ−１５Ｒαへの結合は検出可能でなく、ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡは、ＩＬ−１５ＲαにＰＭ−ＩＬ１５ｍｕｔ ＮＡと比較して高い親和性で結合する（図５Ａ）。ＩＬ−１５Ｒβへの結合を分析することにより、ＰＭ−ＩＬ１５ｍｕｔ ＮＡがＩＬ−１５受容体のＩＬ−１５Ｒβ鎖に結合することができないことが明らかになった（図５Ｂ）。ＰＭ−ＩＬ１５ｓｕｓｈｉ ＮＡバリアントはＩＬ−１５Ｒβに対してＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡよりも強力な結合を示した。
ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡのＩＬ−１５Ｒα（ＣＤ２１５）およびＩＬ−１５Ｒβ（ＩＬ−２ｒβ、ＣＤ１２２）に結合する能力を、上記の通り、ＩＬ−１５ＲαまたはＩＬ−１５Ｒβのいずれかのコーティング後にＥＬＩＳＡによって比較した。ＩＬ−１５Ｒβへの結合を分析することにより、ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔがＣＤ１２２に対してＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡよりも明白に強力な結合を有することが明らかになり、これにより、特にＮＫ細胞に対してＰＭ−ＩＬ１５ｗｔの活性がより高いことを説明することができた（図６Ａ）。ＩＬ−１５Ｒαへの結合は両方の構築物間で同等であった（図６Ｂ）。
（実施例４）
ＦｃγＲＩＩＩａ結合
ＰＭ−ＩＬ１５免疫サイトカインの、抗体ＦｃドメインのＦｃγＲＩＩＩａへの結合を分子レベルで特徴付けるために、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）技術に基づくＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）についてのＦｃγＲ結合アッセイを使用した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）プラットフォームは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒのシンプルビーズに基づく技術に依拠し、従来のＥＬＩＳＡに対するより効率的な代替である。
Ｈｉｓタグが付されたＦｃγＲＩＩＩａ（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ）をＮｉ−キレートドナービーズによって捕捉する。試験ＰＭ−ＩＬ１５免疫サイトカインとウサギ抗マウスカップリングアクセプタービーズはＦｃγＩＩＩａへの結合について競合する。ＦｃγＲＩＩＩａとウサギ抗マウスアクセプタービーズとの相互作用の場合、ドナービーズおよびアクセプタービーズは極めて近傍になり、これにより、６８０ｎｍでレーザー励起されると、化学発光による光の放出がもたらされる。競合剤がなければ最大シグナルが実現される。試験抗体がＦｃγＲＩＩＩａに結合する競合の場合、最大シグナルは濃度依存的に低下する。化学発光を、ＥｎＳｐｉｒｅ ２３００マルチラベルリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用した５２０〜６２０ｎｍにおける測定によって定量した。全ての結果を２連の試料の平均±標準偏差として表した。結果として、上部プラトー、下部プラトー、傾き、およびＥＣ５０によって定義される濃度依存的なＳ字状の用量反応曲線を受け取った。
図７に示されている通り、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔは、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＧＥＸと同等のＦｃγＲＩＩＩａ結合を示すが、Ｆｃ変異Ｎ２９７ＡバリアントＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡはいかなるＦｃγＲＩＩＩａ結合も示さない。
（実施例５）
天然の細胞傷害の誘導
ＩＬ−１５により免疫細胞による天然の細胞傷害を増強することできることが記載されている。ＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインにより天然の細胞傷害を誘導することができるかどうかを試験するために、白血病ジャーカットＴ細胞株を標的細胞として使用し、健康ドナーのＰＢＭＣをエフェクターとして使用した。ジャーカット細胞は、天然の細胞傷害に対して感受性であることが記載されており、ＴＡ−ＭＵＣ１を発現しない。天然の細胞傷害アッセイをユウロピウム（Ｅｕ）放出アッセイとして実施した。ジャーカット細胞にユウロピウムを電気穿孔によってロードし、アッセイプレートに播種した。エフェクター対標的細胞比８０：１のＰＢＭＣ、および試験免疫サイトカインの希釈物を添加した。全ての試料を３連で分析した。最大ユウロピウム放出対照（ＭＲ）として、標的細胞をトリトン（登録商標）Ｘ−１００に溶解させた。基礎ユウロピウム放出（ＢＲ）を、標的細胞上清を含有するウェルから測定した。最後に、標的細胞による自然ユウロピウム放出（ＳＲ）に標的細胞のみを含有する対照によって対処した。全ての対照を６連で分析した。５時間インキュベートした後、上清を回収し、ＤＥＬＦＩＡ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎと一緒にインキュベートした後、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００マイクロプレートリーダーにおいて３４０ｎｍでの励起（extinction）および６１ｎｍでの放出を測定し、放出されたユウロピウムを決定した。
特異的な細胞傷害を以下の通り算出した：
％特異的溶解＝（実験放出−自然放出）／（最大放出−基礎放出）×１００。
図８に示されている通り、試験したＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインの全てにより、ジャーカットＴ細胞に対する免疫細胞による天然の細胞傷害がＰａｎｋｏＭａｂと比較して増加する。天然の細胞傷害の誘導の強度は、ＩＬ−１５モジュールに依存し（ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉ＞ＩＬ−１５ｗｔ＞ＩＬ−１５ｍｕｔ）、機能性Ｆｃドメインを有するバリアントはＦｃサイレンシングバリアントと比較して高い効力を有する。
（実施例６）
ＡＤＣＣアッセイ１
免疫細胞媒介性抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、抗腫瘍抗体の主要な機構である。抗体構築物は、ＴＡ−ＭＵＣ１を介して腫瘍細胞に結合した後、ＮＫ細胞およびＴ細胞を２つの異なる機構によって活性化する。一方では、抗体のＦｃ領域が免疫細胞の表面上のＦｃγ受容体ＩＩＩａに結合し、他方では、構築物のＩＬ−１５部分がＩＬ−２受容体β鎖および共通γ鎖によって形成されるインターロイキン受容体に結合する。活性化された免疫細胞により、ＴＡ−ＭＵＣ１＋腫瘍細胞の細胞死を促進するパーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞傷害顆粒が放出される。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ＡＤＣＣアッセイをユウロピウム（Ｅｕ）放出アッセイとして実施した。生存率が８０％を超える、ＭＵＣ−１を発現するＴ４７Ｄ標的細胞３×１０６個を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、低温ユウロピウム緩衝液１００μＬに再懸濁させた。氷上で１０分間インキュベートした後、細胞にＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて電気穿孔した。電気穿孔された細胞を再度氷上で１０分間インキュベートした後、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋５％（ｖ／ｖ）熱失活ＦＣＳ）で６回洗浄した。標的細胞を計数し、アッセイ培地中に１ｍＬ当たり細胞５×１０４個まで希釈し、１００μＬ／ウェルで抗体希釈物または培地対照に添加した。アッセイ培地中、１０倍濃縮した抗体希釈物を調製し、２０μＬ／ウェルで９６ウェル丸底プレートに移した。ＰＢＭＣを単離し、アッセイ培地中に１ｍＬ当たり細胞５×１０６個の密度まで再懸濁させた。８０μＬ／ウェルのエフェクター細胞を、標的細胞および抗体希釈物または培地を含有するアッセイプレートに移した。全ての試料を３連で分析した。
最大ユウロピウム放出対照（ＭＲ）として、１００μＬ／ウェルの標的細胞に、８０μＬ／ウェルの培地および２０μＬ／ウェルの１０％（ｖ／ｖ）トリトン（登録商標）Ｘ−１００を補充した。基礎ユウロピウム放出（ＢＲ）を１００μＬのアッセイ培地および１００μＬの標的細胞上清を含有するウェルから測定した。最後に、標的細胞による自然ユウロピウム放出（ＳＲ）に１００μＬのアッセイ培地および１００μＬの標的細胞を含有する対照によって処理した（addressed my controls）。全ての対照を６連で分析した。
プレートを３００×ｇで短時間遠心分離し、標準の細胞培養条件で４〜５時間インキュベートした。アッセイウェルの上清のユウロピウムレベルを測定するために、プレートを３００×ｇで５分間遠心分離し、２５μＬ／ウェルの上清を、２００μＬ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを供給した白色９６ウェル平底プレートに移した。プレートを暗闇中で１０分間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００マイクロプレートリーダーを用い、３４０ｎｍでの励起および６１ｎｍでの放出で蛍光を測定した。
特異的な細胞傷害を以下の通り算出した：
％特異的溶解＝（実験放出−自然放出）／（最大放出−基礎放出）×１００。
％自然溶解＝（自然放出−基礎放出）／（最大放出−基礎放出）×１００。
ＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用して、種々の融合タンパク質構築物によりＭＵＣ−１を発現する腫瘍細胞株Ｔ４７Ｄの標的細胞溶解が示された。異なる構築物の活性は異なるＥＣ５０値（最大半量の溶解を実現するために必要な構築物の濃度）によって示される。予測通り、ＩＬ−１５に加えてＩＬ−１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインを含む構築物は、ＩＬ−１５ｗｔを単独で有する構築物よりも活性が高く、ＩＬ−１５ｗｔを単独で有する構築物は、変異したＩＬ−１５ Ｉ６７Ｅを有する構築物よりも活性が高い（図９参照）。抗体のＦｃ領域の効果は、ＰａｎｋｏＭａｂ ｗｔとＰａｎｋｏＭａｂ ＮＡ構築物を比較することによって示される。驚いたことに、抗体Ｆｃ領域を介した免疫細胞活性化を伴わない場合であっても、非常に強力な溶解活性を観察することができた（ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉ ＮＡ）。変異したＩＬ−１５を有するＰａｎｋｏＭａｂ ＮＡ構築物以外は、全ての構築物がネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ抗体よりも活性が高かった。
構築物を腫瘍細胞に結合しない抗体を有する同様の構築物（ＭＯＰＣ）と比較することによって実証された通り、融合タンパク質構築物の抗原結合がＡＤＣＣ効果のために重要である。ＭＵＣ−１を発現するＯｖｃａｒ−３腫瘍細胞株を標的細胞として使用した。ＭＯＰＣ構築物は強力に低下したＡＤＣＣ活性を示す（図１０参照）。
さらなるＡＤＣＣアッセイにおいて、ＭＣＦ−７細胞を標的細胞として使用した。ＴＡ−ＭＵＣ１陽性ＭＣＦ−７腫瘍細胞をアッセイプレート中で２４時間成長させた後、刺激していないＰＢＭＣをエフェクター対標的細胞比１０：１で添加した。示されている濃度の免疫サイトカインを添加し、２４時間後に、細胞の上清中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を定量することによって腫瘍細胞殺滅を評価した（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＬＤＨ）、Ｒｏｃｈｅ）。標的細胞をトリトン（登録商標）−Ｘ−１００と一緒にインキュベートすることによって最大放出を実現し、また、標的細胞およびＰＢＭＣのみを含有し、抗体を含有しない試料において抗体に依存しない細胞死を測定した。
予測通り、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインを含む構築物は、ＩＬ−１５ｗｔを単独で有する構築物よりも活性が高い（図１１参照）。驚いたことに、抗体Ｆｃ領域を介した免疫細胞活性化を伴わない場合であっても強力な溶解活性を観察することができた（ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉ ＮＡ）。試験した免疫サイトカインの全てが、１０：１という低Ｅ：Ｔ比でほんの中程度のＡＤＣＣ活性しか示さないネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ抗体よりも活性が高かった。
（実施例７）
ＡＤＣＣアッセイ２
腫瘍細胞に対する細胞傷害は、免疫治療薬によって誘導されるべき主要な機構の１つである。ＴＡ−ＭＵＣ１を標的とするＩＬ−１５に基づく免疫サイトカインを使用することによってＩＬ−１５を腫瘍細胞に向けることにより、免疫細胞の活性化がもたらされ、グランザイムＢおよびパーフォリンによる腫瘍細胞の直接殺滅がさらにもたらされるはずである。ＰＭ−ＩＬ１５免疫サイトカインの細胞傷害潜在性を評価するために、ＴＡ−ＭＵＣ１陽性ＣａＯＶ−３腫瘍細胞をアッセイプレート中で２４時間成長させた後、ＰＭ−ＩＬ１５免疫サイトカインおよび刺激していないＰＢＭＣをエフェクター対標的細胞比１０：１で添加した。２４時間後に、細胞の上清中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を定量することによって腫瘍細胞殺滅を評価した（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＬＤＨ）、Ｒｏｃｈｅ）。標的細胞をトリトン（登録商標）−Ｘ−１００と一緒にインキュベートすることによって最大放出を実現し、また、標的細胞およびＰＢＭＣのみを含有し、抗体を含有しない試料において抗体に依存しない細胞死を測定した。図１２に示されている通り、ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔのどちらによっても有効な腫瘍細胞の溶解が用量依存的に誘導された。いくつかのドナーＰＢＭＣの分析から、ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔの腫瘍細胞溶解を誘導する効力がＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡと比較して高い（ＥＣ５０がより低く、最大溶解がより高い）ことが明らかになった。
（実施例８）
３Ｄスフェロイドモデルにおける免疫細胞の動員
腫瘍を標的とするＰＭ−ＩＬ１５免疫サイトカインの主要な利点は、腫瘍部位における局所的な免疫細胞の活性化を媒介して、免疫抑制性環境を共有免疫応答が実行可能な場所に変えることである。しかし、さらに、ＩＬ−１５は、その走化特性によって免疫細胞を誘引することが記載されている。ＰＭ−ＩＬ１５免疫サイトカインの、免疫細胞を誘引する潜在性を分析するために、３Ｄ腫瘍スフェロイドを用いたＰＢＭＣの共培養アッセイを確立した。
がん幹細胞（ＣＳＣ）表現型を有する細胞に富む（ＭＣＦ−７ＣＳＣ−富化と称される）ＭＣＦ−７乳がん細胞株を使用した。「古典的な」ＭＣＦ−７細胞株とは対照的に、ＣＳＣ−富化細胞株は、正常な接着性２Ｄ培養物においてＣＤ４４＋／ＣＤ２４−およびサイドポピュレーションの割合の有意な増加を示し、３Ｄ球体を形成する能力を有する。ＴＡ−ＭＵＣ１＋ＭＣＦ−７ＣＳＣ−富化細胞をＣｏｒｎｉｎｇ Ｓｐｈｅｒｏｉｄマイクロプレートに播種し、その後、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で３日間のインキュベーション相を行うことにより、３Ｄスフェロイドを生成した。スフェロイドの圧縮および成長を顕微鏡下で観察することによって確認した。３日目にスフェロイドが形成された後、健康ドナーのヒトＰＢＭＣならびに２０ｎｇ／ｍｌのＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉ ＮＡを添加し、さらに２日間インキュベートした。免疫細胞の３Ｄスフェロイドへの浸潤を免疫組織化学的検査によって分析した。したがって、スフェロイドを収集し、洗浄し、ホルマリンを用いて固定した。次いで、固定されたスフェロイドをＨｉｓｔｏＧｅｌ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で成形し、組織マーキング色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、脱水し、パラフィンに包埋した。３〜４μｍの厚さの連続切片に対し、ＣＤ３に対する抗体およびＣＤ４５に対する抗体を使用し、標準の方法に従って染色を実施した。ペルオキシダーゼとカップリングした検出抗体および基質として液体ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用することにより、結合した一次抗体を検出した。核をヘマトキシリンで対比染色した。
図１３に示されている通り、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉ ＮＡを添加することにより、スフェロイド内のＣＤ４５＋免疫およびＣＤ３＋Ｔ細胞の有意な増加がもたらされる。ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡとＰＭ−ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉ ＮＡの間でＣＤ４５＋免疫細胞の浸潤を増加させるそれらの効力に差異はなかったが、ＰＭ−ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉ ＮＡはＣＤ３＋Ｔ細胞を動員する効力がより高かった。
さらに、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５−ｗｔ ＮＡの免疫細胞を誘引する潜在性を、３Ｄ腫瘍スフェロイドを用いたＰＢＭＣの共培養アッセイにおいて比較した（上記の方法）。
３日目にスフェロイドが形成された後、健康ドナーのヒトＰＢＭＣならびに示されている量のＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインまたはＰａｎｋｏＭａｂを添加し、さらに２日間インキュベートした。パラフィン包埋スフェロイドをＣＤ８およびＣＤ４５で染色した後、免疫細胞の３Ｄスフェロイドへの浸潤を分析した。ペルオキシダーゼとカップリングした検出抗体および基質として液体ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用することにより、結合した一次抗体を検出した。核をヘマトキシリンで対比染色した。
図１４に示されている通り、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡを添加することにより、スフェロイド内のＣＤ４５＋免疫およびＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加がもたらされるが、ＰａｎｋｏＭａｂの使用では効果はなかった。ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔとＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡとの間に差異はなかった。
（実施例９）
免疫細胞活性化および増殖
融合タンパク質構築物による免疫細胞の活性化を調査するために、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞における４８時間後の活性化マーカーＣＤ６９の発現をフローサイトメトリーによって分析した。この目的のために、健康ドナー由来のヒトＰＢＭＣを、示されている濃度の種々の融合タンパク質構築物と一緒に４８時間インキュベートした。４８時間後にＰＢＭＣを回収し、それぞれ、蛍光標識されたαＣＤ４抗体、αＣＤ８抗体、αＣＤ２５抗体、αＣＤ６９抗体、αＣＤ５６抗体、αＣＤ１４抗体、およびαＣＤ１９抗体を用いて染色した。生存細胞を単独で分析するためにＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。細胞をＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）フローサイトメーターで分析した。免疫細胞活性化に加えて、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＩＬ−１５構築物の別の作用機構は、ＮＫ細胞およびＴ細胞増殖の誘導である。免疫細胞増殖を測定するために、健康ドナー由来のＰＢＭＣを、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で標識し、種々の融合タンパク質構築物と一緒に５日間インキュベートした。免疫細胞が増殖する場合、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）色素は増殖している細胞の各世代にわたって希釈される。５日後にＰＢＭＣを回収し、それぞれ、蛍光標識されたαＣＤ４抗体、αＣＤ８抗体、αＣＤ５６抗体、αＣＤ１４抗体、およびαＣＤ１９抗体を用いて染色した。生存細胞を単独で分析するために、７−ＡＡＤ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用した。細胞をＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）フローサイトメーターで分析した。
結果から、全ての融合タンパク質構築物によりＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の活性化ならびにＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導することができることが実証される（図１５および１６参照）。活性化および増殖の誘導の強度は、ＩＬ−１５モジュールに依存し（ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉ＞ＩＬ−１５ｗｔ＞ＩＬ−１５ｍｕｔ）、ＮＫ細胞に関しては、抗体Ｆｃ部分のグリコシル化に依存する（グリコシル化されている＞グリコシル化されていない）。
Ｆｃグリコシル化を伴う、および伴わないＰＭ−ＩＬ１５免疫サイトカイン（Ｆｃ ｗｔおよびＦｃサイレンシング（ＮＡ）バリアント）の免疫賦活特性も詳細に調査した。ＰＢＭＣを示されている分子と一緒に５日間インキュベートした後、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を分析した。刺激されたＰＢＭＣを、蛍光標識されたαＣＤ３抗体、αＣＤ４抗体、αＣＤ８抗体、αＣＤ１４抗体、αＣＤ１９抗体、αＣＤ２５抗体、αＣＤ４５ＲＡ抗体、αＣＤ５６抗体、αＣＤ６９抗体、およびαＣＤ１９７抗体を用いて染色した。分析前に、ＤＡＰＩを添加することによって死細胞を排除した。図１７に示されている通り、ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔによりＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５およびＣＤ６９の発現が誘導されたが、ＰａｎｋｏＭａｂではこのアッセイの設定においてこれらの細胞サブセットを活性化することはできなかった。興味深いことに、ＦｃγＲを誘導することができる構築物ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔは、ＦｃγＲ活性の引き金になることができないＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡよりも高い、ＮＫ細胞を活性化する効力を示した。しかし、ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔによって誘導されるＴ細胞におけるＣＤ２５およびＣＤ６９の発現は両方の構築物間で同一であった。
興味深いことに、メモリーＴ細胞サブセットおよびエフェクターＴ細胞サブセットの分析により、ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔにより古典的なエフェクター集団を活性化することができるだけでなく、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＣＲ７＋）ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞も、この特定の細胞サブセットにおけるＣＤ６９の誘導によって示される通り、活性化することができることが明らかになった（図１８）。さらに、ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔのどちらと一緒にインキュベートしても、ＣＣＲ７−エフェクターＴ細胞の増加がもたらされ、これにより、ＰＭ−ＩＬ１５免疫サイトカインによりエフェクター細胞集団を強化することができることが示される。
ＮＫ細胞およびＴ細胞の十分な活性化により、頑強な増殖がもたらされる。増殖を媒介するＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔの能力を評価するために、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で標識されたＰＢＭＣを、示されている分子と一緒に５日間インキュベートした。刺激されたＰＢＭＣを、蛍光標識されたαＣＤ３抗体、αＣＤ４抗体、αＣＤ８抗体、αＣＤ１４抗体、αＣＤ１９抗体、αＣＤ４５抗体およびαＣＤ５６抗体を用いて染色した。フローサイトメトリーによる分析前に７−ＡＡＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた染色によって死細胞を排除した。ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ１５ｗｔのどちらによってもＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が誘導されたが、ＰａｎｋｏＭａｂ単独では効果がなかった（図１９）。免疫細胞活性化アッセイの結果と同様に、ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡとＰＭ−ＩＬ１５ｗｔの間でＴ細胞増殖を誘導する効力に差異はなかった。しかし、ＰＭ−ＩＬ１５ｗｔではＰＭ−ＩＬ１５ｗｔ ＮＡよりも低濃度でＮＫ細胞増殖が再現性よく誘導された。
（実施例１０）
サイトカイン放出
ＩＬ−１５は、強力なサイトカインであり、ＩＬ−１５による処置によって媒介される潜在的なサイトカイン放出は、前臨床的試験において検討すべき問題である。特に、ＩＬ−１５による刺激後の免疫細胞によるＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭＩＰ１−αの分泌が記載されている。健康ドナー８体のＰＢＭＣを、アッセイウェルの溶液相に添加した示されているＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインと一緒に７２時間インキュベートした。上清を、ＵＰＬＥＸアッセイプラットフォーム（ＭＳＤ）を使用して分析した。ＩＦＮ−γ（図２０Ａ）およびＧＭ−ＣＳＦ（図２０Ｂ）の分泌が示されている。
予測通り、試験したＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインの全てにより、サイトカイン放出が誘導され、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインを含む構築物ではＩＬ−１５ｗｔを単独で有する構築物よりも高度なＩＦＮ−γ（図２０Ａ）およびＧＭ−ＣＳＦ（図２０Ｂ）の分泌が誘導された。驚いたことに、試験したサイトカインの放出に対するＦｃドメインの明らかな影響はなかった。
（実施例１１）
免疫抑制細胞の活性化
固形腫瘍における微小環境は、一般に、高度に抑制性であり、これは、極めて多くの免疫治療薬が実施されるための主要な問題の１つである。ＰＭ−ＩＬ１５免疫サイトカインが、抑制性環境を克服し、抑制された免疫細胞を活性化する能力を有するかどうかを調査するために、健康ドナーのＰＢＭＣを、５０ｎｇ／ｍｌの免疫抑制性サイトカインＴＧＦ−βと一緒にインキュベートした。４８時間後に、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡを等モル濃度（５７２ｎＭ）で添加し、さらに５日間インキュベートした後、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を分析した。ＰＢＭＣを、蛍光標識されたαＣＤ３、αＣＤ４、αＣＤ８、αＣＤ２５、αＣＤ５６およびαＣＤ６９を用いて染色した。分析前に、ＤＡＰＩを添加することによって死細胞を排除した。
ＮＫ細胞（ＣＤ２５）の活性化が図２１Ａに示されており、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ６９）の活性化が図２１Ｂに示されている。予測通り、および以前に記載されている通り、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡにより、抑制されていないＴ細胞は同程度に活性化されるが、ＮＫ細胞は、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔによってＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡよりも強力に活性化される。興味深いことに、どちらのＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインでもＴＧＦ−βによって抑制された免疫細胞を活性化することができた。ＴＧＦ−βによる免疫抑制は、分析した細胞サブセットの全てにおいて、ＴＧＦ−βを用いた処置後にＣＤ２５およびＣＤ６９の発現が低減したので、目に見ることができた。重ねて、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔとＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡが示すＴ細胞を活性化する効力は同様であり、また、抑制されたＮＫ細胞を刺激する効力は機能性Ｆｃドメインを有するＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ構築物の方がＦｃサイレンシングバリアントＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡと比較して高かった。
（実施例１２）
走化性
ＩＬ−１５は、その走化特性によって免疫細胞を誘引することが記載されている。ＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインがなお走化性をなすことを確認するために、古典的な走化性アッセイをセットアップした。健康なＰＢＭＣを９６ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌシステム（５μｍ孔径のポリカーボネート膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）の上部チャンバーに入れた。下部チャンバーにはＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインを添加した培地を満たした。５％ＣＯ２中、３７℃で４時間インキュベートした後、遊走した免疫細胞の数を、フローサイトメーターを使用して下部チャンバー内の細胞を計数することによって決定した。分析前に、細胞を、蛍光標識されたαＣＤ３、αＣＤ４、αＣＤ８、αＣＤ１４、αＣＤ１９、αＣＤ５６、およびＤＡＰＩを用いてで染色した。
いかなる刺激物の添加も無しの、対照ウェルと比べた、示されているＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインへのＮＫ細胞（図２２Ａ）、ＮＫＴ細胞（図２２Ｂ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図２２Ｃ）の遊走（走化性指数）が示されている。ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡはどちらも、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を誘引する高い潜在性を有した。興味深いことに、機能性Ｆｃドメインを有するバリアントＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔによりＮＫ細胞の遊走がＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡよりも強力に誘導されたが、ＮＫＴ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に関しては明白な差異はなかった。
（実施例１３）
ｉｎ ｖｉｖｏにおける薬物動態
ＰＭ−ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉ ＮＡおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡの薬物動態を分析するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２００ｐｍｏｌの抗体をｉ．ｖ．注射した。注射の５分後、１時間後、６時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、５日後および８日後に血清を採取した。血清試料の抗体価を決定するために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６ ＥＬＩＳＡプレートに、０．１Ｍの炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中２μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩｇκ軽鎖抗体を終夜コーティングした。ＰＢＳ中５％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＢＳＡ／ＰＢＳ）を用いて非特異的結合を遮断した。血清試料および標準物質を１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ中に希釈した。試料をインキュベートした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒト（ＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的）抗体を１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ中、１：３０．０００の希釈度で使用した。呈色のために、ＴＭＢ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ＳｕｂｓｔｒａｔｅをＥＬＩＳＡプレートに添加した。反応を１．２５Ｍの硫酸で停止させ、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００マイクロプレートリーダーを使用し、４５０ｎｍおよび６２０ｎｍにおいてシグナルを測定した。
さらに、血液試料を投与前および注射の８日後に分析した。ＰＢＭＣを、フルオロフォアとコンジュゲートした抗マウスＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８を用いて染色し、細胞をＡｔｔｕｎｅ（登録商標）ＮｘＴ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで分析した。
結果から、ＰＭ−ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉ ＮＡの半減期がＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡと比較して短いことが実証される（図２３参照）。さらに、どちらの構築物を用いた処置でもＣＤ８＋Ｔ細胞の増加がもたらされ、効果はＰＭ−ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉ ＮＡを使用した場合に、より顕著である（図２４参照）。
ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔのＦｃγＲ結合ドメインが、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡと比較してＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔの薬物動態プロファイルに影響を及ぼすかどうかを調査するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２ｍｇ／ｋｇの構築物をｉ．ｖ．注射した（ｎ＝３）。注射の５分後、６時間後、１日後、２日後、４日後、７日後および１１日後血清を採取し、抗体価を上記の通りＥＬＩＳＡによって決定した。
図２５に示されている通り、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡはＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて同一のｔ１／２および同様の総曝露（ＡＵＣ）を示す。
（実施例１４）
ｉｎ ｖｉｖｏにおける薬力学
ＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインの薬力学的効果をｉｎ ｖｉｖｏにおいてさらに調査した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、ｎ＝３）に２ｍｇ／ｋｇのＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡまたはＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔのいずれかをｉ．ｖ．注射し、３日目に屠殺して、血液、血清、鼠径リンパ節（ｉｎｇＬＮ）および脾臓を採取した。血清を調査して、サイトカイン分泌に対する効果を分析し、血液およびリンパ器官由来の免疫細胞を免疫細胞サブセットの表現型および頻度について特徴付けた。
３日間にわたるＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインを用いた処置により、脾臓（図２６Ａ）および鼠径リンパ節（図２６Ｄ）内の細胞の総数の増加がもたらされる。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の相対的な増加が観察されたが、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞はむしろ減少した（図２６Ｂ、Ｅ）。最終的に、これにより、脾臓およびｉｎｇＬＮにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の選択的増加がもたらされたが（図２６Ｃ、Ｆ）、Ｂ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の総細胞数は影響を受けなかったか（脾臓）またはほんのわずかだけ影響を受けた（ｉｎｇＬＮ）。一般に、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡとＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔとの間で、ＮＫ細胞増加を刺激する効力がＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔの方が高い以外の差異はなかった。
３日間にわたるＰＭ−ＩＬ−１５による処置によって誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞の選択的増加により、脾臓におけるＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）との比が、最初の７：１から１０：１まで変化し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の優勢が増した（図２７Ａ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞集団内では、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡを用いた処置によりナイーブ細胞の相対的減少がもたらされ、併せて、セントラルメモリー（ＴＣＭ）およびエフェクター（Ｔｅｆｆ）表現型を有する細胞の増加がもたらされる（図２７Ｂ）。ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔとＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡの間で差異はなかった。ｉｎｇＬＮにおいても同様の効果が観察された（図示せず）。
マウス免疫細胞の表現型特徴付けから、ＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインを用いて３日間刺激することにより、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｄの上方制御がもたらされ、驚いたことに、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＣＤ１２２（ＩＬ−２／１５Ｒβ）の上方制御も導もたらされることが明らかになった（図２７Ｃ）。同様に、ＮＫ細胞においてＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１２２が上方制御された（図２７Ｄ）。どちらの効果も脾臓（ここに示す）およびｉｎｇ ＬＮ（図示せず）において目に見えるものであった。ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔとＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡの間で差異は観察されなかった。
３日目にマウスの血清をサイトカイン含有量についてさらに分析した。ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡの注射により、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γのサイトカインレベルが上昇し、どちらのサイトカインの分泌もＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔによりＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡと比較してわずかにより強力に誘導された（図２８）。
最後に、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインの長期の効果を、１１日目の血液中の免疫細胞を分析することによって分析した。ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡの注射後の血液中でより高頻度のＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞をなお観察することができたが、より高頻度のＮＫ細胞はＰＭ−ＩＬ１５ｗｔを用いた場合のみで観察された（図２９）。ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度は影響を受けず、顆粒球および単球のパーセンテージは処置によりむしろ低下した。これにより、ＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインの単回注射によりＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞に対する長期の効果を誘導することができることが示される。
種々のＰＭ−ＩＬ−１５構築物設計の分析
（実施例１５）
抗原結合
ＰＭ−ＩＬ１５免疫サイトカインの異なるバリアントの細胞表面ＴＡ−ＭＵＣ１への結合特性を、ＴＡ−ＭＵＣ１を強力に発現する乳がん細胞株ＺＲ−７５−１を使用して分析した。腫瘍細胞を、示されている抗体の段階希釈物と一緒にインキュベートし、結合した抗体を、フィコエリトリンとコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（重鎖および軽鎖）抗体を使用して検出した。結合をフローサイトメトリーによって分析した。抗体のＣκまたはＣＨ３ドメイン（構築物ＣＨ３４ＧＳ、ＣＨ３ｏＬｉ−ｏＫ、Ｃκ４ＧＳ、Ｃκ１ＧＳ）へのＩＬ−１５の結合は、親抗体ＰａｎｋｏＭａｂと比較した場合ＴＡ−ＭＵＣ１に対する結合特性に影響を及ぼさなかった。抗体のＶＬ領域（構築物ＶＬ４ＧＳ）へのＩＬ−１５の結合により、ＴＡ−ＭＵＣ１に結合する能力が低下した（図３０）。
（実施例１６）
ＩＬ−１５受容体結合
種々のＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ構築物のＩＬ−１５受容体サブユニットへの結合特性をＥＬＩＳＡによって分析した。ＩＬ−１５Ｒα（ＣＤ２１５）を９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートにコーティングした。段階希釈したＰＭ−ＩＬ１５免疫サイトカインをインキュベートし、結合した免疫サイトカインを、ペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片特異的抗体と一緒にインキュベートすることによって検出した。試験した構築物の全てがＣＤ２１５に結合することができた（図３１）。ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳはＣＤ２１５に対して軽鎖融合構築物ＰＭ−ＩＬ−１５−Ｃκ４ＧＳおよびＰＭ−ＩＬ−１５−Ｃκ１ＧＳと比較して優れた結合を示した。
（実施例１７）
細胞増殖の誘導
ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞およびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の生存のために重要であり、また、増殖に関してこのサイトカインに同等に依存性であるＮＫ細胞またはＴ細胞起源の細胞株がいくつか存在する。マウスＣＴＬＬ−２ Ｔ細胞株は、組換えＩＬ−１５の生物活性を増殖アッセイによって試験するために常套的に使用され、また、ナチュラルキラー細胞白血病細胞株ＫＨＹＧ−１ ｍＣＤ１６（マウスＣＤ１６がトランスフェクトされたＫＨＹＧ−１）も増殖と共にＩＬ−１５に応答する。これらの２つの細胞株を使用して、ＰＭ−ＩＬ１５構築物のＣＨ３ドメインまたはＣκドメインのいずれかに融合したＩＬ−１５の生物活性を組換えＩＬ−１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と比較して試験した。組換えＩＬ−１５の、ＣＴＬＬ−２細胞（図３２Ａ）およびＫＨＹＧ−１ ｍＣＤ１６細胞（図３２Ｂ）の増殖を誘導する効力は、適用したＩＬ−１５のモル濃度に対して正規化した場合、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳおよびＰＭ−ＩＬ−１５−Ｃκ４ＧＳと比較して高かった。さらに、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳとＰＭ−ＩＬ−１５−Ｃκ４ＧＳのＫＨＹＧ−１ ｍＣＤ１６細胞の増殖を誘導する活性は等しかったが（図３２Ｂ）、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳにより、ＰＭ−ＩＬ−１５−Ｃκ４ＧＳと比較してＣＴＬＬ−２細胞のより強力な増殖が誘導され（図３２Ａ）、これはおそらくこれらの細胞株におけるＩＬ−１５Ｒ鎖の差次的発現に起因する。
（実施例１８）
免疫細胞活性化の誘導
ＰＭ−ＩＬ−１５ ＣＨ３またはＣκ融合構築物を、一次免疫細胞を活性化するそれらの効力について組換えＩＬ−１５と比較した。健康ドナーのＰＢＭＣを、示されている分子と一緒に５日間インキュベートした。刺激されたＰＢＭＣを、蛍光標識されたαＣＤ３抗体、αＣＤ４抗体、αＣＤ８抗体、αＣＤ１４抗体、αＣＤ２５抗体、αＣＤ４５抗体、およびαＣＤ５６抗体を用いて染色した。分析前に、ＤＡＰＩを添加することによって死細胞を排除した。図３３に示されている通り、試験した分子の全てがＮＫ細胞（図３３Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図３３Ｂ）におけるＣＤ２５の発現を誘導することができた。重ねて、アッセイ中に存在したＩＬ−１５のモル濃度に対して正規化した場合、組換えＩＬ−１５は免疫細胞の活性化に関してどちらのＰＭ−ＩＬ−１５構築物と比較しても優れていた。さらに、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳの免疫エフェクター細胞の活性化を誘導する効力がＰＭ−ＩＬ−１５−Ｃκ４ＧＳと比較してわずかに高かった。
（実施例１９）
抗腫瘍細胞傷害の誘導
次に、腫瘍細胞殺滅アッセイにおいて組換えＩＬ−１５とＰＭ−ＩＬ−１５ ＣＨ３またはＣκ融合構築物との間で同様の差異を観察することができるかどうかを調査した。この目的のために、ＴＡ−ＭＵＣ１陽性ＣａＯＶ−３腫瘍細胞をアッセイプレート中で２４時間成長させた後、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳ、ＰＭ−ＩＬ−１５−Ｃκ４ＧＳまたは組換えＩＬ−１５および刺激していないＰＢＭＣをエフェクター対標的細胞比１０：１で添加した。２４時間後に、細胞の上清中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を定量することによって腫瘍細胞殺滅を評価した（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＬＤＨ）、Ｒｏｃｈｅ）。標的細胞をトリトン（登録商標）−Ｘ−１００と一緒にインキュベートすることによって最大放出を実現し、また、標的細胞およびＰＢＭＣのみを含有し、抗体を含有しない試料において抗体に依存しない細胞死を測定した。図３４に示されている通り、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳおよび−Ｃκ４ＧＳのどちらによってもＣａＯＶ−３腫瘍細胞の特異的溶解が誘導され、前に観察された通り融合ＣＨ３融合構築物はＣκ融合構築物と比較してより高い活性を示した。重要なことに、組換えＩＬ−１５はＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化の誘導に関して優れているが（図３３）、これは、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳおよび−Ｃκ４ＧＳに関して観察される有効な免疫細胞媒介性腫瘍細胞溶解には相当しなかった（図３４、組換えＩＬ−１５を使用した最大溶解は、約２０％であり、比較して、ＰＭ−ＩＬ−１５を使用すると４０％である）。
（実施例２０）
ｉｎ ｖｉｖｏにおける薬物動態に対する構築物設計の影響
抗体のＣＨ３またはＣκドメインへのＩＬ−１５の融合がその薬物動態プロファイルに影響を及ぼすかどうかを調査するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２ｍｇ／ｋｇの構築物をｉ．ｖ．注射した（ｎ＝３）。注射の５分後、６時間後、１日後、２日後、４日後、７日後、および１１日後に血清を採取し、抗体価をＥＬＩＳＡによって決定した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６ ＥＬＩＳＡプレートに、０．１Ｍの炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中２μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩｇκ軽鎖抗体を終夜コーティングした。ＰＢＳ中５％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＢＳＡ／ＰＢＳ）を用いて非特異的結合を遮断した。血清試料および標準物質を１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ／５％（ｖ／ｖ）マウス血清／ＰＢＳ中に希釈し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒト（ＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的）を使用して検出した。呈色のために、ＴＭＢ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ＳｕｂｓｔｒａｔｅをＥＬＩＳＡプレートに添加した。反応を１．２５Ｍの硫酸で停止させ、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００マイクロプレートリーダーを使用し、４５０ｎｍおよび６２０ｎｍにおいてシグナルを測定した。
図３５に示されている通り、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳは、ＰＭ−ＩＬ−１５−Ｃκ４ＧＳと比較して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、より長いｔ１／２およびより大きな総曝露（ＡＵＣ）を示した。両方の構築物のｓ．ｃ．注射後にも同じ結果が観察された。
（実施例２１）
ｉｎ ｖｉｖｏにおける薬力学に対する構築物設計の影響
次に、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳおよびＰＭ−ＩＬ−１５−Ｃκ４ＧＳのｉｎ ｖｉｖｏにおける薬力学的プロファイルにも差異があるかどうかを調査した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、ｎ＝３）に２ｍｇ／ｋｇのＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＣＨ３４ＧＳまたはＣｋ４ＧＳのいずれかをｉ．ｖ．注射およびｓ．ｃ．注射し、１１日目に屠殺して血液を採取した。血液由来の免疫細胞を表現型および頻度について、蛍光標識されたαＣＤ３抗体、αＣＤ４抗体、αＣＤ８抗体、αＣＤ４４抗体、αＣＤ４５抗体、αＣＤ４５Ｒ抗体、αＣＤ６２Ｌ抗体、αＣＤ１２２抗体、およびαＮＫ１．１抗体を使用したフローサイトメトリーによって特徴付けた。ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳの適用により、ｉ．ｖ．注射後およびｓ．ｃ．注射後にＮＫ細胞の増加（２倍）がもたらされたが、ＰＭ−ＩＬ−１５−Ｃκ４ＧＳを使用すると、この時点でＮＫ細胞区画に対する有意な効果はなかった（図３６Ａ）。しかし、どちらの構築物の注射によっても、ＮＫ細胞におけるＣＤ１２２の上方制御が同様にもたらされ、これは、Ｃκ４ＧＳ構築物によってもＮＫ細胞を誘導することができることを意味する（図３６Ｃ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞を分析し、どちらの構築物でもこのサブセットの総頻度およびＣＤ１２２発現を増加させることができたが、重ねて、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳではＰＭ−ＩＬ−１５−Ｃκ４ＧＳ（１．３倍の増加）よりも強力な増加（１．５倍）およびＣＤ１２２上方制御が誘導された（図３６ＢおよびＤ）。
ＣＤ４＋Ｔ細胞集団およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団内では、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳおよびＰＭ−ＩＬ−１５−Ｃκ４ＧＳを用いた処置により、ｉ．ｖ．注射後（図３７ＡおよびＣ）およびｓ．ｃ．注射後（図３７ＢおよびＤ）にナイーブ細胞の相対的減少がもたらされ、併せて、セントラルメモリー（ＴＣＭ）およびエフェクター（Ｔｅｆｆ）表現型を有する細胞の増加がもたらされる。さらに、使用した注射経路に関係なく、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターおよびメモリーＴ細胞の動員に関してＰＭ−ＩＬ−１５−Ｃκ４ＧＳ構築物よりも優れていた。
（実施例２２）
ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルにおける治療有効性
次に、ＴＡ−ＭＵＣ１を標的とするＩＬ−１５免疫サイトカインが、腫瘍を有するマウスの転帰を改善する潜在性を有するかどうかを分析した。糖鎖特異的エピトープＴＡ−ＭＵＣ１はマウスでは見いだされないので、マウス乳癌細胞株４Ｔ１にＭＵＣ１をトランスフェクトし、ＴＡ−ＭＵＣ１を発現するトランスフェクタントＭＵＣ１−４Ｔ１をｉｎ ｖｉｖｏ試験のための腫瘍モデルとして使用した。４Ｔ１細胞に由来する腫瘍は、高度に免疫抑制性を含有する主に骨髄系由来のサプレッサー細胞であることが記載されている。ＭＵＣ１−４Ｔ１細胞を乳房脂肪体（ｍｆｐ）に注射し、１日目、８日目、および１５日目に０．２５ｍｇ／ｋｇのＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳを用いて処置した。腫瘍体積をモニタリングし、州（state）のガイドラインに従って腫瘍量が１ｃｍ３に達したらマウスを屠殺した。図３８Ａは、ＰＢＳで処置したマウスおよびＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳで処置したマウスの経時的な腫瘍体積を示し、矢印は投与日を示す。図３８Ｂは、マウスの生存を示す。ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳの適用により、この高度に抑制性のモデルにおいてマウス６匹のうち３匹において腫瘍成長遅延がもたらされ（図３８Ａ）、これは、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳで処置したマウスの生存がＰＢＳ群と比較して長いことにも反映された（図３８Ｂ）。
ＰＭ−ＩＬ−１５と他の治療薬との組合せ
（実施例２３）
ＰＭ−ＩＬ−１５とＰＭ−ＣＤ３の組合せを使用した免疫細胞の活性化
ＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインを用いた治療の背景にある観念は、ＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインがそれ自体で免疫細胞を活性化するだけでなく、ＮＫ細胞およびＴ細胞が刺激されることにより、進行中の免疫応答もさらに増強されるというものである。この仮説を試験するために、ＴＡ−ＭＵＣ１を標的とするＴ細胞エンゲージャー（ＰＭ−ＣＤ３；ＣＤ３に対するｓｃＦｖ断片が抗ＴＡ−ＭＵＣ１抗体Ｐａｎｋｏｍａｂの重鎖のＣ末端と融合した二重特異性抗体）をＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡと組み合わせ、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖および細胞傷害を分析した。
Ｔ細胞活性化を分析するために、健康ドナーのＰＢＭＣを、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳと一緒に、最適以下の濃度（それぞれ０．４μｇ／ｍｌおよび２μｇ／ｍｌ）のＰＭ−ＣＤ３の非存在下または存在下でインキュベートした。２日後に、刺激されたＰＢＭＣを蛍光標識されたαＣＤ４抗体、αＣＤ８抗体、αＣＤ１４抗体、αＣＤ１９抗体、αＣＤ２５抗体、αＣＤ４５抗体、αＣＤ５６抗体、およびαＣＤ６９抗体を用いて染色することによってＴ細胞の活性化を分析した。フローサイトメトリーによる分析前に、ＤＡＰＩを添加することによって死細胞を排除した。
図３９は、最適以下の濃度での単一の治療としてのＰＭ−ＣＤ３により、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５のわずかな発現が誘導されたことを示す。ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔでは、どちらのＴ細胞サブセットにおいてもＣＤ２５の濃度依存性の増加が誘導され、ＣＤ４＋Ｔ細胞ではＣａＯＶ−３腫瘍細胞の存在下でさらに増強された。興味深いことに、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔとたった０．４μｇ／ｍｌ（２ｎＭ）のＰＭ−ＣＤ３の組合せにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５の発現が強力に増強された。重要なことに、観察された効果は、相加的なだけでなく、高度に相乗的でもあり、また、ＰＭ−ＣＤ３の量を２μｇ／ｍｌ（１０ｎＭ）まで増加させることによってさらに増強することができた。
（実施例２４）
ＰＭ−ＩＬ−１５とＰＭ−ＣＤ３の組合せを使用した免疫細胞の増殖
ＰＭ−ＣＤ３により誘導されるＴ細胞増殖におけるＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインの効果を分析するために、健康ドナーのＰＢＭＣを、ＰＭ−ＣＤ３と一緒に、１μｇ／ｍｌのＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡの非存在下または存在下でインキュベートした。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で標識されたＰＢＭＣを、示されている分子およびＴＡ−ＭＵＣ１陽性ＣａＯＶ−３腫瘍細胞と一緒に５日間インキュベートした。刺激されたＰＢＭＣを、蛍光標識されたαＣＤ４抗体、αＣＤ８抗体、αＣＤ１４抗体、αＣＤ１９抗体、αＣＤ４５抗体およびαＣＤ５６抗体を用いて染色した。フローサイトメトリーによる分析前に７−ＡＡＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた染色によって死細胞を排除した。
ＣａＯＶ−３腫瘍細胞の存在下、ＰＭ−ＣＤ３単独でＣＤ４＋Ｔ細胞（図４０Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図４０Ｂ）の増殖を誘導することができた。驚いたことに、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡ自体ではこの濃度でＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導することができなかったが、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡにより、ＰＭ−ＣＤ３に媒介される増殖が高度に相乗的に強力に増強された。ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔとＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡのＰＭ−ＣＤ３に誘導される増殖を刺激する効力は同等であった。
（実施例２５）
ＰＭ−ＣＤ３と組合せたＰＭ−ＩＬ−１５の細胞傷害
ＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインとＰＭ−ＣＤ３の組合せの腫瘍細胞殺滅における潜在性も評価した。ＴＡ−ＭＵＣ１陽性ＣａＯＶ−３腫瘍細胞をアッセイプレート中で２４時間成長させた後、刺激していないＰＢＭＣをエフェクター対標的細胞比１０：１で添加した。ＰＭ−ＣＤ３を単独で、または示されている濃度のＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔおよびＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡと組み合わせて添加した。２４時間後に、細胞の上清中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を定量することによって腫瘍細胞殺滅を評価した（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＬＤＨ）、Ｒｏｃｈｅ）。標的細胞をトリトン（登録商標）−Ｘ−１００と一緒にインキュベートすることによって最大放出を実現し、また、標的細胞およびＰＢＭＣのみを含有し、抗体を含有しない試料において抗体に依存しない細胞死を測定した。
単一の治療として、ＰＭ−ＣＤ３およびＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインにより、ＣａＯＶ−３腫瘍細胞のわずか〜中程度の溶解を誘導することができた（図４１）。驚いたことに、ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔまたはＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡの添加により、腫瘍細胞の特異的溶解が、再度相加的にだけでなく相乗的にも増強された（図４１ＡおよびＢ）。たった１μｇ／ｍｌのＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔを２００ｎＭのＰＭ−ＣＤ３に添加することにより、ＣａＯＶ−３腫瘍細胞の特異的溶解が３４％から７５％まで増加した。ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡ構築物の効力はわずかに低かった（最大溶解６２％）。図４１Ｃは、組合せ効果が使用するＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインの濃度にも依存することを示す。ＰＭ−ＩＬ−１５ｗｔ ＮＡの濃度を１μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌまで上昇させることにより、さらにＥＣ５０値を低減し、腫瘍細胞の最大溶解を増加させることができた。
（実施例２６）
ＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインとＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１標的化治療との組合せ
以前に記載されている通り、ＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインはそれ自体で免疫細胞の活性化を媒介するが、別の薬物（例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）によって誘導されるＮＫ細胞およびＴ細胞の応答を増強することもできる。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１を標的とするチェックポイント阻害剤は診療所において広く使用されており、したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を実施して、これらの薬剤とＴＡ−ＭＵＣ１を標的とするＩＬ−１５免疫サイトカインの組合せについての理論的根拠があるかどうかを分析した。まず、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳと一緒にインキュベートした後に腫瘍細胞および単球におけるＰＤ−Ｌ１発現が変更されるかどうかを分析した。ＴＡ−ＭＵＣ１陽性ＨＳＣ−４舌扁平上皮癌細胞をアッセイプレート中で２４時間成長させた後、新しく単離したＰＢＭＣをエフェクター対標的細胞比１０：１で添加した。ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳ（２０ｎＭ）またはＰＢＳを添加し、プレートを４８時間培養した。腫瘍細胞およびＰＢＭＣを回収し、ＰＤ−Ｌ１の発現について分析した。図４２に示されている通り、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳの添加により、ＨＳＣ−４腫瘍細胞（図４２Ａ）および単球（図４２Ｂ）におけるＰＤ−Ｌ１の発現が有意に増加した。
次に、腫瘍細胞殺滅アッセイにおけるＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインとＰＤ−Ｌ１を標的とする抗体アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））の組合せの潜在性を調査した。ＴＡ−ＭＵＣ１陽性ＨＳＣ−４腫瘍細胞をアッセイプレート中で２４時間成長させた後、刺激していないＰＢＭＣをエフェクター対標的細胞比１０：１で添加した。ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳを、単独で、または示されている濃度のアベルマブもしくは対照としてｈＩｇＧ１と組み合わせて添加した。２４時間後に、以前に記載されている通り、細胞の上清中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を定量することによって腫瘍細胞殺滅を評価した。
単一の治療として、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳおよびアベルマブにより、ＨＳＣ−４腫瘍細胞のわずかな溶解（約９％）を誘導することができた（図４３）。驚いたことに、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳとアベルマブの組合せにより、腫瘍細胞の特異的溶解が、相加的にだけでなく相乗的にも有意に増加した。たった０．８ｎＭという濃度のＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳが、アベルマブ単独によって誘導される腫瘍細胞溶解を３倍にするのに十分であった（８．９％から２６．５％）。ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳの濃度を上昇させることにより、この効果をさらに増強することができた（最大の観察された溶解５４％）。
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤のｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＴ細胞を活性化する能力を調査するための別の許容される方法は、異なるドナー由来の単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）とＴ細胞とを共インキュベートして、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の相互作用による免疫抑制効果を模倣する、同種異系混合リンパ球反応（ＭＬＲ）である。単球を健康ドナーのＰＢＭＣから単離し、馴化培地、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−４を補充した培地で単球を培養することによってｍｏＤＣを生成した。７日後、ｍｏＤＣを回収し、９６ウェルプレート中、同種異系Ｔ細胞と１：１０の比で、１μｇ／ｍｌの各試験抗体の存在下で培養した。５日後に細胞を回収し、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５の発現についてフローサイトメトリーによって分析した。ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳおよびアベルマブのいずれの添加によっても、対照と比較して、ＣＤ２５の上方制御によって決定されるＣＤ８ Ｔ細胞活性化の増加がもたらされる（それぞれ５．４％および３．９％の増加；図４４）。しかし、ＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳとアベルマブの組合せでは、ＣＤ２５の発現が７．１％から２４．３％まで増加し（１７．２％の増加）、これは、両方の抗体の相乗作用を意味する。
（実施例２７）
ＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインと抗ＥＧＦＲ治療薬との組合せ
次に、ＥＧＦＲを標的とする治療薬を増強することができるかどうかを調査した。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（古典的なｈＩｇＧ１セツキシマブ）およびＣｅｔｕＧＥＸ（登録商標）（トムゾツキシマブ、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅの糖最適化第２世代セツキシマブ）を、実施例１９に記載の腫瘍細胞殺滅アッセイにおいてＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳと組み合わせて試験した。同様の量のＴＡ−ＭＵＣ１およびＥＧＦＲ（内部分析）を発現するＨＳＣ−４腫瘍細胞を標的細胞として使用した。図４５に示されている通り、ＣｅｔｕＧＥＸ（登録商標）単独により、ＬＤＨの濃度依存性放出が誘導され、これは、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）を単独で使用した場合よりも高かった。たった２０ｎＭ（３．５μｇ／ｍｌ）のＰＭ−ＩＬ−１５−ＣＨ３４ＧＳを添加することにより、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）およびＣｅｔｕＧＥＸ（登録商標）と、ある特定の閾値濃度（ＣｅｔｕＧＥＸ（登録商標）については＞０．１ｎｇ／ｍｌ、およびＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）については＞１ｎｇ／ｍｌ）で組み合わせると、ＬＤＨの放出が有意に増加した。これにより、ＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインが抗ＥＧＦＲ処置に対する応答を相乗的に増幅する潜在性を有することが示される。
（実施例２８）
ＣＤ４０アゴニストによるＩＬ−１５Ｒ発現の上方制御
ＰＭ−ＩＬ−１５免疫サイトカインに対するさらに興味深い組合せパートナーは、抗ＣＤ４０抗体のような他の免疫賦活性薬物である。図４６は、ＰＢＭＣを漸増濃度の糖最適化抗ＣＤ４０ ＩｇＧ１（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ）と一緒に３日間インキュベートした後の、無処理の細胞と比較した、フローサイトメトリーによって分析されたＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１５Ｒα（ＣＤ２１５）の発現を示す。抗ＣＤ４０を用いた処置により、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２１５の上方制御がもたらされたが、ＣＤ４＋Ｔ細胞おけるＣＤ２１５の上方制御はもたらされなかった（図４６）。これらのデータは、ＩＬ−１５の交差提示を抗ＣＤ４０ ｍＡｂの存在下で改善し、それにより、ＩＬ−１５に基づく免疫サイトカインの活性を強化することができたことを意味する。
寄託された生物材料の識別
細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ ２８０６、ＤＳＭ ＡＣＣ ２８０７およびＤＳＭ ＡＣＣ ２８５６は、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｒｏｅｓｓｌｅ−Ｓｔｒ．１０、１３１２５ Ｂｅｒｌｉｎ（ＤＥ）によって、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ、３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ＤＥ）に以下の表に示されている日に寄託された。
Figure 2021514625

Claims (19)

  1. （ｉ）ＭＵＣ１に特異的に結合する抗体モジュールと、
    （ｉｉ）ＩＬ−１５モジュールと
    を含む融合タンパク質構築物。
  2. 前記抗体モジュールが、以下の特性
    （ａ）重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む；
    （ｃ）２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖を含む；
    （ｄ）ＩｇＧ型抗体モジュール、特に、ＩｇＧ１型抗体モジュールである；
    （ｅ）ＴＡ−ＭＵＣ１エピトープに特異的に結合する；
    （ｆ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を有する一群のＣＤＲ配列を含む；
    （ｇ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を有する一群のＣＤＲ配列を含む；
    （ｈ）配列番号９もしくは３４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を少なくとも１つ、特に２つ、および配列番号１８のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を少なくとも１つ、特に２つ含む
    の１つまたは複数を有する、請求項１に記載の融合タンパク質構築物。
  3. 前記ＩＬ−１５モジュールが、ヒトＩＬ−１５またはその断片を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質構築物。
  4. 前記ヒトＩＬ−１５またはその断片が、以下の特性
    （ａ）ＩＬ−２受容体β鎖、共通γ鎖およびＩＬ−１５受容体α鎖を含むインターロイキン受容体に特異的に結合する；
    （ｂ）配列番号２１の配列を含む；
    （ｃ）Ｉ６７Ｅなどの、受容体結合を低下させる変異を含む
    の１つまたは複数を有する、請求項３に記載の融合タンパク質構築物。
  5. 前記ＩＬ−１５モジュールが、ヒトＩＬ−１５に特異的に結合するヒトＩＬ−１５受容体α鎖またはその断片をさらに含む、請求項３または４に記載の融合タンパク質構築物。
  6. 前記ＩＬ−１５モジュールが、ＩＬ−１５に特異的に結合するＩＬ−１５受容体α鎖もその断片も含まない、請求項１から４までのいずれか一項に記載の融合タンパク質構築物。
  7. 前記抗体モジュールが、前記抗体重鎖内の任意のＣＨ２ドメイン内にＮ−グリコシル化部位を含む、請求項１から６までのいずれか一項に記載の融合タンパク質構築物。
  8. （ｉ）２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖を含む１つの抗体モジュールと、
    （ｉｉ）２つのＩＬ−１５モジュールであって、一方のＩＬ−１５モジュールが、各抗体重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して融合している、２つのＩＬ−１５モジュールと
    を含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の融合タンパク質構築物。
  9. （ｉ）２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖を含む１つの抗体モジュールと、
    （ｉｉ）２つのＩＬ−１５モジュールであって、一方のＩＬ−１５モジュールが、各抗体軽鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して融合している、２つのＩＬ−１５モジュールと
    を含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の融合タンパク質構築物。
  10. それとコンジュゲートしたさらなる作用物質を含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載の融合タンパク質構築物。
  11. 請求項１から１０までのいずれか一項に記載の融合タンパク質構築物をコードする核酸。
  12. 請求項１１に記載の核酸および前記核酸と作用的に接続したプロモーターを含む発現カセットまたはベクター。
  13. 請求項１１に記載の核酸または請求項１２に記載の発現カセットもしくはベクターを含む宿主細胞。
  14. 請求項１から１０までのいずれか一項に記載の融合タンパク質構築物、ならびに溶媒、希釈剤、および賦形剤からなる群から選択される１つまたは複数のさらなる構成成分を含む医薬組成物。
  15. 医療に使用するための、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の融合タンパク質構築物または請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. がんなどの、異常な細胞成長に関連する疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症または寄生虫感染症などの感染症、および、免疫不全などの、免疫活性の低下に関連する疾患の処置、予後判定、診断および／またはモニタリングにおいて使用するための、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の融合タンパク質構築物または請求項１４に記載の医薬組成物。
  17. 前記がんが、乳がん、結腸がん、胃がん、肝がん、膵がん、腎がん、血液がん、肺がん、子宮内膜がん、甲状腺がんおよび卵巣がんからなる群から選択される、請求項１６に記載の、がんの処置、予後判定、診断および／またはモニタリングにおいて使用するための融合タンパク質構築物または医薬組成物。
  18. 前記融合タンパク質構築物が、さらなる作用物質と組み合わせて使用される、請求項１５から１７までのいずれか一項に記載の、医療に使用するための融合タンパク質構築物または医薬組成物。
  19. 前記さらなる作用物質が、ＭＵＣ１およびＣＤ３を標的とする二重特異性抗体、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体、ＥＧＦＲに対する抗体、ならびにＣＤ４０に対する抗体からなる群から選択される、請求項１８に記載の、医療に使用するための融合タンパク質構築物または医薬組成物。
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