JP2020515532A - Muc1およびcd3に結合する多重特異的抗体構築物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、がん抗原MUC1およびT細胞抗原CD3に対する多重特異的抗体構築物に関する。特に、多重特異的抗体構築物は、T細胞をがんの部位に動員する。多重特異的抗体構築物の設計は、強い抗原結合および高いT細胞活性化を示す。驚くべきことに、本発明者らは、MUC1およびCD3に結合する多重特異的抗体構築物の特異的設計が、かなりより強いCD3結合だけでなく、著しく増加したT細胞活性化ももたらすことを見出した。この優れた設計では、抗CD3抗原結合性断片は、抗MUC1抗体モジュールの重鎖のC末端に融合している。
Description
本発明は、抗体の分野に関する。がん抗原および免疫細胞抗原に対する多重特異的抗体構築物が提供される。特に、多重特異的抗体構築物は、CD3に結合することによってT細胞を、がん抗原MUC1に結合することによってがんの部位に動員する。多重特異的抗体構築物の設計は、提供される特定の状況における別々の利点、特に強い抗原結合および高いT細胞活性化を示す。特定の実施形態においては、本発明は、これらの多重特異的抗体構築物の治療および診断的使用を対象とする。
腫瘍関連抗原に対する抗体は、がんに対して広く使用されている治療薬である。今日、多くの抗がん抗体がヒト治療のために承認されている。これらの抗体のいくつかは、特異的がん細胞の生存または増殖のために重要である、ある特定のシグナル伝達経路を遮断することによって作用する。他の抗がん抗体は、例えばナチュラルキラー細胞を介した抗体依存性細胞傷害(ADCC)を開始することによって、標的化がん細胞に対する患者の免疫応答を活性化する。この機構は、抗体のFc部分を免疫細胞上のFc受容体に結合することによって誘導される。
興味深く、重要な抗体の群は、ムチンタンパク質に対する抗体の群である。ムチンは、脊椎動物において多くの上皮組織により生成される高分子量、高グリコシル化タンパク質のファミリーである。それらは、細胞膜中での保持に有利である疎水性膜貫通ドメインと粘膜表面上へと分泌されるか、または分泌されて唾液成分になるムチンとの存在のために、膜結合型のムチンタンパク質に細分することができる。ヒトムチンタンパク質ファミリーは、膜結合型MUC1を含む多くのファミリーメンバーからなる。
膵がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、結腸がんなどを含む多くの腺癌において、ムチン生成の増大が起こる。ムチンはまた、肺疾患、例えば、喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患または嚢胞性線維症において過剰発現される。2つの膜ムチン、MUC1およびMUC4は、疾患過程におけるそれらの病理学的関連に関して広範に研究されてきた。さらに、ムチンはまた、診断マーカーとしてのそれらの可能性について調査されている。ムチンタンパク質、特に、MUC1に対するいくつかの抗体が、当該分野で公知である。しかし、それらの治療有効性は、なお改善することができる。
これを考慮すれば、治療用の抗MUC1抗体構築物に増加した治療有効性を与える必要性が当技術分野にある。
本発明者らは、それらを抗CD3抗原結合性断片と組み合わせることによって、抗MUC1抗体を改善することができることを見出した。CD3はT細胞の特徴的な表面タンパク質であり、それは、T細胞受容体(TCR)と一緒にTCR−CD3複合体を形成する。抗がん抗原MUC1およびT細胞抗原CD3の同時結合は、腫瘍部位への細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の動員を可能にする。それらは抗腫瘍作用を媒介する最も強力な細胞の1つであるので、CTLの動員は興味深い。驚くべきことに、本発明者らは、MUC1およびCD3に結合する多重特異的抗体構築物の特異的設計が、かなりより強いCD3結合だけでなく、著しく増加したT細胞活性化ももたらすことを見出した。この優れた設計では、抗CD3抗原結合性断片は、抗MUC1抗体モジュールの重鎖のC末端に融合している。実験的に実証されるように、この構築物設計はCD3により強く結合し、抗CD3抗原結合性断片が抗MUC1抗体モジュールの軽鎖のC末端に融合している類似の抗体構築物と比較して、増加したT細胞媒介ADCCおよびT細胞増殖を誘導する。
したがって、第1の態様においては、本発明は、
(i)少なくとも1つの抗体重鎖を含む抗MUC1抗体モジュール、および
(ii)抗CD3抗原結合性断片
を含む特異的抗体構築物であって、前記抗原結合性断片が前記抗体モジュールの重鎖のC末端に融合している、多重特異的抗体構築物を目的とする。
(i)少なくとも1つの抗体重鎖を含む抗MUC1抗体モジュール、および
(ii)抗CD3抗原結合性断片
を含む特異的抗体構築物であって、前記抗原結合性断片が前記抗体モジュールの重鎖のC末端に融合している、多重特異的抗体構築物を目的とする。
第2の態様においては、本発明は、本発明による多重特異的抗体構築物をコードする核酸を提供する。さらに第3の態様においては、本発明による核酸を含む発現カセットまたはベクターおよび前記核酸に作動可能に繋がれたプロモーター、第4の態様においては、本発明による核酸または発現カセットもしくはベクターを含む宿主細胞が提供される。
第5の態様においては、本発明は、本発明による多重特異的抗体構築物を含む医薬組成物を対象とする。
第6の態様によれば、本発明は、医療で、特にがん、感染症、移植片対宿主病または自己免疫性疾患の処置において使用するための、本発明による多重特異的抗体構築物または医薬組成物を提供する。
上記態様を組み合わせることができる。本発明の他の目的、フィーチャ、利点、および態様は、以下の記載および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかとなる。しかし、本願の好適な実施形態を示す以下の記載、添付の特許請求の範囲、および具体例は、実例としてのみ示されていることが理解されるべきである。開示した発明の趣旨および範囲内の様々な変更および改変は、以下を読むことから当業者に容易に明らかとなる。
定義
本明細書において使用する場合、以下の表現は一般に、これらが使用されている脈絡が別段に示す程度を除き、以下に示す意味を好ましくは有するように意図されている。
本明細書において使用する場合、以下の表現は一般に、これらが使用されている脈絡が別段に示す程度を除き、以下に示す意味を好ましくは有するように意図されている。
表現「含む」は、本明細書において使用する場合、その文字通りの意味に加えて、表現「から本質的になる」および「からなる」も含み、具体的に指す。したがって、表現「含む」は、具体的に列挙されたエレメントを「含む」主題がさらなるエレメントを含まない実施形態、ならびに具体的に列挙されたエレメントを「含む」主題がさらなるエレメントを包含する場合があり、かつ/または実際に包含する実施形態を指す。同様に、表現「有する」は、表現「含む」として理解されるべきであり、表現「から本質的になる」および「からなる」も含み、具体的に指す。用語「から本質的になる」は、可能であれば、特に主題がそれから本質的になる明確に列挙されたエレメントに加えて、主題が20%もしくはそれ未満、特に15%もしくはそれ未満、10%もしくはそれ未満または特に5%もしくはそれ未満のさらなるエレメントを含む実施形態を指す。
用語「抗体」は、特に、ジスルフィド結合によって接続された少なくとも2本の重鎖および2本の軽鎖を含むタンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域(VH)および重鎖定常領域(CH)から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)および軽鎖定常領域(CL)から構成される。重鎖定常領域は、3つ、またはIgMもしくはIgEタイプの抗体の場合では、4つの重鎖定常ドメイン(CH1、CH2、CH3、およびCH4)を含み、第1の定常ドメインCH1は、可変領域に隣接しており、ヒンジ領域によって第2の定常ドメインCH2に接続されている場合がある。軽鎖定常領域は、1つの定常ドメインのみからなる。可変領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域とともに散在した相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができ、各可変領域は、3つのCDRおよび4つのFRを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。重鎖定常領域は、γ−、δ−、α−、μ−またはε−型重鎖などの任意の型のものであってもよい。好ましくは、抗体の重鎖は、γ−鎖である。さらに、軽鎖定常領域はまた、κ−またはλ−型軽鎖などの任意の型のものであってもよい。好ましくは、抗体の軽鎖は、κ−鎖である。用語「γ(δ、α、μまたはε)型重鎖」および「κ(λ)型軽鎖」は、天然に存在する重鎖または軽鎖定常領域アミノ酸配列、特にヒト重鎖または軽鎖定常領域アミノ酸配列由来の定常領域アミノ酸配列を有する抗体重鎖または抗体軽鎖をそれぞれ指す。特にγ型(特にγ1型)重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列は、ヒトγ(特にヒトγ1のアロタイプの1つ)抗体重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列と少なくとも95%、特に少なくとも98%同一である。さらにκ型軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列は、ヒトκ抗体軽鎖のアロタイプの1つの定常ドメインのアミノ酸配列と、特に少なくとも95%、特に少なくとも98%同一である。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第1の成分(C1q)を含めた宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。抗体は、例えば、ヒト化、ヒト、またはキメラ抗体であり得る。
抗体の抗原結合性部分は、通常、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の全長または1つもしくは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。抗体の結合性断片の例としては、Fab断片、VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価の断片;F(ab)2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された、それぞれが同じ抗原に結合する2つのFab断片を含む二価の断片;VHおよびCH1ドメインからなるFd断片;抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFv断片;およびVHドメインからなるdAb断片が含まれる。
抗体の「Fab部分」は特に、重鎖および軽鎖可変領域(VHおよびVL)、ならびに重鎖および軽鎖定常領域の第1のドメイン(CH1およびCL)を含む抗体の部分を指す。抗体がこれらの領域のすべてを含まない場合では、用語「Fab部分」は、抗体中に存在する領域VH、VL、CH1、およびCLのもののみを指す。好ましくは、「Fab部分」は、抗体の抗原結合性活性を含有する、パパインで天然抗体を消化することによって得られる断片に対応する抗体の部分を指す。特に、抗体のFab部分は、抗原結合部位またはその抗原結合能を包含する。好ましくは、Fab部分は、抗体の少なくともVH領域を含む。
抗体の「Fc部分」は特に、重鎖定常領域2、3、および適用可能な場合、4(CH2、CH3、およびCH4)を含む抗体の部分を指す。特に、Fc部分は、これらの領域のそれぞれのうちの2つを含む。抗体がこれらの領域のすべてを含まない場合では、用語「Fc部分」は、抗体中に存在する領域CH2、CH3、およびCH4のもののみを指す。好ましくは、Fc部分は、抗体の少なくともCH2領域を含む。好ましくは、「Fc部分」は、抗体の抗原結合性活性を含有しない、パパインで天然抗体を消化することによって得られる断片に対応する抗体の部分を指す。特に、抗体のFc部分は、Fc受容体に結合することができ、したがって例えば、Fc受容体結合部位またはFc受容体結合能を含む。
本明細書で用いる用語「抗体」および「抗体構築物」は、ある特定の実施形態では、同じ種類の抗体または抗体構築物の集団をそれぞれ指す。特に、集団の全ての抗体または抗体構築物は、その抗体または抗体構築物を定義するために使用される特徴を示す。ある特定の実施形態では、集団の中の全ての抗体または抗体構築物は、同じアミノ酸配列を有する。特定の種類の抗体または抗体構築物、例えばMUC1のエピトープおよびCD3のエピトープに特異的に結合する多重特異的抗体構築物への言及は、この種の抗体または抗体構築物の集団を特に指す。
本明細書で使用される用語「抗体」はまた、前記抗体の断片および誘導体を含む。抗体の「断片または誘導体」は、特に、前記抗体に由来し、その抗体と同じ抗原に、特に、同じエピトープに結合することができるタンパク質または糖タンパク質である。かくして、本明細書で抗体の断片または誘導体は一般に、機能的断片または誘導体を指す。特に好ましい実施形態においては、抗体の断片または誘導体は、重鎖可変領域を含む。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。抗体の断片または誘導体の例としては、(i)Fab断片、重鎖および軽鎖各々の可変領域および第1の定常ドメインからなる一価の断片;(ii)F(ab)2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価の断片;(iii)重鎖の可変領域および第1の定常ドメインCH1からなるFd断片;(iv)抗体の単一アームの重鎖および軽鎖可変領域からなるFv断片;(v)scFv断片、単一のポリペプチド鎖からなるFv断片;(vi)共に共有結合された2つのFv断片からなる(Fv)2断片;(vii)重鎖可変ドメイン;ならびに(viii)重鎖および軽鎖可変領域の会合が分子間でのみ生じることができ、分子内では生じ得ないような様式で共に共有結合された重鎖可変領域および軽鎖可変領域からなるマルチボディ(multibody)がある。抗体の誘導体は、特に親抗体と同じ抗原に結合するが、それが由来する親抗体とは異なるアミノ酸配列を有する抗体を含む。これらの抗体断片および誘導体は、当業者に公知の従来技術を使用して得られる。
標的アミノ酸配列が、その全長にわたって、少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の参照アミノ酸配列の対応する部分と相同性または同一性を共有する場合、標的アミノ酸配列は、参照アミノ酸配列に「由来する」または「対応する」。「対応する部分」は、例えば、標的抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域1(FRH1)が参照抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域1に対応することを意味する。特定の実施形態では、参照アミノ酸配列に「由来する」または「対応する」標的アミノ酸配列は、その全長にわたって、参照アミノ酸配列の対応する部分と100%相同、または特に、100%同一である。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「相同性」または「同一性」は、参照配列の全長にわたって、または相同性もしくは同一性が定義される配列に対応する参照配列の対応する部分の全長にわたって、本発明によって好ましくは決定される。特定のCDR配列または特定の可変領域配列などの1つまたは複数のアミノ酸配列によって定義される親抗体に由来する抗体は、特に親抗体のそれぞれのアミノ酸配列と少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相同または同一、特に同一であるCDR配列または可変領域配列などのアミノ酸配列を有する抗体である。ある特定の実施形態においては、親抗体に由来する抗体(すなわちその誘導体)は、親抗体と同じCDR配列を有するが、可変領域の残りの配列において異なる。
本明細書で使用される用語「抗体」はまた、多価および多特異的抗体、すなわち、各々同じエピトープに結合する2つよりも多い結合部位を有する抗体構築物と、第1のエピトープに結合する1つまたは複数の結合部位および第2のエピトープに結合する1つまたは複数の結合部位ならびに必要に応じて、さらなるエピトープに結合するまたさらなる結合部位を有する抗体構築物とを指す。
「特異的結合」は、好ましくは、抗体などの作用物質が、別の標的への結合性と比較して特異的であるエピトープなどの標的により強く結合することを意味する。作用物質は、これが第2の標的の解離定数(Kd)より低い解離定数で第1の標的に結合する場合、第2の標的と比較して第1の標的により強く結合する。好ましくは、作用物質が特異的に結合する標的の解離定数は、作用物質が特異的に結合しない標的の解離定数より100倍超、200倍、500倍、または1000倍超低い。さらに、用語「特異的結合」は特に、少なくとも106M−1、好ましくは少なくとも107M−1、より好ましくは少なくとも108M−1のKaを有する結合パートナー間の結合親和性を示す。ある特定の抗原に特異的な抗体とは、特に、少なくとも106M−1、好ましくは少なくとも107M−1、より好ましくは少なくとも108M−1の親和性定数Kaを有する親和性で前記抗原に結合することができる抗体を指す。例えば、用語「抗MUC1抗体」とは、特に、MUC1に特異的に結合する抗体を指し、好ましくは、少なくとも106M−1、好ましくは少なくとも107M−1、より好ましくは少なくとも108M−1のKaを有する親和性でMUC1に結合することができる。
本明細書で言及される「抗体モジュール」は、抗体に由来し、抗原に特異的に結合することが可能であるポリペプチド構築物を指す。特に、抗体モジュールは、少なくとも1つの、特に2つの抗体重鎖を含み、必要に応じて少なくとも1つの、特に2つの抗体軽鎖を含む。
本明細書で用いる用語「抗原結合性断片」は、抗体に由来し、抗原に特異的に結合することが可能であるが、天然抗体の全てのエレメントを含むとは限らないポリペプチド構築物を指す。特に、抗原結合性断片は抗体の定常ドメインの一部もしくは全部を含まず、2つの抗原結合性部位の代わりに1つだけを含むことができる。
「CD3」は、T細胞共受容体CD3(表面抗原分類3)、特にヒトCD3を指す。それは、4つの別々のポリペプチド鎖、CD3γ鎖、CD3δ鎖および2つのCD3ε鎖で一般的に構成される。T細胞受容体(TCR)と一緒に、CD3はTCR−CD3複合体を形成することができる。
用語「MUC1」は、タンパク質MUC1を指し、ムチン−1、多形性上皮ムチン(PEM)またはがん抗原15−3としても公知であり、特にヒトMUC1を指す。MUC1はムチンファミリーのメンバーであり、膜結合型のグリコシル化リンタンパク質をコードする。MUC1は120〜225kDaのコアタンパク質質量を有し、それは、グリコシル化で250〜500kDaまで増加する。それは、細胞の表面から200〜500nmを越えて伸長する。このタンパク質は、膜貫通ドメインによって多くの上皮細胞の頂端膜側に固定されている。細胞外ドメインは、20個のアミノ酸の可変数タンデムリピート(VNTR)ドメインを含み、リピート数は、異なる個体において20〜120で変動する。これらのリピートは、セリン、トレオニンおよびプロリン残基を豊富に含み、これらは高O−グリコシル化を可能にする。ある特定の実施形態では、用語「MUC1」は、腫瘍関連MUC1(「TA−MUC1」)を指す。TA−MUC1は、がん細胞に存在するMUC1である。このMUC1は、そのかなりより高い発現レベル、その局在化およびそのグリコシル化において、非がん細胞に存在するMUC1と異なる。特に、TA−MUC1はがん細胞の細胞表面全体に無極性的に存在するが、非がん細胞では、MUC1は厳密に頂端性の発現を有し、したがって、全身投与される抗体にとってアクセス可能でない。さらに、TA−MUC1は、MUC1タンパク質主鎖の上で新しいペプチドエピトープを、および新しい炭水化物腫瘍抗原、例えばトムゼン−フリーデンライヒ抗原アルファ(TFα)を曝露させる異常なO−グリコシル化を有する。
トムゼン−フリーデンライヒ抗原アルファまたはCore−1とも呼ばれる「TFα」は、癌腫細胞においてタンパク質のヒドロキシアミノ酸セリンまたはトレオニンにアルファ−アノマー配置でO−グリコシドにより連結する二糖Gal−β1,3−GalNAcを指す。
用語「シアル酸」は、特に、ノイラミン酸の任意のN−またはO−置換誘導体を指す。それは、5−N−アセチルノイラミン酸および5−N−グリコリルノイラミン酸の両方を指す場合があるが、好ましくは5−N−アセチルノイラミン酸のみを指す。シアル酸、特に、5−N−アセチルノイラミン酸は、好ましくは2,3−または2,6−結合により炭水化物鎖に結合する。好ましくは、本明細書に記載の抗体調製物において、2,3−および2,6−結合シアル酸の両方が存在する。
本発明による「グリカンの相対量」は、抗体調製物の、または抗体を含む組成物中の、それぞれ、抗体に結合したグリカンの特定のパーセンテージまたはパーセンテージ範囲を指す。特に、グリカンの相対量は、抗体中に含まれ、かくして、抗体調製物中の、または抗体を含む組成物中の、抗体のポリペプチド鎖に結合したすべてのグリカンの特定のパーセンテージまたはパーセンテージ範囲を指す。グリカンの100%は、抗体集団の、または抗体を含む組成物中の、それぞれ、抗体に結合したすべてのグリカンを指す。例えば、10%の二分岐GlcNAcを担持するグリカンの相対量は、抗体に含まれ、かくして前記組成物中の抗体ポリペプチド鎖に結合したすべてのグリカンの10%が、二分岐GlcNAc残基を含むが、抗体に含まれ、かくして前記組成物中の抗体ポリペプチド鎖に結合したすべてのグリカンの90%が、二分岐GlcNAc残基を含まない、抗体を含む組成物を指す。100%を表すグリカンの対応する基準量は、組成物中の抗体に結合したすべてのグリカン構造またはすべてのN−グリカン、すなわち組成物中の抗体のアスパラギン残基に結合したすべてのグリカン構造またはすべての複合体型グリカンのいずれかであってよい。グリカン構造の参照群は、一般に明確に示されるまたは当業者によって状況から直ちに導き出せる。
用語「N−グリコシル化」は、タンパク質のポリペプチド鎖のアスパラギン残基に結合したすべてのグリカンを指す。これらのアスパラギン残基は、一般に、アミノ酸配列Asn−Xaa−Ser/Thrを有するN−グリコシル化部位の一部であり、式中Xaaは、プロリンを除く任意のアミノ酸であってよい。同様に「N−グリカン」は、ポリペプチド鎖のアスパラギン残基に結合したグリカンである。用語「グリカン」、「グリカン構造」、「炭水化物」、「炭水化物鎖」および「炭水化物構造」は、一般に本明細書において同意語として使用される。一般にN−グリカンは、2個のN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基および3個のマンノース残基からなる一般的コア構造を有し、Asnがポリペプチド鎖のアスパラギン残基である構造Manα1,6−(Manα1,3−)Manβ1,4−GlcNAcβ1,4−GlcNAcβ1−Asnを有する。N−グリカンは、3つの異なる種類、すなわち複合体型グリカン、ハイブリッド型グリカンおよび高マンノース型グリカンにさらに細分される。
本明細書で与えられる数値、特に、特異的グリコシル化特性の相対量は、好ましくは概数として理解されるべきである。特に、数値は、好ましくは最大で10%高い、および/または低い、特に、最大で9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%または1%高い、および/または低い場合がある。
用語「核酸」は、1本鎖および2本鎖核酸およびリボ核酸およびデオキシリボ核酸を含む。天然に存在するおよび合成のヌクレオチドを含んでよく、例えばメチル化、5’および/または3’キャッピングによって天然でまたは合成的に改変されてよい。
用語「発現カセット」は、特にそれに導入されたコード核酸配列の発現を可能にでき、制御できる核酸構築物を指す。発現カセットは、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサーおよび遺伝子の転写またはmRNAの翻訳を制御する他の調節エレメントを含んでよい。発現カセットの正確な構造は、種または細胞型の機能によって変動する場合があるが、一般にTATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列などの、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する5’非転写ならびに5’および3’非翻訳配列を含む。さらに詳細には、5’非転写発現調節配列は、作動可能に繋がれた核酸の転写調節のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。発現カセットは、エンハンサー配列または上流活性化配列も含む場合がある。
本発明によれば、用語「プロモーター」は、発現される核酸配列の上流(5’)に位置付けられ、RNAポリメラーゼのための認識および結合部位を提供することによって配列の発現を調節する核酸配列を指す。「プロモーター」は、遺伝子の転写の制御に関与するさらなる因子のためのさらなる認識および結合部位も含んでよい。プロモーターは、原核生物または真核生物遺伝子の転写を調節できる。さらにプロモーターは、「誘導性」である場合がある、すなわち誘導剤への応答で転写を開始する、または転写が誘導剤によって調節されない場合は「構成的」である場合がある。誘導性プロモーターの調節下にある遺伝子は、誘導剤が存在しない場合は、発現されないまたは少量発現されるのみである。誘導剤の存在下で遺伝子は、スイッチがオンになるまたは転写のレベルが増大される。これは、一般に、特異的転写因子の結合によって媒介される。
用語「ベクター」は、その最も一般的な意味で本明細書において使用され、核酸が、例えば原核生物および/または真核生物細胞に導入され、適切な場合はゲノムに組み込まれるようにする、核酸に関する任意の中間ビヒクルを含む。この種類のベクターは、細胞において好ましくは複製されるおよび/または発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスゲノムを含む。本明細書において使用される用語「プラスミド」は一般に、染色体DNAとは無関係に複製できる染色体外遺伝子材料の構築物、通常環状DNA二重鎖に関する。
本発明によれば、用語「宿主細胞」は、外来性核酸を用いて形質転換またはトランスフェクトされ得る任意の細胞に関する。用語「宿主細胞」は、本発明によれば、原核生物細胞(例えばE.coli)または真核生物細胞(例えば哺乳動物細胞、特にヒト細胞、酵母細胞および昆虫細胞)を含む。特に好ましいのは、ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギまたは霊長類からの細胞などの哺乳動物細胞である。細胞は、多様な組織型に由来してよく、初代細胞および細胞株を含む。核酸は、単一のコピーまたは2つもしくはそれより多いコピーの形態で宿主細胞中に存在してよく、一実施形態においては、宿主細胞において発現される。
本発明による用語「患者」は、ヒト、非ヒト霊長類または別の動物、特にウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはマウスおよびラットなどのげっ歯類などの哺乳動物を意味する。特に好ましい実施形態においては、患者はヒトである。
本発明による用語「がん」は、特に、白血病、精上皮腫、黒色腫、癌腫、奇形腫、リンパ腫、肉腫、中皮腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、子宮内膜がん、腎がん、副腎がん、甲状腺がん、血液のがん、皮膚がん、脳のがん、子宮頸がん、腸がん(intestinal cancer)、肝がん、結腸がん、胃がん、腸がん(intestine cancer)、頭頸部がん、胃腸がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、膵がん、耳鼻咽喉(ENT)がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がんおよび肺がんならびにそれらの転移を含む。本発明による用語がんはまた、がん転移を含む。
「腫瘍」とは、誤調節された細胞増殖により形成される細胞群または組織を意味する。腫瘍は、構造的組織化および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常、明確な組織塊を形成する場合があり、それは、良性である場合も、悪性である場合もある。
「転移」とは、身体のその元の部位から別の部分へのがん細胞の拡散を意味する。転移の形成は非常に複雑なプロセスであり、通常、原発性腫瘍からのがん細胞の剥離、体内循環への進入および身体の他の場所の正常組織内で定着して増殖することを含む。腫瘍細胞が転移する場合、新しい腫瘍は、続発性または転移性腫瘍と呼ばれ、その細胞は通常、元の腫瘍内の細胞に似ている。このことは、例えば、乳がんが肺へと転移した場合、続発性腫瘍は、異常な乳房細胞から構成されており、異常な肺細胞から構成されているわけではないことを意味する。そこで、肺における腫瘍は、転移性乳がんと呼ばれ、肺がんとは呼ばれない。
用語「医薬組成物」は特に、ヒトまたは動物に投与するのに適した組成物、すなわち、薬学的に許容される成分を含有する組成物を指す。好ましくは、医薬組成物は、担体、希釈剤、または薬学的賦形剤、例えば、緩衝剤、保存剤および張度修飾物質などと一緒に、活性化合物、またはその塩またはプロドラッグを含む。
本明細書に記載の数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。本明細書に提供される表題は、全体として本明細書を参照することによって読むことができる本発明の様々な態様または実施形態の限定ではない。一実施形態によれば、方法の場合に、ある特定のステップを含むとして、または組成物の場合に、ある特定の成分を含むとして本明細書に記載される主題は、それぞれのステップまたは成分からなる主題を指す。本明細書に記載の好適な態様および実施形態を選択し、組み合わせることは好適であり、好適な実施形態のそれぞれの組み合わせから生じる特定の主題も本開示に属する。
本発明は、CD3に特異的に結合するscFv断片がMUC1を標的にする抗がん抗体に融合している、二重特異的抗体構築物の開発に基づいている。確立された抗MUC1抗体は、腫瘍関連MUC1に結合し、細胞傷害性免疫細胞を動員、活性化することによってそれらの抗がん活性を発揮する。免疫細胞、特にナチュラルキラー細胞(NK細胞)の結合および活性化は、抗体のFc部分と、免疫細胞上のFcγ受容体、特にFcγRIIIaとの相互作用を介して達成される。活性化の際に、抗体依存性細胞傷害(ADCC)が開始される。腫瘍細胞の殺滅は、高度に効率的な細胞傷害性Tリンパ球によって媒介することもできる。これを考慮すれば、本発明者らは、これらの抗体に抗CD3結合性断片を結合させることによって、確立された抗MUC1抗体の有効性をさらに改善した。CD3は細胞傷害性Tリンパ球の細胞表面タンパク質であり、抗CD3結合性断片は、抗MUC1抗体が標的にする腫瘍部位に前記細胞傷害性Tリンパ球を動員する。
本発明者らは、これに関して、抗MUC1抗体の重鎖のC末端への抗CD3結合性断片の結合が、有意に改善したCD3結合およびT細胞活性化、例えば、T細胞媒介ADCC活性およびT細胞増殖をもたらすことを驚くべきことに見出した。対照的に、抗MUC1抗体の軽鎖のC末端に抗CD3結合性断片を含む二重特異的構築物は、低減したCD3結合およびT細胞活性化を示した。関連した技術分野ではT細胞結合性ドメインとがん細胞結合性ドメインの間の短い距離が強く有利であったので、これは非常に意外であった(例えば、Bluemel, C.ら(2010年)Cancer Immunol Immunother59巻:1197〜1209頁;Chames, P.およびBaty, D.(2009年)mAbs1巻(6号):539〜547頁を参照)。これと対照的に、結合性ドメインの間の距離は、抗CD3結合性断片が軽鎖のC末端に結合している構築物と比較して、抗CD3結合性断片が重鎖のC末端に結合している、本発明の抗体構築物においてかなりより大きい。腫瘍抗原HER2およびCD3を標的にする対照構築物では、実際、2つの結合性部位の間の短い距離は当技術分野で教示されるように有利であった。ここでは、T細胞活性化は、重鎖C末端と比較して軽鎖C末端にCD3結合性部位を有する構築物でより強かった。
この教示は、2つの異なる抗MUC1抗体で検証された。PankoMabは、腫瘍細胞の上だけでアクセス可能である、MUC1の細胞外リピート領域の中のTA−MUC1エピトープに特異的に結合する。KaroMabは、同様に腫瘍細胞の上だけでアクセス可能である、MUC1の上に存在する炭水化物構造体であるトムゼン−フリーデンライヒ抗原に結合する。抗がん抗体PankoMabおよびKaroMabの場合、抗CD3 scFv断片が抗がん抗体の重鎖のC末端に融合している抗体構築物で、優れたCD3結合およびT細胞活性化が得られた。
これらの知見から、本発明は、
(i)少なくとも1つの抗体重鎖を含む抗MUC1抗体モジュール、および
(ii)抗CD3抗原結合性断片
を含む特異的抗体構築物であって、前記抗原結合性断片が前記抗体モジュールの重鎖のC末端に融合している、多重特異的抗体構築物を提供する。
(i)少なくとも1つの抗体重鎖を含む抗MUC1抗体モジュール、および
(ii)抗CD3抗原結合性断片
を含む特異的抗体構築物であって、前記抗原結合性断片が前記抗体モジュールの重鎖のC末端に融合している、多重特異的抗体構築物を提供する。
多重特異的抗体構築物は、異なる抗原に特異的に結合する2つまたはそれより多くの異なる抗原結合性部位を含むタンパク質構築物である。少なくとも1つの抗原結合性部位がMUC1のエピトープに特異的に結合し、少なくとも1つの他の抗原結合性部位がCD3に特異的に結合する。多重特異的抗体構築物はMUC1のエピトープに特異的に結合する1つより多い抗原結合性部位を含むことができ、その抗原結合性部位は同じアミノ酸配列を有することができる。特に、MUC1のエピトープに特異的に結合する全ての抗原結合性部位は、抗MUC1抗体モジュールの一部である。さらに、多重特異的抗体構築物はCD3に特異的に結合する1つより多い抗原結合性部位を含むことができ、その抗原結合性部位は同じアミノ酸配列を有することができる。CD3に特異的に結合する抗原結合性部位は、同じ抗原結合性断片の一部であってもよく、または別個の抗原結合性断片に存在してもよい。
抗原結合性部位は、少なくとも1つの抗体可変領域、特に抗体重鎖可変領域を含む。特定の実施形態においては、抗原結合性部位は、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む。抗原結合性部位の抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域は、ペプチドリンカーを介して互いに融合させることができる。ある特定の実施形態では、抗原結合性部位は、単鎖可変領域断片(scFv)である。
抗MUC1抗体モジュール
抗MUC1抗体モジュールは、MUC1のエピトープに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合性部位を含む。ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、MUC1のエピトープに特異的に結合する少なくとも2つの、特に厳密には2つの抗原結合性部位を含む。これらの抗原結合性部位は異なってもよく、または同一であってもよく、特に同じアミノ酸配列を有することができる。特定の実施形態においては、抗体モジュールの抗原結合性部位は、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む。
抗MUC1抗体モジュールは、MUC1のエピトープに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合性部位を含む。ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、MUC1のエピトープに特異的に結合する少なくとも2つの、特に厳密には2つの抗原結合性部位を含む。これらの抗原結合性部位は異なってもよく、または同一であってもよく、特に同じアミノ酸配列を有することができる。特定の実施形態においては、抗体モジュールの抗原結合性部位は、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む。
抗MUC1抗体モジュールは、少なくとも1つの抗体重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、2つの抗体重鎖を含む。抗体重鎖は、VHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを特に含む。ある特定の他の実施形態では、抗体重鎖はCH2ドメインおよびCH3ドメインを含むが、CH1ドメインを含まない。さらなる実施形態では、重鎖の1つまたは複数の定常ドメインは、他のドメイン、特に類似のドメイン、例えばアルブミンと置き換えることができる。抗体重鎖は、γ、α、ε、δおよびμ鎖を含む任意のタイプであってよく、好ましくは、γ1、γ2、γ3およびγ4鎖を含むγ鎖、特にγ1鎖である。したがって、抗体モジュールは、好ましくはIgG型の抗体モジュール、特にIgG1型の抗体モジュールである。
好ましい実施形態では、抗体モジュールは、Fc領域を含む。抗体モジュールは、特に、ドメインVH、CH1、ヒンジ領域、CH2およびCH3を各々含む2つの重鎖ならびにドメインVLおよびCLを各々含む2つの軽鎖を含む完全抗体であってよい。抗体モジュールは、1つまたは複数のヒトFcγ受容体、特にヒトFcγ受容体IIIAに結合することが特に可能である。ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、ヒトFcγ受容体IIIAに結合しないかまたは顕著には結合しない。これらの実施形態では、抗体モジュールは、CH2ドメインにおいてグリコシル化部位を特に含まない。
特に、抗体モジュールは、少なくとも1つの抗体軽鎖、特に2つの抗体軽鎖をさらに含む。抗体軽鎖は、VLドメインおよびCLドメインを特に含む。抗体軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であってもよく、特にκ鎖である。ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、2つの抗体重鎖および2つの抗体軽鎖を含む。
代わりの実施形態では、抗体モジュールは、抗体軽鎖を含まない。これらの実施形態では、抗体モジュールの抗体重鎖は、軽鎖可変領域をさらに含むことができる。特に、軽鎖可変領域は重鎖のN末端に融合しているか、または重鎖可変領域のC末端側に挿入される。軽鎖可変領域を重鎖の残りの部分と繋ぐために、ペプチドリンカーが存在してもよい。
抗MUC1抗体モジュールは、MUC1のエピトープに特異的に結合する。エピトープはMUC1に特異的であってよく、すなわち、それは他の分子の上に存在しないか、またはそれは他の分子の上にも見出されるエピトープであってもよい。
ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、グリコシル化依存的にMUC1に結合する。特に、それがグリコシル化される場合、特に細胞外タンデムリピートにおいてグリコシル化される場合、抗体モジュールはMUC1により強く結合する。特定の実施形態においては、それがN−アセチルガラクトサミン(Tn)、シアリルα2−6N−アセチルガラクトサミン(sTn)、ガラクトースβ1−3N−アセチルガラクトサミン(TF)またはガラクトースβ1−3(シアリルα2−6)N−アセチルガラクトサミン(sTF)、好ましくはTnまたはTFでO−グリコシル化される場合、抗体モジュールはMUC1により強く結合する。
ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、MUC1の細胞外タンデムリピートのエピトープに特異的に結合する。特に、抗体モジュールは、前記タンデムリピートがN−アセチルガラクトサミン(Tn)、シアリルα2−6N−アセチルガラクトサミン(sTn)、ガラクトースβ1−3 N−アセチルガラクトサミン(TF)またはガラクトースβ1−3(シアリルα2−6)N−アセチルガラクトサミン(sTF)により、好ましくはTnまたはTFにより、トレオニン残基でグリコシル化された場合、より強く結合する。好ましくは、炭水化物部分は、α−O−グリコシド結合によってトレオニン残基に結合される。
特定の実施形態においては、抗体モジュールは、アミノ酸配列PDTR(配列番号19)またはPDTRP(配列番号20)を含むMUC1のタンデムリピートドメインのエピトープに特異的に結合することができる。このエピトープへの結合は、好ましくは、上記のように、グリコシル化依存的であり、特に、上記の炭水化物部分が、それぞれ、配列PDTRまたはPDTRP(配列番号19および20)のトレオニン残基に結合している場合、結合が増大する。
ある特定の実施形態においては、抗体モジュールは、腫瘍関連MUC1エピトープ(TA−MUC1)に特異的に結合する。TA−MUC1エピトープは、特に、腫瘍細胞上に存在するが、正常細胞上には存在しない、かつ/または腫瘍細胞上に存在する場合のみ宿主循環中の抗体によってアクセス可能であるが、正常細胞上に存在する場合アクセス可能でない、MUC1のエピトープを指す。上記のエピトープ、特に、MUC1のタンデムリピートドメインに存在するエピトープは、腫瘍関連MUC1エピトープであり得る。ある特定の実施形態においては、抗体モジュールの、TA−MUC1エピトープを発現する細胞への結合は、正常な非腫瘍MUC1を発現する細胞への結合より強い。好ましくは、前記結合は、少なくとも1.5倍強く、好ましくは少なくとも2倍強く、少なくとも5倍強く、少なくとも10倍強く、または少なくとも100倍強い。特に、TA−MUC1は、その細胞外タンデムリピート領域において少なくとも1つのN−アセチルガラクトサミン(Tn)またはガラクトースβ1−3 N−アセチルガラクトサミン(TF)によりグリコシル化される。ある特定の実施形態においては、抗体モジュールは、N−アセチルガラクトサミン(Tn)またはガラクトースβ1−3 N−アセチルガラクトサミン(TF)を含むTA−MUC1の細胞外タンデムリピート領域のこのエピトープに特異的に結合する。特に、前記エピトープは、MUC1タンデムリピートの少なくとも1つのPDTR配列(配列番号19)またはPDTRP配列(配列番号20)を含み、好ましくはα−O−グリコシド結合を介して、N−アセチルガラクトサミン(Tn)またはガラクトースβ1−3 N−アセチルガラクトサミン(TF)によりPDTR配列(配列番号19)またはPDTRP配列(配列番号20)のトレオニンでグリコシル化される。TA−MUC1結合について、抗体モジュールは、結合強度が、同一の長さおよび同一のペプチド配列の非グリコシル化ペプチドへの結合と比較して、少なくとも2倍、好ましくは4倍または10倍、最も好ましくは20倍増大するように、好ましくはグリコシル化MUC1腫瘍エピトープに特異的に結合する。
以下において、TA−MUC1に特異的に結合する抗体モジュールの特定の実施形態が記載される。
ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、配列番号1のアミノ酸配列を有する相補性決定領域CDR−H1、配列番号3のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号5のアミノ酸配列を有するCDR−H3を含む、または配列番号2のアミノ酸配列を有する相補性決定領域CDR−H1、配列番号4のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR−H3を含む、少なくとも1つの重鎖可変領域を含む。一実施形態によれば、抗体モジュールに存在する重鎖可変領域は、配列番号7、8もしくは9のアミノ酸配列または前記配列のうちの1つと少なくとも75%、特に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくは少なくとも97%同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態においては、抗体モジュールの重鎖可変領域は、(i)CDR−H1が配列番号1のアミノ酸配列を有し、CDR−H2が配列番号3のアミノ酸配列を有し、CDR−H3が配列番号5のアミノ酸配列を有するか、またはCDR−H1が配列番号2のアミノ酸配列を有し、CDR−H2が配列番号4のアミノ酸配列を有し、CDR−H3が配列番号6のアミノ酸配列を有する1組のCDRを含み、(ii)配列番号7、8および9、特に9のうちのいずれか1つと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%同一である、アミノ酸配列を含む。
抗体モジュールは、配列番号10のアミノ酸配列を有する相補性決定領域CDR−L1、配列番号12のアミノ酸配列を有するCDR−L2および配列番号14のアミノ酸配列を有するCDR−L3、または配列番号11のアミノ酸配列を有する相補性決定領域CDR−L1、配列番号13のアミノ酸配列を有するCDR−L2および配列番号15のアミノ酸配列を有するCDR−L3を含む、少なくとも1つの軽鎖可変領域をさらに含むことができる。一実施形態によれば、抗体モジュールに存在する軽鎖可変領域は、配列番号16、17、18、52もしくは53のアミノ酸配列または前記配列のうちの1つと少なくとも75%、特に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくは少なくとも97%同一であるアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態においては、抗体モジュールの軽鎖可変領域は、(i)CDR−L1が配列番号10のアミノ酸配列を有し、CDR−L2が配列番号12のアミノ酸配列を有し、CDR−L3が配列番号14のアミノ酸配列を有するか、またはCDR−L1が配列番号11のアミノ酸配列を有し、CDR−L2が配列番号13のアミノ酸配列を有し、CDR−L3が配列番号15のアミノ酸配列を有する1組のCDRを含み、(ii)配列番号16、17、18、52および53、特に18のうちのいずれか1つと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%同一である、アミノ酸配列を含む。
特定の好ましい実施形態では、抗体モジュールは、配列番号9のアミノ酸配列を含む少なくとも1つの、特に2つの重鎖可変領域、および配列番号18のアミノ酸配列を含む少なくとも1つの、特に2つの軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、抗体モジュールは、上記の配列の1つまたは複数を含む抗体、特に、例えば、WO2004/065423およびWO2011/012309に記載されるそのキメラのもしくはヒト化されたバージョンの抗体PankoMab、または抗体ガチポツズマブ(Gatipotuzumab)に由来する。
特定の実施形態においては、抗体モジュールは、トムゼン−フリーデンライヒ抗原TFαに特異的に結合する。TFαは、癌腫細胞においてタンパク質のヒドロキシアミノ酸セリンまたはトレオニンにα−アノマー配置でO−グリコシドにより連結する二糖構造Gal−β1,3−GalNAcである。がん細胞におけるTFαの主な担体の1つは、MUC1である。TFαは、MUC1の細胞外領域の中のタンデムリピートのO−グリコシル化部位に特に存在する。したがって、抗体モジュールは、MUC1の上のTFαに特に結合する。
以下において、TFαに特異的に結合する抗体モジュールの特定の実施形態が記載される。
ある特定の実施形態では、抗体モジュールは、配列番号21のアミノ酸配列を有する相補性決定領域CDR−H1、配列番号22または23のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号24、25または26のアミノ酸配列を有するCDR−H3を含む、少なくとも1つの重鎖可変領域を含む。特に、重鎖可変領域は、配列番号21、22および24のアミノ酸配列を有するCDRを含む。一実施形態によれば、抗体モジュールに存在する重鎖可変領域は、配列番号27〜32のいずれか1つのアミノ酸配列または前記配列のうちの1つと少なくとも75%、特に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくは少なくとも97%同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態においては、抗体モジュールの重鎖可変領域は、(i)CDR−H1が配列番号21のアミノ酸配列を有し、CDR−H2が配列番号22のアミノ酸配列を有し、CDR−H3が配列番号24または25のアミノ酸配列を有する1組のCDRを含み、(ii)配列番号27〜32のうちのいずれか1つと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%同一である、アミノ酸配列を含む。
抗体モジュールは、配列番号33、34または35のアミノ酸配列を有する相補性決定領域CDR−L1、配列番号36または37のアミノ酸配列を有するCDR−L2および配列番号38または39のアミノ酸配列を有するCDR−L3を含む、少なくとも1つの軽鎖可変領域をさらに含むことができる。特に、重鎖可変領域は、配列番号33、36および38のアミノ酸配列を有するCDR−L3のアミノ酸配列を有するCDRを含む。一実施形態によれば、抗体モジュールに存在する軽鎖可変領域は、配列番号40、41および42のいずれか1つのアミノ酸配列または前記配列のうちの1つと少なくとも75%、特に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくは少なくとも97%同一であるアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態においては、抗体モジュールの軽鎖可変領域は、(i)CDR−L1が配列番号33のアミノ酸配列を有し、CDR−L2が配列番号36のアミノ酸配列を有し、CDR−L3が配列番号38のアミノ酸配列を有する1組のCDRを含み、(ii)配列番号40、41および42のうちのいずれか1つと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%同一である、アミノ酸配列を含む。
特定の好ましい実施形態では、抗体モジュールは、配列番号27、29、30または31のアミノ酸配列を含む少なくとも1つの、特に2つの重鎖可変領域、および配列番号40、41または42のアミノ酸配列を含む少なくとも1つの、特に2つの軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、抗体モジュールは、上記の配列の1つまたは複数を含む抗体に由来する。
抗CD3抗原結合性断片
抗CD3抗原結合性断片は、CD3に特異的な少なくとも1つの抗原結合性部位を含む。特に、抗原結合性断片は、抗体重鎖可変領域(VHドメイン)を含む。特定の実施形態においては、抗原結合性断片は、VHドメインと一緒に抗原結合性部位を形成する、抗体軽鎖可変領域(VLドメイン)をさらに含む。VHドメインおよびVLドメインは、同じポリペプチド鎖によって、または別個のポリペプチド鎖によって形成することができる。特に、それらは同じポリペプチド鎖によって形成され、特に、抗原結合性断片は単鎖の断片である。VHドメインおよびVLドメインは、ペプチドリンカーによって互いに連結することができる。VHドメインおよびVLドメインを互いに連結するために、本明細書に記載されるペプチドリンカーを使用することができる。単一のポリペプチド鎖によって形成されるVHドメインおよびVLドメインを含む抗原結合性断片では、VHドメインはVLドメインのN末端またはC末端であってよく、特にVLドメインのN末端である。ある特定の実施形態では、抗原結合性断片は、CD3に特異的に結合する単鎖の可変領域断片(scFv)である。
抗CD3抗原結合性断片は、CD3に特異的な少なくとも1つの抗原結合性部位を含む。特に、抗原結合性断片は、抗体重鎖可変領域(VHドメイン)を含む。特定の実施形態においては、抗原結合性断片は、VHドメインと一緒に抗原結合性部位を形成する、抗体軽鎖可変領域(VLドメイン)をさらに含む。VHドメインおよびVLドメインは、同じポリペプチド鎖によって、または別個のポリペプチド鎖によって形成することができる。特に、それらは同じポリペプチド鎖によって形成され、特に、抗原結合性断片は単鎖の断片である。VHドメインおよびVLドメインは、ペプチドリンカーによって互いに連結することができる。VHドメインおよびVLドメインを互いに連結するために、本明細書に記載されるペプチドリンカーを使用することができる。単一のポリペプチド鎖によって形成されるVHドメインおよびVLドメインを含む抗原結合性断片では、VHドメインはVLドメインのN末端またはC末端であってよく、特にVLドメインのN末端である。ある特定の実施形態では、抗原結合性断片は、CD3に特異的に結合する単鎖の可変領域断片(scFv)である。
抗CD3抗原結合性断片は1つより多い抗原結合性部位を含むことができるが、特に1つの抗原結合性部位だけを含む。ある特定の実施形態では、抗原結合性断片はいかなる抗体定常領域ドメインも含まない。
抗原結合性断片は、CD3のエピトープに特異的に結合する。特に、抗原結合性断片は、CD3εに特異的に結合する。特定の実施形態においては、抗原結合性断片は、特にそれがCD3δと複合体を形成している場合だけ、コンホメーション依存的にCD3εに特異的に結合する。
ある特定の実施形態では、抗原結合性断片は、配列番号43のアミノ酸配列を有する相補性決定領域CDR−H1、配列番号44のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号45のアミノ酸配列を有するCDR−H3を含む、少なくとも1つの重鎖可変領域を含む。一実施形態によれば、抗原結合性断片に存在する重鎖可変領域は、配列番号46のアミノ酸配列または前記配列のうちの1つと少なくとも75%、特に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくは少なくとも97%同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態においては、抗原結合性断片の重鎖可変領域は、(i)CDR−H1が配列番号43のアミノ酸配列を有し、CDR−H2が配列番号44のアミノ酸配列を有し、CDR−H3が配列番号45のアミノ酸配列を有する1組のCDRを含み、(ii)配列番号46のうちのいずれか1つと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%同一である、アミノ酸配列を含む。
抗原結合性断片は、配列番号47のアミノ酸配列を有する相補性決定領域CDR−L1、配列番号48のアミノ酸配列を有するCDR−L2および配列番号49のアミノ酸配列を有するCDR−L3を含む、少なくとも1つの軽鎖可変領域をさらに含むことができる。一実施形態によれば、抗原結合性断片に存在する軽鎖可変領域は、配列番号50のアミノ酸配列または前記配列のうちの1つと少なくとも75%、特に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくは少なくとも97%同一であるアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態においては、抗原結合性断片の軽鎖可変領域は、(i)CDR−L1が配列番号47のアミノ酸配列を有し、CDR−L2が配列番号48のアミノ酸配列を有し、CDR−L3が配列番号49のアミノ酸配列を有する1組のCDRを含み、(ii)配列番号50のうちのいずれか1つと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%同一である、アミノ酸配列を含む。
特定の好ましい実施形態では、抗原結合性断片は、配列番号46のアミノ酸配列を含む少なくとも1つの、特に1つの重鎖可変領域、および配列番号50のアミノ酸配列を含む少なくとも1つの、特に1つの軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、抗体モジュールは、上記の配列の1つまたは複数を含む抗体に由来する。
さらなる実施形態では、抗原結合性断片は、任意の抗CD3抗体に由来することができる。抗原結合性断片が由来することができる抗CD3抗体の適する例には、WO2008/119567A2に開示される、OKT3、TR66、UCHT1、CLB−T3、L2K、DiL2Kおよび抗CD3抗体が含まれる。ある特定の実施形態では、抗原結合性断片は、そのアミノ酸配列がこれらの抗CD3抗体のいずれか1つの重鎖可変領域と少なくとも85%、特に少なくとも90%または少なくとも95%、特に100%同一である、重鎖可変領域を含む。好ましくは、抗原結合性断片は、そのアミノ酸配列が同じ抗CD3抗体の軽鎖可変領域と少なくとも85%、特に少なくとも90%または少なくとも95%、特に100%同一である、軽鎖可変領域をさらに含む。
多重特異的抗体構築物
多重特異的抗体構築物は、少なくとも1つの抗MUC1抗体モジュールを特異的に、および少なくとも1つの抗CD3抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態では、多重特異的抗体構築物は、少なくとも2つ、特に厳密には2つの抗CD3抗原結合性断片を含む。抗原結合性断片は同一であってもまたは異なってもよく、特に同じアミノ酸配列を有する。抗原結合性断片の少なくとも1つは、抗体モジュールの重鎖のC末端に融合している。
多重特異的抗体構築物は、少なくとも1つの抗MUC1抗体モジュールを特異的に、および少なくとも1つの抗CD3抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態では、多重特異的抗体構築物は、少なくとも2つ、特に厳密には2つの抗CD3抗原結合性断片を含む。抗原結合性断片は同一であってもまたは異なってもよく、特に同じアミノ酸配列を有する。抗原結合性断片の少なくとも1つは、抗体モジュールの重鎖のC末端に融合している。
多重特異的抗体構築物が2つの抗原結合性断片を含む特定の実施形態においては、抗体モジュールは、2つの重鎖も含み、抗原結合性断片の各々は、抗体モジュールの異なる重鎖のC末端に融合している。ある特定の実施形態では、抗原結合性断片は、抗体モジュールの重鎖のC末端に融合し、さらなる抗原結合性断片が、第1の抗原結合性断片のC末端に融合している。抗体モジュールが2つの重鎖を含む場合、これはこれらの重鎖の両方についてあてはまり得る。
抗原結合性断片は、ペプチド結合を介して直接的にまたはペプチドリンカーを介して間接的に、抗体モジュールの重鎖のC末端に融合することができる。直接的融合とは、それらの2つの配列の間にいかなる中間のアミノ酸もなしで、抗原結合性断片の配列が抗体モジュールの重鎖の配列に直接的に続く実施形態を指す。ペプチドリンカーを介した融合とは、1つまたは複数のアミノ酸が抗体モジュールの重鎖の配列と抗原結合性断片の配列の間に存在する実施形態を指す。これらの1つまたは複数のアミノ酸は、抗体モジュールの重鎖と抗原結合性断片の間でペプチドリンカーを形成する。
抗体モジュールの重鎖のC末端への抗原結合性断片の結合を特異的に設計することによって、多重特異的抗体構築物の安定性を改善することができることが見出された。特に、ある特定のストレス条件下では、抗体モジュールの重鎖および抗原結合性断片を含む融合ポリペプチドは変性する可能性があり、抗原結合性断片が、抗体モジュールの重鎖から切断される可能性がある。実施例に実証されるように、これは重鎖のC末端の変異によって予防することができる。ある特定の実施形態、特に抗体モジュールがIgG型の抗体モジュールである、および/またはγ型の重鎖を有する実施形態では、抗体モジュールの重鎖のC末端アミノ酸残基は、リシン残基でない。一般的に、IgG抗体のγ型の重鎖は、C末端の最後のアミノ酸としてリシン残基を有する。このリシン残基の置換または欠失は、融合ポリペプチドの分解を阻害する。特定の実施形態においては、抗体モジュールのγ型の重鎖のC末端のリシン残基は欠失しているかまたは別のアミノ酸によって置換され、好ましくは欠失している。
ペプチドリンカーは、抗体モジュールの重鎖および抗原結合性断片を連結するのに適する、任意の数のアミノ酸および任意のアミノ酸配列を原則として有することができる。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも3、好ましくは少なくとも5、少なくとも8、少なくとも10、少なくとも15または少なくとも20個のアミノ酸を含む。さらなる実施形態では、ペプチドリンカーは、50もしくはそれより少ない、好ましくは45もしくはそれより少ない、40もしくはそれより少ない、35もしくはそれより少ない、30もしくはそれより少ない、25もしくはそれより少ない、または20もしくはそれより少ないアミノ酸を含む。特に、ペプチドリンカーは、5から25のアミノ酸、特に10から20のアミノ酸を含む。特定の実施形態においては、ペプチドリンカーは、グリシンおよびセリン残基からなる。グリシンおよびセリンは、2対1、3対1、4対1または5対1(グリシン残基の数対セリン残基の数)の比で、ペプチドリンカーに存在することができる。例えば、ペプチドリンカーは4グリシン残基と続く1セリン残基の配列を、特に、1、2、3、4、5または6リピートのこの配列を含むことができる。具体例は、アミノ酸配列GGGGS(配列番号51)の2つのリピート、アミノ酸配列GGGGS(配列番号51)の3つのリピートおよびアミノ酸配列GGGGS(配列番号51)の4つのリピートを含むかまたはそれからなるペプチドリンカーである。特に、アミノ酸配列GGGGS(配列番号51)の3つまたは4つのリピートからなるペプチドリンカーを使用することができる。特定の実施形態においては、多重特異的抗体構築物は、抗体モジュールの重鎖のC末端と抗原結合性断片のN末端の間にアミノ酸配列GGGGS(配列番号51)の3つまたは4つのリピートを含むペプチドリンカー、および/または抗原結合性断片のVHドメインとVLドメインの間にアミノ酸配列GGGGS(配列番号51)の3つまたは4つのリピートを含むペプチドリンカーを含む。他の実施形態では、ペプチドリンカーは、ヒトにおいて全くまたは少しの免疫原性能力しか示さない配列、好ましくはヒト配列または天然に存在する配列である配列を含む。さらに好ましい実施形態では、ペプチドリンカーおよび隣接するアミノ酸は、全くまたは少しの免疫原性能力しか示さない。上記のペプチドリンカーは、1つの抗原結合性断片に存在する重鎖可変領域および軽鎖可変領域などの、多重特異的抗体構築物の他のエレメントを連結するために使用することもできる。
多重特異的抗体構築物は、特に二重特異的抗体構築物である。二重特異的抗体構築物は、MUC1のエピトープおよびCD3のエピトープに特異的に結合するが、別の抗原に特異的に結合するいかなるさらなる抗原結合性部位も含まない。代替の実施形態では、多重特異的抗体構築物は、他の抗原に特異的に結合する1つまたは複数のさらなる抗原結合性部位を含む。これらのさらなる抗原結合性部位は、多重特異的抗体構築物の任意の場所に存在することができる。ある特定の実施形態では、さらなる抗原結合性部位は、抗体モジュールの抗体軽鎖のC末端に融合している。特に、抗体モジュールが2つの抗体軽鎖を含む場合は、1つまたは複数の抗原結合性部位、特に1つの抗原結合性部位が抗体モジュールの抗体軽鎖の各々のC末端に融合している。これらの抗原結合性部位は同一であってもまたは異なってもよく、特に同じアミノ酸配列を有する。さらなる抗原結合性部位は、任意の抗原に、特に腫瘍関連抗原または免疫細胞のチェックポイント抗原に特異的に結合することができる。そのような抗原の適する例は、EGFR、HER2、PD−1、PD−L1、CD40、CEA、EpCAM、CD7、CD28、GITR、ICOS、OX40、4−1BB、CTLA−4、TFa、LeY、CD160、ガレクチン−3、ガレクチン−1からなる群より選択することができる。
ある特定の実施形態では、多重特異的抗体構築物は、それにコンジュゲートしている1つまたは複数のさらなる作用物質を含む。さらなる作用物質は、多重特異的抗体構築物へのコンジュゲーションに適する任意の作用物質であってよい。1つより多いさらなる作用物質が多重特異的抗体構築物に存在する場合は、これらのさらなる作用物質は同一であっても異なってもよく、特に全て同一である。多重特異的抗体構築物へのさらなる作用物質のコンジュゲーションは、当技術分野で公知である任意の方法を使用して達成することができる。さらなる作用物質は共有結合的に、特に融合もしくは化学的カップリングによって、または非共有結合的に多重特異的抗体構築物に結合させることができる。ある特定の実施形態では、さらなる作用物質は、特にリンカー部分を介して、多重特異的抗体構築物に共有結合している。リンカー部分は、多重特異的抗体構築物にさらなる作用物質を結合させるのに適する任意の化学実体であってよい。
ある特定の実施形態では、さらなる作用物質は、タンパク質のポリペプチドである。このポリペプチドまたはタンパク質は、抗体モジュールのポリペプチド鎖に、または抗原結合性断片のポリペプチド鎖に特に融合させることができる。ある特定の実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用物質は、抗体モジュールの抗体軽鎖のC末端に融合している。抗体モジュールが2つの抗体軽鎖を含む実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用物質は、2つの抗体軽鎖の各々のC末端に融合させることができる。ポリペプチドまたはタンパク質は同一であってもまたは異なってもよく、特に同じアミノ酸配列を有する。ポリペプチドまたはタンパク質であるそのようなさらなる作用物質の適する例は、サイトカイン、ケモカイン、抗体モジュール、抗原結合性断片、酵素および相互作用ドメインからなる群より選択することができる。
さらなる作用物質は、疾患、特にがんの療法、診断、予後診断および/またはモニタリングにおいて好ましくは有益である。例えば、さらなる作用物質は、放射性核種、化学療法剤、検出可能な標識、毒素、細胞溶解性成分、免疫調節物質、イムノエフェクターおよびリポソームからなる群より選択することができる。
多重特異的抗体構築物のグリコシル化
抗MUC1抗体モジュールは、1つまたは複数の抗体重鎖にCH2ドメインを含むことができる。IgG型の天然のヒト抗体は、CH2ドメインにN−グリコシル化部位を含む。抗体モジュールに存在するCH2ドメインは、N−グリコシル化部位を含んでも含まなくてもよい。
抗MUC1抗体モジュールは、1つまたは複数の抗体重鎖にCH2ドメインを含むことができる。IgG型の天然のヒト抗体は、CH2ドメインにN−グリコシル化部位を含む。抗体モジュールに存在するCH2ドメインは、N−グリコシル化部位を含んでも含まなくてもよい。
ある特定の実施形態では、抗体モジュールに存在するCH2ドメインは、N−グリコシル化部位を含まない。特に、抗体モジュールは、IMGT/Eu番号付けシステムによる297位に対応する重鎖の位置に、アスパラギン残基を含まない。例えば、抗体モジュールは、重鎖にAla297変異を含むことができる。これらの実施形態では、多重特異的抗体構築物は、Fcγ受容体への結合を介して、好ましくは抗体依存性細胞傷害(ADCC)および/または抗体依存性細胞性食作用(ADCP)および/または補体依存性細胞傷害(CDC)を誘導する能力が強く低減しているかまたはその能力を完全に欠いている。これに関して強く低減した能力とは、そのCH2ドメインにN−グリコシル化部位を含み、ヒト細胞株またはCHO細胞株における生成によって入手できるものなどの一般的な哺乳動物グリコシル化パターン、例えば本明細書に記載されるグリコシル化パターンを有する、同じ多重特異的抗体構築物と比較して、10%もしくはそれ未満の、特に3%もしくはそれ未満の、1%もしくはそれ未満の、または0.1%もしくはそれ未満の活性への低減を特に指す。
抗体モジュールのCH2ドメインにN−グリコシル化部位を含まない多重特異的抗体構築物が、それにもかかわらずナチュラルキラー細胞(NK細胞)を活性化することが可能であるが、これらの構築物はNK細胞のFcγ受容体に結合することが可能でないことが驚くべきことに見出された。多重特異的抗体構築物はT細胞を動員し、活性化し、次にそれはNK細胞を活性化すると考えられている。
代替の実施形態では、抗体モジュールに存在するCH2ドメインは、N−グリコシル化部位を含む。このグリコシル化部位は、特に、Kabatの番号付けによる重鎖のアミノ酸297位に対応するアミノ酸位置にあり、アミノ酸配列モチーフAsn Xaa Ser/Thr(式中、Xaaはプロリン以外の任意のアミノ酸であってもよい)を有する。Asn297のN結合グリコシル化は、哺乳動物IgGならびに他の抗体アイソタイプの相同領域において保存されている。可変領域または他の配列改変の中に存在してもよい必要に応じたさらなるアミノ酸のため、この保存されたグリコシル化部位の実際の位置は、抗体のアミノ酸配列中で変化してもよい。好ましくは、抗体モジュールに結合したグリカンは、好ましくは、少なくとも以下の構造:
Asn−GlcNAc−GlcNAc−Man−(Man−GlcNAc)2
(式中、Asnは抗体モジュールのポリペプチド部分のアスパラギン残基であり;GlcNAcはN−アセチルグルコサミンであり、Manはマンノースである)
を含む、二分岐型(biantennary)複合型N−結合炭水化物構造である。末端のGlcNAc残基は、必要に応じてシアル酸残基を担持してもよい、ガラクトース残基をさらに担持してもよい。さらなるGlcNAc残基(二分岐(bisecting)GlcNAcと命名される)を、ポリペプチドに最も近いManに結合させることができる。フコースを、Asnに結合したGlcNAcに結合することができる。
Asn−GlcNAc−GlcNAc−Man−(Man−GlcNAc)2
(式中、Asnは抗体モジュールのポリペプチド部分のアスパラギン残基であり;GlcNAcはN−アセチルグルコサミンであり、Manはマンノースである)
を含む、二分岐型(biantennary)複合型N−結合炭水化物構造である。末端のGlcNAc残基は、必要に応じてシアル酸残基を担持してもよい、ガラクトース残基をさらに担持してもよい。さらなるGlcNAc残基(二分岐(bisecting)GlcNAcと命名される)を、ポリペプチドに最も近いManに結合させることができる。フコースを、Asnに結合したGlcNAcに結合することができる。
好ましい実施形態においては、多重特異的抗体構築物は、N−グリコリルノイラミン酸(NeuGc)または検出可能な量のNeuGcを含まない。さらに、多重特異的抗体構築物はまた、好ましくはGaliliエピトープ(Galα1,3−Gal構造)または検出可能な量のGaliliエピトープを含まない。特に、NeuGcおよび/またはGalα1,3−Gal構造を担持するグリカンの相対量は、多重特異的抗体構築物の集団中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の0.1%未満またはさらには0.02%未満である。
特に、多重特異的抗体構築物は、ヒトグリコシル化パターンを有する。これらのグリコシル化特性のために、副作用を誘導する外来性免疫原性非ヒト構造は存在せず、このことは、ある特定の外来糖構造、例えば両方ともげっ歯類生成系について公知の免疫原性非ヒトシアル酸(NeuGc)もしくはGaliliエピトープ(Gal−Gal構造)、または例えば酵母系から公知の免疫原性高マンノース構造のような他の構造により引き起こされることが公知の、望ましくない副作用または不利益が避けられることを意味する。
特定の実施形態においては、多重特異的抗体構築物は、二分岐GlcNAc残基を担持する検出可能な量のグリカンを有する抗体モジュールのCH2ドメインでのグリコシル化パターンを含む。特に二分岐GlcNAc残基を担持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインのグリコシル化部位に結合したグリカンの総量の少なくとも0.5%、特に少なくとも1%である。さらにある特定の実施形態においては、CH2ドメインでのグリコシル化パターンは、組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも30%の少なくとも1個のガラクトース残基を担持するグリカンの相対量を含む。特に少なくとも1個のガラクトース残基を担持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも40%、特に少なくとも45%または少なくとも50%である。
多重特異的抗体構築物は、高い量のコアフコースまたは低い量のコアフコースを有する抗体モジュールのCH2ドメインでのグリコシル化パターンを有する場合がある。CH2ドメインでのフコシル化の量の低減は、ADCCを誘導する多重特異的抗体構築物の能力を増大させる。ある特定の実施形態においては、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の40%もしくはそれ未満、特に30%もしくはそれ未満または20%もしくはそれ未満である。代替の実施形態においては、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも60%、特に少なくとも65%または少なくとも70%である。
抗MUC1抗体モジュールのCH2ドメインにおけるグリコシル化部位の存在または不在、および前記グリコシル化部位のグリカン構造におけるフコースの存在または不在を介して、抗体モジュールのFc部分を介してADCCを誘導する多重特異的抗体構築物の能力、および前記ADCC誘導の強さを制御することができる。細胞傷害性Tリンパ球により媒介されるADCCは、腫瘍部位への前記Tリンパ球の動員によって既に開始されている。これは多重特異的抗体構築物の2つの結合性部位、腫瘍細胞に結合する抗MUC1抗体モジュールおよび細胞傷害性Tリンパ球に結合する抗CD3抗原結合性断片、によって達成される。T細胞およびNK細胞によって媒介される全体のADCC活性は、抗体モジュールのFc部分のグリコシル化によって、および前記グリコシル化におけるフコシル化の量を低減することによってさらに増加させることができる。Fcグリコシル化で、特に低いフコシル化で、NK細胞によって媒介されるADCCがT細胞によって媒介されるADCCに加えられる。ある特定の適用では、ADCC活性の微調整が重要である。したがって、ある特定の状況では、抗体モジュールのCH2ドメインにグリコシル化部位のない多重特異的抗体構築物、抗体モジュールのCH2ドメインにグリコシル化部位があり、多量のフコシル化のある多重特異的抗体構築物、または抗体モジュールのCH2ドメインにグリコシル化部位があり、少量のフコシル化がある多重特異的抗体構築物が最も有利であるかもしれない。
多重特異的抗体構築物は、好ましくは宿主細胞において組換え生成される。多重特異的抗体構築物の生成に使用される宿主細胞は、抗体生成に使用され得る任意の宿主細胞であり得る。好適な宿主細胞は、特に、真核生物宿主細胞、特に、哺乳動物宿主細胞である。宿主細胞の例としては、Pichia pastoris細胞株などの酵母細胞、SF9およびSF21細胞株などの昆虫細胞、植物細胞、EB66アヒル細胞株などの鳥類細胞、CHO、NS0、SP2/0およびYB2/0細胞株などのげっ歯類細胞ならびにHEK293、PER.C6、CAP、CAP−T、AGE1.HN、Mutz−3およびKG1細胞株などのヒト細胞がある。
ある特定の実施形態においては、多重特異的抗体構築物は、ヒト血液細胞株において、特に、ヒト骨髄性白血病細胞株において組換え生成される。多重特異的抗体構築物の生成に使用され得る好ましいヒト細胞株および好適な生成手技は、WO 2008/028686 A2で説明されている。特定の実施形態においては、多重特異的抗体構築物は、NM−H9D8、NM−H9D8−E6、およびNM−H9D8−E6Q12からなる群より選択されるヒト骨髄性白血病細胞株における発現により得られる。これらの細胞株は、Glycotope GmbH、Robert−Roessle−Str.10、13125 Berlin(DE)によりDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)、Inhoffenstrasse 7B、38124 Braunschweig(DE)にブダペスト条約の要件に従って、受託番号DSM ACC2806(NM−H9D8;2006年9月15日に寄託された)、DSM ACC2807(NM−H9D8−E6;2006年10月5日に寄託された)およびDSM ACC2856(NM−H9D8−E6Q12;2007年8月8日に寄託された)の下で寄託された。NM−H9D8細胞は、高度のシアル酸付加、高度の二分岐GlycNAc、高度のガラクトシル化および高度のフコシル化を有するグリコシル化パターンを提供する。NM−H9D8−E6およびNM−H9D8−E6Q12細胞は、フコシル化の程度が非常に低いことを除いてNM−H9D8細胞と同様のグリコシル化パターンを提供する。他の好適な細胞株としては、米国培養細胞系統保存機関に存在するヒト骨髄性白血病細胞株であるK562(ATCC CCL−243)および上記の細胞株に由来する細胞株がある。
核酸、発現カセット、ベクター、細胞株および組成物
さらなる態様においては、本発明は、多重特異的抗体構築物をコードする核酸を提供する。前記核酸の核酸配列は、多重特異的抗体構築物をコードするために好適な任意のヌクレオチド配列を有し得る。しかし、好ましくは核酸配列は、核酸が発現される宿主細胞または生物の特定のコドン使用頻度、特にヒトコドン使用頻度に少なくとも部分的に適応される。核酸は、2本鎖または1本鎖DNAまたはRNA、好ましくはcDNAなどの2本鎖DNAまたはmRNAなどの1本鎖RNAであってよい。それは連続的な核酸分子であってよく、またはそれは多重特異的抗体構築物の異なる部分をそれぞれコードしているいくつかの核酸分子からなってよい。
さらなる態様においては、本発明は、多重特異的抗体構築物をコードする核酸を提供する。前記核酸の核酸配列は、多重特異的抗体構築物をコードするために好適な任意のヌクレオチド配列を有し得る。しかし、好ましくは核酸配列は、核酸が発現される宿主細胞または生物の特定のコドン使用頻度、特にヒトコドン使用頻度に少なくとも部分的に適応される。核酸は、2本鎖または1本鎖DNAまたはRNA、好ましくはcDNAなどの2本鎖DNAまたはmRNAなどの1本鎖RNAであってよい。それは連続的な核酸分子であってよく、またはそれは多重特異的抗体構築物の異なる部分をそれぞれコードしているいくつかの核酸分子からなってよい。
多重特異的抗体構築物が抗体モジュールの軽鎖および重鎖などの1つより多い異なるアミノ酸鎖からなる場合、核酸は、別々のアミノ酸鎖を産生するためにIRESエレメントなどの調節エレメントによって好ましくは分離された、例えば多重特異的抗体構築物のアミノ酸鎖の1つをそれぞれコードするいくつかのコード領域を含有する単一の核酸分子であってよく、または核酸は、各核酸分子が多重特異的抗体構築物のアミノ酸鎖の1つをそれぞれコードする1つまたは複数のコード領域を含むいくつかの核酸分子からなってよい。多重特異的抗体構築物をコードするコード領域に加えて核酸は、例えば、他のタンパク質をコードできる、コード領域(複数可)の転写および/もしくは翻訳に影響を与えることができる、核酸の安定性もしくは、他の物理的もしくは化学的特性に影響を与えることができる、またはまったく機能を有さない場合があるさらなる核酸配列または他の改変も含む場合がある。
さらなる態様においては、本発明は、本発明による核酸および前記核酸に作動可能に繋がれたプロモーターを含む発現カセットまたはベクターを提供する。さらに発現カセットまたはベクターは、さらなるエレメント、特に核酸の転写および/もしくは翻訳、発現カセットもしくはベクターの増幅および/もしくは再生成、宿主細胞のゲノムへの発現カセットもしくはベクターの組み込み、ならびに/または宿主細胞中の発現カセットもしくはベクターのコピー数に影響を与えるおよび/または制御することができるエレメントを含んでよい。抗体を発現するためのそれぞれの発現カセットを含む好適な発現カセットおよびベクターは、先行技術において周知であり、かくして本明細書でさらなる記載を必要としない。
さらに本発明は、本発明による核酸または本発明による発現カセットもしくはベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の宿主細胞であってよい。それは、単離された細胞または組織に含まれる細胞であってよい。好ましくは宿主細胞は、培養細胞、特に初代細胞または確立された細胞株の細胞、好ましくは腫瘍由来細胞である。好ましくは、それは、E.coliなどの細菌細胞、Saccharomyces属細胞、特にS.cerevisiaeなどの酵母細胞、Sf9細胞などの昆虫細胞または哺乳動物細胞、特に腫瘍由来ヒト細胞などのヒト細胞、CHOなどのハムスター細胞もしくは霊長類細胞である。本発明の好ましい実施形態においては、宿主細胞は、ヒト骨髄性白血病細胞由来である。好ましくは、それは、次の細胞または細胞株:K562、KG1、MUTZ−3またはそれらに由来する細胞もしくは細胞株または前述の細胞の少なくとも1つを含む細胞もしくは細胞株の混合物から選択される。宿主細胞は、NM−H9D8、NM−H9D8−E6、NM H9D8−E6Q12および前記宿主細胞のいずれか1つに由来する細胞もしくは細胞株または前述の細胞の少なくとも1つを含む細胞もしくは細胞株の混合物からなる群から好ましくは選択される。これらの細胞株およびそれらの特性は、PCT出願WO2008/028686A2に詳細に記載されている。好ましい実施形態においては、宿主細胞は、特定のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質、特に抗体の発現のために最適化される。好ましくは、本発明による核酸のコード領域ならびに/または発現カセットもしくはベクターのプロモーターおよびさらなるエレメントにおけるコドン使用頻度は、使用される宿主細胞の種類に適合性であり、より好ましくは最適化されている。好ましくは、多重特異的抗体構築物は、上に記載のとおり宿主細胞または細胞株によって生成される。
別の態様においては、本発明は、多重特異的抗体構築物、核酸、発現カセットもしくはベクター、または宿主細胞を含む組成物を提供する。組成物は、1つを超えるこれらの成分を含有する場合もある。さらに組成物は、溶媒、希釈剤および賦形剤からなる群より選択される1つまたは複数のさらなる成分を含んでよい。好ましくは、組成物は、医薬組成物である。本実施形態においては、組成物の成分は、好ましくはすべて薬学的に許容される。組成物は、固体または液体組成物、特に好ましくは水溶液、エマルジョンもしくは懸濁物または凍結乾燥粉末であってよい。
医薬における使用
特に多重特異的抗体構築物は、医療において、特に疾患、特に本明細書に記載される疾患、好ましくはがん、感染症、炎症性疾患、移植片対宿主疾患および免疫不全の治療、診断、予後診断および/またはモニタリングにおいて有用である。
特に多重特異的抗体構築物は、医療において、特に疾患、特に本明細書に記載される疾患、好ましくはがん、感染症、炎症性疾患、移植片対宿主疾患および免疫不全の治療、診断、予後診断および/またはモニタリングにおいて有用である。
したがって、さらなる態様においては、本発明は、医療における使用のための多重特異的抗体構築物、核酸、発現カセットもしくはベクター、宿主細胞または組成物を提供する。好ましくは医療における使用は、例えばがんなどの異常な細胞増殖に関連する疾患、細菌性、ウイルス性、真菌性または寄生生物感染症などの感染症、自己免疫疾患および炎症性腸疾患などの炎症性疾患、および免疫不全などの免疫活性の低減に関連する疾患などの疾患の処置、予後診断、診断および/またはモニタリングにおける使用である。好ましい実施形態では、疾患はがんである。好ましくは、がんは、卵巣がん、乳がん、例えばトリプルネガティブ乳がん、肺がんおよび膵臓がんからなる群より選択される。がんは、結腸がん、胃がん、肝がん、腎臓がん、膀胱がん、皮膚がん、子宮頸がん(cervix cancer)、前立腺がん、胃腸がんおよび血液がんからさらに特に選択することができる。
ある特定の実施形態では、ウイルス感染症は、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、インフルエンザウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、B型肝炎ウイルスまたはC型肝炎ウイルスによって引き起こされる。炎症性疾患は、炎症性腸疾患、骨盤腹膜炎、虚血性脳卒中、アルツハイマー病、喘息、尋常天疱瘡および皮膚炎/湿疹から選択することができる。自己免疫性疾患は、セリアック病、1型真性糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、白斑、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、強皮症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、ギランバレー症候群、自己免疫性肝炎および強直性脊椎炎からなる群より選択することができる。ある特定の実施形態では、疾患は、MUC1を発現する細胞を含むかまたはそれと関連する。例えば、処置されるがんはMUC1陽性である、すなわち、MUC1を発現するがん細胞を含む。
特定の実施形態においては、多重特異的抗体構築物は、別の治療剤、特に別の抗がん剤と組み合わせて使用される。前記さらなる治療剤は、任意の公知の抗がん薬であってよい。多重特異的抗体構築物と組み合わせることができる好適な抗がん治療剤は、化学療法剤、抗体、免疫賦活剤、サイトカイン、ケモカインおよびワクチンであってよい。さらに、多重特異的抗体構築物による療法は、放射線療法、手術および/または伝統的な漢方薬と組み合わせることができる。
具体的な実施形態
以下において、本発明の具体的な実施形態が記載される。
実施形態1.(i)少なくとも1つの抗体重鎖を含む抗MUC1抗体モジュール、および
(ii)抗CD3抗原結合性断片
を含む特異的抗体構築物であって、前記抗原結合性断片が前記抗体モジュールの重鎖のC末端に融合している、多重特異的抗体構築物。
実施形態2.抗MUC1抗体モジュールが、VHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを各々含む2つの重鎖を含む、実施形態1による多重特異的抗体構築物。
実施形態3.抗MUC1抗体モジュールが、VLドメインおよびCLドメインを各々含む2つの軽鎖を含む、実施形態1または2による多重特異的抗体構築物。
実施形態4.抗MUC1抗体モジュールが、重鎖のC末端にリシン残基を必要に応じて有しない、IgG型の抗体モジュール、特にIgG1型の抗体モジュールである、実施形態1〜3のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態5.抗MUC1抗体モジュールが、κ鎖を有する、実施形態1〜4のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態6.抗MUC1抗体モジュールがTA−MUC1エピトープに特異的に結合する、実施形態1〜5のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態7.抗MUC1抗体モジュールが、配列番号1のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号3のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号5のアミノ酸配列を有するCDR−H3、または配列番号2のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号4のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR−H3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態6による多重特異的抗体構築物。
実施形態8.抗MUC1抗体モジュールが、配列番号7、8および9のいずれか1つと少なくとも80%同一である抗体重鎖可変領域配列を含む、実施形態6または7による多重特異的抗体構築物。
実施形態9.抗MUC1抗体モジュールがTFαに特異的に結合する、実施形態1〜5のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態10.抗MUC1抗体モジュールが、配列番号21のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号22または23のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号24、25または26のアミノ酸配列を有するCDR−H3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態9による多重特異的抗体構築物。
実施形態11.抗MUC1抗体モジュールが、配列番号27〜32のいずれか1つと少なくとも80%同一である抗体重鎖可変領域配列を含む、実施形態9または10による多重特異的抗体構築物。
実施形態12.抗CD3抗原結合性断片が少なくとも1つのVHドメインおよび必要に応じて少なくとも1つのVLドメインを含む、実施形態1〜11のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態13.抗CD3抗原結合性断片がいかなる抗体定常領域ドメインも含まない、実施形態1〜12のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態14.抗CD3抗原結合性断片がscFv断片である、実施形態1〜13のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態15.抗CD3抗原結合性断片がCD3εに特異的に結合する、実施形態1〜14のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態16. 抗CD3抗原結合性断片が、配列番号43のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号44のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号45のアミノ酸配列を有するCDR−H3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態1〜15のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態17. 抗CD3抗原結合性断片が、配列番号46のいずれか1つと少なくとも80%同一である抗体重鎖可変領域配列を含む、実施形態1〜16のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態18.抗CD3抗原結合性断片がVHドメインとVLドメインの間にペプチドリンカーを含む、実施形態1〜17のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態19.抗体モジュールの異なる重鎖のC末端に各々融合している2つの抗CD3抗原結合性断片を含む、実施形態1〜18のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態20.抗体モジュールの重鎖のC末端と抗原結合性断片の間にペプチドリンカーを含む、実施形態1〜19のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態21.二重特異的抗体構築物である、実施形態1〜20のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態22.抗体モジュールがCH2ドメインにN−グリコシル化部位を含まない、実施形態1〜21のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態23.抗体モジュールが抗体重鎖のCH2ドメインにN−グリコシル化部位を含む、実施形態1〜21のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態24.抗体モジュールが、抗体重鎖のCH2ドメインに、以下の特徴のうちの1つまたは複数を有するグリコシル化パターンを有する、実施形態23による多重特異的抗体構築物
(i)組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインのグリコシル化部位に結合したグリカンの総量の少なくとも0.5%の、二分岐GlcNAc残基を担持するグリカンの相対量;
(ii)組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも30%の、少なくとも1つのガラクトース残基を担持するグリカンの相対量;
(iii)組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも60%の、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量。
実施形態25.抗体モジュールが、抗体重鎖のCH2ドメインに、以下の特徴のうちの1つまたは複数を有するグリコシル化パターンを有する、実施形態23による多重特異的抗体構築物
(i)組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインのグリコシル化部位に結合したグリカンの総量の少なくとも0.5%の、二分岐GlcNAc残基を担持するグリカンの相対量;
(ii)組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも30%の、少なくとも1つのガラクトース残基を担持するグリカンの相対量;
(iii)組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の40%もしくはそれ未満の、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量。
実施形態26.それにコンジュゲートしているさらなる作用物質を含む、実施形態1〜25のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態27.さらなる作用物質が、抗体モジュールのポリペプチド鎖に、または抗原結合性断片のポリペプチド鎖に融合しているポリペプチドまたはタンパク質である、実施形態26による多重特異的抗体構築物。
実施形態28.抗体モジュールが少なくとも1つの抗体軽鎖を含み、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用物質が前記抗体軽鎖のC末端に融合している、実施形態27による多重特異的抗体構築物。
実施形態29.さらなる作用物質が、サイトカイン、ケモカイン、抗体モジュール、抗原結合性断片、酵素および結合性ドメインからなる群より選択される、実施形態26〜28のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態30.実施形態1〜29のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物をコードする核酸。
実施形態31.実施形態30による核酸および前記核酸に作動可能に繋がれたプロモーターを含む発現カセットまたはベクター。
実施形態32.実施形態30による核酸または実施形態31による発現カセットもしくはベクターを含む宿主細胞。
実施形態33.実施形態1〜29のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物ならびに溶媒、希釈剤および賦形剤からなる群より選択される1つまたは複数のさらなる成分を含む医薬組成物。
実施形態34.医療で使用するための実施形態1〜29のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物または実施形態33による医薬組成物。
実施形態35.がんなどの異常な細胞増殖に関連する疾患、細菌、ウイルス、真菌または寄生性感染症などの感染症、炎症性疾患、例えば自己免疫性疾患および炎症性腸疾患、移植片対宿主病、ならびに免疫欠損などの免疫活性の低下に関連する疾患の処置、予後診断、診断および/またはモニタリングで使用するための、実施形態1〜29のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物または実施形態33による医薬組成物。
実施形態36.乳房、結腸、胃、肝臓、膵臓、腎臓、血液、肺および卵巣のがんからなる群より選択されるがんの処置で使用するための、実施形態35による多重特異的抗体構築物または医薬組成物。
実施形態37.細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症および寄生生物感染症からなる群より選択される感染症の処置で使用するための、実施形態35による多重特異的抗体構築物または医薬組成物。
実施形態38.セリアック病、1型真性糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスからなる群より選択される自己免疫性疾患の処置で使用するための、実施形態35による多重特異的抗体構築物または医薬組成物。
実施形態39.
(i)2つのヒトγ型抗体重鎖および2つのヒトκ型抗体軽鎖を含む抗MUC1抗体モジュールであって、各重鎖はVHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、各軽鎖はVLドメインおよびCLドメインを含む抗MUC1抗体モジュール;ならびに
(ii)VHドメイン、ペプチドリンカーおよびVLドメインを各々含む2つの抗CD3抗原結合性断片
を含む多重特異的抗体構築物であって、各抗原結合性断片は、ペプチドリンカーを介して抗体モジュールの異なる重鎖のC末端に融合している、多重特異的抗体構築物。
実施形態40.抗MUC1抗体モジュールの各VHドメインが、配列番号7、8および9のいずれか1つと少なくとも80%同一である、特に100%同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号1のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号3のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号5のアミノ酸配列を有するCDR−H3、または配列番号2のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号4のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR−H3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態39による多重特異的抗体構築物。
実施形態41.抗MUC1抗体モジュールの各VLドメインが、配列番号16、17および18のいずれか1つと少なくとも80%同一である、特に100%同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号10のアミノ酸配列を有するCDR−L1、配列番号12のアミノ酸配列を有するCDR−L2および配列番号14のアミノ酸配列を有するCDR−L3、または配列番号11のアミノ酸配列を有するCDR−L1、配列番号13のアミノ酸配列を有するCDR−L2および配列番号15のアミノ酸配列を有するCDR−L3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態40による多重特異的抗体構築物。
実施形態42.抗MUC1抗体モジュールの各VHドメインが、配列番号27〜32のいずれか1つと少なくとも80%同一である、特に100%同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号21のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号22または23のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号24、25または26のアミノ酸配列を有するCDR−H3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態39による多重特異的抗体構築物。
実施形態43.抗MUC1抗体モジュールの各VLドメインが、配列番号40〜42のいずれか1つと少なくとも80%同一である、特に100%同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号33、34または35のアミノ酸配列を有するCDR−L1、配列番号36または37のアミノ酸配列を有するCDR−L2および配列番号38または39のアミノ酸配列を有するCDR−L3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態42による多重特異的抗体構築物。
実施形態44.各抗CD3抗原結合性断片のVHドメインが、配列番号46と少なくとも80%同一である、特に100%同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号43のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号44のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号45のアミノ酸配列を有するCDR−H3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態39〜43のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態45.各抗CD3抗原結合性断片のVLドメインが、配列番号50と少なくとも80%同一である、特に100%同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号47のアミノ酸配列を有するCDR−L1、配列番号48のアミノ酸配列を有するCDR−L2および配列番号49のアミノ酸配列を有するCDR−L3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態44による多重特異的抗体構築物。
実施形態46.抗体モジュールの重鎖のC末端と抗原結合性断片のN末端の間にアミノ酸配列GGGGS(配列番号51)の3つまたは4つのリピートを含むペプチドリンカー、および抗原結合性断片のVHドメインとVLドメインの間にアミノ酸配列GGGGS(配列番号51)の3つまたは4つのリピートを含むペプチドリンカーを含む、実施形態39〜45のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態47.抗MUC1抗体モジュールの重鎖がγ1型の重鎖である、実施形態39〜46のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態48.抗MUC1抗体モジュールが重鎖のC末端にリシン残基を含まない、実施形態39〜47のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態49.抗体モジュールが各抗体重鎖のCH2ドメインにN−グリコシル化部位を含まない、実施形態39〜48のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態50.抗体モジュールが、IMGT/Eu番号付けシステムによる297位に対応する重鎖の位置にアスパラギン残基を含まず、特に、重鎖にAla297変異を含む、実施形態49による多重特異的抗体構築物。
実施形態51.抗体モジュールが各抗体重鎖のCH2ドメインにN−グリコシル化部位を含む、実施形態39〜48のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態52.抗体モジュールが、抗体重鎖のCH2ドメインにグリコシル化パターンを有し、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量が、多重特異的抗体構築物の組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも60%、特に、少なくとも65%または少なくとも70%である、実施形態51による多重特異的抗体構築物。
実施形態53.抗体モジュールが、抗体重鎖のCH2ドメインにグリコシル化パターンを有し、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量が、多重特異的抗体構築物の組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の40%もしくはそれ未満、特に、30%もしくはそれ未満、または20%もしくはそれ未満、である、実施形態51による多重特異的抗体構築物。
実施形態54.がんなどの異常な細胞増殖に関連する疾患、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物感染症などの感染症、炎症性疾患、自己免疫性疾患、移植片対宿主病および免疫欠損の処置で使用するための、実施形態39〜53のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態55.卵巣がん、乳がん、例えばトリプルネガティブ乳がん、肺がんまたは膵臓がんの処置で使用するための、実施形態39〜53のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
以下において、本発明の具体的な実施形態が記載される。
実施形態1.(i)少なくとも1つの抗体重鎖を含む抗MUC1抗体モジュール、および
(ii)抗CD3抗原結合性断片
を含む特異的抗体構築物であって、前記抗原結合性断片が前記抗体モジュールの重鎖のC末端に融合している、多重特異的抗体構築物。
実施形態2.抗MUC1抗体モジュールが、VHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを各々含む2つの重鎖を含む、実施形態1による多重特異的抗体構築物。
実施形態3.抗MUC1抗体モジュールが、VLドメインおよびCLドメインを各々含む2つの軽鎖を含む、実施形態1または2による多重特異的抗体構築物。
実施形態4.抗MUC1抗体モジュールが、重鎖のC末端にリシン残基を必要に応じて有しない、IgG型の抗体モジュール、特にIgG1型の抗体モジュールである、実施形態1〜3のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態5.抗MUC1抗体モジュールが、κ鎖を有する、実施形態1〜4のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態6.抗MUC1抗体モジュールがTA−MUC1エピトープに特異的に結合する、実施形態1〜5のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態7.抗MUC1抗体モジュールが、配列番号1のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号3のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号5のアミノ酸配列を有するCDR−H3、または配列番号2のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号4のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR−H3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態6による多重特異的抗体構築物。
実施形態8.抗MUC1抗体モジュールが、配列番号7、8および9のいずれか1つと少なくとも80%同一である抗体重鎖可変領域配列を含む、実施形態6または7による多重特異的抗体構築物。
実施形態9.抗MUC1抗体モジュールがTFαに特異的に結合する、実施形態1〜5のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態10.抗MUC1抗体モジュールが、配列番号21のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号22または23のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号24、25または26のアミノ酸配列を有するCDR−H3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態9による多重特異的抗体構築物。
実施形態11.抗MUC1抗体モジュールが、配列番号27〜32のいずれか1つと少なくとも80%同一である抗体重鎖可変領域配列を含む、実施形態9または10による多重特異的抗体構築物。
実施形態12.抗CD3抗原結合性断片が少なくとも1つのVHドメインおよび必要に応じて少なくとも1つのVLドメインを含む、実施形態1〜11のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態13.抗CD3抗原結合性断片がいかなる抗体定常領域ドメインも含まない、実施形態1〜12のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態14.抗CD3抗原結合性断片がscFv断片である、実施形態1〜13のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態15.抗CD3抗原結合性断片がCD3εに特異的に結合する、実施形態1〜14のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態16. 抗CD3抗原結合性断片が、配列番号43のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号44のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号45のアミノ酸配列を有するCDR−H3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態1〜15のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態17. 抗CD3抗原結合性断片が、配列番号46のいずれか1つと少なくとも80%同一である抗体重鎖可変領域配列を含む、実施形態1〜16のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態18.抗CD3抗原結合性断片がVHドメインとVLドメインの間にペプチドリンカーを含む、実施形態1〜17のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態19.抗体モジュールの異なる重鎖のC末端に各々融合している2つの抗CD3抗原結合性断片を含む、実施形態1〜18のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態20.抗体モジュールの重鎖のC末端と抗原結合性断片の間にペプチドリンカーを含む、実施形態1〜19のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態21.二重特異的抗体構築物である、実施形態1〜20のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態22.抗体モジュールがCH2ドメインにN−グリコシル化部位を含まない、実施形態1〜21のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態23.抗体モジュールが抗体重鎖のCH2ドメインにN−グリコシル化部位を含む、実施形態1〜21のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態24.抗体モジュールが、抗体重鎖のCH2ドメインに、以下の特徴のうちの1つまたは複数を有するグリコシル化パターンを有する、実施形態23による多重特異的抗体構築物
(i)組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインのグリコシル化部位に結合したグリカンの総量の少なくとも0.5%の、二分岐GlcNAc残基を担持するグリカンの相対量;
(ii)組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも30%の、少なくとも1つのガラクトース残基を担持するグリカンの相対量;
(iii)組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも60%の、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量。
実施形態25.抗体モジュールが、抗体重鎖のCH2ドメインに、以下の特徴のうちの1つまたは複数を有するグリコシル化パターンを有する、実施形態23による多重特異的抗体構築物
(i)組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインのグリコシル化部位に結合したグリカンの総量の少なくとも0.5%の、二分岐GlcNAc残基を担持するグリカンの相対量;
(ii)組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも30%の、少なくとも1つのガラクトース残基を担持するグリカンの相対量;
(iii)組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の40%もしくはそれ未満の、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量。
実施形態26.それにコンジュゲートしているさらなる作用物質を含む、実施形態1〜25のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態27.さらなる作用物質が、抗体モジュールのポリペプチド鎖に、または抗原結合性断片のポリペプチド鎖に融合しているポリペプチドまたはタンパク質である、実施形態26による多重特異的抗体構築物。
実施形態28.抗体モジュールが少なくとも1つの抗体軽鎖を含み、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用物質が前記抗体軽鎖のC末端に融合している、実施形態27による多重特異的抗体構築物。
実施形態29.さらなる作用物質が、サイトカイン、ケモカイン、抗体モジュール、抗原結合性断片、酵素および結合性ドメインからなる群より選択される、実施形態26〜28のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態30.実施形態1〜29のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物をコードする核酸。
実施形態31.実施形態30による核酸および前記核酸に作動可能に繋がれたプロモーターを含む発現カセットまたはベクター。
実施形態32.実施形態30による核酸または実施形態31による発現カセットもしくはベクターを含む宿主細胞。
実施形態33.実施形態1〜29のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物ならびに溶媒、希釈剤および賦形剤からなる群より選択される1つまたは複数のさらなる成分を含む医薬組成物。
実施形態34.医療で使用するための実施形態1〜29のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物または実施形態33による医薬組成物。
実施形態35.がんなどの異常な細胞増殖に関連する疾患、細菌、ウイルス、真菌または寄生性感染症などの感染症、炎症性疾患、例えば自己免疫性疾患および炎症性腸疾患、移植片対宿主病、ならびに免疫欠損などの免疫活性の低下に関連する疾患の処置、予後診断、診断および/またはモニタリングで使用するための、実施形態1〜29のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物または実施形態33による医薬組成物。
実施形態36.乳房、結腸、胃、肝臓、膵臓、腎臓、血液、肺および卵巣のがんからなる群より選択されるがんの処置で使用するための、実施形態35による多重特異的抗体構築物または医薬組成物。
実施形態37.細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症および寄生生物感染症からなる群より選択される感染症の処置で使用するための、実施形態35による多重特異的抗体構築物または医薬組成物。
実施形態38.セリアック病、1型真性糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスからなる群より選択される自己免疫性疾患の処置で使用するための、実施形態35による多重特異的抗体構築物または医薬組成物。
実施形態39.
(i)2つのヒトγ型抗体重鎖および2つのヒトκ型抗体軽鎖を含む抗MUC1抗体モジュールであって、各重鎖はVHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、各軽鎖はVLドメインおよびCLドメインを含む抗MUC1抗体モジュール;ならびに
(ii)VHドメイン、ペプチドリンカーおよびVLドメインを各々含む2つの抗CD3抗原結合性断片
を含む多重特異的抗体構築物であって、各抗原結合性断片は、ペプチドリンカーを介して抗体モジュールの異なる重鎖のC末端に融合している、多重特異的抗体構築物。
実施形態40.抗MUC1抗体モジュールの各VHドメインが、配列番号7、8および9のいずれか1つと少なくとも80%同一である、特に100%同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号1のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号3のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号5のアミノ酸配列を有するCDR−H3、または配列番号2のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号4のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR−H3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態39による多重特異的抗体構築物。
実施形態41.抗MUC1抗体モジュールの各VLドメインが、配列番号16、17および18のいずれか1つと少なくとも80%同一である、特に100%同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号10のアミノ酸配列を有するCDR−L1、配列番号12のアミノ酸配列を有するCDR−L2および配列番号14のアミノ酸配列を有するCDR−L3、または配列番号11のアミノ酸配列を有するCDR−L1、配列番号13のアミノ酸配列を有するCDR−L2および配列番号15のアミノ酸配列を有するCDR−L3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態40による多重特異的抗体構築物。
実施形態42.抗MUC1抗体モジュールの各VHドメインが、配列番号27〜32のいずれか1つと少なくとも80%同一である、特に100%同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号21のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号22または23のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号24、25または26のアミノ酸配列を有するCDR−H3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態39による多重特異的抗体構築物。
実施形態43.抗MUC1抗体モジュールの各VLドメインが、配列番号40〜42のいずれか1つと少なくとも80%同一である、特に100%同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号33、34または35のアミノ酸配列を有するCDR−L1、配列番号36または37のアミノ酸配列を有するCDR−L2および配列番号38または39のアミノ酸配列を有するCDR−L3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態42による多重特異的抗体構築物。
実施形態44.各抗CD3抗原結合性断片のVHドメインが、配列番号46と少なくとも80%同一である、特に100%同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号43のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号44のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号45のアミノ酸配列を有するCDR−H3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態39〜43のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態45.各抗CD3抗原結合性断片のVLドメインが、配列番号50と少なくとも80%同一である、特に100%同一であるアミノ酸配列、ならびに配列番号47のアミノ酸配列を有するCDR−L1、配列番号48のアミノ酸配列を有するCDR−L2および配列番号49のアミノ酸配列を有するCDR−L3による重鎖CDR配列のセットを含む、実施形態44による多重特異的抗体構築物。
実施形態46.抗体モジュールの重鎖のC末端と抗原結合性断片のN末端の間にアミノ酸配列GGGGS(配列番号51)の3つまたは4つのリピートを含むペプチドリンカー、および抗原結合性断片のVHドメインとVLドメインの間にアミノ酸配列GGGGS(配列番号51)の3つまたは4つのリピートを含むペプチドリンカーを含む、実施形態39〜45のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態47.抗MUC1抗体モジュールの重鎖がγ1型の重鎖である、実施形態39〜46のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態48.抗MUC1抗体モジュールが重鎖のC末端にリシン残基を含まない、実施形態39〜47のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態49.抗体モジュールが各抗体重鎖のCH2ドメインにN−グリコシル化部位を含まない、実施形態39〜48のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態50.抗体モジュールが、IMGT/Eu番号付けシステムによる297位に対応する重鎖の位置にアスパラギン残基を含まず、特に、重鎖にAla297変異を含む、実施形態49による多重特異的抗体構築物。
実施形態51.抗体モジュールが各抗体重鎖のCH2ドメインにN−グリコシル化部位を含む、実施形態39〜48のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態52.抗体モジュールが、抗体重鎖のCH2ドメインにグリコシル化パターンを有し、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量が、多重特異的抗体構築物の組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも60%、特に、少なくとも65%または少なくとも70%である、実施形態51による多重特異的抗体構築物。
実施形態53.抗体モジュールが、抗体重鎖のCH2ドメインにグリコシル化パターンを有し、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量が、多重特異的抗体構築物の組成物中の抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の40%もしくはそれ未満、特に、30%もしくはそれ未満、または20%もしくはそれ未満、である、実施形態51による多重特異的抗体構築物。
実施形態54.がんなどの異常な細胞増殖に関連する疾患、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物感染症などの感染症、炎症性疾患、自己免疫性疾患、移植片対宿主病および免疫欠損の処置で使用するための、実施形態39〜53のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
実施形態55.卵巣がん、乳がん、例えばトリプルネガティブ乳がん、肺がんまたは膵臓がんの処置で使用するための、実施形態39〜53のいずれか1つによる多重特異的抗体構築物。
(実施例1:MUC1およびCD3に特異的に結合する二重特異的抗体構築物の生成。)
MUC1特異的結合性部分およびCD3結合性部分からなる二重特異的T細胞係合構築物を作製した。MUC1結合性部分は、一般的な抗体Y形状のヒト化完全長IgG1分子である。CD3結合は、αMUC1 IgGの各Cκ−(αMUC1−αCD3−Cκ)またはCH3−ドメイン(αMUC1−αCD3−CH3)への抗CD3単鎖可変断片の融合によって実現される。構築物の一般構造は、図1に示す。
MUC1特異的結合性部分およびCD3結合性部分からなる二重特異的T細胞係合構築物を作製した。MUC1結合性部分は、一般的な抗体Y形状のヒト化完全長IgG1分子である。CD3結合は、αMUC1 IgGの各Cκ−(αMUC1−αCD3−Cκ)またはCH3−ドメイン(αMUC1−αCD3−CH3)への抗CD3単鎖可変断片の融合によって実現される。構築物の一般構造は、図1に示す。
構築物αMUC1−αCD3−CH3−wtでは、抗TA−MUC1抗体PankoMab(ガチポツズマブ)がMUC1結合性部分として使用され、抗CD3抗体TR66の可変領域を有するscFv構築物がCD3結合性部分として使用される。抗CD3 scFvは、(Gly4Ser)4リンカーを介してPankoMabのCH3ドメインのC末端に融合している。構築物αMUC1−αCD3−Cκ−wtは、抗CD3 scFvがPankoMabのCκドメインのC末端に融合していること以外は、αMUC1−αCD3−CH3−wtと同一である。
構築物αMUC1−αCD3−CH3−NAは、CH2ドメインにおけるグリコシル化部位を無効にするPankoMab重鎖におけるAsn297Ala変異を除いて、「wt」構築物に対応する。したがって、「NA」構築物は、PankoMabのFc部分においてグリコシル化されていない。
構築物はヒト骨髄性白血病由来の細胞株NM−H9D8−E6Q12(DSM ACC2856)において発現され、wt構築物のPankoMab CH2ドメインの約10%の少量のフコシル化を有するヒトグリコシル化パターンで構築物を生成した。さらに、αMUC1−αCD3−CH3−wt構築物は関連した細胞株NM−H9D8(DSM ACC2806)でも生成され、PankoMab CH2ドメインの約90%の多量のフコシル化を有するグリコシル化構築物をもたらした。
MUC1結合性部分としてPankoMabの代わりに抗TFα抗体KaroMabを使用して、類似の構築物が生成された。
無血清培地を使用した生成収量は、以降の精製、生化学的評価およびがん細胞株に対する二重特異的抗体の作用機構の生物機能的評価に十分であった。さらに、多量のαMUC1−αCD3−CH3を生成するための実現可能性を評価するために、無血清条件下で高生産性の細胞クローンをバイオリアクター内で培養した。
治療的二重特異的抗体の1つの主要な難題は、十分な量の組換えタンパク質の生産である。大規模な医薬品製造品質管理基準(GMP)生産に適合する条件下での高収量生産の実現可能性を調査するために、αMUC1−αCD3−CH3産生細胞を2Lバイオリアクター内で培養した。無血清培地による連続灌流プロセスを使用した制御環境で、高い細胞密度に到達した。最大細胞濃度は生存可能細胞数3×107/mLであって、これは撹拌培養における最大細胞密度より約10倍高い。より重要なことに、培養が最大灌流速度に到達したならば、αMUC1−αCD3−CH3力価は最高50μg/mLに到達し、灌流プロセスの持続期間にわたる平均力価は28μg/mLであった。したがって、2L/日の灌流速度で、プロセスは1日につき平均して47mgのαMUC1−αCD3−CH3を与えた。上清は、30日にわたって収集した。細胞生存度は、90%を上回った。生存可能細胞数3×107/mLを超える細胞濃度を回避し、培養のための十分な栄養供給を確実なものにするために、浸出(bleeding)によって細胞をバイオリアクターから除去した。αMUC1−αCD3−CH3抗体の総収量は、30日以内の培養で1.4gであった。
αMUC1−αCD3−CH3をプロテインAクロマトグラフィーによって精製し、LC−MSを使用してインタクトな抗体鎖の分子量について分析した。比較して、αMUC1−αCD3−CH3は、40日を超える例外的に長いバイオリアクター試行の終わりに収集された最終上清からも精製された。
(実施例2:T細胞活性化および増殖)
二重特異的構築物によるT細胞活性化を調査するために、48時間後の活性化マーカーCD69およびCD25の発現を、CD4+およびCD8+T細胞でのフローサイトメトリーによって分析した。この目的のために、健康なドナーからのヒトPBMCを、αMUC1−αCD3−CH3−NAまたは対照としてαMUC1と、示した濃度で48時間インキュベートした。48時間後、PBMCを収集し、蛍光標識されたαCD45、αCD4、αCD8、αCD25、αCD69、αCD56、αCD14およびαCD19抗体でそれぞれ染色した。単に生存可能な細胞を分析するために、DAPI(Sigma−Aldrich)を使用した。細胞は、Attune NxT(Thermo Fisher)フローサイトメーターで分析した。T細胞活性化は、エフェクター細胞と標的細胞の間の5:1の比において、MUC1発現レベルが異なる細胞株の不在下または存在下で分析した。
二重特異的構築物によるT細胞活性化を調査するために、48時間後の活性化マーカーCD69およびCD25の発現を、CD4+およびCD8+T細胞でのフローサイトメトリーによって分析した。この目的のために、健康なドナーからのヒトPBMCを、αMUC1−αCD3−CH3−NAまたは対照としてαMUC1と、示した濃度で48時間インキュベートした。48時間後、PBMCを収集し、蛍光標識されたαCD45、αCD4、αCD8、αCD25、αCD69、αCD56、αCD14およびαCD19抗体でそれぞれ染色した。単に生存可能な細胞を分析するために、DAPI(Sigma−Aldrich)を使用した。細胞は、Attune NxT(Thermo Fisher)フローサイトメーターで分析した。T細胞活性化は、エフェクター細胞と標的細胞の間の5:1の比において、MUC1発現レベルが異なる細胞株の不在下または存在下で分析した。
T細胞活性化の他に、T細胞を動員する二重特異体(bispecific)の別の作用機構は、T細胞増殖の誘導である。T細胞増殖を測定するために、健康なドナーからのPBMCをCellTrace(商標)Violet(Thermo Fisher)で標識し、エフェクター細胞と標的細胞の間の5:1の比において、MUC1発現レベルが異なる細胞株の不在下または存在下で5日間、αMUC1−αCD3−CH3−NAまたは対照としてαMUC1とインキュベートした。T細胞が増殖するとき、増殖細胞の世代ごとにCellTrace(商標)色素は希釈される。5日後、PBMCを収集し、蛍光標識されたαCD45、αCD4、αCD8、αCD56、αCD14およびαCD19抗体でそれぞれ染色した。単に生存可能な細胞を分析するために、7−AAD(Calbiochem)を使用した。細胞は、Attune NxT(Thermo Fisher)フローサイトメーターで分析した。
結果は、MUC1+細胞株およびT細胞上のCD3の同時結合によって、αMUC1−αCD3−CH3がT細胞活性化およびT細胞増殖を誘導することができることを実証する。CD4+T細胞について示すように、複数のMUC1+細胞株およびαMUC1−αCD3−CH3とのインキュベーションは、T細胞活性化マーカーCD69(図2A)およびCD25(図2B)の発現の増加につながる。さらに、CD8+T細胞について示すように、MUC1+細胞株およびT細胞上のCD3の同時結合によって、T細胞増殖が誘導される(図2C)。
(実施例3:NK細胞活性化および増殖)
NK細胞活性化を調査するために、48時間後の活性化マーカーCD69およびCD25の発現をフローサイトメトリーによって分析した。この目的のために、健康なドナーからのヒトPBMCを、αMUC1−αCD3−CH3−NAと、示した濃度で48時間インキュベートした。48時間後、PBMCを収集し、蛍光標識されたαCD45、αCD4、αCD8、αCD25、αCD69、αCD56、αCD14およびαCD19抗体でそれぞれ染色した。単に生存可能な細胞を分析するために、DAPI(Sigma−Aldrich)を使用した。細胞は、Attune NxT(Thermo Fisher)フローサイトメーターで分析した。NK細胞活性化は、エフェクター細胞と標的細胞の間の5:1の比において、MUC1発現レベルが異なる細胞株の不在下または存在下で分析した。
NK細胞活性化を調査するために、48時間後の活性化マーカーCD69およびCD25の発現をフローサイトメトリーによって分析した。この目的のために、健康なドナーからのヒトPBMCを、αMUC1−αCD3−CH3−NAと、示した濃度で48時間インキュベートした。48時間後、PBMCを収集し、蛍光標識されたαCD45、αCD4、αCD8、αCD25、αCD69、αCD56、αCD14およびαCD19抗体でそれぞれ染色した。単に生存可能な細胞を分析するために、DAPI(Sigma−Aldrich)を使用した。細胞は、Attune NxT(Thermo Fisher)フローサイトメーターで分析した。NK細胞活性化は、エフェクター細胞と標的細胞の間の5:1の比において、MUC1発現レベルが異なる細胞株の不在下または存在下で分析した。
NK細胞が活性化されるならば、それらは増殖を開始する。NK細胞増殖を測定するために、健康なドナーからのPBMCをCellTrace(商標)Violet(Thermo Fisher)で標識し、エフェクター細胞と標的細胞の間の5:1の比において、MUC1発現レベルが異なる細胞株の不在下または存在下で5日間、αMUC1−αCD3−CH3−NAまたは対照としてαMUC1とインキュベートした。NK細胞が増殖するとき、増殖細胞の世代ごとにCellTrace(商標)色素は希釈される。5日後、PBMCを収集し、蛍光標識されたαCD45、αCD4、αCD8、αCD56、αCD14およびαCD19抗体でそれぞれ染色した。単に生存可能な細胞を分析するために、7−AAD(Calbiochem)を使用した。細胞は、Attune NxT(Thermo Fisher)フローサイトメーターで分析した。
結果は、αMUC1−αCD3−CH3−NAが、NK細胞活性化およびNK細胞増殖を誘導することができることを実証する。Asn297にN−グリカンのないαMUC1−αCD3−CH3−NAは、αCD3結合性部分を介してT細胞に結合することができるだけであり、NK細胞結合を示さない。驚くべきことに、MUC1+細胞株およびαMUC1−αCD3−CH3−NAの存在に依存するNK細胞活性化および増殖が観察された。おそらくT細胞のαMUC1−αCD3−CH3媒介活性化および刺激性サイトカインの以降の放出のために、NK細胞のさらなる活性化が誘導される。したがって、活性化マーカーCD69(図3A)およびCD25(図3B)の上方制御ならびにNK細胞増殖(図3C)が示すように、αMUC1−αCD3−CH3−NAとのインキュベーションは、直接的なNK細胞結合がないにもかかわらず、NK細胞活性化につながる。
(実施例4:特異的抗原の結合)
αMUC1、αMUC1−αCD3−CκおよびαMUC1−αCD3−CH3ならびにαHER2、αHER2−αCD3−CκおよびαHER2−αCD3−CH3のヒトTA−MUC1およびHER2発現腫瘍細胞への結合特性を、フローサイトメトリーによって分析した。TA−MUC1およびHER2結合を決定するために、強いTA−MUC1および中間的なHER2発現を有するがCD3発現を欠く乳がん細胞株ZR−75−1を使用した。CD3結合を分析するために、CD3+であるがTA−MUC1およびHer2陰性のジャーカット細胞を使用した。簡潔には、標的細胞を収集し、段階希釈の示した抗体とインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、暗所において二次ヤギ抗hIgG(H+L)−RPEコンジュゲート抗体と4℃でインキュベートした。細胞は、FACS Canto II(Becton Dickinson)フローサイトメーターでのフローサイトメトリーを介して分析した。
αMUC1、αMUC1−αCD3−CκおよびαMUC1−αCD3−CH3ならびにαHER2、αHER2−αCD3−CκおよびαHER2−αCD3−CH3のヒトTA−MUC1およびHER2発現腫瘍細胞への結合特性を、フローサイトメトリーによって分析した。TA−MUC1およびHER2結合を決定するために、強いTA−MUC1および中間的なHER2発現を有するがCD3発現を欠く乳がん細胞株ZR−75−1を使用した。CD3結合を分析するために、CD3+であるがTA−MUC1およびHer2陰性のジャーカット細胞を使用した。簡潔には、標的細胞を収集し、段階希釈の示した抗体とインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、暗所において二次ヤギ抗hIgG(H+L)−RPEコンジュゲート抗体と4℃でインキュベートした。細胞は、FACS Canto II(Becton Dickinson)フローサイトメーターでのフローサイトメトリーを介して分析した。
αMUC1、αMUC1−αCD3−CκおよびαMUC1−αCD3−CH3は、TA−MUC1+細胞株ZR−75−1の同等の結合を示した(図4A)。CκドメインまたはCH3ドメインへのαCD3 scFvの追加は、いずれもTA−MUC1の結合に影響しない。αHER2、αHER2−αCD3−CκおよびαHER2−αCD3−CH3は、HER2+細胞株ZR−75−1の同等の結合を示したので、類似の結果が、HER2標的化構築物で得られた(図4B)。対照的に、CD3+ジャーカット細胞への結合の分析では、αMUC1−αCD3−CH3ならびにαHER2−αCD3−CH3は、それらのそれぞれのCκ融合対応物αMUC1−αCD3−CκおよびαHER2−αCD3−Cκと比較して、CD3の結合の増加を示した(図4C)。
(実施例5:ADCCアッセイ)
T細胞媒介抗体依存性細胞傷害(ADCC)は、T細胞係合抗体の主な機構である。TA−MUC1またはHER2結合の後、二重特異的抗体はそれらの表面でCD3に結合することによってT細胞を動員し、TA−MUC1+またはHER2+腫瘍細胞の細胞死を促進するパーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞傷害性顆粒の放出をもたらす。エフェクター細胞として事前活性化T細胞を使用すると、αMUC1−αCD3−CκおよびαMUC1−αCD3−CH3(図5A)ならびにαHER2−αCD3−CκおよびαHER2−αCD3−CH3(図5B)は、TA−MUC1+およびHER2+乳がん細胞株T−47Dの有効な溶解を示した。驚くべきことに、αMUC1−αCD3−CH3によって媒介されるT細胞ADCCは、αMUC1−αCD3−Cκと比較して増強された(図5A)が、αHER2−αCD3−CκはαHER2−αCD3−CH3と比較してより強いなT細胞ADCC活性を示した(図5B)。腫瘍細胞膜とT細胞のより緊密な近接はT細胞活性化および媒介される細胞傷害を増強すると記載されているので(例えば、Bluemel, C.ら(2010年)Cancer Immunol Immunother59巻:1197〜1209頁;Chames, P.およびBaty, D.(2009年)mAbs1巻(6号):539〜547頁を参照)、HER2結合性構築物で得られた結果は、T細胞結合性ドメインとがん細胞結合性ドメインの間の短い距離を強く支持する近年の報告書と一致している。これと対照的に、抗CD3結合性断片が重鎖のC末端に結合しているαMUC1−αCD3−CH3の結合性ドメインの間の距離は、抗CD3結合性断片が軽鎖のC末端に結合しているαMUC1−αCD3−Cκと比較してかなり大きい。それにもかかわらず、αMUC1−αCD3−Cκと比較して、T−47D細胞の比溶解の増加がαMUC1−αCD3−CH3によって誘導された。TA−MUC1およびHER2標的化構築物に類似して、αTFα−αCD3−CH3および事前活性化T細胞をエフェクター細胞として使用すると、前立腺がん細胞株DU−145の比溶解が誘導された(図6)。予想されるように、事前活性化T細胞がエフェクター細胞として使用されたとき、T細胞を動員しない親の抗体αMUC1(図5A)、αHER2(図5B)およびαTFα(図6)のいずれも比溶解を誘導しなかった。
T細胞媒介抗体依存性細胞傷害(ADCC)は、T細胞係合抗体の主な機構である。TA−MUC1またはHER2結合の後、二重特異的抗体はそれらの表面でCD3に結合することによってT細胞を動員し、TA−MUC1+またはHER2+腫瘍細胞の細胞死を促進するパーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞傷害性顆粒の放出をもたらす。エフェクター細胞として事前活性化T細胞を使用すると、αMUC1−αCD3−CκおよびαMUC1−αCD3−CH3(図5A)ならびにαHER2−αCD3−CκおよびαHER2−αCD3−CH3(図5B)は、TA−MUC1+およびHER2+乳がん細胞株T−47Dの有効な溶解を示した。驚くべきことに、αMUC1−αCD3−CH3によって媒介されるT細胞ADCCは、αMUC1−αCD3−Cκと比較して増強された(図5A)が、αHER2−αCD3−CκはαHER2−αCD3−CH3と比較してより強いなT細胞ADCC活性を示した(図5B)。腫瘍細胞膜とT細胞のより緊密な近接はT細胞活性化および媒介される細胞傷害を増強すると記載されているので(例えば、Bluemel, C.ら(2010年)Cancer Immunol Immunother59巻:1197〜1209頁;Chames, P.およびBaty, D.(2009年)mAbs1巻(6号):539〜547頁を参照)、HER2結合性構築物で得られた結果は、T細胞結合性ドメインとがん細胞結合性ドメインの間の短い距離を強く支持する近年の報告書と一致している。これと対照的に、抗CD3結合性断片が重鎖のC末端に結合しているαMUC1−αCD3−CH3の結合性ドメインの間の距離は、抗CD3結合性断片が軽鎖のC末端に結合しているαMUC1−αCD3−Cκと比較してかなり大きい。それにもかかわらず、αMUC1−αCD3−Cκと比較して、T−47D細胞の比溶解の増加がαMUC1−αCD3−CH3によって誘導された。TA−MUC1およびHER2標的化構築物に類似して、αTFα−αCD3−CH3および事前活性化T細胞をエフェクター細胞として使用すると、前立腺がん細胞株DU−145の比溶解が誘導された(図6)。予想されるように、事前活性化T細胞がエフェクター細胞として使用されたとき、T細胞を動員しない親の抗体αMUC1(図5A)、αHER2(図5B)およびαTFα(図6)のいずれも比溶解を誘導しなかった。
事前活性化T細胞によるT細胞ADCCアッセイでは、T細胞を磁気ビーズ分離技術(Dynabeads(登録商標)Untouched(商標)ヒトT細胞キット、Thermo Fisher)によって先ず単離し、その後、単離したT細胞を5日間活性化した(T細胞増大および活性化のためのDynabeads(登録商標)ヒトT活性化因子CD3/CD28、Thermo Fisher)。異なるアッセイで分析されたT細胞活性化における潜在的な差を排除して、細胞死につながる、TA−MUC1への結合ならびにパーフォリンおよびグランザイムの放出の過程だけに基づく結果を得るために、T細胞事前活性化のこの方法を選択した。活性化されたT細胞は、TA−MUC1またはHER2を標的にする異なる二重特異的構築物を比較するために次に使用した。アッセイは、ユウロピウム放出アッセイとして実行した。簡潔には、エレクトロポレーションによって標的細胞にユウロピウム(Eu3+)を負荷し、二重特異的構築物の存在下で10:1のエフェクター細胞対標的細胞の比(E:T比)において事前活性化T細胞と5時間インキュベートした。上清へのユウロピウム放出(抗体媒介細胞死を示す)は、蛍光プレートリーダーInfinite F200(Tecan Austria GmbH)を使用して定量化した。最大放出は標的細胞のトリトン−X−100とのインキュベーションによって達成され、標的細胞だけを含有し、抗体およびPBMCを含有しない試料において自発的放出を測定した。
比細胞傷害を以下の通りに計算した:
比溶解%=(実験による放出−自発的放出)/(最大放出−自発的放出)×100。
比溶解%=(実験による放出−自発的放出)/(最大放出−自発的放出)×100。
T細胞媒介ADCCを事前活性化T細胞で分析した後、エフェクター細胞として未刺激PBMCを使用した異なるアッセイセットアップを確立した。したがって、TA−MUC1またはHER2結合ならびにパーフォリンおよびグランザイムの放出と一緒に、このアッセイセットアップは、T細胞活性化の差をさらに説明する。エフェクター細胞として未刺激PBMCを使用して、事前活性化T細胞で得られた結果を確認した。αMUC1−αCD3−CκおよびαMUC1−αCD3−CH3(図5C)ならびにαHER2−αCD3−CκおよびαHER2−αCD3−CH3(図5D)は、TA−MUC1+およびHER2+乳がん細胞株MCF−7の有効な溶解を示した。再度、αMUC1−αCD3−CH3によって媒介される比溶解は、αMUC1−αCD3−Cκと比較して増強された(図5C)が、αHER2−αCD3−CκはαHER2−αCD3−CH3と比較してより強い細胞傷害活性を示した(図5D)。再度、HER2結合性構築物で得られた結果は、T細胞結合性ドメインとがん細胞結合性ドメインの間の短い距離を強く支持する近年の報告と一致している。これと対照的に、αMUC1−αCD3−Cκと比較して、T−47D細胞の比溶解の増加がαMUC1−αCD3−CH3によって誘導された。未刺激PBMCがエフェクター細胞として使用されたとき、T細胞を動員しない親の抗体αMUC1(図5C)およびαHER2(図5D)のいずれも比溶解を誘導せず、この実験で使用された低いE:T比では、T細胞が細胞傷害を媒介する主なエフェクター細胞集団であることを示す。
PBMC ADCCアッセイは、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出アッセイとして実行した。したがって、溶解アッセイの前日に、TA−MUC1+およびHER2+ヒト乳がんMCF−7細胞を96ウェル平底プレートに播種した。翌日、PBMCを健康なドナーバフィーコートから単離し、αMUC1、αMUC1−αCD3−Cκ、αMUC1−αCD3−CH3、αHER2、αHER2−αCD3−CκおよびαHER2−αCD3−CH3と一緒に10:1の最終E:T比で標的細胞に加えた。24時間〜48時間後、標的細胞の死滅を細胞上清に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の定量化によって評価した(細胞傷害検出キット(LDH)、Roche)。最大放出は標的細胞のトリトン−X−100とのインキュベーションによって達成され、標的細胞およびPBMCだけを含有し、抗体を含有しない試料において抗体非依存性細胞死を測定した。
(実施例6:オフターゲット作用)
二重特異的抗体の安全性プロファイルを分析するために、抗体の特異的標的細胞の存在に依存する免疫細胞のサイトカイン放出を決定した。標的細胞の不在下での免疫細胞の活性化およびサイトカイン放出は、ヒト患者において有害な副作用につながることがある、オフターゲット作用である。
二重特異的抗体の安全性プロファイルを分析するために、抗体の特異的標的細胞の存在に依存する免疫細胞のサイトカイン放出を決定した。標的細胞の不在下での免疫細胞の活性化およびサイトカイン放出は、ヒト患者において有害な副作用につながることがある、オフターゲット作用である。
MUC1+MCF−7細胞の有る無しで、PBMCをαMUC1−αCD3−CH3と48時間インキュベートした。48時間後、上清を収集し、サイトカインIFN−γ、TNF−αおよびIL−6の濃度を分析した。MUC1+標的細胞の存在下で、αMUC1−αCD3−CH3媒介T細胞活性化は、用量依存的サイトカイン放出につながる(図8を参照)。標的細胞の不在下で、サイトカイン放出は検出されなかった。したがって、二重特異的抗体は、特に低いオフターゲット作用を有する非常に優れた標的特異性を示す。
別の実験では、MUC1に結合しないが、さもなければαMUC1−αCD3−CH3と同一である、非標的化T細胞係合二重特異的抗体を使用して二重特異的抗体の特異性を分析した。
CD3+ジャーカット細胞との結合は、両方の二重特異的抗体がCD3発現免疫細胞に同一の親和性を有することを実証した(図7を参照)。しかし、標的化二重特異的抗体αMUC1−αCD3−CH3だけが、免疫細胞を活性化することができる。標的化または非標的化二重特異的抗体およびMUC1+MCF−7細胞とのPBMCのインキュベーションは、標的化αMUC1−αCD3−CH3の存在下でのみCD4+およびCD8+T細胞の活性化を示した(図9を参照)。これは、二重特異的抗体αMUC1−αCD3−CH3による標的細胞への特異的結合および免疫細胞の動員だけが免疫細胞を活性化することを実証する。
(実施例7:T細胞動員)
腫瘍部位への免疫細胞の動員を実証するために、3D in vitroモデルを確立した。PBMCを腫瘍スフェロイドに加え、共培養を二重特異的抗体で刺激した。αMUC1−αCD3−CH3による処置の後、腫瘍スフェロイドにおけるCD8+T細胞の数は著しく増加した(図10を参照)。したがって、二重特異的抗体は、腫瘍部位に免疫細胞を有効に動員する。
腫瘍部位への免疫細胞の動員を実証するために、3D in vitroモデルを確立した。PBMCを腫瘍スフェロイドに加え、共培養を二重特異的抗体で刺激した。αMUC1−αCD3−CH3による処置の後、腫瘍スフェロイドにおけるCD8+T細胞の数は著しく増加した(図10を参照)。したがって、二重特異的抗体は、腫瘍部位に免疫細胞を有効に動員する。
(実施例8:MUC1の上方制御)
標的腫瘍における腫瘍関連MUC1の発現に及ぼす二重特異的抗体による処置の影響を、実施例7の3Dモデルを使用して分析した。PBMCを腫瘍スフェロイドに加え、共培養を二重特異的抗体αMUC1−αCD3−CH3で刺激した。抗体による処置の後、TA−MUC1の上方制御が観察された(図11を参照)。したがって、療法の開始後、腫瘍細胞において上方制御されたTA−MUC1発現によって腫瘍の標的化はさらに改善する。
標的腫瘍における腫瘍関連MUC1の発現に及ぼす二重特異的抗体による処置の影響を、実施例7の3Dモデルを使用して分析した。PBMCを腫瘍スフェロイドに加え、共培養を二重特異的抗体αMUC1−αCD3−CH3で刺激した。抗体による処置の後、TA−MUC1の上方制御が観察された(図11を参照)。したがって、療法の開始後、腫瘍細胞において上方制御されたTA−MUC1発現によって腫瘍の標的化はさらに改善する。
(実施例9:バイスタンダー免疫細胞活性化)
二次作用として、CD3+免疫細胞、特にT細胞の活性化は、二重特異的抗体によるさらなる免疫細胞の活性化ももたらす。これを実証するために、MUC1+標的細胞の存在下でPBMCをαMUC1−αCD3−CH3と48時間インキュベートした。48時間の後、異なる免疫細胞サブセットをフローサイトメトリーによって特異的活性化マーカーの発現について分析した(図12を参照)。標的細胞なしのインキュベーションを、陰性対照として使用した。
二次作用として、CD3+免疫細胞、特にT細胞の活性化は、二重特異的抗体によるさらなる免疫細胞の活性化ももたらす。これを実証するために、MUC1+標的細胞の存在下でPBMCをαMUC1−αCD3−CH3と48時間インキュベートした。48時間の後、異なる免疫細胞サブセットをフローサイトメトリーによって特異的活性化マーカーの発現について分析した(図12を参照)。標的細胞なしのインキュベーションを、陰性対照として使用した。
グラフに示すように、αMUC1−αCD3−CH3は、MUC1+標的細胞の存在下でB細胞、単球、NKT細胞およびNK細胞を活性化した。これらの標的細胞の不在下では、免疫細胞の活性化は観察されなかった。これらの結果は、MUC1+標的細胞の存在下でαMUC1−αCD3−CH3がバイスタンダー免疫細胞も活性化することを実証する。
(実施例10:LC−MSによるインタクトな抗体鎖の分子量の分析)
二重特異的抗体の安定性を分析した。αMUC1−αCD3−CH3およびαTFα−αCD3−CH3は、上で実施例1に記載の通り生成した。さらに、同じ二重特異的フォーマットであるが重鎖のC末端とリンカー配列の間に変異した配列を有する(Fc部分の最後のアミノ酸(K447)が欠失している)参照抗体を、類似の方法で生成した。ストレス下にある試料を、スピナーフラスコにおける長期バッチ生産の上清からの抗体の精製によって生成した。
二重特異的抗体の安定性を分析した。αMUC1−αCD3−CH3およびαTFα−αCD3−CH3は、上で実施例1に記載の通り生成した。さらに、同じ二重特異的フォーマットであるが重鎖のC末端とリンカー配列の間に変異した配列を有する(Fc部分の最後のアミノ酸(K447)が欠失している)参照抗体を、類似の方法で生成した。ストレス下にある試料を、スピナーフラスコにおける長期バッチ生産の上清からの抗体の精製によって生成した。
抗体試料を変性させ、DTTで処理してジスルフィド架橋を還元した。以降の脱グリコシル化は、Rapid PNGase F(NEB)とのインキュベーションによって達成される。試料をC4カラムに注入し、0.1%ギ酸によるH2O/AcN勾配を用いるUPLC−MSによって分析した。ESI−QTOF−MS(ImpactHD、Bruker)で、質量スペクトルを取得した。軽鎖(約24kDa)および重鎖(約77kDa)の予想される質量範囲を反映する20〜80kDaの間のチャージデコンボリューションのために0.7のバックグラウンド減算およびMaxEntアルゴリズムを用いたData Analysis(Bruker)で、生じたスペクトルを処理した。
二重特異的抗体のインタクトな重鎖のシグナル(76.8kDa)および49.3kDaの質量をもたらす重鎖のK447位のαCD3単鎖断片の潜在的喪失を考慮に入れた。結果は、図13に要約する。実証されるように、実施例1に記載の通りに生成された二重特異的抗体(「通常」)は、重鎖のいかなる分解も示さない。しかし、高い程度の死細胞を有する培養後期に由来するストレス下の二重特異的抗体は、分解断片(「ストレス下にある」)を示す。αTFα−αCD3−CH3抗体のために実行した配列変異(重鎖におけるK447の欠失)は、断片が検出不能である(「ストレス下のK447del」)ので、構築物を安定化する。
寄託された生体材料の識別
細胞株DSM ACC 2806、DSM ACC 2807およびDSM ACC 2856は、以下の表に示す日付に、Glycotope GmbH、Robert−Roessle−Str.10、13125 Berlin(DE)によりDSMZ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、Inhoffenstrasse 7B、38124 Braunschweig(DE)に寄託された。
細胞株DSM ACC 2806、DSM ACC 2807およびDSM ACC 2856は、以下の表に示す日付に、Glycotope GmbH、Robert−Roessle−Str.10、13125 Berlin(DE)によりDSMZ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、Inhoffenstrasse 7B、38124 Braunschweig(DE)に寄託された。
Claims (16)
- (i)少なくとも1つの抗体重鎖を含む抗MUC1抗体モジュール、および
(ii)抗CD3抗原結合性断片
を含む特異的抗体構築物であって、前記抗原結合性断片が前記抗体モジュールの重鎖のC末端に融合している、多重特異的抗体構築物。 - 前記抗MUC1抗体モジュールが、
(a)VHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを各々含む2つの重鎖;ならびに
(b)VLドメインおよびCLドメインを含む2つの軽鎖
を含む、請求項1に記載の多重特異的抗体構築物。 - 前記抗MUC1抗体モジュールが、TA−MUC1エピトープに特異的に結合し、
(i)配列番号7、8および9のいずれか1つと少なくとも80%同一であるアミノ酸配列、ならびに
(ii)配列番号1のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号3のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号5のアミノ酸配列を有するCDR−H3、または配列番号2のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号4のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR−H3による重鎖CDR配列のセット
を含む抗体重鎖可変領域を含む、請求項1または2に記載の多重特異的抗体構築物。 - 前記抗MUC1抗体モジュールが、TFαに特異的に結合し、
(i)配列番号27〜32のいずれか1つと少なくとも80%同一であるアミノ酸配列、ならびに
(ii)配列番号21のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号22または23のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号24、25または26のアミノ酸配列を有するCDR−H3による重鎖CDR配列のセット
を含む抗体重鎖可変領域を含む、請求項1または2に記載の多重特異的抗体構築物。 - 前記抗CD3抗原結合性断片が、VHドメイン、VLドメインおよび前記VHドメインと前記VLドメインの間のペプチドリンカーを含み、そして前記抗CD3抗原結合性断片が、特にscFv断片である、請求項1から4のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物。
- 前記抗CD3抗原結合性断片が、CD3εに特異的に結合し、
(i)配列番号46のいずれか1つと少なくとも80%同一であるアミノ酸配列、ならびに
(ii)配列番号43のアミノ酸配列を有するCDR−H1、配列番号44のアミノ酸配列を有するCDR−H2および配列番号34のアミノ酸配列を有するCDR−H3による重鎖CDR配列のセット
を含む抗体重鎖可変領域を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物。 - 前記抗体モジュールの異なる重鎖のC末端に各々融合している2つの抗CD3抗原結合性断片を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物。
- 前記抗体モジュールがCH2ドメインにN−グリコシル化部位を含まない、請求項1から7のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物。
- 前記抗体モジュールが前記抗体重鎖のCH2ドメインにN−グリコシル化部位を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物。
- 前記抗体モジュールが、前記抗体重鎖のCH2ドメインにグリコシル化パターンを有し、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量が、前記多重特異的抗体構築物の組成物中の前記抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の少なくとも60%である、請求項9に記載の多重特異的抗体構築物。
- 前記抗体モジュールが、前記抗体重鎖のCH2ドメインにグリコシル化パターンを有し、コアフコース残基を担持するグリカンの相対量が、前記多重特異的抗体構築物の組成物中の前記抗体モジュールのCH2ドメインに結合したグリカンの総量の40%もしくはそれ未満である、請求項9に記載の多重特異的抗体構築物。
- 前記多重特異的抗体構築物にコンジュゲートしているさらなる作用物質を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物ならびに溶媒、希釈剤および賦形剤からなる群より選択される1つまたは複数のさらなる成分を含む医薬組成物。
- 医療で使用するための、請求項1から12のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物または請求項13に記載の医薬組成物。
- がんなどの異常な細胞増殖に関連する疾患、細菌、ウイルス、真菌または寄生性感染症などの感染症、炎症性疾患、例えば自己免疫性疾患および炎症性腸疾患、移植片対宿主病、ならびに免疫欠損などの免疫活性の低下に関連する疾患の処置、予後診断、診断および/またはモニタリングで使用するための、請求項1から12のいずれか一項に記載の多重特異的抗体構築物または請求項13に記載の医薬組成物。
- 乳房、結腸、胃、肝臓、膵臓、腎臓、血液、肺および卵巣のがんからなる群より選択されるがんの処置で使用するための、請求項15に記載の多重特異的抗体構築物または医薬組成物。
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