CN117412768A - 抗体-nkg2d配体结构域融合蛋白 - Google Patents

抗体-nkg2d配体结构域融合蛋白 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一种抗体融合蛋白，其包括：(i)重链，所述重链包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变区序列；以及(ii)轻链，所述轻链包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变区序列，其中所述轻链在C末端处与A1‑A2结构域融合，所述A1‑A2结构域包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。提供了编码所述抗体融合蛋白的全部或一部分的核酸，以及使用所述抗体融合蛋白治疗例如CD20阳性癌症的方法。本公开进一步提供了一种突变体A1‑A2结构域肽。

Description

抗体-NKG2D配体结构域融合蛋白
技术领域
本发明涉及一种非天然NKG2D配体的与非天然NKG2D受体结合的A1-A2结构域和一种包括所述结构域的抗体融合蛋白。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年6月8日提交的美国临时申请第63/208,407号的权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用完全并入本文。
通过引用并入以电子方式提交的材料
通过引用以其整体并入了与此同时提交并且标识如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表：63,727字节的ASCII(文本)文件，其命名为“56867_Seqlisting.txt”；创建于2022年6月7日。
背景技术
将患者源性T细胞工程化为表达嵌合抗原受体(CAR)已经改变了过继性细胞疗法的前景，使得科学家和临床医师能够利用T细胞的强大细胞溶解能力并且将所述T细胞以MHC非依赖性方式定向到具体抗原表达性靶标。所述T细胞最初用于治疗血液系统恶性病的应用引起了惊人反响，并且激发了大量的研究工作，以推动其在非血液系统适应症中的有效使用。然而，CAR-T细胞疗法因其利用单一目的靶向性结构域、可能归因于细胞因子释放综合征的剂量控制的缺乏、无法解决导致疾病复发的肿瘤抗原损失以及导致缺乏持续性的非人靶向性结构域的免疫原性而受到限制。本领域需要经改进的基于CAR的细胞疗法以解决当前疗法选项的这些局限性。
发明内容
本公开提供了一种抗体融合蛋白，其包括：(i)重链，所述重链包括包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的可变区序列；以及(ii)轻链，所述轻链包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变区序列，其中所述轻链在C末端处与A1-A2结构域融合，所述A1-A2结构域包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在各个方面，所述重链包括恒定结构域，所述恒定结构域包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列。任选地，所述A1-A2结构域通过接头与所述轻链融合，所述接头包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在此方面，所述轻链在各个方面包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在各个方面，所述重链，其包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
本公开进一步提供了一种核酸分子，其包括编码所述抗体融合蛋白的轻链(例如，包括可变区序列的轻链，所述可变区序列包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其中所述轻链在C末端处与A1-A2结构域融合，所述A1-A2结构域包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列)的核苷酸序列。本公开进一步提供了一种组合物，其包括编码所述抗体融合蛋白的轻链的所述核酸分子和包含编码本文所述的抗体融合蛋白的重链(例如，包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变区序列的重链)的核苷酸序列的核酸分子。还提供了一种表达载体，其包括编码本文所述的抗体融合蛋白的轻链的所述核酸分子，所述表达载体任选地进一步包括包含编码本文所述的抗体融合蛋白的重链的核苷酸序列的核酸分子。进一步提供了一种宿主细胞，其包括本文所述的表达载体。本公开提供了一种宿主细胞，其包括包含编码所述抗体融合蛋白的轻链的核苷酸序列的核酸分子以及包含编码所述抗体融合蛋白的重链的核苷酸序列的核酸分子。还提供了一种产生抗体融合蛋白的方法，所述方法包括：培养宿主细胞，所述宿主细胞包括包含编码所述抗体融合蛋白的轻链的核苷酸序列的核酸分子以及包含编码所述抗体融合蛋白的重链的核苷酸序列的核酸分子；以及回收所述抗体融合蛋白。
还提供了一种试剂盒，其包括一个或多个容器，所述一个或多个容器包括本文所述的抗体融合蛋白。任选地，所述试剂盒进一步包括一个或多个容器，所述一个或多个容器包括哺乳动物细胞(例如，人淋巴细胞或人巨噬细胞)，所述哺乳动物细胞包括嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括SEQ ID NO:15。在各个方面，所述嵌合抗原受体进一步包括SEQID NO:16-18。
本公开进一步提供了一种治疗患有CD20阳性癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的抗体融合蛋白以及哺乳动物细胞(例如，人淋巴细胞或人巨噬细胞)，所述哺乳动物细胞包括嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括SEQ ID NO:15。任选地，所述嵌合抗原受体进一步包括SEQ ID NO:16-18。提供了一种抗体融合蛋白和哺乳动物细胞用于治疗CD20阳性癌症的用途，以及抗体融合蛋白和哺乳动物细胞在制备用于治疗CD20阳性癌症的药物中的用途。
本公开还提供了一种A1-A2结构域肽，其包括与SEQ ID NO:30具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述肽包括SEQ ID NO:30的位置40、54和/或84中的一个或多个位置处的丙氨酸或谷氨酰胺。在各个方面，所述肽包括SEQ ID NO:30的位置40和54处的谷氨酰胺残基。任选地，所述肽包括SEQ ID NO:30的位置84处的谷氨酰胺或SEQ ID NO:30的位置84处的丙氨酸。
应当理解，虽然说明书中的各个实施例是使用“包括”语言来呈现的，但是在各种情况下，也可以使用“由...组成”或“基本上由...组成”语言来描述相关实施例。本公开设想了被描述为“包括(comprising)”特征的实施例以包含“由所述特征组成(consistingof)”或“基本上由所述特征组成(consisting essentially of)”的实施例。术语“一个或一种(a/an)”是指一个/种或多个/种。因而，术语“一个(a)”(或“一种(an)”)、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可互换地使用。除非上下文另外明确要求，否则术语“或”应当被理解为涵盖替代或一起的项。
除非在本文中另外指示，否则对本文中值范围的叙述仅旨在充当个别提及属于所述范围的每一单独值和每个端点的速记方法，并且每一单独值和端点并入到本说明书中，如同在本文中单独地叙述一般。然而，本说明书还设想了排除较低和/或较高端点的相同范围。当使用术语“约”时，其意指所叙述的数字加上或减去该所叙述数字的5％、10％或更多。预期的实际变化可从上下文中确定。
除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本公开，而不对本公开的范围构成限制。仅在本文中被描述为对本发明至关重要的此类限制才应被如此看待；缺少未在本文中被描述为至关重要的限制的本发明的变化旨在作为本发明的各方面。
从本申请，包含附图和具体描述整体来看，本发明的另外的特征和变化对于本领域的技术人员来说将是显而易见的，并且所有此类特征均旨在作为本发明的各方面。同样，本文所描述的本发明的特征可以被重新组合到也旨在作为本发明的各方面的另外的实施例中，而不管特征的组合是否被指定为本发明的方面或实施例。整个文档旨在作为统一的公开内容而相关联，并且应当理解，还设想了本文所述的特征的所有组合(即使在单独的章节中进行了描述)，即使特征的组合没有一起存在于本文档的同一句子或段落或章节中。
附图说明
图1是提供本文所描述的各个序列的图表。
图2A展示了以His为标签的单体野生型MIC配体与野生型NKG2D或iNKG2D.YA进行的相互作用的octet BLI动力学结合数据。在基线确立后，用抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器尖端捕获Fc-wtNKG2D或Fc-iNKG2D.YA，所述生物传感器尖端与每个配体的稀释系列缔合(括号内的值表示所检查的最高浓度)。ULBP4不可以作为单体进行表达和纯化，因此未被包含在此测定中。注意，所有轴都是按相同尺度(结合–0nm、0.4nm、0.8nm、1.2nm(y轴)；时间–0秒、50秒、100秒、150秒、200秒、250秒、300秒、350秒(x轴))。数据代表单个实验。
图2B展示了由ELISA得到的结果，其了证实iNKG2D.YA不能够与天然配体接合。将配体-Fc融合物(R&D生物系统公司(R&D Biosystems))涂覆到微量滴定板上，并且施涂生物素化的Fc-wtNKG2D(虚线)或Fc-iNKG2D.YA(实线)的滴定液并通过链霉亲和素-HRP进行检测。(ELISA信号(OD450)(y轴)；配体Fc nM(x轴))。
图3A-3D：正交U2S3配体(A1-A2结构域)与NKG2D Y152A/199F(iNKG2D.AF)(本公开的NKG2D胞外结构域)的选择性结合。所进行的文库设计和噬菌体淘选如针对iNKG2D.YA所描述的进行描述，不同之处在于在针对浓度提高的Fc-wtNKG2D竞争者的几轮选择期间使用了生物素化的双突变体Fc-iNKG2D.AF。数据代表单体配体与Fc-wtNKG2D或Fc-iNKG2D.AF的相互作用的单个实验(图3A)Octet BLI结合数据。数据代表两个实验。(图3B)选自噬菌体展示文库的前导变体被克隆为与利妥昔单抗(Rituximab)轻链的C末端的融合物，并且与Fc-wtNKG2D、Fc-iNKG2D.YA和Fc-iNKG2D.AF差异性结合，并通过ELISA进行定量。示出了四种选择性地与Fc-iNKG2D.YA接合并且不与其它两种受体接合的变体。在图3B的线形图中，wtNKG2D用菱形表示，iNKG2D用正方形表示，并且iNKG2D.AF用三角形表示。(图3C)ELISA证明了与受体变体进行的U2S3和U2R配体结合的排他性，针对所述受体变体分别选择了Fc-iNKG2D.YA和Fc-iNKG2D.AF。U2S3配体在例如美国专利公开第2019/0300594号中进行了进一步描述，所述美国专利公开通过引用特此并入。(图3D)在iNKG2D.YA-CAR或iNKG2D.AF-CAR表达性CD8+T细胞和利妥昔单抗.LC-U2S3或利妥昔单抗.LC-U2R的滴定液的情况下，用Ramos靶细胞以20:1的效应子:靶标比率(E:T)进行的钙黄绿素释放测定。误差条代表技术重复的±SD。
图4A：在第三轮和第四轮淘选后，在存在浓度提高的wtNKG2D竞争者的情况下，所选择的噬菌体与Fc-iNKG2D.YA和Fc-wtNKG2D的相对结合。选择图中以三角形列出的部分中的噬菌体克隆进行进一步表征。
图4B：三种噬菌体变体–S1、S2、S3–被表达为与抗FGFR3抗体克隆R3Mab重链的C末端的融合物，作为MicAbody，并且将其与野生型ULBP2和R81W版本一起，针对选择性变体保持相较于Fc-wtNKG2D(虚线)优先进行Fc-iNKG2D.YA结合(实线)的能力进行测试。所有经纯化的MicAbody都保持与人FGFR3的结合(数据未示出)。
图4C：以His为标签的单体野生型ULBP2、ULBP2 R81W和正交U2S3配体与Fc-NKG2D和Fc-iNKG2D.YA进行结合的结合分析。用抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器尖端捕获Fc-wtNKG2D或Fc-iNKG2D.YA，所述生物传感器尖端之后与配体的稀释系列缔合。数据来自单个实验。
图5：对与利妥昔单抗的重链或轻链的C末端融合时U2S3正交性的Octet BLI验证。用抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器尖端捕获Fc-wtNKG2D或Fc-iNKG2D.YA，所述生物传感器尖端之后与开始于50nM的MicAbody的两倍稀释系列缔合。针对所有感测图，将对应于结合反应的y轴设置相同尺度。Kd值仅可以针对两种正结合相互作用进行计算，示出。
图6：开始于多肽的位于左侧的N末端的iNKG2D.YA CAR受体的示意图，并且包含成熟I型跨膜蛋白中不存在的信号序列(SS)。加下划线的序列对应于信号序列，斜体的序列对应于iNKG2D结构域(SEQ ID NO:15)，普通序列对应于CD8a铰链/跨膜结构域(SEQ ID NO:16)，加下划线且斜体的序列对应于4-1BB结构域(SEQ ID NO:17)，粗体序列对应于CD3ζ结构域(SEQ ID NO:18)，加双下划线的序列对应于接头，并且加点状下划线的序列对应于eGFP(绿色荧光蛋白)序列。
图7A-7C：可转化CAR系统的元件。(图7A)以将NKG2D-MIC轴的组分转化为可转化CAR系统的工程化概述。iNKG2D.YA和U2S3分别成为第二代CAR受体和双特异性衔接分子(MicAbody)的组分。“TAA”是肿瘤相关抗原。(图7B)iNKG2D.YA-CAR成为CD4或CD8细胞的高效率慢病毒转导的代表性实例。转导效率在供体之间有所变化，但始终都实现了>70％的GFP+产率。RITscFv-CAR被示出用于比较，并且除了使用基于利妥昔单抗的VH/VL结构域的scFv而不是iNKG2D.YA之外，与iNKG2D-CAR具有相同的架构。(图7C)通过将细胞与利妥昔单抗.LC-U2S3 MicAbody一起温育，之后进行PE缀合的小鼠抗人κ链抗体染色确定iNKG2D.YA-CAR在CD8+T细胞中的表面表达。未经转导的T细胞被示出用于比较。
图8A-8C：iNKG2D-CAR表达性CD8+T细胞的配体依赖性激活和MicAbody依赖性受体内化。(图8A)用包含野生型NKG2D或iNKG2D.YA作为受体结构域的CAR构建体转导CD8+T细胞。将野生型以His为标签的单体配体或以His为标签的单体U2S3以开始于10ug/mL的1:3稀释系列涂覆到微量滴定板的孔上。将1x105个CAR表达性细胞引入到150uL容积的没有外源性IL2的孔中，24小时后收集上清液，并且通过细胞因子特异性ELISA定量对产生和释放的细胞因子的量进行定量。ULBP4未被包含在测定中，因为以His为标签的版本无法进行表达和纯化。(图8B)在iNKG2D-CAR细胞的情况下，在Rit-S3 MicAbody的浓度提高(nM)的情况下，将表达iNKG2D-CAR或RITscFv-CAR的CD8+细胞与Ramos细胞以4:1的E:T共培养。24小时后，采集培养上清液，并且通过ELISA对释放的细胞因子进行定量。通过共温育两小时后的钙黄绿素释放来测量细胞溶解。所有误差条是技术一式三份的±SD。代表单个实验的所有数据。(图8C)将iNKG2D-CD8+细胞预温育5nM曲妥珠单抗.LC-U2S3 MicAbody(Trastuzumab.LC-U2S3 MicAbody)，然后暴露于用Her2的滴定液预涂覆的孔。2小时后，将细胞与抗κ-PE抗体一起温育以检测表面可及的MicAbody，并且检查GFP以查看所表达的iNKG2D-CAR的总水平。
图9A-9D：可转化CAR活性的体外表征。(图9A)Ramos(CD20+)靶细胞以5:1的E:T暴露于可转化CAR-CD8细胞，并且在利妥昔单抗抗体(ADCC缺陷型)、利妥昔单抗.LC-U2S3MicAbody或曲妥珠单抗.LC-U2S3 MicAbody的浓度提高的情况下共培养。24小时后，采集上清液，并且通过ELISA对IL-2(实心条)或IFNγ(阴影条)进行定量。Rit-U2S3是唯一在5000pg/mL或更高下表现出细胞因子释放的样品。(图9B)将可转化CAR-CD8细胞在AlexaFluor 647缀合的利妥昔单抗.LC-U2S3的浓度提高的情况下温育30分钟，将过量洗涤掉，并且通过流式细胞术对MFI进行定量。5nM表示受体被最大程度地占据的拐点。(图9C)可转化CAR-CD8细胞用如(B)中所描述的提高浓度的利妥昔单抗.LC-U2S3武装，然后与钙黄绿素上样的Ramos细胞以20:1的E:T一起共温育两小时，之后对释放的钙黄绿素的量进行定量。(图9D)将iNKG2D.YA-CAR CD8+细胞用(B)中所描述的5nM利妥昔单抗.LC-U2S3、5nM曲妥珠单抗.LC-U2S3或每一者的2.5nM等摩尔混合物预武装，然后以两种所指示E:T比率暴露于钙黄绿素上样的Ramos或CT26-Her2细胞。两小时后对释放的钙黄绿素的量进行定量。除图9B外，数据代表至少两个独立实验，并且按照技术一式三份的平均值进行绘制。
图10A-10C：重链与轻链U2S3融合物与利妥昔单抗(ADCC-)抗体的比较。(图10A)在不存在人T细胞或肿瘤的情况下，在NSG小鼠体内IV施用100ug后血清利妥昔单抗-U2S3MicAbody水平的药代动力学。所使用的所有MicAbody和抗体对照均为ADCC缺陷型的。左边的图是亲本抗体与轻链U2S3融合物的比较，而右边的图是亲本抗体与重链U2S3融合物的比较。所有误差条是技术一式三份的±SD。(图10B)与E:T为20:1的iNKG2D-CAR CD8+T细胞和Ramos靶细胞和利妥昔单抗-MicAbody的滴定液共培养两小时后的体外钙黄绿素释放测定。误差条代表实验的±SD，并且数据代表多个实验。图中顶部的线对应于利妥昔单抗.LC-U2S3，中间的线对应于利妥昔单抗.HC-U2S3，并且底部的线对应于利妥昔单抗。(图10C)证明利妥昔单抗.LC-U2S3与小鼠NKG2D的结合的ELISA。示出了A480吸光度值。具有与小鼠NKG2D天然结合的小鼠野生型Rae1b配体的曲妥珠单抗.LC-Rae1b被包含作为阳性对照。
图11A-E：对NSG小鼠的播散性Raji B细胞淋巴瘤的控制。(图11A)每个队列的平均发光输出±SD，以及接受(图11B)5x106个或(图11C)15x106个总T细胞的组的个体动物迹线。检查(图11D)血液中的人CD3+细胞和(图11E)通过抗F(ab')2检测到的结合的MicAbody的研究过程内的T细胞动力学。示出了队列平均值±SD，n＝5。
图12A-12C：通过可转化CAR-T细胞对NSG小鼠的皮下植入的Raji肿瘤的控制。(图12A)每个队列的平均肿瘤体积，n＝5。每组内的肿瘤的大小差异很大，因此没有绘制误差条。两个队列，上下颠倒的三角形(7M cCAR-T+60ug Ritux-S3)和正方形(35M预武装的cCAR-T)重叠并且在第26天之后在图形上无法区分。(图12B)展示植入后第14天、第21天和第45天时血清Rit-S3水平的条形图。三个条形图针对每个时间点提供-35M预武装的cCAR-T(左侧条)、7M cCAR-T+60ug Ritux-S3(中间条)和35M cCAR-T+60ug Ritux-S3(右侧条)。误差条表示来自给定队列中的小鼠的±SD样品。(图12C)血液中的CD3+T细胞动力学和利用表面缔合的MicAbody F(ab')2染色对T细胞的百分比的定量，其中示出了±SD误差条。
图13A-13F：补体因子C1q靶向募集到iNKG2D.AF-CAR细胞，以定向其补体介导的耗损。(图13A)表达为N或C末端融合物的与人IgG的Fc部分的正交配体融合物的结构。除了野生型Fc外，还独立地探索了CH2结构域中增强C1q结合的两个突变集合-S267E/H268F/S324T/G236A/I332E(“EFTAE”)和K326A/E333A(“AA”)。(图13B)检查人C1q与每种经纯化的融合蛋白的结合的ELISA。Kd的等级顺序为EFTAE<AA<wt(分别地，0.12nM、0.35nM和0.67nM)，不论融合物的朝向如何。(图13C和13D)用于C1q结合的补体依赖性细胞毒性(CDC)测定增强Fc-融合。在用SYTOX红枚举死亡的T细胞之前，将iNKG2D.AF-CAR或未经转导的CD8+T细胞与每种融合分子的滴定液和10％正常人血清补体一起温育三个小时。(图13E和13F)如上文(图13C)中所描述的用U2S3正交配体融合物将补体定向到iNKG2D.YA-CAR细胞的CDC测定。所有误差条为以iNKG2D-AF和iNKG2D-YA作为单独实验进行的一式三份技术测量的±SD。
图14A–14E：突变体-IL2细胞因子到达iNKG2D-CAR CD8+T细胞的靶向递送。(图14A)用30IUe/mL细胞因子或细胞因子-U2S2融合物进行wtNKG2D-CAR(左侧条)或iNKG2D.YA-CAR(右侧条)处理三天后的体外增殖。较暗的阴影用于突出选择性。(图14B)将低效率(45％GFP+)iNKG2D.YA-CAR转导与30IUe/mL非选择性(U2R81W)或iNKG2D.YA选择性(U2S2)mutIL2融合物一起培养，并维持七天。通过流式细胞术定期检查细胞，以对每个群体中的GFP+细胞％进行定量。顶部的线对应于U2S2-hFc-mutlL2(正方形)和U2S2-mutlL2(圆形)；底部的线对应于U2R80W-mutlL2(圆形)和U2R80W-hFc-mutlL2(正方形)。(图14C)在利妥昔单抗.LC-U2S3的浓度提高的情况下，将iNKG2D-CAR CD8+T细胞与30IUe/mL野生型IL-2或U2S3-hFc-mutIL2一起培养，然后与Ramos细胞以20:1的E:T共培养。对释放的钙黄绿素进行定量，并且将未经转导的CD8+细胞维持在充当阴性对照的rhIL-2。(图14D)将未经转导的(右侧条)或iNKG2D-CAR CAR CD8+T细胞(左侧条)与各种细胞因子分子一起温育三天，并且对增殖进行定量。对照分子包含单体U2S3-hFc以及Rit-S3 MicAbody。括号内的值是所测试的IUe/mL浓度。所示的数据是技术一式三份的平均值。(图14E)U2S3-hFc-mutIL2在NSG小鼠中IP注射60ug后的血清PK(N＝3)。所有误差条是生物一式三份的±SD。数据代表至少两个实验。
图15A-15B：可转化CAR-T细胞对U2S3-hFc-mutIL2的体内应答。(图15A)向NSG小鼠注射7x106个总经iNKG2D转导的细胞(CD4:CD8 1:1)。在第14天T细胞收缩后，每周向小鼠注射一次30ug U2S3-hFc-mutIL2或PBS(用三角形标注)，并且通过流式细胞术监测T细胞动力学。示出了外周血中的人CD3+T细胞的％，其中每条迹线对应于个体小鼠，n＝5。(图15B)U2S3-mutIL2处理后CD8+细胞的扩增以及GFP+(CAR表达性)细胞的比例增加的图。上部的线簇对应于GFP+相对于CD8+细胞的％，下部的线簇对应于血液中的CD8+％。
图16：人PBMC对U2S3-hFc-mutIL2的应答性。将来自三个供体的人PBMC与对照一起在U2S3-hFc-mutIL2或U2S3-hFc-wtIL2的浓度提高的情况下温育四天。检查每种标记的细胞类型的标志物Ki-67，以对每种条件下的增殖性应答进行定量。对于供体1、2和3中的每一者，示出了十一个条；在每个图中，条从左到右表示未经处理的抗CD3[2ug/ml]、IL-2[300IUe/ml]、mutIL2[30IUe/ml]、mutIL2[300IUe/ml]、mutIL2[3000IUe/ml]、mutIL2[30000IUe/ml]、wtIL2[30IUe/ml]、wtIL2[300IUe/ml]、wtIL2[3000IUe/ml]和wtIL2[30000IUe/ml]。误差条是一式三份测量的±SD，并且数据代表单个实验。
图17A-17B展示了评估具有在不同位置处并使用不同接头连接的A1-A2结构域的MicAbody的研究。图17A展示了所测试的构建体。Rit.HCd.S3对应于包括在实施例中被描述为通过GGGS(SEQ ID NO:14)接头与重链融合的U2S3 A1-A2结构域的利妥昔单抗抗体。Rit.HCd.apts.S3对应于包括通过APTSSSGGGGS(SEQ ID NO:10)接头与重链融合的U2S3A1-A2结构域的利妥昔单抗抗体。Rit.HCd.LC.S3对应于包括通过APTSSSGGGGS(SEQ ID NO:10)接头与轻链融合的U2S3 A1-A2结构域的利妥昔单抗抗体。Rit.HCd.LC.gggs.S3对应于包括通过GGGS(SEQ ID NO:14)接头与轻链融合的U2S3 A1-A2结构域的利妥昔单抗抗体。图17B是条形图，其展示了在与E:T为20:1的iNKG2D-CAR CD8+T细胞和Ramos靶细胞和利妥昔单抗-MicAbody的滴定液共培养两小时后的体外钙黄绿素释放测定中使用不同浓度的MicAbody实现的细胞溶解(最大％；y轴)。对于每个构建体，展示了0nM(第一个条)、0.008nM(第二个条)、0.04nM(第三个条)、0.2nM(第四个条)、1nM(第五个条)和5nM(第六个条)MicAbody的细胞溶解的最大％。Rit.HCd.LC.S3(包括轻链上通过APTSSSGGGGS(SEQ ID NO:10)接头连接的A1-A2结构域)表现得比具有GGGS(SEQ ID NO:14)接头的版本更好，并且比具有与重链融合的A1-A2结构域的构建体更好，无论接头如何。
图18是展示了使用利妥昔单抗融合蛋白进行的iNKG2D.YA捕获的线形图，所述利妥昔单抗融合蛋白包括SEQ ID NO:30(U2S3)或SEQ ID NO:11(U2S3(NQ))的与抗体的轻链融合的A1-A2结构域。相对于SEQ ID NO:30具有位置40处和54处的取代的A1-A2结构域与SEQ ID NO:30的A1-A2结构域表现相似。
图19是展示了利妥昔单抗(“Rit”)融合蛋白与野生型NKG2D结合的能力降低的线形图，所述Rit融合蛋白包括SEQ ID NO:30(U2S3)或SEQ ID NO:11(U2S3(NQ))的与抗体的轻链融合的A1-A2结构域。“Rit.P”是指未与A1-A2结构域融合的利妥昔单抗亲本抗体。“Rit.U2wt”是指与野生型ULBP2结构域融合的利妥昔单抗，其预期与野生型NKG2D结合。“Rit.S3”和“Trast.S3”分别是指与U2S3结构域(SEQ ID NO:30)融合的利妥昔单抗或曲妥珠单抗。“Rit.NQ”是指与U2S3(NQ)(SEQ ID NO:11)融合的利妥昔单抗。将NQ突变引入到U2S3结构域中未影响构建体的正交性，并且在与野生型NKG2D结合方面没有出现逆转(即，构建体不与野生型NKG2D结合)。
图20是条形图，其展示了在与E:T为20:1的iNKG2D-CAR CD8+T细胞和Ramos靶细胞和利妥昔单抗-MicAbody的滴定液共培养两小时后的体外钙黄绿素释放测定中使用不同浓度的MicAbody实现的细胞溶解(最大％；y轴)。对于每个构建体，展示了0nM(第一个条)、0.008nM(第二个条)、0.04nM(第三个条)、0.2nM(第四个条)、1nM(第五个条)和5nM(第六个条)MicAbody的细胞溶解的最大％。测试了Rit.S3(包括SEQ ID NO:30的A1-A2结构域)、Rit.S3.NQ(包括SEQ ID NO:30的包括位置40和54处的谷氨酰胺的A1-A2结构域)、Rit.S3.NQ.AYT(包括SEQ ID NO:30的包括位置40和54处的谷氨酰胺和位置82处的丙氨酸的A1-A2结构域)和Rit.S3.NQ.QYT(包括SEQ ID NO:30的包括位置40和54处的谷氨酰胺和位置82处的谷氨酸的A1-A2结构域)。
具体实施方式
本公开提供了一种融合蛋白，其包括抗体(或其它抗原结合蛋白)和非天然NKG2D配体的A1-A2结构域。非天然NKG2D配体与非天然NKG2D受体选择性地结合。在本公开的各个方面，融合蛋白与展现出A1-A2结构域与其结合的非天然NKG2D受体的CAR-T细胞结合使用，由此提供用于递送定制的CAR-T细胞疗法的强大系统，所述系统克服了当前基于CAR-T细胞的治疗剂的许多缺点。与当前可用的基于CAR-T细胞的疗法不同，本公开的融合蛋白和系统允许将T细胞活性定向到所选择的抗原的灵活靶向、减少抗原损失相关的复发的可能性的多重能力、用于CAR-T细胞的差异性接合的剂量控制以及调节性药剂至CAR表达性细胞的选择地递送。
本公开提供了具有特别有利的特性的非天然NKG2D配体的A1-A2结构域。NKG2D是一种在自然杀伤(NK)细胞、一些髓系细胞和某些T细胞上表达为II型同二聚体整合膜蛋白的激活受体。人NKG2D具有八种不同的天然MIC配体(MICA、MICB、ULBP1至ULBP6)，所述天然MIC配体在细胞的表面上响应于各种应激而被上调，并且其差异性调节为免疫系统提供了一种在最小附带损害的情况下对广泛的紧急提示做出反应的方式。Groh等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》93,12445–12450(1996)；Zwirner等人,《人类免疫学(Hum.Immunol.)》60,323–330(1999)；以及Spies等人,《自然免疫学(Nat.Immunol.)》9,1013–1015(2008)。已经解出NKG2D胞外结构域、几种可溶性配体以及配体与胞外结构域的所结合的复合物的结构，从而揭示了同二聚体界面中的鞍状凹槽，所述鞍状凹槽与配体的结构上保守的A1-A2结构域接合，所述结构上保守的A1-A2结构域另外具有不同的氨基酸同一性。Li等人,《自然学杂志》2,443–451(2001)；Radaev等人,《免疫学(Immunity)》15,1039–1049(2001)；Zuo等人,《科学信号传导(Sci Signal)》10,(2017)；以及McFarland等人,《免疫学》19,803–812(2003)。本公开的“A1-A2结构域”不是天然存在的A1-A2结构域，而是包括与NKG2D胞外结构域的突变版本结合并且不与野生型NKG2D(wtNKG2D)结合(或者至少不以这种在体内在生物学上相关的方式与wtNKG2D结合)的氨基酸序列。此基于实例(SEQID NO:30)中描述的U2S3结构域的正交A1-A2结构域允许具有有利特性的独特糖基化模式。在各个方面，本公开提供了一种A1-A2结构域肽，其包括与SEQ ID NO:30具有至少95％同一性(例如，与SEQ ID NO:30具有至少96％同一性、至少97％同一性，至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性)的氨基酸序列，其中所述肽包括SEQ ID NO:30的位置40、54和/或84中的一个或多个位置处的丙氨酸或谷氨酰胺。在此方面，A1-A2结构域可以包括位置40处的谷氨酰胺、位置40处的丙氨酸、位置54处的谷氨酰胺、位置54处的丙氨酸、位置40处的丙氨酸和位置54处的谷氨酰胺(任选地和位置84处的谷氨酰胺或丙氨酸)、位置40处的丙氨酸和位置54处的丙氨酸(任选地和位置84处的谷氨酰胺或丙氨酸)、位置40处的谷氨酰胺和位置54处的丙氨酸(任选地和位置84处的谷氨酰胺或丙氨酸)、位置40处的谷氨酰胺和位置54处的谷氨酰胺(任选地和位置84处的谷氨酰胺或丙氨酸)、位置40处的丙氨酸和位置84的谷氨酰胺、位置40处的丙氨酸和位置84处的丙氨酸、位置40处的谷氨酰胺和位置84处的丙氨酸、位置40处的谷氨酰胺和位置84处的谷氨酰胺、位置54处的丙氨酸和位置84处的谷氨酰胺、位置54处的丙氨酸和位置84处的丙氨酸、位置54处的谷氨酰胺和位置84处的丙氨酸或位置54处的谷氨酰胺和位置84处的谷氨酰胺，其中所述位置参考SEQ ID NO:30内的氨基酸位置。例如，本公开提供了与SEQ ID NO:30具有至少95％同一性的A1-A2结构域肽，其中所述肽包括相对于SEQ ID NO:30的序列的位置40处和54处的谷氨酰胺残基。任选地，A1-A2结构域包括SEQ ID NO:30的位置84处的谷氨酰胺。可替代地，在各个方面，A1-A2结构域可以包括SEQ ID NO:30的位置84处的丙氨酸。在各个方面，A1-A2结构域肽包括SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32(或由其组成)。如本文进一步解释的，本公开的任何A1-A2结构域可以与抗体(或其它抗原结合蛋白)的重链或轻链融合，以产生例如与靶抗原和经突变的NKG2D胞外结构域两者结合的双特异性融合蛋白。这种格式(与A1-A2结构域融合的抗体)还被称为“MicAbody”。
本公开提供了一种抗体融合蛋白，其包括：(i)重链，所述重链包括SEQ ID NO:1的可变区序列；以及(ii)轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:8的可变区序列。所述轻链在C末端处与A1-A2结构域融合，所述A1-A2结构域包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。本抗体融合蛋白的重链可变区和轻链可变区是利妥昔单抗，即与CD20(在B细胞上显示的表面抗原)结合的嵌合单克隆抗体(IgG1κ免疫球蛋白)的那些重链可变区和轻链可变区。利妥昔单抗进一步描述于例如美国专利第5,736,137号；5,776,456；和5,843,439号中。B细胞在某些自身免疫性疾病和癌症的发病机制中发挥作用，并且利妥昔单抗在靶向和杀死B细胞，以在各种病症中实现有益作用方面是有效的。例如，利妥昔单抗在治疗如下癌症方面已显示出功效：白血病(例如，毛细胞白血病(HCL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL))和淋巴瘤(例如，非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkins Lymphoma，NHL，如弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B-cellLymphoma)(DLBCL)、伯基特淋巴瘤(Burkitt Lymphoma)(BL)、套细胞淋巴瘤(Mantel cellLymphoma)(MCL)和滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma))。利妥昔单抗在治疗如下自身免疫性病症方面也展现出功效：类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮(SLE)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病和自身免疫相关贫血。利妥昔单抗也已被批准用于治疗肉芽肿性多血管炎(GPA)(韦格纳氏肉芽肿(Wegener's Granulomatosis))和显微镜下多血管炎(Microscopic Polyangiitis，MPA)。
如本文所使用的，术语“抗体”是指具有全长重链和轻链的免疫球蛋白。本公开的抗体是包含四个高度保守的亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的IgG抗体，这些亚类通常在其恒定区(例如，在铰链和/或CH2结构域)方面有所不同。任选地，本公开的抗体融合蛋白包括其恒定区可以被修饰成降低或失活抗体触发抗体依赖性细胞细胞溶解(ADCC)(例如，通过将D265A/D297A取代引入到Fc结构域中)的能力的IgG1抗体。在各个方面，抗体融合蛋白的重链包括恒定结构域，所述恒定结构域包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列。本公开还设想了其中重链包括恒定结构域的抗体融合蛋白，所述恒定结构域包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列。本公开还设想了其中重链包括与SEQ ID NO:3至少90％相同或至少95％相同的氨基酸序列，但其中SEQ ID NO:3内的位置234处、235处和329处的氨基酸是丙氨酸的抗体融合蛋白。在一些方面，抗体融合蛋白包括SEQ ID NO:7的重链。在此方面，本公开提供了包括SEQ IDNO:21的轻链和SEQ ID NO:7的重链的抗体融合蛋白。在其它方面，抗体融合蛋白包括SEQID NO:6的重链。在此方面，本公开设想了包括SEQ ID NO:21的轻链和SEQ ID NO:6的重链的抗体融合蛋白。
在本公开的各个方面，抗体的轻链包括SEQ ID NO:8的可变区序列。任选地，轻链包括恒定区，所述恒定区包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列(或与SEQ ID NO:9至少约90％相同或95％相同的序列)。因此，在各个方面，本公开的抗体融合蛋白的轻链包括SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9(SEQ ID NO:21)。
轻链任选地在C末端处与包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的NKG2D配体A1-A2结构域融合。如下文更详细地解释的，相比于A1-A2结构域在本公开的抗体的重链上的融合，A1-A2结构域与轻链氨基酸序列的C末端的融合产生优越的活性。在实例中描述的研究之前，不可以预测将结构域放置在本文描述的抗体融合蛋白上的优越特性。
在各个方面，A1-A2结构域通过接头，任选地包括SEQ ID NO:10(或由其组成)的接头与轻链的C末端融合。如下文更详细地解释的，SEQ ID NO:10的接头产生了在B细胞毒性方面出乎意料地优于其它抗体融合物构建体的MicAbody。在本公开的示例性方面，本公开的抗体融合蛋白包括轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:8的可变区序列和SEQ ID NO:11的通过SEQ ID NO:10的接头序列与轻链的C末端融合的A1-A2结构域，任选地包括SEQ ID NO:9的轻链恒定区。在此方面，在本公开的各个方面，抗体融合蛋白的轻链包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
本公开提供了包括SEQ ID NO:13的轻链和SEQ ID NO:7的重链的抗体融合蛋白。本公开还提供了包括SEQ ID NO:13的轻链和SEQ ID NO:6的重链的抗体融合蛋白。制备抗体和抗体融合蛋白的方法是本领域已知的，并且描述于例如下文的实例中。
本公开还提供了一种试剂盒，其包括一个或多个容器，所述一个或多个容器包括本文所描述的抗体融合蛋白。所述试剂盒可以进一步包括关于抗体融合蛋白的适应症和使用的说明书和书面信息。还设想了包括抗体融合蛋白的注射器，例如，一次性或预填充注射器、无菌密封容器，例如，小瓶、瓶子、容器(vessel)和/或试剂盒或包装，任选地与合适的使用说明书。在另外的方面，本公开提供了一种制品或单位剂型，其包括：(a)包括本文描述的抗体融合蛋白的物质组合物；(b)含有所述组合物的容器；以及(c)粘附到所述容器上的标签，或包含在所述容器中涉及所述抗体融合蛋白在治疗疾病或病症(例如，癌症)中的用途的包装插页。本文还提供了包括抗体融合蛋白(以及在各个方面，表达如本文所述CAR的哺乳动物细胞)和药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂的组合物。在示例性方面，所述组合物是无菌组合物。
本公开进一步提供了一种系统或试剂盒，其包括靶向CD20展示细胞的细胞疗法方案的组分。在各个方面，第一组分是本文所述的抗体融合蛋白，即，与CD20和包括NKG2D胞外结构域的CAR两者结合的双特异性基于抗体的融合蛋白。第二组分是被基因修饰成表达自身为惰性的嵌合抗原受体(CAR)(即，未武装的CAR-T)的哺乳动物细胞(例如，人细胞)。在各个方面，哺乳动物细胞是淋巴细胞或巨噬细胞，例如人淋巴细胞(如人T细胞)或人巨噬细胞。在各个方面，第二组分是人NK(自然杀伤)细胞(例如，自体人NK细胞)；本文关于T细胞的公开内容也适用于NK细胞。试剂盒包括一个或多个包括表达CAR的哺乳动物细胞的容器和一个或多个包括抗体融合蛋白的容器。试剂盒可以进一步包括关于本文所描述的组分的适应症和使用的说明书和书面信息。
“嵌合抗原受体”或“CAR”是指被工程化为识别通过靶细胞，如肿瘤细胞表达的抗原并与所述抗原结合的人工免疫细胞受体。通常，CAR是针对T细胞设计的，并且是由T细胞受体(TCR)复合物的信号传导结构域和抗原识别结构域(例如，抗体的单链片段(scFv)或其它抗体片段)构成的嵌合体。参见例如,Enblad等人,《人类基因疗法(Human GeneTherapy)》2015；26(8):498-505。T细胞和NK细胞可以使用基因转移技术被修饰成在其表面上直接且稳定地表达赋予新抗原特异性的跨膜信号传导受体。参见例如，Gill和June,《免疫学评论(Immunological Reviews)》2015.第263卷：68-89；Glienke等人,《药理学前沿(Front.Pharmacol.)》doi:10.3389/fphar.2015.00021。存在多种CAR格式，每种格式都含有不同的组分。“第一代”CAR通过铰链和跨膜结构域将抗原结合结构域与T细胞受体的CD3ζ胞内信号传导结构域连接。“第二代”CAR并入了另外的结构域，例如，CD28、4-1BB(41BB)或ICOS，以提供共刺激信号。“第三代”CAR含有两个与TCR CD3ζ链融合的共刺激结构域。第三代共刺激结构域可以包含例如，CD3ζ、CD27、CD28、4-1BB、ICOS或OX40的组合。如此构建的CAR可以在与所靶向的抗原结合时以类似于内源性T细胞受体但不依赖于主要组织相容性复合物(MHC)的方式触发例如T细胞激活。
本公开的嵌合抗原受体包括作为CAR的“抗原结合结构域”的不能与天然配体接合的经突变的NKG2D胞外结构域。NKG2D胞外结构域的突变进一步描述于例如，Culpepper等人,《分子免疫学(Mol.Immunol.)》48,516–523(2011)和实例中。经突变的NKG2D在本文中被称为“iNKG2D”。在各个方面，iNKG2D结构域包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列。胞外结构域优选地与跨膜结构域、共刺激分子(例如，4-1BB或CD28)的胞内结构域和/或T细胞受体胞内信号传导结构域缔合。例如，在本公开的示例性方面，iNKG2D胞外结构域与CD8a铰链/跨膜结构域(例如，包括SEQ ID NO:16的序列或由其组成)、4-1BB结构域(例如，包括SEQ ID NO:17的序列或由其组成)和/或CD3ζ结构域(例如，包括SEQ ID NO:18的序列或由其组成)融合。在各个方面，CAR包括所有这些组分(例如，SEQ ID NO:15-18或SEQ ID NO:19)。
由于CAR是惰性的，因此当用与其受体非共价结合的同源抗体融合蛋白“武装”CAR时，所述CAR仅可以与展示出抗原的靶细胞形成富有成效的免疫突触，并激活细胞溶解。CAR表达性细胞在本文中被称为“可转化CAR”。所述系统的实例展示于图7A中。本文所述的抗体融合蛋白能够仅在存在表达CD20的细胞的情况下激活iNKG2D-CAR表达性细胞(例如，T细胞)。当与靶向其它抗原的另外的MicAbody(即，具有与不同细胞表面抗原结合的不同可变区的抗体融合蛋白)一起使用时，可转化CAR-T细胞可以同时或依次靶向到不同抗原以介导细胞溶解；这种方法可以在不必创建、扩增和输注多种不同自体CAR细胞的情况下帮助解决例如，由于靶抗原损失而导致的肿瘤抗性和逃逸。这种高度模块化的可转化CAR系统扩展了过继性细胞疗法的潜力，并克服了现有细胞疗法的许多缺点，包含严重的全身毒性、抗原逃逸以及当前CAR-T和CAR-NK细胞治疗剂的受限且不受控的持续性。另外，由于单个CAR可以在多种情况下使用(因为靶向特异性是通过所施用的抗体融合蛋白而不是CAR确定的)，因此细胞制造被简化且较便宜。
CAR细胞疗法可以是利用受试者或患者自身的被工程化为能够在其表面上产生特定CAR的免疫细胞的免疫疗法。在一些情况下，通过单采从受试者或患者的身体中收集细胞(例如，T细胞)。然后将从体内收集的细胞(例如，T细胞)基因工程化为在其表面产生特定的嵌合抗原受体。使CAR表达性细胞通过在实验室中生长而扩增，并且然后施用于受试者或患者，或另一受试者和患者。CAR表达性细胞将识别并杀死在其表面上表达所靶向的抗原的细胞(例如，癌细胞)。细胞可以从将是疗法的接受者的受试者中分离，或者可以从不是疗法的最终接受者的供体受试者中分离。在各个方面，细胞是自体CD4+和CD8+T细胞。
本公开进一步提供了一种治疗受试者的与表达CD20的细胞相关的疾病或病症，如癌症(CD20阳性癌症)的方法。所述方法包括向受试者施用本文所描述的CAR表达性细胞(例如，表达本文所描述的基于iNKG2D的CAR的T细胞或NK细胞)，并向受试者施用本文所描述的抗体融合蛋白。癌症的实例包含但不限于白血病和淋巴瘤，如毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金氏淋巴瘤(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤)。
如本文所使用的，术语“治疗”以及与其相关的词语不一定暗含100％或完全的治疗或缓解。相反，存在不同程度的治疗，本领域普通技术人员认为其中一种具有潜在的益处或治疗效果。在这方面，治疗疾病或病症的方法可以提供任何量或任何水平的治疗。此外，通过所述方法提供的治疗可以包含对正在治疗的疾病的一种或多种病状或症状或体征的治疗。例如，本公开的治疗方法可以抑制疾病的一种或多种症状。而且，通过本公开的方法提供的治疗可以涵盖减缓疾病的进展。
癌症的治疗可以通过多种方法中的任何方法来确定。设想了受试者的健康状况的任何改善(例如，本文所描述的任何参数的至少或约10％减少、至少或约20％减少、至少或约30％减少、至少或约40％减少、至少或约50％减少、至少或约60％减少、至少或约70％减少、至少或约80减少、至少或约90％减少或至少或约95％减少)。例如，治疗剂应答将是指疾病的以下改善中的一种或多种改善：(1)肿瘤细胞的数量减少；(2)肿瘤细胞死亡增加；(3)肿瘤细胞存活受到抑制；(5)肿瘤生长或新病变的出现受到抑制(即，在某种程度上减缓，优选地停止)；(6)肿瘤大小或负担减小；(7)不存在临床上可检测到的疾病；(8)癌症标志物的水平降低；(9)患者存活率提高；和/或(10)与疾病或病状相关的一种或多种症状(例如，疼痛)得到某种缓解。另外，治疗功效还可以以对其它免疫疗法治疗或化疗的应答性来表征。在各个方面，本公开的方法进一步包括监测受试者的治疗。
受试者是哺乳动物，包含但不限于啮齿目(Rodentia)的哺乳动物，如小鼠和仓鼠，以及兔形目(Logomorpha)的哺乳动物，如兔子，食肉目(Carnivora)的哺乳动物，包含猫科动物(Feline)(猫)和犬科动物(Canine)(狗)，偶蹄目(Artiodactyla)的哺乳动物，包含牛科动物(Bovine)(牛)和猪科动物(Swine)(猪)，或奇蹄目(Perssodactyla)的哺乳动物，包含马科动物(Equine)(马)。在一些方面，哺乳动物属于灵长目(Primate)、猿目(Ceboid)或猴目(Simoid)(猴子)或猿猴亚目(Anthropoid)(人和猿)。在一些方面，哺乳动物是人。可以使用多种途径中的任何途径向受试者递送治疗剂组合物，包含肠胃外、局部、口服、鞘内或局部施用。实际上，组合物可以皮下、皮内、真皮内、静脉内、动脉内、肿瘤内、胃肠外、腹膜内、肌内、眼内、骨内、硬膜外、硬膜内、瘤内等施用。
本公开还提供了(i)编码本文所描述的抗体融合蛋白的轻链的核酸分子(即，分离的核酸)和(ii)编码本文所描述的抗体融合蛋白的重链的核酸分子(即，分离的核酸)，以及包括(i)和/或(ii)的组合物。本公开进一步提供了编码本文公开的任何A1-A2结构域肽的核酸分子。本公开的核酸包含编码本文公开的氨基酸序列中的任何氨基酸序列的核酸，以及包括与本公开的核酸具有至少80％、更优选地至少约90％、更优选地至少约95％和最优选地至少约98％同一性的核苷酸序列(即，序列表中列出的核酸序列)的核酸。本公开的核酸包含编码本文公开的氨基酸序列中的任何氨基酸序列的核酸，以及编码与本公开的氨基酸序列具有至少80％、更优选地至少约90％、更优选地至少约95％和最优选地至少约98％的同一性的氨基酸序列(即，序列表中列出的氨基序列)的核酸。本公开的核酸还包含互补核酸。在一些情况下，在比对时，序列将是完全互补的(没有错配)。在其它情况下，序列中可能存在至多约20％错配。本公开提供了包括编码本公开的抗体融合蛋白的重链和轻链两者的核酸序列的核酸分子。
本公开的核酸可以被克隆到表达载体中，如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体、人工染色体(BAC、YAC)或病毒，另一个遗传序列或元件(DNA或RNA)可以插入到所述表达载体中以引起所连接的序列或元件的复制。在一些实施例中，表达载体含有组成型活性启动子段(如但不限于CMV、SV40、延伸因子或LTR序列)或诱导型启动子序列，如类固醇诱导型pIND载体(英杰公司(Invitrogen))，在这种情况下核酸的表达可以进行调节。本公开的表达载体可以进一步包括调节序列，例如，内部核糖体进入位点。分泌型信号肽序列也可任选地由表达载体编码，与所关注的编码序列可操作地连接，使得所表达的多肽可以通过重组宿主细胞分泌，以便更容易地从细胞中分离所关注的多肽。表达载体可以例如通过转染引入到细胞中。
还提供了包括核酸分子(任选地容纳在表达载体中)的重组宿主细胞。重组宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌(E.coli)细胞，或真核细胞，例如哺乳动物细胞或酵母细胞。酵母细胞包含例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)细胞和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。哺乳动物细胞包含例如VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、W138细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、COS-7细胞、MDCK细胞、人胚胎肾系293细胞、非洲绿猴肾细胞和COS细胞。本公开的重组蛋白产生性细胞还包含任何已知的昆虫表达细胞系，如，例如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。在一个实施例中，细胞是哺乳动物细胞，如CHO细胞。
本公开进一步提供了一种产生抗体融合蛋白的方法。所述方法包括培养宿主细胞(分离的宿主细胞)，所述宿主细胞包括包含编码所述抗体融合蛋白的轻链的核苷酸序列的核酸分子以及包含编码所述抗体融合蛋白的重链的核苷酸序列的核酸分子。所述方法进一步包括回收所述抗体融合蛋白。本公开还提供了一种产生本文所描述的A1-A2结构域肽的方法。所述方法包括培养宿主细胞(分离的宿主细胞)，所述宿主细胞包括包含编码A1-A2结构域肽的核苷酸序列的核酸分子。所述方法进一步包括回收结构域肽(所述结构域肽任选地与另一种肽融合)。用于产生重组蛋白，如抗体蛋白的培养条件和方法是本领域已知的。类似地，蛋白质纯化方法是本领域已知的，并且在本文中用于从细胞培养基中回收重组蛋白。在一些方面，用于蛋白质和抗体纯化的方法包含过滤、亲和柱色谱法、阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法和浓缩。任选地，所述方法包括调配抗体融合蛋白或A1-A2结构域肽。
虽然在各个方面，以上公开内容集中于作为A1-A2结构域肽的融合配偶体的抗CD20抗体，但是应当理解，本公开的A1-A2结构域肽可以与其它肽融合，包含其它抗原结合肽，如其它抗体。以上关于抗CD20抗体的结构的公开内容也适用于其它抗原结合蛋白和抗体(即，与其它靶标结合的抗体)。抗体可以是单克隆抗体或多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。A1-A2结构域肽可以与抗体的抗原结合片段融合。抗体片段的实例包含Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段和Fv片段。其它抗原结合蛋白包含双抗体、线性抗体、单链抗体分子等。抗原结合蛋白可以靶向任何合适的抗原，如在癌细胞的表面上表达的抗原。抗原的实例包含但不限于CD19、BMCA、HER2、EGFR、EpCAM、CEA、BCMA、PSMA、CD19、CD20、CD22、CD33、CD37、CD38、CD123、CD276(B7-H3)、GPC2、GPC3、GPRC5D、WT-1、NY-ESO-1、CLDN4、CLDN6、CLDN18.2、PSCA和TSPAN8。本公开进一步提供了治疗受试者的疾病或病症(例如，癌症)的方法。所述方法包括向受试者施用本文所描述的CAR表达性细胞(例如，表达本文所描述的基于iNKG2D的CAR的T细胞或NK细胞)，并向受试者施用包括本文所描述的A1-A2结构域肽的抗原结合融合蛋白。癌症等的实例在以上进行了讨论，并且适用于本公开的此方面。
以下实例仅为了说明本发明而给出，而不以任何方式限制其范围。
实例
本实例描述了产生本公开的抗体融合蛋白和包括NKG2D胞外结构域的CAR-T细胞的示例性方法。所述实例进一步证明了包括来自利妥昔单抗的可变区序列并且包括与轻链的C末端融合的A1-A2结构域的抗体融合蛋白与包括SEQ ID NO:15-18的氨基酸序列的CAR-T细胞选择性结合的能力，以及抗体融合蛋白和CAR-T细胞组合在体内杀死携带CD20的癌细胞的能力。
材料和方法
克隆、表达和纯化：NKG2D(UniProtKB P26718，残基78-216；https://www.uniprot.org)的野生型胞外结构域表达为通过短因子Xa可识别的Ile-Glu-Gly-Arg接头(Fc-wtNKG2D)与人IgG1 Fc的C末端的融合物。通过PCR介导的诱变产生或合成包括单Y152A取代(iNKG2D.YA)或双Y152A/Y199A取代(iNKG2D.AF)的惰性NKG2D变体(IDT公司(IDT))。使Fc-NKG2D分子的DNA构建体在Expi293TM细胞(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))中表达，并且通过蛋白A亲和色谱法(PierceTM#20334，赛默飞世尔公司)对二聚体分泌蛋白纯化。对洗脱的材料进行表征，并且在/>Pure系统上使用Superdex200柱(通用电气生命科学公司(GE Life Sciences))通过尺寸排阻色谱法(SEC)进一步纯化。将经正确组装的大小合适的单体材料分级到磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
用C末端6x-His标签克隆人MICA*001(UniProtKB Q29983，残基24-205)、MICB(UniProtKB Q29980.1，24-205)、ULBP1(UniProtKB Q9BZM6，29-212)、ULBP2(UniProtKBQ9BZM5，29-212)、ULBP3(UniProtKB Q9BZM4，30-212)、ULBP5(NCBI登录号NP_001001788.2，29-212)和ULBP6(UniProtKB，29-212)的A1-A2结构域。从Expi293TM上清液Ni-NTA树脂(HisPurTM，赛默飞世尔公司)中对于单体蛋白进行纯化，并且将洗脱的材料在PD-10脱盐柱(通用电气生命科学公司)中用Sephadex G-25交换到PBS中。
将MIC配体和正交变体通过连接非依赖性组合件(HiFi DNA组装主混合物，NEB#E2621)分别克隆为通过APTSSSGGGGS或GGGS接头与人IgG1抗体的κ轻链或重链的C末端的融合物。另外，将D265A/N297A(Kabat编号)突变引入到所有抗体和MicAbody克隆的重链的CH2结构域中，以消除抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能。将给定抗体克隆的重链和轻链质粒DNA(哺乳动物表达载体pD2610-V12(ATUM)中)共转染到Expi293TM细胞中并通过白A进行纯化。对于所产生的任何单克隆抗体融合物，将适当的VL或VH结构域交换到κ轻链或ADCC缺陷型IgG1重链中。
惰性NKG2D和正交配体工程化：使用FortéBio Octet系统(Pall FortéBio公司(Pall FortéBio LLC))进行生物层干涉测量(BLI)，以验证由iNKG2D引起的野生型MIC配体结合的丧失。将Fc-wtNKG2D、Fc-iNKG2D.YA或Fc-iNKG2D.AF捕获在抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器尖端上，并且监测单体MIC-His配体的滴定液系列中的缔合/解离动力学。另外，用以下进行ELISA(酶联免疫吸附测定)结合测定：涂覆在微量滴定板上的MICA-Fc、MICB-Fc、ULBP1-Fc、ULBP2-Fc、ULBP3-Fc或ULBP4-Fc(R&D系统公司(R&D Systems))、用链霉亲和素-HRP(R&D系统公司#DY998)检测并且用1-Step Ultra TMB ELISA(赛默飞世尔公司#34208)显影的生物素化的Fc-wtNKG2D或Fc-iNKG2D.YA的滴定液。
采用噬菌体展示以鉴定表现出与iNKG2D.YA或iNKG2D.AF的排他性结合的正交ULBP2 A1-A2变体。产生了靶向螺旋2(残基74-78，基于成熟蛋白的编号)或螺旋4(残基156-160)的密码子的合成NNK(其中N＝A/C/G/T并且K＝G/T，产生没有终止密码子的所有20个氨基酸的呈现)DNA文库，所述密码子在结合状态下被定位成密切接近天然NKG2D受体45上的Y152位置。Müller等人,《公共科学图书馆病原体(PLoS Pathog.)》6,e1000723(2010)。将探索单独的螺旋2、单独的螺旋4或其组合的文库克隆为与M13噬菌体的pIII次要外壳蛋白的融合物，并且在SS320大肠杆菌细胞中根据标准方法产生展现出经诱变的A1-A2结构域变体的噬菌体颗粒。将这些A1-A2噬菌体文库用生物素化的Fc-iNKG2D.YA或Fc-iNKG2D.AF蛋白(EZ-LinkTMNHS生物素试剂盒，赛默飞世尔公司#20217)捕获，并且通过用浓度提高的非生物素化的Fc-wtNKG2D竞争者通过四轮选择进行循环来富集。通过斑点ELISA和用生物素化的M13噬菌体外壳蛋白单克隆抗体E1(赛默飞世尔公司#MA1-34468)检测，随后用链霉亲和素-HRP温育的结合的噬菌体来验证阳性噬菌体克隆与板结合的Fc-iNKG2D.YA或Fc-iNKG2D.AF相对于Fc-wtNKG2D优先结合。
对噬菌体变体进行测序，然后克隆为人IgG1单克隆抗体融合物用于另外的验证。为了证实正交变体的选择性保持在二价MicAbody格式，用1μg/mL Fc-wtNKG2D、Fc-iNKG2D.YA或Fc-iNKG2D.AF涂覆ELISA孔，并且用HRP缀合的小鼠抗人κ链抗体(艾博抗公司(Abcam)#ab79115)检测结合的MicAbody。还通过如上文所述的Octet分析来确定单体和抗体融合的ULBP2变体两者的亲和力。
可转化CAR-T细胞的产生：将包括CD8α-链信号序列、NKG2D变体、CD8α铰链和跨膜结构域、4-1BB、CD3ζ和eGFP的经人密码子优化的DNA(GeneArt，赛默飞世尔公司)与包装质粒pCMVdR8.91和pMD2.G48一起克隆到pHR-PGK转移质粒中用于第二代泛嗜性VSV-G假型慢病毒产生。将通过(GGGGS)3接头分离的利妥昔单抗的VH和VL结构域取代成NKG2D模块以产生基于利妥昔单抗scFv的CAR(RITscFv-CAR)。对于产生的每个批次的慢病毒，在转染前一天将6x106个Lenti-X 293T(塔卡拉生物公司(Takara Bio)#632180)细胞接种在10cm培养皿中。然后，将12.9μg pCMVdR8.91、2.5μg pMD2.G和7.2μg pHR-PGK-CAR构建体合并在720μl Opti-MEMTM(赛默飞世尔公司#31985062)中，然后与67.5μl Fugene HD(普洛麦格公司(Promega Corp.)E2311)混合，短暂涡旋，并且在添加到细胞培养皿中之前在室温下温育10分钟。两天后，将上清液通过离心收集并且穿过0.22μm过滤器。添加经5X浓缩的PEG-6000和NaCl以达到8.5％PEG-6000(汉普顿研究公司(Hampton Research)#HR2-533)和0.3M NaCl的最终浓度，在冰上温育两小时，然后在4℃下离心20分钟。将经浓缩的病毒颗粒重悬于0.01体积的PBS中，并在-80℃下冷冻储存。
对于原代人T细胞分离，将来自匿名供体的人外周血Leuko Pak(干细胞技术公司(Stemcell Technologies)#70500.1)用等体积的PBS+2％FBS稀释，然后在室温下以500x g离心10分钟。通过添加每ml细胞50μl分离混合物并且在室温下温育五分钟将细胞以5x107个细胞/ml重悬于PBS+2％FBS和通过阴性选择富集的CD4+或CD8+细胞中(干细胞公司EasySepTM人CD4 T细胞分离试剂盒#17952或EasySep人CD8 T细胞隔离试剂盒#17953)中。随后，每ml细胞添加50μl RapidSpheresTM，并且将样品加满(对于每21mL细胞，14mL PBS)。将细胞用EasySEPTM磁体分离10分钟，随后在保持磁场的同时去除缓冲液。将富集的细胞转移到具有新鲜缓冲液的新管中，并且重新施加磁体以进行第二轮富集，之后将细胞重悬、计数并以10-15x106个细胞/冷冻瓶(RPMI-1640，康宁公司(Corning)#15-040-CV；20％人AB血清，Valley生物医学公司(Valley Biomedical)#HP1022；10％DMSO，阿法埃莎公司(AlfaAesar)#42780)冷冻保存。
为了产生CAR-T细胞，将一小瓶冷冻保存的细胞解冻，并且添加到细添加时添加的10ml T细胞培养基“TCM”(TexMACS培养基，美天旎公司(Miltenyi)130-097-196；5％人AB血清，Valley生物医学公司#HP1022；10mM经中和的N-乙酰-L-半胱氨酸；1X 2-巯基乙醇，赛默飞世尔公司#21985023，1000X；45IUe/ml人IL-2IS“rhIL-2”，美天旎公司#130-097-746)中。将细胞以400x g离心5分钟，然后重悬于10ml TCM中，并调节至1x106个/ml，并以1ml/孔铺板于24孔板中。过夜静置后，每孔添加20μLDynabeadsTM人T活化剂CD3/CD28(赛默飞世尔公司#1131D)并且温育24小时。每孔添加经浓缩的慢病毒颗粒(50μL)，将细胞温育过夜，然后转移到添加了6ml TCM的T25烧瓶中。扩增三天后，去除Dynabeads(MagCellect磁体，R&D系统公司MAG997)，通过流式细胞术评估GFP的转导效率，将其反稀释至5x105个细胞/mL，并且每日监测细胞密度以确保其不超过4x106个细胞/ml。必要时，使用MicAbody并用PE-抗人κ链(艾博抗公司#ab79113)检测，或通过将利妥昔单抗-MicAbody与Alexa Fluor 647(AlexaFluor蛋白质标记试剂盒#A20173，赛默飞世尔公司)直接缀合使iNKG2D的表面表达与GFP表达相关。使用Alexa Fluor 647缀合的利妥昔单抗-MicAbody对可转化CAR-CD8细胞的表面上的iNKG2D表达的量进行定量，并且使中值荧光强度与QuantumTM MESF 647珠(邦斯实验室(Bangs Laboratories)#647)相关。所有流式细胞术均在Bio-Rad S3e细胞分选器或美天旎公司MACSQuant Analyzer 10仪器上进行。
细胞系和体外测定：将Ramos人B细胞淋巴瘤细胞(ATCC公司(ATCC)#CRL-1596)在补充有20mM HEPES和10％FBS的RPMI中培养。还使用了被转染以表达人Her2的小鼠结肠癌系CT26。除了通过流式细胞术验证靶抗原进行表达之外，没有进行另外的支原体测试或鉴别。
对于钙黄绿素释放测定，将肿瘤细胞离心并重悬于1-2x106个细胞/ml的含4mM丙磺舒(probenecid，MP生物医疗公司(MP Biomedicals)#156370)+25μM钙黄绿素-AM(赛默飞世尔公司#C1430)的T细胞培养基中在37℃下持续一小时，洗涤一次并调节至8x105个细胞/ml。将CD8+CAR-T细胞团粒化并以4x106个细胞/mL重悬于含4mM丙磺舒与60IUe/ml IL-2的TCM中，然后根据期望的效应子:靶标比率进行调节(未针对转导效率进行调节)。将25μL靶细胞铺板，之后是25μL培养基或经稀释的MicAbody。然后添加100μL培养基(最小裂解)、培养基+3％Triton-X 100(最大裂解)或CAR-T细胞，并且将板在37℃下温育两小时。将细胞团粒化并将75μL上清液转移到黑色透明底板，并且在Spectramax M2e板读取器(分子装置公司(Molecular Devices))上获取荧光(激发485nm，发射截止值495nm，发射530nm，每次读取6次闪光)。对于用武装的可转化CAR-CD8+进行的实验，将T细胞在37℃下用饱和(5nM)MicAbody或MicAbody的滴定液预温育30分钟，之后进行洗涤以去除未结合的MicAbody并与钙黄绿素上样的靶细胞共培养。
为了对T细胞的靶依赖性激活进行定量，除省略了钙黄绿素预上样之外，如上所述设置实验，并且在不进行IL-2补充的情况下在T细胞培养基中设置测定。24小时共培养后，将上清液采集并且在-80℃下储存，直到可以通过ELISA MAXTM人IL-2或人IFN-g检测试剂盒(百进生物公司(BioLegend)#431801和#430101)对释放的细胞因子的量进行定量。
由ProMab生物技术有限公司(ProMab Biotechnologies，加利福尼亚州里士满(Richmond，CA))生成MicAbody结合曲线数据。将3x105个可转化CAR-CD8+细胞铺板于96孔V形底板中，并且与标记的Alexa Fluor 647标记的利妥昔单抗.LC-U2S3MicAbody在室温下在最终体积为100μL RPMI+1％FBS中温育30分钟，其中滴定曲线开始于200nM。然后冲洗细胞，并且通过流式细胞术确定每个滴定点的中值荧光强度。
动物研究：为了对MicAbody的血清水平进行PK分析，向六周龄的雌性NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ，杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)#005557)静脉内(IV)注射100μg亲本利妥昔单抗抗体(ADCC缺陷型)、利妥昔单抗的重链U2S3融合物(利妥昔单抗.HC-U2S3)或轻链融合物(利妥昔单抗.LC-U2S3)。对收集的血清通过用人抗利妥昔单抗独特型抗体(HCA186，Bio-Rad实验室(Bio-Rad Laboratories))捕获进行ELISA，用大鼠抗利妥昔单抗-HRP抗体(MCA2260P，Bio-Rad实验室)检测，并且使用利妥昔单抗或利妥昔单抗-U2S3标准曲线对血清水平插值。在NSG小鼠中，通过IP注射60μg之后进行定期血清收集进行U2S3-hFc-mutIL2的PK分析。通过如下进行的ELISA对样品进行检查：用Fc-iNKG2D进行捕获并且用生物素化的兔抗人IL-2多克隆抗体(派普泰克公司(Peprotech)#500-P22BT)进行检测，之后用链霉亲和素-HRP进行温育。在GraphPad Prism中，基于曲线的β相，使用非线性回归分析，即平台被限制为零的指数式单相衰减分析计算半衰期。
对于播散性Raji B细胞淋巴瘤研究，向六周龄的雌性NSG小鼠IV植入稳定转染，以组成性地表达来自Luciola italica(珀金埃尔默公司RediFect Red-FLuc-GFP#CLS960003)的萤光素酶的Raji细胞(ATCC公司#CCL-86)。每个体内研究图中详述了处理施用的开始。对于所有实验，将CD4和CD8原代人T细胞独立转导，在不针对转染效率在细胞类型或CAR构建体之间进行归一化的情况下在扩增后以CD4:CD8细胞的1:1混合物进行组合，并且在IV注射前通过流式细胞术验证混合物。除非另有规定，否则MicAbody或对照抗体的施用是通过腹膜内(IP)途径，并且用Xenogen IVIS系统(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))对生物发光进行体内成像。对动物定期采血以通过如下流式细胞术监测人T细胞动力学：用APC抗人CD3(克隆OKT3，#20-0037-T100，Tonbo生物科学公司(Tonbo Biosciences))染色，监测GFP，并且用生物素化的抗人F(ab')2(#109-066-097，杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.))检查细胞相关的MicAbody水平，随后进行链霉亲和素-PE检测(BD公司(BD)#554061)。如上所述进行血清ELISA以监测MicAbody水平。
对于皮下肿瘤研究，将1x106个Raji细胞在matrigel中植入在六周龄的雌性NSG小鼠的右侧上，并且在肿瘤达到70-100mm3时开始疗法。对于接受武装的可转化CAR-T细胞的队列，将细胞与5nM利妥昔单抗.LC-U2S3 MicAbody一起在室温下离体温育30分钟，之后进行洗涤和最终混合，以实现期望的1:1CD4:CD8比率和细胞浓度。武装通过用生物素化的抗人F(ab')2抗体进行的流式细胞术得到证实，并且揭示了GFP与F(ab')2MFI之间的强相关性。这些小鼠没有接受单独的MicAbody施用。定期进行卡尺测量以估计肿瘤体积(L x W x W x0.5＝mm3)，并且对终末肿瘤质量进行称重。
对iNKG2D.AF-CAR细胞的补体介导的消融：为了产生具有增强的补体结合和向表达iNKG2D.AF的T细胞的靶向递送的Fc试剂，将正交配体克隆为通过GGGS接头与人IgG1 Fc的N末端(U2R-Fc)或C末端(Fc-U2R)的融合物，其中Fc包含铰链、CH2结构域和CH3结构域。除野生型Fc外，还探索了K326A/E333A21(Kabat编号，“AA”)和S267E/H268F/S324T/G236A/I332E20(“EFTAE”)C1q增强的结合突变集。所有细胞如上文所述在Expi293T细胞中表达、纯化和分级。如下进行确认性ELISA：通过用Fc-NKG2D.AF捕获，之后在1μg/mL浓度下与U2R/Fc-变体融合物结合，在人-C1q蛋白(艾博抗公司#ab96363)中滴定，然后用多克隆绵羊抗C1q-HRP抗体(艾博抗公司#ab46191)检测。由iQ生命科学公司(iQ Biosciences，加利福尼亚州伯克利市(Berkeley,CA))进行补体依赖性细胞毒性(CDC)测定。简言之，将由NKG2D.AF-CAR转导得到的5x104个CD8+细胞铺板于96孔板中，并且在存在最终浓度为10％(v/v)的正常人血清补体(窥得儿医药公司(Quidel Corporation))的情况下，与每种U2R/Fc-变体融合物的连续稀释液一式三份一起温育三小时。然后将细胞采集并且用SYTOXTMRed死亡细胞染色剂(赛默飞世尔公司)以5μg/mL的最终浓度重悬，并且通过流式细胞术进行分析。细胞毒性的EC50值在拟合到非线性回归曲线的GraphPad prism中计算。
突变体IL2向表达iNKG2D-CAR的T细胞的递送：为产生对U2S3配体来说为单体、对突变体IL-2来说为单体、不能与IL-2Rα(mutIL2，R38A/F42K)(Heaton等人,《癌症研究(Cancer Res.)》53,2597–2602(1993)；Sauve等人,《美国国家科学院院刊》88,4636–4640(1991))结合但仍保留血清稳定性的试剂，采用异二聚体Fc策略。Gunasekaran等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》)285,19637–19646(2010)。U2S3与具有K392D/K409D(Kabat编号)突变的一条链的Fc铰链的N末端融合，而mutIL2与容纳E356K/D399K突变的第二Fc链的C末端融合。另外，将D265A/N297A突变引入在两条Fc链中以使Fc为ADCC缺陷型的。Expi293T细胞中的表达和纯化如上文所述。通过SEC对适当组装的U2S3-hFc-mutIL2材料进行分级，并且通过使SDS-PAGE变性确认单独大小合适的多肽的存在。还产生了正交配体与表达为具有包括甘氨酸-丝氨酸键、FLAG标签和6xHis标签的接头的单个多肽的mutIL2之间的直接融合物，并且通过Ni-NTA交换色谱法对所述直接融合物进行纯化。Ghasemi等人,《自然通讯(Nat Commun)》7,12878(2016)。IUe活性当量的确定基于这样的计算，即野生型IL-2的4.4μM溶液的当量为1000IU/μL。具有V49D突变的减少了与IL-15Rα的结合但保留了生物活性的IL-15类似地用U2S3格式化。Bernard等人,《生物化学杂志》279,24313–24322(2004)。
用WST-1细胞增殖试剂(密理博西格玛公司(Millipore Sigma)#5015944001)对响应于各种细胞因子或U2S3-细胞因子融合物的CAR-T细胞增殖进行定量。简言之，将CAR-T细胞团粒化并重悬于不含有IL-2的T细胞培养基中，以4x104个细胞/孔分配到96孔板中，并且添加适当量的经稀释的U2S3-细胞因子融合物，以在100μL每孔的最终测定体积中达到30IUe/mL或根据需要的更高浓度。包含了重组人IL2和IL15(派普泰克公司#200-02和#200-15)作为对照。在37℃下温育三天后，将10μL WST-1添加到每个孔中，并且允许温育30-60分钟，之后在板读取器上对颜色显影的强度进行定量。通过流式细胞术监测响应于U2S3-细胞因子融合的GFP+CAR表达性细胞的比例的变化。为了监测细胞因子-融合物接合后STAT3或STAT5的激活，使细胞过夜静置在无IL-2补充的TCM培养基中，然后用150IUe/mL IL-2、IL-15、U2S3-hFc-mutIL2或U2S3-hFc-mutIL15处理两小时，之后固定并针对胞内phospo-STAT3(百进生物公司PE抗STAT3 Tyr705克隆13A3-1)和phospo–STAT5(BD公司Alexa Fluor 647抗STAT5 pY694克隆47)进行染色。为监测时间应答，将经处理的可转化CAR-CD8 T细胞在暴露于细胞因子或U2S3-hFc-细胞因子融合物后0分钟、30分钟、60分钟和120分钟时固定，然后染色。
进行人PBMC刺激和免疫表型研究。简言之，将来自三个供体的正常PBMC以1x105个细胞/孔接种在96孔板中，并且暴露于U2S3-hFc-mutIL2或U2S3-hFc-wtIL2(野生型IL2)的10倍稀释系列在37℃下在5％CO2的情况下持续四天。阳性对照包含用2μg/mL的抗人CD3(OKT2)和300IUe/mL的rhIL-2涂覆的孔。温育后，将细胞用TruStain FcX封闭剂(百进生物公司#422301)进行处理，之后用百进生物公司抗体板针对增殖性T细胞(CD8克隆RPA-T8#301050、CD4克隆OKT4#317410、CD3克隆OKT3#300430、KI-67#350514)和Treg细胞(Fox3克隆206D#320106、CD4克隆OKT4、CD3克隆OKT3、KI-67)进行染色。
结果
对正交NKG2D-配体相互作用进行工程化：每个NKG2D单体中的两个中心酪氨酸残基在驱动受体-配体相互作用方面具有关键作用。Culpepper等人,《分子免疫学》48,516-523(2011)。对这些残基处的突变进行了深入研究，其中选择了Y152A突变体(“iNKG2D.YA”)和Y152A/Y199F双突变体(“iNKG2D.AF”)以进行进一步研究，并且通过生物层干涉测量(BLI)(图2A和3A)和ELISA(图2B)确认已丧失与所有天然存在的人配体的结合。选择ULBP2A1A2结构域用于对与iNKG2D变体中的每个变体具有高亲和力结合的突变体进行基于噬菌体展示的选择，因为其不是多态性的。询问螺旋2和螺旋4的NNK文库仅返回螺旋4变体，并且甚至之后仅在自发R81W突变的情况下也是如此，这可能对ULBP2 A1A2结构域具有稳定作用。通过几轮次的提高浓度的wtNKG2D进行的竞争性选择(图4A)产生了三种变体–U2S1、U2S2和U2S3–这些变体可以可再现地排他性地与iNKG2D.YA结合，即使在被重格式化为与抗FGFR3抗体克隆R3Mab的IgG1重链的C末端的融合物时也是如此(图4B)。尽管单独的R81W突变增强了对wtNKG2D和iNKG2D.YA的亲和力(图4B和4C)，但其在iNKG2D选择性变体中的存在被视为是必须的，因为其向野生型残基的逆转导致与iNKG2D.YA的结合丧失。由于U2S3始终表现出更大的结合差异，因此其被更彻底地表征并显示为对iNKG2D.YA的亲和力为野生型ULBP2对wtNKG2D的亲和力的10倍的单体(图4C)。SEQ ID NO:11的A1-A2结构域基于U2S3配体(SEQ ID NO:30)。用二价利妥昔单抗抗体融合物测量与iNKG2D.YA的皮摩尔结合，并且通过轻链(LC)和重链(HC)融合物构型保持正交性(图5)。
类似地鉴定了iNKG2D.AF的候选正交变体，并且将利妥昔单抗-LC融合物与Fc-wtNKG2D、Fc-iNKG2D.YA和Fc-iNKG2D.AF进行比较的ELISA鉴定出四种仅选择性与iNKG2D.AF结合的变体(图3B)，其中U2R变体是最具选择性的。将利妥昔单抗.LC-U2S3和利妥昔单抗.LC-U2R与iNKG2D.YA和iNKG2D.AF两者的结合进行比较的ELISA证实了这两个独立选择的正交配体排他性地与其所演进的惰性NKG2D变体接合(图3C)。
iNKG2D.YA作为嵌合抗原受体的表达：将与4-1BB、CD3ζ和eGFP融合的iNKG2D.YA慢病毒转导为原代人T细胞高效地产生了具有与具有相同铰链、跨膜和细胞内构架的基于利妥昔单抗-scFv的CAR构建体(RITscFv-CAR)相当的强大转基因表达的可转化CAR-T细胞(图2b和图6)。用利妥昔单抗.LC-U2S3 MicAbody对iNKG2D.YA的表面染色与GFP表达密切相关，这表明CAR表达的效率与iNKG2D在T细胞表面上的呈递之间存在直接关系(图7C)。使用Alexa Fluor 647缀合的利妥昔单抗.LC-U2S3MicAbody和标准定量珠的流式细胞术，在表面上表达的iNKG2D.YA的中值量估计为21,000个分子。iNKG2D.YA-CAR受体通过对可转化CAR-CD8+细胞的温育与用野生型或U2S3配体涂覆的微量滴定板的直接接合导致仅用U2S3激活和释放IL-2和IFNγ，而携带wtNKG2D-CAR的细胞仅对野生型配体作出应答，这证实了在T细胞上下文中正交相互作用的选择性(图8A)。此外，可转化CAR-T细胞功能的激活依赖于适当同源ULBP2变体的存在。iNKG2D.YA表达性或iNKG2D.AF表达性T细胞仅在用携带其相应正交配体，即U2S3或U2R的MicAbody武装时才裂解Ramos(CD20+)靶细胞(图3D)。单独的Ramos细胞的共培养不足以驱动可转化CAR-CD8+细胞的活化。相反，需要适当的抗原靶向性MicAbody，因为利妥昔单抗抗体或曲妥珠单抗.LC-U2S3都没有激活CAR细胞，而利妥昔单抗.LC-U2S3触发32-160pM范围内的最大细胞因子释放。另外，通过具有利妥昔单抗.LC-U2S3 MicAbody的可转化CAR-T细胞进行的细胞因子释放超过了RITscFv-CAR细胞进行的细胞因子释放(图8B)。这些数据表明，需要合适的抗原靶向性MicAbody以在靶标与可转化CAR-T细胞之间形成连接，所述连接可能类似于针对scFv-CAR19表征的连接，以驱动T细胞功能的稳健激活(图9A)。
用荧光标记的利妥昔单抗.LC-U2S3 MicAbody对可转化CAR-CD8+细胞进行的染色揭示了总iNKG2D.YA-CAR受体在5nM时饱和(图9B)。然而，在其中可转化CAR-CD8+细胞用减少量的利妥昔单抗.LC-U2S3武装的共培养杀伤实验中，Ramos靶细胞裂解活性在30pM时达到饱和应答，所述30pM比完全占据受体所需的量级低两个数量级(图9C)。这一结果表明，额外未被占据的iNKG2D.YA-CAR受体可以用异源MicAbody武装，以同时引导针对多个靶标的活性。为了直接测试这一点，将可转化CAR-CD8+细胞用利妥昔单抗.LC-U2S3、曲妥珠单抗.LC-U2S3(靶向Her2)或两种MicAbody的等摩尔混合物武装，并暴露于Ramos细胞或CT26-Her2。尽管用单个MicAbody武装的CAR细胞仅将裂解引导到表达同源抗原的肿瘤细胞，但双重武装的CAR靶向两种肿瘤细胞系，而对裂解效力没有任何损害(图9D)。
可转化CAR-T细胞抑制播散性B细胞淋巴瘤：HC和LC利妥昔单抗-U2S3 MicAbody(图10A)两者在NSG小鼠中的药代动力学揭示了与亲本抗体平行的β相和MicAbody的归因于U2S3与内源性小鼠野生型NKG2D的结合的保留的较陡α相(图10C)。LC-U2S3融合物(即，其中A1-A2结构域与抗体的轻链融合的抗体融合蛋白)的终末半衰期比HC融合的MicAbody(即，其中A1-A2结构域与抗体的重链融合的抗体融合蛋白)的终末半衰期更长。LC-U2S3融合物在利用Ramos靶细胞的体外杀伤测定中也优于HC融合物(图10B)，并且在抑制NSG小鼠中的Raji B细胞淋巴瘤扩增方面在早期时间点时似乎更有效。总之，包括与抗体的轻链的N末端融合的A1-A2结构域的抗体融合蛋白出乎意料地优于其中A1-A2结构域与重链融合的抗体构建体。
在探索淋巴瘤控制的给药参数的另外的实验中部署了利妥昔单抗.LC-U2S3(Rit-S3；其中U2S3 A1-A2结构域与抗体的轻链融合的抗体融合蛋白)。20μg的中等Rit-S3剂量被证明是最有效的，因为高浓度可能导致CAR细胞上的受体和肿瘤细胞上的抗原过度饱和，由此干扰富有成效的接合。另外，每两天相比于每四天更高频率的Rit-S3施用搭配上更高剂量(10x106)的可转化CAR-T细胞产生了对肿瘤生长的最大抑制。单独的Rit-S3在肿瘤控制方面无效，而在未经转导的队列和仅可转化CAR的队列两者中一致地观察到移植物抗肿瘤作用。在整个研究过程中，Rit-S3可在小鼠的血清中检测到，其中在更频繁给药的情况下，峰值水平出现得更早。
采用经优化的可转化CAR-T给药的Raji播散性淋巴瘤模型用每两天20μg Rit-S3给药进行，从而将5x106个(5M)与15x106个(15M)可转化CAR-T细胞进行比较。作为阳性对照，还将其体外Ramos杀伤效力与可转化CAR-T细胞的杀伤效力相当的RITscFv-CAR细胞包含在内(图8B)。在5M总T细胞下，RITscFv-CAR和可转化CAR+Rit-S3两者在控制肿瘤方面均是有效的。尽管RITscFv-CAR队列的平均肿瘤生物发光信号较低(图11A)，并且所述队列中的五只小鼠中的四只小鼠表现出肿瘤组织清除，但可转化CAR+Rit-S3队列中的五只小鼠中的三只小鼠表现出清除(图11B)。当总输注的CAR-T细胞剂量增加到15M细胞时，RITscFv-CAR和可转化CAR+Rit-S3两者均能够完全阻断肿瘤扩增(图11A和11B)。在所有研究中，外周人CD3+T细胞的峰值水平在输注后七天左右表现一致，其中scFv-CAR和可转化CAR-T细胞两者在大多数小鼠中收缩了14天(图11D)。在未经转导的队列和仅可转化CAR的队列中，CD3+细胞的扩增延迟，这与移植物抗肿瘤应答的发生是同时的，并且可能是特异性反应性克隆扩增的结果。在可转化CAR+Rit-S3队列中的小鼠的血液中观察到MicAbody相关的可转化CAR-T细胞(图11E)。
可转化CAR-T细胞抑制皮下淋巴瘤：将Raji B细胞皮下植入以评估可转化CAR系统抑制实体瘤质量的生长的能力。一旦肿瘤在10天内建立，在单次IV给药60μg Rit-S3后，施用7x106个(7M)或35x106个(35M)可转化CAR-T。另外，一个队列接受35M在施用前用饱和浓度的Rit-S3预武装的细胞，但没有额外的MicAbody引入的注射。相对于单独的可转化CAR-T细胞，7M可转化CAR-T细胞与Rit-S3(7M+Rit-S3)一起的施用导致肿瘤大小减小(图12A)。此外，在35M+Rit-S3队列中，肿瘤生长被完全抑制。接受35M预武装的细胞的队列中的肿瘤生长也受到抑制。到输注后两天，已经预武装的可转化CAR-T细胞不具有可检测到的表面相关的Rit-S3 MicAbody(图12C)，这可能是由于激活诱导的细胞增殖和转换武装的受体的组合而解除武装的结果。在整个研究中，Rit-S3的血清水平在两种CAR-T细胞剂量下是相当的，并且持续到第21天，此时检测到大约600ng/mL(3.2nM)(图12B)，这对应于高水平的武装的外周CAR细胞(图12C)。到研究的第45天，接受35M+Rit-S3的队列维持相对高的CD3+T细胞数量，但没有很好地用MicAbody武装，而7M+Rit-S3队列确实具有维持表面相关的MicAbody的细胞。这表明，由于血浆中的MicAbody水平下降至可检测限以下，CAR武装不可以维持在高CAR-T细胞水平下。一种替代可能性是35M+Rit-S3队列中的较高CD3+细胞数量反映了不表达CAR构建体的移植物抗肿瘤细胞亚群的扩增。然而，在35M预武装的队列中没有看到CD3+细胞数量升高，这表明情况并非如此。总之，预武装的可转化CAR-T能够发挥抑制肿瘤扩增的强效抗肿瘤应答。此外，当维持可转化CAR-T细胞武装的充足体内水平时，可转化CAR-T能够有效控制实体淋巴瘤。
生物分子向可转化CAR-T细胞的选择性递送：iNKG2D变体与其正交配体之间特许的相互作用使试剂能够仅通过将其作为有效载荷与正交配体本身融合而选择性递送至iNKG2D-CAR表达性细胞。为了证明此特征的功用，探索了两种不同的应用：即利用补体系统的靶向消融和激活细胞因子的选择性递送。在第一应用中，U2R变体与野生型人IgG1 Fc结构域的N或C末端融合，或与先前描述为增强C1q结合-S267E/H268F/S324T/G236A/I332E(“EFTAE”)和K326A/E333A(“AA”)的突变体Fc结构域融合(图13A)。与靶向以表位为标签的CAR细胞的完整治疗性抗体相反，仅使用Fc部分避免了由非iNKG2D表达性细胞的调理带来的副作用。增强的C1q结合通过ELISA得到证实，其中Kd的相对顺序为EFTAE<AA<wt(图13B)。尽管iNKG2D.AF-CAR细胞易于通过人补体以依赖于浓度和C1q亲和力两者的方式杀死(图13C和13D)，但未经转染的细胞不受影响。有趣的是，U2R融合物的定向对于功能来说很重要-以与抗体一致的方式定向Fc的N末端融合物更有效。通过U2S3和iNKG2D.YA配对也获得了类似的结果(图13E和13F)。
正交配体将细胞因子选择性地递送到iNKG2D-CAR表达性细胞的潜在能力不仅有利于促进其扩增，而且还有可能利用差异性细胞因子信号传导来控制T细胞表型和功能。作为一般设计原则，采用与其天然受体复合物的结合减少的突变体细胞因子以减少其与不表达CAR的免疫细胞的接合，并将与野生型细胞因子相关的毒性最小化。另外，将细胞因子融合物保持为单价的，以消除亲合力增强的结合和信号传导。为此，IL-2中的R38A/F42K突变(mutIL2)25和IL-15中的V49D突变(mutIL15)显著降低了与每种细胞因子的相应Rα亚基的结合，同时维持IL-2Rβ/γ复合物接合。使用与mutIL2或mutIL15融合的iNKG2D.YA正交变体U2S2的初始实验促进iNKG2D.YA-CAR表达性细胞的增殖，但不促进表达wtNKG2D-CAR的那些细胞的增殖(图14A)。两个细胞群体都在存在ULBP2.R81W变体的情况下扩增，该变体在wtNKG2D与iNKG2D.YA之间无区别。与配体的直接融合或通过异二聚体Fc键的融合(例如，U2S2-hFc-mutIL2)促进GFP+可转化CAR-T细胞扩增至密度高于存在的未经转导的细胞的密度(图14B)，并且这些经扩增的可转化CAR-T细胞维持其细胞溶解能力(图14C)。iNKG2D.YA通过MicAbody、单价U2S3-hFc(不具有细胞因子有效载荷)或单独的mutIL2的接合不足以驱动可转化CAR-CD8细胞的增殖(图14A和14D)。STAT3和STAT5磷酸化(pSTAT3和pSTAT5)的流式细胞术表征揭示了，暴露于野生型IL-2或IL-15导致未经转导的细胞以及可转化CAR-CD8细胞两者中的pSTAT3或pSTAT5增加。相对于无细胞因子对照，用U2S3-hFc-mutIL2对未经转导的细胞的处理仅导致pSTAT5的最小转化，这与mutIL2对IL-2Rβ/γ结合的保留一致。可转化CAR-CD8细胞在pSTAT5水平提高的情况下通过对JAK3的γ链激活对U2S3-hFc-mutIL2和U2S3-hFc-mutIL15两者均作出应答。与野生型细胞因子不同，未观察到pSTAT3信号增加，这表示在两种情况下，由于Rα结合的破坏，通过IL-2Rβ28进行的JAK1激活减少，这一假设得到了IL-15Rα在增加IL-15对IL-2Rβ的亲和力中的作用的支持。应答U2S3-hFc-mutIL2和U2S3-hFc-mutIL15的动力学几乎相同，这表明其突变体形式的功能冗余。
U2S3-hFc-mutIL2显示出具有几天的体内PK半衰期(图14E)。施用于不存在肿瘤的NSG小鼠的可转化CAR-T细胞经历了稳态扩增，在三天达到峰值，然后收缩。间隔一周分期进行的U2S3-hFc-mutIL2的三次注射引起外周血中的人T细胞的急剧扩增(图15A)，并且在停止U2S3-hFc-mutIL2支持后，T细胞数量减少，其中CD8+T细胞驱动大部分扩增。与扩增并行，GFP+CD8+T细胞的比例增加到100％，这表明iNKG2D-CAR表达性细胞而非未经转导的细胞的选择性扩增(图15B)。
通过暴露于浓度提高的药剂持续四天，之后对对于增殖标志物Ki-67呈阳性的细胞进行基于流的定量，对U2S3-hFc-mutIL2对来自三个供体的正常人PBMC的作用在体外进行了探索(图16)。除了mutIL2融合物外，还包含野生型IL2融合物(U2S3-hFc-wtIL2)，以直接证明mutIL2生物活性的降低是所采用的突变而非融合物格式本身的结果。CD4+和CD8+T细胞对抗CD3和野生型IL-2阳性对照两者以及对最低剂量的U2S3-hFc-wtIL2均作出强烈应答。对U2S3-hFc-mutIL2的增殖性应答以剂量依赖性方式发生，其中在供体中在高于300IUe/mL的水平下观察到扩增，但直到30,000IUe/mL才达到与IL-2阳性对照的水平相当的水平。Treg应答与CD4+和CD8+细胞的应答相当，但来自一个以比其它供体的浓度更低的浓度对U2S3-hFc-mutIL2作出应答的供体的细胞(其另外对抗CD3刺激的应答减弱)除外。总之，这些数据支持这种假设，即正常人PBMC不对U2S3-hFc-mutIL2作出应答，但在超生理水平下除外，所述超生理水平可能提供用于在使毒性和Treg激活最小化的同时将配体融合的mutIL2选择性地递送至可转化CAR细胞的宽给药窗口。
A1-A2结构域位置和接头的比较：除了以上研究外，研究了包括将抗体重链或轻链与A1-A2结构域连接的不同接头的构建体。参见图17A。产生了包括通过GGGS(SEQ ID NO:14)接头(Ritux.HCd.S3)或APTSSSGGGS(SEQ ID NO:10)接头(Ritux.HCd.apts.S3)与重链(Ritux.HCd)连接的基于U2S3的A1-A2结构域的利妥昔单抗抗体。产生了类似构建体，其中A1-A2结构域通过相同的接头(Ritux.HCd.LC.S3(APTSSSGGGGS接头(SEQ ID NO:10))和Ritux.HCd.LOC.gggs.S3(GGGS接头(SEQ ID NO:14)))与利妥昔单抗抗体的轻链融合。使用本文结合图10B描述的方法对构建体进行检查。结果展示在图17B中。包括包含SEQ ID NO:1的可变区序列的重链和包含SEQ ID NO:8的可变区序列的轻链的其中所述轻链在C末端处与A1-A2结构域融合的抗体融合物构建体在杀死肿瘤细胞方面优于其中A1-A2结构域与重链连接的构建体。另外，其中A1-A2结构域通过APTSSSGGGGS接头(SEQ ID NO:10)与轻链融合的构建体出乎意料地优于在几乎所有浓度(0.04nM、0.2nM、1nM和5nM)下测试的所有构建体。
影响糖基化的突变：在蛋白治疗剂制造期间引入的糖基化可能导致最终产物的不期望的异质性。SEQ ID NO:30内的位置40和54处的残基发生突变以通过取代引入丙氨酸或谷氨酰胺。当肽在HEK 293细胞中表达时，这些取代减少了N-糖基化。出乎意料地，当肽在CHO细胞中产生时，在突变体A1-A2结构域肽中观察到N-糖基化。在序列中在位置84处引入另外的突变以通过取代引入丙氨酸或谷氨酰胺。
在与利妥昔单抗融合的U2R配体的上下文中证实了包括位置40、54和/或84处的取代的突变体A1-A2结构域的活性。在用iNKG2D.AF-CAR细胞对CD20阳性Ramos细胞的杀伤测定中测试了包括包含(1)A1-A2结构域的位置40和54处的丙氨酸或(2)A1-A2结构域的位置40和54处的谷氨酰胺的U2R配体的利妥昔单抗融合蛋白。包括突变体A1-A2结构域的融合物与具有亲本A1-A2结构域的融合物(不具有位置40和54处的取代)类似地表现。
还在SEQ ID NO:30(U2S3(NQ))的位置40和54处进行取代，并且产生了包括与利妥昔单抗的轻链融合的经突变的A1-A2结构域的融合蛋白。SDS-PAGE证实，当在Expi-293细胞中表达时，突变体A1-A2结构域融合物表现出减少的N-糖基化。在CHO细胞中观察到类似结果。使用与上述方法类似的方法进行ELISA测定，从而证实包括U2S3(NQ)结构域的抗体与包括SEQ ID NO:30的未经修饰的U2S3结构域的抗体类似地与iNKG2D.YA结合。参见图18。还测试了与野生型NKG2D的结合。参见图19。包括U2S3和U2S3(NQ)的MicAbody表现出与野生型NKG2D的结合显著减少，并且观察到在位置40和54处引入谷氨酰胺产生了融合物，所述融合物出乎意料地对野生型NKG2D结合甚至更具惰性(即，包括取代的A1-A2结构域以与没有取代的亲本结构域类似的程度与iNKG2D.YA结合，但表现出与野生型NKG2D的结合甚至进一步减少)。
当U2S3(NQ)结构域在CHO细胞中表达时，观察到N-糖基化，尽管在有这样的事实，即HEK 293细胞中进行表达时N-糖基化表现出几乎不存在。进行U2S3(NQ)A1-A2结构域的另外取代以在位置84处引入丙氨酸(U2S3(AYT))或谷氨酰胺(U2S3)QYT)。在利妥昔单抗-MicAbody的上下文中用此另外的突变进行Octet结合实验。位置84处用丙氨酸或谷氨酰胺进行的取代不会改变与iNKG2D.YA的结合。细胞毒性也得到证实。参见图20。对Ramos靶细胞上样钙黄绿素，并且与iNKG2D-CAR CD8+T细胞一起在存在提高nM浓度的每种所测试的MicAbody(与U2S3、U2S3(NQ)、U2S3(AYT)和U2S3(QYT)融合的利妥昔单抗)的情况下以20:1的E:T比率共培养两个小时。对释放的钙黄绿素的量进行定量。所有MicAbody介导相当水平的细胞毒性，这表明(a)CD20接合没有受损并且(b)iNKG2D接合没有由于本文所述取代而受损。因此，本文所述的A1-A2结构域表明糖基化减少，介导使用iNKG2D-CAR的相当水平的靶细胞结合和细胞毒性，并且表明与野生型NKG2D的结合进一步减少。
讨论
本公开描述了对包含用于高度可适应的CAR的人类组分的特许的受体-配体(iNKG2D.YA和U2S3)配对进行工程化，从而产生多功能且广泛可控的平台。iNKG2D.YA-CAR受体本身在具有CAR功能的T细胞上保持不变，所述CAR功能易于通过将正交配体与合适的抗原识别抗体连接来定向潜在地任何所关注的抗原。以这种方式，如果例如原始肿瘤抗原在疗法过程期间被下调，则可以根据需要重新靶向相同的可转化CAR-T细胞。这种靶向灵活性不限于抗原的顺序接合，而且还可以多路复用以同时将T细胞定向到多于一种抗原，以降低由抗原损失导致的肿瘤逃逸的可能性，解决瘤内抗原表达的异质性问题，或者甚至同时靶向肿瘤微环境的肿瘤和抑制性细胞组分。传统scFv-CAR细胞通常倾向于受体的固定表达水平，这降低了所述细胞区分健康细胞与异常细胞上存在的抗原水平的能力。如具有可转化CAR-T细胞的MicAbody等开关/衔接子策略的使用可以提供差异性地接合CAR-T，以实现降低严重不良事件风险的治疗指标的机会。
使用特许的受体-配体相互作用以在无需另外的细胞工程化的情况下将有效载荷特异性地递送到携带iNKG2D的细胞是另一个优点。利用白介素功能来驱动扩增和激活、防止耗竭或甚至以受控且靶向的方式促进抑制的能力可能对功效和安全性具有有结果。在CAR制造期间引入细胞因子-配体融合物可以解决患者T细胞的定性和定量限制，并且其在CAR输注后的施用可以使CAR-T细胞的数量扩增，并且其持续性在CD19-CAR疗法的情况下与应答率呈正相关。大多数CAR疗法需要预调理淋巴耗竭方案来促进CAR细胞的植入和扩增，一个原理是其提供了使CAR扩增的更新的免疫环境。患者的稳健且可控的可转化CAR-T扩增可以取代对淋巴耗竭的需要，从而保留完全有能力支持初始可转化CAR介导的抗肿瘤活性的内源性免疫功能。另一种临床策略可以是递送细胞因子-配体融合物以增强可转化CAR-T功能，可能地利用循环方案，以减少T细胞耗竭并促进记忆T细胞的维持。并且最后，由于CAR已表现出在输注后在人体内持续数年，因此召唤驻留的可转化CAR-T以在无需重新工程化或产生新一批的CAR细胞的情况下攻击原发性或继发性恶性肿瘤(使用原始靶向性MicAbody或不同的靶向性MicAbody)的能力应当是高度有利的。与其中CAR已被工程化为组成性地表达细胞因子的情况不同，细胞因子排他性地向可转化CAR-T细胞的递送可以根据制造或临床需要进行调节。
通过设计，可转化CAR系统的每种组分，即基于iNKG2D的CAR受体和MicAbody(其为ADCC缺陷型)，其自身都是功能上惰性的。这在制造期间具有优势，特别是在如T细胞恶性肿瘤等适应症的上下文中，在这种情况下传统的基于scFv的CAR由于自相残杀而遇到扩增障碍。另外，其增强了在治疗期间对CAR功能的控制。本公开证明，可转化CAR-T细胞可以在施用前用MicAbody武装，以提供与传统scFv-CAR相当的抗肿瘤活性的初始爆发。除了激活诱导的复制外，这些细胞还以与利用其它4-1BB/CD3ζscFv-CAR观察到的方式一致的方式内化其所接合的CAR受体。作为这两个过程的结果，可转化CAR-T细胞将在初始扩增和靶接合后快速解除武装，这然后提供了机会，以通过MicAbody给药控制的方式重新武装并重新接合。
除了基于ULBP2的iNKG2D-U2S3配对之外，本公开鉴定了iNKG2D.YA的高亲和力正交MicA和ULBP3变体，所述变体在其氨基酸组合物中通过螺旋4结构域是非冗余的。另外，描述了一种完全独立的iNKG2D.AF和U2R配对。例如，具有互相排斥的受体-配体对使得其能够被引入到不同的细胞群体(例如，CD4和CD8 T细胞)中，以根据需要与所述细胞群体差异性地接合。此外，在同一细胞内，两种iNKG2D变体可以通过分裂的胞内信号传导结构域表达，以提供双抗原依赖性激活，以增强肿瘤上选择性。可替代地，两种iNKG2D变体可以分别与激活或免疫抑制结构域差异性连接，以增强在肿瘤或健康组织之间对T细胞的区分能力。
总之，本文所述的系统已经表现出不仅能够容易地靶向到不同细胞表面抗原，而且还可以选择性地外源性地接合以驱动细胞扩增。已经开发的特许的受体-配体相互作用对细胞类型来说是不可知的，并且以被工程化为任何所关注的细胞类型，只要提供适合细胞的信号传导结构域即可。另外，过继性细胞疗法领域正在积极追寻同种异体细胞的开发，以降低制造的时间、复杂性和成本，以提供更一致的更容易获得的产物。一种高可适应的CAR系统与同种异体努力将是强烈地协同性的，并且一旦验证了真正通用的同种异体CAR系统，治疗领域然后就有了这样的特征，即相对容易开发并实施衔接子分子的文库，从所述文库中可以进行个性化选择。这种策略还拓宽了潜在应用于任何具有可靶向表面抗原的致病细胞的领域。
本文引用的所有参考文献，包含出版物、专利申请和专利均通过引用特此并入，其程度如同每篇参考文献被单独并且具体地指出通过引用并入并且在本文中被整体阐述。
序列表
<110> 修普霍斯生物科学有限公司（XYPHOS BIOSCIENCES INC.）
<120> 抗体-NKG2D配体结构域融合蛋白
<130> 33149/56867A/PC
<150> US 63/208,407
<151> 2021-06-08
<160> 32
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala
115 120
<210> 2
<211> 329
<212> PRT
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<220>
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130 135 140
Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
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<220>
<223> 合成
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
Met Met Arg Pro Ile Val Leu Val Leu Leu Phe Ala Thr Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly
20 25 30
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
35 40 45
Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
50 55 60
Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
85 90 95
Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp
115 120 125
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 5
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
Met Met Arg Pro Ile Val Leu Val Leu Leu Phe Ala Thr Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly
20 25 30
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
35 40 45
Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
50 55 60
Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
85 90 95
Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp
115 120 125
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 6
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 7
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 11
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
Glu Pro His Ser Leu Ser Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro Lys Phe Arg
1 5 10 15
Pro Gly Pro Arg Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp Glu Lys Thr
20 25 30
Phe Leu His Tyr Asp Cys Gly Gln Lys Thr Val Thr Pro Val Ser Pro
35 40 45
Leu Gly Lys Lys Leu Gln Val Thr Thr Ala Trp Lys Ala Gln Asn Pro
50 55 60
Val Leu Arg Glu Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu Trp Asp Ile
65 70 75 80
Gln Leu Glu Asn Tyr Thr Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu Gln Ala Arg
85 90 95
Met Ser Cys Glu Gln Lys Ala Glu Gly His Ser Ser Gly Ser Trp Gln
100 105 110
Phe Ser Phe Asp Gly Gln Ile Phe Leu Leu Phe Asp Ser Glu Lys Arg
115 120 125
Met Trp Thr Thr Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys Glu Lys Trp
130 135 140
Glu Asn Asp Lys Val Val Ala Thr Lys Leu Tyr Leu Trp Ser Met Gly
145 150 155 160
Asp Cys Ile Gly Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met Asp Ser Thr
165 170 175
Leu Glu Pro Ser
180
<210> 12
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 12
Met Met Arg Pro Ile Val Leu Val Leu Leu Phe Ala Thr Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro
20 25 30
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr
35 40 45
Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile
50 55 60
Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly
65 70 75 80
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala
85 90 95
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro
100 105 110
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
115 120 125
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
130 135 140
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
145 150 155 160
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
165 170 175
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
195 200 205
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
210 215 220
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ala Pro Thr Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Glu Pro His Ser Leu Ser Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro Lys Phe
245 250 255
Arg Pro Gly Pro Arg Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp Glu Lys
260 265 270
Thr Phe Leu His Tyr Asp Cys Gly Gln Lys Thr Val Thr Pro Val Ser
275 280 285
Pro Leu Gly Lys Lys Leu Gln Val Thr Thr Ala Trp Lys Ala Gln Asn
290 295 300
Pro Val Leu Arg Glu Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu Trp Asp
305 310 315 320
Ile Gln Leu Glu Asn Tyr Thr Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu Gln Ala
325 330 335
Arg Met Ser Cys Glu Gln Lys Ala Glu Gly His Ser Ser Gly Ser Trp
340 345 350
Gln Phe Ser Phe Asp Gly Gln Ile Phe Leu Leu Phe Asp Ser Glu Lys
355 360 365
Arg Met Trp Thr Thr Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys Glu Lys
370 375 380
Trp Glu Asn Asp Lys Val Val Ala Thr Lys Leu Tyr Leu Trp Ser Met
385 390 395 400
Gly Asp Cys Ile Gly Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met Asp Ser
405 410 415
Thr Leu Glu Pro Ser
420
<210> 13
<211> 404
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 13
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys Ala Pro Thr Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Glu Pro His Ser Leu Ser Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro Lys Phe Arg
225 230 235 240
Pro Gly Pro Arg Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp Glu Lys Thr
245 250 255
Phe Leu His Tyr Asp Cys Gly Gln Lys Thr Val Thr Pro Val Ser Pro
260 265 270
Leu Gly Lys Lys Leu Gln Val Thr Thr Ala Trp Lys Ala Gln Asn Pro
275 280 285
Val Leu Arg Glu Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu Trp Asp Ile
290 295 300
Gln Leu Glu Asn Tyr Thr Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu Gln Ala Arg
305 310 315 320
Met Ser Cys Glu Gln Lys Ala Glu Gly His Ser Ser Gly Ser Trp Gln
325 330 335
Phe Ser Phe Asp Gly Gln Ile Phe Leu Leu Phe Asp Ser Glu Lys Arg
340 345 350
Met Trp Thr Thr Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys Glu Lys Trp
355 360 365
Glu Asn Asp Lys Val Val Ala Thr Lys Leu Tyr Leu Trp Ser Met Gly
370 375 380
Asp Cys Ile Gly Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met Asp Ser Thr
385 390 395 400
Leu Glu Pro Ser
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 15
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 15
Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly
1 5 10 15
Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe
20 25 30
Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser
35 40 45
Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu
50 55 60
Leu Lys Leu Val Lys Ser Ala His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro
65 70 75 80
Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn
85 90 95
Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala
100 105 110
Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr
115 120 125
Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
130 135
<210> 16
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 16
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys Ser Leu
65 70
<210> 17
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 19
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly
1 5 10 15
Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe
20 25 30
Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser
35 40 45
Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu
50 55 60
Leu Lys Leu Val Lys Ser Ala His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro
65 70 75 80
Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn
85 90 95
Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala
100 105 110
Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr
115 120 125
Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
130 135 140
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
145 150 155 160
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
165 170 175
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
180 185 190
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Ser Leu Lys Arg
195 200 205
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
210 215 220
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
225 230 235 240
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
245 250 255
Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
260 265 270
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
275 280 285
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
290 295 300
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
305 310 315 320
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
325 330 335
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
340 345 350
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 20
<211> 629
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Ala His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
195 200 205
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
210 215 220
Cys Ser Leu Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
225 230 235 240
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
245 250 255
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
260 265 270
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
275 280 285
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
290 295 300
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
305 310 315 320
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
325 330 335
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
340 345 350
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
355 360 365
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ser Gly Ser
370 375 380
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr
385 390 395 400
Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His
405 410 415
Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys
420 425 430
Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp
435 440 445
Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg
450 455 460
Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro
465 470 475 480
Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn
485 490 495
Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn
500 505 510
Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu
515 520 525
Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met
530 535 540
Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His
545 550 555 560
Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn
565 570 575
Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu
580 585 590
Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His
595 600 605
Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met
610 615 620
Asp Glu Leu Tyr Lys
625
<210> 21
<211> 85
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr
85
<210> 22
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
atgatgcggc caattgtcct cgtgctcctt ttcgccacct ccgccctcgc tcaagttcag 60
cttcagcagc cgggggctga gttggtgaaa cccggggcca gtgtgaagat gagctgtaaa 120
gcgagcggct acaccttcac ttcttataat atgcattggg ttaagcaaac gccaggaagg 180
gggctggagt ggatcggcgc tatttaccca ggtaacggtg acacatcata taaccaaaag 240
tttaagggaa aggcaaccct cacagcggac aagagtagct caaccgcata catgcaactg 300
tcaagcctta cctccgaaga cagcgcagtg tactactgcg ccagaagcac ctactatggg 360
ggtgattggt acttcaacgt ctggggggct ggcaccacag tgactgtaag cgcagcgtcg 420
accaagggcc cgtcagtgtt cccgctggcc ccgtcatcca agtccacgtc tgggggcaca 480
gcagccctgg gatgcttggt caaggactac ttccccgagc ccgtgactgt gtcctggaac 540
tccggagcac tgacctccgg agtgcacacc tttcccgcgg tgctgcagtc ctccggactg 600
tactccctgt cgtcggtcgt gaccgtgccg agctcctcgc tcggaaccca gacctacatc 660
tgcaacgtga accacaagcc ctcgaacacc aaagtggaca agaaggtcga gcccaaaagc 720
tgcgacaaga ctcacacttg tccgccgtgc cccgcccccg aactgctggg tggcccctcc 780
gtgttcctgt tcccgcctaa gcctaaggac acccttatga tcagccgcac ccctgaagtg 840
acctgtgtcg tcgtggcagt gtcacacgag gacccggagg tcaagttcaa ttggtacgtg 900
gacggcgtgg aagtgcataa cgcaaagacc aagcctcggg aggaacagta cgcctcgacc 960
taccgcgtgg tgtcagtcct gactgtgctg caccaggact ggctgaacgg gaaggagtac 1020
aagtgcaaag tgtcgaacaa ggccctgccg gctccaattg aaaagaccat cagcaaggcc 1080
aagggccagc caagggaacc acaggtgtac accctccctc cttcccggga cgagctgacc 1140
aaaaaccaag tgtccctgac ttgccttgtg aaggggttct acccttctga cattgccgtc 1200
gaatgggaat cgaacggaca gcctgaaaac aactataaga ctaccccgcc cgtgctggat 1260
tccgacggaa gcttcttcct gtactccaag ctgaccgtgg acaagtcgag atggcagcag 1320
ggaaatgtgt tcagctgctc cgtgatgcat gaggcgctgc acaaccacta cacccagaag 1380
tcactgagcc tctcccccgg aaagtagtga 1410
<210> 23
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
caagttcagc ttcagcagcc gggggctgag ttggtgaaac ccggggccag tgtgaagatg 60
agctgtaaag cgagcggcta caccttcact tcttataata tgcattgggt taagcaaacg 120
ccaggaaggg ggctggagtg gatcggcgct atttacccag gtaacggtga cacatcatat 180
aaccaaaagt ttaagggaaa ggcaaccctc acagcggaca agagtagctc aaccgcatac 240
atgcaactgt caagccttac ctccgaagac agcgcagtgt actactgcgc cagaagcacc 300
tactatgggg gtgattggta cttcaacgtc tggggggctg gcaccacagt gactgtaagc 360
gca 363
<210> 24
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 24
gcgtcgacca agggcccgtc agtgttcccg ctggccccgt catccaagtc cacgtctggg 60
ggcacagcag ccctgggatg cttggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gactgtgtcc 120
tggaactccg gagcactgac ctccggagtg cacacctttc ccgcggtgct gcagtcctcc 180
ggactgtact ccctgtcgtc ggtcgtgacc gtgccgagct cctcgctcgg aacccagacc 240
tacatctgca acgtgaacca caagccctcg aacaccaaag tggacaagaa ggtcgagccc 300
aaaagctgcg acaagactca cacttgtccg ccgtgccccg cccccgaact gctgggtggc 360
ccctccgtgt tcctgttccc gcctaagcct aaggacaccc ttatgatcag ccgcacccct 420
gaagtgacct gtgtcgtcgt ggcagtgtca cacgaggacc cggaggtcaa gttcaattgg 480
tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgca aagaccaagc ctcgggagga acagtacgcc 540
tcgacctacc gcgtggtgtc agtcctgact gtgctgcacc aggactggct gaacgggaag 600
gagtacaagt gcaaagtgtc gaacaaggcc ctgccggctc caattgaaaa gaccatcagc 660
aaggccaagg gccagccaag ggaaccacag gtgtacaccc tccctccttc ccgggacgag 720
ctgaccaaaa accaagtgtc cctgacttgc cttgtgaagg ggttctaccc ttctgacatt 780
gccgtcgaat gggaatcgaa cggacagcct gaaaacaact ataagactac cccgcccgtg 840
ctggattccg acggaagctt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcgagatgg 900
cagcagggaa atgtgttcag ctgctccgtg atgcatgagg cgctgcacaa ccactacacc 960
cagaagtcac tgagcctctc ccccggaaag 990
<210> 25
<211> 1269
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
atgatgcgcc ccatcgtgct cgtgctcctt ttcgctacct ccgccctcgc ccagatcgtg 60
ttgtcccaat cacccgcaat tctctctgcg agcccagggg agaaggtgac catgacttgc 120
cgcgcttcaa gttccgtatc ctacattcac tggttccagc agaagcccgg aagttcccct 180
aagccctgga tctatgctac atccaatctg gcaagcggtg ttcccgttag attttccgga 240
agcgggtctg gaaccagtta cagtctgact atttccaggg tcgaggccga agatgcggct 300
acttattatt gccaacagtg gacctctaac ccacccacat tcggcggcgg cactaagttg 360
gaaattaagc ggaccgtggc cgccccgagc gtgttcattt tccctccctc cgacgagcag 420
ttgaaatcgg gcaccgctag cgtggtctgc cttctcaaca atttctatcc acgggaagcc 480
aaagtgcagt ggaaggtcga caacgcgctc caatccggga actcacagga atccgtgact 540
gagcaggatt ccaaggactc gacctactcc ctgtcatcca cgctgaccct gagcaaggca 600
gactacgaga agcacaaggt ctacgcctgc gaagtgacac accagggact gtccagcccc 660
gtgaccaaga gcttcaacag aggagaatgc gcacctacct caagctctgg aggaggtggc 720
agcgagcccc atagtctgag ctacgacatc acagttattc ccaagttcag gcccggaccg 780
cgctggtgtg ccgtgcaagg acaagtcgac gaaaaaacct ttcttcatta cgattgcgga 840
cagaagactg taacgccagt ctctccttta ggtaagaagt tacaggtcac tacggcgtgg 900
aaggcacaaa accccgtcct gcgcgaggtc gtcgacatcc tgactgaaca attgtgggac 960
atccagctcg agaattacac tccaaaggag cctcttaccc tgcaggctag aatgtcttgc 1020
gagcaaaagg cagagggcca ctcctccggc agctggcagt tcagtttcga cggacaaatc 1080
tttctgttat tcgattcaga gaagagaatg tggactacag ttcaccccgg tgcccgtaaa 1140
atgaaggaga agtgggaaaa cgacaaagtg gtggcgacta agctttatct ttggtcgatg 1200
ggagactgca tcggttggct ggaagatttc ctcatgggta tggactccac tttggagcca 1260
tcgtagtga 1269
<210> 26
<211> 317
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 26
agatcgtgtt gtcccaatca cccgcaattc tctctgcgag cccaggggag aaggtgacca 60
tgacttgccg cgcttcaagt tccgtatcct acattcactg gttccagcag aagcccggaa 120
gttcccctaa gccctggatc tatgctacat ccaatctggc aagcggtgtt cccgttagat 180
tttccggaag cgggtctgga accagttaca gtctgactat ttccagggtc gaggccgaag 240
atgcggctac ttattattgc caacagtgga cctctaaccc acccacattc ggcggcggca 300
ctaagttgga aattaag 317
<210> 27
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
cggaccgtgg ccgccccgag cgtgttcatt ttccctccct ccgacgagca gttgaaatcg 60
ggcaccgcta gcgtggtctg ccttctcaac aatttctatc cacgggaagc caaagtgcag 120
tggaaggtcg acaacgcgct ccaatccggg aactcacagg aatccgtgac tgagcaggat 180
tccaaggact cgacctactc cctgtcatcc acgctgaccc tgagcaaggc agactacgag 240
aagcacaagg tctacgcctg cgaagtgaca caccagggac tgtccagccc cgtgaccaag 300
agcttcaaca gaggagaatg c 321
<210> 28
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 28
gagccccata gtctgagcta cgacatcaca gttattccca agttcaggcc cggaccgcgc 60
tggtgtgccg tgcaaggaca agtcgacgaa aaaacctttc ttcattacga ttgcggacag 120
aagactgtaa cgccagtctc tcctttaggt aagaagttac aggtcactac ggcgtggaag 180
gcacaaaacc ccgtcctgcg cgaggtcgtc gacatcctga ctgaacaatt gtgggacatc 240
cagctcgaga attacactcc aaaggagcct cttaccctgc aggctagaat gtcttgcgag 300
caaaaggcag agggccactc ctccggcagc tggcagttca gtttcgacgg acaaatcttt 360
ctgttattcg attcagagaa gagaatgtgg actacagttc accccggtgc ccgtaaaatg 420
aaggagaagt gggaaaacga caaagtggtg gcgactaagc tttatctttg gtcgatggga 480
gactgcatcg gttggctgga agatttcctc atgggtatgg actccacttt ggagccatcg 540
<210> 29
<211> 404
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys Ala Pro Thr Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Glu Pro His Ser Leu Ser Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro Lys Phe Arg
225 230 235 240
Pro Gly Pro Arg Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp Glu Lys Thr
245 250 255
Phe Leu His Tyr Asp Cys Gly Asn Lys Thr Val Thr Pro Val Ser Pro
260 265 270
Leu Gly Lys Lys Leu Asn Val Thr Thr Ala Trp Lys Ala Gln Asn Pro
275 280 285
Val Leu Arg Glu Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu Trp Asp Ile
290 295 300
Gln Leu Glu Asn Tyr Thr Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu Gln Ala Arg
305 310 315 320
Met Ser Cys Glu Gln Lys Ala Glu Gly His Ser Ser Gly Ser Trp Gln
325 330 335
Phe Ser Phe Asp Gly Gln Ile Phe Leu Leu Phe Asp Ser Glu Lys Arg
340 345 350
Met Trp Thr Thr Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys Glu Lys Trp
355 360 365
Glu Asn Asp Lys Val Val Ala Thr Lys Leu Tyr Leu Trp Ser Met Gly
370 375 380
Asp Cys Ile Gly Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met Asp Ser Thr
385 390 395 400
Leu Glu Pro Ser
<210> 30
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
Glu Pro His Ser Leu Ser Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro Lys Phe Arg
1 5 10 15
Pro Gly Pro Arg Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp Glu Lys Thr
20 25 30
Phe Leu His Tyr Asp Cys Gly Asn Lys Thr Val Thr Pro Val Ser Pro
35 40 45
Leu Gly Lys Lys Leu Asn Val Thr Thr Ala Trp Lys Ala Gln Asn Pro
50 55 60
Val Leu Arg Glu Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu Trp Asp Ile
65 70 75 80
Gln Leu Glu Asn Tyr Thr Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu Gln Ala Arg
85 90 95
Met Ser Cys Glu Gln Lys Ala Glu Gly His Ser Ser Gly Ser Trp Gln
100 105 110
Phe Ser Phe Asp Gly Gln Ile Phe Leu Leu Phe Asp Ser Glu Lys Arg
115 120 125
Met Trp Thr Thr Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys Glu Lys Trp
130 135 140
Glu Asn Asp Lys Val Val Ala Thr Lys Leu Tyr Leu Trp Ser Met Gly
145 150 155 160
Asp Cys Ile Gly Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met Asp Ser Thr
165 170 175
Leu Glu Pro
<210> 31
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
Glu Pro His Ser Leu Ser Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro Lys Phe Arg
1 5 10 15
Pro Gly Pro Arg Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp Glu Lys Thr
20 25 30
Phe Leu His Tyr Asp Cys Gly Asn Lys Thr Val Thr Pro Val Ser Pro
35 40 45
Leu Gly Lys Lys Leu Asn Val Thr Thr Ala Trp Lys Ala Gln Asn Pro
50 55 60
Val Leu Arg Glu Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu Trp Asp Ile
65 70 75 80
Gln Leu Glu Asn Tyr Thr Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu Gln Ala Arg
85 90 95
Met Ser Cys Glu Gln Lys Ala Glu Gly His Ser Ser Gly Ser Trp Gln
100 105 110
Phe Ser Phe Asp Gly Gln Ile Phe Leu Leu Phe Asp Ser Glu Lys Arg
115 120 125
Met Trp Thr Thr Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys Glu Lys Trp
130 135 140
Glu Asn Asp Lys Val Val Ala Thr Lys Leu Tyr Leu Trp Ser Met Gly
145 150 155 160
Asp Cys Ile Gly Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met Asp Ser Thr
165 170 175
Leu Glu Pro
<210> 32
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 32
Glu Pro His Ser Leu Ser Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro Lys Phe Arg
1 5 10 15
Pro Gly Pro Arg Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp Glu Lys Thr
20 25 30
Phe Leu His Tyr Asp Cys Gly Asn Lys Thr Val Thr Pro Val Ser Pro
35 40 45
Leu Gly Lys Lys Leu Asn Val Thr Thr Ala Trp Lys Ala Gln Asn Pro
50 55 60
Val Leu Arg Glu Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu Trp Asp Ile
65 70 75 80
Gln Leu Glu Asn Tyr Thr Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu Gln Ala Arg
85 90 95
Met Ser Cys Glu Gln Lys Ala Glu Gly His Ser Ser Gly Ser Trp Gln
100 105 110
Phe Ser Phe Asp Gly Gln Ile Phe Leu Leu Phe Asp Ser Glu Lys Arg
115 120 125
Met Trp Thr Thr Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys Glu Lys Trp
130 135 140
Glu Asn Asp Lys Val Val Ala Thr Lys Leu Tyr Leu Trp Ser Met Gly
145 150 155 160
Asp Cys Ile Gly Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met Asp Ser Thr
165 170 175
Leu Glu Pro

Claims (30)

1.一种抗体融合蛋白，其包括：(i)重链，所述重链包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变区序列；以及(ii)轻链，所述轻链包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变区序列，其中所述轻链在C末端处与A1-A2结构域融合，所述A1-A2结构域包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体融合蛋白，其中所述A1-A2结构域通过接头与所述轻链融合，所述接头包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体融合蛋白，其包括轻链，所述轻链包括SEQID NO:13的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述重链包括恒定结构域，所述恒定结构域包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的抗体融合蛋白，其包括重链，所述重链包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述重链包括恒定结构域，所述恒定结构域包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的抗体融合蛋白，其包括重链，所述重链包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
8.一种抗体融合蛋白，其包括轻链和重链，所述轻链包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列，所述重链包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
9.一种抗体融合蛋白，其包括轻链和重链，所述轻链包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列，所述重链包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
10.一种核酸分子，其包括编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗体融合蛋白的轻链的核苷酸序列。
11.一种组合物，其包括根据权利要求10所述的核酸分子以及包含编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗体融合蛋白的重链的核苷酸序列的核酸分子。
12.一种表达载体，其包括根据权利要求10所述的核酸分子。
13.根据权利要求12所述的表达载体，其进一步包括包含编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗体融合蛋白的重链的核苷酸序列的核酸分子。
14.一种宿主细胞，其包括根据权利要求12或权利要求13所述的表达载体。
15.一种宿主细胞，其包括根据权利要求12所述的表达载体以及包含核酸分子的表达载体，所述核酸分子包括编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗体融合蛋白的重链的核苷酸序列。
16.一种产生抗体融合蛋白的方法，所述方法包括：
培养宿主细胞，所述宿主细胞包括包含编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗体融合蛋白的轻链的核苷酸序列的核酸分子以及包含编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗体融合蛋白的重链的核苷酸序列的核酸分子；以及
回收所述抗体融合蛋白。
17.一种试剂盒，其包括一个或多个容器和使用说明书，所述一个或多个容器包括根据权利要求1至9中任一项所述的抗体融合蛋白。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其进一步包括一个或多个容器，所述一个或多个容器包括哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包括嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括SEQID NO:15。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述哺乳动物细胞是人淋巴细胞或人巨噬细胞。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的试剂盒，其中所述嵌合抗原受体进一步包括SEQ ID NO:16-18。
21.一种治疗患有CD20阳性癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至9中任一项所述的抗体融合蛋白以及哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包括嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括SEQ ID NO:15。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人淋巴细胞或人巨噬细胞。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述嵌合抗原受体进一步包括SEQID NO:16-18。
24.一种A1-A2结构域肽，其包括与SEQ ID NO:30具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述肽包括SEQ ID NO:30的位置40、54和/或84中的一个或多个位置处的丙氨酸或谷氨酰胺。
25.根据权利要求24所述的A1-A2结构域肽，其中所述肽包括SEQ ID NO:30的位置40和54处的谷氨酰胺残基。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的A1-A2结构域，其中所述肽包括SEQ ID NO:30的位置84处的谷氨酰胺。
27.根据权利要求24或权利要求25所述的A1-A2结构域，其中所述肽包括SEQ IDNO:30的位置84处的丙氨酸。
28.根据权利要求24所述的A1-A2结构域肽，其中所述肽包括SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:31或SEQ ID NO:32。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的A1-A2结构域肽，其与抗体轻链融合。
30.根据权利要求24至28中任一项所述的A1-A2结构域肽，其与抗体重链融合。
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