CZ391097A3

CZ391097A3 - Látky a peptidy vážící se na erythropoietinový receptor

Info

Publication number: CZ391097A3
Application number: CZ973910A
Authority: CZ
Inventors: Nicholas C. Wrighton; William J. Dower; Ray S. Chang; Arun K. Kashyap; Linda K. Jolliffe; Dana Johnson; Linda Mulcahy
Original assignee: Ortho Pharmaceutical Corporation; Affymax Technologies, N. V.
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1998-07-15
Also published as: NO975729L; EP1510524A2; PL185040B1; AU712713B2; JP2007277264A; JP2009280616A; CA2223833A1; KR100459984B1; DE69630708T2; ATE254138T1; EP0886648B1; JPH11507367A; NO975729D0; EP0886648A4; WO1996040749A1; NO318783B1; BR9609006A; CN1192748A; NZ310804A; AU6166796A

Description

Oblast techniky

Předkládány vynález poskytuje iníeř aha peptidy a látky, které se vážou na a aktivují érythropoietinový rčceplor (EPO-R) nebo jinak působí jako EPG agoništé. Vynález má použití v oblasti biochemie a lékařské chemie a zejména poskytuje EPO agoriisty pro použití při terapii' lidských chorob.

Dosavadní stav techniky

Erythropoietin (EPO) je glykoproteinový hormon Skládající se zé 165 aminokyselin, 4 glykosylačních míst v aminokyselinových polohách 24, 38, 83 a 126, s molekulovou hmotností 34 000 Původně vzniká jako prekursOrový protein se signálním pěptidem o 23 aminokyselinách: EPO se vyskytuje ve třech formách: α, β a asialo. α a β formy se slabě liší v cukerných komponentách, ale mají shodnou účinnost, biologickou aktivitu a molekulovou hmotnost. Asialo forma je α nebo β forma s Odstraněným teitnínálním cukrem (sialóvou kyselinou): Byly popsány DNA sekvence kódující EPO (Lín (1987) U S. Patent Nó. 4,703,008, zde zahrnutý do odkazu).

EPO stimuluje mitotické dělení a diferenciaci buněk prekursóru erythroeytů, a ták zabezpečuje produkcí erýthrócytů. Vzniká v ledvinách při hypoxiekých podmínkách. Během EPO-indukovanc diferenciace buněk prekursorů erythroeytů se indukuje syntéza globinu a narůstá Syntéza heme-kompíexu a počet feiritiňových receptorů. To umožňuje buňce přijmout více železa á syntetizovat funkční hemoglobin. V maturovaných erythrocytech hemoglobin váže kyslík. Ery throcyty a v nich obsažený hemoglobin máji klíčovou úlohu při zásobování těla kyslíkem. Popsané komplexní procesy jsou iniciovány interakcí EPÓ s odpovídajícím receptorerh na buněčném povrchu buněk prekursorů erythroeytů (např. Graber a Krantz (1978) Ann. Rev. Med 29, 51-66).

♦ «* «9 9 99 99 • 999 · 9 · · · · • · « · · 9 » 9 ·

9 · 9 9 9999 9 999 9 9

9 9 9 9 · ·

9999 9999 99 9 99 99

EPO je přítomen ve velmi nízké koncentraci v plasmě, když je tělo ve zdravém stavu a ~ tkáně jsou dostatečně okysličovány existujícím počtem erythrocytů. Tato normální nízká koncentraceje dostatečná pro nahrazení červených krvinek ztracených Stárnutím.

*’ Množství EPO v Oběhu se zvyšuje při podmínkách hypóxie, když je v Oběhu transport kyslíku krvinkami redukován. Hypoxie může být způsobena ztrátou velkého množství krve při krvácení, zničením červených krvinek vystavením nad iriěnié radiaci; redukcí příjmu kyslíku ve „ velkých nadmořských výškách nebo při dlouhém bezvědomí, nebo při různých formách anemie.

| Jako odpověď na hypoxický stres tkání EPO zvýší produkci červených krvinek stimulací proliferace buněk erythroidního progenitoru. Když je množství červených krvinek v oběhu vyšší než je zapotřebí pro požadavky normálního okysličování tkáně, EPÓ v oběhu še snižuje.

Protože EPO je esenciální při tvorbě červených krvinek, má tento hormon potenciální uplatnění jak při diagnose, tak při terapii krevních poruch charakterizovaných nízkou nebo ___ chybnou produkcí Červených krvinek. Nedávné studie poskytly základy pro plánování účinné terapie EPÓ při různých chorobných stavech, poruchách á stavech hematologické iregularitý, včetně: beta-thalassemie (Vedovato et al. (1984) Ač/d Haematol. 71, 211-213), cystická fibrosa (Vichinsky et al (1984) J.Pediatrie 105,15-21); těhotenství a menstruační poruchy (Cotes et al. (193) Brit. J. Ostét: Gynéacól. 90, 304-311); raná anemie předčasně zralých (Haga et al. (1983) Acta Pediatr. Scand. 72, 827-831); poraněni míchy (Claus-Walkcr et al. (1984) Arch. Phys. Med. ftehabil. 65, 370-374); vesmírné lety (Dunn et al. (1984) Fair. J. Appl. Physioi. 52, 178-182);

akutní ztráta krve (Míller et al. (1982) Brit. J. Haematol.52, 545-590); stárnutí (Udupá et al.

(1984) J. Lab. Clin. Med. 103,574-580 a 581-588, Lipšchnitz et al. (1983) Blood63, 502-509), různé neoplastické chorobné stavy doprovázené abnormáhú erýťhropoiešií (Dainiak et al. (1983)

Cancer 5, lÍOl-1106, Schwartz et ál. (1983) OtolaryngoL 109, 269-272); á renální rί nedostatečnost (Eschbach et al. (1987) N. Eng. J. Med. 316, 73-78).

Byl charakterizovaný čištěný homogenní EPO (Hewick U S. Patent No. 4,677,195), DN A sekvence kódující EPO se čistila, klonovala á exprimovala za produkce syntetických polypeptidu, které měly stejné biochemické a imunologické vlastnosti. Také se připravila rekombinantní EPO molekula s oligosácharidy identickými s přirozeným materiálem (Sasaki et al. (1987) J. Biol. Chem. 262, 12059-12076).

Navzdory dostupnosti purifikovaného rekombinantního EPO je známo pouze málo o mechanismu EPO indukované proliferace a diferenciace erythroblastů. Na charakterižaci čeká ^ι- η fc fc fc í t h i fc' V ϊ « fc « . Í t t * l i, t fc » fc i i

II t ť t í ( I fc ft i fc » fc « fc « ‘ · * i » fc ' t 4 « fc fc t * »· fc « t i li * « 4 li H t: « ³ specifická interakce EPO š progenitory riemáiuróvanýčh červených krvinek, krevní ch 'dešti ček a / _w ' . ... _ \ ...,·..

„ megakaryocytů’ Částečné: je to způsobeno hialým počtem povichOvých EPOreeeptorových ’ molckul na normáiních erythroblastech a ria erythroleukcmičké buněčné linii (Krantz a Goídwasser ! : (1984) Proč W; AcóZ

Mayeuv etal;(1987)7-7?/?5 /zttór.v 211:229-233; Mufson a Gesňér (1987) Blood 69, 1485-1490; Sakaguchi et ál . (1987) BiochemBióphys.Res.Co/nmun. Γ46, 7-12; Sawyer et al: (1987) Proč.

„ Natí. Acad Sci. USA 84^ 3690-3694, SawyeT ei J. Biol Cheni; 262, 5554-5562;. a | Todokóřó et al. (1988) Proč. NatL·Acad. Sci. USA 84, 4126-4130.

Zesíťované komplexy mezi EPO radioznačeným jodem á proteiny buněčného povrchu naznačují; že proteiny buněčného povrchu obsáhují dva polypeptidy o molekulových hmotách 85 0.00, respektive 100 000 daltonů. Dva zesíťované komplexy se nedávno podrobily Štěpení V8 proteázou a byly. u nich zjištěny identické peptidové fragmenty, což nasvědčuje tomu; žé dva EPO vážící polypeptidy jsouproduktystejných nebo velmi podobných genů (Sawyer et al. (1988), viz výše). Většina studií o vazbách na buněčném povrchu vvšákjiikážálajédhOtnOtftřídu vazebných míst, v průměru 300 až 600 na buněčný povrch s 800 pM (pikomolární) Kd (Sawyer et al. (:198.7) Proč. Nati. Acad Sci. USA 84,3690-3694 Nieméně na EPO odpovídající slezinné erythroblasty l připravené z myší inj ikovaných anemickým vláknem(FVA) Friend leukcmického viru vykazují í¹ ? _v f vazebná místa s- vysokou a nízkou afinitou š dišóciačními konstantami100 pM; respektive 800 i ' ' — ί .. ·* pM (Sawyer et al ' (1987) 7. i B/o/. ΟΛβ/η.? 262,'5554-5562. a Landschulz (1989.) Blood 73, ^:1476-1478; Byly popsány DNA šekvence a kódující peptidové sekvence pro kuřecí a lidské EPO : reccptorové proteiny (D Aridrca et.al , PCT Patent Publication No. WO 90/08822 (vydáno 1990). ; l· 5 Dostupnost klonovanýchgenůEPO-R usnadňuje hledání agonistů a antagonistů tohoto t důležitého receptoni Dostupnost proteinu rekombinantního receptoru umoňuje studium[ interakce t recéptor-ligand v různých systémech randomriíhů a semi-randomního generování peptidové fc ' 1 diversity. Týto systémy obsahují systém peptidů na plasmidech popsaný v US patentové přihlášce série No. 778;233; zaregistrované 16. října 1991, systém peptidů na fágu popsaný v US patentové přihlášce série No. 718,577, zaregistrované 20; června 1991 a Cwirla et al. (srpen 1990) Proč.

Nati; Acad Sči: UŠA&T, 6378-6382, systém kódovaných syntetických knihoven (ESL) popsaný v US patentové přihlášce série No: 946,239;zaregistrované 16. září 1992, která je pokračováním _# přihlášky série No? 762-522, zaregistrované 18 září-1991, a> Systém syntézy imobilizovaného ' polymeru’ ve velmi’ velkém měřítku popsaný v US patentové přihlášce série No. 942,462,

... .. V • * v Φ »φ φ Φ φ Φ ·» φφ φ • ΦΦΦ · φ φ φφφ φ φφφφ φ φ φ φ •ΦΦΦΦΦΦΦ φφ zaregistrované 7. března 1990; PCT patentové publikaci No. 90/15070, vydané 13. prosince 1990; US patentové přihlášce série No. 624_; 120, zaregistrované 6. prosince 1990; Fodór et al. (15. únor 1991) Science 251,767-773; Dower a Fodor (1991) Ann. Rep. MecLChem. 26, 271-180; a v US patentové přihlášce série No. 805,727, zaregistrované 6. prosince 1991; každá z předešlých patentových přihlášek je zde zahrnuta d o citací.

Nicméně zůstává potřeba látek, které se vážou na nebo jinak interagují s ÉPO-R,jak přo studium důležitých biologických aktivit zprostředkovaných tímto receptorem, tak pro léčení chorob. Předkládaný vynález poskytuje takové látky

Podstata vynálezu

V jednom provedení vynález poskytuje peptidy, které se vážou na a aktivují EPO-R nebo jinak se chovají jako EPO agonisté. Tyto peptidy mají délku 10 až 40 nebo více aminokyselinových zbytků, s výhodou délku 14 až 20 aminokyselinových zbytků, a obsahují jadernou sekvenci aminokyselin X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X_g (Sekvence ID No;), kde jě každá aminokyselina označena standardní jedhopísmenovou zkratkou; X₃ je C, A, a-amino-y-brombutyrová kyselina nebo Hoc, kde Hocje homocystein; X₄ je R, H, L nebo W; X₅je M, F nebo 1; Xg se nezávazně vybírá z jakékoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin nebo stereoisomernich D-amiriókyselin; X₇ je D, E, 1, L riejpo V; X je C, A, a-aminó-y-brombutyrová kyselina nebo Hoc, kde Hoc je homocystein, v případě, že buď X₃, nebo X_s je C nebo Hoe. S výhodou peptid obsahuje jadernou sekvenci YX₂X₃X₄X₅GPXgTWX₇X_g(Sekvence ID No;), kde je každá aminokyselina označena standardní jedhopísmenovou zkratkou; každé X₂ a Xg se nezávazně vybit á z jakékoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X₃ je C, A, á-amino-y-bfombutyrová kyselina nebo Hoc, kde Hoc je homocystein; X₄ je R, H, L nebo W; X_s je M, F nebo I; X, je D, Ε, I, L nebo V; X je C, A, a-amino-y-brombutyrová kyselina nebo Hoe, kde Hoc je homocystein, v. případě, že buď X₃, nebo X₈ je C nebo Hoc.

Ještě výhodněji peptid obsahuje jadernou sekvenci aminokyselin

X_]YX₂X₃X₄X5GPX₆TU^/X₇X_sX₉X₁₀X_I] (Sekvence ID No), kde je každáaminokyselina označena standardní jednopísmenovou zkratkou;.každé X_b X₂, Xg, X,, Xj₀ a X, se nezávazně vybírá z jakékoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X₃ je G, A, a-amino-y-brombutyrová kyselina nebo Hoc, kde Hoc je homocystein; X₄ je R, H, L nebo W; X₅ je M, F nebo I; X, je D, ·« ·♦ * · - · · · » · * * · · · ·««« ···· ·· ·

E, 1, L nebo V; X₈ je C, A, a-amino-Y-brombutyrová kyselina nebo Hoc, kde Hoc je homocystein, v případě, že buď X₃, nebo X„ je C nebo Hoc.

V ještě výhodnějším provedení jak X₃, tak \ jsou C, a tak peptid obsahuje jadernou sekvenci aminokyselin X_lYX₂CX₄XjGPX«TWX₇GX^X₁0X,₁(Sekvence ID No:). Výhodněji peptid obsahuje jadernou sekvenci aminokyselin XjYXiCX^XjGPXJWXG^X Á i<N „ (Sekvence ID No:), kde X₄ je R nebó H; Xj je-F nebo M; X₆ je I_s L, T, M nebo V; X₇ je D nebo V; X,₇ je G, K, L, Q, R, S nebo T; X_J(>je A, G, P, R néhoY. V nej výhodnějším provedení peptid obsahuje jadernou sekvenci aminokyse!m X,YX₂GX₄X_}GPX_(jTWX₇CX₉X₎₀X₁₁ (Sekvence ID No:), kde X, je D, ΕΛ, N, S, T nebo V; X₂ je A, Η,K, L, M, S nebo Ϊ, X₄ je R nebo H; Xje K, R, S nebo T; X_I0 je P. Zejména výhodné peptidy obsahují, ale nejsou omezeny na následující:

GGLYLCRFGPVrWDCGYKGG;

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG;

GGTYSCHFGPLTWVGKPQ;

GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG;

VGNYMCHFGPITWVCRPGGG;

GGNYMCHFGPITWVGRPGGG;

GGVYACRMGP1TWVCSPLGG;

VGNYMAHMGPITWVCRPGG;

GGPHHVYACRMGPLTWIC;

GGTYSCHFGPLTWVCKPQ;

GGLYACHMGPMTWVCQPLRG,

TIAQYICYMGPETWECRPSPKA;

YSCHFGPLTWVCK;

YCHFGPLTWVC;

Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG,

GGCRIGPITWVCGG;

LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD;

GGTASCHFGPLTWVCRPQGG;

GGNYYCRFGPITFECHPTGG;

GGE YLCRMGPMTWVCTPVGG;

»· * I »· · ··«*····

GGLYTCRMGPITWVCLPAGG;

GGÍTSCHFGPLTWVCRPQGG;

GGTFSGHFGPLTWVCKPQGG;

GGTYSCHFGALTWVCKPQGG,

GGTySCllíGPLAWVCKPQGG;

GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG,

GGT YSCHFGPATWVCKPQGG;

GGTYSCHTGPLTAVCKPQGG,

-gglyschtgpltlvckpqgg,-—-—

TYSCHFGPLTWVCRPQ;

YSCHFGPLTWVCRP;

SCHFGPLTWVCR;

GGTYSCFGPLŤWVGKPQGG; . ... „

TYSCHTGPLTWVCKPQGG;

YSCHFGPLTWVC;

GGTYSCHFGPLTFVCRPQGG;

aHFGPLTWV.

V jiném výhodném provedení jsou peptidy podle předkládaného vynálezu cyklizovány nebo dimenzovány. Příklády peptidů cyklizovaných jako C-termi náhlí amidy obsahují, ale nejsou limitovány na následující:

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG,

GGTYSCHFGPLTWVCKPQ;

GGLYACHMGPMTWVCQPLRG,

TIAQYICYMGPETWECRPSPRA;

YSCHFGPLTWVCK;

YCHFGPLTWVC;

Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG;

GGCRIGPITWVCGG;

LGRRYSCHFGPLTWVCQPARRD;

«I «» · * *

4 4 4

4*4» * » «

4·4 *4 ·* ·· • 4 4 · . * 4 * ·

4 ·««»44·« ·· 4

4 »

4*4

4 4 · · · ♦

*4 4

GGT ASCHFGPLTWVCKPQGG,

GGNYYCRFGP1TFECHPTGG;

GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG;

GGLYTCRMGP1TWVCLPAGG,

GGTŤSCHFGPLTVVVCKPQGG;

GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG;

GGTYSCHFGALTWVCKPQGG;

GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG, —--θΟΤ-Υ-δ€ΗΤΑΡΤΤΛν-νεκΐ⁵0ΟΟ;-----—---—GGTYSCHFGPATWVCKPQGG,

GGTYSCHFGPLTAVGKPQGG;

GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG,

..... TYSCHFGPLTWVCKPQ; . ... ...... . ...... . ... ................. _;. _________________:.

YSCHFGPLTWVCKP,

YSCHFGALTWVCK;

SCHFGPLTWVCK,

GGTYSEHFGPLTWVKKPQGG,

GGTYSCFGPLTWVCKPQGG;

TYSCHFGPLTWVCKPQGG;

YŠCHFGPLTWVC; a GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG.

Následuje příklad dimeru v souhlase s předkládaným vynálezem:

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG I I

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG.

Podle některého provedení předkládaného vynálezu se buď k jednomu, nebo oběma koncům jaderných sekvencí popsaných výše připojí dva nebo více, s výhodou dva až šest aminokyselinových zbytků, nezávisle vybraných z jakékoliv ž 20 geneticky kódovaných

L-aminokysélin nebo stereoisomemích D-aininokyselin. Například sekvence GG se často připojuje buď k jednomu, nebo oběma koncům jaderných sekvencí pro ulehčení syntézy peptidu.

β» ** β « · « t · • ♦ • · ·*· mm «* · « «ο * * · · • »*««· • ♦ · ·· · «« ·· • · · · • . * *· • ♦ · · · * · · «· ·»

Předkládaný vynalez poskytuje kónjugáty těchto peptidů a deriváty a peptidomimetika ·.- peptidů, které si zachovávají schpnost vazby na EPO-R.

Předkládaný vynález také poskytuje způsoby terapie chorob zahrnujících nedostatek EPO

H i využívající nové látky podle vynálezu. Předkládaný vynález dále poskytuje farmaceutické přípravky zahrnující jednu nebo více látek podle vynálezu'a fyziologicky přijatelný nosič.

Stručný popis obrázku ‘ Obrázek 1 ukazuje sekvenci mutagenních oligomerů použitých v postupech zde popsaných.

-—-«.-Obrá7.ek2iukazujesekvencirepresentátivníchpeptidů-podlevynálezu.---——— ·.

Obrázek 3 ukazuje novou fágemidní mutagenovou knihovnu konstruovanou s použitím pVIIT displejového systému. V této knihovně se fixovaly dva cysteiny a tyrošinové, glycin-prolinóyé a threonin-tryptofaňové zbytky (podtržené). Další pólohý mezi cysteinovými

... .......zbytky (označeny italikou na originálním AF1115 4 peptidu) se mutovaly oligo-konstrukcí tak, že ___________ každý aminokyselinový zbytek se mohl změnit v jakýkoliv jiný s frekvencí 50 %. “X” označuje randomní polohu aminokyseliny.

Obrázek 4A-C ukazuje plit a pVlll konstruované a screenované fágemidní mutagenové knihovny. Aminokyselinové zbytky tučně zvýrazněné jsou fixovány, ostatní (označené NNK) se randomizují. 4A (ON3007) a 4Č (ON30Í7) se navrhly pro studium příspěvku extra bočních oblastí na N-koncí, respektive na C-konci k jaderné sekvenci (tyrosinu u druhého cysteinu). 4B (ON3016) se zakládá na peptidu Y-CHFGPLTWVC, kde se tyrosinový zbytek umístil přímo vedle prvního cysteinu. Tato knihovna dodává další randomní zbytky na oba konce jaderné sekvence.

Obrázek 5 ukazuje mutagenovou knihovnu, založenou na GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, konstruovanou a šcreenovanou s použitím nového Lac-1

displej vektoru (‘Headpiece Dimer”). Aminokyselinové zbytky označené X jsou randomní (NNK), podtržěnéjsou slabě mutovány (91:3:3:3/91:3:3:3/K), zatímco ty obrysové jsou mutovány silněji (70:10:10/70:10:10/K)

Obrázek 6 ukazuje mutagenovou knihovnu, založenou na

TÍAQYICYMGPÉTWEČRPSPKA, konstruovanou a šcreenovanou s použitím nového Lac-I displej vektoru (“Headpiece Dimer”). Aminokyselinově zbýtky označené X jsou randomní (NNK), ty obrysové byly fixovány a dva zbytky glutamové kyseliny byly slabě mutovány ·* 9· > · « « * ' ·

• · 9 · · · · • ·· · 9 9 99 • 9» · · • · 9 > 9« (91:3:3:3/91:3:3:3/Κ).

Obrázek 7 graficky zobrazuje výsledky FDGP-l/hEPO-R biotestu,pro vybrané peptidy podle vynálezu, kde:

• zobrazuje výsledky pro GGCR1GP1TWVCGG;

o zobrazuje výsledky pro GGLYLCRFGP VTWDCG YKGG,

Zobrazuje výsledky pro GGTYŠCHFGPLTWVCKPQGG;

▲ zobrazuje výsledky pro GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG;

▼ zobrazuje výsledky pro VGNYMCHFGPITWVCRPGGG;

I zobrazuje výsledky pro GGYYAGRMGPITWVCSPLGG;

+ zobrazuje výsledky pro VGNYMAHMGP1TWVGRPGG; a * zobrazuje výsledky pro EPO

Obrázek 8 graficky zobrazuje výsledky TF-l biotestu pro EPO (▲ a ♦ zobrazují výsledky pro test s použitím EPO a 10 000, nebo respektive 20 000 buněk na jamku); a pro peptid VGNYMCHFGPITWVCRPGGG (Sekvence ID No:) (B a · zobrazují výsledky pro test's použitím peptidu a 10 000, nebo respektive 20 000 buněk na jamku).

Obrázky 9A (kontrola), 9B (působení 500 pM EPO) a 9C (působení 25 mra GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG) jsou fotografie zobrazující výsledky MTT testu proliferace na representativní populaci slězinných buněk myší po působení fenylhydražinu, zvětšeno 200 x.

Obrázek 10 graficky zobrazuje výsledky FDCP-l/hÉPO-R biotestu ukazujícího zvýšenou aktivitu biotinyiovaného peptidu (tzn. GGTYSČHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin)), oligomerizací se streptavidinem Peptidy GGT YŠCHFGPLTWVCKPQGG a GGTYSČHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin) vykazují přibližně stejnou aktivitu, ale v případě prekomplexace druhého peptidu se streptavidinem (tžn. GGTYSČHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin)-streptavidin komplex), je tento mnohem účinnější. V tomto testu se při nejnižší koncentraci (5nM vzhledem k peptidu v komplexu) pozoruje malé snížení aktivity. Samotný streptavidin má při vysokých koncentrácích okrajovou aktivitu.

Obrázek 11 graficky zobrazuje výsledky FDCP-l/hEPO-R biotestu ukazujícího zvýšenou aktivitu peptidu AF 11505 zprostředkovanou polyklonálňním kozím anti-biotinem Prekomplexování GGTYSČHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin). s kozími anti-biotinovými protilátkami (GGTYSČHFGPLTWVCKPQGGSSK + G anti-B) logaritmicky zvyšuje aktivitu «

ΙΟ peptidů ve srovnání s volným peptidem. Samotné purifikované protilátky (G anti-B) nemají žádný stimulační efekt.

Obrázek 12 ukazuje syntetické schéma přípravy dimefního peptidového analogu GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG.

Obrázek ‘ 13 ukazuje graf 1C_5O dimernihč peptidového analogu GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG Afinita se určila s použitím testu radiolígandove Rompetiční vazby proti PIG-tailovaném EPOR imobilizovancm na mAB179.

Obrázek 14 ukazuje in vitro biologickou aktivitu dimerniho peptidového analogu GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG s použitím FDCP-l/hEPO-R testu buněčné proliferace: Dimerni peptid má IC₅₀ 20 ríM, což je 20-násobný nárůst aktivity vzhledem k mateřskému peptidu.

Obrázek 15 ukazuje progresi buněčného cyklu FDC-Pi/ER.

Obrázek 16 ukazuje analýzu rovnovážné vazby při specifické asociaci [ⁱ²⁵I )EPO s EBP imobilizovaným na agarosových kuličkách a indikuje Kd 5 nM ± 2 založenou ná lineární transformaci (Scatchard) vazebné isotermy.

Obrázky 17Λ, 17B a 17C ukazují výsledky polycystemického exhypoxického biotestu na myších s použitím peptidů GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, GGTYSCHFGPLTWVCKPQ, respektive LGRKYSGHFGPLTWVCQPAKKD.

Obrázky 18A a 18B ukazují výsledky polycystemického exhypoxického biotestu na myších s použitím peptidu TIAQYICYMGPETWECRPSPKA, respektive dimerniho peptidového analogu GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG obsahujícího dvě disulfidické vazby (AF12080).

Obrázky 19A a 19B ukazují výsledky fetikuločytověho testu s použitím EPO, respektive GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG. Pro Obě dávkovači skupiny:n = 10 zvířat. EPO: 0,4, 4,0,40,0 jednotek/myš, kontrola-totální dávka prostředku; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG. 2,0, 20,0, 200,0, kontrola-totáíni dávka prostředku + DMSO (1 - 2 %) 200 pg/myš = 10 mg/kg. Údaje z in v/Zro próliferáČriího testu naznačují: 2 pg GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG = 0,4 jednotky EPO.

Obrázky 20Á a 20B ukazuji výsledky retikuloeýtového testu s použitím EPO, respektive

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG. Pro obě dávkovači skupiny n - 10 zvířat. EPO¹: Q;4, 4,0, 40,0 jednotek/myŠ, totální dávka; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG: nárůst dávky na 1 mg/myš, totální dávka = 50 mg/kg a nárůst dávky na 2 mg/myš, totální dávka = mg/kg.

Detailní popis vynálezu a výhodněhoprovedení.

99

9 9 *

9 99

9·« « ff 9 9

9« 99

O 9

9 ff 9 I •π ·« ·· • 0 9 » ff ff • 9

9 • 999 9999

Následující termíny mají následující obecný význam:

Aminokyselinové zbytky peptidů mají následující zkratky: fenylalanin je Phe ňébo F, leucin je Leu ríebo L; isoleučin je Ile nebo I; methionin je Met nebo M, valin je Val nebo V; šeřin je Ser nebo S; proliti je Pro nebo P; threonin je Thř nebo T; alanin je Ala nebo A; tyrosin jé Tyr nebo Y; nisiidin je His nebo H; glutamin je Gin hébo Q; asparagin jé Asn nebo N; lysin je Lys nebo K: kyselina aspartová je Asp nebo Ď; kyselina glutamová je Glu nebo E; cystein je Cys nebo C; tryptofan je Trp nebo W, arginin je Arg nebo R; glycin je Gly nebo G

Stereoisomery (např D-aminokyseliny) dvaceti konvenčních aminokyselin, nepřirozených -amjnok)'seJin_:jako«,cí-disubstiíÍiGvanýchaniinokyselin,_NralkyLaminokysei)n,Yyselinymléčnéj^ dalších nekonvenčních aminokyselin jsou také vhodné složky látek podle.předkládaného vynálezu.

Příklady nekonvenčních aminokyselin zahrnují: 4-hydroxyprolin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formýlmethionin, 3-methylhistidin, 5-hydroxylysin a další podobné aminokyseliny a iminokyseliny (např. 4-hydroxyprolin).

“Agonista” znamená biologicky aktivní ligand, který še váže na svůj komplementární biologicky aktivní receptor a aktivuje receptor bud’ za vyvolání biologické odpovědi reeeptoru, nebo za zvýšení již existující biologické aktivity reeeptoru.

“Hostitelská buňka” znamená eukaiyontní nebo prokaryontní buňku nebo skupinu buněk, která se transformovala vektorem rekombinantní DNA.

“Peptid” nebo “polypeptid” znamená polymer, ve kterém jsou monomery a-aminokyseliny spojeny amidickými vazbami. Peptidy mají obyčejně délku dvou nebo častěji více aminokyselin.

“Farmaceuticky přijatelné sole” znamenají netoxické sole alkalických kovů, kovů alkalických zemin a amonné sole obvyklé používaně ve farmaceutickém průmyslu včetně sodných, draselných; lithných, vápenatých, horečnatých, bamatých, amonných a protamin zinečnatých Solí, které sé připravují technikami v oboru dobře známými. Termín také obsahuje netoxické adiční sole kyselin, které se obecně připravují reakci látek podle vynálezu s vhodnou organickou nebo anorganickou kyselinou. Representativní sole zahrnují hydrochlorid, hydrobromid, síran, hydrogensíran, octan, Šťavelan, valerát, oleáty lauřát, borát, benzoát, laktát, fosfát, tošylát, citrát, maleát, fumařát, sukcinát, tartarát, nápsylát a tak podobně.

“Farmaceuticky nebo terapeutický efektivní dávka nebo množství” znamená úroveň dávkováni dostatečnou pro vyvoláni žádaného biologického výsledku. Výsledkem je zmírnění znaků, symptomů, příčin choroby nebo jiná žádaná alterace biologického systému. Výhodně je ·· ·« ········

·· 4

·* ** tato dávka nebo množství dostatečná pro stimulaci EPO-R a tak zmírňuje symptomy spojené s ' li nedostatkem EPO nébo deféktní nebo nízkou populací červených krvinek in vivo.

“Klonovací nebo exprimující vektor rekombinantní DNA” znamená DNA nebo RNA molekulu kódující užitečnou funkci a použitelnou pro transformaci hostitelské buňky. Pró účely předkládaného vynálezu klonovací vektor slouží primárně jako intermcdiát při konstrukci exprimujícího vektoru; exprimující vektor se používá pro transformaci nebo transfékt hostitelské buňky ták, aby transformovaná hostitelská buňka produkovala protein nebo jiný produkt kódovaný vektorem. Takové vektory jsou typicky “plasmidy”, které, pro účely předkládaného

-f— -...... vynálezu,^jsou^v.ektpry^extrachrornospmálne udržované v hostitelské buňce, nebo vektory integrující do génomu hostitelské buňky. Odborníci Označují zde definované “klonovací vektory” jako “vektory”, a zdě definované “exprimující vektory” jako plasmidy.

Předkládaný vynález poskytuje látky, které se vážou na a aktivují EPO-R nebo se jinak chovají jakoEPO agonist. Tyto látky obsahují “hlavní” peptidové látky, objevené systémy generujícími randomně různorodé peptidy, a “odvozené” látky konstruované se stejnou nébo podobnou molekulovou strukturou nebo tvarem jako hlavní látky, ale lišící se od hlavních látek buď citlivostí k hydrolýže riěbo proteolýze a/hebo jinými biologickými vlastnostmi, jako zvýšenou afinitou k receptoru, zvýšenou aktivitou in vitro a zvýšenou aktivitou in vivo.

Původně používané Systémy generující randomně různorodé peptidy zahrnovaly systém “peptidů ňa fágu” uváděný výše. Randomní peptidy se navrhovaly o délce 8 aminokyselinových zbytků s Cys zbytky na obou koncích (celková délka: 10 aminokyselinových zbytků). V těchto iniciačních systémech Se randomní peptidy vyskytovaly jako část íúžhího proteinu zahrnujícího pVIIl obalovací protein fágového fd derivátu (peptidy na fágu) Fuzní proteiny společné s DNA kódující fuzní proteiny se “miskovalv” na imobilizo váném EPO-R. Miskovaciproces zahrnoval multipiiťní cykly inkubace fúzních proteinů s imobiližovaným reeeptorem, oddělení fúzních proteinů navázaných na receptor (společně s doprovázející DNA) a produkci získaných íuzních proteinů ve větším množství.

typicky se po třech cyklech miskování fúzni proteiny a doprovodná DNA isolovaly a kultivovaly pro získání preparátů íuzních proteinů pró ELISA k určení, zda se fuzní proteiny vážou na receptor. specificky. Tento test se prováděl podobně jako miskování, s výjimkou odstranění nenavázaných íuzních proteinů, na jamky se působilo králičí antifágovou protilátkou (nebo anti-lac protilátkou pro peptidy na plasmidověm systému), poté s kozí antikráličí

t.:.

• 4 44 * 4 4 · * 4 * 4 ·

W

444 4 44 44

protilátkou kůnjugovanow s alkalickou fosfatázou a množství alkalické fosfaťázy v každé jamce se potě určilo standardními metodami. Srovnáním testovacích jamek s kontrolními jamkami (bez receptoru) semrčilo, zda se íuzrií proteiny vážou ria receptor specificky.

Imobilizovaný receptor používaný při miskoýacích a ELISA postupech zahrnoval extracélulární doménu EPO-receptcm a vznik! v rekombinantních hostitelských buňkách. Tato receptorová molekula se vytváří v různých formách á hostitelských buňkách. Jédriá užitečná forma se konstruuje se signálním peptidem pro proteinovou sekreci a pro ukotvení glykofosfolipidové membrány (tato forma ukotvení se nazývá “PÍG-tailing’^:; víz Caras a Weddelf (3. břežen 1989) -žc?cnce-24374496-1-198^.á^Limet ál.TTO.JsrpenLl.99Í0.L^£«^<249,.677-679, oba zde zařazené do odkazu). Tento systém umožňuje snadné odštěpení receptoru z povrchu buněk cxprimujicích receptor a odděleni odštěpeného receptoru. Výhodně se místo proteázového štěpení, jako místo thrombinověho štěpení, zařazuje mezi HP AP epitop PIG-tailovaného receptoru a samotný receptor_____________

Rekombinantní receptorový protein se imobilizoval s použitím následujícího postupu. Mikrotitrové destičky se pokryly anti-rečeptorovou protilátkou a ria jamky obsahující imobilizovaný receptor se působilo hovězím sérumalbuminem (BSA) pro blokování nespecifické vazby. K pokrytým jamkám na mikrotitrové destičce se přidal Pl G-t ailo vany receptor s thrombinovým místem štěpení, jamky se poté promyly pro Odstranění nenavázaného receptoru.

V případě použití systémů generujících randomní peptidy, které umožňují multivaleňtní interakci ligand-receptor, se bere v úvahu, že hustota imobilizovaného receptoru je důležitým faktorem při určování afinity ligandu vázajících: se ná imobilizovaný receptor. Při vyšších hustotách (tzn. na každou jamku pokrytou antireceptorovou protilátkou, se působilo 0,25 až 0,5 mg receptoru) se spíše vyskytuje multivalentni vázání než při nižších hustotách receptoru (tzn. na každou jamku pokrytou antireceptorovou protilátkou se působilo 0,5 až 1 ng receptorů). V případě multivalentniho vázání se spíše isolují ligandy s relativně nízkou afinitou. Typicky se identifikují hlavní látky s použitím vysoké hustoty imobilizovaného receptoru a poté se testuji deriváty hlavní látky při nižších, hustotách receptoru, aby sě identifikovaly látky s vyšší afinitou na réceptor než má hlavní látka.

Často se receptor přidal pouze k alternujícím řadám mikrotitrové destičky;

BSA-blokované jamky v “prázdných” řadách sloužily jako Užitečné negativní kontroly pro určení, zda pozorované výsledky byly způsobené réceptor-specifickou reakcí. Preparáty fuzničh proteinů ·* 44 • 4 4 4

4' 4 «

4 , •4444444 «4

4 4

4-44

444 4

4 • 4 44

4

4 4 .4 4 4 4 • 4 4444

4 4

4 se poté přidaly k jamkám a inkubovaly se pro umožnění navázání na receptor; poté se jamky promyty přo odstranění nenavázaných fijzníčh proteinů.

S použitím výše popsaného systému se objevil peptid vážící se na EPO-R DNA kódující fuzňí protein vážící se na receptor sé sekvěnovala. Tento peptid má sekvenci: (KrCRlGPJ rWVGGG (Sekvence ID No:) (N-terminální GG zbytek umožňuje štěpení na fágu). Tento peptid shodně vykazoval nízké afinity k BSA a k anti-receptorové protilátce a vysokou afinitu k EPO-R podle ELISA Navíc fágemidový klon byl kompetitoýán volným EPO a příbuzným volným peptidem. Volný peptid navíc kompetiťoval s EPO-fágemidem, fuzním bacl-EPO a radioligandem. Konečně volný peptid_nekompetitoval-pri-lLr2R«B-važebnýčh testech.

Provedla se mutagenetická studie tohoto preferovaného peptidu. Prp generování sady oligonukleotidů kódujících randomní peptidy se připravily mutagerietickě oligomery podle obrázku 1, kde N je nukleotid A, C, G nebo T (ekvimolárně; v závislosti na použitém postupu se mohou použít jiné nukleotidy) a K je G nebo T (ekvimolárně) v kodónovém motivu (NNK). Odborníkům v oboru je známo, že NNK motiv kóduje všechny aminokyseliny, kóduje pouze jeden stóp-kodon a redukuje kódónovou odchylku. Z NNK motivu vychází 32 kodonů: 1 pro každou z 12 aminokyselin, 2 pro kažkóu z 5 aminokyselin, 3 pro každou ze 3 aminokyselin a pouze jeden ze tří stop-kodonů.

Mutagenetické fúzní proteiny společně s je kódující DNA se opět “miskovaly' na i mobilizovaném EPO-R. Poté se fuzní proteiny a doprovodná DNA isolovaly a kultivovaly za vzniku preparátů fuzních proteinů pro ELISA pro určení, zda se fuzní proteiny vážou na receptor specificky. Preferované peptidy vyšlé z této studie ukazuje obrázek 2. Tyto peptidy mají charakteristický motiv “X₃X₄X5GPX₆TWX₇X_S (Sekvence.ID No:), kde je každá aminokyselina .označena standardní jednopísmenovou zkratkou; X₆ se nezávazně vybírá z jakékoliv z 20 ’ geneticky kódovaných L-aminokyseliň nebo stereoisomernich D-aminokyselin, X₃ je G, A, a-anuno-y-brombutyrová kyselina nebo Hoc, kde Moc je homocystcin; X₄ je R, H, L nebo W; X₅je M, F nebp 1; X₇ je D, E, 1, L nebo V; X_g je G, A, a-amino-y-brombutyrová kyselina nebo Hóc, kde Hoc jě homocystcin, v případě, že buď X₃, nebo X₈ je G nebo Hoc.

Pro zabezpečení hrubé indikace afinity peptidů se fagové knihovny screenovaly š použitím protokolu afinitní selekce, kde peptidy kompetují s EPO (100 ňM). Tento proces se typicky opakuje po dva cykly miskování, V následných cyklech miskování, se kompetiční teplota (4 °G

4

4 *

4444

4 ii • 4 4 * • 4 * · • 4 «··· 4444

44

4 4 1 λ 4 44

4 4 1

4 1

44 až teplota místnosti) a čas (15 až 30 minut), stejně jako teplota (4 °C až teplota místnosti) přomývacíeh roztoků může měnit při^: vyhledávání peptidu s vyšší afinitou. S použitím tohoto protokolu afinitní selekce se isolovaly peptidy s obecným motivem XjTOjXjX^XjGPXgTWX^gXpíjQX,, (Sekvence ID No:), kde je každá aminokyselina označena standardní jednopismeňovou zkratkou; každé X_b X₂, \,X, X_o a X, se nezávazně vybírá z jakékoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin nebo stereoisomerních D-aminokyselin, X₄je R, H, L nebo W; X< je M, F nebo l; X₇ jé D, E, 1, L nebo V. Ve výhodnějším, provedení peptid zahrnuje sekvenci aminokyselin X₁YX₂CX₄X₅GPX_íTWX₇CX₇X_l0X₁₁ (Sekvence 1D No:), kde X₄je k nebo H; X₅ je F nebo Μ; X, je I, L, Τ, M nebo V; X je D nebo V. X_je_G.-K. L._O.-R.-S nebo T;.X_lftje A, G, P, R nebo Υ. V nejvýhůdňějším provedení jaderný peptid obsahuje sekvenci aminokyselin XjYXjCX^jGPXflTWXiCX^XioX,, (Sekvence ID No:), kde X, je D, E, L, N, S, T nebo V; X₂ je A, Η, K, L, M, S nebo T, X₄ je R nebo H; X^ je K, R, S nebo T; X_toje P.

Následující tabulky ukazují příklady representativních péptídů obsahujících uvedený motiv a isolovaných postupem afinitní selekce.

Tabulka 1

Peptidy z protokolu afinitní selekce

Kómpétice s 100 nM ĚPO, 15 min, 4°C

GGWVTCRMGP1TWVCGVHGG

GGQLLCGIGPITWVCRWVGG

GGLYLCRMGPVTWECQPRGG

GGWVYCRIGP1TWVCDTNGG

GGIYKCLMGPLTWVCTPDGG

GGMYYCRMGPMTWVCKGAGG (Sekvence ID No.) (Sekvence ID No.) (Sekvence ID No:) (Sekvence ID No.) (Sekvence ID No:) (Sekvence ID No:) (Sekvence ID No:)

Bez kompetice

GGTTQČWIGPITWVCRARGG (Sekvence ID No:)

1 ₍ .,1,	·· «« ·· · · »· • · · * * · «''·· • · ·'>·· · · · • l » «. · ···· · ···. · · φ « · ·· «·«
16 GGPYHCRMGPITWVCGPVGG GGEYLCRMGP1TWVCERYGG GGEYRCRMGPISWVCSPQGG GGNYTCRFGPLTWECTPQGGGA CGNYVCRMGPrrWICTPAGG	»··· ···· ·« ·· (Sekvence ID No:) (Sekvence ID No.) (Sekvence ID No ) (Sekvence ID No.) (Sekvence ID No:)
«	Tabulka 2
•	Peptidy z protokolu afinitní selekce	Λ
	Druhá kompetice s 100 nM EPO, 15 min, 4°C
	GGSWDCRTGP1TWVCKWSGG	(Sekvence ID No )
	GGDYTCRMGPMTW1CTATRG	(Sekvence ID No:)
	GGDYNCRFGPETWVCKPSGG	(Sekvence ID No:)
	GGSYLCRMGPTTWLCTAQRG	(Sekvence ID No:)
	GGDYHCŘMGPLTWVCKPLGG VGNYMCHFGP1TWVCRPGGG	(Sekvence TD No:) (Sekvence 3JD No:)
iř	GGLYLCRMGPQTWMCQPGGG	(Sekvence ID No:)
	GGŤYSCHFGPLTWVCKPQGG	(Sekvence ID No:)
	GGDYVCRMGPMTWVCAPYGR	(Sekvence ID No:)
	GGLYECRMGPMTWVCRPGGG	(Sekvence ID No:)
	GGWYSCLMGPMTWVCKAHRG	(Sekvence ID No:)
•	GGKYYCWMGPMTWVCSPAGG	(Sekvence ID No:)
-	Bez kompetice.
	GGYVMCRIGPITWVCD1PGG	(Sekvence ID No:)
	GSCLQCC1GPITWVCRHAGG GGNYFCRMGPITWVCQRSVG	(Sekvence ID No ) (Sekvence LD No?)
	GGEYICRMGPLTWECKRTGG	(Sekvence ID No?)
	GGLYACRMGPITWVCKYMAG	(Sekvence ID No:)
’

•fe fefe • · · · • fe ·« • fefe · · · • · · ·· fefe (Sekvence ID No ) (Sekvence ID No:) (Sekvence ID No:) ·· fefe • · · fe « · • fefe » · fe··· ···· fefe fe • · * • fefefe • ····· • fefe • fe ·

GGQYLCTFGPITWLCRGAGGGS GGVYACRMGPITWVCSPLGG GGYTTCRMGPITWVCS AHGG

Tabulka 3

Péptidy z protokolu afinitní selekce

Kompetice s 100 nM EPO, 15 min, teplota místnosti

VGNYMCHFGPITWVCRPGGG	(Sekvence ID No:)
GGTYKCWMGPMTWVCRPVGG	(Sekvence ID No:)
GGTYSCHFGPLTWVGKPQGG	(Sekvence ID No )
GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG	(Sekvence ID No:)
GGNYYCRFGPITFECHPTGG	(Sekvence ID No:)
GGLYACHMGPMTWVCQPLRGGGS	(Sekvence ID No:)
GGEYKCYMGP1TWVGKPEGG	(Sekvence ID No:)
GGDYVCRMGPMTWVCAPYGRGGS	(Sekvence ID No:)
Bez kompetice
GGNYVCRMGPITW1CTPAGG	(Sekvence ID No:)
GGDYTGRMGPMTWICTATRG	(Sekvence ID No:)
ggéylcRmgpmtwvcťpvgg	(Sekvence ID No:)
GGSYLCRMGPTTWLCTAQRGGGN	(Sekvence ID No )
GGLYTCRMGPITWVCLPAGG	(Sekvence ID No:)
gglykcrmgpmtwvcspfgo	(SékvenCe ID No:)

Tabulka 4

Kompetice s 100 nM EPO, 30 min, teplota místnosti

Péptidy z protokolu afinitní selekce (Sekvence ID No:) (Sekvence ID No:) (Sekvence ID No:) ·· 00 00 0 0« 00 • 0 · 0 00« «000

0 «000 0 0 00 0 0 0 0 0 «000 0 000-0 0

0 000 000 1000 0000 00 * 00 00

GGTYSCHFGPLTWVGKPQGG

GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG

Bez kómpetiee

GGDYNCRFGPLTWVCKPSGG (Sekvence ID No) (Sekvence ID No.)

Proti iniobiiizovanému EPO-R se screenovala i další mutagenetická knihovna se šesti rartdomními aminokyselinovými zbytky umístěnými na randomním 8-meru s dvěma postranními cysteinóvymi zbytky: Miitagénetické tužní proteiny společně sje' kódující DNA se “miskovalý” na (mobilizovaném EPQ-R. Poté se tužní proteiny a doprovodná DNA isolovaly a kultivovaly za vzniku preparátů fiizních proteinů pro ELISA pro určení, zda se tužní proteiny vážou na receptor specificky. Preferované peptidy vyšlé z této studie máji sekvenci GGPHHVYACRMGPLTW1C (Sekvence ID No:) a obsahují jadernou sekvenci YX₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X_S (Sekvence ID No:), kde je každá aminokyselina označena standardní jednopísmenovou zkratkou; každé X₂.a X₆ se nezávazně vybírá z jakékoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin iiebo stereoisomemích D-aminokySelin; X₃ je C, A, a-amino-γ-brombutyrová kyselina nebo Hoc, kde Hoc je homocystein; X₄ je R, H, L nebo W; X, je M, F nebo I; £ je D, Ε, I, L nebo V; Jí je C, A, a-amino-γ-brombutyrová kyselina nebo Hoc, kde Hoc je hómocystein, v případě, že buď X₃, něbó X₈jeC nebo Hoc, přičemž jaderná sekvence se na svém amino-kond váže k jednotce šesti aminokyselin, kde se každá aminokyselina nezávazně vybírá z jakékoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin nebo stereoisomemích D-aminokyselin

ÍC₅₀ se počítaly pro několik peptidů obsahujících výše uvedený motiv. Tyto hodnoty sě určily s použitím volného peptidu a.jsou uvedeny níže v Tabulce 5. (Každý z těchto peptidů se nezávislé připravil a ámidovál na C-konci, ale peptidy jsou snadno připravitelné jako volné karboxylové kyseliny nebo estery nebo jiné karboxyamidy).

Tabulka 5

I

Φφ • 9 · 9

9

Φ· • Φ ··*· ΦΦΦΦ

Φ· · *· «Φ • · · ·ΦΦΦ

Φ ΦΦΦ Φ Φ ' ΦΦ

Φ Φ ΦΦΦΦ > ΦΦΦ Φ Φ ΦΦΦ ΦΦΦ • Φ 9 φφ φφ

Peptid		ic₅₀
GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG	(Sekvence ID No.)	1,67 μΜ
GGTYSCHFGPLŤWVCKPQGG	(Sekvence ID No:)	237 nm
GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG	(Sekvence IE) No:)	179 nm
VGNYMCFIFGPITWVCRPGGG	(Sekvence ID No:)	420 nm
GGVÝACRMGPITWVCSPLGG	(Sekvence ID No.)	352 nm
VGNYMAHMGPITWVCRPGG	(Sekvence ID No:)	67 μΜ

— NavfóTŤ prědčfiážejíčíríršérpróvádělý^dálší mutagenetičké studie s touto peptidovou rodinou vysokoafinitních EPO agonistů za podmínek navržených pro obohacení vysokoafínitními peptidy. Jak se popisuje dříve, pro obohacení vysokoafínitními peptidy se knihovny screemijí s použitím protokolu afinitní selekce, kde peptidy kómpetitují s EPO (100 nM). Tento postup se typicky opakuje po dva cykly miskování. V následných cyklech miskování se kompetiční teplota (4 °C až teplota místnosti) a Čas (15 áž 30 minut), stejně jako teplota (4 °C až teplota místnosti) promývacíeh roztoků může měnit pro vyhledávání peptidů s vyšší afinitou. S použitím těchto postupů se screenovala mutagenetická knihovna obsahující tři randoťnní aminokyselinové Zbytky na každé stráně boční sekvence YXCR1GPITWVC proti mobilizovanému EPO-R (viz Obrázek 3). Mutagěnetické íuzní proteiny společně s je kódující DNÁ se opět “miskovaly” na imobilizovaném EPO-R. Potě se íuzní proteiny a doprovodná DNA isolovaly a kultivovaly za vzniku preparátů fuzních proteinů, pro ELISA pro určení, zda sé íuzní¹ proteiny vážou na receptor specificky. Preferované peptidy vyšlé z této studie jsou uvedeny v Tabulce 6, infra.

Tabulka 6

GGQYICRFGPITWQSQPAGGGS

GREYSCRMGPITWVGMPRASLGS

GDYLCSMGPITWICVPERGGGS

ELWYSCRMGPVTWMCGRYQGGGS

V jiné mutagenetické studii se proti imobilizovanému EPO-R screenovala mutagenetická • 0 0« • «0 0

0

0« • · 0 « 0«

0«« « « «

0 « 0 « ·

0 0

00000 0

0 *««« «000 knihovna obsahující silně konzervativní fixované zbytky (tzn. Y, C, G, Ρ, T a W), další randomizované zbytky a 10 dodatečných zbytků na N-konci před tyrosinem (viz Obrázek 4 A). Mutagenetické fuziíí proteiny společně s je kódující DNA se opět “miskovaly” na mobilizovaném EPO-R Poté se fúzní proteiny a doprovodná DNA isolovaly a kultivovaly za. vzniku preparátů fúzních proteinů přo ELISA pro určení, zda se fiížní proteiny vážou na receptor specificky. Preferované peptidy vyšlé z této studie jsou uvedeny v Tabulce 7, infra.

Tabulka?

QlCRADRKGIYQCWYGPETWlCgg ___ __________„.....

QQGYSLWLPWYNCVLGPYTWVCgg

YGGSAAVPWKYGCSLGPVTWVCgg

QlVSWGEYSGYLCMVGPVTWLCgg

GSGALSAAGWYGCRVGPLTWVCgg

SVVSHDAAGVYDCVIGPVTWICgg lYSWTGILGSYVCWYGPDTWVCgg

SClYVRFFYCYQCSEGPATWLCgg

TVAKGQSGVRYSCLRGPETWVCgg

VQPQYKWATMYQCWKGPSTWFCgg

KSGVWEMGSSYQCARGPRTWCCgg

CSVRRMDREYYRCCRGPFTWQCgg

KYQEEMFMGYQCLQGPKTQLCgg

VCPGSEFRVGYICAMGPYTWDCgg

SLCSSRCNSPYFCSIGPSTWRCgg

QASLGLPLKQYLCVLGPHTWLCgg

ACKPAAEFVQYGCVLGPMTWICgg

SCERAGGRWEYVCQWGPDTWLCgg

RVARQVQQVSYWCAHGPATČYCgg

HKYDTLMLTNYVCQRGPLTQLGgg

V další mutagenetické studii šě proti mobilizovanému EPO-R také screenovala mútagenetická knihovna obsahující silně konzervativní fixované zbytky (tzn. Y, C, G, Ρ, T a W), • 0 00 • > · 0 • ·

0'

0 *000 0000 • · 0 0 0 0 ·

0 0 0 0 0 0· • 0000 00 000« · • 0 0 0 0 0 « · · · · 00 další randomizované zbytky a 10 dodatečných zbytku mezi druhým;cysteinem a (Gly)4-Ser spojkou (viz Obrázek 4B). V této knihovně předcházely konzcivativnímu tyrosinovému zbytku dva glyeinové zbytky, umožňující účinné štěpení signálního peptidů. Mutagenetičké fu zní proteiny společné s je kódující DNA še opět “miškovály” na imobilizovaném EPO-R. Potě se fuzní proteiny a doprovodná ĎNA isolovaly a kultivovaly za vzniku preparátů fúzních proteinů pro ELISA pro určení, zda se fuzní proteiny vážou na receptor specificky. Preferované peptidy vyšlé z této studie jsou uvedeny v Tabulce 8, infra.

Tabulka 8 ggYHCEWGPETWICRPEISPLTVMgg ggYÍCDYGPLTWACKPAGATLLQPgg ggYTCRFGPVTWDCLPAINHNGVLgg ggYQ*FMGPETWVCAPEPRVERVSgg ggYLCRFGPETWTCAPERSWTQSgg ggYVCDFGPTTWICRGQVMEHINTgg ggYMCNMGPLTWDCSPVRSTSMAWgg ggYHCEWGPETWICRPEISPLTVMgg ggYNCTMGPNTWVCTPAAESPAVFgg ggYGCRIGPITWICDDVSRSPRA ggYTCRMGPQTWECLPMSEGV ggYNCKFGPQTWDCSSANLKEV gYLCEMGPETWMCRPEDAKLGV ggYGCKFGPVTWICEDLLLDPMY ggYNCKFGPQTWDCSSANLKEVLV gYLCEMGPETWMGRPEDCEAW ggYGCGLAPVTWECPQVSIPYGLSgg ggYGCRIGPTTWlCDSTVPQLREVgg ggYRCSWAPETWVCDNHSA gYLCNEGPITWDCVSSAQSEMQlgg

V ještě další mutagenetičké studii se proti imobilizovariému EPO-R také sereenovala • « *4 ·· • 4 4 4

4 ·

#

444 4444 »· » »4 44 · »44» • 4 4' 4 4 ·« *··· 4 44 4 β 4 » · 4 4 4 ** 4 4· 44 mutagenetická knihovna obsahující silně konzervativní· fixované zbytky (tzn. Y, C, G, P, T a W) sťyrosinem umístěným přímo vedl e ,prvního cysteinu a dalšími aminokyselinami randomizovanými, včetně 4 zbytků N-términálních k tyrosinu a 5 mezi druhým cysteinem a spojkou (viz Obrázek 4C). N-terminálhím randomním aminokyselinám předcházely dva glycinové zbytky, umožňující účinné procesování. Mutageneti.cké fúzní proteiny společně s je kódující DNA se opět “miskovalv” na imobilizovaném EPO-R. Poté se fúzní proteiny a doprovodná DNA isolovaly a kultivovaly Za vzniku preparátů fúzních proteinů pro ELISA pro určení zda se fúzní proteiny vážou na receptor specificky. Preferované peptidy vyšlé z této studie jsou Uvedeny v Tabulce 9, injra. .

Tabulka 9 ggAELQYCKIGPĚTWVCĎWPHlgg ggPYEGYCSGGPVTWECCVSVCgg ggQPLPYCSPGPTTWFCíNWLFgg ggCSYGYCPMGPFTWMCRQRRLgg ggVRGSYCQSGPPTWQCDLRFFgg ggRCARYCACGPGTWNCLGRCQgg ggLGRCYČVYGPLTWWCSQTSLgg ggLCVWYCSAGPWTWYCTYRSAgg ggKPGPYCSFGPETWVCTALGMgg ggRLGEYCElGPITWICRLFLPgg ggPGLGYC.DFGPLTWVCDGSVDgg ggLSSAYCRYGPETWICWAGTGgg ggVLHLYCYYGPETWDCLPIKAgg ggGGGV YCLVGP VTWLCGPAAMgg ggLTRNYCRIGPETWICQEVAIgg ggWSERYCVLGPLŤWECVHLFAgg ggMPLKYCGMGPVTWVCGEAVSgg ggSVMRYCHFGPETWICPYDMPgg ggALYPYCLIGPMTWVCQVGWIgg ggTYGNYCRGGPGTWHCEDTRGgg •fe fefe * · · •fe · ·· fefe • · · · fe · · · fe · · · fe · · · ·· • · · fe fe fefefe· fe fefefe · · fe · fefefe fefefe fefefefe ···· ·· · ·· fefe ggASYČYCSKGPATWKCVGSILgg ggSLAAYCLQGPKTWPC VRRRLgg ggTDSLYCKLGPLTWHCQLYQKgg gl SQQ YC WRGP ATW VCLEWELgg

Navíc k předcházejícím mutagenetickým studiím se prováděla mutageneze peptidu GGTYSCHFGPLTWVGKPQGG s použitím modifikovaného C-terminálního Lac-I displejového systému, ve kterém se redukovala displejová valence s cílem identifikace látek s vyšší afinitou (“Headpiece Dimer”). Lác-I Headpieee Dimer (HPD) displejový systém se detailně popisuje v — .......... ........... ........................... .. -----------. .. . .....i........*.......·. .......................

U.S. patentu No 5,338,665, který je zde začleněn do odkazu. V zásadě zbytky vysoce konzervativní v předchozích mutagénetickýčh studiích (tžn. Y, C, G, P, T a W) še slabě mutovaly, zatímco méně konzervativní zbytky (tzn; H, F, L a V) se mutovaly na vyšší úrovni. Tyrosinovému zbytku předcházely čtyři randomní zbytky á po něm následoval jeden randomní zbytek. C-koncc mutagenetického schématu končil 6 randomními aminokyselinami následujícími po cysteinu. Detaily konstrukce knihovny jsou uvedeny na Obrázku 5.

Knihovna se screenovala během čtyř cyklů na PÍG-tailovartém EPO-R imunobilizovaném na mAbl79, s použitím EPO eluce pro obohacení klony s vyšší afinitou od cyklu dva dále. Výsledně DNA inserty se poté klonovaly jako zásobník do maltózu vážícího proteinového vektoru (MBP) umožňujícího jejich expresi jako C-terminálního fuzního proteinu. Poté se s pomocí ELISA testovalo vázání surových buněčných lyzátu z raňdomně sebraných individuálních MBP íuzriích klonů na EPO-R. Preferované péptidy vyšlé z této studie jsou uvedeny v Tabulce 10, infra.

Tabulka 10

RTKEYSCQMGPLTWICVPKS

SKAŘYMCHMGPLTWVCRPEV

GGKAYMCRLGPVTWVCSPRIKL

LLRGYECYMGPLTWVCRSSKPR

T1AQYICYMGPETWECRPSPKA

NGRTYSCQLGPVTWVCSRGVRR

LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD • · · · φ · « » «φ • · φ * ······ φφφφ φ • · ΦΦΦ φφ« ···♦φφφφ φφ φ Φβ »·

MKTKYKCYMGPLTWVCEGS

SKTKYRCEMGPLTWVCERW

LTRLYSCHMGPSTWVCSTALRK

RGQLYACHFGPVTWVCKRRKRV

SGJLYECHMGPLTWVCTPSRRR

GSKTYSCQLGPVTWVCGRKR

ARGK YQCQFGPETWECLP1RPR

VTRMYRCRMGPLTWVCER

KPSLYECHLGPETWECRPRRRE

RGHMYSGQLGPVTWVCKPESGR

ITPT YHCKFGPQTWVC APKRS ALTK

GNRMYQCHMGPLTWVCQPTRIH

MKTKYKCYMGPLTWVCEGSRLK

HLGKYDCSFGPQTWVCKPRRSL ' ' · . \

ERRVYECQMGPLTWECKPGVKG

ITPT YHCKFGPQTWVC APKRS ALTK

LGRKYSCHFGPVTWVCQPAKKD

RGRG YSCQMGP VTWVCKRERYF

RLREYRCHMGPQTWVCNGHHSK

SGALYDCQMGP1TWVCRANRQK

TNQVYGCKFGPKTWVCKPAPR1

TRGMYACHMGPQTWVCRPTQPR

VLSNYECTMGPKTWVCKPLRLK

Jedním z nejpozoruhodnějších rysů-peptidů získaných s použitím Lac-1 Headpiece Dimer Displejového systému je akumulace multiplitních pozitivních nábojů v oblastech po stranách konzervativních cysteinů, zejména u RGQLYACHFGPVTWVCKRRKRV, který má na C-konci prodloužení 5 takovými zbytky. Lehce mutagenované aminokyseliny (tzn. Y, C, G, P, T a Wj byly absolutně konzervativní, zatímco nové motivy se generovaly v polohách s mnohem vyšší mutací Zajímavá je přítomnost dalšího tyrosinového zbytku v množství peptidů (např. LLRGYEČYMGPLTWVCRSSKPŘ) a přítomnost dvou zbytků kyseliny glutamové mezi cysteiny ·· 9Φ «9 9 · 9 · 9 9

9 9

9 9 9 φ · φ

9 · » · • · 9 9 9 • * · ff 999 » »99 φ 99 9 9 9 u TIAQYÍCYMGPETWECRPSPKA.

Navíc k předcházejícím mutagenetíekým studiím Se prováděla mutageňezé peptidu T1AQYIGYMGPETWEGRPSPKA s použitím modifikovaného C-těrmináiního Lac-1 displejového systému, podobného Systému popsanému výše. Zbytky vysoce konzervativní v předchozích mutagenetických Studiích (tzn. Y, C, G, P, T a W) še fixovaly, zatímco měně konzervativní zbytky (tzn. H, F, L a V) se randomizovaly. Navíc se slabé mutovaly dva zbytky glutamové kyseliny Tyrosinovému zbytku předcházely čtyři randomní zbytky a po něm následoval jeden randomní zbytek. C-konec mutagenetickcho schématu končil 6 randomními aminokyselinami následujícími po cysteinu. Detaily konstrukce knihovny jsou uvedeny na Obrázku 6.

Knihovna se screenovála během tři cyklů ňa PÍG-táilovaném EPO-Rimunobilizovaném na mAbl79, s použitím EPO eluce pro obohaceni klony s vyšší afinitou od cyklu dva dále. Lifty kolonií se provedly testováním s lidským Fcy-EBP činidlem následovaným kozím anti-lidským Fcy korijugovaným s alkalickou fosfatázou, dostupnou od Sigma Chemical Co , St. Louis, Missouri. Poté se identifikované HPD plasmidy sekvenovaly. Peptidy vyšlé z této studie jsou uvedeny v Tabulce 11, infra.

Tabulka 11

ALKKYDCYFGPETWECLARRPH

ERRFYKCRFGPEŤWECTL

FGQEYRCHLGPETWQCSPVRVG

FRPEYMCRMGPETWECGGARP

GSRKYwCRMGPETWECMKPVRL

GLKAYGCRYGPETWDCRSVILI

IRQPYíCHMGPEŤWECGRYPÁG

KGASYHCIMGPETWECIPQRVW

MKQLYSCÍMGPETWECRPGVER

QRHYYRCALGPETWECRPMSPE

TKRLYHCHMGPETWECHGPMRK

TRPSYRCAFGPVTWECIPAR

RHKSYvCTFGPETWECTGAIRR

RGRMYNCRMGPETWÉCKGQSKD

4 (* ·4 4 • 4 · 4 4

4 4 4

4 4 4 4 • Β 4 4

444 4444 44 ·· 44

4 4 9 • · 4 44

444 «444 4

4 · Η • «· 44

VQKKYLCHFGPETWECGPDRD

WQTWY1CERGPETWECRWLVL

Předcházející zásobník peptidových sekvencí se poté klonoval do maltózu vážícího proteinového, vektoru.(ΜΒΡ) umožňujícího jejich expresi jako C-terminálniho fuzniho proteinu. Poté se s pomoci ELISA testovalo vázaní surových buněčných lyzátů z randomně sebraných individuálních MBP fuzních klonů na EPO-R.· Preferované peptidy vyšlé ž této studie jsou uvedeny v Tabulce 12, irifra.

Tabulka 12

RSMWYRCQMGPQTWVCGPRSAS

SRREYICHLGPQTWVCGPGGRK

GSPSYHCHLGPLTWVCKPHRMR

MVGRYQCHMGPRTWVCKPWHG

GTARYQCHEGPLTWVCKPSLKG

ELRGYICHFGPVTWVCKPNGSR

LKQGYQCQLGPQTWVCRPLRMP

KERKYECQFGPRTWVCQPTRAN

VRKVYACHMGPVŤWVCVPGYKG

SGQRYVCRMGPETWVCRSYRGL

ERRSYSCQMGPVTWVCGRQMGQ

VKNNYRCQFGPVTWVCKAFR

SGASYDCQMGPITWVGRANRQK

Representativní peptidy, které se vázaly specificky na EPO-recéptor, sé také testovaly v buněčných funkčních testech, Jeden test používal FDČP-1, kuřecí multipotenciální primitivní hematopoétickou progenitorovóu buněčnou linii dependentní na růstovém faktoru (např. Děxter

9 · • 999 ·· 99 • 444 * · · • 9 9«

9 9 • 999 444«

49 «4 4 »99

9 9 4 β

4 4

99 et al. (1980)7. Exp: Med. -152, 1036-1047) jako parentální buněčnou linii. Tato buněčná linie může prOfiferoyat, ale nedifereneiuje,když je doplněna WEHI3-k0hdieióvaným médiem (médium obsahuje IL-3, ATCC.číslo T1B68). Párentálňí buněčná linie se transfektuje s lidským nebo kuřecím EPO-R jak se popisuje mže, za vzniku FDCP-l-hEPO-R nebo FDCP-l-mEPO-R buněčně linie. Tyto transfektované buněčné linie mohou v přítomnosti lidského nebo kuřecího EPO proliferovat, ale nediferenciují.

Buňky v.přítomnosti nezbytných růstových faktorů narůstají do pqlostacióňámí hustoty. Buňky se poté promývají PBS a ponechají v nedotčeném médiuBez růstových faktorů 16 až 24 hodin. Po určení schopnosti růstu buněk se připraví zásobní roztoky (v nedotčeném médiu bez růstových faktorů) o 10⁵ buňkách na 50 μΐ. Sériová ředění testovaných látek (typicky volný peptid v roztoku v kontrastu s peptidem vázaným na fág nebo jinak vázaným nebo imohilizováným) se provádějí na 96-jamkových kultivačních miskách na konečný objem 50 μΐ na jamku. Do každé jamky se přidají buňky (50 μΐ) a iňkubují se 24 až 48 hodin, kdy dochází u negativní kontroly k úmrtí nebo ke StayU klidu. Buněčná proliferace se poté měří technikami v oboru Známými, jako test MTT, který koreluje s inkorporací ³H-thymidinu jako indikací buněčné proliferace (Mosmann (1983) J Immunol. Methods 65, 55). Obrázek 7 ukazuje výsledky tohoto testu pro EPÓ a pro peptidy uvedené výše v Tabulce 5. Peptidy, které se vážou na EPO receptor a vykazují aktivitu pri FDCP- 1/hEPO-R buněčném biotestu, jsou preferované látky podle vynálezu.

Druhý buněčný test využívá TF-1 buněčnou linii (Kitamura et al. (1989) Blood 73, 375-380, zde zařazeno do odkazu). Representativní výsledky ukazuje obrázek 8 Obrázek 8 ukazuje vliv EPÓ a volného peptidu VGNYMCHFGPITWVCRPGGG (Sekvence ID No:) na buněčnou proliferaci buněčné linie TF-1.

Další buněčný test, dále iluštnijí.cí schopnost látek podle vynálezu působit jako EPO agonisté, jé založen ná inkorpřaci ³H-thymidinu do Slezinných buněk myší Vystavených působení fenylhydrazinu. Výsledky tohoto testu ukazují obrázky 9A až 9C.

Jsou popsány další biologické testy, použitelné pro demonstraci aktivity látek podle předkládaného vynálezu: Greenberger et al. (1983) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, 2931-2935 (EPO-dependentní hematopoetická progenitoiová buněčná linie); Quelle a Wojchowski (1991) J. Biol. Chem. 266, 609-614. (fosforylace tyrosinu proteinu BóSUt.EP buněk); Dusanter-Fourt et al. (1992)7. Biol. Chem. 287, 10670-10678 (fosforylace tyrosinu EPO receptorů v lidských EPO-responsivních buňkách); Quelle et al. (1992) 7. Biol. Chem. 267, 17055-17060 (fosforylace ·· · • · · • « · · ·♦ ·· * · A · * « ·· ·· ··· » <

A * í *· ·· tyrosinu cytosolového proteinu (ppi00) v FDC-ER buňkách); Worthington et al. (1987) Exp. Hemalol. 15, 85-92 (kolorimetrický test na hemoglobin); Kaiho a Miuno (1985) Anal. Biochem. 149, 117-120 (detekce hemoglobinu 2,7-díaminofluorenem); Patel et al (1992) J Biol. Chem. 267, 21300-21302 (exprese c-/«y/>); Witthuhn et ál. (1993) Cell 74, 227-236 (asociace a fósforylace tyrosinu JAK2); Leonard et ál. (1993) Bloód 82, 1071-1079 (exprese GATA transkripČníchfaktorů); Ando et al. (]993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90, 9571-9575 (regulace G,/3 transice cyklením D2 a D3); a tok vápníku, vše je zde zahrnuto do odkazu.

Přístroj navržený Molecular Devices Cořp., známý jako mikrofysiometr,byl úspěšně použitý pro měření účinku agonistů a antagonistů na různé receptory. Základem tohoto přístroje je měření alterácí při rychlosti acidifikace extracelulárního média jako odpověď na aktivaci receptoru.

Podle výhodného provedení se peptidy podle předkládaného vynálezu dimerizují nebo oligomerizují za zvýšení afinity a/nebo aktivity hlavních zdě popsaných látek. Pro studium vlivu dimerizace/oligomérizaee peptidu na EPO mimetickou schopnost při testech buněčné proliferace se připravil analog GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG biotinylovaný na C-konci (tzn. GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin)).

Peptid se inkuboval sé streptavidinem v PBS v molárnim poměru 4:1 při teplotě místnosti jednu hodinu. Poté se komplex podrobil pro určení 1C_SO vazebnému testu na PIG-tailovaném EPO-R. Peptid někomplexovaný se streptavidinem se podrobil stejnému experimentů. U prekomplexovaného peptidu se zjistila IC_ÍO 20 nM, u peptidu neinkubovaného se streptavidinem byla IGjq 350 nM. Tento více iiež desetinásobný nárůst zjevné aktivity je pravděpodobně způsoben multivalentnim stavem komplexu peptidu sé strepatvidinem. Protože toto srovnání se provádělo s použitím koncentrace volného peptidu a ne s efektivní koncentrací komplexu (teoreticky 4x jiizŠí), byl by účinek ještě vyšší. _

Dále se peptid preinkuboval se streptavidinem v HEPES bez séra pufřovaném RPMI při molárnim poměru 4:1, viz výše. U komplexu se testovala stimulace buněčné proliferace FDCP-l/hEPO-R těstem volného GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin) a něbiotinylovaňého parentálního peptidu (tzn. GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG). Obrázek 10 ukazuje výsledky těstu, kde EPO-ED_5I) volných peptidu byly podobně (1 μΜ), ale přeformovaný streptavidinový komplex měl méně než 10 nM, redukce EPO-ÉD₅₀ o dva logaritmy. Samotný streptavidin měl mdlý stimulační efekt při nejvyšších koncentracích, pravděpodobně v důsledku • · · ♦ · · · · · » * · · · · · a * ·« * · ♦ 9 9999 9 ··· a * • · · ♦ · « fc ···» ttoaa ·« · «· kontaminace bakteriálním endotoxinem.

Při dimerizáci peptidu s kozím anti-biótinovým IgG byl pozorován, nárůst biologické účinnosti. Obrázek 11 ukazuje, že snížení EPO-ED₅₀ o jeden logaritmus se dosáhlo také preinkubací GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin) s purifikováňým kozím anti-biotinovým IgG při molárním poměru 2:1. Tento nárůst biologické účinnosti je pravděpodobně způsoben dimerizáci peptidu protilátkami. Samotné antibiotinové protilátky neměly na buňky žádný vliv. U komplexu GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin) se streptavidinem bylo pozorováno 100-riásobné snížení F.PO-ED₅₀ Ták se může dimerizáci nebo oligomerizací hlavních peptidu podle předkládaného vynálezu zvýšit afinita á/nébo aktivita těchto

V jiném provedení se podle obecného schématu ukázaného na Obrázku 12 připravil dimemí peptidový analog GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG obsahující dvě disulftdické vazby.

První peptidový řetězec se sestavil na nosiči Tentagel. Fmoc-Lys(Alloc) se připojil ke Knorrově spojce, Alloc skupina se použila jako orthogoňálni chránící skupina. Pro první peptidový řetězec se použil Cys(Acm). Po sestavení prvního peptidového řetězce se Alloc Skupina odstranila a vystavěl se druhý peptidový řetězec na ařriinu bočního řetězce lysinového zbytku. U tohoto peptidového řetězce se použil Čys(trt). Po ukončení syntézy se peptid odštěpil z nosiče a čistil.

Peptid se poté cyklizoval za vzniku látky obsahující jednu disulfidickou vazbu. Druhá disulfidická vazba sě poté vytvořila oxidací jodem za vzňiku bicyklického dimeru.

P Obrázky 13 a 14 ukazují iň vitro EPOŘ navázání a biologické aktivity dimeru. Afinita dimeru se testovala proti PIG-tailovanemu EPOR imobilizůvaňém na mAbl79 ve strip-jamkách.

Výsledek testu rovnovážné kompetiční vazby indikoval afinitu 2 nM, 200x větší než u , páťeňtálníhů peptidu GGTYSGHFGPLTWVCKPQGG (200 nM) a 5x větší ňéž u GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotin) komplexu se Streptavidinem. Bioaktívita in v/íro měřená buněčnou proliferací FDCP-l/hEPOR še zvýšila 20x oproti EC_S0 400 nM pro pafentální peptid ha 20 ňM. Tak se může dimerizáci nébo oligomerizací hlavních peptidů podle předkládaného vynálezů podstatně zvýšit afinita a/nebo aktivita těchto peptidů.

Peptidy podle vynálezu nebo jejich deriváty se mohou konjugovat s látkami vážíčími EPO-R za vzniku látek š afinitou pro receptor větší než látky tvořící dané konjugáty Objev těchto peptidů také usnadňuje identifikaci peptidů vážících se na shodnou stranu na EPO-R, protože se může ovlivnit knihovna nebo miskovaci procedura pro eliminaci peptidů s komplementárním ' ...........‘ - ................

·· ·Λ *« * · · · t · * 9 9 9 • · · 4 « » 9 9

9999 9999 99

99 99 • · · « « • · » · >

···· 4 *··« « • * · · • 99 99 “neblokovacím” motivem.

Výhodný motiv sekvence také poskytuje prostředky k určení minimální velikosti EPO agonistů podle vynálezu. S použitím systému “kódované syntetické knihovny” (ESL) popsaném v. U.S. patentové přihlášce série No. 946,239, zaregistrované 16. září 1992, která je pokračováním přihlášky série No. 762,522, zaregistrované 18. Září 1991, nebo systému “syntézy na impbilizovaném polymeru ve velmi velkém měřítku”, popsaném v US. patentové přihlášce série No. 492,462, zaregistrované 7. března 1990; 624,120, zaregistrované 6. prosince 1990; a 805,727, zaregistrované 6. prosince 1991; sé může nejen určit minimální velikost peptidu š takovou aktivitou, ale také vytvořit všechny peptidy tverid-'skupinu pěpíidů, která se liší ód výhodného, motivu (nebo minimální velikosti daného motivu) v jednom, dvou nebo více zbytcích Tato sada peplidů se může třídit podle Schopnosti vázat se na EPO receptor. Tento systém syntézy na zmobilizovaném polymeru nebo další metody Syntézy peptidu se používají pro syntézu' všech zkrácených analogů á všech delečnieh analogů a všech kombinací zkrácených a delečních analogů peptidových látek podle vynálezu

Peptidy podle vynálezu še také připravují klasickými metodami známými v oboru, například s použitím standardních technik na pevné fázi. Standardní metody Zahrnují exkluzivní syntézu na pevné fázi, metody parciální syntézy na pevné fázi, kondenzaci fragmentů, klasickou syntézu v roztoku a techniku rekombinantní DNA (Merrifield (1963)7; Am. Chem. Soc. 85, 2149, zde začleněno do odkazu). Při syntéze na pevné fázi syntéza peptidu začíná od Č-konce s použitím α-aminóchráněného nosiče. Vhodná výchozí látka se připraví například připojením požadované «-aminokyseliny na chlormethylovaný nosič, hydroxymethylovaný nosič nebo benžhydrylaminový nosič. Bio Rad Laboratories, Richmond, CA prodávají chlormethylovaný nosič pod obchodní značkou Bl O-BE AD S SX-1, přípravu hydroxymethylovaného nosiče popisuje Bodonsžký et al. (1966), Chem. Ind.. (London) 38, 1597 Benžhydrylaminový nosič (BHA) popisuji Pietta a Marshall (1970) ChemCommun. 650, nosič je komerčně dostupný od Beckman Instruments, lne., Palo Alto, CA, jako hydrochlorid.

Látky podle vynálezu se připravují spojením α-amino Chráněných aminokyselin s chlormethylovaným nosičem s pomocí například katalyzátoru hydrogenuhličitanu česného podle způsobu, který popisuje Gisin (1973) Hélv. Chim. Acia 56, 1467. Po iniciačním navázáni se odstraní α-aminochránící skupina působením roztoků činidel jako trifluorooctová kyselina (TFA) nebo kyselina chlorovodíková (HCl) v organických rozpouštědlech pri teplotě místnosti.

··· 9 α-Aminochránicí skupiny jsou známě a používané v oboru syntézy peptidu krok za krokem. Zahrnují chránící skupiny aeylového typu (nápř. formyl, trifluoróačetyl, acetyl), chránící

9

9* • » · · 9 « « * 9 9 · 9 9 • · * 9 9 ··· • · «99

HM ·<«· ·« « *9 skupiny typu aromatického urethánu (např. beiizyloxykařbonýl (Cbz) a substituovaný Cbz), chránící skupiny typu alifatického urethánu (např. t-butyloxykarbonyl (Boc), išopropyloxykarbonýlfGykiohexyloxykarboríýl) a chránící skupiny alkylovčho typu (např, benzyl.

trifcnylmethyl). Výhodná chránící skupina jc Fmoc Chránící skupiny pro postranní řetězce (ethery, estery, trityl, PMC a ták podobně) zůstávají intaktní během navazování a neštepí se během dcprotekce chrániči skupiny na amino-konci nebo během navazování. Chránící skupina pro post oanní· řetězec musí být odstranitelriá po. ukončerií syntézy finálního peptidu a za podmínek,.

které nemění cílový peptid.

Chránící skupiny pro postranní řetězec Tyr Zahrnují tetrahydropyranyl, tert.-butyl, trityl, benzyl, Cbz, Z-Br-Cbz a 2,5-dichlorbenzyl. Chránící skupiny pro postranní řetězec Asp zahrnují benzyt 2,6-dichlorbenzyl, methyl, ethyl a cyklohexyl. Chránící skupiny pro postranní řetězec Thr a Ser zahrnují acetyl, benzoyl· trityl, tetrahydropyranyl, benzyl, 2,6-dichlorbenzyl a Cbz. Chránící skupinou pro postranní řetězec Thr a Ser je benzyl. Chrániči skupiny pró postranní řetězec Arg zahrnují nitro, Tosyl (Tos), Cbz, adamantyloxykarbonyl, měsitylšulfonýl (Mts) nebo Boc. Chránící skupiny pro postranní řetězec Lys zahrnují Cbz, 2-chlořbenzyloxykarbonyl (2-Gl-Cbz), 2-brombcnzyloxykarbonyi (2-Br-Cbz), Tos nebo Boc

Po odstranění a-aminochránící skupiny se postupně navazují zbývající chráněné aminokyseliny v požadovaném pořadí. Obecně každá chráněná aminokyselina reaguje v trojnásobném přebytku s použitím odpovídajícího aktivátoru karboxylové Skupiny jako 2-(ÍH45enzotriazol-l-yl)-í,13,3-tétramethyluroniumhexafluorofošfátu (HBTU) nebo dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) v roztoku, například ve směsi methylenchloridu (CH₂CL), dimethylformamidu (DMF).

Po ukončení.žádané aminokyselinové sekvence se požadovaný peptid odštěpí od nosiče působením činidla jako trifluorooctová kyselina (TFA) nebo fluorovodík (HF), které nejen štěj)í peptid z nosiče, ale také štěpí zbývající chránící skupiny na postranních řetězcích. Při použití chlormethylovaného nosiče veďe působení fluorovodíku ke vZniku volných kyselin peptidu. Při použití benzhydrylaminového nosiče vede působení fluorovodíku přímo ke vzniku volného amidu peptidu. Alternativně se při použití chlormethylovaného nosiče může odštěpit peptid s chráněným postranním řetězcem působením amoniaku na nosič s peptidem za vzniku požadovaného amidu β φ φφ φ

«* φ • · φφφφ «φφφ φ

• · · φ ’« · • φ · φ φ φ φ φφφφφ · φφφ* • φ · φ φ «φ · Φ· κs chráněným postranním-řetězcem, nebo působením alkylaminu za vzniku alkylamidu nebo dialkylamidů s chráněným postranním řetězcem. Odstranění chránění postranního řetězce se poté provádí obvyklým postupem působením fluorovodíku za vzniku volných amidů, alkylamidu nebo dialkylamidů.

Při přípravě esterů podle vynálezu se používají nosiče pro přípravu peptidových kyselin a peptid š chráněným postranním řetězcem sě Štěpí bází a odpovídajícím alkoholem, tzn. methanolem. Odstranění chránících skupin postranního řetězce se poté provádí obvyklým postupem působením fluorovodíku za vzniku žádaného estem. Procedury Syntézy peptidů ria pcvňe faZi jsou v oboru dobře známy a dále je popisuje atéwatt_r Soiig Phqse Pepiide Syníheses, (Freeman and Co., San Francisčo, 1969).

Tyto postupy jsou také použitelné při syntéze peptidů s jinými než 20 přirozeně Se vyskytujícími aminokyselinami, geneticky kódované aminokyseliny se substituují v jedné, ve dvou nebo více polohách jakékoliv látky podle vynálezu. Například tryptofan může být nahrazen naftylalanincm usnadňujícím syntézu. Další syntetické aminokyseliny v peptidech podle předkládaného vynálezu zahrnují L-hydroxypropyl, L-3,4-dihydr()xyfeiiy]alanin, ó-amínokyseliny jakoL-5-hydroxylysyl a D-6-methylalanin, L-a-metbylalanin, β-aminokyseliny a isochinóiyl. Do peptidů podle předkládaného vynálezu jsou začlenitelné i Ď-aminokyseliny a nepřirozeně se vyskytující syntetické aminokyseliny.

Přirozeně se vyskytující postranní řetězce u 20 geneticky kódovaných aminokyselin (nebo D-aminokysělin) jsou nahraditelně jinými postranními řetězci, například skupinami jako alkylové, nižší alkylové, cyklické 4-, 5-, 6- až 7-členné alkylové, amidově, amidové nižšího alkylu^ dialkylamidové (nižšího alkylu), nižší alkoxy, hydroxy, karboxy a nižší esterové deriváty, a 4-· 5-, 6- až 7-členné heterocykly. Zejména jsou použitelné prolinové analogy. ve kterých se velikost knihu prolinového zbytku mění z 5-členného na 4-, 6- nebo 7-člcnný. Cyklické skupiny jsou nasycené nebo nenasycené, nenasycené pak aromatické něho hearomatičké.

Cyklické skupiny jsou nasycené nebo nenasyceně, nenasycené pak aromatické nebo nearomátické. Heterócyklické skupiny s výhodou obsahují jeden nebo více dusíkových, kyslíkových a/nebo sírových heteroatomů. Příklady takových Skupin zahrnují furazanyl, furyl, imidazolidinyl, imidázolyl, imidazolinyl, isothiazolyl, isoxazolyl, morfolinyl (např. mórfolino), oxazoíyl, piperazilýl (např. 1-pipétázinyl), piperidyl (např. 1-piperidyl, piperidino), pyranyl, pyrazinyl, pyrazoíidinyl, pyrazolinyl, pyrazolyl, pyridazinyl, pyridyl, pirimidinyl, pyrrolidinyl (např.

• ·

0« • > 0

0 ··· ♦ 0 « • « «· · * 0 0 0 i · ί · • 0 4 0 · • 00 «0 « «· 0

-pyrrolidinyl), pyrrol iny!, pyrrolyl, thiadiazolyl, thiazolyl, thienyl, thiomorfolinyl (např. thiomorfolino) a triazolyl. Tyto heterocyklické skupiny mohou být nesubstituované nebo substituované V případě substituované skupiny může být substituentem alkyl, alkoxyl,. halogen, kyslík nebo nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl.

Peptidy podle předkládaného vynálezu se mohou modifikovat fošforylací, další způsoby přípravy derivátů peptidů podle předkládaného vynálezu popisuje Hrubý et al⁴³ Peptidové látky podle vynálezu tak slouží jako základ přo přípravu peptídových mimetik s podobnou biologickou aktivitou.

PepíiuOvé látky podle vynálezu včetně pepíitioyých ntimétik še. mohou koyaientnL modifikovat s jedním nebo víee různými neproteinovými polymery, např. polyethylenglykolem, pólýpropylenglykolém nebo polyoxyalkeny, způsobem popsaným v U. S. patentu No. 4,640,835; US. patentu No. 4,496,689; U.S. patentu No. 4,301,144; UiS. patentu No. 4,670,437; U.S. páténtu No. 4,791,192; nebo v U.S. patentu No. 4,179,337, všechny jsóu zde čele zařazeny do odkazu.

Odborníci v oboru znalí vědí, že pro přípravu peptídových mimetik se stejnou nebo podobnou biologickou aktivitou jako odpovídající peptidová látka ale s výhodnější aktivitou než peptid co se týče rozpustnosti, stability a náchylnosti k hydrolýze a proteólýze, jsou dostupné různě techniky (např. Morgan a Gainor (1989) Ami. rep. Med Chem. 24, 243-252). Níže jsou popsány způsoby přípravy peptídových mimetik modifikovaných na N-těrminální aminoskupině, na C-terminální karboxyskupine a/nebo se změnou jedné nebo více amidových vazeb v.peptidu na neamidové vazby. Rozumí Se, že v jedné peptidové mimetické struktuře se mohou vyskytovat dvě nebo více takových modifikací (např. modifikace C-terminální karboxyskupiny a inkluze -CH,- karbamátové vazby mezi dvě aminokyseliny v peptidu).

Peptidy se typicky syntetizují jako volná kyselina, ale jak se popisuje výše, mohou být snadno připraveny jako amid nebo ester. Také se může modifikovat amino a/nebo karboxy-terminus peptídových látek podle vynálezu za vzniku jiných látek podle vynálezu. Modifikace na aniino-terminu zahrnují methylaci (tzn. -NHCH-, nebo -NH(CH₃)₂), acetylaci, připojení karbobcnzoylové skupiny nebo blokace amíno-terminu jakoukoliv blokovací skupinou obsahující karboxylátovou fimkci definovanou jako RCOO-, kde R se vybírá ze skupiny zahrnující naftyl, akridinýf steroidyl a podobné Skupiny. Modifikace na karbóxy-terminu zahrnují nahrazení yolné kyseliny karboxyamidovou skupinou nebo vznik cyklického laktamu na karboxy-terminu ·« ·· · 4 • · v

#

0 0 0

0000 >00 0 «

0- 0 0 * 0 0 0* * «00*0 0·0

0« t «« » • 0 «Φ pro zavedeni strukturální, zábrany.

Modifikace na amino-terminu jsou uvedeny výše a zahrnuji alkylací, acetylaci, připojení karbobenzoylóvé skupiny, vytvořeníSůkcinimidové skupiny atd. Specificky může N-terminální aminoskupina reagovat:

(a) za vytvoření amidové skupiny ó vzorci RC(O)NH-, kde R je definovaný výše, reakcí s halidem.kyseliny (např. RC(O)Cl) nebo anhydridem kyseliny. Reakcese typicky provádí smícháním ekvimolámího množství nebo nadbytků (např. 5 ekvivalentů) halidu kyseliny s peptidem v inertním rozpouštědle (např. dichlormethanu) s výhodou obsahujícího nadbytek (např.

IQ ekvivalentů) terciárního aminu, jako diiscprópylethyíamin, pro vychytání kyseliny generované během reakce. Reakční podmínky jsou dále konvenční (teplota místnosti, 30 minut) Alkylace terminálního aminu za vzniku nižším alkylem N-subštítuované látky následovaná výše popsanou reakcí halidu kyseliny poskytne N-alkyl amidovou skupinu o vzorci RC(O)NR-;

(b) za vytvoření sukcinimidově skupiny reakcí se sukcinanhydridem. Jak se popisuje výše, používá se ekvimolární množství nebo nadbytek súkcinanhýdridu (např. 5 ekvivalentů) a aminoskupina se převede ná sukcinimid způsoby v oboru známými včetně použití nadbytku (např; 10 ekvivalentů) terciárního aminů, jako diisopropylethylamin, v inertním rozpouštědle (např. dichlormethanu). Viz např. Wollenberg et al. US. patent No 4,612,132, zde cele uvedený v odkazu. Rozumí se, že sukcinováskupina může být substituována, např. C₂-C₆ alkylovými nebo -SR substituenty, které se připravují konvenčními postupy za vzniku substituovaného sukcinimidů na N-terminu peptidu. Takové alkylové substituenty se připravují reakcí nižšího olefiňu (C₂-C_É) s maleinanhydridem způsobem, který popisuje Wollenberg et al., viz výše, -SR substituenty se připravují reakcí R SH s maleinanhydridem, kde R se definuje výše;

(c) za vytvoření benzyloxykarbonyl-NH- nebo substituované benzyloxykarbonyl-NHskupiny reakcí ekvivalentního množství nebo nadbytku Cbz-Cl (tzn benzyloxykarbonylchlorid) nebo substituovaného Cbz-Cl ve vhodném inertním rozponštědíe (např. dichlormethanu) s výhodou Obsahujícího terciární amin pro vychytání kyseliny generované během reakce, (d) za vytvoření sulfonamidové skupiny reakcí ekvivalentního množství nebo nadbytku (např. 5 ekvivalentů) R-S(O)₂CI ve vhodném inertním rozpouštědle (dichlormethanu) pro převedení terminálního aminu na sulfonamid, kde R se definuje výše. Inertní, rozpouštědlo s výhodou obsahuje nadbytek (např. 10 ekvivalentů) terciárního aminu, jako diisopropylethylamin, pro vychytání kyseliny generované během reakce. Reakční podmínky jsou jinak konvenční (např.

« *·»» 44··

4« * 4 • · t * b 4 • 4 ·· teplota místnosti, 30 minut).

(é) za vytvoření karbamátové skupiny reakcí ekvivalentního množství nebo nadbytku (např. 5 ekvivalentů) R-OC(O)Cl nebo R-OC(O)OC₆Hfp-NO₂ ve vhodném inertním rozpouštědle (např. dichlormethanu) pro převedení terminálniho aminu na karbamát, kde R se definuje výše. Inertní rozpouštědlo s výhodouobsahuje nadbytek (např.'10 ěkvivaleňťůýterěiárňíhó aminu, jako diisopFOpyléthylamin, pró vychytání kyseliny generované během reakce. Reakční podmínky jsou jinak kohvériční (např. teplota místnosti, 30 minut); a (f) za vytvoření urea-skupiny reakcí ekvivalentního množství nebo nadbytku (např. 5 ekvivalěnťů) R-N=C=O ve vhodném inertním rozpouštědle (např. diéihlormethanu) pro převedeni terminálniho aminu na urea-skupinu (tzn.RNHC(O)NH-), kde R se definuje výše. Inertní rozpouštědlo s výhodou obsahuje nadbytek (např. 10 ekvivalentů) terciárního aminu, jako diisópropyléthylamin. Reakční podmínky jsou jinak konvenční (např. teplota místnosti, 30 minut).

Dodatečně nebo alternativně se může modifikovat C-terminus. Při přípravě peptidových mimctik, kde je C-terminální karboxylová skupina nahrazena esterem (tžn. -C(O)OR, kde R se definuje výše) Se používají nosiče pro přípravu peptidových kyselin a peptid s chráněným postranním řetězcem se štěpí bazicky s odpovídajícím alkoholem, např. methanolem. Chránící skupiny se z postranního řetězce odstraňují obvyklým způsobem působením fluorovodíku za vzniku žádaného esteru.

Při přípravě peptidových mimetik, kde je C-terminální karboxylová skupina nahrazena amidem -C(O)NR³R⁴, se jako pevhý nosič pro syntézu peptidů používá benzhydrylaminový nošič. Po ukončení syntézy se působením fluorovodíku při odstraňování peptidu z nosiče získá přímo volný peptidový amid (tzn. -C(O)NH₂ na C-terminu). Alternativně použití ehlorómethylovaného nosiče během peptidové syntézy společně s působením amoniaku při štěpení peptidu s chráněným postranním řetězcem z nůsiče vede k získání volného peptidového amidu, reakce s alkylaminem nebo dialkylaminem poskytuje alkylaffiid nebo dialkylamid s chráněným postranním řetězcem (tzn. -C(O)NRR^! na C-terminu, kde R a R še definují výše). Chránění postranního řetězce se pote odstraňuje obvyklým způsobem působením fluorovodíku za vzniku volných amidů, alkylamidů nebo dialkylamidů.

V jiném alternativním provedení se může C-terminální karboxylová skupina nebo

C-terminálni ester cyklizovat interním nahrazením -OH karboxylové skupiny nebo -OR esteru

N-terminálm aminoskupinou za vzniku cyklického peptidu. Například po syntéze a štěpení za ·· ·· * · · · • · * · ··»·«ί·* φφ φφ ϊ · · · • φ φφ φφφφ · • φ « «φ φ· « · · • φφφ • φ 4«φφ • φ φ φ· Φ vzniku peptidové kyseliny se volná kyselina převede na aktivovaný ester působením např. v didilormethanových (GHjCy, v diméthyllormamidovych (DMT) směsích Cyklický peptid se poté vytváří vnitřním nahrazením aktivovaného esteru N-terminálnim aminem. Interní cykližace, na rozdíl ód polymerizace, se Urychluje použitím velmi zředěných roztoku. Takové méťoďý jsou v oboru dobře známy.

Pro snížení náchylnosti péptidu podle vynálezu k proteázám nebo pro restrikci konfórmace peptidů, se peptid může cyklizovat, nebo se může na konec peptidů zařadit desamino- nebo ^deskarboxv-zbvtek,.takže.chvbítenninainiaminonet)okarbox\iová skupina. C;termináiňi funkční skupiny látek podle předkládaného vynálezu zahrnují amid, amid nižšího alkylu, dialkýlamid (nižšího alkylu), nižší alkoxylové, bydroxylové a karboxylové a nižší esterové deriváty a jejich farmaceuticky přijatelné sole.

Další metody pro přípravu peptidových derivátů látek podle předkládaného vynálezu popisuje Hrubý et al. (1990) Biochem. J. 268(2), 249-262, zde zařazeno do odkážu. Peptidové látky podle vynálezu také slouží .jako strukturní modely pro nepeptidické látky s podobnou biologickou aktivitou. Odborníci v oboru znalí vědí, že pro přípravu látek se stejnou nebo podobnou žádanou biologickou aktivitou jako hlavní peptidové látka, ale s výhodnější aktivitou co se týče rozpustnosti, stability a náchylnosti k hydrolýze a proteolýze než má hlavni peptiďová látka, jsou dostupné různé techniky . (Morgan a Gainor (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24, 243-252, zde zaraženo do odkazu). Tyto postupy nahrazují peptidovou kostru kostrou složenou z fosfonátů, amidátů, karbamátů, sulfonamidů, Sekundárních aminů a N-methylaminokyselin.

Peptidové mimetika, kde je jedna nebo více peptidových vazeb [-C(O)NH-] nahrazeno vazbami jako -CH₂- karbamátovou, fosfonátovou, -£H -sulfonamidovou, urea-vazbou, sekundárním aminem (-CH₂NH-) a alkylovanou peptidovou vazbou [-C(O)NR⁶-, kde R⁶ je nižší alkylj, se připravují bčněni konvenční Syntézy peptidů pouze substitucí aminokyselinová n/\iř£khn oin-iťllo ......vnv vjimuíu vhodně chráněným aminokyselinovým analogem na odpovídajícím místě během syntézy.

Vhodná Činidla zahrnují například aminokyselinové analogy, kde se karboxylové skupina aminokyseliny nahradila skupinou vhodnou pro přípravu výše zmíněných vazeb. Například při nahrazeni -C(G)NR- vazby v peptidů -CH₂- karbamátovou vazbou (-C$ ÓC(O)NR-), se karboxylové skupina (-COOH) vhodně chráněné aminokyseliny nejdříve redukuje na -CH₂0H skupinu, která se poté převede konvenčními způsoby na -OC(O)C1 skupinu nebo

J ί*· • i tj ,

W I yl i * t t . * 4 * 94 « «

O* 1« • « ♦*: 4 k 4 t «4. 44*4 *9 9 ií 4 4 & 9 Í * •37 p-nitrokarboiíátovouOCCOjO-CJL-p-NO,. Reakce takových funkčních skupin s volným ammem nebo alkylovanýmaminem na N-términu Částečněkonstruovaného. p ěpti du ná pevném nosiči veď ě ke vznikh -CH₂OG(O)NR- vazby. Detailnější popis vzniku -CH₂- karbamátové vazby popisuje Gho étáL^Ú993) iyc/éhci?. 261,¹1303-1305:4 C»- * *·*· ··» t κί*Λ*'*< 1 i '.Podobně šě popisuje nahrazení amidové vazby v peptidu fósfonátovou vazbou v U.S. patentovS'chpnhláškách'sěriéNo 07/943,S05,O8/08'l'₎-577 a08/l 19,700,popisyjsouzděcelc zahrnuty do odkazů. ' ......-· ^: p- v”·' ·”. > 'x. · ''Nahrazení amidové vazby v peptidu-GH₂-štilfoharnidÓvou vazbou se uskutečňuje redukcí

-karboxylové.skupitiv^ĚCO.OHLvhodne.chráněne aminokvsdinv na-CtLOH skupinu-a hydroxyi še konvenčními metodami převede na vhodnou odstupující skupinu jako tosyl. Reakce tosýlóvanéhp derivátu š např. thioocto vou kyselinou následovaná hydróiýžóu: á oxidati vní č lil o račí poskytne -GH₂-S(O)₂Č1 funkční skupinu, která nahrazuje karboxylovou skupinu vhodně chráněně aminokyseliny. Použiti tohoto vhodně chráněného aminokyselinového analogu při peptidové syntéze poskytuje začlenění -CH₂-S(O)₂NR vazby, která nahrazuje amidóvouvazbu v pěptičiu,¹a tak vede k peptidovému mimetiku. Úplnější popis konverze karboxylové skupiny aminokyseliny na -CH₂-S(O)₅CI skupinu uvádí např, Weinstein Boris, Chemistry & Biochemistry of Amino Acids, PeplidesandProieins, Vol. 7, pp. 267-357, Marcel Dekker, Tne , New York (1983), zde začleněno do odkazu.

Nahrazení amidové vazby v peptidu urea-vazbou se popisuje v U.S. patentovepřihlášce série No. 08/147,805, přihláška je zde cele zahrnuta do odkazu.

Sekundární aminové vazby, kde-CH₂NH-vazba nahrazuje amidovou vazbu v peptidu, se připravuji např. s- použitím vhodně chráněného dipeptidového analogu, kde sc karbonylová skupina amidové vazby redukuje konvenčními způsoby na GH₂ skupinu Například v případě diglycinu redukce amidu na amin poskytne po deprotekči H₂NCH₂CH₂NHCH₂COOH, který se poté použije^:v N-čhráněné fórině v další spojovací feakči. Příprava takových-analogů· redukcí karboriylóvé skupiny: amidové vazby v dipeptidu jě v oboru dobře známa.

Vhodně chřánený aminokyselinový analog se používá pri konvenční peptidové Syntéze stejným způsobem jako odpovídající, anuhokysélina. Například se obvykle pro tuto reakci používají 3 ekvivalenty chráněného aminokyselinového analogu. Používá še inertní rozpouštědlo jako methylenchlorid nebo DMF a v případě generování kyseliny jáko vedlejšího reakčního produktu reakční rozpouštědlo obvykle obsahuje nadbytečné množství terciárního aminu pro

L * *

Κ · ··* · • ·

Φ· ·· ·· * Μ · • » • 9 • » ·#*·

•φ • φ ♦

• φ vychytávání kyseliny generované během reakce. Zejména výhodným terciárním aminem je diisopropylethylamin, který sé běžné používá v 10-násobném nadbytku Reakce vede k inkorporací aminokysleinovčho analogu s nepeptidovou vazbou do peptidového mimetika. Taková substituce se může opakovat dle prání.od nahražení žádné áž po všechny amidové vazby v peptidů nepeptidovými vazbami.

Pro sníženi náchylnosti peptidů podlé vynálezu k protéázám nebo pro restrikci konformace peptidů se peptid může cyklizovat, nebo se může na konec peptidů zařadit desamino- nebo deskarboxv- zbytek, takže chybí terminálni amino nebo karboxylové skupina. C-terminálnífunkční skupiny látek podle předkládaného vynálezu zahrnují amid, amid nižšího alkylu, diálkýlamid (nižšího alkylu), nižší alkoxylové, hydroxylové a karboxylové a nižší esterové deriváty a jejich farmaceuticky přijatelné sole.

Podle jiného výhodného uspořádání sé zbytky X₃ a X_s nezávazně vybírají ze skupiny C a Hoc. Látky podle předkládaného vynálezu tak mohou existovat v cyklické formě s intramolekulární disulfidovou vazbou. Alternativně se může vytvořit intermolekulární disulfidóvá vazba, která vede k dimemí látce. Tyto intramolekulární a intermolekulární disulfídově deriváty jsou schematicky znázorněny níže:

(CHi)m^

S /(ČHzjn

S ma n jsou nezávazně 1 nebo 2.

Jiná provedení vynálezu poskytují analogy těchto disulfidoyýchderivátů, ve kterých jeden ž atomů síryje nahrazen CH₂ skupinou nebo jiným isosterem síry Tyto analogy se připravují z látek, podle předkládaného vynálezu, kde buď X₃, nebo £ je C nebo Hoc a ten druhý a-annno-y-biityrová kyselina, intramolekulárhím nebo intermolekulárním nahrazením s použitím postupů v oboru známých, jak se uvádí níže:

•0 *· ♦ 0 · 0 * 0 * 0 0 . ♦' 0 ••00 00«0 .·*. ί : ί

01. · · 00 ·

Bř Η ζ ¹ ‘-'V kde ρ jc1 nebo 2. Odbornici v oboru znalí ocení, že toto nahrazení je také uskutečnitelné s použitím jiných homologů a-amino-γ-butyrove kyseliny a homocystéinu.

Navíc k předchozím cyklizačním strategiím se mohou použít jiné nedisulfidóvé postupy peptidóvé cyklizace. Takové alternativní cýkíizačni strategie zahrnují napříJdad amido-cyklizaČní strategií a strategie umožňující vytvoření thio-etherových vazeb. Látky podle předkládaného vynálezu ták mohou existovat v cyklizované formě buď s intramolekulámí amidovou vazbou, nebo intramoiekulárni thio-etherovou Vazbou. Pro ilustraci proveditelnosti amidové cyklizáční strategie se syntetizoval peptid založený na ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg, kde první cystein se nahradil lysinem, druhý cystein se nahradil kyselinou glutamovou a prostřednictvím amidové vazby mezi postranními řetězci těchto dvou zbytků se vytvořil cyklický monomer. Pro ilustraci proveditelnosti thio-etherovč cyklizáční strategie še Syntetizoval peptid založený na ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg, kde první cystein se nahradil lysinem a cyklický monomer sé vytvořil prostřednictvím thio-etherové vazby mezi postranními řetězci ly sinového zbytku a C-terminálníhn Cysteinu. Jáko takové'jsou vedle/lisulfidově cyklizáční strategie pro cyldizaci látek podle předkládaného vynálezu snadno použitelné amidová cyklizáční a ťhio-etherová cyklizáční strategie.

Alternativně může být amino-konec peptidů kepován ur/fa-substituovanou kyselinou octovou, kde je α^-subštihientem odstupující skupina, jako α-halogenoctová kyselina, například a-chloroetová kyselina, α-bromoctová kyselina nebo α-jodpctová kyselina. Látky podle předkládaného vynálezu, kde X₃ je C nebo Hoc sc mohou cyklizovaf prostřednictvím nahrazení

44 «β 4 • 4. 4 4 4· 4 4.

• 4 ·. · 4f ·

4 4 4 4 4444 φ 4ι . 4 4

4444 4444 44 4

4 «« • * ·

4 4«

44» «

4 odcházející skupiny sírou zbytku X₃ (např. Barker et ál..(1992) J. Med:. Chem. 35, 2040-2048 a Oř et al. (1991)7. Org. Chem. 56, 3146-3149, óbajsou zde zahrnuty do odkazu).

Látky podle vynálezu jsou užitečné //? v/Ro jako nástroje porozumění biologické role EPO, včetně hodnoceni mnoha faktorii, o kterých Sc předpokládá, že mají vliv na a mohou být ovlivněny produkcí EPO a vazbou EPO na EPO-R (např. mechanismus transdukce signálu t aktivace receptorů). Předkládané látky jsou také užitečné pro vývoj dalších látek vážících se na EPOR, protože předkládané látky poskytují důležitě informace ó vztahu struktury a reaktivity (SAR), které usháďnují tento vývoj.

..........Navíc na základě Schopnosti vazby na EPO-recěptory jsou peptidy podlé předkládaného vynálezu použitelné jako činidla pro detekci EPO-receptořů v živých buňkách, fixovaných buňkách, v biologických tekutinách, tkáňových homogenátech, v purifikovaném přírodním materiálu atd. Například značením takových peptidů se dají identifikovat buňky s EPO-R na svém povrchu. Navíc na základě schopnosti vazby na EPO-receptor jsou peptidy podle předkládaného vynálezu použitelné pro iň šitu barvení, FACS (sčreenováňí fluorescenčně aktivovaných buněk), Western bloting, ELISA-test (S enzymem spojený imunoadsorpční test) atd .'Navíc na základě schopnosti vazby na EPO-receptor jsou peptidy podlé předkládaného vynálezu použitelné pro purifikaci receptorů nébo purifikaci buněk expnmujících EPO réceptory na buněčném povrchu (nebo uvnitř permeabilizovaných buněk).

Látky podle vynálezu jsou také použitelné jako komerční výzkumná činidla pro různá medicínská výzkumná a diagnostická použití. Taková použití zahrnují, ale nejsou omezena na: (1) použití jako kalibrační standard pro kvantifikaci aktivit kandidátských EPO agonistu v různých funkčních testech; (2) použití jako blokující činidla při řandomním peptidovém scřčenovánp tzn.

“ ' Γ při vyhledávání nových rodin peptidových ligandů EPO receptorů, peptidy jsou použitelné jako blókátory znovuzískánív současnosti nárokovaných EPO peptidů; (3) použití při ko-krystalizaci s EPO-rěcěptořéui, ižit. peptidy podle předkládaného vynálezu umožní vžhik krystalů navázaných na EPO-receptor a usnadní určení struktury receptor/peptíd rentgenovou krystalografií, (4) použiti pro měření'kapacity buněk prekursorů erythrocytň při diferenciaci, a tím stimulaci indukce syntézy globinu a zvýšení syntézy hemo-komplexu v množství ferritinových receptorů; (5) použití na podporu proliferace a růstu EPO-dependenfních buněčných linií, jako FDCP-l-mEPO-R a

TF-1 buněčné linie; a (6) další výzkumné a diagnostické aplikace, kde se s výhodou aktivuje

EPO-receptor nebo se taková aktivace bez obtíží kalibruje proti známému množství EPO i'¹¹'.,; ·'·' «'«J «· i'·'··, it “ sr t , a. an,;* *· .«/ . e «· rl I«!' iiii.ií/ «I Ι'1·.·ιΛ, V ·> ft. . «Ϊ<r- »- _ _s í/itftí; ťjhfti: ftft i g.j.

agonistu, a ták póďóbrie> |Γκ·ί»·/ί*SL»v4 jUACí·,»Λί.ι~·.,ίϊΐ 11¾._t *»!»> -- >··ι ; Látkypodle vynáréáijSoú také ádmiňisťřoVaťělflě těplokrevným živóěičhůrn,včetně lidí, přo simuVači vázání ΕΡΘ na 'EPÓfřŘi'/» vivo Předkládaný vynález tak obsahuje metody terapie poruch spojených s nedoštatkém EPO'’které zahmuji administraci látky podle vynálezu v množství ždostaťéčňem pfb stnnuíači EP0-R,a takzmíriiujísýmptomý:spojené'snedbstatkem LP0í>/v/í-<9 Látky podle předkládaného Vymáležu 'naleznou použití'při terapii'konečného stádia renálního selhání/diálýže; áriemié spojené s AIDS, aněmie spojené š chronickými zánětlivými chorobami (např fheUmátičká arthritida a chronický zánět vnitřností),· auto imunitní chóřóby a málighaiícií;

a pro navýšení počtu červených krvinek u pacienta před ehiiurgiekým zákrokem..

• Další provedeni předkládaného vynálezu poskytují administraci látek podle vynálezu.pro terapii potuch, které nejsou charakterizovány malým množstvím nebo' poruchou íčeivenych krvinek, např. jako pretěrapie před transfuzí.- Navíc administrace látek podlé předkládaného vynálezu muže vést k poklesu doby krvácení; a tak nalezne použití při administraci pacientům před čhiřurgičkýnl zákrokem nebo při indikacích Očekávaní krvácení:⁷ NávíčMátliy “podlé ' předládaného vynálezu nalezn ou použití při aktivaci megakarýo cytů.

Protože se u ÉPÓ nalezly mitogenní a chemotaktiéké účinky na vaskulární cndotelové buňky a účinek na centrální cholinergické neurony (např Viz Amagnostou et al:.(1990) Proč: Nati: -Acad: Sci: USA 87, 5978-5982 aKonishřet al: (1993) Brain Res. 609; 29-3 5), látky podle * předkládaného' vynálezu naleznou» také použití při terapii· různých vaskulárních poruch; jako pódpóra hojení ran, růst kólateťálních koronárních cév (např. těch vyskytujících sě pO infarktu myokardu), terapie traumatu, terapie po vaskulárním ‘štěpu ~á terapie různých neurologických poruch, obecně charakterizovaných nízkými absolutními hladinami acetylcholinu nebo nízkými relativními ftládinámi acetylcholinu vzhledem -k dalším neuroaktivním substancím, např neurotraňsmiterům.

• - Předkládány vynález žáHmujei fannáčeutiěké-přípravky obsahující jako aktivní složku alespoň jeden z peptidů nebo jiných látek podle vynálezu ve spojení s farmaceutickým nosičem nebo diluentem. Látky podle vynálezu, se administrují orálně, parenterálně (intramuskulárně, iňtraperitoneálně, iritřaveriózně(IV) nebopodkožníinjekcí),- transdermálně (buď pasivně, nebo s použitím iontoforézy nebo elektroporače), transmukOZálně (nasálne, vaginálně, rektálně nebo sublinguálněj, nebo s použitítri bióěródibilriíčh irišeftů á formulují se V dávkovačích formách odpovídajících jednotlivým způsobům administrace.

i-, j· • 4, 4 4 • ·χ«· •44 « « • 4 4 ·· 4*

-5 39 33 -3 ♦ 4 · 4 4 4 4 • 4 4 4 4 « <τ . · ♦ · · · 44 ·♦ « 4 4 4 • 444 4444 44 ·

Dávkovači formy v pevném stavu pro orální adminiStraci zahrnují kapsle, tablety, pilulky, prášky agranule. Ú těchto dávkovačích forem v pevném stavu se aktivní látka smíchá s alespoň jedním inertním farmaceuticky přijatelným nosičem jako sacharózou, laktózou nebo Škrobem. Takové dávkovači formy také podle normální praxe obsahují další látky jiné než diluenty, tiapř. lubrikačnj činidla jako stearát hořečnatý. V případě kapslí, tablet a pilulek mohou dávkovači formy tekě obsahovat pufiující činidla, Tablety a pilulky se mohou dále připravit se střevními povlaky

Tekuté;dávkovači, formy pro orální administraci zahrnují farmaceuticky přijatelné emulze, roztoky, suspenze, Sirupy, obsahující inertní diluenty používané v oboru, např. vodu. Kromě takových inertních .dilueritů mohou přípravky také obsahovat adjuvánťý jako zvlhČující činidla, emulzifikační a suspendačrií Činidla a sladící, ochucující a parfémující Činidla.

, Přípravky podle předkládaného vynálezu pro.parenterální administraci obsahují sterilní vodné a nevbdné roztoky, suspenze nébo emulze. Příklady nevodňých rozpouštědel nebo nosičů jsou propylenglýkol, polyethylenglykol, rostlinné oleje jako olivový olej a obilný olej, želatina a injíkovatelné organické estery jako ethyloleát. Takové dávkovači formy také mohou obsahovat adjuvanty jako konzervační, zvlhČující, emulzifikační a dispergující činidla. Mohou se sterilizovat nápř. filtrací přes filtr zadržující bakterie, inkorporací ster ilizáčních látek do přípravku, iradiaeí přípravku nebo zahříváním přípravku. Těsně přeď použitím se s nimi může manipulovat s použitím ¹ . sterilizované vody nebo jiného sterilizovaného injikovaťelného média.

Přípravky pro rektální nebo vaginální admini stráei jsou výhodně čípky, které obsahují vedle aktivní složky excipienty jako kokosové máslo nebo Čípkovývosk. Přípravky pro nasální nebo subliguální administraci se také připravují se standardními excipienty v oboru dobře známými.

' - Dávkovaní aktivní komponenty v přípravku podle vynálezu se může lišit; nicméně je nutné, aby množství aktivní složky odpovídala vhodná dávková forma. Vybrané dávkováni závisí na požadovaném terapeutickém účinku, na způsobu administrace a na požadované době terapie. Obecně se savcům podávají denní dávky mezi 0,001 až 10 mg/kg živé váhy.

Z výše udaného popisu vyplývá, že předkládaný vynález má širókou áplikovatelnost. Následující příklady jsou pro ilustraci, nikoli pro omezení vynálezu.

*· φφ •π ·:· · · • ^! · > »φ • ··· » φ • φ φ ·· ·· ···· ·«·« • Φ * »| · Φ ·, · · · • φ φφφφ φφφ ·« ·

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Syntéza peptidů na pevné fázi. Různé peptidy podle vynálezu se syntetizovaly s použitím techniky Merrifieldovy syntézy, na. pevné fázi (viz Stewart, J.M., Young, i .D. SolidPhase Peptide Synthesis, 2. Vydání (Pierce Chemical, Rockford, IL, 1984)) na automatickém zařízení Milligen/Biosearch 9600. Použitý nosič byl·PAL (Milligen/Biosearch), zesíťovaný polystyren s raménkem.5z(4-í^;rnoc.-aminoinetliyl;3,52_rdimethr)xyťenoxy)yalerovc^kyseiiny PřLPQUzittJ^JAL^ nosiče se po odštěpení peptidu získal karboxy-terminální amid. Primární amin aminokyselin se chránil F-moc, chránící skupiny pro postranní řetězce byly t-butyl pro serinové a tyrosinové hydroxyly, trityl pro glutaminamidy a Pmc (sulfonát 2,2,5,7,8-pentamethylchromanu) pro guanídinovou skupinu argininu. Každé navázání se provádělo jednu, nebo dvě hodiny v přítomnosti BOP (benzotriazolyl N-oxtrisdimethylaminofosfoniumhexafluorofosfát) a HOBt (1hydroxybenzťriazol).

Při syntéze peptidu s amidátovým karboxy-terminem se hotový peptid Štěpil směsí 90 % triflúoroctové kyseliny, 5 % ethandithiólu a 5 % vody, zpočátku při 4 ^CC s postupným nárůstem na teplotu místnosti 1,5 hodiny. Odchráriěný produkt se odfiltroval od nosiče a precipitoval v diethyletheru. Po dostatečném vysušení se produkt purifikoval vysokoúčinriou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi 08 gradientem acetonitril/voda v 0,1% triflúoroctové kyselině.

Příklad 2

Biotešty, .a rrv/^n i/.„mn n

n. rwr-i/iiiBru-iv.

FDCP- 1/mEPO-R buňky (1Ό⁵) narostly na polostaeionární hustotu v přítomnosti růstových faktorů (2,5 nm EPO). Buňky se promylydvakrát PBS a poté se ponechaly 24 hodin v úplném médiu bez růstových faktoru.

Buněčná viabilita se určila barvením trypaňovou modří. Vytvořil se zásobník v úplném médiu bez růstových faktorů, aby se dosáhlo požadovaného počtu buněk y 50 pl i Testované látky se dvojnásobně naředily na 96-jamkové tkáňové kulturační misce (finální objem v jamce 50 pl).

:-ňf		£ ocV
r>] í-g í· • ..4- ¢-	eY Ol 6' i	ί; «ι βί-
f! <	ť 1	Πί O) mR;
r	cl
r*nijr·	0*:/	í -

Do každé jamky se přidaly buňky ;(50 pl na jamku) a iňkubóvaly se 24 až 48 hodin (čas -úmrtí negativní kontroly) Buněčná proliferace sě;určila testěm:ΜΤΤχ ,.',ζ; 'ΓΎζ

B ŤF4? >·'« r ÚM i / pf *·. 5i*i.

ί».'- >

' * .Pró demonstraci aktivity látek podle vyháležu jako EPO. agoništů se také prováděly,testy na buněčné linii TF-1 růstově dcpendéntní na· ÉPÓ.(kitamúráět al. (1-989) B/óoí/73, 375-380, zde zaraženo do odkážu).' Representativní výsledky ukazuje Obrázek 8: Obrázek 8 zobrazuje účinek EPO a peptidu VGNYMCHFGP1TWVCRPGGG na buněčnou proliferací buněčné linie •TF-i.' ' ' ret ’ s jo- ‘,·:· ...

ii i¹

......\ C Proliferace slezinných buněk:.....,.....-........ _ř . ........ .................. ... ...

Pro stanovení schopnosti látek podle předkládaného vynálezu působit jako EPO agonisté : se prováděl mikrotestzaloženy na inkorporaci ³H-thymi dinu do slezinných buněk (Krystal (1983) Exp. Hěmaíol: 11, 649-660, zde zařazený do Odkazu). B6C3F, myším sě po dva dny injikoval fenylhydrazin (60 mg/kg). Třetí den se odstranily slezinné buňky a pomoci testu MTT se stanovila jejich schopnost prolitěrovat 24 hodin. Fotografie ukazuji proliferací representativní populace slezinných buněk, Obrázek 9A (kontrola), 9B (působení 500 pM EPO), 9G (působení 25 pm GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG), zvětšeno 200 x.

D Buněčná proliferace: Peptidově dependentní růst EPO-rcsponzivní buněčné linie, FDCPl/ER.

Y •1.

1, Materiál a metody.

a. Příprava vzorku; peptidy se resuspendovalv v DMSO jako 1 χ 10’² zásobní roztok a postupně se ředily iO-násobně za vzniku následujících 100X roztoků:

IxlO’³ lxlO“⁴ lxlO’⁵ 1x10^ lxlO’⁷ lxlO⁴

Dva pl z každého zásobního ředění se přidaly k buněčné jamce jak se popisuje níže na finální objem 200 pl zá vzniku následujících finálních koncentrací:

1.·1.Λ-5 , J X IU _ i _r . .· Y. rx-Λ

IX tu » ... . 1Λ’7 I X IU' .1 . 1 λ·8

I Λ IU __ 1.Λ-9 I X IU

..1, -- 1 Λ-10 Ί X'1U

b. Test buněčné proliferace:

i. Zdroj buněk: FDC-Pl/ER (Dexter et al. (1980) 7 Exp. Med. 152, 1036-1047, zde zařazený do odkazu) jě dobře charakterizovaná netransformovaná buněčná linie z kuřecí kostní dřeně, ve které se stabilně tránšféktovál 'erythropoietinovy receptor. Buňky vykazují EPO depepnderttrií proliferácí. .·,.·«»; ^v ' c. Experimentální protokol: Buňky s RPMI 1640/10% fetální hovězí sérum/antibiotiká a

......J • re

A

A A A ·'· · ·· •A A • A

A· AA

A • A A • A

AAAAAAAA • ' A A • · A A • A A·· ·

AAA

AA A

U/ml érythropóiétinu narostou do Stacionární fáze. Buňky se oddělí s resuspendují v čerstvém médiu bez růstového faktoru (erythropoietin) 24 hodin. Buňky se počítají a resuspendujína koncentraci 800 000 buněk/ml. Přibližné 40 000 buněk (50 pl) še přidá do každé jamky 96jamkové mikrotitrové destičky. Ke každé jamce sé triplikátnč přidá peptid. S každou sérií peptidu probíhá stanovém standardní dávkové odpovědi. Po 42 hodinách inkubace (2 zdvojení) se ke každé janice přidá thymidin (1 pCi/na jamku). Buňky se inkubují další ch šest hodin, potě se oddělí a počítají pro stanovení inkorporace thymidinu jako indikátoru buněčné proliferace.

d, Výsledky: Peptidy se testují jak na erythropoiétin-ťeceptorové buněčné linii, tak na ^parentální buněčné linii nenesoucí receptor. Ve většině případů se peptidy testovaly na zkrácené lidské erytbropoietin-receptorové buněčné linii .Výsledky se vyjadřují jako množství peptidu nutné pro dosažení poloviny maximální aktivity získané s rekombinantním erythropoietinem. Representativní výsledky jsou uvedeny v tabulce s údaji o relativním navázání (viz Tabulky 1-7 až 22, w/ra).

E. Fosforylaee tyrosinu: Peptidem indukovaná fósforylace tyrosinu erythropoietinového receptoru a intracelulárních proteinů

1. Materiál a metody

a. Příprava vzorku: peptidy se resuspendovaly v DMSO za vzniku koncentrace 1 χ ί 0'² M.

b. Experimentální protokol: Buňky FDC-Pl/inuER s RPMI 1640/10% fetální hovězí sérum/antibiotika á 10 U/ml erythropoietinu narostou do stacionární fáze. Buňky se oddělí s resuspendují v. čerstvém méidiú bez růstového faktoru (erythropoietin) 24 hodin. Buňky se počítají a resuspendují na koncentraci 500 000 buněk/ml. Buňky (1 ml; 500 000) se umísti do Eppendorfovy vialky. K buňkám še přidá 1 pl roztoku peptidu (1 χ 10'³) na finální koncentraci 1 ^;x’KT⁵ MaŮnkubuje sě 10 minut při 37 ?’C. U každého testu probíhalaerythropoietin o vá kontrola (s finální koncentrací 10 U/ml). Buňky se oddělí centrifugaci při 14 OÓOrpm, 4 °C. Buňky se resuspendují ve 100 pl SDS lýžujícím pufru a dělí SDS polyakrylamidovou gelovou elektroforézou. Gel. se transferuje na nitrocelulózu a 1 hodinu je ve styku s anti-fosfótyrósinovou .protilátkou (UpstateB jotechnology Incorporated) ředěnou 1:1000. Membrána se promyje Tris pufróvaným fyziologickým roztokem a vystaví působení anti-myší protilátky značené peroxidázóu. Reaktivní proteiny se vizuálizují s pomocí ECL western blotovacích činidel (Amersham).

c. Výsledky·: Erythropoietin vážící se na receptor indukuje u erythropOietin-responsivní buněčné linie fosforylaci tyrosinu jak u receptoravých, tak u množství intracelúiářních proteinů, φ

• · φφ φφ φ φ · φ φ φ φ φ φ φφφφ φ φ φφ φφφφφ* φ φ φφφ φφφφ φφφφ φ» · • φ φφ • φ · φ • · φφ φφφ φ φ φ φ φ ** «« včetněSlic, vav a JAK2 kinázý, Množství peptidů, včetně GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, se analyzovalo pro stanovení jejich schopnosti mimikovat odpověď pozorovanou u erythropóietiňu. Podle vazebných a proliferačních kritérii aktivní peptidy vyvolávají ú erythropoietin-responsivních buněk identickou fosforylaci jako eřythropoietin. Tyto výsledky ukazují, že aktivní peptidy vyvolávají odpověď cestou tranšdukce erythrópoietinem indukovaného signálu Výsledky jsou uvedény v tabulce s vazebnými a proliféraěfiími údaji (viz Tabulky 17. až 22, inftd).

F Kinětika buněčné odpovědi: peptidem indukovaná iniciace buněčného cyklu měřená obsahem DNA.

..... ........1. Experimentální.protokol: Buňky FDC-Rl/muÉŘ narostly do stacionární táze ~ 3,0 x..

10⁶ buněk/ml. Buňky se oddělily s resuspéndovaly v čerstvém médiu v nepřítomnosti faktoru a ponechaly růst dalších 18 hodin, kdy se buňky rozdělily do tří baněk sc stejnou buněčnou hustotou: -faktor, + EPO a 1 peptid. Buňky se poté stimulovaly buď 10 U/ml EPO, nebo 10 μΜ peptidem. Tři miliony buněk se oddělily v následujících časech: 0, 6, 8, 10 a 12 hodin (viz Obrázek 15). Buňky se dvakrát promyly chlazeným PBS a fixovaly resuspend ováním buněčného pelletu vc 100 μΐ chlazeného PBS následovaným 900 μΙ chlazeného 70% ethanolu. Buňky se barvily propidiumiodidem (50gg/ml) a fluorescence se měřila cytometrem FACS Scan Flow. Procenta buněk v každé fázi se měřila s použitím softwaru CellFlT modél SOBR, Becton Dickinson.

Eřythropoietin (10 U/ml) a GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (1 χ ΙΌ'⁵ M) jsou shodně účinné pro průběh buněčného cyklu buňky. Deset hodin po indukci buď erythrópoietinem, nebo peptidem bylo 45 % buněk v S fázi, v kontrolním médiu 15 %: Tento výsledek ukazuje, že peptid je schopný vyvolat odpověď se stejnou kinetikou jako rekombinantní eřythropoietin.

G. Test v kolonii: test v kolonii kuřecí kostní dřeně a lidské periferní krve.

1. Materiál a metody.

Desetimililitrový vzorek periferní krve se získal od zdravého jedince standarní sterilní hepaririŮvOU Váktiiauieíóvůu ířuuieí. Kuřecí kušiní dřeň se získala z fěiňurůpřibližně 10 myší řiď experiment. Všechna činidla sé získala od Stem Celí Technologies lne, (Vancouver, Canada).

a, Experimentální protokol: Počítáním jaderných buněk se stanovil počet a koncentrace jaderných buněk v originálním vzorku. V případě périferní krve se vzórek centrifúgoval ria FicóllHypaque ,(1,077 g/ml) s gradientem 400 g 30 minut při teplotě místnosti. Mononukleární buňky na rozhraní Ficóll-Hypaque roztoku se opatrně odstraní a ředí na celkový objem 10 ml. Buňky získané z kuřecí kostní dřeně nebo lidské periferní krve se oddělily centrifugací a supernatant se ·« ·· • · φ · • φ • φ φ • ♦ φφφφ φφφφ φφ φ φ φ φφφ φ φφφ* φ φ φ φφ φ ·· ·· φ φ φ • · ·φ *·· φ φ φ ·* φφ dekantovaT Peleto vaně buňky se resuspeňdovaly v čerstvém médiu a oddělily jak se popisuje výše. Promyté buňky se ředily Iscověs médiem/2% fetálriím hovězím sérem na následující koncentrace:

normální dřeň: 1 χ 10⁵ malá hustota buněk normální krev: 4 χ 1Ό⁵ malá hustota buněk

Buňky se po směru přidaly na methylcelulózu. Peptidy se testovaly při následujících finálních koncentracích: 1 χ KT⁶ a 1 x fO v methylceluíózovém médiu “minus EPO”.

Ekvivalentní pocty buněk se umístily v kompletním celulozovém médiu pi.o. ustaveni maximální formace kolonie. Kontrolní test se prováděl u každého testu minus EPO a peptid přo stanovení formace kolonie pozadí. Kolonie se počítaly po 10 a 18 dnech inkubace.

b. Výsledky: GGTYSCHFGPLŤWVCKPQGG je schopen podporovat formaci kolonie ačkoliv se značně nižšími hladinami ve srovnání s kompletním methylcelulózovým médiem (erythropoietin βϋ/ηιΙ), jak v kuřecí kostní dřeni, tak lidské periferní krvi.

« • 0 • 0 • 0 0

0 • 00 0 ·

• 0 i

• 0

0000 0000

Tabulka 13. Koloniový test vzorku lidské periferní krve (donor : muž) (datum; 2/10/94)

0

0 0 0 0 • 0 0 0 * · 0000 0 0 0 • 0 0

Datum	Vzorek	CFU-E	MBFU-E	PBFU-E	CFU-GM
2/23/94	ZERO	X	X	X	X
	DMSO	X	X	X	X
	EPO (METHÓCULT)	Η	25	X	X
	EPO (3U/ml)	7	7	X	X
	AFFY 244 10'⁵ M	10	.5	. X	X
	AFFY 244 10* M	11	5	X	X .

3/4/94	ZERO	X	X X	X
	DMSO	X	X X	X
	epo (methocult;	I Ί	11 13	9
	EPO (3 U/ml)	4	.7 7	3
	AFFY 244 10⁵ M	7	9 2	4
	AFFY 244 10'⁶ M	6	11 1	2
CFU-E:	Jednotka erythroidu tvořící kolonii (1	až 2 shluky)
MBFU-E:	Jednotka erythroidu tvořící maturovaný burst (3 až 8 shluků)
PBRU-E:	Jednotka erythroidu tvořící primitivní.burst (9 a více)
CFU-GM;	Jednotka granulocyt/monocyt/makrofág tvořící kolonii

• 9 99 • 9 9 9

9

9 *9

4 4 '9 4 ·· 9 9 9

9

999 » 9999

4

9 9

9 9 9

9 9999 9 • 94

9

Tabulka 14. Počty buněk tvořících kolonii (kuřecí kostní dřeň)

1/28/94

2/10/94			AFFY11157/AFFY 244
Progenitor	Kontrola	EPO	io-⁵m	10‘⁶M
CFU-E	0	23	2	3
BFU-E	,0	⁵ \	0	0
CFU-GM	0	3	0	0

2/21/94			AFFY11J	57/AFFY 2Ψ
Progenitor	Kontrola	EPO	10'⁵M	ΙΌ^Μ
CFU-E	0	0	0	0
PBFU-E	0	30	2	4
CFU-GM	0	3	.0	0 ’

AFFY11157 = ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg ‘ť

9« 99

9 9 «

9 9 9

9 9 9 «

9 » « 9 9 • 9 9

9» • · * 9 ' 9 9 «999 ««·«

Tabulka 15. Póčty buněk tvořících kolonii (kuřecí kostní dřeň)
2/21/94	3/1794 Progenitor	Kontrola	EPO	AFFYH157/AFFY 244 10'⁵M lO^M
	CFU-E	0	.3	9	ó
	BFU-E	0	3	Í2	0
	CFU-GM	.0	>10	0	0
	3/14/94 . Progenitor	Kontrola	EPO	AFFY11157/AFFY 244 10*⁵M 10’⁶M
	CFU-E	0	0	1	.0
	.. PBFU-E	0	10 _	8 .	________0......... _
	MBFU-E	0	0	4	0
	CFU-GM	0	26	0	0

H. Peptidem indukovaná proliferace: n& ..peptidu dependentní růst buněčných linií neresppnsivních na erythropoietin.

a. Experimentální protokol: peptidy se testovaly jak se popisuje výše v sekci D, Křivka růstu se tvořila pro každou buněčnou linii s použitím mitogen/růstového faktoru relevantního pro každou buněčnou linii pro zajištění růstového potenciálu.

b. Výsledky: Jak ukazuje Tabulka 16- GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG nebyl schopný stimulovat růstovou odpověď u erythtropoietin-neresponsivních buněčných linií včetně heiriáiPpóieiičkýčh a nehémafopoiěíickýéh buněčných iinii.

• 4 ·| » 4 4

II 4 a *

4 44

4 4 4 • * β • 4 4

4 4 4 4

4 4

44

Tabulka 16. Testy buněčné proliferace s 61233

typ. buňky	Vzorek	EPĎ	61233 Odpověď růstového faktoru
hematopoetieký
TFt.1	lidský		+ GM-CSF, IL3 (erythroidní)
M-07E	lidský	-	GM-CSF, 1L3 (megakaryoblastový)
AML193	lidský	-	GM-CSF, G-CSF, IL3 (monocytóvý)
T-buněČný klon	lidský	ND	IL2
osteoblastickv

TE85	lidský	sérum
MC3T3	kuřecí	sérum
prsní buňky
T47D	lidský ND	progestin

0* * • 0 00 « *

00

0*00 « • * · *· 00

00 • »0 0 • * 0 0 0 000

I. Test mobilizovaného EBP založený na kompetitivní vazbě [^12ÍI]EPO.

V E. coli se cxpriniovala a nadprodukovala éxtraěelulární doména lidského erythropoietinového receptoru (EPO vazebný protein; EBP). Jako mnohé jiné rekombinantní eukaryotické proteiny používané u E.coÍi se protein získal jako nerozpustný produkt při fermentacich v laboratorním měřítku, refóidoval se a čistil za vzniku aktivního proteinu. EBP získaný touto metodou obsahuje jednu volnou sulfhydrylovou skupinu, která se může modifikovat bez ovlivnění vazby ligandů v roztoku. Pro imobilizaci EBP při analýze rovnovážné vazby a jako Základ pro test kompetitivní vazby sé EBP kovalentně navázal na agar ózové kuličky. Chemie .joda^tyiové. aktivace Si^fiii^Mhěe^l^eo%Xhe^caÍ Có;,Rocktpm,„lE)je^Specífrcká_tpro3<oíňé. thioly á zajišťuje nerevérsibilitu vazby. Příprava EBP-Sufolink kuliček: Suspenze Sufolínk gelu (10 ml) se smíchala s kondenzačním pufrem (40 ml: 50mM Tris, pH 8,3, 5mM EDTA) a gel Se nechal Usadit. Supernatant se odstranil a navazovaný EBP (0,3-1 mg/ml v kondenzačním pufru) se přidal přímo k promytým kuličkám. Směs se mírně kolébala 30 minut při teplotě místnosti a kuličky sé necKály usadit 1 hodinu při teplotě místnosti. Supeřňatáht se odstranil a uchoval, kuličky še dvakrát promýly 20 ml kondenzačního pufru. Také promytí se regenerovala. Kuličky se poté smíchaly s 20 ml 0,OSM cysteinu 30 minut při teplotě místnosti pro blokaci nenavázaných míst: Nakonec se kuličky promyly 50 ml IM NaCl, poté 30 ml PBS a resuspendovaly v 20 ml PBS a uchovávaly při 4 °C přo pozdější použití: Množství EBP kovalentně navázané ná kuličky se určilo porovnáním OD_2sn původního roztoku EBP a celkové OD_ig0 regenerované Z reakčního supernatantu a dvou 20ml promytí Typicky se na kuličky navazuje 40 až 60 % aplikovaného

Na začátku vazebných testů se do jednotlivých reakčních baněk přidaly EBP kuličky (50 jíl). Celkové navázáni se měřilo v baňkách obsahujících 0,3-30nM ^T2SPEPÓ (NEN Research Products, Boston, MA, 100 pCi/pg). Pro určení nespecifického navázání se přidal neznačený EPO

ΛΛΛ. — -ÍaALL·. ^Ííj:1 lI_- _ JÍ. f JlÍÍIÍ Η25τΊ ~ I. ♦ .

ινυυ-παΛυυιιφιπ pcuyirLU ncz, uyia uujjuviuajicj Kuiicciiuacc [ ijt-nrv* tVCdKUJl UUjeiíL se doplnil na 500 pl vazebným pufrem (PBS/0,2% BSA). Baňky se inkubovaly 5 hodin (časová perioda experimentálně: určená jako adekvátní pro ustavení rovnováhy) při teplotě místnosti za lehkého kolébání. Po 5 hodinách se každá reakční směs přefiltrovala přes Špičku 1ml pipety naplněnou skelnou vatou. Baňky se promyly 1 mí promývacího pufru (PBS/5% BSA) a tento objem, stejně jako 2 další 1 ml promytí se přefiltrovaly přeš špičku pipety a uchovaly pro určení koncentrace volného EPO. Analýza rovnovážného navázání specifické asociace [^,25T]-EPO s ÉBP

00 · · · * · 00 • 0 · 0 · 0 β « • 0 00 • · ι· «0 0 á fe

0 · !··»000

0 0 « · · · » · * 0 · 0 • 00

0 imóbilizqvaném ná těchto agarózových kuličkách indikuje Kd 5 nM ± 2 založenou na lineární transformaci (Scatchard) vazebně isotcrmy (viz Obrázek 16)

Testy kompctit ivní vazby kandidátských peptidů se provedly podle níže uváděného popisu. Jednotlivé peptidy se rozpustily v DMSO za vzniků 1 mÍM zásobního roztoku. Všechny reakční banky (dupiikovanc) obsahovaly 50 μΙ EBP kuliček, 0,5ňM [^1?5I]-EPO a 0-500 μΜ peptid v celkovém Objemu 500 μΐ vazebného pufru. Konečná koncentrace DMSO se adjustovala na 2,5 % ve všech testovaných baňkách, na hodnotu bez detekovatelného účinku, neboť testování citlivosti testu na DMSO ukázalo, že koncentrace až 25% DMSO (V/V) neměla účinek na vazbu. Nespecifické .navázání. se.měřilo: V každém; indi viduální m. testu. iňkluzí .baněk o bsaliuj ípíehiveíkjL nadbytek neznačeného EPO (1000 nM). Pro určení celkového navázání se do každého testů začlenily počáteční body bez přídavku peptidů. Vazebné směsi se inkubovaly přes noc při teplotě místnosti za slabého kolébání. Kuličky se poté oddělily s pomocí Micro-sloupců (lsolab, lne., Akron, Ohio) a promyly se 3 ml promývacího pufru. Sloupce obsahující promyté kuličky se umístily do 12 x 75 mm skleněných baněk a úroveň navázané radioaktivity se určila s pomocí gama-počítače. Množství navázaného [¹²⁵Í]-EPO se vyjádřilo jako procenta kontrolního (totální = 100 %) navázání a vyneslo proti koncentraci peptidů po korekci na nespecifické navázání, IC50 . se definovala jako koncentrace peptidů, který redukuje navázáni [^12ílj-EPO na EBP kuličky na 50%. Všechny údaje jsou udané relativněk GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (RWJ61233), který vykazuje’ IC50 5 μΜ (viz Tabulky i 7 až 22, infra).

99

9 9 9 > 1 ·

β • Μ* · 99

Tabulka 17. Substituční série GGTYSCHFGPLTWVCRPQGG

Sekvence ID No.	Sekvence	Relativní vazba²	EPO-ED_í0 (μΜ)	Fosforylace¹
612334	GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	1	0,1
61231	GGTASCHFGPLTWVCKPQGG	24	IA	-
61520	GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG	24	IA
61598	GGTPSCHFGPLTWVCKPQGG	12	IA	-
61277	GGŤYSCHFGALTWVCKPQGG	2	n i	4-
61278	GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG	18	IA	-
61313	GGTYSCHEAPLTWVCKPQGG	16	IA	-
61314	GGTYSCHEGPATWVCKPQGG	1	0,2	+
61395	GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG .	>100	IA . .	-
62145	GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG	6	0,25
61530	GGTYSC-FGPLTWVCKPQGG	40	IA	-

* Množství požadované pro dosažení poloviny maximální úrovněEPOdependentní proliferace (11 pM) ¹ Testováno při 10 μΜ ² IA = inaktivní ² Vazba relativní kRWJ-61233 ² Všechny peptidy jsou cyklické (s výjimkou 61394) a analyzovaly se jako COOH terminální amidy (-CONH₂) i i'¹1 'i. r rt .

uíxjj — zvrr i i i-ijy — /vrr i zhh

A.'.T?T?4 T » 1 trn., • 4 ··

Β 4

4 • ·

4 * »444·

• 4*4 4·4· ·4«·

Tabulka 18 Zkrácené série GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG

Sekvence ID No	Sekvence	Relativní vazba¹	EPO-ED j,	Fosforylace¹
..61233⁴	GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	1 .	0,1	+.
61596	GGTYSCHFGPLTWVCKPQ	1,6	0,08	+
61597	TYSCHFGPLTWVCKPQGG	8	2	+
61230	TYSCHFGPLTWVCKPQ	6	2
2l nŤO		ň	ΠΛ	Jí_/·
U 1 LJi	lÚVlUAjrijl VV VALIVÍ	7	Z, V
61279	YSCHFGPLTWVCK	14	3	*/-
61477	YSCHFGPLTWVC	50	IA²
61895	YSCHFGALTWVCK	32	IA
61513 ....	Y-CHFGPLTWVC. ...	12. ,	2 .	+ . ....
62177	SCHFGPLTWVČK	18	IA	-
AF11154	GGCRIGPITWVCGG	13	IA	-
61394	HFGPLTWV	>100	IA,	-

* Množství požadované pro dosazeni poloviny maximální úrovně EPO dependentní proliferace (II pM) ¹ Testováno při 10 μΜ ² IA “inaktivní ⁵ Vazba relativní k RWJ-61233 ⁴ Všechny peptidy jsou cyklické (s výjimkou 61394) a analyzovaly se jako COOH terminálni amidy (-CONH^)

61233 = AFFY11157 = AFFY 244

I • 4 44 4 » 4 »4 44 • 444 4 4 4 · · · · « · * 44· · 444 • 4·*4 4444 4 444 4 4

4 444 4*4

444 4 4444 44 * ·· ^ββ

Tabulka 19. Sekvenčně analogické peptidy
RWJ No.	Sekvence	Relativní . Navázání*	ÉPO-ED,₀ Fosforylace¹ (μΜ)
61233*	GGTYSCHFGPFTWVCKPQGG	1	0,1 .+
61721	ggtyséhfgpltwvkkpqgg i 1	>100	IA²
61718	gglyachmgpmtwvcqplrg	0;6	0,1
61719	ggeylcrmgpmtwvctpvgg	8	9
61720	gglytcrmgpitwvclpagg	ND	-
61717	GGNYYCRFGPITFECHPTGG	>100 (Sl)	IA

‘Množství požadované pro dosažení poloviny maximální úrovně EPO dependcntní proliferáce (11 pM) ¹ Testováno při 10 μΜ;² IA = inaktivní * Navázání relativní k RWJ-61233 ^J Všechny peptidy jsou cyklické (s výjimkou 61394) a analyzovaly se jako COOH terminálni amidy (-CONHj

61233 = AFFY11157 = AFFY244 uo

Tabulka 20. Substituční série v poloze #4

OO g

X dl· 'Ώ rťj •T·

Ό;

Ph

R z·

Έ’ _>

h->

Jtí

Tj ff!

9)

O e,

OJ >

jí

OJ rzi o

Z •*-H^ < < < < < - .<

ΛΓ

CM xr

CM cm

O rn

0	0	O	O	o	Q		O
ó	0	O	O	•0	O	Ů	0
σ ft	a Pl	ex Ph	σ Ph	σ a	σ °a	CX R	σ r
X. u	£ U	S O	S O	χ CJ	u	X υ	2- 0
>	>	>	>	>	>	>
£	£	£	£	δ	£	£	δ
H	R	R	H	(-H	H	H	R
U	G	G	U	G	G	Gl	►-Ί.'
CL	Ph	Ph	Ph	R	Ph	Ph	%
O £	O R	O fe-	O Ul,	O Ěf	O R	O fe	0.
S υ	s 0	S 0	s 0		s u	. s u	s u
tZ)	M	ΐΛ	C/J	00	00	cn.	cn.
>	<3	H	W	X	X-	>9
R	. r	R	H	R	R		R
O	o	o	Φ	o	Φ	O	<2
tri’		tri ’	tri	tri	tri	tri -	tri

OJ 4) JC X Ph . Ph ch R

O o z £

CL CL

Ě «υ £ ,x -2·

Ě

UL in Q. i*?

CO		O	00		Či	-O	r—<
co	co	ČM	0\	O\	—1	CM	CM
<N	CM	WO	in	00	'©	O	O
·»—1	i—1	r—«	—1		CM	CM	CM
0		O	Ό	*sO	. VO	\O	O

«« *· ♦ • · · * · · ·

Φ » · · ♦ · »« «·*·· ··· ·ft·· ·· · « ·· ♦ · · · » ·» • · · · » • Φ « • · «i *

CL <D . υ cd : .OJ

Έ

o.

c oj

Ό ^:S

CL

OJ tJ·

O

Ph ω

><u c

>

o o

Έ

-cd

E.

&

S

To ct '5 <u >N.

cd tň

O

Ό ro cn cm

ΛΟ £

. cd i- .s cl δ i *

HH ” Έ

-Ž § 5 >O OJ

Tt” τ

cm >

Uh

OJ

G cd >

O

Ό (d >N

O

CL tn iN

O

G

-td

N '(d >

td .£ rcn >

UL $

m cn cM

Ό · tttt 94 · · · 9« ···· · 9 « 499« • · * · · » ♦ · tttt • · · · * tt··· 9 ·* tt · • 9 · ♦ 9 tttt»

9999 9tttttt 99 4 9« ·*

Tabulka 21. Substituční série v poloze 7/17

Sekvence	Sekvence	Relativní	FPO-ED₅₀ (μΜ)
No.		Navázání**	kuřecí	zkrácený lidský
			receptor	' lidský receptor receptor
65876	GGTYSCHFGPLTW VCKAQGG	>20*	10	0,3 10

” Navázání relativní k 61233 AFFY11157 = AFFY244 Omezená rozpustnost

4 44

4 4 ·

4 44

4 4 4 4 »4 4

4 4 4 • 4 »· «4 • · 4 4 ·

* • 4*44 4444

4 4

444

4 ι·

Tabulka 22, Diferenciální aktivitní série založená na GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG

Sekvence Sekvence Relativní EPO-ED_5f) (μΜ)

No. Navázání* kuřecí zkrácený receptor lidský receptor

61233* 61596 61718	GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GGTYSCHFGPLTWVCKPQ * y-,Τ Tť* X-,·»· '< . řrmi rw , Ζ\Ύ\τ tS tiut. r z\emvjurjvj i yyvi.yri.Mi	1 1,6 0,6	0,1 0,08 Λ -W O,¹	0,1 0,02 0,08
AFT1288	GGL Y ACHMGPMTWVCQPLRG	0,2	0,15	ND¹
61757 (H22	) LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD	1	0,11	0,15
. AF11654	TIAQYIČYMGPETWECRPSPKA .	1	0,2	0,02
62145 ...	GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG	6	0,25.	0,5
62146	Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	4	0,03	0,06
61894	GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG p-NO₂-Phe	17	IA²	0,8
62019	GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG p-NH_rPhe	18	IA	3,0
62020	GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG p-F-Phe	8	1,0	0,1

* Množství požadované pro dosažení poloviny maximální úrovně EPO dependentní proliferace (llpM) ¹ ND == neurčeno,² IA = inaktivní * Navázání relativní k RW3-61233

Všechny peptidy jsou cyklické a analyzovaly se jako COOH terminální amidy ( CONH₂) 61233 = AFFY11157 = AFFY244 * . a • te · · te te »

φ «« *· *♦ *

I Poiycystemický exliypoxický biótest na myších

BDF1 myší samice (18-20 gms) se podrobily kondicionovánému cyklu (v hypobarickýeh komůrkách) 18 hodin při 0,40 ± 0;02 atm a 6 hodin při normálním tlaku po dobu 14 drií.

Před administrací r-HuEPO nebo testovaných vzorků se myši ponechaly 72 hodin při normálním tlaku. Přo injekce do kohdieióhovánýéh myší se testované vzorky nebo r-HuEPO standard ředily. Prostředek obsahoval PBS s 0,1% BSA (w/v). Každé z 10 myši se podkožně administrovalo 0,5 ml jednotlivých ředění O 48 hodin později se administrovalo ⁵⁹Fe. Po 48 hodinách po administraci ^S9Fe se odebraly vzorky krve. U každého vzorku se provedla měření hematokritu a radioaktivity. Tabulka 23 á Obrázky 17AT7C udávají rozsah dávkování a výsledky pro dva rozdílné testy.

Tabulka 23.

	Dávka		n . .	.. . Střední log
EPO-St	0,000	ϋ	10	0,26
	0,025		10	1,65
	0,050		10	2,74
	0,100		10	3,28
DMSO	1,40%		7	0,58
	0,35%		5	0,60
244-1	0,25	Pg	7	0,62
	0,50		8	0,76
	1,00		,9	0;92
244-2	2,00		9	1,38
			» r\	'4 rt ·
	“TjUU		IV	1,01
	8,00		9	2;26
244-3	14,0		10	2,44
	28,0		10	3,15
	56,0		9 .	3,16

0,1 mg AFFY244 = 1 U r-HuEPO (8,3 ňg) *4 «4

4 · ·

4 44

4 4 · 4

4 4

4 4 ·

4* »

4«

S použitím předešlého polycystemiekěho exhypoxického biqtestu na myších se testoval

T1AQY1CYMGPETWECRPSPKA a dimerní peptidový analog GGTYSCHFGPLTWVGKPQGG obsahující dvě disulíidové vazby (AF12080). Výsledky polycystemického exhypoxického biotestu na myších ukazují Obrázky 18Á-18B. Tabulka 24, infra, ukazuje přibližnou ekvivalenci EPO a nižných mitnetických peptidů.

• 4

O · ·

4 4 4

4 * 4444

4 4

4* ·

Tabulka 24.

Peptid Množství peptidu ekvivalentní — --———0-02-5-jednotkám-EPO (nnio!)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 3,8 (RWJ 61233/AFFY11157)

GGTYSCHFGPLTWVCKPQ 0,5 (RWJ 61596) __________ ____________ - LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD 3,1 (RWJ 61.757)

TIAQYICYMGPETWECRPSPK 11-21 (AAFY11654)

GGTYSCJIFGPLTWVCKPQGG dimer 0,035 (A.FFYI2080)_ ; __ ,_

K. Retikulocytový test

Normálním BDF1 myším samičkám se tři po sobě následující dny dávkoval bud’ EPO, nebo testovaná látka (0,5 ml, S.Q.). Prostředek obsahoval PBS, 10% PEG 8000, 0,25% BSA s přídavkem DMSO, Třetí den se myším také dávkoval (0,1 ml, I P.) dextran železa (100 mg/ml) Pátý den se myši anestetikovaly působením. C0₂ a srdeční punkeí se odebrala krev. Procenta retikuloeytů se stanovila barvením thiazolovou oranži a průtokovou cytometrickou analýzou (retic-count program). Hemátokrity se stanovily manuálně. Korigovaná procenta retikuloeytů se stanovila s použitím následujícího vzorce:

·· ·φ • w · φ

• »

Ο 4 φ* · · ·Φ * φ ·: · ·. φ * φ · «' · φ».

• 4 ··»· · ··* φ · φ φ β φ φ . β

Výsledky získané předešlým retikuloeytovým testem ukazují Obrázky 18Á-18B a 19A-19B - . L. Kóloniový test. Vznik kolonie erythroidu

1. Materiál a metody.

Buňky lidské jaderné kostní dřeně získané ód normálních dárců se umístily na pólopevnou metliylcelulóžu (0,9% methylcelulóža, 30% fetálrií hovězí sérum, 1 % hovězí sérurrialbumin, 10*^{2 * 4}2-merkaptoethanól, 2mM L-glutamin). Buňky se oddělily a červené krvinky se lyžovaly přídavkem pufrovaného⁷ chloridu amonného. Buňky se resuspendovaly v médiu obsahujícím 2% fetální telecí sérum a duplikátně umístily na desku o hustotě 2 χ 1Θ^{5 *} buněk/deska. Kolonie eryf hroiuů a grariuiocyt-ťnaiťrúfágů (G?M) vytvořené po 12 drtechy, kuiture.se hod notiiv. podle, barvy a morfologie. Ke stanovení vzniku kolorite GM že vzorku se použila studijní kontrolní deska obsahující rekombinantní lidské růstové faktory IL-3, GM-CSF a SCF (3/GM/S)

Růstový faktor (nM)	Počet kolonií na 2 x 10⁵ shluklých buněk ~ - · — .·· - - -
Erythr Deska i	oid Deska 2	G-M
Deska 1 ,	Deska 2
Kontrola (bez faktorů)	0	0	Q	0
EPO (0,24)	113	106	12	9 .
RWJ 61233 (1000)	29	23	1	2
RWJ 61233 (10 000)	80	75	2	0
3/GM/S (0,7/0,7/2,7)	0	0	176	212

2. Výsledky:

Z údajů uvedených výše je zřejmé, že GGTYSCIiFGPLŤWVCKPQGG (RWJ

61233/AFFY11157) je schopný vyvolat vznik kolonie erythroidů v nepřítomnosti dalších cytokininů. Peptid navíc vykazuje striktní specifrtu pro rodinu erythroidů. svou neschopností vyvolat vznik kolonie GM rodiny.

Výše uvedený popis je ilustrativní, nikoliv restriktivní. Odborníkům znalým v oboru bude podle výše uvedeného popisu zřejmo mnoho provedení: Přehled vynálezu se proto nestanoví podle výše uvedeného popisu, ale měl by být určen s ohledem na přiložené nároky, společně s úplným přehledem ekvivalentů, ke kterým se nároky opravňují. Popis všech Článků a odkazů, včetně patentových publikací je zde zařazen do odkazu.

0 » · 0 · 0 0 0 0 • 0 000* 00 00 • 0« 0 * 000· · ·0· 0 0 0 0 0 0» » · » 0·00 0000 00 0 ·· 00

Průmyslová využitelnost

Látky podle vynálezu jsou použitelné in vitro jako nástroje porozumění biologické role EPO a poskytují důležité informace o vztahu struktury a reaktivity. Na zaklade schopnosti vazby na EPO-receptoiy jsou peptidy podle předkládaného vynálezu použitelné jako činidla pro detekci EPO-receptorů v živých buňkách, fixovaných buňkách, v biologických tekutinách, tkáňových homogenátech, v purifik ováném přírodním materiálu átd. Látky podle vynálezu jsou také použitelné jako komerční výzkumná činidla pro různá medicínská výzkumná a -diagnostická pouzá;. Látky podle vynalezu jsou admiriiSifovaieine icpiOKicvnym zivociciium, vcěihe lidi, pro stimulaci vázání EPO; ná EPO-R in vivo a naleznou použití při terapii konečného stadia renáíního Šelhání/dialýzy; aňemie spojené s.AIDS, anemie spojené s chronickými zánětlivými Chorobami, autoimunitní choroby a malignancií; a pro navýšení počtu červených krvinek u pacienta před chirurgickým zákrokem. Látky podle vynálezu naleznou také použití při terapii různých vaskulámích poruch, jako podpora hojení ran, růst kplaterálních koronárních cév, trauma, terapie po vaskulářním štěpu terapie různých neurologických poruch spojených s nízkými hladinami acetylchólihu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY * 1. Peptid o.délce 10 až 40 aminokyselinových zbytků, v y z n a Č u j i c,í s c t í m, že.se váže na erythropoietinový receptor a obsahuje sekvenci aminokyselin ll ₄ * i

XjX^XjGPXgTWXyXg, kde se každá aminokyselina označuje standardní jednopismeňovou zkratkou; X_fJ se nezávazně vybírá z jakékoliv z 20 geneticky kódovaných L-amihókyšelin; X₃ je C; XJe R, H, L nebo W; X₅ jeM, F nebo I; X₇ je D, É, I, L nebo V; a X_g je C.
2. Peptid podle nároku T, v y z n a č U j i cíše t i m, že obsahuje sekvenci aminokyselin _____YXjXiXiXíGPXgTWX^Xg, kde sékaždáiániinokyšefina označuje standardní--jednopismeňovou zkratkou, každé X₂ a Xg se nezávazně vybírá Z jakékoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X₃ je Č; X₄ je R, H, L nebo W; X₅ je M, F nebo I; X₇ je F),

Ε, I, L nebo V; a X₈ je C.
3 Peptid podle nároku 2, v y z na č u j í c i s e t i m, že obsahuje sekvenci aminokyselin X_}YXPQQXjGPXgTWXjXgXgXjuX,,, kde se každá aminokyselina Označuje standardní jednopismeňovou zkratkou; každé X,, X₂, Xg, X,, X,_o a X;, se nezávazně vybírá z jakékoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X₃ je C; X₄ je R, H, L nebo W; X_sje M, F nebo l; X₇ je D, Ε, I, L nebo V; a Xg je C.
4. Peptid podle nároku 3, v y z n a č u j í c í s e t i m, že X₄ je R nebo H; X₅ je F nebo M; Xg je I, L, Τ, Μ, E nebo V; X₇ je D nebo V; X₉ je G, K, L, Q, R, S nebo Ť; a X₁₀ je A, G, P, RneboY
5. Peptid podle nároku 4, vy z n ač ují c í s e t í m, že X, je D, E, L, N, S, T nebo V; X₂je A, Η, K, L, M, S nebo T, X₄ je R nebo H; X₉ je K, R, Š nebo T; X_|ťJ je P.
6. Peptid podle nároku -1, v y Z n a č u j ící setím, že sé vybírá ze skupiny obsahující: GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG;

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG;

GGTYSCHFGPLTWVCKPQ;

GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG;

4 9 4 • 4 44

44 4 4

4 4

94 94 • · * • 9 9 9

9 9 999 9

9 9 4

99 9 • ·

VGNYMCHFGPITWVCŘPGGG; GGNYMCHFGPITWVCRPGGG; GGVYACRMGPITWVCSPLGG; VGNYMAHMGPITWVCRPGG; GGPHHVYACRMGPFTWIC, GGTYSCHFGPLTWVCKPQ; GGLYACHMGPMTWVCQPLRG; T1AQY1CYMGPÉTWECRPSPKA;

YSCHFGPLTWVCK;___

YCHFGPLTWVC,

Ac-GGTYSCHFGPFTWVCKPQGG;

GGCRIGP1TWVCGG;

LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD;

GGTASCHFGPLTWVCKPQGG;

GGNYYCRFGP1TFECHPTGG;

GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG,

GGLYTCRMGP1TWVCLPAGG;

GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG;

GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG.

GGTYSCHFGALTWVČKPQGG;

GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG;

GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG;

.. GGTYSCHFGPATWVCKPQGG, GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG; GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG; TYSCHFGPLTWVCKPQ; YSCHFGPLTWVCKP; SCHFGPLTWVCK; GGTYSCFGPLTWVČKPQGG; TYSCRFGPLTWVCKPQGG; YSCHFGPLTWVC,

99 «9

9 9 9 9

9< 9 99

99« 9 9

9 9 9

99 9 9

9« 99 • 9 · · • 9 * 9

9 · »•999·*·

99 9

9 9 9

9 9 · 9

9 9 9999

9 9 9 »9 9

GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG; a HFGPLTWV.
7. Peptid podle nároku 1, vy z nač u j i c i seti m, že se vybírá ze skupiny obsahující: GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG;

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG,

GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG;

VGNYMCHFGPITWVCRPGGG;

GGVYACRMGPITWVCSPLGG;______

VGNYMAHMGP1TWVCRPGG,

GGPHHVYACRMGPLTWIC,

GGT YSCHFGPLTWVCKPQ;

GGLYACHMGPMTWVCQPLRG;

TlAQYICYMGPETWECRPŠPKA;

YSCHFGPLTWVCK;

YCHFGPLTWVC; a HFGPLTWV.
8. Peptid podlé nároku 1, vyznačuj ící se tím, že sekvence aminokyselin je cyklizovaná.
9. Peptid podle nároku 1, v y z n a č u j ící s e t í m^ že se vybírá ze skupiny obsahující:

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG; - ......

GGTYSCHFGPLTWVCKPQ;

GGLYACHMGPMTWVCQPLRG;

TlAQYICYMGPETWECRPŠPKA;

YSCHFGPLTWVCK;

YCHFGPLTWVC;

AoGGTYSCHTGPLTWVCKPQGG;

GGCRJGPITWVCGG;

LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD;

00 40

0 0 0

0> 0 00

000 0 0

0 0 0

00 0 1

00 0

0 · 0

0 0 0 0

0 0 0 0000

0 0 0

0S ·

00 «0 • 0, 0 *

0 ·

0 0

0 · • 00 0 0000 i

GGTASCHFGPLTWVCKPQGG;

GGNYYCRFGP1TFECHPTGG;

GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG,

GGLYTCRMGPITWVCLPAGG;

GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG,

GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG;

GGTYSCHFGALTWVCKPQGG;

GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG,

GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG;

GGTYŠCHFGPATWVCKPQGG;

GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG;

GGTYSGHFGPLTFVCKPQGG;

TYSCHFGPLTWVCKPQ;

YSCHFGPLTWVCKP;

YSCHFGALTWVGK;

SGHFGPLTWVCK;

GGTYSEHFGPLTWVKKPQGG;

GGTYSCFGPLTWVCKPQGG;

TYSCHFGPLTWVCKPQGG;

YSCHFGPLTWVC;

GGTYSGHFGPLTFVCKPQGG, a GGTYSEHFGPLTWVKKPQGG.
10. Peptid podle nároku 1, v y znač ují c í set í m, Že sekvence aminokyselin je dimenzovaná.
11. Peptid podle nároku 10, v y z n a č u j í c í setím, že obsahuje následující sekvenci aminokyselin:

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG I I

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG

44 44 • 44 4

4-. 4 44 • 44 4 4

4 4 4

44 44 • 4 ·

4 4 4

4 4 4 4

4' 4 · 4444

4 4 4

44 ·

4 · • · • *

44444444
12. Farmaceutický přípravek, v y zň a č u j í c í se t í m, žě obsahuje látku pole nároku 1 V kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
13. Způsob terapie pacientů s poruchou charakterizovanou nedostatkem erythropóietinu nebo nízkou nebo défektni populací červených krvinek, v y z n a č uj í čí s e t í m’ že zahrnuje administraci pacientu terapeuticky efektivního množství peptidu podle nároku 1.

1.4. Způsob podle nároku 13, v y z n á č u j í c i s e t i m, že porucha je konečné stádium rsnáJniHo colplóřtí- «λΙλλ /4f ti li r-τι iuviijuaii iiVVV UIUCLlilslLU-V» spoiCnaS AíDS/aútoiiiiunitni choioba nebo malignacie; beta-thalasémie; cystická fibróza; raná anemie předčasně zralých; anemie spojená s chronickými zánětlivými Chorobami, poraněni míchy; akutní Ztráta krve, stárnutí; a stavy neoplastických chorob doprovázené abnormální erythropoietikou.
15. Způsob podle nároku 13, v y z n a č u j i c í s e t í m, že peptid obsahuje sekvenci aminokyselin YX₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X_g, kde se každá aminokyselina označuje standardní jednopísmenóvou zkratkou, každé X₂ a X₆ se nezávazně vybírá z jákékoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokýsélin; X₃ je C; X₄ je R, H, L něho W; X₅ je M, F nebo I; X₇ je D, E, 1, L nebo V; a X_g je C.
16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se t í m, že peptid obsahuje sekvenci aminokyselin Χ,ΥΧ,Χ,Χ^ΟΡΧ^ν/Χ-,Χ^Χ^Χ^, kde se každá aminokyselina označuje standardní jednopísmenóvou zkratkou; každé X,, X₂, X_6; Xg, X_!0 a X_t) Se nezávazně vybírá z jakékoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin, X₃ je G; X₄ je R, H, L nebo W; X₅ je M, F nebo I; X₇ je D, É, I, L nebo V, a X_s je G.
17. Způsób podlé nároku 16, v y z n a Č u j í č í setí m, že X₄ je R nebo H; X_s je F nebo M; X₆je I, L, T, M nebo V; X₇ je D nebo V; X₉je G, K, L, Q, R, S nebo T; a X₁₀je A, G, P, R nebo Y.
18. Způsob podle nároku 17, vy z n ač u j í c í s e t í m, že X,je D, E, L, N, S, T nebo V;

X₂ je A, Η, K, L, M, S nebo T, X₄ je R nebo Η; X, je K, R, S nebo T; a X_t0 je P *0 00 « 0 0 0

01 0 00

000 0 ·

0 0 0

0 0 0 0

0« 00

0 0 0 0 • *

0 *

0 0

000 0 0000

00 0

0 0 0 ♦ 0 0 0

0 0 0 0 0

0 0 0

00 0
19. Způsob podle nároku 13, v y z n a ču j í c i s e t í m, že peptid se vybírá ze.škupiny iíeí:

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG,

GGTYSCHFGPLTWVCKPQ;

GGĎYHCRMGPLŤWVCKPLGG;

VGN YMCHFGP1TWVCRPGGG;

GGNYMCHFGPITWVCRPGGG;

GGVYÁCRMGPITWVČSPLGG;

VGNYMAHMGP1TWVCRPGG;

GGPHH VYACRMGPLTWIC,

GGTYSCHFGPLTWVCKPQ;

GGLYACHMGPMTWVCQPLRG,

TIAQY1CYMGPETWECRPSPKA;

YSCHFGPLTWVCK;

YCHFGPLTWVC;

Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG;

GGCRIGPITWVCGG;

LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD;

GGTASCHFGPLTWVCKPQGG;

GGNYYCRFGPITFECHPTGG,

GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG;

GGLYTCRMGPITWVCLPAGG;

GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG;

GGTFSGHFGPLTWVCKPQGG,

GGTYSCHFGALTWVCKPQGG;

GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG;

GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG;

GGTYSCHFGPATWVCKPQGG;

GGTYSCHTGPLTAVCKPQGG,

GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG;

• 9

9« «9 99 9 9· • 949 9 4 4 «94«

9 9 «949 49 4«

4 4 4 4 9444 49 44 4* 4 • 4 949 444

4449 9449 94 * *9 99

ŤYSCHFGPLTWVCKPQ;

YSCHFGPLTWVCKP;

SCHFGPLTWVCK,

GGTYSCFGPLTWVCKPQGG;

TYSCHFGPLTWVGKPQGG;

YSCHFGPLTWVC;

GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG;

aHFGPLTWV.

____
20. Způsob podlé nároku 13, v y znač u jící se ti m, že peptid je cyklizovaný.
21. Způsob podlé nároku 13, vyznačující se t í m, že peptid je dimenzovaný.
22; Způsob terapie pacientů s poruchou charakterizovanou nedostatkem eiythropoietinu nebo nízkou nebo defektní populací Červených krvinek, v y z n a č u j í c í se tí m, že zahrnuje administraci pacientu terapeuticky efektivního množství peptidu o délce 10 až .40 aminokyselinových zbytku, vážícího se na erýthropoietinový.receptor a obsahujícího sekvenci aminokyselin X₃X.,X_SGPX₆TWX₇X₈ (Sekvence ID NO:), kde se každá . aminokyselina označuje standardní jednopíšménovóu zkratkou; 3¾ se nezávazně vybírá z jakékoliv z 20 geneticky kódovaných L-arainOkyselin; X_? je C; X₄ jc R, H, L nebo W, Xj je M, F nebo I; X₇ je D, E, I, L nebo V; a X_s je C.

.
23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se t í m, že porucha je konečné stádium renálňího. selhání nebo diatýzy; anemie spojená s AIDS, autoimunitní choroba nebo malignacie; béta-thalasemie; cystická fibróza; raná anemie předčasně zralých; anemie spojená s chronickými záhetEvýmichorobami; poranění míchy; akutní ztráta krve; stárnutí; a stavy neoplastických chorob doprovázené abnormální erythropoietikou.
24. Způsob podle nároku 22, vyznač u j í c í s e t í m, že peptid obsahuje sekvenci aminokyselin YX_iX₃X₄X₅(jPXšTWX₇Xg, kde se každá aminokyselina označuje standardní jednopísmenovou zkratkou; každé X₂ á X₆ se nezávazně vybírá z jakékoliv z 20 geneticky • 4 ·* «0 0 ·* • 000 0 0 · 0 • 0 0000 0«·· • 4 · 0 « ·00· 0 00« · 0 • 0 000 00* 00000000 00 0 ·· 00 kódovaných L-aminokyselin; X₃ je C; X₄. je R, H, L nebo W; X_s je M, F nebo I; X₇ je D, Ε, I, L nebo V, a X, je C
25. Způsob podlé nároku 24, v y zná č lij í cíše t í m, že peptid obsahuje sekvenci aminokyselin X, YX₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X_aX₉X_l0X₁₁, kde se každá aminokyselina Označuje standardní jednopísmenovou zkratkou; každé X_l7 X₂, X₆, X₉, X_1U a X_u se nezávazně vybírá z jakékoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin, X₃ je C; X₄ je R, H, L nebo W; X_s je M, F nebo I; X₇ je D, E, 1, L nebo V; aX_gjeC.
26. Způsob podle nároku 25, v y z n a.č-u j í e í setí íň, že X₄ je R nebo H; X₅ je F nebo Μ; X,; je l, L Τ, M nebo V; X₇ je D nebo V; X, je G, K, L, Q, R, S nebo T; a X_]0 je A, G, PRneboY
27. Způsob podle nároku 26, vyznačují c i s e t í m, že X, je D,Έ, L, N, S, Tnebo V; X₂ je A, Η, K, L, M, S nebo T, X₄ je R nebo H; X₉ je K, R, S nebo T; a X_J0 je P.
28. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, žě se peptid vybírá ze skupiny obsahující.