KR19990022656A

KR19990022656A - 에리트로포이에틴 수용체(ｅｐｏ-ｒ)에 결합하는 화합물 및 펩티드

Info

Publication number: KR19990022656A
Application number: KR1019970709231A
Authority: KR
Inventors: 씨. 라이튼 니콜라스; 제이. 도워 윌리엄; 에스. 창 레이; 케이. 케쉬얍 아런; 케이. 졸리프 린다; 존슨 다나; 멀케히 린다
Original assignee: 린골드 고돈; 아피맥스 테크놀로지스, 엔.브이.; 존 더블유. 하버; 오르토 파마슈티칼 코오포레이숀
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-03-25
Also published as: NO975729L; EP1510524A2; PL185040B1; AU712713B2; JP2007277264A; JP2009280616A; CA2223833A1; KR100459984B1; DE69630708T2; ATE254138T1; EP0886648B1; JPH11507367A; NO975729D0; EP0886648A4; WO1996040749A1; NO318783B1; BR9609006A; CN1192748A; NZ310804A; AU6166796A

Abstract

본 발명은 EPO-R에 결합하거나 EPO 작용물질로서 작용하며, 길이가 10 내지 40개 또는 그이상인 아미노산 잔기로서 구성되며, 그 서열이 X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈(서열 번호)을 가진 펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다: 여기서 각 아미노산은 표준 용어 약기법으로 다음과 같은 의미를 갖는다: X₃는 C; X₄는 R, H, L, 또는 W이고,; X₅는 M, 또는 F이고; X₆는 유전공학적으로 암호화된 L-아미노산 또는 입체이성체 D-아미노산 20개중 어느 하나로부터 각기 선택된 것이며; X₇는 D, E, I, L, 또는 V이고; X₈는 C이다.

Description

에리트로포이에틴 수용체(ＥＰＯ-Ｒ)에 결합하는 화합물 및 펩티드

EPO는 165개의 아미노산, 아미노산의 24, 38, 83 및 126 위치상의 4개의 글리코실화 반응 부위를 지니며, 분자량이 약 34,000인 당단백질 호르몬이다. EPO는 초기에는 23 개의 아미노산으로 이루어진 단일 펩티드를 갖는 전구체 단백질로서 생성된다. EPO는 알파, 베타 및 아시아로(asialo)의 3가지 형태가 있다. 알파 및 베타형은 탄수화물 성분이 약간 다르지만, 동일한 효능, 동일한 생물학적 활성도, 및 동일 분자량을 지니고 있다. 아시아로형은 말단의 탄수화물(시아린산)이 제거된 알파 및 베타형이다. EPO를 암호화하는 DNA서열은 미국 특허 제 4,703,008호(Lin, 1987)에서 보고된 바있다.

EPO는 유사분열 및 적혈구 전구체 세포의 다양화를 자극하여 적혈구의 생산을 하는 물질로서, 저산소증 조건이 우세할 때 신장에서 생성된다. EPO에 의해 유도된 적혈구 전구체 세포가 다양화되는 동안에 글로빈 합성이 유도되고 햄 복합체의 합성과 페리틴 수용체의 수가 증가한다. 이것은 상기 세포로 하여금 보다 많은 양의 철 생산을 가능하게 할 뿐아니라 작용성 헤모글로빈의 합성도 가능케한다. 성숙된 적혈구에 있는 헤모글로빈은 산소와 결합하므로, 적혈구 및 이에 들어있는 헤모글로빈은 체내에 산소를 공급하는데 있어서 중요한 역할을 담당한다. 개시된 바있는 상기 복합체의 형성 과정은 적혈구 전구세포의 세포 표면상에 적당한 수용체와 EPO의 상호작용하므로써 일어된다(Graber 및 Krantz(1978) Ann. Rev.Med. 29:51-66 참조).

신체가 건강한 상태에 있을 때 조직은 존재하는 적혈구수로 부터 충분한 산소를 공급받기 때문에 MEPO는 혈장에서 저농도로 존재한다. 이러한 정상상태의 낮은 농도는 노화로 인해 일반적으로 소실되는 적혈구 세포의 대체를 자극하는데 충분하다.

순환시에 혈액 세포에 의해 운반되는 산소의 양이 감소될 때 저산소증 조건하에서 순환시 EPO의 양이 증가한다. 저산소증은 출혈을 통한 다량의 혈액 손실, 방사선 조사에 과도로 노출됨으로 인한 적혈구 세포의 파괴, 고도가 높은 곳이나 오랜동안 무의식 상태로 인해 오는 산소 흡입량의 감소, 또는 여러 가지 형태의 빈혈에 의해 일어날 수있다. 저산소성 긴장을 겪는 조직에 반응하여 적혈전구 세포의 증식이 자극되므로써 EPO는 적혈구의 생산을 증대시킨다. 순환시에 적혈구 세포의 수가 정상의 조직 산소 요구치보다 큰 경우에 EPO의 양은 감소한다.

EPO 호르몬이 적혈구 형성 과정에 필수적인 것이기 때문에, 이 호르몬은 낮은 함량 또는 결핍성 함량의 적혈구 생산으로 인한 혈액질환의 진단 및 치료에 획기적인 유용한 용도를 부여할 가능성을 충분히 안고 있다. 최근의 연구는 다양한 질환 상태, 장애, 및 혈액성 병변 상태 치료에 EPO가 효능이 있음을 기본 연구 주제로 하여 왔다. 이러한 것들의 예로는 다음과 같은 것들이 있다; 베타 탈라세미아증(지중해 빈혈증이라고도 함, Vedovato 등, 1984년, Acta. Haematol. 71:211-213 참조); 낭포성 섬유증(Vichinsky등, 1984, J.Pediatric 105:15-21 참조); 임신 및 정신 질환(Cotes등 1983, Brit. J. Ostet.Gyneacol. 90:304-311 참조); 미숙으로 인한 초기 빈혈(Haga등, 1983, Acta Pediatr. Scand. 72:827-831 참조); 척수손상(Claus-Walker 등, 1984, Arch.Phys.Med.Rehabil. 65:370-374 참조); 공간 도피증(Dunn등, 1984, Eur. J.Appl.Physiol. 52:178-182 참조); 급성 혈액 소실증(Miller 등, 1982, Brit.J.Haematol.52:545-590 참조); 노화(Udupa 등, 1984, J.Lab.Clin.Med.103:574-580 및 581-588, Lispschitz등, 11983, Blood 63:502-509 참조); 비정상 적혈구 생성에 의해 수반되는 여러 가지 종양형성 질환(Dainiak등, 1983,Cancer 5:1101-1106 및 Schwartz등, 1983, Otolaryngol, 109:269-272 참조); 및 신부전증(Eschbach등, 1987, N.Eng.J.Med. 316:73-78)등.

Hewick의 미국 특허 제 4,677,195호에는 정제되고 균일한 EPO가 기술되어 있다. EPO를 암호화하는 DNA 서열을 정제한 뒤 클론화하고, 이를 발현시켜 동일한 생화학 특성 및 면역학 특성을 갖는 합성 폴리펩티드를 생산하였다. 천연 물질상의 올리고당과 동일한 올리고당을 갖는 재조합 EPO 분자가 생산된 바있다(Sasaki등, 1987, J.Biol.Chem. 262:12059-12076).

정제된 재조합 EPO가 지닌 유용성에도 불구하고, EPO에 의해 유도되는 적아구의 증식과 다양성의 기전에 관해서는 거의 알려져있지 않다. 미성숙된 적혈구 세포, 혈소판, 및 거핵구의 전구세포들과 EPO의 특이적인 상호반응은 여전히 규명될 필요가 있다. 규명되지 못하고 있는 이유는 적어도 부분적으로는 정상 적혈구 모세포 및 적백혈병 세포주상에서 표면 EPO 수용체 분자의 수가 적기 때문이다. 이에 대해서는 다음 문헌에 나타나 있다: Krantz and Goldwaser(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA Letters 211:229-233; Mufson and Gesner(1987) Blood 69:1485-1490; Sakaguchi et al.(1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:7-12; Sawyer et al.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3690-3694; Sawyer et al.(1987) J. Biol. Chem. 262:5554-5562; and Todokoro et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4126-4130.

방사상 요오드화된 EPO와 세포 표면 단백질과의 가교된 복합체가 제시하는 바는 세포 표면 단백질이 각기 약 85,000 달톤 및 100,000 달톤을 갖는 두 개의 폴리펩티드를 함유한다는 것이다. 특히, 두 개의 가교된 복합체는 V8 프로테아제 분해 처리를 받으며 동일한 펩티드 단편을 가지는 것으로 밝혀졌는데, 이는 두 개의 EPO 결합 폴리펩티드가 동일하거나 매우 유사한 유전자의 생성물일 수있다는 것을 암시한다(Sawyer등, 1988 상기 참조). 하지만, 대부분의 세포 표면 결합 연구는 결합부위가 세포 표면 하나에 대하여 300-600으로 구성되며, Kd가 약 800 pM(피코 몰농도)인 된 단일부류를 나타냈다(Sawyer등, 1987, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 84:3690-3694). 하지만, Friend 백혈병 바이러스의 빈혈 균주(FVA)로 주사된 쥐로 부터 얻은 EPO 반응성 비장의 적아구는 각기 100pM 및 800pM의 해리상수를 각기 가지는 것을 볼 때 높은 친화도 및 낮은 친화도를 각각 지니는 것으로 입증된다(Sawyer등, 1987, J.Biol.Chem. 262:5554-5562 및 Landschulz, 1989, Blood 73:1476-1478 참조). 쥐 및 인간의 EPO 수용체 단백질의 DNA 서열 및 암호화된 펩티드 서열이 개시된바 있다(D'Andrea 등, PCT 특허 공개번호 제 WO 90/08822, 1990년 공개).

EPO-R의 클론화된 유전자는 이 중요한 수용체의 작용 물질 및 길항 물질에 대한 연구를 용이하게 한다. 재조합 수용체 단백질의 유용성은 무작위 및 반 무작위적인 펩티드 다양성 세대 시스템에서의 수용체-리간드 상호작용의 연구를 가능케한다. 이들 시스템은 1991년 10월 16일에 출원된 미국 특허 출원 제 778,233에 기술된 플라스미드상의 펩티드, 1991년 6월 20일에 출원된 미국 특허 출원 제 718,577호의 파지의 펩티드계; Cwirla 등의 1990년 8월에 출간된 Proc. Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382; 1992년 9월 16일에 출원된 미국 특허 출원 제 946,239호의 암호화된 합성 라이브러리(ESL) 시스템; 1990년 3월 7일에 출원된 미국 특허 출원 제 492,462호에 기술된 대규모의 고정화 중합체 합성 시스템; 1990년 12월 13일에 공개된 PCT특허 출원 공개 제 90/15070호; Fodor등 1991년 2월 15일, Science 251:767-773; Dower Fodor, 1991, Ann.Rep.Med.Chem. 26:271-180; 1991년 12월 6일에 출원된 미국 특허출원 제 805,727호에 개시되어 있다.

하지만, 이 수용체에 의해 매개되는 중요한 생물학적 활성도에 대한 연구와 질환의 치료라는 두가지 경우에 있어서 EPO-R에 결합하거나 또는 그렇지 않으면 이와 상호반응하는 화합물에 대한 요구는 여전히 절실하다. 본 발명은 이러한 화합물을 제공한다.

본 출원은 본 명세서에 참고로 인용된 1993년 11월 19일자에 출원된 미국 특허출원 제 08/155,940호의 CIP 출원인 1995년 6월 7일에 출원된 미국 특허출원 제 08/484,635 및 08/484,631호의 CIP출원이다.

본 발명은 에리트로포이에틴 수용체(EPO-R)에 결합하여 이를 활성화시키거나 또는 그렇지 않으면 EPO 작용 물질로서 기능하는 펩티드 및 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 생화학분야 및 의료화학분야를 기술분야로 하는 것으로서 특히 인간의 질환 치료에 사용되는 EPO 작용물질을 제공한다.

도 1은 본 명세서에 기술된 과정에 사용된 돌연변이 올리고머의 서열을 도시한 것이다.

도 2-1 및 도 2-2는 본 발명의 대표적인 펩티드 서열을 도시한 것이다.

도 3은 pVIII 디스플레이 시스템을 사용한 신규한 파지미드 변이 라이브러리를 도시한 것이다. 이 라이브러리에서 두 개의 시스테인뿐 아니라 티로신, 글리신-프롤린 및 트레오닌-트립토판 잔기(밑줄 그은 것)가 고정되었다. 시스테인 잔기 사이의 다른 위치(원래의 AF11154 히트 펩티드에 존재하는 밑줄친 이탤릭체로 나타나 있음)은 올리고 구조물에 의해 변이되어 각 아미노산 잔기가 50%의 빈도로 다른 것을 변화시킬 수 있다. X는 랜덤 아미노산 위치를 나타낸다.

도 4A-4C는 현재 제작 및 스크리닝된 pIII 및 pVIII 파지미드 변이 라이브러리를 도시한 것이다. 굵은 활자체의 아미노산 잔기는 고정된 것이고, 나머지(NNK로 나타난 것)은 랜덤화된 것이다. 4A(ON3007) 및 4C(ON3017)은 코어 서열(티로신에서 두 번째 시스테인)에 각기 N-말단 및 C-말단인 추가로 인접한 영역의 기여도를 연구하기 위해 제작된 것이다. 4B(ON3016)은 펩티드 Y-CHFGPLTWVC 골격을 갖는데, 여기서 티로신 잔기는 첫 번째 시스테인 바로 다음에 위치한다. 이 라이브러리는 또한 코어 서열 양측면에 부가의 임의의 잔기를 갖고 있다.

도 5는 신규의 Lac-I 디스플레이 벡터(헤드피스 이량체)를 사용하여 제작되고 스크린 된 것으로서 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG인 변이 라이브러리를 도시한 것이다. X로 나타난 아미노산 잔기는 랜덤의 것이고(NNK), 밑줄쳐진 것들은 약간 변이된 것이고(91:3:3:3/91:3:3:3/K) 반면에 아웃라인으로 표시된 것들은 높은 정도로 돌연변이 된 것이다(70:10:10/70:10:10/K).

도 6은 신규의 Lac-I 디스플레이 벡터(헤드피스 이량체)를 사용하여 제작되고 스크린된 것으로서 TIAQYICYMGPETWECRPSPKA 변이 라이브러리를 도시한 것이다. X로 나타난 아미노산 잔기는 랜덤한 것이고(NNK), 아웃라인으로 표시된 것들은 고정된 것이며, 두 개의 글루타민산 잔기들이 약간 변이 되었다(91:3:3:/91:3:3:/K).

도 7은 하기의 펩티드로부터 선택하기 위해 FDCP-1/hEPO-R 생물학적 분석 결과를 그래프로 도시한 것이다:

●는 GGCRIGPITWVCGG의 결과를 나타낸 것이고,

○는 GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG의 결과를 나타낸 것이고,

■는 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG의 결과를 나타낸 것이고,

▲는 GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG의 결과를 나타낸 것이고,

▼는 VGNYMCHFGPITWVCRPGGG의 결과를 나타낸 것이고,

｜는 GGVYACRMGPITWVCSPLGG의 결과를 나타낸 것이고,

+ 는 VGNYMAHMGPITWVCRPGG의 결과를 나타낸 것이고,

* 는 EPO의 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 EPO의 TF-1 생분석의 결과를 그래프로 표시한 것이고(▲ 및 ◆는 EPO 및 웰 하나에 대하여 10,000-20,000 세포를 사용한 분석결과를 나타낸 것임); 또한 펩티드 VGNYMCHFGPITWVCRPGGG(서열번호)의 생물학적 분석 결과를 그래프로 도시한 것이다(■ 및 ●는 펩티드 및 웰 하나에 대하여 10,000-20,000 세포를 사용한 분석결과를 나타낸 것임).

도 9A(대조), 도 9B(500pM EPO로 처리) 및 도 9C(25㎜ GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG로 처리한 것)는 페닐히드라진으로 처리한 마우스의 비장 세포의 대표적인 군락에 대해 MTT 증식 분석 결과를 200배율로 사진 촬영한 것이다.

도 10은 스트렙타비딘으로 올리고화반응을 수행함으로써 비오틴화된 펩티드(즉, GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK), Ahx-비오틴의 개선된 효능을 보여주는 FDCP-1/hEPOR 생물학적분석 결과를 그래프로 도시한 그래프이다. 펩티드 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 및 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-비오틴)-스트렙타비딘 복합체는 거의 동일한 활성도를 나타내지만, 후자의 펩티드가 스트렙타비딘과 예비 복합될 때, 효능이 더 커진다. 이러한 분석에 있어서, 활성도는 제일 낮은 농도(복합체중의 펩티드에 대하여 5nM)에서 거의 감소되지 않는 것으로 나타난다. 스트렙타비딘 단독으로는 고농도에서 최저의 활성도를 갖는다.

도 11은 펩티드 AF11505의 효능이 다클론성 염소 항-비오틴-조정된 것에서 증가되었음을 나타내는 FDCP-1/hEPOR의 결과를 그래프로 도시한 것이다. GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-비오틴)과 염소의 항-비오틴 항체(GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK+G 항-B)의 예비복합체는 유리 펩티드에 펩티드 하나의 로그에 대한 효능을 증가시켰었음을 도시한 것이다. 정제된 항체(G 항 -B)는 자극적인 효과를 지니지 못했다.

도 12는 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG의 이량체성 펩티드 아날로그 제조물에 대한 합성도식을 나타낸 것이다.

도 13은 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG의 이량체성 펩티드 아날로그의 IC₅₀을 도시한 것이다. mAB179상에 고정화된 PIG 표지가 붙은 EPO-R에 대하여 방사 리간드 경쟁 결합 분석을 사용하여 친화도를 측정하였다.

도 14는 FDCP-1/hEPOR 세포증식 분석을 사용하여 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG의 이량체성 펩티드 아날로그의 시험관내 생물학적 활성도를 도시한 것이다. 이량체성 펩티드는 모 펩티드에 대하여 효능이 20배 증가된 약 20nM의 EC₅₀을 지닌다.

도 15는 FDC-P1/ER의 세포 사이클 진행을 도시한 것이다.

도 16은 아가로즈 비드상에 고정화된 EBP와 [¹²⁵I]EPO의 특이적인 결합에 대한 평형 결합 분석을 도시한 것으로서 결합 등온선의 선형 형질전화(Scatchard)를 기준으로 5nM±2Kd를 나타낸다.

도 17A, 17B 및 도 17C는 각각 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, GGTYSCHFGPLTWVCKPQ 및 LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD를 사용하여 적혈구 증가성의 저산소증 감소된 마우스를 생물학적으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 18A 및 도 18B는 펩티드 TIAQYICYMGPETWECRPSPKA 및 두 개의 디설파이드 결합을 함유하는 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(AF12080) 이량체성 펩티드 아날로그인을 사용하여 적혈구 증가성의 저산소증이 감소된 쥐의 생물학적 분석 결과를 도시한 것이며,

도 19A 및 도 19B는 EPO 및 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG를 사용하여 망상적혈구 분석을 수행한 결과이다. 두 개의 복용그룹에서 10마리의 동물이 사용되었다. EPO 총복용량; 0.4, 4.0, 40.0 유닛/마우스, 총 복용 매질 대조물; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG; 2.0, 20.0, 200.0㎍/마우스, 총 복용매질 대조물 + DMSO(1-2%) 200㎍/마우스 = 10㎎/㎏ 비율: 시험관내에서 증식분석 데이터는 다음과 같은 비율을 갖는다; 2㎍의 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG = 0.4 유닛의 EPO.

도 20A 및 도 20B는 각각 EPO 및 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG를 사용하여 망상적혈구를 분석한 결과를 도시한 것이다. 두 그룹의 경의 10마리의 동물이 사용되었다. EPO 총복용량: 0.4, 4.0, 40.0 유닛/마우스; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG: 1㎎/마우스의 양으로 증가시 총복용량 = 50㎎/㎏이고, 2㎎/마우스의 양으로 증가시 총복용량은 ㎎/㎏이다.

본 발명의 바람직한 양태

하기의 용어는 다음과 같은 통상의 의미를 갖는다;

펩티드에서 아미노산 잔기는 다음과 같은 약어를 가진다: 페닐알라닌은 Phe 또는 F;루이신은 Leu 또는 L;이소루이신은 Ile 또는 I;메티오닌은 Met 또는 M;발린은 Val 또는 V;세린은 Ser 또는 S; 프롤린은 Pro 또는 P;트레오닌은 Thr또는 T; 알라닌은 Ala 또는 A;티로신은 Tyr 또는 Y;히스티딘은 His 또는 H;글루타민은 Gln 또는 Q;아스파라긴은 Asn 또는 N;리신은 Lys 또는 K;아스팔트산은 Asp 또는 D;글루타민산은 Glu 또는 E;시스테인은 Cys 또는 C;트립토판은 Trp 또는 W; 아르기닌은 Arg 또는 R; 및 글리신은 Gly 또는 G이다.

본 발명의 화합물의 적합한 성분으로서는 20개의 통상적인 아미노산의 입체이성체들(예; D-아미노산), a,a-이치환 아미노산같은 비천연 아미노산, N-알킬 아미노산, 젖산, 다른 비공지된 아미노산등이 가능하다. 여기서 비공지된 아미노산의 예로는 4-히드록시 프롤린, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, 및 다른 비슷한 아미노산 및 이미노산(예; 4-히드록시프롤린)을 포함한다.

작용물질이란 생물학적으로 활성을 갖는 리간드를 의미하는 것으로서 이 리간드는 이의 상보성의 생물학적 활성 수용체에 결합하여 후자를 수용체중에서 생물학적으로 반응을 일으키거나 또는 수용체의 이미 지니고 있는 생물학적 활성도를 증진시킨다.

숙주 세포란 재조합 DNA 벡터에 의해 형질전환될 수있거나 전환된 원핵 또는 진핵세포 또는 이들 세포군을 말한다. 본 발명의 목적과 관련해서는 원핵 세포가 바람직하다.

펩티드 또는 폴리펩티드는 단량체가 아미드 결합을 통하여 함께 결합되는 알파 아미노산의 중합체를 말한다. 펩티드는 2개이상의 아미노산 단량체가 있는 것을 말한다.

악학적으로 허용되는 염이란 통상 제약 분야에서 사용되는 비독성의 알카리 금속염, 알카리 토금속염, 및 암모늄염을 말하는데 이러한 것들의 예로는 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 바륨, 암모늄, 및 프로타민 아연염을 포함하며, 이것들은 기술에 공지된 방법에 따라 제조된다. 또한 약학적 허용염에는 비독성 산부가염이 포함되는데, 이들은 본 발명의 화합물을 적합한 유기산 또는 무기산과 반응시켜 제조한다. 대표적인 염의 예로는 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 황산염, 중황산염, 초산염, 토실레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 발레이트, 올레이트, 라우레이트, 보레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 구연산염, 말레이즈, 푸마레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 납실레이트 등을 포함한다.

약학적 또는 치료학적 유효량 또는 복용량이란 원하는 생물학적 결과를 유도하기에 층분한 양을 말한다. 여기서 생물학적 결과란 병환의 증세, 징후 또는 원인이 완화되거나 또는 생물학적 시스템이 임의의 다른 바람직한 형태로 변형하는 것을 말한다. 바람직하게는 이 용량 또는 복용량은 EPO-R을 자극시키는데 충분하므로 EPO의 결핍과 연관되거나 또는 생체내에서 결함적으로 또는 낮은 적혈구수와 관련된 증상을 경감한다.

재조합 DNA 클로닝 또는 발현 벡터는 숙주세포를 형질전환하는데 사용될 수있으며, 유용한 기능을 암호화하는 DNA 또는 RNA 분자를 말한다. 본 발명의 목적상, 클로닝 벡터는 일반적으로 발현 벡터의 제작시 중간체로서 중요하게 작용한다; 후자의 벡터는 숙주세포를 프랜스펙트 또는 형질전환시키는데 사용되어 형질 전화된 숙주세포들이 벡터에 의해 암호화된 단백질이나 또는 다른 생성물을 생산하게끔 한다. 이러한 벡터들을 통상 플라스미드라고도 하는데 이들은 숙주세포에서 염색체외에 존재할 수 있는 벡터이기도 하지만 숙주세포의 게놈에 통합될 수도 있는 벡터들이다. 당업자들은 이를 클로닝 벡터, 벡터, 발현 벡터, 플라스미드라고 부른다.

본 발명은 EPO-R에 결합하여 이를 활성화 시키거나 그렇지 않으면 EPO 작용물질로서 행동하는 화합물을 제공한다. 이들 화합물은 임의의 펩티드 다양성 생성 시스템에 의해 발견된 리드 펩티드 화합물, 및 유도체 화합물을 포함한다. 이 유도체 화합물은 리드 화합물과 동일하거나 유사한 분자구조 또는 형태를 갖지만 가수분해 또는 단백질 분해에 민감하다는 점 및/또는 다른 생물학적 특성, 가령 수용체의 증가된 친화도, 생체 및 시험관내 증가된 활성도라는 관점에서 리드 화합물과 구별된다.

초기에 사용된 랜덤 펩티드룰 다양하게 생성하는 시스템은 상술된 파지상의 펩티드를 포함하였다. 랜덤 펩티드는 길이가 8인 아미노산 잔기를 갖고, 양 말단에 Cys 잔기가 인접한 것이다(따라서, 총길이는 10개의 아미노산이 된다). 이들 초기 시스템에서, 랜덤 펩티드는 파지 fd 유도체(파지상의 펩티드)의 pVIII 코트 단백질을 함유하는 융합 단백질의 일부로서 제시되었다. 이 융합 단백질을 암호화하는 DNA와 함께 융합 단백질은 고정화된 EPO-R상에 선별된다(panned). 선별과정은 융합 단백질과 고정화된 수용체를 다수회 항온 배양시켜 수용체에 결합된 융합 단백질(수반하는 DNA와 함께)을 수거한 뒤 그 융합 단백질을 많이 생산하는 것을 포함한다.

일반적으로, 선별 작업을 3회 실시한 뒤 융합 단백질 및 수반하는 DNA를 분리하고 이를 배양하여 ELISA 분석을 위한 융합 단백질 제제물을 생산한 뒤 융합 단백질이 수용체에 특이적으로 결합하는 지 여부를 측정한다. 상기 분석은 선별작업과 유사하게 수행하지만, 단 비결합된 융합 단백질을 제거한 후 웰을 토끼의 항파지 항체(또는 플라스미드 시스템상의 펩티드 경우는 항-lac항체)로 처리한 뒤 각 웰의 알카리 포스파타제의 양을 표준방법으로 측정하는 것이 다르다. 테스트 웰과 대조웰(수용체가 없는 것)을 비교하므로써 융합 단백질이 수용체에 특이적으로 결합되었는 지 여부를 결정할 수있다.

선별과정 및 ELISA 분석에 사용된 고정화된 수용체는 EPO-R의 세포외 영역으로 구성되었으며, 재조합 숙주세포에서 생성되었다. 이 수용체 분자는 다양하게 서로 다른 형태 및 숙주세포에서 생산될 수있다. 하나의 유용한 형태는 단백질 분비 및 글리코포스포리피드 막의 결합 부착을 위한 시그날 펩티드로 제작된 형태이다(이 부착 형태는 소위 PIG-표지됨(tailing)으로서 Caras 및 Weddell, 1987년 3월 3일, Science 243:1196-1198; 및 Lin 등의 1990년 8월 10일 Science 249;677-679에 개시되어 있다). 이 시스템은 수용체를 발현하는 세포의 표면으로 부터 수용체가 분해되게 하고 분해된 수용체가 상당히 잘 수거되도록 돕는다. 바람직하게는 프로테아제 분해 부위, 에를 들면 트롬빈 부위는 PIG 표지된 수용체 및 수용체 그 자체사이에 개재된다.

하기의 방법을 사용하여 재조합 수용체 단백질을 고정화하였다. 미량 역가판을 항수용체 항체로 피복한 뒤 고정화된 수용체를 함유할 웰을 소의 혈청 알부민(BSA)으로 처리하여 비특이적인 결합을 차단시켰다. 트롬빈 분해 부위를 갖는 PIG-표지된 수용체를 미량 역가판의 피복된 웰에 가하고 이것을 이후에 세척하여 비결합된 수용체를 제거하였다.

다원자가의 리간드-수용체 상호작용을 허용하는 랜덤 펩티드 생성 시스템을 사용할 때, 고정화된 수용체의 밀도는 고정화된 수용체에 결합할 리간드의 친화도를 결정하는데 있어서 중요한 인자가 된다는 것을 숙지하여야 한다. 높은 수용체 밀도에서(즉, 각각의 항수용체 항체 피복 웰이 0.25 내지 0.5mg의 수용체로 처리되는 경우), 다가 결합은 낮은 수용체 밀도에서 보다(즉, 각각의 항수용체 항체 피복된 웰은 0.5-1ng의 수용체로 처리되는 경우) 더 잘 일어날 수 있다. 다가의 결합이 일어나면 비교적 저친화도를 갖는 리간드를 분리하기가 더 쉽다. 일반적으로, 고정화된 고밀도의 수용체를 사용하여 리드 화합물을 동정할 수있으며, 이후 리드 화합물보다 수용체의 높은 친화도를 갖는 화합물을 분리하기 위해서 낮은 수용체 밀도하에서 리드 화합물의 유도체를 테스트 하였다.

종종, 수용체는 미량역가판의 교호적인 렬(row)에만 첨가되었다; 블랭크렬에서 BSA차단된 웰은 네가티브 대조군으로서 사용되어 수용체-특이적인 반응이 관찰된 결과를 나타내었는 지 여부를 결정한다. 융합 단백질 제제물을 이후에 웰에 첨가하고 항온배양한 뒤 수용체에의 결합이 일어나도록 하고; 그후 웰을 세척하여 비결합된 융합 단백질을 제거하였다.

상술된 시스템을 사용하여, EPO-R에 결합하는 펩티드를 발견하였다. 수용체에 결합한 이 융합 단백질을 암호화하는 DNA를 서열화하였다. 이 펩티드는 다음의 서열을 갖고 있었다:GGCRIGPITWVCGG(서열번호)(N-말단 GG잔기는 파지상에 분해를 허용한다). 이 펩티드는 ELISA분석으로 측정시 BSA와 항수용체 항체에 대해 저친화도를 나타낸 반면 EPO-R에 고친화도를 나타냈다. 또한 파지미드 클론은 유리된 EPO 및 동족의 유리 펩티드와 경쟁하였다. 더욱이, 유리 펩티드는 EPO-파지미드, LacI-EPO 융합물, 및 방사리간드와 경쟁하는 것으로 밝혀졌다. 마지막으로, 유리 펩티드는 IL-2Rαβ 결합 분석에서 경쟁하지 않았다.

이러한 바람직한 펩티드에 대해 돌연변이 연구를 수행하였다. 랜덤 펩티드를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 수거하기 위해, 도 1의 돌연변이 올리고머를 제조하였는데 여기서 N은 뉴클레오티드 A, C, G,또는 T(동몰량;사용된 방법에 따라 다름, 다른 뉴클레오티드가 사용될 수있다)이었으며, K는 코돈 모티브(NNK)에서 G 또는 T(동몰량)였다. 당업자라면 이러한 NNK 모티브가 모든 아미노산을 암호하고, 오직 하나의 종결 코돈만을 암호화하고, 코돈 바이어스를 감소시킨다는 것을 숙지할 수 있을 것이다. NNK 모티브로부터 산출되는 32 개의 가능한 코돈이 있다; 1개는 각기 12 개의 아미노산을 위한 코돈이고, 2개는 각기 5개의 아미노산을 위한 코돈이고, 3개는 각기 3개의 아미노산을 위한 코돈이고, 3개의 종결 코돈을 위해서는 오직 하나가 존재한다.

변이 융합 단백질 및 이를 암호화하는 DNA를 다시 고정화된 EPO-R상에 선별하였다. 융합 단백질 및 수반하는 DNA 를 분리한 뒤 배양하여 융합단백질 제제물을 생성하고 이를 ELISA분석에 사용하므로써 융합 단백질이 수용체에 특이적으로 결합했는지 여부를 측정한다. 본 연구에서 바람직한 펩티드는 도 2에 도시되어 있다. 이들 펩티드는 모티브 X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈(서열번호)로 특성화되는데, 여기서 약어로 표기된 각각의 아미노산은 다음과 같은 의미를 갖는다; X₆는 유전공학적으로 암호된 L-아미노산 또는 입체이성체인 D-아미노산 20개중 하나에서 각각 선택된 것이며; X₃는 C, A, 알파-아미노-감마-브로모부틸산, 또는 Hoc(여기서, Hoc는 호모시스테인임); X₄는 R, H, L 또는 W일 수있으며; X₅는 M, F, 또는 I이고; X₇는 D, E, I, L, 또는 V일 수있으며; X₈는 X₃또는X₈가 C 또는 Hoc 중 하나일 때 C, A, 알파-아미노-감마-브로모부틸산, 또는 Hoc(여기서 Hoc는 호모시스테인임)이다.

펩티드의 친화도를 대략이라도 확실히 측정하기 위해서 파지 라이브러리를 친화도 선택 프로토칼을 사용하여 스크린 하였다. 여기서 펩티드는 EPO(100nM)과 경쟁하였다. 이 과정을 2회의 선별작업으로 반복하였다. 2회중 마지막 선별작업시에 경쟁 온도(4℃에서 주위온도) 및 시간(15분 내지 30분)뿐 아니라 세척 용액의 온도(4℃에서 주위온도)를 보정하여 고친화도를갖는 펩티드를 선택하였다. 이 친화도 선택 과정을 사용하여, 통상의 모티브 X₁YX₂CX₄X₅GPX₆TWX₇CX₉X₁₀X₁₁(서열번호)를 갖는 펩티드를 분리하였다:

여기서 X₁, X₂, X₆, X₉, X₁₀, X₁₁은 유전공학적으로 암호화된 20개의 암호화된 L-아미노산, 또는 입체이성체 D-아미노산 중 어느 하나로부터 각기 선택된 것이며; X₄는 R, H, L 또는 W이고; X₅는 M, F 또는 I이고; X₇은 D, E, I, L 또는 V이다. 더욱 바람직한 구체화로서, 펩티드는 아미노산 서열 X₁YX₂CX₄X₅XGPX₆TWX₇CX₉X₁₀X₁₁(서열번호)를 포함하는데 여기서 X₄는 R 또는 H이고; X₅는 F 또는 M 이고; X₆는 I, L, T, M 또는 V이고; X₇은 D 또는 V이고; X₉는 G, K, L, Q, R, S 또는 T이고; X₁₀은 A, G, P, R 또는 Y이다. 가장 바람직한 구체화로서, 코어 서열은 X₁YX₂CX₄X₅GPX₆TWX₇CX₉X₁₀X₁₁(서열번호)의 아미노산 서열인데, 여기서 X₁은 D, E, L, N, S, T 또는 V이고; X₂는 R 또는 H이고; X₂는 A, H, K, Lm M, S 또는 T이고; X₉는 K, R, S 또는 T이고; X₁₀은 P이다.

이러한 모티브에 속하며, 친화도 선택 과정에서 분리된 대표적인 펩티드의 예는 다음의 표로 나타난다;

친화도 선택 프로토칼로 부터의 펩티드

100nM EPO, 15분, 4℃에서 경쟁

GGWVTCRMGPITWVCGVHGG (SEQ ID NO:)

GGQLLCGIGPITWVCRWVGG (SEQ ID NO:)

GGLYLCRMGPVTWECQPRGG (SEQ ID NO:)

GGKYSCFMGPTTWVCSPVGRGV (SEQ ID NO:)

GGWVYCRIGPITWVCDTNGG (SEQ ID NO:)

GGIYKCLMGPLTWVCTPDGG (SEQ ID NO:)

GGMYYCRMGPMTWVCKGAGG (SEQ ID NO:)

경쟁 없음

GGTTQCWIGPITWVCRARGG (SEQ ID NO:)

GGPYHCRMGPITWVCGPVGG (SEQ ID NO:)

GGEYLCRMGPITWVCERYGG (SEQ ID NO:)

GGEYRCRMGPISWVCSPQGG (SEQ ID NO:)

GGNYTCRFGPLTWECTPQGGGA (SEQ ID NO:)

GGNYVCRMGPITWICTPAGG (SEQ ID NO:)

친화도 선택 프로토칼로 부터의 펩티드

100nM EPO, 15분, 4℃에서 경쟁

GGSWDCRIGPITWVCKWSGG (SEQ ID NO:)

GGDYTCRMGPMTWICTATRG (SEQ ID NO:)

GGDYNCRFGPLTWVCKPSGG (SEQ ID NO:)

GGSYLCRMGPTTWLCTAQRG (SEQ ID NO:)

GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG (SEQ ID NO:)

VGNYMCHFGPITWVCRPGGG (SEQ ID NO:)

GGLYLCRMGPQTWMCQPGGG (SEQ ID NO:)

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:)

GGDYVCRMGPMTWVCAPYGR (SEQ ID NO:)

GGLYECRMGPMTWVCRPGGG (SEQ ID NO:)

GGWYSCLMGPMTWVCKAHRG (SEQ ID NO:)

GGGKYYCWMGPMTWVCSPAGG (SEQ ID NO:)

경쟁 없음

GGYVMCRIGPITWVCDIPGG (SEQ ID NO:)

GSCLQCCIGPITWVCRHAGG (SEQ ID NO:)

GGNYFCRMGPITWVCQRSVG (SEQ ID NO:)

GGEYICRMGPLTWECKRTGG (SEQ ID NO:)

GGLYACRMGPITWVCKYMAG (SEQ ID NO:)

GGQYLCTFGPITWLCRGAGGGS (SEQ ID NO:)

GGVYACRMGPITWVCSPLGG (SEQ ID NO:)

GGYTTCRMGPITWVCSAHGG (SEQ ID NO:)

친화도 선택 프로토칼로부터의 펩티드

100nM EPO, 15분, 실온에서 경쟁

VGNYMCHFGPITWVCRPGGG (SEQ ID NO:)

GGTYKCWMGPMTWVCRPVGG (SEQ ID NO:)

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:)

GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG (SEQ ID NO:)

GGNYYCRFGPITFECHPTGG (SEQ ID NO:)

GGLYACHMGPMTWVCQPLRGGGS (SEQ ID NO:)

GGEYKCYMGPITWVCKPEGG (SEQ ID NO:)

GGDYVCRMGPMTWVCAPYGRGGS (SEQ ID NO:)

경쟁 없음

GGNYVCRMGPITWICTPAGG (SEQ ID NO:)

GGDYTCRMGPMTWICTATRG (SEQ ID NO:)

GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG (SEQ ID NO:)

GGSYLCRMGPTTWLCTAQRGGGN (SEQ ID NO:)

GGLYTCRMGPITWVCLPAGG (SEQ ID NO:)

GGLYKCRMGPMTWVCSPFGG (SEQ ID NO:)

친화도 선택 프로토칼로부터의 펩티드

100nM EPO, 30분, 실온에서 경쟁

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:)

GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG (SEQ ID NO:)

VGNYMCHFGPITWVCRPGGG (SEQ ID NO:)

경쟁 없음

GGDYVCRMGPMTWVCAPYGR (SEQ ID NO:)

GGDYNCRFGPLTWVCKPSGG (SEQ ID NO:)

2개의 시스테인 잔기가 인접한 랜덤 8-량체에 인접한 6개의 아미노산 잔기를 갖는 변이 라이브러리를 고정화된 EPO-R에 대해 스크린 하였다. 변이 융합 단백질 및 이를 암호화하는 DNA 를 고정화된 EPO-R상에 선별하였다. 융합 단백질 및 수반하는 DNA 를 분리한 뒤 배양하여 융합단백질 제제물을 생성한 뒤 이를 ELISA분석에 사용하므로써 융합 단백질이 수용체에 특이적으로 결합했는지 여부를 측정하였다. 본 연구에서 바람직한 펩티드는 서열 GGPHHVYACRMGPLTWIC(서열번호)로 나타나며, 따라서, 이는 코어 서열 YX₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈(서열번호)로 에워싸여져 있는데 여기서 약어로 표기된 각각의 아미노산은 다음과 같은 의미를 갖는다; X₂및 X₆는 유전공학적으로 암호된 L-아미노산 또는 입체이성체인 D- 아미노산 20개중 하나에서 각각 선택된 것이며; X₃는 C, A, 알파-아미노-감마-브로모부틸산, 또는 Hoc(여기서, Hoc는 호모시스테인임); X₄는 R, H, L 또는 W일 수있으며; X₅는 M, F, 또는 I이고; X₇는 D, E, I, L, 또는 V일 수있으며; X₈는 X₃또는X₈가 C,또는 Hoc 중 하나일 때 C, A, 알파-아미노-감마-브로모부틸산, 또는 Hoc(여기서 Hoc는 호모시스테인임)이다. 여기서 코어 서열은 그의 아미노 말단에서 6개의 아미노산 유닛에 커플링되고 각각의 아미노산은 유전공학적으로 암호된 각기 L-아미노산 또는 입체이성체인 D-아미노산중 하나로부터 각기 선택된다.

상술된 일반 모티브에 속하는 펩티드의 몇가지에 대하여 IC₅₀을 계산하였다. 이들 값은 유리 펩티드를 사용하여 측정된 것으로서 결과는 하기 표 5에 나타나 있다(여기서 각각의 펩티드는 각기 합성된 것이고 C-말단이 아미드화된 것이지만,유리 카르복실산 또는 에스테르 또는 다른 카르복시 아미드로서 쉽게 제조될 수있다.

펩티드	IC₅₀
GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG (SEQ ID NO:)	1.67μM
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO:)	237nm
GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG (SEQ ID NO:)	179nm
VGNYMCHFGPITWVCRPGGG (SEQ ID NO:)	420nm
GGVYACRMGPITWVCSPLGG (SEQ ID NO:)	352nm
VGNYMAHMGPITWVCRPGG (SEQ ID NO:)	67μM

전술된 것이외에, 높은 친화도 펩티드를 농축화시키는 조건하에서 펩티드의 높은 친화도 펩티드 EPO 작용물질에 대해 다른 변이에 대한 연구를 수행하였다. 전술된 바와 같이, 높은 친화도를 갖는 펩티드를 농축시키기 위해서는 친화도 선택 프로토칼을 사용하여 라이브러리를 스크린 하였다. 이 경우 펩티드는 EPO(100nM)와 경쟁한다. 이러한 과정을 2회의 선별작업으로서 반복한다. 2회중 마지막 선별작업시에 경쟁 온도(4℃에서 주위온도) 및 시간(15분 내지 30분)뿐 아니라 세척 용액의 온도(4℃에서 주위온도)를 수정하여 고친화도를갖는 펩티드를 선택하였다. 이 친화도 선택 과정을 사용하여, 인접 서열 YXCRIGPITWVC를 고정화된 EPO-R에 대하여 스크린하였다(도 3 참조). 융합 단백질 및 수반하는 DNA 를 분리한 뒤 배양하여 융합단백질 제제물을 생성하고 이를 ELISA분석에 사용하므로써 융합 단백질이 수용체에 특이적으로 결합했는지 여부를 측정하였다. 본연구에서 나타난 바람직한 펩티드는 표 6에 나타나있다.

GGEYICVMGPNTWVCSPTRGHGS

GGEYLCRMGPMTWVSPFTRKGG

GGQYICRFGPITWQSQPAGGGS

GREYSCRMGPITWVCMPRASLGS

GDLYLCSMGITWICVPERGGGS

ELWYSCRMGPVTWMCGRYQGGGS

다른 변이 연구에서, 강하게 보존된 잔기(즉, Y, C, G, P, T, 및 W)를 갖는 변이 라이브러리는 그대로 변형이 없었고, 다른 잔기는 랜덤화되었다. 티로신 앞의 N-말단에서 10 개의 부가의 잔기를 고정화된 EPO-R에 대하여 스크린 하였다(도 4A 참조). 변이 융합 단백질 및 수반하는 DNA 를 분리한 뒤 배양하여 융합단백질 제제물을 생성하고 이를 ELISA분석에 사용하므로써 융합 단백질이 수용체에 특이적으로 결합했는지 여부를 측정하였다. 이 연구에서 나온 바람직한 펩티드를 표 7에 나타냈다.

QICRADRKGIYQCWYCPETWICgg

QQGYSLWLPWYNCVLGPYTWVCgg

YGGSAAVPWKYGCSLGPVTWVCgg

QIVSWGLYSGYLCMVGPVTWVCgg

GSGALSAAGWYGCRVGPLTWVCgg

SVVSHDAAGVYDCVIGPVTWICgg

IYSWTGILGSYVCWYGPDTWVCgg

SCIYVRFFYCYQCSEGPATWLCgg

TVAKGQSGVRYSCLRGPETWVCgg

VQPQYKWATMYQCWKGPSTWFCgg

KSGVWEMGSSYQCARGPPTWCCgg

CSVRRMDREYYRCCRGPFTWQCgg

KYQEEMFMGYQCLQGPKTQLCgg

VCPGSEFRVGYICAMGPYTWDCgg

SLCSSRCNSPYFCSIGPSTWRCgg

QASLGLPLKQYLCVLGPHTWLCgg

ACKPAALFVQYGCVLGPMTWICgg

SCERAGGRWEYVCQWGPDTWLCgg

RVARQVQQVSYWCAHGPATCYCgg

HKYDTLMLTNYVCQRGPLTQLCgg

다른 변이 연구에서, 강하게 보존된 잔기(즉, Y, C, G, P, T, 및 W)를 갖는 변이 라이브러리는 그대로 변형이 없었고, 다른 잔기는 랜덤화되었다. 두 번째 시스테인과 (GLY)-4-Ser 링커사이에 10 개의 부가의 잔기를 고정화된 EPO-R에 대하여 스크린 하였다(도 4A 참조). 이 라이브러리에서 보존된 티로신 잔기는 2개의 글리신 잔기 앞에 위치하므로써 효율적인 시그날 펩티드 분해를 수행히였다. 변이 융합 단백질 및 수반하는 DNA 를 분리한 뒤 배양하여 융합단백질 제제물을 생성하고 이를 ELISA분석에 사용하므로써 융합 단백질이 수용체에 특이적으로 결합했는지 여부를 측정하였다. 이 연구에서 나온 바람직한 펩티드를 표 8에 나타냈다.

ggYHCEWGPETWICRPEISPLTVMgg

ggYICDYGPLTWACKPAGATLLQPgg

ggYTCRFGPVTWDCLPAINHNGVLgg

ggYQ*FMGPETWVCAPEPRVERVSgg

ggYLCRFGPETWTCAPERSVVTQSgg

ggYVCDFGPTTWICRGQVMEHINTgg

ggYMCNMGPLTWDCSPVRSTSMAWgg

ggYHCEWGPETWICRPEISPLTVMgg

ggYNCTMGPNTWVCTPAAESPAVFgg

ggYGCRIGPITWICDDVSRSPRA

ggYTCRMGPQTWECLPMSEGV

ggYNCKFGPQTWDCSSANLKEV

gYLCEMGPETWMCRPEDAKLGV

ggYGCKFGPVTWICEDLLLDPMY

ggYNCKFGPQTWDCSSANLKEVLV

gYLCEMGPETWMCRPEDCEAW

ggYGCGLAPVTWECPQVSIPYGLSgg

ggYGCRIGPTTWICDSTVPQLREVgg

ggYRCSWAPETWVCDNHSA

gYLCNFGPITWDCVSSAQSEMQIgg

또다른 변이 연구에서, 강하게 보존된 잔기(즉, Y, C, G, P, T 및 W)를 갖는 라이브러리는 변형되지 않았는데 이때 티로신은 첫 번째 시스테인에 바로 옆에 결합되었으며 티로신에 대해 4개의 N-말단잔기를 포함하는 다른 아미노산은 랜덤화되어 있고, 두 번째 시스테인과 링커사이에 5개를 고정화된 EPO-R에 대하여 스크린 하였다(도 4C 참조). N-말단 랜덤 아미노산은 다시 2개의 글리신 잔기에 앞서 위치하므로써 효율적인 과정을 허용한다. 융합 단백질과 이를 암호하는 DNA를 다시 고정화된 EPO-R상에서 선별하였다. 융합 단백질 및 수반하는 DNA 를 분리한 뒤 배양하여 융합단백질 제제물을 생성하고 이를 ELISA분석에 사용하므로써 융합 단백질이 수용체에 특이적으로 결합했는지 여부를 측정하였다. 이 연구에서 나온 바람직한 펩티드를 표 9에 나타냈다.

ggAELQYCKIGPETWVCDWPHIgg

ggPYEGYCSGGPVTWECCVSVCgg

ggQPLPYCSPGPTTWFCINWLFgg

ggCSYGYCPMGPFTWMCRQRRLgg

ggVRGSYCQSGPPTWQCDLRFFgg

ggRCARYCACGPGTWNCLGRCQgg

ggLGRCYCVYGPLTWWCSQTSLgg

ggLCVWYCSAGPWTWYCIYRSAgg

ggKPGPYCSFGPETWVCTALGMgg

ggRLGEYCEIGPITWICRLFLPgg

ggPGLGYCDFGPLTWVCDGSVDgg

ggLSSAYCRYGPETWICWAGTGgg

ggVLHLYCYYGPETWDCLPIKAgg

ggGGGVYCLVGPVTWLCGPAAMgg

ggLTRNYCRIGPETWICQEVAIgg

ggWSERYCVLGPLTWECVHLFAgg

ggMPLKYCGMGPVTWVCCEAVSgg

ggSVMRYCHFGPETWICPYDMPgg

ggALYPYCLICPMTWVCQVGWIgg

ggTYGNYCRGGPGTWHCEDTRGgg

ggASYCYCSKGPATWKCVGSILgg

ggSLAAYCLQGPKTWPCVRRRLgg

ggTDSLYCKLGPLTWHCQLYQKgg

gISQQYCWRGPATWVCLEWELgg

전술된 변이 연구이외에, 높은 친화도 히트(헤드피스 이량체)를 동정할 목적으로 디스플레이 원자가가 감소된 변형된 C-말단 Lac-I 디스플레이 시스템을 사용하여 펩티드 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG의 변이를 수행하였다. 이 Lac-I 헤드피스 이량체(HPD) 디스플레이 시스템은 미국 특허 제 5,338,665호에 상세히 기술되어 있다. 실질적으로, 전술된 변이 연구에서 고도로 보존된 잔기(즉, Y, C, G, P, T, 및 W)는 약간 변이된 반면에 이보다 덜 보존된 잔기(즉, H, F, L 및 V)는 고도의 변이율을 나타내었다. 4개의 랜덤 잔기가 티로신 잔기앞에 위치하고 티로신 다음에는 하나의 랜덤 잔기가 위치한다. 시스테인뒤에는 6개의 랜덤 아미노산으로 종결하는 변이도식 C-말단이 있다. 이후 산출된 DNA 구조물의 상세한 설명은 도 5에 도시되어 있다.

높은 친화도를 갖는 클론을 농축시키기 위해 2회째의 EPO 용출물을 사용하면서, mAb179상에 고정된 PIG꼬리가 붙은 EPO-R상에 4회를 통하여 라이브러리를 스크린 하였다. 산출된 DNA 삽입물을 클론한 뒤 이 풀을 말토오즈 결합 단백질(MBP) 벡터에 놓고 이들이 C-말단 융합 단백질로서 발현되게 하였다. 랜덤 선별된 개개의 MBP 융합클론으로 부터 정제하지 않는 조세포 용해물을 ELISA 포맷으로 EPO-R 결합 분석하였다. 본연구에서 바람직한 펩티드는 표 10에 나타나있다.

RTKEYSCQMGPLTWICVPKS

SKARYMCHMGPLTWVCRPEV

GGKAYMCRLGPVTWVCSPRIKL

LLRGYECYMGPLTWVCRSSKPR

TIAQYICYMGPETWECRPSPDA

NGRTYSCQLGPVTWVCSRGVRR

LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD

MKTKYKCYMGPLTWVCEGS

SKTKYRCEMGPLTWVCERW

LTRLYSCHMGPSTWVCSTALRK

RGQLYACHFGPVTWVCKRRKRV

SGILYECHMGPLTWVCTPSRRR

GSKTYSCQLGPVTWVCGRKR

ARGKYQCQFGPLTWECLPIRPR

VTRMYRCRMGPLTWVCER

KPSLYECHLGPLTWECRRRRRE

RGHMYSCQLGPVTWVCKPLSGR

ITPTYHCKFGPQTWVCAPKRSALTK

GNRMYQCHMGPLTWVCQPTRIH

MKTKYKCYMGPLTWVCEGSPLK

HLGKYDCSFGPQTWVCKRRRSL

ERRVYECQMGPLTWECKPGVKG

ITPTYHCKFGPQTWVCAPKRSALTK

LGRKYSCHFGPVTWVCQPAKKD

RGRGYSCQMGPVTWVCKRERYF

RLREYRCHMGPQTWVCNGHHSK

SGALYDCQMGPITWVCRANRQK

TNQVYGCKFGPKTWVCKPARRI

TRGMYACHMGPQTWVCRPTQPR

VLSNYECTMGPKTWVCKPLRLK

Lac-I 헤드피스 이랑체 디스플레이 시스템을 사용하여 얻은 펩티드의 놀라운 특징 중 하나는 보존된 시스테인에 인접한 지역, 특히 RGQLYACHFGPVTWVCKRRKRV(이것은 5개의 그러한 잔기의 C-말단 스트레치를 가지고 있다)에서 다수개의 양전하를 축적하는 것이다. 약간 변이된 아미노산(즉, Y, C, G, P, T, 및 W)은 완전히 보전된 반면 새로운 모티브SMS이 변이된 부위에서 생성되었다. 특히 관심을 끄는 것은 펩티드 수(LLRGYECYMGPLTWVCRSSKPR)에 있어서 부가의 티로신 잔기의 존재이며, TIAQYICYMGPETWECRPSPKA에서의 시스테인사이에 존재하는 두 개의 글루타민 산 잔기의 존재이다.

전술된 변이 연구이외에, 전술된 것과 비슷한 C-말단 Lac-I 디스플레이 시스템을 사용하여 펩티드 TISQYICYMGPETWECRPSPKA의 변이를 수행하였다. 실질적으로, 전술된 변이 연구에서 고도로 보존된 잔기(즉, Y, C, G, P, T, 및 W)는 약간 변이된 반면에 이보다 덜 보존된 잔기(즉, H, F, L 및 V)는 고도의 변이를 나타내었다. 또한 두 개의 글루타민산 잔기는 약간 변이 되었다. 4개의 랜덤 잔기가 티로신 잔기앞에 위치하고 티로신 다음에는 하나의 랜덤 잔기가 위치한다. 시스테인뒤에는 6개의 랜덤 아미노산으로 종결하는 변이도식 C-말단이 있다. 이후 산출된 DNA 구조물의 상세한 설명은 도 6에 도시되어 있다.

높은 친화도를 갖는 클론을 농축시키기 위해 2회째의 EPO 용출물을 사용하면서, mAb179상에 고정된 PIG 표지된 붙은 EPO-R상에 라이브러리를 3회 스크린 하였다. 수거한 콜로니를 인간의 Fcγ-EBP시약에 의해 입증하는데 사용하고, 염소의 항인간 Fcγ을 알카리 포스파타제에 접합시켰는데 이 염소의 항인간 Fcγ는 미국 미조리주 세인트 루이스의 시그마 화학회사에서 구입한 것이다. 본연구에서 바람직한 펩티드는 표 11에 나타나있다.

ALKKYDCYFGPETWECLARRPH

ERRFYKCRFGPETWECTL

FGQEYRCHLGPETWQCSPVRVG

FRPEYMCRMGPETWECGGARP

GSRKYwCRMGPETWECMKPVRL

GLKAYGCRYGPETWDCRSVILI

IRQPYICHMGPETWECGRYPAG

KGASYHCIMGPETWECIPQRVW

MKQLYSCIMGPETWECRPGVER

QRHYYRCALGPEYWECRPMSPE

TKRLYHCHMGPETWECHGPMRK

TRPSYRCAFGPVTWECIPAR

PHKSYvCTFGPETWECTGAIRR

RGRMYNCRMGPETWECKGQSKD

RRRYYRCWMGPETWECSPVSNK

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VQKKYLCHFGPETWECGPDRD

WQTWYICERGPETWECRWLVL

YRMPYRCKMGPETWEVGGRGR

YSREYSCRMGPETWECXRGFLR

전술한 펩티드 서열의 군락은 클론한 뒤 말토오즈 결합 단백질(MBP) 벡터에 넣어 전술한 이들이 C-말단 융합 단백질로서 발현되게 하였다. 랜덤하게 선별된 개개의 MBP 융합 클론으로 부터 정제하지 않는 조세포 용해물을 ELISA 포맷으로 EPO-R 결합 분석하였다. 본연구에서 바람직한 펩티드는 표 12에 나타나있다.

RSMWYRCQMGPQTWVCGPRSAS

SRREYICHLGPQTWVCGPGGRK

GSPSYHCHLGPLTWVCKPHRMR

MVGRQCHMGPRTWVCKPWHG

GTARYQCHFGPLTWVCKPSLKG

ELRGYICHFGPVTWVCKPNGSR

LKQGYQCQLGPQTWVCRPLPMP

KEPKYECQFGPRTWVCQPTRAN

VRKVYACHMGPVTWVCVQGYKG

SGRYVCRMGPETWVCRSYRGL

ERRSYSCQMGPVTWVCGRQMGQ

VKNNYRCQFGPVTWVCKAFR

SGASYDCQMGPITWVCRANRQK

EPO-R에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀진 대표적인 펩티드를 세포계 작용 분석에 의해 테스트하였다. 이 분석 중 하나는 모세포주로서 FDCP-1을 이용하였는데, 이는 쥐의 다효능성 원시 조혈 전구체 세포주에 의존하는 성장인자이다(예; Dexter 등, 1980, J. Exp. Med. 152: 1036-1047 참조). 이 세포주는 WEHI3-조건의 배지(IL-3, ATCC T1B68을 함유하는 배지)로 보충되었을 때 다양화되지는 않지만 증식할 수 있는 것이다. 이를 후술하는 바와 같이 인간 또는 쥐의 EPO-R로 트랜스팩트시켜 FDCP-1-hEPO-R 또는 FDCP-1-mEPO-R 세포주를 각기 생성하였다. 이들 트랜스팩트된 세포주는 인간의 또는 쥐의 EPO 존재하에 증식은 하였지만 다양화되지는 않았다.

세포를 필요한 성장인자 존재하에 정지기 밀도의 1/2 밀도로 배양하였다. 이후 세포를 PBS 중에 세척하고 16∼24시간 동안 성장인자 없는 전체 배지에 아무것도 공급하지 않았다. 세포의 생존도를 결정한 후 50㎕에 대하여 약 10⁵세포를 지닌 스톡용액(성장인자 없는 전체 배지 중에서)을 만들었다. 테스트 할 화합물(통상 파지 결합되거나 또는 다른 것이 결합되거나 또는 고정화된 펩티드에 대향하는 유리의 용액상 펩티드)의 순차적인 희석물을 웰 하나당 최종 부피가 50㎕ 되게 96-웰 조직 평판으로 만들었다. 세포(50㎕)를 각 웰에 가하고, 세포를 24∼48시간 동안 항온 배양하는데 이 시점에 네가티브 대조군은 사멸되어야 한다. 이후 세포증식을 나타내는 척도로서³H-티미딘의 혼입과 관련있는 MTT 분석 같은 종래의 공지된 기술로 세포증식을 측정한다(Mosmann, 1982, J. Immunol. Methods 65:55). 도 7은 상기 표5에 기술된 펩티드 및 EPO에 대한 분석 결과를 도시한 것이다. FDCP-1/hEPO-R 세포계 생물 분석시 EPO 수용체에 결합하고 활성을 나타내는 펩티드는 본 발명의 바람직한 화합물이다.

두번째의 세포계 분석은 TF-1 세포주를 사용하였다(Kitamura 등, 1989, Blood, 73:375-380). 대표적인 결과가 도 8에 나타나있다. 도 8은 세포주 TF-1의 세포증식에 대한 EPO 및 유리 펩티드 VGNYMCHFGPITWVCRPGGG(서열번호)의 효과를 나타낸 것이다.

EPO 작용물질로서 기능을 갖는 본 발명 화합물의 역량을 도시한 세번째 세포계 분석은 페닐히드라진으로 처리한 마우스의 비장세포내로³H-티미딘을 혼입하는 것이다. 이러한 분석 결과가 도 9A-9C에 도시되어 있다.

본 발명의 화합물의 활성을 입증하기 위해 사용된 다른 생물학적 분석은 다음 문헌에 개시되어 있다. 『Greenberger et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2931-2935(EPO-의존의 조혈세포 전구체 세포주); Quelle and Wojchowski (1991) J. Biol. Chem. 266:609-614(B6SUt.EP 세포에서의 단백질 티로신 인산화 작용); Dusanter-Fourt et al. (1992) J. Biol. Chem. 289:10670-10678(인간 EPO-반응성 세포에서의 EPO-R의 티로신 인산화 작용); Quelle et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:17055-17060(FDC ER 세포에서 세포기질분해 단백질(pp100)의 인산화 작용); Worthington et al. (1987) Exp. Hematol. 15:85-92(헤모글로빈의 색상 분석); Kaiho and Miuno(1985) Anal. Biochem. 149:117-120(2, 7-디아미노 플루오렌을 사용한 헤모글로빈 검출); Patel et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:21300-21302(c-myb의 형질발현; Witthuhn et el. (1993) Cell 74:227-236(JAK2의 결합 및 티로신 인산화 작용); Leonard et al. (1993) Blood 82:1071-1079(GATA 전사 인자의 발현); Ando etal. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9571-9575(D2 and D3DM 사이클링에 의한 G₁/3 전이조절); and 칼슘 플럭스.

Microphysiometer로 공지된, Molecular Device Corp.가 디자인한 기구를 사용한 결과 여러 가지 수용체에 대하여 작용물질 및 길항물질을 성공적으로 측정할 수 있었다. 이 장치는 수용체 활성화에 반응하여 세포외 배지의 산성화 속도의 변화를 측정하는 것이다.

바람직한 구체화에 따라, 본 발명의 펩티드를 이량체화 또는 올리고머화하므로써 리드 화합물의 친화도 및/또는 활성도를 증가시켰다. 펩티드의 이량체화 반응/올리고머화 반응이 세포증식분석에서 EPO 미메틱 효능을 갖고 있나를 알아보기 위해서 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG의 C-말단이 비오틴화된 아날로그인 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(Ahx-비오틴)를 합성하였다.

실온에서 1시간 동안 4:1의 몰비로 이 펩티드를 PBS 중의 스트렙타디딘과 함께 항온 배양하였다. 이후에, IC₅₀을 측정하기 위해 PIG-표지의 EPO-R 결합분석을 도입하였다. 스트렙타비딘에 결합하지 않은 펩티드에 대해 동일 실험을 하였다. 스트렙타비딘이 항온 배양되지 않은 펩티드의 IC₅₀350nM과 비교해 볼 때 예비결합된 펩티드는 20nM의 IC₅₀을 갖는 것으로 밝혀졌다. 친화도가 10배이상 증가된 것은 펩티드-스트렙타비딘 복합체의 다원자가 상태 때문인 것으로 추정된다. 이러한 비교는 유효한 복합체 농도(이론적으로 4배이하)가 아닌 유리펩티드 농도를 사용하여 만들어졌기 때문에, 효과는 이보다 더 클 것이다.

또한, 상기처럼 4:1의 몰비로 펩티드를 혈청-유리 HEPES-버퍼 RPMI 중의 스트렙타비딘과 함께 사전 항온 배양시켰다. 이 복합체가 FDCP-1/hEPO-R 생물학적분석 어롱사이드 유리 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-비오틴)과 비오틴화 되지 않은 모펩티드, 즉 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG에서의 세포증식을 자극하는지를 테스트하였다. 도 10은 유리펩티드의 EPO-ED₅₀은 서로 유사하였지만(약 1μM), 미리형성된 스트렙타비딘 복합체의 그것은 10nM미만으로서, 즉 EPO-ED₅₀에서 두 개의 로그감소를 나타낸 분석결과를 도시한 것이다. 스트렙타비딘 단독으로는 박테리아 내독소에 의한 오염 때문에 가장 높은 농도라도 약간의 자극효과가 있을 뿐이다. 또한, 펩티드가 염소 항-비오틴 IgG로 이량체화 되었을 때 생물학적 효능의 증가가 있었다. 도 11은 EPO-ED₅₀에서의 하나의 로그감소가 2:1의 몰비로 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-비오틴)과 정제된 염소 항-비오틴 IgG의 사전 항온배양에 의해 나타날 수 있음을 도시하고 있다. 생물학적 효능이 이와 같이 증가된 것은 항체에 의한 펩티드의 이량체화 반응때문인 것으로 추정된다. 항-비오틴 항체 단독으로는 세포에 대해 아무런 영향을 주지 못했다. 또한, EPO-ED50에서의 100배 감소는 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-비오틴)-스트렙타비딘 복합체에서 나타났다. 그 자체로서, 본 발명의 리드 펩티드를 이량체화 또는 올리고머화 시키므로써, 이러한 펩티드의 친화도 및/또는 활성도가 증가될 수 있다.

다른 구체화로서, 도 12의 일반도식을 사용하여 2개의 디설파이드 결합을 함유하는 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG의 이량체성 펩티드 아날로그를 제조하였다. 제 1 펩티드 사슬을 Tentagel 수지상에 어셈블링하였다. Fmoc-Lys(Alloc)를 Knorr 링커에 결합하고, Alloc 기를 직각으로 위치하는 보호기로서 사용하였다. 처음의 펩티드 사슬로서 Cys(Acm)을 사용하였다. 제 1 펩티드 사슬을 완결한 후에, Alloc 기를 제거하고 제 2 펩티드 사슬을 리신잔기의 측쇄아민에 위치시켰다. Cys(trt)가 이 펩티드 사슬에서 사용되었다. 합성이 완결된 후에, 수지로부터 펩티드를 분해하고 정제하였다. 이후 펩티드를 단일의 디설파이드 결합을 함유하는 화합물에 고리화시켰다. 두번째 디설파이드 결합은 요오드 산화에 의해 형성되어 비시클릭 이량체를 산출하였다.

도 13과 도 14는 시험관 내에서의 이량체의 EPO-R 결합 및 생물학적 활성도를 도시한 것이다. 스트립웰에서 mAb179상에 고정화된 PIG가 표지된 EPO-R에 대해 이량체의 친화도를 테스트하였다. 평형 결합분석 결과 모펩티드인 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG의 200nM값에 대하여 200배인 2nM, 그리고 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ah_x-비오틴)-스트렙타비딘 복합체에 대하여 5배의 친화도 증가를 나타내었다. 시험관의 생물학적 활성도는 FDCP-1/hEPO-R 세포증식법에 의해 측정시 EC₅₀이 400nM(모펩티드)에서 20nM로 약 20배 증가되었다. 그 자체로서, 본 발명의 리드 펩티드를 이량체화 또는 올리고머화 시키므로써, 이 펩티드의 친화도 및/또는 활성도가 상당히 증가될 수 있었다.

접합체가 본 발명의 화합물중 하나로 구성되는 경우보다 더 많이 수용체에 대해 친화도를 갖는 화합물을 제조하기 위해서 본 발명의 펩티드 또는 이의 유도체는 EPO-R에 결합하는 화합물에 접합될 수 있다. 이러한 펩티드의 발견은 또한 EPO-R상에서 동일한 부위와 결합하는 펩티드의 동정을 용이하게 하는데 이는 라이브러리 또는 선별과정을 선택하여 상보적인 비-차단성 모티브를 가진 펩티드를 제거할 수 있기 때문이다.

바람직한 모티브 서열은 본 발명의 EPO 작용물질의 최소크기를 측정하기 위한 수단으로서 제공된다. 암호화된 합성 라이브러리 [ESL]을 사용하는 것은 1992년 9월 16일 출원된 미국 특허출원 제 946,239 호에 기술되어 있다. 이 출원은 1991년 9월 18일에 출원된 762,522호의 CIP출원이다. 또는 1990년 3월 7일에 출원된 미국 특허출원 제 492,462 호, 제 624,162 호(1990. 12. 6일 출원), 제 805, 727 호(1991. 12. 6일 출원)에서는 매우 큰 규모의 고정화된 중합체 합성 시스템에 대하여 기술하고 있는데 당업자는 이러한 활성도를 갖는 펩티드의 최소크기만을 측정할 수 있을 뿐 아니라 하나, 둘 또는 그 이상의 잔기에서 바람직한 모티브(또는 그 모티브의 최소크기)와는 다른 펩티드의 기를 형성하는 모든 펩티드를 만들 수 있다. 펩티드를 모은 것을 수거하여 EPO-수용체에 결합하는 역량을 스크린하였다. 이러한 고정화된 중합체 합성 시스템 또는 다른 펩티드 합성 방법들을 사용하여 본 발명 화합물의 모든 절단 아날로그, 모든 삭제 아날로그, 모든 삭제 및 절단 조합물을 합성할 수 있다.

본 발명의 펩티드는 또한 종래기술에 공지된 고전적인 방법,예를 들면 표준 고체상 기술에 의하여 제조될 수있다. 이러한 방법은 전체 고체상 합성, 부분적인 고체상 합성방법, 단편 축합, 고전적인 용액 합성, 및 재조합 DNA 기술을 포함한다(Merrifield, 1963, J.Am.Chem.Soc.85:2149 참조). 고체상 사용시 합성은 알파 아미노 보호된 수지를 사용하여 펩티드의 C-말단으로부터 출발한다. 적합한 출발 물질은 예를 들면, 필요한 알파-아미노산을 크로모메틸화된 수지, 히드록시메틸 수지 또는 벤즈히드릴아민 수지에 부착하므로써 제조된다. 이러한 크로모메틸화된 수지는 미국, 캘리포니아, 리치몬드에 소재한 Bio Rad Lavoratories에서 시판하는 BIO-BEAD SX-1라는 상표명의 상품이다. 히드록시메틸 수지 제제물은 Bodonszky등, 1966, Chem. Ind(London) 38:1597에 기술되어 있다. 벤즈히드릴아민(BHA)수지는 Marshall, 1970, Chem.Commn.650에 기술되어 있으며, 이는 미국,팔로알토에 소재한 Beckman Instruments, Inc.로부터 염산염의 형태로서 용이하게 구입할 수있었다.

그러므로, 본 발명의 화합물은 Gisin, 1973, Helv.Chim.Acta 56:1467 에 기술된 방법에 따라, 예를 들면 세슘 중탄산염 촉매존재하에 플루오로메틸화 수지에 알파-아미노 보호된 아미노산을 커플링시켜 제조될 수있다. 초기의 커플링 후에, 알파 아미노산보호기는 실온에서 유기 용매중에 트리플루오로아세트산(TFA) 또는 염산(HCL)용액을 비롯한 시약에 의해 제거된다.

알파-아미노 보호기는 펩티드의 단계로 진행되는 합성 기술에 공지된 것들이다. 이의 예로서 포함되는 것은 아실형 보호기(예; 포르밀, 트리플루오로아세틸, 아세틸), 방향족 우레탄형 보호기(예; 벤질옥시카르빌(Cbz) 및 치환된 Cbz), 지방족 우레탄 보호기(예; t-부틸옥시카르보닐, Boc), 이소프로필옥시카르보닐, 시클로헥실옥시카르보닐) 및 알킬형 보호기(예; 벤질, 트리페닐메틸)가 있다. Fmoc가 바람직한 보호기이다. 이러한 측쇄 보호기(일반적으로 에테르, 에스테르, 트리틸, PMC등)는 커플링시에 손상되지 않고 남아있고, 또는 커플링시 또는 아미노-말단 보호기의 탈보호시에 쪼개지지 않는다. 이 측쇄 보호기는 목적 펩티드를 변형시키지 않는 조건하에서 최종 펩티드의 합성이 완결될 때 측쇄 보호기가 제거가능하다.

티로신의 측쇄 보호기는 테트라히드로피라닐, t-부틸, 트리틸, 벤질, 메틸, 에틸 및 시클로헥실을 포함한다. Thr 및 Ser의 측쇄보호기는 아세틸, 벤조일, 트리틸, 테트라히드로피라닐, 벤질, 2,6-디클로로벤질, Cbz, Z-Br-Cbz 및 2,5-디클로로벤질을 포함한다. Asp의 경우 측쇄 보호기는 벤질, 2,6-디클로로벤질, 메틸, 에틸 및 시클로헥실을 포함한다. Thr 및 Ser의 측쇄 보호기는 아세틸, 벤조일, 트리틸, 테트라히드로피라닐, 벤질, 2,6-디클로로벤질 및 Cbz를 포함한다. Thr 및 Ser의 측쇄보호기는 벤지이다. Arg의 경우 측쇄 보호기는 니트로, 토실(Tos), Cbz, 아다만틸옥시카르보닐 메시톨설포닐(Mts), 또는 Boc를 포함한다. Lys의 경우 측쇄 보호기는 Cbz, 2-클로로벤질옥시카르보닐(2-Cl-Cbz), 2-브로모벤질옥시카르보닐(2-BrCbz), Tos, 또는 Boc를 포함한다.

알파-아미노 보호기를 제거한 후에, 남아있는 보호된 아미노산을 바람직한 순서로 단계별로 커플링시킨다. 각각 보호된 아미노산은 용액(예; 메틸렌 클로라이드(CH₂Cl₂), 디메틸 포름아미드(DMF) 혼합물중의 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3 테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU) 또는 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)를 포함한다.

소정의 아미노산 서열이 완성된 후, 바람직한 펩티드는 트리플루오로아세트산(TFA) 또는 불화수소(HF) 같은 시약처리에 의해 수지 지지체로부터 탈커플링되는데, 이는 수지로부터 펩티드를 분해하는 것뿐만이 아니라 남아있는 모든 측쇄보호기를 분해하는 것을 말한다. 클로로메틸화된 수지가 사용되는 경우, 불화수소처리는 유리펩티드산을 형성한다. 벤즈히드릴아민수지가 사용되는 경우, 불화수소처리는 직접 유리펩티드 아미드를 산출한다. 대안으로서, 클로로메틸화된 수지가 사용되면, 측쇄 보호된 펩티드는 암모니아를 펩티드 처리에 의해 탈커플 링되어 측쇄보호된 알킬아미드 또는 디알킬아미드를 생성할 수 있다. 이후 불화수소로 처리하는 통상의 방식에 따라 사슬보호반응을 제거하면 유리아미드, 알킬아미드 또는 디알킬아미드가 생성된다.

본 발명의 에스테르를 제조하기 위해서, 펩티드산을 만드는데 사용된 수지를 사용하고, 보호된 펩티드를 염기 및 메탄올 같은 적합한 알콜로 분해한다. 이후 측쇄기를 불화수소로 처리하는 통상의 방식을 통해 바람직한 에스테르를 얻는다. 이들 고체상 펩티드 합성 절차는 기술에 공지되어 있으며, Stewart, Solid Phase Peptide Syntheses, (Freeman and Co., Sanfrancisco, 1969)에 기술되어 있다.

20개의 천연 아미노산이 유전공학적으로 암호화된 아미노산이외의 아미노산이 본 발명 어떤 화합물의 1, 2, 그 이상의 위치에서 치환된 펩티드를 제조하는데 상기 절차를 사용할 수 있다. 일례로, 용이한 합성을 위해 트립토판 대신에 나프틸알나닌을 사용할 수 있다. 본 발명의 펩티드로 치환될 수 있는 다른 합성 아미노산은 L-히드록시프로필, L-3,4-디히드록시페닐알라닐, δ아미노산(예; L-δ-히드록실리실 및 D-δ-메틸알라닐), L-α-메틸알라닐, β아미노산 및 이소퀴놀릴을 포함한다. D-아미노산과 비천연 합성 아미노산도 본 발명의 펩티드내에 포함될 수 있다.

당업자라면 20개의 유전공학적으로 암호된 아미노산(또는 D 아미노산)의 천연산 측쇄는 알킬, 저급알킬, 시클릭 4-, 5- , 6-, 7-원의 알킬, 아미드, 아미드 저급 알킬, 아미드 디(저급 알킬), 저급 알콕시, 히드록시, 카르복시 및 이의 저급 에스테르 유도체 같은 다른 측쇄 및 4-, 5-, 6-, 7-원 헤테로시클릭 측쇄로 대체할 수 있다. 특히, 프롤린 잔기의 고리 크기가 5원으로부터 4-, 6- 또는 7원으로 변형된 프롤린 아날로그를 사용할 수 있다. 시클릭기는 포화 또는 불포화된 것일수 있으며, 불포화인 경우 방향족 또는 비-방향족일수 있다.

헤테로시클릭기는 바람직하게 하나이상의 질소, 산소 및/또는 황 헤테로원자를 포함한다. 이러한 기의 예로는 푸라자닐, 푸릴, 이미다졸리디닐, 이미다졸릴, 이미다졸리닐, 이소티아졸릴, 이소옥사졸릴, 모르폴리닐(예; 모르폴리노), 옥사졸릴, 피페라지닐(예; 1-피페라지닐), 피페리디닐(예; 1-피페리딜, 피페리디노), 피라닐, 피라지닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리딜, 피리미디딜, 피롤리디닐(예; 1-피롤리디닐), 피롤리닐, 피롤릴, 티아디아졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 티오모르폴리닐(예; 티오모르폴리노) 및 티아졸릴을 포함한다. 이들 헤테로시클릭기는 치환 또는 비치환된 것일수 있다. 기가 치환되는 경우, 치환체는 알킬, 알콕시, 할로겐, 산소 또는 치환된 페닐이거나 비치환된 페닐이다.

당업자는 인산화반응에 의해 본 발명의 펩티드를 쉽게 변형할 수 있으며, 본 발명 화합물의 펩티드 유도체를 제조하는 다른 방법이 Hruby 등에 기술되어 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드 화합물은 유사한 생물학적 활성도를 갖는 펩티드 미메틱을 제조하는데 사용된다.

펩티드 미메틱을 비롯한 본 발명의 화합물은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리알켄같은 하나이상의 다양한 비단백질성 중합체로 공유적으로 변형될 수 있다. 이의 제조 방식에 있어서는 미국 특허 제 4,640,835; 4,496,698;4,301,144;4,670,417;4,791,192; 또는 4,179,337호에 기술되어 있다.

당업자는 상응하는 펩티드 화합물과 동일 유사한 바람직한 생물학적 활성을 갖지만, 용해도, 안정도 및 가수분해애 대한 민감도 및 단백질 분해에 있어서 펩티드보다 바람직한 활성을 갖는 펩티드 미메틱을 제조하기 위한 유용한 기술을 사용할 수있음을 인지하고 있을 것이다(Morgan Gainor Ann. Rep. Med.Chem. 24:243-252(1988) 참조). 후술하는 것은 N-말단 아미노기, C-말단 카르복시기에서 변형되거나 및/또는 펩티드에서 하나이상의 아미도 결합을 비-아미도 결합으로 변형된 펩티드 미메틱을 제조하는 방법에 대하여 기술하고 있다. 2이상의 이러한 변형반응(예; C-말단 카르복시 기에서의 변형 및 펩티드중의 2개의 아미노산간의 -CH-카바메이트의 혼입) 하나의 펩티드 미메틱 구조에 결합될 수 있다.

일반적으로 펩티드는 유리산으로 합성되지만, 전술한 것처럼 아미드 또는 에스테르로서 용이하게 제조될 수있다. 당업자는 또한 본 발명의 펩티드 화합물의 아미노 및/또는 카르복시 말단을 변형시켜 본 발명의 다른 화합물을 생산할 수있다. 아미노 말단 변형반응 메틸화반응(즉, -NHCH₃또는 NH(CH₃)₂), 아세틸화반응, 카르보벤조일기를 첨가하는 반응, 또는 RCOO-인 카르복실레이트 작용기를함유하는 임의의 차단기로 아미노 말단을 차단시키는 반응(여기서 R은 나프틸, 아크리디닐, 스테레오이딜, 및 유사한 기로 구성된 군으로부터 선택된다)을 포함한다. 카르복시 말단 변형반응은 유리산을 카르복사미드기로 대체시키거나 도는 카르복시 말단에서 시클릭 람탐을 형성하여 구조적인 제한을 가지는 것을 포함한다.

아미노 말단 변형반응은 상술된 것과 같으며 이는 알킬화반응, 아세틸화 반응, 카르보벤조일기 첨가반응, 숙신이미드기 형성반응을 포함한다. 특히, N-말단 아미노기는 다음과 같이 반응할 수있다:

(a) RC(O)Cl같은 산할라이드 또는 산 언하이드라이드와의 반응에 의해 RC(O)NH-(R은 상기 정의된 것과 같음)의 아미드기를 형성한다. 일반적으로, 반응은 동몰량 또는 과량(예; 약 5당량)의 산할라이드를 불활성 희석제(예; 디클로로메탄) 중에서 펩티드와 접촉시켜 반응을 수행한다. 이 희석제는 반응시에 생성된 산을 스캐빈저할 수 있는 것으로서 삼차 아민(예; 디이소프로필아민) 과량(예; 약 10당량)을 함유한다. 반응조건은 통상의 조건이다(에, 실온에서 30분간). 저급알킬 N-치환후, 상술된 산할라이드와의 반응을 수행하여 말단의 아미노를 알킬화시면 RC(O)NR-의 N-알킬 아미드기가 제공된다.

(b) 숙시닉 언하이드라이드와의 반응에 의해 숙신이미드기를 형성한다. 전술한 것처럼, 동몰량 또는 과량의 숙시닉 언하이드라이드(예; 약 5당량)을 사용하면 아미노기를 종래기술에 공지된 방법에 따라 숙신아미드로 전환할 수있다. 종래기술이란 불활성 용매 중에서 디이소프로필에틸아민 같은 삼차 아민 과량(예; 10 당량)을 불활성 용매(예; 디클로로메탄)중에서 반응시키는 것을 말한다(Wollenberg 등의 미국 특허 제 4,612,132호 참조). 숙신기는 예를 들면 C2-C6알킬 또는 통상적인 방식으로 치환된 SR치환체로 치환되어 펩티드의 N-말단에서 치환된 숙신이미드를 제공할 수있다. 저급 올레핀(C2-C6)과 말레산 언하이드라이드를 Wollenberg 등의 방법으로 반응시키면 이러한 알킬 치환체가 제조되고, -SR치환체가 R은 상기와 같은 의미를 갖는 RSH를 말레인 언하이드라이드와의 반응에 의해 제조된다;

(c) 반응시에 생성된 산을 스캐빈저하는 삼차 아민을 함유하는 불활성 용매(예; 디클로로메탄)중에서 동물량 또는 과량의 CBZ-Cl(예; 벤질옥시 카르보닐 클로라이드) 또는 치환된 CBZ-Cl을 반응시켜 벤질옥시카르보닐-NH기 또는 치환된 벤질옥시카르보닐-NH 기를 형성한다;

(d)동몰량 또는 과량(예; 5당량)의 R-S(O)₂Cl(R은 상기 정의된 것과 같다)을 적합한 불활성 희석제(디클로로메탄)중에서의 반응에 의해 말단 아미노기를 설폰아미드로 전환시켜 설폰아미드기를 형성한다; 바람직하게는 불활성 희석제는 디이소프로필에틸아민같은 과량의 삼차아민(10당량)을 함유하여 반응시에 생성된 산을 스캐빈저한다. 반응조건은 통상적인 것이다(예; 실온 및 30분간).

(e)동몰량 또는 과량(예; 5당량)의 R-OC(O)Cl 또는 R-OC(O)OC₆H₄-p-NO₂(R은 상기 정의한 것과 같다)을 적합한 불활성 희석제(디클로로메탄)중에서의 반응에 의해 말단 아민기를 카바메이트기로 전환시켜 카바메이트기를 형성한다; 바람직하게는 불활성 희석제는 디이소프로필에틸아민같은 과량의 삼차아민(10당량)을 함유하여 반응시에 생성된 산을 스캐빈저한다. 반응조건은 통상적인 것이다(예; 실온 및 30분간).

(f) 동몰량 또는 과량(예; 5당량)의 R-N=C=O(R은 상기 정의한 것과 같다)을 적합한 불활성 희석제(디클로로메탄)과의 반응에 의해 말단 아민기를 우레아기(즉, RNHC(O)NH-)기(R은 상기 정의됨)로 전환시켜 우레아기를 형성한다; 바람직하게는 불활성 희석제는 디이소프로필에틸아민같은 과량의 삼차아민(10당량)을 함유하여 반응시에 생성된 산을 스캐빈저한다. 반응조건은 통상적인 것이다(예; 실온 및 30분간).

대안으로서, C-말단이 변형될 수있다. C-말단 카르복시기가 에스테르(-C(O)OR;R은 상기 정의됨)로 대체된 때의 펩티드 미메틱을 제조하는 경우에 있어서, 펩티드 산을 제조하는데 사용된 수지가 사용되며, 측쇄 보호된 펩티드는 염기 및 적합한 알콜(예; 메탄올)에 의해 분해된다. 불화수소로 처리하는 통상의 방식으로 측쇄 보호기를 제거하여 바람직한 에스테르를 얻는다.

C-말단의 카르복실기가 -C(O)NR³R⁴로 대체되는 경우의 펩티드 미메틱을 제조하는데 있어서, 수지는 펩티드 합성의 고체 지지체로서 사용된다. 합성의 완결시에, 지지체로부터 펩티드를 이탈시키기 위해 불화수소 처리를 하면 유리 펩티드 아미드가 직접 산출된다(즉, C-말단이 C(O)NH)₂인 경우). 대안으로서, 지지체로부터 측쇄 보호된 펩티드를 분해시키기 위해 암모니아와의 반응에 의해 커플링된 펩티드 합성시에 클로로메틸화된 수지를 사용하면 유리펩티드가 생성되고, 알킬아미드와 디알킬아미드와의 반응은 측쇄 보호된 알킬 아미드 또는 디알킬아미드(R과 R1이 상기 정의된 것과 같으며, C-말단이 -C(O)NRR¹)를 생성한다.

다른 구체화로서, C-말단 카르복시기 또는 C-말단 에스테르는 시클릭 펩티드를 형성하는 N-말단 아미노기를 갖는 에스테르 또는 카르복실기의 -OH 또는 에스테르(-OR)의 내부 배치에 의해 고리화되도록 유도될 수있다. 예를 들면, 합성 및 펩티드산으로의 분해후에, 유리산은 용액(염화 메틸렌, CH₂Cl₂), 디메틸 포름아미드(DMF) 혼합물중의 디시클로카르보디이미드(DCC)같은 카르복실기에 의해 활성화된 에스테르로 전환된다. 시클릭 펩티드는 이후 N-말단 아민을 갖는 활성화된 에스테르의 내부 배치에 의해 형성된다. 중합화에 대향한 내부의 고리화 반응은 매우 묽은 용액을 사용하므로써 개선될 수있다.

당업자라면, 펩티드의 말단에서 데사미노 또는 데사카르복시 잔기를 혼입하거나 또는 본 발명의 펩티드를 고리화할 수있으므로 말단 아미노기 또는 카르복시기 없이 펩티드의 배열을 억제하거나 프로테아제에 대한 민감성을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 화합물의 C-말단 작용기는 아미드, 아미드 저급알킬, 아미드 디(저급 알킬), 저급 알콕시, 히드록시, 및 카르복시,그리고 이의 저급 에스테르 유도체, 약학적 허용염을 포함한다.

본 발명의 화합물의 펩티드 유도체를 만드는 다른 방법이 Hruby 등의 Biochem J.268(2):249-262(1990)에 기술되어 있다. 그러므로, 본 발명의 펩티드 화합물은 또한 비슷한 생물학적 활성을 갖는 비-펩티드성 화합물의 구조적인 모델로서의 역할을 갖는다. 당업자라면 리드 펩티드화합물과 동일 또는 유사한 생물학적 활성도를 갖지만 용해도, 안정도 및 가수분해 그리고 단백질 분해에 대한민감도 관점에서 볼 때 리드 화합물보다 더 많은 활성을 갖는 화합물을 제조하는 기술을 이해할 수 있을 것이다(Morgan Gainor, Ann.Rep.Med, Chem.24:243-252, 1989 참조). 이들 기술은 인산염, 아미드염, 탄산염, 설폰아미드, 이차 아민, 및 N-메틸아미노산으로 구성된 골격으로 펩티드의 골격을 대체하는 것을 포함한다.

하나이상의 펩티딜 결합(-C(O)NH-)이 -CH₂-카바메이트결합, 포스포네이트 결합, -CH₂-설폰아미드결합, 우레아결합, 이차 아민(-CH₂NH-)결합 및 알킬화된 펩티드 결합[-C(O)NR⁶, 여기서 R⁶는 저급 알킬이다]같은 결합으로 대체된 펩티드 미메틱은 통상의 펩티드 합성시에 적당한 지점에서 아미노산 시약으로 적당히 보호된 아미노산 아날로그를 치환하므로써 제조된다.

예를 들면, 적당한 시약은 아미노산의 카르복실기가 상술된 하나이상의 결합을 형성하기 위해 적합한 부분으로 대체된 아미노산 아날로그를 포함한다. 예를 들면 펩티드내의 -C(O)NR결합이 CH₂-카바메이트 결합(-CH₂OC(O)NR-)에 의해 치환된다면 적당히 보호된 아미노산의 카르복시(-COOH)기는 처음에 -CH₂OH로 환원되고 이후에 통상의 방법 따라 -OC(O)Cl 작용기 또는 파라-니트로카르보네이트 -OC(O)OC₆H₄-p-NO₂작용기 전환된다. 고체 지지체상에서 발견되는 부분적으로 제조된 펩티드의 N-말단상에서 상기 작용기와 유리아민 또는 알킬화된 아민 어느 하나와의 반응은 CHO(O)NR 결합을 형성한다. 이러한 CH₂-카바메이트 상에서 상기 작용기와 유리 아민 또는 알킬화된 아민 어느 하나와의 반응은 결합의 형성에 대한 자세한 설명은 Cho등의 Science, 261:1303-1305, 1993에 나타나 있다.

유사하게, 포스포네이트 결합을 펩티드의 아미도 결합으로 치환하는 것은 미국 특허 제 9943,805 호 및 제 119,700호에 기술된 방식에 따라 수행할 수있다.

적당히 보호된 아미노산의 카르복실기(-COOH)를 -CH₂OH기로 환원한 뒤 이를 통상의 방법에 따라 토실기같은 적합한 유리기로 전환시키므로써 펩티드내의 아미도 결합을 -CH₂-설폰아미드 결합으로 대체할 수있다. 토실레이트된 유도체와 티오아세트산을 반응시키고 가수분해 및 산화 염소화반응을 수행하면 적당히 보호되었을 아미노산의 카르복실기를 대체하는 -CH₂-S(O)₂Cl 작용기가 생성된다. 아미노산의 카르복실기가 -CH₂S(O)₂Cl기로 전환하는 것에 대한 자세한 설명은 Weinstein, Boris, Chemistry Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, vol. 7, pp. 267-367, Marcel Dekker, Inc., New York(1983)에 나타나있다.

미국 특허 출원 제 08/147,805호에 기술된 방식으로 펩티드내의 아미도결합을 우레아 결합으로 치환할 수있다.

아미도 결합의 카르보닐 결합이 통상의 방법에 의해 CH₂기로 환원된 적당히 보호된 디펩티드 아날로그를 사용하여 펩티드내의 아미도 결합이 -CH₂NH 로 대체된 2차 아민 결합을 제조할 수있다. 예를 들면 디글리신의 경우에 아민을 아미드를 환원하는 것은 다음의 커플링 단계에서 N-보호된 형태로 사용된 H₂NCH₂CH₂NHCH₂COOH를 탈보호한 후에 나타난다. 디펩티드 결합에서 아미도 결합의 카르보닐 기를 환원하므로써 상기 아날로그를 제조하는 것은 기술에 공지되어 있다.

적당히 보호된 아미노산 아날로그는 상응하는 아미노산에서 사용한 것과 동일한 방식으로 통상의 펩티드 합성에 사용된다. 예를 들면, 보호된 아미노산 아날로그의 약 3당량이 본 반응에 사용된다. 염화메틸렌 또는 DMF같은 불활성 유기 희석제를 사용한다, 산이 반응 부산물로서 생성되는 경우, 반응 용매는 일반적으로 과량의 삼차 아민을 포함하여 반응시에 생성된 산을 스캐빈저한다. 특히 바람직한 삼차 아민은 약 10배의 과량으로 사용되는 디이소프로필에틸아민이다. 반응은 비-펩티딜 결합을 갖는 아미노산의 펩티드 미메틱으로 혼입되는 결과를 나타낸다. 이러한 치환을 바람직하게 반복하여 펩티드중의 아미도 결합이 없는 것으로 부터 있는것 모두가 비-아미도 결합으로 대체되도록한다.

당업자는 또한 본 발명의 펩티드를 고리화하거나 펩티드의 말단에서 데사미노 또는 데스카르복시 잔기를 혼합하여 말단 아미노기 또는 카르복시기 없이 펩티드 배열을 제한하거나 또는 프로테아제에 대한 민감도를 감소시킨다. 본 발명의 화합물의 C-말단 작용기는 아미드, 아미드 저급 알킬, 아미드 디(저급 알킬), 저급 알콕시, 히드록시, 및 카르복시, 이의 저급 에스테르 유도체 및 이의 약학적 허용염을 포함한다.

바람직한 구체화에 따르면, 잔기 X₃또는 X₈는 C 및 Hoc기로부터 각기 선택된다. 따라서, 본 발명의 화합물은 고리형으로서 분자내에 디설파이드 결합을 갖는다. 대안으로서 분자내 디설파이드 결합은 이량체 화합물을 생성할 수있다. 이들 분자내 또는 분자 상호간의 디설파이드 유도체는 하기의 화학식1로 나타난다.

상기식에서, m과 n은 각기 1 또는 2이다.

본 발명의 다른 구체화로서 하나의 황이 CH₂기 또는 황의 다른 이성체로 대체되는 경우의 디설파이드 유도체의 아날로그가 제공된다. 이들 아날로그는 본 발명의 화합물로부터 만들어질 수 있는데, 여기서 X₃또는 X₈은 C 또는 Hoc 이고, 다른 하나는 알파-아미노-감마-부틸산인데 이들은 하기의 공지된 방법에 따라 내부 분자내 또는 분자상호간에 배치하고 있다.

상기식에서 p는 1 또는 2이다. 당업자는 이러한 배치가 알파-아미노-감마-부틸산 호모시스테인의 다른 아날로그를 사용하여 일어날 수있음을 충분히 알 수있을 것이다.

전술된 고리화 단계외에도, 다른 비-디설파이드 펩티드 고리화 단계를 사용할 수있다. 이러한 대안적인 고리화 단계는 예를 들면, 아미드-고리화 단계, 티오-에테르 결합을 형성하는 고리화 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 분자내 아미드 결합 또는 분자내 티오-에테르 결합에 의해 고리화된 형태로 존재할 수있다. 아미드-고리화 반응단계를 용이하게 도시하기 위해서, ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg인 펩티드를 합성하는데, 여기서 처음의 시스테인이 리신으로 대체되고 두 번째 시스테인이 글루타민산으로 대체되며 이 두개의 잔기 측쇄사이에서 아미드 결합을 통하여 시클릭 단량체가 형성된다. 또한, 티오-에테르 고리화 단계를 용이하게 하기 위해서 ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg인 펩티드를 합성하는데, 여기서 처음의 시스테인이 리신으로 대체되고 이 두개의 잔기 측쇄 및 C-말단 시스테인사이에서 티오-에테르 결합을 통하여 시클릭 단량체가 형성된다. 그자체로서, 디설파이드 결합외에, 아미드-고리화 반응 및 티오-에테르 고리화 반응은 본 발명의 화합물을 고리화 하는데 용이하게 사용할 수 있다.

대안으로서, 펩티드의 아미노-말단은 알파 치환된 아세트산으로 캐핑될 수있는데, 여기서 알파 치환체는 유리기로서 예를 들면 알파-할로아세트산(예; 알파-클로로아세트산, 알파-브로모아세트산 또는 알파요오도아세트산)이 있다. X₃가 C 또는 Hoc인 본 발명의 화합물은 유리기를 X₃잔기가 황인 것으로 배치를 하므로써 고리화될 수있다(Barker 등, 1992, J.Med.Chem.35:2040-2048 Or 등의 1991 J.Org.Chem.56:3146-3149참조).

본 발명의 화합물은 영향을 주고 받는 많은 인자들을 평가하는 것, EPO-R에 대한 EPO를 결합하는 것(예; EPO 시그날 형질도입/수용체 활성작용), EPO를 생산하는 것을 비롯한 EPO의 생물학적 역할을 이해하기 위한 독특한 시험관내 도구로서 유용하게 사용된다. 본 발명은 또한 EPO-R에 결합하는 다른 화합물의 개발에도 유용하게 사용될 수 있는데 그 이유는 본 발명의 화합물이 그러한 개발을 촉진하는 중요한 구조-활성 관계(SAR)를 갖고 있기 때문이다.

더욱이, EPO-R에 결합하는 그들의 능력을 고려해볼 때, 본 발명의 화합물은 살아있는 세포, 고정된 세포, 생물학적 유체, 조직 균질물, 정제된 천연 생물학적 물질등에서 EPO-R를 검출하는 시약으로서 유용하다. 예를 들면, 이러한 펩티드에 라벨링을 하므로써 그들 표면에 EPO-R을 갖는 세포를 동정할 수있다. 또한, EPO 수용체에 결합하는 이들의 역량에 근거하여, 본 발명의 펩티드는 동일계로 염색, 즉 FACS(형강-활성의 세포 솔팅), 웨스턴 블러팅, ELISA(효소-결합 면역흡착분석)이 가능하다. 그리고, EPO 수용체에 결합하는 이들의 역량에 근거하여, 본 발명의 펩티드는 수용체 정제, 또는 세포표면에서 EPO-R을 발현하는 세포를 정제하는 데에 사용될 수있다.

본 발명의 화합물은 여러 가지 의학적 연구목적 및 진단 용도로서 사용될 수있는 상업적 시약으로서 사용될 수있다. 이러한 용도는 비제한적인 예들로서 다음을 포함한다:1) 여러 가지 기능 분석에서 가능성 있는 EPO 작용물질의 활성도의 양을 측정하기 위한 표준으로서의 용도; 2) 랜덤 펩티드 스크리닝에서의 블로킹 시약으로서의 용도(즉, EPO-R 펩티드 리간드의 새로운 군을 찾는 데 있어서, 펩티드는 현재 청구된 EPO 펩티드이 회수를 차단시키는 데 사용될 수있다); 3) EPO-R로 공결정화하는 것으로서의 용도(즉, 본 발명의 펩티드는 EPO-R에 결합하는 결정을 형성하여 수용체/펩티드 구조 X-레이 결정그래피의 측정을 용이하게 한다); 4) 글로빈 합성을 다양하게 하여 자극시키고 햄 복합체의 합성과 페리틴 수용체수의 증가를 가져오는 적혈구 전구체 세포의 역량을 측정하는 용도; 5) FDCP-1-mEPO-R TF-1세포주같은 EPO 의존 세포주의 증식 및 성장을 유지하기 위한 용도; 6) EPO-R가 바람직하게 활성화되고 또는 이러한 활성이 EPO 작용물질 등의 공지된 양에 대하여 편리하게 측정하기 위한 목적의 기타 연구 및 진단용도.

본 발명의 화합물은 인간을 비롯한 정온 동물에게 투여하여 EPO-R의 결합을 생체내에서 자극시킬 수있다. 따라서, 본 발명은 EPO-R을 자극시키는 데 충분한 량의 본 발명 화합물을 투여하여 이를 생체내에서 EPO이 결합과 관련된 증상을 경감하는 질환의 치료방법을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 말기의 신부전증/투석증; AIDS와 관련된 빈혈, 만성 염증질환과 관련된 빈혈(예; 류마티스 관절염 및 만성 장염), 자가면역 질환, 악성종양; 및 외과수술전에 환자에게 적혈구를 주입하기 위한 용도에 사용된다.

본 발명의 다른 구체화에 따르면 본 발명의 화합물을 수혈전에 대한 예비처치로서 낮은 수 또는 결핍된 수의 적혈구세포를 가지지 않는 질환의 치료에도 사용된다. 또한, 본 발명의 화합물을 투여하면, 출혈시간이 감소되므로 따라서 출혈이 일어날 것으로 예상되는 징후나 또는 외과수술전에 환자에게 투여하는 용도가 제공된다. 또한, 본 발명의 화합물은 거핵세포를 활성화시키는 용도를 갖는다.

EPO는 혈관 내피세포 및 콜린성 뉴런에도 유사분열 효과 및 화학주성 효과를 갖는 것으로 나타났기 때문에(예; Amagnostou등, 1990, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:5978-5982 및 Konishi등, 1993, Brain Res. 609:29-35), 본 발명의 화합물은 여러 가지 혈관 질환을 치료하는 데, 예를 들면 상처 회복, 부수의 관성 혈관의 성장(심근 경색후에 일어날 수있다), 외상, 혈관 접합 치료후, 다양한 신경 질환(다른 신경활성 성분인 신경절달제와 비교해불 때 아세틸 콜린의 비교적 낮은 량 또는 아세틸 콜린의 절대적으로 낮은 량으로 인한 질환)을 치료하는 데 사용될 수있다.

따라서, 본 발명은 약학적 담체 또는 희석제와 관련된 본 발명의 적어도 하나의 펩티드 또는 다른 화합물을 활성성분으로서 함유하는 약학 조성물을 포함한다. 본 발명의 화합물은 경구, 비경구(정맥내, 복강내, 근육내, 또는 피하내), 경피내(수동적으로 또는 이온 삼투요법으로, 일렉트로포레이숀으로), 점막내 루트(비강, 질, 직장, 또는 설하내)로 투여되거나 또는 생물학적으로 먹을 수 있는 삽입물의 형태로 투여되며 각 투여 루트에 맞게 적당한 복용 제제형태로 제형화된다.

경구 투여에 적합한 고체 복용 제제는 캡슐, 정제, 환제, 파우더, 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 복용 제제에, 활성 화합물은 슈크로즈, 락토오즈, 또는 전분같은 하나 이상의 불확성 약학적 허용 담체와 함께 혼합된다. 또한 이것은 통상의 관습에 따라, 마그네슘 스테아레이트같은 반응제 , 불활성 희석제(윤활제)이외의 부가의 성분을 함유한다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우 복용제제는 완충제, 반응제를 함유한다. 정제 및 환제는 장용피 코팅 될 수있다.

경구 투여에 적합한 액체 제제는 약학적 에멀젼, 용제, 시럽을 기술에 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들면 물을 함유하는 엘릭시르제를 포함한다. 이러한 희석제 외에 제제는 습윤제, 유화제, 현탁제, 감미제, 향신료 또는 향료같은 보조제를 함유한다.

본 발명에 따른 제제는 멸균성 수성 용제 또는 비수성 용제, 현탁제, 또는 유화제를 함유한다. 이러한 비수성 용매 또는 매질은 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일(예; 올리브유, 옥수수유, 젤라틴 및 에틸 올레이트 같은 주사용 유기 에스테르)을 포함한다. 이러한 제제는 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제 같은 보조제를 함유한다. 예를 들면, 이들은 박테리아 보유 필터를 통과하여 여과시키고, 멸균제를 조성물에 혼합시키고, 조성물을 조사시키고, 또는 사용직전에 다른 멸균성 주사 배지를 사용하여 제조될 수있다.

직장투여 및 질 투여용으로 적합한 조성물은 코코아 버터 또는 좌약 왁스같은 부형제와 함께 활성성분을 함유하는 좌약이 바람작하다. 비강 또는 설하 투여는 기술에 공지된 표준 부형제에 의해 제조된다.

본 발명의 조성물에 투입되는 활성성분의 양은 변할 수있지만, 활성 성분의 양은 적당한 복용 제제가 얻어지는 양이다. 복용량의 선택은 바람직한 치료효과, 투여경로, 치료지속시간에 따라 달라진다. 일반적으로 하루에 0.001-10 mg의 체중의 양으로 포유동물에게 투여된다.

상기 개시된 것과 같이, 본 발명은 여러 가지의 용도를 지닌다. 실시예가 비제한적의 구체화 목적으로 후술된다.

제 1양태로서, 본 발명은 EPO-R에 결합하여 이를 활성화시키거나 그렇지 않다면 EPO 작용물질로서 행동하는 펩티드를 제공한다. 이들 펩티드는 길이가 10 내지 40개 또는 그이상인 아미노산 잔기로서 구성되며, 길이가 14-20개의 아미노산 잔기인 것이 바람직하고, 이는 아미노산 코어 서열 X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈(서열 번호)을 포함하는데, 여기서 각 아미노산은 표준 용어 약기법으로 다음과 같은 의미를 갖는다: X₃는 C, A, 알파-아미노-감마-브로모부틸산, 또는 Hoc(Hoc는 호모시스테인이다); X₄는 R, H, L, 또는 W일 수있으며; X₅는 M, F, 또는 I이고; X₆는 유전공학적으로 암호화된 L-아미노산 또는 입체이성체 D-아미노산 20개중 어느 하나로부터 각기 선택된 것이며; X₇는 D, E, I, L, 또는 V이고; X₈는 X₃또는 X₈이 C 또는 Hoc중 어느 하나의 경우를 조건으로 C, 또는 Hoc(Hoc는 호모시스테인이다) 이다. 펩티드는 YX₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈(서열 번호) 코오 서열을 포함하는 것이 바람직한데, 여기서 각 아미노산은 표준 용어 약기법으로 다음과 같은 의미를 갖는다: X₂및 X₆는 유전공학적으로 암호화된 L-아미노산 20개중 어느 하나로부터 각기 선택된 것이며; X₃는 C, A, 알파-아미노-감마-브로모부틸산, 또는 Hoc(Hoc는 호모시스테인이다); X₄는 R, H, L, 또는 W일 수있으며; X₅는 M, F, 또는 I이고; X₇은 D, E, I, L, 또는 V이고; X₈는 X₃또는 X₈이 C 또는 Hoc중 어느 하나의 경우를 조건으로 C, A, 알파-아미노-감마-브로모부틸산, 또는 Hoc(Hoc는 호모시스테인임)이다.

더욱 바람직하게 펩티드는 아미노산의 코어 서열 X₁YX₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈X₉X₁₀X₁₁(서열번호)을 포함하는데, 여기서 각 아미노산은 표준 약어법에 의해 표기된 것으로서다음과 같은 의미를 갖는다. 각각의 X_1,X_2,X_6,X_9,X_10,X₁₁은 유전공학적으로 암호된 L-아미노산 20개중 어느 하나로부터 선택된 것이며; X₃는 C, A, 알파-아미노-감마-브로모부틸산, 또는 Hoc(여기서 Hoc는 호모시스테인임)이고; X₄는 R, H, L, 또는 W 일 수있으며; X₅는 M, F, 또는 I일수 있고; X₇는 D,E,I,L 또는 V일 수있고; X₈는 X₃또는 X₈가 C 또는Hoc일 경우를 조건으로 C, A, 알파-아미노-감마-브로모부틸산, 또는 Hoc(여기서 Hoc는 호모시스테인임)일 수 있다.

더욱 바람직한 구체예로서, X₃와 X₈이 C이므로, 펩티드는 아미노산의 코어 서열 X₁YX₂CX₄X₅GPX₆TWX₇CX₉X₁₀X₁₁(서열번호)을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 펩티드는 아미노산의 코어 서열 X₁YX₂CX₄X₅GPX₆TWX₇CX₉X₁₀X₁₁(서열번호)를 포함하는데, 여기서 X₄또는 R 또는 H; X₅는 F 또는 M; X₆는 I, L, T, M 또는 V이고; X₇은 D 또는 V이고; X₉는 G, K, L, Q, R, S, 또는 T이고, X₁₀은 A, G, P, R 또는 Y 이다. 가장 바람직한 양태에서, 펩티드는 아미노산의 코어 서열 X₁YX₂CX₄X₅GPX₆TWX₇CX₉X₁₀X₁₁(서열번호)을 포함하는데, 여기서 X₁은 D, E, L, N, S, T 또는 V 이고; X₂는 A, H, K, L, M, S 또는 T 이고; X₄는 R 또는 H 이고; X₉는 K, R, S 또는 T 이고; X₁₀은 P 이다.

특히 바람직한 펩티드는 다음을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 펩티드는 고리화되거나 또는 이량체화된다. C-말단 아미드로서 고리화될 수 있는 펩티드의 예로는 다음을 포함한다. 이는 단지 예를 든것에 불과하며 본 발명이 이에 국한되는 것은 아니다:

본 발명의 이량체의 예는 다음과 같다:

본 발명의 구체화에 따르면, 유전공학적으로 암호된 L-아미노산 또는 입체이성체 D-아미노산 20개중 어느 하나로부터 각기 선택된 2개이상, 바람직하게는 2-6개의 아미노산 잔기가 상술된 코어 서열 한 말단 또는 양말단에 커플링된다. 예를 들면, 서열 GG는 펩티드의 합성이 용이하도록 코어 서열의 양말단 또는 한말단에 부착된다. 본 발명은 EPO-R 결합의 특성을 보유하는 펩티드의 펩티드 미메틱(peptidomimetic) 및 이들 펩티드 및 그의 유도체의 접합체를 제공한다.

본 발명은 또한 신규의 화합물을 사용하여 EPO의 결함을 포함한 질환을 치료할 방법을 제공한다. 본 발명은 나아가 하나이상의 화합물 및 약리학적 허용 담체를 함유하는 약학 조성물을 제공한다.

실시예 1

고체상 펩티드 합성

Milligen/Biosearch 9600 자동화된 기계상에서 Merrifield 고체상 합성 기술(Stewart, J.M., 및 Young, J.D., Solid Phase Pepide Synthesis, 2d. edition, Pierce Chemical, Rockford, IL, 1984)을 사용하여 본 발명의 여러 가지 펩티드를 합성하였다. 사용된 수지는 PAL(Milligen/Biosearch)로서 이것은 링커로서 5-(4'-Fmoc-아미노메틸-3,5'-디메톡시페녹시) 발레린산에 의해 가교된 폴리스테렌이다. PAL 수지를 사용하면 수지로부터 펩티드가 분해될 때 카르복시 말단 아미드 기능이 나타난다. 아미노산상에서 주요한 아민의 보호는 F-moc에 의해 이루어지며, 측쇄 보호기는 세린 및 티록신 가수분해의 경우 t-부틸이고, 글루타민 아미드의 경우 트리틸이고, 아르기닌 경우 Pmc(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만 설포네이트) 구아니디노기였다. 각 커플링은 BOP(벤조트리아졸릴 N-옥시트리스디메틸아미노포스포늄 헥사플루오로포스페이트) 및 HOBot(1-히드록시벤즈트리아졸)에 의해 1시간 또는 2시간동안 수행되었다.

아미드화된 카르복시 말단을 갖는 펩티드 합성에 있어서, 1.5시간에 걸쳐 처음에는 4℃, 다음에는 점차적으로 실온으로 증가된 온도에서 완전히 결합된 펩티드를 90%의 트리플루오로아세트산, 5%의 에탄디티올, 및 5% 물로 이루어진 혼합물로 분해하였다. 수지로부터 탈보호된 생성물을 여과한 뒤, 이를 디에틸 에테르로 침전시켰다. 완전히 건조한 후에, 생성물을 0.1%의 트리플루오로아세트산중의 아세토니트릴/물의 구배를 갖는 C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하였다.

실시예 2

생물학적 분석

A. FDCP-1/mEPO-R

성장 인자(2.5nm EPO) 존재하에 FDCP-1/mEPO-R세포(10⁵)를 정지기의 1/2 밀도로 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 성장인자를 뺀 전체 배지에 24시간동안 아무것도 첨가하지 않았다.

트립판 블루 염색법으로 세포 생존도를 측정하였다. 성장 인자가 없는 전체 배지중의 스톡용액이 50㎕당 소정의 세포수를 가지도록 하였다. 테스트할 화합물을 96 웰 조직 배양 플레이트(최종 웰 하나당 50㎕)중에서 2배 희석하였다.

세포(웰 하나당 50㎕)를 각 웰에 가하고 이를 24-48시간동안(네가티브 대조군이 사멸했을 때) 항온배양하였다. 세포증식은 MTT분석으로 측정하였다.

B. TF-1

EPO에 성장을 의존하는 세포주 TF-1과 관련된 Kitamura등(Blood 73:375-380(1989))에 기술된 방법을 수행하여 EPO 작용물질로서의 본 발명 화합물의 활성을 입증하였다. 이의 결과는 도 8에 나타나 있다. 도 8은 세포주 TF-1의 세포 증식에 대한 EPO 및 펩티드 VGNYMCHFGPITWVCRPGGG의 효과를 도시한 것이다.

C. 비장세포 증식

비장세포내에³H-티미딘의 혼입을 평가하는 현미경 분석을 위해 Kristal(Exp. Hematol. 11:649-660(1983)을 사용하여 EPO 작용물질로서 역할을 담당하는 본 발명 화합물의 능력을 확인하였다. 즉, B6C3F₁마우스에 2일간 페닐히드라진(60mg/kg)을 매일 투여하였다. 3일째 되는 날, 비장세포를 분리하고, MTT분석을 사용하여 24시간에 걸쳐 증식하는 이들의 능력을 검증하였다. 비장 세포의 대표적인 수가 증식하는 것을 보여주는 200배율하에서 촬영된 사진이 도 9A(대조용), 9B(500pM EPO로 처리), 및 도 9C(25㎕의 GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG)에 나타나 있다.

D. 세포성 증식: EPO-반응성 세포주, FDC-P1/ER의 펩티드 의존 성장

1. 재료 및 방법

a. 시료 제조: DMSO중에 1 x 10^-2M 스톡 용액으로서 펩티드를 재현탁시키고, 10 배의 증가량으로 순차적으로 희석시켜 하기의 100 배 용액을 생성하였다:

1x10^-31x10^-41x10^-51x10^-61x10^-71x10^-8

각 스톡 희석액 2㎕를 후술하는 것처럼 세포웰에 가하여 최종 부피가 200㎕가 되게 하여 다음과 같은 농도를 생성하였다:

1x10^-51x10^-61x10^-71x10^-81x10^-91x10^-10

b. 세포 증식 분석:

i. 세포원:FDC-P1/ER(Dexter등 J.Exp.Med.(1980) 152:1036-1047)은 EPO-R이 안정하게 트린스팩트된 형질전환되지 않은 쥐의 골수에서 유도된 세포주로 특징짓는 웰이다. 세포는 EPO 의존 증식을 나타낸다.

c. 실험 프로토칼: RPMI 1640/10% 소의 태내 혈청/항생제 및 10U/ml의 EPO에서 유지된 세포를 정지기상으로 배양시켰다. 세포를 수거하고 24시간동안 성장인자(EPO) 없이 신선한 배지에 재현탁시켰다. 세포수를 세고, 이를 800,000 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 약 4만개의 세포(50μ)를 96웰 미량역가 플레이트의 각 웰에 가하였다. 펩티드를 각 웰에 3회씩 가하였다. 표준 복용량 반응 측정은 펩티드의 각 시리즈에 대해 시행되었다. 42시간동안 항온배양한후(2배의 수가 된 후), 각 웰을 1㎕Ci/웰 티미딘으로 펄스하였다. 세포를 6시간동안 항온배양한 뒤, 이 시점에서 세포를 수거하여 수를 세고 세포 증식의 증거로서 티미딘 함입을 평가하였다.

d. 결과: EPO 수용체 세포주 및 비수용체를 지닌 모세포주에 대한 펩티드를 평가하였다. 대부분의 경우에 있어서, 펩티드는 절단된 인간 EPO 수용체 세포주에 대해 평가되었다. 결과는 재조합 EPO에 의해 얻어진 최대 활성도를 1/2를 얻는 데 필요한 펩티드의 양으로서 표시되었다. 대표적인 결과가 상대적인 결합 데이터로서 표에 나타나 있다(표 17-22 참조).

E. 티로신 인산화작용: EPO-R 및 세포내 단백질의 펩티드가 유도한 티로신 인산화 작용

1. 재료 및 방법

a. 시료 제조: 1x10^-2M의 농도를 얻기 위해 펩티드를 DMSO에 현탁시켰다.

b. 실험 프로토칼:RPMI 1640/10% 소의 태내 혈청/항생제 및 10U/ml의 EPO에서 유지된 FDC-P1/muER 세포를 정지기상으로 배양시켰다. 세포를 수거하고 이를 성장인자(EPO)없이 신선한 배지에서 24 시간동안 재현탁시켰다. 세포수를 세고 500,000 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 1ml의 세포(500,000)를 에펜돌프 튜브에 넣었다. 1x10^-3펩티드용액 1㎕를 세포에 가하고(최종 농도 1x10^-5M) 이를 37℃에서 10분간 항온배양하였다. EPO 대조군(최종 농도 10U/ml)을 각각 분석하였다. 세포를 4℃에서 14,000rpm으로 원심분리로서 수거하였다. 세포를 100㎕의 SDS 용해물 버퍼에 재현탁시킨 후 SDS 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동처리를 받게 했다. 겔을 니트로셀룰로오스에 옮긴 뒤 1시간동안 1:1000 배로 희석한 항포스포티로신 항체(Upstate Biotechnology Incorporated에서 구입)로 프로브하였다. 막을 트리스 버퍼 염수로 세척하고, 항-마우스 페록시다제 라벨화된 항체로 재프로브시켰다. ECL 웨스턴 블로팅 시약(Amersham)을 사용하여 반응성 단백질을 가시화하였다.

c. 결과: EPO-반응성 세포주중에서 이의 수용체에 결합하는 EPO는 수용체와 Shc, vav, JAK2 키나제를 비롯한 다수의 세포내 단백질 모두에 대해 티로신 인산화 작용을 유도한다. GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG를 비롯한 다수의 펩티드를 분석하면, EPO에 의해 나타난 반응을 모방하는지에 대한 이들의 역량을 평가할 수있었다. 결합 기준 및 증식 기준에 따라 판단한 바와 같이, 활성 펩티드는 EPO-반응성 세포에서 EPO의 그것과 동일한 인산작용 패턴을 이끌어 내었다. 이러한 결과는 활성 펩티드가 EPO-유도된 시그날 형질도입 경로를 통하여 이들의 반응을 끌어낸다는 것을 암시한다. 결과가 결합 데이터 및 증식 데이터로서 표 17-22에 나타나있다.

F. DNA 성분으로 특정한 세포 사이클의 펩티드-유도 개시화작용

1. 실험 프로토칼: FDCP-1/muER 세포를 정지기상으로 약 3.0x10⁶세포/ml가 되게끔 배양시켰다. 세포를 수거하고, 성장인자 부재하에 신선한 베지중에 현탁시킨 뒤 18시간 동안 재현탁시키고, 이 시점에서 동일한 세포 밀도를 갖는 3개의 플라스크로 세포를 나누었다: -인자, +EPO 및 +펩티드. 이후 세포를 10U/ml EPO 또는 10μM 펩티드로 자극하였다. 삼백만개의 세포를 0, 6, 8, 10, 12시간 되는 시점에서 수거하였다(도 15). 세포를 냉각한 PBS에 넣어 2회 세척하고, 100㎕의 냉각 PBS중에 세포 펠릿을 재현탁하고, 냉각 70% 에탄올 900㎕로 재현탁시켰다.세포를 50㎕/㎖의 프로피듐 요오드로 염색한 뒤, FACS Scan Flow 세포측정기로 형광을 측정하였다. 각 상에서의 세포의 함량(%)는 Becton Dickinson에 의해 SOBR 모델인 CellFIT 소프트 웨어를 사용하여 측정하였다.

EPO(10U/ml)와 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(1x10^-5M)는 세포 사이클을 통하여 자라는 세포에 대해 동일한 효과를 나타내었다. EPO 또는 펩티드중 어느 하나로 10시간 동안 후유도를 행하므로써, 15%의 배지 대조군과 비교해볼 때 약 45%의 세포가 S상에 놓여졌다. 이러한 결과는 재조합 EPO와 동일한 키네틱을 갖는 반응을 펩티드가 유도할수있음을 암시한다.

G. 콜로니 분석:쥐의 골수 및 인간의 말초혈액 콜로니 분석

1. 재료 및 방법:

표준 멸균 헤파린 진공 튜브중의 말초혈액 10㎖ 시료를 건강한 개체로부터 얻었다. 쥐의 골수는 실험 1회당 약 10 마리의 마우스의 대퇴골로부터 얻은 것이다. 모든 시약은 Stem Cell Technologies Inc(벵쿠버, 캐나다)에서 구입한 것이다.

a: 실험 프로토칼; 핵형성된 세포수 측정은 원래의 시료에서 핵형성 세포의 수와 농도를 결정하기 위한 것이다. 이러한 말초혈액의 경우에, 실온에서 30분간 400g의 Ficoll-Hypaque(1ml당 1.077g)구배를 사용한 원심분리를 시료에 대하여 수행하였다. Ficoll-Hypaque 용액의 게면에서 단핵 세포를 조심스럽게 제거하고 이를 약 10ml의 총부피가 되게끔 희석하였다. 쥐의 골수 또는 인간의 말초혈액으로부터 얻은 세포를 원심분리로 수거하고 상청액을 따랐다. 펠릿화된 세포를 신선한 배지에 재현탁시키고, 이를 상술된 바와 같이 수거하였다. 세척된 세포를 하기의 평판 농도로 Iscove의 배지/2% 소의 태내 혈청중에 희석시켰다.

정상 골수: 1x10⁵낮은 밀도 세포수

정상 혈액: 4x10⁵낮은 밀도 세포수

제조업자의 지시에 따라서 세포를 메틸 셀룰로오스에 가하였다. EPO가 제거된 메틸 셀룰로오스 배지중에서 1x10^-6및 1x10^-5M. 펩티드를 분석하였다. 최대의 콜로니 형성을 평가하기 위해서, 완전메틸 셀룰로오스 배지중에 동량의 세포수를 평판배양하였다. EPO 및 펩티드가 없는 각각의 분석을 대조군 평판에 대해 시행하여 콜로니가 형성되는 지를 결정하였다. 10일 및 18일간 항온배양한 후 콜로니의 수를 세었다.

b. 결과: 표 13-15에 나타난 바와 같이, 콜로니를 쥐의 골수 및 인간의 말초혈액중에서 완전 메틸 셀룰로오스 배지(EPO)에서 얻어진 것과 비교해볼 때 상당히 낮은 농도에도 불구하고, GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG가 콜로니 형성을 촉진할 수 있었다.

인간의 말초혈액 표본상에서의 콜로니 분석(94.10.2. 셋업)

날짜	시료	CFU-E	MBFU-E	PBFU-E	CFU-GM
2/23/94	ZERO	X	X	X	X
	DMSO	X	X	X	X
	EPO(METHOCULT)	11	25	X	X
	EPO(3U/ml)	7	7	X	X
	AFFY 244 10^-5M	10	5	X	X
	AFFY 244 10^-6M	11	5	X	X
3/4/94
	ZERO	X	X	X	X
	DMSO	X	X	X	X
	EPO(METHOCULT)	1	11	13	9
	EPO(3U/ml)	4	7	7	3
	AFFY 244 10^-5M	7	9	2	4
	AFFY 244 10^-6M	6	11	1	2
CFU-E:콜로니-형성 유닛-적혈구(1-2 클라스터)MBFU-E: 숙성된 적아구 형성 유닛- 적혈구(1-3 클라스터)PBRU-E: 원시적인 적아구 형성 유닛-적혈구(9이상)CFU-GM: 콜로니 형성 유닛의 과립구/단핵구/대식세포

콜로니 형성 세포수(쥐의 골수에서)

1/28/94
	2/10/94
	전구체	대조군	EPO	10^-5M	10^-6M
	CFU-E	0	23	2	3
	BFU-E	0	5	0	0
	CFU-GM	0	3	0	0
	2/21/94
	전구체	대조군	EPO	10^-5M	10^-6M
	CFU-E	0	0	0	0
	BFU-E	0	30	2	4
	CFU-GM	0	3	0	0
AFFY11157 = ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg

콜로니 형성 세포수(쥐의 골수에서)

2/21/94
	3/1/94
	전구체	대조군	EPO	10^-5M	10^-6M
	CFU-E	0	3	9	0
	BFU-E	0	3	12	0
	CFU-GM	0	10	0	0

	3/14/94
	전구체	대조군	EPO	10^-5M	10^-6M
	CFU-E	0	0	1	0
	BFU-E	0	10	8	0
	MBFU-GM	0	0	4	0
	CFU-GM	0	26	0	0

H. 펩티드-유도된 증식: EPO에 반응하지 않는 세포주상에서의 펩티드 의존 성장

a. 실험 프로토칼: 상기 D 항목에 기술된 바에 따라 펩티드를 분석하였다. 성장 가능성을 평가하기 위해서 각 세포주에 대하여 관련된 유사분열/성장 인자를 사용하여 각 세포주상에서 성장 커브를 그렸다.

b. 결과: 표 16에 나타나듯이, GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG는 조혈 세포주 및 비조혈 세포주를 비롯한 비-조혈반응 세포주상에서 성장 반응을 자극할 수없었다.

61233을 사용한 세포 증식 분석

세포 타입	표본물	EPO	61233	성장 인자 반응
조혈 세포
TF-1	인간	+	+	GM-CSF, IL3(적혈구계)
M-07E	인간	-	-	GM-CSF, IL3(거핵아구계)
AML193	인간	-	-	GM-CSF, G-CSF, IL3(단핵구계)
T-cell 클론	인간	ND	-	IL2
조골세포
TE85	인간	-	-	혈청
MC3T3	쥐	-	-	혈청
가슴세포
T47D	인간	ND	-	프로제스틴

I. 고정화된 EPO RK 주성분인 I¹²⁵ηEPO경쟁 결합 분석

인간의 EPO 수용체의 세포외 영역(EPO 결합 단백질, EPB)이 이.콜리 중에서 발현되어 대량 생산되었다. 이. 콜리에서 사용된 많은 다른 재조합 진핵 단백질의 경우에서 처럼, 단백질은 실험실 규모의 발효공정에서는 불용성 생성물로 나타났고, 이것을 되접어져서 정제하였는 바 활성 단백질을 얻었다. 이 방법에 의해 생성된 EBP는 리간드의 용액상 결합을 시행하지 않고서도 변형될 수 있는 하나의 유리 설프히드릴기를 함유한다. 평형화 결합 분석 및 경쟁 결합 분석을 위한 토대로서 EPB를 고정화시키기 위해서, EPB가 아가로즈 비드에 공유결합하는 지를 관찰하였다. Sulfolink 비드의 아이오도아세틸 활성 화학(Pierce Chemical Co, Rockford, IL)은 유리 티올에 특이적이며, 결합은 쉽게 가역화되지 않는 것이 확실하다. EBP-Sulfolink 비드를 다음과 같이 만들었다: Sulfolink 겔 현탁액(10ml)을 커플링 버퍼(40ml:50mM 트리스, pH 8.3, 5mM EDTA)와 혼합시킨 뒤 겔을 침전시켰다. 상청액을 분리한 뒤 결합될 EBP(커플링 버퍼중에서, 0.3mg/ml)를 세척된 비드에 직접 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분간 부드럽게 흔든 뒤 비드를 실온에서 1시간 동안 정치시켰다. 상청액을 분리하여 보유한 뒤 비드를 커플링 버퍼 20ml로 2회 세척하였다. 세척물을 또한 회수하였다. 이후 비드를 20mM 의 0.05M의 시스테인으로 30분간 실온에서 처리한 뒤 비결합된 부위를 차단시켰다. 마지막으로, 비드를 1 M Nacl 50ml로 세척한 뒤 30ml의 PBS 로 세척하고, 20ml의 PBS에 재현탁시키고 이후의 사용을 위해서 4℃에서 보관하였다. 비드에 공유결합되는 EBP의 양은 원래의 EBP용액의 OD₂₈₀값과 반응상청액 및 2개의 20ml 세척물에서 회수한 OD₂₈₀값과 비교하여서 결정된 것이다. 일반적으로 적용된 EBP의 40-60%가 비드와 결합한 체로 남아 있었다.

EBP비드(50㎕)를 개개의 반응튜브에 첨가하여 결합분석을 개시하였다. 전체결합은 0.3-30㎚ [¹²⁵I]-EPO(NEN Research Products, Boston MA, 100μCi/㎍)를 함유하는 튜브 중에서 측정하였다. 비특이적 결합을 측정하기 위해서 비-라벨된 EPO를 상응하는 [¹²⁵I]EPO 농도의 1000배되는 양으로 가하였다. 결합 버퍼(PBS/0.2% BSA)를 사용하여 각 반응 부피가 500㎕가 되게 하였다. 튜브를 실온에서 부드럽게 교반하면서 5시간동안 항온 배양하였다(이 시간은 평형을 이루는데 걸리는 적합한 시간으로서 실험적으로 결정된 것이다). 5시간 후에, 각 반응 혼합물에 유리울로 밀봉된 1㎕ 피펫 팁을 통과시켰다. 튜브를 1㎕의 세척 버퍼(PBS/5% BSA)로 세척하고, 이것과 1㎕ 세척물 2개를 함께 피펫 팁에 통과시키고 수거하여 유리 EPO의 농도를 측정하였다. 이들 아가로즈 비드상에 고정화된 EBP와 [¹²⁵I]EPO의 특이적 결합에 대한 평형 결합 분석은 결합 등온선의 선형 형질전환(Scatchard)을 기준으로 5㎚±2의 Kd를 나타내었다(도 16 참조).

가능성 있는 펩티드의 경쟁적인 결합분석이 다음과 같이 수행되었다. 각각의 펩티드를 1μM의 스톡용액을 제조하기 위해 DMSO에 용해시켰다. 모든 반응튜브(2개씩)들은 50㎕의 EBP 비드, 0.5nM¹²⁵I]EPO 및 0-500μM의 펩티드를 500㎕의 결합버퍼 중에 함유하고 있었다. DMSO의 최종농도는 모든 분석 튜브에서 2.5%로 조정되었는데, 이 값은 아무런 검출 가능한 효과를 나타내지 못했다. 그 이유는 DMSO에 대한 분석 민감도 관찰 결과 25%이하의 DMSO(V/V)의 농도가 결합시에 아무런 해로운 효과를 갖지 않기 때문이었다. 비라벨된 EPO(1000nM) 과량을 함유하는 튜브를 사용하여 각 개체분석에 의해 비-특이 결합을 측정하였다. 첨가된 펩티드가 없는 초기의 분석점은 각 분석에서 천체 결합을 측정하기 위해 포함된 것이다. 결합 혼합물을 실온에서 부드럽게 교반하면서 실온에서 밤새도록 항온 배양하였다. 이후 비드를 Micro-칼럼(Isolab, Inc., Akron, Ohio)을 사용하여 수거하고 3mL 세척 버퍼로 세척하였다. 세척된 비드를 함유하는 칼럼을 12×75㎜ 유리튜브에 놓고 결합된 방사활성 수준을 감마 계수기를 사용하여 측정하였다. 결합된 [¹²⁵I]EPO의 양은 비-특이적 결합을 보정한후의 펩티드 농도에 대한 대조군(총=100%) 결합을 플러트하여 함량(%)으로서 표시되었다. IC₅₀은 EBP에 대한 [¹²⁵I]EPO의 결합으로 정의되었다. 모든 데이터는 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(RWJ61233)에 대해서 기록되었는데, 이것은 5μM의 IC₅₀을 나타내었다(표 17-22 참조).

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 치환 시리즈

서열번호	서열	상대적인 결합도^‡	EPO-ED₅₀(μM)	인산화반응¹
61233^‡	GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	1	0.1	+
61231	GGTASCHFGPLTWVCKPQGG	24	IA	-
61520	GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG	24	IA	-
61598	GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG	12	IA	-
61277	GGTYSCHFGALTWVCKPQGG	2	0.1	+
61278	GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG	18	IA	-
61213	GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG	16	IA	-
61314	GGTYSCHFGPATWVCKPQGG	1	.2	+
61395	GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG	100	IA	-
62145	GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG	6	0.25
61530	GGTYSC-FGPLTWVCKPQGG	40	IA	-
^*EPO 의존한 증식반응의 최대수준 1/2(11pM)을 도달하는데 필요한 양¹10μM에서 분석됨²IA=불활성^‡RWJ-61233에 대한 결합^‡모든 펩티드는 시클릭(61394 제외)이고, COOH 말단 아미드(-CONH₂)로서 분석됨
61233=AFFY1157=AFFY244

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 절단 시리즈

서열번호	서열	상대적인 결합도^‡	EPO-ED₅₀(μM)	인산화반응¹
61233^‡	GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	1	0.1	+
61596	GGTYSCHFGPLTWVCKPQ	1.6	0.08	+
61597	TYSCHFGPLTWVCKPQGG	8	2	+
61230	TYSCHFGPLTWVCKPQ	6	2	+
61232	YSCHFGPLTWVCKP	9	20	+/-
61279	YSCHFGPLTWVCK	14	3	+/-
61477	YSCHFGPLTWVC	50	IA²	-
61895	YSCHFGALTWVCK	32	IA
61513	Y-CHFGPLTWVC	12	2	+
61177	SCHFGPLTWVCK	18	IA	-
AF11154	GGCRIGPITWVCGG	13	IA	-
61394	HFGPLTWV	100	IA	-
^*EPO 의존한 증식반응의 최대수준 1/2(11pM)을 도달하는데 필요한 양¹10μM에서 분석됨²IA=불활성^‡RWJ-61233에 대한 결합^‡모든 펩티드는 시클릭(61394 제외)이고, COOH 말단 아미드(-CONH₂)로서 분석됨
61233 = AFFY11157 = AFFY244

펩티드의 아날로그 서열

서열번호	서열	상대적 결합도^‡	EPO-ED₅₀(μM)	인산화 반응¹
61233^‡	GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	1	0.1	+
61721		100	IA²
61718	GGLYACHMGPMTWVCQPLRG	0.6	0.1
61719	GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG	8	9
61720	GGLYTCRMGPITWVCLPAGG	ND	-
61717	GGNYYCRFGPITFECHPTGG	100(S1)	IA
^*EPO 의존한 증식반응의 최대수준 1/2(11pM)을 도달하는데 필요한 양¹10μM에서 분석됨²IA=불활성^‡RWJ-61233에 대한 결합^‡모든 펩티드는 시클릭(61394 제외)이고, COOH 말단 아미드(-CONH₂)로서 분석됨
61233 = AFFY11157 = AFFY244

서열번호	(X)	서열	상대적결합도^‡	EPO-ED₅₀(μM)^*
서열번호	(X)	서열	상대적결합도^‡	쥐의수용체	절단된인간의 수용체
61233^‡		GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	1	0.1	0.1
61231		GGTASCHFGPLTWVCKPQGG	24	IA²
61520		GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG	24	IA
61598		GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG	12	IA
61894	p-NO₂-Phe	GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG	17	IA	0.8
62019	p-NO₂-Phe	GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG	18	IA	3.0
62020	p-F-Phe	GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG	8	1.0	0.1
62021	3,5-디브로모-tyr	GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG	30	IA	IA
^*EPO 의존한 증식반응의 최대수준 1/2(11pM)을 도달하는데 필요한 양¹10μM에서 분석됨²IA=불활성^‡RWJ-61233에 대한 결합^‡모든 펩티드는 시클릭(61394 제외)이고, COOH 말단 아미드(-CONH₂)로서 분석됨
61233 = AFFY11157 = AFFY244

17 위치에서의 치환 시리즈

서열번호	서열	상대적결합도^**	EPO-ED₅₀(μM)
서열번호	서열	상대적결합도^**	쥐의 수용체	절단된인간의 수용체	인간의수용체
65876	GGTYSCHFGPLTWVCKAQGG	20^*	10	0.3	10
^*61233에 대한 결합도 = AFFY11157 = AFFY244^제한된 용해도

다양한 활성시리즈 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG계

서열번호	서열	상대적결합도^‡	EPO-ED₅₀(μM)^*
서열번호	서열	상대적결합도^‡	쥐의수용체	절단된인간의 수용체
61233^‡	GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	1	0.1	0.1
61596	GGTYSCHFGPLTWVCKPQ	1.6	0.08	0.02
61718	GGLYACHMGPMTWVCQPLRG	0.6	0.1	0.08
AF11288	GGLYACHMGPMTWVCQPLRG	0.2	0.15	ND¹
61757(H22)	LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD	1	0.11	0.15
AF11654	TIAQYICYMGPETWECRPSPKA	1	0.2	0.02
62145	GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG	6	0.25	0.5
62146	Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	4	0.03	0.06
61894	GGTXSCHFGPLTWVCKPQGGp-NO₂-Phe	17	IA²	0.8
62019	GGTXSCHFGPLTWVCKPQGGp-NH₂-Phe	18	IA	3.0
62020	GGTXSCHFGPLTWVCKPQGGp-F-Phe	8	1.0	0.1
^*EPO 의존한 증식반응의 최대수준 1/2(11pM)을 도달하는데 필요한 양¹10μM에서 분석됨²IA=불활성^‡RWJ-61233에 대한 결합^‡모든 펩티드는 시클릭(61394 제외)이고, COOH 말단 아미드(-CONH₂)로서 분석됨
61233 = AFFY11157 = AFFY244

J. 적혈구 증가성의 저산소증이 감소된 쥐의 생물학적 분석

암컷 BDF1 마우스(18-20g)를 14일간 주위 압력하에서 6시간, 0.40±0.02 atm 에서 18시간 동안의 사이클(저압증실) 처리를 받게 하였다.

γ-HuEPO 또는 테스트 시료를 투여하기 전에 72시간 동안 마우스를 주위 압력하에서 유지하였다. 테스트 시료 또는 표준 γ-HuEPO를 상기 처리를 받은 마우스에게 주사하였다. 이 주사 매질은 0.1%의 BSA(w/v)를 함유하는 PBS로 다음으로 구성되어 있다.

희석하기 위해, 0.5㎖를 10마리의 쥐 각각에 피하 투여한다. 혈액 시료를⁵⁹Fe 투여한지 48시간 후에 수거한다. 적혈구 용적법 및 방사 활용법을 각 시료에 대하여 측정하였다. 복용량 범위 및 결과(두개의 다른 분석)을 표 23 및 도 17A - 도 17C에 기재하였다.

	복용량	n	평균 로그
EPO St.	0.000	10	0.26
	0.025	10	1.65
	0.050	10	2.74
	0.100	10	3.28
DMSO	0.40%	7	0.58
	0.35%	5	0.60
244-1	0.25㎎	7	0.62
	0.50	8	0.76
	1.00	9	0.92
244-2	2.00	9	1.38
	4.00	10	1.81
	8.00	9	2.26
244-3	14.0	10	2.44
	28.0	10	3.15
	56.0	9	3.16
0.1㎎ AFFY244 1 U r-HuEPO (8.3㎎)

또한, 전술된 적혈구 증가성의 저산소증이 감소된 마우스의 생물학적 분석을 사용하여, TIAQYICYMGPETWECRPSPKA 및 두 개의 디설파이드 결합을 함유하는 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(CAF12080) 이량체성 펩티드 아날로그를 테스트하였다. 적혈구 증가성의 저산소증이 감소된 마우스의 생물학적 분석이 도 18A - 도 18B에 제시되어 있다. 표 24는 EPO와 다양한 유사한 펩티드의 적합한 등가물에 대하여 기술하고 있다.

펩티드	0.025 등가의 펩티드의 양 EPO(nmol)
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(RWJ 61233/AFFY11157)	3.8
GGTYSCHFGPLTWVCKPQ(RWJ 61596)	0.5
LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD(RWJ 61757)	3.1
TIAQYICYMGPETWECRPSPK(AAFY11654)	11-21
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG Dimer(AFFY12080)	0.035

K. 망상적혈구 분석

EPO 또는 실험 화합물로 연속하여 3일동안 정상의 비처리된 암컷 BDF1 마우스에게 0.5㎖를 피하 주사하였다. 매질은 PBS, 10%의 PEG 8000, 0.25%의 BSA, DMSO가 함유되었다. 3일째에, 철 덱스트란(100㎎/㎖)을 복강내로 0.1㎖씩 복용시켰다. 5일째에, 마우스를 Co₂로 마취시키고, 심장에 구멍을 내어 피를 흘리게 하였다. 망상적혈구(%)를 티아졸 오렌지 염색법 및 유동의 세포측정기 분석(적혈구 수 프로그램)로 측정하였다. 보정된 망상적혈구(%)는 하기의 식에 따라 측정되었다.

RETIC (%)_(보정값)= RETIC_(관찰값)× Hct_(개체)/Hct_(정상)

전술된 망상적혈구 분석을 사용하여 얻은 결과가 도 18A - 도 18B 및 도 19A - 도 19B에 도시되어 있다.

L. 콜로니 분석: 적혈구 콜로니 형성

1. 재료 및 방법

정상의 공혈자에서 얻은 인체의 핵생성 골수 세포를 반 고형의 메틸셀룰로오스(0.9% 메틸셀롤로오스, 30% 소태내 혈청, 1% 소혈청 알부민)에 평판 배양하였다. 즉, 세포를 수거하고, 버퍼된 염화암모늄을 첨가하여 적혈구 세포를 용해하였다. 2%의 송아지 태내 혈청을 함유하는 배지에 세포를 재현탁시키고 각 플레이트 2개당 2×10⁵세포밀도로 평판 배양하였다. 배양한지 12일 후에 형성된 적혈구와 과립구-대식세포(G-M) 콜로니를 색상 및 형태학을 근거로 수를 세었다. 재조합 인간 성장 인자 IL-3, GM-CSF, SCF(3/GM/S)를 함유하는 대조 평판을 본 연구에 포함시켜 시료의 GM 콜로니 형성을 평가하였다. 결과가 표 25에 나타나 있다.

성장 인자	2 x 10⁵핵 형성된 세포의 콜로니수
	적혈구	G-M
	평판 1	평판 2	평판 1	평판 2
대조군(성장인자 없음)	0	0	0	0
EPO(0.24)	113	106	12	9
RWJ 61233(1000)	29	23	1	2
RWJ 61233(10,000)	80	75	2	0
3/GM/S(0.7/0.7/2.7)	0	0	176	212

2. 결과

상기 데이터로부터, GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(RWJ 61233/AFFY11157)은 부가의 시토킨 없어도 적혈구 콜로니의 형성을 촉진할 수 있다. 또한, 펩티드는, GM 계의 콜로니 형성을 촉진시키지 못하는데 비하여 적혈구계에서는 엄격한 특이성을 나타낸다.

상술된 내용들은 예시의 목적이지 제한하는 것은 아니다. 당업자라면 본 명세서를 검토하면서 더 많은 구체화를 생각할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 영역은 상기 기재내용에만 국한되는 것이 아니라 첨부된 청구범위 및 청구범위와 균등한 범위의 것으로 결정되어야 한다. 한편, 본 명세서의 모든 특허공보를 비롯한 모든 참고문헌은 참고용으로 기술되었다.

EPO-R은 EPO 결핍증 또는 적혈구 세포 군락수가 낮거나 결핍된 환자를 치료하는데 유용하다.

Claims

EPO(에리트로포이에틴) 수용체에 결합하며, X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈아미노산 서열을 함유하는 10 내지 40개 길이의 아미노산을 함유하며, 상기 식에서 각 아미노산은 표준 약어법에 의해 표기된 것으로서, X₆는 유전공학적으로 암호된 L-아미노산 20개중 어느 하나로부터 각기 선택된 것이며; X₃은 C; X₄는 R, H, L 또는 W이고; X₅는 M, F 또는 I이며; X₇은 D, E, I, L 또는 V이고; X₈은 C인 펩티드.
제1항에 있어서, YX₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈아미노산 서열을 함유하며, 상기 식에서 각 아미노산은 표준 약어법에 의해 표기된 것으로서, X₂및 X₆는 유전공학적으로 암호된 L-아미노산 20개중 어느 하나로부터 각기 선택된 것이며; X₃는 C; X₄는 R, H, L 또는 W이고; X₅는 M, F 또는 I이며; X₇은 D, E, I, L 또는 V이고; X₈은 C인 펩티드.
제2항에 있어서, X₁YX₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈X₉X₁₀X₁₁아미노산 서열을 함유하며, 상기식에서 각 아미노산은 표준 약어법에 의해 표기된 것으로서 X₁, X₂, X₆, X₉, X₁₀및 X₁₁은 유전공학적으로 암호된 L-아미노산 20개중 어느 하나로부터 각기 선택된 것이며; X₃는 C; X₄는 R, H, L 또는 W이고; X₅는 M, F 또는 I이며; X₇은 D, E, I, L 또는 V이고; X₈은 C인 펩티드.
제3항에 있어서, X₄는 R, 또는 H이고; X₅는 M, 또는 F 이며; X₆은 I, L, T, M, E 또는 V이고; X₇은 D 또는 V이며; X₉는 G, K, L, Q, R, S 또는 T이고; X₁₀은 A, G, P, R 또는 Y인 펩티드
제4항에 있어서, X₁은 D, E, L, N, S, T 또는 V이며; X₂는 A, H, K, L, M, S 또는 T이고; X₄는 R 또는 H이며; X₉는 K, R, S 또는 T이고; X₁₀은 P인 펩티드.
제1항에 있어서, 하기군으로부터 선택되는 펩티드.
제1항에 있어서, 하기군으로부터 선택되는 펩티드.
제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 고리화된 펩티드.
제8항에 있어서, 하기군으로부터 선택되는 펩티드.
제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 이량체화된 펩티드.
제10항에 있어서, 상기 펩티드가 하기의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드
제1항의 화합물과 약학적 허용염을 함유하는 약학 조성물.
제1항의 펩티드 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하여 EPO결핍증 또는 적혈구 세포수가 낮거나 결함있는 증상을 갖는 질환의 환자를 치료하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 질환이 말기의 신부전증 또는 투석증; AIDS, 자가면역 또는 악성질환과 연관된 빈혈증: 베타-탈라세미아증; 낭포성 섬유증; 미숙으로 인한 초기 빈혈증; 만성염증질환과 연관된 빈혈증; 척수손상증; 급성 혈액 소실증; 노화; 비정상 적혈구 생성으로 인한 종양성 질환인 방법.
제13항에 있어서, X₁YX₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈아미노산 서열을 함유하며, 상기 식에서 각 아미노산은 표준 약어법에 의해 표기된 것으로서, X₂또는 X₆유전공학적으로 암호된 L-아미노산 20개중 어느 하나로부터 각기 선택된 것이며; X₃는 C; X₄는 R, H, L 또는 W이고; X₅는 M, F 또는 I이며; X₇은 D, E, I, L 또는 V이고; X₈은 C인 방법.
제15항에 있어서, X₁YX₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈X₉X₁₀X₁₁아미노산 서열을 함유하며, 상기 식에서 각 아미노산은 표준 약어법에 의해 표기된 것으로서 X₁, X₂, X₆, X₉, X₁₀및 X₁₁은 유전공학적으로 암호된 L-아미노산 20개중 어느 하나로부터 각기 선택된 것이며; X₃는 C; X₄는 R, H, L 또는 W이고; X₅는 M, F 또는 I이며; X₇은 D, E, I, L 또는 V이고; X₈은 C인 방법
제16항에 있어서. X₄는 R 또는 H이고; X₅는 M 또는 F이며; X₆은 I, L, T, M 또는 V이고; X₇은 D 또는 V이며; X₉는 G, K, L, Q, R, S 또는 T이고; X₁₀은 A, G, P, R 또는 Y인 방법.
제17항에 있어서, X₁은 D, E, L, N, S, T 또는 V이며; X₂는 A, H, K, L, M, S 또는 T이고; X₄는 R 또는 H이며; X₉는 K, R, S 또는 T이고; X₁₀은 P인 방법.
제13항에 있어서, 하기군으로부터 선택되는 펩티드
제13항에 있어서, 펩티드가 고리화된 방법.
제13항에 있어서, 펩티드가 이량체화된 방법.
EPO 수용체에 결합하며, 아미노산 서열 X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈을 함유하며, 상기식에서 각 아미노산은 표준 약어법에 의해 표기된 것으로서, X₆는 유전공학적으로 암호된 L-아미노산 20개중 어느 하나로부터 각기 선택된 것이며; X₃는 C; X₄는 R, H, L 또는 W이고; X₅는 M, F 또는 I이며; X₇은 D, E, I, L 또는 V이고; X₈은 C인 10-40 아미노산 잔기의 펩티드 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하여 EPO 결핍증 또는 적혈구 세포 군락수가 낮거나 결핍된 질환을 가진 환자를 치료하는 방법.
제22항에 있어서, 상기 질환은 말기의 신부전증 또는 투석증; AIDS, 자가면역 또는 악성질환과 연관된 빈혈증: 베타-탈라세미아증; 낭포성 섬유증; 미숙으로 인한 초기 빈혈증; 만성염증질환과 연관된 빈혈증; 척수손상증; 급성 혈액 손실증; 노화; 비정상 적혈구 생성으로 인한 종양성 질환인 방법.
제22항에 있어서, YX₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈아미노산 서열을 함유하며, 상기 식에서 각 아미노산은 표준 약어법에 의해 표기된 것으로서, X₂및 X₆는 유전공학적으로 암호된 L-아미노산 20개중 어느 하나로부터 각기 선택된 것이며; X₃는 C; X₄는 R, H, L 또는 W이고; X₅는 M, F 또는 I이며; X₇은 D, E, I, L 또는 V이고; X₈은 C인 방법.
제24항에 있어서, X₁YX₂X₃X₄X₅GPX₆TWX₇X₈X₉X₁₀X₁₁아미노산 서열을 함유하며, 상기 식에서 각 아미노산은 표준 약어법에 의해 표기된 것으로서 X₁, X₂, X₆, X₉, X₁₀및 X₁₁은 유전공학적으로 암호된 L-아미노산 20개중 어느 하나로부터 각기 선택된 것이며; X₃는 C; X₄는 R, H, L 또는 W이고; X₅는 M, F 또는 I이며; X₇은 D, E, I, L 또는 V이고; X₈은 C인 방법.
제25항에 있어서, X₄는 R, H, L 또는 W이고; X₅는 M 또는 F 이며; X₆은 I, L, T, M 또는 V이고; X₇은 D 또는 V이며; X₉는 G, K, L, Q, R, S 또는 T이고; X₁₀은 A, G, P, R 또는 Y인 방법.
제26항에 있어서, X₁은 D, E, L, N, S, T 또는 V이며; X₂는 A, H, K, L, M, S 또는 T이고; X₄는 R 또는 H이며; X₉는 K, R, S 또는 T이고; X₁₀은 P인 방법.
제22항에 있어서, 펩티드는 하기 군으로부터 선택된 방법:
제22항에 있어서, 펩티드가 고리화된 방법.
제22항에 있어서, 펩티드가 이량체화된 방법.