ES2346275T3 - Direccionamiento de agentes farmaceuticos a tejidos lesionados. - Google Patents

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Abstract

Polipéptido de fusión que comprende un dominio de unión a colágeno y un agente modulador de la angiogénesis, en el que el agente modulador de la angiogénesis se selecciona entre el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

Description

Direccionamiento de agentes farmacéuticos a tejidos lesionados.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al direccionamiento de agentes farmacéuticos, mas específicamente al use de dominios de unión a colágeno para dirigir agentes farmacéuticos a un tejido deseado.
Antecedentes de la invención
La arteriopatía coronaria isquémica es una de las causas principales de morbididad y mortalidad en los Estados Unidos. Los enfoques terapéuticos actuales incluyen la modificación de factores de riesgo, la reducción de la demanda de oxigeno del miocardio, y la restauración localizada del flujo al sistema arterial coronario mediante angioplastia, endoprótesis, o derivación coronaria. Estas opciones de tratamiento a menudo son insuficientes y una cantidad significativa de pacientes incluso no son candidatos para las opciones quirúrgicas. Se han hecho algunos intentos para mejorar el suministro sanguíneo del flujo coronario al miocardio isquémico por injerto o con medidas para agrandar los vasos sanguíneos existentes.
La angiogénesis terapéutica es un proceso que puede usarse para desarrollar vasos sanguíneos colaterales al miocardio. El término "angiogénesis" se refiere a un proceso de vascularización tisular que implica el desarrollo de nuevos vasos. La angiogénesis es un proceso complejo que implica la descomposición de la matriz extracelular, con proliferación y migración de células endoteliales y del músculo liso provocando finalmente la formación y organización de nuevos vasos sanguíneos (Folkman, J., y Klagsbrun, M., Science 235: 442-7, 1987). La angiogénesis típicamente sucede mediante uno de tres mecanismos: (1) neovascularización, donde las células endoteliales migran desde vasos pre-existentes que comienzan la formación de los nuevos vasos; (2) vasculogénesis, donde los vasos surgen a partir de células precursoras de novo; o (3) expansión vascular, donde vasos pequeños existentes se agrandan en diámetro para formar vasos más grandes (Blood, C.H., y Zetter, B.R., Biochem, Biophys. Acta. 1022: 89-118, 1990). La angiogénesis es un proceso importante en los procesos normales del crecimiento neonatal y en el sistema reproductor femenino durante el ciclo de crecimiento del cuerpo lúteo (véase. Moses, M.A., et al., Science 248: 1408-10, 1990). En condiciones normales, todos los procesos que implican la nueva formación o el remodelado de vasos sanguíneos existentes o nuevos es un proceso auto-limitante, y la expansión de los tipos celulares específicos esta controlada y coordinada. La angiogénesis también esta implicada en la curación de heridas y en la patogénesis de una gran cantidad de enfermedades clínicas incluyendo inflamación tisular, artritis, asma, crecimiento tumoral, retinopatía diabética, y otras afecciones. Las manifestaciones clínicas asociadas con la angiogénesis se conocen como enfermedades angiogénicas (Folkman y Klagsbrun, 1987, supra).
La expresión "factores de crecimiento" se refería originalmente a sustancias que promueven el crecimiento celular. Se usa para indicar las moléculas que funcionan como estimuladores del crecimiento (mitógenos) pero también como inhibidores del crecimiento (a veces mencionados como factores de crecimiento negativos). también se sabe que los factores de crecimiento estimulan la migración celular (por ejemplo, citoquinas mitogénicas), funcionan como agentes quimiotácticos, inhiben la migración celular o la invasión de células tumorales, modulan las funciones diferenciadas de las células, están implicados en la apoptosis y promueven la supervivencia de las células. Dichos factores pueden secretarse como factores difundibles y también pueden existir en formas ancladas a membrana. Pueden, por lo tanto, actuar de un modo autocrino, paracrino, yuxtacrino o retrocrino. Una citoquina es un tipo de factor de crecimiento.
El término "citoquina" se usa coma un nombre genérico para un grupo diverso de proteínas y péptidos solubles que actúan como reguladores humorales a concentraciones nano a picomolares y que, en condiciones normales o patológicas, modulan las actividades funcionales de células individuales y tejidos. Estas proteínas también median interacciones entre células directamente y regulan procesos que tienen lugar en el entorno extracelular. Las citoquinas comprenden interleuquinas, que inicialmente se creía que se producían exclusivamente por lo leucocitos; linfoquinas, que inicialmente se creía que se producían exclusivamente por los linfocitos; monoquinas, que inicialmente se creía que se producían exclusivamente por los monocitos; interferones, que inicialmente se creía que estaban implicados en respuestas antivirales; factores estimuladores de colonias, que inicialmente se creía que soportaban el crecimiento de células en medios semisólidos; y quimioquinas, que se creía que estaban implicadas en la quimiotaxis, y una diversidad de proteínas diferentes. In vivo, la expresión de la mayoría de las citoquinas esta estrictamente regulada; estos factores habitualmente se producen solamente por células activadas en respuesta a una señal de inducción.
En general, las citoquinas actúan sobre un espectro mas amplio de células diana que las hormonas. Quizás la característica principal que distingue las citoquinas de los mediadores considerados generalmente como hormonas es el hecho de que, a diferencia de las hormonas, las citoquinas no se producen por células especializadas que se organizan en glándulas especializadas; no hay una única fuente orgánica para estos mediadores. El hecho de que las citoquinas sean proteínas secretadas también significa que los sitios de su expresión no predicen necesariamente los sitios en los que ejercen su función biológica. Se ha descubierto que algunas citoquinas, después de la determinación sus estructuras primarias, son idénticas a enzimas clásicas (por ejemplo: el factor derivado de leucemia de células T adultas (ADF), nm23, el factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas (PD-ECGF, o neuroleuquina). Las citoquinas normalmente no tienen actividades enzimáticos aunque hay una lista creciente de excepciones. Las actividades biológicas de las citoquinas pueden medirse por una diversidad de bioensayos que emplean, entre otras cosas, líneas celulares dependientes de factor, o las citoquinas pueden medirse por otros ensayos usando, por ejemplo, anticuerpos. El fenotipado por amplificación de mensaje emplea técnicas modernas de biología molecular y detecta la presencia de ARNm específicos de citoquinas.
Muchos experimentos han sugerido que los tejidos pueden producir factores angiogénicos que promueven la angiogénesis en condiciones de mal suministro sanguíneo durante condiciones tanto normales como patol6gicas. Se ha demostrado que varios factores angiogénicos in vivo promueven la angiogénesis en el miocardio isquémico, incluyendo el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), entre citoquinas y otras moléculas (Lopez y Simons, Drug Delivery 3:143, 1996). Estos factores y compuestos difieren en la especificidad celular y en los mecanismos por los que inducen el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Por ejemplo, pueden inducir la migración y proliferación de células endoteliales a estimular la producción de colagenasa (véase Klagsbrun, M., y D'Amore, P.A., Ann. Rev. Physiol. 53:211-39, 1991). Hay varios bioensayos que permiten la determinación directa de actividades angiogénicos (Wilting, et al., Anat. Embrol. (Berl) 183:259-71, 1991).
El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es una proteína altamente glicosilada homodimérica de 46-48 kDa (subunidades de 24 kDa) (para una revisión véase Ferrara, N., et al., J. Cell Bio. 47:211, 1991; Ferrara, N., et al., Endocrin. Rev. 13:18-32, 1991). La glicosilación no es necesaria, sin embargo, para la actividad biológica. Las subunidades se unen por enlaces disulfuro. El factor humano existe en varias variantes moleculares de 121, 165, 189, y 206 aminoácidos, que surgen por corte y empalme alternativo del ARNm. Se han descrito varias variantes diferentes de VEGF, incluyendo 10 VEGF-B, VEGF-C, y VEGF-D. La variante de 189 aminoácidos de VEGF (VEGF-189) es idéntica al factor de permeabilidad vascular (VPF). VEGF-121 y VEGF-165 son formas secretadas solubles del factor mientras que VEGF-189 y VEGF-206 están principalmente unidas a proteoglicanos que contienen heparina en la superficie celular o en la membrana basal. El VEGF de rata y bovino es un aminoácido más corto que el factor humano, y las secuencias bovina y humana muestran una homología del 95%. Las posiciones de los ocho restos de cisteína están conservadas en VEGF y PDGF. Un receptor de glucoproteína de alta afinidad para VEGF de 170-235 kDa se expresa en células endoteliales vasculares. El VEGF influye significativamente en la permeabilidad vascular y es una proteína muy angiogénica en varios bioensayos, y se ha demostrado que es un mitógeno altamente especifico para células endoteliales vasculares. In vitro, las dos formas mas cortas de VEGF estimulan la proliferación de células endoteliales macrovasculares, pero no parecen potenciar la proliferación de otros tipos celulares.
El suministro perivascular de bFGF ha demostrado mejorar la circulación colateral y es función del miocardio en isquemia crónica de miocardio (Harada et al., J. Clin. Invest. 94:623-30, 1994). Tanto bFGF como VEGF han demostrado potenciar el flujo sanguíneo colateral durante el suministro perivascular por perfusión del miocardio por microesferas de alginato de heparina y bombas osmóticas implantables (Lopez y Simmons, 1996, supra). Sin embargo, el suministro sistémico de factores de crecimiento mediante dicha infusión intravenosa tiene varias limitaciones. Se han descrito varios efectos adversos con la administración sistémica de factores de crecimiento angiogénicos, incluyendo danos renales y hematopoyéticos que destruyen los órganos tales como nefropatía membranosa y supresión de la medula ósea así como efectos hemodinámicos (Lopez y Simmons, 1996, supra). Además, han surgido cuestiones en cuanto al potencial del suministro sistémico de estos agentes para estimular neoplasias latentes. El coste del suministro sistémico de proteínas de factor de crecimiento recombinantes también se considera prohibitivo.
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Descripción resumida de la invención
La presente invención proporciona nuevas composiciones y métodos para inducir la angiogénesis terapéutica localmente, dirigida a desarrollar nuevos vasos sanguíneos colaterales en el miocardio en riesgo para conseguir la restauración localizada del flujo sanguíneo. La presente invención también proporciona nuevas composiciones y métodos útiles en una gran cantidad de enfermedades clínicas incluyendo apoplejía, inflamación tisular, afecciones ulcerativas, artritis, asma, crecimiento tumoral, retinopatía diabética, y otras afecciones.
En una realización, se proporciona un polipéptido de fusión que incluye un dominio de unión a colágeno y un agente modulador de la angiogénesis, que es capaz de unirse al colágeno. El agente modulador de la angiogénesis se selecciona entre el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento endotelial 20 vascular (VEGF). También se proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de fusión.
La alteración local de la circulación en un sujeto puede conseguirse administrando una cantidad moduladora de la circulación de dicho polipéptido de fusión. Además, la alteración local de la circulación en un sujeto puede conseguirse administrando al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una secuencia de ácido nucleico de la invención.
En una realización adicional, se proporciona un injerto tisular, que incluye tejido aislado que contiene células endoteliales en contacto con un polipéptido de fusión del primer aspecto de la invención. también se proporciona un método para preparar dicho injerto tisular poniendo en contacto el tejido aislado con una cantidad eficaz de un polipéptido de fusión de la invención. Se proporciona adicionalmente un método para activar un injerto poniendo en contacto un tejido aislado con una cantidad eficaz de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de la invención, de modo que la secuencia de ácido nucleico se exprese en dicho tejido.
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En otra realización mas, se proporciona una composición farmacéutica que incluye un polipéptido de fusión de la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. también se proporciona una composición farmacéutica que incluye un ácido nucleico de la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se exponen aspectos adicionales de la invención en las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un diagrama esquemático de proteínas VEGF dirigidas a colágeno.
La Fig. 2 es un grafico que documenta la recuperación de proteínas VEGF dirigidas a colágeno.
La Fig. 3 es un grafico de barras que ilustra la recuperación de proteínas VEGF dirigidas a colágeno en diferentes preparaciones.
La Fig. 4 ilustra la proliferación celular inducida por proteínas VEGF dirigidas a colágeno. El panel A muestra un grafico de barras que ilustra la incorporación de 3H-timidina inducida por diferentes concentraciones de una proteína VEGF dirigida a colágeno. El panel B muestra un grafico que compara la incorporación de 3H-timidina de células en contacto con diferentes concentraciones de V110, VI I0-CBD, o V165-CBD.
La Fig. 5 es un grafico que comprara la incorporación de 3H-timidina inducida en células en contacto con diferentes concentraciones de V110-CBD y V110.
La Fig. 6 es un diagrama esquemático que ilustra el aumento de la revascularización transmiocárdica con láser por CBD-factores de crecimiento.
La Fig. 7 es un diagrama esquemático de la captura de células endoteliales en injertos vasculares sintéticos tratados con CBD-factor de crecimiento.
La Fig. 8 es un diagrama esquemático de la captura de células madre endoteliales para el transplante y terapia génica ex vivo.
Descripción de las realizaciones preferidas
Debe observarse que coma se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen referencias plurales salvo que el contexto estipule claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, una referencia a "una célula diana" incluye una pluralidad de dichas células y una referencia a "el vector de expresión" incluye referencias a uno o mas vectores de transformación y equivalentes de los mismos conocidos para los especialistas en la técnica, y etcétera.
Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comprendido habitualmente por los especialistas en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque puede usarse cualquier método, célula y gen similares o equivalentes a los descritos en este documento en la practica o ensayo de la invención, ahora se describen los métodos, dispositivos y materiales preferidos.
La invención proporciona polipéptidos de fusión que comprenden un dominio de unión a colágeno y un agente modulador de la angiogénesis como se especifica en las reivindicaciones. Como se usa en relación con la presente invención, el término "polipéptido" se refiere a un polímero en el que los monómeros son restos aminoacídicos que se unen juntos a través de enlaces amida. Cuando los aminoácidos son alfa-aminoácidos, puede usarse el isómero óptico L o el isómero óptico D, siendo preferidos los isómeros L. Se entiende que los términos "polipéptido" o "proteína" como se usan en este documento abarcan cualquier secuencia de aminoácidos e incluyen secuencias modificadas tales como glucoproteínas. Se pretende específicamente que el término "polipéptido" cubra proteínas de origen natural, así como aquellas que se sintetizan de forma recombinante o sintética. "Fragmentos" son una parte de un polipéptido. El término "fragmento" se refiere a una parte de un polipéptido que muestra al menos un epítopo útil. La expresión "fragmentos funcionales de un polipéptido", se refiere a todos los fragmentos de un polipéptido que retienen una actividad del polipéptido. Por ejemplo, un fragmento funcional de un agente modulador de la angiogénesis incluye un fragmento que retiene la actividad angiogénica. Los fragmentos biológicamente funcionales, por ejemplo, pueden variar en tamaño desde un fragmento polipeptídico tan pequeño como un epítopo capaz de unirse a una molécula de anticuerpo hasta un polipéptido grande capaz de participar en la inducción característica o programación de los cambios fenotípicos dentro de una célula. Un "epítopo" es una región de un polipéptido capaz de unirse a una inmunoglobulina generada en respuesta al contacto can un antígeno.
Los fragmentos pueden tener la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la proteína de origen natural. "Sustancialmente igual" significa que una secuencia de aminoácidos es en gran medida, pero no completamente, igual, pero retiene una actividad funcional de la secuencia con la que esta relacionada. Un ejemplo de una actividad funcional es que el fragmento puede unirse a un anticuerpo que también reconoce el polipéptido de longitud completa. En general, dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente iguales" o "sustancialmente homólogas" si son al menos un 85% idénticas, o si hay variaciones conservativas en la secuencia. Puede usarse un programa informático, tal como el programa BLAST (Altschul et al., 1990) para comparar la identidad de secuencia, y puede usarse el ALOM (Klein et al., 1985) para analizar las secuencias de aminoácidos para regiones periféricas y transmembrana potenciales.
La expresión "variación conservativa" como se usa en este documento 15 se refiere al reemplazo de un resto aminoacídica por otro resto biológicamente similar. Los ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitución de un resto hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un resto polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y 20 similares, El término "variación conservativa" también incluye el use de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido precursor no sustituido con la condición de que los anticuerpos creados contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido sin sustituir.
Los polipéptidos de fusión de la invención son capaces de unirse a colágeno. Una "proteína de fusión" es un polipéptido que contiene partes de la secuencia de aminoácidos derivada de dos o más proteínas diferentes, o de dos o más regiones de la misma proteína que normalmente no están contiguas. Un "dominio de unión a colágeno" es cualquier polipéptido, o parte del mismo, que pueda unirse a colágeno. Se conocen varios dominios de unión a colágeno en la técnica (Cruz, M.A., et al., Interaction of the von Willebrand factor (vWF) with collagen: Localization of the primary collagen-binding site by analysis of recombinant vWF A domain polipeptides, J. Biol. Chem., 270:10822-10827, 1995; Hoylaerts, M.F., et al., von Willebrand factor binds to native collagen VI primarily via its Al domain, Biochem. J., 324:185-191, 1997; Lankhof, H., et al., 35 A3 domain is essential for interaction of von Willebrand factor with collagen type 111, Thrombds Haemostas, 75; 950-958, 1996. En una realización, el dominio de unión a colágeno es el dominio de unión a colágeno del factor de von Willebrand, que esta implicado en el reconocimiento de colágeno vascular expuesto (Takagi, J., et al., Biochemistry 32:8530-4, 1992; Tuan, T.L., et al., Conn. Tiss. Res. 34:1-9, 1996; Gordon, E.M., et al., Hum. Gene Ther. 8: 1385-1394, todos incorporados en este documento por referencia). El factor de von Willebrand se identifico inicialmente como un factor hemostático en estudios de hemofilias hereditarias (Wagner, Ann. Rev. Cell. Biol. 6:217, 1990), y se ha demostrado que realiza una función vital de vigilancia dirigiendo los agregados plaquetarios a lesiones vasculares (Ginsburg y Bowie, Blood 79:2507-2519, 1992). Se ha identificado que el decapéptido WREPSFMALS (SEC ID Nº 1) es la clave en la unión del factor de von Willebrand al colágeno (Takagi, J., et al., supra, 1992; Tuan, T.L; et al., supra, 1996). Se conocen ensayos para identificar dominios de unión a colágeno de use en la presente invención en la técnica (Takagi, J., et al., supra, 1992; Tuan, T.L. et al., supra, 1996).
Un ejemplo de un método para identificar dominios de unión a colágeno es ELISA (Hall et al., Hum. Gene. Ther., 8:2183-2192, 1997). Para evaluar la propiedad de unión al colágeno de la proteína de envuelta quimérica, se preparó por PCR una construcción de envuelta recombinante (SU-ECB-CEE+) y se expresó en E. coli. Se aplicó aproximadamente 1 \mug de la proteína a placas de microtitulación recubiertas con colágeno y se dejo que se uniera durante 20 minutos, seguido de lavado en las condiciones especificadas y la detección de la proteína unida por ELISA modificado. En cinco determinaciones, la proteína quimérica inmunorreactiva, SU-ECB-CEE+, permaneció unida al colágeno después del lavado con PBS, NaCl 1 M, urea 1 y 2 M, requiriéndose urea >_ 3 M para liberar la proteína de las matrices de colágeno (carriles 5-8). Las placas de microtitulación recubiertas con colágeno y secciones de criostato de segmentos aórticos o IVC lesionados o no lesionados, tratados o no tratados se incubaron durante 4 horas a TA a una dilución de anticuerpo primario de 1:1000. después se aplico un anticuerpo de cabra biotinilado contra IgG de rata seguido de un conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. Se usó diaminobenzidina (DAB) como cromógeno seguido de potenciación con cloruro de níquel para las placas de microtitulación. Los portaobjetos histológicos se tiñeron con contraste con hematoxilina.
Un "agente modulador de la angiogénesis" induce la angiogénesis o la proliferación de células endoteliales. Por ejemplo, un agente modulador de la angiogénesis incluye una citoquina, un factor de crecimiento, una enzima, un inhibidor enzimático, o un anticuerpo. Una "citoquina" es un polipéptido que actúa como regulador humoral a concentraciones nano a picomolares y que, en condiciones normales o patológicas, puede modular las actividades funcionales de células individuales y tejidos. Una citoquina puede mediar las interacciones entre células directamente y/o puede regular los procesos que tienen lugar en el entorno extracelular. Las citoquinas comprenden interleuquinas, linfoquinas, monoquinas, interferones, factores estimuladores de colonias, y quimioquinas, además de una diversidad de otras proteínas.
El agente modulador de la angiogénesis, en el polipéptido de fusión de la invención se selecciona entre el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
Cada una de estas moléculas ha demostrado inducir la angiogénesis in vivo.
La invención proporciona secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido de fusión del primer aspecto de la invención, o un fragmento funcional del mismo. "Polinucleótido" o "secuencia de ácido nucleico" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud. Por "secuencia de ácido nucleico aislada" se entiende un polinucleótido que no está inmediatamente contiguo a las dos secuencias codificantes con las que está inmediatamente contiguo (una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma de origen natural del organismo del que se obtiene. El término, por lo tanto, incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector; en un plásmido o virus de replicación autónoma; o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc) independiente de otras secuencias. Los nucleótidos de la invención pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, o formas modificadas de cualquier nucleótido. El término incluye formas mono y bicatenarias de ADN.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican un dominio de unión a colágeno unido a un agente modulador de la angiogénesis, o fragmento funcional del mismo, pueden unirse de forma funcional a secuencias de control de la expresión. "Unido de forma funcional" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que los permite funcionar de su modo pretendido. Una secuencia de control de la expresión unida de forma funcional a una secuencia codificante se liga de tal modo que se consigue la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con las secuencias de control de la expresión. Como se usa en este documento, la expresión "secuencias de control de la expresión" se refiere a secuencias de ácido nucleico que regulan la expresión de una secuencia de ácido nucleico a la que están unidas de forma funcional. Las secuencias de control de la expresión están unidas de forma funcional a una secuencia de ácido nucleico cuando las secuencias de control de la expresión controlan y regulan la transcripción y, según sea apropiado, la traducción de la secuencia de ácido nucleico. Por tanto, las secuencias de control de la expresión pueden incluir promotores, potenciadores, terminadores de la transcripción apropiados, un codón de inicio (es decir, ATG) delante del gen que codifica la proteína, señales de corte y empalme para los intrones; el mantenimiento de la fase de lectura correcta de ese gen para permitir la traducción apropiada del ARNm, y codones de parada. Se pretende que la expresión "secuencias de control" incluya, como mínimo, componentes cuya presencia puede influir en la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias Eider y secuencias compañeras de fusión. Las secuencias de control de la expresión pueden incluir un promotor.
Por "promotor" se entiende la secuencia mínima suficiente para dirigir la trascripción. También se incluyen en la invención aquellos elementos promotores que son suficientes para volver controlable la expresión génica dependiente de promotor para tipos celulares específicos, tejidos específicos, o para volverla inducible por señales o agentes externos; dichos elementos pueden localizarse en las regiones 5' o 3' del gen. Se incluyen promotores tanto constitutivos como inducibles en la invención (véase, por ejemplo, Bitter et al. Methods in Enzymology 153:516-544, 1987). Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como pL de bacteriófago y, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) y similares. Cuando se clona en sistemas celulares de mamífero, pueden usarse promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, el promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, la repetición larga terminal de retrovirus; el promotor tardío de adenovirus; el promotor de 7,5 K del virus vaccinia). También pueden usarse promotores producidos por ADN recombinante o técnicas sintéticas para proporcionar la trascripción de las secuencias de ácido nucleico de la invención.
En la presente invención, las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido de fusión de la invención pueden insertarse en un vector de expresión recombinante. El término "vector de expresión recombinante" se refiere a un plásmido, virus u otro vehículo conocido en la técnica que se ha manipulado por inserción o incorporación de las secuencias de ácido nucleico que codifican los péptidos de fusión de la invención. El vector de expresión típicamente contiene un origen de replicación, un promotor, así como genes específicos que permiten la selección fenotípica de las células transformadas. Los vectores adecuados para su use en la presente invención incluyen, aunque sin limitación, el vector de expresión basado en T7 para la expresión en bacterias (Rosenberg, et al., Gene 56:125, 1987), el vector de expresión pMSXND para la expresión en células de mamífero (Lee y Nathans, J. Biol. Chem, 263:3521, 1988), vectores derivados de baculovirus para la expresión en células de insecto, el virus del mosaico de la coliflor, CaMV; el virus del mosaico del tabaco, TMV.
Dependiendo del vector utilizado, puede usarse cualquiera de varios elementos de trascripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos potenciadores de la trascripción, terminadores de la trascripción, etc. en el vector de expresión (véase, por ejemplo, Bitter, et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987). Estos elementos son bien conocidos para los especialistas en la técnica.
En levaduras, pueden usarse varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles. (Para una revisión véase, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel, at at, Greene Publish. Assoc, & Wiley Interscience, Cap. 13, 1988; Grant, et al., "Expression and Secretion Vectors for Yeast", en Methods in Enzymology, Eds. WU & Grossman, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pag. 516-544, 1987; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.G., Cap. 3, 1986; y "Bitter, Heterologous Gene Expression in Yeast", Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pag. 673-684, 1987; y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vol. I y II, 1982.) Puede usarse un promotor constitutivo de levaduras tal como ADH o LEU2 o un promotor inducible tal como GAL ("Cloning in Yeast", Cap. 3, R. Rothstein En: DNA Cloning Vol. 11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986). Como alternativa, pueden usarse vectores que promueven la integración de secuencias de ADN foráneas en el cromosoma de levaduras.
Por "transformación" se entiende un cambio genético permanente inducido en una célula después de la incorporación de nuevo ADN (es decir, ADN exógeno a la célula). Cuando la célula es una célula de mamífero, el cambio genético permanente generalmente se consigue por la introducción del ADN en el genoma de la célula. Por "célula transformada" se entiende una célula en la que (o en un progenitor de la misma) se ha introducido, mediante técnicas de ADN recombinante, una molécula de ADN que codifica una proteína de fusión que consta de un dominio de unión a colágeno unida a un agente modulador de la angiogénesis, o fragmento del mismo. La transformación de una célula hospedadora con ADN recombinante puede realizarse por técnicas convencionales como saben bien los especialistas en la técnica. Cuando el hospedador es procariota, tal como E. coli, pueden prepararse células competente que sean capaces de captar ADN a partir de células recogidas después de la fase de crecimiento exponencial y tratarse posteriormente por el método de CaCl_{2} por procedimientos bien conocidos en la técnica. Como alternativa, puede usarse MgCl_{2} o RbCl. La transformación también puede realizarse después de formar un protoplasto de la célula hospedadora o por electroporación.
Un polipéptido de fusión de la invención puede producirse por la expresión de ácido nucleico que codifica la proteína en procariotas. Estas incluyen, aunque sin limitación, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o ADN cósmido que codifican una proteína de fusión de la invención. Las construcciones pueden expresarse en E. coli a gran escala para ensayos in vitro. La purificación a partir de bacterias se simplifica cuando las secuencias incluyen marcas para la purificación de una etapa por cromatografía con níquel-quelado. La construcción también puede contener una marca para simplificar el aislamiento del polipéptido de fusión. Por ejemplo, puede incorporarse una marca de polihistidina de, por ejemplo, seis restos de histidina, en el extremo amino terminal de la proteína fluorescente. La marca de polihistidina permite el aislamiento adecuado de la proteína en una única etapa por cromatografía con níquel-quelado. El polipéptido de fusión de la invención también puede diseñarse para que contenga un sitio de escisión para ayudar a la recuperación de la proteína. Como alternativa, los polipéptidos de fusión de la invención pueden expresarse directamente en una célula hospedadora deseada para ensayos in situ.
Cuando el hospedador es un eucariota, pueden usarse métodos de transfección de ADN tales como co-precipitación con fosfato cálcico, procedimientos mecánicos convencionales tales como microinyección, electroporación, inserción de un plásmido encerrado en liposomas, o vectores virales. Las células eucariotas también pueden cotransfectarse con secuencias de ADN que codifican el polipéptido de fusión de la invención, y una segunda molécula de ADN foránea que codifica un fenotipo de selección, tal como el gen de la timidina quinasa de herpes simplex. Otro método es usar un vector viral de eucariotas, tal como el virus de simio 40 (SV40) o el virus del papiloma bovino, para infectar o transformar de forma transitoria células eucariotas y expresar la proteína. (Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). Preferiblemente, se utiliza un hospedador eucariota como célula hospedadora como se describe en este documento.
Los sistemas eucariotas, y preferiblemente los sistemas de expresión en mamíferos, permiten que sucedan las modificaciones post-traducción más apropiadas de proteínas de mamífero expresadas. Deben usarse células eucariotas que tienen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, glicosilación, fosforilación y, ventajosamente secreción del producto génico como células hospedadoras para la expresión del indicador fluorescente. Dichas líneas celulares hospedadoras pueden incluir, aunque sin limitación, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, Jurkat, HEK-293, y WI38.
Para la producción a largo plazo, de alto rendimiento de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células hospedadoras pueden transformarse con el ADNc que codifica una proteína de fusión de la invención controlada por los elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador de selección. El marcador de selección en el plásmido recombinante confiere resistencia para la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Por ejemplo, después de la introducción de ADN foráneo, las células modificadas por ingeniería pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido, y después se cambian a un medio selectivo. Pueden usarse varios sistemas de selección, incluyendo, aunque sin limitación, los genes de la timidina quinasa del virus herpes simplex (Wigler, et al., Cell, 11:223, 1977), de la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybaska y Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:2026, 1962), y la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy, et al., Cell, 22:817, 1980) que pueden emplearse en células tk-, hgprt- o aprf respectivamente. Además, puede usarse resistencia a antimetabolitos como base de selección para los genes dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:3567, 1980; O'Hare, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8:1527, 1981); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072, 1981); neo, que confiere resistencia alaminoglucósido G-418 (Colberre-Garapin, et al., J. Mol. Biol., 150:1, 1981); e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre, et al., Gene, 30:147, 1984). Recientemente, se han descrito genes de selección adicionales, concretamente trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8047,1988); y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de la. ornitinadescarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue L., En: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, ed., 1987).
Las técnicas para el aislamiento, y la purificación de polipéptidos de la invención expresados de forma microbiana o eucariota puede ser por cualquier medio convencional tal como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas tales como las que implican el use de anticuerpos monoclonales o policlonales o antígeno.
La presente invención proporciona composiciones útiles para alterar localmente la circulación en un sujeto. Un sujeto es cualquier mamífero, incluyendo ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos, vacas, ovejas, y seres humanos. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano. Las composiciones de la invención pueden usarse para alterar de forma local la circulación en un sujeto que tiene un trastorno que puede tratarse usando un agente modulador de la angiogénesis. Los términos "tratamiento", "tratando", "tratar" y similares se usan en este documento para indicar de forma general la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una estabilización o cura parcial o completa de una enfermedad y/o un efecto adverso que se puede atribuir a la enfermedad. "Tratamiento" como se usa en este documento cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un sujeto, particularmente un ser humano, e incluye: (a) prevenir que suceda la enfermedad o síntoma en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero que aún no se ha diagnosticado que lo tenga; (b) inhibir el síntoma de la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar el síntoma de la enfermedad, es decir, causar la regresión de la enfermedad o síntoma. Los trastornos que pueden tratarse usando un método de la invención incluyen, aunque sin limitación: enfermedad cardiovascular, tal como infarto de miocardio y arteriopatía periférica, reestenosis vascular después de angioplastia con balón, trastornos ulcerativos e inflamatorios, defectos genéticos y neoplasia (véase a continuación). Además, las composiciones de la invención pueden usarse para aumentar la revascularización transmiocárdica con láser, para promover el aislamiento y expansión de células madre endoteliales, o para promover la endotelización de injertos vasculares.
Se prevé que las composiciones de la invención pueden usarse para ayudar a la curación de heridas. Por ejemplo, pueden usarse para ayudar a la reparación o regeneración de tejidos en un sitio de ulcera en un ser humano u otro sujeto. En otro aspecto, la invención es útil para los propósitos de promover el crecimiento de tejidos durante el proceso de modificación por ingeniería de tejidos. Por "modificación por ingeniería de tejidos" se entiende la creación, diseño, y fabricación de dispositivos protésicos biológicos, en combinación con materiales sintéticos o naturales, para la creación, aumento, o reemplazo de tejidos y órganos corporales. Por tanto, las composiciones pueden usarse para ampliar el diseño y crecimiento de tejido en el interior del cuerpo para reparar o remplazar un tejido enfermo o dañado. Un ejemplo no limitante especifico es su uso para promover el crecimiento de reemplazos de injerto de piel que se usan como terapia en el tratamiento de quemaduras y úlceras.
El término "neoplasia" se refiere a una enfermedad de proliferación celular inapropiada. Este trastorno es más clínicamente evidente cuando el volumen tisular del tumor compromete la función de órganos vitales. Los conceptos que describen el crecimiento tisular normal son aplicables a tejido maligno porque los tejidos normales y malignos pueden compartir características de crecimiento similares, tanto a nivel de célula individual como a nivel de tejido. Los tumores son una enfermedad tanto de regulación de crecimiento tisular alterada como de regulación celular alterada. Las características de crecimiento de los tumores son tales que la producción de nuevas células excede la muerte celular; un acontecimiento neoplásico tiende a producir un aumento en la proporción de células madre que experimentan auto-renovación y una disminución correspondiente en la proporción de progreso a maduración (McCulloch, E.A., et al., The contribution of blast cell properties to outcome variation in acute myeloblastic leukemia (AML), Blood 59:601-608, 1982).
Por "alterar de forma local la circulación" se entiende un cambio en el patrón de flujo sanguíneo a un sitio particular en un sujeto. El cambio en el patrón de flujo sanguíneo puede causarse por un cambio en la forma o morfología de un vaso sanguíneo, o cambiando el patrón de vasos. Un medio para alterar de forma local la circulación es por la formación de vasos sanguíneos colaterales. Otro medio para alterar de forma local la circulación es promoviendo la división de células endoteliales, o induciendo la angiogénesis. La expresión "células endoteliales" significa aquellas células que componen el endotelio, la monocapa de células escamosas simples que reviste la superficie interior del sistema circulatorio. Estas células retienen una capacidad de división celular, aunque proliferan muy lentamente en condiciones normales, experimentando división celular quizás solamente una vez al año. La proliferación de células endoteliales puede demostrarse usando [3H] timidina para marcar células en la fase S. En vasos normales, la proporción de células endoteliales que llegan a marcarse es especialmente elevada en puntos de ramificación en arterias, donde la turbulencia y el desgaste parecen estimular la renovación. (Goss, R.J., The Physiology of Growth, Academic Press, Nueva York, pag. 120-137, 1978). Las células endoteliales normales son quiescentes, es decir, no están en división, y por tanto son distinguibles de las células endoteliales angiogénicas como se analiza a continuación.
Las células endoteliales también tienen la capacidad de migrar, un proceso importante en la angiogénesis. Las células endoteliales forman nuevos capilares in vivo cuando se necesitan, tal como durante la reparación de heridas o cuando hay una necesidad detectada como en la formación de tumores. La formación de nuevos vasos se llama "angiogénesis", e implica moléculas (factores angiogénicos) que pueden ser mitogénicos o quimioatrayentes para células endoteliales (Klagsburn, supra). Durante la angiogénesis, las células endoteliales pueden migrar desde un capilar existente para comenzar la formación de un nuevo vaso, es decir, las células de un vaso migran de un modo que permite la extensión de ese vaso (Speidel, C.C., Am J. Anat. 52:1-79). Estudios in vitro han documentado tanto la proliferación como la migración de células endoteliales; las células endoteliales colocadas en cultivo pueden proliferar y desarrollar espontáneamente tubos capilares (Folkman, J., y Haudenschild, C., Nature 288:551-56, 1980).
Las expresiones "células endoteliales angiogénicas" y "células endoteliales que experimentan angiogénesis" y similares se usan de forma intercambiable en este documento para indicar células endoteliales (como se ha definido anteriormente) que experimentan angiogénesis (como se ha definido, anteriormente). Por tanto, las células endoteliales angiogénicas son células endoteliales que están proliferando a una velocidad mas allá del estado normal de experimentación de división celular casi una vez al año. La velocidad de diferenciación a partir de la proliferación normal de células endoteliales puede ser 2, 5, a 10 veces o más que la proliferación normal y puede variar enormemente dependiendo de factores tales como la edad y el estado del paciente, el tipo de tumor implicado, el tipo de enfermedad vascular, etc. Como la diferencia en el grado de proliferación entre células endoteliales normales y células endoteliales angiogénicas es medible y se considera biológicamente significativa, entonces son diferenciables dos tipos de células. La expresión "células endoteliales correspondientes", "células endoteliales normales o quiescentes" y similares se usan para hacer referencia a células endoteliales normales, quiescentes contenidas dentro del mismo tipo de tejido (en condiciones normales) cuando algunas de las células endoteliales están experimentado angiogénesis y algunas de las células endoteliales están quiescentes.
Una "cantidad moduladora de la circulación" es la cantidad de cualquier agente que puede modular una alteración local en la circulación. Un "agente" es cualquier molécula, por ejemplo, proteína, ácido nucleico, o farmacéutico, con la capacidad de alterar la circulación local. Un "agente modulador de la angiogénesis" es cualquiera de los agentes reivindicados, que pueden modular la angiogénesis.
Una composición para alterar de forma local la circulación en un sujeto, puede administrarse al sujeto, que comprende un polipéptido de fusión de la invención. La "administración" de la composición farmacéutica de la presente invención puede conseguirse por cualquier medio conocido para los especialistas en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas se preparan preferiblemente y se administran en unidades de dosis. Las unidades de dosis sólidas son comprimidos, cápsulas y supositorios. Para el tratamiento de un paciente, dependiendo de la actividad del compuesto, la manera de administración, la naturaleza y gravedad del trastorno, la edad y peso corporal del paciente, son necesarias dosis diarias diferentes. En ciertas circunstancias, sin embargo, pueden ser apropiadas dosis diarias mayores o menores. La administración de la dosis diaria puede realizarse tanto por administración única en forma de una unidad de dosis individual o también varias unidades de dosis más pequeñas y también por múltiple administración de dosis subdivididas a intervalos específicos.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden administrarse de forma local. La administración "local" es el suministro de una composición de una invención en o cerca del sitio fisiológico donde se desea el tratamiento. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se administran, en general, por vía tópica, intravenosa, oral o parenteral o en forma de implantes, pero incluso en principio es posible el uso rectal. Las formas de preparación farmacéutica sólidas o liquidas son, por ejemplo, gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos recubiertos, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, aerosoles, gotas o solución inyectable en forma de ampolla y también preparaciones con liberación prolongada de compuestos activos, en cuya preparación se usan habitualmente excipientes y aditivos y/o auxiliares tales como disgregantes, aglutinantes, agentes de recubrimiento, agentes de hinchamiento, lubricantes, aromatizantes, edulcorantes o solubilizantes como se ha descrito anteriormente. Las composiciones farmacéuticas son adecuadas para su uso en una diversidad de sistemas de suministro de fármacos. Para una breve revisión de los presentes métodos de suministro de fármacos, véase Langer, Science, 249:1527.1533, 1990.
Por "dosis terapéuticamente eficaz" o "cantidad moduladora de la circulación" se entiende la cantidad de un compuesto de acuerdo con la invención necesaria para alterar de forma local la circulación. Cantidades eficaces para este use dependerán, por supuesto, de la gravedad de la enfermedad y el peso y el estado general del paciente. Típicamente, las dosificaciones usadas in vitro pueden proporcionar directrices útiles en las cantidades útiles para administración in situ de la composición farmacéutica, y pueden usarse modelos animales para determinar las dosificaciones eficaces para el tratamiento de trastornos particulares. Se describen diversas consideraciones, por ejemplo, en Gilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a ed., Pergamon Press, 1990; y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, cada uno de los cuales se incorpora en este documento por referencia.
La alteración local de la circulación en un sujeto, puede conseguirse administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de la invención. Dicha terapia conseguirá su efecto terapéutico por la introducción de un polinucleótido terapéutico que codifica un polipéptido de fusión que comprende un dominio de unión a colágeno unido a un agente modulador de angiogénesis en células in vivo que tienen el trastorno o introduciendo el polinucleótido terapéutico en células ex vivo y después reintroduciendo las células en el sujeto. El suministro del polinucleótido terapéutico puede conseguirse usando un vector de expresión recombinante tal como un virus quimérico o un sistema de dispersión coloidal. Se prefiere especialmente para el suministro terapéutico de secuencias polinucleotídicas que codifican un polipéptido de fusión de la invención, el uso de liposomas dirigidos.
Diversos vectores virales que pueden utilizarse para la introducción de secuencias de ácido nucleico en células coma se muestra en este documento incluyen adenovirus, herpesvirus, vaccinia o, preferiblemente, un virus ARN tal como un retrovirus. Preferiblemente, el vector retroviral es un derivado de un retrovirus murino o aviar. Ejemplos de vectores retrovirales en los que puede insertarse un único gen foráneo incluyen, aunque sin limitación: el virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), el virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), el virus del tumor mamario murino (MuMTV), y el virus del sarcoma de Rous (RSV). Preferiblemente, cuando el sujeto es un ser humano, se utiliza un vector tal como el virus de la leucemia del simio gibón (GaLV). Varios vectores retrovirales adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador de selección de modo que puedan identificarse y generarse las células transducidas. Insertando una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de la invención en el vector viral, junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor en una célula diana especifica, por ejemplo, el vector ahora es especifico de diana. Los vectores retrovirales pueden hacerse específicos de diana uniendo, por ejemplo, un azúcar, un glucolípido, o una proteína. El direccionamiento preferido se consigue usando un anticuerpo para dirigir el vector retroviral. Los especialistas en la técnica conocerán, o pueden averiguar fácilmente sin experimentación excesiva, las secuencias polinucleotídicas específicas que pueden insertarse en el genoma retroviral o unirse a una envuelta viral para permitir el suministro especifico de diana de las secuencias polinucleotídicas que codifican un polipéptido de fusión de la invención.
Como los retrovirus recombinantes son imperfectos, requieren ayuda para producir partículas de vector infecciosas. Esta ayuda puede proporcionarse, por ejemplo, usando líneas celulares auxiliares que contienen plásmidos que codifican todos los genes estructurales del retrovirus bajo el control de secuencias reguladoras dentro del LTR. Estos plásmidos tienen ausente una secuencia nucleotídica que posibilita el mecanismo de empaquetado para reconocer un transcrito de ARN para la encapsidación. Las líneas celulares auxiliares que tienen deleciones de la señal de empaquetamiento incluyen, aunque sin limitación, Q2, PA317, y PA12, por ejemplo. Estas líneas celulares producen viriones vacíos, ya que no se empaqueta el genoma. Si se introduce un vector retroviral en dichas células en las que la señal de empaquetamiento está intacta, pero los genes estructurales están remplazados por otros genes de interés, el vector puede empaquetarse y producirse un virión de vector.
Como alternativa, pueden transfectarse células NIH 3T3 u otras células de cultivo tisular directamente con plásmidos que codifican los genes estructurales retrovirales gag, pol y env, por transfección con fosfato cálcico convencional. Estas células después se transfectan con el vector plásmido que contiene los genes de interés. Las células resultantes liberan el vector retroviral en el medio de cultivo.
Otro sistema de suministro dirigido para los polinucleótidos terapéuticos es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, perlas, y sistemas basados en lípidos incluyendo emulsiones de aceite-en-agua, micelas, micelas mixtas, y liposomas. El sistema coloidal preferido de esta invención es un liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificial que son útiles como vehículos de suministro in vitro e in vivo. Se ha demostrado que las vesículas unilamelares grandes (LUV), que varían en tamaño de 0,2-4,0 \mum pueden encapsular un porcentaje sustancial de un tampón acuoso que contiene macromoléculas grandes. Puede encapsularse ARN, ADN y viriones intactos dentro del interior acuoso y suministrarse a las células en una forma biológicamente activa (Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Además de células de mamífero, los liposomas se han usado para suministrar polinucleótidos en células vegetales, levaduras y bacterianas. Para que un liposoma sea un vehículo de transferencia génica eficaz, deben estar presentes las siguientes características: (1) encapsulación de los genes de interés a elevada eficacia sin comprometer al mismo tiempo su actividad biológica; (2) unión preferente y sustancial a una célula diana en comparación con células no diana; (3) suministro de los contenidos acuosos de la vesícula al citoplasma de la célula diana a elevada eficacia; y (4) expresión precisa y eficaz de la información genética (Mannino et al., Biotechniques, 6:682, 1988).
La composición del liposoma es habitualmente una combinación de fosfolípidos, particularmente fosfolípidos de elevada temperatura de transición de fase, habitualmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También pueden usarse otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica, y la presencia de cationes divalentes.
Los ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos, y gangliósidos. Son particularmente útiles diacilfosfatidil-gliceroles, donde el resto lipídico contiene de 14-18 átomos de carbono, particularmente de 16-18 átomos de carbono, y está saturado. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina del huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina.
El direccionamiento de los liposomas puede clasificarse en base a factores anatómicos y mecanísticos. La clasificación anatómica se basa en el nivel de selectividad, por ejemplo, especifica de órgano, especifica de célula, y especifica de orgánulo. El direccionamiento mecanístico puede distinguirse en base a si es pasivo o activo. El direccionamiento pasivo utiliza la tendencia natural de los liposomas a distribuirse en células del sistema reticuloendotelial (RES) en órganos que contienen capilares sinusoidales. El direccionamiento activo, por otro lado, implica la alteración del liposoma por acoplamiento del liposoma a un ligando especifico tal como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glucolípido, o proteína, o por un cambio en la composición o tamaño del liposoma para conseguir el direccionamiento a los órganos y tipos celulares diferentes a los sitios de localización de origen natural.
La superficie del sistema de suministro dirigido puede modificarse de una diversidad de modos. En el caso de un sistema de suministro dirigido por liposomas, pueden incorporarse grupos lipídicos en la bicapa lipídica del liposoma para mantener el ligando de direccionamiento en asociación estable con la bicapa liposomal. Pueden usarse diversos grupos de enlace para unir las cadenas lipídicas al ligando de direccionamiento.
En otra realización, el método proporciona un injerto tisular aislado. El injerto contiene tejido aislado que incluye células endoteliales y un polipéptido de fusión de la invención.
Por "tejido aislado" se entiende tejido que se retira de su localización natural en un sujeto. En una realización preferida, el tejido aislado tiene un componente celular endotelial. El tejido puede ser un órgano, una parte de un órgano, o células aisladas. Por ejemplo, el tejido puede ser piel, una capa de varias células aislada de la piel, un vaso, o tejido vascular aislado de un vaso. En un aspecto, el injerto es un vaso, por ejemplo, un vaso usado para injertos de derivacion. Estos pueden incluyen aortocoronario, aortoiliaco, aortorrenal, femoropopliteal. En otro aspecto, el tejido puede ser un corazón. El tejido aislado puede ponerse en contacto con una cantidad eficaz de un polipéptido de fusión de la invención in vitro, antes de su implante en el mismo sujeto o en uno diferente. "Poner en contacto" incluye condiciones que permiten la interacción entre el tejido y un polipéptido de fusión de la invención, e incluye en fase de solución o sólida.
La invención proporciona adicionalmente un método para preparar un injerto tisular poniendo en contacto tejido aislado con una cantidad eficaz de un polipéptido de fusión de la invención.
El tejido aislado puede ser tejido antólogo o heterólogo. Un injerto " activado" es tejido aislado que se ha estimulado de tal modo que se induce la angiogénesis in vitro, o en el que puede suceder angiogénesis una vez se ha colocado el injerto en un receptor. Un "aloinjerto" es un injerto a transplantar en un miembro genéticamente diferente de la misma especie. Un "xenoinjerto" es un injerto de un miembro de una especie a transplantar en un miembro de una especie diferente. El término "donante" se refiere a un sujeto o cultivo del que se toma un tejido; el término "receptor" se refiere a un sujeto o cultivo en el que tiene que colocarse el tejido. El receptor puede tratarse con un agente inmunosupresor antes o después del transplante.
El tejido aislado puede ponerse en contacto con una cantidad eficaz de un polipéptido de fusión de la invención in vitro, antes del implante en el mismo sujeto o uno diferente. Como alternativa, el tejido aislado puede implantarse en una localización similar en un segundo sujeto, o implantarse en una localización diferente en el mismo sujeto, y ponerse en contacto después del implante con el polipéptido de fusión in vivo.
Como alternativa, el tejido aislado puede ponerse en contacto con una cantidad eficaz de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de la invención.
El tejido aislado puede ponerse en contacto con una cantidad eficaz de dicha secuencia de ácido nucleico in vitro, antes del implante en el mismo sujeto o uno diferente. Como alternativa, el tejido aislado puede implantarse en una localización similar en un segundo sujeto, o implantarse en una diferente localización en el mismo sujeto, y ponerse en contacto después del implante con la secuencia de ácido nucleico in vivo. El contacto puede suceder in vivo o in vitro, e incluye condiciones que permiten la captación y expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de la invención.
Aunque no es necesario, puede ser deseable administrar un agente inmunosupresor a un receptor del injerto antes del transplante y/o después del transplante. Se usa preferiblemente un agente tal como Ciclosporina A (CsA), sin embargo, también pueden utilizarse otros agentes que causan supresión inmune, tales como rapamicina, desoxiespergualina, y FK506 o equivalentes funcionales de estos compuestos. CsA se administra preferiblemente por inyección a una dosis inmunosupresora. La duración del tratamiento con CsA 0 puede variar de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 días.
Si se utiliza, el agente inmunosupresor se administra por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, subcutánea, intrapulmonar, e intranasal, y si se desea para tratamiento inmunosupresor local, administración intralesional (incluyendo perfundiendo o poniendo en contacto de otro modo el injerto con el agente inmunosupresor antes del transplante). Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intra-arterial, o intraperitoneal. Además, el agente inmunosupresor se administra adecuadamente por infusión por pulsos, particularmente con dosis cada vez más débiles del agente inmunosupresor. Preferiblemente, la dosificación se da por inyecciones, más preferiblemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.
La descripción anterior describe en líneas generales la presente invención. Puede obtenerse una compresión mas completa por referencia a los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento para propósitos de ilustración solamente y no se pretende que limiten el alcance de la invención.
Ejemplo I Ingeniería molecular de proteínas de fusión VEGF-CBD dirigidas con colágeno Construcción de las Proteínas de Fusión VEGA-CBD
El VEGF es realmente una familia de 4 isoformas (VEGF-206, 189, 165 y 121) producidas por corte y empalme alternativo de un único gen (Ferrara et al., Endocrine Rev. 18:4, 1997, Neufeld et al., Prog. Growth Factor Res. 5:89-97, 1994; Tischer et al., J. Biol. Chem. 266:11947, 1991). VEGF165, la isoforma expresada de forma más abundante, es un glucoproteína de unión a heparina que muestra un único sitio de glicosilacion, y se secreta en forma de un homodímero de aproximadamente 45 kDa. VEGF165 puede escindirse enzimáticamente por plasmina, que elimina la región de unión a heparina carboxilo-terminal (111-165) para producir el dímero VEGF110 que es equipotente a VEGF120 con respecto a la actividad mitogénica sobre células endoteliales (Houck et al., J. Biol. Chem. 267:26301-26307, 1992). Las proteínas de fusión VEGF165-CBD y VEGF110-CBD, así como la isoforma VEGFIIO se clonaron en construcciones adecuadas para la expresión a elevado nivel en E. coli. Se utilizó una secuencia de unión a colágeno estratégicamente modificada derivada de un dominio funcional dentro del factor de von Willebrand bovino (vWF; CBD) implicado en el reconocimiento de colágeno vascular expuesto (Takagi et al., supra, 1992; Tuan et al., supra; 1996). Se remplazó un resto de cisteína dentro de la secuencia original de vWF de forma conservativa por una metionina, para que este dominio auxiliar no impidiera la formación del enlace disulfuro complejo necesario para el plegamiento y/o renaturalización del factor de crecimiento recombinante. Se diseñaron enlazadores flanqueantes para que incluyeran restos de glicina para aumentar la flexibilidad rotacional y para minimizar los impedimentos estéricos, aunque se incluyo un resto de histidina para promover una conformación externa del dominio de unión a colágeno. Por tanto, las construcciones de fusión VEGA-CBD, que incorporan el decapéptido de unión a colágeno WREPSFMALS (SEC ID Nº 1) en la proteína VEGF, se diseñaron para dirigir VEGF a colágeno expuesto por una lesión, inflamación, enfermedad, o procedimientos quirúrgicos de reparación.
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El desarrollo de estos factores de crecimiento de células endoteliales modificados por ingeniería genética puede describirse como la finalización de las siguientes seis etapas individuales:
1) Diseño de las construcciones moleculares;
2) Clonación molecular de los plásmidos de expresión;
3) Expresión de las proteínas de fusión recombinantes;
4) Purificación de las proteínas de fusión;
5) Renaturalización de los factores de crecimiento recombinantes;
6) Ensayo de actividades biológicas específicas.
Diseño Clonación Molecular de las proteínas de fusión VEGF-CBD: Se diseñó un vector de expresión procariota para producir proteínas de fusión tripartitas (véase la Fig. 1: Congéneres Dirigidos del Factor de Crecimiento Celular del Endotelio Vascular) que consta de una marca de purificación 6xHis, un dominio de unión a colágeno derivado del factor de von Willebrand auxiliar, y la secuencia de ADNc que codifica el fragmento activo maduro de VEGF110 5 humano (VEGF110-CBD) o VEGF165 (VEGF165-CBD).
Los cebadores de PCR utilizados en estos experimentos son los siguientes:
VEGF-110:
1. Con sentido (VEGF-1IOTS1, 21924)
CATATGGGTGCACCCATGGCAGAAGGAG (SEC ID NO 2)
2. Antisentido (VEGF-1 I OAS1, 21926)
TGATCTATCTTTCTTTGGTGTGCATTC (SEC ID NO 3) VEGF-110+CBD:
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1. Con sentido (VEGF-1 I OTS2, 21927)
CATATGTGGCGCGAACCGAGCTTCATGGCT (SEC ID NO 4)
CTGAGCGGTGCACCCATGGCAGAAGGAG (SEC ID NO 5)
2. Antisentido (VEGF-110AS1, 21926)
TCATCTATCTTTCTTTGGTCTGCATTC (SEC ID NO 6) VEGF-165+CBD:
\vskip1.000000\baselineskip
1. Con sentido (VEGF-110CTS2, 21927)
CATATGTGGCGCGAACCGAGCTTCATGGCT (SEC ID NO 4)
CTGAGCGGTGGACCCATGGCAGAAGGAG (SEC ID NO 5)
2. Antisentido (VEGF-165 CBD AS1)
TCACCGCCTCGGCTTGTCACATCA (SEC ID NO 7)
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Fuente de secuencias de VEGA:
bases de datos EMBL/GenBank/DDBJ
\quad
Numero de acceso X62568
\quad
Gen de VEGF, humano, bases 1 a 649
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Ejemplo 2 Expresión, purificación y renaturalización de las proteínas de fusión de VEGF
Las construcciones moleculares se generaron a partir de células endoteliales humanas por RT-PCR. Los productos de PCR se ligaron inicialmente en vectores de clonación TA, y las secuencias se confirmaron por secuenciación de ADN directa. Después de la confirmación de las secuencias correctas de ADN, se liberaron los insertos respectivos por digestión enzimática y se clonaron en un vector de expresión pET (Novagen), se introdujeron por transformación en células competentes (cepa BL21 DE3 de E. coli) y se inició la expresión de proteínas en presencia de IPTG. Las proteínas de fusión expresadas se aislaron de los cuerpos de inclusión de E. coli, se solubilizaron con HCl guanidinio 6 M, se purificaron hasta homogeneidad en condiciones desnaturalizantes (urea 8 M) usando cromatografía con níquel quelado, urea 8 M, y se renaturalizaron por replegamiento oxidativo en condiciones redox optimizadas. La proteína VEGF110 se produce en elevados niveles (la recuperación es de -8 a 10 mg/100 ml de cultivo bacteriano) y se purifica a casi homogeneidad por cromatografía con metal quelado, como se determina por SDS-PAGE. Inicialmente expresado en forma de una proteína refractante insoluble encontrada principalmente dentro de los cuerpos de inclusión bacterianos, el monómero VEGF110 (-15 kDa) puede solubilizarse por HCl guanidinio 6 M o urea 8 M, respectivamente, y renaturalizarse en condiciones redox cuidadosamente controladas para producir un dímero renaturalizado soluble que migra a aproximadamente 33 kDa en condiciones no reductoras. En condiciones óptimas, aproximadamente el 90% de la proteína recombinante purificada puede renaturalizarse y recuperarse en forma de dímero.
Estudios adicionales examinaron las condiciones fisicoquímicas de la renaturalización proteica, incluyendo el rendimiento (% de recuperación) de la proteína renaturalizada a diversas concentraciones proteicas (véase la Fig. 2) y los efectos estabilizadores (% de recuperación) de los aditivos (tal como sacarosa) observados después de la extracción (diálisis) de los desnaturalizantes (véase la Fig. 3). Estos estudios determinaron que se observa replegamiento proteico óptimo y recuperación a concentraciones proteicas por debajo de 0,1 mg/ml.
Ejemplo 3 Evaluación de la actividad biológica específica
La actividad biológica de las proteínas de fusión de VEGF recombinantes se evaluó por ensayos de proliferación celular in vitro, usando VEGF comercial purificado como control estandarizado. Se obtuvo una línea transformada espontáneamente de células endoteliales de cordón umbilical humano de la ATCC (ECV304; ATCC CRL-1998) y se mantuvo en forma de monocapas para estos ensayos. La actividad de VEGF se determinó por la estimulación de la incorporación de 3H-timidina observada a (t=16-20 horas) después de precultivar las células durante 48 horas en condiciones de baja concentración de suero (1%). En estas condiciones, se observó estimulación significativa de incorporación de 3H-timidina con concentraciones de VEGF comercial tan bajas como 2,5 ng/ml, con estimulación máxima observada a -5 ng/ml. Como se muestra en las Fig. 4 y 5, se descubrió que la actividad biológica especifica de cada construcción (VEGF110, VEGF110-CBD, VEGF165-CBD) era casi equivalente a la del patrón comercial, lo que indica que las proteínas de fusión de VEGF renaturalizadas no solamente se replegaban en dímeros estables, sino que eran biológicamente activas de forma demostrable.
Ejemplo 4 Captura de células endoteliales en injertos sintéticos
Se sabe que factores angiogénicos tales como VEGF y CYR61 promueven la migración, así como la proliferación de células endoteliales. Por tanto, la unión y concentración de dichos factores de crecimiento en injertos vasculares recubiertos con colágeno o recubiertos con gelatina, en virtud de un dominio de unión a colágeno modificado por ingeniería genética en el factor de crecimiento recombinante, serviría para consolidar el injerto y promover la endotelización del injerto in vitro e in vivo.
Además, los factores angiogénicos unidos a colágeno supuestamente servirían para reclutar células precursoras endoteliales que están presentes en la circulación (Asahara, T. et al., Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogénesis, Science 275:964-967, 1997). Además, se ha demostrado previamente que puede usarse TGFR1 unido a colágeno, para que sirva como factor de supervivencia para células precursoras mesenquimales, para "capturar" células madre in vitro por supervivencia selectiva en condiciones pobres en suero para su uso potencial en protocolos de terapia génica ex vivo (Gordon et al., Capture and expansion of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells with a transforming growth factor/31-von Willebrand factor fusión protein for retrovirus-mediated delivery of coagulation factor IX, Human Gene Ther, 8:1835-1394, 1997). Así mismo, las proteínas de fusión de VEGF unidas a colágeno pueden usarse de un modo similar para seleccionar y/o "capturar" células madre endoteliales (que expresan receptores de VEGF) para su uso en protocolos de terapia génica ex vivo o en protocolos de transplante basados en células.
Además, se ha demostrado la unión de VEG-165 + GBD (dominio de unión a colágeno) y VEGF110 + CBD a arterias carótidas de rata lesionadas pero no a arterias no lesionadas de control. En cambio, VEGF 110 sin CBD no se unía ni a arterias lesionadas ni a arterias no lesionadas. Estos experimentos se realizaron in vivo en un modelo de lesión de carótida de rata de reestenosis vascular (Zhu et al., Circulation 96 (2):628-635, 1997).
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La Fig. 6 es un diagrama esquemático que ilustra el aumento de la revascularización transmiocárdica con láser por GBD-factores de crecimiento.
La Fig. 7 es un diagrama esquemático de la captura de células endoteliales en injertos vasculares sintéticos tratados con un CBD-factor de crecimiento.
Aunque la invención se ha descrito con referencia a las realizaciones actualmente preferidas, debe entenderse que pueden hacerse diversas modificaciones.
Por consiguiente, la invención está limitada solamente por las siguientes reivindicaciones.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.
Documentos de patente citados en la descripción
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\bullet US 09127134 B [0083]
Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción
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<170> FastSEQ PARA windows versión 4.0
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> péptido generado sintéticamente
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<400> 1
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<212> ADN
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tcatctatct ttctttggtc tgcattc 
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27 
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catatgtggc gcgaaccgag cttcatggct 
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ctgagcggtg cacccatggc agaaggag 
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tcaccgcctc ggcttgtcac atca 
\hfill
24

Claims (28)

1. Polipéptido de fusión que comprende un dominio de unión a colágeno y un agente modulador de la angiogénesis, en el que el agente modulador de la angiogénesis se selecciona entre el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
2. Polipéptido de fusión de la reivindicación 1, en el que dicho agente modulador de la angiogénesis estimula la proliferación de células endoteliales.
3. Polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho dominio de unión a colágeno es un dominio de unión a colágeno de un factor de von Willebrand.
4. Polipéptido de fusión de la reivindicación 3, en el que dicho dominio de unión a colágeno del factor de von Willebrand comprende el decapéptido WREPSFMALS (SEC ID NO 1).
5. Polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho agente modulador de la angiogénesis es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
6. Secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. Secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 6, unida de forma funcional a un promotor.
8. Vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 6 ó 7.
9. Vector de expresión de la reivindicación 8, siendo dicho vector de expresión un vector retroviral.
10. Célula hospedadora que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 6 ó 7.
11. Método para producir el polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende cultivar las células hospedadoras de la reivindicación 10 en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico y recuperar el polipéptido de fusión.
12. Método de la reivindicación 11, en el que el hospedador es una célula procariota.
13. Método de la reivindicación 11, en el que el hospedador es una célula eucariota.
14. Uso del polipéptido de fusión según las reivindicaciones 1-5, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno en un sujeto, seleccionado entre enfermedad cardiovascular, una lesión ulcerativa, una lesión inflamatoria, un tumor, y artritis.
15. Uso del ácido nucleico de la reivindicación 6 ó 7, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno en un sujeto, seleccionado entre enfermedad cardiovascular, una lesión ulcerativa, una lesión inflamatoria, un tumor, y artritis.
16. Uso de la reivindicación 14 ó 15, en el que el sujeto es un ser humano.
17. Injerto tisular, que comprende tejido aislado que comprende células endoteliales tratadas con un polipéptido de fusión que comprende un dominio de unión a colágeno y un agente modulador de la angiogénesis, en el que el agente modulador de la angiogénesis se selecciona entre el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
18. Injerto tisular de la reivindicación 17, en el que dicho tejido es tejido vascular.
19. Injerto tisular de la reivindicación 17, en el que dicho tejido es un vaso.
20. Injerto tisular de la reivindicación 17, en el que dicho tejido es piel.
21. Injerto tisular de la reivindicación 17, en el que dicho tejido es un órgano.
22. Injerto tisular de la reivindicación 17, en el que dicho órgano es el corazón.
23. Método para preparar el injerto tisular de cualquiera de las reivindicaciones 17-22 que comprende poner en contacto tejido aislado con una cantidad eficaz de un polipéptido de fusión que comprende un dominio de unión a colágeno y un agente modulador de la angiogénesis, en el que el agente modulador de la angiogénesis se selecciona entre el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
24. Método para activar el injerto tisular de cualquiera de las reivindicaciones 17-22 que comprende poner en contacto un tejido aislado con una cantidad. eficaz de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que comprende un dominio de unión a colágeno y un agente modulador de la angiogénesis, en el que el agente modulador de la angiogénesis se selecciona entre el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), de modo que dicha secuencia de ácido nucleico se exprese en dicho tejido activando de este modo el injerto.
25. Método de la reivindicación 24, en el que dicha secuencia de ácido nucleico está en un vector de expresión.
26. Composición farmacéutica que comprende el polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
27. Composición farmacéutica que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 6 ó 7 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
28. Injerto tisular de cualquiera de las reivindicaciones 17-22 o el método de cualquiera de las reivindicaciones 23-25, en el que el polipéptido de fusión es el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 2-5.
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