TWI243827B - Fusion protein having enhanced in vivo erythropoietin activity - Google Patents

Description

1243827 _案號91117964 94年厶月2丨日 修正_ 五、發明說明（1) 本發明是有關於一種融合蛋白質，其在活體内具有增 強的抗致命貧血藥物（即紅血球生成素）活性，且特別是有 關於一種融合蛋白質，其具有增強的紅血球生成素活性， 經由其本身之胺基酸序列增加在活體内之半衰期，亦即並 未增加其醣化量，而該融合蛋白質乃包含有一紅血球生成 素分子融合至一特定於活體内自然發生的胜肽。 紅血球生成素（EPO)是一醣化蛋白質，具有分子量約在 30000至34000 Da左右，其是一種造血因子，促進紅血球之 產生與分化。該醣化蛋白質會結合至紅血球先驅細胞之接 受器上，以起動其造血能力，並導致細胞内妈離子量增 加，加強D N A生化合成與刺激血紅素生成。此外，重組紅 血球生成素（rhEPO )也已被核准於治療腎衰竭引致之貧 血、早產、曱狀腺機能低下、營養失調等；而且其醫藥應 用並持續增加中。但是目前，因為重組紅血球生成素半衰 期短暫而需每週施用三次，其不便性以及高價位而致使其 廣泛應用受到限制。所以，若能延長紅血球生成素在活體 内之活性效期，則可減低施用重組紅血球生成素之頻率。 而紅血球生成素在活體内之活性是與其在活體内半衰 期成比例，而其在活體内半衰期已知是與EP0上醣類尾端 之唾液酸（S i a 1 i c a c i d )含量有關。因此，鍊之存在與 否對紅血球生成素在活體内之活性是有極大之影響的。而 細胞之種類會影響醣鍊之種類，所以，當相同之醣化蛋白 質表現於不同之細胞中時，則蛋白質上醣鍊之種類會依細 胞之種類之不同而改變。目前已知細菌細胞，如大腸桿 菌，是無法在產生之蛋白質上附著醣鍊。因為已知經由大

1243827 ____案號 五、發明說明（2) 91117964 曰

腸桿菌表現之蛋白質並無醣鍊，所以大腸桿菌表現么 球生成素也不含有醣鍊。因此獲得之紅血球生成素^ =亡 具有試管内之生化活性，而無活體内之活性。曰、=了實 -醣鍊之紅血球生成素相較之下，不具有醣鍊之紅血球/、 成素會較迅速地被身體排除，導致極短的半衰期。所=生 紅血球生成素上醣鍊之存在與否對紅血球生成素之活 很重要的。 、/ f疋 目前，許多研究正在積極進行以增加EP〇之生化活性。' 大部分研究是以突變發生技術導致EP〇基因突變，而將某 、 些氨基酸置換。例如：AMGEM公司之世界專利申請 || PCT/US 9 4/ 0 9 2 57，標題『紅血球生成素類似物』，揭露一 種經由突變增加EPO醣化量而增加在活體内半衰期之方 法。而也有人嘗試經由形成EPO雙聚體來增加在活體内之 半衣期（參見A.J. Sytkowski et al·， J.B.C. vol. 274

No· 35，ρρ· 24 77 6_778 )。其他增加EP〇在活體内之活性 之方法包括以基因工程融合一新穎氨基酸、胜肽、蛋白質 片段至EP0分子上，以及增加EP0上之醣化量，特別是唾液 酸之含量等。但是，能使用於該方法之氨基酸、胜肽、蛋 白質片段的種類相當有限。大部分情況下，該些基因該便 會導致蛋白質特定活性降低或喪失，或導致在活體内使用〇 時有抗原問題。 目前有研究是針對融合或嵌合蛋白質（但非EP0)，而其 中一例即是針對卵泡刺激素（FSH )，亦即性激素，參見

Furuhashi 等，1995， Mol· Endocrinol。但是該些蛋白質 並未實際應用，因為使用基因工程作基因修正之蛋白質有

第8頁 1243827 案號 91117964 、發明說明（3) 一些問題。不但獲得修正的目標蛋白質本身，即需要高度 之技術，而且，大部分情況下，可能因為新穎氨基酸之添 加或取代，而導致蛋白質活性非預期性地降低或喪失。

一因此，本發明經多次實驗而發展出一種新的方法，經 由融合新穎氨基酸、胜肽或蛋白質片段至”〇分子上，而 增加EPO在活體内活性。實驗過程中，發現經由融合人絨 毛膜促性腺激素（HCG)的b次單位之羧基端胜肽（Carb〇xy Terminal Peptide， CTP)碎片至EPQ而獲得一種融合蛋白 質，可明顯地增加EPO在活體内之半衰期；人絨毛膜促性 腺激素是活體内一自然產生蛋白質。而且，該Ep〇包含可 增加醣化位置但仍保有E P0之原有特性之氨基酸（參見韓國 專利巾請號 1 0 - 2 0 0 0 - 0 0 7 5 2 3 0 )。 本發明非預期地發現，胜肽中醣化位置已移除之C τ p變 異株仍明顯地增加EPO在活體内之半衰期；因此，發展出 利用氨基酸序列而增加E P 0活體内穩定性之c τ p變異株，但 不增加Ε Ρ 0之醣鍊含量，而完成本發明。 本發明利用醣化位置已移除之CTP變異株，是與習知利 用增加Ε Ρ 0之醣鍊含量而增加活體内半衰期大不相同；本 發明是利用所發現能增加Ε Ρ 0活體内穩定性之c τ ρ變異株。

因此，本發明一方面是提供一融合蛋白質，其在活體 内具有增強的人類紅血球生成素活性，而該融合蛋白質包 括一 Ε Ρ 0分子融合至一人絨毛膜促性腺激素（η c G ) b次單位 之變異株的羧基端。 本發明之另一方面是提供一種能編碼該融合蛋白質之 核酸（序列），一種包含該核酸序列之重組載體，以及一種

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五、發明說明（4) 被該重組载體轉感染之細胞株。 本發明之又一方面是提供一種製備一具有增強的人類 紅血球生成素活性融合蛋白質的方法，經由培養轉感染的 該細胞株。 ' 依照本發明一較佳實施例，提供一在活體内具有增強 的人類紅血球生成素活性之融合蛋白質，而該融合蛋白質 包括一EPO分子融合至一種絨毛膜促性腺激素b次單位之變 異株（標示為A T P )的魏基端。較適情況下，c T P包括對庳織 毛膜促性腺激素b次單位位置1 1 2 - 1 4 5之全部或部分氨基 酸，如SEQ I D No· 1所示，較佳是對應至絨毛膜促性腺激 素b次單位位置118-145。故此處之SEQ ID NO. 1係對應至 人類絨毛膜促性腺激素（H C G )的次單位之魏基端胜肽 (Carboxy Terminal Peptide, CTP)的位置112-145 。 ATP(其為一種CTP變異株）有增加EPO分子半衰期之功 能’以其原有之氣基酸序列5亦即並不增加E P 0之酿鍊含 量 ° 因此，上述範圍中氨基酸變異之種類、位置並未特別 限定，只要目標融合蛋白質增加活體内EP0活性之作用並 未受負面影響即可。也就是說，只要融合蛋白質維持增加 活體内EP0活性之作用，在上述範圍位置之氨基酸可在任 意為製備任意氨基酸所置換。 例如：較適情況下，ATP有一個以上之置換氨基酸於第 121、127、132與第138位置；也就是，ATP有一個以上之 置換氨基酸於SEQ ID NO· 1上的第10、16、21與27位置。 最好是，絲氨基酸（Ser)於第121、127、132位置而丙氨酸

第10頁 1243827 -^ 案號 911179立4 五、發明說明（5) (Ala)於第138位置， 之氨基酸序列為SEQ 可被丙氨酸所取代， 丙氨酸尺寸電荷類似 酸。 '^^91,年 曰 γ^,τ_ 第1圖。此時，本發明之融合蛋白質 ^ No· 2。發現上述位置之絲氨基酸 故對此領域者可知其他氨基酸，若與 者如甘氨酸（G 1 y )亦可取代絲氨基 依照本發明另一較估與竑加 如w 該融合蛋白質，一種^例，棱供一核酸序列可編譯 ^ 、 重組載體包含該核酸序列，以及一種

細胞株已被該重組載髀絲九+ J 印巢細胞株(CH0)。轉感…佳情況下，為中國田氛 接彳&依"?、本各月又钗佳實施例，經由培養轉殖細胞株， &供-製備具增強的人類Ep〇活性融合蛋白質的方法。 為讓本發明之上地和其他目的、特徵、和優點能更明 ，易懂，下文特舉-較佳實施例，並配合所附圖式，作詳 細說明如下： 實施例 ^下面將描述本發明之細節。本發明之程序步驟包括： 獲得與選殖一目標融合蛋白質基因、建造一目標基因之表 現載體、轉感染動物細胞與表現EATp，以及純化表現之 EATP與活性量測。 (1)基因獲得 EP0之互補DNA (cDNA)可經由傳統之反向轉錄聚合酶連 鎖反應（RT-PCR)技術獲得，使用RT-PCT Premix試驗組 (Bioneer公司，Korea所購），其中引子EP1與EC2是與EP0 之cDNA兩端互補，之前由人類胚胎肝臟之cDNA庫所製備 (從Invitrogen公司所得）。

第11頁 1243827 _案號 91117964 94·年 月 YU_ 五、發明說明（6) EP1: ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG (SEQ ID NO: 3) EC2: GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT (SEQ ID NO: 4) EPO之cDNA選殖至一載體pGEM-T(Pr〇π]ega公司），注記 為pGEMT-EPO，而其序列在下列操作中做為模版。 本發明所使用之絨毛膜促性腺激素（HCG ) /3次單位的 CTP變異株基因是經人工合成與自動起始聚合酶連鎖反應 (self-priming PCR)而獲得。合成基因片段為EA1、A2、 A3與A4: ’ EA1: AGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACTCCTCTTCCG (SEQ m ID NO: 5) A2: GGAAGGGC GGGGGGAGGGGCCTTG GC GGAAGAGGA (SEQ ID NO: 6) A3: CCGC CCTTCCAAGCCCAG CCCGACTCCCGGGGCCC (SEQ ID NO: 7) A4: TTATTGTGGGAGGATCGGGGTGTCG GC GGGCCCCG (SEQ ID NO: 8) (粗體部分表是氨基酸置換） 四種基因以每1 //L(含50 pmole/ //L)進行PCR，利用 一高度專一的 Taq 系統（Boehringer Manheim 公司）。 〇 在1 %之洋菜膠中鑑定出大約100鹼基對（bps)之尺寸的 基因片段（修飾C T P基因）。該些基因編碼一胜肽，而置換 HCG /3次單位之1 1 8-145位置之28個羧基端氨基酸中位置 · 1 2 1、1 2 7、1 3 2與1 3 8之四個絲氨基酸（參見第1圖）。 以pGEMT - EP0做模版以及EP1與EC2做引子進行pCR，只

第12頁 1243827 _案號 91117964_年 A 月 >1 曰_____ 五、發明說明（7) 會產生ΕΡΟ基因。然後，更以ΕΡΟ基因與修飾CTP基因做為 模版，配合ΕΡ1 1與ΕΡ22引子與高專一度Taq系統進行pcR， 而獲得想要的融合蛋白質包含大約6 3 0 b p s之基因碎片（注 記為EATP基因）。 EP11： TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT (SEQ ID NO： 9) EP22: TGGATCCTTATTGTGGGAGGATCGGGGT (SEQ iD N0: 10) 該些基因轉殖入pGEM-T選殖載體，而其基因序列辯識 如下（注記為pGEMT-EATP)(參見第3圖）。 (2 )建造表現載體 pcDNA3.1載體（Invitrogen公司）用做表現載體。於 pGEMT-EATP中之EATP基因兩端有Hind III與BamH I限制 酶切點，經由引子EP1 1與EP22而來。pcDNA3· 1與所獲得 pGEMT-EATP以Hind III與BamH I處理之。從一洋菜膠獲得 線性化之p c D N A 3 · 1與E A T P基因，利用Q i a g e η溶出試劑組， 接著經由接合（ligation)而轉殖大腸桿菌E. coli NM5 22。由選殖株分離出質體，經由LB_Ampici 1 1 in固態培 養整夜，再以限制酶H i n d I I I a n d B a m Η I處理之。然 後’以1 %洋菜膠電泳只選擇有插入EATP之選殖株。所獲 得知質體注記為pcDNA3.1-EATP (參見第3圖）。

(3) 轉感染CH0細胞與表現EATP CH0細胞（DG44)種於60 mm盤以製備4 0 -8 0%融合性細胞 (l-4x 105 細胞/ 60 mm 盤）。3 //L 之superfection 試劑 (Boehringer Manheim 公司）與 97 //L 培養液（α-ΜΕΜ 與培 養液、無血漿無抗生素）充分混和，加入大約2 // g之質體

第13頁 1243827 _案號 五、發明說明（8) 91117964 曰 修正 pcDNA3.1-EATP DNA (多於〇·ι #g/"L)與 0.2 //g 之 dihydrofolate 還原酵素（dhfr)基因含載體 pLTRdhfr26 (ATCC3 7 2 9 5 )，在室溫下反應5 —；ι 〇分鐘再加入至細胞中。 一天後’以不含培養液之α_ΜΕΜ(含500 "g /mL G418)與 1 0 % F B S來置換培養液。細胞再補充培養液與5 〇 〇 " g / m L G418培養7-1 0天。之後，沒有抗(；41 8—基因之細胞與負面 控制組細胞都死亡。當從G4丨8培養皿所選擇之細胞培養充 刀之後利用EPO ELISA試驗組（Boehringer Manheim公 司）來確認培養盟中有EATp蛋白質。 (4)純化表現之EATp 使用抗-E P 0單株抗體（r & d I n c ·)，而純化用之親和樹 月曰之製備如下。 • 3 g 之 CNBr-活化 Sepharose 4B 浸於 1 mM HC1 中 20 分 1里再至入管柱中，以1 m Μ H C 1沖洗。接著，樹脂以4 m L結 合，衝液（0·1 M NaHC03 與 0.5 M NaCl，pH 8.3)清洗並轉 至官中立刻與溶於結合緩衝液中之抗-EP0單株抗體（500 ^ g/小管）混合，在室溫下反應2小時。同時，充分搖晃該 言°亥產物置於抑制（b 1 〇 c k i n g )緩衝液（〇 · 2 Μ甘氨酸，p Η 8」（〇並於室溫下震盪反應2小時。該樹脂依序以6 · 5 結 合緩衝液、6. 5 mL醋酸緩衝液（0· 1 Μ醋酸，〇. 5 M NaCl， pH 4)與6 · 5 mL結合緩衝液沖洗。製備之樹脂裝置於管柱 中以備純化之用。 細胞生長於無血漿培養液中一天，然後以超過濾濾心 ^Centriprep (收集一般分子量 1〇,〇〇〇 之下）（Millip〇re & 3 )濃縮培養液五倍。濃縮液注入已經以2〇 mL/hr流速

第14頁 1243827 M± 月 a 修正 案號 911179fi4 五、發明說明（9) PBS平衡並沖洗之官柱。則目標蛋白質會在溶出緩衝液 (0 · 1 Μ甘氨酸，p Η 2 · 8 )沖洗下溶出並立刻以1 μ T r i s溶 液滴定調整pH至7· 5。純化EATP之純度為97%以上，以 SDS-PAGE與銀染色鑑定之（參見第4圖）。 (5 )以生物試驗與生化分析量測活性 表現並純化之E P 0與E A T P之生物活性利用老鼠脾臟細胞 以苯聯氨（pheny 1 hydrazine)之生物試驗量測之。結果顯 示EATP之活性高於EPO，表示EATP多出的羧基端並不妨礙 EPO之活性。 (6 )醫藥動力學測試 為確定製備之物質的確有較長的活體内半衰期，在老鼠上 進行醫藥動力學測試。目標物質以靜脈内施用至四隻老 鼠，每隻老鼠劑量為2 0單位。為估計血中之濃度，從老鼠 採集jk而合併採集之血以EIA試驗組（Boehringer Manheim 公司）測量濃度。由老鼠之結果顯示目標物質EATP比控制 組EP0具有較長半衰期（參見第5圖）。 本發明細節描述在以下之實施例，但是並非用以限制 本發明之範圍。 實施例1 : 基因獲得 EP0之cDNA經由傳統之反向轉錄聚合酶連鎖反應（rT_pcr) 技術獲得，使用R T - P C T P r e m i X試驗組（B i ο n e e r公司，

Korea所購），其中引子EP1與EC2是與EPO之cDNA兩端互 補’之如由人類胚胎肝臟之c D N A庫所製備（從I n v i t r o g e η 公司所得）。PCR反應進行30回合，反應條件：5 5。C

(anneal ing) 35 秒、72 ° C 40 秒與94。C 20 秒而產生EPO

第15頁 _I9Zl3S97 案號 91117964_年 6 月 t 日 修正 五、發明說明（ίο) "

cDNA。所獲之EPO cDNA殖入選殖載體pGEM_T。也就是， PCR產物以1%洋菜膠溶出、接合至pGEM_T、轉殖E. c〇H NM522。培養於 X-gai/ipTG 塗佈 LB-Ampicillin 固態培養一 夜之後，質體DNA從白色選殖株中分離出來，並與限制 酶Sac I與Sac I I反應選擇出含EP0 cDNA插入之選殖株。 所獲之載體注記為pGEMT-EPO而其辯識序列做為後續程序 之模版使用。 HCG /5次單位之修飾CTP基因經人工合成與自動起始pCR 而獲得。合成基因片段EA1，A2，A3與A4。 · 每1 之四種基因（sOpmole/^zL)進行15回合PCR，‘ 利用高度專一之Taq系統，反應條件：55。C (anneal i ng) 40秒、72。C 40秒與94。C 20秒而產生約loo bps之基因碎 片，以1 %洋菜膠辯識（修飾CTP基因）。 該些基因編碼一胜肽，經由以丙氨酸置換HCG冷次單 位之118-145位置之28個羧基端氨基酸中位置121、127、 1 3 2與1 3 8之四個絲氨基酸（參見第1圖）。 以pGEMT-EPO為模版與EP1和EC2引子進行PCR只產生EP0 基因。進行30回合PCR，利用EP0基因與修飾CTP基因做模 版配合EP1 1與EP22引子，於高專一Taq系統，反應條件 57 ° C (anneal i ng)42 秒、72。C 60 秒與94。C 20 秒。故獲 大約6 3 0 bps之融合基因碎片（注記為EATP基因）。該些基 因以上述方法殖入pGEM-T (注記為pGEMT-EATP)，而其序 列亦被辯識。

實施例2 :建造表現載體pcDNA3. 1-EATP pcDNA3. 1載體（invi trogen)用做表現載體。於pGEMT一

第16頁 修正 ^ 91117964 A午年 /,月 Zl 日 五、發明說明（11) EATP中之EATP基因兩端有Hind III與BamH I限制酶切 點，由引子EP11與EP22而來。PcDNA3. 1與所獲得pGEMT — EATP以Hind III與BamH I處理之。從一洋菜膠獲得線性化 之pcDNA3. 1與EATP基因，利用Qi agen溶出試劑組，接著經 由接合（1 igation)而轉殖大腸桿菌ε· c〇i i NM5 22。由選 殖株分離出質體，經由LB-Ampici 11 in固態培養整夜，再 以限制酶H i n d I I I a n d B a m Η I處理之。然後，以1 %洋菜 膠電泳只選擇有插入EATP之選殖株。所獲得知質體注記為 pcDNA3· 1 -EATP (參見第3 圖）。 實施例3 :轉感染CH0細胞與表現EATP CHO細胞（DG44)種於6 0 mm盤以製備4 0-8 0%融合性細胞 (1 -4 X 105 細胞/60 mm 盤）。3 //L 之super feet ion 試劑 (Boehringer Manheim 公司）與97 "L 培養液（α-ΜΕΜ 與培 養液、無血漿無抗生素）充分混和，加入大約2 // g之質體 pcDNA3.1-EATP DNA (多於 〇·1 //g///L)與 0.2 "g 之 dihydrofolate 還原酵素（dhfr)基因含載體 pLTRdhfr26 (ATCC37295) ’在室溫下反應5-10分鐘再加入至細胞中。 一天後，以不含培養液之α-ΜΕΜ(含500 "g /mL G418)與 1 0% FBS來置換培養液。細胞再補充培養液與50 〇 // g /mL G41 8培養7-1 0天。之後，沒有抗G41 8 -基因之細胞與負面 控制組細胞都死亡。當從G 4 1 8培養皿所選擇之細胞培養充 分之後’利用EPO ELISA試驗組（Boehringer Manheim 公 司）來確認培養皿中有EATP蛋白質。

實施例4 : 純化表現之EATP 使用抗-EP0單株抗體（R&D Inc.)，而純化用之親和樹

第17頁 f 1243827 案號 91117964 竹年 五、發明說明（12) 脂之製備如下。 0.3 g 之 CNBr-活化 Sepharose 4B 樹脂浸於1 mM HC1 中 2 0分鐘再至入管柱中，以1 m μ H C 1沖洗。接著，樹脂以4 mL 結合緩衝液（〇·1 M NaHC03 與 〇·5 μ NaCl，pH 8.3)清 洗，並轉至管中立刻與溶於結合緩衝液中之抗_ Ep〇單株抗 體（5 0 0 // g /小管）混合’在室溫下反應2小時。同時，充 分搖晃該管。該產物置於抑制緩衝液（〇. 2 Μ甘氨酸，pH 8. 0 )並於室溫下反應2小時。該樹脂依序以6 . 5 mL結合緩 衝液、6. 5 mL醋酸緩衝液（0· 1 μ醋酸，〇· 5 M NaCl，pH 4)與6 · 5 mL結合緩衝液沖洗。製備之樹脂裝置於管柱中以 備純化之用。 細胞生長於無血漿培養液中一天，然後以超過濾濾心 如Centriprep (收集一般分子量1〇 〇〇〇之下）（MilHp〇re 公司）濃縮培養液五倍。濃縮液注入已經以2〇 mL/hr流速 PBS平衡並沖洗之管柱。則目標蛋白質會在溶出緩衝液 (0· 1 Μ甘氨酸，pH 2· 8)沖洗下溶出並立刻以1 μ Tris溶 液滴定調整pH至7· 5 °純化EATP之純度為97%以上，以 SDS-PAGE與銀染色鑑定之（參見第4圖）。 貫施例5 :以生物試驗與生化分析量測活性 苯聯氨（phenyl hydrazine)施用於老鼠每天一次共雨 天，劑量為60mg/kg。三天之後，從老鼠中取出漲大的脾 臟並在均質器中打碎以獲得脾細胞。脾細胞稀釋至6 X 1 〇6 cel Is/mL之濃度，並將每1〇 Q " l之稀釋脾細胞移至9 6孔 盤。標準EPO( 0 - 5 0 0 mU/mL)以及表現的Ep〇與£八7{)(各1〇〇 mU/iriL)加至該些孔中。將該些盤置於二氧化碳培養器中， 第18頁 1243827 --- -91117964 年匕月2丨曰 益：,下_ 五、發明說明（13) 維持在37° C下22小時。在每孔中加入50 //L之雙甲基-3H- 胸腺 ’σ定核脊（dimethyl-3H-thymidine，20 //Ci/mL)。各 盤再反應2小時然後將每孔中反應液吸至玻璃過濾器 (Nunc卜73 1 64 )，以食鹽水將過濾器清洗三次，以貝塔 (/5 )計數器量測其放射性。量測結果顯示e A τ p之活性是與 ΕΡΟ之活性相當，甚或較高，代表ΕΑΤΡ多出之羧基端並未 影響ΕΡΟ活性。 實施例6 ··醫藥動力學測試 為破定製備之目標物質的確有較長的活體内半衰期， 決定在老鼠上進行醫藥動力學測試。如實施例5所述方法 純化之融合蛋白質以靜脈内施用至四隻老鼠，每隻老氣劑 ®為2 0單位。為估計血中之濃度，定時從老鼠採集血，也 就是剛開始每3 0分鐘而2小時後每2小時採集一次，而合併 扭集之血以ΕΙΑ試驗組（Boehringer Manheim公司）測量濃 度。醫藥動力學結果顯示在第5圖。如第5圖所示，目標物 質EATP比控制組EP0具有較長半衰期（長至2· 5倍以上f。 根據本發明’ E P 0之活體内i n v i v 〇活性可經由增加活 體内半衰期而加強，但仍保留原本EP0活性與原$始氨曰基彳 酸，亦即是在沒有增加EP0醣鍊含量之情況下。 土 雖然本發明已以一較佳實施例揭露如上，麸其並非用 以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離'本發明之 ，和範圍内’當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之^ 護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。 μ

1243827 修正 案號 91117964 圖式簡單說明 第1圖是描述ATP(亦即CTP之變異株）的核酸序列與氨基 酸序列。 第2圖是描述EPO與ATP之一種融合蛋白質（EATP)的核酸 序列與氨基酸序列。 第3圖顯示製造一表現載體pcDNA3. 1-EATP之流程圖。 第4圖顯示純化的EAT P之電泳圖形。 第5圖是顯示E A T P之藥物動力學分析結果之曲線圖。

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Claims (1)

12顾 q 4年6月2 1日 修正 Π錢ui”正本 案號 91Ϊ17964 六、申請專利範圍 1. 一種融合蛋白質，包括紅血球生成素（EPO)，並具有 一羧基端與一突變連接至該羧基端，該突變為一胜肽含有 絲氨酸（Ser)在如SEQ ID NO : 1所示氨基酸序列之第10、 16、21與27位置被置換成丙氨酸（Ala)或是甘氨酸（Gly)， 而SEQ ID NO. 1係對應至人類絨毛膜促性腺激素（HCG)的 次單位之魏基端胜肽（Carboxy Terminal Peptide, CTP) 的位置1 1 2 - 1 4 5。 2 —種編碼如申請專利範圍第1項所述之融合蛋白質的 核酸。 3. —種製備具有增強的活體内紅血球生成素活性之融 合蛋白質的方法，包括培養以包含如申請專利範圍第2項 所述之核酸之一重組載體轉感染之一細胞株。

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