JP2003189853A - 生体内エリスロポエチン活性が増進した融合蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 生体内ＥＰＯ活性が増進した融合蛋白質を提
供する。 【解決手段】 ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）のカル
ボキシル末端に、ＨＣＧβサブユニットのカルボキシル
末端ペプチド（ＣＴＰ）断片のアミノ酸が１〜４個置換
された変異体が融合されることを特徴とする融合蛋白質
に係り、この融合蛋白質はＥＰＯの固有活性自体はその
まま保有しつつ、糖鎖含量の増加なく生体内半減期が画
期的に増加できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、悪性貧血治療剤で
ある、生体内(in vivo)でのヒトのエリスロポエチン
（以下、「ＥＰＯ」とも略する）活性が増進した融合蛋
白質に関するものである。より具体的には、本発明は、
インビボで自然に生じる(naturally occurring)特定ペ
プチドにＥＰＯ分子が融合されてなる、糖鎖含量を増加
させずに、それ自体のアミノ酸配列により生体内(in vi
vo)半減期を増加することによって、エリスロポエチン
活性が増進された融合蛋白質に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＥＰＯは、分子量３０，０００〜３４，
０００の糖蛋白質であり、赤血球の生成及び分化を促進
する造血因子である。この糖蛋白質は、赤血球系前駆細
胞の受容体に結合して造血作用を開始して、細胞内のカ
ルシウムイオン濃度の増加、ＤＮＡ生合成の促進及びヘ
モグロビン生成の刺激などを引き起こす。また、組換え
型のヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）は、腎不全、
未熟児、甲状腺機能不全、栄養失調などに関連する貧血
の治療剤として使われてきた。一方、ｒｈＥＰＯは、半
減期が短く、週に３回程度の投与を必要とするので、不
便であり、また、コストも高い。このため、ｒｈＥＰＯ
の広範な使用は制限されている。したがって、これらの
生体内活性をより長期間維持させることにより、治療の
ためのｒｈＥＰＯの投与頻度を減少させうる。

【０００３】ＥＰＯの生体内での生物活性は生体内半減
期に比例し、この生体内半減期はＥＰＯの糖鎖の末端に
位置するシアル酸の含量と相関関係があることが知られ
ている。したがって、ＥＰＯの生体内での生物活性は、
糖鎖の存在あるいは不存在により大きく左右される。と
ころが、糖鎖の形態は細胞のタイプによって各々異なる
ので、同じ糖蛋白質を相異なる細胞で発現させると、蛋
白質の糖鎖の形態は、細胞のタイプによってそれぞれ異
なるものとなる。細菌、例えば、大腸菌(E. coli)は蛋
白質に糖鎖を付加できないことが知られている。一般
に、大腸菌で発現する蛋白質には糖が付加されていない
ために、大腸菌で発現したＥＰＯは糖鎖を含まない。こ
のような場合でのＥＰＯは、試験管内(in vitro)では活
性が確認されるが、生体内では全く活性を有さない。そ
の理由は、糖鎖のないＥＰＯは、糖鎖を有するものに比
べて、体内から迅速に除去され、その半減期が非常に短
いからである。ゆえに、ＥＰＯにおける糖鎖の存在は、
ＥＰＯの生物学的活性に非常に重要な役割を果たしてい
る。

【０００４】現在まで、ＥＰＯの活性を増加させるため
に多くの研究が盛んに行われてきた。そのうち主流をな
したのは、突然変異誘発技術を用いてＥＰＯ遺伝子に突
然変異を誘導することによっていくつかのアミノ酸を置
換させる方法である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９
２５７（発明の名称：Erythropoietin Analogs、出願
人：Amgen Inc.）には、突然変異誘発によりＥＰＯの糖
鎖含量を増加させることによって生体内半減期を増進さ
せる方法が開示されている。また、ＥＰＯの二量体形成
により生体内半減期を増加させようとする試みもあった
(A.J. Sytkowskiet al., J.B.C. vol.274, No.35, pp.2
4773-24778)。その他にも、遺伝子操作を用いてＥＰＯ
分子に新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片を融
合させて、ＥＰＯの糖鎖含量、具体的には、シアル酸の
含量を増加させることによって、ＥＰＯの生体内活性を
増進させる方法がある。しかしながら、上記方法に使用
されるアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質断片の種類が非
常に制限される。多くの場合、このような遺伝子の修飾
は、蛋白質の特定の活性を低下または失活させたり、ま
たはこれらの物質を生体内で使用する際にしばしば生じ
る抗原性の問題を引き起こす可能性がある。

【０００５】一方、ＥＰＯに関するものではないが、融
合蛋白質またはキメラ蛋白質に関する研究が行なわれて
おり、これらの例としては、例えば、性ホルモンの一種
の卵胞刺激ホルモンに対するものがある(Furuhashi et
al., 1995, Mol.Endocrinol.)。しかしながら、このよ
うな蛋白質は、遺伝子操作を用いて遺伝子が修飾された
蛋白質には問題があるため、実際に適用された例はなか
った。また、修飾された蛋白質自体を得ることは容易で
はなく、高度の技術が要求される。加えて、新しいアミ
ノ酸の付加または置換によって、蛋白質の活性が減少し
たりまたは失われたりすることが多かった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、ＥＰＯ分子をそのカルボキシル末端にＨＣＧβ
サブユニットのＣＴＰ変異体に融合されてなる、ヒトＥ
ＰＯの生体内活性が増進した融合蛋白質を提供すること
である。

【０００７】本発明の他の目的は、当該融合蛋白質をコ
ード化する核酸、当該核酸を含有する組換えベクター、
及び当該組換えベクターで形質転換またはトランスフェ
クションされた細胞系を提供することである。

【０００８】本発明のさらなる他の目的は、当該形質転
換またはトランスフェクションされた細胞系を培養する
ことによる増進したヒトＥＰＯ活性を有する融合蛋白質
を製造する方法を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＥＰＯ分
子に新しいアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質（断片）を
融合することによって、ＥＰＯの生体内活性を増進させ
うる新規な方法を開発することに鋭意検討を行なった結
果、ＥＰＯに、インビボで自然に生じる(naturally occ
urring)蛋白質であるヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（本
明細書中では、「ＨＣＧ」とも称する）のβサブユニッ
トのカルボキシル末端ペプチド（本明細書中では、「Ｃ
ＴＰ」とも称する）断片を融合することによって得られ
る融合蛋白質が、ＥＰＯの生体内活性を劇的に促進する
ことを見出した。また、この際のＥＰＯは、ＥＰＯの固
有の活性を維持しつつ糖鎖部位を増加させる機能を有す
るアミノ酸を含むものであった（韓国特許出願第１０−
２０００−００７５２３０号を参照）。

【００１０】上記知見に加えてさらに鋭意検討を行なっ
た結果、本発明者らは、驚くべきことに、ペプチド中の
糖鎖部位を予め除去したＣＴＰ変異体はＥＰＯの生体内
半減期を画期的に増加させることを見出した。この知見
により、ＥＰＯの糖鎖含量を増加させることなく、アミ
ノ酸配列を用いてＥＰＯの生体内安定性を増加できるＣ
ＴＰ変異体を開発するに至り、このような知見に基づい
て、本発明を完成した。

【００１１】すなわち、配糖化部位を予め除去したＣＴ
Ｐ変異体を利用する本発明は、ＥＰＯの糖鎖含量の増加
により生体内半減期を増加させる従来の方法とは有意に
異なるものであり、本発明はＥＰＯの生体内安定性を増
加できるＣＴＰ変異体の発見に基づくものである。

【００１２】すなわち、上記諸目的は、下記（１）〜
（６）によって達成される。

【００１３】（１） ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）
のカルボキシル末端に、ＥＰＯの糖鎖含量を増加させず
に生体内ＥＰＯ活性を増進させる、ヒト絨毛性性腺刺激
ホルモン（ＨＣＧ）βサブユニットのカルボキシル末端
ペプチド（ＣＴＰ）断片のアミノ酸が１〜４個置換され
た変異体（本明細書中では、「ＡＴＰ」とも称する）が
融合されることを特徴とする融合蛋白質。

【００１４】（２） 上記カルボキシル末端ペプチド断
片は、配列番号：１に記載されるＨＣＧβサブユニット
のアミノ酸配列の１１２〜１４５番目、より好ましくは
１１８〜１４５番目のアミノ酸の少なくとも一部を含
む、前記（１）に記載の融合蛋白質。なお、配列番号１
において、当該アミノ酸配列は、ＨＣＧβサブユニット
のアミノ酸配列の１１２〜１４５番目のアミノ酸配列に
相当する。このため、例えば、「配列番号：１に記載さ
れるＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１１２番目
のアミノ酸」とは、配列番号１における１０番目のＳｅ
ｒ残基を意味する。

【００１５】（３） 上記変異体は、配列番号：１に記
載されるＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１２
１、１２７、１３２及び１３８番目からなる群より選択
される少なくとも一のアミノ酸が置換される、前記
（２）に記載の融合蛋白質。

【００１６】（４） 上記変異体は、配列番号：１に記
載されるＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１２
１、１２７、１３２及び１３８番目からなる群より選択
される少なくとも一のセリン残基（Ｓｅｒ）がアラニン
残基（Ａｌａ）またはグリシン残基（Ｇｌｙ）に置換さ
れる、前記（３）に記載の融合蛋白質。

【００１７】（５） 前記（１）〜（４）のいずれかに
記載の融合蛋白質をコード化することを特徴とする核
酸。

【００１８】（６） 前記（５）に記載の核酸を含む組
換えベクターで形質転換またはトランスフェクションさ
れた細胞を培養する段階を有する、生体内エリスロポエ
チン活性が増進した融合蛋白質を製造する方法。

【００１９】

【発明の実施の形態】本発明の第一は、ヒトＥＰＯのカ
ルボキシ末端にＨＣＧβサブユニットのＣＴＰ断片のア
ミノ酸が１〜４個置換された変異体（本明細書中では、
「ＡＴＰ」とも称する）が融合された、生体内ヒトＥＰ
Ｏ活性が増進した融合蛋白質を提供するものである。本
発明の融合蛋白質は、従来のものと異なり、ＥＰＯの糖
鎖含量を増加させずに生体内ＥＰＯ活性を増進させるこ
とができる。前記ＣＴＰ断片は、下記配列番号：１に記
載されたＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１１２
〜１４５番目のアミノ酸またはその一部、特に好ましく
は１１８〜１４５番目のアミノ酸を含むことが望まし
い。なお、下記アミノ酸配列（配列番号：１）は、ＨＣ
Ｇβサブユニットのアミノ酸配列の１１２〜１４５番目
のアミノ酸に相当するため、例えば、配列番号１のアミ
ノ酸配列の１番目のアミノ酸は、ＨＣＧβサブユニット
のアミノ酸配列の１１２番目のアミノ酸に相当する。

【００２０】 ＜ＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１１２〜１４５番目のアミノ酸配列 （配列番号：１）＞ Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10 15 Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu 20 25 30 Pro Gln ＣＴＰ断片の変異体であるＡＴＰは、そのアミノ酸配列
により、即ち、ＥＰＯの糖鎖含量を増加させることな
く、ＥＰＯ分子の生体内半減期を増加させて、ゆえに生
体内ＥＰＯ活性を増進させる機能を有するものである。
したがって、ＡＴＰにおける変異が起こるアミノ酸置換
の特定位置及び置換されるアミノ酸の種類は、融合蛋白
質の生体内エリスロポエチン活性増進作用に悪影響がな
いかぎり、特に制限されるものではない。すなわち、融
合蛋白質がエリスロポエチンの生体内活性を増進させる
活性を維持するかぎり、該当位置範囲内のアミノ酸はい
ずれの位置でいずれのアミノ酸でも置換が可能である。

【００２１】例えば、ＡＴＰは、配列番号：１に記載さ
れるＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１２１、１
２７、１３２及び１３８番目の位置のアミノ酸（Ｓｅｒ
残基）のうち一つ以上が置換されたものであることがよ
り好ましく、最も望ましくは、当該配列の１２１、１２
７、１３２及び１３８番目の位置のセリン残基（Ｓｅ
ｒ）がアラニン残基（Ａｌａ）またはグリシン残基（Ｇ
ｌｙ）、特に望ましくは図１に示されるようにＡｌａ
（それぞれ、図１中の４、１０、１５及び２１番目のＡ
ｌａに相当）に置換されたものである。本実施態様によ
る融合蛋白質は、下記配列番号：２に記載されたアミノ
酸配列を有する。即ち、配列番号２に記載されるアミノ
酸配列は、本発明の特に好ましい一実施態様によるＥＰ
ＯとＡＴＰとの融合蛋白質（本明細書中では、「ＥＡＴ
Ｐ」とも称する）のアミノ酸配列を示すものである。こ
こでは、配列番号：２の１９６、２０２、２０７及び２
１３番目の位置のアミノ酸が、それぞれ、配列番号：１
のアミノ酸配列の１２１、１２７、１３２及び１３８番
目の位置のアミノ酸に相当し、ＳｅｒがＡｌａに置換さ
れている。前記位置のＳｅｒがＡｌａに置換されうる事
実からみて、Ａｌａと類似した大きさ及び電荷を有する
他のアミノ酸、例えば、Ｇｌｙも、Ａｌａと同様にし
て、置換が可能である。

【００２２】 ＜ＥＰＯおよびＨＣＧβサブユニットのＣＴＰ断片の変異体（ＡＴＰ）との融 合蛋白質（ＥＡＴＰ）アミノ酸配列（配列番号：２）＞ Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Ser Ser Ser Ala Lys Ala Pro Pro Pro Ala Leu Pro Ser Pro Ala Arg 195 200 205 Leu Pro Gly Pro Ala Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 210 215 220 本発明の第二は、本発明の融合蛋白質をコード化する核
酸、当該核酸を含む組換えベクター、及び当該組換えベ
クターで形質転換またはトランスフェクションされた細
胞系、望ましくはＣＨＯ(chinese hamster ovary)細胞
株を提供するものである。

【００２３】本発明の第三は、本発明の細胞系（細胞
株）を培養することによる、増進したヒトＥＰＯ活性を
有する融合蛋白質を製造する方法を提供するものであ
る。

【００２４】以下、本発明をより詳細に説明する。

【００２５】本発明の融合蛋白質は、ＥＰＯのカルボキ
シル末端に所望のＡＴＰが融合されたものであれば、そ
の製造方法は、特に制限されず公知の方法が使用でき、
また、これをコード化する核酸、当該核酸を含む組換え
ベクター、及び当該組換えベクターで形質転換またはト
ランスフェクションされた細胞系もまた、特に制限され
ず公知の方法が使用できる。一般的には、本発明は、目
的とする融合蛋白質の遺伝子の確保及びクローニング、
目的とする遺伝子の発現ベクターの作製、当該ベクター
の動物細胞への形質転換／トランスフェクション及びＥ
ＡＴＰの発現、ならびに発現されたＥＡＴＰの分離（精
製）及び活性度測定の段階を経る。

【００２６】以下、各工程ごとに説明する。

【００２７】（１） 遺伝子の確保及びクローニング ＥＰＯの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、特に制限され
ず、公知の方法を用いて得られる。一実施態様による
と、ヒト胎児の肝のｃＤＮＡライブラリー(Invitrogen
Corp.)からあらかじめ調製されたＥＰＯ ｃＤＮＡの両
末端と相補的なプライマーＥＰ１、ＥＣ２を使用して、
ＲＴ−ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ Ｋｉｔ(Bioneer)を用い
た公知のＲＴ−ＰＣＲ(reverse transcription-polymer
ase chain reaction)技術によって得られる。上記実施
態様において使用されるプライマーＥＰ１及びＥＣ２の
塩基配列を以下に示す。

【００２８】ＥＰ１：ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＣＧＡＡＴＧ
ＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧ（配列番号：３） ＥＣ２：ＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴ
（配列番号：４） 次に、このようにして得られたＥＰＯ ｃＤＮＡを、ク
ローニングベクターのｐＧＥＭ−Ｔ(Promega Corp.)に
クローニングして、ｐＧＥＭＴ−ＥＰＯを得、その塩基
配列を確認した後、次の操作における鋳型として使用す
る。なお、上記実施態様においては、特定のクローニン
グベクターを使用したが、本発明はこれに限定されるも
のではなく、他の公知のクローニングベクター及びクロ
ーニング方法を使用してもよい。

【００２９】本発明で使用されるＨＣＧβサブユニット
のＣＴＰ遺伝子変異体の製造方法は、特に制限されず、
公知の方法が使用できる。例えば、ＨＣＧβサブユニッ
トのＣＴＰ遺伝子変異体は、合成及びセルフプライミン
グＰＣＲ(self-priming PCR)によって得られる。合成さ
れた遺伝子断片を、ＥＡ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４と称
し、その塩基配列を以下に示す。下記塩基配列におい
て、太字で表示した部分は、アミノ酸置換を誘導するた
めの部分である。

【００３０】

【化１】

【００３１】上記４つの遺伝子を、それぞれ、１μｌず
つ取り（５０ｐｍｏｌｅ／μｌ）、高正確度Ｔａｑシス
テム(high fidelity Taq system)(Boehringer Manheim
Corp.)を使用してＰＣＲを行なう。

【００３２】１％アガロースゲルで、約１００ｂｐの遺
伝子断片（修飾ＣＴＰ遺伝子）を確認・同定する。これ
らの遺伝子は、ＨＣＧβサブユニット（配列番号：１）
の１１８〜１４５番目の位置の２８個のカルボキシル末
端アミノ酸のうち１２１、１２７、１３２及び１３８番
目の４つのＳｅｒ残基をＡｌａ残基に置換して得られた
遺伝子をコード化するものである（図１を参照）。

【００３３】ｐＧＥＭＴ−ＥＰＯを鋳型としてならびに
上記ＥＰ１及びＥＣ２をプライマーとして使用して、Ｐ
ＣＲを行なうことによって、ＥＰＯ遺伝子のみを得る。
次に、このＥＰＯ遺伝子及び修飾ＣＴＰ遺伝子双方を鋳
型としてならびにプライマーＥＰ１１及びＥＰ２２を使
用して、高正確度Ｔａｑシステム(high fidelity Taqsy
stem)(Boehringer Manheim Corp.)によるＰＣＲをさら
に行なうことによって、約６３０ｂｐの遺伝子断片を有
する所望の融合遺伝子（「ＥＡＴＰ遺伝子」と称する）
を得る。なお、ここで使用されたプライマーＥＰ１１及
びＥＰ２２の塩基配列を以下に示す。

【００３４】ＥＰ１１：ＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＧＧＧ
ＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴ（配列番号：９） ＥＰ２２：ＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＧＧＧＡＧＧ
ＡＴＣＧＧＧＧＴ（配列番号：１０） これらの遺伝子をクローニングベクターであるｐＧＥＭ
−Ｔにクローニングした後、塩基配列を確認する（これ
を、本明細書中では、「ｐＧＥＭＴ−ＥＡＴＰ」と称す
る）（図３を参照）。

【００３５】（２） 発現ベクターの構築 所望の融合遺伝子（ＥＡＴＰ遺伝子）を発現させるため
の発現ベクターは、特に制限されず、発現宿主の種類に
よって、公知の発現ベクターから適宜選択されて使用で
きる。例えば、ｐｃＤＮＡ３.１ベクター(Invitrogen)
が、発現ベクターとして使用される。上記（１）で作製
されたｐＧＥＭＴ−ＥＡＴＰのＥＡＴＰ遺伝子の両末端
は、プライマーＥＰ１１及びＥＰ２２由来のＨｉｎｄＩ
ＩＩ及びＢａｍＨＩの制限酵素部位を有する。これを利
用して、発現ベクターとしてのｐｃＤＮＡ３.１及び上
記（１）で得られたｐＧＥＭＴ−ＥＡＴＰを、制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩとで処理する。線形化され
たｐｃＤＮＡ３.１及びＥＡＴＰ遺伝子を、Ｑｉａｇｅ
ｎ溶出キットを用いてアガロースゲルから得た後、ライ
ゲーション（連結）して、これを大腸菌 ＮＭ５２２株
に形質転換する。ＬＢ−アンピシリン固体培地で一晩イ
ンキュベートした後、現れたコロニーからプラスミドを
単離し、このプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及び
ＢａｍＨＩで処理する。さらに、ＥＡＴＰ遺伝子が挿入
されたプラスミドを、１％アガロースゲル電気泳動によ
って選択する。このプラスミドをｐｃＤＮＡ３.１−Ｅ
ＡＴＰと命名する（図３中では、単に「ｐｃＤＮＡ−Ｅ
ＡＴＰ」）。

【００３６】（３） ＣＨＯ細胞へのトランスフェクシ
ョン（形質転換）及びＥＡＴＰの発現 上記（２）で調製された発現プラスミドからの所望のＥ
ＡＴＰの発現のために使用される宿主細胞やそれからの
所望のＥＡＴＰの発現方法は、特に制限されず、使用さ
れた宿主細胞によって公知の方法が適宜選択できる。以
下に、宿主細胞としてＣＨＯ(chinese hamster ovary)
細胞株を使用する場合の実施態様を記載する。ＣＨＯ細
胞（ＤＧ４４）を、６０ｍｍ細胞培養皿で生育させて、
４０〜８０％コンフルエントな細胞（１〜４×１０⁵細
胞／６０ｍｍ皿）を調製する。スーパーフェクション試
薬(superfection reagent)(Boehringer Manheim Corp.)
３μｌ及び細胞培地（培養基(media)を含むが、血清及
び抗生物質を含まないα−ＭＥＭ）９７μｌをよく混合
する。この混合液に、上記（２）で得られたプラスミド
ｐｃＤＮＡ３.１−ＥＡＴＰ（０.１μｇ／μｌ以上）約
２μｇ及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝
子を含むベクターｐＬＴＲｄｈｆｒ２６（ＡＴＣＣ３７
２９５）０.２μｇを添加して、室温で５〜１０分間反
応させた後、上記で調製されたＣＨＯ細胞に加える。１
日経過後、培地を、１０％ＦＢＳを有する培養基(medi
a)を含まないα−ＭＥＭ（５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８
を含む）培地に交換する。細胞を、５００μｇ／ｍｌ
Ｇ４１８が添加される培養基(media)を補充して、７〜
１０日間培養する。ここで、Ｇ４１８耐性遺伝子を持た
ない細胞及び陰性対照群の細胞はすべて死滅する。Ｇ４
１８培地で選別された細胞を十分に培養した後、培地で
発現したＥＡＴＰ蛋白質を、ＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット
(Boehringer Manheim Corp.)を用いて確認する。

【００３７】（４） 発現したＥＡＴＰ蛋白質の精製 上記（３）で作製されたＥＡＴＰ蛋白質を発現する細胞
からの所望のＥＡＴＰ蛋白質の精製方法は、特に制限さ
れず、アフィニティクロマトグラフィー等の公知の方法
が使用できる。以下に、その一実施態様を説明する。

【００３８】まず、抗−ＥＰＯモノクローナル抗体（Ｒ
＆Ｄ社）を用いて、分離精製用のアフィニティ樹脂を下
記のようにして調製する。

【００３９】０．３ｇのＣＮＢｒで活性化されたセファ
ロース４Ｂ(Sepharose 4B)を、１ｍＭ ＨＣｌ中で２０
分間、膨潤させて、樹脂をカラムに移した後、１ｍＭ
ＨＣｌで洗浄する。次に、このようにして得られた樹脂
をさらに４ｍｌのカップリング緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ
ＨＣＯ₃、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）で洗浄
し、チューブに移した後、直ちにカップリング緩衝液に
入っている抗−ＥＰＯモノクローナル抗体（５００μｇ
／バイアル）とチューブ内で混合して、室温で２時間反
応させる。この時、チューブを十分振盪する。さらに、
このようにして得られた反応産物を、ブロッキング緩衝
液（０．２Ｍグリシン、ｐＨ８．０）で置換した後、攪
拌しながら室温で２時間反応させる。このようにして得
られた樹脂を、６．５ｍｌのカップリング緩衝液、６．
５ｍｌのアセテート緩衝液（０．１Ｍ 酢酸、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ４）及び６．５ｍｌのカップリング緩
衝液で順次洗浄する。このように調製された樹脂をカラ
ムに充填して、次のように精製を実施する。

【００４０】上記（３）で得られた細胞を、無血清培養
液で一日生育させた後、培養液だけをＣｅｎｔｒｉｐｒ
ｅｐ（Millipore Corp.製、カットオフ１０，０００）
を用いて約５倍濃縮する。次に、この濃縮液を、約２０
ｍｌ／ｈｒの流速でＰＢＳで平衡化させたカラムにのせ
て、再びＰＢＳで洗浄する。所望の蛋白質を溶出緩衝液
（０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．８）で溶出させた後直ち
に、１Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）溶液でｐＨ７．５になるよ
うに滴定する。ＥＡＴＰの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び
銀染色で確認したとところ、９７％以上である（図
４）。

【００４１】（５）バイオアッセイ法による活性測定及
び生化学的分析 上記（４）で精製されたＥＡＴＰ及びコントロールとし
てのＥＰＯの生物学的活性の測定及びそれらの生化学的
分析が行なわれるが、その際の測定及び分析方法は、特
に制限されず、公知の方法が使用できる。以下に、その
一実施態様を記載する。

【００４２】発現され及び適当に精製されたＥＰＯ及び
ＥＡＴＰの生物学的活性を、フェニルヒドラジンで処理
されたマウスの脾細胞を用いたバイオアッセイによって
測定する。その結果、ＥＡＴＰの活性がＥＰＯのものよ
り高く現れることから、ＥＡＴＰで添加されたカルボキ
シル末端の存在がＥＰＯの活性自体を阻害しないことが
示唆される。

【００４３】（６）薬物動態試験 調製された候補物質、即ち、ＥＡＴＰが実際より長い生
体内での半減期を有するかどうかを確認するために、薬
物動態試験を、例えば、マウスを対象で実施する。この
際使用できる確認方法は、特に制限されず公知の方法が
使用でき、その対象動物もまたマウスに制限されず、ラ
ットやウサギ等の他の動物が使用できる。以下に、その
確認方法の一実施態様を示す。候補物質を、４匹のマウ
スに１匹当り２０ユニットの投与量で静脈内投与する。
経時的血中濃度を確認するために、血液をマウスから集
め、ＥＩＡキット(Boehringer Manheim Corp.)を使用し
て、血中濃度を決定する。マウスで行なわれた薬物動態
試験から、候補物質であるＥＡＴＰはコントロール物質
であるＥＰＯよりかなり長い半減期を有することが分か
る（図５を参照）。

【００４４】

【実施例】以下、本発明を実施例を参照しながらより具
体的に説明するが、本発明の範囲は下記実施例によって
制限されない。

【００４５】実施例１：遺伝子の確保 ＥＰＯのｃＤＮＡを、ヒト胎児の肝臓のｃＤＮＡライブ
ラリー(Invitrogen Corp.)であらかじめ調製されたＥＰ
Ｏ ｃＤＮＡの両末端と相補的なプライマーＥＰ１、Ｅ
Ｃ２を使用した、ＲＴ−ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ Ｋｉｔ
を用いた公知のＲＴ−ＰＣＲ技術(Bioneer Corp., Kore
a)によって得た。なお、ＰＣＲ反応は、５５℃で３５秒
（アニーリング）、７２℃で４０秒、及び９４℃で２０
秒の条件下で、３０サイクル行なわれ、これによりＥＰ
Ｏ ｃＤＮＡが調製された。また、この際使用されるプ
ライマーＥＰ１及びＥＣ２の塩基配列は、下記のとおり
である。

【００４６】ＥＰ１：ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＣＧＡＡＴＧ
ＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧ（配列番号：３） ＥＣ２：ＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴ
（配列番号：４） 次に、このようにして得られたＥＰＯ ｃＤＮＡを、ク
ローニングベクターのｐＧＥＭ−Ｔ(Promega Corp.)に
クローニングした。より詳細に述べると、上記操作で得
られたＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルから溶出し
て、ｐＧＥＭ−Ｔに連結した後、大腸菌ＮＭ５２２に形
質転換させた。Ｘ−ｇａｌ／ＩＰＴＧを塗り付けたＬＢ
−アンピシリン固体培地で一晩インキュベートした後、
白色コロニーらからプラスミドＤＮＡを単離し、これを
制限酵素ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩで処理して、ＥＰＯ ｃ
ＤＮＡが挿入されているコロニーを選別した。得られた
ベクターをｐＧＥＭＴ−ＥＰＯと命名して、その塩基配
列を確認した後、次の操作における鋳型として使用し
た。

【００４７】ＨＣＧβサブユニットの修飾されたＣＴＰ
遺伝子を、合成及びセルフプライミングＰＣＲを利用し
て得た。合成された遺伝子断片は、ＥＡ１、Ａ２、Ａ３
及びＡ４を、ＥＡ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４と称し、その
塩基配列を以下に示す。

【００４８】ＥＡ１：ＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧ
ＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＧ（配列番
号：５） Ａ２：ＧＧＡＡＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＣＴ
ＴＧＧＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡ（配列番号：６） Ａ３：ＣＣＧＣＣＣＴＴＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＣＣＧ
ＡＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＣＣ（配列番号：７） Ａ４：ＴＴＡＴＴＧＴＧＧＧＡＧＧＡＴＣＧＧＧＧＴＧ
ＴＣＧＧＣＧＧＧＣＣＣＣＧ（配列番号：８） これら４つの遺伝子を１μｍずつとって（５０ｐｍｏｌ
ｅ／(ｌ）、高正確度Ｔａｑシステム(high fidelity Ta
q system)(Boehringer Manheim Corp.)を使用して、５
５℃で４０秒（アニーリング）、７２℃で４０秒及び９
４℃で２０秒の条件下で計１５サイクルのＰＣＲを行な
った。１％アガロースゲルで約１００ｂｐの遺伝子断片
を確認した（修飾されたＣＴＰ遺伝子）。

【００４９】この遺伝子は、ＨＣＧβサブユニットの２
８個のカルボキシル末端のアミノ酸の１２１、１２７、
１３２及び１３８番目の４個のＳｅｒ残基がＡｌａに置
換されたペプチドをコード化するものである（図１）。

【００５０】ｐＧＥＭＴ−ＥＰＯを鋳型としてならびに
上記ＥＰ１及びＥＣ２をプライマーとして使用して、前
記と同じ条件でＰＣＲを行なうことによって、ＥＰＯ遺
伝子だけを得た。次に、このＥＰＯ遺伝子及び上記で得
られた修飾されたＣＴＰ遺伝子双方を鋳型としてならび
にプライマーＥＰ１１及びＥＰ２２を使用して、高正確
度Ｔａｑシステム(high fidelity Taq system)(Boehrin
ger Manheim Corp.)を用いて、５７℃で４２秒（アニー
リング）、７２℃で１分、及び９４℃で２０秒の条件下
で３０サイクルのＰＣＲをさらに行なうことによって、
約６３０ｂｐの融合遺伝子断片（「ＥＡＴＰ遺伝子」と
称する）が得られた。なお、ここで使用されたプライマ
ーＥＰ１１及びＥＰ２２の塩基配列を以下に示す。

【００５１】ＥＰ１１：ＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＧＧＧ
ＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴ（配列番号：９） ＥＰ２２：ＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＧＧＧＡＧＧ
ＡＴＣＧＧＧＧＴ（配列番号：１０） これらの遺伝子を、前記と同じ方法でクローニングベク
ターであるｐＧＥＭ−Ｔにクローニングした後、その塩
基配列を確認する（ｐＧＥＭＴ−ＥＡＴＰと称する）
（図３）。

【００５２】実施例２：発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１
−ＥＡＴＰの構築 本実施例では、ｐｃＤＮＡ３.１ベクター(Invitrogen)
を、発現ベクターとして使用した。実施例１で作製され
たｐＧＥＭＴ−ＥＡＴＰのＥＡＴＰ遺伝子の両末端は、
プライマーＥＰ１１及びＥＰ２２由来のＨｉｎｄＩＩＩ
及びＢａｍＨＩの制限酵素部位を有する。

【００５３】これを利用して、発現ベクターとしてのｐ
ｃＤＮＡ３.１及び実施例１で得られたｐＧＥＭＴ−Ｅ
ＡＴＰを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化
した。線形化されたｐｃＤＮＡ３.１及びＥＡＴＰ遺伝
子を、Ｑｉａｇｅｎ溶出キットを用いてアガロースゲル
から得た後、ライゲーション（連結）して、これを大腸
菌 ＮＭ５２２株に形質転換した。ＬＢ−アンピシリン
固体培地で一晩インキュベートした後に現れたコロニー
からプラスミドを単離し、このプラスミドを制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで処理した。さらに、ＥＡ
ＴＰ遺伝子が挿入されたプラスミドを、１％アガロース
ゲル電気泳動によって選択した。このようにして得られ
たプラスミドをｐｃＤＮＡ３.１−ＥＡＴＰと命名する
（図３参照；ただし、図３中では、単に「ｐｃＤＮＡ−
ＥＡＴＰ」として示される）。

【００５４】実施例３：ＣＨＯ細胞の形質転換及びＥＡ
ＴＰ発現 ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４）を、６０ｍｍ細胞培養皿で生育
させて、４０〜８０％コンフルエントな細胞（１〜４×
１０⁵細胞／６０ｍｍ皿）を調製した。スーパーフェク
ション試薬(superfection reagent)(Boehringer Manhei
m Corp.)３μｌ及び細胞培地（培養基(media)を含む
が、血清及び抗生物質を含まないα−ＭＥＭ）９７μｌ
をよく混合した。この混合液に、実施例２で得られたプ
ラスミドｐｃＤＮＡ３.１−ＥＡＴＰ（０.１μｇ／μｌ
以上）約２μｇ及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆ
ｒ）遺伝子を含むベクターｐＬＴＲｄｈｆｒ２６（ＡＴ
ＣＣ３７２９５）０.２μｇを添加して、室温で５〜１
０分間反応させた後、上記で調製されたＣＨＯ細胞に加
えた。１日経過後、培地を、１０％ＦＢＳを有する培養
基(media)を含まないα−ＭＥＭ（５００μｇ／ｍｌ
Ｇ４１８を含む）培地に交換した。細胞を、５００μｇ
／ｍｌ Ｇ４１８を含む培養基を補充して、７〜１０日
間培養する。ここで、Ｇ４１８耐性遺伝子を持たない細
胞及び陰性対照群の細胞はすべて死滅した。Ｇ４１８培
地で選別された細胞を十分に培養した後、培地で発現し
たＥＡＴＰ蛋白質を、ＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット(Boehr
inger Manheim Corp.)を用いて確認した。

【００５５】実施例４：発現されたＥＡＴＰの精製 まず、抗−ＥＰＯモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ）社を用
いて、分離精製用のアフィニティ樹脂を下記のようにし
て調製した。

【００５６】０．３ｇのＣＮＢｒで活性化されたセファ
ロース４Ｂ(Sepharose 4B)を、１ｍＭ ＨＣｌ中で２０
分間、膨潤させて、この樹脂をカラムに移した後、１ｍ
ＭＨＣｌで洗浄した。次に、このようにして得られた樹
脂をさらに４ｍｌのカップリング緩衝液（０．１Ｍ Ｎ
ａＨＣＯ₃、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）で洗浄
し、チューブに移した後、直ちにカップリング緩衝液に
入っている抗−ＥＰＯモノクローナル抗体（５００μｇ
／バイアル）とチューブ内で混合して、攪拌しながら室
温で２時間反応させた。この時、チューブを十分振盪し
た。さらに、このようにして得られた反応産物を、ブロ
ッキング緩衝液（０．２Ｍグリシン、ｐＨ８．０）で置
換した後、室温で２時間反応させた。このようにして得
られた樹脂を、６．５ｍｌのカップリング緩衝液、６．
５ｍｌのアセテート緩衝液（０．１Ｍ 酢酸、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ４）及び６．５ｍｌのカップリング緩
衝液で順次洗浄した。このように調製された樹脂をカラ
ムに充填して、次のように精製を実施した。

【００５７】実施例３で得られた形質転換ＣＨＯ細胞
を、無血清培養液で一日生育させた後、培養液だけをＣ
ｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（Millipore Corp.製、カットオフ
１０，０００）を用いて約５倍濃縮した。次に、この濃
縮液を、約２０ｍｌ／ｈｒの流速でＰＢＳで平衡化させ
たカラムにのせて、再びＰＢＳで洗浄した。所望の蛋白
質を溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．８）で溶
出させた後直ちに、１Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）溶液でｐＨ
７．５になるように滴定した。ＥＡＴＰの純度をＳＤＳ
−ＰＡＧＥ及び銀染色で確認したとところ、９７％以上
であった（図４）。

【００５８】実施例５：バイオアッセイ法による活性測
定 フェニルヒドラジンを、マウスに１日１回の割合で２日
間、６０ｍｇ／ｋｇ、投与した。３日後、肥大した脾臓
をマウスから単離し、ホモゲナイザーで破砕して、脾細
胞を得た。この脾細胞を６×１０⁶細胞／ｍｌに希釈し
て、この希釈サンプルを９６ウェルのプレートに１００
μｌずつ分取した。それぞれのウェルに、標準ＥＰＯ
（０〜５００ｍＵ／ｍｌ）及び発現されたＥＰＯ及びＥ
ＡＴＰ（実施例４）を、それぞれ、１００ｍＵ／ｍｌの
濃度で加えた後、プレートを、３７℃に維持されたＣＯ
₂インキュベーターで２２時間、放置した。各ウェルに
ジメチル−³［Ｈ］−チミジン（２０μＣｉ／ｍｌ）を
５０μずつ添加した。このプレートを、さらに同じイン
キュベーターで２時間反応させた後、各ウェルのサンプ
ル溶液をガラスフィルター(Nunc 1-73164)に吸着させ
た。このフィルターを生理食塩水で３回洗浄して、ベー
タ（β）カウンターを用いて各フィルターの放射能量を
測定して、ＥＰＯ及びＥＡＴＰの活性を測定した。測定
結果から、ＥＡＴＰの活性はＥＰＯのものと実質的に同
等であるあるいは若干高いことが示された。これから、
ＥＡＴＰに添加されたカルボキシル末端の存在はＥＰＯ
の活性を阻害しないことが示唆される。

【００５９】実施例６：薬物動態試験 本実施例では、候補物質が実際より長い生体内での半減
期を有するかどうかを確認するために、薬物動態試験を
マウスで行なった。すなわち、実施例５で調製・精製さ
れた融合蛋白質（ＥＡＴＰ）を、４匹のマウスに１匹当
り２０ユニットの投与量で静脈内投与した。経時的血中
濃度を確認するために、始めは３０分間隔でおよび２時
間以後では２時間間隔でマウスから採血した後、ＥＩＡ
キット(Boehringer Manheim Corp.)を使用して、血中濃
度を測定した。その結果を図５に示す。図５に示される
ように、候補物質であるＥＡＴＰは、コントロール物質
であるＥＰＯより、２．５倍以上という有意により長い
半減期を有する。

【００６０】

【発明の効果】本発明は、（１）ヒトエリスロポエチン
（ＥＰＯ）のカルボキシル末端に、ＨＣＧβサブユニッ
トのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）断片のアミノ
酸が１〜４個置換された変異体が融合されることを特徴
とする融合蛋白質；（２）当該融合蛋白質をコード化す
ることを特徴とする核酸；ならびに（３）当該核酸を含
む組換えベクターで形質転換またはトランスフェクショ
ンされた細胞を培養する段階を有する、生体内エリスロ
ポエチン活性が増進した融合蛋白質を製造する方法を提
供するものである。したがって、本発明によれば、その
アミノ酸配列によるＥＰＯ固有の活性自体には影響を与
えずに、即ち、ＥＰＯの糖鎖含量の増加させることな
く、生体内での半減期を画期的に増加させることによっ
て、ＥＰＯの生体内での活性が増進できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】は、本発明の特に好ましい一実施態様によるＨ
ＣＧ変異体であるＡＴＰ（修飾ＣＴＰ遺伝子）の塩基及
びアミノ酸配列を示すものである。

【図２】は、本発明の特に好ましい一実施態様によるＥ
ＰＯとＡＴＰとの融合蛋白質（ＥＡＴＰ）の塩基及びア
ミノ酸配列を示すものである。

【図３】は、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＥＡＴＰ
の作製過程を示す模式図である。

【図４】は、精製されたＥＡＴＰの電気泳動写真であ
る。

【図５】は、ＥＡＴＰ及びＥＰＯの薬物動態結果を示す
グラフである。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 第一製糖株式会社(Cheil Jedang Corporation) <120> 生体内エリスロポエチン活性が増進した融合蛋白質 <130> 2002P0454 <150> KR 10-2001-75994 <151> 2001-12-03 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(34) <223> Amino acids in the positions of 112 to 145 of human chorionic gonadotropin(HCG) beta subunit <400> 1 Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10 15 Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu 20 25 30 Pro Gln <210> 2 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein (EATP) of erythropoietin (EPO) and a variant of carboxy terminal peptide (ATP) of human chorionic gonadotropin (HCG) beta subunit <400> 2 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Ser Ser Ser Ala Lys Ala Pro Pro Pro Ala Leu Pro Ser Pro Ala Arg 195 200 205 Leu Pro Gly Pro Ala Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 210 215 220 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EP1 having the nucleotide sequence complementary to the terminal sequence of EPO cDNA <400> 3 atgggggcac gaatgtcctg cctggctgg 2 9 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EC2 having the nucleotide sequence complementary to the terminal sequence of EPO cDNA <400> 4 gtcccctgtc ctgcaggcct 2 0 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of HCG beta subunit CTP gene fragment EA1 <400> 5 aggggaggcc tgcaggacag gggactcctc ttccg 3 5 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of HCG beta subunit CTP gene fragment A2 <400> 6 ggaagggcgg ggggaggggc cttggcggaa gagga 3 5 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of HCG beta subunit CTP gene fragment A3 <400> 7 ccgcccttcc aagcccagcc cgactcccgg ggccc 3 5 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of HCG beta subunit CTP gene fragment A4 <400> 8 ttattgtggg aggatcgggg tgtcggcggg ccccg 3 5 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EP11 for PCR to obtain the desired fusion gene EATP <400> 9 taagcttatg ggggtgcacg aatgt 2 5 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EP22 for PCR to obtain the desired fusion gene EATP <400> 10 tggatcctta ttgtgggagg atcggggt 2 8

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ａ６１Ｐ 7/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＤ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 金 起 完 大韓民国ソウル特別市西大門区弘恩洞414 −９番地201号 (72)発明者 鄭 普 燮 大韓民国京畿道安養市万安区安養洞719番 地 グリーンパーク ビー棟202号 (72)発明者 朴 持 淑 大韓民国ソウル特別市盧原区中渓洞 新栄 アパート101棟801号 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA01 CA04 CA07 DA02 EA04 GA11 HA12 4B064 AG13 CA10 CA19 CC24 DA01 4C084 AA07 BA02 BA08 BA19 BA22 BA23 BA41 CA18 DB49 DB56 NA05 NA14 ZA551 ZC032 4H045 AA10 AA20 BA10 BA53 CA40 DA13 EA24 FA74

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）のカル
   ボキシル末端に、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣ
   Ｇ）βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴ
   Ｐ）断片のアミノ酸が１〜４個置換された変異体が融合
   されることを特徴とする融合蛋白質。
2. 【請求項２】 該カルボキシル末端ペプチド断片は、配
   列番号：１に記載されるＨＣＧβサブユニットのアミノ
   酸配列の１１２〜１４５番目のアミノ酸の少なくとも一
   部を含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
3. 【請求項３】 該変異体は、配列番号：１に記載される
   ＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１２１、１２
   ７、１３２及び１３８番目からなる群より選択される少
   なくとも一のアミノ酸が置換される、請求項２に記載の
   融合蛋白質。
4. 【請求項４】 該変異体は、配列番号：１に記載される
   ＨＣＧβサブユニットのアミノ酸配列の１２１、１２
   ７、１３２及び１３８番目からなる群より選択される少
   なくとも一のセリン残基（Ｓｅｒ）がアラニン残基（Ａ
   ｌａ）またはグリシン残基（Ｇｌｙ）に置換される、請
   求項３に記載の融合蛋白質。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の融
   合蛋白質をコード化することを特徴とする核酸。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の核酸を含む組換えベク
   ターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞
   を培養する段階を有する、生体内エリスロポエチン活性
   が増進した融合蛋白質を製造する方法。